BR112015008635B1

BR112015008635B1 - Anticorpos anti-hiv amplamente neutralizantes

Info

Publication number: BR112015008635B1
Application number: BR112015008635-7A
Authority: BR
Inventors: Hugo Mouquet; Michel Nussenzweig; Pamela J. Bjorkman; Louise Scharf
Original assignee: The Rockefeller University; California Institute Of Technology
Priority date: 2012-10-18
Filing date: 2013-10-18
Publication date: 2023-10-31
Also published as: JP7076722B2; IL238320A0; AU2020244391B2; AU2023201926A1; HK1212935A1; JP2021003104A; CA2888659A1; EP2908912A4; IL301018A; DK2908912T3; JP2022115946A; JP2015534982A; AU2020244391A1; AU2013331049A1; EA201590741A1; JP6461804B2; CY1124405T1; US10392433B2; EP2908912B1; AU2019201039B2

Abstract

anticorpos anti-hiv amplamente neutralizantes. a presente invenção refere-se a anticorpos anti-hiv. também são descritos métodos e composições relacionadas. as causas de hiv síndrome de imunodeficiência adouirida (acquired immunodeficiency syndrome - aids), uma condição em seres humanos caracterizada por características clínicas incluindo síndromes do desperdiço (wasting syndromes), degeneração do sistema nervoso central e profunda imunosupressão que resulta em risco de vida por infecções oportunistas e malignidades. desde sua descoberta en 1981, hiv tipo 1 (hiv-1) levou à morte de pelo menos 25 milhões de pessoas em todo o mundo.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA PARA PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade sob 35 U.S. C. § 119(e) para Pedido Provisório U.S. No. 61/715,642 depositado em 18 de outubro de 2012 e é por este meio incorporado inteiramente neste documento.

INTERESSES DO GOVERNO

[002] A invenção divulgada neste documento foi feita, pelo menos em parte, com o apoio do governo sob Grant No. P01 AI081677 do National Institutes of Health. Consequentemente, o U.S. Governo dos Estados Unidos tem determinados direitos sobre esta invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO

[003] Esta invenção relata para anticorpos amplos e potentes contra Virus da Imunodeficiência Humana (Human Immunodeficiency Virus - "HIV").

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[004] O HIV causa sindrome de imunodeficiência adquirida (Acquired Immunodeficiency Syndrome - AIDS), uma condição caracterizada em humanos por características clínicas incluindo síndromes oportunistas, degeneração do sistema nervoso central e profunda imunossupressão que resulta em infecções oportunistas que ameaçam a vida e doenças malignas.

[005] Deste que foi descoberto em 1981, HIV tipo 1 (HIV- 1) tem levado a morte pelo menos 25 milhões de pessoas em todo o mundo. Está previsto que 20-60 milhões de pessoas se tornarão infectada nas duas próximas décadas ainda se existisse um decréscimo anual de 2,5% anual de infecções de HIV. Existe uma necessidade para agentes terapêuticos e métodos para tratamento ou inibição de infecção HIV.

[006] Alguns indivíduos infectados de HIV mostram anticorpos amplamente neutralizantes IgG em seus soro. No entanto, pouco se sabe a respeito da especificidade e atividade desses Anticorpos, apesar da sua importância potencial na criação de vacinas eficazes. Em modelo animal, transferência passiva de anticorpos neutralizantes pode contribuir para a proteção contra o desafio do vírus. Resposta de anticorpo neutralizante também pode ser desenvolvida em infectados individuais de HIV, mas a composição detalhada da resposta sorológica ainda está para ser totalmente descoberta.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] Esta invenção relata para novas categorias de anticorpos anti-HIV amplamente neutralizantes. As sequências de aminoácidos de consenso da cadeia pesada e leve dos Anticorpos estão listadas abaixo e mostradas nas Figuras 3a e 3b: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGX1SX2X3DX4YWSWIRQSPGKGLEWIGYVHDSGD TNYNPSLKSRVX5X6SLDTSKNQVSLKLX7X8VTAADSAX9YYCARAXioHGXnRI YGIVAFGEX12FTYFYMDVWGKGTTVTVSS (SEQ ID NO: 1) SXIVRPQPPSLSVAPGETARIX2CGEX3SLGSRAVQWYQQRPGQAPSLIIYNNQDRPSGI PERFSGSPDX4X5FGTTATLTITX6VEAGDEADYYCHIWDSRX7PTXaWVFGGGTTLTVL (SEQ ID NO: 2)

[008] Na sequência de SEQ ID NO: 1 ou 2, cada "X"pode ser qualquer resíduo de aminoácido ou não aminoácido. Pref erencialmente, cada um dos Xs pode ser um resíduo na posição correspondente das variantes clonais 10-259, 10- 303, 10-410, 10-847, 10-996, 10-1074, 10-1121, 10-1130, 101146, 10-1341, e 10-1369 como mostrado nas Figuras 3a e 3b, e uma versão artificialmente modificada de anticorpo 101074, 10-1074GM.

[009] Por consequência, um aspecto desta invenção caracteriza um isolado anticorpo anti-HIV, ou porção do antígeno de ligação, tendo pelo menos uma região complementarmente determinada (Complementarity Determining Region - CDR) tendo uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 33-38, com uma condição que o anticorpo não é anticorpo PGT-121, 122, ou 123. SEQ ID NOs: 33-38 refere-se para as sequências de cadeia pesada CDRs (CDRH) 1-3 e a cadeia leve CDRs (CDRL) 1-3 sob o sistema Kabat como mostrado nas Figuras 3 a e 3b. Em uma concretização, o CDR pode conter uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 39-104, isto é, as sequências CDR sob o sistema KABAT como mostrado na Tabela 1 abaixo. Alternativamente, o CDR pode conter uma sequência selecionada destas correspondentes sequências de anticorpos CDR sob o sistema IMGT como mostrado na Tabela 1 abaixo.

[0010] Em uma concretização, o isolado anticorpo anti HIV, ou porção do antigeno de ligação, contido em uma região variável de cadeia pesada que incluam CDRH 1, CDRH 2, e CDRH 3, caracterizado por: os CDRH 1, CDRH 2 e CDRH 3 incluírem as respectivas sequências de SEQ ID NOs: 33-35 . Os CDRH 1, CDRH 2 e CDRH 3 podem também incluir as respectivas sequências de um conjunto CDRH selecionado do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 39-41, SEQ ID NOs: 45-47, SEQ ID NOs: 51-53, SEQ ID NOs: 57-59, SEQ ID NOs: 63-65, SEQ ID NOs: 69-71, SEQ ID NOs: 75-77, SEQ ID NOs: 81-83, SEQ ID NOs: 87-89, SEQ ID NOs: 93-95, SEQ ID NOs: 99-101, e SEQ ID NOs: 131-133.

[0011] Alternativamente, os CDRHs podem conter as respectivas sequências selecionadas destas correspondentes sequências de anticorpos de CDR sob o sistema IMGT como mostrado na Tabela 1 abaixo.

[0012] Em outra concretização, o isolado anticorpo anti HIV, ou porção do antigeno de ligação, contendo uma região variável de cadeia leve que inclui CDRL 1, CDRL 2 e CDRL 3, caracterizado por: os CDRL 1, CDRL 2 e CDRL 3 incluem as respectivas sequências de SEQ ID NOs: 36-38. Por exemplo, os CDRL 1, CDRL 2 e CDRL 3 podem incluir as respectivas sequências de um conjunto CDRL selecionado do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 42-44, SEQ ID NOs: 48-50, SEQ ID NOs: 54-56, SEQ ID NOs: 60-62, SEQ ID NOs: 66-68, SEQ ID NOs: 72-74, SEQ ID NOs: 78-80, SEQ ID NOs: 84-86, SEQ ID NOs: 90-92, SEQ ID NOs: 96-98, SEQ ID NOs: 102-104, e SEQ ID NOs: 134-136. Alternativamente, os CDRLs podem conter as respectivas sequências selecionadas destas correspondentes sequências de anticorpos CDR sob o sistema IMGT como mostrado na Tabela 1 abaixo.

[0013] Ainda em outra concretização, o acima mencionado anticorpo anti HIV isolado, ou porção do antigeno de ligação, incluem (i) uma cadeia pesada de região variável que inclui CDRH 1, CDRH 2, e CDRH 3, e (ii) uma cadeia leve de região variável que inclui CDRL 1, CDRL 2 e CDRL 3. Os CDRH 1, CDRH 2, CDRH 3, CDRL 1, CDRL 2 e CDRL 3 podem incluir as respectivas sequências de um conjunto CDR selecionado do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 39-44, SEQ ID NOs: 45-50, SEQ ID NOs: 51-56, SEQ ID NOs: 57-62, SEQ ID NOs: 63-68, SEQ ID NOs: 69-74, SEQ ID NOs: 75-79, SEQ ID NOs: 81-86, SEQ ID NOs: 87-92, SEQ ID NOs: 93-98, SEQ ID NOs: 99-104, e SEQ ID NOs: 131-136. Alternativamente, os CDRHs e CDRLs podem conter as respectivas sequências selecionadas destes correspondentes sequências CDR de anticorpos sob o sistema IMGT como mostrado na Tabela 1 abaixo.

[0014] Em uma concretização adicional, o anticorpo anti HIV isolado, ou porção do antigeno de ligação, contem um ou ambos de (i) uma cadeia pesada tendo sequência de consenso de aminoácido de SEQ ID NO: 1 e (ii) uma cadeia leve tendo a sequência de consenso aminoácido de SEQ ID NO: 2. A cadeia pesada pode conter uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, e 129, e a cadeia leve pode conter uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, e 130. Por exemplo, a cadeia pesada e a cadeia leve podem incluir as respectivas sequências de SEQ ID NOs: 3-4, SEQ ID NOs: 5-6, SEQ ID NOs: 7-8, SEQ ID NOs: 9-10, SEQ ID NOs: 11-12, SEQ ID NOs: 13-14, SEQ ID NOs: 15-16, SEQ ID NOs: 17-18, SEQ ID NOs: 19-20, SEQ ID NOs: 21-22, SEQ ID NOs: 23-24, e 129- 130.

[0015] Em uma concretização preferencial, o anticorpo anti HIV isolado é um selecionado do grupo consistindo de 10- 259, 10-303, 10-410, 10-847, 10-996, 10-1074, 10-1074GM, 10-1121, 10-1130, 10-1146, 10-1341, e 10-1369. Sua correspondente cadeia pesada de região variável, cadeia leve de região variável, CDRH 1-3 e CDRL 1-3 são mostradas nas Figuras 3a e 3b. Em uma concretização preferencial, o anticorpo anti HIV isolado é um anticorpo como 10-1074-, isto é, um reselecionado do grupo consistindo de 10-847, 10-996, 10-1074, 10-1074GM, 10-1146, e 10-1341. Um anticorpo deste grupo é mais potente em neutralizar virus contemporâneos que PGT121. Os anticorpos acima discutidos podem ser um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, ou um anticorpo quimérico.

[0016] Em um segundo aspecto, a invenção fornece um ácido nucléico isolado tendo uma sequência que codifica um CDR, uma cadeia pesada de região variável, ou uma cadeia leve de região variável dos anticorpos anti HIV acima discutidos, ou porção do antigeno de ligação. Também exibido é um vetor tendo o ácido nucléico e uma célula cultivada.

[0017] O ácido nucléico, vetor, e célula cultivada podem ser usados em um método para fazer um anticorpo anti HIV ou um fragmento destes. O método inclui, entre outros, os passos de: obter a célula cultivada mencionada acima; cultivar a célula em um meio sob condições permitindo expressão de um polipeptideo codificado pelo vetor e montado em um anticorpo ou fragmento destes, e purificando o anticorpo ou fragmento da célula cultivada ou o meio da célula.

[0018] Em um terceiro aspecto, a invenção caracteriza uma composição farmacêutica contendo (i) pelo menos um anticorpo anti HIV mencionado acima, ou porção do antigeno de ligação, e (ii) um transportador farmaceuticamente aceitável.

[0019] Em um quarto aspecto, a invenção fornece um método de prevenir ou tratar uma infecção de HIV ou uma doença relacionada com HIV. 0 método inclui, entre outros, os passos de: identificar um paciente na necessidade de tal prevenção ou tratamento, e administração para o dito paciente um primeiro agente terapêutico contendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um anticorpo anti HIV mencionada acima, ou porção do antigeno de ligação. 0 método pode adicionalmente incluir a administração de um segundo agente terapêutico, tal como um agente antiviral.

[0020] Em um quinto aspecto, a invenção fornece um kit tendo uma unidade de dosagem farmaceuticamente aceitável de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de pelo menos um anticorpo anti HIV isolado mencionada a acima, ou porção do antigeno de ligação, e uma unidade de dosagem- farmaceuticamente aceitável de uma quantidade f armaceuticamente eficaz de um agente anti HIV. As duas unidades de dosagem farmaceuticamente aceitável podem opcionalmente tomar a forma de uma única unidade de dosagem farmaceuticamente aceitável. Exemplares agentes anti HIV podem ser um selecionado do grupo consistindo de um inibidor não nucleotideo de transcriptase reversa, um inibidor de protease, um inibidor de protease, um inibidor de entrada ou de fusão, e um inibidor da integrase.

[0021] Em um sexto aspecto, a invenção fornece um kit para o diagnóstico, prognóstico ou monitoração do tratamento de uma infecção de HIV em um sujeito. 0 kit contendo um ou mais reagentes de detecção que especificamente liga para os anticorpos neutralizantes de anti HIV em uma amostra biológica de um sujeito. 0 kit pode adicionalmente incluir reagentes para realização de espectrometria PCR ou de massa.

[0022] Os detalhes de uma ou mais concretizações da invenção são apresentadas na descrição abaixo. Outras características, objetos, e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição e das reivindicações.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

[0023] A Figura 1 mostra: Atividade de neutralização de variantes como PGT121 e como 10-1074. (A) Mapa de calor comparando as potências de neutralização de anticorpos como PGT 121 e como 10-1074 no ensaio TZM-bl. Cores mais escuras = neutralização mais potente; branco = sem neutralização. (B) Correlação entre o meio IC50 o contra 9 vírus (eixo y) e aparente K?, os valores para ligação para gpl20 e gpl40 (eixo x). (C)(Gráfico comparando a amplitude de neutralização e potências de anticorpos PGT 121, 10-996 e 10-1074 no ensaio TZM-bl contra painel alargado de 119 vírus, o eixo y mostra a frequência acumulativa de IC50 valores até a concentração mostrada no eixo x. O gráfico radar (canto superior esquerdo) mostra a distribuição de frequência de vírus neutralizados de acordo com as clades HIV-1. (D) Gráfico de pontos mostrando razões de neutralização molar (MNRs; razões de concentrações do Fab e IgG IC50) . Barras horizontais representam o meio IC50S para todos os vírus.(E) Gráfico de barra comparando as potências de neutralização de PGT 121 (cinza escuro) e 10-1074 (cinza claro) contra virus isolados de históricos (Hist.) e contemporâneos (Cont.) soro convertidos, não significantes; **, p<0,005. A Dobra da diferença entre IC50S médio para a neutralização de virus contemporâneos por PGT 121 e 10-1074 é indicada.

[0024] A Figura 2 mostra: Atividades de ligação e neutralização de anticorpos mutantes de PGTHIGM e 10- 1074GM.

[0025] Gráfico de barras comparando aparente K?, valores para o ligando de anticorpos 10-1074, PGT 121, PGT121GMe 10-1074GMpara gpl20 e gpl40. As barras de erro indicam o erro padrão da média (Standard Erro Medium - SEM) do valor de K obtido de três experimentos independentes. Diferenças dobradas entre K?>valor anticorpos de "tipo selvagem"versus "glico mutante"são indicados.

[0026] Gráfico de barras comparando ligando de glicanos (Figura 7A) por PGT121 e 10-1074 com anticorpos mutantes (PGT121GM e 10-1074GM) . Pontuações numéricas de ligando são medidas como intensidade de fluorescência (significa em pontos duplicados) para sondas dispostas a 5 fmol por ponto. (Gráfico de cobertura Q comparando a amplitude de neutralização e potências de anticorpos PGT121, PGT121GM, 10-1074 e 10-1074GMno ensaio TZM-bl contra um painel de 40 virus.

[0027] A Figura 3 representa: Alinhamento de sequência de variantes clonais de PGT121 e 10-1074.

[0028] Alinhamento de aminoácido da cadeia pesadas (IgH) de anticorpos como PGT 121 e como 10-1074, e a linha germinal provável (linha germinal - GL) VH para todas as variantes clonais. Numeração de aminoácido baseado na, estrutura de cristal, quadro (framework - FWR) e regiões determinantes de complementaridade (Complementary Determining Regions - CDR) como definido por Kabat (J Exp Med 132(2):21 1-250) e IMGT (Ácido nucléicos Res 37 (emissão da base de dado):D1006-1012) são indicados. Sombreamento de cor mostra aminoácidos ácido (vermelho), básico (azul), e tirosina (verde). Mesmo como A, mas para a cadeia leves (IgL).

[0028] A Figura 4 mostra: Afinidade de ligação de variantes clonais PGT121 e 10-1074. (A) Afinidade de ligação da interação de anticorpo variante PGT 121 IgG com ligandos YU-2 gpl40 e gpl20 como medido por ressonância de plasma de superficie (surface plasmon resonance - SPR) . M, mol/1; s, segundos; RU, unidades de resposta; /, não detectada ligando. Um valor de qui (x ) <10 indica que o modelo de ligação 1:1 usado para ajustar as curvas adequadamente descreveu os dados do experimento. As constantes de equilíbrio e cinética mostradas são consideradas como constantes aparentes" para contar efeitos da avidez resultante da ligação bivalente de IgGs. (B) Gráficos de pontos mostram a razão de associação (ka) e dissociação (kd) constantes para como PGT 121 (sombra azul) e como 10-1074 (sombra verde). (C) Gráficos de regressão linear compara valores de ka e kd dos anticorpos IgG com seus ligandos para gpl20 e gpl40 (eixo x) versus suas potências de neutralização (valor médio de IC80) contra 9 vírus mostrados na Tabela 4 (eixo y).

[0029] A Figura 5 representa: ligação de variantes de PGT121 para proteinas gpl20 do "núcleo", mutante gpl20GD324 5AA e peptideos lineares gpl20v3. (A) Análise de ligando baseado em ELISA de anticorpos como PGT121 e como 10-1074 para HXB2 gpl20nucleo e 2CC proteinas do núcleo comparado com intacto YU-2 gpl20. O eixo x mostra a concentração de anticorpo (M) requerida para obter os valores ELISA (OD40s nrn) indicados no eixo y. 0 anticorpo anti-CD4bs VRCO1 (Science 329(5993):856-861), o anticorpo anti-V3 loop 10- 188 (PLoS One 6(9) :e24078) , e o anticorpo não reativo HTV- mG053 (Science 301(5638): 1374-1377) foram usados como controles. (B) Mesmo como (A), mas para ligação para proteina mutante gpl20GD324 5AA (C) Gráficos de barra comparando a reatividade de ELISA de anticorpos como PGT 121 e como 10-1074 e anticorpos de controle (controle positivo, 10-188, 1-79, 2-59 e 2- 1261 (Natural 458(7238):636-640)), e controle negativo, mG053) contra gpl20v3-c3sobrepondo 5 peptideos. O eixo y indica os valores ELISA (OD405 nm) obtidos pelo teste dos anticorpos IgG a 2 pg/ml. As sequências de aminoácido de peptideos individuais são mostradas na parte inferior direita. Todos os experimentos foram realizados pelo menos em duplicação. Dados representativos são mostrados.

[0030] A Figura 6 representa: Ligação de PGT121 com glicosilação mutantes gpl20e desglicosilado gpl20. (A) Análise de ligação baseada em ELISA de anticorpo variantes de PGT121 e 10-1074 para gpl20NNT301-303AAA, gpl20N332A e gpl20N332A/NNT301"303AAA‘ 0 eixo x mostra as concentrações de anticorpo (M) requeridas para obter os valores de ELISA (OD405 nm) indicados no eixo y. O tracejado preto e as linhas continuas mostram a reatividade média contra os quatro antigenos de anticorpos controles positivo (10-188) e negativo (mG053). (B) Gel SDS-PAGE corado com prata comparado com gpl20 não tratado (tipo selvagem, WT), PNGase F- e EndoH-digerido gpl20s. L, graduação de proteina. (C) Mesmo como (A) , mas comparando não tratado e PNGase F- tratado gpl20. (D) Mesmo como (A), mas comparando não tratado e EndoH-tratado gpl20. Todos os experimentos foram realizados pelo menos em duplicado.

[0031] A Figura 7 representa: Ligação de variantes clonais PGT121 e 10-1074 com glicanos. (A)Sequências de monossacarideo do conjunto de 15 sondas N-glicano usados na análise do micro arranjo de glicano para examinar anticorpos como PGT 121 e como 10-1074 por ligação direta para N-glicanos. DH, designa um rótulo de lipideo 1,2- dihexadecil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DHPE) para os quais os N-glicanos foram conjugados por aminação redutiva. Características chaves de nota são: (i) grupo anticorpos PGT 121 liga a sonda de monoantenárias N-glicano 10 (N2) com uma terminação antena de galactose se juntou por 1-3- ligado para o núcleo manose, mas não as 5 sondas de N- glicano isoméricas 11 (designada N4) com a antena 1-6- ligado para o núcleo manose; (ii) a presença destes galactose-terminação 1-6-ligado antena, como na sonda biantenária 13 (NA2), foi permissiva para ligação, como foi na presença de cc2-6-ligado (mas não a2-3-ligado) ácido siálico; (iii) a sonda biantenária 12 (NGA2), ausência de galactose e terminação em N-acetilglicoseamina, não foi ligada. (B)Gráfico de barras comparando ligação de glicano com como PGT 121, como 10-1074, e a linha germinal 30 versão (GL) anticorpos. 10-188, uma volta de anticorpo anti-V3, foi usada como controle negativo. Escores numéricos de ligando são medidos como intensidade de fluorescência (significa em pontos duplicados) para arranjo de sondas em 2 fmol (branca) e 5 fmol por ponto (cinza).

[0032] A Figura 8 representa: Ligação de anticorpo e atividade de neutralização contra somente gpl20 de alta manose e virus. (A) Gel SDS-PAGE gel corado de prata comparado com YU-2 gpl20 produzidos em células tratadas com kifunensine (gpl20kif) e gpl20 produzido em células não tratado (WT, tipo selvagem). L, graduação de proteina. (B) Comparação ELISA do ligando de anticorpos como PGT 121 (etiqueta azul) e como 10-1074 (etiqueta verde) com YU-2 gpl20 (gpl20WT) e gpl20kif. 0 eixo x mostra a concentração de anticorpo (M) requerida para obter os valores ELISA valores (OD405 nn>) indicados no eixo y. (C) Curvas de neutralização para avaliados PGT 121 contra selecionados PGT 121 sensível/ 10-1074 pseudovirus resistentes produzidos na presença (Viruskif) ou ausência (VirusWT) de kifunensine. A linha horizontal pontilhada indica neutralização 50%, a partir de que valor de IC50 pode ser derivado da concentração de anticorpo no eixo x. Os experimentos foram realizados em triplicado. Barras de erros indica o desvio padrão (standard deviation - SD) das medições em triplicadas.(D) Gráfico de barras comparando a atividade de neutralização de selecionados anticorpos contra pseudovirus YU-2 e PVO.4 produzidos em células HEK 293S GnTI-/' (VirusGnT-/‘) ou em células tipo selvagem (VirusWT) . O eixo y mostra o valor médio de IC50 µg/ml) para a neutralização do virus mostrado no eixo x. Barrar de erros indica o erro padrão da média (Standard Erro Medium - SEM) de valores de IC50 obtidos de dois experimentos independentes.

[0033] A Figura 9 mostra: Atividade de Neutralização de PGT121, 10-996 e 10-1074. (A) Gráficos comparando as potências de neutralização de PGT 121, 10-996 e 10-74 contra virus dos clades HIV-1 indicados (determinados usando o ensaio TZM-bl e um painel de 119 pseudovirus). O eixo x mostra a concentração de anticorpo µg/ml) requerido para alcançar neutralização de 50% (IC50) ¦ 0 eixo y mostra a frequência acumulativa de valores de IC50 até a concentração mostrada no eixo x. (B) Gráfico comparando a amplitude de neutralização e potências de anticorpos PGT 121, 10-996 e 10-1074 contra o painel estendido de 119 virus como determinados pelo ensaio de neutralização TZM- bl. O eixo y mostra a frequência acumulativa de valores de IC50 até a concentração mostrada no eixo x. (C) Gráficos mostra curvas de neutralização dos virus selecionada por PGT 121 e 10-1074. A linha pontilhada horizontal indica neutralização de 50%, de quais valores de IC50podem ser derivados da concentração de anticorpo no eixo x. Os Experimentos foram realizados em triplicidade. Barras de erros indicam o desvio padrão - SD das medidas triplicadas.

[0034] A Figura 10 representa: Atividade de neutralização contra históricos versus contemporâneos clade de virus B. Gráficos de pontos comparam potências de neutralização contra clade de virus B isolados de históricos (Hist.) e contemporâneos (Cont.) soro conversores para o bNAbs selecionado. As barras horizontais representam a média de IC50 para todos os virus por paciente. Diferenças entre grupos foram avaliadas usando teste Mann- Whitney, ns, não significante.

[0035] A Figura 11 representa: Neutralização de dois trópicos SHIVs R5 com um painel de 11 anti-HIV-1 mAbs agindo amplamente. Os valores de IC50 calculados para neutralizantes SHIVAD8EO (A) e SHIVDH12-V3AD8 (B).

[0036] A Figura 12 representa: O relacionamento das concentrações de plasma de neutralizante mAbs passivamente administrado para aquisição de virus após o desafio de macacos com dois diferentes R5 SHIVs. Circulos preenchidos indicam macacos protegido (sem aquisição); circulos abertos representam animais infectados.

[0037] A Figura 13 representa: A concentração de plasma de bNAbs. A concentração de mAbs foi determinada pela medição da atividade de neutralização em amostra de plasma. (A) Valores de ID50 medido em ensaio de neutralização TZM.bl de 10-1074 e 3BNC1 17 contra cerpas de HIV-1 que são sensíveis para um mas não a outro bNAb (isto é HIV-1 cerpa X2088 9 (10-1074 sensível); HIV-1 cerpa Q769_d22 (3BNC 1 17 sensível). (B) Atividade de neutralizante de plasma antes da administração do anticorpo (preP), mas cravado com 0,01, 0,1, 1, 10, e 100 µg/ml de anticorpos 10-1074 (azul) ou 3BNC1 17 (verde).A atividade neutralizante reportadas como plasma título ID50 (colunas da esquerda) e convertido para concentrações de anticorpo (colunas da direita) baseado nos valores ID50 medido em (A) . (C) Titulos ID50 (colunas da esquerda) e concentrações de bNAbs (colunas da direita) medidos nas amostras de plasma macaco indicado antes (pré sangue) e após administração de bNAb (Dia).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0038] Esta invenção é baseada, pelo menos em parte, em uma revelação inesperada de uma nova categoria de anticorpos amplamente neutralizante (bNAbs) contra HIV que podem reconhecer epitopos dependentes de carboidrato, incluindo N-glicano do tipo complexo, em gpl20.

[0039] Anticorpos são essenciais para o sucesso da maioria das vacinas, e os anticorpos contra HIV parecem ser o único correlato de proteção no teste de vacina recente RV144 anti-HIV. Alguns pacientes infectados de HIV-1 desenvolveram atividade sorológica amplamente neutralizante contra o pico virai gplõO 2-4 anos após a infecção, mas •estes anticorpos geralmente não protegem humanos infectados porque virus autólogos escapam através de mutação. No entanto, atividade amplamente neutralizante coloca pressão seletiva sobre os virus e passiva transferência de anticorpos amplamente neutralizante

[0040] O (bNAbs) para proteger os macacos contra infecção de HIV. Por conseguinte, foi proposto que vacinas que extrai tais anticorpos pode ser protetor contra infecção de HIV em humanos.

[0041] O desenvolvimento de técnicas de clonagem de anticorpos de célula individual revelou que alvo bNAbs de vários epitopos diferentes no gpl60 pico de HIV-1. O mais potente HIV-1 bNAbs reconhece o site do ligando CD4 (CD4bs) (Science 333 ( 6049):1633-1637; Nature 477(7365):466-470; Science 334(6060): 1289-1293) e epitopos dependente de carboidrato associado com as voltas variáveis (Nature 477 (7365) :466-470; Science 326(5950):285-289; Science 334(6059): 1097-1103; Nature 480 (7377) :336-343), incluindo o V1/V2 (PG9/PG16) (Science 326(5950):285-289) e voltas V3 (PGTs) (Nature 477 (7365):466-470) . Pouco é conhecido sobre epitopos dependentes de carboidadro porque os anticorpos estudados até agora são exemplos únicos ou membros de familia clonal pequena.

[0042] Para melhor entender a resposta de anticorpo neutralizante para HIV-1 e o epitopo alvo para anticorpos PGT, isolamos membros de uma grande familia clonal dominando o IgG resposta de memória especifica de gpl60 de paciente infectado de clade A que produziu PGT 121. Como divulgado neste documento, anticorpos PGT121 segregados em dois grupos, um grupo -como PGT 121 e um como 10-1074, de acordo com a sequência, afinidade de ligação, atividade neutralizante e reconhecimento de carboidratos e a volta V3. O 10-1074 e membros da familia relacionadas exibem incomum neutralização potente, incluindo ampla reatividade contra virus recém transmitidos. Ao contrário de anteriormente bNAbs caracterizado por depender de carboidrato, PGT 121 liga para o tipo complexo, em vez de elevado teor de manose, N-glicanos em experimentos de micro arranjo de glicano. Estruturas de cristais de PGT 121 e 10- 1074 comparado com estruturas de sua linha germinal precursora e uma estrutura de PGT 121 ligando para um N- glicano tipo complexo racionalizando suas propriedades distintas.

[0043] Em um exemplo, ensaios foram conduzidos para isolar clones de célula B codificação PGT 121, que é única entre bNAbs dependentes de glicano no reconhecimento de tipo complexo, em vez de elevado teor de manose-, N- glicanos. Os clones PGT 121 segregados em grupos como PGT 121 e como 10-1074 distinto por sequência, afinidade de ligação, carboidrato reconhecimento e atividade neutralizante. 0 grupo 10-1074 grupo exibe potência notável e amplitude apesar de não ligação detectável para glicano livre de proteína. A estruturas de cristais de não ligado PGT 121, 10-1074, e suas precursoras linhas germinais revela que o reconhecimento diferencial de carboidrato mapeia para uma fissura entre CDRH2 e CDRH3, que foi ocupada pelo N-glicano tipo complexo em uma estrutura separada de PGT121. Trocar resíduos de contato de glicano entre PGT 121 e 10-1074 confirmou a importância destes resíduos em atividades neutralizantes. Envelopes de HIV exibem proporções variadas de elevado manose e N-glicanos tipo complexo, assim estes resultados, incluindo a primeira caracterização de estrutura de N-glicano tipo complexo reconhecido por anti-HIV bNAbs, são críticos para o entendimento de como anticorpos e em última análise vacinas pode conseguir uma ampla atividade neutralizante.

[0044] O termo "anticorpo"(antibody - Ab) como usado neste documento inclui anticorpos monoclonal anticorpos, anticorpos policlonal, anticorpos multi específico (por exemplo, anticorpos bi específicos e anticorpos poli reativos), e fragmentos de anticorpo. Assim, o termo "anticorpo"como usado em qualquer contexto dentro desta especificação significa para incluir, mas não ser limitado para, qualquer especifico membro de ligação, classe de imunoglobulina e/ou isótipo (exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD, IgE e IgM); e fragmento biologicamente relevante ou membro de ligação especifico destes, incluindo mas não limitado para Fab, F(ab’)2, Fv, e scFv (cadeia única ou entidade relacionada). Será entendido na matéria que um anticorpo é uma glicoproteina tendo pelo menos duas cadeias pesadas (heavy - H) e duas cadeias leves (light - L) interconectadas por ligação de dissulfeto, ou um antigeno ligando porção destas. Uma cadeia pesada é composta de uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região constante de cadeia pesada (CHI, CH2 e CH3) . A cadeia leve é composta de uma região variável de cadeia leve (VL) e uma região constante de cadeia leve (CL) . As regiões variáveis de ambas as cadeias leve e pesada compreende quadro de regiões (framework regiões - FWR) e regiões de determinação de complementaridade (Complementarity Determining Regions - CDR) . As quatros regiões FWR são relativamente conservadas enquanto regiões CDR (CDR1, CDR2 e CDR3) representam regiões hiper variáveis e são arrumadas do NH2 terminal para o COOH terminal como segue: FWR1, CDR1, FWR2, CDR2, FWR3, CDR3, e FWR4. AS regiões variáveis de cadeia leve e pesada contem uma dominio de ligação que interage com um antigeno enquanto, dependendo do isótipo, a região(s) constante pode mediar a ligação da imunoglobulina para os tecidos hospedeiros ou fatores.

[0045] Também incluido na definição de "anticorpo"como usado neste documento são anticorpos quimérico, anticorpos humanizados, e anticorpos recombinantes, anticorpos humanos gerados de um animal transgênico não humano, tanto quanto anticorpos selecionados de bibliotecas usando tecnologias de enriquecimento disponíveis para o especialista.

[0046] 0 termo "variável"refere-se para o fato que certos segmentos do dominio variável (V) diferem extensivamente na sequência entre anticorpos. 0 dominio V serve de mediador na ligação de antigeno e define especificidade de um particular anticorpo para seu particular antigeno. Embora, a variabilidade não está distribuída uniformemente em toda a extensão de 110- aminoácido das regiões variáveis. Como alternativa, as regiões V consistem de relativamente trechos invariantes chamados quadro de regiões (FRs) de 15-30 aminoácidos separados por regiões curtas de extrema variabilidade chamada "regiões hiper variáveis" que tem cada 9-12 aminoácidos de comprimento. As regiões variáveis de cadeia leve e pesada nativa cada uma compreende quatro FRs, adotando largamente uma configuração de folha beta, conectada por três regiões hiper variáveis, que formam voltas conectadas, e em alguns casos formando parte da estrutura de folha beta. As regiões hiper variáveis em cada cadeia são mantidas juntas em estreita proximidade pelo FRs e, com as regiões hiper variáveis das outra cadeia, contribuindo pra a formação do site de ligação de antigeno de anticorpos (ver, por exemplo, Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Nd. (1991)).

[0047] O termo "região hiper variável" como usado neste documento refere-se para o resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis para ligação de antigeno. a hiper região variável geralmente compreende resíduo de aminoácidos de uma "região de determinação de complementaridade"("CDR").

[0048] O termo "anticorpo monoclonal"como usado neste documento refere-se para um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que constituem uma população são idênticos exceto por possíveis mutações ocorrendo naturalmente que podem estar presentes em quantidades menores. O termo "anticorpo policlonal"refere-se para preparações que incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes ("epítopos") .

[0049] Os anticorpos monoclonais neste documento incluem anticorpos "quimérico"em que uma porção da cadeia leve e/ou pesada é idêntica com, ou homóloga para, as sequências correspondentes nos anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencem a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o restante da cadeia(s) é idêntica com, ou homóloga para, as sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencem à outra classe ou subclasse de anticorpo, tanto quanto fragmentos de tais anticorpos, desde que estes exibam a desejada atividade biológica (ver, por exemplo, Patente U.S. No. 4,816,567; e Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81 :6851-6855 (1984)). A invenção descrita fornece sequências de ligação de antigeno de região variável derivadas de anticorpos humanos. Consequentemente, anticorpos quimérico de interesse primário neste documento incluem anticorpos tendo uma ou mais sequências de ligação de antigeno humano (por exemplo, CDRs) e contendo uma ou mais sequências derivadas de um anticorpo não humano, por exemplo, uma sequência FR ou região C. Em adição, anticorpos quiméricos incluidos neste documento são estes compreendendo uma sequência de ligação de região variável de antigeno humano de uma classe ou subclasse de anticorpo e outra sequência, por exemplo, sequência de região FR ou C, derivada de outra classe ou subclasse de anticorpo.

[0050] Um "anticorpo humanizado" geralmente é considerado para ser um anticorpo humano que tem um ou mais resíduo de aminoácidos introduzido dentro de uma fonte que não é humana. Estes resíduos não humanos de aminoácidos frequentemente são referidos como resíduos de "importação", que tipicamente são tomados de região variável de importação. A humanização pode ser realizada seguindo o método de Winter e colegas de trabalho (ver, por exemplo, Jones et al., Nature, 321 :522-525 (1986); Reichmann et al, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al, Science, 239: 1534-1536 (1988)), substituindo sequências de importadas de região hiper variável pela correspondentes sequências de um anticorpo humano. Consequentemente, tais anticorpos "humanizados"são anticorpos quiméricos (ver, por exemplo, Patente U.S. No. 4,816,567), onde substancialmente menos que uma região variável humana intacta foi substituída pela correspondente sequência de uma espécie não humana.

[0051] Um "fragmento de anticorpo" compreende uma porção de um anticorpo intacto, tal como o antigeno de ligação ou região variável do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não são limitados para, fragmentos de Fab, Fab1, F(ab’)2, e Fv; diacorpos; anticorpos lineares (ver, por exemplo, Patente U.S. No. 5,641,870; Zapata et al, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); moléculas de anticorpo de cadeia única; e anticorpos multi especifico formado de fragmentos de anticorpo.

[0052] "Fv"é o fragmento de anticorpo minimo que contém um antigeno completo de reconhecimento e site de ligação de antigeno. Estes fragmentos contem um dimero de um dominio de região variável de cadeia pesada ou leva, em associação não covalente. A partir da dobra destes dois dominios emanam seis voltas hipervariáveis (três voltas de cada uma da cadeia H e L) que contribuem com os residues de aminoácidos para ligação de antigeno e confere especificidade da ligação de antigeno para o anticorpo. Embora, cada região variável única (ou metade de um Fv compreendendo só três CDRs específicos para um antigeno) tem a habilidade para reconhecer e ligar antigeno, embora a uma afinidade menor que o site de ligação completo.

[0053] "Cadeia única Fv" ("sFv"ou "scFv") são fragmentos de anticorpo que compreendem o dominios de anticorpo VH e VL conectado dentro de uma cadeia única de polipeptideo. O polipeptideo sFv pode adicionalmente compreender um ligador de polipeptideo entre os dominios VH e VL que permite o sFv formar a estrutura desejada para o ligador de antigeno. Para uma revisão de sFv, ver, por exemplo, Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. , Springer- Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, infra.

[0054] O termo "diacorpos"refere-se para fragmentos pequenos de anticorpo preparados por construção de fragmentos sFv com ligadores pequenos (cerca de 5-10 resíduos) entre os domínio VH e VL tal que a inter cadeia, mas não intra cadeia que emparelha os domínios V é aumentado, resultando em um fragmento bivalente, isto é, fragmento tendo dois sites de ligação de antigeno. Diacorpos biespecíficos são héteros dímeros de duas fragmentos sFv "crossover"em que os domínios VH e VL dos dois anticorpos estão presentes em diferentes cadeias de polipeptideo. Diacorpos são descritos mais completamente em, por exemplo, EP 404,097; WO 93/11161; e Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993).

[0055] Anticorpos de domínio (dAbs), que podem ser produzidos em forma completamente humanos, são os menos conhecidos fragmentos de anticorpos ligando antigeno, no intervalo entre cerca de 11 kDa a cerca de 15 kDa. DAbs são as regiões variáveis robustas das cadeias leve ou pesada de imunoglobulinas (VH e VL, respectivamente) . Eles são altamente expressos em cultura de célula microbial, mostra propriedades biofísicas favoráveis incluindo, por exemplo, mas não limitado para, solubilidade e estabilidade de temperatura, e são bem adequadas para seleção e maturação de afinidade pelo sistema de seleção in vitrotal como, por exemplo, exibição em fagos. DAbs são bioativo como os monômeros e, que é devido ao seu tamanho pequeno e inerente estabilidade, pode ser formado em moléculas grandes para criar fármacos com prolongada meia vida de soro ou outras atividades farmacológicas. Exemplos destas tecnologias foram descritas em, por exemplo, W09425591 para anticorpos derivados de Ig de cadeia pesada Camelidae, como em US20030130496 descreveu a isolação de anticorpos humanos de dominio completamente único de biblioteca de fago.

[0056] Fv e sFv são as únicas espécies com combinação de sites intactos que são desprovidos de regiões constantes. Assim, eles são adequados para reduzir ligandos não específicos durante uso in vivo.As proteínas de fusão sFv podem ser construídas para obter fusão de uma proteína de efeito no amino ou o terminal carboxi de um sFv. Ver, por exemplo, Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. O fragmento de anticorpo também pode ser um "anticorpo linear", por exemplo, como descrito em Patente U.S. No. 5,641,870 por exemplo. Tais fragmentos de anticorpo linear podem ser mono ou biespecífico.

[0057] Em certas concretizações, anticorpos da invenção descrita são biespecíficas ou multi-específicas. Anticorpos biespecíficos são anticorpos que têm especificidade de ligação para pelo menos dois diferentes epitopos. Exemplares anticorpos biespecíficos podem ligar para dois diferentes epitopos de um antigeno único. Outros tais anticorpos podem combinar um primeiro site de ligação de antigeno com urn site de ligação para um segundo antigeno. Alternativamente, um braço anti-HIV pode ser combinado com um braço que liga para um desencadeamento de molécula em um leucócito, tal como uma molécula receptora de célula T (por exemplo, CD3), ou receptores Fc para IgG (Fc gama R) , tal como Fc gama RI (CD64), Fc gama RII (CD32) e Fc gama RIII (CD 16), de modo a focar e localizar mecanismo de defesa celular para as células infectadas.

[0058] Anticorpos bi-especificos também podem ser usados para localizar agentes citotóxicos para células infectadas. Anticorpos bi-especificos podem ser preparados como anticorpos de comprimento completo ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, F(ab')2 anticorpos bi-especificos). Por exemplo, WO 96/16673 descreve um anticorpo bi- especifico anti-ErbB2/anti-Fc gama RIII e Patente U.S. No. 5,837,234 descrevem um anticorpo biespecífico anti- ErbB2/anti-Fc gama RI. Por exemplo, um anticorpo biespecifico anti-ErbB2/Fc alfa é reportado em WO98/02463; Patente U.S. No. 5,821,337 ensinam um anticorpo biespecifico anti-ErbB2/anti-CD3. Ver também, por exemplo, "Mouquet et al, Polyreatividade Increases The Apparent Affinity Of Anti-HIV Antibodies By Heteroligation. Nature. 467, 591-5 (2010), and Mouquet et al, Enhanced HIV-1 neutralization by antibody heteroligation" Proc Natl Acad Sci USA. 2012 Jan 17; 109 ( 3) :875-80.

[0059] Métodos para produzir anticorpo biespecificos são conhecidos na matéria. Produção tradicional de anticorpos biespecificos de comprimento completo é baseado na co- expressâo de dois pares de cadeia pesada cadeia leve de imunoglobulina, onde as duas cadeias têm diferentes especificidades (ver, por exemplo, Millstein et al, Nature, 305:537-539 (1983)). Procedimentos similares são divulgados em, por exemplo, WO 93/08829, Traunecker et al, EMBO J. , 10:3655-3659 (1991) e ver também Mouquet et al, Enhanced HIV-1 neutralization by antibody heteroligation" Proc Natl Acad Sci USA. 2012 Jan 17 ; 109 ( 3) :875-80.

[0060] Alternativamente, regiões variáveis de anticorpo com as desejadas especificidades de ligação (sites combinando anticorpo-antigeno) são fundidas para sequências de dominio constante de imunoglobulina. A fusão é com um Ig de dominio constante de cadeia pesada, compreendendo pelo menos parte das regiões de charneira, CH2, e CH3. De acordo com algumas concretizações, a primeira cadeia pesada de região constante (CHI) contendo o site necessário para ligação da cadeia leve, está presente em pelo menos uma das fusões. Os DNAs que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina são inseridas dentro de vetores de expressão separados, e são co-transfectado dentro de uma célula hospedeira adequada. Isto fornece maior flexibilidade mo ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos de polipeptideo nas concretizações quando razões desiguais das três cadeias de polipeptideo usadas na construção fornecem o rendimento ótimo do anticorpo biespecífico desejado. É no entanto, possivel as sequências de codificação para dois todas as três cadeias de polipeptideo no vetor de expressão único quando a expressão de pelo menos duas cadeias de polipeptideo com razões iguais resulta em alto rendimento ou quando as razões não têm nenhum efeito significativo no rendimento da combinação de cadeia desejada.

[0061] Técnicas para geração de anticorpo biespecificos de fragmentos de anticorpo foram também descritas na literatura. Por exemplo, anticorpos biespecificos podem ser preparados usando ligação quimica. Por exemplo, Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) descreve um procedimento caracterizado por: anticorpos intactos são proteoliticamente clivados para gerar fragmentos de F(ab')2. Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente de complexação de ditiol, sódio arsenito, para estabilizar ditióis vicinais e prevenir a formação de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos de Fab gerados quando são convertidos para derivados de tionitrobenzoato (thionitrobenzoate - TNB) Um dos derivados de Fab-TNB quando é reconvertido para Fab-tiol por redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado de Fab-TNB para formar o anticorpo biespecifico. Os anticorpos biespecificos produzidos pode ser usado como agentes para a imobilização seletiva de enzimas.

[0062] Outras modificações do anticorpo são contempladas neste documento. Por exemplo, o anticorpo pode ser ligado para uma de uma variedade de polímeros não proteináceos, por exemplo, polietileno glicol, polipropileno glicol, polioxialquilenos, ou copolimeros de polietileno glicol e polipropileno glicol. O anticorpo também pode ser aprisionado em micro cápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial (por exemplo, hidroximetilcelulose ou micro cápsulas de gelatina e micro cápsulas poli-(metilmetacrilato), respectivamente), em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (por exemplo, lipossomas, micro esferas albumina, micro emulsões, nano partículas e nano cápsulas), ou em macro emulsões. Tais técnicas são divulgadas em, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A. , Ed., (1980).

[0063] Tipicamente, os anticorpos da descritos da invenção são produzido recombinantemente, usando vetores e métodos disponíveis na matéria. Anticorpos humanos também podem ser gerados por células B ativadas in vitro (ver, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5,567,610 e 5,229,275). Métodos gerais em genéticas s e engenharia genética úteis na presente invenção são descritas em edições atuais de Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Technology (Methods in Enzymology, Vol. 185, edited by D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, CA) , "Guide to Protein Purification" in Methods in Enzymology (M.P. Deutshcer, ed., (1990) Academic Press, Inc.); PCR Protocols: A Guide to Methods and Aplications (Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, CA), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2nd Ed. (R.I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, NY), and Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed. E.J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.). Reagentes, vetores de clonagem, e kits para manipulação genética são disponíveis de vendedores comerciais tais como BioRad, Stratagene, Invitrogen, ClonTech e Sigma- Aldrich Co.

[0064] Anticorpo humano também pode ser produzidos em animais transgênicos (por exemplo, rato) que são capazes de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica da cadeia pesada de anticorpo juntando região (JH) gene em quimérico e linha de germe mutante de rato resulta em complete inibição de produção de anticorpos endógenos. A transferência da matriz de linha de germe de genes de arranjo imunoglobina humana em tais linhas de germe mutante resulta em rato mutante na produção de anticorpos humanos após desafio de antigeno. Ver, por exemplo, Jakobovits et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al, Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al, Year in Imuno., 7:33 (1993); U.S. Patente Nos. 5,545,806, 5,569, 825, 5, 591,669 (all de GenPharm) ; Patente U.S.- No. 5,545,807; e WO 97/17852. Tais animais podem ser geneticamente construídos para produzir anticorpos humanos compreendendo um polipeptideo da invenção descrita.

[0065] Várias técnicas foram desenvolvidas para a produção de fragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados via digestão proteolitica de anticorpos intactos (ver, por exemplo, Morimoto et al, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992); e Brennan et al, Science, 229:81 (1985)). Embora, estes fragmentos possam agora atualmente produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Os fragmentos Fab, Fv e ScFv de anticorpo podem todos ser expressos em e secretado de E. coli, assim permitindo a facilidade de produção de grande quantidades destes fragmentos. Os fragmentos Fab'-SH podem ser diretamente recuperado de E. coli e acoplado quimicamente para formar fragmentos F(ab')2 (ver, por exemplo, Carter et al, Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem, fragmentos F(ab')2 podem ser isolados diretamente de cultura de célula hospedeira recombinante. Os fragmento Fab e F(ab')2 com aumentada meia vida in vivo compreende um receptor de salvamento ligando residues epitopo são descritos em Patente U.S. No. 5,869,046. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo será aparente para experiente na matéria.

[0066] Outras técnicas que são conhecidas na matéria para a seleção de fragmentos de anticorpo de biblioteca usando tecnologias de enriquecimento, incluindo mas não limitado para exibição em fagos, exibição em ribosoma (Hanes e Pluckthun, 1997, Proc. Nat. Acad. Sei. 94: 4937- 4942), exibição em bactéria (Georgiou, et al, 1997, Nature Biotechnology 15: 29-34) e/ou exibição em levedura (Kieke, et al, 1997, Protein Engineering 10: 1303-1310) podem ser utilizadas como alternativas para as tecnologias previamente discutidas para selecionar anticorpos de cadeia única. Os anticorpos de cadeia única são selecionados de uma biblioteca de anticorpos de cadeia única produzidos diretamente utilizando tecnologia de filamento de fago. tecnologia de exibição em fagos é conhecida na matéria (exemplo, ver tecnologia de Cambridge Antibody. Tecnologia (CAT) como divulgada nas Patentes U.S. Nos. 5,565,332; 5,733,743; 5,871,907; 5,872,215; 5,885,793; 5,962,255; 6,140,471; 6,225,447; 6,291650; 6,492,160; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915; 6,593, 081, bem como outros membros da familia U.S., ou aplicações que dependem da prioridades depositada em GB 9206318, depositada 24 de maio de 1992; ver também Vaughn, et al. 1996, Nature Biotechnology 14: 309-314). Cadeia [única de anticorpos pode também ser designada e construída usando tecnologia de DNA recombinante, tal como um método de amplificação de DNA (exemplo, PCR), ou possivelmente usando um hibridoma do respectivo cDNA de como um modelo.

[0067] Os anticorpos variantes também são incluídos dentro do escopo da invenção. Assim, variantes das sequências definidas na aplicação também são incluídas dentro do escopo da invenção. Adicionalmente variantes das sequências de anticorpo tendo afinidade melhorada podem ser obtidas usando métodos conhecidos na matéria e são incluídas dentro do escopo da invenção. Por exemplo, substituições de aminoácido podem ser usadas para obter anticorpos com adicional melhora da afinidade. Alternativamente, otimização de códon da sequência de nucleotideo pode ser usada para melhorar a eficiência de translação nos sistemas de expressão para a produção do anticorpo.

[0068] Tais sequências variantes de anticorpo compartilharão 70% ou mais (isto é, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%o, 99%) ou mais) da sequência identidade com a sequências definida na aplicação. Tal identidade de sequência é calculada com em relação ao comprimento completo da sequência referência (isto é, a sequência definida na aplicação). Percentagem de identidade, tal como referido neste documento, é como determinado usando versão BLAST 2.1.3 utilizando os parâmetros padrão especificados pelo NCBI (o National Center for Biotechnology Information; www.ncbi.nlm.nih.gov/) [Blosum 62 matrix; gap open penalty=ll e gap extension penalty=l]. Por exemplo, sequências de peptideo são fornecidas para esta invenção que compreendem pelo menos cerca de 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, ou mais peptideos contiguos de uma ou mais das sequências divulgadas neste documento assim como todos os comprimentos intermédios entre estes. Como usado neste documento, o termo "comprimentos intermediários" pretende descrever qualquer comprimento entre os valores citados, tal como 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, etc.; 21, 22, 23, etc.; 30, 31, 32, etc.; 50, 51, 52, 53, etc.; 100, 101, 102, 103, etc.; 150, 151, 152, 153, etc.

[0069] A presente invenção proporciona anticorpos, que isoladamente ou em combinação com outros anticorpos, tais como, mas não limitado para, VRCO1, voltas anti-V3, anticorpos CD4bs e CD4i bem como anticorpos semelhantes PG9/PG16, que têm atividade ampla de neutralizante no soro.

[0070] De acordo com outra concretização, a presente invenção fornece métodos para a preparação e administração de uma composição de anticorpo HIV que é adequada para administração para um paciente primata humano ou não humano tendo infecção HIV, ou em risco de infecção HIV, em uma quantidade e de acordo coma um programa suficiente para induzir uma resposta imune preventiva contra HIV, ou redução do virus HIV, em um humano.

[0071] De acordo com outra concretização, a presente invenção fornece uma vacina compreendendo pelo menos um anticorpo da invenção e um transportador farmaceuticamente aceitável. De acordo com uma concretização, a vacina é uma vacina compreendendo pelo menos um anticorpo descrito neste documento e um transportador farmaceuticamente aceitável. A vacina pode incluir uma pluralidade dose anticorpos tendo as características descritas neste documento em qualquer combinação e pode adicionalmente incluir anticorpos neutralizante para HIV como são conhecidos na matéria.

[0072] É para ser entendido que composições pode ser um único ou uma combinação de anticorpos divulgados neste documento, que pode ser o mesmo ou diferentes, de modo a tratar profilaticamente ou terapeuticamente a progressão de vários subtipos de infecção HIV depois da vacinação. Tais combinações podem ser selecionadas de acordo com a desejada imunidade. Quando um anticorpo é administrado para um animal ou um humano, pode ser combinado com um ou mais transportadores, excipientes ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis, como são conhecido por um experiente na matéria. A composição pode adicionalmente incluir anticorpos amplamente neutralizantes conhecidos na matéria, incluindo mas não limitado para, VRCO1, bl2, volta anti-V3, anticorpos CD4bs e CD4i tanto quanto anticorpos como PG9/PG16.

[0073] Adicionalmente, com relação à determinação do nivel eficaz em um paciente para tratamento de HIV, em particular, adequados modelos animais são disponíveis e têm sido amplamente aplicada para avaliar eficácia contra HIV in vivo de vários protocolos de terapia de gene (Sarver et al. (1993b), supra). Estes modelos incluem ratos, macacos e gatos. Mesmo que estes animais não sejam naturalmente susceptíveis à doença de HIV, modelos de rato quimérico (por exemplo, SCID, bg/nu/xid, NOD/SCID, SCID-hu, imunocompetente SCID-hu, medula óssea-ablated BALB / c) reconstituído com células mononuclear de sangue periférico humano (Peripheral Blood Mononuclear Cells - PBMCs), nódulos linfáticos, figado fetal / timo ou outros tecidos podem ser infectados com vetor lentiviral ou HIV, e empregado como modelos para patogênese de HIV. Similarmente, o virus da imunodeficiência simia (Simian Immune deficiency virus SIV) / do modelo de macaco pode ser empregado, como pode o virus da imunodeficiência felina (Feline Immune deficiency Virus - FIV)/ modelo de gato. A composição farmacêutica pode conter outros farmacêuticos, em conjunção com um vetor de acordo com a invenção, quando usado para tratar terapeuticamente AIDS. Estes outros farmacêuticos podem ser usados em seu modo tradicional (isto é, como agentes para tratar a infecção HIV).

[0074] De acordo com outra concretização, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica baseada em anticorpo compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo isolado de Anticorpo HIV, ou uma versão de afinidade maturada, que fornece um tratamento profilático ou terapêutico escolhido para reduzir infecção do vírus HIV. A composição farmacêutica baseada em anticorpo da presente invenção pode ser formulada para qualquer número de estratégias conhecidas na matéria (exemplo, ver McGoff and Scher, 2000, Solution Formulation of Proteins/Peptides: In McNally, E.J., ed. Protein Formulação and Deliver. New York, NY: Marcel Dekker; pp. 139-158; Akers and Defilippis, 2000, Peptides and Proteins as Parenteral Solutions. In: Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins. Philadelphia, PA: Talyor and Francis; pp. 145- 177; Akers, et al., 2002, Pharm. Biotechnol. 14:47-127). Uma composição farmaceuticamente aceitável adequada para administração em paciente conterá uma quantidade eficaz do anticorpo em uma formulação que tanto retém a atividade biológica enquanto também promove a estabilidade máxima durante o armazenamento dentro de um intervalo aceitável de temperatura. A composição farmacêuticas pode também incluir, dependendo da formulação desejada, diluentes farmaceuticamente aceitáveis, transportadores farmaceuticamente aceitáveis e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis, ou qualquer veiculo comumente usado para formular composições farmacêuticas para administração em animal ou humano. 0 diluente é selecionado tal que não afete a atividade biológica da combinação. Exemplos de tais diluentes são: água destilada, solução salina tamponada de fosfato fisiológico, soluções de Ringer, soluções de dextrose, e solução de Hank. A quantidade de um excipiente que é útil na composição farmacêutica ou formulação desta invenção é uma quantidade que serve para uniformemente distribuir o anticorpo através da composição tal que pode ser uniformemente dispersada quando é para ser entregue para um sujeito na necessidade disto. Pode servir para diluir o anticorpo para uma concentração que forneça o desejado benefício paliativo ou resultado curativo enquanto ao mesmo tempo minimiza qualquer efeito colateral adverso que possa ocorrer de uma concentração muito alta. Pode também ter um efeito preservativo. Assim, para o anticorpo tendo uma alta atividade fisiológica mais do excipiente será empregado. Ou de outro modo, para qualquer ingrediente(s) ativo que exiba uma baixa atividade fisiológica, uma menor quantidade do excipiente será empregado.

[0075] Os anticorpos e composições de anticorpo ou composições de vacina, acima descritos, compreendendo pelo menos um ou uma combinação dos anticorpos descritos neste documento, pode ser administrado para o tratamento profilático e terapêutico de infecção HIV viral.

[0076] A presente invenção também relata para polipeptídeos isolados compreendendo as novas sequências de aminoácido de cadeias leves e cadeias pesadas, tanto as sequências de consenso para as cadeias pesada e leves de SEQ ID NOs: 1 e 2, como listado na Figura 3.

[0077] Em outras concretizações relatadas, a invenção fornece polipeptídeo variantes que codifica as sequências de aminoácido dos anticorpos HIV listado na Figura 3; a sequências de consenso para as cadeia pesadas e leves de SEQ ID NOs: 1 e 2. Estes polipeptídeo variantes têm pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%, ou mais, sequência identidade comparado com a sequência de polipeptideo desta invenção, como determinado usando os métodos descritos neste documento, (por exemplo, análise BLAST usando parâmetros padrão). Um experiente na matéria reconhecerá que estes valores podem ser apropriadamente ajustados para determinar a identidade correspondente das proteinas codificadas para ter a similaridade de aminoácido e semelhantes.

[0078] O termo "polipeptideo" é usado em sua maneira convencional, isto é, como uma sequência de aminoácidos. Os polipeptideos não são limitados para um comprimento especifico do produto. Peptideos, oligopeptideos, e proteinas são incluídos dentro da definição de polipeptideo, e tais termos podem ser usados intercambiáveis neste documento a menos que especificamente indicado de outra maneira. Este termo também inclui modificações pós expressão do polipeptideo, por exemplo, glicosilações, acetilações, fosforilações e semelhantes, tanto quanto outras modificações conhecidas na matéria, ambos ocorrendo naturalmente e não naturalmente. Um polipeptideo pode ser uma proteina inteira, ou uma subsequência desta. Particular polipeptideos de interesse no contexto desta invenção são subsequências de aminoácido compreendendo CDRs, VH e VL, sendo capazes de ligar um antigeno ou célula infectada HIV.

[0079] Um polipeptideo "variante,"como o termo é usado neste documento, é um polipeptideo que tipicamente difere de um polipeptideo especificamente divulgado neste documento em uma ou mais substituições, deleções, adições e/ou inserções. Tais variantes podem ser de ocorrendo naturalmente ou pode ser gerado sinteticamente, por exemplo, por modificação de uma ou mais das sequências de polipeptideo da invenção e avaliação de uma ou mais atividades biológicas dos polipeptideo como descrito neste documento e/ou usando qualquer de um número de técnicas bem conhecidas na matéria.

[0080] Por exemplo, certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos em uma estrutura de proteína sem apreciável perda de suas habilidade para ligar outros polipeptideos (por exemplo, antigenos) ou células. Uma vez que é a capacidade de ligação e a natureza de uma proteína que define que a atividade funcional biológica da proteina, certas substituições de sequências de aminoácidos podem ser feitas em uma sequência de proteina e, em conformidade, a sua subjacente sequência de codificação de DNA, com o que uma proteina com propriedades iguais é obtida. Assim é contemplado que várias trocas podem ser feita nas sequências de peptideos das composições divulgadas, ou correspondentes sequências de DNA que codifica os ditos peptideos sem apreciável perda de suas utilidades ou atividades biológica.

[0081] Em muitos exemplos, um variante de polipeptideo conterá uma ou mais substituições conservativas. Uma "substituição conservative"é uma em que um aminoácido é substituído por outro aminoácido que tem propriedades similares, de tal modo que um experiente na matéria de quimica de peptideo esperaria que a estrutura secundária e a natureza idiopática do polipeptídeo para ser substancialmente inalterada.

[0082] Substituições de aminoácido geralmente são baseados na relativa similaridade da cadeia lateral do aminoácido substituintes, por exemplo, suas hidrofobicidade, hidrofilicidade, carga, tamanho, e semelhantes. Exemplares substituições que acompanham várias das características acima expostas na consideração são bem conhecidas para experientes na matéria e incluem: arginina e lisina; glutamato e aspartato; serina e treonina; glutamina e asparagina; e valina, leucina e isoleucina.

[0083] "Homologia"ou "sequência identidade" refere-se para a percentagem de resíduos na sequência de polinucleotídeo ou polipeptídeo variante que são idênticas para a sequência não variante depois do alinhamento das sequências e introdução de lacunas, se necessário, para atingir a máxima percentagem de homologia. Em concretizações particulares, polinucleotídeos e polipeptídeo variantes têm pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%>, pelo menos cerca de 90%>, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%) , ou pelo menos cerca de 99% homologia de polinucleotídeo ou polipeptídeo com um polinucleotídeo ou polipeptídeo descrito neste documento.

[0084] Tais sequências de polipeptídeos variantes compartilhaãoá 70%>ou mais (isto é 80%>, 85%, 90%>, 95%, 97%), 98%), 99%) ou mais) da sequência identidade com as sequências definidas na aplicação. Em concretizações adicionais, a invenção descrita fornece fragmentos de polipeptideo compreendendo vários comprimentos de trechos contiguos de sequências de aminoácido divulgadas neste documento. Por exemplo, sequências de peptideos são providas por esta invenção que compreende pelo menos cerca de 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, ou mais contiguos peptideos de uma ou mais das sequências divulgadas neste documento tanto quanto todos os comprimentos intermediários entre estes.

[0085] A invenção também inclui sequências de ácido nucléico codificando parte ou toda as cadeias leve ou pesadas dos anticorpos inventivos descritos, e fragmentos destes. Devido redundância do código genético, existirão variantes destas sequências que codificam as mesmas sequências de aminoácido.

[0086] A presente invenção também inclui sequências de ácido nucléico isoladas que codificam os polipeptideos para as cadeias pesadas e leves dos anticorpos HIV listados na Figura 3 e as sequências de consenso para a- cadeias pesada e leve de SEQ ID NOs: 1 e 2.

[0087] Em outras concretizações relatadas, a invenção descrita fornece polinucleotideo variantes que codifica as sequências de peptideos das cadeias pesada e leve dos anticorpos HIV listados na Figura 3; as sequências de consenso para as cadeias pesada e leve de SEQ ID NOs: 1 e 2. Estes polinucleotideos variantes têm pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%>, pelo menos 85%, pelo menos 90%>, pelo menos 95%, pelo menos 96%>, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, ou mais, da sequência identidade comparado com uma sequência de polinucleotideo desta invenção, como determinado usando os métodos descritos neste documento, (por exemplo, análise BLAST usando parâmetros padrão). Um experiente na matéria reconhecerá que estes valores podem ser apropriadamente ajustados para determinar correspondente identidade de proteinas codificada pelas duas sequências de nucleotideo tendo em conta degeneração de códon, similaridade de aminoácido, posicionamento de leitura, e semelhantes.

[0088] Os termos "ácido nucléico"e "polinucleotideo"são usados intercambiáveis neste documento para referir para RNA, DNA de cadeia simples ou cadeia dupla, ou polímeros misturados. Polinucleotídeos podem incluir sequências genômicas, extra-genômica e sequências plasmídeo, e segmentos de genes menores manipulados que expressam, ou podem ser adaptados para expressar polipeptideos.

[0089] Um "ácido nucléico isolado"é um ácido nucléico que é substancialmente separado de outras sequências de DNA genômica tanto quanto proteínas ou complexos tais como ribosomas e polimerases, que naturalmente acompanham uma sequência nativa. O termo codifica uma sequência de ácido nucléico que foi removido destes ambientes que ocorre naturalmente, e incluem recombinantes ou clonados DNA isolados e análogos quimicamente sintetizados ou análogos biologicamente sintetizados por sistemas heterólogos. Um ácido nucléico substancialmente puro inclui formas isoladas do ácido nucléico. Consequentemente, estes se referem para o ácido nucléico como isolado originalmente e não exclui genes ou sequências mais tarde acrescentados para o ácido nucléico isolado pela habilidade do homem.

[0090] Um polinucleotídeo "variante," como o termo é usado neste documento, é um polinucleotídeo que tipicamente difere de um polinucleotídeo especificamente divulgado neste documento em uma ou mais substituições, deleções, adições e/ou inserções. Tais variantes podem ser ocorrendo naturalmente ou podem ser geradas sinteticamente, por exemplo, por modificação de uma ou mais das sequências polinucleotídeo da invenção e avaliação de uma ou mais atividades biológicas do polipeptídeo codificado como descrito neste documento e/ou usando qualquer de uma série de técnicas bem conhecidas na matéria.

[0091] Modificações podem ser feitas na estrutura dos polinucleotídeos da invenção descrita e ainda obter uma molécula funcional que codifica um polipeptídeo variante ou derivado com características desejáveis. Quando é desejada a alteração da sequência de aminoácido de um polipeptídeo para criar um equivalente, ou mesmo uma melhoria, variante ou porção de um polipeptídeo da invenção, um experiente na matéria tipicamente trocará um ou mais dos códons da sequência DNA que codifica.

[0092] Tipicamente, polinucleotídeo variantes têm uma ou mais substituições, adições, deleções e/ou inserções, tais que as propriedades de ligações imunogênicas do polipeptídeo codificado pelos polinucleotídeo variante não é substancialmente diminuída em relação a um polipeptídeo codificado por uma sequência de polinucleotídeo especificamente estabelecida neste documento.

[0093] Em concretizações adicionais, a invenção descrita fornece fragmentos de polinucleotídeo compreendendo vários comprimentos de trechos contiguos de sequência idêntica a ou complementar a uma ou mais das sequências divulgadas neste documento. Por exemplo, polinucleotideos são fornecidos nesta invenção que compreendem pelo menos cerca de 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 ou 1000 ou mais nucleotideos contiguos de uma ou mais das sequências divulgadas neste documento tanto quanto todos os comprimentos intermediários destes e engloba qualquer comprimento entre os valores citados, tal como 16, 17, 18, 19, etc.; 21, 22, 23, etc.; 30, 31, 32, etc.; 50, 51, 52, 53, etc.; 100, 101, 102, 103, etc.; 150, 151, 152, 153, etc.; e incluindo todos os inteiros entre 200-500; 500- 1.000.

[0094] Em outra concretização da invenção, composições de polinucleotideo são fornecidas que são capazes de hibridização sob condições de severidade moderadas a altas para uma sequência de polinucleotideo fornecida neste documento, ou um fragmento destas, ou uma sequência complementar destas. As técnicas de hibridização são bem conhecidas na matéria de biologia molecular. Para o propósito de ilustração, adequadas condições de severidade moderada para testar hibridização de um polinucleotideo desta invenção com outros polinucleotideos incluem pré lavagem em uma solução de 5x SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0); hibridização a 50-60° C, 5x SSC, durante a noite; seguido por lavagem duas vezes a 65°C por 20 minutos com cada de 2x, 0,5x, e 0,2x SSC contendo 0,1% SDS. Um experiente na matéria entenderá que a severidade da hibridização pode ser prontamente manipulada, tal como por alterando o conteúdo de sal da solução hibridização e/ou a temperatura na qual a hibridização é realizada. Por exemplo, em outra concretização, adequadas condições altamente severas de hibridização incluem estas descritas acima, com a exceção que a temperatura de hibridização é aumentada, por exemplo, para 60-65 °C ou 65-70 °C.

[0095] Em algumas concretizações, o polipeptideo codificado pelo polinucleotideo variante ou fragmento tem a mesma especificidade de ligação (isto é, especificamente ou preferencialmente ligado para o mesmo epitopo ou cepa de HIV) como os polipeptideo codificados pelo polinucleotideo nativo. Em algumas concretizações, os descritos polinucleotideos, polinucleotideos variantes, fragmentos e sequências de hibridização, codifica polipeptideos que têm um nivel de atividade de ligação de pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, e pelo menos cerca de 90%> do que para uma sequência de polipeptideo especificamente estabelecida neste documento.

[0096] 0 polinucleotideos da invenção descrita, ou fragmentos destes, independentemente do comprimento da sua própria sequência de codificação, podem ser combinados com outras sequências de DNA, tal como promotores, sinais de poliadenilação, adicional sites de enzima de restrições, sites de clonagem múltipla, outras segmentos codificados, e semelhantes, tais que seu comprimento global pode variar consideravelmente. Um fragmento de ácido nucléico de quase qualquer comprimento é empregado. Por exemplo, ilustrativos segmentos de polinucleotideo com total comprimento de cerca de 10.000, cerca de 5.000, cerca de 3.000, cerca de 2.000, cerca de 1.000, cerca de 500, cerca de 200, cerca de 100, cerca de 50 pares de base no comprimento, e semelhantes, (incluindo todos os comprimentos intermediários) são incluidos em várias implementações desta invenção.

[0097] Adicionalmente incluído dentro do escopo da invenção são vetores tal como vetores de expressão, compreendendo uma sequência de ácido nucléico de acordo com a invenção. As células transformadas com tais vetores também são incluídas dentro do escopo da invenção.

[0098] A presente invenção também fornece vetores e células hospedeiras compreendendo um ácido nucléico da invenção, tanto quanto técnicas recombinantes para a produção de um polipeptídeo da invenção. Vetores da invenção incluem estes capazes de replicação em qualquer tipo de célula ou organismo, incluindo, por exemplo, plasmídeos, fago, cosmídeos, e mini cromossomas. Em algumas concretizações, vetores compreendendo um polinucleotídeo da invenção descrita são vetores adequados para propagação ou replicação do polinucleotídeo, ou vetores adequados para expressar um polipeptídeo da invenção descrito. Tais vetores são conhecidos na matéria e comercialmente disponíveis.

[0099] "Vetor"inclui vetores de transporte e expressão. Tipicamente, o construtor de plasmídeo também incluirá uma origem de replicação (por exemplo, a origem de replicação ColEl) e um marcador selecionável (por exemplo, resistência a ampicilina ou tetraciclina), para replicação e seleção, respectivamente, do plasmídeos na bactéria. Um "vetor de expressão" refere-se para um vetor que contenha as necessárias sequências de controle ou elementos reguladores para expressão dos anticorpos incluindo fragmentos de anticorpo da invenção, em células de bactérias ou eucarióticas.

[00100] Como usado neste documento, o termo "célula"pode ser qualquer célula, incluindo, mas não limitado para, estas de espécie eucariótica, multicelular (por exemplo, em oposição a uma célula de levedura unicelular), tais como, mas não limitado para, uma célula mamifera ou uma célula humana. Uma célula pode estar presente como uma entidade única, ou pode ser parte de uma grande coleção de células. Tal como "coleções de células grandes" podem compreender, por exemplo, uma cultura de célula (misturada ou pura), um tecido (por exemplo, endotelial, epitelial, mucosa ou outro tecido), um órgão (por exemplo, pulmão, figado, músculo e outros órgãos), um sistema de órgãos (por exemplo, sistema circulatório, sistema respiratório, sistema gastrointestinal, sistema urinário, sistema • nervoso, sistema tegumentário ou outros sistemas de órgão), ou um organismo (exemplo, um pássaro, mamifero, ou semelhantes) .

[00101] Polinucleotideos da invenção podem sintetizados, completamente ou em partes que então são combinados, e inseridos dentro de um vetor usando técnicas de biologia de célula e molécula rotineiras, incluindo, por exemplo, subclonando o polinucleotideo dentro de um vetor linearizado usando apropriados sites de restrição e enzimas de restrição. Polinucleotideos da invenção descrito são amplificados por reação de cadeia de polimerase usando oligonucleotídeo iniciadores complementares para cada cadeia do polinucleotideo. Estes iniciadores também incluem sites de clivagem de enzima de restrição para facilitar subclonagem dentro de um vetor. Os componentes do vetor replicável geralmente incluem, mas não são limitados para, um ou mais dos seguintes: uma sequência de sinal, um original de replicação, e um ou mais genes marcadores ou selecionáveis.

[00102] De modo a expressar um polipeptideo da invenção, a sequências de nucleotideo que codifica o polipeptideo, ou equivalentes funcionais, podem ser inseridos dentro de um apropriado vetor de expressão, isto é, um vetor que contenha os elementos necessários para a transcrição e translação da sequência codificada inserida. Métodos bem conhecidos por experientes na matéria podem ser usados para construir vetores de expressão contendo sequências de codificação para polipeptideo de interesse e apropriados elementos de controle transcricional e translacional. Estes métodos incluem técnicas recombinantes de DNA in vitro, técnicas sintéticas, e recombinação genética in vivo. Tais técnicas são descritas, por exemplo, em Sambrook, J. , et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., e Ausubel, F. M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, New York. N.Y.

[00103] A presente invenção também fornece kits úteis na realização de ensaios de diagnósticos e prognósticos usando os anticorpos, polipeptideos e ácido nucléicos da presente invenção. Kits da presente invenção incluem um recipiente adequado compreendendo um anticorpo HIV, um polipeptideo ou um ácido nucléico da invenção na forma rotulado ou não rotulada. Em adição, quando o anticorpo, polipeptídeo ou ácido nucléico é fornecido em uma forma rotulada adequada para um ensaio de ligação indireto, o kit adicionalmente inclui reagentes para a realização do apropriado ensaio indireto. Por exemplo, o kit pode incluir um ou mais recipientes adequados incluindo substratos de enzima ou agentes de derivatização, dependendo da natureza do rotulo. Amostras de controle e/ou instruções podem também serem incluidas. A presente invenção também fornece kits para a detecção da presença dos anticorpos HIV ou a sequência nucleotideo do anticorpo de HIV na presente invenção em uma amostra biológica por PCR ou espectrometria de massa.

[00104] "Rótulo"como usado neste documento refere-se para um composto ou composição detectável que está conjugada diretamente ou indiretamente para o anticorpo de modo a gerar um anticorpo "rotulado". Um rótulo pode também ser conjugado para um polipeptídeo e/ou uma sequência de ácido nucléico divulgada neste documento. O rótulo pode ser detectável por si próprio (por exemplo, rótulos de radioisótopos ou rótulos fluorescentes) ou, no caso de um rótulo enzimático, pode catalisar uma alteração química de um composto ou composição de substrato que é detectável. Anticorpos e polipeptideos da invenção descrita também podem ser modificados para incluir uma etiqueta ou rótulo de epitopo, por exemplo, para uso na purificação ou aplicações de diagnóstico. Meios adequados de detecção incluem o uso de rótulos tais como, mas não limitados para, radionucleotideos, enzimas, coenzimas, agentes fluorescentes, agentes quimioluminescentes, cromogios, substratos de enzima ou co-fatores, inibidores de enzimas, complexos de grupos prostéticos, radicais livres, partículas, corantes, e semelhantes.

[00105] De acordo com outra concretização, a presente invenção fornece métodos de diagnóstico. Métodos de diagnóstico geralmente envolve contactar uma amostra a biológica obtida de um paciente, tal como, por exemplo, sangue, soro, saliva, urina, expectoração, uma amostra de célula swab, ou uma biopsia de tecido, com um anticorpo HIV e determinar se o anticorpo preferencialmente liga pra a amostra quando comparado com uma amostra de controle ou predeterminado valor de corte, desta forma indicando a presença de virus HIV.

[00106] De acordo com outra concretização, a presente invenção fornece métodos para detectar a presença dos anticorpos HIV da presente invenção em uma amostra biológica de um paciente. Os métodos de detecção geralmente envolvem a obtenção de uma amostra biológica de um paciente, tal como, por exemplo, sangue, soro, saliva, urina, expectoração, uma amostra de célula swab, ou um tecido de biopsia e isolação de anticorpos HIV ou fragmentos destes, ou o ácido nucléicos que codifica um Anticorpo HIV, e ensaiado pela presença de um anticorpo HIV na amostra biológica. Também, a presente invenção fornece métodos para detectar a sequência de nucleotideo de um anticorpo HIV em uma célula. A sequência de nucleotideo de um anticorpo HIV pode também ser detectada usando os iniciadores divulgados neste documento. A presença do anticorpo HIV em uma amostra biológica de um paciente pode ser determinada utilizando conhecidas técnicas recombinantes e/ou o uso de um espectrômetro de massa.

[00107] Em outra concretização, a presente invenção fornece um método para detectar um anticorpo HIV compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de consenso altamente conservada e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de consenso altamente conservada em uma amostra biológica, compreendendo a obtenção de uma imunoglobulina-contendo a amostra biológica de um sujeito mamífero, isolando um anticorpo HIV da dita amostra, e identificando a sequências de consenso altamente conservadas da cadeia pesada e a cadeia leve. A amostra biológica pode ser sangue, soro, saliva, urina, expectoração, uma amostra célula swab, ou um tecido de biopsia. As sequências de aminoácido podem ser determinadas por métodos conhecidos na matéria incluindo, por exemplo, PCR e espectrometria de massa.

[00108] O termo "avaliação"inclui qualquer forma de medida, e inclui determinar se um elemento está presente ou não. Os termos "determinação", "medição", "avaliação", "avaliar" e "ensaiar" são usados intercambiáveis e incluem quantitativas e qualitativas determinações. Avaliação pode ser relativa ou absoluta. Avaliar a presença inclui a determinação da quantidade de alguma presença, e/ou a determinação se está presente ou ausente. Como usado neste documento, os termos "determinação,""medição,"e "avaliação,"e "ensaiar"são usadas intercambiáveis e incluem ambas as determinações quantitativas e qualitativas.

II. Método de Redução de Replicação Virai

[00109] Métodos para reduzir um aumento na titulação de virus HIV, replicação de virus, proliferação de vírus ou uma quantidade de uma proteína HIV viral em um sujeito são adicionalmente providos. De acordo com outro aspecto, um método inclui a administração para o sujeito de uma quantidade eficaz de um anticorpo HIV para reduzir um aumento na replicação da titulação de HIV, replicação de vírus ou uma quantidade de uma proteína HIV de uma ou mais cepas HIV ou isolada no sujeito.

[00110] De acordo com outra concretização, a presente invenção fornece um método de redução de replicação virai ou espalhamento de infecção HIV para células adicionais ou tecido hospedeiro compreendendo contactar uma célula mamífera com o anticorpo, ou uma porção destes, que liga para um epítopo antigênico em gpl20.

III. Método de Tratamento

[00111] De acordo com outra concretização, a presente invenção fornece um método para tratamento de um mamífero infectado com uma infecção de vírus, tal como, por exemplo, HIV, compreendendo a administração para o dito mamífero uma composição farmacêutica compreendendo os anticorpos HIV divulgados neste documento. De acordo com uma concretização, o método for tratamento de um mamífero infectado com HIV compreendendo a administração para o dito mamífero de uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo da presente invenção, ou um fragmento destes. As composições da invenção podem incluir mais que um anticorpo tendo as características divulgadas (por exemplo, uma pluralidade ou pool de anticorpos). Também pode incluir outros anticorpos HIV neutralizante como são conhecidos na matéria, por exemplo, mas não limitado para, VRCO1, PG9 e bl2.

[00112] Imunização passiva provou ser uma estratégia eficaz e segura para a prevenção e tratamento de doenças virai. (Ver, por exemplo, Keller et al., Clin. Microbiol. Rev. 13:602-14 (2000); Casadevall, Nat. Biotechnol. 20: 114 (2002); Shibata et al, Nat. Med. 5:204-10 (1999); e Igarashi et al, Nat. Med. 5:211-16 (1999). A imunização passiva usando anticorpos monoclonais humanos fornece uma estratégia imediata de tratamento para profilaxia de emergência e tratamento de HIV.

[00113] Sujeitos em risco para doenças ou desordens relacionadas com HIV incluem pacientes que tenham entrado em contato com uma pessoa infectada ou que foi exposto para HIV em alguma outra forma. A administração de um agente profilático pode ocorrer antes da manifestação de sintomas característicos de doença ou desordens relacionadas com HIV, tal que a doença ou desordem é prevenida ou, alternativamente, retardada na sua progressão.

[00114] Para tratamento de pacientes humanos e não humanos in vivo,o paciente é administrado ou provido com uma formulação farmacêutica incluindo um anticorpo HIV da invenção. Quando usado para terapia in vivo, os anticorpos da invenção são administrados para o paciente em quantidades terapeuticamente eficazes (isto é, quantidades que eliminam ou reduzem a carga viral do Paciente) . Os anticorpos são administrados para um paciente humano, de acordo com métodos conhecidos, tal como administração intravenosa, por exemplo, na forma de bolus ou por infusão continua ao longo de um periodo de tempo, por rotas intramuscular, intraperitoneal, intracerobroespinal, subcutânea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, topical, ou inalação. Os anticorpos podem ser administrados parenteralmente, quando possível, no site da célula alvo, ou intravenosamente. Em algumas concretizações, o anticorpo é administrado por administração intravenosa ou subcutânea. Composições terapêuticas da invenção podem ser administradas para um paciente ou sujeito sistematicamente, parenteralmente, ou localmente. Os parâmetros acima para avaliação de tratamento bem sucedida e melhora na doença são prontamente medidas por procedimentos rotineiros familiares para um médico.

[00115] Para administração parenteral, os anticorpos podem ser formulados em uma forma de dosagem única injetável (solução, suspensão, emulsão) em associação com um veiculo parenteral farmaceuticamente aceitável. Exemplos de tais veículos incluem, mas não são limitados para água, salino, solução de Ringer, solução dextrose, e 5% de soro de albumina humana. Veículos não aquosos incluem, mas não são limitados para, óleo de fixação e etil oleato. Liposomas podem ser usados como transportadores. O veículo pode conter menor quantidade de aditivos tais como substâncias que aumentam a isotonicidade e estabilidade química, tais como, por exemplo, tampões e preservativos. Os anticorpos podem ser formulados em tais veiculos a concentrações de cerca de 1 mg/ml a 10 mg/ml.

[00116] A dose e regime de dosagem dependem de uma variedade de fatores prontamente determinados por um médico, tal como a natureza da infecção, por exemplo, seu indice terapêutico, o paciente, e a história do paciente. Geralmente, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo é administrada para um paciente. Em algumas concretizações, a quantidade de anticorpo administrado está no intervalo de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg do peso corporal do paciente. Dependendo do tipo e severidade da infecção, cerca de 0, 1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg peso corporal (por exemplo, cerca de 0,1-15 mg/kg/dose) de anticorpo é uma dosagem inicial candidata para administração para o paciente, se, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas, ou por infusão continua. O progresso desta terapia é prontamente monitorado por métodos e ensaios convencionais e baseado nos critérios conhecidos para um médico ou outras pessoas experiente na matéria. Os parâmetros acima para a avaliação de tratamento bem sucedido e melhora na doença são prontamente mensuráveis por procedimentos rotineiros familiares para um médico.

[00117] Outros regimes terapêuticos podem ser combinados com a administração do anticorpo HIV da presente invenção, a administração combinada inclui co-administração, usando formulações separadas ou uma formulação farmacêutica única, e administração consecutiva em qualquer ordem, caracterizado por: preferencialmente existir um periodo de tempo durante ambos (ou todos) os agentes ativos simultaneamente exercerem suas atividades biológica. Tal terapia combinada pode resultar em um efeito terapêutico sinergético. Os parâmetros acima para avaliar o sucesso do tratamento e melhoria da doença são prontamente mensuráveis por procedimentos rotineiros familiares para um médico.

[00118] Os termos "tratar" ou "tratamento" ou "alivio" são usados intercambiáveis e referem para ambos os tratamentos terapêutico e profilático ou medidas preventivas; caracterizado por: o objeto ser para prevenir ou desacelerar (diminuir) a condição ou desordem patológica alvo. Estes necessitados de tratamento incluem estes já com a desordem tanto quanto aqueles propensos para ter a desordem ou aqueles nos quais a desordem se pretende prevenir. Um sujeito ou mamifero é "tratado"com sucesso para uma infecção se, após receber uma quantidade terapêutica de um anticorpo de acordo com os métodos da presente invenção, o paciente mostra observável e/ou redução mensurável ou ausência de uma ou mais dos seguintes: redução no número de células infectadas ou ausência das células infectadas; redução no percentual de células de totais que estão infectadas; e/ou alivio e certa medida, uma ou mais dos sintomas associados com a infecção especifica; morbidade e mortalidade reduzida, e melhora na qualidade de questões de vida. Os parâmetros acima para avaliação do sucesso do tratamento e melhora da doença são prontamente mensuráveis por procedimentos rotineiros familiares para um médico.

[00119] O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se para uma quantidade de um anticorpo ou uma fármaco eficaz para tratar uma doença ou desordem em um sujeito ou mamifero.

[00120] A administração "em combinação com" um ou mais agentes terapêuticos adicionais inclui administração simultânea (concorrente) e consecutiva em qualquer ordem.

[00121] "Transportadores" como usados neste documento incluem transportadores, excipientes, ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis, que não são tóxicos para a célula ou mamifero sendo exposto às mesmas nas dosagens e concentrações empregadas. Frequentemente transportador fisiologicamente aceitável é uma solução tamponada de aquoso pH. Exemplos de transportadores fisiologicamente aceitáveis incluem, mas não limitados para, tampões tal como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo, mas não limitados para, ácido ascórbico; baixo peso molecular (menor que cerca de 10 residues) polipeptideo; proteinas, tais como, mas não limitados para, albumina do soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polimeros hidrofilico tais como, mas não limitado para, polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como, mas não limitado para, glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monosacarideos, disacarideos, e outros carboidratos incluindo, mas não limitado para, glicoses, manose, ou dextrins; agentes quelantes tais como, mas não limitados para, EDTA; alcoóis de açúcar tais como, mas não limitados para, manitol ou sorbitol; contra ions formando sal tais como, mas não limitados para, sódio; e/ou surfactantes não iônico tais como, mas não limitados para, TWEEN.; polietileno glicol (PEG), e PLURONICS.

[00122] Quando é fornecido um intervalo de valores, entende-se que cada valor intermediário, ao décimo da unidade do limite inferior a menos que o contexto claramente declara de outra maneira, entre o limite superior e inferior deste intervalo e qualquer outro valor estabelecido ou intermediário neste intervalo estabelecido é englobado no âmbito invenção. Os limites superiores e inferiores destes intervalos menores que podem independentemente ser incluídos em intervalos menores também está englobado no âmbito da invenção, sujeito a qualquer limite especificamente excluido no intervalo estabelecido. Onde o intervalo estabelecido inclui um ou ambos os limites, os intervalos excluidos qualquer um de ambos desses limites incluídos estão também incluídos na.

EXEMPLO 1

[00123] Este exemplo descreve os -materiais e métodos usados nos EXEMPLOS 2-5 abaixo.

[00124] Os anticorpos HIV foram clonados e produzidos após a captura, de células B especificas de gpl40 único, como descrito previamente (Mouquet, H. et al. PLoS One 6, e24078 (2011); Tiller, T. et al. J Imunol Methods 329, 112-24 (2008); e Scheid, J.F. et al. Nature 458, 636-40 (2009)). PGT121GM e 10-1074GM"glycomutant"Os anticorpos foram gerado por substituição de resíduos 10-1074 no HC posições 32, 53, 54, 58, 97, 1001 dentro de PGT121 e vice versa. As propriedades ligação de anticorpos anti-gpl40 para HIV Env proteínas foram ensaiadas por ensaios ELISA, SPR e micro arranjo glicano como previamente descrito (Scheid, J.F. et al. Science 333, 1633-7 (2011); Walker, L.M. et al. Nature 477, 466-70 (2011); e Mouquet, H. et al. PLoS One 6, e24078 (2011)). A neutralização foi avaliada usando (i) um ensaio baseado em luciferase em células TZM.bl, e (ii) um ensaio baseado em PBMC usando infecção com variantes primárias HIV-1 como previamente descrito (Li, M. et al. J Virol 79, 10108-25 (2005); Euler, Z. et al. Journal of virology 85, 7236-45 (2011); e Bunnik, E.M. et al. Nature medicine 16, 995-7 (2010)). Estruturas de PGT121 ("não ligando" e "ligando"), 10-1074 e fragmentos GL Fab foram resolvido por recolocamento molecular para 2.8 A, 2.3 A, 1.8 A e 2.4 A resolução, respectivamente.

Análise de célula B única RT-PCRs e gene Ig

[00125] Triagem de célula única de gpl40+CD19+IgG+células B do paciente 10 (ptlO; referido como paciente 17 na Natureza 477(7365):466-470.) PBMCs, sintese de cDNA e amplificações aninhadas de PCR de genes Ig foram realizadas em um estudo anterior (PLoS One 6(9):e24078). Os genes Igk expressado por variantes clonais PGT121 foram amplificado PCR usando um iniciador direto (L-V 3-21 *02: 5'CTGGACCGTTCTCCTCCTCG 3') adicionalmente upstream na região lider para evitar a região potencialmente mutada (31). Todos os produtos PCR foram sequenciados e analisados por gene Ig Uso, análise CDR3e número de hipermutações somáticas VH/VK (IgBLAST; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblaste IMGT®; http://www.imgt.org). Alinhamento de sequência múltipla foi realizados usando o programa MacVetor (v.12.5.0) com a função de análise ClustalW (parâmetros omitidos), e foram usados para gerar dendrogramas pelo método Neighbor Joining (com modo de melhor árvore e enraizamento do grupo de saída). Alternativamente, dendrogramas foram gerados usando o método UPGMA (com modo de melhor árvore).

[00126] Os segmentos de linha germinal (germline - GL) de precursor de anticorpos de gene como PGT 121 e como 10-1074 foram identificados usando IgBLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast) e IMGTdVV-QUEST (http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/) como VH4- 59*01, JH6*03, VL3-21 *02 e JL3*02. (Estes segmentos de gene estão entre os mais frequentemente usados no repertório de anticorpos humanos (PLoS One 6(8):e22365; Imuno genéticos 64 ( 5):337-350) . Para construir uma representativa sequência GL ancestor, foi alinhada as sequências IgH e IgL de 10-996 (o anticorpo contendo o menor número de hipermutações somáticas) para as sequências GL usando IgBLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast). A sequência GL IgH foi construída por recolocação de segmento de gene maduros VH e JH com seus homólogos GL e usando a sequência 10-996 par a região CDRH3 envolvendo nucleotídeos N-região e o segmento de gene DH. A sequência GL IgL foi montada da sequências de segmento de gene do VL3-21 *02 e JL3*02.

Clonagem e Produção de Anticorpos

[00127] Produtos PCR purificados digeridos foram clonados em vetores de expressão IgYi-, ou IgÀ humano (J Imunol Methods 329(1-2): 112-124). Vetores contendo genes IgH e IgÀ foram então sequenciados e comparados com as sequências do produto PCR original. PGT121 e 10-303 compartilharam o mesmo gene IgÀ e tiveram uma diferença de aminoácido na posição 2 do gene IgH (Figura 4); portanto para produzir o PGT121 IgG, foi usado o 10-303 gene IgÀ e um PGT 121 gene IgH gerado por introdução de uma substituição única (V2M) no 10-303 gene IgH por metagênese direcionada a site- (QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit; Stratagene). Para gerar His-tagged Fabs, o PGT 121 e 10-1074 VH genes foram subclonado em um 6xHis-IgC'Yl vetor de expressão gerado por modificação de nosso vetor Igyi padrão (Science 301(5638): 1374-1377) para codificar o dominio IgGl CH1 seguido por uma 6x-His tag. Os fragmentos IgH DNA codificando anticorpos mutantes PGT121GM (S32Y, K53D, S54R, N58T, H97R, T1001Y) e 10-1074GM (Y32S, D53K, R54S, T58N, R97H, Y1001T) foram obtidos como um minigene sintético (IDT) e subclonado em IgYi expressando vetores. Abaixo está listado a sequência de cadeia pesada para 10- 1074GM onde as mutações são sublinhadas. A sequência de cadeia leve de 10-1074GM é a mesma como que a de 10-1074. QVQLQESGPGLVKPSETLSVTCSVSGDSMNNSYWTWIRQSPGKGLEWIGYISKSE SANYNPSLNSRVVISRDSKNQLSLKLNSVPADTAVYYCATARHGQRIYGVVSFGE FFTYY SM DVWGKGVTVS S

[00128] Anticorpos e fragmentos Fab foram produzidos por transfecção de transiente de IgH e IgL plasmideos de expressão em crescimento exponencial de células HEK 293T (ATCC, CRL-11268) usando o método de precipitação de polietilenoimina (polyethyleneimine - PEI)- (PLoS One 6(9) :e24078) . Os anticorpos IgG foram purificaos por afinidade usando Protein G contas de sefarose (GE Healthcare) de acordo com as instruções do fabricante. Os fragmentos Fab foram purificaos por afinidade usando Resin HisPur™ Cobalto (Thermo scientific) como descrito abaixo.

Proteína HIV-1 Env

[00129] As mutações de alanina foram introduzidas no vetor pYU-2 gpl20 (gift de J. Sodroski, Harvard Medical School) nas posições 301 a 303 (Asn-Asn-Thr) , 324 a 325 (Gly-Asp), e 332 (Asn) (numeração de aminoácido HXBc2) usando o kit QuikChange Site-Directed Mutagenesis (Stratagene) de acordo com o instruções do fabricante. 0 mesmo procedimento foi usado para gerar mutantes "glicano duplo" por introdução de mutações alanina única no vetor pYU-2 gpl20N332A em cada PNGS localizado entre Asn262gpi2o e Asn406gpi2o. Mutações direcionada a site foram verificada por sequenciamento de DNA.

[00130] Codificação de vetores de expressão YU-2 gpl40 (Journal of virology 74 (12) :5716-5725), YU-2 gpl20, HXB2c gpl20núcleo (Natureza 393 (6686) : 648-659) , HXB2c 2CCnúcleo (PLoS Pathog 5 (5} : el000445) proteínas, e YU-2 gpl20 proteínas mutantes foram usadas para transfectar células HEK 293T. Para produzir só manose de alta proteína YU-2 gpl20 (gpl20kif) , 25 µM kifunensina (Enzo Life Sciences) foi acrescentada no momento da transfecção. As culturas de supernadantes foram colhidas e concentradas usando dispositivos de filtração baseado em centrifugação (Vivacell 100, Sartorius Stedim Biotech Gmbh) que permite troca de tampão das amostras em 10 mM imidazole, 50 mM fosfato de sódio, 300 mM cloreto de sódio; pH 7,4. Proteínas foram purificadas por cromatografia de afinidade usando Resina de HisPur™ Cobalto (Thermo scientific) de acordo com as instruções do fabricante.

[00131] Para reações de deglicosilação, 50 µg de células HEK 293T produziu YU-2 gpl20 em PBS foi digerido durante a noite a 37°C com 200 0 de PNGase F (New England Biolabs) ou 10.000 U de Endo Hf(New England Biolabs) em suas respectivos tampões de reação sem agentes de denaturantes. Depois da troca do tampão em PBS usando Filtros Centrífugos (Amicon® Ultra, Millipore), gp tratados com glicosidase gp 120s (200 ng) foram examinados por SDS-PAGE usando um 4-12% NuPAGE gel (Invitrogen) seguido por coloração com prata (Pierce Silver Stain Kit, Thermo Scientific).

ELISAs

[00132] Alta ligação com placas de 96 cultura ELISA (Costar) foram cobertas durante a noite com 100 ng/cultura de purificado gpl20 em PBS. Depois da lavagem, as placas foram bloqueadas por 2 horas com 2% BSA, IµM EDTA, 0,05% Tween-PBS (tampão de bloqueio) e então incubadas por 2 horas com IgGs a concentrações de 26,7 nM (ou 427,2 nM por ELISAs usando os mutantes YU-2 gpl20 glicano duplo) e 7 consecutivas diluições 1:4 em PBS. Depois da lavagem, as placas foram desenvolvida para incubação com conjugado HRP de cabra anti-anticorpo humanos IgG (Jackson ImunoReseach) (a 0,8 µg/ml em tampão de bloqueio) por 1 hora, e por adição de substrato cromogenico HRP (solução ABTS, Invitrogen) (PLoS One 6 (9) : e24078) . Anticorpo ligando para o selecionado gpl20 sobrepondo peptideos foi testado usando um método ELISA de peptídeo previamente descrito.

[00133] Para competição ELISAs, placas cobertas de gpl20 foram bloqueadas por 2 horas com tampão de bloqueio e então incubado por 2 horas com anticorpos biotinilatado (a uma concentração de 26,6 nM para PGT121, 0,21 nM para 10-1074, 0,43 nM para 10-996 e 1,67 nM para 10-1369) em soluções de anticorpo competidores 1:2 diluidas em série em PBS (intervalo de concentração de IgG de 5,2 a 667 nM) . As placas foram desenvolvidas como descrito acima usando estreptavidina conjugada com HRP (Jackson ImunoReseach) (a 0,8 µg/ml em tampão de bloqueio), todos os experimentos foram realizados pelo menos em duplicado.

Análise de Micro arranjo Glicano

[00134] Os micros arranjos foram gerados por meio de impressão robótica de sondas de glicano ligadas ao lipídeo (neoglicolipídeos) sobre lâminas de vidro revestidas com nitrocelulose (Métodos Mol Biol 808: 117-136) e dois níveis (2 e 5 fmol/spot) em duplicação. Ensaios de ligação foram realizados com micro arranjos contendo 15 neoglicolipídeos derivados de N-glicanos de manose alta e tipos complexos. As sequências das sondas são mostradas na Figura 7A. Em resumo, anticorpos foram testados a 50 µg/ml, e a ligação foi detectada com biotinilatado anti-humano IgG (Vetor) seguido por estreptavidina rotulada com AlexaFluor 647- (Molecular Probes).

Ressonância de Plasma de Superfície

[00135] Os experimentos foram realizado usando um Biacore T100 (Biacore, Inc) (Natureza 467(7315):591- 595). Resumidamente, proteínas YU-2 gpl40 e gpl20 foram acopladas com amina primária no chip CM5 (Bianucleo, Inc.) a uma densidade de acoplamento de 300 RUs. Anti-gpl20 IgGs e o precursor da linha germinal (germline - GL) foram injectados sobre fluxo de células a 1 µM e 10 µM, respectivamente, a razão de fluxo de 35 µl/minuto com associação de 3 minuto e dissociação de fase de 5 minuto. A superficie do sensor foi regerado por uma injeção de 30 segundos de 10 mM glicina-HCl pH 2,5 a uma razão de fluxo de 50 µl/min. Dissociação (kd (s'1)), associação (k&(JVT1 s'x) e constantes de ligação {Ky, (M) ou KA (M'1) foram calculadas da análise cinética após a subtração de "backgrounds"usando um modelo de ligação 1:1 sem correção de Índice de refração de massa (reflective index - RI) (Biacore T100 Evaluation software). Constantes de ligação para IgGs bivalente calculada usando um modelo de ligação 1:1 são referidas no texto como afinidades "aparente" para enfatizar que o valores KD incluem efeitos potenciais de avidez

Ensaios de Neutralização

[00136] A neutralização de vírus foi avaliada usando um ensaio baseado em luciferase em células TZM.bl (J Virol 79(16):10108-10125). O pseudovirus HIV-1 testado continha principalmente vírus tier-2 e tier-3 (Journal of virology 84(3): 1439-1452) (Tabelas 4 e 5) . Somente pseudoviru de alta mamose foram produzido em células tipo selvagem tratadas com 25 µM kifunensina (Enzo Life Sciences) (Figura 8C) ou em células HEK 293S GnTI-/- (Figura 8D) . A análise de regressão não linear foi usada para calcular concentrações em que a metade da inibição máxima foi observada (IC50 valores). As atividades de neutralizaçao também foram avaliadas com um ensaio baseado em PBMC previamente caracterizados utilizando infecção com variantes primárias de HIV-1 (n=95) isolados de doadores infectados clade B com conhecido dados soro conversão entre 1985 e 1989 ("historical seroconverters", n=14) ou entre 2003 e 2006 ("contemporary seroconverters", n=21) (Journal of virology 85(14):7236-7245; Nat Med 16(9) ;995-997) . A atividade de neutralização for cada anticorpo foi calculada usando o software GraphPad Prism (v5.0b) como a área sob a curva melhor ajustada, que ajusta a proporção de vírus neutralizados sobre valores IC50 variando entre 0,001 a 50 µg/ml. Os valores da área relativa sob a curva (Relative Area Under the Curve - RAUC) foram derivados por normalização de todos os valores AUC pelo valor mais elevado (obtido com 10-1074).

Análise Estatística

[00137] A análise Estatística foram realizadas com o software GraphPad Prism (v5.0b). As potências de neutralização no ensaio TZM-bl contra o selecionado painel de 9 cepas de vírus versus as aparentes afinidades de ligação dos anticorpos para gpl20 e gpl40 foram analisadas usando um teste de correlação de Spearman. O teste de Mann Whitney foi usado para comparar: (i) afinidades para gpl20/gpl40 de anticorpos pertencentes ao grupo PGT121 ou 10-1074, e (ii) atividades de neutralização contra vírus isolados de soroconversores histórico e contemporâneos.

Determinações de Cristalização e Estrutura

[00138] PGT121, 10-1074 e 10-996GL Fabs marcados com 6x- His para cristalização foram expressos. Os Fabs foram purificados de supernadantes de células HEK 293-6E transfectadas transientalmente por afinidade sequencial Ni -NTA (Qiagen) e Superdex200 10/300 (GE Healthcare) cromatografia de exclusão de tamanho. Para cristais dos PGT121 Fab, PGT121 IgG não ligados foi isolado de supernadantes transfectados transientalmente de células HEK 293-6E por cromatografia de afinidade de Proteina A (Pierce), e os fragmentos de Fab foram obtidos por clivagem de papaina do IgG e purificação adicional usando Superdex200 10/300 (GE Healthcare) cromatografia de exclusão de tamanho.

[00139] Os Fabs purificados foram concentrados para 8-20 mg/ml ("não ligantes" PGT121, 8 mg/mL; 10-1074 e GL, 20 mg/ml) em tampão PBS. Os cristais de "ligantes" PGT121 Fab foram preparados de uma amostra de proteina (concentração final: 15 mg/ml) que foi misturada com um excesso molar de 3 vezes de NA2 glicano e incubados a 20°C por 2 horas. As condições de cristalização foram blindadas a 20°C usando um robô de cristalização Mosquito® (TTP labs) em 400 nl de gotas usando uma 1:1 proteina para razão de deposito. Os cristais de "não ligantes" PGT121 Fab (P2i2i2i; a = 56,8, b = 74,7, c = 114,9 A) foram obtidos em 24% PEG 4.000, 0,1 M Tris-HCl pH 8,5, 10 mM CuClz e os cristais de "ligantes" PGT121 Fab (P2i2i2i; a = 67,8, b = 67,8, c = 94,1 A) cresceu em 17% PEG 10.000, 0, IM Bis-Tris pH 5,5, 0,lM CH3COOHNH4. Cristais de 10-1074 Fab (P2i; a = 61,4, b = 40,3, c = 84,5 A; ß = 95,39°) foram obtidos em 25% PEG 3,350, 0,1 M Bis-Tris pH 5,5, 0,2 M NaCl, e cristais de GL Fab (P2i; a = 54,9, b = 344,7, c = 55,2 A; ß = 91,95°) cresceu em 20% PEG 3.350, 0,24 M sódio malonato pH 7,0, 10 mM MnCl2- Os cristais foram crioprotegidos por imersão em licor mãe contendo 20% glicerol ("não ligantes" e "ligantes"PGT121 Fab) ou 20% etileno glicol (10-1074 Fab e GL Fab) e subsequentemente refrigerado por flash em nitrogênio liquido.

[00140] Dados de difração foram coletados em linha de luz 12-2 (comprimento de onda = 1,029 A) no Stanford Synchrotron Radiation Lightsource (SSRL) em um detector Pilatus 6M pixel (Dectris). Os dados foram indexados, integrados e escalado usando XDS. Usando os dados obtidos dos "não ligantes" cristais PGT121 Fab, foi utilizado Phenix para encontrar solução de recolocação molecular para um Fab por unidade assimétrica (cadeias H e L para a e cadeia pesada e leve, respectivamente) usando dois modelos de pesquisa, os dominios CH-CLde PGT128 Fab (PDB código 3PV3) e os dominios VH-VLde 2F5 (PDB código 3 ID J) depois de omitir residues nas voltas CDRH3 e CDRL3. Subsequentemente, foi utilizada estrutura "não ligantes"PGT121 como um modelo de pesquisa para encontrar soluções de recolocação de molecular para "ligantes"PGT121 Fab (um Fab por unidade assimétrica), 10-1074 Fab (um Fab por unidade assimétrica) e GL (quatro Fabs por unidade assimétrica).

[00141] O refinamento iterativo (incluindo restrições de simetria não cristalográfica para GL) foi realizado usando Phenix e modelos de ajuste manual em mapas de densidade de elétron usando Coot. Os modelos atômicos foram refinados para 3,0 A resolução para PGT121 Fab (Rwork = 21,6%; Rfree = 26,4%), 1,9 A resolução para 10-1074 Fab (Rwork= 18,7%; Riivre = 22,3%), 2,4 A resolução para quatro GL Fab moléculas (Rwork= 19,4%; Riivre = 23,7%), e 2,4 A resolução para "ligantes"PGT121 Fab (Rwork = 20,1%; Riivre = 24,9%). 0 modelo atômico de PGT121 Fab contendo 95,2%, 4,9% e 0,0% dos resíduos na região favorecidas, permitidas e não permitidas di plot Ramachandrant, respectivamente (10-1074 Fab: 98,8%, 0,9%, 0,2%; GL Fab: 96,0%, 3,8%, 0,23%; "ligantes PGT121 Fab: 96,7%, 3,1%), 0,2%)). PyMOL foi usado para visualização molecular e para gerar figuras das estruturas Fab. Cálculos de área de superfície enterradas foram realizado com Areaimol (CCP4 Suite) usando uma sonda 1, 4 A.

[00142] As estruturas Fab foram alinhadas usando o Super script em PyMOL. Alinhamentos aos pares Ca foram realizados usando PDBeFold.

EXEMPLO 2 Predomínio e Diversidade de clonotipo PGT121

[00143] As células B de memória de IgG específicos de gpl40 foram isoladas de uma doador Africano infectado com clade A usando YU-2 gpl40 trímeros como "isca". Oitenta e sete apropriados genes de imunoglobulina cadeia pesada (heavy - IgH) e Leve (light - IgL) correspondendo a 23 famílias clonais únicas foram identificadas. O repertório de IgH anti-gpl40 foi dominado por uma família clonal representando -28% de todos os clones de célula B expandida. Esta família de célula B corresponde para o mesmo clone como PGT121-123 (Natureza 477(7365):466-470) e continham 38 membros, 29 dos quais eram variantes únicas no nível de nucleotídeo (Tabela 3). Baseado nas suas sequência de nucleotídeo IgH, a família PGT121 dividida em dois grupos: um como grupo PGT 121 contendo PGT 121-123 e 9 variantes estreitamente relacionadas, e um segundo grupo, como 10-1074, contendo 20 membros. Embora nossos iniciadores tradicionais (J Imunol Métodos 329(1-2): 112- 124; Science 301(5638): 1374-1377) não amplificaram os genes IgL expressado pelo PGT 121 clone de célula B devido às deleções de nucleotideo na região de codificação da região de quadro 1, 24 de 38 gene Igs foram obtidos usando novos iniciadores específicos Ig designados para amplificar fortemente os genes mutados somaticamente- (Tabela 3). Consistente com os altos niveis de hipermutação nos genes IgH (18,2% do gene VH em média), os genes Igs amplificados foram altamente mutados (18,2% do gene vÀ em média) e conduziu deleções de nucleotideo na região de quadro 1 (FWR1) (12 a 21 nucleotideos) e uma inserção de 9 nucleotideo na região de quadro 3 (FWR3) (Figura 3B e Tabela 3).

[00144] As sequências alinhadas de três anticorpos PGT (PGT-121, -122, e -123), onze variantes clonais PGT121 e 10-1074 (10-259, 10-303, 10-410, 10-847, 10-996, 10-1074, 10-1121, 10-1130, 10-1146, 10-1341, 10-1369, e 10-1074GM,), linha germinal apropriada (GL), e sequências de consenso são mostradas nas Figuras 3 (a) e 3 (b) . As sequências para as correspondentes cadeias pesadas de região variáveis, cadeia leve região variáveis, cadeia pesada CDRs, e cadeia leve CDRs sob ambos os sistemas IMGT e KABT são listados na Tabela 1 abaixo. Os números atribuídos para a identificação de sequência para as sequências sob o sistema KABT são listados na Tabela 2 abaixo. Tabela 1 SEQUÊNCIAS IgH Tabela 2

[00145] Onze novas variantes únicas foram expressas (Tabela 3) e demonstraram ligação para YU-2 gpl20 e gp!40 por ELISA e ressonância de superfície plasma (surface plasmon resonance - SPR) . a menos que de outra maneira mostrado, as proteinas gpl20 e gpl40 para este e outros experimentos foram expressas em células de mamíferos que pode ligar um tipo complexo ou um N-glicano de alta manose para um PNGS. O nivel de reatividade com gpl20 difere entre anticorpos pertencentes a grupos PGT121 e 10-1074, esta última exibindo maior afinidade aparente (Eigura 3A) principalmente devido à dissociação lenta de gpl20/gpl40 para os anticorpos 10-1074 relacionados (Figura 4B).

EXEMPLO 3 Epitopos PGT121 e 10-1074

[00144] Asn332gpi2o na vizinhança da haste da volta V3 foi reportado como critico para ligação e neutralização virai por PGT121 (Natureza 477 (7365) :466-470), assim examinamos a função de V3 em reconhecimento de antigeno por anticorpos como PGT 121 e como 10-1074. ELISAs foram realizados usando HXB2 gpl20 "núcleo"proteinas que falta voltas VI - V3 (gpl20nucleo) ou retém uma porção de V3 (2CC-núcleo) , e usando uma proteina mutante YU-2 gpl20 conduzindo uma substituição dupla de alanina na haste V3 (gpl2 0GD324-5AA) . Os anticorpos testado mostraram redução de reatividade contra variantes faltando à volta V3 e gpl20GD32,1 5AAquando comparado para impacto YU-2 gpl20, com a ligação de anticorpos grupo 10-1074 sendo o mais afetados (Figura 5A e B). Estes resultados sugerem que o reconhecimento por ambos os grupos de anticorpo envolve proteina determinantes na vizinhança da volta V3. Nenhum dos anticorpos ligados peptideos de sobreposto, abrangendo V3, sugeriu que os epitopos direcionados são descontínuos e/ou requerem uma conformação particular não alcançada por isolados peptideos (Figura 5C).

[00145] Asn332gpl2o (Asn337gpi20 em numeração anterior (J Proteome Res 7(4): 1660-1674)) é o residue N-terminal de um site de potencial N-glicosilação (potential N-glycosylation site - PNGS) definido como a sequência Asn - X -Ser/Thr. Para determinar se Asn332gpl20 e/ou seus glicano ligados N são requeridos para a reatividade gpl20 dos novos anticorpos grupos PGT121 e 10-1074, testamos suas ligações para YU-2 gpl20N332Apor ELISA. A substituição N332A diminuiu a ligação de PGT121 e de todas os novos anticorpos variantes, enquanto que a sua reatividade contra um mutante gp!20 que falta um site de glicosilação nas proximidades (gp120NNT301-3AAAmutante) não foi trocado. Para determinar se um PNGS em adição para o Asn332gpi20 PNGS afeta reconhecimento pelos novos anticorpos, construimos uma series de 11 glicano mutantes duplo em que a mutação N332A em YU-2 gpl20 foi combinada com a mutação de PNGSs localizada entre Asn262gpl2o e Asn406gpl20. Todos os anticorpos como PGT121 e como 10-1074 ligados para cada um dos glicano mutantes duplos com afinidades comparáveis como para aqueles de gpl20N332A.

[00146] Para comparação geral de reconhecimento de glicano pelos anticorpos como PGT121 e 10-1074, examinamos suas ligação para YU-2 gpl20 tratados com PNGase F, que cliva ambos os tipos complexo e N-glicanos de alta manose. porque gpl20 não pode ser completamente desglicosilado enzimaticamente a menos que seja denaturado, tratamento PNGase F resultou em parcial deglicosilação de nativamente dobrado gpl20 (Figura 6). Ainda assim, a reatividades dos dois grupos de anticorpos diferiram em que parcial deglicosulação de gpl20 por PNGase F reduziu a atividade de ligação de todos os anticorpos como PGT 121 mas de nenhum dos anticorpos como 10-1074 (Figura 6C). Experimentos similares conduzidos com YU-2 gpl20 tratadas com Endo H, que cliva alta manose, mas não tipo complexo, N-glicanos, afeta ligação de anticorpos como 10-1074 mais que anticorpos como PGT 121 (Figura 6D).

[00147] Um micro arranjo N-glicano revelou que seis dos sete testados anticorpos como PGT 121 mostraram ligação detectável com tipo mono complexo ou N-glicanos biantenárias terminando com galactose ou ácido siálico ligando a2-6- mas não detectável ligação para glicanos tipo alta manose tipo, corroborando e reportes anteriores estendidos de não ligação de PGT 121-123 para N-glicanos de alta manose e não terminando com galactose ou ácido siálico ligando a2-6, mas não detectável ligação para glicanos tipo alta manose, corroborando e estendendo reportes anteriores de não ligação de PGT 121-123 para N-glicano de alta manose e não competindo por Man4e Man9 dendrons por ligando g 120 (Figura 7). em contraste, não existiu ligação detectável para glicanos livre de proteina por anticorpos como 10-1074 (Figura 7). Embora anticorpos como PGT121 ligam para tipo complexo livre de proteina, mas não glicanos de alta manose, N-, anticorpos como PGT 121 retém ligação para YU-2 gpl20 produzido em células tratadas com kifunensina (gpl20kif) , uma manosidase inibidora que resulta em ligação exclusiva de- glicanos de alta manose para PNGSs (Figura 8B). Muitos dos anticorpos como PGT121 exibiram uma pequena, mas reproduzível, redução na ligação para gpl20kif. Por contraste, anticorpos como 10-1074 retém ligação completa para gpl20kif(Figura 8B) . Estes resultados são consistentes com a hipótese que alta manose, tanto quanto tipo complexo, N-glicanos podem ser envolvidos no epítopo de anticorpos como PGT 121.

[00148] Experiências de mapeamento de epítopo foram realizadas com dois membros representativos de cada grupo (PGT121 e 10-1369 para o grupo como PGT121; 10-1074 e 10- 996 para o grupo como 10-1074) por competição ELISA. Todos os quatros anticorpos mostraram competição cruzada, mas PGT 121 mais modestamente inibiu a ligação de 10-996 e 10-1074 para gpl20 como vice-versa. Para mapeamento de epitopos alvos adicionais, usamos anticorpos anti-gpl20 que reconhece a soberania do loop V3 (Figura 5), o CD4bs, o site de ligação de co-receptor (CD4-induzido; CD4i), uma constelação de N-glicanos de alta manose (2G12) (Journal of virology 76(14):7293-7305; Proc Natl Acad Sci USA 102(38): 13372-13377)), ou volta V3 e glicanos ligando N nas posições 301 e 332 (PGT128). A soberania di anticorpos anti-V3 inibiu a ligação de PGT 121 e 10-1369, mas não interferiu com a ligação de 10-996 e 10-1074. PGT128, e para um menor grau 2G12, mas não os anticorpos CD4bs e CD4i, diminuiram a ligação de todos os quatros anticorpos para gpl20.

[00149] Tomando junto, estes dados sugerem que membros PGT 121 clonais reconhecem um site envolvendo uma proteina determinante na proximidade da volta V3 e o glicano associado com Asn332gpi2o- Embora, os clone segregados em duas familias, os grupos como PGT 121 e como 10-1074, que diferem em suas afinidades para gpl20 e no papel de glicanos na formação de epitopo.

EXEMPLO 4 Ampla e Potente Neutralização de HIV

[00150] Para avaliar a atividade neutralizante dos novos variantes de PGT 121, medimos suas habilidades para inibir infecção HIV de células TZM-bl usando 10 cepas virai incluindo R1166.cl, que carece de PNGS no gpl20 posição 332. Todas as variantes PGT121, incluindo os anticorpos como 10-1074, neutralizou 9 pseudovirus e nenhum neutralizou o controle R1166.C1 (Figura IA e Tabela 4) . A atividade neutralizante correlacionada com afinidade para o HIV spike, com o grupo 10-1074 mostrou potências ligeiramente maior que o grupo PGT121 (Figura IB e Figura 4C) . Uma versão representativa de linha germinal (GL) do anticorpo clonotipo PGT 121/10-1074 falhou para ligar gp 120/gpl40 ou neutralizar qualquer virus no painel, o que implica que mutação somática é requerida para ligação e neutralização. Emparelhada cadeia leve GL com mutado grupo 10-1074- ou 10-996- cadeias pesada falhou para resgatar ligação ou neutralização, sugerindo que ambos as cadeias mutadas contribuem para própria montagem de anticorpo paratope.

[00151] Os próximos ensaios foram conduzidos para comparar a atividades de neutralização do PGT121 e dois anticorpos como 10-1074 (10-996 e 10-1074) contra um painel estendido de 119 pseudovirus difícil de neutralizar (classificado como tier-2 e tier-3) (Tabelas 4 e 5). 10-996- e 10-1074 mostraram potências de neutralização e amplitude similar para PGT 121 (Figura 1C, Figura 9, e Tabelas 5 e 6). Como antecipado, a maioria dos vírus que permitem troca de aminoácido no gpl20 posições 332 e/ou 334 (abrangendo o Asn332-X-Ser334/Thr334 PNGS) foram resistentes para neutralização (83,8% foram resistentes para PGT 121, 100% foram resistentes para 10-1074 e 10-996). Mutações nestes PNGS representam a maioria dos vírus resistentes para neutralização (68,5% para 10-996, 72,5% para 10-1074 e 60,8% para PGT121) (Tabela 7). Comparáveis atividades de neutralização foram observadas para as formas IgG e Fab de PGT 121 e 10-1074, sugerindo que a bivalência não é critica para sua atividade (Figura ID).

[00152] Para avaliar o papel potencial do tipo complexo N-glicanos no envelope HIV na neutralização por PGT 121 e 10-1074, produziu vírus de alta manose de dois modos diferentes: por arranjo de pseudovirus em células tratadas com kifunensina, que resulta em Man9GlcNAc2 gliganos ligados N, ou pelo arranjo em células HEK 293S GnTI*z“, que resulta em glicanos ligado N Man5GlcNAc2. Concluímos que PGT 121 neutraliza 2 de 3 kifunensina derivado de cepas PGT 121 -sensitivo/ 10-1074-resistente equivalentemente para seus homólogos produzido em células tipo selvagem (Figura 8C) . Duas cepas viral PGT121 -sensitiva/ 10-1074-sensitiva produzida em células em in GnTI-/” foram igualmente sensitiva para PGT 121 e 10-1074 como seus homólogos produzido em células selvagens. Consistente com relatórios anteriores que complexo tipo N-glicanos parcialmente protege ao site de ligação CD4 ligando de anticorpo de ligação, os vírus produzidos em células GnTI-/~ foram mais sensitivos para site de ligação de anticorpos CD4 (NIH45- 46G54W e 3BNC60) (Figura 8D) .

EXEMPLO 5 HIV Transmitido Recentemente

[00153] Examinaremos a seguir a atividade de PGT 121 e 10-1074 contra vírus fundador transmitidos pela avaliação da neutralização em uma célula mononuclear de sangue periférico (Peripheral Blood Mononuclear Cell - PBMC)- baseado em ensaio usando 95 virus clade B isolados de um corte de indivíduos que foram soro conversores entre 1985 e 1989 (soroconversores, n=14) ou entre 2003 e 2006 (soro conversores contemporâneos, n=25) (51, 52). Comparamos PGT121 e 10-1074 com anti-CD4bs bNAbs e outro bNAbs incluindo VRCO1, PG9/PG16, bl2, 2G12, 4E10 e 2F5. A análise de Clustering de atividade de neutralização mostrou segregação nos dois grupos; o grupo PGT 121/10-1074 continha o mais ativo neutralizador de HIV incluindo os anticorpos anti-CD4bs e PG9 (Tabela 8). Notavelmente, 101074 mostrou excepcional potência de neutralização neste painel de virus clade B, exibindo a maior amplitude a 0,1 µg/ml (67% dos 95 virus clade B) de todos os bNAbs testados (Tabela 8). Embora 10-1074 tenha mostrado maior potência em contemporâneos virus clade B que PGT 121 (aproximadamente diferença de 20 vezes), ambos anticorpos foram mais eficazes contra virus históricos que contemporâneos (Figura 1E e Figura 10) .

EXEMPLO 6 Estrutura de Cristal de PGT21, 10-1074 e G1

[00154] Para investigar a estrutura determinante das diferenças entre anticorpos como PGT 121 e como 1074, resolvemos estruturas de cristais dos fragmentos Fab de PGT 121, 10-1074 e uma linha germinal precursora representativa (germline - GL) uma resolução 3,0 A, 1.9 A e 2,4 A, respectivamente (Tabela 9) . Super imposição de domínio variável da cadeia pesada e leve (VRe VL) entre os três Fabs mostrou conservação da estrutura do backbone, com diferenças limitadas para pequenos deslocamentos das voltas CDRH3 e CDRL3 dos Fabs de maturada afinidade relativa ao GL (Tabela 10).

[00155] Uma característica incomum compartilhada pelos anticorpos é seus longas voltas (25 resíduos) CDRH3, que forma uma das duas cadeias anti paralela da folha ß entendida do dominio VR cadeias F e G. Em cada Fab, a ponta da volta estendida CDRH3 primariamente contem residues não polar. Uma característica similar da estrutura foi observada para o CDRH3 de PGT 145, um anticorpo sensivel a carboidrato cujo epitopo envolve a volta gpl20 V1V2. Embora, a estendida folha ß de duas cadeias de PGT145's CDRH3 continha principalmente residuo de carga negativa, incluindo duas tirosinas sulfatadas na extremidade. Alinhamento VH-VLde PGT121 e PGT145 (Tabela 10) mostra que estendido CDRH3PGT145 passou CDRH3PGTI21? que sua extremidade e dominio VH são alinhados, enquanto que o CDRH3s de PGT121, 10-1074 e GL inclina para VL. A inclinação de CDRH3PGTI2I/CDRH3 10“107'1 /CDRH3GL para VL abre uma fissura entre CDRH2 e CDRH3, a característica não compartilhada pelos anticorpos relacionados.

[00156] PGT 121 e 10-1074 são altamente divergentes com relação ao GL e cada outro (de 132 residues, PGT 121VH difere de 10-1074VH e GLVH por 36 e 45 residues, respectivamente, e 10-1074VH e GLVH diferem por 29). A maioria das diferenças de PGT 121/10-1074 é localizada nas voltas CDRVH e CDRL3. Curiosamente, seis substituições em CDRH3 (resíduos 100d, 100f, 100h, 100j, 1001, 100n) alternados tal que cada segundo residuo é substituido, causando re cobertura da fissura entre CDRH2 e CDRH3 que resulta da inclinação de CDRH3 para VL. Esta região igualmente contribui para as finas diferenças de especificidades de PGT121 e 10-1074. Cinco outras substituições expondo solvente em cadeia pesada de região de quadro 3 (FWR3HC) (resíduos das cadeias 64, 78, 80-82; cadeias D e E) são potenciais sites de contato de antigeno dado que regiões de quadro em anticorpos HIV pode contactar gpl20. Outra diferença que podem contribuir para fina diferença de especificidade inclui um caminho negativo em PGT121 na vizinhança de Asp56nc não presente em 10-1074 ou GL (Ser56Hc ?m 10-1074 e GL) e caminho positivo na superfície de CDRL1 e CDRL3 não encontrada na superfície do análogo de GL .

[00157] As mutações somáticas comuns para PGT121 e 10- 1074 podem ser envolvidas em características compartilhadas de seus epitopos. As cadeias pesadas de PGT121 e 10-1074 compartilha somente três mutações comuns (de 36 diferentes PGT121-GL e 29 10-1074-GL). Em contraste, PGT121 e 10-1074 compartilham 18 mutações de cadeia leve comuns (de diferentes 37 PGT121-GL e 36 10-1074-GL), incluindo uma inserção na cadeia leve FWR3 que provoca o abaulamento da volta conectando cadeias D e E, e a substituição de Asp50Lc_Asp51Lc em CDRL2GLpara Asn50Lc-Asn51Lc em ambos os PGT121 e 10-1074, resultando na menos superfície de carga negativa. O grande número de substituições comuns introduzidas em ponto LCPGT121 e LC10-1074 (aproximadamente 50% de substituições LC) para CDRL1 , CDRL2 e FWR2Lc como potenciais regiões de contacto para epitopos compartilhado por PGT121 e 10-1074.

[00158] Seguindo, comparações foram feitas com a estrutura de PGT 128, que reconhece glicanos ligando Asn332gpl2o- e Asn3OlgPi2o e V3 e foi resolvido como um complexo com um domínio exterior/mini volta V3 gpl20 expressado em células que não podem produzir tipo complexo de proteinas modificando N-glicano. Ao contrario as voltas CDRH3 de PGT 121 e 10-1074, PGT 128CDRH3 não é inclinada para PGTI28VL,? CDRH3PGTi28 não inclui uma das duas cadeias de folha ß. Em adição, CDRH3PGTi28 (18 residues) é menor que CDRFBs de PGT121 e 10-1074 (24 resíduos), enquanto que CDRH2pGTi28 contem uma inserção de seis resíduos não encontrados na PGT121 ou 10-1074. Devido a estas diferenças, CDRH2 tem a característica mais proeminente no PGT128, enquanto que CDRH3 tem a mais proeminente em PGT121 e 10-1074. CDRH2PGTI28e CDRL3PGTI28 juntos reconhecem Mang/? ligado para Asn332gpi20, e CDRH3PGTi28 contacta à volta V3 base. Este modo de reconhecimento de gpl20 não é possível para PGT121 e 10-1074 porque as características de estrutura de suas voltas CDRH2 e CDRH3 diferem significantemente destas de PGT128, consistente com a habilidade de PGT128, mas não PGT121 e 10-1074 (Figura 7), para reconhecer glicanos de alta manose livre de proteína.

EXEMPLO 7 Estrutura de Cristal de Complexo Glicano PGT121

[00159] Uma resolução de resolução de 2,4 A de PGT121 associado com. um tipo complexo glicano sialilatado bi antenário foi resolvido (Tabela 9) usando cristais obtidos sob condições incluindo NA2, um glicano tipo complexo asialilatado bi-antenário (Figura 7). Surpreendentemente, a ligação de glicano para PGT121 na nossa estrutura de cristal não foi NA2, mas sim um N-glicano tipo complexo de uma vizinhança PGT121 Fab na estrutura de cristal; especificamente o N-glicano liga para Asnl05Ho A identidade de glicano é evidente porque existe densidade de elétron para a ligação glicosidica para Asnl05Hc ? para um ácido siálico o terminal na antena Manal-3Man (o galactose e porção de ácido siálico de Man l-6Man antena não foram dissolvido). a composição da ligação de glicano corresponde a uma porção do a2-6-sialilatado A2 (2-6) glicano que foi ligado por PGT121 em experimentos de micro arranjo (Figura 7) e para a esperada ligação sialil no N-glicanos tipo complexo ligado para PNGS em expressada proteínas em células HEK293T. Embora os domínios VH-VL desta estrutura ("ligantes"PGT121) sobreponham com diferenças não significante sobre os domínios de VH-VLda estrutura PGT121 sem ligação N-glicano ("não ligantes"PGT121) (Tabela 10), o ângulo de curvatura (ângulo entre os pseudo dupla (díades) VH-VL e CH1-CL) difere entre as estruturas. Esta diferença igualmente reflete flexibilidade que permite o Fab adotar ângulos de dobra variáveis dependendo da força da estrutura de cristal.

[00160] Uma vez que observamos ligação de N-glicano tipo complexo em uma estrutura de cristal (a estrutura de "ligantes" PGT121), mas não em outras estruturas (a estrutura "não ligantes" PGT121), estimou que a afinidade de PGT121 para N-glicano tipo complexo não ligado para gpl20 está no intervalo da concentração de PGT121 em cristais (aproximadamente 10 mM) . Se assumirmos que o KD, para ligação de glicano isolado está no intervalo de 1-10 mM, comparável com o 1, 6 mM KD, derivado por ligação de PG9 para Man5GlcNAc2-Asn, então o KD para ligação PGT121 de glicano isolado representa só a menor contribuição para a afinidade de PGT121 para gpl20, está no nM intervalo (Figura 4A).

[00161] O glicano na estrutura "ligans"PGT121 interage exclusivamente com o dominio VHe faz extensivo contacto com resíduos em todos os três CDRs (área de superfície oculta em PGT121HC = 600 A2). Contatos incluem 10 diretas e 18 mediada por ponte de hidrogênio mediada por água (Tabela 11) com 9 aminoácidos ancorando o glicano entre a porção de N-acetilglicoseamina ligada para a ramificação de manose e o terminal ácido siálico na antena 1-3. Vários contatos com PGT121 são feitos por este ácido siálico, incluindo três ligações diretas de hidrogênio com resíduos PGT121 como As 3 1 HC e HIS97HCem adição a ligação de hidrogênio mediada por água com Asp3 1 HC- O ácido siálico também contribui para uma ligação de hidrogênio mediada por água intra rede de glicano. O contato direto com ácido siálico pode explicar a forte ligação de PGT121 para o sialilatado A2(2- 6) glicano com o asialilatado NA2 glicano em nossa análise de micro arranjo glicano (Figura 7). Extensivos contatos de proteínas mediada por e estabelecidos pelas porções de N- acetil glicoseamina e galactose da antena 1-3 poderia explicar a ligação observada por asialilatado mono- e bi- glicanos antenário para PGT121 (Figura 7).

[00162] Seis dos resíduos que contribuem diretamente ou apropriadamente para contato de cadeia lateral de aminoácido para o glicano (Ser32Hc-CDRHi , Lys53Hc-CDRH2, Ser54Hc-CDRH2, Asn58Hc-CDRH2, HÍS97HC-CDRH3,Thrl001Hc-CDRH3) diferem destes em 10-1074 (Tyr32Hc-cDRHi, Asp53HC-CDRH2, Arg54HC- CDRH2r Thr 5 8HC-CDRH2 rAr g 9 7 HC-CDRH3 rT y r 1 0 0 1HC-CDRH3 ) i? São altamente conservados em anticorpos como PGT121como, mas não em como 10-1074,. Os resíduos 10-1074 faltam nos correspondentes grupos funcionais para fazer o observado contato de glicano ou têm cadeias laterais volumosas que possam causar confrontos esféricos. Quatro destes resíduos também diferem destes no GL (Tyr 32HC-CDRHI ,Tyr53HC_ CDRH2, Gln97Hc-cDRH3/ Tyr 100 1HC-CDRH3) ,sugerindo que a falta de ligação de anticorpos como 10-1074 e GL para glicanos tipo complexo livre de proteína em nossos micro arranjos de glicano resulta da ausência de ligação de hidrogênio e/ou confrontos esféricos (exemplo, HIS97PGTI2i versus Arg97io-io?4 ; Thrl001PGTi2i versus Tyrl001io-io?4) • Como a maioria das diferenças de sequência entre aglomerações PGT121 e 10-1074 nas voltas CDRH, especificamente para a superfície da fissura entre CDRH2 e CDRH3 onde observamos a ligação de N- glicano tipo complexo, diferencial reconhecimento de glicanos tipo complexo em gpl20 pode responsável por algumas ou todas as diferenças em suas fina especificidade observada.

EXEMPLO 8 A Substituição de Resíduos de Anticorpo contactando Glicano afeta a Neutralização

[00163] Para avaliar as contribuições de N-glicano tipo complexo contactando resíduos identificados da estrutura de "ligantes" PGT121, geramos dois anticorpos mutantes designados para troca de glicano tipo complexo contactando resíduos entre PGT121 e 10-1074: a 10-1074 IgG com resíduos PGT121 (seis substituições em IgH Y32S, D53K, R54S, T58N, R97H, Y1001T) e um PGT121 IgG com substituições recíprocas. Os anticorpos "glicomutante"(10-1074GMe PGT121GM)exibiram afinidade aparente próxima do tipo selvagem para YU-2 gpl20/gpl40 como medido por SPR (Figura 2 A), demonstrando que as substituições não destroem ligação para uma ponta de envelope derivada de uma cepa virai neutralizada por ambos PGT121 e 10-1074 (Figura IA) . o fato que PGT 121 N-glicano tipo complexo contacta residuos pode ser acomodado dentro do "background"10-1074 sem destruir ligação para uma ligação gpl20/gpl40 para ambos os anticorpos tipo selvagem implica global similaridade em ligação de antigeno ligando apesar da fina diferença de especificidade.

[00164] Ao contrario do tipo selvagem PGT 121, PGT121GM não mostrou ligação de glicano em experimentos de micro arranjo, confirmando que residuos 10-1074 nas posições substituídas não são compatíveis com ligação de glicano livre de proteina (Figura 2B) e apoio a sugestão que residuos contactando o glicano nas estruturas de "ligantes" PGT 121 são envolvidos no reconhecimento de glicanos tipo complexo nos micro arranjos. 10-1074GM também não mostrou ligação para glicanos livre de proteina (Figura 2B), indicando o envolvimento de residuos em adição a estes substituídos na criação de site de ligação para um N- glicano tipo complexo livre de proteina.

[00165] Seguindo, um ensaio baseado em TZM-bl foi usado para comparar neutralização de anticorpos do tipo selvagem e "glicomutante". Testamos 40 cepas virais incluindo cepas diferencialmente resistentes para PGT121 ou 10-1074 e cepas sensivel para ambos os tipos de anticorpos selvagens (Figura 20 e Tabela 12). Consistente com a ligação de PGT 121 GM e 10-1074GM para purificadas proteinas envelope YU- 2, ambos os mutantes neutralizaram os vírus YU-2; contudo, 64% das cepas sensíveis de PGT121 foram resistente para PGT121GM (Figura 2C, e Tabela 12) sugerindo que os resíduos contactando glicano identificados na estrutura "ligantes"PGT 121 são relevante para a atividade de neutralização de PGT 121. Reciprocamente, 10-1074GM exibiu uma maior potência média que o tipo selvagem 10-1074 contra as cepas sensíveis 10-1074 (Figura 2C e Tabela 12), incluindo aumento de potência de >3 vezes contra quatro cepas sensíveis 10-1074 (WITC 160.33, ZM214M.PL15, Cel 172_H1, e 3817.v2.c59). Em geral, as substituições PGT121 no 10-1074 não conferiram sensitividade para 10-1074GKem cima destas cepas PGT121 sensível / 10-1074 resistente, embora duas destas cepas (CNE19 e 62357_14_D3_4589) tornaram sensível para 10-1074GM (IC50s=0,19 µg/ml e 40,8 µg/ml, respectivamente). Interessantemente, existem só cepas PGT 121 -sensível / 10-1074-resistente que incluem uma intacto PNGS ligado para Asn332^pi2o • As outras cepas PGT 121- sensivel/1 0-1074-resistente falta o glicano ligando Asn332gp120e são resistente para PGT121GMe 10-1074GM, implicando que suas sensitividades para o tipo selvagem PGT 121 envolve uma proximidade de N-glicano e/ou compensação por porções de proteína do epítopo. Embora um ganho dramático da função fosse observado somente para 10-1074GM contra uma cepa (CNE19), este resultado, junto com a geral melhora observada para 10-1074GM contra cepas 10-1074 sensível (Figura 2C), é consistente com a interpretação que resíduos contactando glicano identificados cristalograficamente- pode transferir reconhecimento de propriedades de como PGT 121 para 10-1074 em alguns contextos e/ou afetar sua potência em outros. Em adição, a perda de atividade de neutralização para PGT121GM contra cepas PGT 121 sensivel demonstrou que a atividade de neutralização de PGT 121 envolve os residues identificados como contata do N-glicano tipo complexo na estrutura de "ligantes"PGT 121.

Resultados

[00166] O PGT 121 é um bNAb dependente de glicano que foi originalmente identificado no soro de um doador infectado de clade A em uma tela funcional rendendo os dois membros relacionados com clonagem. Trimeres gpl40 foram usados como "modelo"para triagem de célula única para isolar 29 novas variantes clonais. A família de clonal PGT 121 inclui grupos distintos de anticorpos intimamente relacionados; grupos PGT 121 e 10-1074. Os resultados sugerem que os epitopos de ambos os grupos envolvem o PNGS em Asn332gpl2o e a base da volta V3. Os grupos de como PGT121 e como 10-1074 diferem nas sequências de aminoácido, gpl20/gpl40 ligando afinidades, e atividades neutralizantes, com os anticorpos como 10-1074 sendo completamente dependente para a neutralização em um intacto PNGS em Asn332gpi2o, enquanto anticorpos como PGT121 foram capazes de neutralizas algumas cepas virais na ausência de Asn332gpi2o PNGS.

[00167] Uma diferença notável entre os dois grupos de anticorpo é que os anticorpos como PGT 121 liga N-glicanos tipo complexo em arranjos de carboidrato, enquanto os anticorpos como 10-1074 não mostrou ligação detectável para qualquer dos N-glicanos livre de proteina testado (Figura 7). Glicano livre de proteina ligado por anticorpo anti HIVs não é sempre detectável; exemplo, embora PG9 reconheça glicano de alta manose associado a gpl20, nenhuma ligação para glicanos livre de proteina foi detectada nos micro arranjos. Assim embora um resultado positivo em um micro arranjo de glicano implica envolvimento de um particular glicano no anticorpo epitopo, um resultado negativo não excluiu reconhecimento de glicano. Por exemplo, embora não detectável nos experimentos de micro arranjo de glicano, glicanos de alta manose podem ser envolvidos no epitopo PGT 121, consistente com ligação e neutralização de alta manose de únicas formas de proteina gpl20e virus (Figura 8) .

[00168] A base molecular para a diferença entre PGT 121, 10-1074 e seu progenitor GL foi revelada em parte por suas estruturas de cristais. A constatação de que a maioria das mutações de cadeias leves somáticas é compartilhada entre PGT 121 e 10-1074, enquanto mutações nas cadeias pesadas diferem, sugere que contacto de porções de cadeia leve compartilhadas do epitopo gpl20 e a cadeia pesada reconhecem distintas características. Todos os três anticorpos exibem um estendido CDRH3 com uma extremidade não polar que pode permitir acesso de epitopos crípticos. Diferenças no site de ligação de antigeno de dois Fabs amadurecidos foram principalmente localizados para uma fissura entre CDRH2 e o estendido CDRH3. Curiosamente, a fenda de ligação ao antigeno putativo entre CDRH2 e CDRH3 também foi encontrada em uma representativa linha germinal progenitora de PGT 121 e 10-1074.

[00169] A informação estrutural foi obtidos em relação ao reconhecimento de glicano pelos anticorpos como PGT 121 de uma estrutura de cristal em que um N-glicano sialatado tipo complexo ligado para um resíduo de dominio VHque interagiu com o site de combinação de uma vizinhança PGT121 Fab. Várias características da estrutura de "ligantes"PGT 121 sugerem que é relevante para entender o reconhecimento de N-glicanos tipo complexo em gpl20 por anticorpos como PGT 121. Primeiro, o glicano na estrutura corresponde para o a2-6 sialatado glicano A2(2-6) PGT 121 que liga nos micro arranjos (Figura 7). Segundo, o glicano interaja com PGT 121 usando a fissura entre CDRH3 e CDRH2 que foi sugerida pela análise estrutural para ser envolvida no reconhecimento de epítopo, potencialmente explicando a inclinação incomum de CDRH3 para VLnas estruturas de PGT 121 e 10-1074. Terceiro, a maioria dos resíduos VH identificados como interagindo como o glicano difere entre PGT 121 e 10-1074, racionalizando diferentes características de ligação nos micro arranjos de glicano e potencialmente explicando as diferentes especificidades finas reveladas nos experimento de ligação de proteína. Quarto, troca de resíduos contactando glicano identificados cristalograficamente entre PGT121 e 10-1074 em parte transfere suas propriedades: PGT121GM, como 10-1074, não ligam para glicanos livres de proteína, mas ambos PGT121GM e 10-1074GM preservados próximo da ligação de tipo selvagem para purificar YU-2 gpl20/gpl40. Embora PGT121GM retenha a habilidade para neutralizar algumas cepas virais que foram neutralizadas pelo tipo selvagem PGT121 e 10-1074, não conseguiu neutralizar cepas que são PGT 121 sensivel/ 10- 1074-resistente, demonstrando que o motivo da ligação de glicano é essencial para a atividade neutralizante de PGT 121 contra cepas 10-1074-resistente. Para a troca reciproca, a potência de neutralização de 10-1074GM foi aumentada ou não afetada em relação ao 10-1074, e em uma caso, 10-1074GM potencialmente neutraliza uma cepa PGT 121 -sensivel/ 10-1074-resistente, consistente com o motivo da transferência do glicano identificado cristalograficamente e a hipótese que os epitopos de anticorpos PGT121- e como 10-1074 são relacionados. Na análise de sequências gpl20 de cepas para as quais dados de neutralização de PGT121 estão disponíveis, outra que uma correlação com o PNGS no Asn332gpl20 para virus sensíveis para anticorpos como PGT 121 e como 10-1074, nenhum padrão claro de uso de PNGS aparece para as diferentes categorias de cepas virai (PGT 121-sensível/ 10-1074-sensível, PGT 121-sensível/ 10-1074- resistente, PGT 121-resistente/10-1074-sensível) exceto que as cepas 10-1074-resistente geralmente não têm PNGS associados o Asn332gpl20.

EXEMPLO 9 Transferência Passiva de iriAbs neutralizando anti- HIV-1 in vivo

[00170] Isolado cinco potentes e amplamente ativos anticorpos anti-HIV neutralizante monoclonal foram administrados para macacos rhesus e desafiou-os intraretalmente 24h depois com qualquer de dois diferentes SHIVs. Ao combinar os resultados obtidos dos 60 animais desafiados, o título de neutralização protetiva no plasma preveniu a aquisição de virus em 50% dos macacos expostos foi aproximadamente 1:100. Experimentos de Animais Os macacos usados neste estudo foram negativos para o MHC classe I Mamu-A*01 allele. Construção do R5-trópico SHIVDH12- V3AD8

[00171] A metagênese PCR, com iniciadores correspondendo aos 5’ e 3' metades do SHIVAD8EO

[00172] (PNAS 109, 19769-19774 (2012)) gpl20 V3 região código (iniciador para frente: AGAGCATTTTATACAACAGGAGACATAATAGGAGATATAAGACAAGCACATTGCAA CATTAGTAAAGTAAAATGGC e iniciador reverso: TCCTGGTCCTATATGTATACTTTTCCTTGTATTGTTGTTGGGTCTTGTACAATTAATTT CTACAGTTTCATTC), foi empregado para introduzir estas sequências V3 no genético background do clone molecular pSHIVDH12_CL7 (J. de Virology 78, 5513-5519 (2004)), usando Platinum PFX DNA polimerase (Invitrogen). Seguindo purificação por gel, o produto PCR foi tratado com T4 polinucleotídeo kinase (GibcoBRL) e ligações "blunt-end" para criar pSFnVDH12_V3AD8, que foi usado para transformar células competentes.

Vírus

[00173] O estoque de virus foram preparados pela primeira transfecção de células 293T com os clones moleculares SHIVAD8EO ou SHIVDH12-V3AD8 usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Cultura supernadantes foi coletada 48 h depois e armazenado alíquotas a -80°C até o uso. Os rhesus PBMCs estimulados por Concanavalin A (2 x 106 células em 500 µl) foram infectados com célula supernadantes transfectadas por espinoculação (J. of Virology 74, 1007410080 (2000)) por 1 hora, misturado com o mesmo número/volume de ativado PBMC, e as culturas foram mantidas por pelo menos 12 dias com recolocação diária de meio de cultura. Amostras de meio de supernadantes foram reunidas em torno do tempo de pico de produção RT para preparar individual estoque de virus.

Anticorpos

[00174] Onze anticorpos monoclonal (VRCO1, NIH45-46, 45- 46G54W, 45-46m2, 3BNC117, 12A12, 1NC9, e 8ANC195, 10-1074, PGT121, e PGT126) foram isolados e produzidos. DEN3, um virus da dengue NS1 especifico anticorpo humano IgGl monoclonal (PNAS 109, 18921-18925 (2012)), ou IgG de controle humano (NIH Fonte de Reagente Primata Não humano "(NIH - Nonhuman Primate Reagent"http://www.nhpreagentes.org) foram usados como anticorpos de controle negativo neste estudo. Os anticorpos monoclonal selecionados para pré exposição da transferência passiva foram administrados intravenosamente 24 h antes do desavio com virus.

Quantificação de Niveis de RNA de Plasma Virai.

[00175] Niveis de RNA viral no plasma foram determinados por transcripção PCR reversa de tempo real (ABI Prism 7900HT sistema de detenção de sequência; Applied Biosistemas).

Concentrações de Anticorpo no Plasma.

[00176] As concentrações de anticorpos monoclonal administrados em plasma de macacos foram determinados por ensaio de imunosorbência de ligação de enzima (Enzyme- Linked Immunosorbent Assay - ELISA) usando recombinante HIV-1JRFL gp!20 (Progenies Pharmaceuticals) ou HIVIIIB (Advanced Biotechnology inc) (J. of Virology 75, 8340-8347 (2001)). Resumidamente, placas de micro titulação foram cobertas com HIV-1 gpl20 (2 µg/ml) e incubadas durante a noite a 4 °C. As placas foram lavadas com PBS/0,05% Tween- 20 e bloqueada com 1%) (vol/vol) BSA. Depois do bloqueio, diluições em série de anticorpos ou amostras de plasmas foram acrescentadas para a placa e incubadas por 1 hora a temperatura ambiente. A ligação foi detectada com um anti corpo de fragmentos de anti IgG F(ab)2 humano de cabra acoplado para fosfatase alcalino (Pierce) e visualizado com SIGMAFAST OPD (Sigma-Aldrich). A decadência da meia vida de anticorpos neutralizante monoclonal foi calculada por uma fórmula decadência de exponencial simples baseada nas concentrações de plasma começando no dia 5 ou dia 7 após administração do anticorpo (J. of Virology 84, 1302-1313 (2010)).

Ensaios de Neutralização.

[00177] A potência in vitro de cada mAb e a atividade de neutralização presente na amostra de plasma coletada de macacos rhesus foram avaliadas por dois tipos de ensaios de neutralização; 1) Ensaio de entrada TZM-bl com pseudo tipagem desafio de virus (AIDS Res Hum Retrovirus 26, 89-98 (2010)) ou 2) um ensaio de 14 dia de replicação de PBMC com replicação de virus competentes (J. of virology 76, 2123- 2130 (2002)). Para o ensaio TZM-bl, serialmente diluidos mAb ou amostras de plasma foram incubadas com pseudo tipagem virus, expressando env gene derivado de SHIVAD8EO ou SHIVDH12_V3AD8 e preparado por cotransfecção de células 293T com pNLenvl e pCMV vetores expressando as proteínas do respectivo envelope (J. of Virology 84, 4769-4781 (2010)). A 50%> dose inibidora de neutralização (IC50) a titulação foi calculada como a diluição causando uma redução 50%> em relação às unidades de luminescência (Relative Luminescence Units - RLU) comparado com níveis cultura de controle de vírus depois da subtração de célula controle RLU (J. of Virology 84, 1439-1452 (2010)). 0 fenótipo de neutralização (níveis de titulação) do clone molecular SHIVDH12_ V3AD8 foi determinado por ensaio de célula TZM-bl usando amostras de plasma de um coorte de estudo, que exibia um completo intervalo de atividades neutralizantes contra subtipo isolados de B HIV-1 (J. of General Virology 91, 2794-2803 (2010)) .

Determinação de Titulação de Proteção de Animal e Análise Estatística.

[00178] O cálculo da titulação de neutralizante no plasma contra cada R5 SHIV, resultou na prevenção de aquisição de vírus de 50 ou 80% dos animais desafiados com vírus, foi realizado usando o método de Reed e Muench (Am J Hyg 27, 493-497 (1938)). Um significante animal outlier (valor atípico) (DEW7) foi omitido do cálculo. A regressão Probit foi usada para modelar a relação entre as titulação no plasma requerido para conferir esterilização de imunidade in vivousando todos os 60 passivelmente imunizados macacos (Cambridge University Press, Cambridge, England, ed. 3rd, 2007), com p-valores deste modelo baseado nos testes de razão de Likelihood. A titulação de plasma necessária para diferentes niveis de proteção in vivo (33%, 50%, 80%, 90%, e 95%>) foi determinada do modelo estimado e o método probit de bootstrapping foi usado para construir intervalo de confiança de 90%>.

Resultados:

[00179] SHIVDH12-V3AD8, como SHIVAD8EO, possui Tier 2 anti-HIV-1 propriedades de sensibilidade de neutralização (Tabela 13). Os macacos Rhesus inoculados intravenosamente ou intraretalmente com SHIVDH12-V3AD8 exibiu pico de viremia no intervalo de 105 a 107 RNA virai competido/ml de plasma nas semanas 2 a 3 após infecção (Post Infection - PI). E muitos animais infectados com SHIVDH12-V3AD8, a carga viral prasmática declinou para os niveis de background entre 8 a 20 semanas PI.

[00180] A sensibilidade de neutralização de SHIVAD8EO para 11 amplamente relatado recentemente que reagem com anti-HIV-1 mAbs foi inicialmente determinada no sistema de ensaio TZM-bl (FIGURAS 11A e B). Oito destes anticorpos, VRCO1, NIH45-46 (23), 45-46G54W, 45-46m2, 3BNC117, 12A12, 1NC9 , e 8ANC195 foram alvo de gpl20 CD4 bs (Science 333, 1633-1637 (2011)) e três, 10-1074, PGT121, e PGT126 (Nature 477, 466-470 (2011)), foram dependente na presença do glicano HIV-1 gpl20 N332. Quando testado contra SHIVAD8EO, todos os três mAbs dependentes de glicano exibiram maior potência que os CD4 bs mAbs (FIGURA 11 A) . Os valores IC50 para os três mAbs alvo do glicano gpl20 N332 ficaram no intervalo de 0,09 a 0,15 µg/ml. O CD4 bs mAbs exibiu um intervalo mais amplo (0,14 a 6,34 µg/ml) de atividade neutralizante IC50com 3BNC117 sendo o mais potente. Uma similar hierarquia (dependente de glicano > dependente de CD4 bs) de potência neutralizante mAb foi também observada com SHIVDH12-V3AD8, mas a atividade neutralizante foi distribuída através de uma amplitude de intervalo muito maior (>100 vezes) comparado com os valores de IC50 observados por SHIVAD8EO (FIGURA 11B). SHIVDH12-V3AD8 foi um pouco mais sensível para o glicano alvo de mAbs e mais resistente para o mAbs neutralizante de CD4 bs que SHIVAD8EO.

[00181] Baseado nos resultados mostrados na FIGURA 11, cinco neutralizantes mAbs foram selecionados para um estudo de pré exposição de transferência passiva: VRCO1, porque foi o primeiro CD4bs NAb dos recentes isolados NAbs amplamente agindo para ser caracterizado; o CD4 bs mAbs 45- 46m2 e 3BNC117, ambos dos quais exibiu forte atividade neutralizante contra SHIVAD8EO e SHIVDH12-V3AD8; e o gpl20 N332 mAbs dependente de glicano, PGT121 e 10-1074.

[00182] O protocolo para experimentos de transferência passiva foi para administrar quantidades decrescentes de neutralizante mAbs intravenosamente e animais desafiados intraretalmente 24 horas depois. O objetivo foi de bloquear aquisição vírus, acoplados com o conhecimento que administração repetida de anti-HIV mAbs humanizado para macacos individuais poderia reduzir suas potência e/ou a possibilidade de induzir respostas anafilática, um dose de desafio de SHIV de tamanho suficiente para estabilizar uma infecção in vivo seguindo uma única inoculação foi escolhido. Nesta consideração, previamente realizamos titulação intraretal de SHIVAD8 em macacos rhesus e relatado que a inoculação de 1 x 103 TCID50, determinado pelo ponto final de diluição em macacos rhesus PBMC, foi equivalente para a administração de aproximadamente 3 animal infectados com 50 doses (AID50) (J. of virology 86, 8516-8526 (2012)). De fato, inoculações intraretal única de 3 AID50 resultaram no estabelecimento com sucesso da infecção em 10 de 10 macacos rhesuss com SHIVAD8EO ou SHIVDH12-V3AD8.

[00183] Como um controle para o primeiro experimento de transferência passiva, um vírus anti-dengue NS1 IgGl mAb foi administrado intravenosamente para os animais, que foram desafiados com SHIVAD8EO 24 horas depois. Ambos os macacos (ML1 e MAA) rapidamente se tornaram infectados, gerando níveis de pico de viremia no plasma em 2 semanas após infecção. VRCO1 foi o primeiro anti-HIV-1 neutralizante mAb testado para proteção contra aquisição de vírus e foi administrado para dois macacos a uma dose de 50 mg/kg. Um (DEGF) dos dois macacos inoculados foi completamente protegido do desafio de SHIVAD8EO, com nenhuma evidência de viremia de plasma ou viral DNA associado à célula durante 45 semanas do período de observação. O outro recipiente de 50 mg/kg VRC01 (DEH3) se tornou infectado, mas o pico de viremia de plasma foi retardado até 5 emanas após infecção. Dois macacos adicionais administrados com quantidades menores (20 mg/kg) de VRCO1 não foram protetora do desafio de SHIVAD8EO. Estes resultados são sumarizados na Tabela 13.

[00184] Próximo exame, as propriedades de proteção de PGT121 contra um desafio de SHIVAD8EO. PGT121 foi um dos mais potentes glicano neutralizante do alvo mAbs medido no ensaio TZM-bl (FIGURA 11) . Baseado nos resultados obtidos com VRCO1, PGT121 mAb in vivo titulação a 20 mg/kg foi escolhida para começar, os dois macacos desafiados (K X e MK4) resistiram ao desafio de SHIVAD8EO. Quanto menores quantidades (viz. 5 mg/kg, 1 mg/kg, ou 0.2 mg/kg) de PGT121 foram administradas, 1 de 2, 2 de 2, e 0 de 2 animais, respectivamente, foram protegidos (Tabela 13).

[00185] A capacidade de VRCO1 e PGT121 mAbs para bloquear aquisição de SHIVDH12-V3AD8 foi similarmente avaliada (Tabela 13) . Os resultados obtidos com VRCO1 foram comparáveis com estes observados com o desafio de SHIVAD8EO: 1 de 2 recipientes de 30 mg/kg foi protegido conta o estabelecimento de uma infecção SHIVDH12-V3AD8. O PGT121 mAb foi consideravelmente mais potente que VRCO1 na prevenção de aquisição de SHIVDH12-V3AD8: 2 de 2 recipientes de 0,2 mg/kg PGT121 resistiram à infecção. PGT121 também apareceu para ser um pouco mais eficaz na prevenção de infecções de SHIVDH12-V3AD8 versus SHTVAD8EO in vivo (Tabela 13). Este resultado é consistente com a diferença de 8 vezes nos valores IC50 para PGT121 para neutralização de dois SHIVs no ensaio in vitro(FIGURA 11).

[00186] Os resultados de transferir passivamente mAbs neutralizante 10-1074, 3BNC117, ou 45-46m2 para macacos rhesus, seguido por um desafio com SHIVAD8EO ou SHIVDH12- V3AD8, são sumarizados na Tabela 13. O 10-1074 mAb potencialmente bloqueio a aquisição in vivo de ambos SHIVs. Os CD4bs 3BNC117 e 45-46m2 mAbs foram selecionados para transferência passiva para macacos baseado nos seus valores IC50 contra ambos SHIVs nos experimentos de neutralização in vitromostrada na FIGURA 11. 3BNC117 com sucesso bloqueio de infecção SHIVAD8EO em 2 de 2 macacos a 5 mg/kg mas não em 2 outros animais dado uma dose de 1 mg/kg (Tabela 13). isto foi similar para os resultados observados quando as mesmas quantidades de 3BNC117 foram administrados para desafios de macacos com SHIVDH12-V3AD8: 1 de 2 se tornou infectado a 5 mg/kg; 1 de 2 se tornou infectado a 1 mg/kg.

[00187] As amostras de plasma coletadas em vários tempos de macacos passivamente transferido foram analisadas por HIV-1 gpl20 ELISA para determinar concentrações mAb neutralizante. Em geral, as concentrações de plasma de cada mAb no tempo do desafio (24 horas após administração do anticorpo) correlacionado com a dose administrado de anticorpo (Tabela 13).

[00188] O relacionamento das concentrações de plasma mAb para proteção in vivosão mostrados na FIGURA 12. dos 5 mAbs neutralizante avaliados, PGT121 foi claramente o mais eficaz contra ambos os virus, com SHIVDH12-V3AD8 exibindo uma pouca maior sensitividade para este mAb (2 de 2 macacos protegidos a uma concentração de plasma de 0,2 µg/ml). Em contraste, uma concentração de plasma de aproximadamente 400 µg/ml de VRCOl foi requerida para proteger 1 de 2 animais contra o mesmo desafio de virus SHIVDH12-V3AD8 (Tabela 13). o mais potente CD4 bs mAb administrado para os macacos neste estudo, 3BNC117, foi aproximadamente 6 a 10- vezes mais eficaz que VRCOl na prevenção ou aquisição de SHIV (FIGURA 12, Tabela 13).

[00189] O cálculo da meia vida de PGT121, 10-1074, 3BNC117, e VRCO1 mAbs foram muito similares: 3,5 dias, 3,5 dias, 3,3 dias, e 3,1 dias, respectivamente. Em contraste, a meia vida de 45-46m2 foi extremamente curta e não pode ser determinada. Baseado nas concentrações de mAb no plasma em vários macacos 24 horas após a administração de 20 mg/kg de neutralizante mAbs humanizado (viz. aproximadamente 250 µg/ml [Tabela 13]), os dois macacos receberam 20 mg/kg de 45-46m2 concentrações de mAb no plasma de só 15,0 e 17,6 µg/ml, uma redução de mais que 95% em relação ao outro neutralizante mAbs em 24 horas.

[00190] Titulação de neutralização foi medida nas amostras de plasma coletadas 24 horas após a administração de mAb quando os macacos foram desafiados com SHIVAD8EO ou SHIVDH12-V3AD8. Como mostrado na Tabela 13, boa correlação foi observada entre titulação de neutralização anti-viral de plasma e proteção de infecção SHIV. A administração de dois mAbs dependente de glicano (PGT121 e 10-1074) claramente resultou em titulação mais elevada de atividade neutralizante de anti-HIV-1 no momento do desafio do virus. As titulações medidas nos recipientes do 45-46m2 mAb foram aos limites de detecção ou não detectável devido as suas extremamente curtas meias vidas in vivo.

[00191] 0 método descrito por Reed e Muench (Am J Hyg 27, 493-497 (1938)) foi usado para calcular a titulação de neutralização, medido em plasma, necessário para prevenir aquisição de vírus em 50% dos macacos desafiados. Estas titulações protetoras para os 28 macacos, desafiados com SHIVAD8EO, ou os 32 macacos, desafiados com SHIVDH12-V3AD8, foram separadamente deduzidas (Tabelas 15 e 16). A titulação de neutralização de plasma requerida para proteger 50% dos animais desafiados com SHIVAD8EO ou SHIVDH12-V3AD8 foram calculados para ser 1:115 e 1:96, respectivamente. Porque estas titulações similares foram obtidas seguindo: 1) desafio de SHIV por rotas idênticas e tamanho de inoculo e 2) a administração do mesmo conjunto de neutralizante mAbs, os dados de neutralização de todos os 60 animais foram combinados e submetidos à regressão probit para examinar a relação entre as titulações de neutralização de plasma e proteção in vivo. como um controle adicional, quando um termo para o virus SHIV foi incluido no modelo de regressão probit em todos os 60 macacos, não existirá evidência de uma diferença entre os dois vírus SHIV. (p=0,16). Quando aplicado para o grupo inteiro de 60 macacos, a regressão probit estimou que a titulação de neutralização de plasma 1 104 impediria aquisição de vírus em 50% dos animais. A análise probit dos dados também estimou que 50% de titulação de neutralização de plasma de 1:57 ou 1:329 protegeria 33% ou 80%, respectivamente, dos animais expostos.

EXEMPLO 10 Administração de Neutralizante mAbs para Modelos Cronicamente Infectados HIV in-vivo

[00192] Resumo dos Métodos: As atividades de neutralização dos amplamente ativos mAbs neutralizantes de 3BNC11724 e 10- 107423 contra SHIVAD8EO foram inicialmente determinados no sistema célula TZM-bl contra SHIVAD8EO. Suas capacidades para bloquear aquisição de vírus ou para controlar viremia de plasma em animais cronicamente infectados desafiados com o R5-trópico SHIVAD8E0 foram avaliadas por monitoração de carga viral do plasma e ácido nucléicos virai associado a células; niveis de sub populações de células CD4 + T foram medidos por citometria de fluxo. A análise SGA de circulação de variantes virai e a determinação de níveis de anticorpo no plasma. A concentração de plamas de NAbs foi determinada pela medida da atividade neutralizante contra preparações sensíveis única de pseudovirus HIV-1 para 10- 1074 ou 3BNC117.

Resultados:

[00193] Dois grupos de macacos cronicamente infectados foram avaliados. o primeiro grupo consistiu de dois animais clinicamente assintomáticos (DBZ3 e DC99A) que foram infectados por 159 semanas e tinham sustentado similar e significante declínio de circulação de células CD4+ T (Tabela 17) . O regime para o tratamento em curso de infecção SHIVs foi para co-administrar 101074 e 3BNC117, a uma dose de 10 mg/kg. No momento da administração de mAb, a carga viral no plasma nos macacos DBZ3 e DC99A foram 1,08 x 104 e 7,6 x 103 RNA cópias/ml, respectivamente. Ambos os macacos responderam para a combinação e tratamento anti- HIV-1 mAb com imediata e rápida reduções de viremia de plasma para níveis não detectáveis dentro de 7 a 10 dias. A supressão de SHIVAD8EO mensurável no plasma de macacos DBZ3 e DC99A, seguindo uma administração única dos dois mAbs, permanecendo 27 e 41 dias, respectivamente. Em cada caso, viremia plasma recuperou para níveis pré tratamento.

[00194] Um segundo grupo de três animais (DBX3, DCF1, e DCM8), cada um dos quais foram também infectados com SHIVAD8EO por mais que 3 anos e foram clinicamente sintomáticos com intermitente diarréia e/ou anorexia, foram tratados com os dois anticorpos neutralizante (Tabela 17). no momento da administração de mAb, o nivel de circulação de células CD4 + T no macaco DCM8 foi só 43 células/pl e um pouco mais alta nos animais DCF1 (105 células/pl) e DBXE (158 células/pl).

[00195] A carga de viral no plasma excedeu 105 R A cópias/ml nos animais DBXE e DCF1 e foram signif icantemente menor (1,59 x 103 RNA cópias/ml) no macaco DCM8 . A administração dos dois mAbs para o macaco DBXE resultou em uma redução bifásica de viremia de 2,0 x 105 RNA cópias no dia 0 para niveis não detectável no plasma no dia 20. Isto foi seguido, dentro de uns poucos dias, por um ressurgimento de niveis alto de virus circulando em DBXE.O macaco DCM8, com carga de virus mais modesta no plasma e muito pouco números células CD4+ T circulando, experimentando um rápido declínio de viremia para níveis não detectáveis entre 6 e 20 dias seguidos da iniciação de tratamento de mAb. Finalmente, animal DCF1, previamente relatado para ter gerado amplamente reação anti-HIV-1 NAbs, exibiu um transiente e uma comparativamente modesta redução de viremia de plasma 27 vezes por 6 dias em resposta a terapia de combinação de mAb, antes de a carga virai retornar para níveis alto pré tratamento.

[00196] PBMC associado a níveis viral RNA e DNA foram também determinados antes e depois da administração de anticorpo (Tabela 18). Para cada animal, tratamento mAb resultou níveis reduzidos de células associadas a RNA virai, correlacionando bem com as medidas de carga viral de plasma. Padrão não consistente foi observado para niveis viral de DNA associado à célula como um resultado do tratamento de anticorpo. A administração de neutralizante mAbs para macacos cronicamente infectados SHIVAD8EO também teve efeitos benéficos nos niveis de circulação de célula CD4 + T, particularmente em animais com carga muito alta de virus, o número de células CD4 + T nos macacos DBXE e DCF1 aumentou 2 a 3 vezes durante o periodo de supressão de virus mediado por mAb, mas gradualmente declinou para niveis pré tratamento como a viremia novamente tornou-se detectável.

[00197] As concentrações de plasma de cada mAb foram determinadas pela medida da atividade neutralizante de plasma contra selecionadas cepas HIV-1 pseudovirus sensiveis a um ou a outro, mas não para ambos os anticorpos (FIGURA 13 A). Em cada animal tratado, a supressão de viremia SHIVAD8EO foi mantida até uma concentração limiar de mAb plasma de aproximadamente 1 a 3 µg/ml foi alcançada (FIGURAS 13B e 13C) . Este foi ainda o caso para macaco DCF1, para o qual uma modesta e transiente redução de niveis virai RNA de plasma foi observada. Curiosamente, a administração de mAbs para macacos clinicamente sintomáticos DCM8 e DCF1 encurtou a meia vida ou foram não detectável. como notado anteriormente, macaco DCM8 teve niveis extremamente baixo de célula CD4+ T (43 células/pl plasma) e macaco DCF1 teve que ser sacrificado no dia 56 após inicio do tratamento devido à sua condição clinica de deterioração. Uma necropsia de DCF1 revelou severa enteropatia, caracterizada por disseminada gastrointestinal criptosporidiose, pancreatite, e colangite.

[00198] A análise SGA foi usada para determinar se substituições de aminoácido tinham surgido em regiões gpl20 previamente mostrada para afetar a sensitividade para 10- 1074 ou 3BNC117 mAbs. Em cada caso o virus rebound presente no plasma seguindo imunoterapia não foi trocado. Para adicionalmente testar a sensitividade do virus reemergente, terapia de combinação 10-1074 mais 3BNC117 (10 mg/kg de cada) foi re-administrado para os dois macacos clinicamente assintomáticos (DBZ3 e DC99A). A carga virai em cada animal novamente rapidamente caiu, tornando-se não detectável no dia 7 do segundo ciclo de imunoterapia. A viremia foi suprimida durante 7 dias no macaco DBZ3 e mais que 21 dias mo macaco DC99A. Tomadas em conjunto, estes resultados sugerem que a reemergência de virus após o primeiro ciclo de tratamento nestes dois animais representou niveis insuficiente de mAb niveis in vivoem vez de anticorpo resistente a virus selecionado. Tabela 3 Repertório de Variantes Clonais PGT121 e 10-1074 VHmut e Vimut indicam o número total de mutações no genes Ig VH e VL. (-) e ( + ) indica os números de cargas positiva e negativa de aminoácidos na região complementarmente determinada (Complementarity Determining Região - CDR), respectivamente. Y indica o número de residues de Tirosina no IgLJ CDR3s (em verde). 1Baseado na nomenclatura Kabat IgBLAST, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast. Ácido e base estão em vermelho e azul, respectivamente. FRWl_del, número de nucleotideos deletados na região 1 de frame work (FRW1) do IgL. FRW3 Ins, número de nucleotideos inseridos na região 3 do framework (FRW3)do I. Cor de sombreamento, mostra membros clonais com sequências IgH idênticas entre eles, a sequência identidade IgH que define clones é indicada em negrito *Indica anticorpos variantes representativos que produzidos e analisados. 10-265 IgL não foi clonado e 10-1141 não foi produzido Tabela 4 Ensaio de Neutralização de TZM-bl In vitrono Painel de Base Os números indicam as concentrações de anticorpos IgG em µg/ml para alcançar IC50 (superior) e IC80 (inferior) no ensaio de neutralização de TZM-bl. Valores de IC50/80 são codificados em cores e indica de verde escuro a vermelho escuro, um aumento da sensitividade de neutralização . > indica que o IC50 para um dado virus não foi alcançada na concentração testada. Virus de leucemia de Murino (Murine Leukemia Virus - MuLV) e R1166.C1 (Clade AE) são controle negativo Tabela 5 Os números indicam as concentrações de anticorpos IgG em µg/ml para alcançar IC50 no ensaio de neutralização de TZM-bl. Valores de IC50 são codificados em cores e indicam de verde escuro a vermelho escuro, um aumento da sensitividade de neutralização > indica que o IC50 para um dado vírus não foi alcançado na concentração testada.Tabela 6 Tabela 7 Os pontos indicam a presença de uma asparagina e de um resíduo de serina na posição 332 e 334, respectivamente. Mutações nas posições 332 e 334 (numeração da sequência HXB2) são indicadas pelo aminoácido substituído. Valores de IC50 são codificados em cores e indica de verde escuro a vermelho escuro, um aumento na sensitividade de neutralização no ensaio de TZM-bl. Tabela 8 Ensaio de Neutralização Baseado em PBMC Tn vitro Os números indicam as concentrações de anticorpos IgG em µg/ml para alcançar IC80 no ensaio baseado em neutralização. Valores de IC50 são codificados em cores e indica de verde escuro a vermelho escuro, um aumento da sensitividade de neutralização . * indica que o ICgo para um dado virus não foi alcançado na concentração testada Tabela 9 Coleta de Dados e Refinamento Estatístico (substituição molecular) Tabela 10 Tabela 11 Tabela 12 Tabela 13 Tabela 14 Tabela 15 Tabela 16 Tabela 17Tabela 18 Os exemplos e descrição acima expostas de concretizações preferidas deverão ser tomas como ilustrações, mas não como uma limitação da presente invenção como definido pelas reivindicações. Como serão prontamente apreciado, numerosas variações e combinações das características estabelecidas acima podem ser utilizadas sem se afastar da presente invenção como estabelecido nas reivindicações. Tais variações não são consideradas como um afastamento do escopo da invenção, e todas tais variações são entendidas para serem incluídas dentro do escopo das reivindicações seguintes. Todas as referências citadas neste documento são incorporadas inteiramente neste documento.

Claims

1. Anticorpo anti HIV isolado, ou porção do antígeno de ligação do mesmo, caracterizado por: compreender um CDRH 1, um CDRH 2, um CDRH 3, um CDRL 1, um CDRL 2 e um CDRL 3, em que o CDRH 1, CDRH 2, CDRH 3, CDRL 1, CDRL 2 e CDRL 3 compreendem as respectivas sequências de um conjunto CDR selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 69-74, SEQ ID NOs: 5762, SEQ ID NOs: 63-68, SEQ ID NOs: 87-92 e SEQ ID NOs: 93-98.

2. Anticorpo anti HIV isolado, de acordo com a reivindicação 1, ou porção de ligação ao antígeno, caracterizado por: compreender as respectivas sequências de um par de região variável de cadeia pesada (VH) e região variável de cadeia leve (VL) selecionado do grupo de SEQ ID NOs : 13-14, SEQ ID NOs: 9-10, SEQ ID NOs: 11-12, SEQ ID NOs: 19-20 e SEQ ID NOs: 21-22.

3. Anticorpo anti HIV isolado, de acordo com a reivindicação 1, ou porção do antígeno de ligação do mesmo, caracterizado por: o anticorpo ser um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, ou um anticorpo quimérico.

4. Composição farmacêutica caracterizada por: compreender (i) pelo menos um anticorpo anti-HIV conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-3, ou antígeno ligando porção deste, e (ii) um veículo farmaceuticamente aceitável.

5. Anticorpo anti-HIV isolado, de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 3, ou uma porção do antígeno de ligação, caracterizado por ser para uso na prevenção ou tratamento de uma infecção de HIV.

6. Kit compreendendo: uma dose unitária farmaceuticamente aceitável de uma quantidade farmaceuticamente efetiva de pelo menos um anticorpo anti HIV isolado de conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-3, e uma dose unitária farmaceuticamente aceitável de uma quantidade farmaceuticamente efetiva de um agente anti-HIV, caracterizado por: as duas doses farmaceuticamente aceitáveis poderem opcionalmente tomar a forma de uma simples dose unitária farmaceuticamente aceitável.