BR112014009753B1 - Nanopartícula biocompatível funcionalizada e respectivo uso - Google Patents

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Abstract

nanopartícula biocompatível funcionalizada e método para mudar funcionalidade celular dentro de célula de mamífero a presente invenção se refere a reveladas nanopartículas biocompatíveis funcionalizadas capazes de penetrar através de uma membrana celular de um mamífero e administrar intracelularmente várias moléculas bioativas para modular uma função celular. as nanopartículas biocompatíveis funcionalizadas compreendem: uma nanopartícula central com tamanho de cerca de 5 a cerca de 50 nm e com um revestimento polimérico sobre ela, e vários grupos funcionais ligados covalentemente ao revestimento polimérico, em que as várias moléculas bioativas são ligadas aos vários grupos funcionais, em que as várias moléculas bioativas incluem ao menos um peptídeo e uma proteína, em que o peptídeo é capaz de penetrar através de uma membrana celular de um mamífero e entrar na célula, e em que a proteína é capaz de propiciar uma nova funcionalidade dentro da célula. a proteína pode ser um fator de transcrição selecionado dentre o grupo composto por oct4, sox2, nanog, lin28, cmyc e klf4.

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO REFERÊNCIA REMISSIVA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] O presente Pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido Provisório dos EUA n° 61/550.213, depositado no dia 21 de outubro de 2011, o qual se incorpora por referência ao presente documento na íntegra para todos os fins.
CAMPO TÉCNICO
[0002] Em termos gerais, a presente invenção refere-oiled assesse à síntese orgânica e à nanobiotecnologia e, mais especificamente, a nanopartículas funcionalizadas para a administração de moléculas bioativas a células para a modulação da função celular, bem como a métodos relacionados a elas. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO. A capacidade de as células se proliferarem, migrarem e se diferenciar de vários tipos de células normalmente é fundamental à embriogenia e à função de células maduras, incluindo, entre outras, as células dos sistemas hematopoiético e/ou cardiovascular em uma variedade de doenças hereditárias ou adquiridas. Essa capacidade funcional das células-tronco e/ou de tipos de células especializados mais diferenciados é alterada em várias condições patológicas, mas pode ser normalizada quando da introdução intracelular de componentes biologicamente ativos. Por exemplo, funções celulares anormais, como a sobrevivência debilitada e/ou a diferenciação debilitada de células- tronco/células progenitoras da medula óssea para neutrófilos, são observadas em pacientes com neutropenia congênita cíclica ou grave, que podem sofrer infecções fatais graves e desenvolver leucemia mieloide aguda ou outras malignidades [Aprikyan et al, “Impaired survival of bone marrow hematopoietic progenitor cells in cyclic neutropenia”, Blood, 97, 147 (2001); Goran Carlsson et al, “Kostmann syndrome: severe congenital neutropenia associated with defective expression of Bcl-2, constitutive mitochondrial release of cytochrome C, and excessive apoptosis of myeloid progenitor cells”, Blood, 103, 3.355 (2004)]. Distúrbios hereditários ou adquiridos, como a neutropenia congênita grave ou a síndrome de Barth, são acionados por várias mutações genéticas e decorrem da produção e função deficientes de células sanguíneas e/ou cardíacas do paciente, levando, subsequentemente, à neutropenia, cardiomiopatia e/ou insuficiência cardíaca [Makaryan et al., “The cellular and molecular mechanisms for neutropenia in Barth syndrome. Eur J Haematol”, 88: 195 a 209 (2012)]. O fenótipo da neutropenia congênita grave pode ser causado por diferentes mutações por substituição, deleção, introdução ou truncamento no gene da elastase neutrofílica, no gene HAX1 ou no gene da Proteína da Síndrome de Wiskott-Aldrich [Dale et al, “Mutations in the gene encoding neutrophil elastase in congenital and cyclic neutropenia”, Blood, 96: 2.317 a 2.322 (2000); Devriendt et al, “Constitutively activating mutation in WASP causes X-linked severe congenital neutropenia”, Nat Genet, 27: 313 a 317 (2001); Klein et al, “HAX1 deficiency causes autosomal recessive severe congenital neutropenia (Kostmann diseasef, Nat Genet, 39: 86 a 92 (2007)].
[0003] Outras doenças hereditárias, como a síndrome de Barth, um transtorno multissistêmico das células-tronco induzido por mutações presumivelmente com perda das funções do gene mitocondrial TAZ, estão associadas à neutropenia (níveis reduzidos de neutrófilos no sangue), as quais podem causar infecções recorrentes graves e por vezes fatais e/ou a cardiomiopatia, que pode levar à insuficiência cardíaca, que poderia ser resolvida com transplante cardíaco. Na maioria dos casos, os produtos de genes mutantes, envolvidos na patogenia e no desenvolvimento de doenças humanas hereditárias ou adquiridas, causam eventos intracelulares distintos que levam a funções celulares anormais e ao fenótipo específico da doença.
[0004] O tratamento desses pacientes com o fator estimulante de colônias de granulócitos (G-CSF) induz mudanças adaptáveis na molécula receptora do G-CSF localizada na superfície celular, que, subsequentemente, aciona uma cadeia de eventos intracelulares que, em última análise, recuperam a produção de neutrófilos a um nível próximo ao normal e melhoram a qualidade de vida do paciente [Welte e Dale, “Pathophysiology and treatment of severe chronic neutropenia”, Ann. Hematol., 72, 158 (1996)]. Não obstante, pacientes tratados com o G-CSF podem desenvolver leucemia [Aprikyan et al, “Cellular and molecular abnormalities in severe congenital neutropenia predisposing to leukemia”, Exp Hematol, 31, 372 (2003); Philip Rosenberg et al, “Neutrophil elastase mutations and risk of leukaemia in severe congenital neutropenia”, Br J Haematol, 140, 210 (2008); Peter Newburger et al, “Cyclic Neutropenia and Severe Congenital Neutropenia in Patients with a Shared ELANE Mutation and Paternal Haplotype: Evidence for Phenotype Determination by Modifying Genes”, Pediatr. Blood Cancer, 55, 314 (2010)], motivo pelo qual abordagens inovadoras alternativas estão sendo exploradas.
[0005] Os eventos intracelulares podem ser influenciados e regulados com mais eficiência quando da administração intracelular de diferentes moléculas biologicamente ativas usando nanopartículas distintamente funcionalizadas. Essas moléculas bioativas podem normalizar a função celular ou eliminar as células indesejadas quando necessário. No entanto, a membrana celular serve como barreira ativa que impede a cascata de eventos intracelulares de ser afetada por estímulos exógenos.
[0006] Logo, há a necessidade na técnica por novos tipos de moléculas bioativas capazes de penetrar através das membranas celulares e efetuar os eventos intracelulares de interesse. A presente invenção satisfaz essas necessidades e traz ainda mais vantagens relacionadas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0007] A presente invenção, em algumas concretizações, refere-se a métodos de funcionalização que consistem em ligar proteínas e/ou peptídeos a nanopartículas biocompatíveis para modular funções celulares. Em algumas concretizações, a presente invenção refere-se às próprias nanopartículas biocompatíveis funcionalizadas.
[0008] Em uma concretização, uma nanopartícula biocompatível funcionalizada capaz de penetrar através de uma membrana celular de um mamífero e administrar intracelularmente várias moléculas bioativas para modular uma função celular compreende: uma nanopartícula central com tamanho de 5 a 50 nm e com um revestimento polimérico sobre ela, e vários grupos funcionais ligados covalentemente ao revestimento polimérico, em que as várias moléculas bioativas são ligadas aos vários grupos funcionais, em que as várias moléculas bioativas incluem ao menos um peptídeo e uma proteína, em que o peptídeo é capaz de penetrar através de uma membrana celular de um mamífero e entrar na célula, e em que a proteína é capaz de propiciar uma nova funcionalidade dentro da célula.
[0009] A nanopartícula central pode compreender ferro e ser magnética. Os peptídeos da presente invenção podem ser ligados à proteína (em vez de ligados à nanopartícula). Cada um dos peptídeos e proteínas pode ser ligado à nanopartícula por meio de uma ou mais moléculas de ligação interpostas. O peptídeo pode incluir de cinco a nove aminoácidos básicos em algumas concretizações, ao passo que, em outras, inclui nove ou mais aminoácidos básicos. A proteína pode ser um fator de transcrição como, por exemplo, um fator de transcrição selecionado dentre o grupo composto por Oct4, Sox2, Nanog, Lin28, cMyc e Klf4.
[0010] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para mudar uma funcionalidade celular dentro de uma célula de um mamífero. O método inovador compreende administrar uma quantidade efetiva de nanopartículas biocompatíveis funcionalizadas à célula e mudar a funcionalidade celular dentro dela. A mudança da funcionalidade celular pode envolver uma mudança em uma propriedade físico-química da célula, uma mudança na propriedade proliferativa da célula, uma mudança na capacidade de sobrevivência da célula ou uma mudança na propriedade fenotípica morfológica da célula. A mudança da funcionalidade celular pode envolver uma capacidade adquirida da célula de produzir um novo tipo de célula, incluindo uma célula-tronco ou um tipo de célula mais especializado.
[0011] Esses e outros aspectos da presente invenção transparecerão melhor com referência à descrição detalhada e aos desenhos anexos. Deve-se ter em mente, contudo, que várias mudanças, alterações e substituições podem ser feitas às concretizações específicas reveladas neste documento sem divergir de seu âmbito nem de sua essência. Por fim, todas as várias referências citadas neste documento incorporam-se expressamente a este documento por referência.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0012] A Figura 1 ilustra um esquema de funcionalização de uma nanopartícula em várias etapas com base na ligação simultânea de moléculas de peptídeo e proteína à nanopartícula de acordo com uma concretização da invenção.
[0013] A Figura 2A ilustra uma reação de uma nanopartícula contendo grupos amino com razões equimolares de LC1-SPDP de cadeia longa e ácido iodoacético na nanopartícula de acordo com uma concretização da presente invenção.
[0014] A Figura 2B ilustra uma redução da ligação de bissulfeto do PDP para produzir uma nanopartícula sem grupo SH de acordo com uma concretização da presente invenção.
[0015] A Figura 2C ilustra uma reação de LC1-SMCC de cadeia longa com os grupos lisina de uma nanopartícula de proteína de acordo com uma concretização da presente invenção.
[0016] A Figura 2D ilustra uma reação de uma nanopartícula multifuncional com a proteína reagida com SMCC e contém uma nanopartícula de grupo terminal maleimida reativa de acordo com uma concretização da presente invenção.
[0017] A Figura 2E ilustra uma reação de um grupo amino de um peptídeo com LC2-SMCC. A reação é, então, seguida por uma reação com mercaptoetanol para converter a maleimida terminal em uma nanopartícula de álcool de acordo com uma concretização da presente invenção.
[0018] A Figura 2F ilustra uma reação de uma conta funcional (e proteína vinculada) com um peptídeo modificado ao grupo sem carboxila na nanopartícula de acordo com uma concretização da presente invenção.
[0019] A Figura 3A ilustra uma reação de uma nanopartícula contendo grupos amina com uma nanopartícula de LC1-SPDP de acordo com uma concretização da presente invenção.
[0020] A Figura 3B ilustra uma redução da ligação de bissulfeto do PDP para produzir uma nanopartícula sem grupo SH de acordo com uma concretização da presente invenção.
[0021] A Figura 3C ilustra uma reação de LC2-SMCC de cadeia longa com os grupos lisina de uma nanopartícula de proteína de acordo com uma concretização da presente invenção.
[0022] A Figura 3D ilustra uma reação de uma nanopartícula multifuncional com a proteína reagida com SMCC e contém uma nanopartícula de grupo maleimida terminal reativa de acordo com uma concretização da presente invenção.
[0023] Esses e outros aspectos da presente invenção transparecerão melhor aos versados na técnica à luz da descrição detalhada a seguir junto com os desenhos anexos.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0024] A fim de administrar moléculas biologicamente ativas intracelularmente, os inventores da presente invenção apresentam um dispositivo universal com base em nanopartículas penetráveis na membrana celular com moléculas biologicamente ativas ligadas covalentemente a elas. Para tanto, os inventores apresentam, neste documento, um método de funcionalização inovador que garante a ligação covalente de proteínas e peptídeos a nanopartículas. As nanopartículas modificadas penetráveis na célula da presente invenção proporcionam um mecanismo universal para a administração intracelular de moléculas biologicamente ativas para a regulação e/ou normalização da função celular.
[0025] A capacidade de as células se proliferarem, migrarem e se diferenciar de vários tipos de células normalmente é fundamental à embriogenia e à função de células maduras, incluindo, entre outras, as células-tronco/células progenitoras e as células mais diferenciadas dos sistemas hematopoiético e/ou cardiovascular em uma variedade de doenças hereditárias ou adquiridas. Essa capacidade funcional das células-tronco e/ou de tipos de células especializados mais diferenciados é alterada em várias condições patológicas devido a alterações aberrantes em eventos intracelulares, mas pode ser normalizada quando da introdução intracelular de componentes biologicamente ativos. Por exemplo, a sobrevivência debilitada e a diferenciação debilitada de células progenitoras da medula óssea humana em neutrófilos observadas em pacientes com neutropenia congênita cíclica ou grave, que sofrem de infecções fatais graves e podem desenvolver leucemia, podem ser normalizadas por uma pequena molécula inibidora da elastase neutrofílica penetrável na membrana celular, a qual interfere em eventos intracelulares aberrantes e, aparentemente, restaura o fenótipo normal. Não obstante, essas pequenas moléculas específicas para produtos mutantes alvo causadores do transtorno raramente estão disponíveis, motivo pelo qual são necessários dispositivos de penetração na membrana celular eficientes alternativos para a administração celular de moléculas biologicamente ativas capazes de modular a função celular.
[0026] Os métodos revelados neste documento utilizam nanopartículas biocompatíveis, incluindo, por exemplo, partículas de óxido de ferro superparamagnéticas semelhantes às previamente descritas na literatura científica. Esse tipo de nanopartículas pode ser usado em estruturas clínicas para a geração de imagens por ressonância magnética de células da medula óssea, de nódulos linfáticos, do baço e do fígado [vide, por exemplo, Shen et al, “Monocrystalline iron oxide nanocompounds (MION); physicochemical properties”, Magn. Reson. Med., 29, 599 (1993); Harisinghani et. al, “MR lymphangiography using ultrasmall superparamagnetic iron oxide in patients with primary abdominal and pelvic malignancies”, Am. J. Roentgenol, 172, 1.347 (1999)]. Essas nanopartículas magnéticas de óxido de ferro contêm um núcleo de cerca de 5 nm revestido com dextrano reticulado e com cerca de 45 nm do tamanho total das partículas. Mais importantemente, demonstrou-se que essas nanopartículas contendo peptídeos derivados de Tat reticulados permeáveis na membrana celular incorporam-se com eficiência a células hematopoiéticas e progenitoras neurais em quantidades de até 30 pg de nanopartículas de ferro superparamagnéticas por célula [Lewin et al, “Tat peptide-derivatized magnetic nanoparticles allow in vivo tracking and recovery of progenitor cells”, Nat. Biotechnol., 18, 410 (2000)]. Além disso, a incorporação de nanopartículas não afeta as características proliferativas nem as características de diferenciação das células progenitoras primitivas CD34+ derivadas da medula óssea nem a viabilidade celular [Maite Lewin et al, Nat. Biotechnol. 18, 410 (2000)]. Essas nanopartículas podem ser usadas para o acompanhamento in vivo das células marcadas.
[0027] As células marcadas mantêm sua capacidade de diferenciação e também podem ser detectadas em amostras de tecido usando geração de imagens por ressonância magnética. Neste documento, apresentam- se dispositivos inovadores à base de nanopartículas, que agora são funcionalizadas para transportar peptídeos e proteínas que podem servir como excelentes veículos para a administração intracelular de moléculas biologicamente ativas em soluções de reprogramação celular a fim de afetar eventos intracelulares e modular funções e propriedades celulares.
[0028] Descrição Geral de Conjugados de Nanopartícula-Peptídeo/ Proteína:
[0029] As nanopartículas à base de ferro ou outro material com revestimento biocompatível (por exemplo, polissacarídeo dextrano) com grupos funcionais X/Y são ligadas pontes de vários comprimentos, que, por sua vez, são ligadas covalentemente a proteínas e/ou peptídeos (ou outras moléculas pequenas) por intermédio dos grupos funcionais X/Y destas.
[0030] Grupos funcionais que podem ser usados para reticulação incluem:
[0031] -NH2 (por exemplo, lisina, a— NH2),
[0032] -SH,
[0033] -COOH,
[0034] -NH-C(NH)(NH2),
[0035] carboidrato,
[0036] -hidroxila (OH),
[0037] -ligação via fotoquímica de um grupo azido na ponte.
[0038] Reagentes reticulantes podem incluir:
[0039] SMCC [succinimidil-4-(N-maleimido-metil)-ciclohexano-l- carboxilato]. Também existe à disposição o Sulfo-SMCC, o derivado sulfossuccinimidila para grupos reticulantes amino e tiol.
[0040] LC-SMCC (SMCC de cadeia longa). Também Sulfo-LC-SMCC.
[0041] SPDP [N-succinimidil-3-(pipridilditio)-proprionato]. Também Sulfo-SPDP. Reage com aminas e produz grupos tiol.
[0042] LC-SPDP (SPDP de cadeia longa). Também Sulfo-LC-SPDP.
[0043] EDC [cloridrato de l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodi- imida]. Reagente usado para ligar o grupo -COOH ao grupo —NH2.
[0044] SM(PEG)n, onde n = 1,2, 3, 4,... 24 unidades de glicol. Também o derivado Sulfo-SM(PEG)n.
[0045] SPDP(PEG)n, onde n = 1, 2, 3, 4,... 12 unidades de glicol. Também o derivado Sulfo-SPDP(PEG)n.
[0046] Molécula de PEG contendo grupos carboxila e amina.
[0047] Molécula de PEG contendo grupos carboxila e sulfidrila.
[0048] Reagentes de capeamento e bloqueio incluem:
[0049] Anidrido citracônico; específico para NH
[0050] Etil-maleimida; específica para SH
[0051] Mercaptoetanol; específico para maleimida
[0052] À luz do disposto acima, tratamos nanopartículas biocompatíveis para produzir aminas funcionais na superfície, que, por sua vez, foram usadas para ligar quimicamente proteínas e peptídeos curtos.
[0053] No caso de ligar proteínas, por exemplo, a Proteína Verde Fluorescente ou um fator de transcrição, a nanopartículas superparamagnéticas ou alternativas, é possível adotar o seguinte protocolo: Contas superparamagnéticas contendo grupos funcionais amino no exterior podem ser adquiridas comercialmente junto a várias fabricantes. O tamanho delas varia de 20 a 50 nm, e elas possuem de 1015a 1020 nanopartículas por ml com 10 ou mais grupos amina por nanopartícula. As nanopartículas são dispostas no tampão de reação correto (tampão de fosfato a 0,1 M, pH 7,2) pelo uso de uma unidade de filtro centrífugo da Amicon (microcoluna) com corte molecular de 10.000 dáltons. Geralmente, são necessárias cerca de 4 lavagens para garantir um sistema de tamponamento adequado. As nanopartículas são removidas da unidade de filtro de acordo com as recomendações da fabricante (inversão da coluna/dispositivo de filtro girando-o a baixa velocidade).
[0054] Dissolve-se SMCC (da Thermo Fisher) em dimetilformamida (DMF) obtida junto à ACROS (ampola vedada e anídrica) à concentração de 1 mg/ml. A amostra é vedada e é usada quase que imediatamente.
[0055] Adicionam-se dez (10) microlitros da solução a nanopartículas em um volume de 200 microlitros. Isso proporciona um grande excesso de SMCC aos grupos amina disponíveis presentes, e, então, permite-se que a reação prossiga por uma hora. A SM e a DMF excessivas podem ser removidas usando uma coluna de filtro centrífugo da Amicon com um corte de 3.000 dáltons. Geralmente, são necessárias cinco trocas de volume para garantir a troca adequada do tampão. Ê importante remover o excesso de SMCC nesse estágio.
[0056] Qualquer molécula à base de proteína, por exemplo, a Proteína Verde Fluorescente (GFP) disponível para comercialização, uma GFP recombinante purificada ou outras proteínas, é adicionada à solução contendo certa quantidade de etileno-glicol para congelar a -30° C. Para 3 microgramas da proteína em 14 microlitros, adicionam-se 10 microlitros de uma solução recém-preparada de DTT (ditiotreitol, reagente de Cleland) em PBS com vórtice vigoroso. Como as proteínas normalmente contêm mais de uma cisteína, existe a tendência de reticular diferentes moléculas de GFP. Portanto, o DTT excessivo diminui a ligação de ditiol e libera GFP. Permite-se que a reação continue por duas horas a 4o C e, então, remove-se o reagente excessivo por meio de uma unidade de filtro centrífugo da Amicon com um corte de peso molecular de 3.000 dáltons.
[0057] As nanopartículas ativadas e as soluções de proteína são combinadas e, então, permite-se que elas reajam por duas horas, depois do que a proteína não reagida é removida por uma unidade de filtro centrífugo da Amicon com um corte de peso molecular adequado (no exemplo com GFP, o corte é de 50.000 dáltons). A amostra é armazenada a -80° C. Em vez de usar colunas de filtro rotativo da Amicon, também é possível usar pequenas colunas rotativas contendo componentes de filtragem de tamanho sólido, como colunas Bio Rad P. Estas são colunas de exclusão por tamanho. Deve-se ter em mente que o SMCC também pode ser adquirido como um sulfo-derivado (Sulfo- SMCC), tornando-o mais solúvel em água. O DMSO também pode ser substituído por DMF como veículo solvente para o reagente de marcação; mais uma vez, ela deve ser anídrica.
[0058] Todos os outros reagentes reticulantes podem ser aplicados de maneira semelhante. O SPDP também é aplicado à proteína/peptídeo aplicável da mesma maneira que o SMCC. Ele é prontamente solúvel em DME. O ditiol é cortado por uma reação com DTT por uma hora ou mais. Depois de remover os subprodutos e o material não reagido, ele é purificado com o uso de uma coluna de filtro centrífugo da Amicon com um corte de peso molecular de 3.000 dáltons.
[0059] Outro meio mais direto e controlado de marcar uma nanopartícula com um peptídeo e proteína seria usar dois reagentes de acoplamento bifuncionais diferentes. A sequência de reação é um tanto semelhante à da Figura 1. O ácido iodoacético é usado para introduzir um número seleto de grupos “carboxila” na superfície da nanopartícula.
[0060] O peptídeo contendo LC-SMCC é tratado com aminomercaptoetanol. Isso gera uma ligação por intermédio do grupo sulfidrila e produz um grupo amino livre. Esse grupo amino é, então, acoplado ao grupo carboxila na nanopartícula usando EDC. O EDC é conhecido como cloridrato de l-etil-3[3-dimetilaminopropil]carbodi- imida. Essa etapa de acoplamento é realizada por último no esquema da reação.
[0061] A Figura 1 ilustra a descrição geral das nanopartículas magnéticas, adutos de proteínas/peptídeos. Uma nanopartícula magnética é revestida com um polissacarídeo e, então, funcionalizada. Ela pode ser adquirida com aminas na superfície. Ela também pode ser alterada/transformada em quaisquer outros formatos funcionais. O extensor/conector liga fisicamente as duas unidades uma à outra.
[0062] Vários grupos funcionais podem ser usados para ligar quimicamente a nanopartícula à proteína por meio de reações de reticulação. A variedade de grupos funcionais à disposição permite que várias proteínas/peptídeos sejam ligados à nanopartícula, um de cada vez.
[0063] À semelhança, vários reagentes reticulantes ou catalisadores reativos podem ser usados para reticular nanopartículas a proteínas/peptídeos por meio de reagentes hétero-bifuncionais. Vale salientar também que esses reagentes reticulantes vêm em vários comprimentos. Por exemplo, muitos contêm a notação LC, que se refere a extensores ou “cadeias longas”. O composto peguilado também é disponibilizado em vários comprimentos. Dessa forma, pontes de vários comprimentos podem ser adicionadas às nanopartículas e proporcionar diferentes comprimentos de ligação para moléculas maiores, como proteínas, e moléculas menores, como peptídeos.
[0064] Geralmente, diferentes proteínas podem conter os mesmos grupos funcionais, o que dificulta marcar a nanopartícula com as várias proteínas. Há reagentes que permitem alterar os grupos funcionais; logo, podemos mudar os grupos funcionais das proteínas, possibilitando-nos, assim, a seletividade de uma maneira gradual sem interferência das outras proteínas. Isso requer mudar os grupos funcionais das proteínas.
[0065] Vários reagentes podem ser usados para alterar proteínas para que diferentes químicas possam ser usadas para ligar proteínas a grupos funcionais semelhantes. Por exemplo, um composto, tal como o SPDP, pode ser usado para converter uma amina em sulfidrila, que é, então, receptiva à reação com um grupo terminal maleimida.
[0066] Ao ligar proteínas à conta (nanopartícula) de maneira gradual, geralmente grupos residuais e ativos de proteínas previamente ligados podem interferir nas químicas de acoplamento. Por essa razão, reagentes de capeamento permanentes ou reversíveis podem ser usados para bloquear esses grupos terminais ativos contra a interferência de reagentes prestes a ser usados para ligar uma segunda ou terceira proteína à nanopartícula.
[0067] Vários compostos de capeamento diferentes podem ser usados para bloquear os grupos terminais não reagidos. Os compostos de capeamento devem ser usados judiciosamente visto que também podem interferir na atividade das proteínas. Eles são usados com mais frequência quando uma segunda etapa de ligação química é necessária e esse grupo funcional pode interferir.
[0068] Para demonstrar que as proteínas podem ser ligadas a contas (nanopartículas) usando as químicas mencionadas acima, realizamos a síntese de nanopatículas magnéticas, que contiveram Proteína Verde Fluorescente derivada de águas-vivas. O LCC-SMCC foi usado nesse esquema de síntese.
[0069] Reage-se a N-hidroxissuccinimida quimicamente com os grupos amina livres na nanopartícula a fim de formar uma ligação química. Isso produz um grupo terminal maleimida que pode reagir com a GFP. Sabe-se que a GPF possui duas cisteínas e que as cisteínas de várias moléculas de GFP podem reagir para formar ligações de bissulfeto. Para remover essa interferência, a molécula é primeiramente reduzida com o reagente de Cleland.
[0070] A proteína é purificada e, então, permite-se que ela reaja com contas contendo o grupo LC-maleimida. Permite-se que a reação continue por 1 hora e, a seguir, a reação é purificada no filtro rotativo da Amicon (corte de 50.000 dáltons). Tiraram-se imagens com um microscópico eletrônico de fluorescência.
[0071] Vários tipos de grupos funcionais podem ser criados em uma nanopartícula. Isso permite a adição de três ou mais proteínas diferentes que serão ligadas.
[0072] Um primeiro começa com uma amina na superfície.
[0073] O reagente de Traut pode ser usado para converter algumas dessas aminas em sulfidrila. Além disso, o ácido iodoacético pode ser usado para converter algumas aminas em ácido carboxílico.
[0074] Tanto no caso de proteínas quanto no caso de peptídeos, as aminas são convertidas em grupos funcionais com diferentes comprimentos de ponte, conforme descrito em mais detalhes abaixo. Isso servirá como um grupo genérico para ligar proteínas e peptídeos.
[0075] A Figura 1 ilustra a representação esquemática da funcionalização de uma nanopartícula e da ligação de peptídeos e proteínas a essa nanopartícula.
[0076] As sínteses e o revestimento são realizados conforme o seguinte: O NHS-LC-SPDP, disponibilizado para comercialização pela Thermo Fisher, é um extensor de cadeia longa com reagentes de acoplamento bifuncionais de ambos os lados, os quais são específicos para aminas, e um bissulfeto, o qual pode ser convertido em sulfeto.
[0077] Uma extremidade possui éster de N-hidroxissuccinimida, ao passo que a outra extremidade do extensor contém um grupo piridilditiol. Esse grupo ditiol pode ser reduzido para produzir uma sulfidrila. Permite-se que o NHS-LC-SPDP reaja com as nanopartículas, podendo-se limpar a reação do NHS-LC-SPD não incorporado. As nanopartículas acopladas são, então, reduzidas, conforme ilustra a Figura 1.
[0078] Produção de Proteínas Acopladas: As proteínas biologicamente ativas purificadas usando colunas de afinidade contêm um grupo epsilon-amina livre decorrente do resíduo de carbóxi-lisina terminal adicionado para facilitar a ligação com as nanopartículas. O NHS-LC- SMCC é usado como reagente de acoplamento bifuncional. A molécula possui um extensor de cadeia LC1. Uma extremidade possui o reagente N-hidroxisuccinimida específico para aminas. A outra extremidade contém o grupo maleimida, bastante específico para grupos sulfidrila. Depois que o material é acoplado a uma proteína e separado da mistura de reação, a proteína acoplada à maleimida será adicionada às nanopartículas que contêm sulfidrila. O material resultante é separado por filtragem em gel.
[0079] Acoplamento de Peptídeos a Nanopartículas: Neste caso, o peptídeo também contém um carbóxi-lisina terminal que servirá de base para o acoplamento do éster de NHS-LC-maleimida. A molécula possui um extensor de cadeia LC2. Todos os procedimentos são semelhantes aos descritos acima para a proteína.
[0080] Durante a otimização, o peptídeo e as proteínas permeáveis na membrana são misturados a razões diferentes para obter o número máximo de moléculas acopladas à nanopartícula. Com base em estudos previamente publicados, de 3 a 4 moléculas de peptídeo penetrável na célula ligados à superficie por nanopartícula são suficientes para a administração intracelular eficiente de nanopartículas superparamagnéticas.
[0081] O uso do braço LC2-extensor proporciona um meio importante para aumentar o número de moléculas à base de peptídeo vinculadas. O uso de diferentes concentrações de NHS-LC-SPDP permite um maior número de moléculas de peptídeos e proteínas ancoradas à superfície de nanopartículas e, portanto, a penetração mais eficiente e, por conseguinte, uma atividade de reprogramação celular mais robusta.
[0082] Ligação de Peptídeos e Proteínas a uma Nanopartícula: Isso pode ser consumado adotando o procedimento ilustrado na Figura 1. Neste caso, adicionam-se razões de proteínas e peptídeos marcados com SMCC às contas e permite-se que elas reajam.
[0083] Outro meio mais direto e controlado de marcar uma nanopartícula com um peptídeo e uma proteína seria usar dois reagentes de acoplamento bifuncionais diferentes (Figuras de 2A a 2F). A sequência de reação é um tanto semelhante à da Figura 1, com algumas modificações descritas abaixo.
[0084] O ácido iodoacético é usado para introduzir um número seleto de grupos “carboxila” na superfície das nanopartículas. Isso é realizado na etapa I, vide as Figuras de 2A a 2F, etapas de I a VII.
[0085] O peptídeo contendo NH-LC-SMCC é tratado com aminoetanol. Isso gera uma ligação por intermédio do grupo sulfidrila e produz um grupo amino livre. Esse grupo amino é, então, ligado ao grupo carboxila na nanopartícula usando EDAC (EDC). O EDAC é conhecido como cloridrato de l-etil-3(3-dimetilaminopropil)-carbodi-imida. Essa etapa de acoplamento é realizada por último no esquema da reação.
[0086] Em outro aspecto, a presente invenção também se refere a um método para administrar moléculas bioativas ligadas a nanopartículas funcionalizadas para a modulação da atividade intracelular. Por exemplo, células humanas, fibroblastos ou outros tipos de células disponíveis para comercialização ou obtidos usando procedimentos experimentais padrão ou modificados são, em primeiro lugar, laminados em condições estéreis sobre uma superfície sólida com ou sem um substrato para as células se aderirem (células alimentadoras, gelatina, martigel, fibronectina etc.). As células laminadas são cultivadas por certo período de tempo com uma combinação específica de fatores que permite a divisão/proliferação celular ou a manutenção de uma viabilidade celular aceitável. Exemplos incluem soro e/ou vários fatores de crescimento, que podem, mais tarde, ser retirados ou renovados e as culturas continuadas. As células laminadas são cultivadas na presença de nanopartículas biocompatíveis funcionalizadas permeáveis na célula com moléculas bioativas ligadas a elas usando vários métodos descritos neste documento na presença ou ausência de um campo magnético. O uso de um ímã, no caso de partículas superparamagnéticas, produz um aumento importante na área da superfície de contato entre as células e as nanopartículas e, portanto, reforça ainda mais a melhor penetração das nanopartículas funcionalizadas através da membrana celular. Quando necessário, a população celular é tratada repetidamente com as nanopartículas funcionalizadas para administrar as moléculas bioativas intracelularmente.
[0087] As células são suspensas em um meio de cultura e as nanopartículas não incorporadas são removidas por centrifugação ou separação celular, deixando as células presentes na forma de aglomerados. As células aglomeradas são, então, ressuspensas e recultivadas em um meio fresco por um período de tempo adequado. As células podem ser submetidas a vários ciclos de separação, ressuspensão e recultivo até a observação de um efeito biológico consequente acionado pelas moléculas bioativas específicas administradas intracelularmente.
[0088] Um dos usos da invenção consiste na triagem de um composto (ou compostos) para um efeito na reprogramação celular. Isso envolve combinar o composto ligado à nanopartícula usando um ou mais dos métodos revelados neste documento a uma população celular de interesse, cultivar por um período de tempo adequado e, então, determinar qualquer efeito modular resultante dos um ou mais compostos. Isso pode incluir a iniciação da reprogramação celular e a geração de células-tronco pluripotentes, a diferenciação ou a transdiferenciação de células para tipos celulares mais especializados ou diferentes, o exame das células quanto à toxicidade, mudanças metabólicas ou um efeito na atividade contrátil, além de outras funções.
[0089] Outro uso da invenção consiste na formulação de células especializadas como um medicamento ou em um dispositivo de administração destinado ao tratamento do corpo de um ser humano ou animal. Isso permite ao médico administrar as células ao tecido (coração, músculo, fígado etc.) danificado ou em torno dele por meio da vasculatura ou diretamente no músculo ou parede do órgão, permitindo, assim, que as células especializadas enxertem, limitem o dano e participem da reformação da musculatura do tecido e da restauração da função especializada.
[0090] Um dos usos da presente invenção envolve nanopartículas funcionalizadas com outras proteínas, como os fatores de transcrição Oct4 e Sox2, a fim de garantir a reprogramação celular e a geração de células-tronco ou de tipos celulares mais diferenciados com a preservação do genoma intacto.
[0091] Outro uso da presente invenção consiste na triagem de um composto (ou compostos) para um efeito na reprogramação celular. Isso envolve combinar o composto ligado à nanopartícula usando os métodos revelados neste documento a uma população celular de interesse, cultivar por um período de tempo adequado e, então, determinar qualquer efeito modular resultante dos um ou mais compostos. Isso pode incluir a iniciação da reprogramação celular e a geração de células-tronco pluripotentes, a diferenciação ou a transdiferenciação de células para tipos celulares mais especializados ou diferentes, o exame das células quanto à toxicidade, mudanças metabólicas ou um efeito na atividade contrátil, além de outras funções.
[0092] Ainda outro uso da presente invenção é a formulação de células especializadas como um medicamento ou em um dispositivo de administração destinado ao tratamento do corpo de um ser humano ou animal. Isso permite ao médico administrar as células ao tecido (coração, músculo, fígado etc.) danificado ou em torno dele por meio da vasculatura ou diretamente no músculo ou parede do órgão, permitindo, assim, que as células especializadas enxertem, limitem o dano e participem da reformulação da musculatura do tecido e da restauração da função especializada.
[0093] Como forma de ilustrar melhor a presente invenção, sem contudo restringi-la, os Exemplos a seguir revelam outros aspectos dela.
[0094] EXEMPLOS
[0095] Exemplo 1
[0096] Ligou-se GFP à partícula superparamagnética usando LC-SMM como reticulador (ligado aos grupos amina das contas), o qual foi então acoplado diretamente aos grupos sulfidrila na GFP. Dissolveu-se SMCC (da Thermo Fisher) em dimetilformamida (DMF) obtida junto à ACROS (ampola vedada e anídrica) à concentração de 1 mg/ml. A amostra estava vedada e foi usada quase que imediatamente.
[0097] Adicionaram-se dez (10) microlitros da solução a nanopartículas em um volume de 200 microlitros. Isso proporcionou um grande excesso de SMCC aos grupos amina disponíveis presentes, e, então, permitiu-se que a reação prosseguisse por uma hora. A SMCC e a DMF excessivas foram removidas usando uma coluna de filtro rotativo Amicon com um corte de 3.000 dáltons. Foram necessárias cinco trocas de volume para garantir a troca adequada do tampão. Foi importante remover o excesso de SMCC nesse estágio.
[0098] Qualquer molécula à base de proteína, por exemplo, a Proteína Verde Fluorescente (GFP) disponível para comercialização, uma GFP recombinante purificada ou outras proteínas, foi adicionada à solução contendo certa quantidade de etileno-glicol para congelar a -30° C. Para 3 microgramas da proteína em 14 microlitros, adicionaram-se 10 microlitros de uma solução recém-preparada de DTT (ditiotreitol, reagente de Cleland) em PBS com vórtice vigoroso. Como as proteínas normalmente contêm mais que uma cisteína, houve a tendência de reticulação de diferentes moléculas de GFP. Portanto, o DTT excessivo diminuiu a ligação de ditiol e liberou a GFP. Permitiu-se que a reação continuasse por duas horas a 4o C e, então, removeu-se o reagente excessivo por meio de uma unidade de filtro centrífugo da Amicon com um corte de peso molecular de 3.000 dáltons.
[0099] As nanopartículas ativadas e as soluções de proteína foram combinadas e, então, permitiu-se que elas reagissem por duas horas, depois do que a proteína não reagida foi removida por uma unidade de filtro centrífugo da Amicon com um corte de peso molecular adequado (no exemplo com GFP, o corte é de 50.000 dáltons). A amostra foi armazenada a -80° C. Deve-se ter em mente que um sulfo-derivado da SMCC (Sulfo-SMCC), que é mais solúvel em água, pode ser usado. O DMSO também pode ser substituído por DMF como veículo solvente para o reagente de marcação; mais uma vez, ela deve ser anídrica.
[00100] Exemplo 2
[00101] Neste método, os grupos amino da lisina foram usados para a reação de acoplamento com grupos sulfidrila na conta. Contas recém- equilibradas com tampão de fosfato a 0,1 M com pH de 7,2 foram usadas nesses estudos. O LC-SPDP a 1 mg/ml (em DMF) foi recém- preparado. Adicionaram-se 10 microlitros de solução de SPDP à suspensão da conta sob vórtice vigoroso, e, então, permitiu-se que reagissem por uma hora. Depois disso, o material não reagido foi removido por centrifugação e as nanopartículas foram lavadas com tampão de fosfato usando um filtro rotativo da Amicon com um corte de 10.000 dáltons. A ligação de bissulfeto do SPDP foi interrompida usando reagente de Cleland; adicionou-se 1 mg à solução e permitiu-se que a reação prosseguisse por uma hora. Subprodutos e o reagente de Cleland não reagido foram removidos por meio de um filtro rotativo da Amison com um corte de 10.000 dáltons.
[00102] Enquanto a reação acima prosseguia, a GFP foi bloqueada usando N-etilmaleimida. Etilmaleimida excessiva foi adicionada à solução de GFP. A reação prosseguiu por uma hora a temperatura ambiente e materiais indesejados foram removidos usando um filtro rotativo da Amicon com um corte de 3.000 dáltons. Permitiu-se, então, que a GFP reagisse com o SMCC excessivo por uma hora. Depois disso, a GFP foi purificada em uma coluna rotativa e, então, reagida com PDP- nanopartículas. A reação prosseguiu por uma hora e o produto final foi purificado usando um filtro rotativo da Amicon com um corte de 50.000 dáltons.
[00103] Exemplo 3
[00104] Fibroblastos humanos disponíveis para comercialização ou obtidos usando procedimentos experimentais padrão conforme descrito [Moretti et al, “Mouse and human induced pluripotent stem cells as a source for multipotent Isll cardiovascular progenitors”, FASEB J., 24: 700 (2010)] são laminados à densidade de 150.000 células em condições estéreis sobre uma superfície sólida com ou sem células alimentadoras pré-laminadas à densidade de 150.000 a 200.000 células em placas com seis cavidades. As células alimentadoras são obtidas comercialmente ou usando procedimentos de laboratório padrão. As células laminadas são cultivadas por algum tempo com uma combinação específica de fatores que permite a divisão/proliferação celular ou a manutenção de uma viabilidade celular aceitável no meio de cultura contendo soro, que pode, mais tarde, ser retirado ou renovado e as culturas continuadas em condições estéreis em uma incubadora umedecida com CO2 a 5% e O2 ambiente.
[00105] As células coletadas no fundo de um tubo cônico ou as células laminadas são tratadas com 50 microlitros de suspensão contendo nanopartículas biocompatíveis funcionalizadas permeáveis na célula com moléculas bioativas ligadas a elas usando vários métodos revelados neste documento na presença ou ausência de campo magnético.
[00106] O uso de campo magnético, no caso de partículas superparamagnéticas, produz um aumento importante na área da superficie de contato entre as células e nanopartículas e, assim, garante a melhor penetração de nanopartículas funcionalizadas através da membrana celular. De maneira importante, à semelhante da proteção mediada por polietilenoglicol (PEG) de vários fármacos à base de proteínas (PEG-GCSF, Amgen, CA; PEG-Interferon, Schering- Plough/Merck, NJ) aos quais é ligado o PEG, as nanopartículas usadas junto com peptídeos acoplados aumentam o tamanho do polipeptídeo e mascaram a superfície da proteína, diminuindo, assim, a degradação da proteína por enzimas proteolíticas e resultando em maior estabilidade das moléculas de proteína usadas. Se necessário, uma população celular é tratada repetidamente com as nanopartículas funcionalizadas para administrar as moléculas bioativas intracelularmente.
[00107] As células são suspensas em um meio de cultura e nanopartículas não incorporadas são removidas por centrifugação durante 10 minutos a cerca de 1.200 x g, deixando as células presentes na forma de aglomerados no grânulo. As células aglomeradas são, então, ressuspensas, lavadas novamente usando um procedimento semelhante e recultivadas em um meio fresco por um período de tempo adequado. As células podem ser submetidas a vários ciclos de separação, ressuspensão e recultivo em um meio de cultura até a observação de um efeito biológico consequente ativado pelas moléculas bioativas específicas administradas intracelularmente.
[00108] Neste exemplo específico com proteína verde fluorescente, as nanopartículas penetráveis na célula administram proteínas dentro das células, o que propicia a aquisição de nova fluorescência verde por parte das células-alvo. Essa propriedade recém-adquirida permite, subsequentemente, a classificação e separação das células com proteínas administradas intracelularmente com alto grau de homogeneidade que pode ser adicionalmente usado para várias aplicações. De maneira importante, o uso de nanopartículas funcionalizadas permeáveis na célula com proteínas ligadas a elas eliminam qualquer integração ao genoma celular, garantindo, assim, que toda célula com nova propriedade (neste caso, fluorescência) mantenha seu genoma intacto e preserve a integridade do DNA celular.
[00109] A presente invenção pode ser concretizada em outras formas específicas sem divergir de seu âmbito nem de suas características essenciais. As concretizações supramencionadas devem ser, portanto, consideradas ilustrativas em vez de limitantes à invenção descrita neste documento. Sendo assim, o âmbito da invenção é definido pelas Reivindicações anexas, em vez de pela descrição anterior, e todas as modificações que se enquadrem no sentido e nos limites de equivalência das Reivindicações serão abrangidas por ele.

Claims (14)

1. Nanopartícula Biocompatível Funcionalizada, para penetrar através de uma membrana celular de mamífero, para a administração intracelular de molécula bioativa para modular uma função celular, sendo a referida nanopartícula biocompatível funcionalizada compreendendo: uma nanopartícula central com um ou mais grupos funcionais ligados a ela, um peptídeo de penetração celular para penetrar através de uma membrana da referida célula de mamífero, caracterizada por que o referido peptídeo de penetração celular é ligado através de uma primeira molécula ligante a um primeiro grupo funcional na referida nanopartícula central, e uma molécula bioativa para modular uma função da referida célula de mamífero, em que a referida molécula bioativa é ligada através de uma segunda molécula ligante a um segundo grupo funcional na referida nanopartícula central; em que o referido peptídeo de penetração celular e a referida molécula bioativa são independentemente ligados à referida nanopartícula central por meio da ligação do referido peptídeo de penetração celular à referida primeira molécula ligante e a ligação da referida molécula bioativa à referida segunda molécula ligante.
2. Nanopartícula Biocompatível Funcionalizada, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por que a referida nanopartícula central tem um tamanho variando de 5 a 50 nm.
3. Nanopartícula Biocompatível Funcionalizada, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por que o referido primeiro grupo funcional é o mesmo que o referido segundo grupo funcional.
4. Nanopartícula Biocompatível Funcionalizada, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por que a referida nanopartícula central compreende ainda revestimento polimérico.
5. Nanopartícula Biocompatível Funcionalizada, de acordo com a Reivindicação 4, caracterizada por que um ou ambos do referido primeiro grupo funcional e do referido segundo grupo funcional estão ligados ao referido revestimento polimérico na referida nanopartícula central.
6. Nanopartícula Biocompatível Funcionalizada, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por que a referida nanopartícula central compreende ferro.
7. Nanopartícula Biocompatível Funcionalizada, de acordo com a Reivindicação 6, caracterizada por que a referida primeira molécula ligante tem um primeiro comprimento, em que a referida segunda molécula ligante tem um segundo comprimento e em que o referido primeiro comprimento é maior que o referido segundo comprimento.
8. Nanopartícula Biocompatível Funcionalizada, de acordo com a Reivindicação 4, caracterizada por que o referido peptídeo de penetração celular inclui de cinco aminoácidos básicos a nove aminoácidos básicos.
9. Nanopartícula Biocompatível Funcionalizada, de acordo com a Reivindicação 4, caracterizada por que o referido peptídeo de penetração celular inclui nove ou mais aminoácidos básicos.
10. Nanopartícula Biocompatível Funcionalizada, de acordo com a Reivindicação 4, caracterizada por que a referida molécula bioativa é um fator de transcrição.
11. Nanopartícula Biocompatível Funcionalizada, de acordo com a Reivindicação 10, caracterizada por que o referido fator de transcrição é selecionado dentre o grupo que consiste em Oct4, Sox2, Nanog, Lin28, cMyc e Klf4.
12. Uso de Nanopartícula Biocompatível Funcionalizada, caracterizado por que é para o fabrico de um medicamento para mudar uma funcionalidade celular dentro de uma célula de mamífero.
13. Uso de Nanopartícula Biocompatível Funcionalizada, de acordo com a Reivindicação 12, caracterizado por que a citada mudança da referida funcionalidade celular é selecionada do grupo que consiste numa mudança de uma propriedade físico-química, de uma propriedade proliferativa, da capacidade de sobrevivência, na propriedade fenotípica morfológica e no estado de diferenciação da dita célula.
14. Uso de Nanopartícula Biocompatível Funcionalizada, de acordo com a Reivindicação 13, caracterizado por que a mudança da funcionalidade celular envolve uma habilidade adquirida da célula de produzir um novo tipo celular, incluindo uma célula-tronco ou um tipo de célula mais diferenciado.
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Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013059831A1 (en) * 2011-10-21 2013-04-25 Stemgenics, Inc Functionalized nanoparticles for intracellular delivery of biologically active molecules
CN116474071A (zh) 2013-03-01 2023-07-25 康德生物医疗有限公司 治疗线粒体疾病的方法
WO2014134554A1 (en) 2013-03-01 2014-09-04 Stealth Peptides International, Inc. Methods and compositions for the prevention or treatment of barth syndrome
WO2014209905A2 (en) 2013-06-26 2014-12-31 Stealth Peptides International, Inc. Methods and compositions for detecting and diagnosing diseases and conditions
EP3035917A4 (en) * 2013-08-23 2017-03-01 Rutgers, the State University of New Jersey Biologically active synthetic nanoparticle constructs and methods of use therof
US11306326B2 (en) 2013-08-23 2022-04-19 Rutgers, The State University Of New Jersey Biologically active synthetic nanoparticle constructs and methods of use thereof
WO2015120421A1 (en) * 2014-02-10 2015-08-13 Nvigen, Inc. Cell modulation nanocomposition, and methods of use
CN105440112A (zh) * 2015-12-07 2016-03-30 国家纳米科学中心 多肽-白蛋白偶联药物、其制备方法及应用
RU2018146815A (ru) * 2016-06-03 2020-07-10 Стемдженикс, Инк. Прямое перепрограммировние соматических клеток человека в направлении выбранной (предопределенной) дифференцированной клетки с использованием функционализированных наночпстиц
EP3463316A4 (en) * 2016-06-03 2020-05-27 Stemgenics, Inc. FUNCTIONALIZED NANOPARTICLES FOR INTRACELLULAR ADMINISTRATION OF BIOLOGICALLY ACTIVE MOLECULES AND METHOD FOR THE PRODUCTION AND USE THEREOF
WO2018071572A1 (en) * 2016-10-11 2018-04-19 Stemgenics, Inc. Nanoparticles functionalized with gene editing tools and related methods
US11491114B2 (en) 2016-10-12 2022-11-08 Curioralrx, Llc Formulations for enteric delivery of therapeutic agents
JOP20190248A1 (ar) 2017-04-21 2019-10-20 Amgen Inc بروتينات ربط مولد ضد trem2 واستخداماته
WO2018226529A1 (en) * 2017-06-05 2018-12-13 The Regents Of The University Of Michigan Complexes for delivery of antigenic peptides
CN108287235B (zh) * 2018-02-07 2021-03-09 常州天地人和生物科技有限公司 一种高效、稳定的磁性免疫微球的制备和应用
US20200326325A1 (en) 2019-04-12 2020-10-15 Lisa Diamond Nanosensor chip with compound nanopores
CN110642876A (zh) * 2019-10-10 2020-01-03 南京市口腔医院 半胱氨酸修饰金纳米颗粒和制备方法、应用及促进骨组织再生产品
CN112472685B (zh) * 2020-12-10 2023-03-24 哈尔滨工业大学 一种杂化中性粒细胞机器人的制备方法

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10046508A1 (de) * 1999-09-14 2001-04-05 Tridelta Bio Medical Gmbh Magnetische Nanoteilchen mit biochemischer Wikrsamkeit und Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung
US7329638B2 (en) * 2003-04-30 2008-02-12 The Regents Of The University Of Michigan Drug delivery compositions
CN101389314A (zh) 2005-03-14 2009-03-18 得克萨斯大学体系董事会 生物活性fus1肽和纳米颗粒-多肽复合物
WO2007149062A2 (en) * 2005-03-14 2007-12-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Bioactive fus1 peptides and nanoprticle-polypeptide complexes
MX2007016039A (es) * 2005-06-17 2008-10-27 Univ North Carolina Metodos, sistemas y materiales de fabricacion de nanoparticulas.
US20080213377A1 (en) * 2006-12-08 2008-09-04 Bhatia Sangeeta N Delivery of Nanoparticles and/or Agents to Cells
US20080166412A1 (en) 2007-01-02 2008-07-10 Kiminobu Sugaya Methods and materials for stimulating proliferation of stem cell
KR100925689B1 (ko) 2007-07-25 2009-11-10 한국생명공학연구원 항체와 나노입자를 세포 내로 동시에 전달할 수 있는다기능성 단백질
WO2009035541A1 (en) 2007-09-10 2009-03-19 Merck & Co., Inc. Method of treating inherited severe neutropenia
KR100951719B1 (ko) * 2007-10-02 2010-04-07 재단법인서울대학교산학협력재단 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체 및그 용도
EP2227241A1 (en) 2007-11-30 2010-09-15 Cytomatrix PTY LTD Methods of inducing pluripotency involving sox2 protein
WO2009105671A2 (en) 2008-02-21 2009-08-27 Burnham Institute For Medical Research Methods and compositions related to peptides and proteins with c-terminal elements cross-reference to related applications
JP2012513218A (ja) * 2008-12-23 2012-06-14 ヴィヴォスクリプト，インコーポレイテッド 遺伝子改変を伴わずに細胞を再プログラミングするための組成物および方法
EP2417262B1 (en) * 2009-04-07 2015-05-20 Dow AgroSciences LLC Nanoparticle mediated delivery of sequence specific nucleases
WO2013059831A1 (en) * 2011-10-21 2013-04-25 Stemgenics, Inc Functionalized nanoparticles for intracellular delivery of biologically active molecules

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