BR112014009491B1 - Molécula de ácido nucleico isolada, vetor, célula hospedeira, uso de uma semente de planta transgênica, pólen transgênico ou parte de planta transgênica, proteína e método para produção de um hospedeiro transgênico de maior produtividade - Google Patents

Abstract

MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADA, USO DE UMA SEM ENTE DE PLANTA, PARTE DE PLANTA OU PLANTA COMPREENDENDO A MESMA VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, PRODUTO DE PLANTA PROCESSADO, MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE UM HOSPEDEIRO DE CULTIVO DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA E PARA GERAR UMA SEMENTE DE PLANTA, PARTE DE PLANTA OU PLANTA TRANSGÊNICA A invenção refere-se a polinucleotídeos que codificam um fator de transcrição HaHB4 modificado e polinucleotídeos que codificam fragmentos e variant es funcionalmente ativos de um fator de transcrição Ha HB4 modificado bem como vetores e células hospedeiras contendo esses polinucleotídeos e os polipeptídeos codificados por esses polinucleotídeos. A invenção também engloba células hospedeiras transgênicas, plantas, semente, pólen, e partes da planta contendo os polipeptídeos e/ou polinucleotídeos da invenção. A invenção ainda engloba métodos de produção das células hospedeiras transgênicas, plantas, semente, pólen, e partes da planta e os produtos de planta processados produzidos a partir desses hospedeiros transgênicos.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Esse pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório US 61/601,335, depositado em 21 de fevereiro de 2012, o qual está incorporado por referência em sua totalidade.

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIA COMO ARQUIVO DE TEXTO

[0002] Esse pedido se refere a uma “Listagem de Sequência” listada abaixo, a qual é provida como um arquivo de texto. O arquivo de texto contém um documento intitulado “HAHB4_SEQID_Listing_ascii_NA.txt” (25.010 bytes, criado em 20 de fevereiro de 2013), o qual está incorporado por referência em sua totalidade.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO

[0003] A invenção se refere a polinucleotídeos que codificam um fator de transcrição HaHB4 modificado e polinucleotídeos que codificam fragmentos e variantes funcionalmente ativos de um fator de transcrição HaHB4 modificado bem como vetores e células hospedeiras contendo esses polinucleotídeos e os polipeptídeos codificados por esses polinucleotídeos. A invenção também engloba células hospedeiras transgênicas (incluindo células de plantas), plantas, semente, pólen, e partes da planta contendo os polipeptídeos e/ou polinucleotídeos da invenção. A invenção ainda engloba métodos de produção de células hospedeiras transgênicas, plantas, semente, pólen, e partes da planta e os produtos vegetais processados a partir desses hospedeiros transgênicos.

TÉCNICA ANTERIOR

[0004] O homeodomínio é geralmente conhecido por ser um motivo de ligação de DNA conservado de 61 aminoácidos presentes em um subconjunto de fatores de transcrição eucarióticos que está envolvido nos processos de regulação do desenvolvimento em organismos maiores (Gehring, Science 236: 1245-1252 (1987)). Os genes que codificam o homeodomínio contendo proteínas foram isolados de muitos organismos eucarióticos incluindo fungos, mamíferos e plantas (Gehring et al., Annu. Rev. Biochem. 63:487-526 (1994)). Entretanto, os genes que codificam as proteínas que contêm um homeodomínio associado com uma proteína interagindo com domínio de fecho de leucina (frequentemente referido como proteínas HD-Zip) têm de ser, até o momento, apenas encontrados em plantas. Acredita-se que as proteínas de fecho de leucina do homeodomínio estão geralmente envolvidas nos processos de regulação do desenvolvimento associados com a resposta de plantas para condições ambientais (Chan et al., Biochim. Biophys. Acta 1442(1):1-19 (1998), Carabelli et al., Plant J. 4:469-479 (1993); Schena et al., Genes Dev. 7:367379 (1993)).

[0005] HaHB4 é um fator de transcrição de girassol (Helianthus annuus) que pertence à subfamília I das proteínas HD-Zip e compartilha cerca de 50% da identidade da sequência de aminoácido dentro do homeodomínio com outros membros dessa subfamília, com a exceção dos fatores de transcrição de Arabidopsis thaliana AtHB7 e AtHB12, que compartilham 60% e 53% de identidade, respectivamente com a sequência de homeodomínio HaHB4 correspondente. HaHB4 é endogenamente expresso em níveis muito baixos em plantas de girassol cultivadas em condições ambientais controladas e normais. Acredita-se que a regulação alta da expressão de HaHB4 endógeno em disponibilidade de água limitada e mediante exposição ao ácido abscísico (ABA) conduz a uma tolerância aumentada à planta girassol para estresse hídrico. Similarmente, Arabidopsis thaliana transgênica expressando HaHB4 recombinante relatou demonstrar tolerância aumentada para condições de escassez de água (estiagem). Em particular, o documento de Patente Norte-Americana n° 7.674.955 divulga que as plantas Arabidopsis thaliana transgênicas superexpressando HaHB4 exibem tolerância à estiagem como comparado à variedade tipo selvagem da planta Arabidopsis thaliana sob as mesmas condições. Entretanto, o documento de Patente Norte- Americana n° 7.674.955 não divulga os fatores de transcrição HaHB4 modificados descritos aqui, ou a produtividade aumentada de plantas transgênicas contendo esses fatores de transcrição HaHB4 modificados sob as condições de escassez de água e não escassez de água como comparado à variedade tipo selvagem das plantas sob as mesmas condições.

[0006] O aumento da produtividade agrícola e a habilidade das culturas em tolerar uma faixa mais ampla de condições ambientais apresentam duas abordagens para enfrentar os maiores desafios enfrentados pela agricultura mundial na alimentação de uma população cada vez maior em recursos de terra arável que diminuem continuamente. Consequentemente, há uma necessidade de prover novas variedades de culturas e outras plantas que exibam produtividade de cultura aumentas e tolerância ao estresse ambiental.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0007] Acredita-se que HaHB4 seja um membro de uma subfamília de fatores de transcrição de planta que está envolvido nos processos de regulação do desenvolvimento associados com a resposta de plantas para condições ambientais. A expressão geneticamente projetada de fator de transcrição HaHB4 Helianthus annuus em plantas transgênicas relatou melhorar a tolerância agronômica à estiagem e condições de salinidade. Não foi relatada melhora na produtividade em condições de crescimento padrão, mas leves penalidades na produção foram relatadas quando a expressão de HaHB4 estava muito alta quando direcionada por um promotor constitutivo. Aqui é relatado o uso de sequências de HaHB4 modificado para a engenharia genética de plantas transgênicas com produtividade aumentada. Mas particularmente, mediante sequenciamento dos transgenes HaHB4 do trigo, milho e linhagens de soja exibindo produtividades aumentadas, os inventores determinaram surpreendentemente que os transgenes têm alterações de sequência distintas quando comparados à sequência de HaHB4 nativo (SEQ ID No: 2). Além disso, os inventores geraram uma sequência de HaHB4 modificado adicional contendo diferentes segmentos sobrepostos que codificam as proteínas de HaHB4 nativo e modificado.

[0008] Consequentemente, em uma realização, a invenção se refere aos polinucleotídeos que codificam um fator de transcrição HaHB4 modificado, o qual mediante expressão em plantas transgênicas, resulta em uma produtividade aumentada ou tolerância ao estresse ambiental quando cultivado em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado a uma variedade tipo selvagem de tal planta cultivada em condições ambientais similares. Em uma realização adicional, a invenção se refere a polinucleotídeos que codificam um fator de transcrição HaHB4 modificado, o qual mediante expressão em plantas transgênicas, resulta em uma taxa de fotossíntese aumentada. A invenção também se refere a polinucleotídeos que codificam HaHB4 modificado (modHaHB4 (por exemplo, mod1HaHB4, mod2HaHB4, mod3HaHB4 e mod4HaHB4)) e polinucleotídeos que codificam fragmentos e variantes funcionalmente ativos de modHaHB4, bem como vetores e células hospedeiras contendo esses polinucleotídeos e as proteínas codificadas por esses polinucleotídeos. A invenção também engloba células hospedeiras transgênicas (incluindo células de planta), plantas, sementes, pólen, e partes da planta contendo polipeptídeos e/ou polinucleotídeos da invenção. Métodos de produção de células hospedeiras transgênicas, plantas, sementes, pólen, e partes da planta usando os polinucleotídeos da invenção e a semente, progenia e produtos de planta processados a partir dessas células hospedeiras transgênicas, plantas, sementes, pólen, e partes da planta também estão englobadas pela invenção.

[0009] De acordo com a realização, a invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica um fragmento ou variante de HaHB4 (SEQ ID No: 2) em que as plantas transgênicas contendo a molécula de ácido nucleico têm uma produtividade aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado a uma variedade tipo selvagem de controle de tal planta cultivada em condições ambientais similares. Em outra realização, a invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica um fragmento ou variante de HaHB4 (SEQ ID No: 2) em que as plantas transgênicas contendo a molécula de ácido nucleico têm uma taxa de fotossíntese aumentada. Uma realização adicional é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica um fragmento ou variante de HaHB4 (SEQ ID No: 2) em que as plantas transgênica contendo a molécula de ácido nucleico têm uma produtividade aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado às plantas transgênicas HaHB4 (SEQ ID No: 2) da mesma variedade, em que a expressão de HaHB4 recombinante está sob controle do mesmo promotor. Uma realização adicional é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica um fragmento ou variante de HaHB4 (SEQ ID No: 2) em que as plantas transgênicas contendo a molécula de ácido nucleico têm uma taxa de fotossíntese aumentada. Em outra realização, as moléculas de ácido nucleico da invenção compreendem uma sequência de polinucleotídeo que codifica a variante de HaHB4 mod1HaHB4 (HaHB4.2 (SEQ ID No: 4)) em que as plantas transgênicas contendo a molécula de ácido nucleico têm uma produtividade aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado a uma variedade tipo selvagem de controle de tal planta cultivada em condições ambientais similares. Em outra realização, as moléculas de ácido nucleico da invenção compreendem uma sequência de polinucleotídeo que codificam a variante de HaHB4 mod1HaHB4 (HaHB4.2 (SEQ ID No: 4)) em que as plantas transgênicas contendo a molécula de ácido nucleico têm uma taxa de fotossíntese aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado a uma variedade tipo selvagem de controle de tal planta cultivada em condições ambientais similares. Uma adicional realização é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica um fragmento ou variante mod1HaHB4 (HaHB4.2 (SEQ ID No: 4)) em que as plantas transgênicas contendo a molécula de ácido nucleico têm uma produtividade aumentada e/ou taxa de fotossíntese aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado às plantas transgênicas de HaHB4 (SEQ ID No: 2) da mesma variedade, em que a expressão de HaHB4 recombinante está sob controle do mesmo promotor. Uma realização adicional é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica um fragmento ou variante mod1HaHB4 (HaHB4.2 (SEQ ID No: 4)) em que as plantas transgênicas contendo a molécula de ácido nucleico têm uma taxa de fotossíntese aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado às plantas transgênicas de HaHB4 (SEQ ID No: 2) da mesma variedade, em que a expressão de HaHB4 recombinante está sob controle do mesmo promotor.

[00010] Em uma realização adicional, as moléculas de ácido nucleico da invenção compreendem uma sequência de polinucleotídeo que codifica a variante de HaHB4 mod2HaHB4 (HaHB4.3 (SEQ ID No: 8)) em que as plantas transgênicas contendo a molécula de ácido nucleico têm uma produtividade aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado a uma variedade tipo selvagem de controle de tal planta cultivada em condições ambientais similares. Em uma realização adicional, as moléculas de ácido nucleico da invenção compreendem uma sequência de polinucleotídeo que codifica a variante de HaHB4 mod2HaHB4 (HaHB4.3 (SEQ ID No: 8)) em que as plantas transgênicas contendo a molécula de ácido nucleico têm uma taxa de fotossíntese aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado a uma variedade tipo selvagem de controle de tal planta cultivada em condições ambientais similares. Outra realização é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica um fragmento ou variante mod2HaHB4 (HaHB4.3 (SEQ ID No: 8)) em que as plantas transgênicas contendo a molécula de ácido nucleico têm uma produtividade aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado às plantas transgênicas de HaHB4 (SEQ ID No: 2) da mesma variedade, em que a expressão de HaHB4 recombinante está sob controle do mesmo promotor. Outra realização é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica um fragmento ou variante de mod2HaHB4 (HaHB4.3 (SEQ ID No: 8)) em que as plantas transgênicas contendo a molécula de ácido nucleico têm uma taxa de fotossíntese aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado às plantas transgênicas de HaHB4 (SEQ ID No: 2) da mesma variedade, em que a expressão de HaHB4 recombinante está sob controle do mesmo promotor.

[00011] Em outra realização, as moléculas de ácido nucleico da invenção compreendem uma sequência de polinucleotídeo que codificam a variante de HaHB4 mod3HaHB4 (HaHB4.4 (SEQ ID No: 38)) em que as plantas transgênicas contendo a molécula de ácido nucleico têm uma produtividade aumentada e/ou taxa de fotossíntese aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado a uma variedade tipo selvagem de controle de tal planta cultivada em condições ambientais similares. Outra realização é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica um fragmento ou variante de mod3HaHB4 (HaHB4.4 (SEQ ID No: 38)) em que as plantas transgênicas contendo a molécula de ácido nucleico têm uma produtividade aumentada e/ou taxa de fotossíntese aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado às plantas transgênicas de HaHB4 (SEQ ID No: 2) da mesma variedade, em que a expressão de HaHB4 recombinante está sob controle do mesmo promotor.

[00012] Em uma realização adicional, as moléculas de ácido nucleico da invenção compreendem uma sequência de polinucleotídeo que codifica o HaHB4 variante mod4HaHB4 (HaHB4.5 (SEQ ID No: 39)) em que as plantas transgênicas contendo a molécula de ácido nucleico têm uma produtividade aumentada e/ou taxa de fotossíntese aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado a uma variedade tipo selvagem de controle de tal planta cultivada em condições ambientais similares. Outra realização é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica um fragmento ou variante de mod4HaHB4 (SEQ ID No: 39) em que as plantas transgênicas contendo a molécula de ácido nucleico têm uma produtividade aumentada e/ou taxa de fotossíntese aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado às plantas transgênicas de HaHB4 (SEQ ID No: 2) da mesma variedade, em que a expressão de HaHB4 recombinante está sob controle do mesmo promotor...

[00013] A invenção também provê uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica (a) a variante de HaHB4 mod1HaHB4 (HaHB4.2 (SEQ ID No: 4)); (b) um fragmento funcionalmente ativo de mod1HaHB4, em que a sequência de aminoácido do dito fragmento não está presente na sequência correspondente de HaHB4 (SEQ ID No: 2); ou (c) uma variante funcionalmente ativa de mod1HaHB4 (SEQ ID No: 4), em que a dita variante compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID No: 4, e em que a sequência de aminoácido da dita variante não está presente na sequência correspondente de HaHB4 (SEQ ID No: 2). As moléculas de ácido nucleico isoladas compreendendo a sequência de polinucleotídeo da SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 12, SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 15 ou SEQ ID No: 16 ou a cadeia complementar da mesma, e fragmentos e variantes dessas moléculas de ácido nucleico que não estão presentes na sequência de polinucleotídeo correspondente de HaHB4 (SEQ ID No: 1 e SEQ ID No: 18), também estão englobados pela invenção.

[00014] Em outra realização, a invenção provê molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica (a) a variante de HaHB4 mod2HaHB4 (HaHB4.3 (SEQ ID No: 8)); (b) um fragmento funcionalmente ativo mod2HaHB4, em que a sequência de aminoácido do dito fragmento não está presente na sequência correspondente de HaHB4 (SEQ ID No: 2); ou (c) uma variante funcionalmente ativa de mod2HaHB4 (HaHB4.3 (SEQ ID No: 8)) em que a dita variante compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80%, 85%, 90%,95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID No: 8; e em que a sequência de aminoácido da dita variante não está presente na sequência correspondente de HaHB4 (SEQ ID No: 2). As moléculas de ácido nucleico isoladas compreendendo a sequência de polinucleotídeo da SEQ ID No: 14 ou SEQ ID No: 17, ou a cadeia complementar da mesma, e fragmentos e variantes dessas moléculas de ácido nucleico que não estão presentes na sequência de polinucleotídeo correspondente de HaHB4 (SEQ ID No: 1 e SEQ ID No: 18), também são englobadas pela invenção.

[00015] Em uma realização, a invenção provê uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica a variante de HaHB4 mod3HaHB4 (HaHB4.4 (SEQ ID No: 38)). Em outra realização, a invenção provê uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica a variante de HaHB4 mod4HaHB4 (HaHB4.5 (SEQ ID No: 39)).

[00016] De acordo com algumas realizações, as variantes ou fragmentos de polipeptídeo funcionalmente ativos codificados pelos polinucleotídeos da invenção são capazes de ligar a sequência de DNA 5’-CAAT(A/T)ATTG-3‘ (SEQ ID No: 11) in vitro. Em outra realização, as variantes ou fragmentos de polipeptídeo funcionalmente ativos codificados pelos polinucleotídeos da invenção são capazes de ligar a sequência de DNA 5’-CAAT(A/T)ATTG-3’ (SEQ ID No: 11) em uma solução consistindo em HEPES-NaOH a 20 mM (pH 7,6), KCl a 50 mM, MgCl2 a 2mM, EDTA a 0,5 mM, DTT a 1,0 mM, 0,5% de Triton X100, 10% de glicerol, e 1,0 μg de poli(dl-dC), a 24 °C. Em outras realizações, as células de plantas transgênicas expressando as variantes ou fragmentos de polipeptídeo funcionalmente ativos da invenção têm um perfil de expressão de gene diferente das células de controle tipo selvagem (por exemplo, parental) de tecido comparável, em um estágio de desenvolvimento comparável e cultivo em condições comparáveis. Em outras realizações, as células de planta transgênica expressando os fragmentos ou variantes de polipeptídeo funcionalmente ativos da invenção têm um perfil de transcrição diferentes das células transgênicas de HaHB4 de tecido comparável, em um estágio de desenvolvimento comparável, e cultivadas em condições comparáveis, e em que a expressão de HaHB4 transgênico está sob controle do mesmo promotor como sequência de codificação de fragmento ou variante de modHaHB4. Em realizações adicionais, as plantas transgênicas que expressam os fragmentos ou variantes de polipeptídeo funcionalmente ativos da invenção têm uma produtividade aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado a uma variedade tipo selvagem de tal planta cultivada em condições ambientais similares. Em realizações adicionais, as plantas transgênicas que expressam os fragmentos ou variantes de polipeptídeo funcionalmente ativos da invenção têm a taxa de fotossíntese aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado a uma variedade tipo selvagem de tal planta cultivada em condições ambientais similares. Em outras realizações, as plantas transgênicas que expressam os fragmentos ou variantes de polipeptídeo funcionalmente ativos da invenção têm produtividade aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado às plantas transgênicas de HaHB4 cultivadas em condições ambientais similares, em que a expressão de HaHB4 transgênico e sob o controle do mesmo promotor como sequência de codificação do fragmento ou variante de modHaHB4. Em outras realizações, as plantas transgênicas que expressam os fragmentos ou variantes de polipeptídeo funcionalmente ativos da invenção têm taxa de fotossíntese aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado às plantas transgênicas de HaHB4 cultivadas em condições ambientais similares, em que a expressão de HaHB4 transgênico está sob o controle do mesmo promotor como sequência de codificação de fragmento ou variante de modHaHB4.

[00017] Os ácidos nucleicos, incluindo vetores e cassetes de expressão, compreendendo os polinucleotídeos da invenção operacionalmente associados com um promotor também estão englobados pela invenção. De acordo com algumas realizações, os polinucleotídeos da invenção são operacionalmente associados com um promotor constitutivo. Em realizações particulares, o promotor constitutivo é o promotor 35S CaMV ou o promotor Ubi1. De acordo com outras realizações, os polinucleotídeos da invenção são operacionalmente associados com um promotor induzível. Em realizações particulares, o promotor induzível é uma versão modificada do promotor de HaHB4 fundido com o primeiro íntron do Arabidopsis Cox5c-2.

[00018] A invenção também engloba células hospedeiras compreendendo os ácidos nucleicos da invenção. As células hospedeiras exemplares para uso de acordo com a invenção incluem, entre outros, bactérias, fungos, insetos, células vegetais e animais. Em realizações particulares, a célula hospedeira é uma célula vegetal. De acordo com algumas realizações, a célula hospedeira é uma célula vegetal monocotiledônea. Em outras realizações, a célula hospedeira é trigo (Triticum aestivum), milho (Zea mays), ou arroz (Oryza sativa). De acordo com outras realizações, a célula hospedeira é uma célula vegetal dicotiledônea. Em realizações particulares, a célula hospedeira é soja (Glycine max). Em realizações adicionais, a célula hospedeira é Arabidopsis (Arabidopsis thaliana).

[00019] As plantas transgênicas, semente, pólen, partes da planta, e células de planta transgênica compreendendo sequências de polinucleotídeo da invenção também estão englobadas pela invenção. Em uma realização, a planta transgênica, semente, pólen, parte da planta ou célula de planta transgênica compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica mod1HaHB4 (SEQ ID No: 4). Em outras realizações, o polinucleotídeo que codifica mod1HaHB4 compreende uma sequência de polinucleotídeo selecionada de: SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 12, SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 15 e SEQ ID No: 16. Em outra realização, a planta transgênica, semente, pólen, parte da planta ou célula de planta transgênica compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica mod2HaHB4 (SEQ ID No: 8). Em outras realizações, o polinucleotídeo que codifica mod2HaHB4 compreende uma sequência de polinucleotídeo selecionada de SEQ ID No: 14 e SEQ ID No: 17.

[00020] Em outra realização, a planta transgênica, semente, pólen, parte da planta ou célula de planta transgênica compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica mod3HaHB4 (SEQ ID No: 38). Em outra realização, a planta transgênica, semente, pólen, parte da planta ou célula de planta transgênica compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica mod4HaHB4 (SEQ ID No: 39).

[00021] Em uma realização adicional, a invenção engloba uma planta transgênica, semente, pólen ou parte da planta compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica (a) mod1HaHB4 (SEQ ID No: 4); (b) um fragmento funcionalmente ativo de mod1HaHB4 (SEQ ID No: 4), em que a sequência de aminoácido do dito fragmento não está presente na sequência correspondente de HaHB4 (SEQ ID No: 2); ou (c) uma variante funcionalmente ativa de mod1HaHB4 (SEQ ID No: 4), em que a dita variante compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID No: 4, e em que a sequência de aminoácido da dita variante não está presente na sequência correspondente de HaHB4 (SEQ ID No: 2).

[00022] Em outra realização, a invenção engloba uma planta transgênica, semente, pólen ou parte da planta compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica (a) mod2HaHB4 (SEQ ID No: 8); (b) um fragmento funcionalmente ativo de mod2HaHB4, em que a sequência de aminoácido do dito fragmento não está presente na proteína de HaHB4 (SEQ ID No: 2); ou (c) uma variante funcionalmente ativa de mod2HaHB4 (SEQ ID No: 8), em que a dita variante compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID No: 8, e em que a sequência de aminoácido do dito fragmento não está presente em HaHB4 (SEQ ID No: 2).

[00023] Em outra realização, a invenção engloba uma planta transgênica, semente, pólen ou parte da planta compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica (a) mod3HaHB4 (SEQ ID No: 38); (b) um fragmento funcionalmente ativo de mod3HaHB4, em que a sequência de aminoácido do dito fragmento não está presente na proteína de HaHB4 (SEQ ID No: 2); ou (c) uma variante funcionalmente ativa de mod3HaHB4 (SEQ ID No: 38), em que a dita variante compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID No: 38, e em que a sequência de aminoácido do dito fragmento não está presente em HaHB4 (SEQ ID No: 2).

[00024] Em outra realização, a invenção engloba uma planta transgênica, semente, pólen ou parte da planta compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica mod4HaHB4 (SEQ ID No: 39).

[00025] De acordo com algumas realizações, as plantas transgênicas que expressam os polinucleotídeos da invenção têm produtividade aumentada como comparado à variedade tipo selvagem da planta. Em outras realizações, as plantas transgênicas que expressam os polinucleotídeos da invenção têm produtividade aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado à variedade tipo selvagem da planta. Em outras realizações, as plantas transgênicas que expressam os polinucleotídeos da invenção têm taxa de fotossíntese aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado à variedade tipo selvagem da planta. Em realizações adicionais, as plantas transgênicas que expressam os polinucleotídeos da invenção têm tolerância melhorada a um ou mais estresses ambientais como comparado à variedade tipo selvagem da planta. Os estresses ambientais, em resposta que as plantas transgênicas da invenção podem demonstrar tolerância melhorada, incluem, entre outros, estiagem, salinidade, estresse osmótico, exposição à temperatura fria, exposição ao calor, disponibilidade reduzida de nutriente nitrogênio, disponibilidade reduzida de nutriente fósforo e alta densidade vegetal.

[00026] Em realizações adicionais, as plantas transgênicas que expressam polinucleotídeos da invenção têm produtividade aumentada como comparado a um HaHB4 transgênico da variedade de planta tipo selvagem correspondente, em que a expressão de HaHB4 recombinante está sob controle do mesmo promotor como os polinucleotídeos de codificação da invenção. Em outras realizações, as plantas transgênicas que expressam os polinucleotídeos da invenção têm produtividade aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado a um HaHB4 transgênico da variedade de planta tipo selvagem correspondente, em que a expressão de HaHB4 recombinante está sob controle do mesmo promotor como os polinucleotídeos de codificação da invenção. Em outras realizações, as plantas transgênicas que expressam os polinucleotídeos da invenção têm taxa de fotossíntese aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado a um HaHB4 transgênico da variedade de planta tipo selvagem correspondente, em que a expressão de HaHB4 recombinante está sob controle do mesmo promotor como os polinucleotídeos de codificação da invenção. Em realizações adicionais, as plantas transgênicas que expressam os polinucleotídeos da invenção têm tolerância melhorada a um ou mais estresses ambientais como comparado a um HaHB4 transgênico da variedade de planta tipo selvagem correspondente.

[00027] De acordo com algumas realizações, a planta transgênica, semente, ou parte da planta monocotiledônea. Em algumas realizações, a planta transgênica, semente, ou parte da planta é trigo (Triticum aestivum). Em realizações adicionais, a planta transgênica, semente, ou parte da planta é milho (Zea mays). Em outras realizações, a planta transgênica, semente, ou parte da planta é arroz (Oryza sativa). Em realizações adicionais, a planta transgênica, semente, ou parte da planta da invenção é uma dicotiledônea. Em algumas realizações, a planta transgênica, semente, ou parte da planta é soja (Glycine max). Em realizações adicionais, a planta transgênica, semente, ou parte da planta é Arabidopsis thaliana. A semente e a progenia das células de planta transgênica e plantas transgênicas também estão englobadas pela invenção, como estão a semente e os produtos vegetais processados a partir dessas plantas transgênicas, sua semente, e sua progenia.

[00028] A invenção também está direcionada aos métodos de produção de hospedeiros transgênicos, incluindo, entre outros, bactérias, fungos, e células de planta, e plantas transgênicas compreendendo os polinucleotídeos da invenção. A progenia e semente das células hospedeiras transgênicas e plantas transgênicas produzidas de acordo com esses métodos, bem como os produtos vegetais processados produzidos a partir desses hospedeiros transgênicos, sua semente, e sua progenia.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS/FIGURAS

[00029] A figura 1A provê um alinhamento entre o fator de transcrição HaHB4 (SEQ ID No: 2), fator de transcrição HaHB4 modificado 1 (mod1HaHB4/HaHB4.2 (SEQ ID No: 4); e fator de transcrição HaHB4 modificado 2 (mod2HaHB4 (SEQ ID No: 8)). A região de fecho de homeodomínio-leucina é embalada. A figura 1B provê alinhamento entre o fator de transcrição HaHB4 (HaHB4.1 (SEQ ID No: 2)), mod1HaHB4 (HaHB4.2 (SEQ ID No: 4)); mod2HaHB4 (HaHB4.3 (SEQ ID No: 8)); mod3HaHB4 (HaHB4.4 (SEQ ID No: 38)); e mod4HaHB4 (HaHB4.5 (SEQ ID No: 39)).

[00030] As figuras 2A-2J proveem uma representação esquemática de vetores exemplares e construtos mencionados na aplicação para transformar as células hospedeiras com os polinucleotídeos da invenção. As figuras 2A-C representam construtos pGmHaHB4.2, pGmPrHB4.2, e pGmPrInHB4.2, respectivamente, que têm aplicações na transformação de soja e outras plantas. A figura 2D D-G representa construtos pTaBAR, pTaHaHB4.2, pTaPrHB4.2, e pTaPrInHB4.2, respectivamente, que têm aplicações na transformação do trigo e outras plantas. As figuras 2H-J representam construtos pZmHaHB4.2, pZMPrHB4, e pZmPrInHB4.2, respectivamente, que têm aplicações na transformação de milho e outras plantas. Abreviações: aadA (gene aminoglicosídeo 3’adenililtransferase de S. flexneris 2a que confere resistência ao antibiótico estreptomicina), bar (gene fosfinotricina acetil transferase de S. hygroscopicus que confere resistência ao herbicida fosfinotricina e seus derivados), P35S (o promotor 35S do vírus mosaico da couveflor), Tnos (NOS-Term; terminador 3’ do gene nopalina sintase de A. tumefaciens); Tvsp (terminador 3’ de gene de proteína de armazenamento vegetativa de soja), TEV (intensificador de translação do Tobacco Etch Virus); RB (fragmento da borda direita de T-DNA a partir da cepa nopalina de A. tumefaciens); LB (fragmento da borda esquerda de T-DNA a partir da cepa nopalina de A. tumefaciens); pVS1 (plasmídeo com ampla faixa de hospedeiro de Pseudomonas); AmpR (gene resistente à ampicilina); KanR (gene resistente à Kanamicina); ori (replicação com origem em bactérias); HaHB4.2 (sequência de HaHB4 modificado como descrito na Seção de Exemplos (inserção pTHaHB4.2c); LPF (promotor HaHB4 com modificações descritas na Seção de Exemplos); e íntron COX5c2 (primeiro íntron do gene COX5c- 2).

[00031] As figuras 3A-3D proveem gráficos em barra indicando melhora na produtividade em culturas transgênicas em condições de campo irrigado (sem limitações de água em condições de não escassez de água) em um ambiente de alta produtividade. As figuras 3A-3B descrevem dados de milho transgênico indicando produtividade do grão (kg/ha) correspondendo a duas linhagens de milho transgênico homozigoto expressando constitutivamente HaHB4.2 (SEQ ID No: 4) e milho de controle tipo selvagem (WT). Os dados foram coletados a partir de lotes de campo replicados em duas localizações com diferentes tipos de solo: em um solo argiloso sedimentoso com 626 mm de chuva recebida durante o período de cultivo (Figura 3A), e em um solo argiloso sedimentoso bem drenado com 545 mm de chuva recebida durante o ciclo da cultura (Figura 3B). A figura 3C descreve dados de trigo transgênico indicando a produtividade do grão (kg/ha) correspondendo a uma linhagem de trigo transgênico homozigoto expressando constitutivamente HaHB4.2 (SEQ ID No: 4) e trigo de controle tipo selvagem (WT). Os dados na figura 3C foram obtidos a partir de lotes de campo replicados em uma localização com solo arenoso bem drenado (pH 7,14%, OM 1,57%). A irrigação suplementar foi aplicada para prover 755 mm de água durante o ciclo da cultura. A figura 3D provê dados de soja transgênica indicando produtividade do grão (kg/ha) correspondendo a duas linhagens de soja transgênica homozigota expressando constitutivamente HaHB4.2 (SEQ ID No: 4) e soja de controle tipo selvagem (WT). Os dados na figura 3D foram obtidos a partir de lotes de campo replicados na localização com solo arenoso (pH 5,99%, OM 1,41%). A irrigação suplementar foi aplicada para prover 579 mm de água durante o ciclo de cultura.

[00032] A figura 4 provê um gráfico em barras indicando atividade de transativador de vários HaHB4 modificados em um simples ensaio híbrido de levedura.

[00033] A figura 5 provê um gráfico em barras indicando a taxa de fotossíntese em dois experimentos independentes de plantas Arabidopsis transformadas com um cassete de expressão contendo o promotor 35S constitutivo operacionalmente associado com sequência de ácido nucleico que codifica mod1HaHB4 (HaHB4.2 (SEQ ID No: 4) (isto é, 35S.H4.2).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO DEFINIÇÕES

[00034] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido pelo técnico no assunto ao qual pertence essa invenção. No caso de conflito, o presente pedido de patente incluindo as definições controlará. Também, a menos que requerido de outra forma pelo contexto, os termos singulares devem incluir pluralidade e termos plurais devem incluir o singular. Todas as publicações, patentes e outras referências mencionadas aqui são incorporadas por referência e suas totalidades.

[00035] O termo “polinucleotídeo” destina-se a englobar uma molécula de ácido nucleico singular bem como qualquer um ou mais segmentos de ácido nucleico, por exemplo, fragmentos de DNA ou RNA, presentes em uma molécula de ácido nucleico, e se refere a uma molécula ou construto de ácido nucleico isolado (por exemplo, vetor), por exemplo, RNA mensageiro (mRNA) ou DNA plasmídeo (pDNA) referindo-se a um polinucleotídeo da invenção. Os termos “ácido nucleico” e “polinucleotídeo” são usados alternadamente aqui. Por ácido nucleico ou polinucleotídeo “isolado” entende-se molécula de ácido nucleico, DNA ou RNA, o qual foi removido de seu ambiente natural. Por exemplo, um polinucleotídeo isolado inclui polinucleotídeos recombinantes mantidos em células hospedeiras heterólogas ou purificadas (parcial ou substancialmente) polinucleotídeos em solução. As moléculas de RNA isoladas incluem transcritos de RNA in vivo ou in vitro de polinucleotídeos da presente invenção. Além disso, um polinucleotídeo ou um ácido nucleico pode ser ou pode incluir um elemento regulador tal como um promotor, local de ligação de ribossoma ou um terminador de transcrição.

[00036] Como usado aqui, uma “região de codificação” é uma porção de molécula de ácido nucleico que consiste em códons traduzidos em aminoácidos. Embora um “códon de terminação” (TAG, TGA, ou TAA) não seja traduzido em um aminoácido, ele pode ser considerado como parte de uma região de codificação, mas quaisquer sequências de flanqueamento, por exemplo, promotores, locais de ligação de ribossoma, terminadores de transcrição, íntrons e similares, não são parte de uma região de codificação. Além disso, um vetor, polinucleotídeo, ou ácido nucleico da invenção pode codificar regiões de codificação heterólogas.

[00037] Em certas realizações, o polinucleotídeo ou ácido nucleico é DNA. No caso do DNA, um polinucleotídeo compreendendo um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo pode incluir um promotor e/ou outros elementos de controle de transcrição ou tradução operacionalmente associados com uma ou mais regiões de codificação. Uma associação operável é quando uma região de codificação para um produto de gene, por exemplo, um polipeptídeo, está associado com uma ou mais sequências regulatórias de tal modo a colocar a expressão do produto de gene sob a influência ou controle da(s) sequência(s) regulatória(s). Dois fragmentos de DNA (tais como uma região de codificação de polipeptídeo e um promotor associado a ela) são “operacionalmente associados” ou “operacionalmente ligados” se indução da função do promotor resulta na transcrição do mRNA que codifica o produto de gene desejado e se a natureza da ligação entre os dois fragmentos de DNA não interfere na habilidade das sequências regulatórias de expressão para direcionar a expressão do produto de gene ou interferir na habilidade do modelo de DNA a ser transcrito. Assim, uma região do promotor estaria operacionalmente associada com um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo se o promotor for capaz de efetuar a transcrição daquele ácido nucleico. Geralmente, operacionalmente ligado significa que as sequências de polinucleotídeo que são ligadas são contíguas e, onde necessário unir duas regiões de codificação de proteína, contíguas e no quadro de leitura de modo a produzir uma “proteína de fusão.” Uma “proteína de fusão” é uma proteína compreendendo sequências de aminoácido derivadas de dois ou mais polipeptídeos heterólogos.

[00038] O termo “promotor”, como usado aqui, se refere a um fragmento de ácido nucleico regulatório que funciona para controlar a transcrição de um ou mais genes, localizados a montante com relação à direção da transcrição do local de iniciação da transcrição do gene, e é estruturalmente identificado pela presença de um local de ligação para locais de iniciação de transcrição de RNA polimerase dependente do DNA e quaisquer outras sequências de DNA, incluindo, entre outros, locais de ligação do fator de transcrição, locais de ligação de proteína repressores e ativadores, e qualquer outra sequência de polinucleotídeo conhecida na técnica para agir direta ou indiretamente para regular a quantidade de transcrição do promotor.

[00039] Um “promotor de planta” é um promotor capaz de iniciar a transcrição em células de planta se sua origem for ou não uma célula de planta, por exemplo, se for bem conhecido que os promotores de Agrobacterium são funcionais em células de planta. Consequentemente, os promotores de planta incluem sequências de DNA do promotor derivadas de plantas, vírus de planta e bactérias tais como Agrobacterium. Exemplos de promotores sob controle de desenvolvimento incluem promotores que preferencialmente ou apenas iniciam a transcrição em certos tipos de célula ou tecidos, tais como folhas, raízes ou sementes; e promotores que são “induzíveis” ou “reprimíveis” em condições ambientais incluindo, por exemplo, condições anaeróbicas, exposição a certos produtos químicos e variações na exposição à luz. Os promotores da invenção incluem promotores “constitutivos” que são ativos na maioria dos tecidos sob a maior parte das condições fisiológicas e de desenvolvimento e promotores “não constitutivos” ou “induzíveis” em desenvolvimento (por exemplo, por aplicação externa de certos compostos) ou fisiologicamente regulados. Exemplos de promotores constitutivos aqui revelados incluem, entre outros, o promotor 35S CaMV (vide, por exemplo, pGmHaHB4.2 (Figura 2A), e pZmHaHB4.2 (Figura 2H), e promotor Ubi (vide, por exemplo, pTaHaHB4.2 (Figura. 2E). Exemplos de promotores induzíveis úteis de acordo com a invenção também são aqui revelados e incluem, entre outros, um promotor HaHB4 modificado (vide, por exemplo, pGmPrHB4.2 (Figura 2B), pTaPrHB4.2 (Figura 2F), e pZMPrHB4.2 (Figura 2I) e um promotor induzível composto de uma versão modificada do promotor HaHB4 fundido com o primeiro íntron do gene de Arabidopsis Cox5c-2 (vide, por exemplo, pGmPrInHB4.2 (Figura 2C), e pTaPrInHB4.2 (Figura 2G), e pZmPrInHB4.2 (Figura 2J).

[00040] As “sequências regulatórias” ou “elementos regulatórios” referem-se à sequências de nucleotídeo localizadas à montante (sequências de não codificação 5’ ), dentro, ou a jusante (sequências de não codificação 3’ ) de uma sequência de codificação, e que influencia a transcrição, processamento ou estabilidade do RNA, ou tradução da sequência de codificação associada. As sequências regulatórias podem incluir promotores, intensificadores, operadores, repressores, sinais de terminação de transcrição, sequências líder de tradução, íntrons, sequências de reconhecimento de poliadenilação, local de processamento de RNA, local de ligação efetora e estrutura de stem-loop.

[00041] Os termos “plasmideo” e “vetor” e “cassete de expressão” são usados alternadamente aqui e referem-se a um elemento cromossômico extra que frequentemente carrega genes que não são parte do metabolismo central da célula. Tais elementos podem ser sequências autônomas de replicação, sequências de integração do genoma, sequências de fago ou nucleotídeo, lineares ou circulares, de um DNA ou RNA de cadeia única ou dupla, derivadas de qualquer fonte, em que várias sequências de nucleotídeo se uniram ou forma recombinadas em uma única construção que é capaz de introduzir um fragmento de promotor e sequência de DNA para um produto de gene selecionado junto de uma sequência não traduzida 3’ apropriada em uma célula. Qualquer vetor incluindo um plasmídeo, cosmídeo, fago ou vetor binário de Agrobacterium na forma linear ou circular de cadeia simples ou dupla que pode ou não ser autotransmissível ou mobilizável, e que pode transformar hospedeiro procariótico ou eucariótico tanto por integração no genoma celular ou existir extracromossomicamente (por exemplo, um plasmídeo de replicação autônomo com uma origem de replicação) pode ser usado na prática dos métodos e fazer as composições da invenção. Especificamente incluídos estão os vetores de transporte que se entende por um veículo de DNA capaz de replica, naturalmente ou por projeto, em dois organismos hospedeiros diferentes, que podem ser selecionados de, por exemplo, bactéria, plantas maiores, leveduras ou células fúngicas.

[00042] Alternativamente, o termo “cassete de expressão” pode se referir a um fragmento de ácido nucleico que expressa uma ou mais proteínas específicas, incluindo sequências regulatórias precedendo (sequências de não codificação 5’ ) e seguindo (sequências de terminação 3’ ) sequências de codificação para as proteínas.

[00043] Como usado aqui, o termo “transformação” se refere à transferência de um ácido nucleico em um organismo hospedeiro, resultando em herança geneticamente estável. Os organismos hospedeiros contendo os fragmentos de ácido nucleico transformados são referidos como organismos “transgênicos” ou “recombinantes” ou “transformados”.

[00044] Os termos “expressar” ou “expressão”, como usados aqui, referem-se à transcrição e acúmulo de RNA sentido (mRNA) ou antissentido derivado do fragmento de ácido nucleico da invenção. A expressão também pode ser referir à tradução de mRNA em um polipeptídeo. O processo inclui qualquer manifestação da presença funcional do polinucleotídeo expresso, gene, ou polipeptídeo dentro da célula incluindo, sem limitação, gene knockdown bem como expressão transitória e expressão estável.

[00045] Como usado aqui, o termo “polipeptídeo” destina-se a englobar um “polipeptídeo” singular bem como “polipeptídeos” plurais, e se refere a uma molécula composta de monômeros (aminoácidos) linearmente ligados por ligações de amida (também conhecidas como ligações de peptídeo). O termo “polipeptídeo” se refere a qualquer cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, e não se refere a um comprimento específico do produto ou forma do produto póstraducionalmente modificada. Os termos “polipeptídeo” e “proteína” são usados alternadamente aqui.

[00046] Como usado aqui, o termo “célula hospedeira” se refere a qualquer tipo de sistema celular que pode ser projetado para expressar os polipeptídeos da invenção. As células hospedeiras incluem células cultivadas, células de levedura, células de inseto, células de planta e células de mamíferos, para citar apenas alguns, bem como células compreendidas dentro de um organismo transgênico, tal como uma planta transgênica, ou tecido da planta cultivada.

[00047] Como usado aqui, o termo “planta” inclui referência às plantas inteiras, partes da planta (por exemplo, folhas, caules, raízes etc.), sementes, pólen e células de planta e progenia do mesmo. A célula da planta, como usada aqui, inclui, sem limitação, sementes, culturas de suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, folhas, raízes, brotos, gametófitos, esporófitos, pólen, e micrósporos.

[00048] Como usado aqui, uma “célula de planta transgênica” significa uma célula de planta que é transformada com uma sequência de polinucleotídeo estavelmente integrada da invenção ou alternativamente, com um vetor de replicação autônomo contendo uma sequência de polinucleotídeo da invenção. O termo “estavelmente integrado”, como usado aqui, se refere aos polinucleotídeos que são cromossomicamente integrados, geneticamente estáveis e hereditários pela progenia através de sucessivas gerações. Os métodos para transformar as células de planta são descritos aqui ou conhecidos de outra forma na técnica e incluem, entre outros, transformação mediada por Agrobacterium, eletroporação, e bombardeamento com micropartículas revestidas com DNA. As células de planta transgênica da invenção incluem célula de plantas originalmente transformadas que existe como uma cultura de célula ou organismo, uma célula de planta de progenia presente no tecido regenerado e/ou diferenciado, tal como uma planta transgênica com sequências de polinucleotídeo estavelmente integradas, recombinantes não naturais da invenção. As células de planta transgênica também incluem semente ou pólen derivados de uma progenia de planta transgênica. Para as finalidades da invenção, os termos “grão,” “semente” e “núcleo” são usados alternadamente.

[00049] Como usado aqui, “planta transgênica” inclui referência a uma planta, que compreende dentro de seu genoma um polinucleotídeo da invenção. Geralmente, o polinucleotídeo da invenção está estavelmente integrado dentro do genoma do hospedeiro de modo que o polinucleotídeo seja passado para sucessivas gerações. O polinucleotídeo heterólogo pode ser integrado no genoma sozinho ou como parte de um cassete de expressão recombinante. “Transgênico” é usado aqui para incluir qualquer célula, linhagem de célula, calo, parte da planta ou planta, contendo um polinucleotídeo da invenção incluindo aqueles transgênicos que são inicialmente alterados bem como aqueles criados por cruzamentos sexuais ou propagação assexuada a partir do transgênico inicial.

[00050] Como usado aqui, o termo “funcionalmente ativo” se refere a polinucleotídeos e polipeptídeos (incluindo fragmentos e variantes) capazes de exibir pelo menos uma atividade funcional de HaHB4 ou um fator de transcrição HaHB4 modificado. Em uma realização, um polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção (incluindo fragmentos e variantes) é capaz de ligar a sequência de DNA 5’-CAAT(A/T)ATTG-3’ (SEQ ID No: 11) in vitro. Em outras realizações, os polipeptídeos funcionalmente ativos da invenção são capazes de ligar a sequência de DNA 5’CAAT(A/T)ATTG-3’ (SEQ ID No: 11) em uma solução consistindo em HEPES-NaOH a 20 mM (pH 7,6), KCl a 50 mM, MgCl2a 2mM, EDTA a 0,5 mM, DTT a 1,0 mM, 0,5% de Triton X-100, 10% de glicerol, e 1,0 μg de poli(dl-dC), a 24 °C. Os ensaios de ligação do DNA que podem ser usados para identificar os polipeptídeos funcionalmente ativos que codificam pelos polinucleotídeos da invenção são conhecidos na técnica e podem ser aplicados rotineiramente ou modificados conforme necessário. De acordo com um exemplo, a presença de proteínas de ligação de DNA HaHB4 modificado funcional pode ser ensaiada por um ensaio de desvio da mobilidade eletroforética (EMSA) usando um oligonucleotídeo de cadeia dupla sintético compreendendo a sequência 5’-CAAT(A/T)ATTG-3’ (SEQ ID No: 11). Por exemplo, as proteínas bacterianas purificadas (por exemplo, E. coli) ou proteínas nucleares de célula de planta purificada podem ser incubadas com DNA de cadeia dupla radiomarcado contendo a sequência 5’- AATTCAGATCTCAATAATTGAGAG-3’ (SEQ ID No: 36) e 5’- GATCCTCTCAA TTATTGAGATCTG-3’ (SEQ ID No: 37) no meio de ligação contendo HEPES-NaOH a 20 mM (pH 7,6), KCl a 50 mM, EDTA a 0-2 mM, ditiotreitol a 1,0 mM (DTT), 0,5% de Triton X100, 20% de glicerol, e 1,0 ug de poli(dl-dC), por 20 min a 25° C, suplementado com 2,5% (p/v) de Ficoll e a reação resultante é então carregada em um gel de acrilamida e subsequentemente avaliada para alterações na mobilidade do DNA no gel que funciona como um resultado da ligação do DNA. Outras técnicas e ensaios para avaliar a ligação dos fatores de transcrição para motivos de sequência de DNA, e as afinidades de ligação das proteínas para DNA são conhecidas na técnica.

[00051] Em outra realização, um polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção (incluindo fragmentos e variantes) liga uma ou mais proteínas de planta hospedeira endógena diferente em condições fisiológicas do fator de transcrição HaHB4 (SEQ ID No: 2). Em algumas realizações, um polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção é capaz de ligar uma proteína de planta hospedeira endógena que não é ligada pela porção de polipeptídeo correspondente de HaHB4. Em outras realizações, um polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção não é capaz de ligar uma proteína de planta hospedeira endógena que é ligada pela porção de polipeptídeo correspondente de HaHB4. Os métodos e materiais para determinar a interação proteína-proteína incluindo, por exemplo, a levedura de dois sistemas híbridos, são conhecidos na técnica e podem ser rotineiramente adaptados e aplicados para avaliar as interações de proteína-proteína dos polipeptídeos da invenção. Em uma realização, um polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção (incluindo fragmentos e variantes) liga uma ou mais proteínas Arabidopsis thaliana diferentes em condições fisiológicas do fator de transcrição HaHB4 (SEQ ID No: 2). Os métodos exemplares úteis na análise das interações de proteína-proteína entre um polipeptídeo da invenção e proteínas Arabidopsis thaliana, incluem o protoplasmo de dois sistemas híbridos Arabidopsis (P2H) revelados em Ehlert et al., Plant J. 46:890-900 (2006).

[00052] Em realizações adicionais, uma célula hospedeira contendo um polinucleotídeo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção (incluindo fragmentos e variantes) exibe um perfil de transcrição diferente como comparado a um controle (por exemplo, genótipo tipo selvagem) não contendo os polinucleotídeos ou polipeptídeos da invenção. Em uma realização, uma célula hospedeira contendo um polinucleotídeo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção exibe um perfil de transcrição diferente sob estiagem, condições de salinidade ou exposição ao etileno, como comparado a um controle (por exemplo, genótipo tipo selvagem) não contendo os polinucleotídeos ou polipeptídeos da invenção.

[00053] As análises do perfil de transcrição podem ser realizadas usando reagentes e técnicas conhecidas na técnica. Tais técnicas incluem, entre outras, microarranjos, RT-PCR, proteção RNAse, análise Northern e Western. O perfil de expressão, geralmente por análise de micromatriz, pode ser usado para medir simultaneamente diferenças ou induzir mudanças na expressão de muitos genes diferentes. As técnicas para análise de micromatriz e outras técnicas para avaliar a expressão de uma sequência de codificação, tal como Northern, Western, PCR, e análise de proteção de RNAse são conhecidas na técnica (Schena et al., Science 270:467-470 (1995); Baldwin et al., Curr. Opin. Plant Biol. 2(2):96-103 (1999); Dangond F, Physiol. Genomics 2:53-58 (2000); van Hal et al., J. Biotechnol. 78:271-280 (2000); Richmond and Somerville, Curr. Opin. Plant Biol. 3:108-116 (2000); Almoguera et al., Plant Mol. Biol. 19:781-792 (1992); and Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY.

[00054] Em uma realização, a análise do perfil de transcrição é realizada nas plantas transgênicas Arabidopsis thaliana, partes da planta, ou células de planta da invenção. Os métodos exemplares úteis nas análises de perfil de transcrição das plantas transgênicas, partes da planta, ou célula de plantas da invenção são providos em Manavella et al., Plant Journal 48:125-137 (2006) e Hilson et al., Gen. Res. 14:21762189 (2004); cada qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade. Por exemplo, de acordo com um método, a análise de transcriptoma é realizada usando uma matriz CATMA contendo 24.576 tags específicos de gene de Arabidopsis thaliana. Nos métodos adicionais, o RT-PCR em tempo real é realizado usando iniciadores de oligonucleotídeo projetados usando as sequências disponíveis publicamente (vide, por exemplo, Arabidopsis.org; e Crowe et al., Nucl. Acids. Res. 31:156-158 (2003)).

[00055] Em uma realização adicional, uma célula hospedeira contendo um polinucleotídeo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção exibe um perfil diferente de transcrição ou expressão de mRNA ou proteína selecionada do grupo consistindo em LOX2, CSD1, ERF2, ERF5, ACO, SAM, EIN1, e EIN3, como comparado a um controle (por exemplo, genótipo tipo selvagem) não contendo os polinucleotídeos ou polipeptídeos da invenção. Em uma realização adicional, uma célula hospedeira contendo um polinucleotídeo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção (incluindo fragmentos e variantes) exibe um perfil de transcrição diferente como comparado a uma célula hospedeira HaHB4 transgênica expressando HaHB4 (SEQ ID No: 2) sob o mesmo promotor. Em outra realização, uma célula hospedeira contendo um polinucleotídeo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção exibe um perfil de transcrição diferente sob condições de estiagem, condições de salinidade ou exposição ao etileno, como comparado a uma célula hospedeira HaHB4 transgênica expressando HaHB4 (SEQ ID No: 2) sob o mesmo promotor. Em uma realização adicional, uma célula hospedeira contendo um polinucleotídeo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção exibe um mRNA de expressão diferente ou proteína selecionada do grupo consistindo em LOX2, CSD1, ERF2, ERF5, ACO, SAM, EIN1, e EIN3, como comparado a uma célula hospedeira HaHB4 transgênica expressando HaHB4 (SEQ ID No: 2) sob o mesmo promotor.

[00056] Em outra realização, uma planta transgênica contendo um polinucleotídeo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção (incluindo fragmentos e variantes) exibe uma produtividade alterada quando comparado a um controle (por exemplo, genótipo tipo selvagem) não contendo os polinucleotídeos ou polipeptídeos da invenção. Em outra realização, uma planta transgênica contendo um polinucleotídeo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção (incluindo fragmentos e variantes) exibe uma taxa de fotossíntese alterada quando comparado a um controle (por exemplo, genótipo tipo selvagem) não contendo os polinucleotídeos ou polipeptídeos da invenção. Em realizações particulares, uma planta transgênica contendo um polinucleotídeo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção exibe uma produtividade aumentada quando comparado a um controle (por exemplo, genótipo tipo selvagem) não contendo os polinucleotídeos ou polipeptídeos da invenção. Em realizações particulares, uma planta transgênica contendo um polinucleotídeo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção exibe uma taxa de fotossíntese aumentada quando comparado a um controle (por exemplo, genótipo tipo selvagem) não contendo os polinucleotídeos ou polipeptídeos da invenção. Em realizações particulares, uma planta transgênica contendo um polinucleotídeo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção exibe uma produtividade aumentada sob condições de não escassez de água quando comparado a um controle (por exemplo, genótipo tipo selvagem) sob as condições de não escassez de água. Em realizações particulares, uma planta transgênica contendo um polinucleotídeo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção exibe uma taxa de fotossíntese aumentada sob condições de não escassez de água quando comparado a um controle (por exemplo, genótipo tipo selvagem) sob as mesmas condições de não escassez de água.

[00057] Em uma realização adicional, uma planta transgênica contendo um polinucleotídeo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção (incluindo fragmentos e variantes) exibe uma produtividade alterada quando comparado a uma planta transgênica expressando HaHB4 (SEQ ID No: 2) sob o mesmo promotor. Em uma realização adicional, uma planta transgênica contendo um polinucleotídeo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção (incluindo fragmentos e variantes) exibe uma taxa de fotossíntese alterada quando comparado a uma planta transgênica expressando HaHB4 (SEQ ID No: 2) sob o mesmo promotor.

[00058] Em realizações particulares, uma planta transgênica contendo um polinucleotídeo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção exibe uma produtividade aumentada quando comparado a uma planta transgênica expressando HaHB4 (SEQ ID No: 2) sob o mesmo promotor. Em realizações particulares, uma planta transgênica contendo um polinucleotídeo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção exibe uma taxa de fotossíntese aumentada quando comparado a uma planta transgênica expressando HaHB4 (SEQ ID No: 2) sob o mesmo promotor.

[00059] Em algumas realizações, uma planta transgênica contendo um polinucleotídeo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção exibe uma produtividade aumentada quando cultivadas em condições de não escassez de água como comparado a uma planta transgênica expressando HaHB4 (SEQ ID No: 2) sob o mesmo promotor e sob as mesmas condições hídricas. Em algumas realizações, uma planta transgênica contendo um polinucleotídeo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção exibe uma taxa de fotossíntese aumentada quando cultivada em condições de não escassez de água como comparado a uma planta transgênica expressando HaHB4 (SEQ ID No: 2) sob o mesmo promotor e sob as mesmas condições hídricas. Em algumas realizações, uma planta transgênica contendo um polinucleotídeo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção exibe uma produtividade aumentada quando cultivada em condições de escassez de água como comparado a uma planta transgênica expressando HaHB4 (SEQ ID No: 2) sob o mesmo promotor e sob as mesmas condições hídricas. Em algumas realizações, uma planta transgênica contendo um polinucleotídeo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção exibe uma taxa de fotossíntese aumentada quando cultivada em condições de escassez de água como comparado a uma planta transgênica expressando HaHB4 (SEQ ID No: 2) sob o mesmo promotor e sob as mesmas condições hídricas.

[00060] Em outras realizações, uma planta transgênica contendo um polinucleotídeo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção exibe uma produtividade aumentada quando cultivada em condições de escassez de água e não hídrico como comparado a uma planta transgênica expressando HaHB4 (SEQ ID No: 2) sob o mesmo promotor e sob as mesmas condições hídricas. Em outras realizações, uma planta transgênica contendo um polinucleotídeo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção exibe uma taxa de fotossíntese aumentada quando cultivada em condições de escassez de água e não hídrico como comparado a uma planta transgênica expressando HaHB4 (SEQ ID No: 2) sob o mesmo promotor e sob as mesmas condições hídricas.

[00061] Em outras realizações, uma planta transgênica contendo um polinucleotídeo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção exibe uma produtividade aumentada quando cultivada em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado a um controle (por exemplo, genótipo tipo selvagem) sob as mesmas condições hídricas. Em outras realizações, uma planta transgênica contendo um polinucleotídeo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção exibe uma taxa de fotossíntese aumentada quando cultivada em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado a um controle (por exemplo, genótipo tipo selvagem) sob as mesmas condições hídricas. Em realizações particulares, uma planta transgênica contendo um polinucleotídeo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção exibe uma produtividade aumentada quando cultivada em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado a uma planta transgênica contendo HaHB4 (SEQ ID No: 2) sob o mesmo promotor e sob as mesmas condições hídricas. Em realizações particulares, uma planta transgênica contendo um polinucleotídeo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção exibe uma taxa de fotossíntese aumentada quando cultivada em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado a uma planta transgênica contendo HaHB4 (SEQ ID No: 2) sob o mesmo promotor e sob as mesmas condições hídricas.

[00062] As realizações particulares são direcionadas aos métodos de uso dos polinucleotídeos da invenção para produzir uma planta que tenha uma produtividade aumentada em condições limitantes não hídricas, ou em condições de limitação de água e limitantes não hídricas, compreendendo as etapas de introdução de um polinucleotídeo da invenção em uma célula de planta hospedeira, seleção para a presença da molécula de polinucleotídeo para produzir uma célula de planta transgênica, e regeneração de uma planta transgênica a partir da célula de planta transgênica, pelo que a planta transgênica tem uma produtividade aumentada em condições limitantes não hídricas ou condições de limitação de água, quando comparado a uma planta tipo selvagem comparável ou uma planta transgênica HaHB4 em que HaHB4 está sob controle do mesmo promotor. As realizações particulares são direcionadas aos métodos de uso dos polinucleotídeos da invenção para produzir uma planta que tenha uma taxa de fotossíntese aumentada em condições limitantes não hídricas, condições de limitação de água, ou em ambas as condições de limitação de água e limitantes não hídricas e, compreendendo as etapas de introdução de um polinucleotídeo da invenção em uma célula de planta hospedeira, seleção para a presença da molécula de polinucleotídeo para produzir uma célula de planta transgênica, e regeneração de uma planta transgênica a partir da célula de planta transgênica, pelo que a planta transgênica tem uma taxa de fotossíntese aumentada em condições limitantes não hídricas ou condições de limitação de água, quando comparado a uma planta tipo selvagem comparável ou uma planta transgênica HaHB4 em que HaHB4 está sob controle do mesmo promotor.

[00063] Por um ácido nucleico ou polinucleotídeo tendo uma sequência de nucleotídeo pelo menos, por exemplo, 95% “idêntica” a uma sequência de nucleotídeo de referência da presente invenção, pretende-se que a sequência de nucleotídeo do polinucleotídeo seja idêntica à sequência de referência, exceto que a sequência de polinucleotídeo pode incluir até cinco mutações de ponto por cada 100 nucleotídeos da sequência de nucleotídeo de referência. Em outras palavras, para obter um polinucleotídeo que tenha uma sequência de nucleotídeo pelo menos 95% idêntica a uma referência nucleotídeo sequência, até 5% dos nucleotídeos na sequência de referência podem ser excluídos ou substituídos com outro nucleotídeo, ou vários nucleotídeos até 5% dos nucleotídeos totais na sequência de referência podem ser inseridos na sequência de referência.

[00064] Como uma questão prática, se qualquer molécula de ácido nucleico particular ou polipeptídeo for pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica a uma sequência de nucleotídeo ou sequência de polipeptídeo da presente invenção pode ser determinado usar convencionalmente programas de computador conhecidos. O termo “identidade percentual”, como conhecido na técnica, é uma relação entre duas ou mais sequências de polipeptídeo ou duas ou mais sequências de polinucleotídeo, conforme determinado pela comparação das sequências. Na técnica, “identidade” também significa o grau de relacionamento da sequência entre as sequências de polipeptídeo ou polinucleotídeo, como pode ser o caso, como determinado pela correspondência entre as cadeias de tais sequências. “Identidade” e “similaridade” podem ser prontamente calculadas por métodos conhecidos, incluindo, entre outros, aqueles descritos em: 1.) Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., Ed.) Oxford University: NY (1988); 2.) Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., Ed.) Academic: NY (1993); 3.) Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., Eds.) Humania: NJ (1994); 4.) Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., Ed.) Academic (1987); and 5.) Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., Eds.) Stockton: NY (1991).

[00065] Os métodos preferidos para determinar a identidade são projetados para dar a melhor correspondência entre as sequências testadas. Os métodos para determinar a identidade e similaridade são codificados em programas de computadores disponíveis publicamente. Os alinhamentos de sequência e cálculos de identidade percentual podem ser realizados usando o programa MegAlign® do conjunto de computação de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI). Os múltiplos alinhamentos das sequências são realizados usando o “método de alinhamento Clustal” que engloba diversas variedades do algoritmo incluindo o “método de alinhamento Clustal V” correspondente ao método de alinhamento marcado Clustal V (descrito por Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989); Higgins et al., Comput. Appl. Biosci., 8:189-191 (1992)) e encontrado no programa MegAlign® do conjunto de computação de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc.). Para múltiplos alinhamentos, os valores padrão correspondem a GAP PENALTY=10 e GAP COMPRIMENTO PENALTY=10. Os parâmetros padrão para alinhamentos em pares e cálculo de identidade percentual das sequências de proteína usando o método Clustal são KTUPLE=1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 e DIAGONALS SAVED=5. Para ácidos nucleicos, esses parâmetros são KTUPLE=2, GAP PENALTY=5, WINDOW=4 e DIAGONALS SAVED=4. Após o alinhamento das sequências usando o programa Clustal V, é possível obter uma “identidade percentual” através da visualização da tabela das “distâncias da sequência” no mesmo programa. Adicionalmente, o “método de alinhamento Clustal W” está disponível e corresponde ao método de alinhamento marcado Clustal W (descrito por Higgins and Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins et al., Comput. Appl. Biosci. 8:189-191(1992)) e encontrado no programa MegAlign® v6.1 do conjunto de computação de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc.). Os parâmetros padrão para múltiplo alinhamento (GAP PENALTY=10, GAP COMPRIMENTO PENALTY=0.2, Delay Divergen Seqs (%)=30, Peso de Transição de DNA =0.5, Matriz de Peso da Proteína = Série Gonnet, Matriz de Peso do DNA =IUB ). Após alinhamento das sequências usando o programa Clustal W, é possível obter uma “identidade percentual” através da visualização da tabela das “distâncias da sequência” no mesmo programa.

[00066] Por um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido pelo menos, por exemplo, 95% “idêntica” a uma sequência de aminoácido de consulta da presente invenção, pretende-se que a sequência de aminoácido do polipeptídeo em questão seja idêntica à sequência de consulta, exceto que a sequência de polipeptídeo em questão pode incluir até cinco alterações de aminoácido por cada 100 aminoácidos da sequência de aminoácido de consulta. Em outras palavras, para obter um polipeptídeo que tenha uma sequência de aminoácido pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácido de consulta, até 5% dos resíduos de aminoácido na sequência em questão podem ser inseridos, excluídos ou substituídos com outro aminoácido. Essas alterações da sequência de referência podem ocorrer nas posições amino ou carbóxi terminal da sequência de referência de aminoácido ou qualquer lugar entre aquelas posições terminais, intercaladas individualmente dentre os resíduos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência.

[00067] Como uma questão prática, se qualquer polipeptídeo particular for pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a um polipeptídeo de referência pode ser determinado usar convencionalmente programas de computador conhecidos. Um método para determinar a melhor correspondência geral entre uma sequência de consulta (uma sequência da presente invenção) e uma sequência em questão, também referida como um alinhamento de sequência global, pode ser determinado usar o programa de computador FASTDB com base no algoritmo de Brutlag et al., Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990). Em um alinhamento de sequência, as sequências de consulta e em questão são sequências de nucleotídeo ou ambas as sequências de aminoácido. O resultado do dito alinhamento de sequência global está na identidade percentual. Os parâmetros preferidos usados em um alinhamento de aminoácido FASTDB são: Matriz=PAM 0, k-tupla=2, Mismatch Penalty=1, Joining Penalty=20, Randomization Group Comprimento=0, Cutoff Score=1, Window Size=sequência comprimento, Gap Penalty=5, Gap Size Penalty=0.05, Window Size=500 ou o comprimento da sequência de aminoácido em questão, seja qual for o menor.

[00068] Se a sequência em questão é menor que a sequência de consulta devido às exclusões do terminal N ou C, não por causa das exclusões internas, uma correção manual deve ser feita para os resultados. Isso é porque o programa FASTDB não leva em conta os truncamentos do terminal N e C da sequência em questão ao calcular a identidade percentual global. Para as sequências em questão truncadas nos terminais N e C, em relação à sequência de consulta, a identidade percentual é corrigida através do cálculo do número de resíduos da sequência de consulta que são N e C da sequência em questão, que não são correspondidos/alinhados com um resíduo em questão correspondente, como uma porcentagem das bases totais da sequência de consulta. Se um resíduo for correspondido/alinhado é determinado pelos resultados do alinhamento de sequência FASTDB. Essa porcentagem é então subtraída da identidade percentual, calculada pelo programa FASTDB acima usando os parâmetros especificados, para chegar a uma pontuação final da identidade percentual. Essa pontuação final da identidade percentual é o que é usada para as finalidades da presente invenção. Apenas resíduos para os terminais N e C da sequência em questão, que não são correspondidos/alinhados com a sequência de consulta, são considerados para as finalidades de ajustar manualmente a pontuação da identidade percentual. Isto é, apenas as posições do resíduo de consulta do lado de fora dos resíduos mais distantes do terminal N e C da sequência em questão.

[00069] Por exemplo, uma sequência em questão de 90 resíduos de aminoácido é alinhada com uma sequência de consulta de 100 resíduos para determinar a identidade percentual. A exclusão ocorre no terminal N da sequência em questão e, portanto, o alinhamento FASTDB não mostra uma correspondência/alinhamento dos primeiros 10 resíduos no terminal N. Os 10 resíduos não pareados representam 10% da sequência (número de resíduos nos terminais N e C não correspondido/ número total de resíduos na sequência de consulta) assim 10% são subtraídos da pontuação da identidade percentual calculada pelo programa FASTDB. Se os 90 resíduos restantes forem perfeitamente correspondidos, a identidade percentual final seria 90%. Em outro exemplo, uma sequência em questão de 90 resíduos é comparada com uma sequência de consulta de 100 resíduos. Nesse momento, as exclusões são exclusões internas, assim não há resíduos nos terminais N ou C da sequência em questão que não são correspondidos/alinhados com a consulta. Nesse caso, a identidade percentual calculada por FASTDB não é corrigida manualmente. Mais uma vez, apenas as posições do resíduo fora das extremidades do terminal N e C da sequência em questão, conforme exibido no alinhamento de FASTDB, que não são correspondidos/alinhados com a sequência de consulta são corrigidas manualmente. Não devem ser feitas outras correções manuais para as finalidades da presente invenção.

[00070] A identidade percentual de polinucleotídeos e/ou polipeptídeos também pode ser determinada usando os programas BLAST disponíveis através do Centro Nacional para Informação de Biotecnologia (NCBI), com os parâmetros padrão indicados nos programas.

[00071] Como usado aqui, “identidade percentual” significa, na medida em que dois DNA idealmente alinhados ou segmentos de proteína são invariáveis em toda uma janela de alinhamento dos componentes, por exemplo, sequência de nucleotídeo ou sequência de aminoácido. Uma “fração de identidade” para segmentos alinhados de uma sequência de teste e uma sequência de referência é o número dos componentes idênticos àqueles que são compartilhados pelas sequências dos dois segmentos alinhados divididos pelo número total dos componentes de sequência no segmento de referência sobre uma janela de alinhamento que é a menor da sequência de teste completa ou da sequência de referência completa. “Identidade percentual” (“% identidade”) é a fração da identidade vezes 100. Tal alinhamento ideal é considerado entendido como alinhamento local das sequências de DNA. Para alinhamento de proteína, um alinhamento local das sequências de proteína deve permitir introdução de lacunas para alcançar alinhamento ideal. A identidade percentual é calculada sobre o comprimento alinhado não incluindo as lacunas introduzidas pelo alinhamento per se.

[00072] Como usado aqui, o termo polinucleotídeos ou polipeptídeos “variantes” se refere a um polinucleotídeo ou polipeptídeo diferindo de um polinucleotídeo ou polipeptídeo especificamente citado na invenção por inserções, exclusões, mutações e substituições, no resíduo de aminoácido e posições de polinucleotídeo, respectivamente, criados usando, por exemplo, técnicas de DNA recombinante. Especificamente, as variantes recombinantes que codificam esses mesmos polipeptídeos ou similares podem ser sintetizadas ou selecionadas fazendo uso da “redundância” no código genético. Várias substituições de códon, tais como as mudanças silenciosas que produzem vários locais de restrição, podem ser introduzidas para otimizar a clonagem em um plasmídeo ou vetor viral ou expressão em um sistema procariótico ou eucariótico particular (isto é, “otimização de códon” direcionada ao hospedeiro). As mutações na sequência de polinucleotídeo podem ser refletidas no polipeptídeo ou domínios de outros peptídeos adicionados ao polipeptídeo para modificar as propriedades de qualquer parte do polipeptídeo, para mudar as características tais como DNA e outras afinidades de ligação de ligante, ou taxa de degradação/rotatividade. De acordo com algumas realizações, os polinucleotídeos da invenção são códons otimizados para otimizar a expressão do polipeptídeo em um hospedeiro transgênico.

[00073] O termo “códon otimizado”, que se refere aos genes ou regiões de codificação das moléculas de ácido nucleico para transformação de vários hospedeiros, se refere à alteração dos códons no gene ou regiões de codificação das moléculas de ácido nucleico para refletir o uso típico do códon do organismo hospedeiro sem alterar o polipeptídeo codificado pelo DNA. Tal otimização inclui substituir pelo menos um, ou mais de um, ou um número significativo, de códons com um ou mais códons que são mais frequentemente usados nos genes daquele organismo.

[00074] Os desvios na sequência do nucleotídeo que compreende os códons que codificam os aminoácidos de qualquer cadeia de polipeptídeo permitem variações na codificação da sequência para o gene. Uma vez que cada códon consiste em três nucleotídeos, e os nucleotídeos compreendendo DNA são restritos a quatro bases específicas, há 64 combinações possíveis de nucleotídeos, 61 dos quais codificam os aminoácidos (o três códons restantes codificam a tradução de terminação dos sinais). Como um resultado, muitos aminoácidos são designados por mais de um códon. Por exemplo, os aminoácidos alanina e prolina são codificados por quatro tripletos, serina e arginina por seis, enquanto triptofano e metionina são codificados por apenas um tripleto. Essa degeneração permite a composição de base do DNA para variar ao longo de uma ampla faixa sem alterar a sequência de aminoácido das proteínas codificadas pelo DNA.

[00075] Muitos organismos exibem um viés para uso de códons particulares para codificar a inserção de um aminoácido particular em uma cadeia de peptídeo em crescimento. A preferência do códon, ou viés do códon, diferenças no uso do códon entre os organismos, é proporcionada pela degeneração do código genético, e está bem documentada dentre muitos organismos. O viés do códon frequentemente se correlaciona com a eficiência de tradução do RNA mensageiro (mRNA), que, por sua vez, acredita-se que seja dependente, inter alia, das propriedades dos códons que estão sendo traduzidos e a disponibilidade das moléculas de RNA de transferência particular (tRNA). A predominância dos tRNAs selecionados em uma célula é geralmente um reflexo dos códons usados mais frequentemente na síntese de peptídeo. Consequentemente, os genes podem ser adaptados para expressão de gene ideal em um dado organismo com base na otimização do códon.

[00076] Dado o grande número de sequências de gene disponíveis para uma ampla variedade de espécies animal, vegetal e microbiana, é possível calcular as frequências relativas de uso do códon. As tabelas de uso do códon estão prontamente disponíveis, por exemplo, na “Base de Dados de Uso do Códon” disponível em http://www.kazusa.or.jp/codon/ (visitado em 20 de março de 2008), e essas tabelas podem ser adaptadas de várias maneiras. Vide Nakamuraet al., Nucl. Acids Res. 28:292 (2000).

[00077] Usar as tabelas de uso do códon, um técnico no assunto pode aplicar as frequências para qualquer dada sequência de polipeptídeo, e produzir um fragmento de ácido nucleico de uma região de codificação de códon otimizado que codifica o polipeptídeo, mas que usa códons ideais para expressar uma sequência de interesse em um hospedeiro de interesse.

[00078] Os códons de atribuição aleatória em uma requência otimizada para codificar uma dada sequência de polipeptídeo podem ser feitos manualmente calculando as frequências do códon para cada aminoácido, e então atribuir os códons à sequência de polipeptídeo aleatoriamente. Adicionalmente, vários algoritmos e programas de computador estão prontamente disponíveis para os técnicos no assunto. Por exemplo, a função “EditSeq” no Pacote Lasergene, disponível de DNAstar, Inc., Madison, WI, a função tradução de volta no Conjunto VectorNTI, disponível de InforMax, Inc.,Bethesda, MD, e a função “traduzir de volta” no Pacote GCGWisconsin, disponível de Accelrys, Inc., San Diego, CA. Além disso, vários recursos estão disponíveis publicamente para otimizar por códon as sequências de região de codificação, por exemplo, a função “tradução de volta” em http: “entelechon.com/bioinformatics/ backtranslation.php?lang=eng e a função “backtranseq” disponível em http “bioinfo.pbi.nrc.ca:8090/EMBOSS/index.html.” Construir um algoritmo rudimentar para atribuir os códons com base em uma dada frequência também pode ser facilmente realizado com funções matemáticas básicas por um técnico no assunto. Além disso, as regiões de codificação de códon otimizado podem ser designadas por vários métodos conhecido do técnico no assunto incluindo pacotes de software tais como “designer de gene sintético” tendo um http: that of “phenotype.biosci.umbc. edu/codon/sgd/ index.php.”

[00079] Em algumas realizações, a invenção engloba polinucleotídeos que são códons otimizados para expressar os polipeptídeos de interesse em um hospedeiro de interesse. Assim, por exemplo, embora os polinucleotídeos da invenção possam ser expressos em ambas as espécies de planta monocotiledônea e dicotiledônea, as sequências de polinucleotídeo podem ser modificadas para explicar as preferências de códon específicas e preferências de teor de GC para uma planta monocotiledônea ou planta dicotiledônea de interesse. As tabelas de uso do códon e programas de software úteis para orientação no códon que otimizam qualquer dada sequência para expressão em uma célula hospedeira de interesse estão prontamente disponíveis e podem ser aplicadas rotineiramente usando as técnicas descritas aqui ou de outra forma conhecida na técnica. Para orientação de utilização do códon exemplar, vide, por exemplo, Murray et al., Nucleic Acids Res. 17:477-98 (1989), o qual e incorporado por referência em sua totalidade. Os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos da invenção podem igualmente ser recombinantemente designados para remover sequências de desestabilização potencial e estrutura secundária potencial que podem ser prontamente identificas e modificadas usando técnicas conhecidas na técnica.

[00080] Como usado aqui, uma “planta de controle” significa uma planta que não contém uma sequência de polinucleotídeo da invenção. As plantas de controle adequadas incluem a planta não transgênica da linhagem parental usada para gerar uma planta transgênica ou uma planta não transgênica que é a mesma variedade da planta transgênica, que pode geralmente ser aqui referida como uma planta “tipo selvagem”.

[00081] Como usado aqui, um “traço melhorado” significa uma característica de uma planta transgênica que inclui, entre outros, um traço agronômico melhorado caracterizado pela morfologia, fisiologia, crescimento e desenvolvimento de planta melhorada, produtividade, melhora nutricional, resistência à doença ou praga ou tolerância química e ambiental. Em aspectos mais específicos dessa invenção, o traço melhorado é selecionado do grupo de traços melhorados consistindo em eficácia melhorada no uso da água (por exemplo, “tolerância à estiagem”), tolerância melhorada à salinidade, tolerância melhorada ao frio, produtividade aumentada, e eficácia melhorada no uso de nitrogênio.

[00082] Como usado aqui, “condições reduzidas de água” ou condições de “não escassez de água” são usados alternadamente e se referem às condições nas quais as plantas ou células são cultivadas sem limitações de água e para as quais a célula, planta, ou a maioria das plantas não exibe sinais ou sintomas visíveis associados com condições de déficit de água. Em contrapartida, “condições restritas de água,” “condições de déficit de água” e “condições de escassez de água” são usados alternadamente para se referir às condições nas quais as plantas ou células são cultivadas em condições de limitação de água e para as quais a célula, planta, ou maioria das plantas exibe sinais e sintomas visíveis associados com a estiagem e a escassez de água.

[00083] Como usado aqui, “condições reduzidas de água” ou condições de “não escassez de água” são usados alternadamente e se referem às condições nas quais as plantas ou células são cultivadas em limitações de água e para as quais a célula, planta, ou a maioria das plantas não exibe sinais e sintomas visíveis associados com condições de déficit de água. Em contrapartida, “condições restritas de água,” “condições de déficit de água” e “condições de escassez de água” são usados alternadamente para se referir às condições nas quais as plantas ou células são cultivadas em condições de limitação de água e para as quais a célula, planta, ou maioria das plantas exibe sinais e sintomas visíveis associados com a estiagem e a escassez de água.

[00084] O termo “produtividade aumentada”, como usado aqui, pretende conformar com a maneira que esse termo seria tipicamente usado e entendido nos campos da agricultura e/ou pesquisa. A produtividade aumentada de uma planta transgênica da invenção pode ser medida em diversas maneiras, incluindo peso de teste, número de semente por planta, peso da semente, número de semente ou peso por unidade de área (por exemplo, sementes, ou peso das sementes, por acre). Em uma realização particular, a produtividade aumentada referese a um aumento estatisticamente significativo na produção de semente ou peso do grão por uma planta ou grupo de plantas (por unidade de área). De acordo com uma realização, a produtividade da semente ou peso do grão de um tamanho de amostra estatisticamente significativo das plantas transgênicas da invenção (por exemplo, n= 10 ou mais) é aumentada pelo menos 5% quando comparado à produtividade da semente ou peso do grão de um número comparável de plantas de controle.

[00085] O termo “taxa de fotossíntese aumentada”, como usado aqui, pretende se conformar com a maneira que esse termo seria tipicamente usado e entendido nos campos da agricultura e/ou pesquisa. A fotossíntese aumentada de uma planta transgênica da invenção pode ser medida em diversas maneiras, incluindo medição da troca de gás CO2 da folha. Em uma realização particular, a taxa de fotossíntese aumentada se refere a um aumento estatisticamente significativo na troca de gás CO2 da folha através de uma planta ou grupo de plantas (por unidade de área). De acordo com uma realização, a taxa de fotossíntese de um tamanho de amostra estatisticamente significativo das plantas transgênicas da invenção (por exemplo, n= 10 ou mais) é aumentada pelo menos 5% quando comparado à taxa de fotossíntese de um número comparável das plantas de controle.

POLINUCLEOTÍDEOS E POLIPEPTÍDEOS DE HAHB4 MODIFICADOS

[00086] A invenção se refere à constatação de que as modificações da sequência do fator de transcrição HaHB4 surpreendentemente resultam em traços melhorados em plantas transgênicas que foram transformadas com as sequências de polinucleotídeo que codificam a proteína HaHB4 modificada. O gene de HaHB4 (incluindo promotor e sequências regulatórias), proteína, e hospedeiros transgênicos de HaHB4 também são descritos e caracterizados no documento de Patente NorteAmericana n° 7.674.955, incorporado aqui por referência em sua totalidade.

[00087] Em algumas realizações, a invenção provê moléculas de ácido nucleico compreendendo sequências de polinucleotídeo que codificam uma proteína de HaHB4 modificado. Em realizações adicionais, a invenção provê moléculas de ácido nucleico compreendendo sequências de polinucleotídeo que codificam um fragmento ou variante funcionalmente ativo de HaHB4 modificado tendo uma sequência que é distinta de HaHB4 (SEQ ID No: 2). As proteínas codificadas por esses e outros polinucleotídeos da invenção também são englobadas pela invenção.

[00088] Conforme aqui revelado, as plantas transgênicas transformadas com proteína de HaHB4 modificado (modHaHB4) tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID No: 4 e SEQ ID No: 8 exibem inesperadamente traços melhorados incluindo produtividade aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado às plantas de controle. Similarmente, conforme aqui revelado, as plantas transgênicas transformadas com proteína de HaHB4 modificado (modHaHB4) tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID No: 4 e SEQ ID No: 8 exibem inesperadamente traços melhorados incluindo fotossíntese aumentada quando cultivada em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado às plantas de controle. Assim, em uma realização, a invenção é direcionada às moléculas de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica a proteína de Helianthus annuus HB-4 modificado (mod1HaHB4) tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID No: 4. Em uma realização particular, o ácido nucleico compreende a sequência de polinucleotídeo de SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 12, SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 15 ou SEQ ID No: 16. Em outra realização, a invenção é direcionada às moléculas de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica uma proteína de Helianthus annuus HB4 modificado (mod2HaHB4) tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID No: 8. Em realizações particulares, o ácido nucleico compreende a sequência de polinucleotídeo de SEQ ID No: 14 ou SEQ ID No: 17.

[00089] As plantas transgênicas transformadas com proteína de HaHB4 modificado (modHaHB4) tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID No: 38 e SEQ ID No: 39 também são englobadas pela invenção. Em realizações particulares, essas plantas exibem traços melhorados incluindo produtividade aumentada e/ou fotossíntese aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado às plantas de controle. Assim, em uma realização, a invenção é direcionada às moléculas de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica uma proteína de mod3HaHB4 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID No: 38. Em outra realização, a invenção é direcionada às moléculas de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica uma proteína de mod4HaHB4 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID No: 39.

[00090] A invenção ainda provê polinucleotídeos que codificam fragmentos funcionalmente ativo de mod1HaHB4(HaHB4.2 (SEQ ID No: 4)) compreendendo uma sequência de mod1HaHB4 que não está presente na sequência correspondente de HaHB4 (SEQ ID No: 2). Em algumas realizações, os fragmentos funcionalmente ativos compreendem pelo menos 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 125, 150, ou 175 resíduos de aminoácido consecutivos da sequência de aminoácido de mod1HaHB4 (SEQ ID No: 4). Em outras realizações, os fragmentos compreendem 10 a 50, 25 a 75, 50 a 100, 75 a 125, ou 100 a 175 resíduos de aminoácido consecutivos da sequência de aminoácido de mod1HaHB4 (SEQ ID No: 4). Em realizações adicionais, os fragmentos compreendem a sequência de 2 a 10 resíduos de aminoácido da SEQ ID No: 4, 13 a 25 resíduos de aminoácido da SEQ ID:4, ou 150 a 170 resíduos de aminoácido da SEQ ID:4.

[00091] A invenção ainda provê polinucleotídeos que codificam fragmentos funcionalmente ativos de mod2HaHB4 (HaHB4.3 (SEQ ID No: 8)) compreendendo uma sequência de mod2HaHB4 que não está presente em HaHB4 (SEQ ID No: 2). Em algumas realizações, os fragmentos funcionalmente ativos compreendem pelo menos 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 125, 150, ou 175 resíduos de aminoácidos consecutivos da sequência de aminoácido de mod2HaHB4 (SEQ ID No: 8). Em realizações adicionais, os fragmentos compreendem 10 a 50, 25 a 75, 50 a 100, 75 a 125, ou 100 a 175 resíduos de aminoácidos consecutivos da sequência de aminoácido de mod2HaHB4 (SEQ ID No: 8). Em realizações adicionais, os fragmentos compreendem a sequência de 2 a 10 resíduos de aminoácido da SEQ ID No: 8.

[00092] A invenção ainda provê polinucleotídeos que codificam fragmentos funcionalmente ativos de mod3HaHB4 (HaHB4.4 (SEQ ID No: 38)) compreendendo uma sequência de mod3HaHB4 que não está presente em HaHB4 (SEQ ID No: 2). Em algumas realizações, os fragmentos funcionalmente ativos compreendem a sequência de 2 a 15 ou 165 a 175 resíduos de aminoácido da SEQ ID No: 38 e compreendem pelo menos 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 125, 150, ou 175 resíduos de aminoácidos consecutivos da sequência de aminoácido de mod3HaHB4 (SEQ ID No: 38). Em realizações adicionais, os fragmentos funcionalmente ativos compreendem a sequência de 2 a 15 ou 165 a 175 resíduos de aminoácidos da SEQ ID No: 38 e compreendem 10 a 50, 25 a 75, 50 a 100, 75 a 125, ou 100 a 175 resíduos de aminoácidos consecutivos da sequência de aminoácido de mod3HaHB4 (SEQ ID No: 38).

[00093] A invenção ainda provê polinucleotídeos que codificam fragmentos funcionalmente ativos de mod4HaHB4 (SEQ ID No: 39)) compreendendo uma sequência de mod4HaHB4 que não está presente em HaHB4 (SEQ ID No: 2). Em algumas realizações, os fragmentos funcionalmente ativos compreendem a sequência de 2 a 10 resíduos de aminoácidos de SEQ ID No: 39 e compreendem pelo menos 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 125, 150, ou 175 resíduos de aminoácidos consecutivos da sequência de aminoácido de mod4HaHB4 (SEQ ID No: 39). Em realizações adicionais, os fragmentos compreendem a sequência de 2 a 10 resíduos de aminoácidos da SEQ ID No: 39 e compreendem 10 a 50, 25 a 75, 50 a 100, 75 a 125, ou 100 a 175 resíduos de aminoácidos consecutivos da sequência de aminoácido de mod4HaHB4 (SEQ ID No: 39).

[00094] Em outra realização, os polinucleotídeos da invenção codificam os fragmentos funcionalmente ativos correspondentes às exclusões do terminal N e/ou terminal C de mod1HaHB4 (SEQ ID No: 4). Assim, de acordo com algumas realizações, os polinucleotídeos da invenção codificam os fragmentos funcionalmente ativos de mod1HaHB4 tendo pelo menos 1, mas menos que 5, 10, 15, ou 20 aminoácidos excluídos do terminal N de mod1HaHB4 (SEQ ID No: 4). Em realizações adicionais, os polinucleotídeos da invenção codificam os fragmentos funcionalmente ativos de mod1HaHB4 (SEQ ID No: 4) tendo pelo menos 1, mas menos que 10, 25, 50, 75, ou 100 aminoácidos excluídos do terminal C de mod1HaHB4 (SEQ ID No: 4). Em outras realizações, os polinucleotídeos da invenção codificam os fragmentos funcionalmente ativos de mod1HaHB4 tendo pelo menos 1, mas menos que 5, 10, 15, ou 20 aminoácidos excluídos do terminal N e pelo menos 1, mas menos que 10, 25, 50, 75, ou 100 aminoácidos excluídos do terminal C de mod1HaHB4 (SEQ ID No: 4).

[00095] Em outra realização, os polinucleotídeos da invenção codificam os fragmentos funcionalmente ativos correspondentes às exclusões do terminal N e/ou terminal C de mod2HaHB4 (SEQ ID No: 8). Assim, de acordo com algumas realizações, os polinucleotídeos da invenção codificam os fragmentos funcionalmente ativos de mod2HaHB4 tendo pelo menos 1, mas menos que 5, 10, 15, ou 20 aminoácidos excluídos do terminal N de mod2HaHB4 (SEQ ID No: 8). Em realizações adicionais, os polinucleotídeos da invenção codificam os fragmentos funcionalmente ativos de mod2HaHB4 (SEQ ID No: 8) tendo pelo menos 1, mas menos que 10, 25, 50, 75, ou 100 aminoácidos excluídos do terminal C de mod2HaHB4 (SEQ ID No: 8). Em outras realizações, os polinucleotídeos da invenção codificam os fragmentos funcionalmente ativos de mod2HaHB4 tendo pelo menos 1, mas menos que 5, 10, 15, ou 20 aminoácidos excluídos do terminal N e pelo menos 1, mas menos que 10, 25, 50, 75, ou 100 aminoácidos excluídos do terminal C de mod2HaHB4 (SEQ ID No: 8).

[00096] Em outra realização, os polinucleotídeos da invenção codificam os fragmentos funcionalmente ativos correspondentes às exclusões do terminal N e/ou terminal C de mod4HaHB4 (HaHB4.3 (SEQ ID No: 38)). Assim, de acordo com algumas realizações, os polinucleotídeos da invenção codificam os fragmentos funcionalmente ativos de mod3HaHB4 tendo pelo menos 1, mas menos que 9, 10, 15, ou 20 aminoácidos excluídos do terminal N de mod4HaHB4 (SEQ ID No: 38). Em realizações adicionais, os polinucleotídeos da invenção codificam os fragmentos funcionalmente ativos de mod3HaHB4 (SEQ ID No: 38) tendo pelo menos 1, mas menos que 9 aminoácidos excluídos do terminal C de mod3HaHB4 (SEQ ID No: 38). Em outras realizações, os polinucleotídeos da invenção codificam os fragmentos funcionalmente ativos de mod3HaHB4 tendo pelo menos 1, mas menos que 5, 10, 15, ou 20 aminoácidos excluídos do terminal N e pelo menos 1, mas menos que 10, 25, 50, 75, ou 100 aminoácidos excluídos do terminal C de mod3HaHB4 (SEQ ID No: 38).

[00097] Em outra realização, os polinucleotídeos da invenção codificam os fragmentos funcionalmente ativos correspondentes às exclusões do terminal N e/ou terminal C de mod4HaHB4 (SEQ ID No: 39). Assim, de acordo com algumas realizações, os polinucleotídeos da invenção codificam os fragmentos funcionalmente ativos de mod4HaHB4 tendo pelo menos 1, mas menos que 5, 10, 15, ou 20 aminoácidos excluídos do terminal N de mod4HaHB4 (SEQ ID No: 39). Em realizações adicionais, os polinucleotídeos da invenção codificam os fragmentos funcionalmente ativos de mod4HaHB4 (SEQ ID No: 39) tendo pelo menos 1, mas menos que 10, 25, 50, 75, ou 100 aminoácidos excluídos do terminal C de mod4HaHB4 (SEQ ID No: 39). Em outras realizações, os polinucleotídeos da invenção codificam os fragmentos funcionalmente ativos de mod4HaHB4 tendo pelo menos 1, mas menos que 5, 10, 15, ou 20 aminoácidos excluídos do terminal N e pelo menos 1, mas menos que 7 aminoácidos excluídos do terminal C de mod4HaHB4 (SEQ ID N-: 39).

[00098] As regiões de proteínas de modHaHB4 (por exemplo, mod1HaHB11 (SEQ ID Noo: 4)) e mod2HaHB11 (SEQ ID No: 8)) incluem a região amino terminal (“NTR”: SEQ ID No: 6 ou SEQ ID No: 9); homeodomínio (“HD”: 13 a 78 resíduos de aminoácidos da SEQ ID N o: 4; 12 a 77 resíduos de aminoácidos da SEQ ID No: 8); fecho de leucina (“LZ”: 79 a 108 resíduos de aminoácidos da SEQ ID No: 4 ou 78 a 107 resíduos de aminoácidos da SEQ ID No: 8); e a região carbóxi terminal (“CTR”: 109 a 177 resíduos de aminoácidos da SEQ ID No: 4 ou 108 a 176 resíduos de aminoácidos da SEQ ID No: 8). De acordo com algumas realizações, os polinucleotídeos incluem proteínas compreendendo uma ou mais regiões da proteína de mod1HaHB4 selecionada do grupo consistindo em: a NTR (SEQ ID No: 6 ou SEQ ID No: 9), homeodomínio (13 a 78 resíduos de aminoácidos da SEQ ID No: 4 ou 12 a 77 resíduos de aminoácidos da SEQ ID No: 8); fecho de leucina (79 a 108 resíduos de aminoácidos da SEQ ID No: 4; ou 78 a 107 resíduos de aminoácidos da SEQ ID No: 8); e CTR (109 a 177 resíduos de aminoácidos da SEQ ID No: 4 ou 108 a 176 resíduos de aminoácidos da SEQ ID No: 8). Também são providos polinucleotídeos que codificam qualquer combinação de duas ou mais regiões de modHaHB4 selecionadas do grupo consistindo em: a NTR (SEQ ID No: 6 ou SEQ ID No: 9), homeodomínio (13 a 78 resíduos de aminoácidos da SEQ ID No: 4); fecho de leucina (79 a 108 resíduos de aminoácidos da SEQ ID No: 4); e CTR (109 a 177 resíduos de aminoácidos da SEQ ID No: 4).

[00099] As regiões da proteína de mod3HaHB4 (SEQ ID No: 38) incluem o homeodomínio (“HD”: 13 a 78 resíduos de aminoácidos da SEQ ID No: 38); a região carbóxi terminal (“CTR”: 109 a 177 resíduos de aminoácidos da SEQ ID No: 38). De acordo com algumas realizações, os polinucleotídeos incluem proteínas compreendendo uma ou mais regiões da proteína de mod3HaHB4 selecionada do grupo consistindo em: o homeodomínio (13 a 78 resíduos de aminoácidos da SEQ ID No: 38; e CTR (109 a 177 resíduos de aminoácidos da SEQ ID No: 38).

[000100] Em realizações adicionais, a invenção engloba polinucleotídeos que codificam as variantes funcionalmente ativas de mod1HaHB4 (SEQ ID No: 4) ou mod2HaHB4 (SEQ ID No: 8), em que a sequência da variante não é aquela de HaHB4 (SEQ ID No: 2). Em realizações adicionais, a invenção engloba polinucleotídeos que codificam as variantes funcionalmente ativas de mod3HaHB4 (SEQ ID No: 38) ou mod4HaHB4 (SEQ ID No: 39), em que a sequência da variante não é aquela de HaHB4 (SEQ ID No: 2). As variantes da invenção incluem adições, substituições nas sequências de mod1HaHB4 ou mod2HaHB4. As variantes da invenção incluem adições, substituições nas sequências de mod3HaHB4 ou mod4HaHB4. As “substituições” de aminoácido podem resultar na substituição de um aminoácido com outro aminoácido que tenha propriedades estruturais e/ou químicas similares, por exemplo, substituição de aminoácido conservador. As substituições de aminoácido “conservador” podem ser feitas com base na similaridade na polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou na natureza anfipática dos resíduos envolvidos. Por exemplo, aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano, e metionina; aminoácidos neutros polares incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, e glutamina; aminoácidos carregados positivamente (básicos) incluem arginina, lisina, e histidina; e aminoácidos carregados negativamente (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico. “Inserções” ou “exclusões” estão geralmente na faixa de cerca de 1 a cerca de 20 aminoácidos, mais especificamente cerca de 1 a cerca de 10 aminoácidos, e ainda mais especificamente, cerca de 2 a cerca de 5 aminoácidos. As substituições não conservadoras implicam na troca de um membro de uma dessas classes por outra classe. Por exemplo, as substituições de aminoácido também podem resultar na substituição de um aminoácido com outro aminoácido tendo diferentes propriedades estruturais e/ou químicas, por exemplo, substituindo um aminoácido de um grupo (por exemplo, polar) com outro aminoácido de um grupo diferente (por exemplo, básico). A variação permitida pode ser determinada experimentalmente ao fazer sistematicamente inserções, exclusões ou substituições de aminoácidos em uma molécula de polipeptídeo usando técnicas de DNA recombinante e ensaiando as variantes recombinantes resultantes para atividade.

[000101] Em realizações particulares, os polinucleotídeos da invenção codificam as variantes funcionalmente ativas de mod1HaHB4 ou mod2HaHB4 que contêm 1, 2, 3, 4, 5, 10, ou mais substituições, inserções, ou exclusões quando comparado à sequência correspondente da proteína de mod1HaHB4 (SEQ ID No: 4) ou proteína de mod2HaHB4 (SEQ ID No: 8), em que as variantes não contém a sequência de aminoácido correspondente de HaHB4 (SEQ ID No: 2). Em algumas realizações, os polinucleotídeos codificam as variantes funcionalmente ativas de mod1HaHB4 ou mod2HaHB4 que contêm 1, 2, 3, 4, 5, 10, ou mais substituições conservadoras quando comparado à sequência correspondente de proteína de mod1HaHB4 (SEQ ID No: 4) ou proteína de mod2HaHB4 (SEQ ID No: 8). Em outras realizações, os polinucleotídeos codificam as variantes funcionalmente ativas de mod1HaHB4 ou mod2HaHB4 que contêm 1, 2, 3, 4, 5, 10, ou mais substituições não conservadoras quando comparado à sequência correspondente da proteína de mod1HaHB4 (SEQ ID No: 4) ou proteína de mod2HaHB4 (SEQ ID No: 8).

[000102] Em realizações adicionais, os polinucleotídeos codificam as variantes funcionalmente ativas da proteína de mod1HaHB4 ou mod2HaHB4 que contêm 1 a 10, 1 a 20 ou 1 a 25 substituições, inserções, ou exclusões quando comparado à sequência correspondente da proteína de mod1HaHB4 (SEQ ID No: 4) ou proteína de mod2HaHB4 (SEQ ID No: 8), em que as variantes não contém a sequência correspondente de aminoácido de HaHB4 (SEQ ID No: 2). Em algumas realizações, os polinucleotídeos codificam as variantes funcionalmente ativas da proteína de mod1HaHB4 ou mod2HaHB4 que contêm 1 a 10, 1 a 20 ou 1 a 25 substituições conservadoras quando comparado à sequência correspondente da proteína de mod1HaHB4 (SEQ ID No: 4) ou proteína de mod2HaHB4 (SEQ ID No: 8). Em realizações adicionais, os polinucleotídeos codificam as variantes funcionalmente ativas da proteína de mod1HaHB4 ou mod2HaHB4 que contêm 1 a 10, 1 a 20 ou 1 a 25 substituições não conservadoras quando comparado à sequência correspondente da proteína de mod1HaHB4 (SEQ ID No: 4) ou proteína de mod2HaHB4 (SEQ ID No: 8).

[000103] Em realizações particulares, os polinucleotídeos codificam as variantes funcionalmente ativas da proteína de mod1HaHB4 que contêm uma inserção de uma serina na posição 7, uma substituição de treonina com serina na posição 9, substituição de arginina com lisina na posição 18, ou substituição de lisina com fenilalanina na posição 155.

[000104] Em realizações particulares, a proteína de HaHB4 modificado funcionalmente ativo que contém substituição de treonina com serina na posição 9 da proteína de HaHB4 nativo (SEQ ID No: 2), substituição de treonina com serina na posição 13 de proteína de HaHB4 nativo (SEQ ID No: 2), substituição de lisina com arginina na posição 22 da proteína de HaHB4 nativo (SEQ ID No: 2), substituição de fenilalanina com lisina na posição 159 da proteína de HaHB4 nativo (SEQ ID No: 2), ou substituição de leucina na posição 175 da proteína de HaHB4 nativo (SEQ ID No: 2).

[000105] Em realizações adicionais, a invenção engloba polinucleotídeos que codificam as variantes funcionalmente ativas da proteína de mod1HaHB4 em que a dita variante compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de aminoácido da proteína de mod1HaHB4 (SEQ ID No: 4), e em que as variantes não contêm a sequência de aminoácido correspondente de HaHB4 (SEQ ID No: 2). Além disso, os fragmentos de polinucleotídeo adequados tendo as homologias acima codificam um polipeptídeo que tem pelo menos 50 aminoácidos, pelo menos 100 aminoácidos, pelo menos 150 aminoácidos, em que a sequência correspondente não está presente em HaHB4 (SEQ ID No: 2). Os fragmentos de polinucleotídeo adequados tendo as homologias acima codificam um polipeptídeo que tem pelo menos 50 aminoácidos, pelo menos 100 aminoácidos, pelo menos 150 aminoácidos e não contêm a sequência de aminoácido correspondente de HaHB4 (SEQ ID No: 2).

[000106] Em realizações adicionais, a invenção engloba polinucleotídeos que codificam as variantes funcionalmente ativas da proteína de mod2HaHB4, em que a dita variante compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de aminoácido da proteína de mod2HaHB4 (SEQ ID No: 8), e em que as variantes não contêm a sequência de aminoácido correspondente de HaHB4 (SEQ ID No: 2). Os fragmentos de polinucleotídeo adequados tendo as homologias acima codificam um polipeptídeo que tem pelo menos 50 aminoácidos, pelo menos 100 aminoácidos, ou pelo menos 150 aminoácidos e não contêm a sequência de aminoácido correspondente de HaHB4 (SEQ ID No: 2).

[000107] Em outras realizações, a invenção engloba uma variante de polinucleotídeo que é pelo menos 80%,85%, 90%, 92%, 95%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de polinucleotídeo da SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 12, SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 15 ou SEQ ID No: 16 SEQ ID No: 14, ou SEQ ID No: 17, ou a cadeia complementar de qualquer uma sequências, ou fragmentos da mesma, em que a sequência de polinucleotídeo não está presente na sequência de polinucleotídeo correspondente de HaHB4 (SEQ ID No: 1) e não codifica HaHB4 (SEQ ID No: 2). Os fragmentos de polinucleotídeo adequados tendo as homologias acima incluem fragmentos que são pelo menos 20 nucleotídeos, pelo menos 30 nucleotídeos, pelo menos 40 nucleotídeos, pelo menos 50 nucleotídeos, pelo menos 75 nucleotídeos, ou pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento.

[000108] Em uma realização adicional, a invenção engloba uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica (a) mod1HaHB4 (SEQ ID No: 4); (b) um fragmento funcionalmente ativo da dita proteína modificada em que a sequência de aminoácido do dito fragmento está ausente em HaHB4 (SEQ ID No: 2); ou (c) uma variante funcionalmente ativa da proteína de HaHB4 modificado em que a dita variante compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID No: 4; em que a sequência de aminoácido do dito fragmento ou variante não está presente na sequência de aminoácido de HaHB4 da SEQ ID No: 2.

[000109] Em outra realização, a invenção engloba uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica (a) mod1HaHB4 (SEQ ID No: 4); (b) um fragmento funcionalmente ativo de mod1HaHB4 em que a sequência de aminoácido do dito fragmento está ausente em HaHB4 (SEQ ID No: 2); ou (c) uma variante funcionalmente ativa de mod1HaHB4 em que a dita variante compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID No: 4 e em que a sequência de aminoácido do dito fragmento ou variante não está presente no HaHB4 (SEQ ID No: 2).

[000110] A invenção ainda provê ácidos nucleicos compreendendo uma sequência de polinucleotídeo (incluindo fragmentos de modHaHB4 que codificam os polinucleotídeos descritos aqui) que hibridiza em condições de hibridização rigorosas, para um ácido nucleico contendo uma cadeia complementar de um polinucleotídeo que codifica mod1HaHB4 (SEQ ID No: 4) ou mod2HaHB4 (SEQ ID No: 8), em que os polinucleotídeos de hibridização codificam um polipeptídeo funcionalmente ativo que não é HaHB4 (SEQ ID No: 2). Em realizações adicionais, os polinucleotídeos hibridizam em condições de hibridização rigorosas, para um ácido nucleico contendo uma cadeia complementar da sequência de polinucleotídeo da SEQ ID No: 3 ou SEQ ID No: 14, em que o polinucleotídeo de hibridização codifica um polipeptídeo funcionalmente ativo que não é HaHB4 (SEQ ID No: 2).

[000111] Como usado aqui, um polinucleotídeo que é “hibridizável” para outro polinucleotídeo ou fragmento de ácido nucleico, tal como uma molécula de cDNA, DNA genômico, ou RNA, quando uma forma de cadeia única do polinucleotídeo ou fragmento de ácido nucleico pode fundir em outro fragmento de ácido nucleico em condições apropriadas de temperatura e força iônica da solução. Hibridização e condições de lavagem são bem conhecidas e exemplificadas em Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989), particularmente Capítulo 11 e Tabela 11.1 ali (que é incorporado por referência em sua totalidade). As condições de temperatura e força iônica determinam a “rigidez” da hibridização. As condições de rigidez podem ser ajustadas para triagem de fragmentos moderadamente similares (tais como sequências homólogas de organismos distantemente relacionados), para fragmentos altamente similares (tais como genes que duplicam as enzimas funcionais de organismos intimamente relacionados). As lavagens pós-hibridização determinam as condições de rigidez. Um conjunto de condições usa uma série de lavagens começando com 6X SSC, 0,5% de SDS à temperatura ambiente por 15 min, então repetida com 2X SSC, 0,5% de SDS a 45 °C por 30 min, e então repetido duas vezes com 0,2X SSC, 0,5% de SDS a 50 °C por 30 min. Outro conjunto de condições rigorosas usa temperaturas mais altas nas quais as lavagens são idêntica àquelas acima, exceto a temperatura das duas lavagens finais de 30 min em 0.2X SSC, 0,5% de SDS que foi elevada para 60 °C. Ainda, outro conjunto de condições altamente rigorosas usa duas lavagens finais em 0,1X SSC, 0,1% de SDS a 65 °C. Um conjunto adicional de condições rigorosas inclui hibridização a 0,1X SSC, 0,1% de SDS, 65 °C e lavages com 2X SSC, 0,1% de SDS seguidas por 0,1X SSC, 0,1% de SDS, por exemplo.

[000112] A hibridização requer que dois ácidos nucleicos contenham sequências complementares, embora dependendo da rigidez da hibridização, desajustes entre as bases são possíveis. A rigidez apropriada para hibridização dos ácidos nucleicos depende do comprimento dos ácidos nucleicos e o grau de complementação, variáveis bem conhecidas na técnica. Quanto maior o grau de similaridade ou homologia entre duas sequências de nucleotídeo, maior o valor de Tm para híbridos de ácidos nucleicos que têm aquelas sequências. A estabilidade relativa (correspondente a Tm maior) de hibridizações de ácido nucleico diminui na seguinte ordem: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Para híbridos de mais de 100 nucleotídeos de comprimento, equações para calcular Tm foram derivadas (vide, Sambrook et al., supra, 9.50-9.51). Para hibridizações com ácidos nucleicos mais curtos, isto é, oligonucleotídeos, a posição de desajustes se torna mais importante, e o comprimento do oligonucleotídeo determina sua especificidade (vide Sambrook et al., supra, 11.7-11.8). Em uma realização, o comprimento para um ácido nucleico hibridizável é pelo menos cerca de 10 nucleotídeos. Em outra realização, um comprimento mínimo para um ácido nucleico hibridizável é pelo menos cerca de 15 nucleotídeos. Ainda em outra realização, um comprimento mínimo para um ácido nucleico hibridizável é pelo menos cerca de 20 nucleotídeos ou pelo menos cerca de 30 nucleotídeos. Além disso, o técnico no assunto reconhecerá que a temperatura e a concentração de sal na solução de lavagem podem ser ajustadas conforme necessário de acordo com os fatores tais como comprimento da sonda.

[000113] O DNA recombinante padrão e as técnicas de clonagem molecular usados aqui são bem conhecidos na técnica e são descritos por Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) (doravante “Maniatis”); e por Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1984); e por Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, publicado por Greene Publishing Assoc. e Wiley-Interscience (1987); Frohman (Frohman Cloning PCR products. In The Polymerase Chain Reaction, eds. K. B. Mullis, F. Fre, & R. A. Gibas, pages 1437; cada qual é incorporado por referência em sua totalidade), para gerar proteínas que tenham uma sequência de aminoácido diferente, por exemplo, para criar substituições, exclusões e/ou inserções de aminoácido.

VETORES E CÉLULAS HOSPEDEIRAS

[000114] Vetores (incluindo cassetes de expressão) contendo os polinucleotídeos de modHaHB4 também são englobados pela invenção.

[000115] Os vetores da invenção podem ser compostos de DNA ou RNA, e podem ser lineares ou um plasmídeo circular fechado. Os vetores podem ser vetores de clonagem, amplificação, transporte ou expressão. O sistema vetor pode ser um vetor simples ou plasmídeo ou dois ou mais vetores que juntos contêm ou controlam a replicação, integração e/ou expressão dos polinucleotídeos da invenção na célula hospedeira. Os polinucleotídeos da invenção podem ser inseridos no vetor em uma orientação para frente ou reversa com respeito a qualquer sequência particular do promotor contida no vetor.

[000116] Os componentes do vetor para transformação da célula hospedeira (por exemplo, bacteriana ou vegetal) geralmente incluem, entre outros, um ou mais dos seguintes: uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores selecionáveis e opcionalmente um promotor, tal como um promotor induzível, permitindo a expressão de DNA exógeno. Geralmente, os genes marcadores selecionáveis codificam uma proteína necessária para a sobrevivência ou crescimento de células hospedeiras transformadas cultivadas em um meio de cultura seletivo. Os genes de seleção típicos codificam as proteínas que conferem resistência aos antibióticos ou outras toxinas (por exemplo, ampicilina, canamicina, tetraciclina, neomicina, trimetoprim, estreptomicina, sulfonamidas ou metotrexato), (b) complementam as deficiências auxotróficas, ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis dos meios complexos. Aquelas células que são transformadas com sucesso com uma proteína heteróloga ou fragmento da mesma produzem uma proteína conferindo resistência à droga e assim sobrevivem ao regime de seleção.

[000117] A construção de vetores adequados contendo um ou mais dos componentes listados acima e os polinucleotídeos da invenção emprega técnicas padrão de DNA recombinante e pode ser prontamente preparada usando os métodos e reagentes disponíveis na técnica. Vide, por exemplo, Sambrook et al., supra, e Ausubel et al., supra. Geralmente, os plasmídeos de ácido nucleico isolado ou fragmentos de DNA são rotineiramente clivados, adaptados e religados para formar um contruto vetor contendo os componentes associados necessários de modo a prover o construto com a função e propriedades desejadas. Numerosos vetores e promotores adequados estão comercialmente disponíveis e/ou são conhecidos na técnica e podem ser rotineiramente usados ou modificados para uso de acordo com a invenção. Os exemplos representativos de vetores bacterianos incluem: pQE70, pQE80L, pQE81L, pQE82L, pQE60, e pQE-9 (Qiagen); pBS, pD10, phagescript, psiX174, pBS.RTM. SK, pBS.RTM. KS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A; pGEX-3X, pGEX-4T1 a pGEX-4T-3, pGEX-5X-1 a pGEX-5X-3, e pGEX-6P-1 a pGEX-6P3; pBluescript SK e pBluescript KS, e pBluescript II (Stratagene, La Jolla, California), vetores pIN (Van Heeke and Schuster, 1989), pTRC99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, e pRIT5 (Pharmacia Uppsala, Sweden). Os exemplos representativos de vetores eucarióticos incluem: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene), pSG5, pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL, GEM1 (Promega Biotec, Madison, Wis.) e pSVLSV40.

[000118] Em algumas realizações, os polinucleotídeos da invenção são inseridos em um vetor em ligação operável com um promotor adequado que funciona em uma planta hospedeira para acionar a expressão da sequência de polinucleotídeo. Muitos vetores são conhecidos na técnica para essa finalidade e podem ser rotineiramente selecionados para construção e usados de acordo com a invenção com base nos fatores que incluem, por exemplo, o tamanho da sequência de polinucleotídeo a ser inserida no vetor e a célula hospedeira particular a ser transformada com o vetor. Os vetores de transformação da planta da invenção também podem conter um HaHB4 funcional ou sequência heteróloga de íntron posicionada a montante da sequência de codificação ou mesmo dentro da sequência de codificação dos polinucleotídeos da invenção, e também podem conter uma sequência líder não traduzida de cinco iniciadores (5’) (isto é, um UTR ou 5’-UTR) posicionada entre o promotor e o ponto de início da tradução.

[000119] Os vetores da invenção preferencialmente contêm um marcador selecionável que confere um fenótipo selecionável que permite a identificação de células transformadas que expressam e/ou contêm os polinucleotídeos da invenção. Por exemplo, em várias realizações, o gene do marcador selecionável codifica uma proteína que confere resistência a biocida, resistência a antibiótico (por exemplo, canamicina, bleomicina G418, higromicina etc.), ou resistência a herbicida (por exemplo, glifosato etc.). Exemplos de marcadores selecionáveis que podem ser usados de acordo com as composições e métodos da invenção incluem, entre outros, um gene neo que codifica resistência à canamicina e pode ser selecionado para usar a canamicina, o gene nptII, que confere resistência à canamicina e antibióticos relacionados (Messing et al., Gene 19:259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304:184-187 (1983)), o gene bar, que confere resistência ao herbicida fosfinotricina (White et al., Nucl. Acids Res. 18:1062 (1990), Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79:625-631 (1990)), o gene hph, que confere resistência ao antibiótico higromicina (Blochinger et al., Mol. Célula. Biol. 4:2929-2931 (1984); G418, um gene sintase EPSP mutante que codifica resistência ao glifosato (Patentes Norte-Americana n°s 4.940.835 e 5.188.642); um gene sintase acetolactato mutante (ALS) que confere resistência à imidazolinona ou sulfonilureia; um gene nitrilase que confere resistência à bromoxinila; e um gene DHFR resistente a metotrexato. Adicionalmente, múltiplos marcadores selecionáveis estão disponíveis para conferir resistência à ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, canamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina, espectinomicina, rifampicina, e tetraciclina. Exemplos de tais marcadores selecionáveis estão ilustrados nos documentos de Patente Norte-Americana nos 5.550.318; 5.633.435; 5.780.708 e 6.118.047, os conteúdos completos dos quais estão incorporados por referência em sua totalidade.

[000120] De acordo com algumas realizações, a invenção é direcionada aos ácidos nucleicos, incluindo vetores e cassetes de expressão, compreendendo os polinucleotídeos da invenção operacionalmente associados com um promotor. Em algumas realizações, os polinucleotídeos da invenção estão operacionalmente associados com um promotor constitutivo. Em realizações particulares, o promotor constitutivo é o promotor 35S CaMV ou o promotor Ubi. De acordo com outras realizações, os polinucleotídeos da invenção estão operacionalmente associados com um promotor induzível. Em realizações particulares, o promotor induzível é um promotor induzível por estresse. Em outras realizações, o promotor induzível é a versão modificada do promotor HaHB4 fundido com o primeiro íntron de Arabidopsis Cox2-c.

[000121] Em realizações adicionais, os vetores da invenção contêm a sequência do promotor de alelo pequeno HaHB4 (SEQ ID No: 20), a sequência do promotor de alelo maior HaHB4 (SEQ ID No: 21), ou um fragmento funcionalmente ativo ou derivado da sequência do promotor de alelo grande ou pequeno do promotor HaHB4. De acordo com uma realização, o promotor compreende as sequências de nucleotídeo 805 a 1221, 904 a 1221, 1011 a 1221, ou 15 a 622 da sequência do promotor de alelo pequeno HaHB4 (SEQ ID No: 20). De acordo com outra realização, o promotor compreende a sequência dos polinucleotídeos 15 a 409 ou 805 a 1221 da sequência do promotor de alelo grande HaHB4 (SEQ ID No: 21). De acordo com outra realização, o promotor compreende a sequência dos polinucleotídeos 15 a 409 ou 805 a 1221 da sequência do promotor de alelo grande HaHB4 (SEQ ID No: 21). Em outra realização, o promotor compreende a sequência de um fragmento de pelo menos 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, ou 800 nucleotídeos da sequência do promotor de alelo pequeno HaHB4 (SEQ ID No: 20). Em uma realização adicional, o promotor compreende a sequência de um fragmento de pelo menos 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, ou 800 nucleotídeos da sequência do promotor de alelo grande HaHB4 (SEQ ID No: 21).

[000122] Os numerosos promotores adicionais que estão ativos nas células de planta são conhecidos na técnica e são providos nos vetores de expressão de planta de acordo com várias realizações da invenção. Esses promotores incluem promotores presentes nos genomas da planta bem como promotores de vírus, bactérias e outras fontes, incluindo promotor de nopalina sintase (NOS) e promotores de octopina sintase (OCS) realizados em plasmídeos de indução de tumor de A. tumefaciens e promotores caulimovírus tais como promotores do vírus do mosaico da couve-flor ou vírus do mosaico da escrofulária. Vide, por exemplo, os documentos de Patente Norte-Americana nos 5.858.742 e 5.322.938 que divulgam versões do promotor constitutivo derivado do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV35S), documento de Patente Norte-Americana n° 5.378.619 que divulga um promotor 35S do Vírus do Mosaico da Escrofulária (FMV), documento de Patente Norte- Americana n° 6.437.217 que divulga um promotor RS81 do milho), documento de Patente Norte-Americana n° 5.641.876 que divulga um promotor actina do arroz, documento de Patente NorteAmericana n° 6.426.446 que divulga um promotor RS324 do milho, documento de Patente Norte-Americana n° 6.429.362 que divulga um promotor PR-1 do milho, documento de Patente Norte-Americana n° 6.232.526 que divulga um milho A3 promotor, U.S. Pat. No. 6,177,611 que divulga constitutive milho promotores, documento de Patente Norte-Americana n° 6.433.252 que divulga um promotor oleosina L3 do milho, documento de Patente Norte-Americana n° 6.429.357 que divulga um promotor actina 2 do arroz e íntron, documento de Patente Norte-Americana n° 5.837.848 que divulga um promotor específico da raiz, documento de Patente Norte-Americana n° 6.084.089 que divulga promotores induzíveis ao frio, documento de Patente Norte-Americana n° 6.294.714 que divulga promotores induzíveis à luz, documento de Patente NorteAmericana n° 6.140.078 que divulga promotores induzíveis ao sal, documento de Patente Norte-Americana n° 6.252.138 que divulga promotores induzíveis por patógeno, documento de Patente Norte- Americana n° 6.175.060 que divulga promotores induzíveis por deficiência de fósforo, Publicação do Pedido de Patente Norte- Americana n° 2002/0192813A1 que divulga 5’, 3’ e elementos de íntron úteis no projeto de vetores de expressão de planta eficazes, Pedido de Patente NorteAmericana n° 09/078,972 que divulga um promotor coixina, Pedido de Patente Norte-Americana n° 09/757,089 que divulga um promotor cloroplasto aldolase de milho, e Pedido de Patente Norte- Americana n° 10/739,565 que divulga promotores induzíveis por déficit de água, cada qual é incorporado aqui por referência. Esse e outros numerosos promotores que funcionam nas células de planta são conhecidos na técnica e podem ser operacionalmente ligados aos polinucleotídeos da invenção e/ou usados nos vetores da invenção para acionar e controlar a expressão das sequências de polinucleotídeo em células de planta transgênica.

[000123] Em realizações adicionais, os polinucleotídeos da invenção (sozinhos ou em associação com sequência do vetor) estão operacionalmente ligados a um promotor derivado da região regulatória de um gene de planta que é superexpresso em condições de déficit de água. Em realizações particulares, os polinucleotídeos da invenção estão operacionalmente ligados a um promotor derivado da região regulatória 5’ correspondente a um gene selecionado de: proteína de choque térmico 17.5 (HSP17.5), HVA22 (HVA22), Rab17, ou 4- hidroxilase de ácido cinâmico (CA4H). Os promotores exemplares induzíveis ao déficit de água são revelados no documento do Pedido de Patente n° 10/739,565, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

[000124] Em outras realizações, os polinucleotídeos da invenção estão operacionalmente ligados a um promotor que é, por sua vez, ligado operacionalmente a uma ou mais “sequências potenciadoras” que elevam a expressão de gene acionada pelo promotor. Tais potenciadores podem normalmente ser inseridos na orientação para frente ou reversa 5’ ou 3’ para a sequência de codificação e podem estar presentes no íntron. Numerosos potenciadores são conhecidos e/ou podem prontamente ser identificados usando reagentes e técnicas conhecidas na técnica. Os potenciadores exemplares que podem estar operacionalmente associados com os polinucleotídeos da invenção incluem os íntrons 5’ dos genes actina 1 do arroz e actins 2 do arroz, e elementos do promotor CaMV 35S (Odell et al., Nature 6:810-812 (1985), genes octopina sintasse, o gene de alcohol desidrogenase de milho, o gene shrunken 1 de milho, o íntron Adh 1 (Callis et al., Genes and Develop., 1:1183 (1987)), íntron sacarose sintase (Vasil et al., Plant Physiol. 91:1575 (1989)) e elemento ômega TMV (Gallie et al., Célula de planta 1:301 (1989)).

[000125] Em realizações adicionais, os polinucleotídeos da invenção (sozinhos ou em associação com sequência do vetor) estão operacionalmente ligados a um terminador de transcrição que é responsável por encerrar a transcrição além dos polinucleotídeos da invenção e corrigir a poliadenilação do mRNA. Os terminadores de transcrição adequados exemplares conhecidos por funcionar em plantas incluem, entre outros, o terminador CaMV 35S, o terminador tml, o terminador nopalina sintase derivado de A. tumefaciens (Bevan et al., Nucl. Acids Res., 11:369 (1983), Depicker et al., J. Mol. Appl. Genet. 1:561-573 (1982)), o terminador para rbcS E9, o terminador para a transcrição T7 do gene octopina sintase de A. tumefaciens, e a extremidade 3’ dos genes do inibidor protease I ou II da batata ou tomate.

[000126] Os vetores de transformação de planta preferidos incluem aqueles derivados de um plasmídeo Ti de A. tumefaciens (por exemplo, conforme descrito nos documentos de Patente Norte-Americana n°s 5.981.840, 5.501.967, 4.536.475,4.658.082, 4.693.977, e 4.886.937, e Simpson et al., Plant Mol. Biol. 6:403-15 (1986) e EP 0 122 791)), os conteúdos de cada um são incorporados por referência em sua totalidade). Outros vetores de transformação de planta preferidos incluem aqueles revelados, por exemplo, por Herrera-Estrella et al., Nature 303:209-213 (1983); Bevan, M., Nucl. Acids Res. 12:8711-8721 (1984), e EP 0 120 516, os conteúdos de cada um são incorporados por referência em sua totalidade. Para A. tumefaciens com base no sistema de transformação de planta, os elementos adicionais presentes no construto do vetor de transformação incluem sequências de borda direita e esquerda do T-DNA para facilitar a incorporação do polinucleotídeo recombinante no genoma de planta. As descrições dos sistemas e métodos de vetor Agrobacterium para transferência de gene mediada por Agrobacterium são providas em, por exemplo, Gruber et al., “Vectors for Plant Transformation,” in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology supra; e Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238 (1989). De acordo com outras realizações, os vetores são parte do sistema de vetor binário, tal como pBin19, pC22, pGA482, pCV001, pJJ1881, pPZP111, pPVP, pGreen0029, pCGN1547, pMON10098, pBI121 (Bevan, Nucl. Acids Res. 12:8711-8721 (1984), pBI101 (Jefferson et al., EMBO J. 6:3901-3907 (1987)) Risch et al.,Plant Mol. Biol. 27:405-409 (1995), e Rothstein et al., Gene 53:153-161 (1987)), ver também, Becker et al., Plant Mol. Biol. 20:1195-1197 (1992) e Hajdukiewicz et al., Plant Mol. Biol. 25:989-994 (1994), cada qual é incorporado por referência em sua totalidade.

[000127] Os vetores adicionais (incluindo cassetes de expressão) e métodos e reagentes de cultura in vitro para célula de planta ou transformação de tecido e regeneração das plantas são conhecidos na técnica e podem prontamente ser aplicados ou modificados para praticar a invenção. A clonagem, manipulação e síntese do ácido nucleico, construções do vetor e outras técnicas recombinantes necessárias para fazer e usar os polinucleotídeos, polipeptídeos, células hospedeiras, e plantas transgênicas da invenção são geralmente conhecidos na técnica, por exemplo, conforme descrito em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y., (1989); and Kriegler, Gene Transfer and Expressão: A Laboratory Manual (1990), que é incorporado por referência em sua totalidade.

[000128] Em geral, pode ser preferido introduzir um DNA recombinante funcional em uma localização não específica em um genoma de planta. Em casos especiais, pode ser útil inserir um construto de DNA recombinante através de integração de local específico. Existem diversos sistemas de recombinação de local específico, os quais são conhecidos por funcionar em plantas incluem cre-lox conforme revelado em, por exemplo, documento de Patente Norte-Americana n° 4.959.317 e FLP-FRT conforme revelado no documento de Patente Norte-Americana n° 5.527.695, os conteúdos de ambos são incorporados por referência em sua totalidade.

[000129] A invenção também provê células hospedeiras compreendendo os vetores (incluindo cassetes de expressão) e/ou polinucleotídeos da invenção. As células hospedeiras compreendendo polinucleotídeos da invenção incluem, entre outros, células de bactérias (por exemplo, E. coli), de fungos, de inseto, de planta e animal. Os polinucleotídeos da invenção podem ser integrados no genoma da célula hospedeira ou existir extracromossomicamente no hospedeiro (por exemplo, um plasmídeo de replicação autônoma com uma origem de replicação). De acordo com algumas realizações, a sequência de polinucleotídeo da invenção está operacionalmente ligada a um promotor.

[000130] Acredita-se que os métodos adequados para transformação das células hospedeiras para uso com a invenção atual incluem virtualmente qualquer método conhecido na técnica através do qual o DNA pode ser introduzido (transiente ou estavelmente) em uma célula. Por exemplo, os polinucleotídeos da invenção podem ser rotineiramente transformados nas células hospedeiras bacterianas, tais como E coli, e outros hospedeiros através da transfecção de fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-Dextrano, ou eletroporação (Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986)).

[000131] Alternativamente, as células hospedeiras podem ser transformadas com polinucleotídeos da invenção usando técnicas tais como, absorção direta de DNA em protoplastos usando precipitação de CaCl2, álcool polivinílico ou poli-L-ornitina (vide, por exemplo, Hain et al., Mol. Gen. Genet. 199:161 (1985); e Draper et al., Plant Cell Physiol. 23:451 (1982)).

[000132] Em realizações adicionais, as células hospedeiras são transformadas com polinucleotídeos da invenção usando uma técnica conhecida na técnica. As técnicas exemplares para transformar as células hospedeiras incluem transformação de protoplasto (vide, por exemplo, documento de Patente Norte-Americana n° 5.508.184), microinjeção (Crossway, et al., Biotechniques 4:320-334 (1986); e documento de Patente Norte-Americana n° 6.300.543), eletroporação (Riggs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606 (1986) Fromm, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5824-5828 (1985)), transferência direta de gene (Paszkowski et al., EMBO J. 3:2717-2722 (1984)), métodos de sonicação (Bao et al., Ultrasound in Medicine & Biology 23:953-959 (1997); Finer et al., Lett. Appl. Microbiol. 30:406-10 (2000); Amoah et al., J. Exp. Bot. 52:1135-42 (2001)); métodos de polietilenoglicol (Krens et al., Nature 296:72-77 (1982)); absorção de DNA mediada por dessecação/inibição (Potrykus et al., Molec. Genet. 199:183 (1985), eletroporação (documento de Patente Norte-Americana n° 5.384.253), agitação com fibras de carboneto de silício (documentos de Patente Norte-Americana n°s 5.302.523 e 5.464.765), através da transformação mediada por Agrobacterium (documentos de Patente Norte-Americana n°s 563.055; 5.591.616; 5.693.512; 5.824.877; 5.981.840; 6.384.301) e através de bombardeamento de microprojéteis revestidos com DNA (documentos de Patente Norte-Americana n°s 399.861; 6.160.208; 6.403.865; 5.015.580; 5.550.318; 5.538.880; 4.945.050; Publicação do Pedido de Patente Internacional n° WO 91/10725; e McCabe et al., Biotechnology 6:923-926 (1988)), Sanford, Physiol. Plant 79:206 (1990); e Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992)), Tomes et al., “Direct DNA Transfer into Intact Cell Plants Via Microprojectile Bombardment” pp. 197-213 in Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods. eds. O. L. Gamborg & G. C. Phillips. Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York, 1995; Padgette et al., 1995).

[000133] No caso de espécies multicelulares, as células transgênicas podem ser regeneradas em organismos transgênicos usando técnicas conhecidas na técnica tais como aquelas descritas em Christou et al., Plant Physiol. 87:671674 (1988) (soybean); Datta et al., Biotechnology 8:736-740 (1990) (arroz); Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (1988) (milho); Klein et al., Biotechnology 6:559-563 (1988) (milho); Int. App. Pub. No. WO91/10725 (milho); Klein et al., Plant Physiol. 91:440-444 (1988) (milho); e Gordon-Kamm et al., Cell Plant 2:603-618 (1990) (milho).

[000134] Os polinucleotídeos da invenção podem geralmente ser introduzidos (transiente ou estavelmente) nas plantas através de uma ou mais técnicas tipicamente usadas para distribuição direta nas células. Tais protocolos podem variar dependendo do tipo de planta, por exemplo, monocotiledônea ou dicotiledônea, e a parte da planta marcada para a modificação do gene. Numerosos métodos para produção dos núcleos da célula de planta com DNA recombinante são conhecidos e podem ser usados de acordo com a invenção. Dois métodos comumente usados para transformação da planta são transformação mediada por Agrobacterium e bombardeamento de microprojétil. Os métodos exemplares de bombardeamento de microprojétil são revelados nos documentos de Patente Norte- Americana n°s 5.015.580 (soja); 5.550.318 (milho); 5.538.880(milho); 5.914.451 (soja); 6.160.208 (milho); 6.399.861 (milho) e 6.153.812 (trigo). Os métodos exemplares de transformação mediada por Agrobacterium são descritos nos documentos de Patente Norte- Americama n°s 5.159.135 (algodão); 5.824.877 (soja); 5.591.616 (milho); r 6.384.301 (soja), e Horsch et al., Science 227:1229-31 (1985)), os conteúdos de cada qual são incorporados por referência em sua totalidade. Em realizações adicionais, a transformação mediada por Agrobacterium é realizada de acordo com os métodos revelados em Hofgen et al., Nucleic Acid Research 16: 9977 (1998), ou usando um método de imersão (imersão floral), tal como descrito por Clough et al., Plant J. 16:735-743 (1998), os conteúdos de cada qual são incorporados por referência em sua totalidade.

[000135] Os recipientes de célula de planta dos polinucleotídeos da invenção incluem, entre outros, cultura de célula de planta, células de meristema, calo, embriões imaturos e pólen e células somáticas. De acordo com algumas realizações, a célula de planta hospedeira é uma dicotiledônea. De acordo com outras realizações, a célula de planta hospedeira é uma monocotiledônea. Uma vez transformada, as células de planta podem ser usadas para regenerar as plantas transgênicas. Os reagentes e métodos de transformação exemplares para fazer plantas transgênicas são descrito, por exemplo, nos documentos de Patente NorteAmericana n°s 6.194.636, 6.232.526, e 4,658,082, e Shahin, Theor. Appl. Genet. 69:235-40 (1985); os conteúdos de cada um são incorporados por referência em sua totalidade.

[000136] A semente de plantas transgênicas, pólen e partes da planta compreendendo um polinucleotídeo ou polipeptídeo da invenção estão englobados pela invenção. Em algumas realizações, os polinucleotídeos da invenção estão integrados no DNA da planta transgênica. Em realizações específicas, os polinucleotídeos da invenção estão estavelmente integrados no DNA genômico do hospedeiro. Em realizações adicionais, os polinucleotídeos da invenção existem extracromossomicamente (por exemplo, um plasmídeo de replicação autônoma com uma origem de replicação) dentro da célula de planta hospedeira. De acordo com algumas realizações, os polinucleotídeos da invenção estão operacionalmente ligados a um promotor. Em outras realizações, pelo menos uma célula em uma planta transgênica, célula de planta, semente, pólen ou parte da planta expressa ou é capaz de expressar um polipeptídeo da invenção. Ainda em outra realização, pelo menos uma célula em uma planta transgênica, célula de planta, semente, pólen ou parte da planta expressa ou é capaz de expressar uma proteína da invenção que é capaz de se ligar à sequência de DNA de não codificação endógena da célula de planta hospedeira in vitro.

[000137] As plantas “hospedeiras”, célula de plantas, semente, pólen e partes da planta que podem ser usadas e produzidas de acordo com os métodos da invenção (bem como sua progenia de reprodução sexuada ou assexuada) incluem virtualmente qualquer espécie na qual os polinucleotídeos da invenção podem ser introduzidos (transiente ou estavelmente). As plantas hospedeiras e células de planta hospedeira da invenção incluem plantas de cultura ou plantas usadas para produzir alimento e ração. De acordo com algumas realizações, a planta hospedeira, célula de planta, semente, pólen e parte de planta é uma monocotiledônea. Em algumas realizações, a planta hospedeira, célula de planta, semente, pólen, parte de planta, ou produto transgênico da mesma é soja (Glycine max). Em algumas realizações, a planta hospedeira, célula de planta, semente, pólen, parte da planta, ou produto transgênico da mesma é trigo (Triticum aestivum). Em realizações adicionais, a planta hospedeira, célula de planta, semente, pólen, parte da planta, ou produto transgênico da mesma é milho (Zea mays). Em realizações adicionais, a planta hospedeira, célula de planta, semente, pólen, parte da planta, ou produto transgênico da mesma é arroz (Oryza sativa). Em outras realizações, a planta hospedeira, célula de planta, semente, pólen, parte da planta, ou produto transgênico da mesma é algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum). Em outras realizações, a planta hospedeira, célula de planta, semente, pólen, parte da planta, ou produto transgênico da mesma é cana de açúcar (Saccharum spp.). Em realizações adicionais, a planta hospedeira, célula de planta, semente, pólen, parte da planta, ou produto transgênico da mesma é Arabidopsis (por exemplo, Arabidopsis thaliana).

[000138] De acordo com as realizações adicionais, a planta hospedeira, célula de planta, semente, pólen, parte da planta, ou produto transgênico da mesma é selecionada do grupo consistindo em: alfalfa (Medicago sativa), Brassica sp. (por exemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea): particularmente aquelas espécies Brassica úteis como fontes de óleo de semente incluindo, canola, girassol (Helianthus annuus), açafrão (Carthamus tinctorius), amendoins (Arachis hypogaea, sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare)), aveia, centeio (Secale cereale), painço (por exemplo, milheto-pérola (Pennisetum glaucum)), milheto proso (Panicum miliaceum), milheto rabo de raposa (Setaria italica), milheto em forma de dedo (Eleusine coracana), tabaco (Nicotiana tabacum), cevada (Hordeum), aveias (Avena sativa), tomates (Lycopersicon esculentum), abóbora, melões (por exemplo, melão rendilhado (C. melon), e cantalupo (C. cantalupensis)), cana de açúcar (Saccharum spp.), uma leguminosa diferente de soja, e tubérculo/raízes ricos em amido, por exemplo, batata (Solanum tuberosum), batata-doce (Ipomoea batatus), cassaya (Manihot esculenta), inhame, cana, e beterrabas (Beta vulgaris).

[000139] Em outras realizações, a planta hospedeira, célula de planta, semente, pólen, parte da planta, ou produto transgênico da mesma é um legume. As células hospedeiras dos legumes (plantas) da invenção incluem, por exemplo, alface (por exemplo, Lactuca sativa), vagens (Phaseolus vulgaris), feijões lima (Phaseolus limensis), ervilhas (Lathyrus spp.), e membros do gênero Cucumis tal como pepino (C. sativus).

[000140] Em outras realizações, a planta hospedeira, célula de planta, semente, pólen, parte da planta, ou produto transgênico da mesma é selecionada do grupo consistindo em: café (Cofea spp.), coco (Cocos nucifera), abacaxi (Ananas comosus), árvores cítricas (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea ameericana), figo (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava), manga (Mangijera indica), azeitona (Olea europaea), papaia (Carica papaya), caju (Anacardium occidentale), macadâmia (Macadamia integrifolia), e amêndoa (Prunus amygdalus).

[000141] Semente, pólen, tecido, células e progenia das plantas transgênicas e células da invenção também estão dentro do escopo da invenção.

[000142] Em uma realização, a invenção engloba uma planta transgênica transformada com uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de polinucleotídeo da invenção, em que a sequência de polinucleotídeo é expressa de modo a produzir uma proteína recombinante na planta e em que a proteína recombinante provê uma produtividade aumentada da planta como comparado a uma variedade tipo selvagem da planta sob as mesmas condições. De acordo com algumas realizações, a planta é uma monocotiledônea. Em outra realização, a planta é milho. Em uma realização adicional, a planta é trigo. Em outra realização, a planta é arroz. De acordo com outras realizações, a planta transgênica é uma dicotiledônea. Em uma realização, a planta transgênica é soja. Em uma adicional realização, a planta transgênica é Arabidopsis.

[000143] Em outra realização, a invenção engloba uma semente de planta transgênica transformada com uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de polinucleotídeo da invenção, em que a sequência de polinucleotídeo é expressa de modo a produzir uma proteína recombinante na semente da planta e em que a dita proteína recombinante provê uma tolerância aumentada à estiagem como comparado a uma variedade tipo selvagem da semente da planta sob as mesmas condições. De acordo com algumas realizações, a semente de planta transgênica é uma monocotiledônea. Em uma realização, a semente de planta transgênica é milho. Em uma realização, a semente de planta transgênica é trigo. Em outra realização, a semente de planta transgênica é arroz. De acordo com outras realizações, a semente de planta transgênica é uma dicotiledônea. Em uma realização, a semente de planta transgênica é soja. Em uma realização adicional, a semente de planta transgênica é Arabidopsis.

[000144] Em outra realização, a invenção engloba um método de produção de um hospedeiro transgênico de maior produtividade compreendendo (a) transformar estavelmente uma célula de planta com uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeo da invenção, em que o ácido nucleico é capaz de ser expresso na célula de planta, e (b) regenerar a célula em uma planta. De acordo com uma realização, a célula de planta é uma monocotiledônea. Em outra realização, a célula de planta é milho. Em uma realização, a célula de planta é trigo. Em outra realização, a célula de planta é arroz. De acordo com outras realizações, a célula de planta é uma dicotiledônea. Em uma realização, a célula de planta é soja. Em uma realização adicional, a célula de planta é Arabidopsis.

[000145] Os métodos e reagentes para regenerar as plantas e tecido de planta da célula transgênica são conhecidos na técnica e variam de espécie para espécie de plantas. Geralmente, a célula é cultivada para formação do calo, e a formação de brotos é induzida a partir do calo e subsequentemente enraizada. Alternativamente, a formação de embriões pode ser induzida no tecido do calo. Esses embriões germinam como embriões naturais para formar as plantas. Os meios de cultura geralmente contêm componentes suficientes para sustentar o crescimento e a divisão da célula, e incluem, por exemplo, aminoácidos e hormônios tais como, auxinas e citocininas, para sustentar o crescimento e induzir a diferenciação celular. É previsto que após a integração estável de polinucleotídeos da invenção no DNA genômico do hospedeiro, os polinucleotídeos podem ser transferidos para outras plantas através de cruzamento sexual. Qualquer uma de várias técnicas de reprodução padrão pode ser usada, dependendo da espécie a ser cruzada. Uma vez que as plantas transgênicas desse tipo são produzidas, as próprias plantas podem ser cultivadas de acordo com o procedimento convencional, de modo que o construto de ácido nucleico esteja presente nas plantas resultantes. Alternativamente, as sementes ou propágulos transgênicos (por exemplo, mudas) são recuperados das plantas transgênicas. Essas sementes podem então ser plantadas no solo e cultivadas usando procedimentos convencionais para produzir as plantas transgênicas.

[000146] Em algumas realizações, a invenção provê um método de cultivo de uma planta transgênica compreendendo, (a) plantar uma semente transgênica compreendendo um ácido nucleico, vetor e/ou cassete de expressão da invenção e (b) cultivar uma planta transgênica a partir da semente transgênica. Em algumas realizações, o método ainda compreende a etapa de colheita da planta transgênica. Em realizações adicionais, o método ainda compreende a etapa de replantio da semente a partir da planta transgênica. Em algumas realizações, a planta transgênica é uma monocotiledônea. Em realizações adicionais, a planta transgênica é milho. Em outras realizações, a planta transgênica é trigo. Em algumas realizações, a planta transgênica é arroz. Em outras realizações, a planta transgênica é uma dicotiledônea. Em algumas realizações, a planta transgênica é soja...

[000147] A planta transgênica formada usando métodos de transformação de Agrobacterium tipicamente pode conter uma sequência DNA recombinante simples única inserida em um cromossomo, referido como um evento transgênico. Tais plantas transgênicas podem ser referidas como sendo heterozigotas para a sequência exógena inserida. Uma planta transgênica homozigota com relação a um transgene pode ser obtida pelo acasalamento sexual (“autopolinização”) de uma planta transgênica segregante independente que contém uma sequência de gene exógeno único para ela mesma, por exemplo, uma planta F0, para produzir semente F1. Um quarto da semente F1 produzida será homozigoto com relação ao transgene. Germinar semente F1 resulta em plantas que podem ser testada para heterozigosidade, tipicamente usando um ensaio SNP ou um ensaio de amplificação térmica que permite a distinção entre heterozigotos e homozigotos (isto é, um ensaio de zigosidade). Cruzar uma planta heterozigota com ela mesma ou outra planta heterozigota resulta em progenia heterozigota, bem como progenia transgênica homozigota e nula homozigota.

[000148] Além disso, para a transformação direta de uma planta com um polinucleotídeo da invenção, as plantas transgênicas podem ser preparadas pelo cruzamento de uma primeira planta que tenha um polinucleotídeo da invenção com uma segunda planta que falta o polinucleotídeo da invenção. Por exemplo, um polinucleotídeo da invenção pode ser estavelmente introduzido (isto é, integrado no DNA genômico) na primeira linhagem de planta que é favorável à transformação para produzir uma planta transgênica que possa ser cruzada com uma segunda linhagem de planta para introduzir o polinucleotídeo da invenção na segunda linhagem de planta.

[000149] Também são providos métodos de uso dos polinucleotídeos da invenção para produzir uma planta caracterizada por ter um traço melhorado, compreendendo as etapas de introdução de um polinucleotídeo da invenção em uma célula de planta hospedeira, seleção da presença da molécula de polinucleotídeo para produzir uma célula de planta transgênica, e regenerar uma planta transgênica a partir da célula de planta transgênica, por meio de que a planta transgênica tem um traço melhorado quando comparado a uma planta tipo selvagem comparável ou uma planta transgênica de HaHB4 em que HaHB4 está sob o mesmo promotor. Os traços melhorados das plantas transgênicas que podem ser selecionadas de acordo com os métodos da invenção incluem, entre outros, eficácia melhorada do uso da água (por exemplo, “tolerância à estiagem”), tolerância melhorada à salinidade, tolerância melhorada ao estresse osmótico, produtividade aumentada, e combinações da mesma.

PRODUTOS DE PLANTA, SEMENTE E PARTE DA PLANTA

[000150] Em realizações adicionais, a invenção se refere a produtos de base de planta e métodos para produzir produtos de base de planta, produzidos a partir de uma planta ou parte da planta conforme descrito aqui. Os produtos de base contendo sequências de polinucleotídeo ou polipeptídeo da invenção, e produzidos a partir de uma planta ou semente transgênica contendo as sequências de polinucleotídeo da invenção são especificamente contemplados como realizações da invenção. Um produto de base contendo um polinucleotídeo ou polipeptídeo da invenção pretende incluir, entre outros, refeições, óleos, grãos triturados ou integrais ou sementes de uma planta, ou qualquer produto alimentício compreendendo qualquer refeição, óleo ou grão triturado ou integral de uma planta ou semente recombinante contendo uma ou mais das sequências da presente invenção. Assim, de acordo com uma realização, a invenção engloba produto de planta processado contendo uma quantidade detectável de um polinucleotídeo ou polipeptídeo da invenção em que o produto de planta compreende um alimento, uma refeição, uma farinha, um extrato ou homogenato obtido de pelo menos uma parte de uma planta. Em uma realização adicional, a invenção engloba um produto de planta processado contendo uma quantidade detectável de um polinucleotídeo ou polipeptídeo da invenção em que o produto de planta compreende um alimento, uma refeição, uma farinha, extrato ou homogenato de uma semente. A detecção dos polinucleotídeos e polipeptídeos da invenção em produtos de planta processados pode ser realizada usando técnicas e regentes conhecidos na técnica incluindo, por exemplo, PCR, e análise Northern, Southern, e Western.

EMPILHAMENTO GÊNICO

[000151] A presente invenção também engloba sementes e plantas que têm um ou mais eventos transgênicos. A invenção também contempla que os polinucleotídeos e polipeptídeos da invenção podem ser usados em combinação com outros “eventos” transgênicos para criar plantas com múltiplos traços desejados ou ainda um traço melhorado. Esses eventos transgênicos “empilhados” podem ser eventos que são direcionados ao mesmo organismo ou traço alvo, ou eles podem ser direcionados a diferentes patógenos, pragas ou traços alvo. Além disso, os eventos empilhados podem ser criados por qualquer método incluindo, entre outros, cruzamento de plantas transgênicas, ou múltipla transformação genética.

[000152] Em algumas realizações, uma semente ou planta transgênica da invenção adicionalmente tem um evento transgênico empilhado que provê tolerância a herbicida. Exemplos de herbicidas para os quais a expressão recombinante provê resistência incluem, entre outros, dicamba, glufosinato-amônio e glifosato e N-(fosfonometil) glicina, incluindo sua forma de sal de isopropilamina.

[000153] Em realizações adicionais, uma semente ou planta transgênica da invenção adicionalmente tem um evento transgênico empilhado que provê resistência a insetos. Exemplos de genes para os quais a expressão recombinante provê resistência a insetos incluem, entre outros, variantes do Bacillus thuringiensis Cry (por exemplo, Cry1A, Cry1Ac, Cry2A, Cry1F-1Ac, Cry3A, Cry3Bb, Cry35Ab1) e/ou famílias do Cyt.

[000154] Em outras realizações, uma semente ou planta transgênica da invenção adicionalmente tem um evento transgênico empilhado que provê resistência à doença fúngica, doença viral ou doença bacteriana ou infestação (por exemplo, infestação por nematoide).

[000155] Em outras realizações, uma semente ou planta transgênica da invenção adicionalmente tem um evento transgênico empilhado que provê resistência a um estresse ambiental selecionado do grupo consistindo em: condições de estiagem, condições de salinidade, estresse osmótico, exposição à temperatura fria, exposição ao calor, disponibilidade reduzida de nutriente de nitrogênio, disponibilidade reduzida de nutriente de fósforo, e alta densidade da planta.

[000156] Em outras realizações, uma semente ou planta transgênica da invenção adicionalmente tem um evento transgênico empilhado que provê eficácia ou produtividade aumentada do uso de nitrogênio.

EXEMPLOS

[000157] A invenção é ainda descrita nos Exemplos a seguir. Deve ser entendido que esses Exemplos são providos a título de ilustração apenas. Da discussão acima e dos Exemplos a seguir, pode-se determinar as características essenciais dessa invenção, e sem se afastar do espírito e escopo da mesma, pode-se fazer várias mudanças e modificações da invenção para adaptá-los a vários usos e condições.

EXEMPLO 1

[000158] Geração e Caracterização dos Construtos de Expressão de HaHB4.2 Modificado

[000159] O quadro de leitura aberta de cDNA que codifica HaHB4 de comprimento total (SEQ ID No: 1) clonado nos locais de BamH1/Sac1 do vetor pBlueScript SK- (Stratagene, Upsala, Sweden) foi usado como um modelo para uma série de reações de PCR para criar HaHB4 modificado. Em uma primeira etapa, uma reação de PCR foi realizada usando o iniciador dianteiro H4m-F (5’- ATGTCTCTTCAACAAGTAACAACCACCAGG3’; SEQ ID No: 22) e o iniciador reverso Transf2 (5’GCCGAGCTCTTAGAACTCCCACCACTTTTG-3‘; SEQ ID No: 23) para gerar um primeiro produto PCR amplificado. O projeto do iniciador para essa execução de ampliação amplificou um produto que contém um local de iniciação de transcrição recém-introduzido e local de encerramento da transcrição. O primeiro produto de amplificação de PCR foi clonado em um vetor pGEM®-T-Easy (Promega, Madison, Wisconsin) e chamado “pTHaHB4.2a.”

[000160] pTHaHB4.2a foi, por sua vez, usado como o modelo em uma segunda reação de amplificação de PCR usando o iniciador dianteiro H4m-F (5’-ATGTCTCTTCAACAAGTAACAACC ACCAGG-3’; SEQ ID No: 22) e um iniciador reverso designado H4m-R (5-TTAGAACTCCC ACCACTTTTGAAGGTCTGG-3’; SEQ ID No: 24) para gerar um segundo produto de amplificação de PCR que foi então clonado em um vetor pGEM®-T-Easy e chamado pTHaHB4.2b. [00164] Em uma terceira reação de amplificação de PCR, pTHaHB4.2b foi usado como um modelo em uma reação de PCR usando dois conjuntos de iniciadores, um conjunto de iniciadores correspondendo ao iniciador dianteiro Transf-1 (5’-GCGGGATCCACCATGTCTCTTCAACAAGTA-3’; SEQ ID No: 26) e um iniciador reverso designado H4m-R1 (5’- GTTTCCTTCTTCAAGGTACGCAAAAC CGTCGC-3’; SEQ ID No: 27) e um segundo conjunto de iniciadores consistindo no iniciador dianteiro H4m-F1 (5’-CGGTTTTGCGTACCTTGAAGAAGGAAACAGTTTG-3’; SEQ ID No: 25) e o iniciador reverso Transf-2 (5’GCCGAGCTCTTAGAACTCCAACCACTT TTG-3’; SEQ ID No: 23). Os produtos amplificados dos 2 conjuntos de iniciadores foram então fundidos em uma sequência de polinucleotídeo quimérica contígua usando técnicas recombinantes convencional. Vide, por exemplo, Silver J, Limjoco T, Feinstone S (1995) Sitespecific mutagenesis using the polymerase chain reaction. In: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ (eds.) PCR Strategies. Academic Press Inc, San Diego, pp 179-188. Brevemente, a estratégia incluiu a desnaturação de ambos os produtos de PCR seguidos pela mistura e etapas de hibridização. Os produtos de hibridização foram estendidos com a enzima Klenow e em outra reação de PCR foi realizada a sequência de polinucleotídeo quimérica como o modelo, o iniciador dianteiro Transf-1 (SEQ ID No: 26) e os iniciadores reversos Transf-2 (SEQ ID No: 23). O produto de PCR amplificado dessa reação foi então clonado em um vetor pGEM®-T-Easy e chamado pTHaHB4.2c.

[000161] Uma análise de sequência dos produtos amplificados em cada etapa do processo de geração do construto de expressão de pTHaHB4.2c revelou o seguinte quando comparado com a sequência de polinucleotídeo HaHB4 da SEQ ID No: 1: (a) o produto de PCR amplificado codificou um polipeptídeo contendo uma exclusão de quatro aminoácidos na região amino terminal (7 a10 resíduos de aminoácidos da SEQ ID No: 2); (b) o segundo produto de PCR amplificado continha uma mutação de P175L em uma região que codifica o domínio de ativação putativo de HaHB4, e uma exclusão de quatro nucleotídeos localizados no 5’ UTR; (c) o produto da terceira reação de PCR continha uma mutação L159F em uma região que codifica a porção carbóxi terminal de HaHB4; e (d) o produto amplificado da última reação de PCR descrita acima continha uma mutação conservadora R22K.

[000162] A inserção em pTHaHB4.2c foi então amplificada em uma reação de PCR a fim de introduzir uma mudança de aminoácido conservador K22R. A sequência correspondente à inserção amplificada em pTHaHB4.2c foi sequenciada e determinada para corresponder ao polinucleotídeo SEQ ID No: 3 e para codificar a sequência de polipeptídeo reveladas na Figura 1A-B (SEQ ID No: 4). A Figura 1A-B apresenta um alinhamento indicando as diferenças de sequência de HaHB4 (SEQ ID No: 2), HaHB4.2 (mod1HaHB4 (SEQ ID No: 4)) e um fator de transcrição HaHB4 modificado adicional (mod2HaHB4 (SEQ ID No: 8)).

CONSTRUTOS DE EXPRESSÃO DE HaHB4.2

[000163] As sequências de polinucleotídeo pTHaHB4.2c (HaHB4.2) geradas acima foram clonadas em ligação operacional nos vetores de milho, soja e trigo para gerar os construtos de expressão de soja (figuras. 2A-2C), trigo (figuras 2D-2G) e milho (figuras 2H-2J) esquematicamente descritos nas figuras 2A-2J. Cada um dos construtos de expressão descritos nas figuras 2A-2J, contém a sequência de HaHB4.2 que codifica uma proteína de mod1HaHB4 de comprimento total de 177 aminoácidos (isto é, HaHB4.2 (SEQ ID No: 4)) e está operacionalmente ligada com (a) um promotor constitutivo, tal como o promotor 35S CaMV (pZmHaHB4.2, pGmHaHB4.2) ou promotor Ubi (pTaHaHB4.2), ou (b) um promotor induzível composto de uma versão modificada do promotor HaHB4 fundido com o primeiro íntron do gene de Arabidopsis Cox5c-2 (LPF-Cox) (pZmPrInHBH4.2, pGmPrInHB4.2, e pTaPrInHB4.2). Cada um dos construtos de expressão descritos nas figuras 2A-2J também contém um marcador de seleção e um terminador nos a jusante do cDNA de HaHB4.2.

EXEMPLO 2

[000164] Produção de Plantas transgênicas de HaHB4 Modificado

GERAÇÃO E SELEÇÃO DE EVENTOS TRANSGÊNICOS DE SOJA mod1HaHB4

[000165] Os eventos transgênicos de soja mod1HaHB4 foram gerados usando um protocolo mediado por Agrobacterium e o cultivar Williams 82. As sementes T1 foram obtidas para 35 eventos independentes usando três diferentes cassetes de expressão refletindo estratégias, uma constitutiva e duas induzíveis. A expressão da sequência de codificação do cDNA de mod1HaHB4 nos eventos constitutivos foi acionada pelo promotor 35S CaMV. A expressão da sequência de codificação do cDNA de mod1HaHB4 nos eventos induzíveis foi direcionada pelo alelo longo do promotor nativo HaHB4 ou uma sequência de polinucleotídeo quimérica contendo o mesmo alelo longo do promotor HaHB4 e o íntron AtCOX5c2.

[000166] A primeira multiplicação das células transformadas foi conduzida em uma estufa durante o tempo que 10 T1 individuais derivados de cada evento foram amostrados por um teste de segregação através da determinação de PCR. As linhagens derivadas de selfings de indivíduos a partir de eventos selecionados (segregação 3:1 em T1) foram semeadas e as plantas foram amostradas usando análise de PCR para identificar as linhagens homozigotas, conforme indicado pela ausência de segregantes negativos dentre a progenia amostrada (pelo menos 5 indivíduos amostrados por linhagem). Alguns segregantes negativos identificados durante o processo de triagem foram mantidos como “linhagens nulas” de controle.

[000167] O aumento da semente (semente T3) de linhagens nulas e de homozigoto de cópia única foi conduzido em uma estufa durante a qual as sementes de linhagens de homozigoto mod1HaHB4 selecionado foram usadas para confirmar a insensibilidade de etileno e para quantificar Hahb4 e os níveis de expressão de gene a jusante (LOX2 e CSD-1) nas linhagens selecionadas. As linhagens de homozigoto de mod1HaHB4 selecionado também foram avaliadas para tolerância ao estresse de estiagem em condições de laboratório. Vinte e duas linhagens de célula de homozigoto mod1HaHB4 de cópia única foram identificadas para estudo posterior.

ENSAIOS DE CAMPO DE SOJA TRANSGÊNICA mod1HaHB4

[000168] A soja transgênica (mod1HaHB4 (SEQ ID No: 4)) e as linhagens de controle foram avaliadas em condições de campo em Liborio Luna (33°35’15”S, 65°38’09”W), San Luis, Argentina. O solo foi um franco arenoso com um pH de 5,99 e conteúdo de matéria orgânica de 1,41 %. A precipitação média anual é de 800 mm.

[000169] Quinze linhagens transgênicas, sete linhagens de segregantes negativos (nulos) e o tipo selvagem (Williams 82) foram plantadas em uma taxa de 28 plantas por m-2. O projeto experimental foi um bloco aleatório completo, subparcelas com 3 replicações com a irrigação como a principal parcela e as linhagens de soja como as subparcelas. Dois níveis (alto e baixo) de regime e irrigação foram aplicados. Para o regime de irrigação baixo, o fornecimento de água foi suspenso dos estágios reprodutivos da planta R1 a R6. Portanto, esse regime consistiu em apenas duas aplicações de água, uma no começo da estação e o outro no final da estação. Conforme indicado na Tabela 1, o alto regime de irrigação consistiu em aplicações de água mensais.

[000170] As parcelas tinham 5 m de comprimento com 4 filas espaçadas em 0,7 m. Os pesticidas e fertilizantes foram aplicados de acordo com as práticas locais. Os dados de produtividade foram obtidos a partir de duas filas centrais em cada parcela. As plantas foram recortadas à mão e debulhadas com o equipamento estacionário. O peso e umidade da semente foram gravados. A produtividade para cada replicação é apresentada na Tabela 2. Tabela 1: Regime de Irrigação e Precipitação Durante Estação Crescente do Ensaio de Campo

[000171] Os dados de produtividade foram analisados como subparcela, usando procedimento GLM (SAS software) que permite análises de variação para os conjuntos de dados com valores omissos. As diferenças significativas foram detectadas em um nível alfa de 0,05. O tratamento (irrigação alta e baixa) foi a parcela principal e as linhagens de soja foram as subparcelas. Os dados de produtividade são apresentados na Tabela 2.

[000172] Houve tratamento significativo (p=0,0079) e efeitos principais da linhagem (p<0,0001). O regime de baixa irrigação causou uma redução da produtividade de 35% comparada ao regime de alta irrigação (de 2900 Kg ha-1 a 1897 Kg ha-1). Dado que nem todas as linhagens de homozigoto tiveram suas contrapartes nulas, as comparações entre as linhagens nulas e de homozigoto foram realizadas dentro ou entre as construções. As linhagens transgênicas de mod1HaHB4 homozigoto dentro ou entre as construções e dentro da mesma linhagem tiveram produtividade maior do que as linhagens nulas, exceto a linhagem a3H. Essa linhagem de homozigoto teve rendimento menor que seis linhagens nulas (a7N, a9N, b1N, b8N, b10N, c4N). Não houve diferenças significativas de produtividade entre as linhagens transgênica e nula para eventos transgênicos induzíveis dentro da mesma linhagem. Entretanto, os eventos transgênicos constitutivos mod1HaHB4 a7H e a9H tiveram produtividade maior do que suas contrapartes nulas respectivamente, em ambos os regimes de alta e baixa irrigação. Os eventos nulos a9N, a7N e uma linhagem de homozigoto (a3H) teve uma redução de produtividade significativa quando comparado a Williams 82. Tabela 2: Dados de produtividade (kg.ha ) para as condições de alto me baixo crescimento irrigado para as linhagens de soja transgênica constitutiva mod1HaHB4 testadas. (NA= não disponível).

[000173] As figuras 3A-3D proveem gráficos em barra indicando melhora na produtividade em culturas transgênicas em condições de campo irrigado (sem limitações de água em condições de não escassez de água) em um ambiente de alta produtividade. As figuras 3A-3B apresentam gráficos em barra retratando a melhora da produtividade de duas linhagens de milho transgênico de homozigoto (expressando HaHB4.2 (SEQ ID No: 4) sob o controle de um promotor constitutivo 35S) como comparado ao campo do milho de controle tipo selvagem (WT). Os dados foram coletados de lotes de campo replicados em duas localizações com diferentes tipos de solo: em um solo argiloso sedimentoso com 626 mm de chuva recebida em todo o período de cultivo (Figura 3A), e em um solo argiloso sedimentoso bem drenado com 545 mm de chuva recebida durante o ciclo de cultura (Figura 3B). A figura 3C apresenta um gráfico em barra retratando a melhora da produtividade de uma linhagem de trigo transgênico de homozigoto (expressando HaHB4.2 (SEQ ID No: 4) sob o controle de um promotor constitutivo 35S) como comparado à produtividade do trigo de controle tipo selvagem (WT). Os dados na figura 3C foram obtidos dos lotes de campo replicados em uma localização com solo arenoso bem drenado (pH 7,14%, OM 1.57%). A irrigação suplementar para prover 755 mm de água durante todo o ciclo de cultura. A figura 3D apresenta um gráfico em barra retratando melhora da produtividade de duas linhagens de soja transgênica de homozigoto (expressando HaHB4.2 (SEQ ID No: 4) sob o controle de um promotor constitutivo 35S) como comparado à produtividade de soja de controle tipo selvagem (WT). Os dados na figura 3D foram obtidos de lotes de campo replicados na localização com solo arenoso (pH 5,99%, OM 1,41%). A irrigação suplementar foi aplicada para prover 579 mm de água por todo o ciclo de cultura.

PROCEDIMENTO PARA CARACTERIZAÇÃO DE TRANSGENES DE LINHAGENS DE MILHO E SOJA

[000174] A análise Northern foi inicialmente conduzida usando métodos e materiais conhecidos na técnica para confirmar a expressão de HaHB4 nas linhagens transgênicas de milho e soja. As sequências de codificação dos transgenes correspondentes às linhagens de planta transformadas de HaHB4 homozigoto foram então amplificadas usando métodos de PCR convencionais e materiais conforme geralmente descrito aqui. O DNA genômico transgênico de milho e soja foi preparado usando métodos conhecidos na técnica e foi usado como o modelo nas reações de PCR. Os transgenes correspondentes aos cassetes de expressão constitutivos (promotor 35S CaMV) foram amplificados nas reações de PCR usando o iniciador dianteiro 35S PrimF (5’-TGACGCACAATCCCACTATC-3‘ (SEQ ID No: 34) e o iniciador reverso NOS121R (5-GAATTCCCGATCTAGTAACA TA-3’ (SEQ ID No: 35). Os transgenes correspondentes aos cassetes de expressão induzíveis (promotor TRANSF1Xba) foram amplificados nas reações de PCR usando o iniciador dianteiro TRANSF1Xba (5’ATGTCTCTTCAACAAGTACCCAC-3‘ (SEQ ID No: 32)), o iniciador reverso NOS121R (5’-GAATTCCCGATCTAGTAACATA-3‘ (SEQ ID No: 33), e DNA genômico transgênico de milho ou soja como o modelo.

[000175] A análise de sequência dos polinucleotídeos de HaHB4 amplificados identificou múltiplas variações entre a sequência amplificada e a sequência de HaHB4 (SEQ ID No: 1) nativo. A figura 1 provê um alinhamento entre HaHB4 nativo e a sequência codificada pelo mod1HaHB4 (HaHB4.2 (SEQ ID No: 4)) e mod2HaHB4 (HaHB4.3 ((SEQ ID No: 8)) identificado por essa análise.

EXEMPLO 3 Transativação por HaHB4 Modificado em Levedura

[000176] Os polinucleotídeos que codificam proteínas de HaHB4 modificado (HaHB4.2 (mod1HaHB4)HaHB4.3 (mod2HaHB4), ou HaHB4.4 (mod3HaHB4)) foram clonados no vetor pGBKT7 em associação operativa com o domínio de ligação de DNA GAL4 no vetor e a levedura transformada com os construtos de expressão resultantes foram ensaiados em um ensaio hibrido simples de levedura para determinar a transativação pelo HaHB4 modificado codificado. A transativação por HaHB4 modificado (e proteína HaHB4 de controle) foi determinada pela medição da atividade de β-galactosidase para a levedura contendo proteínas de HaHB4 modificado (e proteína de HaHB4 de controle) usando ONPG como substrato. A figura 4 provê um gráfico em barra mostrando que todas as proteínas de HaHB4 modificado agem como um ativador no sistema de ensaio híbrido simples de levedura.

[000177] Similarmente, a fim de determinar a habilidade da proteína de HaHB4 modificado para heterodimerizar, dois ensaios híbridos foram realizados. O cDNA de HaHB4.2 foi clonado no vetor pGAD e fundido para o domínio de ativação do fator de transcrição GAL4 de levedura. O construto de expressão resultante foi então transformado na cepa S. cerevisiae AH109, e um ensaio de dois híbridos foi realizado usando a levedura expressando a proteína modificada e quatro proteínas de Arabidopsis HD-Zip com terminais carbóxi excluídos que foram previamente clonados no vetor pGBK7 e fundidos com o domínio de ligação GAL4 aqui. As interações putativas foram avaliadas por auxotrofia em um meio SD (-HIS). Os resultados indicaram que HaHB4.2 agiu como um fator de transcrição e foi capaz de interagir com AtHB1, AtHB7 e AtHB12. (dados não mostrados).

[000178] Esses resultados indicam que a interação com proteínas endógenas podem constituir um mecanismo parcial de mod1HaHB4 (HaHB4.2) para exercer sua função.

EXEMPLO 4 Morfologia e Taxa de Fotossíntese de Plantas Transgênicas Arabidopsis

[000179] As plantas Arabidopsis foram transformadas com 35S::H4.2 (um construto de expressão compreendendo mod1HaHB4 (SEQ ID No: 4) operacionalmente associado com um promotor constitutivo 35S) através de técnica de imersão floral para gerar plantas transgênicas de Arabidopsis. As medições de troca de gás CO2 na folha foram feitas em três plantas por vaso. Uma folha destacada de cada planta da amostra foi colocada na cuba da folha de um sistema de fotossíntese Licor 6400 XT. As folhas foram iluminadas pela fonte de luz de LED Licor 6400 provendo uma densidade de fluxo de fóton fotosssintético por volta de 1000 μmol m-2 s-1.

[000180] A taxa de fotossíntese (μmol m-2 s-1) foi medida quando a absorção de CO2 foliar foi constante, enquanto o ar fluindo da cuba da folha foi regulado pelo sistema Licor 6400 para manter a temperatura por volta de 24 °C e uma concentração de CO2 por volta de 500 μmol mol-1. A figura 5 provê um gráfico em barras mostrando a taxa de fotossíntese nas plantas transgênicas expressando vetor vazio (pBI121) e plantas transgênicas expressando mod1HaHB4 (HaHB4.2 Line 30) em dois experimentos independentes. Foi observado que as plantas transgênicas expressando mod1HaHB4 tiveram uma taxa de fotossíntese significativamente maior do que as plantas de controle expressando o vetor vazio. Esse aumento pode ser responsável pela produtividade aumentada observada nas culturas transformadas com mod1HaHB4 modificado.

[000181] Esse pedido de patente reivindica o benefício do Pedido Provisório de Patente Norte-Americana n° 61/601.335, depositado em 21 de fevereiro de 2012, que é incorporado por referência em sua totalidade. Além disso, todas as publicações referenciadas aqui são incorporadas por referência em sua totalidade.

[000182] A descrição mencionada acima das realizações específicas revelarão completamente a natureza geral da invenção que outros podem, ao aplicar o conhecimento dentro da técnica, prontamente modificar e/ou adaptar para várias aplicações tais realizações específicas, sem experimentação indevida, sem se afastar do conceito geral da presente invenção. Portanto, tais adaptações e modificação pretendem estar dentro do significado e faixa dos equivalentes das realizações divulgadas, com base no ensinamento e orientação apresentados aqui. Deve ser entendido que a fraseologia ou terminologia daqui é para a finalidade de descrição e não de limitação, de modo que a terminologia ou fraseologia do presente relatório descritivo seja interpretada pelo técnico no assunto à luz dos ensinamentos e orientações.

Claims (18)

1. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica o fator de transcrição mod1HaHB4 de SEQ ID NO: 4 e um promotor, em que a referida sequência de polinucleotídeos é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16.

2. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o promotor é um promotor constitutivo.

3. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o promotor é o promotor 35S CaMV ou o promotor Ub1.

4. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o promotor é um promotor induzível.

5. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o promotor consiste em pelo menos 200 nucleotídeos da SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 21.

6. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o promotor é fusionado ao primeiro íntron de Arabidopsis Cox5c2.

7. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 1.

8. Vetor, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um promotor operacionalmente ligado à molécula de ácido nucleico.

9. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 1, sendo que a célula hospedeira é uma célula bacteriana, ou célula fúngica.

10. Uso de uma semente de planta transgênica, pólen transgênico ou parte de planta transgênica compreendendo o ácido nucleico como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para plantar e/ou cultivar uma plantação transgênica.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a referida semente de planta transgênica, um pólen transgênico ou uma parte de planta transgênica é de uma monocotiledônea ou dicotiledônea.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a referida semente de planta transgênica, um pólen transgênico ou uma parte de planta transgênica é selecionada a partir do grupo que consiste em milho, trigo, arroz e soja.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico está integrada no DNA da célula vegetal transgênica.

14. cido nucleico está operacionalmente ligada a um promotor.

15. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a referida semente da planta transgênica, um pólen transgênico ou uma parte da planta transgênica expressa SEQ ID NO:4.

16. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a referida semente da planta transgênica, um pólen transgênico ou uma parte da planta transgênica apresenta empilhamento gênico.

17. Proteína, caracterizada pelo fato de que é codificada pela molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 1, em que a dita proteína consiste em SEQ ID NO: 4.

18. Método para produção de um hospedeiro transgênico de maior produtividade, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) transformação estável de uma célula de planta com uma molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 1, em que o ácido nucleico é capaz de ser expressado na célula de planta, e (b) regeneração da célula em uma planta.

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