BR112014014664B1 - Método para analisar um gene ahasl de planta e kit para analisar um gene ahasl de planta - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA ANALISAR UM GENE AHASL DE PLANTA, KIT PARA ANALISAR UM GENE AHASL DE PLANTA E INICIADOR DIRETO AHASL. A presente descrição disponibiliza métodos, kits e iniciadores para analisar genes AHASL de plantas, incluindo trigo. Os métodos, kits e iniciadores da presente invenção podem utilizar iniciadores diretos AHASL projetados sem usar software ou outra tecnologia de ensaio?design e podem ser usados em um ensaio de PCR em tempo real para determinar a zigosidade de genes AHASL que codificam enzimas AHAS que outorgam tolerância a inibidores de enzimas AHAS.

Description

Campo da invenção

[0001] A presente invenção se refere ao campo da análise dos genes e, em particular, a métodos e composições para a análise de genes AHASL e a identificação de seu caráter zigomático.

Antecedentes da invenção

[0002] A aceto-hidroxiácido sintase (AHAS; EC 4.1.3.18), também conhecida como acetolactato sintase (ALS), é a primeira enzima que catalisa a síntese bioquímica dos aminoácidos de cadeia ramificada valina, leucina e isoleucina (Singh B. K. (Ed) Plant amino acids. Marcel Dekker Inc. New York, N.E. Pg 227-247). AHAS é o sítio de ação de quatro famílias de herbicidas estruturalmente diversas que incluem as sulfoniluréias (LaRossa R A e Falco S C, 1984 Trends Biotechnol. 2:158-161), as imidazolinonas (Shaner et ao., 1984 Plant Physiol. 76:545-546), as triazolopirimidina (Subramanian and Gerwick, 1989, A inibição da acetolactato sintase pelas triazolopirimidinas em (ed) Whitaker J R, Sonnet P E Biocatalysis in agricultural biotechnology. ACS Symposium Series, Americam Chemical Society. Washington, D.C. Pg 277-288), e pelos benzoatos de pirimidinilo (Subramanian et ao., 1990 Plant Physiol 94: 239-244.). Mediante a inibição da atividade de AHAS, estas famílias de herbicidas impedem o maior crescimento e desenvolvimento de plantas sensíveis inclusive muitas espécies de ervas daninhas. Os herbicidas imidazolinona (IMI) e sulfoniluréia (SU) são de amplo uso na agricultura moderna, devido a sua efetividade com coeficientes de aplicação muito baixos e relativa ausência de toxicidade nos animais.

[0003] Nas plantas, a enzima AHAS consiste de duas subunidades: uma subunidade grande (função catalítica) e uma subunidade pequena (função reguladora) (Duggleby and Pang (2000) J. Biochem Mol Biol 33:1-36). A subunidade grande AHAS (AHASL) pode ser codificada por um único gene, como no caso de Arabidopsis e arroz, ou por vários membros da família de genes, como em milho, canola e algodão. Umas substituições específicas, de um único nucleotídeo na subunidade grande pode conferir à enzima um grau de insensibilidade frente a uma ou mais classes de herbicidas (Chang and Duggleby (1998) Biochem J. 333:765-777). Por convenção, as modificações da sequência de aminoácido AHAS geralmente se identificam com referência a sua posição na sequência de AHAS de Arabidopsis thaliana (N.° de acesso de EMBL X51514) e são denotadas com (At).

[0004] As modificações de genes AHAS podem dar lugar a fenótipos tolerantes aos herbicidas (Hattori, 1995; Warwick, 2008). As substituições nos genes, que codificam a subunidade grande AHAS, são denominadas como genes AHASL, é a base molecular da tolerância aos herbicidas nas plantas de cultivo CLEARFIELD ® que têm uma tolerância incrementada aos herbicidas imidazolinona. Devido a que cada uma destas substituições tem como resultado um fenótipo semidominante, uma substituição em um estado heterozigoto pode ser suficiente para produzir um nível de tolerância aos herbicidas que é aceitável para muitos sistemas de produções de plantas de cultivo. No entanto, para aplicações de herbicida particulares, e em casos de plantas de cultivo que tenham múltiplos genes AHASL, tais como o trigo, são desejáveis as combinações de substituições para conseguir um maior nível de tolerância aos herbicidas.

[0005] Triticum aestivum é uma espécie de trigo hexaploide que tem três genomas, ou seja, denominados um genoma D, um genoma B, e um genoma A. Cada genoma contém um gene AHAS e os genes foram nomeados levando em consideração o genoma de origem e seu parentesco evolutivo, por exemplo, o gene de AHAS de subunidade grande situado nos genomas D, B, e A de Triticum aestivum são conhecidos como TaAHASL1D, TaAHASL1B e TaAHASL1A, respectivamente.

[0006] Cada um dos genes apresenta uma expressão significativa baseada na resposta ao herbicida e nos dados bioquímicos obtidos de variantes em cada um dos três genes (Ascenzi et ao. (2003) International Society of Plant Molecular Biologists Congress, Barcelona, Espanha, Ref. N.° S10-17). As sequências de codificação de todos os três genes compartilham uma homologia extensa ao nível de nucleotídeo (documento WO 03/014357). Através do sequenciamento dos genes AHASL de diferentes variedades de Triticum aestivum, a base molecular da tolerância aos herbicidas na maioria das linhagens tolerantes à IMI (imidazolinona) demonstrou ser uma única troca de par de bases que tem como resultado a substituição de aminoácido S653 (At) N (S653N), o que indica uma substituição de uma serina por uma asparagina em uma posição equivalente à serina no aminoácido 653 na arabidopsis thaliana (documentos WO 03/014356, WO 03/014357). A substituição S653N é devida a um polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP) na sequência de DNA que codifica a proteína AHASL. A substituição foi identificada nos três genomas e deve ser fácil e rapidamente diferenciada o cultivo seletivo preciso e a confirmação de lotes de sementes comerciais (Berard, 2009; Dong, 2009).

[0007] Um dos objetivos dos cultivadores seletivos de plantas é o de introduzir uma tolerância à imidazolinona nas linhagens de trigo existentes mediante a indução da substituição de S653N nas linhagens existentes ou mediante o cruzamento de linhagens não resistentes a IMI com linhagens tolerantes a IMI, seguido por retrocruzamento e seleção baseada na tolerância à imidazolinona. Outro objetivo dos cultivadores seletivos de plantas é produzir plantas de trigo com níveis incrementados de tolerância à imidazolinona, além dos níveis de tolerância observados nas plantas de trigo que possuem uma única substituição de S653N em um único gene AHASL de trigo. Portanto, é desejável cultivar plantas de trigo que possuem combinações de substituições S653N em dois ou mais dos genes AHASL. Além disso, é também desejável cultivar seletivamente plantas de trigo que sejam homozigotas para o alelo S653N substituído em um ou mais dos genes AHASL. No entanto, para desenvolver as plantas de trigo desejadas, são necessários métodos rápidos para identificar as plantas desejadas. Os métodos existentes para a detecção de plantas de trigo com tolerância à imidazolinona não são muito eficientes para seu uso no desenvolvimento de plantas que possuam mais de um único alelo S653N em um gene AHASL único.

[0008] Os métodos existentes para a identificação de plantas com maior tolerância às imidazolinonas incluem os ensaios de rociado com herbicida em estufa e ensaios bioquímicos para detectar uma atividade de AHAS. No entanto, estes métodos consomem tempo e, em geral, não são adequados para distinguir, entre um grande número de plantas individuais, os incrementos sutis na tolerância à imidazolinona que podem surgir quando é introduzido um segundo alelo S653N em uma planta de trigo.

[0009] Os métodos alternativos para identificar plantas desejadas incluem métodos baseados no DNA. Por exemplo, os genes AHASL, ou porções dos mesmos, podem ser amplificados a partir de DNA genômico mediante métodos de reação em cadeia de polimerase (PCR) e o gene amplificado resultante AHSL ou parte do mesmo pode ser sequenciado para identificar o alelo S653N substituído e o gene AHASL particular que está presente no mesmo. No entanto, tal método de sequenciamento baseado no DNA não é eficiente para um grande número de amostras. Outro enfoque implica o uso de oligonucleotídeos específicos para alelos, radiomarcados ou marcados não isotopicamente (ASOs) como sondas para dot-blot de DNA genômico ou para DNA ampliado por PCR (polimerase chain reaction, reação em cadeia da polimerase). (Connor et ao. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 80:278-282; Orkin et ao (1983) J. Clin Invest 71:775-779; Brun et ao (1988) Nucl Acids Res. 16:352; e Bugawan et ao. (1988) Biotechnology 6:943-947. Embora este enfoque seja útil para distinguir entre dois alelos em um locus único, este enfoque não é útil para os genes AHASL de trigo, porque os três genes AHASL são quase idênticos na região que rodeia o SNP que dá lugar à proteína substituída S653 (At)N. Portanto, não seria possível desenvolver um conjunto de seis sondas de oligonucleotídeos, que fossem capazes de distinguir entre os alelos substituídos e de tipo selvagem em cada um dos três genes AHASL de trigo.

[0010] Um método que pode ser adoptado para classificar rapidamente grandes quantidades de indivíduos para a análise de um SNP é o ARMS (amplification refractory mutation system, sistema de amplificação refratária de mutação) (Newton et ao. (1989) Nucl. Acids Res. 17:2503-2516). Este método baseado em PCR pode ser utilizado para diferenciar entre dois alelos de um gene que diferem em um único nucleotídeo e também pode ser utilizado para diferenciar heterozigotas de homozigotas com relação a qualquer alelo por inspeção dos produtos de PCR depois de eletroforese em gel de agarose e tingimento com brometo. O método de ARMS baseia-se no suposto de que os oligonucleotídeos com um resíduo 3' que não combina não funcionará como iniciadores em PCR sob as condições adequadas (Newton et ao. (1989) Nucl. Acids Res. 17:2503-2516). Um sistema de mutação refratário (ARMS-PCR) que utilize métodos de detecção de gel baseados em agarose pode incorporar uma ausência interna de concordância dentro de um iniciador específico para alelo (AS) para reforçar o caráter específico do ensaio. Por exemplo, a posição de uma ausência interna de concordância foi investigada em um sistema alélico múltiplo em uma população de frangos na que um iniciador ótimo tinha 2 pares de base de ausência de concordância com relação ao nucleotídeo polimórfico.

[0011] O uso de ausências de concordância deliberadas no PCR quantitativa (qPCR) foi provado no campo médico. A genotipagem de SNP (polimorfismo de nucleotídeo individual, polimorfismo de um único nucleotídeo) é realizada com frequência para avaliar a sensibilidade a doenças e para a avaliação de quimerismo. O desenvolvimento de um sistema de qPCR foi tentado para o seguimento de quimerismo. O ensaio de SNP específico de qPCR foi capaz de detectar o alelo planilha positivo em 0,1%. Os iniciadores AS continham uma ou duas ausências de concordância intencionais dentro de 1-4 pares de bases do polimorfismo de interesse.

[0012] As ausências de concordância nos iniciadores dirigidos a uma região polimórfica de um gene em um organismo não poliploide demonstraram criar um corrimento na CT em direção a valores mais altos durante qPCR com detecção de SYBR verde (por exemplo, o gene lim1 de Picea glauca). Isto reduz a sensibilidade do ensaio, tornando esta técnica inadequada para amostras agrupadas. A troca é menos drástica quando a ausência de concordância está mais perto do extremo 3' do iniciador. No entanto, é necessário diminuir a concentração de DNA visando evitar a adição voluntária de ausências de concordância.

[0013] Apesar do ARMS-PCR ter demonstrado ser útil para a análise de um SNP em um gene único, este método, ou outros métodos baseados PCR, pode ser utilizado para a análise de SNP que dá lugar a substituições tolerantes aos herbicidas em genes AHAS nativos em genomas diferentes da mesma espécie, por exemplo, a substituição S653N em cada um dos três genes AHASL de trigo não foi objeto de informes. Os métodos existentes experimentam uma ausência de sensibilidade do ensaio que pode torná-los indesejáveis para a detecção de SNP, em particular para a detecção de SNP na análise de genes altamente homólogos na mesma espécie, por exemplo, em espécies que têm genomas múltiplos.

[0014] Portanto, continua existindo uma necessidade de um método que possa diferenciar mais eficientemente entre plantas de trigo que têm AHASLs de tipo selvagem e plantas de trigo que têm variantes de AHASLs e o caráter zigomático do mesmo.

Síntese da invenção

[0015] A presente divulgação disponibiliza métodos para a análise de um gene AHASL de planta. Os métodos podem implicar um ensaio que abrange disponibilizar DNA que abrange o gene AHASL de planta; amplificar o DNA utilizando um iniciador direto AHASL, um iniciador AHASL inverso, polimerase, e desoxirribonucleotídeos trifosfato; a detecção dos produtos da amplificação com uma sonda AHASL de tipo selvagem e com uma sonda AHASL tolerante aos herbicidas para identificar o caráter zigomático do gene AHASL, por exemplo, como homozigoto tipo silvestre, heterozigoto ou homozigoto substituído, e a substituição de nucleotídeos produz a substituição S653N. O ensaio pode ser um ensaio de PCR em tempo real ou um ensaio multiplex que permite um ensaio multiplex em tempo real. A sonda AHASL de tipo selvagem pode ser marcada com um primeiro tipo de sinal detectável, por exemplo, um primeiro tipo de molécula informante fluorescente e a sonda AHASL tolerante a herbicida pode ser marcada com um segundo tipo de sinal detectável, por exemplo, um segundo tipo de molécula informante fluorescente. O caráter zigomático do gene AHASL pode ser identificado baseando-se nos valores dCt gerados durante o ensaio de PCR em tempo real.

[0016] Os métodos para analisar um gene AHASL de planta podem ser utilizados para analisar o DNA genômico. Os métodos podem ser utilizados para a análise dos genes AHASL de plantas que têm genomas múltiplos. Por exemplo, os métodos descritos na presente invenção podem ser utilizados para analisar os genes AHASL de plantas de trigo, incluídas as plantas de trigo hexaploide e tetraploide, tais como Triticum aestivum e T. turgidum ssp. durum, respectivamente.

[0017] É desejável dispor de um método para distinguir entre os genes AHASL de diferenças espécies de trigo. Também é desejável ter um ensaio que não tenha uma diminuição da sensibilidade na análise de genes altamente homólogos dentro da mesma espécie, por exemplo, espécies de plantas tais como o trigo que tem genomas múltiplos, que são muito similares. Como foi descrito previamente, os métodos existentes têm uma sensibilidade reduzida e não são adequados para estes fins. Os métodos aqui descritos abordam a ausência de sensibilidade do ensaio dos métodos existentes e permitem distinguir entre os genes AHASL de diferentes espécies de trigo e analisar genes altamente homólogos dentro da mesma espécie, por exemplo, Triticum aestivum e T. turgidum ssp. duro.

[0018] Os métodos descritos na presente invenção utilizam iniciadores diretos AHASL projetados manualmente. Cada um dos iniciadores diretos AHASL pode incorporar, como o nucleotídeo 3’-terminal, um nucleotídeo que combine com um polimorfismo nucleotídeo único trialélico situado aproximadamente 40 nucleotídeos corrente acima com relação à substituição de nucleotídeos no gene AHASL que produz a substituição S653N. O iniciador direto AHASL também pode incluir uma ou mais ausências de concordância adicionais deliberadas de nucleotídeos com o gene AHASL. A ausência deliberada de concordância pode estar localizada 2 ou 3 nucleotídeos corrente acima a partir do nucleotídeo 3'-terminal do iniciador direto AHASL. Portanto, os iniciadores diretos AHASL podem ter uma ausência de concordância deliberada de nucleotídeos com o nucleotídeo no gene AHASL situado 2 ou 3 nucleotídeos corrente acima do SNP trialélico.

[0019] Como foi exposto anteriormente, o uso de iniciadores com ausência de concordâncias internas de nucleotídeos pode reduzir a sensibilidade do ensaio. Os métodos descritos aqui utilizam designs de iniciador baseados em uma ausência de coincidência deliberada de nucleotídeos e um polimorfismo único e em uma genotipagem SNP em tempo real para o aspecto de interesse. Além disso, outros tipos de marcadores, por exemplo, inserções, supressões, repetições de dois ou três nucleotídeos, microssatélite pequeno, ou outros SNPs, nas proximidades do polimorfismo de destino, podem disponibilizar um aspecto único que pode ser utilizado para aumentar a especificidade do ensaio. Os outros tipos de marcadores podem estar situados dentro de 300 pares de bases corrente acima ou corrente abaixo do polimorfismo de destino, preferentemente dentro de 200 pares de bases, mais preferivelmente dentro de 200 pares de bases.

[0020] Os métodos revelados no presente pedido podem utilizar iniciadores diretos AHASL que abrangem de dez a quinze nucleotídeos terminais da SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, ou SEQ ID NO:17. Os iniciadores diretos AHASL podem ser selecionados entre nucleotídeos que têm uma sequência indicada em SEQ ID NO:13, oligonucleotídeos que têm uma sequência indicada em SEQ ID NO:14, oligonucleotídeos que têm uma sequência estabelecida em SEQ ID NO:15, oligonucleotídeos que têm uma sequência estabelecida em SED ID NO:16, oligonucleotídeos que têm uma sequência estabelecida em SED ID NO:17, oligonucleotídeos que têm uma sequência estabelecida em SED ID NO:18, oligonucleotídeos que têm uma sequência estabelecida em SEQ ID NO:19, oligonucleotídeos que têm uma sequência estabelecida em SED ID NO:20; oligonucleotídeos que têm uma sequência estabelecida em SED ID NO:21, oligonucleotídeos que têm uma sequência estabelecida em SED ID NO:22, oligonucleotídeos que têm uma sequência estabelecida em SED ID NO:23, oligonucleotídeos que têm uma sequência estabelecida em SEQ ID NO:24, oligonucleotídeos que têm uma sequência estabelecida em SEQ ID NO:25, oligonucleotídeos que têm uma sequência estabelecida em SEQ ID NO:26, oligonucleotídeos que têm uma sequência estabelecida em SEQ ID NO:27, oligonucleotídeos que têm uma sequência estabelecida em SEQ ID NO:28, e oligonucleotídeos que têm uma sequência estabelecida em SEQ ID NO:29.

[0021] A presente revelação também disponibiliza um kit para analisar um gene AHASL de planta. O kit pode abranger um iniciador direto AHASL; um iniciador inverso AHASL; uma sonda AHASL de tipo selvagem; uma sonda AHASL tolerante aos herbicidas; uma polimerase; e desoxirribonucleotídeo trifosfatos.

[0022] A presente revelação também disponibiliza iniciadores diretos AHASL. Os iniciadores diretos podem ser oligonucleotídeos que têm uma sequência estabelecida em SEQ ID NO:13, oligonucleotídeos que têm uma sequência estabelecida em SEQ ID NO:14, oligonucleotídeos que têm uma sequência estabelecida em SEQ ID NO:15, oligonucleotídeos que têm uma sequência estabelecida em SED ID NO:16, oligonucleotídeos que têm uma sequência estabelecida em SEQ ID NO:17, oligonucleotídeos que têm uma sequência estabelecida em SED ID NO:18; oligonucleotídeos que têm uma sequência estabelecida em SED ID NO:19, oligonucleotídeos que têm uma sequência estabelecida em SED ID NO:20, oligonucleotídeos que têm uma sequência estabelecida em SED ID NO:21, oligonucleotídeos que têm uma sequência estabelecida em SEQ ID NO:22, oligonucleotídeos que têm uma sequência estabelecida em SEQ ID NO:23, oligonucleotídeos que têm uma sequência estabelecida em SEQ ID NO:24, oligonucleotídeos que têm uma sequência estabelecida em SEQ ID NO:25, oligonucleotídeos que têm uma sequência estabelecida em SEQ ID NO:26, oligonucleotídeos que têm uma sequência estabelecida em SEQ ID NO:27, oligonucleotídeos que têm uma sequência estabelecida em SEQ ID NO:28, e oligonucleotídeos que têm uma sequência estabelecida em SEQ ID NO:29.

[0023] A presente revelação também disponibiliza sondas AHASL, por exemplo, sondas que podem ser específicas para um alelo AHASL de tipo selvagem ou para um alelo AHASL tolerante aos herbicidas. Em SEQ ID NO: 32 se da um exemplo de sequência de sonda de tipo selvagem. Em SEQ ID NO: 33 se da um exemplo de sequência de sonda tolerante aos herbicidas.

[0024] Na presente invenção são descritas sondas AHASL úteis em um formato multiplex dos métodos revelados na presente. Um conjunto de tais sondas pode incluir duas ou três sondas diferentes que incluem como sua extremidade 5' nucleotídeos SNP diferentes elegidos entre os inovadores SNPs de gene AHASL trialélicos revelados na presente, e como sua extremidade 3’ o nucleotídeo que dá origem à substituição S653N; e pode incluir pelo menos uma sonda “de tipo selvagem” que também tem um nucleotídeo SNP tal como seu nucleotídeo de extremidade 5’, mas que tem em sua extremidade 3’ o nucleotídeo de tipo selvagem na posição correspondente à posição 653(At) do gene AHASL. Por exemplo, um ensaio multiplex pode fazer uso de sondas específicas para cada alelo AHASL, tal como um conjunto de seis sondas, na proporção de uma para cada um dos alelos de tipo selvagem e tolerante aos herbicidas de AHASL1D, AHASL1B, e AHASL1A, caracterizado pelo fato de que a sonda para cada alelo está marcada (“labeled”) com um único sinal detectável que permite a detecção de todos os alelos AHASL presentes em uma amostra.

Breve descrição das figuras

[0025] A Figura 1A ilustra as sequências parciais de nucleotídeo (SEQ ID NO:1) e parciais de aminoácido (SEQ ID NO:2) do AHASL1D de tipo selvagem (WT) parcial de nucleotídeo (SEQ ID NO:3) e de aminoácido parcial (SEQ ID NO: 4) do AHASL1D tolerante aos herbicidas (HT);

[0026] A Figura 1B ilustra as sequências parciais de nucleotídeo (SEQ ID NO:5) e parciais de aminoácido (SEQ ID NO:6) do AHASL1B de tipo selvagem (WT) parcial de nucleotídeo (SEQ ID NO:7) e de aminoácido parcial (SEQ ID NO: 8) do AHASL1B tolerante aos herbicidas (HT);

[0027] A Figura 1C ilustra as sequências parciais de nucleotídeo (SEQ ID NO:9) e parciais de aminoácido (SEQ ID NO:10) do AHASL1A de tipo selvagem (WT) parcial de nucleotídeo (SEQ ID NO:11) e de aminoácido parcial (SEQ ID NO: 12) do AHASL1A tolerante aos herbicidas (HT);

[0028] A Figura 2 ilustra um alinhamento parcial de três sequências de DNA AHASL de trigo (AHASL1D, AHASL1B; and AHASL1A) com iniciadores diretos AHASL TaAHASDMMFor2 (SEQ ID NO:16), TaAHASDMMFor3 (SEQ ID NO:18), TaAHASDForSNP (SEQ ID NO:19), e TaAHASD (SEQ ID NO:30) e uma sonda AHASL de tipo selvagem (SEQ ID NO:32);

[0029] A Figura 3 é uma tabela de identidades porcentuais de sequências de nucleotídeos de comparações emparelhadas das sequências de codificação do gene AHASL. O hexaploide L1D, hexaploide L1B, e o hexaploide L1A designam os genes AHASL1D, AHASL1B, e AHASL1A, respectivamente, de Triticum aestivum. Tetraploide L1B, e Tetraploide L1A designam os genes AHASL1B e AHASL1A, respectivamente, de T. turgidum ssp. Durum;

[0030] A Figura 4 é um gráfico de dispersão de valores de dCt de um ensaio de validação no qual foi utilizado o iniciador TaAHASDMMFor2 (SEQ ID NO:16);

[0031] A Figura 5 é um gráfico de dispersão de valores de dCt de um ensaio de validação no qual foi utilizado o iniciador TaAHASDMMFor3 (SEQ ID NO:18);

[0032] A Figura 6 é um gráfico de dispersão de valores de dCt de um ensaio experimental no qual foi utilizado o iniciador TaAHASDMMFor2 SEQ ID NO:16); e

[0033] A Figura 7 é um alinhamento parcial de três sequências AHASL cDNA de trigo (AHASL1D, SEQ ID NO:34; AHASL1B, SEQ ID NO:35; e AHASL1A, SEQ ID NO:36) com uma posição de referência com a sequência de nucleotídeos AHAS de Arabidopsis thaliana.

Lista de sequências

[0034] As sequências de ácidos nuclêicos e de aminoácidos incluídas na seguinte lista de sequências demonstram mediante abreviaturas padrão de letras para bases de nucleotídeos. As sequências de ácido nuclêico continuam a convenção padrão de começar no extremo 5' da sequência e seguindo diretamente (ou seja, da esquerda à direita em cada linha) até o extremo 3'. É mostrada somente uma cadeia de cada sequência de ácido nuclêico, mas se entende que a cadeia complementar está incluída mediante qualquer referência à cadeia exibida. As sequências de aminoácidos continuam a convenção Padrão começadas no termo aminoácidos e continuando para frente (ou seja, da esquerda à direita em cada linha) em direção ao carboxi-terminal.

[0035] SEQ ID NO:1 indica a sequência de nucleotídeo de uma porção do alelo de tipo selvagem de AHASL1D.

[0036] SEQ ID NO:2 estabelece a sequência de aminoácido codificada pela sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:1.

[0037] SEQ ID NO:3 indica a sequência de nucleotídeo de uma porção do alelo HT (resistente aos herbicidas) de AHASL1D.

[0038] SEQ ID NO:4 estabelece a sequência de aminoácido codificada pela sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:3.

[0039] SEQ ID NO:5 indica a sequência de nucleotídeo de uma porção do alelo de tipo selvagem de AHASL1B.

[0040] SEQ ID NO:6 estabelece a sequência de aminoácido codificada pela sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:5.

[0041] SEQ ID NO:7 indica a sequência de nucleotídeo do alelo HT (resistente aos herbicidas) de AHASL1B.

[0042] SEQ ID NO:8 estabelece a sequência de aminoácido codificada pela sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:7.

[0043] SEQ ID NO:9 indica a sequência de nucleotídeo de uma porção do alelo de tipo selvagem de AHASL1A.

[0044] SEQ ID NO:10 estabelece a sequência de aminoácido codificada pela sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:9.

[0045] SEQ ID NO:11 indica a sequência de nucleotídeo de uma porção do alelo HT (resistente aos herbicidas) de AHASL1A.

[0046] SEQ ID NO:12 estabelece a sequência de aminoácido codificada pela sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:11.

[0047] SEQ ID NO:13 indica a sequência de nucleotídeo de um iniciador direto, que também leva a designação de TaAHASMMFor2.

[0048] SEQ ID NO:14 indica a sequência de nucleotídeo para um iniciador direto AHASL, que na presente invenção também recebe a designação de TaAHASMMFor3.

[0049] SEQ ID NO:15 indica a sequência de nucleotídeo para um iniciador direto AHASL1D, que na presente invenção também recebe a designação de TaAHASDMMFor2Gen.

[0050] SEQ ID NO:16 indica a sequência de nucleotídeo para um iniciador direto AHASL1D, que na presente invenção também recebe a designação de TaAHASDMMFor2.

[0051] SEQ ID NO: 17 indica a sequência de nucleotídeo para um iniciador direto AHASL1D, que na presente invenção também recebe a designação de TaAHASDMMFor3Gen.

[0052] SEQ ID NO:18 indica a sequência de nucleotídeo para um iniciador direto AHASL1D, que na presente invenção também recebe a designação de TaAHASDMMFor3.

[0053] SEQ ID NO:19 indica a sequência de nucleotídeo para um iniciador direto AHASL1D, que na presente invenção também recebe a designação de TaAHASDForSNP.

[0054] SEQ ID NO:20 indica a sequência de nucleotídeo para um iniciador direto AHASL1B, que na presente invenção também recebe a designação de TaAHASBMMFor2Gen.

[0055] SEQ ID NO:21 indica a sequência de nucleotídeo para um iniciador direto, que na presente invenção também recebe a designação de TaAHASBMMFor2.

[0056] SEQ ID NO:22 indica a sequência de nucleotídeo para um iniciador direto AHASL1B primeiro, que na presente também recebe a designação de TaAHASBMMFor3Gen.

[0057] SEQ ID NO:23 indica a sequência de nucleotídeo para um iniciador direto AHASL1B primeiro, que na presente também recebe a designação de TaAHASBMMFor3.

[0058] SEQ ID NO:24 indica a sequência de nucleotídeo para um iniciador direto AHASL1B primeiro, que na presente também recebe a designação de TaAHASBForSNP.

[0059] SEQ ID NO:25 indica a sequência de nucleotídeo para um iniciador direto AHASL1A primeiro, que na presente também recebe a designação de TaAHASAMMFor2Gen.

[0060] SEQ ID NO:26 indica a sequência de nucleotídeo para um iniciador direto AHASL1A primeiro, que na presente solução também recebe a designação de TaAHASAMMFor2.

[0061] SEQ ID NO: 27 indica a sequência de nucleotídeo para um iniciador direto, que na presente invenção também recebe a designação de TaAHASAMMFor3Gen.

[0062] SEQ ID NO:28 indica a sequência de nucleotídeo para um iniciador direto AHASL1A, que na presente invenção também recebe a designação de TaAHASAMMFor3.

[0063] SEQ ID NO:29 indica a sequência de nucleotídeo para um iniciador direto AHASL1A, que na presente solução também recebe a designação de TaAHASAForSNP.

[0064] SEQ ID NO:30 indica a sequência de nucleotídeo para um iniciador direto AHASL, que na presente solução também recebe a designação de TaAHASD.

[0065] SEQ ID NO:31 indica a sequência de nucleotídeo para um iniciador inverso AHASL.

[0066] SEQ ID NO:32 indica a sequência de nucleotídeo para uma sonda AHASL de tipo selvagem.

[0067] SEQ ID NO:33 indica a sequência de nucleotídeo para uma sonda HT (tolerante aos herbicidas) de AHASL.

[0068] SEQ ID NO:34 estabelece uma sequência parcial de DNAc de AHASL1D de trigo.

[0069] SEQ ID NO:35 estabelece uma sequência parcial de DNAc de AHASL1B de trigo.

[0070] SEQ ID NO:36 estabelece uma sequência parcial de DNAc de AHASL1A de trigo.

Descrição detalhada da invenção

[0071] A presente revelação disponibiliza métodos, kits, e iniciadores para a análise dos genomas das plantas, e em particular para a análise dos genes AHASL nos mesmos. Os métodos aqui descritos implicam a análise de um único polimorfismo de nucleotídeo (SNP, polimorfismo de nucleotídeo simples) mediante a detecção em tempo real da amplificação de objetivo mediante a medição de sinais detectáveis, por exemplo, sinais fluorescentes liberados de sondas informantes ao acontecer hibridação com objetivos de SNP.

[0072] Os métodos aqui descritos implicam um ensaio de PCR em tempo real para determinar se está presente um alelo tolerante aos herbicidas (HT) ou um alelo de tipo selvagem em um ou mais dos genes AHASL no genoma de uma planta. O alelo HT pode abranger sequências de nucleotídeo que codificam proteínas AHASL tolerantes a herbicidas que têm a substituição S653N. Os métodos permitem a determinação do caráter zigomático de cada gene AHASL em uma planta. Os métodos são particularmente úteis para analisar os genes AHASL de plantas que têm múltiplos genes AHASL, tais como, por exemplo, trigo de padaria, Triticum aestivum, e trigo duro, T. turgidum ssp. durum.

[0073] A substituição aminoácidos S653N é um resultado de uma transição de G a A na posição que corresponde ao nucleotídeo 1958 da sequência de nucleotídeos AHASL de Arabidopsis thaliana estabelecida no EMBL N° de acesso X51514, que se incorpora aqui por referência. As Figuras de 1A a 1C mostram as sequências de nucleotídeos de tipo selvagem e de HT e as sequências de aminoácidos codificadas para AHASL1D, AHASL1B, e AHASL1A, respectivamente.

[0074] Os métodos, kits e os iniciadores descritos na presente podem ser utilizados para determinar o caráter zigomático de uma planta, por exemplo, para estabelecer si uma planta de trigo é homozigota para o alelo AHASL tolerante aos herbicidas (HT), heterozigotas, homozigotas para o alelo de tipo selvagem, hemizigotas para o alelo HT ou de tipo selvagem, ou nulo para o gene AHASL, em cada um dos três genes AHASL em uma planta de trigo T. aestivum trigo ou dos dois genes AHASL em uma planta de trigo T. turgidum ssp. durum. Os métodos podem ser úteis em programas de cultivo seletivo para a produção de plantas de trigo tolerantes a imidazolinona que tenham um, dois, três, quatro, cinco, ou seis alelos AHASL em seus genomas.

[0075] T. aestivum tem um genoma hexaploide que abrange três genes AHASL muito similares, mas diferentes, designados como AHASL1D, AHASL1B e AHASL1A. Em contraste, T. turgidum ssp. duro tem um genoma tetraploide que abrangem dois genes muito similares, mas diferentes, designado como AHASL1B e AHASL1A. Apesar de não serem idênticos, AHASL1B e AHASL1A de T. aestivum se relacionam estreitamente com AHASL1B e AHASL1A de T. turgidum ssp. duro baseado no alinhamento de sequências e em cálculos de porcentagem de identidade de sequência. A Figura 3 mostra identidades de sequência de nucleotídeo tomadas de comparações por pares do gene AHASL que codifica sequências de T. aestivum e T. turgidum ssp. duro.

[0076] A seguir, são definidos diversos termos utilizados na presente invenção.

[0077] Um “iniciador” é um oligonucleotídeo de cadeia simples, que tem um extremo 3' e um extremo 5', que é capaz de fusionar em um sítio de fusão em uma cadeia de DNA apontada e de servir como um ponto de iniciação para a síntese de DNA por uma polimerase de DNA, em particular na amplificação por PCR. Um iniciador tal pode ou não pode ser completamente complementar com relação a seu sítio de fusão no DNA apontado.

[0078] Um “sítio de fusão” sobre uma cadeia de um DNA objetivo é o sítio no que um iniciador é capaz de se fusionar.

[0079] Em geral, para a amplificação de um fragmento de um gene por PCR, é utilizado um par de iniciadores que se fusionam em cadeias opostas de uma molécula de DNA de dobro cadeia. Por convenção padrão, o “iniciador direto” se fusiona com a cadeia não codificante do gene e o “iniciador inverso” se fusiona com a cadeia codificante.

[0080] Um “iniciador direto AHASL” como é divulgado na presente e “iniciador inverso AHASL” como é divulgado na presente solução são utilizados como um par de iniciadores na amplificação de um fragmento de um par AHASL particular tal como, por exemplo, AHASL1D, AHASL1B, e AHASL1A de T. aestivum e/ou AHASL1B, e AHASL1A de T. turgidum ssp. durum. Um iniciador direto AHASL como é divulgado na presente invenção pode ser específico para um gene AHASL particular, por exemplo, específica para um dos seguintes: AHASL1D, AHASL1B e AHASL1A. O iniciador inverso AHASL pode ser utilizado para cada gene AHASL.

[0081] As expressões “alelo tolerante aos herbicidas (HT)”, “alelo AHASL tolerante aos herbicidas”, “gene tolerante aos herbicidas”, “alelo variante”, “alelo AHASL variante”, “variante de gene AHASL”, “alelo substituído”, “alelo AHASL substituído”, e “gene AHASL substituído”, a menos que seja indicado o contrário na presente, se referem a um polinucleotídeo que codifica uma proteína AHASL tolerante à imidazolinona e que abranja substituição S653N.

[0082] As expressões “alelo de tipo selvagem”, “alelo AHASL de tipo selvagem”, “gene AHASL de tipo selvagem” “alelo sensível” “alelo AHASL sensível” e “gene AHASL sensível”, a menos que seja indicado o contrário na presente, se referem a um polinucleotídeo que codifica uma proteína AHASL que carece da substituição de S653N. No entanto, os mencionados “alelo de tipo selvagem”, “alelo AHASL de tipo selvagem”, “gene AHASSL de tipo selvagem”, “alelo sensível”, “alelo AHASL sensível” ou “gene AHASL sensível” podem opcionalmente abranger substituições diferentes da substituição que causa a substituição de S653N.

[0083] Como foram utilizadas na presente invenção, as expressões “de tipo selvagem” ou “planta correspondente de tipo selvagem” significam a forma típica de um organismo ou de seu material genético, como se apresenta normalmente, por exemplo, diferentemente das formas variante, substituída e/ou recombinante.

[0084] A menos que seja indicado o contrário na presente, o termo “polimerase” se refere a uma polimerase de DNA, em particular uma polimerase de DNA que é adequada para seu uso nas amplificações de PCR reveladas na presente, por exemplo, a Taq polimerase.

[0085] Os métodos revelados na presente invenção incluem ensaios para a identificação de ISP e para a determinação do caráter zigomático nos genes AHASL de trigo com relação à transmissão de nucleotídeos que produz a substituição de S653N. O processo da identificação de SNP como é divulgado na presente pode ser uma detecção em tempo real da amplificação objetivo mediante a medição de sinais fluorescentes emitidas por moléculas informantes sobre as sondas ao acontecer a hibridação com os objetivos de SNP. Geralmente, isto pode ser seguido pela digestão enzimática de molécula de apagado por Taq polimerase mediante PCR.

[0086] A determinação exata das trocas de pares de bases pode ser sumamente difícil. Geralmente, isto é, devido à hibridação cruzada das sondas específicas para alelo HT e específicas para alelo de tipo selvagem, com relação a qualquer alelo, independentemente do genótipo real. A ausência de caráter específico pode resultar da homologa idêntica da região de gene que contém o SNP de interesse. O design do ensaio pode incluir um ligante menor de ranhura ou um ácido nuclêico bloqueado na extremidade 3' da sonda fluorescente para reforçar o caráter específico.

[0087] Devido aos parâmetros estritos associados com o desenvolvimento do ensaio em tempo real, geralmente os ensaios são elaborados por completo com o uso de software. No entanto, os ensaios revelados na presente invenção podem incluir aspectos que foram projetados sem o uso de software nem de outra tecnologia de design de ensaio, por exemplo, sequências de iniciador e sequências de sonda desenhadas sem software nem tecnologia de design de ensaio. Em particular, os iniciadores diretos AHASL revelados na presente solução podem ser projetados sem o uso de software nem de outra tecnologia de design de ensaio. Em outras palavras, os iniciadores diretos AHASL podem estar projetados manualmente. Os iniciadores diretos AHASL podem utilizar um SNP trialélico que existe entre os três genes AHASL, ou um correspondente NP bialélico que existe entre dois genes AHASL. Determinados iniciadores diretos AHASL revelados na presente invenção também podem levar incorporada uma ausência deliberada de concordância entre o iniciador e o gene AHASL para reforçar a identificação da substituição de S653N. O uso de uma ausência deliberada de concordância entre iniciadores e sequências objetivos não é típico de ensaios de PCR em tempo real projetados com software para o gene AHASL de plantas, trigo inclusive.

[0088] Conforme são utilizadas na presente solução, as expressões “SNP trialélico” e “SNP bialélico” se referem a polimorfismos individuais de nucleotídeos entre diferentes genes AHASL em uma planta multigene, por exemplo, entre cada um dos genes AHASL1D, AHASL1B, e AHASL1A de um trigo hexaploide ou entre cada um dos genes AHASL1B e AHASL1A de um trigo tetraploide. As expressões SNP trialélico e SNP bialélico, conforme são utilizadas na presente invenção, podem identificar um gene AHASL particular de uma planta que têm múltiplos genes AHASL. As expressões SNP trialélico e o SNP bialélico, conforme são utilizadas na presente invenção, não diferenciam entre alelos de tipo selvagem e os alelos AHASL HT.

[0089] Os iniciadores diretos AHASL utilizados nos métodos revelados na presente invenção recebem a denominação TaAHASMMFor2 (SEQ ID NO:13) e TaAHASMMFor3 (SEQ ID NO:14). Os métodos revelados na presente invenção podem utilizar iniciadores diretos AHASL que podem ser específicos para um gene AHASL em particular. Os iniciadores diretos para ser utilizados nos métodos revelados na presente invenção recebem a denominação de iniciador TaAHASDMMFor2Gen (SEQ ID NO:15), iniciador TaAHASDMMFor2 (SEQ ID NO:16), iniciador TaAHASDMMFor3Gen (SEQ ID NO:17), iniciador TaAHASDMMFor3 (SEQ ID NO:18), e iniciador TaAHASDForSNP (SEQ ID NO:19). Os iniciadores diretos AHASL1B para seu uso nos métodos revelados na presente invenção recebem a denominação iniciador TaAHASBMMFor2Gen (SEQ ID NO:20), iniciador TaAHASBMMFor2 (SEQ ID NO:21), iniciador TaAHASBMMFor3Gen (SEQ ID NO:22), iniciador TaAHASBMMFor3 (SEQ ID NO:23), e iniciador TaAHASBForSNP (SEQ ID NO:24). Os iniciadores diretos AHASL1A para seu uso nos métodos revelados na presente invenção recebem a denominação iniciador TaAHASAMMFor2Gen (SEQ ID NO:25), iniciador TaAHASAMMFor2 (SEQ ID NO:26), iniciador TaAHASAMMFor3Gen (SEQ ID NO:27), iniciador TaAHASAMMFor3 (SEQ ID NO:28), e iniciador TaAHASAForSNP (SEQ ID NO:29). Os iniciadores diretos AHASLB e AHASLA são adequados para seu uso em T. aestivum e T. turgidum ssp. durum.

[0090] Estes iniciadores diretos AHASL são elaborados sem a utilização de software nem de outra tecnologia para o design de ensaios, e têm incorporado um SNP trialélico entre os genomas AHASL1D, AHASL1A, e AHASL1B de T. aestivum, ou, no caso de T. turgidum ssp. durum, um SNP bialélico entre AHASL1A e AHASL1B. O SNP está posicionado a aproximadamente 40 nucleotídeos corrente acima da substituição que codifica a substituição S653N. O SNP para cada genoma de T. aestivum é como continua: AHASL1D tem uma adenina, AHASL1B tem uma timina, e AHASL1A tem uma citosina. Os SNPs para AHASL1B e AHASL1A são os mesmos em T. turgidum ssp. durum.

[0091] Além da inclusão do SNP trialélico no design do iniciador direto AHAS, os iniciadores diretos TaAHASMMFor2 (SEQ ID NO:13), TaAHASMMFor3 (SEQ ID NO:14), TaAHASDMMFor2Gen (SEQ ID NO:15), TaAHASDMMFor2 (SEQ ID NO:16), TaAHASBMMFor2Gen (SEQ ID NO:20), TaAHASBMMFor2 (SEQ ID NO:21), TaAHASBMMFor3Gen (SEQ ID NO:22), TaAHASBMMFor3 (SEQ ID NO:23), TaAHASAMMFor2Gen (SEQ ID NO: 25), TaAHASAMMFor2 (SEQ ID NO:26), TaAHASAMMFor3Gen (SEQ ID NO:27), e TaAHASMMFor3 (SEQ ID NO:28) têm uma ausência deliberada de concordância com o gene AHASL situado três nucleotídeos corrente acima com relação ao nucleotídeo terminal do iniciador. A ausência deliberada de concordância do iniciador direto TaAHASDMMFor2 (SEQ ID NO:16) é mostrada na Figura 2. A Figura 2 ilustra o nucleotídeo não concordante como uma Ausência de concordância C-a-A situada 3 nucleotídeos corrente acima do nucleotídeo terminal 3’. Os iniciadores TaAHASBMMFor2 (SEQ ID NO: 21), TaAHASAMMFor2 (SEQ ID NO:26), e TaAHASAMMFor3 (SEQ ID NO:28) também podem ter a ausência de concordância deliberada C-a-A. O iniciador TaAHASBMMFor3 (SEQ ID NO: 23) pode ter uma ausência deliberada de concordância C-a-G. A ausência de concordância pode ser uma ausência de concordância C-a-A, uma ausência de concordância C-a-G ou uma ausência de concordância C-a-T, como nos iniciadores TaAHASMMFo2 (SEQ ID NO:13), TaAHASMMFor3 (SEQ ID NO:14), TaAHASDMMFor2Gen (SEQ ID NO:15), TaAHASBMMFor2Gen (SEQ ID NO:20), TaAHASBMMFor3Gen (SEQ ID NO:22), TaAHASAMMFor2Gen (SEQ ID NO: 23), e TaAHASAMMFor3Gen (SEQ ID NO:27).

[0092] Além da inclusão do SNP trialélico no design do iniciador direto AHASL, os iniciadores diretos TaAHASDMMFor3Gen (SEQ ID NO:17) e TaAHASDMMFor3 (SEQ ID NO:18) têm uma ausência deliberada de concordância com o gene AHASL situado dois nucleotídeos corrente acima a partir do nucleotídeo terminal do iniciador. A ausência deliberada de concordância do iniciador TaAHASDMMFor3 (SEQ ID NO:18) é mostrada na Figura 2. A Figura 2 ilustra o nucleotídeo não concordante como uma ausência de concordância A-a-G. No entanto, a ausência de concordância podem ser uma ausência de concordância A-a-G, uma ausência de concordância A-a-C ou uma ausência de concordância A-a-T, como no iniciador TaAHASDMMFor3Gen (SEQ ID NO:17).

[0093] O uso da ausência deliberada de concordância entre o iniciador direto AHASL e o gene AHASL a exatidão das tendências zigóticas nos ensaios de tempo real em comparação com os iniciadores diretos AHASL que levam incorporado o SNP trialélico, mas que não têm um nucleotídeo adicional carente de concordância. Por exemplo, o iniciador ASDForSNP não inclui o nucleotídeo deliberadamente desprovido de concordância como nos iniciadores TaAHASDMMFor2 e TaAHASDMMFor3. O iniciador TaAHASDForSNP não disponibiliza tendências zigóticas em um ensaio de PCR de tempo real com a mesma exatidão que os iniciadores TaAHASDMMFor2 e TaAHASDMMFor3.

[0094] Os iniciadores diretos AHASL que têm incluídos o SNP trialélico ou o gene AHASL gene podem ter uma temperatura de fusão Tm fora do intervalo de temperaturas de fusão recomendado para técnicas baseados em PCR em tempo real. O intervalo de temperaturas de fusão recomendado para os iniciadores utilizados nas técnicas baseadas em PCR de tempo real pode estar no intervalo de 58-60 °C. A temperatura de fusão dos iniciadores diretos AHASL reveladas na presente invenção pode ser de aproximadamente 54 °C.

[0095] Os iniciadores diretos AHASL descritos acima não se limitam a oligonucleotídeos da longitude exata das sequências dadas em SEQ ID NO:13 a SEQ ID NO:29. Os iniciadores diretos AHASL utilizados nos métodos revelados na presente invenção podem ser de uma longitude mais curta sempre e quando incluam o SNP trialélico ou bialélico como nucleotídeo terminal e, opcionalmente, a ausência deliberada de concordância acima descrita. Por exemplo, os iniciadores diretos AHASL úteis podem abranger os dez a quinze nucleotídeos terminais dados em SEQ ID NO:13 a SEQ ID NO:29.

[0096] O iniciador direto TaAHASD (SEQ ID NO:30) é um iniciador projetado mediante computador. Este iniciador projetado mediante computador não inclui o SNP trialélico SNP entre os genes AHASL nem uma ausência deliberada de concordância entre iniciador e objetivo como são levados incorporados nos iniciadores diretos AHASL de design manual. Apesar de ser projetado como um iniciador direto para o gene AHASL1D, o iniciador direto pode ser utilizado nos genes AHASL1B e AHASL1A. No entanto, o iniciador direto TaAHASD é inadequado para seu uso em um ensaio de PCR em tempo real para analisar genes AHASL já que não pode diferenciar entre de tipo selvagem homozigota e heterozigota.

[0097] Como foi mencionado, os iniciadores TaAHASMMFor2, TaAHASMMFor3, TaAHASDMMFor2Gen, TaAHASDMMFor2, TaAHASDMMFor3Gen, TaAHASDMMFor3, TaAHASDForSNP, TaAHASBMMFor2Gen, TaAHASBMMFor2, TaAHASBMMFor3Gen, TaAHASBMMFor3, TaAHASBForSNP, TaAHASAMMFor2Gen, TaAHASAMMFor2, TaAHASAMMFor3Gen, TaAHASAMMFor2, e TaAHASAForSNP são elaborados sem o uso de software nem de nenhuma outra tecnologia para o design de ensaios. O software para o design de iniciadores não aceita estes designs de iniciadores por serem inadequados para um ensaio de PCR em tempo real para analisar os genes AHASL de plantas.

[0098] Um iniciador inverso AHASL para seu uso nos métodos revelados na presente invenção é o dado pela SEQ ID NO:31. O iniciador inverso AHASL pode ser utilizado para os genes AHASL1D, AHASL1B e AHASL1A. O iniciador inverso AHASL alinha- se com o gene AHASL corrente abaixo da substituição de nucleotídeo que resulta na substituição S653N.

[0099] Os iniciadores inversos AHASL adequados para os métodos revelados na presente invenção não se limitam a oligonucleotídeos que têm a sequência indicada na SEQ ID NO:31. Os iniciadores inversos AHASLs adequados podem ser selecionados visando produzir um fragmento amplificado que tem um uma longitude máxima de 200 pares de bases, do iniciador direto e a sonda ocupam de 40 a 80 pares de bases do fragmento amplificado, preferentemente de 50 a 75 pares de bases, mais preferentemente de 60 a 75 pares de bases, e mais preferentemente ainda, aproximadamente 67 pares de bases. O fragmento amplificado pode ser de aproximadamente 100-200 pares de bases de longitude, preferentemente de aproximadamente 120-180 pares de bases, mais preferentemente de aproximadamente 140-160 pares de bases, e mais preferentemente ainda de aproximadamente 150 a aproximadamente 160 pares de bases de longitude. O fragmento amplificado pode ser de aproximadamente 155 pares de bases ou de aproximadamente 156 pares de bases de longitude. Um fragmento amplificado que é mais longo que 200 pares de bases pode ter como resultado uma amplificação não específica do DNA genômico. Os iniciadores inversos AHASLs adequados podem ter uma temperatura de fusão no intervalo de aproximadamente 55°C a aproximadamente 60°C.

[0100] Para a análise de SNP, são elaboradas duas sondas de oligonucleotídeos para diferenciar os dois alelos diferentes: de tipo selvagem/sensível e variável/tolerante a herbicida. Uma sonda de tipo selvagem adequada é a dada por SEQ ID NO:32. Uma sonda tolerante à herbicida (HT) adequada é a dada por SEQ ID NO:33. Cada sonda tem um sinal detectável diferente, por exemplo, diferentes moléculas fluorescentes, que podem ser independentemente entre si detectadas dentro de um PCR duplex, por exemplo, mediante a emissão de sinais fluorescentes de diferentes longitudes de onda. As sondas adequadas para seu uso nos métodos revelados na presente invenção não se limitam às sondas indicadas por SEQ ID NO:32 e SEQ ID NO:33. Por exemplo, as sondas adequadas podem diferir em longitude com relação a as sondas de SEQ ID NO:32 e SEQ ID NO:33. A título de exemplo adicional, é possível projetar sondas adequadas para fusionar qualquer cadeia, por exemplo, uma sonda inversa.

[0101] A sonda TH está desenhada para hibridar-se especificamente ao alelo resistente, e a sonda de tipo selvagem é específica com relação ao alelo sensível. Nos métodos revelados na presente invenção, tanto a sonda HT como a sonda de tipo selvagem podem ser mescladas na mesma cavidade com um conjunto em comum de iniciadores de PCR, por exemplo, um dos iniciadores diretos AHASL e o iniciador inverso AHASL. Cada uma das sondas HT e de tipo selvagem se hibrida especificamente com a região de AHASL que leva o SNP situado entre os iniciadores direto e inverso. Ambas as sondas se alinham com a região dos genes AHASL que contêm o polimorfismo de nucleotídeo individual, resultando a substituição de S653N. A atividade da 5’ exonuclease durante a extensão de polimerase de uma sonda com uma concordância perfeita resultará no desdobramento da molécula informante que emite um sinal fluorescente. As longitudes de onda do sinal fluorescente são medidas mediante um termociclador em tempo real.

[0102] A diferença na acumulação de sinais fluorescentes entre alelos HT e de tipo selvagem se calculam em um momento específico durante a amplificação que leva a designação de “ciclo a valor limiar” ou “valor de Ct”. O limiar pode ser determinado manualmente ou automaticamente mediante o software associado com a instrumentação em tempo real. Geralmente se ajusta o valor limiar para permitir a medição do sinal durante a fase exponencial do PCR. Esses valores limiares de ciclo térmico, de ambas as longitudes de onda, são seguidamente comparados, e são determinados os genótipos.

[0103] Em um ensaio de PCR em tempo real, as tendências zigóticas e as designações de genótipo podem ser calculadas restando o valor de Ct da sonda de tipo selvagem do valor de Ct da sonda TH. Este cálculo disponibiliza um “valor delta Ct”, que também recebe a designação de “valor de dCt” para cada amostra. Os valores de delta Ct dos controles de tipo selvagem, heterozigota e homozigota padrão tolerantes ao herbicida, podem ser utilizados para disponibilizar um valor de referência para determinar as tendências zigóticas de amostras desconhecidas. Os valores de dCt para as amostras homozigotas HT e heterozigotas podem ser um número negativo. Os valores dos controles padrão podem ser utilizados para segregar os grupos de genótipos das amostras desconhecidas. Por isso é crítico incluir controles padrão sobre cada placa de PCR. A representação por gráfico ou diagrama dos valores de dcT em um gráfico de dispersão pode ajudar na interpretação dos resultados.

[0104] Os valores de corte para determinar o caráter zigomático são obtidos a partir das amostras de controle mediante o cálculo automático da média entre os dCts duplicados para o intervalo do caso. Os valores de corte são estabelecidos para diferenciar entre homozigota e heterozigota, de tipo selvagem, e entre heterozigota e homozigota tolerante aos herbicidas. Os ensaios para diferentes genes HASL, por exemplo AHASL1D, AHASL1B ou AHASL1A, podem ter um diferente intervalo de valores delta Ct para o conjunto de controle. O intervalo depende das eficiências dos iniciadores, que podem ser reduzidas, devido a uma limitada região de interesse para a detecção de SNP; o caráter específico da sonda de SNP, e a variabilidade inerente que tem lugar entre placas.

[0105] Os métodos descritos na presente invenção não se limitam a uma molécula fluorófora e apagadora em particular. A seleção de um fluoróforo particular pode depender do tipo de plataforma de ensaios utilizada, e os fluoróforos aceitáveis para um dispositivo são geralmente fornecidos nas instruções do fabricante. Para os métodos descritos na presente solução, as moléculas informantes podem ter um intervalo de emissão de fluorescência de 500 a 660 nm. Os fluoróforos com este intervalo de emissão incluem FAM, TET, JOE, Yakima Yellow, VIC, Hex, Cy3, TAMRA, Texas Red, e Redmond Red. Cy5 tem uma emissão de fluorescência fora de este intervalo de 500-660 nm, mas pode ser utilizado. O BHQ-1 e BHQplus-1 podem ser utilizados como moléculas de apagado. A seleção de uma molécula apagadora em especial pode se basear na seleção do fluoróforo e da longitude da sonda, como abrangerá uma pessoa competente na técnica.

[0106] Apesar de que os métodos revelados na presente invenção sejam descritos na análise dos genes AHASL de plantas de trigo hexaploides e tetraploides, é possível utilizar os métodos na análise dos genes AHASL de plantas de trigo diploides, por exemplo, trigo einkorn (Triticum monococcum). Por exemplo, os iniciadores diretos AHASL1A, TaAHASAMMFor2Gen (SEQ ID NO: 25), TaAHASAMMFor2 (SEQ ID NO: 26), TaAHASAMMFor3Gen (SEQ ID NO: 27), TaAHASMMFor3 (SEQ ID NO: 28), e TaAHASAForSNP (SEQ ID NO: 29) são adequados para seu uso em um ensaio de PCR em tempo real para determinar o caráter zigomático do gene AHASL no trigo einkorn. Estes métodos também podem utilizar iniciador inverso AHASL, sonda AHASL de tipo selvagem, e sondas AHASL HT descritas na presente invenção.

[0107] Os métodos revelados na presente invenção podem ser adaptados para designs multiplex para analisar e determinar o caráter zigomático dos genes AHASL de plantas, o que inclui ensaio de PCR multiplex em tempo real. Por exemplo, é possível projetar sondas para que incorporem, no nucleotídeo de extremo 5', um nucleotídeo SNP trialélico e, como nucleotídeo no extremo 3', o nucleotídeo na posição da substituição G-a-A que dá origem à substituição S653N. As sondas adequadas para seu uso em designs multiplex podem ter longitudes de aproximadamente 15 nucleotídeos a aproximadamente 250 nucleotídeos, preferentemente de aproximadamente 25 nucleotídeos a aproximadamente 50 nucleotídeos. A longitude da sonda pode ser otimizada de acordo com tipo de plataforma de ensaios como entenderá uma pessoa competente na técnica. Por Exemplo, os métodos e os iniciadores revelados na presente invenção podem ser adaptados para seu uso em plataformas de ensaio baseado em Luminex R, plataformas de ensaio baseados em Scorpiom R, plataformas de ensaio, baseados em TaqMan ®, e plataformas de ensaio baseados em Amplifluor ®. Estas plataformas de ensaio podem utilizar sondas que tenham longitudes de 50-150 nucleotídeos, 80-140 nucleotídeos, 100-130 nucleotídeos, ou 120 nucleotídeos. Também é possível projetar sondas com configurações em espirais forquilhas, tal como um sinal molecular.

[0108] Em um ensaio de PCR multiplex em tempo real, as sondas podem ser marcadas como é entendido por uma pessoa competente na técnica. Por exemplo, é possível projetar conjuntos de sondas mediante o uso de dois ou três fluoróforos diferentes, na proporção de um para cada SNP específico para alelo, para distinguir entre os alelos genômicos de trigo poliploide. Pode ser utilizado um fluoróforo para identificar alelos do tipo selvagem e um fluoróforo para identificar alelos tolerantes a herbicidas. Isto pode disponibilizar uma detecção específica para alelos, e, quando for utilizado com os iniciadores diretos AHASL anteriormente mencionados, a amplificação específica para alelo. Tais sondas podem ser utilizadas, por exemplo, em um ensaio multiplex no qual for utilizado o iniciador direto AHASL descrito anteriormente ou um conjunto universal de iniciadores diretos AHASL.

[0109] A presente revelação também disponibiliza kits para levar a cabo os métodos descritos na presente solução. Tais kits podem abranger pelo menos um iniciador direto AHASL descrito na presente invenção, pelo menos um iniciador inverso AHASL, pelo menos uma polimerase capaz de catalisar a amplificação de PCR, pelo menos uma sonda alelo HT, e pelo menos uma sonda de alelo de tipo selvagem, caracterizado pelo fato de que as sondas incluem uma molécula informante.

[0110] A presente descoberta também disponibiliza iniciadores diretos AHASL descritos na presente invenção.

[0111] Os iniciadores diretos descritos na presente invenção podem ser utilizados em formatos de ensaio que não utilizam sondas, por exemplo, ensaios de gel de agarose e ensaios de pirosequenciado. Tais métodos podem incluir etapas de disponibilizar DNA que abrangem os genes AHASL de planta; amplificar o DNA onde for utilizado um iniciador direto AHASL, um iniciador inverso AHASL, polimerase, e desoxirribonucleotídeos trifosfatos; e detectar produtos da amplificação com os que se identifica o caráter zigomático do gene AHASL; onde o iniciador direto AHASL é um oligonucleotídeo que tem uma sequência que abrange dez nucleotídeos terminais de SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, ou SEQ ID NO:17. Para estes métodos, a detecção dos produtos da amplificação pode implicar técnicas adequadas para tais plataformas de ensaios, como compreenderá uma pessoa competente na técnica.

[0112] Apesar de que os métodos e kits revelados na presente não dependam de iniciadores de PCR nem de nenhum número particular de nucleotídeos, se reconhece que a porção de um iniciador de PCR que se fusiona ao seu objetivo complementar sobre o DNA temperado em geral será de entre aproximadamente 10 e 50 nucleotídeos contíguos, preferentemente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais, nucleotídeos contíguos. No entanto, um iniciador de PCR da invenção pode, além disso, abranger em seu extremo 5' nucleotídeos adicionais que não estão destinados à fusão com o objetivo, tal como, por exemplo, uma sequência de DNA que abrange um ou mais sítios de reconhecimento de enzimas de restrição, repetições tandem breves, um número variável de repetições tandem, repetições simples de sequências, e polimorfismos de longitude de sequência simples.

[0113] Os métodos revelados na presente implicam o uso de polimerases de DNA para a replicação de DNA por PCR. Os métodos não dependem de uma polimerase de DNA particular para a amplificação de DNA por PCR, somente que tais polimerases são capazes de amplificar um ou mais genes AHASL de planta ou fragmentos deles, e abrange uma atividade de exonuclease 5’-3’, o que inclui sem limitação; Taq polimerases; Pfu polimerases; Tth polimerases; Tfl polimerases; Tfu polimerases; polimerases de DNA termoestáveis de hermococcus gorgonarious que também são conhecidos como Tgo DNApolimerases; polimerases de DNA termoestáveis de Thermococcus litoralis tais como, por exemplo, as que são conhecidos como Vent® DNA polimerases, polimerases de DNA termoestáveis de Pyrococcus species GB-D tais como, por exemplo, as que são conhecidos como Deep Vent® DNA polimerases; e versões modificadas, e suas mesclas. É preferível que as polimerases de DNA utilizadas nos métodos revelados sejam polimerases de DNA termoestáveis, polimerases de DNA que têm uma atividade de exonuclease de 5’ a 3’ e/ou polimerases de DNA que têm uma capacidade de verificação.

[0114] Os métodos revelados na presente implicam a amplificação de uma sequência de DNA de objetivo por PCR. Em determinadas formas de realização, a sequência de DNA de objetivo pode ser ampliada diretamente a partir de uma mostra que abrangem DNA genômico isolado de pelo menos uma planta ou parte, orgão, tecido ou célula dela. As pessoas competentes na técnica reconhecerão que a quantidade ou concentração de DNA genômico dependerá de qualquer quantidade de fatores que incluem, sem limitação, as condições de PCR (por exemplo, temperatura de fusão, temperatura de desnaturalização, quantidade de ciclos, concentrações de iniciador, concentrações de dNTP, e similares), a polimerase de DNA termoestável, a sequência dos iniciadores, e a sequência do objetivo. Geralmente, nas formas de realização descritas na presente, a concentração de DNA genômico é de pelo menos aproximadamente 5 ng/μL até aproximadamente 100 ng/μL.

[0115] Os métodos revelados na presente também são adequados para seu uso com DNA diferente de DNA genômico. Por exemplo, o DNAc ou os produtos de PCR específicos para genes podem ser utilizados como planilhas iniciais de DNA nos métodos revelados na presente.

[0116] Além da amplificação de PCR, os métodos revelados na presente podem implicar diversas técnicas de biologia molecular, o que inclui, por exemplo, isolamento de DNA, isolamento de DNA genômico, digestão de DNA mediante enzimas de restrição e nucleasas, ligação de DNA, sequenciamento de DNA, e similares.

[0117] Os métodos revelados na presente implicam o uso de DNA genômico isolado de uma planta. Os métodos da invenção não dependem de DNA genômico isolado mediante nenhum método em particular. Qualquer método conhecido na especialidade para isolar ou purificar, a partir de uma planta, DNA genômico, que possa ser utilizado como fonte de planilha de DNA para as amplificações de PCR acima descritas, pode ser utilizado nos métodos da invenção. É preferível que tais métodos para isolar DNA genômico de plantas sejam adequados, ou possam ser adaptados por uma pessoa competente na técnica, para o isolamento de DNA genômico a partir de quantidades relativamente grandes de amostras de tecidos de plantas.

[0118] Para os métodos revelados na presente, o DNA genômico pode ser isolado a partir de plantas inteiras ou a partir de qualquer parte, orgão, tecido ou célula, delas. Por exemplo, o DNA genômico pode ser isolado a partir de plântulas, folhas, caules, raízes, inflorescências, sementes, embriões, brotos, coleóptilos, anteras, estigmas, células cultivadas e similares. Por outro lado, os métodos não dependem do isolamento de DNA genômico a partir de plantas ou partes, órgãos, tecidos, ou células deles que estejam em qualquer etapa de desenvolvimento em particular. Os métodos podem utilizar DNA genômico que seja isolado de, por exemplo, plântulas ou plantas maduras, ou de qualquer parte, orgão, tecido ou células deles. Por outro lado, os métodos não dependem de plantas que sejam cultivadas sob alguma condição em particular. As plantas podem ser cultivadas, por exemplo, sob condições de campo, em uma estufa, ou em uma câmara de cultivo, em cultivo, ou ainda mediante hidroponia em uma estufa ou câmara de cultivo. Geralmente, as plantas são cultivadas sob condições de luz, temperatura, nutrientes, e umidade que favorecem o crescimento e desenvolvimento das plantas. Adicionalmente, para os métodos revelados na presente, o DNA genômico pode ser isolado a partir de produtos agronômicos, por exemplo, óleo de sementes, farinha de sementes, e similares.

[0119] As pessoas competentes na técnica vão compreender facilmente que são óbvias outras modificações e adaptações adequadas para os métodos e aplicações descritas na presente invenção, e que as mesmas podem ser implementadas sem afastar-se dos alcances da invenção nem de nenhuma forma de realização da mesma. Tendo agora descrito a invenção com detalhes, a mesma será compreendida melhor fazendo referência aos seguintes exemplos, que se incluem na presente invenção somente para fins de ilustração e que não têm o objetivo de limitar a invenção.

EXEMPLOS

[0120] A seguir, são disponibilizados exemplos específicos dos métodos revelados na presente invenção.

EXEMPLO 1

[0121] Genes AHASL de trigo

[0122] Para Triticum aestivum, três variantes de sequências aceto-hidroxiácido sintase subunidade maior (AHASL) foram identificadas a partir do sequenciamento de DNAc durante o dia trigo. Os genes correspondentes a estas variantes foram mapeados em seu respectivo genoma e braço de cromossoma (6L) e são denominados em base ao genoma no que residem (por exemplo, AHASL sobre o genoma A=AHASL1A). São obtidas sequências de nucleotídeos para múltiplas variedades de transcritos de Triticum aestivum AHASL1A, AHASL1B e AHASL1D. Estas sequências abrangem as sequências de codificação completas para os polipéptidos maduros.

[0123] Para T. turgidum ssp. durum, foram identificados duas variantes de sequências de aceto-hidroxiácido sintase subunidade maior (AHASL) a partir do sequenciamento de DNAc de trigo. Os genes correspondentes a estas variantes foram mapeados em seu respectivo genoma e se designam sobre a base do genoma no que residem (por exemplo, AHASL sobre o genoma A=AHASL1A). São obtidas sequências de nucleotídeos para múltiplos variedades de transcritos T. turgidum ssp. durum AHASL1A e AHASL1B. Estas sequências abrangem as sequências de codificação completas para os polipéptidos maduros.

[0124] Para Triticum aestivum e T. turgidum ssp. durum, uma comparação entre variedades tolerantes à imidazolinona (IMI) com genitores de tipo selvagem mostra que o tipo mais comum de substituição é uma transição G-a-A, que produz uma substituição de serina (S) a asparagina (N) em uma posição correspondente a S653 no táxon modelo, Arabidopsis thaliana.

[0125] Uma comparação entre as sequências AHASL dos genomas A, B, e D de Triticum aestivum (ou seja, AHASL1A, AHASL1B e AHASL1D) mostra que existe um SNP trialélico situado aproximadamente 40 nucleotídeos corrente acima com relação à transição que produz a substituição S653N. O polimorfismo nesta posição é uma adenina sobre o genoma D, uma timina sobre o genoma B, e uma citosina sobre o genoma A.

[0126] Uma comparação entre as sequências AHASL dos genomas A e B de T. turgidum ssp. durum (ou seja, AHASL1A e AHASL1B) mostra que existe um SNP bialélico situado a aproximadamente 40 nucleotídeos corrente acima com relação à transição que produz a substituição S653N. O polimorfismo nesta posição é uma timina sobre o genoma, e uma citosina sobre o genoma A.

EXEMPLO 2

[0127] Design de iniciador direto

[0128] Os iniciadores diretos são elaborados para seu uso em um ensaio, por exemplo, em um ensaio de PCR em tempo real, para a detecção da substituição S653N no trigo. O iniciador TaAHASD (SEQ ID NO: 30) é um iniciador projetado mediante software (ou seja, é um iniciador direto projetado mediante o programa de design para ensaios RealTimeDesign de BioSearch Technologies).

[0129] São elaborados iniciadores diretos adicionais sem o uso de software nem tecnologia de design de ensaios baseada no SNP entre genomas AHASL descritos no Exemplo 1. Estes iniciadores levam incorporado o SNP como nucleotídeo terminal do iniciador. Determinados iniciadores diretos são elaborados de tal maneira de incluir uma ausência deliberada de concordância com a sequência de nucleotídeos objetivo, situada 2 ou 3 nucleotídeos corrente acima com relação ao nucleotídeo terminal do iniciador. Cada iniciador pode ser específico para um gene AHASL sobre um genoma particular. Cada iniciador direto para o genoma AHASL B e A pode ser utilizado em Triticum aestivum e T. turgidum ssp. durum.

[0130] Os iniciadores diretos projetados manualmente para o genoma AHASL1D recebem a designação iniciador TaAHASDMMFor2 (SEQ ID NO: 16), iniciador TaAHASDMMFor3 (SEQ ID NO: 18), e iniciador TaAHASDForSNP (SEQ ID NO: 19). Os iniciadores diretos de design manual para o genoma AHASL1B recebem a designação de iniciador TaAHASBMMFor2 (SEQ ID NO: 21), iniciador TaAHASBMMFor3 (SEQ ID NO: 23), e iniciador TaAHASBForSNP (SEQ ID NO: 24). Os iniciadores de design manual para elemento genoma AHASL1A recebem a designação de iniciador TaAHASAMMFor2 (SEQ ID NO: 26), iniciador TaAHASAMMFor3 (2SEQ ID NO: 28), e iniciador TaAHASAForSNP (SEQ ID NO: 29). A temperatura de fusão Tm dos iniciadores que têm incluídos o SNP trialélico é de aproximadamente 54 °C.

[0131] O iniciador TaAHASDMMFor2 (SEQ ID NO:16), iniciador TaAHASBMMFor2 SEQ ID NO:21), iniciador TaAHASAMMFor2 (SEQ ID NO:26), e iniciador TaAHASAMMFor3 primeiro (SEQ ID NO: 28) têm uma ausência deliberada de concordância três nucleotídeos corrente acima com relação ao nucleotídeo terminal do iniciador. A ausência de concordância é uma substituição C-a- A desde a sequência de nucleotídeos AHASL.

[0132] O iniciador TaAHASBMMFor3 (SEQ ID NO:23) tem uma ausência deliberada de concordância três nucleotídeos corrente acima com relação ao nucleotídeo terminal do iniciador. A ausência de concordância é uma substituição C-a- G desde a sequência de nucleotídeos AHASL.

[0133] O iniciador TaAHASDMMFor3 (SEQ ID NO:18) tem uma ausência deliberada de concordância dois nucleotídeos corrente acima com relação ao nucleotídeo terminal do iniciador. A ausência de concordância é uma substituição A-a- G desde a sequência de nucleotídeos AHASL.

[0134] O programa de design de iniciadores RealTimeDesign não aceita iniciadores diretos manualmente projetados descritos acima para seu uso nos designs de ensaios de PCR em tempo real. Os parâmetros de design são os parâmetros “mais restritivos”. O programa também não aceita iniciadores diretos manualmente projetados sob os parâmetros de design de iniciadores “menos restritivos”.

[0135] O programa de design de iniciadores RealTimeDesign disponibiliza a sequência para o iniciador direto AHASL TaAHASD (SEQ ID NO:30).

EXEMPLO 3

[0136] Validação de iniciadores diretos AHASL

[0137] São realizados ensaios em tempo real nos quais são utilizados amostras AHASL de trigo de caráter zigomático conhecido com o iniciador TaAHASDMMFor2 (SEQ ID NO:16), iniciador ASDMMFor3 (SEQ ID NO:18), iniciador ASDForSNP (SEQ ID NO:19), iniciador ASBMMFor2 (SEQ ID NO:21), iniciador ASBMMFor3 (SEQ ID NO:23), iniciador ASBForSNP (SEQ ID NO:24), iniciador ASAMMFor2 (SEQ ID NO:26), iniciador ASAMMFor3 (SEQ ID NO:28), iniciador ASAForSNP (SEQ ID NO:29), e iniciador TaAHASD (SEQ ID NO:30) para fins de validação.

[0138] As amostras podem ser obtidas mediante a extração de DNA genômico de farinha em massa de variedades de trigo que representam, por exemplo, variantes homozigotas S653N dos genes AHASL1D, AHASL1B, e AHASL1A genes de T. aestivum e genes AHASL1B e AHASL1A de T. turgidum ssp. durum. Uma amostra heterozigota pode ser produzida, por exemplo, para fins de controle, mediante a combinação de DNA genômico de uma planta de trigo que tem um gene AHASL de tipo selvagem (identificado no presente como “Grupo W”) e uma variante homozigota para o gene AHASL1D (identifica no presente como “Grupo D” e “CV9804”) em uma relação 1:1. O DNA genômico é subdividido em alíquotas de três replicados para cada variedade.

[0139] É preparada uma solução de iniciador direto de tal maneira de disponibilizar mesclas concentradas 25 X (que no presente recebem a designação “WheatDSNP”) como é mostrada na Tabela 1. O iniciador inverso AHASL (SEQ ID NO:31), a sonda AHASL de tipo selvagem (SEQ ID NO:32), e a sonda AHASL HT (SEQ ID NO:33) estão incluídas em cada uma das soluções mãe. Cada uma das mesclas de WheatDSNP é armazenada a -20°C. Tabela 1

[0140] É preparada uma mescla de polimerase (“Mescla de polimerase 2x suplementada”) como é mostrada na Tabela 2. A mescla de polimerase suplementada 2 x é armazenada a 4°C. Tabela 2

[0141] É preparada uma amostra magistral para o ensaio em tempo real para o AHASL1D S653N, a partir de cada uma das mesclas de DSNP de trigo e a mescla de polimerase suplementada 2 X como é mostrada na Tabela 3. Tabela 3

[0142] É realizado o ensaio em tempo real utilizando um Biomek FxP de acordo com o seguinte protocolo. 45 μl de mescla magistral são dispersos em cada cavidade de uma série de 8 tubos. A série é colocada em um suporte de placas de 86 cavidades com a coluna 1 para o quadrante 1, a coluna 2 para o quadrante 2, a coluna 3 para o quadrante 3, e a coluna 4 para o quadrante 4, de uma placa de reação de PCR de 384 cavidades. 3 μl de mescla magistral de trabalho ‘WheatDSNP’ Real-time (1x) por cavidade 2 μl de DNA eluído em 1X TE por cavidade (a concentração inicial pagDNA é de aproximadamente 5-10 ng/μl). As placas são seladas imediatamente com fita de selado óptico, e são submetidas à centrifugação durante 2 minutos a 1.000 rpm. As placas podem ser armazenadas a 4oC durante até 48 horas.

[0143] A placa é processada em ciclador de luz sob as condições de ciclagem mostradas na Tabela 4. Tabela 4

[0144] A partir dos resultados do ensaio de PCR em tempo real, são determinadas as tendências zigóticas e as designações de genótipo restando o valor de Ct (ciclo no limite) da sonda específica para tipo selvagem do valor de CT da sonda específica para HT, visando obter um valor delta Ct (dCt) para cada amostra de controle. O valor de dCt dos controles padrão homozigotas de tipo selvagem, heterozigotas e homozigotas HT, disponibilizam os valores de referência para determinar as tendências zigóticas das amostras desconhecidas. Os valores dos controles padrão podem ser utilizados para segregar os conjuntos de genótipos das amostras desconhecidas. A graficação dos valores de dCt em um gráfico de dispersão pode ajudar na interpretação dos resultados.

[0145] Os valores de corte são obtidos a partir das amostras de controle mediante o cálculo automático do valor médio entre os dCts duplicados para o intervalo relevante. Existe um corte gerado entre nulo (homozigotas de tipo selvagem) e heterozigotas, e um corte gerado entre variantes heterozigota e homozigota. As tendências zigóticas e as designações de genótipo das amostras são efetuadas baseando- se nestes valores de corte.

[0146] A Tabela 5 e sua legenda disponibilizam dados de validação para o iniciador direto TaAHASDMMFor2 (SEQ ID NO:16). A Figura 4 mostra um gráfico de dispersão dos valores de dCt obtidos a partir dos dados. Tabela 5

A Tabela 6 e sua legenda disponibilizam dados de validação para o iniciador direto TaAHASDMMFor3 (SEQ ID NO:18). A Figura 5 mostra um gráfico de dispersão dos valores de dCt a partir dos dados. Tabela 6

[0147] Ensaios em tempo real nos quais são utilizados soluções com os iniciadores diretos TaAHASDMMFor2 (SEQ ID NO: 16) e TaAHASDMMFor3 (SEQ ID NO:18) disponibilizam valores de dCt que estão suficientemente separados entre si para assegurar tendências zigóticas exatas às designações entre os de tipo selvagem, heterozigotas, e homozigotas tolerantes aos herbicidas. O iniciador direto TaAHASDMMFor2 (SEQ ID NO: 16) mostra um conjunto mais estreito nos replicados e incrementa a separação em valores de dCt entre homozigotas de tipo selvagem, heterozigotas e homozigotas resistentes aos herbicidas com relação ao iniciador direto TaAHASDMMFor3. Tanto TaAHASDMMFor2 (SEQ ID NO: 16) como TaAHASDMMFor3 (SEQ ID NO:18) podem ser utilizados nos ensaios visando disponibilizar as tendências zigóticas e as designações de genótipo, exatas.

[0148] Ensaios em tempo real nos que é utilizada a solução com o iniciador direto TaAHASDForSNP (SEQ ID NO:19) disponibilizam valores de dCt que permitem a identificação das três classes de genótipo. No entanto, os valores de dCt são próximos entre si, o que pode ter como resultado as tendências zigóticas e as designações de genótipo, errôneas.

[0149] Ensaios em tempo real nos quais são utilizados soluções com os iniciadores diretos TaAHASBMMFor2 (SEQ ID NO:21) e TaAHASBMMFor3 (SEQ ID NO:23) disponibilizam valores de dCt que são comparáveis com os valores de dCt nos ensaios nos que for utilizado TaAHASDMMFor2 (SEQ ID NO:16) e TaAHASDMMFor3 (SEQ ID NO:18). Os iniciadores TaAHASBMMFor2 (SEQ ID NO: 21) e TaAHASBMMFor3 (SEQ ID NO: 23) disponibilizam valores de dCt que estão suficientemente separadas visando assegurar as tendências zigóticas e as designações de genótipo, exatas, entre de tipo selvagem, heterozigota, e homozigota tolerante aos herbicidas. O iniciador direto TaAHASBMMFor2 (SEQ ID NO: 21) permite obter um dCT médio com um valor que é o dobro entre as amostras de heterozigotas e homozigotas tolerantes aos herbicidas.

[0150] Ensaios em tempo real nos que é utilizada a solução com o iniciador direto TaAHASBForSNP (SEQ ID NO:24) disponibilizam valores de dCt que permitem a identificação das três classes de genótipo. No entanto, os valores de dCt são próximos entre si, o que pode resultar em tendências zigóticas e as designações de genótipo, errôneas.

[0151] Ensaios em tempo real nos quais são utilizados soluções com os iniciadores diretos TaAHASAMMFor2 (SEQ ID NO:26) e TaAHASAMMFor3 (SEQ ID NO:28) disponibilizam valores de dCt que são comparáveis com os valores de dCt nos ensaios no qual foi utilizado TaAHASDMMFor2 (SEQ ID NO:16) e TaAHASDMMFor3 (SEQ ID NO:18). Os iniciadores TaAHASAMMFor2 (SEQ ID NO: 26) e TaAHASAMMFor3 (SEQ ID NO: 28) disponibilizam valores de dCt que estão suficientemente separados para assegurar as tendências zigóticas e as designações de genótipo, exatas, entre de tipo selvagem, heterozigotas, e homozigotas tolerantes a herbicida. Estes iniciadores também funcionam bem e podem ser utilizados em ensaios visando disponibilizar as tendências zigóticas e as designações de genótipo, exatas.

[0152] Ensaios em tempo real nos quais é utilizada a solução com o iniciador direto TaAHASAForSNP (SEQ ID NO:29) disponibilizam valores de dCt que permitem a identificação das três classes de genótipo. No entanto, os valores de dCt são próximos entre si, o que pode resultar nas tendências zigóticas e as designações de genótipo, errôneas.

[0153] Ensaios em tempo real nos que é utilizada a solução com o iniciador direto projetado com software TaAHASD (SEQ ID NO: 30) não permite diferenciar entre indivíduos de tipo selvagem e heterozigotas para nenhum dos genes AHASL.

EXEMPLO 4

[0154] Ensaio em tempo real para o genoma D AHASL de trigo

[0155] É obtida uma amostra que contém DNA genômico mediante qualquer método conhecido na técnica para purificar DNA genômico tomado de tecidos de planta, por exemplo, Triticum aestivum. O DNA genômico de trigo pode ser obtido, por exemplo, de tecido de folhas jovens ou de farinha de sementes. As amostras podem ser obtidas extraindo DNA genômico a partir de farinha a granel de variedades de trigo que representam, por exemplo, variantes homozigotas S653N dos genes AHASL1D, AHASL1B, e AHASL1A de T. aestivum e genes AHASL1B e AHASL1A de T. turgidum ssp. durum.

[0156] Quando são comparadas duas ou mais plantas de trigo, é possível utilizar uma quantidade equivalente de tecido de cada planta para a purificação do DNA genômico visando assegurar que as amostras de cada uma das plantas contenham concentrações similares de DNA genômico. A concentração de DNA da amostra é de aproximadamente 5 a 10 ng de DNA por μL. Apesar do método não depender de uma concentração de DNA em particular, a concentração de DNA da amostra é preferentemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 ng de DNA por μL.

[0157] É preparada uma solução-mãe do iniciador TaAHASDMMFor2 (SEQ ID NO:16) visando disponibilizar uma mescla concentrada 25X de acordo com o protocolo do Exemplo 3 e como é mostrada na Tabela 1. O iniciador inverso AHASL (SEQ ID NO:31), a sonda AHASL de tipo selvagem (SEQ ID NO:32), e a sonda AHASL HT (SEQ ID NO:33) estão incluídos em cada uma das soluções mãe. Cada uma das mesclas WheatDSNP é armazenada a - 20°C.

[0158] É preparada uma mescla de polimerase (“mescla de polimerase 2x suplementada”) de acordo com o protocolo do Exemplo 3 e como é mostrada na Tabela 2. A mescla de polimerase 2x suplementada é armazenada a 4°C.

[0159] É preparada uma amostra para o ensaio em tempo real para o AHASL1D S653N a partir das mesclas Wheat DSNP e de mesclas de polimerase 2x suplementada de acordo com o protocolo do Exemplo 3 e como é mostrada na Tabela 3.

[0160] O ensaio em tempo real é realizado utilizando um Biomek FxP de acordo com o seguinte protocolo. 45 μl de mescla magistral 1 x são dispersos em cada cavidade de uma série de 8 tubos. A série é colocada em um suporte projetado em forma de placas de 96 cavidades com a coluna 1 para o quadrante 1, a coluna 2 para o quadrante 2, a coluna 3 para o quadrante 3, e a coluna 4 para o quadrante 4, de uma placa de reação de PCR de 384 cavidades. 3 μL de mescla magistral de trabalho ‘WheatDSNP’ Real-time (1x) por cavidade com 2 μl de DNA eluído em 1X TE por cavidade (a concentração inicial de gASDN é de aproximadamente 5-10 ng/μl). As placas são seladas imediatamente com fita de selado óptica e centrifugadas durante 2 minutos a 1.000 rpm. As placas podem ser armazenadas a 4oC durante até 48 horas.

[0161] A placa é processada no ciclador de luz sob as condições de ciclagem de acordo com o protocolo do Exemplo 3 e como é mostrado na Tabela 4.

[0162] A tendência zigótica, as designações de genótipo, e os valores de corte são calculados de acordo com o protocolo no Exemplo 3.

[0163] A Tabela 7 e suas legendas disponibilizam resultados para um ensaio no qual foi utilizado o iniciador direto TaAHASDMMFor2 (SEQ ID NO:16). A Figura 6 mostra um gráfico de dispersão dos valores de dCt a partir dos resultados do ensaio. Tabela 7

[0164] Apesar de a precedente descoberta ter sido descrita detidamente visando proporcionar clareza e compreensão, as pessoas competentes na técnica vão compreender, baseando-se na leitura desta descoberta, que é possível efetuar diversas trocas com relação à forma e detalhe, sem afastar-se dos verdadeiros alcances da revelação e reivindicações adjuntas.

Claims (27)

1. Método para analisar um gene AHASL de planta, dito método sendo caracterizado pelo fato de compreender: (a) prover DNA do gene AHASL de planta; (b) amplificar o DNA usando um iniciador direto AHASL, um iniciador inverso AHASL, polimerase e desoxirribonucleotídeos trifosfato; (c) detectar produtos da amplificação com uma sonda AHASL do tipo selvagem e uma sonda AHASL tolerante a herbicida (HT) identificando assim o gene AHASL como tipo selvagem ou variante para o polimorfismo de nucleotídeo único resultando em uma substituição de aminoácido correspondente à substituição S653(At)N; sendo que o iniciador direto AHASL é um oligonucleotídeo consiste na: SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:26, ou SEQ ID NO:28; sendo que o iniciador direto AHASL apresenta uma disparidade com o gene AHASL de planta localizada a 2 ou 3 nucleotídeos a montante do nucleotídeo do 3’-terminal do iniciador direto AHASL; e sendo que o nucleotídeo do 3’-terminal do iniciador direto AHASL é um sítio de polimorfismo de nucleotídeo único AHASL (SNP).

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de as mencionadas etapas de amplificação e detecção serem conduzidas simultaneamente em um ensaio de PCR em tempo real.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a mencionada etapa de detecção identificar o genoma fonte do gene AHASL de planta.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de o genoma fonte ser um genoma A de trigo, um genoma B de trigo, ou um genoma D de trigo.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o gene AHASL de planta ser selecionado do grupo consistindo de um gene AHASL1A de trigo, um gene AHASL1B de trigo, e um gene AHASL1D de trigo.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender ainda repetir as citadas etapas de amplificação e detecção com um iniciador direto AHASL diferente consiste na: SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:26, ou SEQ ID NO:28 para identificar a zigosidade do gene AHASL para o polimorfismo de nucleotídeo individual resultando em uma substituição de aminoácido correspondente à substituição S653(At)N.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 6, caracterizado pelo fato de a mencionada etapa de detecção identificar a fonte do gene AHASL de planta.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de a fonte ser uma planta poliploide.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de a fonte ser uma planta de trigo.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de a fonte ser Triticum aesivum ou T. turgidum ssp. durum.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o iniciador direto AHASL ser um oligonucleotídeo consiste na: SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:26, ou SEQ ID NO:28.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o iniciador inverso AHASL ser um oligonucleotídeo consistindo da sequência representada na SEQ ID NO:31.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a sonda AHASL de tipo selvagem ser um oligonucleotídeo consistindo da sequência representada na SEQ ID NO:32.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a sonda HT AHASL ser um oligonucleotídeo consistindo da sequência representada na SEQ ID NO:33.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a sonda AHASL de tipo selvagem ser marcada com um primeiro tipo de sinal detectável e a sonda HT AHASL ser macada com um segundo tipo de sinal detectável.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de os sinais detectáveis serem moléculas informantes fluorescentes.

17. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o DNA ser DNA genômico.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de o DNA ser obtido de uma planta de trigo.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de a planta de trigo ser um Triticum aestivum.

20. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de a planta de trigo ser um T. turgidum ssp. durum.

21. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o AHASL SNP ser um SNP trialélico.

22. Kit para analisar um gene AHASL de planta, o mencionado kit sendo caracterizado pelo fato de compreender: a) um iniciador direto AHASL consiste na: SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO;26, ou SEQ ID NO:28; b) um iniciador inverso AHASL; c) uma sonda AHASL de tipo selvagem; d) uma sonda AHASL tolerante a herbicida (HT); e) uma polimerase; e f) desoxirribonucleotídeos trifosfato; sendo que o iniciador direto AHASL apresenta uma disparidade com o gene AHASL de planta localizada a 2 ou 3 nucleotídeos a montante do nucleotídeo do 3’-terminal do iniciador direto AHASL; e sendo que o nucleotídeo do 3’-terminal do iniciador direto AHASL é um sítio de polimorfismo de nucleotídeo individual AHASL (SNP).

23. Kit, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de o iniciador direto AHASL consiste na: SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO.26, ou SEQ ID NO:28.

24. Kit, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de o iniciador inverso AHASL ser um oligonucleotídeo consistindo da SEQ ID NO:31.

25. Kit, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de a sonda AHASL de tipo selvagem ser um oligonucleotídeo consistindo da SEQ ID NO:32.

26. Kit, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de a sonda HT AHASL ser um oligonucleotídeo consistindo da SEQ ID NO:33.

27. Kit, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de a sonda AHASL de tipo selvagem estar marcada com um primeiro tipo de sinal detectável e a sonda HT AHASL ser marcadaa com um segundo tipo de sinal detectável.

Images