BR112015003757B1

BR112015003757B1 - Anticorpo anti-ror-1 isolado, seu uso, e ácido nucleico isolado que codifica o referido anticorpo

Info

Publication number: BR112015003757B1
Application number: BR112015003757-7A
Authority: BR
Inventors: Thomas James Kipps; Jian Yu; Bing Cui; Liguang Chen; George Widhopf; Charles Prussak
Original assignee: The Regents Of The University Of California
Priority date: 2012-08-24
Filing date: 2013-03-15
Publication date: 2022-08-16
Also published as: MX2015002337A; JP2019110906A; NI201500024A; CA2881966C; DK2888283T3; KR102134088B1; EP2888283A1; CN109369808B; KR101935088B1; IL236962B; KR20150046111A; IL264057B; US20190389962A1; PL3489261T3; US20180066063A1; SG11201500730XA; EP3489261A1; US10344096B2; KR102312856B1; CN104662044A

Abstract

ANTICORPOS E VACINAS PARA USO NO TRATAMENTO DE CÂNCERES DE ROR1 E INIBIÇÃO DE METÁSTASE. A presente invenção refere-se a composições farmacêuticas e um método de inibir metástase usando anticorpos anti-ROR1 ou fragmentos de ligação de antígeno, peptídeos de ligação a ROR1 e vacinas de ROR1.

Description

DADOS RELACIONADOS AO PEDIDO

[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade sob 35 U.S.C § 119(e) do Pedido de Patente U.S. N° 61/693.230, depositado em 24 de agosto de 2012, Pedido de Patente U.S. N° 61/709.055, depositado em 2 de outubro de 2012 e Pedido de Patente U.S. N° 61/709.803 depositado em 4 de outubro de 2012, todo o conteúdo dos quais é incorporado a adendo por referência.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[002] O material na listagem de sequência anexa é aqui incorporado com referência na sua totalidade. O arquivo anexo, chamado "ST-UCSD3820-1WO_ST25.txt", foi criado em 14 de março de 2013 e é de 33 Kb. O arquivo pode ser acessado usando o Microsoft Word em um computador que usa o sistema operacional Windows.

INFORMAÇÃO DE CONCESSÃO

[003] Esta invenção foi feita com apoio do governo sob P01- CA081534 e R37-CA049870 emitidos pelo National Institutes of Health e da Califórnia DR1-01430 California Institute of Regenerative Medicine. O governo tem determinados direitos na invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO

[004] A invenção refere-se geralmente a anticorpos e vacinas de receptor 1 órfão semelhante a receptor tirosina-quinase, bem como métodos para inibir a metástase.

INFORMAÇÃO BÁSICA

[005] Câncer é a segunda causa principal de morte humana ao lado de doença coronária. Em todo o mundo, milhões de pessoas morrem de câncer anualmente. Nos Estados Unidos sozinho, câncer provoca a morte de bem mais de meio milhão de pessoas anualmente, com alguns 1,4 milhões de novos casos diagnosticados por ano. Embora mortes por doenças cardíacas venham diminuindo significativamente, aquelas resultantes de câncer geralmente estão em ascensão. Tirosina quinases do receptor (RTKs) desempenham um papel crítico na diferenciação, proliferação, migração, angiogênese e sobrevida celular. O receptor 1 órfão semelhante a receptor tirosina- quinase (ROR1) é uma proteína de membrana evolutivamente conservada tipo I que pertence à subfamília ROR e tem domínios extracelulares que contêm domínios semelhantes à imunoglobulina (Ig), Frizzled e de Kringle. Os camundongos deficientes em ROR1 exibem uma variedade de defeitos fenotípicos dentro dos sistemas esqueléticos e urogenitais, bem como retardo no crescimento pós-natal. ROR1 é expresso durante a embriogênese e por uma variedade de diferentes tipos de câncer, mas não por tecidos pós-parto normais e pode ser considerado um antígeno de superfície onco-embrionário. Dados funcionais sugerem que ROR1 pode funcionar em sinalização de WNT não-canônica para assegurar a sobrevida de células malignas. Estudos mais recentes demonstraram que sinalização de WNT não-canônica desempenha um papel importante basal-símile e outros subtipos de metástase de câncer de mama. Expressão de câncer de mama humano de ROR1 também está associada com a ativação da via AKT-CREB e crescimento de célula tumoral reforçado.

[006] Receptor 1 órfão semelhante a receptor tirosina-quinase (ROR1) é uma proteína embrionária conservada cuja expressão torna- se progressivamente reduzida durante o desenvolvimento embrionário em mamíferos. A proteína intacta, incluindo seu domínio extracelular, parece não ser significativamente expressa em tecidos de mamífero adulto normal. Em particular, estudos não identificaram significativa expressão de ROR1 na superfície das células dos tecidos humanos adultos normais, incluindo normais, não células não cancerígenas B (Baker et al, Clin. Cancer Res., 14:396 (2008); DaneshManesh et al., Int. J. Cancer, 123:1190 (2008) e Fukuda et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. EUA, 105:3047 (2008)). No entanto, ROR1 é expresso na superfície das células de células malignas B (B-LLC) e linfoma das células do manto (MCL). Também foi relatado que o ROR1 é expresso em determinadas outras linhagens celulares de câncer incluindo do linfoma de Burkett, carcinoma de células renais, câncer de cólon e câncer de mama (Pedido de Patente U.S. 2007/02075110). Portanto, ROR1 pode ser considerado um marcador seletivo para esses tipos de câncer.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] A invenção fornece anticorpos contra ROR1 que podem inibir a metástase e o crescimento de células de câncer. Esta invenção fornece anticorpos contra ROR1, peptídeos de ligação de ROR1 e vacinas de peptídeo de ROR1. Ainda são fornecidos composições e métodos para inibir a metástase usando anticorpos anti-ROR1 ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos, imunoconjugados de anticorpo de ROR1, vacinas de peptídeo de ROR1 ou peptídeos de ligação de ROR1. Em uma modalidade, a invenção prevê um anticorpo de ROR1 anti-humano isolado tendo a mesma especificidade de ligação como o anticorpo 99961. Em um aspecto, o anticorpo liga-se ao domínio semelhante a lg, que é contíguo com o domínio CRD de ROR-1 humano (hROR1). Em um aspecto adicional, o anticorpo liga-se a um mapeamento de epítopo de aminoácidos 42-160 de hROR-1. Em um outro aspecto, o anticorpo liga-se a um mapeamento de epítopo de aminoácidos 130-160 de hROR-1. Em outro aspecto, o anticorpo requer a presença de ácido glutâmico na posição 138 de hROR-1 para ligação.

[008] Em uma modalidade adicional, a invenção prevê um anticorpo de ROR1 anti-humano isolado que compreende uma região de cadeia pesada variável selecionada do grupo constituído por SEQ ID. NO:1, SEQ ID. NO:5, SEQ ID. NO:9, SEQ ID. NO:13, e SEQ ID. NO:17 e a região variável de cadeia leve é selecionada do grupo constituído por SEQ ID. NO:3, SEQ ID. NO:7, SEQ ID. NO:11, SEQ ID. NO:15 e SEQ ID. NO:19. Em um aspecto, o anticorpo de acordo com a região variável de cadeia pesada é SEQ ID NO:5 e a região variável de cadeia leve é SEQ ID NO:7.

[009] Em uma modalidade, a invenção prevê um anticorpo de ROR1 anti-humano isolado que compreende uma região de cadeia pesada variável constituída de CDR1, CDR2 e CDR3 selecionados do grupo constituído por SEQ ID. NO:27, SEQ ID. NO:28, SEQ ID. NO:29, SEQ ID. NO:33, SEQ ID NO:34 e SEQ ID. NO:35 e a região variável de cadeia leve constituída de CDR1, CDR2 e CDR3 selecionados do grupo constituído por SEQ ID. NO:30, SEQ ID. NO:31, SEQ ID. NO:32, SEQ ID. NO:36, SEQ ID NO:37 e SEQ ID. NO:38. Em um aspecto a região variável de cadeia pesada composta de CDR1, CDR2 e CDR3 é constituída de SEQ ID. NO:27, SEQ ID. NO:28 e SEQ ID. NO:29 e a região variável de cadeia leve constituída de CDR1, CDR2 e CDR3 selecionados do grupo constituído por SEQ ID. NO:30, SEQ ID. NO:31 e SEQ ID. NO:32

[0010] Em outra modalidade, a invenção prevê um anticorpo de ROR-1 anti-humano com uma afinidade de ligação superior a 41 nM. Em um aspecto, a afinidade de ligação do anticorpo é entre cerca de 500 pM e cerca de 6 nM. Em um aspecto, a afinidade de ligação do anticorpo é cerca de 800 pM.

[0011] Em um aspecto, o anticorpo é 99961 ou forma humanizada do mesmo, incluindo anticorpos 99961.1, 99961.2, 99961.3 ou 99961.4. Em outro aspecto, o anticorpo inibe metástases. Em um aspecto adicional, o anticorpo internaliza e inibe a migração celular. Em um outro aspecto, o anticorpo internaliza e modula para baixo vimentina, snail1/2 ou ZEB. Em um aspecto preferencial, o anticorpo é humano, humanizado ou quimérico.

[0012] Em outra modalidade, a invenção fornece uma formulação farmacêutica compreendendo o anticorpo contra ROR1 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0013] Uma modalidade ainda fornece um ácido nucleico isolado codificando o anticorpo contra ROR1. Em outra modalidade, a invenção prevê um vetor de expressão, composto por um ácido nucleico codificando um anticorpo contra hROR1. Em uma modalidade adicional, a invenção prevê uma célula hospedeira que compreende o ácido nucleico codificando um anticorpo contra hROR1. Em outra modalidade, a invenção fornece um método de produzir um anticorpo de ROR1 anti- humano compreendendo cultivo das células hospedeiras em condições de produzir o anticorpo, em seguida, opcionalmente, recuperar o anticorpo.

[0014] Em uma modalidade a invenção prevê uma vacina contra células expressando ROR-1, a vacina caracterizada pelo fato de compreender uma composição farmaceuticamente aceitável de um peptídeo isolado ou produzido sinteticamente tendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade de sequência com a região ligante a ROR-1 do anticorpo D10. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos da região de ligação de ROR-1 do anticorpo D10 é VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC. Em um outro aspecto, a sequência de aminoácidos da região de ligação de ROR-1 do anticorpo D10 é EVVSSTGVLFVKFGPC. Em outro aspecto, a célula que expressa ROR-1 é uma célula de câncer. Em um aspecto adicional, a célula de câncer é leucemia de célula b, linfoma, CLL, AML, B-ALL, T-ALL, câncer de ovário, cólon, pulmão, pele, pancreático, testículo, bexiga, útero, próstata ou adrenal.

[0015] Em outra modalidade, a invenção prevê uma vacina que inclui um peptídeo de ligação de ROR1 tendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade de sequência com VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em um aspecto, o peptídeo é mamífero. Em um aspecto adicional, o peptídeo de ligação de ROR1 é quimérico e/ou do ser humano, camundongo, rato, suíno, bovino, primata, felino, canino, coelho, cabra, galinha ou de origem ursina. Em outro aspecto, a vacina ainda compreende um adjuvante imunogênico. Em um outro aspecto, o adjuvante é uma fração transportadora imunogênica conjugada com o peptídeo de ligação. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos do peptídeo de ligação é VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC. Em outro aspecto, a fração transportadora imunogênica é um peptídeo veículo, como a hemocianina do caranguejo Megathura crenulata (KLH “keyhole limpet hemocyanin”), albumina de soro bovino (BSA), a ovalbumina, hidróxido de alumínio ou outro adjuvante imunológico farmaceuticamente aceitável. Exemplos de adjuvantes imunes farmaceuticamente aceitáveis podem ser encontrados em Methods in Molecular Medicine, Vol. 42: Vaccine adjuvants: Preparation, Methods and Research Protocols; Editado D. T. O’Hagan; Humana Press Inc., Totowa NJ e European Agency for the Evaluation of Medicinal Products, Committee for Proprietary Medicinal Products, Guidelines on Adjuvants in Vaccines, Londres 2004.

[0016] Em outra modalidade, a invenção prevê uma vacina que inclui um peptídeo de ligação de ROR1 tendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade de sequência com EVVSSTGVLFVKFGPC e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em um aspecto adicional, o peptídeo de ligação de ROR1 é quimérico e/ou do ser humano, camundongo, rato, suíno, bovino, primata, felino, canino, coelho, cabra, galinha ou de origem ursina. Em um outro aspecto, o adjuvante é uma fração transportadora imunogênica conjugada com o peptídeo de ligação. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos do peptídeo de ligação é VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC. Em outro aspecto, a fração transportadora imunogênica é um peptídeo veículo, como a hemocianina do caranguejo Megathura crenulata (KLH), albumina de soro bovino (BSA), a ovalbumina, hidróxido de alumínio ou outro adjuvante imunológico farmaceuticamente aceitável. Exemplos de adjuvantes imunes farmaceuticamente aceitáveis podem ser encontrados em Methods in Molecular Medicine, Vol. 42: Vaccine adjuvants: Preparation, Methods and Research Protocols; Editado D. T. O’Hagan; Humana Press Inc., Totowa NJ e European Agency for the Evaluation of Medicinal Products, Committee for Proprietary Medicinal Products, Guidelines on Adjuvants in Vaccines, Londres 2004.

[0017] Em uma modalidade adicional, a invenção prevê uma formulação farmacêutica que compreende a vacina que compreende um peptídeo de ligação de ROR1 tendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade de sequência com VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0018] Em uma modalidade adicional, a invenção prevê uma formulação farmacêutica que compreende a vacina que compreende um peptídeo de ligação de ROR1 tendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade de sequência com EVVSSTGVLFVKFGPC e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0019] Em uma modalidade, a invenção prevê um peptídeo de ligação de ROR1 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada do grupo constituído por: SEQ ID NO:25 e SEQ ID NO:26. Em um aspecto, o peptídeo tem uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade de sequência com VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC. Em outro aspecto, o peptídeo tem uma sequência de peptídeo de aminoácido de pelo menos 95% de identidade de sequência com EVVSSTGVLFVKFGPC. Em outro aspecto, o peptídeo de ligação é mamífero. Em um aspecto adicional, o peptídeo de ligação é quimérico e/ou do ser humano, camundongo, rato, suíno, bovino, primata, felino, canino, coelho, cabra, galinha ou de origem ursina.

[0020] Em uma modalidade, a invenção prevê uma formulação farmacêutica compreendendo um peptídeo de ligação de ROR1 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada do grupo constituído por: SEQ ID NO:25 e SEQ ID NO:26 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0021] Em outra modalidade, a invenção prevê um ácidos nucleico isolado codificando um peptídeo de ligação de ROR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:25 e SEQ ID NO:26. Em outra modalidade, a invenção prevê um vetor de expressão que compreende o ácidos nucleico codificando um peptídeo de ligação de ROR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:25 e SEQ ID NO:26. Em outra modalidade, a invenção prevê uma célula hospedeira compreendendo o ácidos nucleico codificando um peptídeo de ligação de ROR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:25 e SEQ ID NO:26. Em uma modalidade adicional, a invenção prevê um método de produção de um peptídeo compreendendo cultivo da célula hospedeira que codifica um peptídeo de ligação de ROR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ IDNO:25 e SEQ ID NO:26 sob condições para produzir o peptídeo de ligação. Em um aspecto, o método para a produção de um peptídeo ainda compreende recuperar o peptídeo de ligação.

[0022] Em uma modalidade, a invenção prevê um método de suprimir a metástase do câncer que expressa ROR-1, o método caracterizado pelo fato de compreender romper a transição epitelial- mesenquimal de células tumorais através da administração de um anticorpo com a especificidade de ligação do anticorpo monoclonal 99961, uma vacina composta de um peptídeo com uma sequência de aminoácidos de pelo menos 95% de identidade de sequência com a região de ligação a ROR-1 de anticorpo D10 ou um peptídeo de ligação de ROR-1 tendo uma sequência de aminoácidos de pelo menos 95% de identidade de sequência com VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC. Em um aspecto, o câncer que expressa ROR-1 é a leucemia de células B, linfoma, CLL, AML, B-ALL, T-ALL, do ovário, cólon, pulmão, pele, pancreático, do testículo, bexiga, útero, próstata ou câncer adrenal.

[0023] Em uma modalidade, a invenção prevê um método de suprimir a metástase do câncer que expressa ROR-1, o método caracterizado pelo fato de compreender romper a transição epitelial- mesenquimal de células tumorais através da administração de um anticorpo com a especificidade de ligação do anticorpo monoclonal 99961, uma vacina composta de um peptídeo com uma sequência de aminoácidos de pelo menos 95% de identidade de sequência com a região de ligação a ROR-1 de anticorpo D10 ou um peptídeo de ligação de ROR-1 tendo uma sequência de aminoácidos de pelo menos 95% de identidade de sequência com EVVSSTGVLFVKFGPC. Em um aspecto, o câncer que expressa ROR-1 é a leucemia de células B, linfoma, CLL, AML, B-ALL, T-ALL, do ovário, cólon, pulmão, pele, pancreático, do testículo, bexiga, útero, próstata ou câncer adrenal.

[0024] Em uma modalidade adicional, a invenção prevê um método de tratar ou prevenir um câncer em um sujeito, o método caracterizado pelo fato de compreender a administração ao sujeito de um anticorpo com a especificidade de ligação do anticorpo monoclonal 99961, uma vacina composta de um peptídeo com uma sequência de aminoácidos de pelo menos 95% de identidade de sequência com a região de ligação a ROR-1 de anticorpo D10 ou um peptídeo de ligação de ROR-1 tendo uma sequência de aminoácidos de pelo menos 95% de identidade de sequência com VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC. Em um aspecto, o câncer é a leucemia de células B, linfoma, CLL, AML, B-ALL, T-ALL, do ovário, cólon, pulmão, pele, pancreático, do testículo, bexiga, útero, próstata ou câncer adrenal.

[0025] Em uma modalidade adicional, a invenção prevê um método de tratar ou prevenir um câncer em um sujeito, o método caracterizado pelo fato de compreender a administração ao sujeito de um anticorpo com a especificidade de ligação do anticorpo monoclonal 99961, uma vacina composta de um peptídeo com uma sequência de aminoácidos de pelo menos 95% de identidade de sequência com a região de ligação a ROR-1 de anticorpo D10 ou um peptídeo de ligação de ROR-1 tendo uma sequência de aminoácidos de pelo menos 95% de identidade de sequência com EVVSSTGVLFVKFGPC. Em um aspecto, o câncer é a leucemia de células B, linfoma, CLL, AML, B-ALL, T-ALL, do ovário, cólon, pulmão, pele, pancreático, do testículo, bexiga, útero, próstata ou câncer adrenal.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0026] A Figura 1 mostra que expressão de alto nível de ROR1 no câncer de mama está associada a menor sobrevida livre de metástase e assinatura de gene de EMT. (A) O gráfico foi derivado de dados publicados disponíveis na base de dados PubMed GEO (GSE2603, GSE5327, GSE2034 e GSE12276). Curvas de Kaplan-Meier retratam o impacto prognóstico da expressão de ROR1 na sobrevida global livre de metástase. Para cada análise, 582 casos foram separados em tercis com o grupo designado ROR1H representando o um terço dos pacientes que tinham tumores com os mais altos níveis de mRNA de ROR1 e o grupo designado ROR1L representando o um terço dos pacientes que tiveram câncer com os níveis mais baixos de mRNA de ROR1. O um terço dos pacientes que tinham tumores com expressão intermediária de mRNA de ROR1 foi designado como ROR1M. Sobrevida livre de metástase foi determinada pela análise de Kaplan- Meier e diferenças estatísticas foram determinadas pelo teste log-rank. O número de pacientes em cada categoria, os eventos metastáticos totais e os correspondentes valores de P (teste de qui-quadrado) são mostrados nas tabelas incorporadas. (B) Mapa de calor mostrando a expressão de ROR1 (topo), genes relacionados com EMT (SNAI1 e SNAI2 codificando Snail-1 e Snail-2, ZEB1 codificando ZEB-1, VIM codificando vimentina, CDH2 codificando N-caderina, CDH1 codificando E-caderina, TJP1 codificando ZO-1, TJP3 codificando ZO-3, KRT19 codificando CK-19, ou CLDN3 codificando Claudin 3, em células de câncer de mama primário isoladas de pacientes. (C) Mapa de calor mostrando a expressão dos genes relacionados com EMT isolados de células MDA-MB-231 (esquerda), HS-578T (meio), BT549 (direita) tratadas com ROR1-siRNA ou CTRL-siRNA. (D) Immunoblots de lisados de proteína de MDA-MB-231, HS-578T ou BT549 (conforme indicado na parte inferior) transfectados com CTRL-shRNA ou ROR1- shRNA, conforme indicado na parte superior. Immunoblots foram analisados com anticorpos específicos para as proteínas indicadas à esquerda. (E) Immunoblots de lisado de proteína de MCF7 transfectados com um vetor de controle ou um vetor ROR1-expressante, conforme indicado na parte superior. Immunoblots foram analisados com anticorpos específicos para as proteínas indicadas à esquerda.

[0027] A Figura 2 mostra que a expressão de ROR1 por linhagens celulares de câncer de mama está associada a características de EMT e maior potencial metastático. (A) Alterações morfológicas (40x) de MDA-MB-231, HS-578T ou BT549 (conforme indicado no lado esquerdo) transfectadas com CTRL-shRNA ou ROR1-shRNA, conforme indicado na parte superior. (B) A expressão de vimentina, E-caderina ou CK-19 foram detectadas por coloração de imunofluorescência em células MDA-MB-231 transfectadas com CTRL-shRNA ou ROR1- shRNA sob ampliação de 63x. (C) Mudanças morfológicas (40x) de células MCF7 transfectadas com vetor de controle ou vetor ROR1- expressante (conforme indicado na parte superior). (D) A expressão de vimentina, E-caderina ou CK-19 foi detectada por coloração de imunofluorescência de células MCF7 transfectadas com vetor de controle ou vetor ROR1-expressante (ampliação de 63x). (E) Ensaios de migração celular (histogramas esquerdos) ou invasão (histogramas direitos) em MDA-MB-231, HS-578T ou BT549 transfectadas com CTRL-shRNA (preto) ou ROR1-shRNA (branco). Todos os dados foram normalizados para os resultados de células transfectadas com CTRL- shRNA, que não diferiram daqueles notável para as linhas de célula parental. Os resultados são o valor médio para cada grupo de teste (± SEM) (n = 3 por grupo teste). (F) Fotomicrografias representativas de MDA-MB-231 transfectadas com CTRL-shRNA (painéis esquerdos) ou MDA-MB-231 transfectadas com ROR1-shRNA (painéis direitos) em ensaios para a migração celular (topo) ou invasão (parte inferior). Dados são apresentados como médias ± SEM; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, comparado com o grupo de CTRL-shRNA.

[0028] A Figura 3 mostra que silenciamento de ROR1 reduz a metástase do câncer da mama após o xenoenxerto de panículo mamário. (A) Diagrama representando a fase I ou II do estudo. (B) Volumes de tumor ao longo do tempo (dias) durante o estágio I. (C) Peso dos tumores extirpados de cada grupo. (D) Fluxo de fóton ex vivo de tumores primários de cada grupo. (E-F) O fluxo de fóton de pulmão in vivo (e) ou fluxo de fóton de fígado (f) de cada camundongo durante o estágio II foi normalizado com fluxo de fóton de tumor primário para cada camundongo. Histogramas retratam o pulmão normalizado e o fluxo de fóton de fígado de cada grupo. (G) O fluxo de fóton de pulmão in vivo durante o estágio II de cada grupo. (H) Barras horizontais indicam fluxo de fóton de pulmão ex vivo médio de camundongos em d21 para cada grupo (à esquerda). Á direita estão imagens de bioluminescência representativas dos pulmões extirpados de cada grupo. (I) Histogramas representam o índice pulmão-peso para cada grupo. (J) Seções do pulmão representativas H&E-coloradas. (H) Barras horizontais indicam fluxo de fóton de fígado ex vivo médio de camundongos em d21 para cada grupo (à esquerda). Á direita estão imagens de bioluminescência representativas de fígados extirpados em d21 de cada grupo. (l) Seções H&E-coloradas representativas do fígado em d21 de camundongos injetados para cada grupo. Dados são mostrados como médias ± SEM. Dados são apresentados como médias ± SEM; P > 0,05 é considerado não significativo (N.S.), *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, comparado com o grupo de CTRL-shRNA.

[0029] A Figura 4 mostra que silenciamento de ROR1 reduz metástase pulmonar experimental e metástase óssea de célula MDA- MB-231 in vivo. A) Curvas de sobrevida de Kaplan-Meier dos camundongos injetados i.v. com 5x105 células CTRL-shRNA- transfectadas ou ROR1-shRNA-transfectadas (P<0,001 pelo teste logrank). (B) O fluxo de fóton de pulmão in vivo de cada grupo ao longo do tempo após injeção (à esquerda). Imagens de bioluminescência representativas dos camundongos de cada grupo são descritas à direita. (C-E) Seções representativas H&E-coloradas do pulmão em (c) d3, (d) d21 e (e) d28. (F) Histogramas de fundo fornecem fluxo de fóton GFP pulmonar ex vivo em d28 para cada grupo. Imagens de bioluminescência representativas dos pulmões extirpados em d28. (G) O índice pulmão-peso de cada grupo em d28 (parte inferior). Fotografias representativas dos pulmões (topo) de cada grupo. (H)Curvas de sobrevida de Kaplan-Meier dos camundongos injetados i.c. com 1x105 células CTRL-shRNA-transfectadas ou ROR1-shRNA-transfectadas (P=0,0017 pelo teste log-rank). (I) Imagens representativas de bioluminescência de camundongos após injeção i.c. de tumor. As caixas brancas definem a área da qual adquirimos os dados de bioluminescência apresentados em (j). (J) Os histogramas fornecem o fluxo de fóton normalizado ósseo in vivo de cada grupo. (K) O fluxo de fóton ósseo ex vivo dos ossos pélvicos extraídos de cada grupo em d21. Imagens de bioluminescência representativas dos ossos pélvicos extraídos são descritas à direita. (L) Seções H&E-coloradas representativas histológicas ósseas de camundongos de cada um. O desenho do camundongo é modificado da referência (30). Dados são apresentados como as médias ± SEM; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, comparado com o grupo de CTRL-shRNA.

[0030] A Figura 5 mostra que um anticorpo anti-ROR1 reduz metástase pulmonar de célula MDA-MB-231 in vivo. (A) D10 mAb provoca a internalização de ROR1. Células MDA-MB-231 foram coloradas com controle-IgG-Alexa647 (vermelho), ou D10-Alexa647 por 30 min no gelo e então mantidas no gelo (azul) ou transferidas para 37 °C durante 1h (laranja) antes da citometria de fluxo. (B) Microscopia confocal das células MDA-MB-231 D10-coloradas (verde) antes e depois da incubação de 1h a 37° C. (C) Células MDA-MB-231 foram tratadas com ou sem controle (-) IgG (IgG) ou D10 para 24h antes da coloração com um anti-ROR1 fluorocromo-marcado sem crossblocking, sem perda de viabilidade. Intensidade de fluorescência média (IFM) de células tratadas é mostrada (***P<0,001 por Análise de Variância simples (One-way ANOVA)). (D) Immunoblots representativos vasculhados à procura de vimentina (topo) ou β-actina (inferior) de lisados preparados a partir de MDA-MB-231 antes (0h) ou após 1, 4, ou 24 h de tratamento com D10 ou IgG de controle. As razões de intensidade de banda entre vimentina e β-actina são fornecidas abaixo. (E) Imunoprecipitados de MDA-MB-231-lisado celular usando controle de IgG (IgG) ou anti-ROR1 (ROR1) foram usados para análises de immunoblot sondadas com anticorpos específicos para vimentina (topo) ou ROR1 (parte inferior). (F) Histogramas fornecem o número de células migradas MDA-MB-231 que foram previamente tratadas por 1h com D10 ou controle de IgG. (G) Á esquerda, histogramas retratando o fluxo de fóton de pulmão in vivo. Á direita, seções H&E-coloradas representativas dos pulmões. (H) O gráfico mostra o fluxo de fóton de pulmão in vivo normalizado. (I) Imagens representativas de bioluminescência de camundongos tumor-injetados tratados com IgG (topo) ou D10 (parte inferior). (J) O histograma retrata o índice pulmão- peso. (K) Seções H&E-coloradas representativas dos pulmões. Dados são apresentados como médias ± SEM; * P < 0,05, **P < 0,01, *** P < 0,001, comparado com o grupo de lgG.

[0031] A Figura 6 mostra os construtos quiméricos usados para mapear o epítopo do anticorpo de ROR1 D10. A parte cara do construto é de camundongo e a parte mais escura é humana.

[0032] A Figura 7 retrata mapeamento de epítopo para o anticorpo D10, que não reage com proteína de ROR1 de camundongo. A proteína de ROR1 humana ou de camundongo têm os resíduos de aminoácidos diferentes em posições de aminoácidos 138, 142 ou 160; a proteína de ROR1 humana tem resíduos de aminoácidos E, S ou Y nessas posições, enquanto a proteína de ROR1 de camundongo tem resíduos de aminoácidos, K, T ou S nas posições de aminoácidos 138, 142 ou 160, respectivamente. Geramos proteínas recombinantes de ROR1 humanas, tendo o resíduo de aminoácido humano ou de camundongo nestas posições somente. Estas proteínas recombinantes foram separadas em gel de poliacrilamida não-desnaturante e depois transferidas para o nylon, que foi sondado com o mAb de D10. Como pode ser visto nesta figura, D10 reage com proteínas recombinantes 1, 3, 4 e 7, mas não 2, 5 ou 6, que são descritas na legenda abaixo. Note- se que a substituição do resíduo de aminoácido humano E na posição 138 da proteína de ROR1 humana com o resíduo de aminoácido de camundongo T na posição 138 revoga ligação de D10.

[0033] A Figura 8 mostra o mapeamento de epítopo para o anticorpo 4A5 de ROR1 anti-humano. A proteína de ROR1 humana ou de camundongo têm os resíduos de aminoácidos diferentes em posições de aminoácidos 88, 105, 109 ou 111; a proteína de ROR1 humana tem resíduos de aminoácidos T, L, S ou I nessas posições, enquanto a proteína de ROR1 de camundongo tem resíduos de aminoácidos, S, I, A ou N nas posições de aminoácidos 88, 105, 109 ou 111, respectivamente. Geramos proteínas recombinantes de ROR1 humanas, tendo o resíduo de aminoácido humano ou de camundongo nestas posições somente. Estas proteínas recombinantes foram separadas em gel de poliacrilamida não-desnaturante e depois transferidas para o nylon, que foi sondado com o 4A5 mAb. Como pode ser visto nesta figura, 4A5 pôde se ligar às proteínas recombinantes, 1, 2, 3, ou 5, mas não 4. Proteína recombinante 4 é a proteína ROR1 humana, mas com o resíduo de aminoácido de camundongo N na posição 111 em vez do resíduo de aminoácido I, que é encontrado na proteína ROR1 humana.

[0034] A Figura 9 demonstra que anticorpo de ROR1 anti-humano D10 inibe a metástase de células de câncer de mama. A-B. O anticorpo monoclonal D10 facilita a internalização do receptor ROR1. C. 24 horas de tratamento com anticorpo anti-ROR1 D10 diminui superfície expressão de ROR1 em células MDA-MB-231. D. ROR1 forma complexo com vimentina em células MDA-MB-231 de câncer de mama. E. Tratamento com anticorpo D10 in vitro poderia diminuir a expressão de vimentina. F. Anticorpos de ROR1 anti-humano diminuem a migração de câncer de mama in vitro. G. O anticorpo monoclonal D10 inibe metástase pulmonar de estágio inicial (dia 2) de câncer de mama de MDA-MB-231. H. O anticorpo monoclonal D10 inibe metástase pulmonar de câncer de mama de MDA-MB-231. I. Camundongos representativos injetados com células 5E5 MDA-MB-231 são mostrados na posição dorsal. J. Tratamento com anticorpo de ROR1 anti-humano reduziu o peso do pulmão de camundongos portadores de MDA-MB- 231. K. Histologia pulmonar de H&E representativa de camundongos portadores de MDA-MB-231 após tratamento com anticorpo anti-ROR1. As barras de erro indicam SEM; *p<0,05, **p<0,01; com base no teste t de Student de dois lados não pareados.

[0035] Figura 10 retrata os anticorpos de alta afinidade gerados contra o epítopo de ROR1 reconhecido por mAbs D10, 99451, 99961 ou 99221. A proteína de ROR1 humana ou de camundongo têm os resíduos de aminoácidos diferentes em posições de aminoácidos 138, 142 ou 160; a proteína de ROR1 humana tem resíduos de aminoácidos E, S ou Y nessas posições, enquanto a proteína de ROR1 de camundongo tem resíduos de aminoácidos, K, T ou S nas posições de aminoácidos 138, 142 ou 160, respectivamente. Geramos proteínas recombinantes de ROR1 humanas, tendo o resíduo de aminoácido humano ou de camundongo nestas posições somente. Estas proteínas recombinantes foram separadas em gel de poliacrilamida não- desnaturante e depois transferidas para o nylon, que foi sondado com cada um dos três mAb, 99451, 99961, ou 99221, como indicado na margem esquerda. Como pode ser visto nesta figura, cada um desses anticorpos reage com proteínas recombinantes 2, 4, 5 e 8, mas não 2, 3, 6 ou 7, que são descritas na legenda abaixo. Note-se que a substituição do resíduo de aminoácido humano E na posição 138 da proteína de ROR1 humana com o resíduo de aminoácido de camundongo T na posição 138 revoga a ligação de 99451, 99961 ou 99221.

[0036] A Figura 11 mostra a atividade de ligação de anticorpos D10 ou 99961 para proteína de ROR1 recombinante ou do tipo selvagem. Vetores codificando proteína de ROR1 humana ou quimérica foram transfectados para 293 células. Isto permitiu produção de proteína de ROR1 quimérica humano-camundongo recombinante que então poderia ser separada por tamanho em um gel PAGE não-desnaturante (à direita) ou gel SDS-PAGE (à esquerda) para análise de immunoblot com mAb anti-ROR1 diferente. Os resultados indicam que ambos anticorpos D10 e 99961 se ligam com a mesma região, no C-terminal do domínio semelhante a Ig, e D10 e 99961 podem se ligar a ROR1 sob condições desnaturadas e nativas. Observe que D10 e 99961 ligam-se a todas as proteínas recombinantes exceto 13. A proteína quimérica #13 é conforme descrito na Figura 6. O domínio extracelular humano completo é fornecido na faixa mais à esquerda de qualquer gel.

[0037] A Figura 12 mostra a caracterização de anticorpo de ROR1 anti-humano 99961. A, B. O anticorpo 99961 foi capaz de bloquear a enxertia de CLL em camundongos transgênicos. C. O anticorpo 99961 tem uma afinidade de ligação aproximadamente 50x maior do que o anticorpo D10.

[0038] A Figura 13 mostra a atividade específica de 99961 contra células CLL em camundongos deficientes imunes de sangue de cordão humano reconstituídos. A. Anticorpo 99961 elimina > 90% das células CLL. B, C. Anticorpo 99961 não tem efeito sobre o desenvolvimento normal de células B ou T.

[0039] A Figura 14 mostra a atividade específica de 99961 em AML primária de ROR+.

[0040] A Figura 15 mostra que o epítopo reconhecido por 99961 não é expresso por células progenitoras ou tronco hematopoiéticas normais.

[0041] A Figura 16 mostra que 99961 não reage cruzado com tecido de adulto normal.

[0042] A Figura 17 mostra estudos PK sobre 99961 em camundongos deficientes imunes.

[0043] A Figura 18 ilustra projeção de uma vacina de peptídeo de ROR1. Três epítopos de anticorpo diferentes foram usados para fazer peptídeos A19, R22 e K19. Acima das barras que correspondem a ROR1 humano (topo) ou de camundongo (inferior), estão barras marcadas A19, R22 ou K19. Estas barras descrevem a localização dos peptídeos, A19, R22 ou K19 no domínio extracelular ROR1.

[0044] A Figura 19 mostra o método usado para conjugar KLH aos peptídeos.

[0045] A Figura 20 mostra o projeto de peptídeo do peptídeo R22. Uma cisteína foi adicionada ao C-terminal do peptídeo para ser usada para conjugar a KLH.

[0046] A Figura 21 mostra que D10 e 99961 se ligam ao peptídeo R22 enquanto 4A5 não.

[0047] A Figura 22 mostra o esquema de imunização para a imunização de R22 de camundongos BALB/c.

[0048] A Figura 23 mostra análise de immunoblot do epítopo a que os anticorpos de ROR1 induzidos por R22 ligam-se em ROR1.

[0049] A Figura 24 mostra o esquema de imunização para R22-KLH em camundongos C57BL/6.

[0050] A Figura 25 mostra a análise de FACS de células de câncer de mama MDA-MB-231 ROR1-positivas que foram incubadas com antissoros anti-R22-KLH a4° C ou a 37° C durante 1 h e então contra- coloradas com anticorpos do isotipo controle-Alexa647-marcas, ou conjugado 4A5-Alexa647 por 30 min no gelo antes da análise de FACS de expressão de ROR1. Os resultados mostraram que os soros anti- ROR1 de camundongos transgênicos induziram internalização de receptor ROR1 a 37° C, mas não a 4° C.

[0051] A Figura 26 mostra que os soros anti-ROR1 de camundongos transgênicos imunizados com R22-KLH inibem a migração de câncer de mama in vitro.

[0052] A Figura 27 mostra o esquema de imunização para R-22- KLH em camundongos C57BL/6.

[0053] A Figura 28 mostra as curvas de titulação de antissoros de camundongos imunizados com conjugados KLH de qualquer um dos três peptídeos descritos na Figura 18. Retratado está os antissoro que se liga às placas de poliestireno revestidas com proteína de ROR1 humano conforme avaliado por ELISA.

[0054] A Figura 29 mostra a análise de FACS de células EW36, JeKo-1 ou CLL. Para este estudo, uma diluição do antissoro de camundongos imunizados com R22-KLH foi incubada com as células por 20 minutos a 4 graus C. As células então foram lavadas e então marcadas com uma Ig anti-camundongo de cabra que foi conjugado com um fluorocromo para a detecção por citometria de fluxo. Os histogramas abertos são as células coloradas com Ig anti-camundongo de cabra sem primeiro incubar as células com os antissoros R22-KLH. Os histogramas sombreados são a fluorescência das células que primeiro foram incubadas com antissoros anti-R22-KLH. O aumento na fluorescência das células é devido aos anticorpos anti-ROR1 de camundongo ligados à superfície, que em seguida foram detectados com Ig anti-camundongo de cabra. Os antissoros pré-imunização destes camundongos ou os antissoros de camundongos imunizados com KLH não se ligam a essas células.

[0055] Figura 30 - as células indicadas na legenda foram lavadas e banhadas em 25μl com 5*105 células por poço em FBS RPMI/10% em placas de 96 poços de fundo redondo (Corning Costar). Os antissoros diluídos (25μl) e 25μl de uma diluição de 1:5 de complemento de bebê coelho foram adicionados por poço. MAb de D10 foi usado como controle positivo. Todas as condições foram realizadas em triplicata. As placas foram incubadas durante 4h a 37° C, e as células foram quantificadas imediatamente para viabilidade pela coloração de DiOC6/PI e Análise de Fluxo Citométrico. Este estudo indica que D10 ou os antissoros gerados contra o peptídeo R22-KLH poderiam dirigir lise mediada por complemento de células portando ROR1 humano. Células que não portavam ROR1 não foram mortas (não mostrado).

[0056] A Figura 31 mostra o primeiro esquema de imunização de R22-KLH para camundongos C57BL/6. Este peptídeo foi conjugado com hemocianina do caranguejo Megathura crenulata (KLH) e usado para imunizar camundongos C57BL/6 de acordo com o esquema ilustrado acima. A primeira injeção de KLH ou R22-KLH foi no adjuvante de Freund completo (CFA). A segunda injeção e as injeções subsequentes foram no adjuvante incompleto de Freund (IFA). Os animais foram sangrados nos dias marcados com a seta roxa. 44 dias após o dia da primeira injeção, os camundongos C57BL/6 foram desafiados com CLL ROR1-humano-expressante que se originou em um camundongo C57BL/6 ROR1-humano-transgênico que também foi transgênico para a leucemia de T-célula 1 (gene TCL1), também sob o controle de um promotor/potenciador específico de célula B (E-Cμ). Esta leucemia se assemelha a CLL humana e expressa ROR1 de superfície humana.

[0057] A Figura 32 mostra os resultados da imunização com R22- KLH. A. Um baço representativo de camundongos imunizados com KLH versus um camundongo imunizado com R22-KLH. B. Inibição da enxertia de ROR1+ CLL pela imunização com peptídeo de ROR1 R22- KLH em camundongos C57BL/6.

[0058] A Figura 33 mostra o segundo esquema de imunização para R22-KLH em camundongos C57BL/6.

[0059] A Figura 34 mostra os resultados da imunização com peptídeo de R22. A. Baços de um camundongo imunizado com KLH e um camundongo imunizado com R22-KLH. B. Inibição da enxertia de ROR1+ CLL após imunização com R22-KLH em camundongos C57BL/6.

[0060] A Figura 35 é análises de FACS de esplenócitos de camundongos C57BL/6 imunizados com KLH (linha superior) ou R22- KLH (linha inferior), usando mAb fluorocromo-conjugada específica para B220 (eixo y) ou ROR1 (eixo x). A mAb usada para colorar as células se liga a um epítopo de não-crossblocking de ROR1 do que os anticorpos induzidos por R22-KLH. A caixa delimita a área em que são detectadas as células de leucemia. Observe que existem muito menos, se houver, células de leucemia nos baços de camundongos imunizados com a vacina de R22-KLH.

[0061] Figura 36 é análise de FACS de ROR1 nas células ROR1+CLL, que indica que ROR1 foi modulado para baixo após a imunização com R22-KLH em camundongos C57BL/6.

[0062] A Figura 37 é análise de FACS de células T CD8+ presentes nos camundongos que foram imunizados com KLH ou R22-KLH. A. Imunização com R22 provoca um aumento do número de células T CD8+, que era ausente em camundongos imunizados com KLH. O painel inferior mostra o percentual de células T CD8+ do baço de camundongos primeiro imunizados 75 dias antes com KLH ou R22-KLH.

[0063] A Figura 38 mostra o esquema de imunização para a imunização de R22-KLH de camundongos transgênicos de ROR1.

[0064] A Figura 39 é análise de FACS da inibição da enxertia de ROR+ CLL pela imunização com peptídeo de ROR1 R22 em camundongos ROR1-Tg.

[0065] A Figura 40 mostra os resultados da imunização com R22- KLH em camundongos transgênicos de ROR1. CLL de ROR1+ foi inibida após imunização com R22-KLH em camundongos transgênicos de ROR1.

[0066] A Figura 41 é análise de FACS de ROR1 nas células CLL de ROR1+, que indica que ROR1 foi modulado para baixo após a imunização com R22-KLH em camundongos transgênicos de ROR1.

[0067] A Figura 42 é análise de FACS de linfócitos T CD3+ presentes nos camundongos ROR1-Tg que foram imunizados com KLH ou R22-KLH. Painel A mostra que a imunização com R22-KLH causou uma proliferação de linfócitos T. Painel B mostra o percentual de linfócitos T CD3+ colhidos dos baços dos camundongos no dia 75.

[0068] A Figura 43 é análise de FACS de células T CD4+ presentes nos camundongos que foram imunizados com KLH ou R22-KLH. O painel A mostra que a imunização com R22-KLH provoca um aumento do número de células T CD4+, que não é detectado em camundongos imunizados com KLH. O painel B mostra o percentual de células T CD4+ colhidas dos baços dos camundongos no dia 75.

[0069] A Figura 44 é análise de FACS de células T CD8+ presentes nos camundongos que foram imunizados com KLH ou R22-KLH. O painel A mostra que a imunização com R22-KLH provoca um aumento do número de células T CD8+, que não é detectado em camundongos imunizados com KLH. O painel B mostra o percentual de células T CD8+ colhidas dos baços dos camundongos no dia 75.

[0070] A Figura 45 mostra que expressão de alto nível de ROR1 no câncer de mama está associada a mais curta sobrevida de pulmão, osso e cérebro livre de metástase. O gráfico foi derivado de dados publicados disponíveis na base de dados PubMed GEO (GSE2603, GSE5327, GSE2034 e GSE12276). Curvas de Kaplan-Meier retratam o impacto prognóstico da expressão de ROR1 na (A) sobrevida livre de metástase do pulmão, (B) sobrevida livre de metástase do osso ou (C) sobrevida livre de metástase cerebral. Para cada análise, 582 casos foram separados em tercis com o grupo designado ROR1H representando o um terço dos pacientes que tinham tumores com os mais altos níveis de mRNA de ROR1 e o grupo designado ROR1L representando o um terço dos pacientes que tiveram câncer com os níveis mais baixos de mRNA de ROR1. O um terço dos pacientes que tinham tumores com expressão intermediária de mRNA de ROR1 foi designado como ROR1M. Sobrevida livre de metástase foi determinada pela análise de Kaplan- Meier e diferenças estatísticas foram determinadas pelo teste log-rank. O número de pacientes em cada categoria, os eventos metastáticos totais e os correspondentes valores de P (teste de qui-quadrado) são mostrados nas tabelas incorporadas.

[0071] A Figura 46 mostra que expressão de alto nível de ROR1 no câncer de mama está associada com menor sobrevida livre de metástase e independente de seu status de ER, PR e HER2. Coorte de 582 pacientes com adenocarcinoma de mama foram incluídos na análise de sobrevida. (A) Comparação dos níveis de expressão de mRNA de ROR1 das células malignas de pacientes com câncer de mama ERNeg (n = 242) e ER+ (n = 325) (painel esquerdo), pacientes com câncer de mama PRNeg (n = 274) e PR+ (n = 271) (painel central) e pacientes com câncer de mama HER2Neg (n = 404) e HER2+ (n = 106) (painel direito). Os resultados são médias ± SEM. O valor de p foi determinada pelo teste t de Student. (B) Impacto prognóstico do status de ER na sobrevida global livre de metástase (P = 0.13 pelo teste logrank). (C) Impacto prognóstico de status ER e expressão de mRNA de ROR1 na sobrevida global livre de metástase (P < 0,0001 pelo teste logrank). (D) Impacto prognóstico do status de PR na sobrevida global livre de metástase (P = 0,0007 pelo teste log-rank). (E) Impacto prognóstico de status PR e expressão de mRNA de ROR1 na sobrevida global livre de metástase (P < 0,0001 pelo teste log-rank). (F) Status de HER2 na sobrevida global livre de metástase (P = 0,16 pelo teste log-rank). (G) Impacto prognóstico de status HER2 e expressão de mRNA de ROR1 na sobrevida global livre de metástase (P < 0,0001 pelo teste log-rank).

[0072] A Figura 47 mostra que a expressão de ROR1 por linhagens celulares de câncer de mama está associada a características de EMT. (A) Immunoblots de lisados de MDA-MB-231 transfectados com CTRL- shRNA ou ROR1-shRNA foram analisados com anticorpos específicos para ROR1 (topo) ou β-actina (parte inferior) conforme indicado no lado esquerdo. (B) Quantidade média de VIM e KRT19 (± SEM), como detectado através de qRT-PCR em amostras triplicadas. Dados são apresentados como médias ± SEM; * P < 0,05, **P < 0,01, comparado com o grupo de CTRL-shRNA.

[0073] A Figura 48 mostra que silenciar ROR1 reduz a expressão de CXCR4. (A) Histogramas indicando a quantidade de mRNA de CXCR4 detectado através de qRT-PCR em amostras triplicadas de MDA-MB-231 transfectadas com CTRL-shRNA2 ou ROR1-shRNA2, conforme indicado na parte inferior de cada histograma. (B) Histogramas de fluorescência de citometria de fluxo representativos de células MDA-MB-231 de ROR1-shRNA2 (histograma aberto com linha verde) ou CTRL-shRNA2 (histograma aberto com linha azul) transduzidas coloradas com mAb anti-CXCR4-APC ou mAb isotipo- controle (histogramas sombreados), respectivamente. (C) Células foram inoculadas em câmaras de topo de transwell sem BD MatrigelTM para examinar quimiotaxia para CXCL12, que adicionada a uma concentração final de 200ng/ml para as câmaras inferiores. As células que migraram depois de seis horas a 37° C foram enumeradas sob ampliação de 10x. Cada um dos histogramas fornece os números de células migradas em cada uma das três câmaras inoculadas com células MDA-MB-231 transfectadas com CNTL-shRNA ou ROR1- shRNA, conforme indicado na parte inferior do histograma. Os resultados são representativos de 3 experimentos independentes. Dados são apresentados como médias ± SEM; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, comparado com o grupo de CTRL-shRNA.

[0074] A Figura 49 mostra que silenciar que ROR1 regula a expressão de genes de EMT. Histogramas indicando a quantidade relativa de mRNA de genes de variedade, conforme indicado na parte inferior de cada histograma, detectados através de qRT-PCR em amostras triplicadas de MDA-MB-231(A), HS578T(B) e BT549(C) transfectadas com CTRL-siRNA ou ROR1-siRNA. Os resultados são representativos de 2 experimentos independentes. Dados são apresentados como médias ± SEM; *P < 0,05, **P < 0,01, comparado com o grupo de CTRL-siRNA.

[0075] A Figura 50 mostra que silenciar ROR1 efetua inibição de crescimento tardio modesta de xenoenxertos ortotópicos no local da injeção mas também forte inibição de metástase pulmonar experimental. (A) RAG-/-YC-/-camundongos receberam subcutâneas (s.c.) ou injeções intravenosas (i.v.) de CTRL-shRNA-transfectadas ou ROR1-shRNA-transfectadas MDA-MB-231. O fluxo de fóton de bioluminescência do tumor primário no panículo adiposo mamário injetado ou do pulmão de cada camundongo foi normalizado contra o fluxo de fóton detectado para a primeira medição após a injeção de tumor (100 representa 100% do fluxo de fótons detectado no dia da medição inicial) (painéis no topo). Os três primeiros gráficos retratam o fluxo de fóton de bioluminescência normalizado dos panículos adiposos de camundongos aos quais foram dadas injeções s.c. de 1*106 (à esquerda), 5*105 (centro) ou 2,5*105 (à direita) células indicadas. Os gráficos inferiores fornecem fluxo de fóton de bioluminescência normalizado do pulmão de camundongos aos quais foram dadas injeções i.v. de 1*106 (à esquerda), 5*105 (centro) ou 2,5*105 células indicadas (à direita). (Nota: o gráfico esquerdo inferior retrata o fluxo de fóton de bioluminescência médio real dos pulmões de camundongos aos quais foram dadas injeções i.v. de 1*106 células indicadas. (B) Os histogramas retratam o índice pulmão-peso para os camundongos de cada grupo no d21 (n=5-8) que foram injetados i.v. com CTRL-shRNA- transfectadas (preto) ou ROR1-shRNA-transfectadas MDA-MB-231 (cinza) ou nenhuma célula (branco). Os valores de P foram determinados por One-Way ANOVA. (C) Seções H&E-marcadas do pulmão representativas dos camundongos de cada grupo em d21. Dados são apresentados como médias ± SEM; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, comparado com o grupo de CTRL-shRNA.

[0076] A Figura 51 mostra a imuno-histoquímica de focos metastáticos experimentais. RAG-/-YC-/-camundongos receberam injeções intravenosas (i.v.) de 5x105 CTRL-shRNA-transfectadas MDA- MB-231 (painéis de topo) ou ROR1-shRNA-transfectadas MDA-MB-231 (painéis inferiores). (A) Seções de pulmão foram preparadas a partir de animais sacrificados no dia 21. Os pulmões de camundongos injetados com células transfectadas com ROR1-shRNA tinham poucos focos metastáticos, que foram identificados para análise imuno-histoquímica. As seções foram coloradas com mAbs específicas para Ki67+, CK-19, ou vimentina ou desoxinucleotidil transferase terminal dUTP nick end labeling (técnica Tunel). (ampliação de 40x). (B) Seções de pulmão como em (a) foram coloradas com mAb específica para fosfo-AKT (painel esquerdo) ou fosfo-CREB (painel direito) (ampliação de 40x).

[0077] A Figura 52 mostra que silenciamento de ROR1 reduz metástase pulmonar e metástase óssea de linhas célula derivadas de MDA-MB-231 LM2-4175 e BoM-1833 in vivo. (A) Diagrama esquemático mostrando que as células LM2-4175 preferencialmente metastatizam para pulmão e células BoM-1833 preferencialmente metastatizam para o osso. Análises de citometria de fluxo mostrando a expressão de ROR1 em LM2-4175 e BoM-1833. Desenhos de camundongos são modificados da referência Cancer Cell, 2009;1;67-78) (B-C). Análises de citometria de fluxo mostrando a eficiência de silenciamento de ROR1 em LM2-4175 e BoM-1833, usando ROR1-shRNA2. (D) Camundongos receberam cada um uma injeção intravenosa de 2x105 células CTRL- shRNA-transfectadas ou ROR1-shRNA-transfectadas LM2-4175. Esquerda, imagens de bioluminescência representativas de cada grupo; Direita, fluxo de fótons in vivo de pulmão normalizado de cada grupo. (E) Curvas de sobrevida de Kaplan-Meier de camundongos injetados i.v. com 2x105 células LM2-4175 indicadas (P < 0,0001 pelo teste logrank). (F) o índice pulmão-peso de cada grupo no d21 (parte inferior). Fotografias representativas dos pulmões (topo) de cada grupo. (G) O fluxo de fóton GFP de pulmão ex vivo de cada grupo no d21 (parte inferior). Fotografias representativas dos ossos (topo) de cada grupo. (H) Seções histológicas H&E-marcadas representativas do pulmão no d21. (I) Os camundongos receberam cada uma injeção i.c. de 1x105 células CTRL-shRNA-transfectadas ou ROR1-shRNA-transfectadas BoM-1833. Topo, imagens de bioluminescência representativas de cada grupo; Parte inferior, fluxo de fóton de osso in vivo normalizado de cada grupo. (J) Fluxo de fótons ex vivo de osso e seções H&E-marcadas histológicas do osso no d21. (K) Fluxo de fóton de fígado ex vivo e seções H&E-marcadas histológicas do fígado no d21. Dados são apresentados como médias ± SEM; * P < 0,05, **P < 0,01, *** P < 0,001, comparado com o grupo de CTRL-shRNA.

[0078] A FIGURA 53 mostra que silenciar ROR1 inibe a migração de HS-578T e BT549 in vitro. Dados são mostrados como os meios ± SEM *P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001, em comparação com as células tratadas com controle de IgG.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0079] A presente invenção refere-se à descoberta seminal de composições e métodos de inibir metástase usando anticorpos anti- ROR1 ou fragmentos de ligação a antígeno respectivos, imunoconjugados de anticorpo de ROR1, vacinas de peptídeo de ROR1 ou peptídeos de ligação a ROR1.

[0080] Antes que as presentes composições e métodos sejam descritos, deve ser entendido que esta invenção não está limitada a composições particulares, a métodos, e a circunstâncias experimentais descritas, porque tais composições, métodos, e circunstâncias podem variar. Deve também ser entendido que a terminologia usada neste documento é para finalidades de descrever modalidades particulares somente, e não está pretendida para ser limitante, uma vez que o escopo da invenção atual será limitado somente nas reivindicações anexadas.

[0081] Como usado neste relatório descritivo e nas reivindicações anexadas, as formas singulares "um" "uma" e "o/a" incluem referências de plurais a menos que o contexto indique claramente de outra forma. Assim, por exemplo, referências a "o método" incluem um ou mais métodos, e/ou etapas do tipo descritas neste documento as quais se tornarão aparentes àquelas pessoas versadas na técnica acerca de ler esta divulgação e assim por diante.

[0082] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado conforme comumente entendido por um versado na técnica ao qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos neste documento também possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferenciais são agora descritos.

ROR1

[0083] Os candidatos anteriormente descobriram expressão de ROR1 completo em numerosas linhagens celulares de câncer e amostras, mas não para outros tecidos, incluindo o sangue ou linfócitos esplênicos de pacientes não-leucêmicos ou doadores adultos normais e também geraram antissoros de camundongo contra ROR1 humano completo. Fukuda et al., Blood: ASH Annual Meeting Abstracts 2004 104, Abstract 772 (2004) (incorporado aqui por referência em sua totalidade). O polipeptídeo e sequências de codificação para ROR1 foram relatados em outros lugares e são também incorporados a adendo por esta referência (ver, por exemplo, N° de adesão. NP_005003.1 e NM_005012.1). As células cancerosas que expressam a proteína Wnt5a, tais como células CLL, não só ligam ROR1, mas tem uma vantagem de sobrevida atribuída como consequência. A invenção, portanto, fornece meios para utilizar a especificidade da expressão de ROR-1 em células de câncer para tratar ou prevenir câncer.

[0084] Mostrou-se que essa expressão de ROR1 aumenta a resistência à apoptose e promove o crescimento de células de câncer. Como mostrado nos exemplos, expressão de ROR1 associa a transição epitelial-mesenquimal (EMT), que ocorre durante a embriogênese e metástase de câncer. Expressão de alto nível de ROR1 associa reforçadas taxas de recaída e metástases em pacientes com adenocarcinoma de mama. Silenciamento de ROR1 em linhagens celulares de câncer de mama propensas a metástase atenuou expressão de proteínas associadas a EMT (por exemplo, vimentina, Snail-1/2 e ZEB), reforçou expressão de citoqueratinas epiteliais e proteínas de junção apertada (por exemplo, CK-19 e ZO-1) e comprometeram sua capacidade de migração/invasão e potencial metastático. Tratamento de MDA-MB-231 com D10, mAb específico para ROR1, vimentina modulada para baixo (que se associa com ROR1) para inibir a migração de células de câncer. Administração de D10 para camundongos imunodeficientes enxertados com MDA-MB- 231 significativamente inibe metástases de tumor.

Anticorpos

[0085] Determinadas modalidades compõem imunopeptídeos dirigido contra a proteína de ROR1 humano. Os peptídeos de imunoglobulina, ou anticorpos, aqui descritos são demonstrados ligando-se à proteína de ROR1. A atividade de ligação de ROR1 é específica; a ligação observada de anticorpo a ROR1 substancialmente não é bloqueada por reagentes não-específicos. Estes anticorpos específicos de ROR1 podem ser usados para diferenciar entre células de ROR1 e as células normais. Os anticorpos específicos de ROR1 também podem ser usados em imunoterapia contra um câncer de ROR1, para determinar a resposta após a terapia para um câncer de ROR-1 e para inibir a metástase. Tais imunopeptídeos podem ser cultivados em uma variedade de meios conhecidos na técnica.

[0086] Como usado aqui, o termo anticorpo engloba todos os tipos de anticorpos e fragmentos de anticorpos, por exemplo, policlonais, monoclonais, e aqueles produzidos por metodologia de Phage display. Anticorpos particularmente preferenciais da invenção são anticorpos que têm um grau relativamente elevado de afinidade com ROR1. Em determinadas modalidades, os anticorpos apresentam uma afinidade com ROR1 de cerca de Kd<10-8 M.

[0087] Substancialmente purificado geralmente refere-se a uma composição que é essencialmente livre de outros componentes celulares com que os anticorpos estão associados em um não- purificada, por exemplo, nativo, estado ou ambiente. Anticorpo purificado é geralmente um estado homogêneo, embora possa ser em um estado seco ou em solução aquosa. Pureza e homogeneidade são normalmente determinadas usando técnicas de química analítica como eletroforese em gel de poliacrilamida ou cromatografia líquida de alta performance.

[0088] Anticorpo substancialmente purificado ROR-1-específico geralmente compreenderá mais de 80% de todas as espécies macromoleculares presentes numa preparação antes da adição ou formulação do anticorpo com um veículo farmacêutico, excipiente, adjuvante, tampão, agente potenciador de absorção, estabilizador, conservante, adjuvante ou outro co-ingrediente. Mais geralmente, o anticorpo é purificado para representar mais que 90% de todas as proteínas presentes em uma preparação purificada. Em modalidades específicas, o anticorpo é purificado para mais de 95% de pureza ou é essencialmente homogêneo enquanto outras espécies macromoleculares não são detectáveis por técnicas convencionais.

[0089] Peptídeos de imunoglobulina incluem, por exemplo, anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais e fragmentos de anticorpos. O que vem a seguir descreve a geração de peptídeos de imunoglobulina, especificamente anticorpos de ROR1 , através de métodos que podem ser usados por aqueles versados na técnica de fazer outros peptídeos de imunoglobulina apropriados tendo especificidade e afinidade semelhante que são funcionalmente equivalentes aos usados nos exemplos.

Anticorpos Policlonais

[0090] Anticorpos policlonais podem ser facilmente gerados por aqueles versados na técnica a partir de uma variedade de animais de sangue quente, tais como cavalos, vacas, diversas aves, coelhos, camundongos ou ratos. Brevemente, antígeno de ROR1 é utilizado para imunizar o animal através de injeções intraperitoneal, intraocular, intramuscular ou subcutânea, com um adjuvante como adjuvante completo ou incompleto de Freund. Após várias imunizações de reforço, amostras de soro são recolhidas e testadas para reatividade para ROR1. Particularmente preferidos antissoros policlonais darão um sinal em um destes ensaios pelo menos três vezes maior que o fundo. Uma vez que o título do animal atingiu um patamar em termos de sua reatividade para ROR1, maiores quantidades de antissoros podem ser facilmente obtidas por sangrias semanais, ou por exsanguinação do animal.

Anticorpos Monoclonais

[0091] Tecnologia de anticorpo monoclonal (mAb) pode ser usada para obter mAbs para ROR1. Brevemente, hibridomas são produzidas usando células de baço de camundongos imunizados com antígenos de ROR1 humano. As células de baço de cada camundongo imunizado são fundidas com células de Sp 2/0 de mieloma do camundongo, por exemplo, usando o método de fusão de polietileno glicol de Galfre, G. e Milstein, C., Methods Enzymol., 73:3-46(1981). Crescimento de hibridomas, seleção no meio HAT, clonagem e triagem de clones contra antígenos são realizadas usando metodologia padrão (Galfre, G. e Milstein, C., Methods Enzymol., 73:3-46(1981)).

[0092] Clones HAT-selecionados são injetados em camundongos para produzir grandes quantidades de mAb em ascite, como descrito por Galfre, G. e Milstein, C., Methods Enzymol., 73:3-46 (1981), que podem ser purificados usando cromatografia de coluna de proteína A (BioRad, Hercules, Califórnia). mAbs são selecionados com base em sua (a) especificidade para ROR-1, (b) afinidade de alta ligação, isotipo (c) e (d) estabilidade.

[0093] Os mAbs podem ser examinados ou testados para especificidade de ROR1 usando qualquer de uma de uma variedade de técnicas padrão, incluindo a Western Blotting (Biochim Koren, E. et al.. Biophys. Acta 876:91-100 (1986)) e ensaio imunoadsorvente ligado à enzima (ELISA) (Koren, E. et al., Biochim. Biophys. Acta 876:91-100 (1986)).

Anticorpos Humanizados

[0094] Formas humanizadas de anticorpos de camundongo podem ser geradas ligando as regiões CDR de anticorpos não-humanos para regiões constantes humanas por técnicas de DNA recombinante (ver, por exemplo, Queenet al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033, 1989 e WO 90/07861, cada qual incorporado por referência). Anticorpos humanos podem ser obtidos usando métodos de Phage display (ver, por exemplo, Dower et al., WO 91/17271; McCafferty et al., WO 92/01047). Nesses métodos, bibliotecas de fago são produzidas em que membros exibem anticorpos diferentes na sua superfície exterior. Os anticorpos são normalmente exibidos como fragmentos de Fab ou Fv. Anticorpos exibindo fago com uma especificidade desejada podem ser selecionados por enriquecimento de afinidade.

Fragmentos de Anticorpo

[0100] Pode ser desejável produzir e usar fragmentos funcionais de um mAb para uma aplicação particular. A bem conhecida estrutura básica de uma molécula de IgG típica é uma molécula simétrica tetramérica em forma de Y de aproximadamente 150.000 a 200.000 daltons, consistindo de duas cadeias leves idênticas de polipeptídeo (contendo cerca de 220 aminoácidos) e duas cadeias pesadas polipeptídicas idênticas (contendo cerca de 440 aminoácidos). Cadeias pesadas estão ligadas umas às outra através de pelo menos uma ligação de dissulfeto. Cada cadeia leve está ligada a uma cadeia pesada contígua por uma ligação de dissulfeto. Um sítio de ligação de antígeno ou domínio situa-se em cada braço da molécula de anticorpo em forma de Y e é formado entre as regiões amino-terminais de cada par cadeias leves e pesadas ligadas por dissulfeto. Estas regiões amino-terminais das cadeias leves e pesadas consistem em aproximadamente seus primeiro 110 aminoácidos amino-terminais e são conhecidas como as regiões variáveis das cadeias leves e pesadas.

[0101] Além disso, no interior das regiões variáveis das cadeias leves e pesadas há regiões hipervariáveis que contêm trechos de sequências de aminoácidos, conhecidas como regiões determinantes de complementaridade (CDRs). CDRs são responsáveis pela especificidade do anticorpo para um sítio específico sobre uma molécula de antígeno chamada um epítopo. Assim, a molécula de IgG típica é divalente no sentido em que pode ligar duas moléculas de antígeno porque cada sítio de ligação de antígeno é capaz de ligar o epítopo específico de cada molécula do antígeno. As regiões de carboxi terminal das cadeias leves e pesadas são semelhantes ou idênticas às de outras moléculas do anticorpo e são chamadas de regiões constantes. A sequência de aminoácidos da região constante das cadeias pesadas de um anticorpo específico define que tipo de anticorpo é, por exemplo, IgG, IgD, IgE, IgA ou IgM. Algumas classes de anticorpos contêm dois ou mais idênticos anticorpos associados uns aos outros em arranjos de ligação de antígeno multivalentes.

[0102] Fragmentos Fab e F(ab')2 de mAbs que ligam ROR-1 podem ser usados no lugar de mAbs por completo. Porque fragmentos Fab e F(ab')2 são menores do que moléculas de anticorpo intactas, mais domínios de ligação de antígeno estão disponíveis do que quando moléculas de anticorpo inteiras são usadas. Clivagem proteolítica de uma molécula IgG típica com papaína é conhecida para produzir dois fragmentos de ligação de antígeno separados chamados fragmentos Fab os quais contêm uma cadeia leve intacta ligada a uma parcela terminal de amino da cadeia pesada contígua através de ligação dissufeto. A parcela restante da molécula de imunoglobulina de papaína-digerida é conhecida como o fragmento Fc e consiste nas parcelas de carboxi terminal de anticorpo à esquerda intacto e ligado junto através de ligações de dissulfeto. Se um anticorpo for digerido com pepsina, um fragmento conhecido como um fragmento F(ab')2 é produzido o qual carece a região Fc mas contem ambos domínios de ligação de antígeno prendidos juntos por ligações de dissulfeto entre cadeias leves e pesadas contíguas (como em fragmentos Fab) e também ligações dissulfeto entre as parcelas restantes das cadeias pesadas contíguas (Handbook of Experimental Immunology. Vol 1: Immunochemistry, Weir, D. M., Editor, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1986)).

[0103] Foram desenvolvidos métodos de DNA recombinante que permitem a produção e seleção de peptídeos recombinantes de imunoglobulina que são polipeptídeos de cadeia única antígeno-ligantes conhecidos como fragmentos de Fv de cadeia única (anticorpos ScFvs ou ScFv). Além disso, ScFvs pode ser dimerizados para produzir um diabody. ScFvs ligam um epítopo específico de interesse e podem ser produzidos usando qualquer de uma variedade de métodos baseados em fago bacterianos recombinantes, por exemplo, como descrito em Lowman et al. (1991) Biochemistry, 30, 10832-10838; Clackson et al. (1991) Nature 352, 624-628; e Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6378-6382. Estes métodos baseiam-se geralmente na produção do fago filamentoso geneticamente alterado, tais como fagos M13 recombinante ou fd, que exibem na superfície da partícula de fago uma proteína de fusão recombinante contendo o anticorpo de ScFv antígeno-ligante como região amino terminal da proteína de fusão e a proteína menor de revestimento de fago g3p como região carboxi terminal da proteína de fusão. Tais fagos recombinantes podem ser facilmente cultivados e isolados usando métodos bem conhecidos do fago. Além disso, as partículas de fago intactas geralmente podem ser rastreadas diretamente para a presença (display) de um ScFv de ligação de antígeno em sua superfície, sem necessidade de isolar o ScFv longe da partícula fago.

[0104] Para produzir um scFv, protocolos padrão de transcriptase reversa padrão são usados para primeiro produzir cDNA do mRNA isolado de um hibridoma que produz um mAb para se direcionar ao antígeno de ROR1. As moléculas cDNA que codificam as regiões variáveis das cadeias pesadas e leves do mAb podem então ser amplificadas pela metodologia de reação de cadeia de polimerase padrão (PCR) usando um jogo de iniciadores para regiões variáveis de cadeia pesadas e leves de imunoglobulina de camundongo (Clackson (1991) Nature, 352, 624-628).. Os cDNAs amplificados que codificam regiões variáveis de cadeia pesada e leve mAb são ligados então junto com um vinculador de oligonucleotídeo no intuito de gerar uma molécula de DNA de scFv recombinante. O DNA de scFv é ligado em um plasmídeo de fago filamentoso projetado para fundir as sequências de cDNA amplificadas na 5' região do gene fago que codifica a proteína menor de revestimento chamada g3p. células bacterianas de Escherichia coli são então transformadas com os plasmídeos de fagos recombinantes, e fago filamentoso cultivado e recolhido. Os fagos recombinantes desejados indicam domínios de ligação de antígeno fundidos à região amino terminal da proteína menor de revestimento. Tais "display phages" podem então ser passados sobre o antígeno imobilizado, por exemplo, usando o método conhecido como "panning", ver Parmley e Smith (1989) Adv. Exp. Med. Biol. 251, 215-218; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6378-6382, para absorver aquelas partículas de fago que contêm proteínas de anticorpo de scFv que são capazes de se ligar a antígeno. As partículas de fago de ligação de antígeno podem então ser amplificadas por métodos padrão de infecção de fago padrão, e a população de fago recombinante amplificada selecionada outra vez para habilidade de ligação de antígeno. Tais rodadas sucessivas de seleção para habilidade de ligação de antígeno, seguido pela amplificação, selecionam por habilidade antígeno-ligante potenciada nos scFvs indicados em fagos recombinantes. Seleção para maior capacidade de ligação de antígeno pode ser feita ajustando as condições sob as quais ligação toma lugar para requerer uma atividade de ligação mais firme.

[0105] Outro método para selecionar atividade de ligação de antígeno aprimorada é alterar sequências de nucleotídeos dentro de cDNA codificando domínio de ligação do scFv e sujeitar populações de fago recombinante a sucessivas rodadas de seleção para atividade e amplificação de ligação de antígeno (ver Lowman et al. (1991) Biochemistry 30, 10832-10838; e Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 87, 6378-6382).

[0106] Uma vez que ScFv é selecionado, o anticorpo de ROR1 recombinante pode ser produzido em uma forma livre, usando um vetor apropriado em conjunto com a cepa de E. coli HB2151. Estas bactérias secretam na verdade scFv em uma forma solúvel, livre de componentes de fago (Hoogenboom et al. (1991) Nucl. Acids Res. 19, 4133-4137). A purificação de scFv solúvel do meio de cultura de bactérias HB2151 pode ser realizada por cromatografia de afinidade, usando moléculas de antígeno imobilizadas em um suporte sólido como AFFIGEL™ (BioRad, Hercules, Califórnia).

[0107] Outros desenvolvimentos na tecnologia de anticorpos recombinantes demonstram possibilidades para melhorias adicionais, tais como maior avidez de ligação por polimerização de ScFvs em dímeros e tetrâmeros (ver Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448).

[0108] Porque ScFvs são moléculas ainda menores do que fragmentos Fab ou F(ab')2, podem ser usados para atingir densidades ainda maiores dos sítios de ligação de antígeno por unidade de área de superfície quando imobilizados em um material de suporte sólido do que possível usando anticorpos inteiros, fragmentos F(ab')2 ou Fab. Além disso, tecnologia de anticorpo recombinante oferece uma fonte genética mais estável de anticorpos, em comparação com hibridomas. Anticorpos recombinantes também podem ser produzidos mais rapidamente e economicamente usando métodos de produção padrão de fago bacteriano.

[0109] Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, fragmentos imunoespecíficos, variantes ou derivados dos mesmos da invenção incluem, mas não estão limitados a, anticorpos policlonais, monoclonais, multiespecíficos, humanos, humanizados, primatizados, murinizados ou quiméricos, anticorpos de cadeia única, fragmentos de ligação ao epítopo, por exemplo, Fab, Fab' e F(ab')2, Fd, Fvs, Fvs de cadeia única (scFv), anticorpos de cadeia única, Fvs ligados por dissulfeto (sdFv), fragmentos que compreendem o domínio VL ou VH, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, e anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id) (incluindo, por exemplo, anticorpos anti-Id para os anticorpos ROR1 divulgados neste documento). As moléculas de ScFv são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, na patente US 5.892.019. As moléculas de imunoglobulina ou de anticorpo da invenção podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse da molécula de imunoglobulina. Exemplos de ScFv para ROR1 humano e exemplos de SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 e SEQ ID NO:24.

[0110] Fragmentos de anticorpo, incluindo anticorpos de cadeia única, podem compreender a(s) região(ões) variável(eis) sozinha(s) ou em combinação com a totalidade ou uma porção dos seguintes: região de dobradiça, domínios CH1, CH2 e CH3. Também incluídos na invenção estão os fragmentos de ligação a antígeno que também compreendem qualquer combinação de região(ões) variável(is) com uma região de dobradiça, domínios CH1, CH2 e CH3. Os anticorpos ou seus fragmentos imunoespecíficos da presente invenção podem ser de qualquer origem animal, incluindo pássaros e mamíferos. De preferência, os anticorpos são anticorpos humanos, murinos, de burro, de coelho, de cabra, de porco da Guiné, de camelo, de lhama, de cavalo ou de frango. Em outra modalidade, a região variável pode ser condricthoid na origem (por exemplo, de tubarões). Como usados neste documento, anticorpos "humanos" incluem anticorpos tendo a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana e incluem anticorpos isolados de bibliotecas de imunoglobulina humana ou de animais transgênicos para uma ou mais imunoglobulinas humanas e que não expressam imunoglobulinas endógenas, como descrito infra e, por exemplo, em Pat. U.S. N° 5.939.598, de Kucherlapati et al.

Produção de Anticorpos Recombinantes

[0111] Para produzir anticorpos descritos neste documento recombinantemente, ácidos nucleicos codificando regiões variáveis de cadeia leve e pesada, opcionalmente ligadas às regiões constantes, são inseridos em vetores de expressão. As cadeias leves e pesadas podem ser clonadas em vetores de expressão iguais ou diferentes. Por exemplo, as cadeias pesadas e leves de SEQ ID NOs: 1-5 podem ser usadas de acordo com a presente invenção. Os ensinamentos da Patente U.S. N° 6.287.569 Kipps et al, incorporados neste documento por referência na sua totalidade, e os métodos providos neste documento podem ser adaptados facilmente por aqueles versados na técnica para criar as vacinas da presente invenção. Os segmentos de DNA codificando cadeias de anticorpo estão operavelmente ligados a sequências de controle no(s) vetor(es) de expressão que garantem a expressão das cadeias de anticorpo. Tais sequências de controle podem incluir uma sequência de sinal, um promotor, um potenciador e uma sequência de terminação da transcrição.

[0112] Vetores de expressão são tipicamente replicáveis em organismos hospedeiros como epissomas ou como parte integral do cromossomo hospedeiro. Escherichia coli é um hospedeiro procariótico particularmente útil para expressar anticorpos da presente invenção. Outros hospedeiros microbianos adequados para uso incluem bacilos, tais como Bacillus subtilus e outras enterobactérias, tais como Salmonela, Serrátia e várias espécies de Pseudomonas. Nesses hospedeiros procarióticos, também se pode fazer vetores de expressão, os quais normalmente contêm sequências de controle de expressão compatíveis com a célula hospedeira (por exemplo, uma origem de replicação) e sequências reguladoras tais como um sistema promotor de lactose, um sistema promotor do triptofano (trp), um sistema promotor de beta-lactamase ou um sistema promotor do fago lambda. Outros micróbios, tais como levedura, também podem ser utilizados para expressão. Saccharomyces é um hospedeiro preferencial, com vetores adequados tendo sequências de controle de expressão, como promotores, incluindo 3-fosfoglicecamundongo quinase ou outras enzimas glicolíticas e uma origem de replicação, sequências de terminação semelhantes como desejado. Cultura de células de tecidos de mamíferos também pode ser usada para expressar e produzir os anticorpos da presente invenção (ver, por exemplo, Winnacker, From Genesto Clones VCH Publishers, N.Y., 1987). Células eucarióticas são preferidas, porque um número de linhagens celulares hospedeiras adequadas capazes de secretar anticorpos intactos foi desenvolvido. Células hospedeiras adequadas preferidas para expressar ácidos nucleicos codificando imunoglobulinas da invenção incluem: linha CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linha de rim embrionário humano; células de rim de hamster bebê (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês (CHO); células de sertoli de camundongo; células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL 1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de camundongo búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (060562 MMT, ATCC CCL51); e células TRI.

[0113] Os vetores que contém as sequências de polinucleotídios de interesse (por exemplo, as sequências de codificação de cadeia leve e pesada e sequências de controle de expressão) podem ser transferidos para a célula hospedeira. Transfecção de cloreto de cálcio é comumente utilizada para células procarióticas, enquanto que tratamento de fosfato de cálcio ou eletroporação pode ser usado para outros hospedeiros celulares (ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 2nd ed., 1989). Quando cadeias pesadas e leves são clonadas em vetores de expressão separados, os vetores são co-transfectados para se obter a expressão e reunião de imunoglobulinas intactas. Após introdução de DNA recombinante, linhas celulares expressando produtos de imunoglobulina são célula-selecionadas. Linhagens celulares capazes de expressão estável são preferidas (ou seja, níveis inalterados de expressão depois de cinquenta passagens da linha celular).

[0114] Uma vez expressos, os anticorpos inteiros, seus dímeros, cadeias leves e pesadas individuais, ou outras formas de imunoglobulina da presente invenção podem ser purificados de acordo com os procedimentos padrão da técnica, incluindo a precipitação do sulfato de amônio, colunas de afinidade, cromatografia de coluna, eletroforese de gel e afins (ver, por exemplo, Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982). Imunoglobulinas substancialmente puras de pelo menos cerca de 90 a 95% de homogeneidade são preferidas, e 98 a 99% ou mais de homogeneidade mais preferido. Múltiplos anticorpos específicos, imunoconjugados de anticorpo e moléculas de fusão.

[0115] Anticorpos de ROR1 ou fragmentos antígeno-ligantes, variantes ou derivados respectivos da invenção podem ser "mutliespecíficos", por exemplo, biespecíficos, triespecíficos ou de multiespecidade maior, significando que reconhece e liga-se a dois ou mais diferentes epítopos presentes em um ou mais antígenos diferentes (por exemplo, proteínas) ao mesmo tempo. Assim, se um anticorpo de ROR1 é "monoespecífico" ou "multiespecífico", por exemplo, "biespecífico", refere-se ao número de epítopos diferentes com o qual reage um polipeptídeo de ligação. Anticorpos multiespecíficos podem ser específicos para diferentes epítopos de um polipeptídeo alvo aqui descrito ou podem ser específicos para um polipeptídeo alvo tanto quanto um epítopo heterólogo, tais como um polipeptídeo heterólogo ou material de suporte sólido.

[0116] Como usado aqui o termo "valência" refere-se ao número domínios de ligação potenciais de, por exemplo, domínios de ligação de antígeno, presentes em um anticorpo de ROR1, polipeptídeo de ligação ou anticorpo. Cada domínio de ligação especificamente liga um epítopo. Quando um anticorpo de ROR1, polipeptídeo de ligação ou anticorpo compreende mais de um domínio de ligação, cada domínio de ligação pode especificamente ligar o mesmo epítopo, para um anticorpo com dois domínios de ligação, denominado "monoespecífico bivalente", ou para diferentes epítopos, para um anticorpo com dois domínios de ligação, denominado "bivalente biespecífico." Um anticorpo pode também ser biespecífico e bivalente para cada especificidade (denominado "anticorpos tetravalentes biespecíficos"). Em outra modalidade, podem ser feitos minicorpos tetravalente ou anticorpos de domínio deletado.

[0117] Anticorpos bivalentes biespecíficos e métodos de fazê-los são descritos, por exemplo, em Pat. U.S. N° 5.731.168; 5.807.706; 5.821.333; e Pedidos de Patente U.S. Publ N° 2003/020734 e 2002/0155537, as divulgações de todos os quais são incorporadas por referência neste documento. Anticorpos biespecíficos tetravalentes e métodos de fazê-los são descritos, por exemplo, em WO 02/096948 e WO 00/44788, as divulgações de ambas as quais são incorporadas por referência neste documento. Em geral, consulte publicações PCT WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt et al, J. Immunol. 147:60-69 (1991); Pat. U.S. N° 4.474.893; 4.714.681; 4.925.648; 5.573.920; 5.601.819; Kostelny et al, J. Immunol. 148:15471553 (1992).

[0118] A presente invenção inclui anticorpos de ROR1 multiespecíficos. Por exemplo, um anticorpo biespecífico composto de dois fragmentos de anticorpos de scFv, ambos os quais ligam ROR1. Os fragmentos de anticorpos de scFv podem ligar os mesmos ou diferentes epítopos em ROR1. Como um exemplo adicional, o anticorpo multiespecífico pode ser um diabody que liga os epítopos dos anticorpos com uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste de SEQ ID nO:1. SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:39 ou SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO:3. SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:41 ou SEQ ID NO:45.

[0119] A invenção ainda estende-se a proteínas de fusão. As proteínas de fusão são moléculas quiméricas que compreendem, por exemplo, um domínio de ligação a antígeno da imunoglobulina com pelo menos um sítio de ligação alvo, e pelo menos uma porção heteróloga, isto é, uma porção a qual não está naturalmente ligado na natureza. As sequências de aminoácidos podem normalmente existir em proteínas separadas que são reunidas no polipeptídeo de fusão ou elas podem normalmente existir na mesma proteína, mas são colocadas em um novo arranjo no polipeptídeo de fusão. As proteínas de fusão podem ser criadas, por exemplo, por meio de síntese química, ou por meio da criação e tradução de um polinucleotídeo em que as regiões de peptídeos são codificadas na relação desejada.

[0120] Os anticorpos de ROR1, ou fragmentos de ligação de antígenos, variantes, ou seus derivados da invenção podem ainda ser recombinantemente fundidos a um polipeptídeo heterólogo no terminal N- ou C- ou quimicamente conjugados (incluindo conjugações covalentes e não covalentes) para polipeptídeos ou outras composições. Por exemplo, anticorpos específicos de ROR1 podem ser recombinantemente fundidos ou conjugados a moléculas úteis como marcas em ensaios de detecção e moléculas efetoras como polipeptídeos heterólogos, drogas, radionuclídeos ou toxinas. Veja, por exemplo, publicações PCT WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; Pat. U.S. N° 5.314.995; e EP 396.387. Anticorpos de ROR1 radiomarcados da invenção serão particularmente úteis, enquanto conjugados de drogas e anticorpo (ADCs) continuam a ser desenvolvidos.

[0121] Os anticorpos de ROR1, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos da invenção também incluem derivados que são modificados, por exemplo, pela anexação covalente de qualquer tipo de molécula ao anticorpo, tal que a anexação covalente não impede que o anticorpo se ligue a ROR1. Por exemplo, mas não a título de limitação, os derivados do anticorpo incluem anticorpos que foram modificados, por exemplo, por glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um ligante celular ou a outra proteína, etc. Qualquer uma das inúmeras modificações químicas pode ser realizada por técnicas conhecidas, incluindo, mas não se limitando a clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina etc. Adicionalmente, o derivado pode conter um ou mais aminoácidos não clássicos.

[0122] Anticorpos ROR1, ou fragmentos de ligação de antígenos, variantes, ou seus derivados da invenção podem ser compostos de aminoácidos unidos entre si por meio de ligações de peptídeos ou ligações de peptídeos modificados, ou seja, peptídeos isósteros, e podem conter aminoácidos que não são os 20 aminoácidos codificados por gene. Os anticorpos ROR1-específicos podem ser modificados por meio de processos naturais, tal como o processamento pós- translacional, ou por meio de técnicas de modificação química que são bem conhecidas na técnica. Tais modificações são bem descritas em textos básicos e em monografias mais detalhadas, bem como em uma literatura de pesquisa volumosa. Modificações podem ocorrer em qualquer lugar do anticorpo ROR1-específico, incluindo a estrutura principal do peptídeo, as cadeias laterais do aminoácido e os terminais amino ou carboxila, ou em frações tais como carboidratos. Será apreciado que o mesmo tipo de modificação pode estar presente em graus iguais ou diferentes em vários locais em um determinado anticorpo ROR1-específico.

[0123] A presente invenção também fornece proteínas de fusão que compreendem um anticorpo de ROR1, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou derivado do mesmo, e um polipeptídeo heterólogo. O polipeptídeo heterólogo ao qual o anticorpo é fundido pode ser útil para a função ou é útil para tomar por alvo as células expressando polipeptídeo de ROR1. Em uma modalidade, uma proteína de fusão da invenção compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em, um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido de qualquer uma ou mais das regiões VH de um anticorpo da invenção ou a sequência de aminoácido de uma ou mais das regiões VL de um anticorpo da invenção ou fragmentos ou variantes do mesmo, e uma sequência polipeptídica heteróloga.

[0124] Em outra modalidade, uma proteína de fusão para uso em métodos de tratamento divulgados neste documento compreende um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de qualquer um, dois, três dos VH-CDRs selecionados do grupo que consiste de SEQ ID NO:27, SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO:29 de um anticorpo específico de ROR1, ou fragmentos, variantes ou seus derivados, ou a sequência de aminoácidos de qualquer um, dois, três dos VL-CDRs selecionados do grupo constituído de SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31 e SEQ ID NO:32 de um anticorpo específico de ROR1, ou fragmentos, variantes ou seus derivados e uma sequência heteróloga de polipeptídeo. Em uma modalidade, a proteína de fusão compreende um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido de uma VH-CDR3 de um anticorpo ROR1- específico da presente invenção, ou fragmento, derivado ou variante do mesmo, e uma sequência polipeptídica heteróloga, cuja proteína de fusão se liga especificamente a pelo menos um epítopo de ROR1. Em outra modalidade, uma proteína de fusão compreende um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido de pelo menos uma região VH de um anticorpo ROR1-específico da invenção e a sequência de aminoácido de pelo menos uma região VL de um anticorpo ROR1-específico da invenção ou fragmentos, derivados ou variantes do mesmo, e uma sequência polipeptídica heteróloga. De preferência, as regiões VH e VL da proteína de fusão correspondem a um anticorpo de única fonte (scFv ou fragmento Fab) que se liga especificamente ao menos um epítopo de ROR1. Ainda em outra modalidade, uma proteína de fusão para uso nos métodos de diagnóstico e de tratamento divulgados neste documento compreende um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido de qualquer uma, duas, três ou mais das VH-CDRs de um anticorpo ROR1-específico e a sequência de aminoácidos de qualquer uma, duas, três ou mais das VL-CDRs de um anticorpo ROR1- específico, ou fragmentos ou variantes do mesmo, e uma sequência polipeptídica heteróloga. De preferência, dois, três, quatro, cinco, seis ou mais dos VH-CDR(s) ou VL-CDR(s) correspondem à única fonte de anticorpos (ou scFv ou fragmento Fab) da invenção. As moléculas de ácido nucleico que codificam essas proteínas de fusão também são abrangidas pela invenção.

[0125] Proteínas de fusão podem ser preparadas usando métodos que são bem conhecidas na técnica; ver, por exemplo, patente US N° 5.116.964 e 5.225.538). O sítio preciso em que a fusão é feita pode ser selecionado empiricamente para otimizar as características de secreção ou ligação da proteína de fusão. O DNA que codifica a proteína de fusão é então transfectado para dentro de uma célula hospedeira para a expressão.

[0126] A invenção prevê um anticorpo de ROR1 anti-humano particularmente preferencial; ou seja, um anticorpo anti-ROR1 isolado tendo a mesma especificidade de ligação como o anticorpo 99961. Em um aspecto, o anticorpo liga-se ao domínio semelhante a lg, que é contíguo com o domínio CRD de ROR-1. Em um aspecto adicional, o anticorpo liga-se aos aminoácidos 42-160 de hROR1. Em um outro aspecto, o anticorpo liga-se aos aminoácidos 130-160 de ROR-1. Em outro aspecto, o anticorpo requer a presença de ácido glutâmico na posição 138 de hROR1 para ligação

[0127] Em uma modalidade adicional, a invenção prevê um anticorpo anti-ROR1 isolado que compreende uma região de cadeia pesada variável selecionada do grupo constituído por SEQ ID. NO:1, SEQ ID. NO:5, SEQ ID. NO:9, SEQ ID. NO:13 e SEQ ID. NO:17 e a região variável de cadeia leve é selecionada do grupo constituído por SEQ ID. NO:3, SEQ ID. NO:7, SEQ ID. NO:11, SEQ ID. NO:15 e SEQ ID. NO:19. Em um aspecto, o anticorpo de acordo com a região variável de cadeia pesada é SEQ ID NO:5 e a região variável de cadeia leve é SEQ ID NO:7.

[0128] Em uma modalidade, a invenção engloba um anticorpo de ROR1 anti-humano isolado que compreende uma região de cadeia pesada variável constituída de CDR1, CDR2 e CDR3 selecionados do grupo constituído por SEQ ID. NO:27, SEQ ID. NO:28, SEQ ID. NO:29, SEQ ID. NO:33, SEQ ID NO:34 e SEQ ID. NO:35 e a região variável de cadeia leve constituída de CDR1, CDR2 e CDR3 selecionados do grupo constituído por SEQ ID. NO:30, SEQ ID. NO:31, SEQ ID. NO:32, SEQ ID. NO:36, SEQ ID NO:37 e SEQ ID. NO:38. Em um aspecto a região variável de cadeia pesada composta de CDR1, CDR2 e CDR3 é constituída de SEQ ID. NO:27, SEQ ID. NO:28 e SEQ ID. NO:29 e a região variável de cadeia leve constituída de CDR1, CDR2 e CDR3 selecionados do grupo constituído por SEQ ID. NO:30, SEQ ID. NO:31 e SEQ ID. NO:32.

[0129] Em outra modalidade, a invenção prevê um anticorpo de ROR-1 anti-humano com uma afinidade de ligação superior a 41 nM. Em um aspecto, a afinidade de ligação do anticorpo é entre cerca de 500 pM e cerca de 6 nM. Em um aspecto, a afinidade de ligação do anticorpo é cerca de 800 pM.

[0130] Em outro aspecto, o anticorpo inibe metástases. Em um aspecto adicional, o anticorpo internaliza e inibe a migração celular. Em um outro aspecto, o anticorpo internaliza e modula para baixo vimentina, snail1/2 ou ZEB. Em outro aspecto, o anticorpo é humano, humanizado ou quimérico. Em um aspecto, o anticorpo é 99961, 99961.1, 99961.2, 99961.3 ou 99961.4. Em um aspecto preferencial, o anticorpo é 99961.1.

[0131] Uma modalidade da invenção fornece uma formulação farmacêutica compreendendo o anticorpo contra ROR1 e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade adicional, a invenção fornece um ácido nucleico isolado codificando o anticorpo contra ROR1. Em outra modalidade, a invenção prevê um vetor de expressão compreendendo o ácido nucleico de acordo com o ácido nucleico codificando um anticorpo contra ROR1. Em uma modalidade adicional, a invenção prevê uma célula hospedeira que compreende o ácido nucleico codificando um anticorpo contra ROR1. Em outra modalidade, a invenção fornece um método de produzir um anticorpo anti-ROR1 compreendendo cultivo das células hospedeiras em condições de produzir o anticorpo. Em um aspecto, o método de produção de um anticorpo ainda compreende recuperar o anticorpo.

[0132] Como mostrado nos exemplos, anticorpo anti-ROR1 D10 inibe enxerto de CLL humano e de camundongo, pode direcionar citotoxicidade complemento-dependente, induz a redução significativa da carga leucêmica e bloqueia metástase de células de câncer de mama ao pulmão e osso.

[0133] D10 foi mostrado tendo atividade biológica, enquanto outros anticorpos anti-ROR1 conhecidos (por exemplo, 4A5 e K19) não apresentam atividade biológica apesar de 4A5 ter uma significativamente maior afinidade de ligação com ROR1. Anticorpo 4A5 foi mostrado se ligando a diferentes epítopos de D10. Também tem sido demonstrado que em um subconjunto de pacientes com câncer, em que o câncer é ROR+, antissoros para ROR1 são produzidos. Um subconjunto mais dos pacientes faz anticorpos que inibem a atividade de Wnt5a, conduzindo assim à conclusão de que nem todos os anticorpos de ROR1 tem atividade biológica.

[0134] Conforme descrito adicionalmente nos exemplos, mapeamento de epítopo foi realizado para determinar o epítopo de D10 e 4A5. Estes estudos determinaram que D10 liga um epítopo no C- terminal do domínio semelhante a Ig que é contíguo com o CRD em ROR1. O epítopo para 4A5 também foi mapeado para o domínio semelhante a Ig, mas mais perto do terminal amino do domínio. Estes resultados levaram à conclusão de que anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo como D10 inibirão a atividade biológica de ROR1 enquanto os anticorpos que se ligam em outro lugar talvez não.

[0135] Como mostrado nos exemplos, anticorpos de alta afinidade, ou seja, 99961, foram derivados usando o epítopo D10 para selecionar anticorpos recombinantes de alta afinidade. Dentre os anticorpos selecionados, 99961 tem uma significativamente maior afinidade de ligação para ROR1 que D10. O anticorpo 99961 tem 50x maior afinidade de ligação do que D10, ou seja, 800 pM v. 41 nM. Além disso, 99961 foi humanizado gerando quatro diferentes anticorpos. Experiências confirmaram que 99961 tem o mesmo epítopo como D10. Experiências confirmaram que este epítopo não é expresso em células tronco e progenitoras hematopoiéticas normais. Além disso, 99961 não reage cruzado com tecidos de adultos normais. Este anticorpo também demonstrou atividade contra células CLL, atividade em AML primária de ROR+ e indução de internalização de ROR1.

Vacinas

[0136] Além disso, a invenção fornece uma vacina para o tratamento ou prevenção de câncer ou a inibição da metástase em um sujeito que consiste de uma composição farmaceuticamente aceitável de um isolado ou sinteticamente produzido peptídeo de ligação de ROR1. A invenção também prevê um peptídeo de ligação de ROR1 com pelo menos 95% de identidade de sequência para a região de ligação de ROR-1 de D10. Em um outro aspecto, a invenção prevê um peptídeo de ligação de ROR1 com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para a região de ligação de D10. Em um aspecto, a região de ligação de D10 é VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC. Em um aspecto adicional, a região de ligação de D10 é EVVSSTGVLFVKFGPC. Em um aspecto região de ligação de D10 é pelo menos 22 aminoácidos. Em um outro aspecto, a região de ligação de D10 é pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 20, 21 ou 22 aminoácidos.

[0137] A presente invenção também prevê utilização de vacinas de peptídeo de ligação de ROR1 contra doenças, como um linfoma, por exemplo, CLL, que envolvem a expressão de ROR1. Porque tecidos adultos normais não parecem expressar ROR-1, representa um antígeno tumor-específico que pode ser direcionado em terapia imune ativa. Por exemplo, os níveis de ROR1 podem ser regulados para baixo pela administração ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina de peptídeo de ligação de ROR1 que produz nos animais uma resposta imune protetora ou terapêutica contra ROR1 e os efeitos de sua expressão. As vacinas podem incluir peptídeos. Métodos de usar tais peptídeos incluem o uso em vacinas e para a geração de anticorpos contra ROR1. O peptídeo de ligação de ROR1 também pode incluir um adjuvante imunológico. O imunoadjuvante pode ser uma fração transportadora imunogênica, conjugada com o peptídeo de ligação. Em um aspecto, a fração transportadora imunogênica é um peptídeo. Exemplos de um veículo adequado para a vacina ainda compreende um adjuvante imunogênico. Em um outro aspecto, o adjuvante é uma fração transportadora imunogênica conjugada com o peptídeo de ligação. A fração transportadora imunogênica pode ser um peptídeo veículo, como a hemocianina do caranguejo Megathura crenulata (KLH), albumina de soro bovino (BSA), a ovalbumina, hidróxido de alumínio ou outro adjuvante imunológico farmaceuticamente aceitável. Exemplos de adjuvantes imunes farmaceuticamente aceitáveis podem ser encontrados em Methods in Molecular Medicine, Vol. 42: Vaccine adjuvants: Preparation, Methods and Research Protocols; Editado D. T. O’Hagan; Humana Press Inc., Totowa NJ e European Agency for the Evaluation of Medicinal Products, Committee for Proprietary Medicinal Products, Guidelines on Adjuvants in Vaccines, Londres 2004. Normalmente a composição da vacina também incluirá um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

[0138] Em uma modalidade a invenção prevê uma vacina contra células expressando ROR-1, a vacina caracterizada pelo fato de compreender uma composição farmaceuticamente aceitável de um peptídeo isolado ou produzido sinteticamente tendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade de sequência com a região ligante a ROR-1 do anticorpo D10. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos da região de ligação de ROR-1 do anticorpo D10 é VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC. Em um outro aspecto, a sequência de aminoácidos da região de ligação de ROR-1 do anticorpo D10 é EVVSSTGVLFVKFGPC. Em outro aspecto, a célula que expressa ROR1 é uma célula de câncer. Em um aspecto adicional, a célula de câncer é de leucemia de célula b, linfoma, LLC, AML, B-ALL, T-ALL, câncer de ovário, cólon, pulmão, pele, pancreático, testículo, bexiga, útero, próstata ou adrenal.

[0139] Em outra modalidade, a invenção prevê uma vacina que inclui um peptídeo de ligação de ROR1 tendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de sequência de identidade com VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em um aspecto, o peptídeo é mamífero. Em um aspecto adicional, o peptídeo é quimérico e/ou do ser humano, camundongo, rato, suíno, bovino, primata, felino, canino, coelho, cabra, galinha ou de origem ursina. Em outro aspecto, a vacina ainda compreende um adjuvante imunogênico. Em um outro aspecto, o adjuvante é uma fração transportadora imunogênica conjugada com o peptídeo de ligação. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos do peptídeo de ligação é VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC. Em outro aspecto, o peptídeo veículo imunogênico é hemocianina do caranguejo Megathura crenulata (KLH). A vacina ainda compreende um adjuvante imunogênico. Em um outro aspecto, o adjuvante é uma fração transportadora imunogênica conjugada com o peptídeo de ligação. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos do peptídeo de ligação é VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC. A fração transportadora imunogênica pode ser um peptídeo veículo, como a hemocianina do caranguejo Megathura crenulata (KLH), albumina de soro bovino (BSA), a ovalbumina, hidróxido de alumínio ou outro adjuvante imunológico farmaceuticamente aceitável. Exemplos de adjuvantes imunes farmaceuticamente aceitáveis podem ser encontrados em Methods in Molecular Medicine, Vol. 42: Vaccine adjuvants: Preparation, Methods and Research Protocols; Editado D. T. O’Hagan; Humana Press Inc., Totowa NJ e European Agency for the Evaluation of Medicinal Products, Committee for Proprietary Medicinal Products, Guidelines on Adjuvants in Vaccines, Londres 2004.

[0140] Em outra modalidade, a invenção prevê uma vacina que inclui um peptídeo de ligação de ROR1 tendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de sequência de identidade com EVVSSTGVLFVKFGPC e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em um aspecto, o peptídeo é mamífero. Em um aspecto adicional, o peptídeo é quimérico e/ou do ser humano, camundongo, rato, suíno, bovino, primata, felino, canino, coelho, cabra, galinha ou de origem ursina. Em outro aspecto, a vacina ainda compreende um adjuvante imunogênico. Em um outro aspecto, o adjuvante é uma fração transportadora imunogênica conjugada com o peptídeo de ligação. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos do peptídeo de ligação é EVVSSTGVLFVKFGPC. A fração transportadora imunogênica pode ser um peptídeo veículo, como a hemocianina do caranguejo Megathura crenulata (KLH), albumina de soro bovino (BSA), a ovalbumina, hidróxido de alumínio ou outro adjuvante imunológico farmaceuticamente aceitável. Exemplos de adjuvantes imunes farmaceuticamente aceitáveis podem ser encontrados em Methods in Molecular Medicine, Vol. 42: Vaccine adjuvants: Preparation, Methods and Research Protocols; Editado D. T. O’Hagan; Humana Press Inc., Totowa NJ e European Agency for the Evaluation of Medicinal Products, Committee for Proprietary Medicinal Products, Guidelines on Adjuvants in Vaccines, Londres 2004.

[0141] Em uma modalidade adicional, a invenção engloba uma formulação farmacêutica que compreende a vacina que compreende um peptídeo de ligação de ROR1 tendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de sequência de identidade com VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0142] Em uma modalidade adicional, a invenção engloba uma formulação farmacêutica que compreende a vacina que compreende um peptídeo de ligação de ROR1 tendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de sequência de identidade com EVVSSTGVLFVKFGPC e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0143] Como mostrado nos exemplos, as vacinas de peptídeo foram desenvolvidas conforme mostrado na Figura 18. Três peptídeos foram utilizados com base nos epítopos de anticorpos ROR1 D10, 4A5 e K19. Os animais foram imunizados com os três peptídeos. Todos os três peptídeos induziram a produção de antissoros de ROR1. Os resultados demonstram que a imunização com peptídeo R22 produziu o maior título de anticorpos. Como indicado nos exemplos, o antissoro de ROR1 se liga a ROR1, diminui cargas leucêmicas, induz internalização de ROR1, media a citotoxicidade dependente de complemento, inibe a migração de célula de câncer de mama e inibe a enxertia de células de leucemia ROR+. Assim, a invenção fornece um método para imunizar pacientes contra ROR1 para permitir a indução de anticorpos para inibir a capacidade das células de câncer ROR+ de migrar e metástase.

Peptídeo de ligação de ROR1

[0144] Em uma modalidade, a invenção prevê um peptídeo de ligação de ROR1 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada do grupo constituído por: SEQ ID NO:25 e SEQ ID NO:26. Em um aspecto, o peptídeo tem uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade de sequência com VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC. Em outro aspecto, o peptídeo tem uma sequência de peptídeo de aminoácido de pelo menos 95% de identidade de sequência com EVVSSTGVLFVKFGPC. Em outro aspecto, o peptídeo de ligação é mamífero. Em um aspecto adicional, o peptídeo de ligação é quimérico e/ou do ser humano, camundongo, rato, suíno, bovino, primata, felino, canino, coelho, cabra, galinha ou de origem ursina.

[0145] Em uma modalidade, a invenção prevê uma formulação farmacêutica compreendendo um peptídeo de ligação de ROR1 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada do grupo constituído por: SEQ ID NO:25 e SEQ ID NO:26 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0146] Em outra modalidade, a invenção prevê um ácidos nucleico isolado codificando um peptídeo de ligação de ROR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:25 e SEQ ID NO:26. Em outra modalidade, a invenção prevê um vetor de expressão que compreende o ácidos nucleico codificando um peptídeo de ligação de ROR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:25 e SEQ ID NO:26. Em outra modalidade, a invenção prevê uma célula hospedeira compreendendo o ácidos nucleico codificando um peptídeo de ligação de ROR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:25 e SEQ ID NO:26. Em uma modalidade adicional, a invenção prevê um método de produção de um peptídeo compreendendo cultivo da célula hospedeira que codifica um peptídeo de ligação de ROR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ IDNO:25 e SEQ ID NO:26 sob condições para produzir o peptídeo de ligação. Em um aspecto, o método para a produção de um peptídeo ainda compreende recuperar o peptídeo de ligação.

Supressão da Metástase

[0147] Em uma modalidade, a invenção prevê um método de suprimir a metástase do câncer que expressa ROR-1, o método caracterizado pelo fato de compreender romper a transição epitelial- mesenquimal de células tumorais através da administração de um anticorpo com a especificidade de ligação do anticorpo monoclonal 99961, uma vacina composta de um peptídeo com uma sequência de aminoácidos de pelo menos 95% de identidade de sequência com a região de ligação a ROR-1 de anticorpo D10, um peptídeo de ligação de ROR-1 tendo uma sequência de aminoácidos de pelo menos 95% de identidade de sequência com VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC ou um peptídeo de ligação de ROR-1 tendo uma sequência de aminoácido com pelo menos 95% de identidade de sequência com EVVSSTGVLFVKFGPC. Em um aspecto, o câncer que expressa ROR- 1 é a leucemia de células B, linfoma, CLL, AML, B-ALL, T-ALL, do ovário, cólon, pulmão, pele, pancreático, do testículo, bexiga, útero, próstata ou câncer adrenal.

[0148] Os exemplos fornecem evidências que anticorpos de ROR1, peptídeos de ligação e vacinas têm a capacidade de inibir células cancerosas de ROR+ de migrar ou entrar em metástase.

Tratamento

[0149] Conforme usado neste documento, os termos "tratar" ou "tratamento" referem-se ao tratamento terapêutico e profilático ou a medidas preventivas, em que o objetivo é impedir ou diminuir (reduzir) uma mudança ou distúrbio patológico indesejado, tal como o desenvolvimento ou espalhamento do câncer. Os resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não estão limitados a, alívio dos sintomas, diminuição da extensão da doença, estado da doença estabilizado (isto é, não piora), retardamento ou diminuição da progressão da doença, melhora ou paliação do estado da doença e remissão (tanto parcial quanto total), quer sejam detectáveis ou indetectáveis. "Tratamento" pode significar também o prolongamento da sobrevida, em comparação à sobrevida esperada, se não receber tratamento. Aqueles que precisam de tratamento incluem os que já têm a condição ou transtorno, bem como os propensos a ter a condição ou transtorno ou aqueles em quem a condição ou transtorno deve ser prevenido.

[0150] Como usado aqui, o termo "câncer" ou "célula cancerosa" ou "câncer expressando ROR1" ou "célula de câncer expressando ROR1" refere-se a todo crescimento e proliferação de células neoplásicas, malignas ou benignas, incluindo todas as células e tecidos transformados e todas as células e os tecidos cancerosos. Câncer inclui, mas não está limitado a, neoplasmos, benignos ou malignos, localizado na: próstata, cólon, abdômen, osso, peito, sistema digestivo, fígado, pâncreas, peritônio, glândulas endócrinas (adrenal, paratireoide, pituitária, testículos, ovário, timo, tireoide), olho, cabeça e pescoço, nervoso (central e periférico), sistema linfático, pélvico, pele, tecidos moles, baço, torácico e do trato urogenital. Tais neoplasmos, em determinadas incorporações, expressam, superexpressam anormalmente expressam ROR1.

[0151] Câncer também inclui mas não está limitado a leucemia de células B, linfoma, CLL, AML, B-ALL, T-ALL, ovário, cólon, pulmão, pele, pancreático, testículo, bexiga, útero, próstata e câncer adrenal.

[0152] Os anticorpos anti-ROR1, peptídeos de ligação de ROR1 e vacinas de ROR1 aqui descritos podem ser usadas para o tratamento ou prevenção de câncer de ROR1 ou para inibir a metástase de uma célula de câncer de ROR1 em um sujeito.

Anticorpos

[0153] Em determinadas incorporações terapêuticas, o anticorpo selecionado será tipicamente um anticorpo anti-ROR1, que pode ser administrado sozinho ou em combinação com, ou conjugado a, um ou mais agentes terapêuticos combinatórios. Quando os anticorpos aqui descritos são administrados sozinhos como agentes terapêuticos, eles podem exercer um efeito benéfico no sujeito por uma variedade de mecanismos. Em determinadas incorporações, anticorpos monoclonais que se ligam especificamente a hROR-1 são purificados e administrados a um paciente para neutralizar uma ou mais formas de hROR-1, para bloquear uma ou mais atividades de hROR-1, ou para bloquear ou inibir a interação de uma ou mais formas de hROR-1 com outra biomolécula.

[0154] Os reagentes imunoterapêuticos da invenção podem incluir anticorpos humanizados, e podem ser combinados para uso terapêutico com ingredientes inertes ou ativos adicionais, por exemplo, em portadores farmaceuticamente aceitáveis convencionais ou diluentes, por exemplo, adjuvantes imunogênicas e opcionalmente com adjuvante ou agentes combinatoriamente ativos tais como drogas anti- neoplásicas.

[0155] Em outras modalidades, os anticorpos terapêuticos aqui descritos são administrados coordenadamente com, co-formulados com, ou acoplado a (por exemplo, covalentemente ligados) um agente terapêutico combinatório, por exemplo um radionuclídeo, um indutor de diferenciação, uma droga ou uma toxina. Vários radionuclídeos conhecidos podem ser empregados, incluindo 90Y, 123I, 125I, 131I, 186Re, 188Re, e 211At. Drogas úteis para uso em tais formulações combinatórias de tratamento e métodos incluem metotrexato e pirimidina e análogos de Purina. Indutores de diferenciação adequada incluem ésteres de forbol e ácido butírico. Toxinas apropriadas incluem ricina, abrina, toxina difteria, toxina de cólera, gelonina, Pseudomonas exotoxina, toxina de Shigella, e proteína antiviral Phytolacca. Estes agentes terapêuticos combinatórios podem ser acoplados a um anticorpo anti-ROR1 direta ou indiretamente (por exemplo, através de um grupo vinculador). Uma reação direta entre um agente e um anticorpo é possível quando cada um possui um substituinte capaz de reagir com o outro. Por exemplo, um grupo nucleofílico, como um amino ou grupo sulfidrila, pode ser capaz de reagir com um grupo contendo carbonil, como um anidrido ou um haleto ácido, ou com um grupo alquil contendo um bom grupo lábil (por exemplo, um haleto) no outro. Alternativamente, pode ser desejável acoplar um agente terapêutico combinatório e um anticorpo através de um grupo vinculador como um espaçador para distanciar um anticorpo do agente terapêutico combinatório para evitar interferência com capacidades de ligação. Um grupo vinculador pode também servir para aumentar a reatividade química de um substituinte em um agente ou um anticorpo e, assim, aumentar a eficiência de acoplamento. Será ainda mais evidente para aqueles versados na técnica que uma variedade de reagentes bifuncionais ou polifuncionais, ambos homo e hetero- funcionais (como os descritos no catálogo da Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois), pode ser empregada como um grupo vinculador. Acoplamento pode ser efetuado, por exemplo, através de grupos amino, grupos carboxil, grupos tióis ou resíduos de carboidrato oxidado.

[0156] Também pode ser desejável acoplar mais do que um agente a um anticorpo anti-ROR1. Em uma modalidade, várias moléculas de um agente são acopladas a uma molécula de anticorpo. Em outra modalidade, mais de um tipo de agente pode ser acoplado a um anticorpo. Independentemente da modalidade particular, imunoconjugados com mais de um agente podem ser preparados em uma variedade de maneiras. Por exemplo, mais de um agente pode ser acoplado diretamente a uma molécula de anticorpo ou vinculadores que fornecem vários sítios para anexação podem ser usados. Alternativamente, pode ser usado um veículo.

[0157] Uma variedade de vias de administração de anticorpos e imunoconjugados pode ser usada. Normalmente, a administração é endovenosa, intramuscular ou subcutânea.

[0158] Será evidente que a dose precisa do anticorpo/ imunoconjugado irá variar dependendo de fatores como o anticorpo usado, a densidade do antígeno e a taxa de liberação do anticorpo. Uma quantidade segura e eficaz de um agente anti-ROR1, por exemplo, é aquela quantidade que causaria o efeito terapêutico desejado em um paciente enquanto minimiza os efeitos colaterais indesejados. Geralmente, uma quantidade terapeuticamente eficaz é aquela suficiente para promover a produção de um ou mais citocinas e/ou causar a citotoxicidade celular mediada por complemento ou dependente de anticorpo. A posologia será determinada por médicos qualificados, com base em fatores tais como a natureza exata da condição a ser tratada, a gravidade da condição, idade e condição física geral do paciente e assim por diante.

[0159] Em uma modalidade adicional, a invenção fornece um método de tratar ou prevenir um câncer em um sujeito, o método caracterizado pelo fato de compreender administrar um sujeito um anticorpo com a especificidade de ligação do anticorpo monoclonal 99961, uma vacina composta de um peptídeo com uma sequência de aminoácidos de pelo menos 95% de identidade de sequência com a região de ligação ao ROR-1 humano do anticorpo D10, um peptídeo de ligação de ROR-1 tendo uma sequência de aminoácidos de pelo menos 95% de identidade de sequência com VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC ou um peptídeo de ligação de ROR-1 tendo uma sequência de aminoácido com pelo menos 95% de identidade de sequência com EVVSSTGVLFVKFGPC. Em um aspecto, o câncer é leucemia de célula B, linfoma, CLL, AML, B-ALL, T-ALL, do ovário, cólon, pulmão, pele, pancreático, do testículo, bexiga, útero, próstata ou câncer adrenal. Inibição da metástase por direcionamento a ROR1.

[0160] A disseminação de células neoplásicas do seu sítio original para áreas distantes do corpo é responsável por 90% das mortes relacionadas ao câncer. O processo metastático inclui a translocação física das células do tumor primário para um órgão distante e subsequente colonização. Algumas assinaturas de gene de prognóstico pobre sugerem que as células de alguns tumores primários estão predispostas a metástase. No entanto, entendimento dos determinantes moleculares e celulares da metástase é limitado, e os processos através dos quais células tumorais se submetem a este evento são em grande parte desconhecidos. A atenção recente centrou-se em um programa celular-biológico chamado de transição epitelial-mesenquimal (EMT), que agora é considerada fator proeminente na progressão do tumor, aquisição de motilidade, invasão, metástases e traços de autorrenovação.

[0161] EMT confere a células epiteliais neoplásicas os traços biológicos necessários para realizar a maioria das etapas da cascata de invasão-metástase. No desenvolvimento normal e metástases de câncer, EMT parece regulado por sinais contextuais que células epiteliais recebem do seu microambiente. Através da utilização de múltiplas vias envolvidas na morfogénese embrionária e cicatrização de feridas, as células cancerosas concomitantemente podem adquirir atributos que permitem a invasão e metástase.

[0162] Trabalho para definir células-tronco de câncer (CSCs) que pode responder por metástases ou recidiva de câncer após terapia identificou uma variedade de traços associados com uma ou mais subpopulações de CSCs dentro de vários tumores. Alguns desses estudos descobriram que aquisição da característica fenotípica de células em EMT pode induzir não-CSCs a entrar em um estado semelhante a CSC. Portanto, as células de câncer metastático, que tenham presumivelmente sofrido EMT, podem exibir um fenótipo de CSC e adquirir propriedades invasivas que promovem a sobrevida na circulação, extravasamento em um órgão distante, angiogênese e crescimento descontrolado nos sítios metastáticos.

[0163] Como mais detalhado nos exemplos, expressão de alto nível de ROR1 em células de câncer está associada a taxas mais elevadas de doença reincidente e/ou metastática. Os efeitos da expressão e silenciamento de ROR1 em pacientes com adenocarcinoma da mama, descrita no exemplo 1, ilustra a prática da invenção para inibir a metástase. Como mostrado, silenciar expressão de ROR1 em linhagens celulares de câncer de mama metastático-propensas inverte características fenotípicas associadas com EMT e prejudica a migração, invasão e metástase in vitro e in vivo. Além disso, os anticorpos inventivos específicos para ROR1 inibem metástases de células de câncer de mama humanas xenoenxertadas em camundongos imunodeficientes. Esses estudos identificam um caminho até então desconhecido para metástase de câncer de mama e validam ROR1 como um alvo promissor para tratamento de câncer. Baixos níveis de expressão de ROR1 foram correlacionados com maior sobrevida livre de metástase, e mais importante, direcionamento terapêutico de ROR1 com anticorpos anti-ROR1 pode inibir o desenvolvimento de metástase de câncer de mama.

[0164] Metástase é a disseminação de células cancerosas do seu local primário para outras partes do corpo. Uma vez que o câncer se torna metastático, não pode ser eficazmente tratado por cirurgia ou radioterapia. Além disso, a causa predominante de mortalidade do paciente com câncer é metástase. Recepetores tirosina quinase (RTKs) são conhecidos por desempenhar papéis cruciais em muitos processos celulares, incluindo diferenciação, proliferação, migração, angiogênese e sobrevida. Embora ROR2 não tenha sido descoberto como facilitando facilitar metástase de células de câncer de próstata e melanoma, não há diferença significativa na expressão de ROR2 entre linhagens celulares de câncer de mama agressivas e não agressivas. No entanto, a expressão de ROR1 tem uma forte correlação com as linhagens celulares de câncer de mama agressivas.

[0165] Embora a invenção não seja limitada por teorias sobre o seu mecanismo de ação, é notável que ROR1 ativa os genes que codificam proteínas implicadas na metástase do câncer da mama, como 1 Snail- 1, Snail-2, TCF8/ZEB, CK-19, vimentina, CXCR4. AKT recentemente foi relatado envolvido com funções de metástase, incluindo EMT, resistência à apoptose e angiogênese. Como demonstrado nos exemplos, atividade de AKT regulado para cima de ROR1 e exposição das células MDA-MB-231 anticorpo anti-ROR1 D10 reduziram atividade p-AKT. Estes dados sugerem que a inibição da ativação de AKT ROR1- regulado pode ser um mecanismo pelo qual D10 exerce seu efeito antitumoral.

[0166] No que diz respeito à metástase do câncer da mama em particular, usando assinaturas de expressão do gene foi encontrado que expressão de ROR1 em tumores de mama primários está associada com metástase do câncer da mama incluindo metástases de osso, pulmão e cerebrais. Entre 582 casos que foram analisados, a taxa de recidiva foi 55% no grupo de alto ROR1, em comparação com 37% no grupo de baixo ROR1. Importante, esta taxa de recidiva aumentou para 63% em ROR1 no grupo 75-centésimo. Expressão de ROR1 é também fortemente correlacionada com marcadores de tumor de câncer mamário clinicamente agressivos, incluindo ER - PR- e Her2-. Embora não houvesse diferença estatisticamente significativa entre os grupos com base na T-fase de câncer de mama, a percentagem de pacientes com alto ROR1 aumentou de 51% para 77% nos estágios de T1 e T4, respectivamente. Metástase de órgão específico (câncer de mama, pulmão ou osso) foi significativamente inibida por knockdown de ROR1 de acordo com a invenção. Estes dados sugerem que ROR1 pode regular certos genes específicos de pulmão e osso, tais como CXCR4.

[0167] Quimiocinas humanas são compostas de uma superfamília de 48 ligantes que se ligam aos 19 diferentes receptores de quimiocina acoplados à proteína G. Foi tomado por hipótese que as células do tumor metastático podem 'sequestrar' vias de migração celular mediada por receptor de quimiocina. Células de tumor de câncer de mama expressam receptores de quimiocina selecionados incluindo CXCR4. Inibição do eixo CXCL12-CXCR4 de acordo com a invenção pode bloquear a metástase in vivo da linha celular MDA-MB-231 ao pulmão. Células MDA-MB-231 silenciadas para ROR1 tinham menor expressão de CXCR4 que parental MDA-MB-231 ou MDA-MB-231 transfectadas com CTRL-shRNA.

[0168] Usando análise de expressão de gene, verificou-se que a expressão de ROR1 também foi associada com metástase de pulmão (Fig. 1B), de osso (Fig. 1C) e cerebral (Fig. 1D). Com base em uma análise de relação de risco, ROR1 foi determinado a ser um melhor preditor de metástase de osso e pulmonar globais do que ER, PR e HER2. ROR1 também pode ser um gene preditor metástase- relacionado com base na taxa de recidiva global de uma recaída total de pacientes de câncer de mama por status de ER e ROR1. Embora houvesse alguma diferença entre casos ER+ e ER-na fase inicial de sobrevida livre de metástase, só casos de baixo ROR1 e alto ROR1 significativamente tinham diferenças na fases finais da sobrevida livre de metástase. Assim, a invenção fornece uma via para inibir a metástase e melhorar a sobrevida do paciente.

[0169] Em geral, a dosagem de anticorpos administrados de ROR1, componentes de anticorpos de ROR1, composições de vacina de peptídeo de ligação, seus imunoconjugados e proteínas de fusão irão variar dependendo de fatores como idade, peso, altura, sexo, condição médica geral e histórico médico anterior do paciente. Normalmente, é conveniente fornecer ao recipiente uma dosagem de componente anticorpo, vacina, imunoconjugado ou proteína de fusão que está na faixa de cerca de 1 ng/kg a 20 mg/kg (quantidade de agente/peso do paciente), embora uma dosagem inferior ou superior também possa ser administrada como ditarem as circunstâncias.

[0170] Administração de anticorpos, componentes do anticorpo, vacinas, imunoconjugados ou proteínas de fusão a um paciente pode ser intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intrapleural intramuscular, subcutânea, intratecal, por perfusão através de um cateter regional, ou por injeção intralesional direta. Quando se administra proteínas terapêuticas, peptídeos ou conjugados por injeção, a administração pode ser por infusão contínua ou bolus único ou múltiplo.

[0171] Aqueles versados na técnica são conscientes de que a injeção intravenosa fornece um modo útil de administração devido ao rigor da circulação em distribuir rapidamente anticorpos. Administração intravenosa, no entanto, está sujeita a limitação por uma barreira vascular composta por células endoteliais da vasculatura e da matriz de subendotelial. Ainda assim, a barreira vascular é um problema mais notável para a absorção de anticorpos terapêuticos por tumores sólidos. Os linfomas têm taxas de fluxo de sangue relativamente altas, contribuindo para a entrega de anticorpos eficaz. Rotas intralinfáticas de administração, tais como a injeção subcutânea ou intramuscular, ou por cateterismo dos vasos linfáticos, também fornecem um meio útil de tratar linfomas.

[0172] De preferência, anticorpos de ROR1, peptídeos de ligação, imunoconjugados respectivos e proteínas de fusão são administrados em baixas doses de proteína, tais como 20 a 3000 mg de proteína por dose, dadas uma vez, ou repetidamente, por via parentérica. Alternativamente, a administração é em doses de 100 a 300 mg de proteína por dose, ou 300 a 1000 mg de proteína por dose, 1000 a 2000 mg de proteína por dose.

[0173] A presente invenção também contempla métodos terapêuticos nos quais componentes de anticorpo de ROR1 são radiomarcados ou suplementados com imunoconjugado radiomarcado ou administração de proteína de fusão. Em uma variação, anticorpos de ROR1 são administrados como ou com anticorpos de ROR1 de baixa dose radiomarcados ou fragmentos. Como alternativa, anticorpos de ROR1 podem ser administrados com imunoconjugados de ROR1- citocina radiomarcados de baixa dose. Aqueles versados na técnica estarão familiarizados com moléculas de radiomarcação farmaceuticamente aceitáveis e seus níveis de dosagens apropriados. Para referência, considere "baixas doses" de imunoconjugados 131I- rotulados, em que uma dosagem preferível é na faixa de 15 a 40 mCi, enquanto a faixa mais preferível é de 20 a 30 mCi. Em contraste, uma dose preferencial de imunoconjugados 90Y-marcados é na faixa de 10 a 30 mCi, enquanto a faixa mais preferível é 10 a 20 mCi.

[0174] A invenção em todos os seus aspectos é ilustrada mais nos exemplos a seguir. Os exemplos não limitam, no entanto, o escopo da invenção, que é definido pelas reivindicações acrescentadas.

Exemplo 1 ROR1 é Associado a Recaída Metastática Precoce no Adenocarcinoma da Mama

[0175] Os dados de transcriptoma no banco de dados GEO em células de câncer de mama isoladas de pacientes em uma coorte combinada de 582 pacientes foram interrogados. Aproximadamente dois-terços (426 de 582) desses casos não tiveram câncer detectável nos linfonodos regionais no momento da cirurgia e não tiveram terapia adjuvante administrada. Os restantes casos tinham doença detectável em linfonodos regionais e terapia hormonal adjuvante recebida e/ou quimioterapia. Entre os 582 casos, 46% recaíram (n=270), e tiveram um tempo de sobrevida livre de metástases médio de 22,1 meses. Nós segregamos pacientes em três grupos com base na sua expressão relativa do câncer-célula de ROR1. Pacientes com tumores tendo o nível de terço superior de expressão de mRNA de ROR1 (ROR1H) tiveram uma sobrevida livre de metástases significativamente menor do que pacientes com tumores que tinham o nível de terço inferior (ROR1L) ou intermediário (ROR1M) de expressão de ROR1 (p<0,0001; Figura 1A). Sobrevida livre de metástase por sítios de órgão foi examinada. Verificou-se que os pacientes com tumores de ROR1H tiveram taxas mais elevadas de metástase para o pulmão (p = 0,002; figura 45A), ou osso (p = 0,004; Figura 45B), ou o cérebro (p = 0,04; Figura 45 C) do que pacientes com cânceres de mama de ROR1L ou ROR1M. Cânceres de ROR1H tinham proporções significativamente menores de tumores com características de prognósticos favoráveis, como receptores de estrógeno/progesterona ou HER2, que cânceres com ROR1L ou ROR1M.

[0176] Expressão de alto nível de ROR1 também se apresentou como um fator independente na previsão de menor sobrevida livre de metástase. Pacientes com tumores de ROR1 H tinham uma maior taxa de metástase, recaída mais precoce e sobrevida mais pobre do que pacientes com tumores de ROR1L/M, independentemente do estatuto de ER, PR ou HER2 (figura 46). Além disso, o interrogatório dos dados de matriz GSE2034, GSE2603, GSE5327 e GSE12276 para assinaturas de gene de EMT no câncer de mama revelou que tumores de ROR1L tinham níveis significativamente mais altos de expressão de genes associados com células epiteliais, tais como CDH1 (codificando E- caderina), TJP1 (codificando ZO1), e TJP3 (codificando ZO3), mas níveis de expressão mais baixos de genes associados com células mesenquimais, tais como SNAI1 (codificando Snail-1), SNAI2 (codificando Snail-2), CDH2 (codificando N-caderina) ou o VIM (codificando vimentina), que os tumores de ROR1H (figura 1B).

Exemplo 2 ROR1 + Linhagens celulares de Câncer de Mama

[0177] Quatorze expressões de linhagens celulares epiteliais distintas de câncer de mama de ROR1 foram examinadas, incluindo seis linhagens celulares de câncer de mama do tipo basal e oito linhagens celulares de câncer de mama do tipo luminal. O nível de expressão de ROR1 foi significativamente maior em linhagens celulares de câncer de mama do tipo basal em relação àquele em linhagens celulares de câncer de mama do tipo luminal, que geralmente não expressam ROR1. Além disso, os níveis de expressão relativos de ROR1 correlacionaram com fenótipos de tumor agressivo, como triplo negativo ERNegPRNegHER2/NeuNeg e capacidade de migração de alto nível e invasão in vitro.

[0178] ROR1 foi silenciado em linhagens celulares de câncer mama altamente invasivas, basal-tipo (por exemplo, MDA-MB-231) usando short hairpin RNAs (shRNAs) que se direcionaram a qualquer uma das duas sequências diferentes de ROR1. Expressão da proteína de ROR1 foi inibida em células transfectadas com ROR1-shRNA1 ou ROR1- shRNA2, em contraste com as células transfectadas com um shRNA controle (CTRL-shRNA) (Fig. 47A). Interrogatório da matriz de dados para diferenças de expressão gênica entre MDA-MB-231 transfectada com CTRL-shRNA ou ROR1-shRNA (adesão GEO: GSE31631) revelou que células silenciadas para ROR1 tinham maiores níveis de expressão de KRT19 (codificando CK19), menores níveis de expressão de CXCR4 e VIM que parental MDA-MB-231 ou MDA-MB-231 transfectadas com CTRL-shRNA. Estes resultados foram confirmados por qRT-PCR (figura 47B, figura 48A). Análises de citometria de fluxo demonstraram também que a expressão de superfície celular de CXCR4 foi menor nas células silenciadas para ROR1 (Fig. 48B).

[0179] Para avaliar o potencial papel de ROR1 na regulação de EMT, examinamos marcadores EMT-associados em células tratadas com CTRL-shRNA ou ROR1-shRNA. Suprimindo a expressão de ROR1 com ROR1-siRNA ou ROR1-shRNA1/2, em qualquer dentre três distintas linhas celulares do tipo basal de câncer de mama (MDA-MB-231, HS- 578T ou BT549) atenuou a sua expressão de mRNA e/ou proteínas codificadas associadas com EMT (por exemplo, vimentina, Snail-1/2 e ZEB1). Por outro lado, silenciar ROR1 aumentou a expressão de mRNA e codificou citoqueratinas epiteliais (por exemplo, CK-19). Embora não houvesse nenhuma mudança significativa no mRNA TJP1 codificando ZO-1 em qualquer das 3 linhas celulares examinadas, células silenciadas para ROR1 tinha níveis mais altos de expressão desta proteína de junção apertada, sugerindo que ZO-1 pode estar sob controle pós-transcricional (Figura 1C-D e Figura 49). Finalmente, transfecção de células MCF7 ROR1-negativas para expressar ROR1 diminuiu a expressão de proteínas epiteliais (por exemplo, E-caderina e CK19) e aumento da expressão dos fatores transcricionais de EMT, tais como SNAIL1/2 (Figura 1E).

[0180] Em cultura, células MDA-MB-231, HS-578T ou BT549 tipicamente tinham exibido uma morfologia estrelada, que é semelhante àquela de células mesenquimais in vitro. No entanto, após tranfecção com ROR1-shRNA estas células assumiram uma morfologia mais esférica, que era similar à de células epiteliais (Figura 2A). Transfecção dessas células com CTRL-shRNA não induziu tais mudanças. Além disso, coloração imunofluorescente revelou que transfecção com ROR1-shRNA induziu células MDA-MB-231 a expressar níveis modestos de E-caderina e níveis mais elevados de CK-19, mas reduziu expressão da vimentina (figura 2B). Resultados semelhantes também foram observados para células HS-578T ou BT549. Por outro lado, em comparação com células não tratadas ou células transfectadas com um vetor de controle, as células MCF7 ROR1-negativas desenvolveram uma semelhança morfológica com células mesenquimais e tiveram diminuição da expressão de marcadores epiteliais (por exemplo, CK19 e E-caderina) e aumento da expressão de marcadores mesenquimais, tais como vimentina, quando transfectados para expressar ROR1. Além disso, células silenciadas para ROR1 tinham menos capacidade de migração/invasão em comparação com aquela de células tratadas com CTRL-shRNA (Figura 2E e F). Também foi descoberto que quimiotaxia para CXCL12 foi significativamente reduzida nas células silenciadas para ROR1 (Figura 48). Resultados idênticos foram obtidos usando células silenciadas com ROR1-shRNA1 ou ROR1-shRNA2. Coletivamente, estes resultados indicam que a expressão de ROR1 pode contribuir para metástase de tumor e EMT.

Exemplo 3 Silenciamento de ROR1 Inibe Metástases Mulmonares Ortotópicas Cultura de Células

[0181] Linhas de célula de câncer de mama MDA-MB-231, HS- 578T, BT549, MDA-MB-415, MDA-MB-435s, MDA-MB-436, MDA-MB- 157, MDA-MB-134, MCF7, BT-474, MDA-MB-453, SKBR3, MDA-MB- 330 e BT-483 foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC) e mantidas como anteriormente descrito (Neve et al. Cancer Cell, 10:515 (2006)).

ROR1

-knockdown

[0182] Knockdown de ROR1 foi alcançado por direcionamento às sequências de 5‘-TCC GGA TTG GAA TTC CCA TG-3‘ (shRNAI), e 5- CTT TAC TAG GAG ACG CCA ATA-3’ (shRNA2) como descrito anteriormente (Zhang, S. Et al., Cancer Cell, 16:67 (2009)).). Um controle de shRNA inespecífico foi criado por direcionamento às sequências de 5‘- AGC GGA CTA AGT CCA TTG C-3‘. Sistemas de expressão lentiviral VirapowerTM (Invitrogen) foram usados para expressar o shRNA de acordo com as instruções do fabricante. Os construtos de ROR1-shRNA1 e CTRL-shRNA1 também codificaram proteínas de fluorescência vermelha (RFP). Oligonucleotídeos para os construtos de ROR1-shRNA1 e CTRL-shRNA1 foram sintetizados (Integrated DNA Technologies) e inseridos no vetor de RFP-pLKO.1. Construtos de ROR1-shRNA2 e CTRL-shRNA2 foram comprados da Open Biosystems (Rockford, IL). As partículas virais para infecção de linhagens celulares de câncer de mama foram obtidas por transfecção de linhagem de células de empacotamento 293-FT e coletadas de sobrenadantes de células em 48 e 72 horas pós-transfecção. Sobrenadantes foram filtrados e centrifugados a 43.000 x g para concentrar as partículas virais, que foram utilizadas para infectar culturas subconfluentes na presença de 5 μg/ml de polibreno durante a noite.

[0183] Vinte e quatro horas pós-transfecção, as células foram selecionadas com puromicina de 2 μg/ml. Células de knockdown foram classificadas por citometria de fluxo, usando um mAb anti-ROR1 (4A5). Células classificadas que expressam etavelmente shRNA1 ou shRNA2 foram designadas ROR1-shRNA1 ou ROR1-shRNA2, respectivamente. Populações em pool de células de knockdown, obtidas nas primeiras 10 gerações após triagem de célula sem subclonagem, foram injetadas em rag-/-Y-/-camundongos para experimentos in vivo. A eficiência do knockdown de ROR1 foi confirmada por PCR quantitativo com ensaios de expressão de gene verde Sybr (Applied Byosystems) com transcrição reversa (qRT-PCR) ou análise de western immunoblot (anticorpo anti-ROR1, S4102, sinalização celular). β2-microglobulina e actina foram usados como controles endógenos por qRT-PCR e western blot, respectivamente.

Migração de transwell e ensaios de invasão

[0184] Células de câncer foram condicionadas à noite no meio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado com 0,2% de soro bovino fetal (FBS) sem fatores de crescimento. No dia seguinte, as células foram tripsinizadas e re-suspendidas em 0,2% de mídia de FBS DMEM sem fatores de crescimento. Células de tumores foram inoculadas em uma densidade de 25.000 células por poço em inserções transwell (tamanho de poro de 3 μM, BD Falcon) para os ensaios de migração ou em uma densidade de 50.000 células por poço em câmaras matrigel- revestidas, crescimento-fator-reduzidas, de invasão (8 μM de tamanho do poro, BD Biosciences). Poços foram lavados com solução salina tamponada de fosfato (PBS) e corrigidos com paraformaldeído a 4% depois de 6 h para os ensaios de migração ou 22 h para ensaios de invasão. As células do lado apical de cada inserção foram removidas por raspagem. Células que migraram para o lado basal da membrana foram coloradas e visualizadas com um microscópio Nikon invertido.

Análise da expressão de mRNA e da proteína

[0185] O RNA total foi purificado usando o kit de RNeasy (Qiagen) e 2 μg de cada amostra foram usados para gerar o cDNA usando os kits de transcrição do Reversor de cDNA de alta capacidade (ABI). Cada cDNAs foi analisado em triplicata, utilizando um ABI 7500 Fast RealTime PCR System (Applied Biosystem). Os níveis de expressão da proteína foram avaliados por análise de immunoblot com lisados celulares (40 - 60 μg) em tampão de lise (20 mM de HEPES (pH 7.9), 25% de glicerol, 0,5 N de NaCl, EDTA a 1 mM, 1% de NP-40, ditiotreitol a 0,5 mM e 0,1% desoxicolato) contendo inibidores de protease (Roche) usando anticorpos anti-ROR1 (sinalização celular) e anti-β-actina (sinalização celular).

Citometria de fluxo

[0186] Células de câncer de mama foram coloradas ou triadas por pool por citometria de fluxo. Células foram lavadas e re-suspendidas em 2% de albumina de soro bovino (BSA) (Sigma) em solução de PBS e coloradas para expressão de ROR1 expressão usando um anticorpo Alex488-conjugado (clone 4A5 ou clone D10) ou um controle de isotipo IgG2a ou IgG2b Alex488-conjugado, de acordo com o protocolo do fabricante. Dados de citometria de fluxo foram coletados usando um citômetro de FACSCalibur (BD Biosciences) e analisados utilizando o software FlowJo.

Análise da imunofluorescência e imuno-histoquímica

[0187] Pulmões de camundongo foram corrigidos com paraformaldeído a 4% e incorporados em parafina ou congelados em OCT para exame histopatológico. As seções de tecido (espessura de 5μm) foram preparadas e coloradas com hematoxilina & eosina (H & E) ou anticorpos primários de p-AKT (Ser473, D9E, sinalização de célula), p-Creb (Ser133, 87 G 3, sinalização celular), CK-19 (RCK108, Dako) ou vimentina (D21H3, sinalização celular). Imagens foram coletadas utilizando um microscópio Delta Vision e processadas com o software SPOT.

Análise de metástase

[0188] Rag-/-Y-/-camundongos fêmeas foram injetados com: um pool de células parentais MDA-MB-231 ROR1-shRNA1 (grupo 1) e células de controle de shRNA para MDA-MB-231 parental (grupo 2). As células foram injetadas por via intravenosa na veia lateral da cauda em 100 μl de PBS (5*105 para grupos de 1-2; 2*105 para grupos 3 - 4) ou administradas por Injeção intracardíaca em 100 μ de PBS (1*105 para grupos 5-6). Imageamento de bioluminescência não-invasiva foi realizado semanalmente por sistemas de imagem IVIS 200. Todos os camundongos que anteriormente não tinham morrido ou parecido doentes foram sacrificados 3-4 semanas pós-injeção, e seus pulmões foram removidos e fixados em formol a 10%.

[0189] Para estudar o efeito de ROR1 sobre a metástase in vivo de um enxerto de panículo mamário, tumores de câncer de mama foram induzidos em Rag-/—Y—/-camundongos fêmeas de oito semanas de idade injetando 100 μl de uma suspensão de célula única (1x106 células viáveis/camundongo) por via subcutânea para a segunda área do panículo adiposo da glândula mamária direita abdominal. O tamanho do tumor foi medido a cada 3 dias. Os tumores foram removidos quando os volumes de tumor atingiram 300mm3. Para estudar o efeito terapêutico de anticorpos monoclonais anti-ROR1 em metástase de câncer de mama, tumores de câncer de mama foram induzidas em Rag-/-Y- /- camundongos fêmeas de oito semanas de idade através de injeção intravenosa de 100 μl de uma suspensão de célula única (5x105 células/camundongo). IgG de camundongo ou mAbs anti-ROR1 foram injetados por via intravenosa semanalmente. Imageamento de bioluminescência não-invasiva foi realizado semanalmente. Cinco semanas após o xenoenxerto, os camundongos foram sacrificados e os pulmões foram removidos e fixados em formol a 10%.

Análise de dados de expressão de gene Oncomine

[0190] Uma micromatriz de conjunto de dados de 582 pacientes do banco de dados Pubmed GEO (GEO2603, GSE5327, GSE2034 e GSE12276) foi compilada. Esses conjuntos de dados foram transformados por log2 e cada micromatriz foi centrada para a média de todas a sondas. Para cada paciente, a sobrevida livre de metástase foi definida como o intervalo de tempo entre a cirurgia e o diagnóstico de metástase. Relativos níveis de expressão de mRNA de ROR1 em tecidos humanos foram determinados pela análise de banco de dados Oncomine Cancer Microarray (www.oncomine.org) de um conjunto de dados de expressão de gene publicado. Os dados foram log-2- transformado, com a mediana definida como zero e s.d. definido como um.

[0191] Análises Estatísticas: Comparações entre curvas de Kaplan- Meier foram realizadas usando o teste de log rank. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM). Um teste t de Student não pareado foi utilizado para comparar dois grupos, salvo indicação em contrário. P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

[0192] O desempenho de ROR1 na previsão de sobrevida livre de metástases foi analisado pela análise multivariada, com modelos de regressão de risco proporcional de Cox. A taxa de risco de cada covariável e seu intervalo de confiança de 95% são relatadas. P-valores são calculados com base na distribuição Normal, avaliando a probabilidade da hipótese nula (taxa de risco = 1, ou seja, sem significância prognóstica) para ser verdade.

[0193] O potencial metastático e CTRL-shRNA-transfectado foi comparado com células MDA-MB-231 transfectadas com ROR1-shRNA que foram estavelmente transfectadas usando um vetor de luciferase/GFP-expressão em um modelo ortotópico (Fig. 3A). Injeção de células de 2,5-10x105 na panícula adiposa subcutânea mamária de tumores primários de RAG-/-YC-/-camundongos imunodeficientes gerados no local da injeção que nós poderíamos monitorar através de bioluminescência. Não observamos diferenças significativas nos progressivos aumentos em bioluminescência de tumores que resultaram de injeção de células CTRL-shRNA-transfectadas versus células transfectadas com ROR1-shRNA até 3 ou mais semanas após a injeção de pelo menos 1x106 células, como observado em estudos prévios. Para examinar as diferenças nas taxas de metástase de câncer 'espontâneas', os tumores primários resultantes da injeção de 1x106 células foram removidos cirurgicamente quando atingiram um volume de 300 mm3 (linha pontilhada, Figura 3B). Devido às taxas de crescimento diferentes, o número médio de dias da célula-injeção à remoção cirúrgica dos tumores primários foi significativamente maior para os camundongos injetados com células silenciadas para ROR1 (40 ± 2,5 dias) do que para os camundongos que receberam igual número de células transfectadas em CTRL-shRNA (31 ± 0,5 dias) (Figura 3B). Os tumores primários extirpados tinham semelhante volume, peso e bioluminescência ex vivo (Figura 3, C a E). Após a remoção do tumor primário monitoramos para doença metastática via bioluminescência. Animais injetados com células transfectadas com CTRL-shRNA tinham bioluminescência significativamente maior no pulmão ou no fígado no momento da excisão primária de tumor do que os camundongos enxertados com células silenciadas para ROR1 no tempo mais tarde quando tiveram seus tumores primários extirpados (Figura 3, E e F). Animais injetados com células silenciadas para ROR1 tiveram aumento menos detectável em bioluminescência de pulmão em relação a camundongos injetados com células transfectadas com CTRL-shRNA (Figura 3G). Os animais foram sacrificados 21 dias após seus tumores primários serem removidos para examinar a bioluminescência ex vivo, tamanho e histologia do fígado (Figura 3, K e L) e pulmão (Figura 3, H a J). Os pulmões e fígados extirpados de camundongos injetados com células transfectadas com CTRL-shRNA tinham significativamente maior peso e bioluminescência do que aqueles dos camundongos injetados com células ROR1-silenciadas. Além disso, os pulmões e fígados de camundongos injetados com células transfectadas com CTRL-shRNA universalmente tinham doença metastática extensa, que não foi observada nos tecidos dos camundongos injetados com células ROR1-silenciadas (Figura 3, J e L).

Exemplo 4 Silenciamento de ROR1 inibe Metástase Pulmonar e Óssea Experimental

[0194] As células MDA-MB-231 transfectadas com ROR1-shRNA ou CTRL-shRNA foram administradas a Rag- / y- / - camundongos de 6 semanas de idade por injeção intravenosa (5*105 células) ou intracardíaca (1*105 células) para avaliar as diferenças no potencial metastático de células injetadas no sangue arterial ou venoso. Todos os animais que receberam células transfectadas com CTRL-shRNA na veia lateral da cauda morreram dentro de 32 dias de injeção devido à metástase pulmonar. Animais que tinham um número igual de células transfectadas com ROR1-shRNA injetadas na veia da cauda sobreviveram significativamente mais tempo (Fig. 4A). Animais injetados com células transfectadas com CTRL-shRNA tinham bioluminescência maior por 19-vezes ou 60-vezes nos pulmões no dia 21 ou no dia 28, respectivamente, do que os camundongos injetados com células silenciadas para ROR1 (Figura 4B). Nós também sacrificamos animais em outro experimento várias vezes para examinar os pulmões para doença metastática. Enquanto que focos metastáticos nascentes foram detectados prontamente aos 3 dias após a injeção de células transfectadas com CTRL-shRNA, poucos, se é que houve algum, focos metastáticos puderam ser detectados nos pulmões dos animais injetados com células ROR1-silenciadas, mesmo em pontos de tempo posteriores (Figura 4C-E). Além disso, os pulmões extirpados de camundongos injetados com células transfectadas com CTRL-shRNA tinham significativamente maior bioluminescência ex vivo e mediana de peso (3 vezes e seis vezes mais no dias 21 e 28, respectivamente) do que os pulmões de camundongos injetados com células ROR1- silenciadas (Figura 4F-G, dados não mostrados). Os focos metastáticos que se desenvolveram em animais injetados com células transfectadas com CTRL-shRNA também expressaram níveis mais elevados de fosfo- AKT e fosfo-CREB e tinham maiores proporções de proliferação de células do que os poucos focos metastáticos que detectamos em camundongos injetados com células ROR1-silenciadas, que em vez disso expressaram níveis mais elevados de CK-19 e menores níveis de vimentina (Figura 47).

[0195] Também examinamos para doença metastática após injeção de 1x105 células no ventrículo esquerdo cardíaco. Todos os camundongos que receberam células transfectadas com CTRL-shRNA morreram dentro de 30 dias após esta injeção, enquanto que animais injetados com células ROR1-silenciadas sobreviveram significativamente mais tempo (Figura 4H). Camundongos injetados com células transfectadas com CTRL-shRNA desenvolveram substancial bioluminescência femoral/de área pélvica, que não foi detectada em camundongos injetados com células tumorais silenciadas para ROR1 (Figura 4, I e J). Nós sacrificamos animais no dia 21 e descobrimos que os ossos de fêmur/pélvicos isolados de camundongos injetados com células transfectadas com CTRL-shRNA tinham alta bioluminescência (Figura 4K) devido à metástase extensa da medula (Figura 4L), que não foi aparente em camundongos injetados com células silenciadas para ROR1.

[0196] Estudos recentes descobriram que diferentes sítios de tecidos impõem exigências diferentes para a criação de metástases por circulação de células de câncer. Linhagens celulares de câncer de mama humano BoM1833 e LM2-4175 foram selecionadas de MDA-MB- 231 para ter tropismo de diferentes tecidos. BoM-1833 preferencialmente metastatiza para o osso e LM2-4175 preferencialmente metastatiza para o pulmão. Descobrimos que cada uma destas linhas de célula reteve expressão de ROR1 (Figura 5A). Transfecção de cada linhagem celular com ROR1-shRNA2 silenciou a expressão de ROR1 (Figura 5B e C), permitindo-nos examinar a ROR1- dependência da metástase de órgão específico após injeção intravenosa de 2x105 LM2-4175 ou injeção intracardíaca de 1xio5 BoM- 1833 em RAG-/—YC-/-camundongos de 6 semanas de idade. Camundongos injetados com LM2-4175 silenciados para ROR1 tiveram um aumento de mediana significativamente menor em bioluminescência do pulmão e sobrevida média significativamente mais longa do que os camundongos injetados com LM2-4175 CTRL-shRNA-transfectadas (Figura 5 e E). Consistente com estas observações, os pulmões de camundongos isolados 21 dias após a injeção de LM2-4175 ROR1- silenciada tinha significativamente menor peso mediano, bioluminescência ex vivo e focos metastáticos menores e menos do que os camundongos injetados com LM2-4175 CTRL-shRNA-transfectadas (Figura 5F a H). Da mesma forma, camundongos injetados com BoM- 1833 silenciados para ROR1 tinham significativamente menores aumentos em bioluminescência esquelética do que camundongos injetados com igual número de BoM-1833 CTRL-shRNA-transfectadas (Figura 5I e J). Além disso, a necropsia de animais sacrificados 21 dias após Injeção intracardíaca revelou poucos, se houve algum, focos metastáticos detectáveis no osso ou no fígado. Isto estava em nítido contraste com a doença metastática extensa detectada em cada um desses sítios em animais injetado com BoM-1833 CTRL-shRNA- transfectadas (Figura 5J e K).

Exemplo 5 Um Anticorpo Anti-ROR1 Inibe Metástases de Câncer

[0197] Anticorpos Monoclonais (mAb) específicos para o domínio extracelular de ROR1 foram gerados e um, designado D10, poderia induzir rápida modulação negativa da superfície de ROR1 a 37oC (Fig. 5A). Tratamento de MDA-MB-231 com D10 causou internalização de ROR1, avaliada através de microscopia confocal (Figura 5B). Isto resultou em redução significativa de ROR1 de superfície, avaliada através de citometria de fluxo, usando um diferente mAb específico para um epítopo sem cross-blocking, distinto, de ROR1 (Figura 5C). Tratamento de MDA-MB-231 com D10 também reduziu expressão da vimentina citoplasmática (Figura 5), que estava ligada a ROR1 em estudos de precipitação co-imune (Figura 5E). Tratamento com D10 também significativamente inibiu a capacidade de migração e invasão do MDA-MB-231 in vitro (Figura 5F e G). D10 também pôde inibir a capacidade de migração/invasão de outras linhas celulares de câncer de ROR1+ (por exemplo, HS-578T e BT549 (Figura 9)).

[0198] D10 foi avaliado para inibição da invasão e metástase de MDA-MB-231 injetado na veia da cauda de RAG-/—YC-/-camundongos. Após injeção de 5x105 células, os camundongos receberam uma injeção intravenosa de controle de IgG ou D10 a 5 mg/kg e foram sacrificados então 3 dias depois. A bioluminescência ex vivo dos pulmões dos animais que receberam D10 foi significativamente menor do que os animais tratados com controle IgG (Figura 5H). Além disso, os pulmões dos animais que receberam controle IgG tinham vários focos metastáticos, que não foram detectáveis em camundongos tratados com D10. Em outro experimento, cada camundongo recebeu uma injeção intravenosa de 5x105 MDA-MB-231 e então recebeu 3 injeções semanais intravenosas de controle IgG ou D10 a 5 mg/kg. Camundongos tratados com D10 desenvolveram significativamente menos bioluminescência pulmonar do que os camundongos que receberam controle IgG (Figura 5, I e J). Quando sacrificados no dia 35, os pulmões de camundongos tratados com D10 tinham significativamente menor peso (Figura 5 K) e menos focos metastáticos (Figura 5L) do que os pulmões dos animais que receberam controle IgG. Coletivamente, estes dados indicam que D10 pode inibir metástase em camundongos imunodeficientes.

[0199] Em conclusão, é por este meio demonstrado que ROR1 pode mediar a metástase do câncer de mama e que direcionamento terapêutico de ROR1 pode retardar o desenvolvimento de metástase de câncer de mama. Embora as células-tronco embrionárias expressem detectável proteína de ROR1 e a perda de ROR1 possa realçar anormalidades esqueléticas e do coração em camundongos deficientes em ROR2, principais tecidos adultos raramente expressam proteínas de ROR1, exceto em níveis baixos no pâncreas e tecido adiposo, fornecendo os anticorpos e os métodos para a sua utilização da invenção com especificidade de câncer de ROR1

Exemplo 6 Anticorpos de alta afinidade de ROR1

[0200] Estudos de epítopo foram realizados no anticorpo de ROR1 D10, descrito acima. Uma série de proteínas quiméricas com trechos de ROR1 humanos e de camundongo foram geradas para mapear o(s) epítopo(s) reconhecido por D10 que podem para modular para baixo ROR1, efetuar redução na expressão de vimentina e inibir a migração de células de câncer in vitro (um marcador substituto bom da capacidade do câncer para formar metástases). A única região de ROR1 que está envolvida é o domínio semelhante a lg que é no terminal amino de ROR1. Cada construto contém um domínio quimérico semelhante a Ig e domínio humano de CRD e Kringle (porção de camundongo é clara, porção humana é escura). Apenas os domínios semelhantes a Ig são mostrados aqui (Figura 6). Esses construtos foram expressos nas células de estilo livre 293. Meios de cultura usados foram immunoblot e proteínas purificadas foram usadas para ELISA. Já que mAb anti-ROR1 D10 reconheceu ROR1 humano, mas não o ROR1 de camundongo, achar qual desses construtos pode ou não pode ligar poderia ajudar a mapear o epítopo reconhecido por D10. Os resultados indicam que os anticorpos D10 liga ROR1 no C-terminal do domínio semelhante a Ig contíguo ao domínio CRD (Figura 7). A Figura 8 mostra o mapeamento do epítopo para o anticorpo 4A5 de ROR1. Como indicado o epítopo 4A5 difere do epítopo D10.

[0201] Como descrito acima, um anticorpo anti-ROR1, ou seja, D10, pode inibir a metástase pulmonar de célula MDA-MB-231 in vivo. O anticorpo monoclonal D10 facilita a internalização do receptor ROR1 (Figura 9 A, B). As células MDA-MB-231 foram coloradas com iso- Alex647, ou D10-Alex647 por 30 min no gelo. As células coloradas foram então separadas em duas frações. Uma fração foi mantida no gelo por 1h e as outras frações foram transferidas para 37° C por 15min, 30min. Tratamento de anticorpo anti-ROR1 D10 de vinte e quatro horas diminui expressão de superfície de ROR1 em células MDA-MB-231 (Figura 9C). ROR1 forma complexo com vimentina em células MDA- MB-231 de câncer de mama (Figura 9D). Tratamento com anticorpo D10 in vitro poderia diminuir a expressão de vimentina (Figura 9E) Anticorpos anti-ROR1 diminuem a migração de câncer de mama in vitro. (Figura 9F). O anticorpo monoclonal D10 inibe metástase pulmonar de estágio inicial (dia 2) de câncer de mama de MDA-MB-231 (Figura 9G). O anticorpo monoclonal D10 inibe metástase pulmonar de câncer de mama de MDA-MB-231 (Figura 9H). Camundongos de xenoenxerto camundongos foram intravenosamente (i.v.) injetados com anticorpo anti-ROR1 a 200mg no dia 1 e anticorpo anti-ROR1 a 100mg nos dias 3, 7, 14 e 21. Os fluxos de fóton normalizados do pulmão de camundongos portando MDA-MB-231 são mostrados. Camundongos representativos injetados com células 5E5 MDA-MB-231 são mostrados na posição dorsal (Figura 9I). Tratamento com anticorpo de anti-ROR1 reduziu o peso do pulmão de camundongos portadores de MDA-MB- 231 (Figura 9J). Histologia pulmonar de H&E representativa de camundongos portadores de MDA-MB-231 após tratamento com anticorpo anti-ROR1 (Figura 9K). As barras de erro indicam SEM; *p<0,05, **p<0,01; com base no teste t de Student de dois lados não pareados.

[0202] Os construtos representados na Figura 6 foram usados para selecionar anticorpos recombinantes de alta afinidade. Western nativo também indicou que todos os três mAbs semelhantes a D10 humanizados se direcionam ao epítopo como D10 e requerem aminoácido 138 para ligação a ROR1 humano (Figura 10). Construtos ROR1-ex quiméricos e humanos foram transfectados em 293 células. Isto permitiu produção de proteínas de ROR1 quiméricas humano- camundongo recombinantes que então poderiam ser separadas por tamanho em um gel PAGE não-desnaturante ou gel SDS-PAGE para análise de immunoblot com mAb anti-ROR1 diferente. Os resultados indicam que ambos anticorpos D10 e 99961 se ligam para a mesma região, no C-terminal do domínio semelhante a Ig, e D10 e 99961 podem se ligar a ROR1 sob condições desnaturadas e nativas. O domínio extracelular humano completo é fornecido na faixa mais à esquerda de qualquer gel (Figura 11). Anticorpo 99961 tem uma 50x maior afinidade de ligação para ROR1 que D10 e reduzida carga leucêmicas mais que D10 (Figura 12). O anticorpo 99961 foi humanizado para produzir quatro anticorpos designados 99961.1, 99961.2, 99961.3 e 99961.4.

Caracterização de anticorpo de ROR1 99961

[0203] Ensaios foram realizados para demonstrar a atividade específica de 99961 contra células CLL em camundongos imunodeficientes de sangue de cordão humano reconstituído. RAG-/-Y- /-camundongos reconstituídos com células de sangue do cordão umbilical humano (CB), a fim de desenvolver um sistema imunológico humano foram injetados i.p. com PBMC fresco ou congelado de CLL. No dia seguinte os camundongos receberam 1mg/kg de 99961 ou D10 ou controle mIgG i.v. Sete dias mais tarde, as células PBMC de CLL de cavidade peritoneal foram colhidas e analisadas por citometria de fluxo (figura 13A). Os dados indicam que o 99961 elimina > 90% das células de CLL e não tem efeito sobre desenvolvimento normal de célula T ou B humana (Figura 13B, C).

[0204] Estudos realizaram-se, também, para demonstrar a atividade específica de 99961 em ROR+ AML primária. Os resultados indicam que 99961 diminui a sobrevida das colônias primárias e A capacidade de autorrenovação das colônias secundárias (Figura 14).

[0205] Mapeamento de epítopo do mAb 99961 demonstrou que este epítopo só é expresso em vários tipos de câncer e não em células de sangue de cordão ou adultas humanas e células progenitoras ou células-tronco derivadas de fígado fetal (Figura 15). Também ficou demonstrado que 99961 liga-se às células leucêmicas mas não reage cruzado com tecidos adultos normais (Figura 16). A matriz de linfoma multi-tecido multi era da Lifescan Biosciences (LS-SLYCA5) com seções de 40 linfomas, havia 5 casos onde Ab9991 ligou-se às células malignas. A matriz de multi-tecido normal de Biomax (FDA999) com seções de vários diferentes tecidos normais não mostrou áreas específicas de ligação com 99961. A imuno-histoquímica foi realizada usando recuperação deantígeno induzida por calor com tampão de pH elevado da DAKO (Carpenteria, CA), seguida por potenciamento usando amplificação de tiramida biotinil (kit CSA da DAKO).

[0206] Foram realizados estudos de PK de 99961 com 1mg/ anticorpo de camundongo injetado iv em Rag-/-Y-/-camundongos. Sangue foi tirado em pontos diferentes de tempo e níveis de mAb 99961 no plasma foram medidos por ELISA. Os resultados indicam que o meia- vida do anticorpo foi 11,4 dias, volume foi de 1,18 mL (47 mL/kg) e depuração foi 0,072 mL/dia (0,12 mL/h/kg) consistente com outras macromoléculas e anticorpos clinicamente utilizados (Figura 17).

Exemplo 7 Vacina de peptídeo de ROR1

[0207] Como discutido acima, ficou demonstrado que D10 se liga no carboxi terminal do domínio semelhante a Ig que é contíguo ao domínio CRD de ROR1. Anticorpo 4A5 se liga a um epítopo diferente do domínio semelhante a Ig e carece de atividade biológica. Os epítopos dos mAbs foram confirmados por sítio-mutação e ROR1-ex quimérico dos aminoácidos diferentes entre ROR1 de camundongo e humano. Peptídeos correspondentes ao domínio extracelular de ROR1 onde D10, 4A5 e outras ligações de anticorpos de ROR1 foram construídas, A19, R22 e K19. O peptídeo A19 corresponde ao epítopo reconhecido pelo mAb 4A5; peptídeo R22 corresponde ao epítopo reconhecido pelo mAb D10, o mAb 99961 (ou seja, VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC) e osmAbs 99961 humanizados; e peptídeo K19 correspondem a uma região de domínio Kringle que é reconhecida por outro mAb específico para ROR1 (Figura 18). Os três peptídeos foram cada um conjugados no C-terminal com hemocianina do caranguejo Megathura crenulata (KLH) para imunização em adjuvante de Freund completo (CFA) ou adjuvante de Freund incompleto (IFA). Uma cisteína (C) foi adicionada no C-terminal e usada para conjugação de KLH com MBS (Figura 20). A reação de conjugação é retratada na Figura 19. Os peptídeos conjugados foram mostrados ligando-se a D10 e 99961 (Figura 21). C57Bl/6 e camundongos transgênicos foram imunizados com os peptídeos conjugados. Anticorpos foram coletados 4 semanas após a imunização. Vacina de R22-KLH induziu uma maior concentração de antissoros anti-ROR1 em camundongos C57BL/6 ou camundongos ROR1-Tg (Figura 28). Este experimento foi repetido com um peptídeo de 16 aminoácidos do epítopo D10, R16 que também induziu anticorpos que reagiram com a proteína humana de ROR1, embora os títulos fossem geralmente inferiores aos induzidos por R22-KLH (dados não mostrados).

[0208] Anticorpos anti-ROR1 induzidos pela vacina de R22-KLH foram mostrados ligando-se à superfície de ROR1 presente nas células EW36, JeKo-1 ou CLL (Figura 29). Para este estudo, uma diluição do antissoro de camundongos imunizados com R22-KLH foi incubada com as células por 20 minutos a 4 graus C. As células então foram lavadas e então marcadas com um lg anti-camundongo de cabra que foi conjugado com um fluorocromo para a detecção por citometria de fluxo. Os histogramas abertos são as células coloradas com Ig anti- camundongo de cabra sem primeiro incubar as células com os antissoros R22-KLH. Os histogramas sombreados são a fluorescência das células que primeiro foram incubadas com antissoros anti-R22-KLH. O aumento na fluorescência das células é devido aos anticorpos anti- ROR1 de camundongo ligados à superfície, que em seguida foram detectados com Ig anti-camundongo de cabra. Os antissoros pré- imunização destes camundongos ou os antissoros de camundongos imunizados com KLH não se ligaram a essas células (Figura 29)

[0209] O antissoro induzido por R22-KLH foi testado para citotoxicidade dependente de complemento. Células EW36, Jeko-1, 1- CLL e CLL-2 foram lavadas e plaqueadas a 25μl com 5*105 células por poço em FBS de RPMI/10% em placas de 96 poços de fundo redondo (Corning Costar). Os antissoros diluídos (25μl) e 25μl de uma diluição de 1:5 de complemento de bebê coelho foram adicionados por poço. MAb de D10 foi usado como controle positivo. Todas as condições foram realizadas em triplicata. As placas foram incubadas durante 4h a 37° C, e as células foram quantificadas imediatamente para viabilidade pela coloração de DiOC6/PI e Análise de Fluxo Citométrico. Este estudo indica que D10 ou os antissoros gerados contra o peptídeo R22 poderiam dirigir lise mediada por complemento de células portando ROR1 humano (Figura 30). Células que não portavam ROR1 não foram mortas.

[0210] As subclasses de Ig dos anticorpos induzidos por R22-KLH foram examinadas. Para isso, usamos um ELISA empregando placas revestidas com ROR1 humano, que depois foram incubadas com antissoros diluídos, lavados e então detectadas usando anticorpos secundários conjugados a enzima específica para cada uma das subclasses de IgG, conforme indicado no eixo x. Os resultados mostraram que IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3 foram todos induzidos em diferentes graus. IgG2a, IgG2b e IgG3 estão associados com perfil Th1 e IgG1 é associado com o perfil Th2. Estes resultados indicam que células ajudantes de T Th1 e Th2 CD4+ são ambas ativadas após a vacinação.

[0211] R22-KLH foi usado para imunizar camundongos C57BL/6, conforme mostrado na figura 31. A primeira injeção de peptídeo KLH ou R22-KLH foi em CFA. A segunda injeção e as injeções subsequentes foram em IFA. Os animais foram sangrados nos dias marcados com a seta roxa. Quarenta e quatro dias após o dia da primeira injeção, os camundongos C57BL/6 foram desafiados com células CLL que expressam ROR1-humano que se originaram em um ROR1 humano de camundongo transgênico. Este camundongo foi transgênico para a T- celular-leucemia 1 (gene TCL1). Ambos os transgenes estão sob o controle de um promotor/potenciador célula B-específico (E-Cμ). Esta leucemia se assemelha a CLL humana e expressa ROR1 de superfície humana.

[0212] Os antissoros coletados produziram uma redução significativa da carga de células de leucemia em camundongos imunizados com R22-KLH, mas não em camundongos imunizados com KLH. (Figura 32) C57BL/6 camundongos

[0213] R22-KLH foi usado para imunizar camundongos C57BL/6 de acordo com o esquema como mostrado na figura 33. A primeira injeção de peptídeo KLH ou R22-KLH foi em CFA. A segunda injeção e injeções subsequentes foram em IFA. Os animais foram sangrados nos dias marcados com a seta roxa. Quarenta e quatro dias após o dia da primeira injeção, os camundongos C57BL/6 foram desafiados com células CLL que expressam ROR1-humano que se originou em um ROR1 de humano camundongo transgênico que também foi geneticamente modificado para T-celular-leucemia 1 (gene TCL1). Ambos os transgenes estão sob o controle de um promotor/potenciador célula B-específico (E-Cμ). Esta leucemia se assemelha a CLL humana e expressa ROR1 de superfície humana.

[0214] Resposta de anticorpo para ROR1 humano foi observada em camundongos imunizados com R22-KLH no dia 42, mas não em camundongos imunizados com KLH. Todos os 4 camundongos imunizados com R22-KLH geraram anticorpos de alto título contra ROR1 humano como detectado via ELISA empregando placas revestidas com o domínio extracelular da proteína de ROR1 humano recombinante. Estes dados indicam que a imunização com o peptídeo R22-KLH pode quebrar autotolerância para ROR1, que é expressa em todas as células B destes camundongos de ROR1-Tg. Os baços dos camundongos que receberam o peptídeo R22-KLH mantiveram-se semelhantes aos animais de controle, mas os camundongos KLH tinham significativamente maiores baços (Figura 34).

[0215] Citometria de fluxo de esplenócitos de camundongos C57BL/6 imunizados com KLH ou R22-KLH, usando fluorocromo- conjugado mAb específico para CD5 ou ROR1. O mAb usado para colorar as células se liga a um epítopo de não-crossblocking de ROR1 do que os anticorpos induzidos por R22-KLH. Observe que existem muito menos, se houver, células de leucemia nos baços de camundongos imunizados com a vacina de R22-KLH (Figura 39.)

[0216] O número total de células de leucemia encontradas nos baço de camundongos C57BL/6 injetados com peptídeo R22-KLH 30 dias mais cedo com 1x105 células CLL + ROR1 humano foi significativamente menor do que o baço de camundongos injetados com KLH. O número de células de leucemia por baço derivou-se multiplicando a porcentagem de células de leucemia nas populações de esplenócito (avaliadas através de citometria de fluxo), pelo número de esplenócitos colhidos do baço (Figura 34).

[0217] O número de células CD8+ no baço de camundongos imunizados com KLH ou R22-KLH foi determinado por citometria de fluxo. Após imunização com R22-KLH houve um aumento dramático em células CD8 T, que não foram aumentadas em camundongos imunizados com KLH. A linha inferior indica o número absoluto de células T CD8 colhidas dos baços dos camundongos no dia 75 (Figura 37) Camundongos transgênicos de ROR1 C57Bl/6

[0218] Camundongos transgênicos foram injetados com R22-KLH ou KLH conforme mostrado na figura 38. Os camundongos são transgênicos para ROR1 humano sob uma célula B específica de promotor/potenciador (E-Cμ). A primeira injeção de peptídeo KLH ou R22-KLH foi em CFA. A segunda injeção e injeções subsequentes foram em IFA. Os animais foram sangrados nos dias marcados com a seta roxa. Quarenta e quatro dias após o dia da primeira injeção, os camundongos C57BL/6 foram desafiados com células CLL que expressam ROR1-humano que se originou em um ROR1-Tg humano de camundongo que também foi geneticamente modificado para T- celular-leucemia 1 (gene TCL1). Ambos os transgenes estão sob o controle de um promotor/potenciador célula B-específico (E-Cμ). Portanto, estes camundongos ROR1-Tg tem células B que expressam ROR1 humano. Os resultados demonstram que o peptídeo R22-KLH pode induzir imunidade protetiva anti-ROR1 nos camundongos que expressam ROR1 e, portanto, quebra autotolerância.

[0219] Resposta de anticorpo para ROR1 humano foi observada em camundongos de ROR1-Tg imunizados com R22-KLH no dia 42, mas não em camundongos imunizados com KLH. Todos os 4 camundongos imunizados com R22-KLH geraram anticorpos de alto título contra ROR1 humano como detectado via ELISA empregando placas revestidas com o domínio extracelular da proteína de ROR1 humano recombinante. Uma análise mais aprofundada por citometria de fluxo demonstrou que existem menos, se existem, células de leucemia no baço de camundongos imunizados com a vacina de R22-KLH do que os camundongos imunizados com KLH (figura 40). Análise de FACs também mostrou que ROR1 foi modulado para baixo nos camundongos imunizados com R22-KLH mas não nos camundongos imunizados com KLH. Baços de camundongos imunizados com R22-KLH tinham células de leucemia significativamente menores em comparação com camundongos imunizados com KLH. Como com os camundongos C57BL/6, imunização com R22-peptídeo-KLH conduziu a um aumento dramático em células T CD8, que não foram aumentadas em camundongos imunizados com KLH (figura 39). Resultados semelhantes foram vistos com células T CD4+ (Figura 43) e células T CD3+ (Figura 42). Camundongos BALB/c

[0220] Camundongos BALB/c foram imunizados com KLH ou R22- KLH conforme mostrado na Figura 22. Para isso, cada KLH ou peptídeo KLH-conjugado formou-se em uma emulsão com adjuvante (CFA ou IFA). CFA foi usado para a primeira imunização e IFA foi usado para o impulso subsequente. Os dias de sangramento e injeção de peptídeo são indicados.

[0221] Níveis de anticorpo anti-ROR1 induzidos por R22-KLH foram determinados por ELISA. Domínio de ROR1-extracelular purificado foi revestido com placa de 96 poços e incubou antissoros com tempos de diluição indicados de dias de sangramento individuais. Resultados de ELISA indicaram que as concentrações de anticorpos anti-ROR1 foram induzidas em camundongos BALB/c imunizados ao longo do tempo. O soro desses animais recolhido antes da imunização não reagiu com a proteína de ROR1, mesmo em baixa diluição.

[0222] Análise de Immunoblot também indicou que anticorpos anti- ROR1 gerados por imunização de R22-KLH de camundongos BALB/c produziram anticorpos anti-ROR1 que tinham a mesma especificidade de epítopo como D10 (Figura 23). Além disso, parece que os antissoros também reagem com a proteína do camundongo.

[0223] Análise de FACS confirmou a ligação de antissoros de R22- KLH-imunizados camundongos BALB/c para ROR1 na superfície das células. Camundongos transgênicos II

[0224] Camundongos transgênicos foram imunizados com R22- KLH ou KLH conforme mostrado na figura 24. O peptídeo conjugado de KLH foi misturado com adjuvante (CFA ou IFA). CFA foi usado para a primeira imunização e IFA foi usado para o impulso subsequente. Resultados de ELISA indicaram que as concentrações de anticorpos anti-ROR1 foram induzidas em camundongos transgênicos de ROR1 imunizados por R22-KLH ao longo do tempo. Análise de FACS confirmou a ligação de antissoros de R22-KLH-imunizados camundongos transgênicos de ROR1 para ROR1 na superfície das células.

[0225] Antissoros de camundongos R22-KLH-imunizados foram examinados pela capacidade de internalização de receptor ROR1. Células MDA-MB-231 foram incubadas com antissoros de camundongos transgênicos a 4° C ou a 37° C durante 1 h e então coloradas com isotipo-Alexa647, ou Alexa647-4A5 por 30 min no gelo antes da análise de FACS da expressão de ROR1. Os resultados mostraram que antissoros ROR1 de camundongos transgênicos imunizados com R22-KLH induziram internalização de receptor ROR1 (figura 25)

[0226] Antissoros de camundongos R22-KLH-imunizados foram examinados para determinar seu efeito na migração de câncer de mama. Células migradas foram observadas sob ampliação de 10* após 1h de tratamento antissoro e, em seguida, 16 h de incubação a 37 °C. Os resultados são as médias ± s.e.m. n=3. **p < 0,01. Os resultados indicaram que soros Anti-ROR1 de camundongo transgênico podem diminuir s migração de câncer de mama in vitro (Figura 26).

Claims

1. Anticorpo anti-ROR1 isolado, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a referida região variável da cadeia pesada compreende uma CDR1 conforme estabelecido na SEQ ID NO: 27, uma CDR2 conforme estabelecido na SEQ ID NO: 28, uma CDR3 conforme estabelecido na SEQ ID NO: 29; e em que a referida região variável da cadeia leve compreende uma CDR1 conforme estabelecido na SEQ ID NO: 30, uma CDR2 conforme estabelecido na SEQ ID NO: 31, e uma CDR3 conforme estabelecido na SEQ ID NO: 32.

2. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida região variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 17; e em que a referida região variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 19.

3. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a referida região variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos apresentada pela SEQ ID NO: 5; e em que a referida região variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos apresentada pela SEQ ID NO: 7.

4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga aos aminoácidos 130-160 do polipeptídeo maduro de hROR-1.

5. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo requer que o aminoácido 138 de ROR-1 do polipeptídeo maduro seja ácido glutâmico para ligação a hROR-1.

6. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que (a) o anticorpo inibe metástases; e/ou (b) o anticorpo é humanizado ou quimérico.

7. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que codifica o anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que uma sequência nucleotídica que codifica a região variável da cadeia pesada do anticorpo compreende a sequência nucleotídica apresentada em qualquer uma das SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 18, e uma sequência nucleotídica que codifica a região variável da cadeia leve do anticorpo compreende a sequência nucleotídica estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, e SEQ ID NO: 20.

8. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é para uso como um medicamento na supressão de metástases de câncer que expressa ROR-1, o uso compreendendo a interrupção da transição epitélio- mesênquima de células tumorais pela administração do anticorpo.

9. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o câncer que expressa ROR-1 é selecionado do grupo que consiste em: leucemia de células B, linfoma, CLL, AML, B-ALL, TALL, ovário, cólon, pulmão, pele, câncer pancreático, testicular, da bexiga, uterino, próstata e adrenal.

10. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento ou prevenção de um câncer em um indivíduo, o uso compreendendo a administração ao indivíduo do anticorpo.

11. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo que consiste em: leucemia de células B, linfoma, CLL, AML, B-ALL, T-ALL, ovário, cólon, pulmão, pele, pancreático, testicular, câncer de bexiga, útero, próstata e adrenal.

12. Uso do anticorpo anti-ROR-1 isolado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e 9 a 11, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de uma composição farmacêutica ou medicamento para tratar ou prevenir um câncer em um indivíduo.

13. Uso do anticorpo anti-ROR-1 isolado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e 9 a 11, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de uma composição farmacêutica ou medicamento para suprimir metástases de cânceres que expressam ROR-1 e para interromper a transição epitélio-mesênquima de células tumorais.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo constituído por: leucemia de célula b, linfoma, LLC, AML, B-ALL, T-ALL, câncer de ovário, cólon, pulmão, pele, pâncreas, testículo, bexiga, útero, próstata e adrenal.

15. Uso, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer que expressa ROR-1 e é selecionado do grupo constituído por: leucemia de célula b, linfoma, LLC, AML, B-ALL, T-ALL, câncer de ovário, cólon, pulmão, pele, pâncreas, testículo, bexiga, útero, próstata e adrenal.