BR112015021788B1 - Métodos para mover uma ou mais helicases imobilizadas, para controlar o movimento de um polinucleotídeo alvo, para caracterizar um polinucleotídeo alvo e para controlar o carregamento de uma ou mais helicases em um polinucleotídeo alvo, uso de um poro de transmembrana e de um potencial aplicado e de um ou mais espaçadores, complexo, e, kit - Google Patents
Métodos para mover uma ou mais helicases imobilizadas, para controlar o movimento de um polinucleotídeo alvo, para caracterizar um polinucleotídeo alvo e para controlar o carregamento de uma ou mais helicases em um polinucleotídeo alvo, uso de um poro de transmembrana e de um potencial aplicado e de um ou mais espaçadores, complexo, e, kit Download PDFInfo
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Abstract
MÉTODOS PARA MOVER UMA OU MAIS HELICASES IMOBILIZADAS, PARA CONTROLAR O MOVIMENTO DE UM POLINUCLEOTÍDEO ALVO, PARA CARACTERIZAR UM POLINUCLEOTÍDEO ALVO E PARA CONTROLAR O CARREGAMENTO DE UMA OU MAIS HELICASES EM UM POLINUCLEOTÍDEO ALVO, USO DE UM PORO DE TRANSMEMBRANA E DE UM POTENCIAL APLICADO E DE UM OU MAIS ESPAÇADORES, COMPLEXO, E, KIT. A invenção refere-se aos métodos novos de mover helicases para além de espaçadores em polinucleotídeos e de controlar o carregamento de helicases em polinucleotídeos. A invenção também se refere aos métodos novos de caracterizar polinucleotídeos alvos com o uso de helicases.
Description
[001] A invenção refere-se aos métodos novos de mover helicases para além de espaçadores em polinucleotídeos e de controlar o carregamento de helicases em polinucleotídeos. A invenção também se refere aos métodos novos de caracterizar polinucleotídeos alvo com o uso de helicases.
[002] Há atualmente uma necessidade de tecnologias de identificação e sequenciamento de polinucleotídeos (por exemplo DNA ou RNA) rápidas e baratas em uma ampla variedade de aplicações. As tecnologias existentes são lentas e caras principalmente porque se baseiam em técnicas de amplificação para produzir grandes volumes de polinucleotídeo e necessitam de uma quantidade elevada de compostos químicos fluorescentes especiais para detecção de sinal.
[003] Poros de transmembrana (nanoporos) têm grande potencial como biossensores elétricos, diretos para polímeros e uma variedade de moléculas pequenas. Em particular, foco recente tem sido dado aos nanoporos como uma tecnologia de sequenciamento de DNA potencial.
[004] Quando um potencial é aplicado através de um nanoporo, há uma alteração no fluxo de corrente quando um analito, como um nucleotídeo, reside transientemente na barreira durante um determinado período de tempo. A detecção por nanoporo do nucleotídeo produz uma alteração de corrente de cuukpcVwtc g fwtc>«q eqnjgekfcu Pq ofiVqfq fg “ugswgpekcogpVq fg fiVc”. uma única fita de polinucleotídeo é passada através do poro e as identidades dos nucleotídeos são derivadas. O sequenciamento da fita pode envolver o uso de uma proteína manipuladora de nucleotídeo, como uma helicase, para controlar o movimento do polinucleotídeo através do poro.
[005] Espaçadores em polinucleotídeos são tipicamente capazes de imobilizar helicases, isto é, evitar que as helicases se movam mais adiante ao longo dos polinucleotídeos para além dos espaçadores. Os inventores têm surpreendentemente demonstrado que é possível mover uma ou mais helicases imobilizadas para além de um espaçador em um polinucleotídeo pelo contato da helicase e do polinucleotídeo com um poro de transmembrana e pela aplicação de um potencial. Visto que a helicase é tipicamente muito grande para passar através do poro, a força do polinucleotídeo se movem através do poro ao longo do potencial move a helicase para além do espaçador. Isto tem aplicações importantes para controlar o movimento de polinucleotídeos e caracterizar, como sequenciar, os polinucleotídeos. Os inventores também têm surpreendentemente demonstrado que é possível controlar o carregamento de uma ou mais helicases em um polinucleotídeo com o uso de um ou mais espaçadores.
[006] A invenção, portanto, fornece um método de mover uma ou mais helicases imobilizadas para além de um ou mais espaçadores em um polinucleotídeo alvo, compreendendo contactar (a) as uma ou mais helicases imobilizadas e o polinucleotídeo alvo com um poro de transmembrana e (b) aplicar um potencial através do poro e assim mover as uma ou mais helicases para além dos um ou mais espaçadores no polinucleotídeo alvo.
[007] A invenção também fornece: - um método de controlar o movimento de um polinucleotídeo alvo através de um poro de transmembrana, compreendendo (a) fornecer o polinucleotídeo alvo com um ou mais espaçadores; (b) contactar o polinucleotídeo alvo com uma ou mais helicases de tal modo que as uma ou mais helicases parem nos um ou mais espaçadores; (c) contactar o polinucleotídeo alvo e as uma ou mais helicases imobilizadas com o poro; e (d) aplicar um potencial através do poro de tal modo que as uma ou mais helicases movam-se para além dos um ou mais espaçadores e controlar o movimento do polinucleotídeo alvo através do poro; - um método de caracterizar um polinucleotídeo alvo, compreendendo (a) executar o método de controlar o movimento de um polinucleotídeo alvo através de um poro de transmembrana da invenção; e (b) realizar uma ou mais medições à medida que polinucleotídeo se move com relação ao poro sendo que as medições são indicativas de uma ou mais características do polinucleotídeo e assim caracterizar o polinucleotídeo alvo; - um método de controlar o carregamento de uma ou mais helicases em um polinucleotídeo alvo, compreendendo (a) fornecer o polinucleotídeo com um ou mais espaçadores; e (b) contactar o polinucleotídeo fornecido em (a) com as uma ou mais helicases de tal modo que as uma ou mais helicases se liguem ao polinucleotídeo e parem em cada espaçador; - um adaptador para controlar o movimento de um polinucleotídeo alvo, sendo que o adaptador compreende (a) (L-S-D)n ou (D- S-N+p pc fktg>«q 70 rctc 50. ugpfq swg N fi wo rqnkpwengqVifgq fg hkVc úpkec qw um polinucleotídeo não hibridizado, S é um espaçador e D é um polinucleotídeo de fita dupla e sendo que n é um número inteiro e (b) uma ou mais helicases imobilizadas em cada adaptador; e - um kit para controlar o movimento de um polinucleotídeo alvo, sendo que o kit compreende (a) um ou mais espaçadores, (b) uma ou mais helicases e (c) um poro de transmembrana.
[008] Figura 1 mostra um diagrama do constructo de DNA lambda usado no Exemplo 1. SEQ ID NO: 9 (indicada por A) está ligada por meio de uwc" gzvtgokfcfg" 5Ó" cqu" swcvtq" espaçadores iSpC3 (indicados por B). Os quatro espaçadorgu"kUrE5"u«q"nkicfqu"§"gzvtgokfcfg"7Ó"fg"UGS"KF"PQ<"32" (indicada por C). SEQ ID NO: 10 está ligada aos quatro espaçadores iSpC3 (indicados por D) que estão ligados à SEQ ID NO: 11 (indicada por E) por ogkq"fg"uwc"gzvtgokfcfg"7Ó0"UGS"KF"PQ<"32"fi"hibrizada com a SEQ ID NO: 12 (indicada por F, que tem um grupo de ancoragem (tether+"5Ó-colesterol).
[009] Figura 2 mostra um traçado de corrente exemplificador (indicação de eixo-y = Corrente (pA, 20 a 120), indicação de eixo-x = Tempo (s, 3.500 a 8.000)) de quando uma helicase (T4 Dda - E94C/A360C (SEQ ID PQ< : eqo owVc>õgu G;6E1C582E g gpV«q *ΔO3+I3I4+++ eqpVtqnc c translocação do constructo de DNA lambda (0,2 nM conforme descrito e ilustrado na Figura 1) através de um nanoporo (MS(B1- G75S/G77S/L88N/Q126R)8 MspA (MspA - B2C) (SEQ ID NO: 2 com mutações G75S/G77S/L88N/Q126R)).
[0010] Figura 3 mostra ampliação nas regiões do movimento de DNA controlado por helicase mostrado no traçado de corrente na Figura 2 (indicação de eixo-y = Corrente (pA, traçado superior 20 a 80, traçado inferior 20 a 60), indicação de eixo-x = Tempo (s, traçado superior 2,995 a 3,020, traçado inferior 8,140 a 8,170) para ambos os traçados superior e inferior). A) mostra o início do movimento de DNA controlado por helicase e B) mostra o término do movimento de DNA controlado por helicase. A seta indicada por 1 corresponde a quando o primeiro grupo de quatro espaçadores iSpC3 (que é usado para imobilizar o movimento da enzima antes da captura pelo nanoporo) move-se através do nanoporo. A seta indicada por 2 corresponde a um segundo grupo de quatro espaçadores iSpC3 movendo-se através do nanoporo.
[0011] Figura 4 (a) mostra os projetos de substrato de MuA em grampo cabelo e em formato Y usados no Exemplo 2. O dUMP em SEQ ID NO: 19 é realçado como um triângulo e os espaçadores iSpC3 são mostrados eqoq ZÓUO Hkiwtc 6 *d+ oquVtc q eqpuVtweVq fg FPC Ncodfc FPC rtqfwzkfq durante o procedimento de preparação de amostra detalhada no Exemplo 2. O fragmento de 5-10 kB de DNA Lambda é indicado por X, o fragmento de DNA inserido pela polimerase e unido ao restante do constructo pela ligase é indicado por y (e é mostrado como uma linha tracejada) e os espaçadores kUrE5 u«q oquVtcfqu eqoq ZÓUO Woc ugswêpekc fg cpeqtcigo * tether sequence) (SEQ ID NO: 16) é hibridizada com o constructo de DNA como oquvtcfq0 Nkicfqu rgnc gzvtgokfcfg 5Ófg UGS KF PQ< 38 guv«q ugku espaçadorgu kUr3: nkicfqu c fqku tguifwqu fg vkokfkpc g c wo 50-colesterol- TEG (mostrado como um círculo cinza).
[0012] Figura 5 mostra traçados de corrente exemplificadores (indicação de eixo-y = Corrente (pA), indicação de eixo-x = Tempo (s) para ambos os traçados superior e inferior) de quando uma helicase (Trwc Cba (SEQ ID NO: 9) controla a translocação do constructo de DNA lambda (mostrado na Figura 4b) através de um nanoporo (MS(B1-G75S/G77S/L88N/ Q126R)8 MspA (SEQ ID NO: 2 com mutações G75S/G77S/L88N/Q126R)). O traçado superior mostra o movimento de DNA controlado por helicase do constructo de DNA Lambda inteiro através do nanoporo, o primeiro espaçador iSpC3 indicado por X1 produz o pico em corrente indicado por 1, o segundo espaçador iSpC3 indicado por X2 produz o pico em corrente indicado por 2. O traçado inferior mostra uma ampliação em região do término do movimento de DNA controlado por helicase através do nanoporo, o terceiro espaçador iSpcC3 indicado por X3 produz o pico em corrente indicado por 3.
[0013] Figura 6 (a) mostra os projetos de substratos de MuA em itcorq fg ecdgnq g go hqtocvq [ wucfqu pq Gzgornq 50 Q 7Ó-fosfato é indicado como um círculo, as inosinas em SEQ ID NO: 18 são realçadas como um retângulo e os espaçadorgu"kUrE5"u«q"oquvtcfqu"eqoq"zÓu0"Hkiwtc"8" (b) mostra o constructo de DNA Lambda produzido durante o procedimento de preparação de amostra detalhado no Exemplo 3. O fragmento de 5-10 kB de DNA Lambda é indicado por X, as inosinas que estão agora ligadas a x são indicadas como um retângulo e os espaçadores iSpC3 são mostrados como ZÓUO Woc ugswêpekc fg cpeqtcigo * tether sequence) (SEQ ID NO: 16) é hibridizada com o constructo de DNA como mostrado. Ligados pela gzvtgokfcfg"5Ó"fg"UGS"KF"PQ<"38"guv«q"ugku"espaçadores iSp18 ligados a dois tguífwqu fg Vkokfkpc g c wo 50-colesterol-TEG (como mostrado como um círculo cinza).
[0014] Figura 7 mostra traçados de corrente exemplificadores (indicação de eixo-y = Corrente (pA), indicação de eixo-x = Tempo (s) para ambos os traçados superior e inferior) de quando uma helicase (Trwc Cba (SEQ ID NO: 17) controla a translocação do constructo de DNA lambda (mostrado na Figura 6b) através de um nanoporo (MS(B1- G75S/G77S/L88N/Q126R)8 MspA (SEQ ID NO: 2 com mutações G75S/G77S/L88N/Q126R)). O traçado superior mostra o movimento de DNA controlado por helicase do constructo de DNA Lambda inteiro através do nanoporo, o primeiro espaçador iSpC3 indicado por X1 produz o pico em corrente indicado por 1, o segundo espaçador iSpC3 indicado por X2 produz o pico em corrente indicado por 2 e o terceiro espaçador iSpC3 indicado por X3 produz o pico em corrente indicado por 3. O traçado inferior mostra uma amplificação em região da segunda metade do movimento de DNA controlado por helicase através do nanoporo, o segundo espaçador iSpC3 indicado por X2 produz o pico em corrente indicado por 2 e o terceiro espaçador iSpC3 indicado por X3 produz o pico em corrente indicado por 3.
[0015] Figura 8 Ensaio de fluorescência para testar a atividade de enzima. Um substrato fluorescente adaptado foi usado para testar a capacidade da helicase (indicada por a) para deslocar dsDNA hibridizado. 1) A fita de substrato fluorescente (48,75 nM final, SEQ ID NO: 25 e 26) tem woc ucnkêpekc 50-ssDNA (20 bases), e uma seção de 40 bases de dsDNA hibridizado. A fita superior (b) tem uma base contendo carboxifluoresceína *e+ pc gzVtgokfcfg 70 fg UGS KF PQ< 47. g q eqorngogpVq jkdtkfkzcfq *f+ tem uma base black-hole quencher (BHQ-1, marca registrada, inativador buraco-pgitq+ *g+ pc gzvtgokfcfg 5Ó fg UGS KF PQ< 480 Swcpfq jkdtkfkzcfq. a fluorescência da fluoresceína é inativada pela BHQ-1 local, e o substrato é essencialmente não fluorescente. 0,975 μM de uma fita de captura (f, SEQ ID NO: 27) que é parcialmente-complementar à fita inferior do substrato fluorescente é incluído no ensaio. 2) Na presença de ATP (0,975 mM) e MgCl2 (10 mM), helicase Hel308 Mbu (12 nM, SEQ ID NO: 28) liga-se à ucnkêpekc 5Ó fq uwduvtcvq hnwqtguegpvg. oqxg-se ao longo da fita superior, e desloca a fita complementar (d) como mostrado. 3) Quando a fita complementar com BHQ-1 é totalmente deslocada a fluoresceína na fita maior fluoresce (mostrado como um formato de estrela). 4) A fita inferior deslocada (d) preferencialmente anela-se com um excesso de fita de captura (f) para evitar o reanelamento do substrato inicial e a perda de fluorescência.
[0016] Figura 9 Ensaio de fluorescência para testar a atividade de enzima. Foram usados dois possíveis substratos fluorescentes para testar a capacidade da helicase (indicada por a) para deslocar o dsDNA hibridizado, estes são mostrados na Figura 9 (a) (indicados por 1C-3C) tem quatro espaçadores Sp9 (mostrados como um triângulo preto) conectando a gzvtgokfcfg 5Ó fg UGS KF PQ< 49 § gzvtgokfcfg 5Ó fg UGS KF PQ< 4; g *d+ (indicado por 1B-3B) tem um espaçador Sp9 (mostrado como um triângulo rtgvq+ eqpgevcpfq c gzvtgokfcfg 5Ó fg UGS KF PQ< 49 § gzvtgokfcfg 5Ó fg SEQ ID NO: 29. A fita de substrato fluorescente (48,75 nM final quer a) quer d+ fguetkvq rtgxkcogpvg+ vgo woc ucnkêpekc 5Ó-ssDNA (20 bases), e uma seção de 40 bases de dsDNA hibridizado. A fita superior (b) tem uma base contendo ectdqzkflwqtguegípc *e+ na gzVtgokfcfg 5’ fg UGS KF PQ< 49. q eqorlgogpVq hibridizado (d) tem uma base black-hole quencher (BHQ-1) (e) na gzVtgoifcfg 5"fg UGS KF PQ< 48o Swanfq jkdtkfkzcfq. c flwqtgueêpekc fc fluoresceína é inativada pela BHQ-1 local, e o substrato é essencialmente não fluorescente. 1 μM de uma fita de captura (f, SEQ ID NO: 27) que é parcialmente-complementar à fita inferior do substrato fluorescente é incluído no ensaio. 2 a) e b) Na presença de ATP (0,975 mM) e MgCl2 (10 mM), helicase Hel308 Mbu (SEQ ID NO: 28) liga-ug § uclkêpekc 5Ó fq uwduvtcvq fluorescente, move-se ao longo da fita superior até o(s) grupo(s) Sp9. O grupo Sp9 (1 em B e 4 em C) cessa o movimento da helicase para além dele e a helicase não desloca a fita complementar (SEQ ID NO: 26). Portanto, a fluoresceína e o black-hole quencher permanecem em proximidade mutuamente rente e fluorescência não é observada.
[0017] Figura 10 Gráfico (eixo-y = taxa de utilização relativa de dsDNA, eixo-x = substrato fluorescente) da taxa de utilização relativa de dsDNA em soluções tamponantes (HEPES 100 mM pH8, ATP 0,975 mM, MgCl2 10 mM, BSA 1 mg/mL, substrato fluorescente DNA 48,75 nM (A = SEQ ID NOs: 25 e 26, B = SEQ ID NO: 27 ligada por meio de sua gzvtgokfcfg 5Ó rqt wo espaçador Ur; § gzvtgokfcfg 7Ófg UGS KF PQ< 4; g hibridizada com SEQ ID NO: 6, C = SEQ ID NO: 27 ligada por meio de sua extremidafg 5Ó rqt swcvtq espaçadorgu Ur; § gzvtgokfcfg 7Ó fg UGS KF PQ< 29 e hibridizada com SEQ ID NO: 26), 0,975 μM de DNA de captura (SEQ ID NO: 27)) para a helicase Hel308 Mbu (indicada por A, SEQ ID NO: 28) a 400 mM de KCl.
[0018] Figura 11 Gráfico (eixo-y = taxa de utilização relativa de dsDNA, eixo-x = substrato fluorescente) da taxa de utilização relativa de dsDNA em soluções tamponantes (HEPES 100 mM pH8, ATP 0,975 mM, MgCl2 10 mM, BSA 1 mg/mL, substrato fluorescente DNA 48,75 nM (D = SEQ ID NOs: 32 e 26, E = SEQ ID NO: 27 ligada por meio de sua gzvtgokfcfg"5Ó"rqt"wo"itwrq"kfUr"§"gzvtgokfcfg"7Ó"fg"UGS"KF"PQ<"52"g" hibridizada com SEQ ID NO: 26, F = SEQ ID NO: 27 ligada por meio de sua gzvtgokfcfg"5Ó"rqt"swcvtq"itwrqu"kfUr"§"gzvtgokfcfg"7Ó"fg"UGS"KF"PQ<"53"g" hibridizada com SEQ ID NO: 26 e G = SEQ ID NO: 33 hibridizada com SEQ ID NO: 26), 0,975 μM de DNA de captura (SEQ ID NO: 27)) para a helicase Hel308 Mbu (indicada por A, SEQ ID NO: 28) a 400 mM de KCl.
[0019] Figura 12 mostra as etapas experimentais para a fita de controle que não contém espaçadores iSpC3 ou iSp18 que param a helicase (indicada por 1). A fita de controle (SEQ ID NO: 34) não contém espaçadores ou grupos bloqueadores e é hibridizada com uma fita complementar mais curta de DNA (SEQ ID NO: 35, que tem uma carboxifluoresceína ligada à sua gzVtgokfcfg 5’, oquVtcfc eqoq wo eitewnq eipzc+o KuVq rtqfwz wo eqnuVtweVq de fita dupla parcialmente duplicado que tem uma saliência de 50 nucleotídeos. O constructo (SEQ ID NO: 34 hibridizada com SEQ ID NO: 35) é pré-incubado com T4 Dda - E94C/A360C para permitir que a enzima se ligue à saliência. Devido ao comprimento da saliência mais que uma enzima pode se ligar à ela como mostrado. A enzima é então fornecida com os componentes necessários para promover o movimento de helicase (ATP e MgCl2). Fita de captura adicional (SEQ ID NO: 37) também é adicionada com os ATP e MgCl2. A helicase então transloca-se ao longo da fita de controle, deslocando a fita complementar mais curta, deixando a fita de controle sem helicase ou fita complementar ligada (indicada por A). A fita complementar então forma um grampo de cabelo de modo que ela não possa ser reanelada à fita de controle (indicada por B). A helicase que está livre na solução tem se movido ao longo do DNA de controle e ao desligar-se na extremidade é então ligada pela fita de captura em excesso (SEQ ID NO: 37, complexo indicado por C) como mostrado. Qualquer DNA que não se liga à helicase permanece intacto (permanece como espécie F). A mistura de amostra é então corrida sobre um gel e as espécies separadas são identificadas pelas bandas produzidas sobre o gel.
[0020] Figura 13 mostra as etapas experimentais para uma fita que contém os espaçadorgu"kUrE5"qw"kUr3:"*oquvtcfqu"eqoq"ZÓu"pc"Hkiwtc+"eqo" o propósito de imobilizar a helicase (indicada por 1). O mesmo procedimento foi realizado como mostrado na Figura 12, a enzima foi pré-incubada com o constructo de DNA (a fita complementar mais curta tem uma ectdqzkflwqtguegípc Ikicfc § uwc gzVtgokfcfg 70+0 Qu itwrqu espaçadores estão localizados em frente da região de fita dupla e a helicase é capaz de se ligar ao DNA como mostrado. Após a adição de ATP, MgCl2 e DNA de captura (indicado por 2) a helicase é então fornecida com os componentes necessários para promover o movimento de helicase. Se os espaçadores são capazes de imobilizar a helicase então ela permanecerá ligada ao constructo de DNA que ainda contém a fita complementar curta (indicada por D). Se os espaçadores não são capazes de imobilizar a helicase então ela se moverá para além do espaçador e deslocará a fita complementar (indicada por B) deixando espécie A sem helicase ligada. A enzima livre então se ligará à fita de captura em excesso (indicada por C) e a fita complementar deslocada formará um grampo de cabelo (indicado por B). Se os espaçadores são capazes de imobilizar uma helicase mas não duas helicases então a primeira helicase será empurrada para além dos espaçadores pela helicase atrás e deslocará a fita complementar. Entretanto, a segunda helicase não será capaz de mover-se para além dos espaçadores resultando no complexo indicado por E. Algum DNA que não se liga à helicase permanece intacto sem helicase ligada (espécie F). A mistura de amostra é então corrida sobre um gel e as espécies separadas são identificadas pelas bandas que produzem sobre o gel.
[0021] Figura 14 mostra o ensaio em gel que foi realizado para a fita de controle (1 em tabela 11). A pista indicada por M mostra uma escada de DNA como referência (bandas correspondem desde a massa mais baixa (parte inferior do gel) até a massa mais alta (parte superior do gel) 200 pb (pares de bases), 300 pb, 400 pb, 500/517 pb, 600 pb, 700 pb, 800 pb, 900 pb, 1.000 pb, 1.200 pb e 1.517 pb). Pista 1 contém apenas DNA anelado (SEQ ID NO: 34 hibridizada com SEQ ID NO: 35). Pista 2 contém a helicase (T4 Dda - E94C/A360C) pré-ligada à fita de controle (sem combustível adicionado). Pista 3 mostra a fita de controle após combustível (ATP e MgCl2) ter sido adicionado em tampão 1. Pista 4 mostra a fita de controle após combustível (ATP e MgCl2) ter sido adicionado em tampão 2. Banda X corresponde à SEQ ID NO: 34 apenas e banda Y corresponde à SEQ ID NO: 34 hibridizada com SEQ ID NO: 35. A região indicada por 1Y corresponde a uma helicase ligada à SEQ ID NO: 34 hibridizada com SEQ ID NO: 35. A região indicada por 2Y corresponde a duas helicases ligadas à SEQ ID NO: 34 hibridizada com SEQ ID NO: 35. A região indicada por 3Y corresponde a três helicases ligadas à SEQ ID NO: 34 hibridizada com SEQ ID NO: 35. A região indicada por 4Y corresponde a quatro helicases ligadas à SEQ ID NO: 34 hibridizada com SEQ ID NO: 35. A região indicada por 5Y corresponde a cinco helicases ligadas à SEQ ID NO: 34 hibridizada com SEQ ID NO: 35.
[0022] Figura 15 mostra o ensaio em gel que foi realizado para constructos de DNA contendo 3 (7 em tabela 11, pistas correspondentes = 14), 4 (8 em tabela 11, pistas correspondentes = 5-8) e 5 espaçadores iSp18 (9 em tabela 11, pistas correspondentes = 9-12) na junção entre ssDNA e dsDNA. As pistas indicadas por M mostram uma escada de DNA como referência (bandas correspondem desde a massa mais baixa (parte inferior do gel) até a massa mais alta (parte superior do gel) 200 pb (pares de bases), 300 pb, 400 pb, 500/517 pb, 600 pb, 700 pb, 800 pb, 900 pb, 1.000 pb, 1.200 pb e 1.517 pb). Pista 1 contém DNA anelado apenas (SEQ ID NO: 9 ligada por ogkq fg uwc gzVtgokfcfg 3’ cqu Vtêu espaçadores iSp18 que estão ligados à gzVtgoifcfg 70 fg UGS KF PQ< 58 jkdtkfkzcfc eqo UGS KF PQ< 57+o RkuVc 4 contém a helicase (T4 Dda - E94C/A360C) pré-ligada ao constructo de DNA sem combustível adicionado (SEQ ID NO: 9 ligada por meio de sua gzVtgokfcfg 5’ cqu Vtêu espaçadorgu iUr3: swg guV«q niicfqu § gzVtgoifcfg 5’ de SEQ ID NO: 36 hibridizada com SEQ ID NO: 35). Pista 3 mostra o constructo de DNA (SEQ ID NO: 9 niicfc rqt ogiq fg uwc gzvtgoifcfg 5Ó aos três espaçadorgu iUr3: swg guv«q niicfqu § gzvtgoifcfg 7Ó fg UGS KF NO: 36 hibridizada com SEQ ID NO: 35) após combustível (ATP e MgCl2) ter sido adicionado em tampão 1. Pista 4 mostra o constructo de DNA (SEQ ID NQ< ; niicfc rqt ogiq fg uwc gzvtgoifcfg 5Ó cqu vtêu espaçadores iSp18 Swg guV«q niicfqu § gzVtgoifcfg 5’ fg UGS KF PQ< 58 jidtifizcfc eqo UGS ID NO: 35) após combustível (ATP e MgCl2) ter sido adicionado em tampão 2. Pista 5 contém DNA anelado apenas (SEQ ID NO: 9 ligada por meio de uwc gzvtgoifcfg 5’ cqu swcvtq espaçadores iSp18 que estão ligados à gzvtgoifcfg 7’ fg UGS KF PQ< 58 jidtifizcfc eqo UGS KF PQ< 57+0 Riuvc 8 contém a helicase (T4 Dda - E94C/A360C) pré-ligada ao constructo de DNA sem combustível adicionado (SEQ ID NO: 9 ligada por meio de sua gzvtgoifcfg 5’ cqu swcvtq espaçadores iSp18 que estão ligados à extremidade 7’ fg UGS KF PQ< 58 jidtifizcfc eqo UGS KF PQ< 57+0 Riuvc 9 oquvtc q constructo de DNA (SEQ ID NO: 9 ligada por meio de sua extremidcfg 5’ aos quatro espaçadorgu iUr3: swg guv«q niicfqu § gzvtgoifcfg 7’ fg UGS KF NO: 36 hibridizada com SEQ ID NO: 35) após combustível (ATP e MgCl2) ter sido adicionado em tampão 1. Pista 8 mostra o constructo de DNA (SEQ ID NO: 9 ligada por meio de sua ezvtgoifcfg 5’ cqu swcvtq espaçadores iUr3: swg guv«q niicfqu § gzvtgoifcfg 7’ fg UGS KF PQ< 58 jidtifizcfc eqo SEQ ID NO: 35) após combustível (ATP e MgCl2) ter sido adicionado em tampão 2. Pista 9 contém DNA anelado apenas (SEQ ID NO: 9 ligada por meio de uwc gzvtgoifcfg 5’ cqu eipeq espaçadores iSp18 que estão ligados à gzvtgoifcfg 7’ fg UGS KF PQ< 58 jidtifizcfc eqo UGS KF PQ< 57+0 Riuvc 32 contém a helicase (T4 Dda - E94C/A360C) pré-ligada ao constructo de DNA sem combustível adicionado (SEQ ID NO: 9 ligada por meio de sua gzvtgoifcfg 5’ cqu eipeq espaçadores iSp18 que estão ligados à extremidade 7Ó fg UGS KF PQ< 58 jkdtkfkzcfc eqo UGS KF PQ< 57+o RkuVc 33 oquVtc q eqpuvtwevq fg FPC *UGS KF PQ< ; nkicfc rqt ogkq fg uwc gzvtgokfcfg 5Ó aos cinco espaçadoreu kUr3: swg guv«q nkicfqu § gzvtgokfcfg 7Ó fg UGS KF NO: 36 hibridizada com SEQ ID NO: 35) após combustível (ATP e MgCl2) ter sido adicionado em tampão 1. Pista 12 mostra o constructo de DNA (SEQ KF PQ< ; nkicfc rqt ogkq fg uwc gzvtgokfcfg 5Ó cqu ekpeq espaçadores iSp18 swg guv«q nkicfqu § gzvtgokfcfg 7Ó fg UGS KF PQ< 58 jkdtkfkzcfc eqo UGS ID NO: 35) após combustível (ATP e MgCl2) ter sido adicionado em tampão 2. Banda X corresponde ao constructo de ssDNA apenas (por exemplo SEQ ID NO: 9 ligada por meio de uwc gzVtgokfcfg 3’ cqu Vtêu, swcVtq qw ekpeq espaçadorgu kUr3: swg guv«q nkicfqu § gzvtgokfcfg 7Ó fg UGS KF PQ< 58+ apenas e banda Y corresponde ao constructo de dsDNA apenas (SEQ ID NO: ; nkicfc rqt ogkq fg uwc gzvtgokfcfg 5Ó cqu vtêu. swcvtq qw ekpeq espaçadores kUr3: swg guv«q nkicfqu § gzvtgokfcfg 7Ó fg UGS KF PQ< 58 jkdtkfkzcfc eqo SEQ ID NO: 35). A região indicada por 1X corresponde a uma helicase ligada § UGS KF PQ< ; nkicfc rqt ogkq fg uwc gzvtgokfcfg 5Ó cqu vtêu. swcvtq qw cinco espaçadores iSp18 que estão ligados à SEQ ID NO: 36. A região indicada por 1Y corresponde a uma helicase ligada à SEQ ID NO: 9 ligada rqt ogkq fg uwc gzvtgokfcfg 5Ó cqu vtêu. swcvtq qw ekpeq espaçadores iSp18 que estão ligados à SEQ ID NO: 36 hibridizada com SEQ ID NO: 35. A região indicada por 2Y corresponde a duas helicases ligadas à SEQ ID NO: 9 nkicfc rqt ogkq fg uwc gzvtgokfcfg 5Ó cqu vtêu. swcvtq qw ekpeq espaçadores iSp18 que estão ligados à SEQ ID NO: 36 hibridizada com SEQ ID NO: 35. A região indicada por 3Y corresponde a três helicases ligadas à SEQ ID NO: ; nkicfc rqt ogkq fg uwc gzvtgokfcfg 5Ó cqu vtêu. swcvtq qw ekpeq espaçadores iSp18 que estão ligados à SEQ ID NO: 36 hibridizada com SEQ ID NO: 35. A região indicada por 4Y corresponde a quatro helicases ligadas à SEQ ID PQ< ; nkicfc rqt ogkq fg uwc gzvtgokfcfg 5Ó cqu vtêu. swcvtq qw ekpeq espaçadores iSp18 que estão ligados à SEQ ID NO: 36 hibridizada com SEQ ID NO: 35. A região indicada por 5Y corresponde a cinco helicases ligadas à SEQ ID NO: 9 ligada por meio fg uwc gzVtgokfcfg 3’ cqu Vtêu. swcVtq qw cinco espaçadores iSp18 que estão ligados à SEQ ID NO: 36 hibridizada com SEQ ID NO: 35.
[0023] Figura 16 mostra o constructo de DNA padrão usado no Gzgornq ;0 Qu zÓu tgrtgugpvco itwrqu espaçadores aos quais uma helicase não pode se ligar. O comprimento da região indicada por 1 pode ser alterado com o propósito de controlar o número de helicases que podem se ligar àquela região. A Figura mostra, como um exemplo, a ligação de uma ou duas helicases na região 1.
[0024] Figura 17 mostra um ensaio em gel exemplificador do constructo de DNA indicado por 3 em tabela 12 (Cinco espaçadores iSpC3 niicfqu § gzVtgokfcfg 5’ fg UGS KF PQ< 9, swg guVá niicfc rqt ogiq fg uwc gzvtgokfcfg 5Ó cqu swcvtq espaçadores iSpC3 que estão ligados à extremidade 70 fg UGS KF PQ< 58 swg fi hibrifizafa eqm UGS KF PQ< 57+o C riuVc indicada por M mostra uma escada de DNA como referência (bandas correspondem desde a massa mais baixa (parte inferior do gel) até a massa mais alta (parte superior do gel) 200 pb (pares de bases), 300 pb, 400 pb, 500/517 pb, 600 pb, 700 pb, 800 pb, 900 pb, 1.000 pb, 1.200 pb e 1.517 pb). Pistas 1-6 correspondem às concentrações diferentes de T4 Dda - E94C/A360C - 1 = 5.000 nM, 2 = 2.500 nM, 3 = 1.250 nM, 4 = 625 nM, 5 = 312,5 nM e 6 = 0 nM). A banda observada em nível X corresponde ao constructo de dsDNA não ligado. Os números ao lado esquerdo do gel referem-se ao número de enzimas ligadas ao DNA. Para este constructo de DNA foi possível ligar até 6 helicases na concentração mais alta de enzima adicionada. Os números mostrados no parte superior do gel correspondem à concentração de T4 Dda - E94C/A360C) adicionada.
[0025] Figura 18 mostra o constructo de DNA usado no Exemplo 9. Regiões indicadas por A e B são fitas curtas de DNA (SEQ ID NO: 37) que têm sido projetadas de modo que uma helicase possa se ligar à cada região (como mostrado no lado direito). A região 1 corresponde a 25 espaçadores 25 SpC3, região 2 corresponde a dois espaçadores iSp18, região 3 corresponde a dois espaçadores iSp18, região 4 é uma seção de DNA (SEQ ID NO: 10) que hibridiza com outra fita de DNA que pode ou não ser composta de DNA em formato de garfo (por exemplo SEQ ID NO: 42 = não em formato de garfo (fragmento faltante indicado por 7) e SEQ ID NO: 12 ligada a seis espaçadores iSp18 (mostrados como fragmento indicado por 7) = em formato de garfo), região 5 corresponde a quatro 5-nitroindóis e região 6 corresponde à outra região de DNA (SEQ ID NO: 41) que é hibridizada com seu complemento (SEQ ID NO: 43).
[0026] Figura 19 mostra um ensaio em gel do constructo de DNA descrito e mostrado na Figura 18. A banda observada no nível X corresponde ao constructo de dsDNA não ligado. A pista indicada por M mostra uma escada de DNA como referência (bandas correspondem desde a massa mais baixa (parte inferior do gel) até a massa mais alta (parte superior do gel) 200 pb (pares de bases), 300 pb, 400 pb, 500/517 pb, 600 pb, 700 pb, 800 pb, 900 pb, 1.000 pb, 1.200 pb e 1.517 pb). Os números no lado esquerdo do gel referem-se ao número de enzimas ligadas ao DNA. Para este constructo de DNA foi possível observar ligação de duas helicases (uma na região A e a segunda na região B como mostrado na Figura 18) de uma concentração de 475 nM de enzima e acima. Os números mostrados no parte superior do gel correspondem à concentração de T4 Dda - E94C/A360C) adicionada.
[0027] Figura 20 mostra o constructo de DNA usado no Exemplo 10 (chamado de constructo de DNA X1). Há 25 espaçadores SpC3 (mostrados eqoq zóu+ nkicfqu § gzVtgoifcfg 5’ fg UGS KF PQ< 5: swg guVá nkicfa por ogkq fg uwc gzvtgokfcfg 5Ó cqu 6 espaçadores iSp18 (mostrados como quadrados pretos). Os quatro espaçadorgu kUr3: u«q nkicfqu § gzvtgokfcfg 7Ó fg UGS KF PQ< 32 swg guvá nkicfc rqt ogkq fg uwc gzvtgokfcfg 5Ó cqu swcvtq 5-nitroindóis (mostrados como triângulos cinzas). Os quatro nitroindóis são gpv«q" nkicfqu" §" gzvtgokfcfg" 7Ó" fg" UGS" KF" PQ<" 630" C" hkvc" fg" FPC" complementar que hibridiza com a SEQ ID NO: 41 é a SEQ ID NO: 43. A fita de DNA complementar que hibridiza com a SEQ ID NO: 10 é a SEQ ID NO: 12 (ligcfqu"§"gzvtgokfcfg"5Ó"fg"UGS"KF"PQ<"34Ó"guv«q"ugku"espaçadores kUr3: nkicfqu a fqku tguifwqu fg Vkokpc g a wo 50-colesterol-TEG (mostrado como um círculo cinza)). A região indicada por A corresponde à região do constructo onde T4 Dda - E94C/A360C é capaz de se ligar.
[0028] Figura 21 mostra um traçado de corrente exemplificador (indicação de eixo-y = Corrente (pA, 50 a 250), indicação de eixo-x = Tempo (s, 238 a 252)) de quando uma helicase (T4 Dda - E94C/A360C) controla a translocação do constructo de DNA (0,1 nM, consulte a descrição da Figura 20) através de um nanoporo (MspA - B2C). A região indicada por 1 mostra uma translocação controlada por helicase da região poliT (SEQ ID NO: 38, aquela à qual a enzima se liga) através do nanoporo. A região indicada por 2 corresponde a uma translocação controlada por helicase dos espaçadores iSp18 através do nanoporo.
[0029] Figura 22 mostra um diagrama do constructo de DNA usado pq Gzgornq 60 Fwcu vkokpcu u«q nkicfcu rqt ogkq fc gzvtgokfcfg 5Ó cqu 4: espaçadores iSpC3 (indicados por A). Os 28 espaçadores iSpC3 são ligados rqt ogkq fc qwvtc gzvtgokfcfg § gzvtgokfcfg 7Ó fg UGS KF PQ< 45 (sequência corresponde à região B = seção poliT e região C = sequência complementar à sequência de ancoragem (tether) (SEQ ID NO: 12)). A extremidade 3’ fg UGS KF PQ< 45 guVá nkicfc cqu swcVtq espaçadores iSpC3 (indicados por D). A outra extremidade dos 4 espaçadores iSpC3 está ligada à gzVtgmifcfg 70 fg UGS KF PQ< 46o C ugswêpekc fg aneqtcigm * tether) (SEQ ID NO: 12) está ligada por meio de sua extremkfcfg 5Ó cqu ugku espaçadores kUr3: nkiafqu aqu fqku tguifwqu fg vkmina g a wm 50-colesterol-TEG.
[0030] SEQ ID NO: 1 mostra a sequência de polinucleotídeo otimizada nos códons que codifica o mutante MS-B1 do monômero MspA. Este mutante está isento da sequência de sinalização e inclui as seguintes mutações: D90N, D91N, D93N, D118R, D134R e E139K.
[0031] SEQ ID NO: 2 mostra a sequência de aminoácidos da forma madura do mutante MS-B1 do monômero MspA. Este mutante está isento da sequência de sinalização e inclui as seguintes mutações: D90N, D91N, D93N, D118R, D134R e E139K.
[0032] SEQ ID NO: 3 mostra a sequência de polinucleotídeo que codifica um monômero de -hemolisina-E111N/K147N ( -HL-NN; Stoddart et al., PNAS, 2009; 106(19): 7702-7707).
[0033] SEQ ID NO: 4 mostra a sequência de aminoácidos de um monômero de -HL-NN.
[0034] SEQ ID NOs: 5 a 7 mostram as sequências de aminoácidos de MspB, C e D.
[0035] SEQ ID NO: 8 mostra a sequência de aminoácidos da helicase Dda 1993 de fago T4 de Enterobactérias.
[0036] SEQ ID NO: 9 mostra uma sequência de polinucleotídeo usada nos Exemplos 1, 2, 3, 7 e 8.
[0037] SEQ ID NO: 10 mostra uma sequência de polinucleotídeo usada nos Exemplos 1 e 9.
[0038] SEQ ID NO: 11 mostra uma sequência de polinucleotídeo usada no Exemplo 1. SEQ ID NO: 11 está ligada por meio de sua extremidade 7’ c Vtêu espaçadorgu kUrE5 swg guV«q nkicfqu § gzVtgokfcfg 3’ fg UGS KF NO: 10.
[0039] SEQ ID NO: 12 mostra uma sequência de polinucleotídeo usada nos Exemplos 1 e 9. No Exemplo 1 a SEQ ID NO: 12 está ligada por ogkq fg uwc gzvtgokfcfg 5Ó c ugku espaçadores iSp18 ligados a dois resíduos fg vkokpc g c wo 5Ó-colesterol-TEG. No Exemplo 9 a SEQ ID NO: 12 está nkicfc"rqt"ogkq"fg"uwc"gzvtgokfcfg"5Ó"c"ugks espaçadores iSp18 apenas.
[0040] SEQ ID NO: 13 mostra a sequência de polinucleotídeo do fago X fg GpVgtqdceVfitkcUo C ugswêpekc eqpVfio woc ucnkêpekc fg 34 dcugu cfkekqpcn nkicfc § gzVtgokfcfg 5’ fc hkVc fg ugpuqo C ugswêpekc cswk oquVtcfc fi crgpcu aquela da fita de senso.
[0041] SEQ ID NO: 14 mostra uma sequência de polinucleotídeo usada nos Exemplos 2 e 3. SEQ ID NO: 14 está ligada por meio de sua gzvtgokfcfg 5’ § gzvtgokfcfg 5’ fg UGS KF PQ< 35 rqt swcvtq wpkfcfgu fg espaçador iSpC3.
[0042] SEQ ID NO: 15 mostra uma sequência de polinucleotídeo usada nos Exemplos 2 e 3. SEQ ID NO: 15 está ligada por meio de sua gzvtgokfcfg 5’ § gzvtgokfcfg 5’ fg UGS KF PQ< 36 rqt swcvtq wpkfcfgu fg espaçador iSpC3.
[0043] SEQ ID NO: 16 mostra uma sequência de polinucleotídeo wucfc pqu Gzgornqu 4 g 5 swg rqt ogkq fc gzvtgokfcfg 5’ fc ugswêpekc vgo seis espaçadores iSp18 ligados a dois tguifwqu fg vkokpc g c wo 5’-colesterol- TEG.
[0044] SEQ ID NO: 17 mostra a sequência de aminoácidos da helicase Trwc Cba.
[0045] SEQ ID NO: 18 mostra uma sequência de polinucleotídeo usada no Exemplo 3. SEQ ID NO: 18 está ligada por meio de sua extremidade 5’ § gzvtgokfcfg 5’ fg UGS KF PQ< ; rqt swcvtq wpkfcfgu fg espaçador kUrE50 Guvc ugswêpekc vgo wo hquhcvq nkicfq § uwc gzvtgokfcfg 5’ g 5 fguqzk- inosinas nas posições 1 a 5.
[0046] SEQ ID NO: 19 mostra uma sequência de polinucleotídeo usada no Exemplo 2.
[0047] SEQ ID NO: 20 mostra uma sequência de polinucleotídeo usada no Exemplo 2.
[0048] SEQ ID NOs: 21 e 22 são marcadores de posição para manter a numeração das sequências seguintes.
[0049] SEQ ID NO: 23 mostra a sequência de polinucleotídeo usada pq"Gzgornq"60"Nkicfcu"§"gzvtgokfcfg"7Ó"fguva sequência estão 28 unidades de espaçador kUrE5 ewjc únvkoc Vgo wo cfkekqpcn fg fwcu VÓU nkicfcu § gzVtgoifcfg 5’ fq iturq espaçador Nkicfqu § gzVtgoifcfg 5’ fguVc ugswêpekc estão quatro unidades de espaçador kUrE5 swg guv«q nkicfcu § gzvtgokfcfg 7Ó de SEQ ID NO: 24.
[0050] SEQ ID NO: 24 mostra a sequência de polinucleotídeo usada pq Gzgornq ;0 Niicfqu § gzVtgoifcfg 5’ fguVc ugswêpeic guV«q swcVtq unidades de espaçador iSpC3, cuja última está ligada à SEQ ID NO: 23. Niicfcu § gzVtgoifcfg 5’ fg UGS KF PQ< 45 guV«o 28 unidades de espaçador iUrE5 ewlc únVioc Vgo wo cfieiqpcn fg fwcu V’u niicfcu § gzVtgoifcfg 5’ fq grupo espaçador.
[0051] SEQ ID NO: 25 mostra uma sequência de polinucleotídeo usada no Exemplo 5. Ela tem uma base contendo carboxifluoresceína (FAM) em sua extrgoifcfg 5’0
[0052] SEQ ID NO: 26 mostra uma sequência de polinucleotídeo usada nos Exemplos 5 e 6. Ela tem uma base black-hole quencher (BHQ-1) go uwc gzVtgoifcfg 5’0
[0053] SEQ ID NO: 27 mostra uma sequência de polinucleotídeo usada nos Exemplos 5 e 6.
[0054] SEQ ID NO: 28 mostra a sequência de aminoácidos de Hel308 Mbu.
[0055] SEQ ID NO: 29 mostra uma sequência de polinucleotídeo usada no Exemplo 5. Esta sequência é conectada à SEQ ID NO: 27 à sua gzVtgoifcfg 5’ rqt swgt wo swgt swcVtq itwrqu espaçadores iSp9.
[0056] SEQ ID NO: 30 mostra uma sequência de polinucleotídeo usada no Exemplo 6. Esta sequência é conectada à SEQ ID NO: 27 à sua gzVtgoifcfg 5’ rqt wo itwrq ifUr0
[0057] SEQ ID NO: 31 mostra uma sequência de polinucleotídeo usada no Exemplo 6. Esta sequência é conectada à SEQ ID NO: 27 à sua gzvtgokfcfg"7Ó"rqt"swcvtq"itwrqu"kfUr0
[0058] SEQ ID NO: 32 mostra uma sequência de polinucleotídeo usada no Exemplo 6. Ela tem uma base contendo carboxifluoresceína (FAM) go"uwc"gzvtgokfcfg"7Ó0
[0059] SEQ ID NO: 33 mostra uma sequência de polinucleotídeo usada no Exemplo 6. Ela tem uma base contendo carboxifluoresceína (FAM) go"uwc"gzvtgokfcfg"7Ó0
[0060] SEQ ID NO: 34 mostra uma sequência de polinucleotídeo usada no Exemplo 7.
[0061] SEQ ID NO: 35 mostra uma sequência de polinucleotídeo usada nos Exemplos 7 e 8. Ela tem uma base contendo carboxifluoresceína (FAM) em sua extremidade 5’.
[0062] SEQ ID NO: 36 mostra uma sequÍncia de polinucleotÌdeo usada nos Exemplos 7 e 8.
[0063] SEQ ID NO: 37 mostra uma sequÍncia de polinucleotÌdeo usada nos Exemplos 7, 8 e 9.
[0064] SEQ ID NO: 38 mostra uma sequÍncia de polinucleotÌdeo usada nos Exemplos 8 e 10.
[0065] SEQ ID NO: 39 mostra uma sequÍncia de polinucleotÌdeo usada no Exemplo 8.
[0066] SEQ ID NO: 40 mostra uma sequÍncia de polinucleotÌdeo usada no Exemplo 8.
[0067] SEQ ID NO: 41 mostra uma sequÍncia de polinucleotÌdeo usada no Exemplo 9.
[0068] SEQ ID NO: 42 mostra uma sequÍncia de polinucleotÌdeo usada no Exemplo 9.
[0069] SEQ ID NO: 43 mostra uma sequÍncia de polinucleotÌdeo usada no Exemplo 9.
[0070] Deve ser entendido que aplicações diferentes dos produtos e métodos revelados podem ser adaptadas às necessidades específicas da técnica. Também deve ser entendido que a terminologia aqui usada é apenas para o propósito de descrever modalidades específicas da invenção, e não é pretendida para ser limitadora.
[0071] Além disso como usado neste relatório descritivo e nas reivindicações go cpgzq. cu fotocu pq ukpiwnct “wo”, “uma”, “o” e “c” incluem as referências no plural a não ser que o contexto dite claramente ao eqpVtáriOo FguVc fotoc, rot ezeorno. tefetêpekc c “wo ronkpwengoVífgq” kpenwk foku ow ocku rqnkpweneoVífequ, tehetêpekc c “wo espaçador” kpenwk foku ow mais espaçadorgu. tghgtêpekc c “woc jgnkecug” kpenwk fwcu ow ocku jgnkecugu. tghgtêpekc c “wo roto fg vtcpuogodtcpc” kpenwk foku ow ocku rotou. g semelhantes.
[0072] Todas as publicações, patentes e todos os pedidos de patente aqui citadas (citados), quer supra quer infra, são por meio deste aqui incorporadas (incorporados) em suas totalidades como referências.
[0073] A invenção fornece um método de mover uma ou mais helicases imobilizadas para além de um ou mais espaçadores em um polinucleotídeo alvo. Uma helicase está imobilizada se ela parou de se mover ao longo do polinucleotídeo. Cada espaçador tipicamente para as uma ou mais helicases. Métodos para determinar se ou não uma ou mais helicases estão imobilizadas são discutidos abaixo. As uma ou mais helicases podem estar imobilizadas antes de um espaçador. As uma ou mais helicases podem ser imobilizadas por um espaçador. As uma ou mais helicases podem estar imobilizadas em um espaçador. A invenção refere-se à movimentação das uma ou mais helicases para além, isto é, mais adiante, dos um ou mais espaçadores.
[0074] As uma ou mais helicases imobilizadas e o polinucleotídeo alvo são contactados com um poro de transmembrana e um potencial é aplicado. Como descrito com mais detalhe abaixo, o polinucleotídeo alvo move-se através do poro com o campo resultante do potencial aplicado. As uma ou mais helicases são tipicamente muito grandes para se moverem através do poro. Quando uma parte do polinucleotídeo alvo entra no poro e se move através do poro ao longo do campo resultante do potencial aplicado, as uma ou mais helicases são movidas para além do espaçador à medida que o polinucleotídeo alvo se move através do poro. Isto é porque o polinucleotídeo alvo (incluindo os um ou mais espaçadores) move-se através do poro e as uma ou mais helicases permanecem sobre o topo do poro.
[0075] Isto permite que seja controlada a posição das uma ou mais helicases no polinucleotídeo alvo. Antes de as uma ou mais helicases imobilizadas e o polinucleotídeo alvo serem contactados com um poro de transmembrana e o potencial ser aplicado, as uma ou mais helicases permanecem na posição onde elas estão imobilizadas. Mesmo na presença dos componentes necessários para facilitar o movimento de helicase (por exemplo ATP e Mg2+), as uma ou mais helicases não se moverão para além de um espaçador no polinucleotídeo alvo e não se moverão ao longo da porção do polinucleotídeo alvo no outro lado do espaçador até que elas estejam na presença do poro de transmembrana e do potencial aplicado.
[0076] As uma ou mais helicases também permanecerão na posição onde elas estão imobilizadas na presença do poro de transmembrana, mas na ausência do potencial aplicado. Neste caso, a aplicação de um potencial move as uma ou mais helicases para além de um espaçador. A aplicação de um potencial pode, portanto, ser usada para instigar o movimento das uma ou mais helicases para além de um espaçador e ao longo do polinucleotídeo alvo no outro lado do espaçador. Por exemplo, um aumento em voltagem pode ser usado para mover as uma ou mais helicases para além do espaçador.
[0077] A invenção também fornece um método de controlar o movimento de um polinucleotídeo alvo através de um poro de transmembrana. O polinucleotídeo é fornecido com um ou mais espaçadores um ou mais espaçadores. O polinucleotídeo alvo é contactado com uma ou mais helicases e as uma ou mais helicases param nos um ou mais espaçadores. Isto garante que as uma ou mais helicases permaneçam em uma ou mais posições específicas no polinucleotídeo. Isto é discutido com mais detalhe abaixo. O polinucleotídeo alvo e as uma ou mais helicases imobilizadas são contactados com um poro de transmembrana. Quando um potencial é aplicado, as uma ou mais helicases movem-se para além dos um ou mais espaçadores e ao longo da porção do polinucleotídeo no outro lado do(s) espaçador(es). Isto que as uma ou mais helicases controlem o movimento do polinucleotídeo através do poro. O potencial é também tipicamente usado para inserir o polinucleotídeo dentro do poro.
[0078] As helicases podem controlar o movimento de polinucleotídeos em pelo menos dois modos ativos de operação (quando a helicase é fornecida com todos os componentes necessários para facilitar o movimento, por exemplo ATP e Mg2+) e um modo inativo de operação (quando a helicase não é fornecida com os componentes necessários para facilitar o movimento). Quando fornecida com todos os componentes necessários para facilitar o movimento, a helicase move-se ao longo do rqnkpwengqVifgq go woc fktg>«q fg 5’ rctc 3’ qw woc fktg>«q fg 3’ rctc 5’ (dependendo da helicase), mas a orientação do polinucleotídeo dentro do poro (que é dependente de qual extremidade do polinucleotídeo é capturada pelo poro) significa que a helicase pode ser usada quer para mover o polinucleotídeo para fora do poro contra o campo aplicado quer para mover o polinucleotídeo para dentro do poro com o campo aplicado. Quando a extremidade do polinucleotídeo para a qual a helicase se move é capturada pelo poro, a helicase funciona contra a direção do campo resultante do potencial aplicado e puxa o polinucleotídeo inserido para fora do poro e para dentro do compartimento cis. Entretanto, quando a extremidade para longe da qual a helicase se move é capturada dentro do poro, a helicase funciona com a direção do campo resultante do potencial aplicado e empurra o polinucleotídeo inserido para dentro do poro e para dentro do compartimento trans.
[0079] Quando a helicase não é fornecida com os componentes necessários para facilitar o movimento ela pode ligar-se ao polinucleotídeo e atuar como um freio tornando mais lento o movimento do polinucleotídeo quando ele é puxado para dentro do poro pelo campo resultante do potencial aplicado. No modo inativo, não importa qual extremidade do polinucleotídeo é capturada, é o campo aplicado que puxa o polinucleotídeo para dentro do poro para lado trans com a helicase atuando como um freio. Quando no modo inativo, o controle do movimento do polinucleotídeo pela helicase pode ser descrito em numerosas maneiras que incluem avanço, deslizamento e frenagem.
[0080] No método da invenção, as uma ou mais helicases preferencialmente controlam o movimento do polinucleotídeo alvo através do poro com o campo resultante do potencial aplicado. Em uma modalidade preferida, as uma ou mais helicases são usadas no modo ativo e a extremidade para longe da qual as uma ou mais helicases se movem é capturada pelo poro de tal maneira que as uma ou mais helicases funcionam com o campo resultante do potencial aplicado e empurram o polinucleotídeo através do poro. Se as uma ou mais helicases movem-ug pc fktg>«q 5’ rctc 5’, c gzVtgoifcfg 70 fq rqnkpwengqVífgq alxq fi rtgfgtgpekclmgpVg ecrVwtcfc rgnq poro. Em tais modalidades, as uma ou mais helicases são movidas para além dos um ou mais espaçadorgu pc fktg>«q 5’ rctc 5’. Ug cu wmc qw mcku helicases movem-ug pc fktg>«q 5’ rctc 5’, c gzVtgmkfcfg 5’ fq polinucleotídeo alvo é preferencialmente capturada pelo poro. Em tais modalidades, as uma ou mais helicases são movidas para além dos um ou mais espaçadorgu pc fktg>«q 50 rctc 7\
[0081] Em uma outra modalidade preferida, as uma ou mais helicases são usadas no modo inativo de tal maneira que o campo aplicado puxa o polinucleotídeo alvo através do poro e as uma ou mais helicases atuam como um freio. No método da invenção, as uma ou mais helicases preferencialmente tornam mais lento ou freiam o movimento do polinucleotídeo alvo através do poro com o campo resultante do potencial aplicado. Em ambos os casos, as uma ou mais helicases são tipicamente tão grandes para se moverem através do poro e o poro empurra as uma ou mais helicases para além dos um ou mais espaçadores no polinucleotídeo à medida que o polinucleotídeo move-se através do poro com o campo resultante do potencial aplicado.
[0082] O método de controlar o movimento de um polinucleotídeo alvo através de um poro de transmembrana pode ser útil durante a caracterização do polinucleotídeo com o uso do poro, por exemplo durante o sequenciamento de fita. A invenção também fornece um método de caracterizar um polinucleotídeo alvo. O polinucleotídeo é fornecido com um ou mais espaçadores um ou mais espaçadores. O polinucleotídeo alvo é contactado com uma ou mais helicases e as uma ou mais helicases param nos um ou mais espaçadores. Isto garante que as uma ou mais helicases permaneçam em uma ou mais posições específicas no polinucleotídeo. Isto é discutido com mais detalhe abaixo. O polinucleotídeo alvo e as uma ou mais helicases imobilizadas são contactados com um poro de transmembrana. Quando um potencial é aplicado, as uma ou mais helicases movem-se para além dos um ou mais espaçadores e ao longo da porção do polinucleotídeo no outro lado do(s) espaçador(es). Isto permite que as uma ou mais helicases controlem o movimento do polinucleotídeo através do poro. O método também compreende realizar uma ou mais medições à medida que polinucleotídeo se move com relação ao poro. As medições são indicativas das uma ou mais características do polinucleotídeo.
[0083] A capacidade para imobilizar uma ou mais helicases no polinucleotídeo alvo e para mover as uma ou mais helicases para além de um ou mais espaçadores com o uso de um poro de transmembrana e um potencial aplicado é vantajosa porque permite a caracterização eficaz, como sequenciamento, do polinucleotídeo alvo. Por exemplo, as uma ou mais helicases podem ser imobilizadas perto de uma extremidade do polinucleotídeo alvo em uma sequência líder que é projetada para ser capturada pelo poro e não precisa ser caracterizada (como descrito abaixo). A imobilizada das uma ou mais helicases na sequência líder significa que as uma ou mais helicases não se movem para longe da sequência líder ao longo da parte do polinucleotídeo a ser caracterizada até que ela/elas seja(m) contactada(s) com o poro e um potencial seja aplicado. Quando as uma ou mais helicases e o polinucleotídeo são contactados com o poro e um potencial é aplicado, a sequência líder é tipicamente capturada pelo poro e move-se através do poro. Este movimento move as uma ou mais helicases para além do(s) espaçador(es) e ao longo de parte do polinucleotídeo a ser caracterizada (como descrito acima). As uma ou mais helicases podem então controlar o movimento da parte do polinucleotídeo a ser caracterizada.
[0084] Se as uma ou mais helicases não são imobilizadas na sequência líder, ela/elas não se moverá (moverão) para longe da sequência líder e ao longo da parte do polinucleotídeo a ser caracterizada. Quando as uma ou mais helicases e o polinucleotídeo são contactados com o poro e um potencial é aplicado sob estas circunstâncias, a sequência líder e algum, se não todo, o polinucleotídeo a ser caracterizado se moverão em uma maneira descontrolada através do poro ao longo do campo resultante do potencial aplicado. Apenas quando as uma ou mais helicases entram em contato com o poro ela/elas começará (começarão) a controlar o movimento da parte do polinucleotídeo a ser caracterizada como discutido acima. Qualquer parte do polinucleotídeo que se move através do poro em uma maneira descontrolada não pode ser caracterizada como descrito abaixo. Se as uma ou mais helicases movem-se para longe da sequência líder e ao longo da maior parte do restante do polinucleotídeo alvo pouco, se houver, do polinucleotídeo será caracterizado.
[0085] O uso de um ou mais espaçadores de acordo com a invenção permite também que sejam controlados o número e a posição das uma ou mais helicases no polinucleotídeo alvo como discutido com mais detalhe abaixo. Por exemplo, um número específico de helicases pode ser parado em posições específicas em adaptadores que podem ser ligados ao polinucleotídeo alvo antes da caracterização. Tais adaptadores são fornecidos pela invenção e podem ser fornecidos em um kit para caracterização. O uso de um ou mais espaçadores garante que as helicases permaneçam onde se supõe que estejam até que a caracterização comece, mesmo se o adaptador e/ou o polinucleotídeo alvo antes da caracterização estiverem na presença dos componentes necessários para facilitar o movimento da helicase (por exemplo ATP e Mg2+).
[0086] Um polinucleotídeo, como um ácido nucleico, é uma macromolécula compreendendo dois ou mais nucleotídeos. O polinucleotídeo ou ácido nucleico pode compreender qualquer combinação de quaisquer nucleotídeos. Os nucleotídeos podem ser artificiais ou de ocorrência natural. Um ou mais nucleotídeos no polinucleotídeo podem ser oxidados ou metilados. Um ou mais nucleotídeos no polinucleotídeo podem ser danificados. Por exemplo, o polinucleotídeo pode compreender um dímero de pirimidina. Tais dímeros estão tipicamente associados com dano por luz ultravioleta e são a causa principal de melanomas de pele. Um ou mais nucleotídeos no polinucleotídeo podem ser modificados, por exemplo com um marcador ou uma etiqueta. Marcadores adequados são descritos abaixo.
[0087] Um nucleotídeo tipicamente contém uma nucleobase, um açúcar e pelo menos um grupo fosfato. A nucleobase e o açúcar formam um nucleosídeo.
[0088] A nucleobase é tipicamente heterocíclica. As nucleobases incluem, mas não se limitam a, purinas e pirimidinas e mais especificamente adenina (A), guanina (G), timina (T), uracila (U) e citosina (C).
[0089] O açúcar é tipicamente um açúcar pentose. Os açúcares de nucleotídeo incluem, mas não se limitam a, ribose e desoxirribose. O açúcar é preferencialmente uma desoxirribose.
[0090] O nucleotídeo no polinucleotídeo é tipicamente um ribonucleotídeo ou desoxirribonucleotídeo. O polinucleotídeo pode compreender os seguintes nucleosídeos: adenosina, uridina, guanosina e citidina. O nucleotídeo é preferencialmente um desoxirribonucleotídeo. O polinucleotídeo preferencialmente compreende os seguintes nucleosídeos: desoxiadenosina (dA), desoxiuridina (dU) e/ou timidina (dT), desoxiguanosina (dG) e desoxicitidina (dC).
[0091] O nucleotídeo tipicamente contém um monofosfato, difosfato ou trifosfcvq0" Hquhcvqu" rqfgo" guvct" hkzcfqu" pq" ncfq" 7Ó" qw" 5Ó" fg" wo" nucleotídeo.
[0092] Os nucleotídeos adequados incluem, mas não se limitam a, adenosina-monofosfato (AMP), guanosina-monofosfato (GMP), timidina- monofosfato (TMP), uridina-monofosfato (UMP), citidina-monofosfato (CMP), adenosina-monofosfato cíclica (cAMP), guanosina-monofosfato cíclica (cGMP), desoxiadenosina-monofosfato (dAMP), desoxiguanosina- monofosfato (dGMP), desoxitimidina-monofosfato (dTMP), desoxiuridina- monofosfato (dUMP) e desoxicitidina-monofosfato (dCMP). Os nucleotídeos são preferencialmente selecionados dentre AMP, TMP, GMP, CMP, UMP, dAMP, dTMP, dGMP, dCMP e dUMP. Os nucleotídeos são com a máxima preferência selecionados dentre dAMP, dTMP, dGMP, dCMP e dUMP. O polinucleotídeo preferencialmente compreende os seguintes nucleotídeos: dAMP, dUMP e/ou dTMP, dGMP e dCMP.
[0093] Os nucleotídeos no polinucleotídeo podem ser ligados uns aos outros em qualquer maneira. Os nucleotídeos são tipicamente ligados por seus grupos açúcar e fosfato como em ácidos nucleicos. Os nucleotídeos podem ser conectados via suas nucleobases como em dímeros de pirimidina.
[0094] O polinucleotídeo pode ser um ácido nucleico. O polinucleotídeo pode ser qualquer ácido nucleico sintético conhecido na técnica, como ácido peptídeo-nucleico (PNA), ácido glicerol-nucleico (GNA), ácido treose-nucleico (TNA), ácido nucleico bloqueado (LNA) ou outros polímeros sintéticos com cadeias laterais de nucleotídeos. A cadeia principal de PNA é composta de unidades de repetição de N-(2-aminoetil)-glicina ligadas por ligações peptídicas. A cadeia principal de GNA é composta de unidades de repetição de glicol ligadas por ligações fosfodiéster. A cadeia principal de TNA é composta de unidades de repetição de açúcares treose ligadas juntas por ligações fosfodiéster. LNA é formado a partir de ribonucleotídeos como discutido acima tendo uma ponte extra que conecta o qzkiêpkq 2’ g q ectdqpq 6 pc rqt rqt>«q tkdqugo
[0095] O polinucleotídeo é com a máxima preferência ácido nucleico ribonucleico (RNA) ou ácido desoxirribonucleico (DNA).
[0096] O polinucleotídeo preferencialmente não compreende nenhuns nucleotídeos abásicos (isto é, nucleotídeos que estão isentos de uma nucleobase), exceto nos um ou mais espaçadores. O polinucleotídeo preferencialmente não compreende nenhuns espaçadores C3 (isto é nucleotídeo que está isento de uma nucleobase e um açúcar), exceto nos um ou mais espaçadores.
[0097] O polinucleotídeo pode ser de qualquer comprimento. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser de comprimento de pelo menos 10, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 150, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300, pelo menos 400 ou pelo menos 500 nucleotídeos. O polinucleotídeo pode ser de comprimento de 1.000 ou mais nucleotídeos, 5.000 ou mais nucleotídeos ou 100.000 ou mais nucleotídeos.
[0098] A helicase pode mover-se ao longo de todo o ou de apenas parte do polinucleotídeo alvo no método da invenção. O todo ou apenas parte do polinucleotídeo alvo pode ser caracterizado (caracterizada) com o uso do método da invenção.
[0099] O polinucleotídeo alvo pode ser de fita única. Pelo menos uma porção do polinucleotídeo alvo é preferencialmente de fita dupla. As helicases tipicamente ligam-se aos polinucleotídeos de fita única. Se pelo menos uma porção do polinucleotídeo alvo é de fita dupla, o polinucleotídeo alvo preferencialmente compreende uma região de fita única ou uma região não hibridizada. As uma ou mais helicases são capazes de se ligarem à região de fita única ou a uma fita da região não hibridizada. O polinucleotídeo alvo preferencialmente compreende uma ou mais regiões de fita única ou uma ou mais regiões não hibridizadas.
[00100] Os um ou mais espaçadores são preferencialmente incluídos na região de fita única ou na região não hibridizada do polinucleotídeo alvo. O polinucleotídeo alvo pode compreender mais que uma região de fita única ou mais que uma região não hibridizada. O polinucleotídeo alvo pode compreender uma região de fita única ou uma região não hibridizada dentro de sua sequência e/ou em uma ou ambas extremidades. Os um ou mais espaçadores podem estar incluídos na região de fita dupla do polinucleotídeo alvo.
[00101] Se as uma ou mais helicases usadas no método se movem na fktg>«q 70 rctc 50. q rqnkpwengqVifgq cnxq rtgfgtgpekclogpVg eqortggpfg woc região de fita única ou uma região não hibridizada em sua gzvtgokfcfg 7Ó0 Ug cu woc qw ocku jgnkecugu wucfcu pq ofiVqfq ug oqxgo pc fktg>«q 50 rctc 7\ q polinucleotídeo alvo preferencialmente compreende uma região de fita única ou uma região não hibridizada go uwc gzvtgokfcfg 5Ó0 Ug cu woc qw ocku helicases são usadas no modo inativo (isto é como um freio), não importa onde a região de fita única ou a região não hibridizada está localizada.
[00102] A região de fita única preferencialmente compreende uma sequência líder que preferencialmente entra dentro do poro. A sequência líder facilita o método da invenção. A sequência líder é projetada para preferencialmente entrar dentro do poro da transmembrana e assim facilitar o movimento de polinucleotídeo alvo através do poro. A sequência líder tipicamente compreende um polímero. O polímero está preferencialmente negativamente carregado. O polímero é preferencialmente um polinucleotídeo, como DNA ou RNA, um polinucleotídeo modificado (como DNA abásico), PNA, LNA, poli(glicol etilênico) (PEG) ou um polipeptídeo. A sequência líder preferencialmente compreende um polinucleotídeo e mais preferencialmente compreende um polinucleotídeo de fita única. A sequência líder pode compreender qualquer um dos polinucleotídeos discutidos acima. A sequência líder de fita única com a máxima preferência compreende uma fita única de DNA, tal como uma seção de poli-dT. A sequência líder preferencialmente compreende os um ou mais espaçadores.
[00103] A sequência líder pode ser de qualquer comprimento, mas é tipicamente de comprimento de10 a 150 nucleotídeos, como de 20 a 150 nucleotídeos. O comprimento da sequência líder tipicamente depende do poro de transmembrana usado no método.
[00104] Se pelo menos uma porção do polinucleotídeo alvo é de fita dupla, as duas fitas da porção de fita dupla são preferencialmente ligadas com o uso de uma porção de ligação por ponte, como um grampo de cabelo. Isto facilita o método de caracterização da invenção. A ligação das duas fitas do polinucleotídeo alvo por uma porção de ligação por ponte permite que ambas as fitas do polinucleotídeo sejam caracterizadas, como sequenciadas, pelo poro de transmembrana. As duas fitas se desibridizam à medida que o polinucleotídeo move-se através do poro como um polinucleotídeo de fita única. Este método é vantajoso porque duplica a quantidade de informação obtida a partir de um único polinucleotídeo alvo de fita dupla. Além disso, rqtswg c ugswêpekc pc fíVc fg òcpVkuugpuqó eqorngogpVct fi pgeguuctkcogpVg qrtqiqpcn § ugswêpekc fc fkVc fg òugpuqó. c kpfotoc>«q fcu fwcu fiVcu rqfg ugt informaticamente combinada. Desta forma, este mecanismo fornece uma capacidade de revisão que fornece observações muito mais (confiáveis.
[00105] Pode ser usada qualquer uma das modalidades reveladas no Pedido Internacional n° PCT/GB2012/051786 (publicado como WO 2013/014451). A porção de ligação por ponte tipicamente liga covalentemente as duas fitas do polinucleotídeo. A porção de ligação por ponte pode ser qualquer uma que é capaz de ligar as duas fitas do polinucleotídeo alvo, desde que a porção de ligação por ponte não interfira com o movimento do polinucleotídeo através do poro de transmembrana. As porções de ligação por ponte adequadas incluem, mas não se limitam a um ligante polimérico, um ligante químico, um polinucleotídeo ou um polipeptídeo. Preferencialmente, a porção de ligação por ponte compreende DNA, RNA, DNA modificado (como DNA abásico), RNA, PNA, LNA ou poli(glicol etilênico) (PEG). A porção de ligação por ponte é mais preferencialmente DNA ou RNA. A porção de ligação por ponte pode compreender os um ou mais espaçadores.
[00106] A porção de ligação por ponte é com a máxima preferência uma alça de grampo de cabelo. A alça de grampo de cabelo pode ser formada a partir de qualquer um dos polinucleotídeos revelados acima. A alça de grampo de cabelo ou a alça da alça de grampo de cabelo é tipicamente de comprimento de cerca de 4 a cerca de 100 nucleotídeos, preferencialmente de comprimento de cerca de 4 a cerca de 8 nucleotídeos.
[00107] A porção de ligação por ponte está ligada às duas fitas do polinucleotídeo alvo por qualquer meio adequado conhecido na técnica. A porção de ligação por ponte pode ser sintetizada separadamente e quimicamente ligada ou enzimaticamente ligada ao polinucleotídeo alvo. Alternativamente, a porção de ligação por ponte pode ser gerada no processamento do polinucleotídeo alvo.
[00108] A porção de ligação por ponte está ligada ao polinucleotídeo alvo na ou próximo de uma extremidade do polinucleotídeo alvo. A porção de ligação por ponte é preferencialmente ligada ao polinucleotídeo alvo dentro de10 nucleotídeos da extremidade do polinucleotídeo.
[00109] Os um ou mais espaçadores são preferencialmente posicionados de tal modo que ele/eles para(m) as uma ou mais helicases e evita(m) que ela/elas se mova(m) ao longo do polinucleotídeo alvo a ser controlado ou caracterizado. Por exemplo, os um ou mais espaçadores estão preferencialmente localizados entre uma sequência líder e o polinucleotídeo alvo a ser controlado ou caracterizado, por exemplo dentro de uma sequência líder em uma extremidade do polinucleotídeo. A sequência líder tipicamente entra no poro com o campo resultante do potencial aplicado e as uma ou mais helicases são movidas para além dos um ou mais espaçadores à medida que o polinucleotídeo move-se através do poro. As uma ou mais helicases podem então controlar o movimento do restante do polinucleotídeo alvo através do poro e facilitar sua caracterização.
[00110] Na modalidade de máxima preferência , o polinucleotídeo alvo compreende uma porção de fita dupla que está ligada a uma extremidade por uma porção de ligação por ponte, como uma alça de grampo de cabelo, e uma porção de fita única na outra extremidade da porção de ligação por ponte que compreende uma sequência líder. Os um ou mais espaçadores podem estar presentes na sequência líder e/ou na porção de ligação por ponte.
[00111] O polinucleotídeo alvo está presente em qualquer amostra adequada. A invenção é tipicamente realizada em uma amostra que conhecidamente contém ou é suspeita de conter o polinucleotídeo alvo. A invenção pode ser realizada em uma amostra para confirmar a identidade dos um ou mais polinucleotídeos alvos cuja presença na amostra é conhecida ou suposta.
[00112] A amostra pode ser uma amostra biológica. A invenção pode ser realizada in vitro em uma amostra obtida de ou extraída de qualquer organismo ou micro-organismo. O organismo ou micro-organismo é tipicamente archaeal, procariótico ou eucariótico ou e tipicamente pertence a um dos cinco reinos: plantae, animalia, fungi, monera e protista. A invenção pode ser realizada in vitro em uma amostra obtida de ou extraída de qualquer vírus. A amostra é preferencialmente uma amostra fluida. A amostra tipicamente compreende um fluido de corpo do paciente. A amostra pode ser urina, linfa, saliva, muco ou fluido amniótico mas é preferencialmente sangue, plasma ou soro. Tipicamente, a amostra é de origem humana, mas alternativamente pode ser de outro animal mamífero como de animais comercialmente criados como cavalos, gado bovino, ovelhas ou porcos ou pode ser alternativamente de animais de estimação como cães e gatos. Alternativamente uma amostra de origem vegetal é tipicamente obtida de cultura agrícola comercial, como cereal, legume, fruta ou hortaliça, por exemplo trigo, quinoa, cevada, aveia, canola, milho, soja, arroz, bananeiras, macieiras, tomateiros, batateiras, parreiras, tabaco, feijões, lentilhas, cana-de- açúcar, cacau, algodoeiro.
[00113] A amostra pode ser uma amostra não biológica. A amostra não biológica é preferencialmente uma amostra fluida. Exemplos de uma amostra não biológica incluem fluidos cirúrgicos, água como água potável, água do mar ou água de rio, e reagentes para testes em laboratório.
[00114] A amostra é tipicamente processada antes de ser analisada, por exemplo por centrifugação ou por passagem através de uma membrana que filtra células ou moléculas indesejadas, como células vermelhas do sangue. A amostra pode ser medida imediatamente após ter sido colhida. A amostra também pode ser tipicamente armazenada antes da análise, preferencialmente abaixo de -70flC.
[00115] Os um ou mais espaçadores são incluídos no polinucleotídeo alvo. Os um ou mais espaçadores são preferencialmente parte do polinucleotídeo alvo, por exemplo ele/eles interrompe(m) a sequência de polinucleotídeo. Os um ou mais espaçadores preferencialmente não são parte de uma ou mais moléculas bloqueadoras, como bombas de velocidade, hibridizadas com o polinucleotídeo alvo.
[00116] Pode haver qualquer número de espaçadores no polinucleotídeo alvo, como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais espaçadores. Há preferencialmente dois, quatro ou seis espaçadores no polinucleotídeo alvo. Pode haver o espaçador em regiões diferente do polinucleotídeo alvo, como um espaçador na sequência líder e um espaçador na alça de grampo de cabelo.
[00117] Cada um dos um ou mais espaçadores fornece uma barreira de energia que as uma ou mais helicases não podem ultrapassar mesmo no modo ativo. Os um ou mais espaçadores podem imobilizar as uma ou mais helicases pela redução da tração da helicase (por exemplo pela remoção das bases dos nucleotídeos no polinucleotídeo alvo) ou pelo bloqueio físico das uma ou mais helicases (por exemplo com o uso de um grupo químico volumoso) .
[00118] Os um ou mais espaçadores podem compreender qualquer molécula ou combinação de moléculas que para as uma ou mais helicases. Os um ou mais espaçadores podem compreender qualquer molécula ou combinação de moléculas que impede que uma ou mais helicases se movimentem ao longo do polinucleotídeo alvo. É fácil determinar se ou não as uma ou mais helicases são imobilizadas em um ou mais espaçadores na ausência de um poro de transmembrana e um potencial aplicado. Por exemplo, isto pode ser testado como mostrado nos Exemplos, por exemplo a capacidade da helicase para se mover para além de um espaçador e deslocar uma fita complementar de DNA pode ser medida por PAGE.
[00119] Os um ou mais espaçadores tipicamente compreendem uma molécula linear, como um polímero. Os um ou mais espaçadores tipicamente têm uma estrutura diferente do polinucleotídeo alvo. Por exemplo, se o polinucleotídeo alvo é DNA, os um ou mais espaçadores tipicamente não são DNA. Em particular, se o polinucleotídeo alvo é ácido desoxirribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA), os um ou mais espaçadores preferencialmente compreendem ácido peptídeo-nucleico (PNA), ácido glicerol-nucleico (GNA), ácido treose-nucleico (TNA), ácido nucleico bloqueado (LNA) ou um polímero sintético com cadeias laterais de nucleotídeos.
[00120] Os um ou mais espaçadores preferencialmente compreendem um ou mais nitroindóis, como um ou mais 5-nitroindóis, uma ou mais inosinas, uma ou mais acridinas, uma ou mais 2-aminopurinas, uma ou mais 2-6-diaminopurinas, uma ou mais 5-bromo-desoxiuridinas, uma ou mais timidinas invertidas (dTs invertidas), uma ou mais didesoxitimidinas invertidas (ddTs), uma ou mais didesoxicitidinas (ddCs), uma ou mais 5- metilcitidinas, uma ou mais 5-jkftqzkogvknekvkfkpcu."woc"qw"ocku"dcugu"fg"4Ó- O-Metil-RNA, uma ou mais Iso-desoxicitidinas (Iso-dCs), uma ou mais Iso- desoxiguanosinas (Iso-dGs), um ou mais grupos iSpC3 (isto é nucleotídeos que estão isentos de açúcar e uma base), um ou mais grupos fotocliváveis (PC), um ou mais grupos hexanodiol, um ou mais grupos espaçador 9 (iSp9), um ou mais grupos espaçador 18 (iSp18), um polímero ou uma ou mais conexões tiol. Os um ou mais espaçadores podem compreender qualquer combinação destes grupos. Muitos destes grupos estão comercialmente disponíveis junto à IDT® (Integrated DNA Technologies®).
[00121] Os um ou mais espaçadores podem conter qualquer número destes grupos. Por exemplo, para 2-aminopurinas, 2-6-diaminopurinas, 5- bromo-desoxiuridinas, dTs invertidas, ddTs, ddCs, 5-metilcitidinas, 5- jkftqzkogvknekvkfkpcu." dcugu" fg" 4Ó-O-Metil-RNA, Iso-dCs, Iso-dGs, grupos iSpC3, grupos PC, grupos hexanodiol e conexões tiol, os um ou mais espaçadores preferencialmente compreendem 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais. Os um ou mais espaçadores preferencialmente compreendem 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais grupos iSp9. Os um ou mais espaçadores preferencialmente compreendem 2, 3, 4, 5 ou 6 ou mais grupos iSp18. O espaçador de máxima preferência é quatro grupos iSp18.
[00122] O polímero é preferencialmente um polipeptídeo ou um poli(glicol etilênico) (PEG). O polipeptídeo preferencialmente compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais aminoácidos. O PEG preferencialmente compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais unidades monoméricas.
[00123] Os um ou mais espaçadores preferencialmente compreendem um ou mais nucleotídeos abásicos (isto é nucleotídeos isentos de uma nucleobase), como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais nucleotídeos abásicos. A nucleobase pode ser substituída por -H (idSp) ou -OH no nucleotídeo abásico. Os espaçadores abásicos podem ser inseridos nos polinucleotídeos alvos pela remoção das nucleobases de um ou mais nucleotídeos adjacentes. Por exemplo, os polinucleotídeos podem ser modificados para incluir 3-metiladenina, 7-metilguanina, 1,N6-etenoadenina- inosina ou hipoxantina e as nucleobases podem ser removidas destes nucleotídeos com o uso de Alquil-Adenina-DNA-Glicosilase de Humano (hAAG). Alternativamente, os polinucleotídeos podem ser modificados para incluir uracila e as nucleobases podem ser removidas com Uracil-DNA- Glicosilase (UDG). Em uma modalidade, os um ou mais espaçadores não compreendem nenhuns nucleotídeos abásicos.
[00124] As uma ou mais helicases podem ser imobilizadas por (isto é antes) ou em cada um dos espaçadores de molécula linear. Se espaçadores de molécula linear são usados, o polinucleotídeo alvo é preferencialmente fornecido com a região de fita dupla de polinucleotídeo adjacente à extremidade de cada espaçador para além da qual são para serem movidas as uma ou mais helicases. A região de fita dupla tipicamente ajuda a imobilizar as uma ou mais helicases no espaçador adjacente. A presença da(s) região (regiões) de fita dupla é particularmente preferida se o método é realizado em uma concentração de sal de cerca de 100 mM ou menor. Cada região de fita dupla é tipicamente de comprimento de pelo menos 10, como pelo menos 12, nucleotídeos. Se o polinucleotídeo alvo usado na invenção é de fita única, a região de fita dupla pode ser formada por hibridização de um polinucleotídeo mais curto com uma região adjacente a um espaçador. O polinucleotídeo mais curto é tipicamente formado a partir dos mesmos nucleotídeos que os do polinucleotídeo alvo, mas pode ser formado a partir de nucleotídeos diferentes Por exemplo, o polinucleotídeo mais curto pode ser formado de LNA.
[00125] Se espaçadores de molécula linear são usados, o polinucleotídeo alvo é preferencialmente fornecido com uma molécula bloqueadora na extremidade de cada espaçador oposta à extremidade para além da qual são para serem movidas as uma ou mais helicases. Isto pode ajudar a garantir que uma ou mais helicases permaneçam imobilizadas em cada espaçador. Também pode ajudar a manter as uma ou mais helicases no polinucleotídeo alvo no caso no qual ela/elas se difunde(m) em solução. A molécula bloqueadora pode compreender qualquer um dos grupos químicos discutidos abaixo que fisicamente causam a imobilizada das uma ou mais helicases. A molécula bloqueadora pode ser uma região de fita dupla de polinucleotídeo.
[00126] Os um ou mais espaçadores preferencialmente compreendem um ou mais grupos químicos que fisicamente causam a imobilizada das uma ou mais helicases. Os um ou mais grupos químicos são preferencialmente um ou mais grupos químicos pendentes. Os um ou mais grupos químicos podem ser ligados a uma ou mais nucleobases no polinucleotídeo alvo. Os um ou mais grupos químicos podem ser ligados à cadeia principal do polinucleotídeo alvo. Qualquer número destes grupos químicos pode estar presente, como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais. Os grupos adequados incluem, mas não se limitam a, grupos fluoróforos, estreptavidina e/ou biotina, colesterol, azul de metileno, dinitrofenóis (DNPs), digoxigenina e/ou antidigoxigenina e dibenzilciclo-octino.
[00127] Espaçadores diferentes no polinucleotídeo alvo podem compreender moléculas paradoras diferentes. Por exemplo, um espaçador pode compreender uma das moléculas lineares discutidas acima e outro espaçador pode compreender um ou mais grupos químicos que fisicamente causam a imobilizada das uma ou mais helicases. Um espaçador pode compreender qualquer uma das moléculas lineares discutidas acima e um ou mais grupos químicos que fisicamente causam a imobilizada das uma ou mais helicases, como um ou mais abásicos e um fluoróforo.
[00128] Espaçadores adequados podem ser projetados dependendo do tipo do polinucleotídeo alvo e das condições sob as quais o método da invenção é realizado. A maioria das helicases liga-se e move-se ao longo de DNA e assim pode ser imobilizada com o uso de qualquer coisa que não seja DNA. As moléculas adequadas são discutidas acima.
[00129] O método da invenção é preferencialmente realizado na presença de nucleotídeos livres e/ou na presença de um cofator de helicase. Isto é discutido com mais detalhe abaixo. Na ausência do poro de transmembrana e de um potencial aplicado, os um ou mais espaçadores são preferencialmente capazes de imobilizar as uma ou mais helicases na presença de nucleotídeos livres e/ou na presença de um cofator de helicase.
[00130] Se o método da invenção é realizado na presença de nucleotídeos livres e um cofator de helicase como discutido abaixo (de tal modo que as uma ou mais helicases estejam no modo ativo), um ou mais espaçadores mais longos são tipicamente usados para garantir que as uma ou mais helicases sejam imobilizadas no polinucleotídeo alvo antes de elas serem contactadas com o poro de transmembrana e um potencial ser aplicado. Um ou mais espaçadores mais curtos podem ser usados na ausência de nucleotídeos livres e um cofator de helicase (de tal modo que as uma ou mais helicases estejam no modo inativo).
[00131] A concentração de sal também afeta a capacidade dos um ou mais espaçadores para imobilizar as uma ou mais helicases. Na ausência do poro de transmembrana e de um potencial aplicado, os um ou mais espaçadores são preferencialmente capazes de imobilizar as uma ou mais helicases em uma concentração de sal de cerca de 100 mM ou menor. Quando mais alta a concentração de sal usada no método da invenção, mais curtos são os um ou mais espaçadores tipicamente usados e vice- versa.
[00132] Combinações preferidas de características são mostradas na tabela 1 abaixo. Tabela 1
[00133] Como discutido com mais detalhe abaixo, o método pode envolver mover duas ou mais helicases para além de um espaçador. Em tais situações, o comprimento do espaçador é tipicamente aumentado para evitar que a helicase de trás empurre a helicase da frente para além do espaçador na ausência do poro e do potencial aplicado. Se o método envolve mover duas ou mais helicases para além de um ou mais espaçadores, os comprimentos do espaçador discutidos acima podem ser aumentados pelo menos 1,5 vezes, como 2 vezes, 2,5 vezes ou 3 vezes. Por exemplo, se o método envolve mover duas ou mais helicases para além de um ou mais espaçadores, os comprimentos do espaçador na terceira coluna da Tabela 1 acima podem ser aumentados 1,5 vezes, 2 vezes, 2,5 vezes ou 3 vezes.
[00134] As duas ou mais helicases também podem estar separadas de tal modo que cada uma tenha seus próprios um ou mais espaçadores. Isto é discutido com mais detalhe abaixo.
[00135] Qualquer helicase pode ser usada na invenção. A helicase pode ser ou ser derivada de uma helicase Hel308, uma helicase RecD, como helicase TraI ou uma helicase TrwC, uma helicase XPD ou uma helicase Dda. A helicase pode ser qualquer uma das helicases, helicases modificadas ou constructos de helicase revelados nos Pedidos Internacionais n°s (publicado como WO 2013/057495); (publicado como WO 2013/098562); (publicado como WO2013098561); PCT/GB2013/051925; PCT/GB2013/051924 e PCT/GB2013/051928; e no Pedido UK (Reino Unido) n° 1318464,3 depositado aos 18 de Outubro de 2013.
[00136] A helicase preferencialmente compreende a sequência mostrada em SEQ ID NO: 17 (Trwc Cba) ou sua variante, a sequência mostrada em SEQ ID NO: 28 (Hel308 Mbu) ou como sua variante ou a sequência mostrada em SEQ ID NO: 8 (Dda) ou uma sua variante. Variantes podem diferir das sequências nativas em qualquer das maneiras discutidas abaixo para poro de transmembrana. Uma variante preferida de SEQ ID NO: 8 compreende E94C/A360C e então *ΔO3+I3I4 *kuVq fi fgng>«q fg O3 g então adição de G1 e G2).
[00137] Qualquer número de helicases pode ser movido para além dos um ou mais espaçadores de acordo com a invenção. Por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais helicases podem ser movidas para além dos um ou mais espaçadores. Em algumas modalidades, números diferentes de helicases podem ser movidos para além de cada espaçador. Por exemplo, se duas helicases são imobilizadas com o uso de dois espaçadores separados, uma helicase (a primeira helicase) pode ser movida para além do primeiro espaçador, mas duas helicases (as primeira e segunda helicases) podem ser movidas para além do segundo espaçador.
[00138] O método da invenção preferencialmente compreende mover duas ou mais, como três ou mais ou quatro ou mais, helicases imobilizadas para além de um ou mais espaçadores. As duas ou mais helicases são tipicamente helicases iguais. As duas ou mais helicases podem ser helicases diferentes.
[00139] As duas ou mais helicases podem ser qualquer combinação das helicases mencionadas acima. As duas ou mais helicases podem ser duas ou mais helicases Dda. As duas ou mais helicases podem ser uma ou mais helicases Dda e uma ou duas helicases TrwC. As duas ou mais helicases podem ser variantes diferentes da mesma helicase.
[00140] As duas ou mais helicases são preferencialmente ligadas uma à outra. As duas ou mais helicases são mais preferencialmente covalentemente ligadas uma à outra. As helicases podem ser ligadas em qualquer ordem e com o uso de qualquer método. Os constructos de helicase preferidos para uso na invenção são descritos nos Pedidos Internacionais n°s PCT/GB2013/051925; PCT/GB2013/051924 e PCT/GB2013/051928; e em Pedido UK (Reino Unido) n° 1318464,3 depositado aos 18 de Outubro de 2013.
[00141] O método compreende aplicar um potencial através do poro. O potencial aplicado pode ser um potencial de voltagem. O método pode compreender aplicar um potencial de voltagem através do poro. O método pode compreender aumentar a voltagem aplicada através do poro. Nesta modalidade, o potencial de voltagem inicial é tipicamente insuficiente para mover as uma ou mais helicases para além dos um ou mais espaçadores e o potencial de voltagem aumentado é tipicamente suficiente mover as uma ou mais helicases para além dos um ou mais espaçadores. Alternativamente, o potencial aplicado pode ser um potencial químico. Um exemplo deste é o uso de um gradiente de sal através de uma camada anfifílica. Um gradiente de sal é revelado em Holden et al., J. Am. Chem. Soc. 2007 Jul 11;129(27):8650-5. Em alguns casos, a corrente que passa através do poro à medida que o polinucleotídeo alvo move-se com respeito ao poro é usada para determinar a sequência do polinucleotídeo alvo. Isto é sequenciamento de fita.
[00142] Um poro de transmembrana é uma estrutura que cruza a membrana em alguma extensão. Ele permite que íons hidratados conduzidos por um potencial aplicado fluam através ou dentro da membrana. O poro de transmembrana tipicamente cruza a membrana inteira de modo que os íons hidratados possam fluir de um lado da membrana para o outro lado da membrana. Entretanto, o poro de transmembrana não tem que cruzar a membrana. Ele pode estar fechado em uma extremidade. Por exemplo, o poro pode ser um poço na membrana ao longo do qual ou para dentro do qual íons hidratados podem fluir.
[00143] Qualquer poro de transmembrana pode ser usado na invenção. O poro pode ser biológico ou artificial. Poros adequados incluem, mas não se limitam a, poros de proteína, poros de polinucleotídeo e poros no estado sólido.
[00144] Qualquer membrana pode ser usada de acordo com a invenção. Membranas adequadas são bem conhecidas na técnica. A membrana é preferencialmente uma camada anfifílica. Uma camada anfifílica é uma camada formada de moléculas anfifílicas, como fosfolipídios, que têm tanto pelo menos uma porção hidrofílica quanto pelo menos uma porção lipofílica ou hidrofóbica. As moléculas anfifílicas podem ser sintéticas ou de ocorrência natural. Moléculas anfifílicas de ocorrência não natural ou moléculas anfifílicas que formam uma monocamada são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, copolímeros em bloco (Gonzalez-Perez et al., Langmuir, 2009, 25, 10447-10450). Os copolímeros em bloco são materiais poliméricos nos quais uma ou mais subunidades monoméricas são polimerizadas juntas para produzir uma única cadeia polimérica. Os copolímeros em bloco tipicamente têm propriedades que são fornecidas por cada subunidade monomérica. Entretanto, um copolímero em bloco pode ter propriedades peculiares que os polímeros formados das subunidades individuais não possuem. Copolímeros em bloco podem ser modificados de tal modo que uma das subunidades monoméricas é hidrofóbica (isto é lipofílica), enquanto que a(s) outra(s) subunidade(s) é (são) hidrofílicas enquanto em meios aquosos. Neste caso, o copolímero em bloco pode possuir propriedades anfifílicas e pode formar uma estrutura que imita uma membrana biológica. O copolímero em bloco pode ser um dibloco (consistindo em duas subunidades monoméricas), mas também pode ser construído com mais que duas subunidades monoméricas para formar arranjos mais complexos que se comportam como moléculas anfifílicas. O copolímero pode ser um copolímero em tribloco, tetrabloco ou pentabloco.
[00145] A camada anfifílica pode ser uma monocamada ou uma bicamada. A camada anfifílica é tipicamente uma bicamada lipídica planar ou uma bicamada suportada.
[00146] A camada anfifílica é tipicamente um bicamada lipídica. As bicamadas lipídicas são modelos de membranas celulares e servem como plataformas excelentes para uma variedade de estudos experimentais. Por exemplo, as bicamadas lipídicas podem ser usadas para investigação in vitro de proteínas de membrana por registro de canal unitário. Alternativamente, as bicamadas lipídicas podem ser usadas como biossensores para detectar a presença de uma variedade de substâncias. A bicamada lipídica pode ser qualquer bicamada lipídica. Bicamadas lipídicas adequadas incluem, mas não se limitam a, uma bicamada lipídica planar, uma bicamada lipídica suportada ou um lipossoma. A bicamada lipídica é preferencialmente uma bicamada lipídica planar. Bicamadas lipídicas adequadas são reveladas em Pedido Internacional n° PCT/GB08/000563 (publicado como WO 2008/102121), Pedido Internacional n° PCT/GB08/004127 (publicado como WO 2009/077734) e Pedido Internacional n° PCT/GB2006/001057 (publicado como WO 2006/100484).
[00147] Métodos para formar as bicamadas lipídicas são conhecidos na técnica. Métodos adequados são revelados nos Exemplos. Bicamadas lipídicas são comumente formadas pelo método de Montal e Mueller (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1972; 69: 3561-3566), no qual uma monocamada lipídica é transportada em uma interface de solução aquosa/ar para além de qualquer lado de uma abertura que é perpendicular àquela interface.
[00148] O método de Montal & Mueller é popular porque é método eficaz em termos de custo e relativamente fácil para formar bicamadas lipídicas de boa qualidade que são adequadas para inserção em poro de proteína. Outros métodos comuns de formação de bicamada incluem tipdipping (imersão de ponta de micropipeta), painting bilayers (bicamadas pintadas) e patch-clamping (clampeamento de canais iônicos) de bicamadas de lipossoma.
[00149] Em uma modalidade preferida, a bicamada lipídica é formada como descrito em Pedido Internacional n° PCT/GB08/004127 (publicado como WO 2009/077734).
[00150] Em uma outra modalidade preferida, a membrana é uma camada no estado sólido. Uma camada no estado sólido não é de origem biológica. Em outras palavras, uma camada no estado sólido não é derivada de ou isolada de um ambiente biológico como um organismo ou uma célula, ou uma versão sinteticamente produzida de uma estrutura biologicamente disponível. As camadas no estado sólido podem ser formadas de ambos materiais orgânicos e inorgânicos que incluem, mas não se limitam a, materiais microeletrônicos, materiais isolantes como Si3N4, A12O3, e SiO, polímeros orgânicos e inorgânicos como poliamida, plásticos como Teflon® ou elastômeros como borracha de silicone curada por adição de dois componentes, e vidros. A camada no estado sólido pode ser formada de camadas monoatômicas, como grafeno, ou camadas que são apenas de uns poucos átomos de espessura. As camadas de grafeno adequadas são reveladas em Pedido Internacional n° PCT/US2008/010637 (publicado como WO 2009/035647).
[00151] O método é tipicamente realizado com o uso de (i) uma camada anfifílica artificial compreendendo um poro, (ii) uma bicamada lipídica de ocorrência natural, isolada, compreendendo um poro, ou (iii) uma célula tendo um poro inserido nela. O método é tipicamente realizado com o uso de uma camada anfifílica artificial, como uma bicamada lipídica artificial. A camada pode compreender outras proteínas de transmembrana e/ou de intramembrana e também outras moléculas em adição ao poro. Aparelho adequado e condições adequadas são discutidos abaixo. O método da invenção é tipicamente realizado in vitro.
[00152] O polinucleotídeo alvo é preferencialmente acoplado à membrana. Isto pode ser feito com o uso de qualquer método conhecido. Se a membrana é uma camada anfifílica, como uma bicamada lipídica (como discutido em detalhe acima), o polinucleotídeo alvo é preferencialmente acoplado à membrana via um polipeptídeo presente na membrana ou uma âncora hidrofóbica presente na membrana. A âncora hidrofóbica é preferencialmente um lipídio, ácido graxo, esterol, nanotubo de carbonos ou aminoácido.
[00153] O polinucleotídeo alvo pode ser acoplado diretamente à membrana. Pode ser acoplado à membrana com o uso de quaisquer meios revelados no Pedido Internacional n° PCT/GB2012/051191 (publicado como WO 2012/164270). O polinucleotídeo alvo é preferencialmente acoplado à membrana via um ligante. Os ligantes preferidos incluem, mas não se limitam a, polímeros, como polinucleotídeos, poli(glicóis etilênicos) (PEGs) e polipeptídeos. Se um polinucleotídeo alvo é acoplado diretamente à membrana, então alguns dados serão perdidos porque o processamento de caracterização não pode continuar até a extremidade do polinucleotídeo devido à distância entre a membrana e o poro e/ou a helicase. Se um ligante é usado, então o polinucleotídeo alvo pode ser processado até a completitude. Se um ligante é usado, o ligante pode ser fixado ao polinucleotídeo alvo em qualquer posição. O ligante é tipicamente fixado ao polinucleotídeo alvo no polímero cauda.
[00154] O acoplamento pode ser estável ou transiente. Para determinadas aplicações, é preferida a natureza transiente do acoplamento. Se woc oqnfiewnc fg ceqrncogpVq guVáxgn fi hkzcfc swgt pc gzVtgoifcfg 3’ swgt pc gzVtgoifcfg 70 fg um rqnkpwengqVífgq, gpV«q cniwpu fcfqu ugt«q rgtfkfqu porque o procedimento de caracterização não pode continuar até a extremidade do polinucleotídeo devido à distância entre a membrana e o poro e/ou a helicase. Se o acoplamento é transiente, então quando a extremidade acoplada torna-se aleatoriamente livre da membrana, então o polinucleotídeo pode ser processado até a completitude. Grupos químicos que formam ligações estáveis ou transientes com a membrana são discutidos em detalhe abaixo. O polinucleotídeo pode ser transientemente acoplado a uma camada anfifílica, como uma bicamada lipídica com o uso de colesterol ou uma cadeia acila graxa. Qualquer cadeia acila graxa que tem um comprimento de 6 a 30 átomos de carbono, como ácido hexadecanoico, pode ser usada.
[00155] Em modalidades preferidas, o polinucleotídeo é acoplado a uma camada anfifílica. O acoplamento de polinucleotídeos às bicamadas lipídicas sintéticas tem sido realizado previamente com várias estratégias de ancoragem (tethering) diferentes . Estas são resumidas na tabela 2 abaixo. Tabela 2
[00156] Polinucleotídeos podem ser funcionalizados com o uso de um fosforoamidito modificado na reação de síntese, que é facilmente compatível para a adição de grupos reativos, como grupos tiol, colesterol, lipídio e biotina. Estes grupos químicos de ligação diferentes dão um conjunto de opções de ligação para os polinucleotídeos. Cada grupo de modificação diferente ancora o polinucleotídeo em uma maneira um pouco diferente e o acoplamento nem sempre é permanente de modo que concede tempos de permanência diferentes ao polinucleotídeo na membrana. As vantagens de acoplamento transiente são discutidas acima.
[00157] O acoplamento de polinucleotídeos também pode ser realizado por numerosos outros meios desde que um grupo reativo possa ser adicionado ao polinucleotídeo. A adição de grupos reativos a cada extremidade de DNA tem sido relatada previamente. Um grupo tiol pode ser adicionado à gzVtgokfcfg 70 fg uuFPC eqo q wuq fg rqnipwengqVifgq-cinase e CVRyU (Grant, G. P. e P. Z. Qin (2007). "A facile method for attaching nitroxide spin labels at the 5' terminus of nucleic acids." Nucleic Acids Res. 35(10): e77). Uma seleção mais diversa de grupos químicos, como biotina, tióis e fluóforos, pode ser adicionada com o uso de transferase terminal para incorporar qniiqpwengqVifgqu mqfihiecfqu § gzVtgmifcfg 3’ fg uuFPC (Mwmct, Co, R. Tchen, et al. (1988). "Nonradioactive labeling of synthetic oligonucleotide probes with terminal desoxynucleotidyl transferase." Anal. Biochem. 169(2): 376-82).
[00158] Alternativamente, o grupo reativo poderia ser considerado uma região curta no polinucleotídeo em relação à uma já acoplada à membrana, de modo que a ligação possa ser realizada via hibridização. A região poderia ser parte do polinucleotídeo ou ligada a ele. A ligação de pedaços pequenos de ssDNA tem sido relatada com o uso de T4-RNA-ligase I (Troutt, A. B., M. G. McHeyzer-Williams, et al. (1992). "Ligation-anchored PCR: a simple amplification technique with single-sided specificity." Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89(20): 9823-5).
[00159] Com a máxima preferência, o polinucleotídeo é acoplado à membrana com o uso de um polinucleotídeo etiquetado com colesterol que hibrizida com o polinucleotídeo.
[00160] O poro de transmembrana é preferencialmente um poro de proteína de transmembrana. O poro de proteína de transmembrana é um polipeptídeo ou uma coleção de polipeptídeos que permite que íons hidratados, como um analito, fluam de um lado da membrana para o outro lado da membrana. Na presente invenção, o poro de proteína de transmembrana é capaz de formar um poro que permite que íons hidratados conduzidos por um potencial aplicado fluam de um lado da membrana para outro lado da membrana. O poro de proteína de transmembrana preferencialmente permite que analito como nucleotídeos flua de um lado da membrana, como uma bicamada lipídica, para o outro lado da membrana. O poro de proteína de transmembrana permite que um polinucleotídeo ou ácido nucleico, como DNA ou RNA, seja movido através do poro.
[00161] O poro de proteína de transmembrana pode ser um monômero ou um oligômero. O poro é preferencialmente composto de várias subunidades de repetição, como 6, 7, 8 ou 9 subunidades. O poro é preferencialmente um poro hexamérico, heptamérico, octamérico ou nonamérico.
[00162] O poro de proteína de transmembrana tipicamente compreende um cilindro ou canal através do qual os íons podem fluir. As subunidades do poro tipicamente circundam um eixo central e produzem um canal ou cilindro-β fg Vtcpuogodtcpc qw wo ecpcn qw hgkzg de hélices-g fg transmembrana.
[00163] O cilindro ou canal do poro de proteína de transmembrana tipicamente compreende aminoácidos que facilitam a interação com o analito, como nucleotídeos, polinucleotídeos ou ácidos nucleicos. Estes aminoácidos estão preferencialmente localizados próximos de uma constrição do cilindro ou canal. O poro de proteína de transmembrana tipicamente compreende um ou mais aminoácidos positivamente carregados, como arginina, lisina ou histidina, ou aminoácidos aromáticos, como tirosina ou triptofano. Estes aminoácidos tipicamente facilitam a interação entre o poro e os nucleotídeos, polinucleotídeos ou ácidos nucleicos.
[00164] Os poros de proteína de transmembrana para uso de acordo com a invenção podem ser derivados de poros de cilindro-β qw fg rqtqu fg feixe de hélices-g0 Qu rqtqu fg eknkpftq-β eqortggpfgo wo eknkpftq qw ecpcn que é formado de fitas-β0 Qu rqtqu fg eknkpftq- β kpenwgo. ocu p«q ug nkokvco c. β-vqzkpcu. eqoq g-hemolisina, toxina do antraz e leucocidinas, e porinas/proteínas de membrana externa de bactérias, como porina de Mycobacterium smegmatis (Msp), por exemplo MspA, MspB, MspC ou MspD, lisenina, porina F de membrana externa (OmpF), porina G de membrana externa (OmpG), fosfolipase A de membrana externa e lipoproteína autotransportadora de Neisseria (NalP). Poros de feixe de hélices- compreendem um cilindro ou canal que é formado de hélices-c. Poros de feixe de hélices-g cfgswcfqu kpenwgo. ocu p«q ug nkokvco c. proteínas de membrana interna e proteínas-g fg ogodtcpc kpvgtpc. eqoq WZA e toxina ClyA. O poro de transmembrana pode ser derivado de lisenina. Os poros adequados derivados de lisenina são revelados em Pedido Internacional n° PCT/GB2013/050667 (publicado como WO 2013/153359). O rqtq"fg"vtcpuogodtcpc"rqfg"ugt"fgtkxcfq"fg"Our"qw"fg"g-jgoqnkukpc"*g-HL).
[00165] O poro de proteína de transmembrana é preferencialmente derivado de Msp, preferencialmente de MspA. Um tal poro será oligomérico e tipicamente compreende 7, 8, 9 ou 10 monômeros derivados de Msp. O poro pode ser um poro homo-oligomérico derivado de Msp compreendendo monômeros idênticos. Alternativamente, o poro pode ser um poro hetero- oligomérico derivado de Msp compreendendo pelo menos um monômero que difere dos outros. Preferencialmente o poro é derivado de MspA ou um seu homólogo ou parálogo.
[00166] Um monômero derivado de Msp tipicamente compreende a sequência mostrada em SEQ ID NO: 2 ou uma sua variante. SEQ ID NO: 2 é o mutante MS-(B1)8 do monômero MspA. Inclui as seguintes mutações: D90N, D91N, D93N, D118R, D134R e E139K. Uma variante de SEQ ID NO: 2 é um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos que varia daquela de SEQ ID NO: 2 e que mantém sua capacidade para formar um poro. A capacidade de uma variante para formar um poro pode ser testada com o uso de qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, a variante pode ser integrada em uma camada anfifílica juntamente com outras subunidades apropriadas e pode ser determinada a sua capacidade para oligomerizar para formar um poro. São conhecidos na técnica métodos para inserir subunidades nas membranas, como camadas anfifílicas. Por exemplo, subunidades podem ser suspensas em uma forma purificada em uma solução que contém uma bicamada lipídica de tal modo que elas se difundam para a bicamada lipídica e sejam inseridas por ligação na bicamada lipídica e por montagem em um estado funcional. Alternativamente, subunidades podem ser diretamente inseridas na membrana coo q wuq fq ofiVqfq fg “pick and place ” *“ugngekqpct g rqukekqpct”+ fguetkVq go OA Jqnfgp. Jo Dc{ng{ J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 6502-6503 e Pedido Internacional n° PCT/GB2006/001057 (publicado como WO 2006/100484).
[00167] Em relação ao comprimento inteiro da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, uma variante preferencialmente será pelo menos 50% homóloga àquela sequência com base na identidade de aminoácido. Mais preferencialmente, a variante pode ser pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% e mais preferencialmente pelo menos 95%, 97% ou 99% homóloga com base na identidade de aminoácido com relação à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 em relação à sequência inteira. Pode haver pelo menos 80%, por exemplo pelo menos 85%, 90% ou 95%, de identidade de aminoácido em relação a um segmento de 100 ou mais, por exemplo 125, 150, 175 ou 200 ou mais, aminoácidos contíguos *“jooonoikc cnvc’^
[00168] Métodos padrão na técnica podem ser usados para determinar a homologia. Por exemplo o Pacote UWGCG fornece o programa BESTFIT que pode ser utilizado para calcular a homologia, por exemplo usado em configurações padrão (Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395). Os algoritmos PILEUP e BLAST podem ser usados para calcular a homologia ou alinhar as sequências (como identificar resíduos equivalentes ou sequências correspondentes (tipicamente em suas configurações padrão)), por exemplo como descrito em Altschul S. F. (1993) J. Mol. Evol. 36:290300; Altschul, S.F et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Programa de computador para realizar análises por BLAST está publicamente disponível ogfkcpVg q "Nctiond EgnVgt hot DkqVgejpqnqi{ KnhotocVkon” (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
[00169] SEQ ID NO: 2 é o mutante MS-(B1)8 do monômero MspA. A variante pode compreender qualquer uma das mutações nos monômeros MspB, C ou D em comparação com MspA. As formas maduras dentre MspB, C e D são mostradas em SEQ ID NOs: 5 a 7. Em particular, a variante pode compreender a seguinte substituição presente em MspB: A138P. A variante pode compreender uma ou mais dentre as seguintes substituições presentes em MspC: A96G, N102E e A138P. A variante pode compreender uma ou mais dentre as seguintes substituições presentes em MspD: Deleção de G1, L2V, E5Q, L8V, D13G, W21A, D22E, K47T, I49H, I68V, D91G, A96Q, N102D, S103T, V104I, S136K e G141A. A variante pode compreender combinações de uma ou mais das mutações e substituições dentre Msp B, C e D. A variante preferencialmente compreende a mutação L88N. Uma variante de SEQ ID NO: 2 tem a mutação L88N em adição a todas as mutações de MS-(B1)8 e é chamada de MS-(B2)8. O poro usado na invenção é preferencialmente MS-(B2)8. A variante adicionalmente preferida compreende as mutações G75S/G77S/L88N/Q126R. A variante de SEQ ID NO: 2 tem as mutações G75S/G77S/L88N/Q126R em adição a todas as mutações de MS-(B1)8 e é chamada de MS-(B2C)8. O poro usado na invenção é preferencialmente MS-(B2)8 ou MS-(B2C)8.
[00170] Substituições de aminoácido podem ser realizadas na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 em adição àquelas discutidas acima, por exemplo até 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 ou 30 substituições. Substituições conservativas substituem aminoácidos por outros aminoácidos de estrutura química simular, propriedades químicas similares ou volume de cadeia lateral similar. Os aminoácidos introduzidos podem ter polaridade, hidrofilicidade, hidrofobicidade, basicidade, acidez, neutralidade ou carga similar à dos aminoácidos que substituem. Alternativamente, a substituição conservativa pode introduzir outro aminoácido que é aromático ou alifático no lugar de um aminoácido aromático ou alifático pré-existente. Alterações conservativas de aminoácido são bem conhecidas na técnica e podem ser selecionada de acordo com as propriedades dos 20 aminoácidos conforme definidas na tabela 3 abaixo. Se os aminoácidos tiverem polaridade similar, isto também pode ser determinado com referência à escala de hidropatia para as cadeias laterais de aminoácido na tabela 4. Tabela 3 - Propriedades químicas de aminoácidos
Tabela 4 - Escala de hidropatia 
[00171] Um ou mais resíduos de aminoácido da sequência de SEQ ID NO: 2 podem ser adicionalmente deletados dos polipeptídeos descritos acima. Até 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 ou 30 resíduos podem ser deletados, ou mais.
[00172] As variantes podem incluir fragmentos de SEQ ID NO: 2. Tais fragmentos mantém a atividade de formação de poro. Os fragmentos podem ser de comprimento de pelo menos 50, 100, 150 ou 200 aminoácidos. Tais fragmentos podem ser usados para produzir os poros. Um fragmento preferencialmente compreende o domínio de formação de poro de SEQ ID NO: 2. Os fragmentos precisam incluir um dos resíduos 88, 90, 91, 105, 118 e 134 de SEQ ID NO: 2. Tipicamente, os fragmentos incluem todos os resíduos 88, 90, 91, 105, 118 e 134 de SEQ ID NO: 2.
[00173] Um ou mais aminoácidos podem ser alternativa ou adicionalmente adicionados aos polipeptídeos descritos acima. Uma extensão pode ser fornecida à terminação amino ou terminação carboxila da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou uma sua variante ou um seu fragmento. A extensão pode ser muito curta, por exemplo de comprimento de 1 a 10 aminoácidos. Alternativamente, a extensão pode ser mais longa, por exemplo até 50 ou 100 aminoácidos. Uma proteína carreadora pode ser fusionada em uma sequência de aminoácidos de acordo com a invenção. Outras proteínas de fusão são discutidas com mais detalhe abaixo.
[00174] Como discutido acima, uma variante é um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos que varia daquela de SEQ ID NO: 2 e que mantém sua capacidade para formar um poro. Uma variante tipicamente contém as regiões de SEQ ID NO: 2 que são responsáveis pela formação de poro. A capacidade de formação de poro de Msp, que contém um cilindro-β. fi concedida pelas folhas-β go ecfc uwdwpkfcfgo Woc xctkcpVg fg UGS KF PQ< 2 tipicamente compreende as regiões em SEQ ID NO: 2 que formam folhas-β Uma ou mais modificações podem ser feitas nas regiões de SEQ ID NO: 2 que formam folhas-β fgufg swg c xctkcpvg ocpvgpjc uwc ecrcekfcfg rctc formar um poro. Uma variante de SEQ ID NO: 2 preferencialmente inclui uma ou mais modificações, como substituições, adições ou deleções, dentro de suas hélices-g glqw tgikõgu fg cn>Co
[00175] Os monômeros derivados de Msp podem ser modificados para ajudar em sua identificação ou purificação, por exemplo pela adição de resíduos de histidina (uma etiqueta his), resíduo de ácido aspártico (uma etiqueta asp), uma etiqueta estreptavidina ou uma etiqueta flag, ou pela adição de uma sequência de sinalização para promover sua secreção de uma célula onde o polipeptídeo na natureza não contém uma tal sequência. Uma alternativa à introdução de uma etiqueta genética é quimicamente reagir uma etiqueta em uma posição nativa ou modificada do poro. Um exemplo disto seria reagir um reagente de deslocamento em gel com uma cisteína modificada no lado externo do poro. Isto tem sido demonstrado como um método para seimobilizar hetero-oligômeros de hemolisina (Chem. Biol. 1997 Jul; 4(7):497-505).
[00176] O monômero derivado de Msp pode ser marcado com um marcador revelador. O marcador revelador pode ser qualquer marcador adequado que permite que o poro seja detectado. Os marcadores adequados são descritos abaixo.
[00177] O monômero derivado de Msp também pode ser produzido com o uso de D-aminoácidos. Por exemplo, o monômero derivado de Msp pode compreender uma mistura de L-aminoácidos e D-aminoácidos. Isto é convencional na técnica para produzir tais proteínas ou peptídeos.
[00178] O monômero derivado de Msp contém uma ou mais modificações específicas para facilitar a discriminação de nucleotídeo. O monômero derivado de Msp também pode conter outras modificações não específicas desde que elas não interfiram com a formação de poro. Numerosas modificações não específicas de cadeia lateral são conhecidas na técnica e podem ser feitas nas cadeias laterais do monômero derivado de Msp. Tais modificações incluem, por exemplo, alquilação redutora de aminoácidos pela reação com um aldeído seguida pela redução com NaBH4, amidinação com metilacetimidato ou acilação com anidrido acético.
[00179] O monômero derivado de Msp pode ser produzido com o uso de métodos padrão conhecidos na técnica. O monômero derivado de Msp pode ser produzido sinteticamente ou por meio recombinante. Por exemplo, o poro pode ser sintetizado por tradução e transcrição in vitro (IVTT). Métodos adequados para produzir poros são discutidos nos Pedidos Internacionais n°s PCT/GB09/001690 (publicado como WO 2010/004273), PCT/GB09/001679 (publicado como WO 2010/004265) ou PCT/GB10/000133 (publicado como WO 2010/086603). São discutidos métodos para inserir poros em membranas.
[00180] O poro de proteína de transmembrana também é preferencialmente derivado de g-jgoqnkukpc"*g-JN+0"Q"rqtq"fg"g-HL de tipo selvagem é formado de sete monômeros idênticos ou subunidades idênticas (isto é ele é heptamérico). A sequência de um monômero ou de uma uwdwpkfcfg" fg"g-hemolisina-NN é mostrada em SEQ ID NO: 4. O poro de proteína de transmembrana preferencialmente compreende sete monômeros cada um compreendendo a sequência mostrada em SEQ ID NO: 4 ou uma sua variante. Aminoácidos 1, 7 a 21, 31 a 34, 45 a 51, 63 a 66, 72, 92 a 97, 104 a 111, 124 a 136, 149 a 153, 160 a 164, 173 a 206, 210 a 213, 217, 218, 223 a 228, 236 a 242, 262 to 265, 272 a 274, 287 a 290 e 294 de SEQ ID NO: 4 formam regiões de alça. Resíduos 113 e 147 de SEQ ID NO: 4 formam parte de uma constrição do cilindro ou canal de g-HL.
[00181] Em tais modalidades, um poro compreendendo sete proteínas ou monômeros cada um(a) compreendendo a sequência mostrada em SEQ ID NO: 4 ou uma sua variante são preferencialmente usados no método da invenção. As sete proteínas podem ser iguais (homo-heptâmero) ou diferentes (hetero-heptâmero).
[00182] Uma variante de SEQ ID NO: 4 é uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos que varia daquela de SEQ ID NO: 4 e que mantém sua capacidade de formação de poro. A capacidade de uma variante para formar um poro pode ser testada com o uso de qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, a variante pode ser inserida em uma camada anfifílica, como uma bicamada lipídica, juntamente com outras subunidades apropriadas e sua capacidade para oligomerizar para formar um poro pode ser determinada. São conhecidos na técnica métodos para inserir subunidades em camadas anfifílicas, como bicamadas lipídicas. Métodos adequados são discutidos acima.
[00183] A variante pode incluir modificações que facilitam a ligação covalente à ou a interação com a helicase. A variante preferencialmente compreende um ou mais resíduos de cisteína reativos que facilitam a ligação à helicase. Por exemplo, a variante pode incluir uma cisteína em uma ou mais posições 8, 9, 17, 18, 19, 44, 45, 50, 51, 237, 239 e 287 e/ou na terminação amino ou na terminação carboxila de SEQ ID NO: 4. As variantes preferidas compreendem uma substituição do resíduo na posição 8, 9, 17, 237, 239 e 287 de SEQ ID NO: 4 com cisteína (A8C, T9C, N17C, K237C, S239C ou E287C). A variante é preferencialmente qualquer uma dentre as variantes descritas nos Pedidos Internacionais n°s PCT/GB09/001690 (publicado como WO 2010/004273), PCT/GB09/001679 (publicado como WO 2010/004265) ou PCT/GB10/000133 (publicado como WO 2010/086603).
[00184] A variante também pode incluir modificações que facilitam qualquer interação com nucleotídeos.
[00185] A variante pode ser uma variante de ocorrência natural que é expressada na natureza por um organismo, por exemplo por uma bactéria Staphylococcus. Alternativamente, a variante pode ser expressada in vitro ou recombinantemente por uma bactéria como Escherichia coli. Variantes também incluem variantes que não ocorrem na natureza produzidas por tecnologia recombinante. Em relação ao comprimento inteiro da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, uma variante preferencialmente será pelo menos 50% homóloga àquela sequência com base na identidade de aminoácido. Mais preferencialmente, um polipeptídeo variante pode ser pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% e mais preferencialmente pelo menos 95%, 97% ou 99% homólogo com base na identidade de aminoácido com relação à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 em relação à sequência inteira. Pode haver pelo menos 80%, por exemplo pelo menos 85%, 90% ou 95%, de identidade de aminoácido em relação a um segmento de 200 ou mais, por exemplo 230, 250, 270 ou 280 ou ocku. fg cokpqáekfqu eqpViiwqu *“jqoqlqikc clVc’^ Jqoqnqikc rqfg ugt determinada como discutido acima.
[00186] Substituições de aminoácido podem ser feitas na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 em adição àquelas discutidas acima, por exemplo até 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 ou 30 substituições. Substituições conservativas podem ser feitas como discutido acima.
[00187] Um ou mais resíduos de aminoácido da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 podem ser adicionalmente deletados dos polipeptídeos descritos acima. Até 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 ou 30 resíduos podem ser deletados, ou mais.
[00188] Variantes podem ser fragmentos de SEQ ID NO: 4. Tais fragmentos mantém a atividade de formação de poro. Os fragmentos podem ser de comprimento de pelo menos 50, 100, 200 ou 250 aminoácidos. Um fragmento preferencialmente compreende o domínio de formação de poro de SEQ ID NO: 4. Os fragmentos tipicamente incluem resíduos 119, 121, 135. 113 e 139 de SEQ ID NO: 4.
[00189] Um ou mais aminoácidos podem ser alternativamente ou adicionalmente adicionados aos polipeptídeos descritos acima. Uma extensão pode ser fornecida à terminação amino ou à terminação carboxila da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou uma sua variante ou um seu fragmento. A extensão pode ser muito curta, por exemplo de comprimento de 1 a 10 aminoácidos. Alternativamente, a extensão pode ser mais longa, por exemplo até 50 ou 100 aminoácidos. Uma proteína carreadora pode ser fusionada em um poro ou uma variante.
[00190] Como discutido acima, uma variante de SEQ ID NO: 4 é uma subunidade que tem uma sequência de aminoácidos que varia daquela de SEQ ID NO: 4 e que mantém a sua capacidade para formar um poro. Uma variante tipicamente contém as regiões de SEQ ID NO: 4 que são responsáveis pela formação de poro. A capacidade de formação de poro de g-HL, que contém um cilindro-β. fi fomgekfc rgncu fiVcu-β go ecfc uwdwpkfcfgo Woc xctkcnVg fg SEQ ID NO: 4 tipicamente compreende as regiões em SEQ ID NO: 4 que formam fitas-βo Qu cmknqáekfqu fg UGS KF PQ< 6 swg fotoco fiVcu-β u«q discutidos acima. Uma ou mais modificações podem ser feitas nas regiões de SEQ ID NO: 4 que formam fitas-β fgufg swg c xctkcnvg tguwnvcnvg ocnvgnjc sua capacidade para um poro. Modificações específicas que podem ser feitas nas regiões de fita-β fg UGS KF PQ< 6 u«o fkuewvkfcu cekoc.
[00191] Uma variante de SEQ ID NO: 4 preferencialmente inclui uma ou mais modificações, como substituições, adições ou deleções, dentro de suas hélices-g glow tgikõgu fg cn>co Coknoáekfqu swg fotoco jfinkegu-g g alças são discutidos acima.
[00192] A variante pode ser modificada para auxiliar sua identificação ou purificação como discutido acima.
[00193] Rotgu fgtkxcfou fg g-HL podem ser feitos como discutido acima com referência aos pores derivados de Msp.
[00194] Em algumas modalidades, o poro de proteína de transmembrana é quimicamente modificado. O poro pode ser quimicamente modificado em qualquer maneira e em qualquer sítio. O poro de proteína de transmembrana é preferencialmente quimicamente modificado por ligação de uma molécula a uma ou mais cisteínas (ligação de cisteína), ligação de uma molécula a uma ou mais lisinas, ligação de uma molécula a um ou mais aminoácidos não naturais, modificação por enzima de um epítopo ou modificação de uma terminação. Métodos adequados para realizar tais modificações são bem conhecidos na técnica. O poro de proteína de transmembrana pode ser quimicamente modificado pela ligação de qualquer molécula. Por exemplo, o poro pode ser quimicamente modificado pela ligação de um corante ou um fluoróforo.
[00195] Qualquer número de monômeros no poro pode ser quimicamente modificado. Um ou mais, como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, dos monômeros é preferencialmente quimicamente modificado como discutido acima.
[00196] A reatividade de resíduos de cisteína pode ser aumentada pela modificação dos resíduos adjacentes. Por exemplo, os grupos básicos de resíduos de arginina, histidina ou lisina flanqueadores alterarão o pKa do grupo tiol de cisteínas para aquele do grupos S- mais reativo. A reatividade de resíduos de cisteína pode ser protegida por grupos protetores de tiol como dTNB. Estes podem ser reagidos com um ou mais resíduos de cisteína do poro antes de um ligante ser ligado.
[00197] A molécula (com a qual o poro é quimicamente modificado) pode ser ligada diretamente ao poro ou ligada via um ligante como revelado em Pedidos Internacionais N°s PCT/GB09/001690 (publicado como WO 2010/004273), PCT/GB09/001679 (publicado como WO 2010/004265) ou PCT/GB10/000133 (publicado como WO 2010/086603).
[00198] A helicase pode ser covalentemente ligada ao poro. A helicase é preferencialmente não ligada covalentemente ao poro.
[00199] Qualquer uma das proteínas aqui descritas pode ser modificada para ajudar em sua identificação ou purificação, por exemplo pela adição de resíduos de (uma etiqueta his), resíduo de ácido aspártico (uma etiqueta asp), uma etiqueta estreptavidina, uma etiqueta flag, uma etiqueta SUMO, uma etiqueta GST ou uma etiqueta MBP, ou pela adição de uma sequência de sinalização para favorecer sua secreção de uma célula onde o polipeptídeo não contém de modo natural uma tal sequência. Uma alternativa à introdução de uma etiqueta genética é quimicamente reagir uma etiqueta em uma posição nativa ou modificada em uma helicase ou um poro. Um exemplo disto seria reagir um reagente de deslocamento em gel com uma cisteína modificada no lado externo do poro. Isto tem sido demonstrado como um método para seimobilizar hetero-oligômeros de hemolisina (Chem. Biol. 1997 Jul; 4 (7):497-505).
[00200] O polinucleotídeo alvo, a helicase ou o poro pode ser marcado (marcada) com um marcador revelador. O marcador revelador pode ser qualquer marcador adequado que pode ser detectado. Marcadores adequados incluem, mas não se limitam a, moléculas fluorescentes, radioisótopos, 125I, 35S, enzimas, anticorpos, antígenos, polinucleotídeos e ligantes como biotina.
[00201] Proteínas podem ser preparadas sinteticamente ou por meio recombinante. Por exemplo, as proteínas podem ser sintetizadas por tradução e transcrição in vitro (IVTT). A sequência de aminoácidos da proteína pode ser modificada para incluir aminoácidos de ocorrência não natural ou para aumentar a estabilidade da proteína. Quando uma proteína é produzida por meio sintético, os aminoácidos podem ser introduzidos durante a produção. As proteínas também podem ser alteradas após produção quer sintética quer recombinante.
[00202] As proteínas também podem ser produzidas com o uso de D- aminoácidos. Por exemplo, o poro ou a helicase pode compreender uma mistura de L-aminoácidos e D-aminoácidos. Isto é convencional na técnica para produzir tais proteínas ou peptídeos.
[00203] As proteínas usadas na invenção também podem conter outras modificações não específicas desde que não interfiram com a função das proteínas. Numerosas modificações não específicas são conhecidas na técnica e podem ser realizadas nas cadeias laterais da(s) proteína(s). Tais modificações incluem, por exemplo, alquilação redutora de aminoácidos pela reação com um aldeído seguida pela redução com NaBH4, amidinação com metilacetimidato ou acilação com anidrido acético.
[00204] As sequências de polinucleotídeo que codificam uma proteína podem ser derivadas e replicadas com o uso de métodos padrão na técnica. As sequências de polinucleotídeo que codificam uma proteína podem ser expressadas em uma célula hospedeira bacteriana com o uso de técnicas padrão na técnica. A proteína pode ser produzida em uma célula por expressão in situ do polipeptídeo a partir de um vetor de expressão recombinante. O vetor de expressão recombinante opcionalmente traz um promotor induzível para controlar a expressão do polipeptídeo. Estes métodos são descritos em Sambrook, J. e Russell, D. (2001). “Oqngewhct Enqpkpi< C NcdqtcVqt{ Ocpwcn”, 3a Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, EUA.
[00205] O gene que codifica a sequência de interesse pode ser amplificado com o uso de PCR que envolvem iniciadores específicos. As sequências amplificadas podem ser então incorporadas em um vetor replicável recombinante como um vetor de clonagem. O vetor pode ser usado para replicar o polinucleotídeo em uma célula hospedeira compatível. Desta forma as sequências de polinucleotídeo podem ser preparadas pela introdução de um polinucleotídeo que codifica a sequência de interesse em um vetor replicável, pela introdução do vetor em uma célula hospedeira compatível, e pelo crescimento da célula hospedeira sob condições que produzem a replicação do vetor. O vetor pode ser recuperado da célula hospedeira. As células hospedeiras adequadas para clonagem de polinucleotídeos são conhecidas na técnica e descritas com mais detalhe abaixo.
[00206] A sequência de polinucleotídeo pode ser clonada em um vetor de expressão adequado. Em um vetor de expressão, a sequência de polinucleotídeo é tipicamente funcionalmente ligada a uma sequência de controle que é capaz de realizar a expressão da sequencia codificara pela célula hospedeira. Tais vetores de expressão podem ser usados para expressar um constructo.
[00207] Q Vgtoq “fwpekqpalmepVe Ikicfq” tefete-se a uma justaposição na qual os componentes descritos estão em uma relação que permite que funcionem em sua maneira pretendida. Uma sequência de controle “fwpekqpalmepVe Ikiafa” a woc uesuêpeka eqfkfíeafqta euVá Ikiafa eo uoa Vai maneira que a expressão da sequência codificadora é realizada sob condições compatíveis com as sequências de controle. Cópias múltiplas do mesmo polinucleotídeo ou do polinucleotídeo diferente podem ser introduzidas no vetor.
[00208] O vetor de expressão pode ser então introduzido em uma célula hospedeira adequada. Desta forma, um constructo pode ser produzido pela inserção de uma sequência de polinucleotídeo que codifica um constructo em um vetor de expressão, pela introdução do vetor em uma célula hospedeira compatível, e pelo crescimento da célula hospedeira sob condições que produzem a expressão da sequência de polinucleotídeo.
[00209] Os vetores podem ser por exemplo, vetores plasmídeo, vírus ou fago fornecidos com uma origem de replicação, opcionalmente um promotor para a expressão da dita sequência de polinucleotídeo e opcionalmente um regulador do promotor. Os vetores podem conter um ou mais genes marcadores selecionados, por exemplo um gene de resistência à ampicilina. Promotores e outros sinais de regulação de expressão podem ser selecionados para serem compatíveis com a célula hospedeira para a qual o vetor de expressão é projetado. Um promotor T7, trc, lac, ara ou AL é tipicamente usado.
[00210] A célula hospedeira tipicamente expressa o constructo em um nível alto. As células hospedeiras transformadas com uma sequência de polinucleotídeo serão escolhidas para serem compatíveis cm o vetor de expressão usado para transformar a célula. A célula hospedeira é tipicamente bacteriana e preferencialmente E. coli. Qualquer célula com um fago n lisogênico DE3, por exemplo Rosetta2(DE3)pLys, C41 (DE3), BL21 (DE3), JM109 (DE3), B834 (DE3), TUNER, Origami e Origami B, pode expressar um vector compreendendo o promotor T7.
[00211] Proteínas podem ser introduzidas em grande escala após a purificação por qualquer sistema de cromatografia líquida de proteína dos organismos produtores de proteína ou após a expressão recombinante. Sistemas de cromatografia líquida de proteína típicos incluem FPLC, sistemas AKTA, o sistema Bio-Cad, o sistema Bio-Rad BioLogic e o sistema Gilson HPLC system.
[00212] O método da invenção envolve medir uma ou mais características do polinucleotídeo alvo. O método pode envolver medir duas, três, quatro ou cinco ou mais características do polinucleotídeo alvo. As uma ou mais características são preferencialmente selecionadas dentre (i) o comprimento do polinucleotídeo alvo, (ii) a identidade do polinucleotídeo alvo, (iii) a sequência do polinucleotídeo alvo, (iv) a estrutura secundária do polinucleotídeo alvo e (v) esteja ou não modificado o polinucleotídeo alvo. Qualquer combinação de (i) a (v) pode ser medida de acordo com a invenção.
[00213] Para (i), o comprimento do polinucleotídeo pode ser medido por exemplo por determinação do número de interações entre o polinucleotídeo alvo e o poro ou a durante de interação entre o polinucleotídeo alvo e o poro.
[00214] Para (ii), a identidade do polinucleotídeo pode ser medida em numerosas maneiras. A identidade do polinucleotídeo pode ser medida juntamente com a medição da sequência do polinucleotídeo alvo ou sem medição da sequência do polinucleotídeo alvo. A primeira é fácil; o polinucleotídeo é sequenciado e com isso identificado. A última pode ser feita em várias maneiras. Por exemplo, a presença de um motivo específico no polinucleotídeo pode ser medida (sem medir a sequência restante do polinucleotídeo). Alternativamente, a medição de um sinal elétrico e/ou óptico específico no método pode identificar o polinucleotídeo alvo como proveniente de uma fonte específica.
[00215] Para (iii), a sequência do polinucleotídeo pode ser determinada como previamente descrito. Métodos de sequenciamento adequados, particularmente aqueles que usam medições elétricas, são descritos em Stoddart D et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12;106(19):7702-7, Lieberman KR et al., J. Am. Chem. Soc. 2010;132(50):17961-72, e em Pedido Internacional n° WO 2000/28312.
[00216] Para (iv), a estrutura secundária pode ser medida em uma variedade de maneiras. Por exemplo, se o método envolve uma medição elétrica, a estrutura secundária pode ser medida com o uso de uma alteração no tempo de permanência ou uma alteração no fluxo de corrente através do poro. Isto permite que regiões de polinucleotídeo de fita única e de fita dupla sejam diferenciadas.
[00217] Para (v), a presença ou ausência de qualquer modificação pode ser medida. O método preferencialmente compreende determinar se o polinucleotídeo alvo está ou não modificado por metilação, por oxidação, por dano, com uma ou mais proteínas ou com um ou mais marcadores, uma ou mais etiquetas ou um ou mais espaçadores. Modificações específicas resultarão em interações específicas com o poro que podem ser medidas com o uso dos métodos descritos abaixo. Por exemplo, metilcitosina pode ser distinguida de citosina com base no fluxo de corrente através do poro durante sua interação com cada nucleotídeo.
[00218] Pode ser realizada uma variedade de tipos diferentes de medições. Esta inclui sem limitação: medições elétricas e medições ópticas. As medições ópticas possíveis incluem: medições de corrente, medições de impedância, medições por tunelamento (Ivanov AP et al., Nano Lett. 2011 Jan 12;11(1):279-85), e medições por FET (Pedido Internacional n° WO 2005/124888). As medições ópticas podem ser combinadas com as medições elétricas (Soni GV et al., Rev. Sci. Instrum. 2010 Jan;81(1):014301). A medição pode ser uma medição de corrente de transmembrana como medição de fluxo de corrente iônica através do poro.
[00219] As medições elétricas podem ser realizadas com o uso de equipamento de registro de canal unitário padrão como descrito em Stoddart D et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12;106(19):7702-7, Lieberman KR et al., J. Am. Chem. Soc. 2010;132(50):17961-72, e Pedido Internacional n° WO- 2000/28312. Alternativamente, as medições elétricas podem ser realizadas com o uso de um sistema de multicanais como descrito no Pedido Internacional n°
[00220] WO-2009/077734 e no Pedido Internacional n° WO- 2011/067559.
[00221] O método pode ser realizado com o uso de qualquer aparelho que é adequado para investigar um sistema de membrana/poro no qual um poro está presente em uma membrana. O método pode ser realizado com o uso de qualquer aparelho que é adequado para detectar poro de transmembrana. Por exemplo, o aparelho compreende um compartimento compreendendo uma solução aquosa e uma barreira que separa o compartimento em duas seções. A barreira tipicamente tem uma abertura na qual a membrana contendo o poro é formada. Alternativamente a barreira forma a membrana na qual o poro está presente.
[00222] O métodos podem ser realizados com o uso do aparelho descrito no Pedido Internacional n° PCT/GB08/000562 (WO 2008/102120).
[00223] O métodos podem envolver medir a corrente que passa através do poro à medida que o polinucleotídeo move-se com respeito ao poro. Portanto o aparelho também pode compreender um circuito elétrico capaz de aplicar um potencial e mediar um sinal elétrico através da membrana e do poro. Os métodos podem ser realizados com o uso de um clampeamento de sinais iônicos (patch clamp) ou um clampeamento de voltagem (voltage clamp). Os métodos preferencialmente envolvem o uso de um clampeamento de voltagem.
[00224] O métodos da invenção podem envolver a medição de uma corrente que passa através do poro à medida que o polinucleotídeo move-se com respeito ao poro. As condições adequadas para medir correntes iônicas através dos poros de proteína de transmembrana são conhecidos na técnica e revelados nos Exemplos. O método é tipicamente realizado com uma voltagem aplicada através da membrana e do poro. A voltagem usada é tipicamente de +2 V a -2 V, tipicamente -400 mV a +400 mV. A voltagem usada está preferencialmente em uma faixa que tem um limite inferior selecionado dentre -400 mV, -300 mV, -200 mV, -150 mV, -100 mV, -50 mV, -20mV e 0 mV e um limite superior independentemente selecionado dentre +10 mV, + 20 mV, +50 mV, +100 mV, +150 mV, +200 mV, +300 mV e +400 mV. A voltagem usada está mais preferencialmente na faixa de100 mV a 240 mV e com a máxima preferência na faixa de 120 mV a 220 mV. É possível aumentar a discriminação entre nucleotídeos diferentes por um poro pelo uso de um potencial aplicado aumentado.
[00225] Os métodos são tipicamente realizados na presença de quaisquer carreadores de carga, como sais de metais, por exemplo sal de metal alcalino, sais de haleto, por exemplo sais de cloreto, como sal de cloreto de metal alcalino. Os carreadores de carga podem incluir líquidos iônicos ou sais inorgânicos, por exemplo cloreto de tetrametilamônio, cloreto de trimetilfenilamônio, cloreto de feniltrimetilamônio, ou cloreto de 1-etil-3- metilimidazólio. No aparelho exemplificador discutido acima, o sal está presente na solução aquosa no compartimento. Cloreto de potássio (KCl), cloreto de sódio (NaCl), cloreto de césio (CsCl) ou uma mistura de ferrocianeto de potássio e ferricianeto de potássio é tipicamente usada. KCl, NaCl e uma mistura de ferrocianeto de potássio e ferricianeto de potássio são preferidos. A concentração de sal pode estar na saturação. A concentração de sal pode ser 3 M ou menor and é tipicamente de 0,1 M a 2,5 M, de 0,3 M a 1,9 M, de 0,5 M a 1,8 M, de 0,7 M a 1,7 M, de 0,9 M a 1,6 M ou de 1 M a 1,4 M. A concentração de sal é preferencialmente de 150 mM a 1 M. As helicases Hel308, XPD, RecD, TraI e Dda surpreendentemente funcionam sob concentrações de sal altas. O método é preferencialmente realizado com o uso de uma concentração de sal de pelo menos 0,3 M, como pelo menos 0,4 M, pelo menos 0,5 M, pelo menos 0,6 M, pelo menos 0,8 M, pelo menos 1,0 M, pelo menos 1,5 M, pelo menos 2,0 M, pelo menos 2,5 M ou pelo menos 3,0 M. Concentrações de sal altas fornecem uma razão alta entre sinal e ruído e permitem que sejam identificadas correntes indicativas da presença de um nucleotídeo a ser identificado contra o sinal de fundo de flutuações de corrente normais.
[00226] Os métodos são tipicamente realizados na presença de um tampão. No aparelho exemplificador discutido acima, o tampão está presente na solução aquosa dentro do compartimento. Qualquer tampão pode ser usado no método da invenção. Tipicamente, o tampão é tampão fosfato. Outros tampões adequados são tampão HEPES e tampão Tris-HCl. Os métodos são tipicamente realizados em um pH de 4,0 a 12,0, de 4,5 a 10,0, de 5,0 a 9,0, de 5,5 a 8,8, de 6,0 a 8,7 ou de 7,0 a 8,8 ou 7,5 a 8,5. O pH usado é preferencialmente cerca de 7,5.
[00227] Os métodos podem ser realizados a de 0°C a 100°C, de 15°C a 95°C, de 16°C a 90°C, de 17°C a 85°C, de 18°C a 80°C, 19°C a 70°C, ou de 20°C a 60°C. Os métodos são tipicamente realizados à temperatura ambiente. O métodos são opcionalmente realizados em uma temperatura ambiente que mantém a função da helicase, como cerca de 37°C.
[00228] O método pode ser realizado na presença de nucleotídeos livres ou análogos de nucleotídeo livres e/ou um cofator de helicase que facilita a ação da helicase. O método também pode ser realizado na ausência de nucleotídeos livres ou de análogos de nucleotídeo livres e na ausência de um cofator de helicase. Os nucleotídeos livres podem ser um ou mais dentre quaisquer dos nucleotídeos individuais discutidos acima. Os nucleotídeos livres incluem, mas não se limitam a, adenosina-monofosfato (AMP), adenosina-difosfato (ADP), adenosina-trifosfato (ATP), guanosina- monofosfato (GMP), guanosina-difosfato (GDP), guanosina-trifosfato (GTP), timidina-monofosfato (TMP), timidina-difosfato (TDP), timidina-trifosfato (TTP), uridina-monofosfato (UMP), uridina-difosfato (UDP), uridina- trifosfato (UTP), citidina-monofosfato (CMP), citidina-difosfato (CDP), citidina-trifosfato (CTP), adenosina-monofosfato cíclica (cAMP), guanosina- monofosfato cíclica (cGMP), desoxiadenosina-monofosfato (dAMP), desoxiadenosina-difosfato (dADP), desoxiadenosina-trifosfato (dATP), desoxiguanosina-monofosfato (dGMP), desoxiguanosina-difosfato (dGDP), desoxiguanosina-trifosfato (dGTP), desoxitimidina-monofosfato (dTMP), desoxitimidina-difosfato (dTDP), desoxitimidina-trifosfato (dTTP), desoxiuridina-monofosfato (dUMP), desoxiuridina-difosfato (dUDP), desoxiuridina-trifosfato (dUTP), desoxicitidina-monofosfato (dCMP), desoxicitidina-difosfato (dCDP) e desoxicitidina-trifosfato (dCTP). Os nucleotídeos livres são preferencialmente selecionados dentre AMP, TMP, GMP, CMP, UMP, dAMP, dTMP, dGMP ou dCMP. Os nucleotídeos livres são preferencialmente adenosina-trifosfato (ATP). Um cofator de helicase é um fator que permite que a helicase ou o constructo funcione. Um cofator de helicase é preferencialmente um cátion de metal divalente. O cátion de metal divalente é preferencialmente Mg2+, Mn2+, Ca2+ ou Co2+. Um cofator de helicase é com a máxima preferência Mg2+.
[00229] A invenção também fornece um método de controlar o carregamento de uma ou mais helicases em um polinucleotídeo alvo. O método compreende fornecer o polinucleotídeo alvo com um ou mais espaçadores. O método preferencialmente compreende modificar o polinucleotídeo alvo de modo que ele compreenda um ou mais espaçadores. Todas as modalidades de discutidas acima aplicam-se igualmente a este método.
[00230] O método também compreende contactar o polinucleotídeo alvo com as uma ou mais helicases de tal modo que as uma ou mais helicases se ligam ao polinucleotídeo alvo e uma ou mais helicases param em cada espaçador. A imobilizada de helicases em espaçadores pode ser testada como discutido acima.
[00231] O polinucleotídeo alvo pode compreender qualquer número de espaçadores como discutido acima. O polinucleotídeo alvo preferencialmente compreende dois ou mais espaçadores, como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais espaçadores. Qualquer número de helicases pode ser parado em cada espaçador como discutido acima. Nesta maneira, é possível controlar onde e como muitas helicases são carregadas no polinucleotídeo alvo e assim facilitar a caracterização do polinucleotídeo alvo. As uma ou mais helicases podem ser movidas para além dos um ou mais espaçadores com o uso de qualquer um dos métodos discutidos acima.
[00232] O polinucleotídeo alvo é preferencialmente fornecido com um ou mais espaçadores S e uma ou mais regiões de fita única ou uma ou mais regiões não hibridizadas L (L representa o sítio de carregamento). O comprimento de cada região L depende do número de helicases que devem se ligar a cada L e ser imobilizadas em cada espaçador S. Os um ou mais espaçadores S e as uma ou mais regiões L podem estar adjacentes (isto é ao lado) um aos outros (umas às outras) ou podem estar separados (separadas) por parte do polinucleotídeo alvo. Cada espaçador está tipicamente localizado na ou próxima da extremidade de cada região L para a qual a helicase se move. Por exemplo, se a helicase fi"woc"jgnkecug"fg"7Ó"rctc"5Ó."ecfc"espaçador guVá VkrkecogpVg nqecnkzcfq pc qw rrózkoq fc gzVtgokfcfg 3’ fg ecfc tgik«q. kuvq fi 7Ó-L-S-5Ó0 Ug c jgnkecug fi woc jgnkecug fg 5Ó rctc 7Ó. ecfc espaçador está tipicamente localizado na ou próximo da extremidade 7Ó fg ecfc tgik«q kuvq fi 7Ó-S- L-5Ó0
[00233] O polinucleotídeo alvo é preferencialmente fornecido com (L- S)n ou (S-L)n pc fktg>«q 70 rctc 3’, ugpfq swg N fi um rqnkpwengqVífgq fg hkVc única ou um polinucleotídeo não hibridizado, S é um espaçador e n é um número inteiro, como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou maior. n é rtgfetgpekclogpVe 3. 4. 5 qw 60 C fktg>«q fg 5’ rctc 3’ tefete-se ao polinucleotídeo alvo.
[00234] O polinucleotídeo alvo é preferencialmente fornecido com uma ou mais regiões de fita única ou uma ou mais regiões não hibridizadas L cada uma das quais tem um espaçador S na ou próximo de cada extremidade, isto é, é fornecido com (S-L-S)n.
[00235] Em uma modalidade preferida, o espaçador está adjacente a woc teik«q fe hkvc fwrnc F eqoq fkuewvkfq cekoc. kuvq fi 7Ó-L-S-D-5Ó rctc cu jenkecueu fe 7Ó rctc 5Ó qw jenkecueu wucfcu pq oqfq kpcvkxq qw 7Ó-D-S-L-5Ó rctc jenkecueu fe 5Ó rctc 7Ó qw jenkecueu wucfcu pq oqfq kpcvkxq0 Q polinucleotídeo alvo é preferencialmente fornecido com (L-S-D)n ou (D-S-L)n pc fkte>«q 70 rctc 3’, uepdo que L é um polinucleotídeo de fita única ou um polinucleotídeo não hibridizado, S é um espaçador, D é um polinucleotídeo de fita dupla e n é um número inteiro, como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou maior. n é preferencialmente 1, 2, 3 ou 4. L pode ser do tipo igual de polinucleotídeo que D ou pode ser de um tipo diferente de polinucleotídeo de D. L e/ou D podem ser do tipo igual de polinucleotídeo que o polinucleotídeo alvo ou podem ser de um tipo diferente de polinucleotídeo do polinucleotídeo alvo.
[00236] Em uma modalidade preferida, uma molécula bloqueadora B é fornecida na extremidade de cada espaçador oposta à extremidade para além fc swcn cu woc qw ocku jenkecueu u«q rctc ueteo oqxkfcu. kuvq fi 7’-B-L-S-5’ rctc jenkecueu fe 7’ rctc 5’ qw jenkecueu wucfcu pq oqfq kpcvkxq qw 7’-S-L-B- 3’ rctc jelkecueu fe 3’ rctc 5’. Q rqlkpweleqVifgq clxq fi rtehgtgpekclogpVe fornecido com (B-L-S)n ou (S-L-B)n pc fkte>«q 5’ rctc 3’, uepfq swe N fi wo polinucleotídeo de fita única ou um polinucleotídeo não hibridizado, S é um espaçador, B é uma molécula bloqueadora e n é um número inteiro, como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou maior. n é preferencialmente 1, 2, 3 ou 4.
[00237] Na modalidade de máxima preferência, o polinucleotídeo é fornecido com um ou mais espaçadores ambos D e B, isto fi"7Ó-B-L-S-D-5Ó" rctc"jgnkecugu"fg"7Ó"rctc"5Ó"qw"jgnkecugu"wucfcu"pq"oqfq"kpcvkxq"qw"7Ó-D-S-L- B-50 rctc jgnkecugu fg 3’ rctc 5’. Q rqnkpwengqVifgq clxq fi eqo c oázkoc preferência fornecido com (B-L-S-D)n ou (D-S-L-B)n pc fktg>«q 5’ rctc 3’, sendo que L é um polinucleotídeo de fita única ou um polinucleotídeo não hibridizado, S é um espaçador, B é molécula bloqueadora, D é um polinucleotídeo de fita dupla e n é um número inteiro, como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou maior. n é preferencialmente 1, 2, 3 ou 4.
[00238] O polinucleotídeo alvo pode ser fornecido com qualquer número destas unidades que contêm espaçador. Por exemplo, o rqlkpwelgqVifgq clxq rqfg ugt fomgekfq eqo *7ó-L-S-5ó+n, (5’-S- L-5’+n, (S-L- S)n, *7Ó-L-S-D-5Ó+n, *7Ó-D-S-L-5Ó+n, *7Ó-B-L-S-5Ó+n, *7Ó- S-L-B-5Ó+n, *7Ó-B-L- S-D-5Ó+n qw (7Ó-D-S-L-B-5Ó+n, onde n é 2 ou maior, como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou maior. Tais modalidades permitem que múltiplas helicases sejam imobilizadas no polinucleotídeo alvo.
[00239] O polinucleotídeo alvo pode ser fornecido com todas as modalidades discutidas acima com referência a L, S, D e B pela ligação de um adaptador da invenção ao polinucleotídeo alvo.
[00240] Em uma modalidade preferida, o polinucleotídeo alvo é contado com as uma ou mais helicases de tal modo que uma helicase (isto é apenas uma helicase) pare em cada espaçador. Isto pode ser realizado pelo fornecimento do polinucleotídeo alvo com um ou mais espaçadores S e uma ou mais regiões de fita única ou uma ou mais regiões não hibridizadas L1 cada um (uma) dos (das) quais é suficientemente longo (longa) para uma helicase se ligar. O polinucleotídeo alvo é preferencialmente fornecido com (L1-S)n ou (S-L1)n pc fktg>«q 50 rctc 50, ugpfq swg N1 é um polinucleotídeo de fita única ou um polinucleotídeo não hibridizado cada um dos quais é suficientemente longo para uma helicase se ligar, S é um espaçador e n é um número inteiro, como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou maior. n é preferencialmente 1, 2, 3 ou 4.
[00241] O comprimento de região L1 depende da área ocupada pela helicase e pode ser calculado em uma maneira fácil. Região L1 pode ser parte do polinucleotídeo alvo ou pode ser adicionada ao polinucleotídeo alvo, por exemplo como parte de um adaptador da invenção. Região L1 é tipicamente de comprimento de 8, 9, 10, 12, 13, 14 ou 15 nucleotídeos. Os um ou mais espaçadores S e as uma ou mais regiões L1 podem estar adjacentes (isto é ao lado) uns aos outros (umas às outras) ou podem estar separados (separadas) por parte do polinucleotídeo alvo. Cada espaçador está tipicamente localizado na ou próximo da extremidade de cada região L1 para a qual a helicase se oqxg0"Rqt"gzgornq."ug"c"jgnkecug"fi"woc"jgnkecug"fg"7Ó"rctc"5Ó."ecfc"espaçador U guVá VkrkecogpVg nqecnkzcfq pc qw rt„zkoq fc gzVtgokfcfg 3’ fg ecfc tgik«q L1. kuvq fi 7Ó-L1-S-5Ó0 Ug c jgnkecug fi woc jgnkecug fg 5Ó rctc 7Ó. ecfc espaçador U guvá vkrkecogpvg nqecnkzcfq pc qw rt„zkoq fc gzvtgokfcfg 7Ó fg cada região L1. kuVq fi 5’-S- L1-3’. Q rqnkpwengqVifgq cnxq fi rtgfgtgpckcnmgpVg fornecido com uma ou mais regiões de fita única ou uma ou mais regiões não hibridizadas L1 cada uma das quais é suficientemente longa para uma helicase se ligar e cada uma das quais tem um espaçador S na ou próximo da extremidade, isto é (S-L1-S)n.
[00242] Q rqnkpwengqVifgq cnxq rqfg ugt fomgckdo eqm *5ó-L1-S-3ó+n, *5Ó-S- L1-5Ó+n, (S-L1-S)n. *5Ó-L1-S-D-5Ó+n. *5Ó-D-S-L1-5Ó+n. *5Ó-B-L1-S-5Ó+n, *5Ó- S-L1-B-3Ó+n. *5Ó-B-L1-S-D-3Ó+n qw *5Ó-D-S-L1-B-3Ó+n, sendo que n é um número inteiro, como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou maior. n é preferencialmente 1, 2, 3 ou 4. Tais modalidades permitem que n helicases sejam imobilizadas no polinucleotídeo alvo. Uma helicase é imobilizada por cada espaçador.
[00243] Em uma outra modalidade preferida, o polinucleotídeo alvo é contactado com as uma ou mais helicases de tal modo que duas helicases (isto é apenas duas helicases) parem em cada espaçador. Isto pode ser realizado pelo fornecimento do polinucleotídeo alvo com um ou mais espaçadores S e uma ou mais regiões de fita única ou uma ou mais regiões não hibridizadas L2 cada um(a) dos (as) quais é suficientemente longo (longa) para duas helicases se ligarem. O polinucleotídeo alvo é preferencialmente fornecido com (L2-S)n ou (S-L2)n pc fktg>«q 70 rctc 5’, ugpfq swg N fi wo rqnkpwengqVifgq fg hkVc única ou um polinucleotídeo não hibridizado que é apenas suficientemente longo para duas helicases se ligarem, S é um espaçador e n é um número inteiro, como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou maior. n é preferencialmente 1, 2, 3 ou 4.
[00244] O comprimento de região L2 depende da área ocupada pela helicases e pode ser calculada em uma maneira fácil. Região L2 pode ser parte do polinucleotídeo alvo ou pode ser adicionada ao polinucleotídeo alvo, por exemplo como parte de um adaptador da invenção. Região L2 é tipicamente de comprimento de 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 nucleotídeos. Os um ou mais espaçadores S e as uma ou mais regiões L2 podem estar adjacentes (isto é, ao lado) um aos outros (umas às outras) ou podem estar separados (separadas) por parte do polinucleotídeo. Cada espaçador está tipicamente localizado na ou próximo da extremidade de cada região para a qual a helicase se move. Por gzgornq, ug c jgnkecug fi woc jgnkecug fg 7Ó rctc 5Ó, ecfc espaçador está VkrkecogpVg nqecnkzcfq pc qw rt„zkoq fc gzVtgoifcfg 5’ fg ecfc tgik«qo Q polinucleotídeo é preferencialmente fornecido com uma ou mais regiões de fita única ou uma ou mais regiões não hibridizadas L2 cada uma das quais é apenas suficientemente longa para duas helicases se ligarem e cada uma das quais tem um espaçador S na ou próximo da extremidade, isto é (S-L2-S)n.
[00245] O polinudgqVifgq cnxq rqfg ugt fomgcido eqm (7’-L2-S-5’)n, *7Ó-S- L2-5Ó+n, (S-L2-S)n, *7Ó-L2-S-D-5Ó+n, *7Ó-D-S-L2-5Ó+n, *7Ó-B-L2-S-5Ó+n, (7Ó- S-L2-B-5Ó+n, (7Ó-B-L2-S-D-5Ó+n ow (7Ó-D-S-L2-B-5Ó+n, sendo que n é um número inteiro, como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou maior. n é preferencialmente 1, 2, 3 ou 4. Tais modalidades permitem que 2n helicases sejam imobilizadas no polinucleotídeo alvo. Duas helicases são imobilizadas por cada espaçador.
[00246] As duas helicases imobilizadas em cada espaçador são preferencialmente diferentes uma da outra. Isto pode ser controlado em várias maneiras. Por exemplo, duas helicases diferentes podem ser ligadas uma à outra, como covalentemente ligadas uma à outra, e então imobilizadas em cada espaçador. Constructos adequados são discutidos acima. Alternativamente, Polinucleotídeos bloqueadores podem ser usados para garantir que helicases diferentes sejam imobilizadas por cada espaçador. Se o método compreende fornecer o polinucleotídeo com um ou mais espaçadores S e uma ou mais regiões de fita única ou uma ou mais regiões não hibridizadas L2 cada um dos quais (uma das quais) é apenas suficientemente longo (longo) para duas helicases se ligarem, o método preferencialmente compreende hibridizar um polinucleotídeo bloqueador com parte de cada região L2 de modo que a parte restante (isto é não bloqueada) de cada região seja apenas suficientemente longa para se ligar a uma helicase. Polinucleotídeos bloqueadores são tipicamente de comprimento de 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 nucleotídeos. O polinucleotídeo bloqueador evita que duas helicases se liguem à mesma região ao mesmo tempo. O polinucleotídeo compreendendo os polinucleotídeos bloqueadores é preferencialmente contactado com uma ou mais helicases de tal modo que uma helicase se liga à parte restante (isto é não bloqueada) de cada região L2. Cada helicase pode ser então usada para remover cada polinucleotídeo bloqueador. As uma ou mais helicases são preferencialmente fornecidas com nucleotídeos livres e um cofator de helicase de tal modo que removem cada polinucleotídeo bloqueador e param em cada espaçador S. O polinucleotídeo produzido nesta maneira é então preferencialmente contactado com uma ou mais helicases que são diferentes das helicases usadas primeiro no método de tal modo que uma helicase diferente se liga a cada região e é imobilizada pelo espaçador e a outra helicase imobilizada.
[00247] O método preferencialmente compreende (a) fornecer o polinucleotídeo alvo com (L2-S)n ou (S-L2)n PC fktg>«q 5’ rctc 5’, ugpfq swg L é um polinucleotídeo de fita única ou um polinucleotídeo não hibridizado que é apenas suficientemente longo para duas helicases se ligarem, S é um espaçador e n é um número inteiro, como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou maior; (b) hibridizar a polinucleotídeo bloqueador com parte de cada região L2 de modo que a parte restante de cada região L2 seja apenas suficientemente longa para se ligar a uma helicase; (c) contactar o polinucleotídeo alvo produzido em (b) com uma ou mais helicases de tal modo que uma helicase se liga à parte restante de cada região L2; (d) fornecer as uma ou mais helicases ligadas em (c) com nucleotídeos livres e um cofator de helicase de tal modo que elas removem cada polinucleotídeo bloqueador e param em cada espaçador S; e (e) contactar o polinucleotídeo alvo produzido em (d) com uma ou mais helicases que são diferentes daquelas usadas em (c) de tal modo que uma helicase diferente se liga à cada região L2 e é imobilizada por cada espaçador e cada helicase imobilizada em (d). n é preferencialmente 1, 2, 3 ou 4. Outros arranjos de S e L2, como (S-L2-S)n,"*7Ó-L2-S-D-5Ó+n,"*7Ó-D-S-L2-5Ó+n,"*7Ó-B-L2- S-5Ó+n," *7Ó- S-L2-B-5Ó+n," *7Ó-B-L2-S-D-5Ó+n g" *7Ó-D-S-L2-B-5Ó+n como discutido acima, também podem ser usados nesta modalidade.
[00248] Como discutido acima, o comprimento de um espaçador pode ser usado para controlar o número de helicases que são imobilizadas e/ou o número de helicases que podem ser movidas para além do espaçador. Espaçadores mais longos podem ser usados para imobilizar mais helicases. Trens de duas ou mais helicases, como 3, 4 ou 5 helicases, também podem se mover para além de espaçadores mais longos porque as helicases de trás podem empurrar as helicases da frente para além do espaçador. As modalidades com referência a L1 e L2 acima podem ser tais que 3, 4 ou 5 helicases são imobilizadas em cada espaçador. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser fornecido com um ou mais espaçadores S e uma ou mais regiões de fita única ou uma ou mais regiões não hibridizadas cada um dos quais (uma das quais) é apenas suficientemente longo (longa) para três (L3), quatro (L4) ou cinco (L5) helicases se ligarem.
[00249] A invenção também fornece um adaptador para controlar o movimento de um polinucleotídeo alvo. O adaptador é preferencialmente para caracterizar um polinucleotídeo alvo. O adaptador compreende (a) (L-S-D)n ou (D-S-L)n pc fktg>«q 5’ rctc 5’, ugpfq swg N fi wo rqnkpwengqVífgq fg fíVc única ou um polinucleotídeo não hibridizado, S é um espaçador e D é um polinucleotídeo de fita dupla and sendo que n é um número inteiro, como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou maior, e (b) uma ou mais helicases imobilizadas em ecfc cfcrVcfqto p fi rtghetgpekalogpVg 3, 4, 5 qw 60 C fktg>«q fg 5’ rctc 5’ refere-se à direção dos polinucleotídeos L e D no adaptador.
[00250] As uma ou mais helicases podem ser imobilizadas antes do espaçador S, pelo espaçador S ou no espaçador S.
[00251] O adaptador pode ser ligado a um polinucleotídeo alvo de tal modo que o polinucleotídeo alvo pode ser usado em qualquer método discutido acima.
[00252] L pode ser L1 ou L2 como discutido acima. Um adaptador pode compreender uma combinação de L1 e L2.
[00253] Todas as modalidades de espaçador discutidas acima aplicam- se igualmente a este método.
[00254] Qualquer uma das modalidades discutidas acima com referência a L, S e D aplica-se igualmente aos adaptadores da invenção. O cfcrvcfqt rqfg eqortggpfgt *7"-L1-S-D-5"+n, *7"-D-S-L1-5"+n, *7"-B-L1-S-D- 5"+n qw *7"-D-S-L1-B-5"+n, *7"-L2-S-D-5"+n, *7"-D-S-L2-5"+n, *7"-B-L2-S-D-5"+n qw (5’-D-S-L2-B-5’)n pc fkte>«q 5’ rctc 5’, ugpfq swe p fi wo púoetq kpVektq, como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou maior. n é preferencialmente 1, 2, 3 ou 4. L1 ou L2 pode ser substituído por L3, L4 ou L5.
[00255] Com a máxima preferência n é 1 e uma ou duas helicases são imobilizadas em um adaptador.
[00256] A invenção também fornece um kit para controlar o movimento de um polinucleotídeo alvo. O kit é preferencialmente para caracterizar um polinucleotídeo alvo. O kit compreende (a) um ou mais espaçadores, (b) uma ou mais helicases e (c) um poro de transmembrana. Todas as modalidades de espaçador discutidas acima com referência aos métodos da invenção aplicam-se igualmente aos kits da invenção. Por exemplo, os um ou mais espaçadores podem ser parte de um adaptador de polinucleotídeo, preferencialmente um adaptador de polinucleotídeo de fita única, que pode estar ligado ao polinucleotídeo alvo e que compreende uma sequência líder que preferencialmente entra dentro do poro. O kit pode compreender qualquer uma das helicases e qualquer um dos poros discutidas (discutidos) acima.
[00257] Os um ou mais espaçadores e as uma ou mais helicases podem ser parte de um adaptador da invenção.
[00258] O kit pode adicionalmente compreender componentes de uma membrana, como os fosfolipídeos necessários para formar uma camada anfifílica, como uma bicamada lipídica.
[00259] O kit da invenção pode adicionalmente compreender um ou mais outros reagentes ou instrumentos que permitem que qualquer uma das modalidades mencionadas acima seja realizada. Tais reagentes ou instrumentos incluem um ou mais dentre os seguintes: tampão (tampões) (soluções aquosas) adequado(s), meios para obter uma amostra de um sujeito (como um vaso ou um instrumento compreendendo uma agulha), meios para amplificar e/ou expressar polinucleotídeos, uma membrana como definida acima ou aparelho de clampeamento de voltagem ou de sinais iônicos. Reagentes podem estar presentes no kit em um estado seco de tal modo que uma amostra fluida ressuspenda os reagentes. O kit também pode, opcionalmente, compreender instruções para permitir que o kit seja usado no método da invenção ou detalhes relacionando quais pacientes podem usar o método. O kit pode, opcionalmente, compreender os componentes necessários para facilitar o movimento de helicase (por exemplo ATP e Mg2+). Os seguintes Exemplos ilustram a invenção.
[00260] Este exemplo descreve como uma helicase T4 Dda - E94C/A360C (SEQ ID NO: 8 com mutações E94C/A360C e então *ΔO3+I3I4+ rqfg eqpVtqnct q oqxkogpVq fg fíVcu fg FPC kpVceVcu cVtcxfiu de um único nanoporo MspA (MS(B1- G75S/G77S/L88N/Q126R)8 (MspA - B2C) (SEQ ID NO: 2 com mutações G75S/G77S/L88N/Q126R). Os espaçadores iSpC3 no constructo de DNA Lambda (SEQ ID NO: 9 ligada rgnc uwc gzvtgoifcfg 5Ó cqu swcvtq espaçadores iSpC3 que estão ligados à gzVtgoifcfg 5’ fg UGS KF PQ< 32 swg guVá ligcclc c Vtêu espaçadores iSpC3 que estão ligados pela gzvtgoifcfg 5Ó § UGS KF PQ< 33. c tgii«q fg UGS KF NO: 10 deste constructo é hibridizada com SEQ ID NO: 12 (que tem ligada à uwc gzvtgoifcfg 5’. ugiu espaçadores iSp18 ligados a dois resíduos de timina e c wo 5’-colesterol-TEG)) são usados para imobilizar a enzima até o constructo ser capturado pelo nanoporo. Após a captura a força do potencial aplicado move a enzima T4 Dda - E94C/A360C para além do espaçador parador e permite o movimento, controlado por enzima, de DNA do constructo lambda através do nanoporo.
[00261] Antes da configuração do experimento, o constructo de DNA Ncodfc *UGS KF PQ< ; niicfc rgnc uwc gzvtgoifcfg 5’ cqu swcvtq espaçadorgu iUrE5 swg guv«q niicfqu § gzvtgoifcfg 5’ fg UGS KF PQ< 32 swg está ligada por meio de sua extremifcfg 5’ § UGS KF PQ< 33. c tgii«q fg SEQ ID NO: 10 deste constructo é hibridizada com SEQ ID NO: 12 (que tem q itwrq fg cpeqtcigo 50-colesterol)) e T4 Dda - E94C/A360C foram pré- incubados juntos durante 15 minutos a 23°C em tampão (CAPS 20 mM, pH 10,0, NaCl 500 mM, Glicerol 5%, DTT 2 mM).
[00262] Medições elétricas foram realizadas a 20°C (pelo posicionamento do sistema experimental sobre uma placa esfriadora) de únicos nanoporos MspA (MspA - B2C) inseridos em copolímero em bloco em tampão (KCl 600 mM, fosfato de potássio 25 mM, ferrocianeto (II) de potássio 75 mM, ferricianeto (III) de potássio 25 mM, pH 8). Após a obtenção de um único poro inserido no copolímero em bloco, então o tampão (1 mL, KCl 600 mM, fosfato de potássio 25 mM, ferrocianeto (II) de potássio 75 mM, ferricianeto (III) de potássio 25 mM, pH 8) foi fluído através do sistema para remover algum excesso de nanoporos MspA (MspA - B2C) e finalmente o tampão experimental foi fluído para dentro do sistema (2 mL de KCl 960 mM, fosfato de potássio 25 mM, ferrocianeto (II) de potássio 3 mM, ferricianeto (III) de potássio 1 mM, pH 8). MgCl2 (concentração final de 10 mM) e ATP (concentração final de 1 mM) foram misturados juntos com o tampão (KCl 960 mM, fosfato de potássio 25 mM, ferrocianeto (II) de potássio 3 mM, ferricianeto (III) de potássio 1 mM, pH 8) e então adicionados à pré-mistura de constructo de DNA Lambda (concentração final de 0,2 nM), T4 Dda - E94C/A360C (concentração final de 10 nM), tampão (CAPS 20 mM, pH 10,0, NaCl 500 mM, Glicerol 5%, DTT 2 mM). A pré-mistura foi então adicionada ao sistema experimental de nanoporo único. Experimentos foram realizados durante quatro horas seguindo um processo de inversão de potencial (+100 mV durante 2 s, então 0 V durante 2 s, então -120 mV durante 14.500s aplicado no lado cis) e foi monitorado o movimento de DNA controlado por helicase.
[00263] O constructo de DNA é mostrado na Figura 1. A T4 Dda - E94C/A360C é capaz de se ligar à região do constructo indicado por A (SEQ ID NO: 9) quando pré-incubada com o constructo de DNA. Entretanto, a enzima não é capaz de se mover para além dos grupos paradores quando em solução livre (indicado por B e D na Figura 1). Portanto, a enzima é imobilizada nos espaçadores iSpC3 (indicado por B na Figura 1) até o constructo de DNA ser capturado pelo nanoporo. Quando capturada pelo nanoporo, a força do potencial aplicado move a enzima T4 Dda - E94C/A360C para além do espaçador parador e permite o movimento, controlado por enzima, de DNA do constructo lambda através do nanoporo. Um exemplo de movimento de DNA controlado por helicase é mostrado na Figura 2. O movimento de DNA controlado por helicase foi de 5.170 segundos de duração e corresponde à translocação de aproximadamente 30 kB do constructo lambda através do nanoporo. A Figura 3 mostra aumentada em regiões do início (a) e do final (b) do movimento de DNA controlado por helicase, 1 e 2 mostram quando os espaçadores iSpC3 translocam através do nanoporo sob o controle da helicase.
[00264] O constructo de DNA usado neste exemplo foi produzido por fragmentação de DNA Lambda em fragmentos de ~ 5-10 kB com o uso de MuA. Os fragmentos que foram produzidos pela preparação de amostra foram então passados através de um nanoporo, com seu movimento controlado por uma enzima helicase. A helicase foi movida para além da região de dsDNA (onde o grupo de ancoragem hibridiza com o constructo) e os espaçadores pela força do potencial aplicado atravessam o nanoporo. A observação dos blocos característicos produzidos por um movimento controlado por helicase dos marcadores através do nanoporo mostrou que o procedimento de preparação de amostra havia sido bem sucedido e que a enzima havia sido imobilizada como mostrado na Figura 4 (b). Isto significa que a enzima teve um ponto inicial definido e foi incapaz de se mover para além da região de dsDNA (onde o grupo de ancoragem hibridiza com o constructo) e espaçadores até que capturada pelo nanoporo.
[00265] Os substratos de MuA em grampo de cabelo e em formato Y foram preparados como mostrado na tabela 5 abaixo. As misturas de amostra que continham o DNA para formar os substratos de MuA em grampo de cabelo e em formato Y foram então aquecidas para 95°C durante 2 minutos e então esfriadas para 16°C em uma taxa de 2°C por minuto. Isto permitiu que as SEQ ID NOs: 14 e 15 (onde SEQ ID NO: 14 está ligada por meio de sua gzvtgokfcfg"5Ó"§"gzvtgokfcfg"7Ó"fg"UGS"KF"PQ<"37"rqt"swcvtq"wpkfcfgu de espaçador iSpC3) anelassem nas SEQ ID NO: 19 e 9 (onde SEQ ID NO: 19 guVá nkicfc rqt ogkq fg uwc gzVtgokfcfg 3’ § gzVtgokfcfg 7’ fg UGS KF PQ< 9 por quatro unidades de espaçador iSpC3) para formar o substrato de MuA em formato Y e em SEQ ID NO: 19 e 20 (onde SEQ ID NO: 19 está ligada rqt ogkq fg uwc gzVtgokfcfg 5Ó § gzVtgokfcfg 7Ó fg UGS KF PQ< 37 rqt quatro unidades de espaçador iSpC3) para formar o substrato de MuA em alça de grampo de cabelo. Os projetos de substrato de DNA dos dois substratos de MuA formados são mostrados na Figura 4 (a).
Tabela 5
[00266] DNA Lambda de fita dupla (SEQ ID NO: 13 corresponde à sequência da fita de senso) foi fragmentado em fitas de comprimento de aproximadamente 5-10 kB com o uso de uma MuA-transposase. A MuA- transposase inseriu os substratos de MuA (os substratos de MuA em grampo de cabelo e em formato Y) que foram anelados na seção 3.1. A amostra foi preparada como mostrado na tabela 6 abaixo. A amostra foi então incubada a 30°C durante 1 hora e termicamente inativada a 75°C durante 10 minutos. A amostra foi então adicionalmente purificada com o uso de um “QIAquick™ PCR Purification kit” (Qiagen) e eluída em β6 µL.
Tabela 6
[00267] O volume de amostra 1 purificada da etapa 3.2 foi então VtcVcfq eqo c gpzkoc fkiguVqtc WUGT™ eqo q rtqpósito de remover a dUMP de SEQ ID NOs: 19. Consulte a Tabela 7 abaixo para volumes apropriados e concentrações apropriadas. A amostra foi então incubada a 37°C durante 30 minutos antes que fosse esfriada em um bloco de gelo.
Tabela 7
[00268] Volume de amostra 2 produzido após o tratamento com WUGT™ hqk gpV«q VtcVcfq eqo FPC-polimerase e ligase com o propósito de fechar a lacuna de fita única. Volume de amostra 3 (consulte a tabela 8 abaixo para volumes aproximados e concentrações aproximadas) foi incubado durante 30 minutos a 16°C e então EDTA (0,5 M, 10 μL) foi adicionado ao xqnwog fg coquVtc 5o Wo “SKAsukck™ RET RwtkfiecVkqp kit” hqk gpV«q wucfq para purificar cada amostra, que foi eluída em 50 μL de água. Uma alíquota da amostra purificada (1 μL) foi processada sobre um chip Agilent 12000 para quantificar a amostra e Tris-HCl e NaCl (pH 7,5) foram adicionados ao restante da amostra até que as concentrações fossem 10 mM e 50 mM tgurgeVkxcogptgo Hkpcnogptg. UGS KF PQ< 38 *gzttgokfcfg 3’ fc ugswêpekc tem seis espaçadoreu kUr3: niicfqu c fqku tguifwqu fg tkokpc g c wo 3’- colesterol-TEG, 0,5 μM) foi anelada na amostra purificada.
Tabela 8
[00269] Antes da configuração do experimento, o constructo de DNA Lambda (0,2 nM, fragmentos of DNA Lambda de 5-10 kB que têm os substratos MuA em formato Y e os substratos de MuA em grampo de cabelo em cada extremidade dos fragmentos pela MuA-transposase (consulte a Fig. 4 (b) para um constructo exemplificador)) e Trwc Cba (SEQ ID NO: 9, 1 μM) foram pré-incubados juntos durante 1 hora em tampão (CAPS 50 mM, pH 10,0 (pH alterado para pH 10,0 pela adição de NaOH), NaCl 100 mM).
[00270] Medições elétricas foram adquiridas de únicos nanoporos MspA (MspA - B2C) inseridos em copolímero em bloco em tampão (KCl 600 mM, KH2PO4 25 mM, ferrocianeto (II) de potássio 75 mM, ferricianeto (III) de potássio 25 mM, pH 8). Após formar um poro único na bicamada, então o tampão (1 mL, KCl 600 mM, KH2PO4 25 mM, ferrocianeto (II) de potássio 75 mM, ferricianeto (III) de potássio 25 mM, pH 8) foi fluído através do sistema para remover algum excesso de nanoporos MspA (MspA - B2C) e o sistema experimental foi posicionado sobre uma placa esfriadora ajustada a 8°C que deu uma temperatura de sistema de ~15°C. MgCl2 (10 mM) e dTTP (5 mM) foram misturados juntos com o tampão (KCl 600 mM, KH2PO4 25 mM, ferrocianeto (II) de potássio 75 mM, ferricianeto (III) de potássio 25 mM, pH 8) e então adicionados à pré-mistura de constructo de DNA Lambda (0,2 nM), Trwc Cba (SEQ ID NO: 9, 1 μM), tampão (50 mM CAPS, pH 10,0 (pH alterado para pH 10,0 pela adição de NaOH), 100 mM NaCl). A pré- mistura foi então adicionada ao sistema experimental de nanoporo único. Os experimentos foram realizados durante duas horas após um processo de inversão de potencial (+120 mV durante 30 minutos, então -100 mV durante 2 segundos e então 0 mV durante 2 segundos) e foi monitorado o movimento de DNA controlado por helicase.
[00271] Movimento de DNA controlado por helicase foi observado para o constructo de DNA Lambda, um exemplo de um movimento de DNA controlado por helicase é mostrado na Figura 5. Os espaçadores iSpC3 presentes no constructo de DNA Lambda produziram um nível de bloqueio característico realçado pelos números 1, 2 e 3 na Figura 5. O substrato de MuA em formato Y tem quatro espaçadores iSpC3 em qualquer fita e o substrato de MuA em grampo de cabelo também tem quatro espaçadores iSpC3, cada espaçador iSpC3 permite que mais corrente flua à medida que aquela região do constructo de DNA lambda se transloca através do nanoporo. Se a preparação de amostra tem ocorrido com sucesso então os eventos de espaçador iSpC3 serão observados no início do constructo de DNA lambda, no meio (fazendo a transição entre sequências de senso e de antissenso) e no final. Figura 5 mostra claramente três situações de fluxo de corrente aumentado que correspondem às regiões de espaçador iSpC3. Portanto, a preparação de amostra eficazmente introduziu substratos de MuA no DNA Lambda para produzir os constructos de DNA Lambda mostrados na Figura 4 (b). Após a captura do DNA pelo nanoporo, a enzima (indicada por A) é movida para além da região de dsDNA (onde o grupo de ancoragem hibridiza com o constructo) e os espaçadores pela força do potencial aplicado através do nanoporo.
[00272] O constructo de DNA usado neste exemplo foi produzido por fragmentação de DNA Lambda em fragmentos de ~5-10 kB com o uso de MuA. Este exemplo é similar àquele descrito no Exemplo 2, entretanto, o procedimento de preparação de amostra é diferente (etapas 2.3 e 2.4 como descritas acima não são necessárias) porque as sequência de transposase contêm inosinas neste exemplo. A enzima foi movida para além da região de dsDNA e os espaçadores pela força do potencial aplicado através do nanoporo.
[00273] Os substratos de MuA em formato Y 2 e em grampo de cabelo 2 foram preparados como descrito no Exemplo 2.1 acima. Volumes, concentrações e sequências que foram usados neste exemplo são detalhados na tabela 9 abaixo. Os projetos de substrato de DNA dos dois constructos formados são mostrados na Figura 6 (a).
Tabela 9
[00274] DNA Lambda de fita dupla (SEQ ID NO: 13 mostra a sequência da fita de senso apenas) foi fragmentado em fitas de comprimento de aproximadamente 5-10 kB com o uso de uma MuA-transposase. A MuA- transposase foi inserida nos substratos de MuA (os substratos de MuA em formato Y 2 e em grampo de cabelo 2) que foram anelados na seção 3.1. A amostra foi preparada por um procedimento análogo àquele descrito na Seção 2.2 e tabela 6 acima exceto que os substratos de MuA usados foram substratos de MuA em formato Y 2 e em grampo de cabelo 2. Neste caso a amostra X purificada foi eluída em um volume de 20 μL.
[00275] Quando os substratos de MuA em formato Y 2 e em grampo de cabelo 2 são inseridos no DNA Lambda fragmentado é necessário reimobilizar a quebra de ligação fosfodiéster (nick) na fita e unir as inosinas ao fragmento de DNA Lambda para produzir um fragmento de DNA Lambda de fita dupla completo. Foi realizada uma reação sobre gelo como descrito na tabela 10 abaixo. A amostra foi incubada a 16°C durante 60 minutos antes que EDTA (10 μL, 0,5 M) fosse adicionado à amostra. A mistura de amostra tguwnvcpvg hqk rwtkfíecfc eqo q wuq fg wo “SkcSwkemTM rwtkfy” g hqk gnwífc em 50 μL de água. Uma alíquota da amostra purificada (1 μL) foi processada sobre um chip Agilent 12000 para quantificar a amostra e Tris-HCl e NaCl (pH 7,5) foram adicionados ao restante da amostra até que as concentrações fossem 10 mM e 50 mM respectivamente. Finalmente, SEQ ID NO: 16 (extrgokfcfg 3’ fc ugswênekc Vgo ugku espaçadores iSp18 ligados a dois tguífwqu fg vkokpc g c wo 5Ó-colesterol-TEG, 0,5 μM) foi anelada ao constructo de DNA Lambda purificado.
Tabela 10
[00276] Antes da configuração do experimento, o constructo de DNA Lambda (0,2 nM, fragmentos de 5-10 kB de DNA Lambda que têm os substratos de MuA em formato Y 2 e em grampo de cabelo 2 MuA ligados a cada extremidade dos fragmentos pela MuA-transposase (consulte a Figura 6 (b) para um constructo exemplificador)) e Trwc Cba (SEQ ID NO: 17, 1 μM) foram pré-incubados juntos durante 1 hora em tampão (CAPS 50 mM, pH 10,0 (pH alterado para pH 10,0 pela adição de NaOH), NaCl 100 mM).
[00277] Medições elétricas foram adquiridas de únicos nanoporos MspA (MspA - B2C) inseridos em copolímero em bloco em tampão (KCl 600 mM, KH2PO4 25 mM, ferrocianeto (II) de potássio 75 mM, ferricianeto (III) de potássio 25 mM, pH 8). Após obter um único poro na bicamada, então o tampão (3 mL, KCl 600 mM, KH2PO4 25 mM, ferrocianeto (II) de potássio 75 mM, ferricianeto (III) de potássio 25 mM, pH 8) foi fluído através do sistema para remover algum excesso de nanoporos MspA (MspA - B2C) e o sistema experimental foi posicionado sobre uma placa esfriadora ajustada para 8°C que deu uma temperatura de sistema de ~15°C. MgCl2 (10 mM) e dTTP (5 mM) foram misturados juntos com o tampão (KCl 600 mM, KH2PO4 25 mM, ferrocianeto (II) de potássio 75 mM, ferricianeto (III) de potássio 25 mM, pH 8) e então adicionados à pré-mistura de constructo de DNA Lambda (0,2 nM), Trwc Cba (SEQ ID NO: 17, 1 μM), tampão (50 mM CAPS, pH 10,0 (pH alterado para pH 10,0 pela adição de NaOH), 100 mM NaCl). A pré- mistura foi então adicionada ao sistema experimental de nanoporo único. Experimentos foram realizados durante duas horas após um processo de inversão de potencial (+120 mV durante 30 minutos, então -100 mV durante 2 segundos e então 0 mV durante 2 segundos) foi monitorado o movimento de DNA controlado por helicase.
[00278] O movimento de DNA controlado por helicase foi observado para o constructo de DNA Lambda, um exemplo de um movimento de DNA controlado por helicase é mostrado na Figura 7. Os espaçadores iSpC3 presentes no constructo de DNA Lambda produziram um nível de bloqueio característico realçado por números 1-3 na Figura 7. O substrato de MuA em formato Y 2 tem quatro espaçadores iSpC3 em cada fita e o substrato de MuA em grampo de cabelo também tem quatro espaçadores iSpC3, cada espaçador iSpC3 permite que mais corrente flua à medida que aquela região do constructo de DNA lambda transloca-se através do nanoporo. Se a preparação de amostra ocorreu com sucesso então os eventos de espaçador iSpC3 serão observados no início do constructo de DNA lambda, no meio (fazendo a transição entre as sequências de senso e de antissenso) e no final. Figura 7 mostra claramente as três situações de fluxo de corrente aumentado que que correspondem às regiões de espaçador iSpC3. Portanto, o procedimento de preparação de amostra eficazmente introduziu substratos de MuA no DNA Lambda para produzir os constructos de DNA Lambda mostrados na Figura 6 (b). Após a captura do DNA pelo nanoporo, a enzima (indicada por A) é posicionada para além da região de dsDNA (onde o grupo de ancoragem hibridiza com o constructo) e os espaçadores pela força do potencial aplicado através do nanoporo. Devido ao uso das inosinas nos substratos de MuA em formato Y 2 e em grampo de cabelo 2, as etapas no procedimento de preparação de amostra foram reduzidas porque quando os substratos de MuA haviam sido inseridos foi necessário somente fechar as quebras de ligação fosfodiéster (nicks) nos constructos de DNA de fita dupla.
[00279] Este Exemplo compara a capacidade de um monômero TrwC Cba (SEQ ID NO: 17), para controlar o movimento de fitas de DNA intactas (lkicfqu"§"gzvtgokfcfg"7Ó"fg"UGS"KF"PQ<"45"guv«q"4:"wpkfcfgu"fg"espaçador kUrE5 c únvkoc fcu swcku Vgo wo cfkekqpcl fg fwcu VÓU nkicfcu § gzVtgokfcfg 7Ó fq itwrq espaçador. nkicfqu § gzvtgokfcfg 5Ó fg UGS KF PQ< 45 guv«q mais quatro espaçadores iSpC3 que est«q lkicfqu § gzvtgokfcfg 7Ó fg UGS KF NO: 24, onde SEQ ID NO: 12 está hibridizada com a região de SEQ ID NO: 23) através de um nanoporo, com aquela do dímero TrwC Cba Q276C- 3,4kDa (onde cada unidade monomérica compreende SEQ ID NO: 17 com a mutação Q276C, com uma unidade monomérica estando ligada à outra via posição 276 de cada unidade monomérica com o uso de um ligante PEG de 3,4 kDa). O constructo de DNA usado neste exemplo é mostrado na Figura 22 (a helicase é capaz de se ligar à região indicada por B). Quando o constructo de DNA é capturado pelo nanoporo, o potencial aplicado através do nanoporo move a enzima para além da região de dsDNA (onde o grupo de ancoragem hibridiza com o constructo) e espaçadores e é observado o movimento de DNA controlado por helicase.
[00280] Após a comparação do movimento controlado por helicase do monômero com o dímero, foi observado que o dímero resultou em uma percentagem maior de movimento de permanência mais longa de DNA controlado por helicase (um movimento de permanência mais longa é um movimento de DNA controlado por helicase que está mais que três desvios padrão afastado da média da população maior de movimentos de DNA controlados por helicase) que o monômero.
[00281] Antes da configuração do experimento, o DNA (1 nM, ligados §"gzvtgokfcfg"7Ó"fg"UGS"KF"PQ<"45"guv«q"4:"wpkfcfgu"fg"espaçador iSpC3 a únvkoc fcu swcku Vgo wo cfkekqpcn fg fwcu VÓU nkicfcu § gzVtgokfcfg 5’ fq grupo espaçador. nkicfqu § gzvtgokfcfg 5Ó fg UGS KF PQ< 45 guv«q ocku quatro espaçadores iSpC3 swg guv«q nkicfqu § gzvtgokfcfg 7Ó fg UGS KF PQ< 24, onde SEQ ID NO: 12 está hibridizada com a região de SEQ ID NO: 23) e a enzima (quer um monômero TrwC Cba (1 nM, SEQ ID NO: 17) quer um dímero TrwC Cba Q276C-3,4kDa (0,3 nM, onde cada unidade monomérica compreende SEQ ID NO: 17 com a mutação Q276C, com uma unidade monomérica estando ligada à outra via a posição 276 de cada unidade monomérica com o uso de um ligante PEG de 3,4 kDa)) foram pré-incubados juntos durante >16 horas.
[00282] Medições elétricas foram adquiridas de únicos nanoporos MspA MS(G75S/G77S/L88N/Q126R)8 MspA (SEQ ID NO: 2 com as mutações G75S/G77S/L88N/ Q126R) inseridas em copolímero em bloco em tampão (KCl 625 mM, HEPES 100 mM, ferrocianeto (II) de potássio 75 mM, ferricianeto (III) de potássio 25 mM, pH 8). MgCl2 (10 mM) e dTTP (5 mM) foram misturados juntos com o tampão (KCl 625 mM, HEPES 100 mM, ferrocianeto (II) de potássio 75 mM, ferricianeto (III) de potássio 25 mM, pH 8) e então adicionados à pré-mistura de DNA (constructo previamente descrito), enzima (quer um monômero TrwC Cba (1 nM, SEQ ID NO: 17) quer um dímero TrwC Cba Q276C-3,4kDa (1 nM, onde cada unidade monomérica compreende SEQ ID NO: 17 com a mutação Q276C, com uma unidade monomérica estando ligada à outra via a posição 276 de cada unidade monomérica com o uso de um ligante PEG de 3,4 kDa)). Após produzir um único poro na bicamada, a pré-mistura foi adicionada ao sistema experimental de único nanoporo. Os experimentos foram realizados em um potencial constante de +120 mV e foi monitorado o movimento de DNA controlado por helicase.
[00283] O movimento de DNA controlado por helicase foi observado para um monômero de helicase TrwC Cba (SEQ ID NO: 17) e um dímero de helicase TrwC Cba Q276C-3,4kDa (onde cada unidade monomérica compreende SEQ ID NO: 17 com a mutação Q276C, com uma unidade monomérica estando ligada à outra via a posição 276 de cada unidade monomérica com o uso de um ligante PEG de 3,4 kDa). Após a captura do constructo de DNA pelo nanoporo a helicase foi movida para além da região de dsDNA (onde o grupo de ancoragem hibridiza com o constructo) e os espaçadores e foi observado o movimento controlado por helicase.
[00284] Dos movimentos de DNA controlados por helicase observados há uma população maior que totaliza cerca de 95% dos movimentos detectados, entretanto, há uma percentagem pequena de movimentos que estão significativamente mais longe em tempo de permanência (mais que três desvios padrão afastados da média da população maior de movimentos de DNA controlados por helicase). Estes movimentos mais longos permitem a análise de dados aprimorada. Quando o dímero TrwC Cba Q276C-3,4kDa (1 nM) foi usado para controlar o movimento de DNA foi então observada uma percentagem muito mais alta (20% para o dímero TrwC Cba Q276C-3,4kDa em comparação com e 5% para o monômero TrwC Cba) destes movimentos de tempo de permanência mais longo (mais que três desvios padrão afastados da média da população maior de movimentos de DNA controlados por helicase). O uso da helicase dimérica fornece uma vantagem em relação ao monômero porque permite análise de dados aprimorada no sistema de sequenciamento em nanoporo.
[00285] Este Exemplo ilustra que as unidades de separador Sp9 podem ser usadas para imobilizar o movimento de Hel308 Mbu (SEQ ID NO: 28) (quando fornecido com ambos ATP e MgCl2) em um ensaio baseado em fluorescência para testar a atividade da enzima.
[00286] Três substratos fluorescentes adaptados diferentes (A = (fitas de controle não contendo espaçadores) SEQ ID NOs: 25 e 26, B = (fita contendo um único espaçador Sp9) SEQ ID NO: 27 ligada por meio de sua gzvtgokfcfg"5Ó"rqt"wo"espaçador Ur;"§"gzvtgokfcfg"7Ó"fg"UGS"KF"PQ<"4;"g" hibridizada com SEQ ID NO: 26, C = (fita contendo quatro Sp9) SEQ ID NO: 27 ligada por meio de uwc" gzvtgokfcfg" 5Ó" rqt" swcvtq" espaçadores Sp9 à gzVtgokfcfg 7’ fg UGS KF PQ< 4; g jidrifizcfc eqo UGS KF PQ< 48+ fotcm usados para testar a capacidade de Hel308 Mbu (SEQ ID NO: 28) para deslocar dsDNA hibridizado. DNA marcado com FAM (para substrato fluorescente A = SEQ ID NO: 25, B = SEQ ID NO: 27 ligada por sua gzVtgokfcfg 50 c wm espaçador Ur; swg guVá niicfq § gzVtgokfcfg 3’ fg UGS KF PQ< 4;. E ? UGS KF PQ< 49 niicfc rgnc uwc gzvtgoifcfg 5Ó cqu swcvtq espaçadorgu Ur; swg guV«q nkicfqu § gzVtgokfcfg 5’ fe SEQ ID NO: 29) é anelado à fita parcialmente complementar que tem um black-hole quencher nkicfq § uwc gzVtgokfcfg 5’ *UGS KF PQ< 48+ go woc tcz«q fg wo rctc wo (1 μM de cada fita) em KCl 400mM, HEPES 100mM pH8, MgChlOmM, BSA1mg/ml. As fitas foram aneladas à temperatura ambiente durante 30 minutos. O DNA anelado (A = SEQ ID NOs: 25 e 26, B = SEQ ID NO: 27 nkicfc rqt ogkq fg uwc gzVtgokfcfg 5’ rqt wo espaçador Sp9 à extremidade 7’ fg UGS KF PQ< 4; g jkdtkfkzcfc eqo UGS KF PQ< 48. E ? UGS KF PQ< 27 ligada pqt ogkq fg uwc gzVtgokfcfg 5’ rqt swcVtq espaçadores Sp9 à gzVtgokfcfg 7’ fg UGS KF PQ< 4; g jkdtkfkzcfc eqo UGS KF PQ< 48+ hqk diluído para 50 nM em KCl 400 mM, HEPES 100 mM pH8, MgCl2 10 mM, BSA 1 mg/mL, ATP 1 mM (1μM de DNA de captura (SEQ ID NO: 27 também presente). Uma amostra de Hel308 Mbu (SEQ ID NO: 28) foi diluída para 475nM em KCl 400mM, HEPES 100mM pH8, MgCl2 10mM, BSA 1mg/ml. Hel308 Mbu (12 nM) foi então testada (como descrito abaixo e mostrado nas Figuras 8 e 9) em relação a 48,75 nM de DNA anelado em KCl 400mM, HEPES 100mM pH8, MgCl210mM, BSA 1mg/ml, ATP 0,975 mM (0,975 μM de DNA de captura também presente).
[00287] A fita de controle A é mostrada na Fig. 8, onde em 1A) a fita fg uwduVtcVq flwqtguegpVg *6:,97 pO hkpcl+ Vgo ucliêpeic 3’ uuFPC. g woc seção de 40 bases de dsDNA hibridizado. A fita superior, contendo a saliência 50 uuFPC, Vgo woc dcug eqpVgpfq ectdqzihlwqtguegipc liicfc § gzVtgmifcfg 70 fg UGS KF PQ< 47, g q eqorlgogpVq jidtifizcfq Vgo woc dcug black-hole quencher (BHQ-1) ligada à extremidafg 5Ó fg UGS KF PQ< 480 Swcpfq hibridizada a fluorescência da fluoresceína é inativada pela BHQ-1 local, e o substrato é essencialmente não fluorescente. 1 μM de uma fita de captura (SEQ ID NO: 27) que é parcialmente-complementar à fita inferior do substrato fluorescente é incluído no teste. Como mostrado em 2A), na presença de ATP (0,975 mM) e MgCl2 (10 mM), helicase (12 nM) adicionada ao substrato liga-ug § ecwfc 5Ó fq uwduVtcVq hlwqtguegpVg, oqxg-se ao longo da fita superior, e desloca a fita complementar. Como mostrado em 3A), quando a fita complementar com BHQ-1 é totalmente deslocada a fluoresceína na fita maior fluoresce. Como mostrado em 4A), a fita desloca preferencialmente anela-se com um excesso de fita de captura para evitar reanelamento de substrato inicial e a perda de fluorescência. A Figura 9 mostra as etapas do ensaio para as fitas B (1B-3B) e C (1C-3C), para estas fitas os espaçadores Sp9 param a helicase e evitam que ela se separe da fita com a fluoresceína ligada da fita com o black hole quencher ligado.
[00288] O gráfico na Figura 10 mostra a taxa inicial de atividade em solução tampão (HEPES 100 mM pH8,0, ATP 0,975 mM, MgCl2 10 mM, BSA 1 mg/mL, substrato fluorescente DNA 48,75 nM (substratos A, B e C como discutido acima), 0,975 μM de DNA de captura (SEQ ID NO: 27)) para Hel308 Mbu (indicada por A nas Figuras 8 e 9; SEQ ID NO: 28) a 400 mM de KCl. Na concentração de sal investigada a Hel308 Mbu (SEQ ID NO: 28) apresentou taxa de utilização de dsDNA da fita de controle A. Entretanto, a Figura 10 indica claramente que para ambos os constructos que têm espaçadores Sp9 na sequência (B (um espaçador Sp9) e C (quatro espaçadores Sp9)) a taxa de utilização de dsDNA foi eliminada. Isto indica que na presença de ATP e MgCl2 os espaçadores Sp9 param a enzima Hel308 Mbu em solução livre.
[00289] Este Exemplo ilustra que grupos idSp podem ser usados para imobilizar o movimento de Hel308 Mbu (SEQ ID NO: 28) (quando fornecida com ambos ATP e MgCl2) em um ensaio à base de fluorescência para testar a atividade da enzima.
[00290] Quatro substratos fluorescentes adaptados diferentes (D = (fita de controle não contendo espaçadores) SEQ ID NOs: 32 e 26, E = (fita contendo um único espaçador idSp) SEQ ID NO: 27 ligada por meio de sua gzvtgokfcfg"5Ó"rqt"wo"itwrq"kfUr"§"gzvtgokfcfg"7Ó"fg"UGS"KF"PQ<"52"g" hibridizada com SEQ ID NO: 26, F = (fita contendo quatro idSp) SEQ ID PQ<"49"nkicfc"rqt"ogkq"fg"uwc"gzvtgokfcfg"5Ó"rqt"swcvtq"itwrqu"kfUr"§" gzVtgokfcfg 70 fg UGS KF PQ< 53 g jidtifizcfc com SEQ ID NO: 26 e G = (segunda fita de controle não contendo espaçadores) SEQ ID NOs: 33 e 26) foram usados para testar a capacidade de Hel308 Mbu (SEQ ID NO: 28) para deslocar dsDNA hibridizado. DNA marcado com FAM (para substrato fluorescente D = SEQ ID NO: 32, E = SEQ ID NO: 27 ligada por sua gzVtgokfcfg 3’ c wo itwrq ifUr swg guVá niicfq § gzVtgoifcfg 3’ fg UGS KF PQ< 52. H ? UGS KF PQ< 49 nkicfc rqt uwc gzvtgokfcfg 5Ó c swcvtq itwrqu ifUr swg guV«q niicfqu § gzVtgoifcfg 5Ó fg UGS KF PQ< 53 g I ? UGS ID NO: 33) é anelado à fita parcialmente complementar que tem um black-hole quencher niicfq § uwc gzVtgokfcfg 3’ *UGS KF PQ< 48+ gm wma taz«q fg 3 para 1,2 (1:1,2 μM) em KCl 400mM, HEPES 100 mM pH8, MgCh 10 mM, BSA 1 mg/mL. As fitas foram aneladas à temperatura ambiente durante 15 minutos. O DNA anelado (D = SEQ ID NOs: 32 e 26, E = SEQ ID NO: 27 niicfc rqt ogiq fg uwc gzVtgoifcfg 5’ rqt wo itwrq ifUr § gzVtgoifcfg 7’ fg SEQ ID NO: 30 e hibridizada com SEQ ID NO: 26, F = SEQ ID NO: 27 ligada por meio de swc gzVtgoifcfg 5’ rqt swcVtq itwrqu ifUr § gzVtgoifcfg 7’ fg UGS KF PQ< 33 g jidtifizcfc eqm UGS KF PQ< 48 g G = SEQ ID NOs: 33 e 26) foi diluído para 50 nM em KCl 400 mM, HEPES 100 mM pH8, MgCl2 10 mM, BSA 1 mg/mL, ATP 1 mM (1μM de DNA de captura (SEQ ID NO: 27 também presente). Hel308 Mbu (12 nM) foi então testada (como previamente descrito no Exemplo 5 (exceto os constructos de DNA são diferentes e contêm grupos idSp no lugar de espaçadores Sp9) e mostrado nas Figuras 8 e 9 (de novo onde os grupos Sp9 nestas figura estão substituídos por grupos idSp)) em relação a 48,75 nM de DNA anelado em KCl 400 mM, HEPES 100 mM pH8, MgCl2 10 mM, BSA 1 mg/mL, ATP 0,975 mM (0,975 μM de DNA de captura também presente).
[00291] O gráfico na Figura 11 mostra a taxa inicial de atividade em solução tampão (HEPES 100 mM pH 8,0, ATP 0,975 mM, MgCl2 10 mM, BSA 1 mg/mL, substrato fluorescente DNA 48,75 nM (substratos D, E, F e G como discutidos acima), 0,975 μM de DNA de captura (SEQ ID NO: 27)) para da Hel308 Mbu (indicada por A em Figuras 8 e 9; SEQ ID NO: 28) a 400 mM de KCl. Na concentração de sal investigada a Hel308 Mbu (SEQ ID NO: 28) apresentou taxa de utilização de dsDNA das fitas de controle D e G. Entretanto, a Figura 11 indica claramente que para o construto que tem quatro espaçadores idSp na sequência (F) a taxa de utilização de dsDNA foi eliminada. Isto indica que na presença de ATP e MgCl2 os quatro grupos idSp param a enzima Hel308 Mbu em solução livre.
[00292] Este Exemplo ilustra um ensaio à base de gel que foi usado para medir a capacidade de espaçadores iSpC3 e de espaçadores iSp18 para imobilizar o movimento de T4 Dda - E94C/A360C.
[00293] Os complexos de DNA anelados (sequências testadas são mostradas na tabela 11 abaixo) foram misturados em uma razão de (1:1, v/v) com T4 Dda - E94C/A360C em fosfato 25 mM pH 8,0, KCl 200 mM dando concentrações finais de T4 Dda - E94C/A360C (2.000 nM) e de DNA (100 nM). A helicase foi permitida se ligar ao DNA durante 2 horas à temperatura ambiente. A fita de captura (SEQ ID NO: 37, 20 μM) foi adicionada a cada amostra para se ligar a alguma enzima não ligada e as amostras foram incubadas à temperatura ambiente durante 30 minutos. Tampão foi adicionado às amostras (o constructo de DNA da tabela 11 = 50 nM, DNA de captura (SEQ ID NO: 37) = 10 μM e T4 Dda - E94C/A360C = 1.000 nM) e foram incubados à temperatura ambiente durante uma hora (quer no Tampão 1 = fosfato 25 mM pH 8,0, KCl200 mM, MgCl2 20 mM, ATP 10 mM quer no Tampão 2 = fosfato 25 mM pH 8, KCl 0,1 M, ferricianeto (III) de potássio 25 mM, ferrocianeto de potássio 75 mM, MgCl2 20 mM, ATP10 mM). Tampão de carregamento (Fosfato 25mM pH 8,0, KCl 151,5 mM, Glicerol 25%, EDTA 125mM) é adicionado a cada amostra para inativar a atividade de helicase. As amostras foram carregadas sobre gel contendo 4-20% de TBE e a corrida no gel foi a 160 V durante 1,5 horas. O Gel foi corado com ouro SYBR com o propósito de observar as bandas de DNA.
Tabela 11
[00294] A Figura 12 mostra o gel do experimento de controle positivo onde o constructo de DNA não contém espaçadores para imobilizar a helicase (T4 Dda - E94C/A360C). A pista 2 da Figura 14 mostra que até 5 enzimas helicase podem se ligar à seção de fita única de SEQ ID NO: 34. Após a adição de ATP e MgCl2, as bandas mais altas correspondendo ao constructo de dsDNA ligado às múltiplas enzimas desaparecem e a banda correspondendo ao constructo de ssDNA (indicado por X e correspondendo à SEQ ID NO: 34 apenas) aumenta em intensidade. Isto indica que quando a helicase é fornecida com combustível ela move-se ao longo do DNA e desloca a fita complementar hibridizada (SEQ ID NO: 35).
[00295] A Figura 15 mostra um exemplo de um gel mostrando o experimento de atividade de enzima para os constructos de DNA 7-9 da tabela 11 (por exemplo DNA que tem três, quatro ou cinco espaçadores iSp18 imediatamente antes da junção de ssDNA/dsDNA). As pistas 1-4 correspondem a três espaçadores iSp18, as pistas 5-7 correspondem aos quatro espaçadores iSp18 e as pistas 9-12 correspondem a cinco espaçadores iSp18. As pistas 2, 6 e 10 mostram que, similarmente ao controle, até cinco enzimas helicase podem se ligar à seção de fita única dos constructos de DNA 7-9 na tabela 11. Após a adição de ATP e MgCl2 as helicases serão fornecidas com componentes necessários com o propósito de se moverem ao longo da fita de DNA. As pistas 3-4, 7-8 e 11-12 mostram os vários constructos de DNA sob duas condições de tamponamento diferentes (tampão 1 e 2) após a adição de ATP e MgCl2. Duas bandas são claramente visíveis na região indicada por 1Y e 1X. 1Y corresponde ao constructo de dsDNA com uma helicase imobilizada e ligada. Isto mostra que três, quatro e cinco espaçadores iSp18 são capazes de imobilizar a helicase sob as condições testadas. 1X corresponde ao constructo de ssDNA com uma helicase imobilizada e ligada. Esta banda resultou de múltiplas helicases se ligando ao constructo de DNA e as helicases empurrando a helicase da frente para além dos grupos paradores, deslocando assim a banda complementar curta (SEQ ID NO: 35). Entretanto, esta banda ainda tem um helicase ligada porque uma única helicase não pode se mover para além dos espaçadores iSp18 (por exemplo resulta a espécie E na Figura 13). No caso do uso de 4 e 5 espaçadores iSp18 para imobilizar a helicase, há bandas esmaecidas em nível 2Y. Isto mostra que sob as condições testadas, quando 4/5 espaçadores iSp18 são usados é possível imobilizar o movimento de até duas helicases.
[00296] Das outras combinações de espaçadores investigadas (entradas 2-6 da tabela 11) em pelo menos uma das condições de tamponamento testadas ambos os espaçadores iSpC3 e iSp18 foram capazes de imobilizar uma helicase. Das duas condições de tamponamento testadas, de modo geral imobilizada mais eficaz foi observada para o tampão 2 do que para o tampão 1. Quanto maior o número de espaçadores incluídos maior a eficácia de imobilizada das helicases sob as condições testadas.
[00297] Este Exemplo investiga o número de bases necessárias para controlar a ligação de apenas uma ou duas helicases T4 Dda - E94C/A360C em uma região específica.
[00298] Constructos de DNA (concentração final de 1 μM ou 100 nM) detalhados abaixo na tabela 12 foram incubados em tampão apropriado com T4 Dda - E94C/A360C serialmente diluída. As amostras foram então carregadas sobre géis contendo 4-20% de TBE e corridas a 160 V durante 90 minutos. Os géis contendo as entradas 1-6 foram então corados com o uso de SYBR. A Figura 16 mostra o tipo de constructo de DNA usado neste experimento. O comprimento da região indicada por 1 é variado de 2 a 50 para otimizar as condições de modo que seja possível controlar o número de helicases T4 Dda - E94C/A360C que podem se ligar ao DNA.
Tabela 12
[00299] Cada um dos constructos de DNA listados na tabela 12 foram investigados para determinar quantas enzimas podem se ligar à região 1 (mostrada na Figura 16) que tem sido variada de 2 bases a 50 bases. Para cada um dos constructos de DNA testados apenas uma única banda para DNA não ligado foi observada quando não foi adicionada helicase. Sob as condições investigadas, foi observado que o constructo 4 (que tem uma região de ligação de 2 bases timina) e o constructo 5 (que tem uma região de ligação de 4 bases timina) não permitem que nenhumas helicases se liguem em nenhuma concentração (consulte a tabela 14). Foi observado que o constructo 6 (que tem uma região de ligação de 8 bases timina, consulte a tabela 14) e o constructo 1 (que teve uma região de ligação de 10 bases timina) ligam uma helicase apenas (consulte a tabela 13). O constructo 2 que tem uma região de ligação de 20 bases timina permitiu que duas enzimas se liguem nas concentrações mais altas testadas e o constructo 3 que tem uma região de ligação de 50 bases timina permitiu que até 6 enzimas se liguem nas concentrações mais altas testadas (consulte a Figura 17 para o gel que mostra este experimento consulte a tabela 13). Os constructos 1-6 usaram espaçadores iSpC3 para evitar a ligação da helicase à junção da região de ssDNA/dsDNA. Os constructos 7 e 8 usaram espaçadores iSp18 para evitar a ligação da helicase à junção da região de ssDNA/dsDNA. Tanto o constructo 7 (que tem uma região de ligação de 16 timinas) quanto o constructo 8 (que tem uma região de ligação de 18 timinas) permitiram que até duas helicases se liguem sob as condições testadas (consulte a tabela 15). Portanto, as regiões de ligação de comprimento maior que 8 bases de timina permitem que pelo menos uma enzima se ligue aos constructos de DNA.
Tabela 13 
Tabela 14 
Tabela 15
[00300] Este Exemplo investiga a concentração de helicase T4 Dda - E94C/A360C que quando adicionada ao constructo de DNA X (descrito e mostrado na Figura 18) resulta na ligação de duas helicases.
[00301] Dois constructos de DNA foram testados um dos quais tem uma fita complementar de DNA que não é de formato em formato de garfo (SEQ ID NO: 42 está hibridizada com o constructo de DNA mostrado na Figura 18) e um que é de formato em formato de garfo (SEQ ID NO: 12 (que tem 6 espaçadorgu kUpi: nkicfqu § gzVtgokfcfg 3’+ guVá jkdtkfkzcfq eqo q constructo de DNA mostrado na Figura 18). As fitas de DNA mostradas na tabela 16 foram aneladas a 1 μM em fosfato 25 mM pH 8,0, KCl 1515,5 mM (um excesso de 10% de fitas complementares SEQ ID NO: 43 (em entradas 9 e 10 abaixo) e SEQ ID NO: 12 (entrada 10 abaixo) ou SEQ ID NO: 42 (entrada 9 abaixo) foi usada).
Tabela 16
[00302] T4 Dda - E94C/A360C foi extraída com tampão em fosfato 25 mM pH 8,0, KCl 151,5 mM e serialmente diluída. A helicase e o DNA foram então misturados (1:1, v/v) com as amostras de constructo de DNA 9 e 10 descritas acima (concentração final de DNA = 100 nM, concentrações de helicase investigadas = 3800 nM, 1.900 nM, 950 nM, 475 nM, 238 nM, 0 nM). Os volumes de DNA e de enzima foram então incubados à temperatura ambiente durante 1,5 horas. Tampão de carregamento isento de corante (5x, 7,5 μL) foi adicionada à cada amostra (30 μL). Cada amostra (37,5 μL) foi então carregada sobre gel contendo de 4-20% de TBE e corrida a 160 V durante 90 minutos. O gel foi então corado com o uso de SYBR.
[00303] Os dois constructos de DNA listados na tabela 16 foram investigados para determinar qual concentração de helicase T4 Dda - E94C/A360C é necessária com o objetivo de facilitar a ligação de duas helicases. Para cada um dos constructos de DNA testados apenas uma única banda para DNA não ligado foi observada quando nenhuma helicase foi adicionada. Sob as condições investigadas, foi observado que ambos os constructos 9 (constructo não em formato de garfo ) e 10 (em formato de garfo) ligam-se a uma helicase a partir da helicase a 238 nM e a duas enzimas a partir de concentração de 475 nM e mais alta. À medida que a concentração de enzima era aumentada a banda correspondendo às duas enzimas ligadas aumentou em intensidade. O projeto do constructo de DNA mostrado na Figura 18 permite a ligação de apenas duas enzimas em concentrações tão altas quanto 3.800 nM. Portanto, os espaçadores investigados não permitem que uma helicase se ligue a eles quando os constructos são pré-incubados.
[00304] Este Exemplo mostra como a T4 Dda - E94C/A360C é imobilizada por quatro espaçadores iSp18 em solução livre até que o constructo (constructo de DNA X1) seja capturado pelo nanoporo. Após a captura a força do potencial aplicado move a enzima T4 Dda - E94C/A360C para além do espaçador parador e permite o movimento de DNA controlado por enzima do constructo lambda através do nanoporo.
[00305] Antes da configuração do experimento, o constructo de DNA X1 (0,13 μL, 100nM) e T4 Dda - E94C/A360C (15,6 μL, 250nM) foram pré- incubados juntos durante 1 hora à temperatura ambiente em tampão (fosfato de potássio 50 mM, KCl 253 mM, pH 8,0).
[00306] Medições elétricas foram realizadas a 30°C (pelo posicionamento do sistema experimental sobre uma placa esfriadora) de únicos nanoporos MspA (MspA - B2C) inseridos em copolímero em bloco em tampão (KCl 600 mM, fosfato de potássio 25 mM, ferrocianeto (II) de potássio 75 mM, ferricianeto (III) de potássio 25 mM, pH 8). Após a obtenção de um único poro inserido no copolímero em bloco, então o tampão (1 mL, KCl 600 mM, fosfato de potássio 25 mM, ferrocianeto (II) de potássio 75 mM, ferricianeto (III) de potássio 25 mM, pH 8) foi fluído através do sistema para remover algum excesso de nanoporos MspA (MspA - B2C). Ferricianeto (III) de potássio (concentração final de 200 μM) foi adicionado à pré-mistura de DNA (concentração final de 0,1 nM), enzima (concentração final de 3 nM) e deixado incubar durante um minuto antes que MgCl2 (concentração final de 10 mM) e ATP (concentração final de 1 mM) fossem misturados juntos com o tampão (1.260 μL, KCl 600 mM, fosfato de potássio 25 mM, ferrocianeto (II) de potássio 75 mM, ferricianeto (III) de potássio 25 mM, pH 8). Esta mistura experimental foi então adicionada ao sistema experimental de único nanoporo. Os experimentos foram realizados durante seis horas após um processo de inversão de potencial (+180 mV durante 2 s, então 0 V durante 2 s, então -120 mV durante 3.600s (x6 repetições) aplicado no lado cis) e foi monitorado o movimento de DNA controlado por helicase.
[00307] O constructo de DNA é mostrado na Figura 20. A T4 Dda - E94C/A360C é capaz de se ligar à região do constructo indicada por A (SEQ ID NO: 9) quando pré-incubada com o constructo de DNA. Entretanto, a enzima não é capaz de se mover para além dos grupos paradores (quatro espaçadores iSp18) quando em solução livre (indicados como quadrados pretos). Portanto, a enzima é imobilizada nos espaçadores iSp18 (indicado por B na Figura 1) até o constructo de DNA ser capturado pelo nanoporo. Quando capturado pelo nanoporo, a força do potencial aplicado move a enzima T4 Dda - E94C/A360C para além do espaçador parador (quatro espaçadores iSp18) e permite o movimento de DNA controlado por enzima do constructo de DNA X1 através do nanoporo. Um exemplo de um movimento de DNA controlado por helicase é mostrado na Figura 21. A seção indicada por 1 mostrou quando a região pT de SEQ ID NO 38 translocou através do nanoporo sob o controle da helicase. A seção indicada por 2 mostrou quando o espaçador iSp18 translocou através do nanoporo sob o controle da helicase. Foi observado que a helicase tem um ponto de início (resultante da imobilizada da helicase pelos espaçadores iSp18) porque os eventos de helicase observados mostraram a região pT e o sinal iSp18 no início dos movimentos de DNA controlados por helicase.
Claims (25)
1. Método para mover uma ou mais helicases imobilizadas para além de um ou mais espaçadores em um polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de compreender: contatar (a) um polinucleotídeo compreendendo um ou mais espaçadores, em que uma ou mais helicases são imobilizadas nos espaçadores, com um poro de transmembrana e (b) aplicar um potencial através do poro e assim mover as uma ou mais helicases para além dos um ou mais espaçadores no polinucleotídeo.
2. Método para controlar o movimento de um polinucleotídeo alvo através de um poro de transmembrana, caracterizado pelo fato de compreender: (a) fornecer o polinucleotídeo alvo com um ou mais espaçadores; (b) contactar o polinucleotídeo alvo com uma ou mais helicases de tal modo que as uma ou mais helicases parem nos um ou mais espaçadores; (c) contactar o polinucleotídeo alvo e as uma ou mais helicases imobilizadas com o poro; e (d) aplicar um potencial através do poro de tal modo que as uma ou mais helicases movam-se para além dos um ou mais espaçadores e controlar o movimento do polinucleotídeo alvo através do poro.
3. Método para caracterizar um polinucleotídeo alvo, caracterizado pelo fato de compreender: (a) realizar o método conforme definido na reivindicação 2; e (b) realizar uma ou mais medições à medida que o polinucleotídeo se move com relação ao poro sendo que as medições são indicativas de uma ou mais características do polinucleotídeo e assim caracterizar o polinucleotídeo alvo.
4. Método de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que fornecer o polinucleotídeo alvo com um ou mais espaçadores compreende modificar o polinucleotídeo alvo de modo que ele compreenda um ou mais espaçadores.
5. Método de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que as uma ou mais características são (a) selecionadas dentre (i) o comprimento do polinucleotídeo alvo, (ii) a identidade do polinucleotídeo alvo, (iii) a sequência do polinucleotídeo alvo, (iv) a estrutura secundária do polinucleotídeo alvo, (v) se o polinucleotídeo alvo está ou não modificado e (vi) se o polinucleotídeo alvo é modificado por metilação, por oxidação, por dano, com uma ou mais proteínas ou com um ou mais marcadores, com uma ou mais etiquetas ou com um ou mais espaçadores; (b) medidas por medição elétrica e/ou medição óptica; ou (c) medida por uma medição de corrente, uma medição de impedância, uma medição por tunelamento ou uma medição por transistor de efeito de campo (FET).
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que as uma ou mais helicases controlam o movimento do polinucleotídeo alvo através do poro com o campo resultante do potencial aplicado.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que (a) os um ou mais espaçadores têm uma estrutura diferente do polinucleotídeo; (b) o polinucleotídeo é ácido desoxirribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA) e os um ou mais espaçadores compreendem ácido peptídeo-nucleico (PNA), ácido glicerol-nucleico (GNA), ácido treose- nucleico (TNA), ácido nucleico bloqueado (LNA) ou um polímero sintético com cadeias laterais de nucleotídeos; (c) os um ou mais espaçadores compreendem um ou mais nitroindóis, uma ou mais inosinas, uma ou mais acridinas, uma ou mais 2- aminopurinas, uma ou mais 2-6-diaminopurinas, uma ou mais 5-bromo- desoxiuridinas, uma ou mais timidinas invertidas (dTs invertidas), uma ou mais didesoxitimidinas invertidas (ddTs), uma ou mais didesoxicitidinas (ddCs), uma ou mais 5-metilcitidinas, uma ou mais 5-hidroximetilcitidinas, uma ou mais bases de 2’-O-Metil-RNA, uma ou mais Iso-desoxicitidinas (IsodCs), uma ou mais Iso-desoxiguanosinas (Iso-dGs), um ou mais grupos C3, um ou mais grupos fotocliváveis (PC), um ou mais ou grupos hexanodiol, um ou mais grupos espaçadores 9 (iSp9), um ou mais grupos espaçadores 18 (iSp18), um polímero ou uma ou mais conexões tiol; (d) os um ou mais espaçadores compreendem um polipeptídeo ou um poli(glicol etilênico) (PEG); (e) os um ou mais espaçadores compreendem um ou mais nucleotídeos abásicos; (f) os um ou mais espaçadores compreendem um ou mais grupos químicos que causam a imobilização das uma ou mais helicases; (g) os um ou mais espaçadores compreendem um ou mais grupos químicos que causam a imobilização das uma ou mais helicases e o um ou mais grupos químicos são um ou mais fluoróforos, estreptavidina e/ou biotina, colesterol, azul de metileno, um dinitrofenol (DNP), digoxigenina e/ou antidigoxigenina ou um grupo dibenzilciclo-octino; (h) os um ou mais espaçadores são capazes de imobilizar as uma ou mais helicases na presença de nucleotídeos livres e/ou na presença de um cofator de helicase; (i) os um ou mais espaçadores são capazes de imobilizar as uma ou mais helicases em uma concentração de sal de cerca de 100 mM ou menor; ou (j) os um ou mais espaçadores estão incluídos no polinucleotídeo e/ou não são parte de uma ou mais moléculas bloqueadoras hibridizadas com o polinucleotídeo.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o método compreende (i) mover duas ou mais helicases imobilizadas para além de cada espaçador, (ii) mover duas ou mais helicases ligadas uma à outra para além de cada espaçador, ou (iii) mover duas ou mais helicases covalentemente ligadas uma à outra para além de cada espaçado.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que (a) pelo menos uma porção do polinucleotídeo é de fita dupla; (b) pelo menos uma porção do polinucleotídeo é de fita dupla e os um ou mais espaçadores estão incluídos em uma região de fita única ou uma região não hibridizada do polinucleotídeo; (c) pelo menos uma porção do polinucleotídeo é de fita dupla e os um ou mais espaçadores estão incluídos em uma região de fita única que compreende uma sequência líder que preferencialmente entra dentro do poro; (d) pelo menos uma porção do polinucleotídeo é de fita dupla e as duas fitas da porção de fita dupla são ligadas com o uso de uma porção de ligação por ponte; ou (e) pelo menos uma porção do polinucleotídeo é de fita dupla, as duas fitas da fita dupla estão ligadas com o uso de uma porção de ligação por ponte e os um ou mais espaçadores estão incluídos na porção de ligação por ponte.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que as uma ou mais helicases são: (a) uma ou mais helicases Hel308, uma ou mais helicases RecD, uma ou mais helicases XPD ou uma ou mais helicases Dda; (b) uma ou mais helicases derivadas dentre qualquer uma das helicases em (a); ou (c) uma combinação dentre quaisquer das helicases em (a) e/ou (b).
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o poro é: (a) um poro de proteína de transmembrana ou um poro no estado sólido; (b) um poro de proteína de transmembrana derivado de uma hemolisina, leucocidina, porina A de Mycobacterium smegmatis (MspA), MspB, MspC, MspD, lisenina, porina F de membrana externa (OmpF), porina G de membrana externa (OmpG), fosfolipase A de membrana externa, lipoproteína autotransportadora de Neisseria (NalP) e WZA; (c) formado de oito subunidades idênticas como mostrado em SEQ ID NO: 2; ou (d) formado de sete subunidades idênticas como mostrado em SEQ ID NO: 4.
12. Uso de um poro de transmembrana e de um potencial aplicado, caracterizado pelo fato de ser para mover uma ou mais helicases imobilizadas para além de um ou mais espaçadores em um polinucleotídeo.
13. Uso de um ou mais espaçadores, caracterizado pelo fato de ser para imobilizar uma ou mais helicases em um polinucleotídeo antes do polinucleotídeo ser contatado com um poro de transmembrana.
14. Método para controlar o carregamento de uma ou mais helicases em um polinucleotídeo alvo, caracterizado pelo fato de compreender: (a) fornecer o polinucleotídeo alvo com um ou mais espaçadores; e (b) contactar o polinucleotídeo alvo fornecido em (a) com as uma ou mais helicases de tal modo que as uma ou mais helicases se liguem ao polinucleotídeo alvo e parem em cada espaçador.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) compreende modificar o polinucleotídeo alvo de modo que ele compreenda um ou mais espaçadores e/ou em que o polinucleotídeo alvo é fornecido com um ou mais espaçadores (L-S)n ou (S- L)n na direção 5’ para 3’, sendo que L é um polinucleotídeo de fita única ou um polinucleotídeo não hibridizado, S é um espaçador e n é um número inteiro.
16. Método de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) compreende contactar o polinucleotídeo alvo fornecido em (a) com as uma ou mais helicases de modo que as uma ou mais helicases se liguem ao polinucleotídeo alvo e uma helicase pare em cada espaçador.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) compreende fornecer o polinucleotídeo alvo com (L1-S)n ou (S-L1)n na direção 5’ para 3’, sendo que L é um polinucleotídeo de fita única ou um polinucleotídeo não hibridizado que é apenas suficientemente longo para uma helicase se ligar, S é um espaçador e n é um número inteiro.
18. Método de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) compreende contactar o polinucleotídeo alvo fornecido em (a) com as uma ou mais helicases de tal modo que as uma ou mais helicases se liguem ao polinucleotídeo alvo e duas helicases parem em cada espaçador.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) compreende fornecer o polinucleotídeo alvo com (L2-S)n ou (S-L2)n na direção 5’ para 3’, sendo que L é um polinucleotídeo de fita única ou um polinucleotídeo não hibridizado que é apenas suficientemente longo para duas helicases se ligarem, S é um espaçador e n é um número inteiro.
20. Método de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que as duas helicases imobilizadas em cada espaçador são diferentes uma da outra ou em que as duas helicases imobilizadas em cada espaçador são ligadas uma à outra ou covalentemente ligadas uma à outra.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, o dito método caracterizado pelo fato de compreender: (a) fornecer o polinucleotídeo alvo com (L2-S)n ou (S-L2)n na direção 5’ para 3’, sendo que L é um polinucleotídeo de fita única ou um polinucleotídeo não hibridizado que é apenas suficientemente longo para duas helicases se ligarem, S é um espaçador e n é um número inteiro; (b) hibridizar um polinucleotídeo bloqueador com parte de cada região L2 de modo que a parte restante de cada região L2 seja apenas suficientemente longa para se ligar a uma helicase; (c) contactar o polinucleotídeo alvo produzido em (b) com uma ou mais helicases de tal modo que uma helicase se ligue à parte restante de cada região L2; (d) fornecer as uma ou mais helicases ligadas em (c) com nucleotídeos livres e um cofator de helicase de tal modo que removam cada polinucleotídeo bloqueador e parem em cada espaçador S; e (e) contactar o polinucleotídeo alvo produzido em (d) com uma ou mais helicases que são diferentes daquelas usadas em (c) de tal modo que uma helicase diferente se ligue à cada região L2 e seja imobilizada por cada espaçador e cada helicase imobilizada em (d).
22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 21, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é fornecido com dois ou mais espaçadores e/ou em que as uma ou mais helicases imobilizadas são movidas para além dos um ou mais espaçadores com o uso do método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11.
23. Complexo para controlar o movimento de um polinucleotídeo alvo, o dito complexo, caracterizado pelo fato de compreender (a) um adaptador compreendendo (L-S-D)n ou (D-S-L)n na direção 5’ para 3’, sendo que L é um polinucleotídeo de fita única ou um polinucleotídeo não hibridizado, S é um espaçador e D é um polinucleotídeo de fita dupla e sendo que n é um número inteiro e (b) uma ou mais helicases imobilizadas em cada adaptador.
24. Complexo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que (a) L é capaz de ligar apenas uma helicase (L1) ou capaz de ligar apenas duas helicases (L2) ou (b) em que L é capaz de ligar apenas uma helicase (L1) ou capaz de ligar apenas duas helicases (L2) e n é 1 e uma ou duas helicases são imobilizadas no adaptador.
25. Kit para controlar o movimento de um polinucleotídeo alvo, o dito kit caracterizado pelo fato de compreender: (a) um ou mais espaçadores, um ou mais espaçadores como definido na reivindicação 7 ou um ou mais adaptadores como definidos na reivindicação 23 ou 24, (b) uma ou mais helicases e (c) um poro de transmembrana.
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