BR112014009491A2

BR112014009491A2 - molécula de ácido nucleico isolado; vetor; célula hospedeira; cultura de tecido; semente de planta transgênica, pólen ou parte da planta; célula de planta transgênica estavelmente transformada com uma molécula de ácido nucleico; semente de planta transgênica, pólen ou parte da planta estavelmente transformada com uma molécula de ácido nucleico; planta transgênica transformada com uma molécula de ácido nucleico; semente de planta transgênica transformada com uma molécula de ácido nucleico; planta transgênica; semente ou grão de pólen; planta de progenia de qualquer geração da planta transgênica; grão; proteína; produto de planta processado; método de produção de uma célula de planta transgênica com uma molécula de ácido nucleico; célula de planta transgênica; método de produção de um hospedeiro transgênico de maior produtividade; método de cultivo de uma planta transgênica; e; uso de um ácido nucleico

Info

Publication number: BR112014009491A2
Application number: BR112014009491-8A
Authority: BR
Inventors: Raquel Lia Chan; Daniel Hector Gonzalez
Original assignee: Bioceres, Inc; Conicet; Unl
Priority date: 2012-02-21
Filing date: 2013-02-20
Publication date: 2020-10-27
Also published as: AR090110A1; AU2013222553B2; MX360337B; CN104080913B; CN104080913A; WO2013126451A1; BR112014009491B1; US9035132B2; MX2014010057A; AU2013222553A1; US20130263327A1; UY34635A

Abstract

  MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADA, USO DE UMA SEM ENTE DE PLANTA, PARTE DE PLANTA OU PLANTA COMPREENDENDO A MESMA VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, PRODUTO DE PLANTA PROCESSADO, MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE UM HOSPEDEIRO DE CULTIVO DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA E PARA GERAR UMA SEMENTE DE PLANTA, PARTE DE PLANTA OU PLANTA TRANSGÊNICA A invenção refere-se a polinucleotídeos que codificam um fator de transcrição HaHB4 modificado e polinucleotídeos que codificam fragmentos e variant es funcionalmente ativos de um fator de transcrição Ha HB4 modificado bem como vetores e células hospedeiras contendo esses polinucleotídeos e os polipeptídeos codificados por esses polinucleotídeos. A invenção também engloba células hospedeiras transgênicas, plantas, semente, pólen, e partes da planta contendo os polipeptídeos e/ou polinucleotídeos da invenção. A invenção ainda engloba métodos de produção das células hospedeiras transgênicas, plantas, semente, pólen, e partes da planta e os produtos de planta processados produzidos a partir desses hospedeiros transgênicos.

Description

| 1/107 MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO; VETOR; CÉLULA HOSPEDEIRA; CULTURA DE TECIDO; SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, PÓLEN OU PARTE DA PLANTA; CÉLULA DE PLANTA TRANSGÊNICA ESTAVELMENTE TRANSFORMADA COM UMA MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO; SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, PÓLEN OU PARTE DA PLANTA ESTAVELMENTE TRANSFORMADA COM UMA MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEIÇO; PLANTA TRANSGÊNICA TRANSFORMADA COM UMA MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO;

SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA TRANSFORMADA COM UMA MOLÉCULA . DE ÁCIDO NUCLEICO; PLANTA TRANSGÊNICA; SEMENTE OU GRÃO DE PÓLEN; PLANTA DE PROGENIA DE QUALQUER GERAÇÃO DA PLANTA TRANSGÊNICA; GRÃO; PROTEÍNA; PRODUTO DE PLANTA PROCESSADO; MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA CÉLULA DE PLANTA TRANSGÊNICA COM UMA MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO; CÉLULA DE PLANTA TRANSGÊNICA; MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM HOSPEDEIRO TRANSGÊNICO DE MAIOR PRODUTIVIDADE; MÉTODO DE CULTIVO DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA; E; USO DE UM ÁCIDO NUCLEICO REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Esse pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório Norte-Americano nº 61/601,335, 7 depositado em 21 de fevereiro de 2012, o qual está incorporado por referência em sua totalídade.

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIA COMO ARQUIVO DE TEXTO

[002] Esse pedido refere-se a uma “Listagem de Sequência” listada abaixo, a qual é provída como um arquivo de texto. O arquivo de texto contém um documento intitulado “HAHB4 SEQID Listing ascii NA.txt“ (25.010 bytes, criado em de fevereiro de 2013), o qual está incorporado por referência em sua totalidade.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO

[003] A invenção refere-se à polinucleotídeos que codificam um fator de transcrição HaHB4 modificado e polinucleotideos que codificam fragmentos e variantes funcionalmente ativos de um fator de transcrição HaHB4 modificado bem como vetores e células hospedeiras contendo esses polinucleotídeos e os polipeptideos codificados por esses polinucleotídeos. A invenção também engloba células . hospedeiras transgênicas [incluíndo cêlulas de plantas), plantas, semente, pólen, e partes da planta contendo os polipeptídeos e/ou polinucleotídeos da invenção. A invenção ainda engloba métodos de produção de células hospedeiras transgênicas, plantas, semente, pólen, e partes da planta e os produtos vegetais processados a partir desses hospedeiros transgênicos,

TÉCNICA ANTERIOR

[004] DO homeodomínio é geralmente conhecido por ser um motivo de ligação de DNA conservado de 61 amincácidos presentes em um subconjunto de fatores de transcrição 1 eucarióticos que está envolvido nos processos de regulação do desenvolvimento em organismos maiores lGehring, Science 236: Ú 1245-1252 (1987)). Os genes que codificam o homeodomínio contendo proteínas foram isolados de muitos organismos eucarióticos incluíndo fungos, mamíferos e plantas (Gehring et al., Anúu. Rev. Biíochem. 63:487-526 (1994)). Entretanto, os dgeênes que codificamm as proteinas que contêm um homeodomínio associado com uma proteína interagindo com domínio de fecho de leucina (frequentemente referido como proteínas HD-Zip) têm de ser, até o momento, apenas encontrados em plantas. Acredita-se que as proteínas de fecho i 3/107 de leucina do homeodomínio estão geralmente envolvidas nos processos de regulação do desenvolvimento associados com a resposta de plantas para condições ambientais (Chan et al., Biochim. Biophys. Acta 1442(1):1-19 (1998), Carabelli et al., Plant J. 4:469-479 (1993); Schena et al., Genes Dev. 7:367- 379 41993)).

[005] HaHBAá ê um fator de transcrição de i girassol (Helianthus annuus) que pertence à subfamília I das : proteínas HD-Zip e compartilha cerca de 50% da identidade da sequência de aminoácido dentro do homeodomínio com outros membros dessa subfamília, com a exceção dos fatores de transcrição de Arabidopsis thalianma AtHB7 e AtHBl2, que compartilham 60% e 53% de identidade, respectivamente com à sequência de homeodomínio HaHB4 correspondente, HaHBA é endogenamente expresso em níveis muito baixos em plantas de girassol cultivadas em condições ambientais controladas e normais. Acredita-se que à regulação alta da expressão de HaHB4 endôgeno em disponibilidade de áqua limitada e mediante exposição ao ácido abscísico (ABA) conduz à uma tolerância 7 aumentada à planta girassol para estresse hídrico. Similarmente, Arabidopsis thaliana transgênica expressando HaHBA recombinante relatou demonstrar tolerância aumentada para condições de escassez de água (estiagem). Em particular, o documento de Patente Norte-Americana nº 7.674,955 divulga que as plantas Arabidopsis thaliana transgênicas superexpressando HaHB4 exibem tolerância à estiagem como comparado à variedade tipo selvagem da planta Arabidopsis thaliana sob as mesmas condições. Entretanto, o documento de Patente Norte-Americana nº 7.674.955 não divulga os fatores de transcrição HaHB4 modificados descritos aqui, Ou à produtividade aumentada de plantas transgênicas contendo esses fatores de transcrição HaHB4 modificados sob as condições de escassez de água e não escassez de áqua como comparado à variedade tipo selvagem das plantas sob as mesmas condições.

[9006] O aumento da produtividade agrícola e a habilidade das culturas em tolerar uma faixa mais ampla de condições ambientais apresentam duas abordagens para : enfrentar os maiores desafios enfrentados pela agricultura mundial na alimentação de uma população cada vez maior em recursos de terra arável que diminuem continuamente. Consequentemente, há uma necessidade de prover novas variedades de culturas e outras plantas que exibam produtividade de cultura aumentas e tolerância ao estresse ambiental.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[907] Acredita-se que HaHB4 seja um membro de uma subfamília de fatores de transcrição de planta que está envolvido nos processos de regulação do desenvolvimento - associados com a resposta de plantas para condições ambientais. A expressão geneticamente projetada de fator de , transcrição HaHB4 Helianthus annuvs em plantas transgênicas relatou melhorar a tolerância agronômica à estiagem e condições de salinidade. Não foi relatada melhora na produtividade em condições de crescimento padrão, mas leves penalidades na produção foram relatadãs quando a expressão de HaHB4 estava muito alta quando direciorada por um promotor constitutivo. Aqui é relatado o uso de sequências de HaHB4 modificado para à engenharia genética de plantas transgênicas com produtivídade aumentada. Mas particularmente, mediante sequenciamento dos transgenes HaHB4 do trigo, milho e linhagens de soja exibindo produtividades aumentadas, oS inventores determinaram surpreendentemente que os transgenes têm alterações de sequência distintas quando comparados à sequência de HaHB4 nativo (SEQ ID Nº: 2). Além disso, os inventores geraram uma sequência de HaHB4 modificado adicional contendo diferentes segmentos sobrepostos que codificam as proteínas de HaHB4 nativo e modificado.

[008] Consequentemente, em uma realização, a invenção refere-se aos polinucleotídeos que codificam um fator de transcrição HaHB4 modificado, o qual mediante expressão em plantas transgênicas, resulta em uma produtividade aumentada ou tolerância ao estresse ambiental quando cultivado em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado à uma variedade tipo selvagem de tal pianta cultivada em condições ambientais similares, Em uma realização adicional, a invenção refere-se a polinucleotídeos que codificam um fator de transcrição HaHB4 modificado, o qual mediante expressão em plantas 7 transgênicas, resulta em uma taxa de fotossíntese aumentada, A invenção também se refere a polinucleotídeos que codifícam Ú RaHB4 modificado (modHaHB4 (por exemplo, modlHaHB4, mod2HaHB4, mod3HaHB4 e mod4iHaHB4)) e polinucleotídeos que codificam fragmentos e variantes funcionalmente ativos de modHaHB4, bem como vetores e células hospedeiras contendo esses polinucleotídeos e as proteinas codificadas por esses polinucleotídecs,. A invenção também engloba células hospedeiras transgênicas (incluindo células de planta), plantas, sementes, pólen, e partes da planta contendo polipeptídeos e/ou polinucleotideos da invenção. Métodos de produção de células hospedeiras transgênicas, plantas, sementes, pólen, e partes da planta usando os polinucleotídeos da invenção e a semente, progenia e produtos de planta processados a partir dessas células hospedeiras transgênicas, plántas, sementes, pólen, e partes da planta também estão englobadas pela invenção.

[009] De acordo com à realização, à invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo : uma sequência de polinucleotídeo que codifica um fragmento ou variante de HaHB4 (SEQ ID Nº: 2) em que as plantas transgênicas contendo a molécula de ácido nucieico têm uma produtividade aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado à uma variedade tipo selvagem de controle de tal planta cultivada em condições ambientais similares. Em outra realização, à invenção é direcionada à uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotideo que codifica um fragmento ou variante de HaHB4 (SEQ ID Nº: 2) em que as plantas transgênica contendo à molécula de ácido nucleico têm . uma taxa de fotossíntese aumentada. Uma realização adicional é direcionada à uma molécula de ácido nucleico compreendendo i uma sequência de polinucleotideo que codifica um fragmento ou variante de HaHB4 (SEQ ID Nº: 2) em que as plantas transgênica contendo a molécula de ácido nucleico têm uma produtividade aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado às plantas transgênicas HaHB4 (SEQ ID Nº: 2) da mesma variedade, em que a expressão de HaHB4á recombinante está sob controle do mesmo promotor. Uma realização adicional é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídes que codifica um fragmento ou variante de HaHB4 (SEQ ID Nº: 2) em que as plantas transgênicas contendo a molécula de ácido nucleico têm uma taxa de fotossíntese aumentada.

Em outra realização, as moléculas de ácido nucleico da invenção compreendem uma sequência de polinucleotídeo que codifica a variante de HaHBA modlHaHB4 (HaHB4.2 (SEQ ID Nº: 4)) em que as plantas transgênicas i contendo à molécula de ácido nucleico têm uma produtividade ' aumentada quando cultivadas em condições de escassez de áqua ou não escassez de água como comparado à uma variedade tipo selvagem de controle de tal planta cultivada em condições ambientais similares.

Em outra realização, as moléculas de ácido nucleico da invenção compreendem uma sequência de polinucleotídeo que codificam a variante de HaHB4á modlHaHB4 (HaHB4.2 (SEQ ID Nº: 4)) em que as plantas transgênicas contendo a molécula de ácido nucleico têm uma taxa de fotossíntese aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado a uma variedade tipo selvagem de controle de tal planta cultivada ' em condições ambientais similares.

Uma adicional realização é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo Ú uma sequência de polinucleotícdeo que codifica um fragmento ou variante modiHaHB4 (HaHB4.2 (SEQ ID Nº: 4)) em que as plantas transgênicas contendo a molécula de ácido nucleico têm uma produtividade aumentada e/ou taxa de fotossíntese aumentada quando cultivadas em condições de escassez de áqua Ou não escassez de água como comparado às plantas transgênicas de HaHB4 (SEQ ID Nº: 2) da mesma variedade, em que à expressão de HaHB4 recombinante está sob controle do mesmo promotor, Uma realização adicional é direcionada à uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotideo que codifica um fragmento ou variante modlHaRB4 (HaHB4.2 (SEQ ID Nº: 4)) em que as plantas transgênicas contendo a molécula de ácido nucleico têm uma taxa de fotossíntese aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado às plantas transgênicas de HaHB4 (SEQ 1D Nº: 2) da mesma variedade, em que à expressão i de HaHB4 recombinante está sob controle do mesmo promotor.

' [0010] Em uma realização adicional, as moléculas de ácido nucleico da invenção compreendem uma sequência de polinucleotideo que codifíca a variante de HaHB4á mod2HaHB4 (HaHB4.3 (SEQ 1D Nº: 8)) em que as plantas transgênicas contendo a molêcula de ácido nucleico têm uma produtividade aumentada quándo cultivadas em condições de escassez de água Ou não escassez de água como comparado a uma variedade tipo selvagem de controle de tal planta cultivada em condições ambientais similares. Em uma realização adicional, as moléculas de ácido nucleico da invenção compreendem uma sequência de polinucleotídeo que codifica a variante de HaHB4 . mod2HaHB4 (HaHB4.3 (SEQ ID Nº: 8)) em que às plantas transgênicás contendo a molécula de ácido nucleico têm uma taxa de fotossíntese aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado a uma variedade tipo selvagem de controle de tal planta cultivada em condições ambientais similares. Outra realização é direcionada à uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica um fragmento ou variante mod2HaHB4 (HaHB4.3 (SEQ ID Nº: 8)) em que as plantas transgênicas contendo a molécula de ácido nucleico têm uma produtividade aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado às plantas transgênicas de HaHB4 (SEQ ID Nº: 2) da mesma variedade, em que a expressão de HaHB4 recombinante está sob contrele do mesmo promotor. Outra realização é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotideo que codifica um fragmento ou variante de mod?2HaHB4 (HaHB4.3 (5EQ ID Nº: 8)) em que as plantas : transgênicas contendo à molécula de ácido nucleico têm uma . taxa de fotossíntese aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado às plantas transgênicas de HaHB4 (SEQ ID Nº: 2) da mesma variedade, em que a expressão de HaHB4 recombinante está sob controle do mesmo promotor.

[0011] Em outra realização, as moléculas de ácido nucleico da invenção compreendem uma sequência de polinucleotídeo que codificam a variante de HaHB4 mod3HaHB4 (HaHB4,4 (SEQ ID Nº: 38)) em que as plantas transgênicas contendo à molécula de ácido nucleico têm uma produtividade aumentada e/ou taxa de fotossíntese aumentada quando 7 cultivadas em condições de escassez de água ou não ESCassez de água como comparado a uma variedade tipo selvagem de Ú controle de tal planta cultivada em condições ambientais similares. Outra realização é direcionada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica um fragmento ou variante de mod3HaHB4 (HaHBA4.4 (SEQ ID Nº: 38)) em que as plantas transgênicas contendo à molécula de ácido nmucleico têm uma produtividade aumentada e/ou taxa de fotossíntese aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado às plantas transgênicas de HaHB4 (SEQ ID Nº: 2) da mesma variedade, em que a expressão de HaHB4 recombinante está sob controle do mesmo promotor,

[0012] Em uma realização adicíonal, as molêculas de ácido mucieico da invenção compreendem uma sequência de polinucleotideos que codifica o HaHBAá variante modáHaHB4 (HaHB4.5 (SEQ ID Nº: 39)) em que as plantas transgênicas contendo a molécula de ácido nucleico têm uma produtividade | aumentada e/ou taxa de fotossíntese aumentada quando - cultivadas em condições de escassez de água Ou não escassez de água como comparado à uma variedade tipo selvagem de controle de tal planta cultivada em condições ambientais similares. Outra realização é direcionada a uma molécula de ácido nmucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica um fragmento ou variante de mod4iHaHB4 (SEQ ID Nº: 39) em que as plantas transgênicas contendo a molécula de ácido mnucleico têm uma produtividade aumentada e/ou taxa de fotossíntese aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado às plantas transgênicas de HaHB4 (SEQ ID Nº: 2) da mesma " variedade, em que à expressão de HaHB4 recombinante está sob controle do mesmo promotor.

i [10013] A invenção também provê uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica (a) a variante de HaHB4 modlHaHB4 (HaHB4.2 (SEQ ID Nº: 4)); (b) um fragmento funcionalmente ativo de modliHaHB4, em que a sequência de aminoácido do dito fragmerto não está presente na sequência correspondente de HaHB4 (SEQ ID NE: 2); ou (c) uma variante funcionalmente ativa de modlHaHBá (SEQ TD Nº: 4), em que a dita variante compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80%, 85%, 30%,

95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de amincácido da SEQ ID Nº: 4, e em que à sequência de aminoácido da dita variante não está presente na sequência correspondente de HaHB4 (SEQ ID Nº: 2). As moléculas de ácido nucleico isoladas compreendendo a sequência de polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 3, SEQ ID Nº: 12, SEQ ID Nº: 13, SEO ID Nº: 15 ou SEQ ID Nº: 16 ou à cadeia complementar da mesma, e fragmentos e variantes dessas moléculas de ácido nucleico que não estão presentes na . sequência de polinucleotídeo correspondente de HaHB4 (SEQ ID Nº: 1 e SEQ ID Nº: 18), também estão englobados pela invenção.

[0014] Em outra realização, à invenção provê molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polínucleotídeo que codifica (a) a variante de HaHB4 mod?2HaHB4 (HaHB4.3 (SEQ ID Nº: 8)); (bj um fragmento funcionalmente ativo mod2HaHB4, em que a sequência de aminoácido do dito fragmento não está presente na sequência correspondente de HaHB4 (SEQ ID Nº: 2); ou (Cc) uma variante funcionalmente ativa de mod?2HaHB4á (HaHB4,3 (SEQ ID Nº: 8)) em * que à dita variante compreende uma sequência de amincácido que é pelo menos 80%, 85%, 90%,95%, 96%, 97%, 968, ou 99% i idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID Nº: B; e em que a sequência de amincácido da dita variante não está presente na sequência correspondente de HaHB4 (SEQ ID Nº: 2). As moléculas de ácido nucleico isoladas compreendendo à sequência de polinucleotideo da SEQ TD Nº: 14 ou SEQ ID Nº: 17, ou a cadeia complementar da mesma, e fragmentos e variantes dessas moléculas de ácido nucleico que não estão presentes na sequência de polinmucleotídeo correspondente de

HaHB4 (SEG ID Nº: 1 e SEQ ID Nº: 18), também são englobadas pela invenção.

[0015] Em uma realização, a invenção provê uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica a variante de HaHB4 mod3HaHB4 (HaHB4.4 (SEQ ID Nº: 368)). Em outra realização, à invenção provê uma molécula de ácido mnucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica a variante de HaHB4 . mod4HaHB4 (HaHB4,.5 (SEQ ID Nº: 39)).

[0016] De acordo com algumas realizações, as variantes ou fragmentos de polipeptídeo funcionalmente ativos codificados pelos polinucleotídeos da invenção são capazes de ligar a sequência de DNA 5'-CAAT(A/TJATTG-3' (SEQ ID Nº: 11) in vitro. Em outra realização, às variantes ou fragmentos de polipeptídeo funcionalmente ativos codificados pelos polinucleotideos da invenção são capazes de ligar à sequência de DNA 5'-CAAT(A/T)ATTG-3' (SEQ ID Nº: 11) em uma solução consistindo em HEPES-NaOH a 20 mM (pH 7,6), KCl a 50 mM, MgCl; a 2mM, EDTA à 0,5 mM, DTT a 1,0 mM, 0,5% de Triton Xx- . 100, 10% de glicerol, e 1,0 ug de poli(dI-dc), a 24 ºC, Em outras realizações, as células de plantas transgênicas ' expressando as variantes ou fragmentos de polipeptídeo funcionalmente ativos da invenção têm um perfil de expressão de gene diferente das células de controle tipo selvagem (por exemplo, parental) de tecido comparável, em um estágio de desenvolvimento comparável e cultivo em condições comparáveis. Em outras realizações, as células de planta transgênica expressando os fragmentos ou variantes de polipeptideo funcionalmente ativos da invenção têm um perfil de transcrição diferentes das células transgênicas de HaHB4

| 13/107 de tecido comparável, em um estágio de desenvolvimento comparável, e cultivadas em condições comparáveis, e em que à expressão de HaHB4 transgênico está sob controle do mesmo promotõr como sequência de codificação de fragmento Ou variante de modHaHB4, Em realizações adicionais, as plantas transgênicas que expressam os fragmentos ou variantes de . polipeptideo funcionalmente ativos da invenção rêm uma produtividade aumentada quando cultivadas em condições de - escassez de água ou não escassez de água como comparado à uma variedade tipo selvagem de tal planta cultivada em condições ambientais similares.

Em realizações adicionais, as plantas transgênicas que expressam os fragmentos ou variantes de polipeptídeo funcionalmente ativos da invenção têm a taxa de fotossíntese aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado a uma varíedade tipo selvagem de tal planta cultivada em condições ambientais similares.

Em outras realizações, as plantas transgênicas que expressam 08 fragmentos ou variantes de polipeptídeo funcionalmente ativos da invenção têm Ú produtividade aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado às ] plantas transgênicas de HKHaHBiA cultivadas em condições ambientais similares, em que a expressão de HaHB4 transgênico e sob o controle do mesmo promotor como sequência de codificação do fragmento ou variante de modHaHB4. Em outras realizações, as plantas transgênicas que expressam os fragmentos ou variantes de polipeptídeo funcionalmente ativos da invenção têm taxa de fotossíntese aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado às plantas transgênicas de HaHB4 i 14/107 cultivadas em condições ambientais similares, em que à expressão de HaHB4 transgênico está sob o controle do mesmo promotor como sequência de codificação de fragmento cu variante de modHafiB4.

[10017] Os ácidos nucleicos, incluindo vetores e cassetes de expressão, compreendendo os polinucleotídeos da ' invenção operácionalmente associados com um promotor também estão englobados pela invenção. De acordo com algumas : realizações, os polinucleotídeos da invenção são operacionalmente associados com um promotor constitutivo, Em realizações particulares, o promotor constitutivo é o promotor 358 CaMV ou o promotor Ubil. De acordo com outras realizações, os polimucileotiídeos da invenção são operacionalmente associados com um promotor indutível. Em realizações particulares, o promotor indutível é uma versão modificada do promotor de HaHB4 fundido com 6 primeiro íntron do Arabidopsis Cox5c-2.

[0018] A invenção também engloba células hospedeiras compreendendo os ácidos nucleicos da invenção. As B células hospedeiras exemplares para uso de acordo com a invenção incluem, entre cutros, bactérias, fungos, insetos, células vegetais e animais. Em realizações particulares, a célula hospedeira é uma célula vegetal. De acordo com aigumas realizações, a célula hospedeira é uma célula vegetal monocotiledôênea, Em outras realizações, a célula hospedeira é trigo (Triticum aestivum), milho (Zea mays), Ou arroz (Oryza satíva). De acordo com outras realizações, a célula hospedeira é uma célula vegetal dicotiledônea. Em realizações particulares, a célula hospedeira é soja (Glycine max). Em realizações adicionais, a célula hospedeira é Arabidopsis (Arabidopsis thaliana).

[10013] As plantas transgênicas, semente, pólen, partes da planta, e células de planta transgênica compreendendo “sequências de polinucleotideo da invenção também estão englobadas pela invenção. Em uma realização, a planta transgênica, semente, pólen, parte da planta ou célula de planta transgênica compreende uma sequência de : polinucleotídeo que codifica modlHaHB4 (SEQ ID Nº: 4). Em outras realizações, o polinucleotídeó que codifica modiHaHB4 compreende uma sequência de polinucleotídeo selecionada de: SEQ ID Nº; 3, SEQ ID Nº: 12, SEQ ID Nº; 13, SEQ 1D Nº: 15 e SEQ ID Nº: 16. Em outra realização, a planta transgênica, semente, pólen, parte da planta ou célula de planta transgênica compreende uma sequência de polinucleoóotídeo que codifica mod2HaHB4 (SEQ ID Nº: 8). Em outras realizações, O polinucleotídeo que codifica mod2HaHBA compreende uma sequência de polinucleorídeo selecionada de SEQ ID Nº: 14 e SEQ ID Nº; 17.

- [0020] Em outra realização, a planta transgênica, semente, pólen, parte da planta ou célula de ' planta transgênica compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica mod3HaHB4 (SEQ ID Nº: 38). Em outra realização, a planta transgênica, semente, pólen, parte da planta ou célula de planta transgênica compreende uma sequência de polinucieotídeo que codifica modiHaHB4A (SEQ ID Nº: 39).

[0021] Em uma realização adicional, à invenção engloba uma planta transgênica, semente, pólen ou parte da planta compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica (a) modlHaHB4 (SEQ ID Nº: 4); (b) um fragmento funcionalmente ativo de modlHaHB4 (SEQ ID Nº: 4), em que à sequência de aminoácido do dito fragmento não está presente na sequência correspondente de HaHB4 (SEQ ID Nº: 2); ou (c) uma variante funcionalmente ativa de modlHaHdB4 (SEQ ID Nº: 4), em que a dita variante compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID Nº: : 4, E em que à sequência de aminoácido da dita variante não está presente na sequência correspondente de HaHB4 (SEQ LD Nê: 2).

[10022] Em óutra realização, a invenção engloba uma planta transgênica, semente, pólen ou parte da planta compreendendo uma sequência de polinuclectideo que codifica (a) mod2HaHB4 (SEQ ID Nº: B); (b) um fragmento funcionalmente ativo de mod?HaHB4, em que a sequência de amincácido do dito fragmento não está presente na proteína de HaHB4 (SEQ ID Nº: 2); ou (Cc) uma variante funcionalmente ativa de mod2HaHB4 (SEQ ID Nº: 8), em que a dita variante compreende uma - sequência de aminoácido que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 25%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de aminoácido da ' SEQ ID Nº: 8, e em que a sequência de aminoáoido do dito fragmento não está presente em HaHB4 (S5EQ ID Nº; 2).

[0023] Em outra realização, a invenção engloba uma planta transgênica, semente, pólen ou parte da planta compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica (a) mod3HaHB4 (SEQ ID Nº: 38); (b) um fragmento funcionalmente ativo de mod3HaHB4, em que a sequência de aminoácido do dito fragmento não está presente na proteína de HaHB4 (SEQ ID Nº: 2); ou (Cc) uma variante funcionalmente ativa de mod3HaHB4 (SEQ ID Nº: 36), em que a dita variante compreende uma sequência de amincácido que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de aminoácido de SEG ID Nº: 38, e em que a sequência de aminoácido do dito fragmento não está presente em HaHB4 (SEQ ID Nº: 2).

10024] Em outra realização, a invenção engloba uma planta transgênica, semente, pólen ou parte da planta : compreendendo uma seguência de polinucieotídeo que codifica mod4HaHB4 (SEQ TD Nº: 39).

[0025] De acordo com algumas realizações, as plantas transgênicas que expressam os polinucleotídeos da invenção têm produtividade aumentadá como comparado à variedade tipo selvagem da planta. Em outras realizações, as plantas transgênicas que expressam os polinuclectídeos da invenção têm produtividade aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água OU não escassez de água como comparado à variedade tipo selvagem da planta. Em outras realizações, as plantas transgênicas que expressam OS B polinucleotídeos da invenção têm taxa de fotossíntese aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado à variedade tipo selvagen da planta. Em realizações adicíonais, as plantas transgênicas que expressam os polinucleotídeos da invenção têm tolerância melhorada à um ou mais estresses ambientais como comparado à variedade tipo selvagem da planta. Os estresses ambientais, em resposta que as plantas transgênicas da invenção podem demonstrar tolerância melhorada, incluem, entre outros, estiagem, salinidade, estresse osmótico, exposição à temperatura fria, exposição ao calor,

| 18/107 disponibilidade reduzida de nutriente nitrogênio, disponibilidade reduzida de nutriente fósforo e alta densidade vegetal.

[0026] Em realizações adicionais, as plantas transgênicas que expressam polinucleotídeos da invenção têm produtividade aumentada como comparado a um HaHB4 transgênico da variedade de planta tipo selvagem correspondente, em que a expressão de HaHB4 recombinante está sob controle do mesmo promotor como os polinucleotídeos de codificação da invenção. Em outras realizações, as plantas transgênicas que expressam os polinucleotideos da invenção têm produtividade aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água Ou não escassez de água como comparado a um HaHB4 transgênico da variedade de planta tipo selvagem correspondente, em que a expressão de HaHB4 recombinante está sob controle do mesmo promotor como cs polinucleotídeos de codificação da invenção. Em cutras realizações, as plantas transgênicas que expressam os polinuclectídeos da invenção têm taxa de fotossíntese aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ' Ou não escassez de água como comparado à um HaHB4 transgênico da variedade de planta tipo selvagem correspondente, em que a expressão de HaHB4 recombinante está scb controle do mesmo promotor como os polinucleotídeos de codificação da invenção. Em realizações adicionais, as plantas transgênicas que expressam os polinucleotídeos da invenção têm tolerância melhorada a um Ou mais estresses ambientais como comparado a um HaHB4 transgênico da variedade de planta tipo selvagem correspondente,

[0027] De acordo com algumas realizações, a planta transgênica, semente, ou parte da planta

| 19/107 monocotiledênea, Em algumas realizações, a planta transgênica, semente, ou parte da planta é trigo (Triticum aestivum). Em realizações adicionais, a planta transgênica, semente, ou parte da planta é milho (Zea mays)., Em outras realizações, a planta transgênica, semente, ou parte da planta é arroz (Oryza sativa). Em realizações adicionaís, à planta transgênica, semente, ou parte da planta da invenção é uma dicotiledôênea. Em algumas realizações, a planta ' transgênica, semente, ou parte da planta é soja (Glycine max). Em realizações adicionais, a planta transgênica, semente, ou parte da planta é Arabidopsis thaliana, A semente e à progenia das células de planta transgênica e plantas transgênicas também estão englobadas pela invenção, como estão a semente e os produtos vegetais processados a partir dessas plantas transgênicas, sua semente, e sua progenia.

[0028] A invenção também está direcionada aos métodos de produção de hospedeiros transgênicos, incluindo, entre outros, bactérias, fungos, é células de planta, e plantas transgênicas compreendendo os pclinucleotídeos da . invenção. A progenia e semente das células hospedeiras transgênicas e plantas transgênicas produzidas de acordo com ' esses métodos, bem como os produtos vegetais processados produzidos a partir desses hospedeiros transgênicos, sua semente, e sua progenia. 10029) BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS/FIGURAS

[0030] A figura 1A provê um alinhamento entre oO fator de transcrição HaHB4 (SER ID Ni: 2), fator de transcrição HaHB4 modificado 1 (modlHaHB4/HaHB4.2 (SEQ ID Nº: 4); e fator de transcrição HaHB4 modificado 2 (mod2HaHB4 (SEQ ID Nê: 8)). A região de fecho de homeodomínio-leucina é

| 20/107 embalada. A figura 1B provê alinhamento entre o fator de transcrição HaHB4 (HaHB4.1 (SEG ID Nº: 2));, modliHaHB4 (HaHB4.2 (SEQ ID Nº: 4)); mod2HaHB4 (HaHB4.3 (SEQ ID Nº: 8)); mod3HaHB4 (HaHB4.4 (SEQ ID Nº: 38)); e mod4HaHB4 (HaHB4.5 (SEQ ID Nº: 39)).

[0031] As figuras 2A-2J proveem uma representação esquemática de vetores exemplares e construtos mencionados na aplicação para transformar as células hospedeiras com os polinucleotiídeos da invenção. As figuras 2A-C representam construtos pGmHaHB4d.2, PGMmMPrHB4,2, e pGmPrInNnHB4.2, respectivamente, que têm aplicações na transformação de soja e outras plantas. A figura 2D D-G representa construtos pPpTaBAR, pTaHaHB4.2, pTaPrHB4.2, e pTaPrInHB4.2, respectivamente, que têm aplicações na transformação do trigo e outras plantas, As figuras 2H-J representam construtos pZmHaHB4.2, pZMPrHBA, e pzmPrInHBA4.2, respectivamente, que têm aplicações na transformação de milho e outras plantas. Abreviações: aadA (gene aminoglicosídeo 3'- adenililtransferase de Ss. flexneris 2a que confere resistência ao antibiótico estreptomicina), bar (gene fosfinotricina acetil transferase de S. hygroscopicus que ' confere resistência ao herbicida fosfinotricina e seus derivados), P35S (o promotor 35S do vírus mosaico da couve- flor), Tnos (NOS-Term; terminador 3' do gene nopalina sintase de A. tumefaciens); Tvsp (terminador 3' de gene de proteina de armazenamento vegetativa de soja), TEV (intensificador de translação do Tobacco Etch Virus); RB (fragmento da borda direita de T-DNA a partir da cepa nopalina de A, tumefaciens); LB (fragmento da borda esquerda de T-DNA a partir da cepa nopalina de A, tumefaciens); pVSl1 (plasmídeo com ampla faixa de hospedeiro de Pseudomonas); AmMpR (gene resistente à ampicilina); KanR (gene resistente à Kanamicina); ori (replicação com origem em bactérias); HaHB4.2 (sequência de HaHB4 modificado como descrito na Seção de Exemplos (inserção pTHaHB4.20c); LPF (promotor HaHB4 com modificações descritas na Seção de Exemplos); e íntron COX5c- 2 (primeiro íntron do gene COX5c-2).

[10032] As figuras 3A-3D proveem gráficos em barra indicando melhora na produtividade em culturas transgênicas em condições de campo irrigado (sem limitações de água em condições de não escassez de água) em um ambiente de alta produtividade. As figuras 3A-3B descrevem dados de milho transgênico indicando produtividade do grão (kg/ha) correspondendo a duas linhagens de milho transgênico Hhomozigoto expressando constiturivamente HaHB4.2 (SEQ ID Nê: 4) e milho de controle tipo selvagem (WT). Os dados foram coletados a partir de lotes de campo replicados em duas localizações com diferentes tipos de solo: em um solo argiloso sedimentoso com 626 mm de chuva recebida durante o período de cultivo (Figura 3A), e em um solo argiloso sedimentoso bem drenado com 545 mm de chuva recebida durante ' o ciclo da cultura (Figura 3B). A figura 3C descreve dados de trigo transgênico indicando a produtividade do grão (kg/ha) correspondendo a uma linhagem de trigo transgênico homozigoto expressando constitutivamente HaHB4.2 (SEQ ID NÉ: 4) e trigo de controle tipo selvagem (WT). Os dados na figura 3C foram obtidos a partir de lotes de campo replicados em uma localização com solo arenoso bem drenado (pH 7,14%, OM 1,57%). A irrigação suplementar foi aplicada para prover 755 mm de água durante 0 ciclo da cultura. A figura 3D provê dados de soja transgênica indicando produtividade do grão (kg/ha) correspondendo a duas linhagens de soja transgênica homozigota expressando constitutivamente HaHB4.2 (SEQ ID Nº: 4) e soja de controle tipo selvagem (WT). Os dados na figura 3D foram obtidos a partir de lotes de campo replicados na localização com solo arenoso (pH 5,99%, OM 1,418). A irrigação suplementar foi aplicada para prover 579 mm de áqua ] durante o cicio de cultura.

[0033] A figura 4 provê um gráfico em barras indicando atividade de transativador de vários HaHB4 modificados em um simples ensaio híbrido de levedura.

[0034] A figura 5 provê um gráfico em barras indicando a taxa de fotossíntese em dois experimentos independentes de plantas Arabidopsis transformadas com um cassete de expressão contendo o promotor 358 constitutivo operacionalmente associado com sequência de ácido nucleico que codifica modifiaHB4 (HaHB4.2 (SEQ ID Nê: 4) (isto é,

358.H4,.2), (0035) DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO ' [0036] DEFINIÇÕES

[0037] A menos que definido de outra forma, S todos os termos técnicos e científícos usados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido pelo técnico no assunto ao qual pertence essa invenção. No caso de conflito, o presente pedido de patente incluíndo as definições controlará. Também, à menos que requerido de outra forma pelo contexto, os termos singulares devem incluír pluralidade e termos “plurais devem incluir o singular. Todas às publicações, patentes e outras referências mencionadas aqui são incorporadas por referência e suas totalidades.

[0038] O termo “polinucleotídeo” destina-se à englobar uma molécula de ácido nucleico singular bem como qualquer um ou mais segmentos de ácido nucleico, por exemplo, fragmentos de DNA ou RNA, presentes em uma molécula de ácido nucleico, e se refere à uma molécula ou construto de ácido nucleico isolado (por exemplo, vetor), por exemplo, RNA mensageiro (mMRNA) ou DNA plasmídeo (pDNA) referindo-se à um S polinucleotídeo da invenção, Os termos “ácido nucleico” e : “polinucleotídeo” são usados alternadamente aqui. Por ácido nucleico ou polinucleotiídeo “isolado” entende-se molécula de ácido mucleico, DNA ou RNA, o qual foi removido de seu ambiente natural. Por exemplo, um polinucleotídeo isolado inclui polinucleotídeos recombinantes mantidos em células hospedeiras heterólogas ou purificadas (parcial ou substancialmente) polinucleotíideos em solução. As moléculas de RNA isoladas incluem transcritos de RNA in vivo ou ip vitro de polinucleotídeos da presente invenção. Além disso, um polinucleotíideo ou um ácido nucleico pode ser ou pode incluir um elemento regulador tal como um promotor, local de 7 ligação de ribossoma ou um terminador de transcrição.

[9039] Como usado aqui, uma “região de ' codificação” é uma porção de molécula de ácido nucleico que consiste em códons traduzidos em aminoácidos. Embora um “códon de terminação” (TAG, TGA, ou TAA) não seja traduzido em um aminoácido, ele pode ser considerado como parte de uma região de codificação, mas quaisquer sequências de flangueamento, por exemplo, promotores, locais de ligação de ribossoma, terminadores de transcrição, íntrons e similares, não são parte de uma região de codificação. Além disso, um vetor, polinucleotídeo, ou ácido nucleico da invenção pode codificar regiões de codificação heterólogas,.

[0040] Em certas realizações, o polinucleotídeo ou ácido nucleico é DNA, No caso do DNA, um polinucleotídeo compreendendo um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo pode incluir um promotor e/ou outros elementos de controle de transcrição ou tradução operacionalmente associados com uma ou mais regiões de codificação. Uma associação operável é ' quando uma região de codificação para um produto de gene, por exemplo, um polipeptídeo, está associado com uma ou mais sequências regulatórias de tal modo a colocar a expressão do produto de gene sob a influência ou controle da(s) sequência(s) regulatória(s). Dois fragmentos de DNA (tais como uma região de codificação de polipeptídeo e um promotor associado a ela) são “operacionalmente associados” ou “operacionalmente ligados” se indução da função do promotor resulta na transcrição do mRNA que codifica o produto de gene desejado e se a natureza da ligação entre os dois fragmentos de DNA não interfere na habilidade das sequências : regulatórias de expressão para direcionar a expressão do produto de gene ou interferir na habilidade do modelo de DNA " a ser transcrito. Assim, uma região do promotor estaria operacionalmente associada com um ácido nucieico que codifica um polipeptides se o promotor for capaz de efetuar a transcrição daquele ácido nucleico. Geralmente, operacionalmente ligado significa que as sequências de polinucleotídeo que são ligadas são contíguas e, onde necessário unir duas regiões de codificação de proteína, contíguas e no quadro de leitura de modo a produzir uma “proteína de fusão.” Uma “proteína de fusão” é uma proteina compreendendo sequências de aminoácido derivadas de dois ou mais polipeptídeos heterólogos.

[0041] O termo “promotor”, como usado aqui, refere-se a um fragmento de ácido nucleico regulatório que funciona para controlar a transcrição de um ou mais genes, localizados a montánte com relação à direção da transcrição do local de iniciação da transcrição do gene, e é estruturalmente identificado pela presença de um local de . ligação para locais de iniciação de transcrição de RNA polimerase dependente do DNA e quaisquer outras sequências de DNA, incluindo, entre outros, locais de ligação do fator de transcrição, locais de ligação de proteína repressores e ativadores, e qualquer outra sequência de polinucleotídeo conhecida na técnica para agir direta ou indiretamente para regular a quantidade de transcrição do promotor.

[0042] Um “promotor de planta” é um promotor capaz de iniciar à transcrição em cêlulas de planta se sua origem for ou não uma célula de planta, por exemplo, se for bem conhecido que os promotores de Agrobacterium são funcionais em células de planta. Consequentemente, os promotores de planta incluem sequências de DNA do promotor : derivadas de plantas, vírus de planta e bactérias tais como Agrobacterium, Exemplos de promotores sob controle de desenvolvimento incluem promotores que preferencialmente ou apenas iniciam a transcrição em certos tipos de célula ou tecidos, tais como folhas, raízes ou sementes; e promotores que são “induzíveis” ou “reprimíveis” em condições ambientais incluindo, por exemplo, condições anaeróbicas, exposição a certos produtos químicos e variações na exposição à luz. Os promotores da invenção incluem promotores “constitutivos” que são ativos na maioria dos tecidos sob a maior parte das condições fisiológicas e de desenvolvimento e promotores “não constitutivos” ou “induzíveis” em desenvolvimento (por exemplo, por aplicação externa de certos compostos) Cu fisiologicamente regulados. Exemplos de promotores constitutivos aqui revelados incivem, entre outros, o promotor 358 CaMV (vide, por exemplo, pGmHaHB4.2 (Figura 2A), e pZzmHaHB4.2 (Figura 2H), e promotor Ubi (vide, por exemplo, . pTaHaHB4.2 (Figura. 2E), Exemplos de promotores induzíveis úteis de acordo com a invenção também são aqui revelados e incluem, entre outros, um promotor HaHB4 modificado (vide, por exemplo, pGmPrHB4.2 (Figura 2B), pTaPrHB4.2 (Figura 2FE), e pzMPrHB4.2 (Figura 21) e um promotor induzível composto de uma versão modificada do promotor HaHB4 fundido com o primeiro intron do gene de Arabidopsis Cox5c-2 ívide, por exemplo, pGmPrinHB4.2 (Figura 2C), e pTaPrInHB4,2 (Figura 2G), é pzmPrIinHB4a.2 (Figura 20).

[0043] As “sequências regulatórias” ou “elementos regulatórios” referem-se à sequências de nucleotideo localizadas à montante (sequências de não codificação 5" ), dentro, ou a jusante (sequências de não , codificação 3” ) de uma sequência de codificação, e que influencia à transcrição, processamento ou estabilidade do RNA, ou tradução da sequência de codificação associada. As sequências regulatórias podem incluir promotores, intensificadores, operadores, repressores, sinais de terminação de transcrição, sequências líder de tradução, íntrons, sequências de reconhecimento de poliadenilação, local de processamento de RNA, local de ligação efetora e estrutura de stem-loop.

[0044] os termos “plasmideo” e “vetor” e “cassete de expressão” são usados alternadamente aqui e referem-se a um elemento cromossômico extra que frequentemente carrega genes que não são parte do metabolismo central da célula. Tais elementos podem ser sequências autônomas de replicação, sequências de integração do genoma, sequências de fago ou nucleotídeo, lineares ou circulares, de um DNA ou RNA de cadeia única ou dupla, derivadas de qualquer fonte, em que várias sequências de nucleotídeo se uniram ou forma recombinadas em uma única construção que é capaz de introduzir um fragmento de promotor e sequência de DNA para um produto de gene selecionado junto de uma sequência não traduzida 3' apropriada em uma célula. Qualquer vetor incluindo um plasmídeo, cosmídeo, fago ou vetor binário de Agrobacterium na forma linear ou circular de cadeia simples ou dupla que pode ou não ser autotransmissível ou mobilizável, e que pode transformar hospedeiro procariótico ou eucariótico tanto por integração no genoma celular ou existir extracromossomicamente (por exemplo, um plasmídeo de replicação autônomo com uma origem de replicação) pode ser usado na prática dos métodos e fazer as composições da invenção. Especificamente incluídos estão os vetores de transporte que se entende por um veículo de DNA capaz de replica, naturalmente ou por projeto, em dois organismos hospedeiros diferentes, que podem ser selecionados de, por exemplo, bactéria, plantas maiores, leveduras ou células fúngicas.

[0045] Alternativamente, o termo “cassete de expressão” pode se referir a um fragmento de ácido nucleico que expressa uma ou mais proteínas específicas, incluindo sequências “regulatórias precedendo (sequências de não codificação 5" ) e seguindo (Sequências de terminação 3' ) sequências de codificação para as proteínas,

[0046] Como usado aqui, o termo “transformação” refere-se à transferência de um ácido nucleico em um organismo hospedeiro, resultando em herança geneticamente estável. Os organismos hospedeiros contendo os fragmentos de Ú ácido nucleico transformados são referidos como organismos . “transgênicos” ou “recombinantes” ou “transformados”,

[0047] Os termos “expressar” ou “expressão”, como usados aqui, referem-se à transorição e acúmulo de RNA sentido (mMRNA) ou antissentido derivado do fragmento de ácido nucleico da invenção. À expressão também pode ser referir à tradução de mRNA em um polipeptídeo. O processo inclui qualquer manifestação da presença funcional do polinucleotídes expresso, gene, ou polipeptideo dentro da célula incluindo, sem limitação, gene knockdown bem como expressão transitória e expressão estável.

[0048] Como usado aqui, o termo “polipeptiídeo” : destina-se a englobar um “polipeptídeo” singular bem como “polipeptiídeos” plurais, e refere-se a uma molécula composta i de monômeros (amincácidos) linearmente ligados por ligações de amida (também conhecidas como ligações de peptídeo). O termo “polipeptídeo” refere-se a qualquer cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, e não se refere a um comprimento específico do produto ou forma do produto pós- traduocionalmente modificada. Os termos “polipeptídeo” e “proteína” são usados alternadamente aqui.

[0049] Como usado aqui, o termo “célula hospedeira” refere-se à qualquer tipo de sistema celular que pode ser projetado para expressar os polipeptídeos da invenção. As células hospedeiras incluem células cultivadas, células de levedura, células de inseto, células de planta e células de mamíferos, para citar apenas alguns, bem como células compreendidas dentro de um organismo transgênico, tal como uma planta transgênica, ou tecido da planta cultivada.

10050] Como usado aqui, o termo “planta” inclui referência às plantas inteiras, partes da planta (por . exemplo, folhas, caules, raízes etc.), sementes, pólen e células de planta e progenia do mesmo, A célula da planta, como usada aqui, inclui, sem limitação, sementes, culturas de suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, folhas, raízes, brotos, gametófitos, esporófitos, pólen, e micrésporos.

[0051] Como usado aqui, uma “célula de planta transgênica” significa uma célula de planta que é transformada com uma sequência de polinucieotídeo estavelmente integrada da invenção ou alternativamente, com um vetor de replicação autônomo contendo uma sequência de polinucleotídeo da invenção. o termo “estavelmente integrado”, como usado aqui, refere-se aos polinucleotídeos i que são cromossomicamente integrados, geneticamente estáveis e hereditários pela progenia através de sucessivas gerações. Os métodos para transformar as células de planta são descritos aqui ou conhecidos de outra forma na técnica e incluem, entre outros, transformação mediada por Agrobacterium, eletroporação, e bombardeamento com micropartículas revestidas com DNA. As células de planta transgênica da invenção incluem célula de plantas originalmente transformadas que existe como uma cultura de célula ou organismo, uma célula de planta de progenia presente no tecido regenerado e/ou diferenciado, tal como uma planta transgênica com sequências de polinucleotiídeo estavelmente integradas, recombinantes não naturais da invenção. As células de planta transgênica também incluem semente ou pólen derivados de uma progenia de planta transgênica. Para as finalidades da invenção, os termos “grão,” “semente” e “núcleo” são usados alternadamente.

. [0052] Como usado aqui, “planta transgênica” inclui referência a uma planta, que compreende dentro de seu genoma um polínucleotideo da invenção. Geralmente, o polinucleotídeo da invenção está estavelmente integrado dentro do genoma do hospedeiro de modo que o polinucleotídeo seja passado para sucessivas gerações, O polimucleotídeo heterólogo pode ser integrado no genoma sozinho ou como parte de um cassete de expressão recombinante. “Transgênico” é usado aqui para incluir qualquer célula, linhagem de célula, calo, parte da planta ou planta, contendo um polimucleotídeo da invenção incluindo aqueles transgênicos que são - inicialmente alterados bem como aqueles criados por cruzamentos sexuais ou propagação assexuada a partir do transgênico inicial,

[0053] Como usado aqui, o termo “funcionalmente ativo” refere-se a polinucleotídeos e polipeptídeos (incluindo fragmentos e variantes) capazes de exibir pelo menos uma atívidade funcional de HaHBiá ou um fator de transcrição HaHB4 modificado, Em uma realização, um polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção (incluindo fragmentos e variantes) é capaz de ligar à sequência de DNA S' -CABTIA/T)ATTG-3' (SEQ ID Nº: 11) in vitro. Em outras realizações, os polipeptídeos funcionalmente ativos da invenção são capázges de ligar a sequência de DNA 5'- CAAT(A/T)ATTG-3' (SED ID Nº; 11) em uma solução consistindo em HEPES-NaO0H a 20 mM (ph 7,6), KCl a 50 mM, MogCl; a 2mM, EDTA a 0,5 mM, DIT a 1,0 mM, 0,5% de Triton X-100, 10% de glicerol, e 1,0 pq de poli(ídi-dC), a 24 ºC.

Os ensaios de ligação do DNA que podem ser usados para ldentificar os i polipeptídeos funcionalmente ativos que codificam pelos polinucleotídeos da invenção são conhecidos na técnica e podem ser aplicados rotineiramente ou modificados conforme necessário.

De acordo com um exemplo, a presença de proteínas de ligação de DNA HaHB4 modificado funcional pode ser ensaiada por um ensaio de desvio da mobilidade eletroforética (EMSA) usando um oligonucleotídeo de cadeia dupla sintético compreendendo a sequência 5'-CAATIA/T)ATTG-3' (SEQ ID Nº: 11). Por exemplo, as proteínas bacterianas purificadas (por exemplo, E, colil ou proteínas nucleares de célula de planta purificada podem ser incubadas com DNA de cadeia dupla radiomarcado contendo a sequência 7 5" -AATTCAGATCTCAATAATTGAGAG-3" (SEQ ID Nº: 36) e 5" -GATCCTCTCAA TTATTGAGATCTG-3' (SEQ ID Nº: 37) no meio de i ligação contendo HEPES-NaOH a 20 mM (pH 7,6), KCl a 50 mM, EDTA a 0-2 mM, ditiotreitol a 1,0 mM (DTT), 0,5% de Triton X- 100, 20% de glicerol, e 1,0 ug de poliídI-dC), por 20 min a 25º C, suplementado com 2,5% (p/v) de Ficoll e à reação resultante é então carregada em um gel de acrilamida e subsequentemente avaliada para alterações na mobilidade do DNA no gel que funciona como um resultado da ligação do DNA.

Outras técnicas é ensaios para avaliar à ligação dos fatores de transcrição para motivos de sequência de DNA, e às afinidades de ligação das proteínas para DNA são conhecídas na técnica.

[0054] Em outra realização, um polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção (incluindo fragmentos e variantes) liga uma ou mais proteínas de planta hospedeira endógena diferente em condições fisiológicas do fator de transcrição HaHB4 (SEQ ID Nº: 2), Em algumas realizações, um i polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção é capaz de ligar uma proteína de planta hospedeira endógena que não é ligada pela porção de polipeptídeo correspondente de HaHB4, Em outras realizações, um polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção não é capaz de ligar uma proteina de planta hospedeira endógena que é ligada pela porção de polipeprídeo correspondente de HaHB4., Os métodos e materiais para determinar a interação proteina-proteina incluindo, por exemplo, a levedura de dois sistemas híbridos, são conhecidos na técnica e podem ser rotineiramente adaptados e aplicados para avaliar as interações de proteina-proteína dos polipeptídeos da invenção. Em uma realização, um polipeptídeo ' funcionalmente ativo da invenção (incluindo fragmentos e variantes) liga uma ou mais proteínas Arabidopsis thalíana diferentes em condições fisiológicas do fator de transcrição HaHB4 (SEQ ID Nº: 2). Os métodos exemplares úteis na análise das interações de proteiína-proteína entre um polipeptídeo da invenção e proteinas Arabidopsis thaliama, incluem oO protoplasmo de dois sistemas híbridos Arabidopsis (PZ2H) revelados em Ehlert et al., Plant J. 46:890-900 (2006).

[0055] Em realizações adicionais, uma célula hospedeira contendo um polinucleotideo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção (incluindo fragmentos e variantes) exibe um perfil de transcrição diferente como comparado a um controle (por exemplo, genótipo tipo selvagem) não contendo os políinucleotídeos ou polipeptídeos da invenção. Em uma realização, uma célula hospedeira contendo um polinucleotideo ou polipeptiídeoc funcionalmente ativo da invenção exibe um perfil de transcrição diferente sob estiagem, condições de salinidade ou exposição ao etileno, ' como comparado a um controle (por exemplo, genótipo tipo selvagem) não contendo os polinucleotídeos ou polipeptiídeos da invenção.

[0056] As análises do perfil de transcrição podem ser realizadas usando reagentes e técnicas conhecidas na técnica. Tais técnicas incluem, entre outras, microarranjos, RT-PCR, proteção RNAsºe, análise Northern e Western, O perfil de expressão, geralmente por análise de micromatriz, pode ser usado para medir simultaneamente diferenças ou induzir mudanças na expressão de muitos genes diferentes. As técnicas para análise de micromatriz e outras técnicas para avaliar a expressão de uma sequência de - codificação, tal como Northern, Western, PCR, e análise de proteção de RNàse são conhecidas na técnica (Schena et al., Ú Science 270:467-470 (1995); Baldwin et al., Curr. Opin. Plant Biol. 2/2):96-103 (1999); Dangond F, Physiol. Genomics 2;:53- 58 (2000); van Hal et al., J. Biotechnol. 78:271-280 (2000); Richmond and Somerville, Curr. Opin. Plant Biol. 3:108-116 (2000); Almoguera et al., Plant Mol. Biol. 19:781-792 (1992); and Ausubel et aàal., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY.

[0057] Em uma realização, a análise do perfil de transcrição é realizada nas plantas transgênicas Arabidopsis thaáliana, partes da planta, ou células de planta da invenção. Os métodos exemplares úteis nas análises de perfil de transcrição das plantas transgênicas, partes da planta, OU célula de plantas da invenção são providos em Manavella et al., Plant Journal 48:125-137 (2006) e Hilson er al., Gen. Res. 14:2176-2189 (2004); cada qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade. Por exemplo, de acordo com um ' método, a análise de transcriptoma é realizada usando uma ' matriz CATMA contendo 24.576 tags específicos de gene de Arabidopsis thaáliana. Nos métodos adicionais, o RT-PCR em tempo real é realizado usando iniciadores de oligonucleotídeo projetados usando as sequências disponíveis publicamente (vide, por exêmplo, Arabidopsis.org; e Crowe er aál., Nucl. Acids. Res. 31:156-158 (2003)).

[0058] Em uma realização adicional, uma célula hospedeira contendo um polinuclestideo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção exibe um perfil diferente de transcrição ou expressão de mRNA ou proteína selecionada do grupo consistindo em LOX2, CSDl, ERF2, ERF5, ACO, SAM, EINI, ' e EIN3, como comparado a um controle (por exemplo, genótipo tipo selvagem) não contendo os polinucieotídeos ou polipeptídeos da invenção. Em uma realização adicional, uma célula hospedeira contendo um polinucleotídeo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção (incluindo fragmentos & variantes) exibe um perfil de transcrição diferente como comparado a uma célula hospedeira HaHB4 transgênica expressando HaHB4 (SEQ ID Nº: 2) sob o mesmo promotor. Em outra realização, uma célula hospedeira contendo um polinucleotídeo ou polipeptiídec funcionalmente ativo da invenção exibe um perfil de transcrição diferente sob condições de estiagem, condições de salinidade ou exposição ao etileno, como comparado a uma célula hospedeira HaHB4 transgênica expressando HaHB4 (SEQ ID Nº: 2) sob o mesmo promotor. Em uma realização adicional, uma célula hospedeira contendo um polimucleotideo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção exibe um mRNA de expressão diferente ou proteína selecionada do grupo consistindo em LOX2, CSCDl, ERF2, ERF5, ACO, SAM, EINI, e EIN3, como comparado a uma célula hospedeira HaHB4 transgênica expressando HaHB4 (SEQ ID Nº: 2) sob o mesmo promotor.

[0052] Em outra realização, uma planta transgênica contendo um polinucleotideos ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção (incluindo fragmentos e variantes) exite uma produtividade alterada quando comparado a um controle (por exemplo, genótipo tipo selvagem) não contendo os polinuclieotídeos ou polipeptídeos da invenção. Em outra realização, uma planta transgênica contendo um polinucleotíideo ou Ppolipeptideo fFuncionalmente ativo da invenção (incluindo fragmentos e variantes) exibe uma taxa de ' fotossíntese alterada quando comparado a um controle (por exemplo, genótipo tipo selvagem) não contendo os polinucleotídeos ou polipeptídeos da invenção. Em realizações particulares, uma planta transgênica contendo um polinucleotideo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção exibe uma produtividade aumentada quando comparado a um controle (por exemplo, genótipo tipo selvagem) não contendo os polinucleotídeos ou polipeptídeos da invenção. Em realizações particulares, uma planta transgênica contendo um polinucleotideo ou polipeptideo funcionalmente ativo da invenção exibe uma taxa de fotossíntese aumentada quando comparado a um controle (por exêmplo, genótipo típo selvagem) não contendo os polinucleotídeos ou polipeptídeos da invenção. Em realizações particulares, uma planta transgênica contendo um polinucleotídeo ou polipeptideo funcionalmente ativo da invenção exibe uma produtividade aumentada sob condições de não escassez de água quando comparado a um controle (por exemplo, genótipo tipo selvagem sob as condições de não escassez de água. Em realizações particulares, uma planta transgênica contendo um polinucleotideo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção exibe uma taxa de fotossíntese aumentada sob condições de não escassez de água quando comparado à um controle (por exemplo, genótipo tipo selvagem) sob às mesmas condições de não escassez de áqua.

[0060] Em uma realização adicional, uma planta transgênica contendo um polinucleotideo ou polipeptídeo funcionalmente arivo da ínvenção (incluindo fragmentos e variantes) exibe uma produtividade alterada quando comparado a uma planta transgênica expressando HaHB4 (SEQ ID Nº: 2) sob 1 o mesmo promotor, Em uma realização adicional, uma planta transgênica contendo um polinucleotideo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção (incluindo fragmentos e variantes) exibe uma taxa de fotossíntese alterada quando comparado a uma planta transgênica expressando HaHB4 (SEQ ID Nº: 2) sob 6 mesmo promotor.

[0061] Em realizações particulares, uma planta transgênica contendo um Ppolinucleotídeo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção exibe uma produtividade aumentada quando comparado a uma planta transgênica expressando HaHB4 (SEQ ID Nº: 2) sob o mesmo promotor. Em realizações particulares, uma planta transgênica contendo um polinucleotídeo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção exibe uma taxa de fotossíntese aumentada quando comparado à uma planta transgênica expressando HaHB4 (SEQ ID Nº: 2) sob o mesmo promotor.

[0062] Em algumas realizações, uma planta transgênica contendo um polinucleotideo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção exibe uma produtividade aumentada quando cultivadas em condições de não escassez de água como comparado a uma planta transgênica expressando HaHBA (SEQ ID Nº: 2) sob o mesmo promotor é sob as mesmas condições hídricas. Em algumas realizações, uma planta transgênica contendo um polinucleotideo ou polipeptideo funcionalmente ativo da invenção exibe uma taxa de fotossíntese aumentada quando cultivada em condições de não Escassez de água como comparado a uma planta transgênica expressando HaHB4 (SEQ ID Nº: 2) sob o mesmo promotor e sob as mesmas condições hídricas. Em algumas realizações, uma planta transgênica contendo um polinucleotídeo ou " polipeptideo funcionalmente ativo da invenção exibe uma produtividade aumentada quando oultivada em condições de escassez de água como comparado a uma planta transgênica expressando HaHB4 (SEQ ID Nº: 2) sob o mesmo promotor e sob as mesmas condições hídricas. Em algumas realizações, uma planta transgênica contendo um polinucleotídeo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção exibe uma taxa de fotossíntese aumentada quando cultivada em condições de escassez de água como comparado a uma planta transgênica expressando HaHB4 (SEQ ID Nº: 2) sob o mesmo promotor é sob as mesmas condições hídricas,

[0063] Em outras realizações, uma planta transgênica contendo um polinucleotideo ou polipeptídeo funcionalmentê ativo da invenção exibe uma produtividade aumentada quando cultivada em condições de escassez de água e não hídrico como comparado a uma planta transgênica expressando HaHB4 (SEQ ID Nº: 2) sob o mesmo promotor e sob . as mesmas condições hídricas. Em outras realizações, uma planta transgênica contendo um polinucleotídeo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção exibe uma taxa de fotossíntese aumentada quando cultivada em condições de escassez de água e não hídrico como comparado a uma planta transgênica expressando HaHB4á (SEQ ID Nº: 2) sob o mesmo promotor e sob as mesmas condições hídricas.

[10064] Em outras realizações, uma planta transgênica contendo um polinucleotideo ou polipeptídeo funcionalmente ativo da invenção exibe uma produtividade aumentada quando cultivada em condições de escassez de áqua ou não escassez de água como comparado à um controle (por exemplo, genótipo tipo selvagem) sob as mesmas condições ' hídricas. Em outras realizações, uma planta transgênica contendo um polinucleotídeo ou polipeptideo funcionalmente i ativo da invenção exibe uma taxa de fotossíntese aumentada quando cultivada em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado a um controle (por exemplo, genótipo tipo selvagem) sob as mesmas condições hídricas. Em realizações particulares, uma planta transgênica contendo um polinuclectídeo ou polipeptideo funcionalmente ativo da invenção exibe uma produtividade aumentada quando cultivada em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado à uma planta transgênica contendo HaHB4 (SEQ ID Nº:

2) sob o mesmo promotor e sob as mesmas condições hídricas. Em realizações particulares, uma planta transgênica contendo um polinucleotídeo ou polípeptideo funcionalmente ativo da invenção exibe uma taxa de fotossíntese aumentada quando cultivada em condições de escassez de água Ou não escassez de água como comparado a uma plánta transgênica contendo HaHB4 (SEQ ID Nº; 2) sob o mesmo promotor e sob as mesmas condições hídricas.

[9065] As realizações particulares são direcionadas aos métodos de uso dos polinucleotídeos da invenção para produzir uma planta que tenha uma produtividade aumentada em condições limitantes não hídricas, ou em condições de limitação de água e limitantes não hídricas, compreendendo as etapas de introdução de um polinucleotídeo da invenção em uma célula de planta hospedeira, seleção para a presença da molécula de polinucleotideo para produzir uma célula de planta transgênica, é regeneração de uma planta transgênica a partir da célula de planta transgênica, pelo que a planta transgênica tem uma produtividade aumentada em 7 condições limitantes não hídricas ou condições de límitação de água, quando comparado à uma planta tipo selvagem i comparável ou uma planta transgênica HaHB4 em que HaHB4 está sob controle do mesmo promotor. As realizações particulares são direcionadas aos métodos de uso dos polinucleotideos da invenção para produzir uma planta que tenha uma taxa de fotossintese aumentada em condições limitantes não hídricas, condições de limitação de água, ou em ambas as condições de limitação de água e limitantes não hídricas e, compreendendo as etapas de introdução de um polinucleotídeo da invenção em uma célula de planta hospedeira, seleção para a presença da molécula de polinucleotiídeo para produzir uma célula de planta transgênica, e regeneração de uma planta transgênica a partir da célula de planta transgênica, pelo que a planta transgênica tem uma taxa de fotossíntese aumentada em condições limitantes não hídricas ou condições de limitação de água, quando comparado a uma planta tipo selvagem ' comparável ou uma planta transgênica HaHB4 em que HaHB4 está sob controle do mesmo promotor.

[0066] Por um ácido nucleico ou polinucleotideo tendo uma sequência de nucleotídeo pelo menos, por exemplo, 95% “idêntica” a uma sequência de nucleotídeo de referência da presente invenção, pretende-se que a sequência de nucleotídeo do polinucleotídeo seja idêntica à sequência de referência, exceto que à sequência de polinucleotídeo pode incluir até cinco mutações de ponto por cada 100 nucleotídeos da sequência de nucleotideo de referência. Em outras palavras, para obter um polinucleotídeo que tenha uma sequência de nucleotideo pelo menos 95% idêntica a uma referência nucleotídeo sequência, até 5% dos nucleotídeos na Ú sequência de referência podem ser excluídos ou substituídos com outro mucleotideo, ou vários nucleotídeos até 5% dos nucleotídeos totais na sequência de referência podem ser inseridos na sequência de referência.

[0067] Como uma questão prática, se qualquer molécula de ácido mnucleico particular ou polipeptídeo for pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica a uma sequência de nucleotídeo ou sequência de polipeptídeo da presente invenção pode ser determinado usar convencionalmente programas de computador conhecidos. O termo “identidade percentual”, como conhecido na técnica, é uma relação entre duas ou mais sequências de polipeptídeo ou duas ou mais sequências de polinucleotídeo, conforme determinado pela comparação das sequências. Na técnica, “identidade” também significa o grau de relacionamento da sequência entre as sequências de polipeptídeo ou polinucleotídeo, como pode ser o caso, como determinado pela correspondência entre as cadeias de tais sequências, “Identidade” e “similaridade” : podem ser prontamente calculadas por métodos conhecidos, . incluindo, entre outros, aqueles descritos em; 1.) Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., Ed.) Oxford University: NY (1988); 2.) Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., Ed.) Academic: NY (1993); 3.) Computer Analysis of Sequence Data, Part 1 (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., Eds.) Humania: NJ (1994); 4.) Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., Ed.) Academic 11987); and 5.) Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereuz, J., Eds.) Stockton: NY (1991),

[9068] Os métodos preferidos para determinar a identidade são projetados para dar a melhor correspondência * entre as sequências testadas. Os métodos para determínar a identidade e similaridade são codificados em programas de ' computadores disponíveis publicamente. Os alinhamentos de sequência e cálculos de identidade percentual podem ser realizados usando o programa MegAlignfg do conjunto de computação de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI). Os múltiplos alinhamentos das sequências são realizados usando o “método de alinhamento Clustal” que engloba diversas variedades do algoritmo incluindo o “método de alinhamento Clustal VV” correspondente ao método de alinhamento marcado Clustal V (descrito por Higgins and

Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989); Higgins et al., Comput. Appl. Biosci., 8:189-191 (1992)) e encontrado no programa Megalignê? do conjunto de computação de bioinformáticai LASERGENE (DNASTAR Inc.). Para múltiplos alinhamentos, 098 valores padrão correspondem a GAP PENALTY=10 e GAP COMPRIMENTO PENALTY=10., Os parâmetros padrão para alinhamentos em pares e . cálculo de identidade percentual das sequências de proteína usando o método Clustal são KTUPLE=1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 - e DIAGONALS SAVED=5. Para ácidos nucleicos, esses parâmetros são KTUPLE=2, GAP PENALTY=5, WINDOW=4 e DIAGONALS SAVED=4,. Após o alinhamento das sequências usando o programa Clustal V, é possível obter uma “identidade percentual” através da visualização da tabela das “distâncias da sequência” no mesmo programa. Adicionalmente, o “método de alinhamento Clustal W" está disponível e corresponde ao método de alinhamento marcado Clustal W (descrito por Higgins and Sharp, CABIOS. 5;:151-153 (1989); Higgins et al., Comput. Appl. Biosci. 8:189-191(1992)) e encontrado no programa MegalignS v6.1 do conjunto de computação de bioinformática LASERGENE (DNASTAR ' Inc.). Os parâmetros padrão para múltiplo alinhamento (GAP BR PENALTY=10, GAP COMPRIMENTO PENALTY=0.2, Delay Divergen Segs (%)=30, Peso de Transição de DNA =0,5, Matriz de Feso da Proteína = Série Gonnet, Matriz de Peso do DNA =ITUB ). Após alinhamento das sequências usando o programa Clustal W, é possível obter uma “identidade percentual” através da visualização da tabela das “distâncias da sequência“ no mesmo programa,

[0069] Por um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido pelo menos, por exemplo, 95% “idêntica” a uma sequência de aminoácido de consulta da presente invenção,

Pretende-se que à sequência de aminoácido do polipeptídeo em questão seja idêntica à sequência de consulta, exceto que a sequência de polipeptideo em questão pode incluir até cinco alterações de amincácido por cada 100 aminoácidos da sequência de aminoácido de consulta, Em outras palavras, para obter um polipeptiídeo que tenha uma sequência de aminoácido pelo menos 95% idêntica à uma sequência de aminoácido de ' consulta, até 5% dos resíduos de amincácido na sequência em : questão podem ser inseridos, excluídos ou substituídos com outro aminoácido. Essas alterações da sequência de referência podem ccorrer nas posições amino ou carbóxi terminal da sequência de referência de aminoácido ou qualquer lugar entre aquelas posições terminais, intercaladas individualmente dentre os resíduos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência.

[0070] Como uma questão prática, se qualquer polipeptídeo particular for pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 9B%t ou 99% idêntica à um polipeptídeo de referência pode ser determinado usar convencionalmente programas de . computador conhecidos. Um método para determinar a melhor correspondência geral entre uma sequência de consulta (uma Ú sequência da presente invenção) e uma sequência em questão, também referida como um alinhamento de sequência global, pode ser determinado usar o programa de computador FASTDB com base no algoritmo de Brutlag et al., Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990). Em um alinhamento de sequência, as sequências de consulta e em questão são sequências de nucleotídeo ou ambas as seguências de aminoácido. O resultado do dito alinhamento de sequência global está na identidade percentual. Os parâmetros preferidos usados em um alinhamento de aminoácido

FASTDB são: Matriz=PAM O, k-tupla=2, NMismatch Penalty=1, Joining Penalty=20, Randomization Group Comprimento=0, Cutoeff Score=1, Window Size=sequência comprimento, Gap Penalty-=s, Gap Size Penalty=0.05, Window Size=500 ou o comprimento da sequência de aminoácido em questão, seja qual for o menor.

[0071] Se a sequência em questão é menor que à sequência de consulta devido às exclusões do terminal N ou C, não por causa das exclusões internas, uma correção manual deve ser feita para os resultados. Isso é porque o programa FASTDEB não leva em conta os truncamentos do terminal N e € da sequência em questão àão calcular à identidade percentual global. Pára às sequências em questão truncadas nos terminais N e C, em relação à sequência de consulta, a identidade percentual é corrigida através do cálculo do número de resíduos da sequência de consulta que são N e C da sequência em questão, que não são correspondidos/alinhados com um resíduo em questão correspondente, como uma porcentagem das bases totais da sequência de consulta, Se um resíduo for correspondido/alinhado é determinado pelos resultados do alinhamento de sequência FASTDB. Essa porcentagem é então subtraída da identídade percentual, calculada pelo programa i FASTDB acima usando os parâmetros especificados, para chegar à uma pontuação final da identidade percentual. Essa pontuação final da identidade percentual é o que é usada para as finalidades da presente invenção. Apenas resíduos para o5S terminais N e C da sequência em questão, que não são correspondidos/alinhados com a sequência de consulta, são considerados para as finalidades de ajustar manualmente a pontuação da identidade percentual. Isto é, apenas as posições do resíduo de consulta do lado de fora dos resíduos mais distantes do terminal N e C da sequência em questão. 10072] Por exemplo, uma sequência em questão de 290 resíduos de amincácido é alinhada com uma sequência de consulta de 100 resíduos para determinar a identidade percentual. A exclusão ocorre no terminal N da sequência em questão e, portanto, o alinhamento FASTDB não mostra uma ' correspondência/alinhamento dos primeiros 10 resíduos no ' terminal N. Os 10 resíduos não pareados representam 10% da sequência (número de resíduos nos terminais N e C não correspondido/ número total de resíduos na sequência de consulta) assim 10% são subtraídos da pontuação da identidade percentual calculada pelo programa FASTDB. Se os 90 resíduos restantes forem perfeitamente correspondidos, a identidade percentual final seria 90%. Em outro exemplo, uma sequência em questão de 290 resíduos é comparada com uma sequência de consulta de 100 residuos. Nesse momento, as exclusões são exclusões internas, assim não há resíduos nos terminais N OU CC da sequência em questão que não são á correspondidos/alinhados com a consulta. Nesse caso, a identidade percentual calculada por FASTDB não é corrigida manualmente, Mais uma vez, apenas as posições do resíduo fora das extremidades do terminal N e C da sequência em questão, conforme exibido no alinhamento de FASTDB, que não são correspondidos/alínhados com a sequência de consulta são corrigidas manualmente. Não devem ser feitas outras correções manuais para às finalidades da presente invenção,

[0073] A identidade percentual de polinucleotídeos e/ou polipeptídeos também pode ser determinada usando os programas BLAST disponíveis através do

Centro Nacional para Informação de Biotecnologia (NCBI), com os parâmetros padrão indicados nos programas.

[0074] Como usado aqui, “identidade percentual” significa, na medida em que dois DNA idealmente alinhados ou segmentos de proteína são invariáveis em toda uma janela de alinhamento dos componentes, por exemplo, sequência de nucleotídeo ou sequência de aminoácido. Uma “fração de ' identidade” para segmentos alinhados de uma sequência de : teste e uma sequência de referência é o número dos componentes idênticos àqueles que são compartilhados pelas sequências dos dois segmentos alinhados divididos pelo número total dos componentes de sequência no segmento de referência sobre uma jaánela de alinhamento que é à menor da sequência de teste completa ou da sequência de referência completa. “Identidade percentual” (“% identidade”) é a fração da identidade vezes 100. Tal alinhamento ideal é considerado entendido como alinhamento local das sequências de DNA. Para alinhamento de proteína, um alinhamento local das sequências de proteína deve permitir introdução de lacunas para alcançar ' alinhamento ideal. A identidade percentual é calculada sobre o comprimento alinhado não incluindo as lacunas introduzidas pelo alinhamento per se.

[0075] Como usado aqui, o termo polinucleotídeos ou polipeptídeos “variantes” refere-se a um polinuclectídeo ou polipepríideos diferindo de um polinucleotideo ou polipeptídeo especificamente citado na invenção por inserções, exclusões, mutações e substituições, no resíduo de aminoácido e posições de polinucleotídeo, respectivamente, criados usando, por exemplo, técnicas de DNA recombinante. Especificamente, as variantes recombinantes que codificam esses mesmos polipeptídeos ou similares podem ser sintetizadas ou selecionadas fazendo uso da “redundância” no código genético. Várias substituições de códon, tais como às mudançãs silenciosas que produzem vários locais de restrição, podem ser introduzidas para otimizar a clonagem em um plasmideo ou vetor viral ou expressão em um sistema procariótico ou eucariótico particular (isto é, “otimização de códon” direcionada ao hospedeiro). As nmutações na . sequência de polinucleotideo podem ser refletidas no polipeptídeo ou domínios de outros peptídeos adicionados ao polipeptídeo para modificar as propriedades de qualquer parte do polipeptídeo, para mudar as características tais como DNA e outras afinidades de ligação de ligante, Ou taáãxa de degradação/rotatividade. De acordo com algumas realizações, os polinucleotideos da invenção são códons otimizados para otimizar à expressão do polipeptídeo em um hospedeiro transgênico.

[0076] O termo “códon otimizado”, que se refere aos genes ou regiões de codificação das moléculas de ácido . nucleico para transformação de vários hospedeiros, refere-se à alteração dos códons no gerie ou regiões de codificação das : moléculas de ácido nucleico para refletir o uso típico do códon do organismo hospedeiro sem alterar o polipeptideo codificado pelo DNA. Tal otimização inclui substituir pelo menos um, ou mais de um, ou um número significativo, de códons com um ou mais códons que são mais frequentemente usados nos genes daquele organismo.

[9077] Os desvios na sequência do nucleotídeo que compreende os códons que codificam os amincácidos de qualquer cadeia de polipeptídeo permitem variações na codificação da sequência para o gene. Uma vez que cada códon consiste em três nucleotídeos, e os nucleotídeos compreendendo DNA são restritos a quatro bases específicas, há 64 combinações possiveis de nucleotídeos, 61 dos quais codificam os aminoácidos (o três códons restantes codificam a tradução de terminação dos sinais). Como um resultado, muitos aminoácidos são designados por mais de um códon, Por exemplo, i os aminoácidos alanina e prolina são codificados por quatro . tripletos, serina e arginina por seis, enquanto triptofano e metionina são codificados por apenas um rtripleto. Essa degeneração permite a composição de base do DNA para variar ao longo de uma ampla faixa sem alterar à sequência de aminoácido das proteínas codificadas pelo DNA.

[0078] Muitos organismos exibem um viés para uso de cóédons particulares para codificar a inserção de um aminoácido particular em uma cadeia de peprídeo em crescimento. A preferência do códon, ou viés do códon, diferenças no uso do códon entre os organismos, é proporcionada pela degeneração do código genético, e está bem ' documentada dentre muitos organismos. O viés do códon frequentemente se correlaciona com a eficiência de tradução do RNA mensageiro (mRNA), que, por sua vez, acredita-se que seja dependente, inter alia, das propriedades dos códons que estão sendo traduzidos e a disponibilidade das moléculas de RNA de transferência particular (tRNA). A predominância dos LtRNAS selecionados em uma célula é geralmente um reflexo dos códons usados mais frequentemente na síntese de peptídeo. Consequentemente, os genes podem ser adaptados para expressão de gene ideal em um dado organismo com base na otimização do códon.

[0679] Dado o grande número de sequências de gene disponiveis para uma ampla variedade de espécies animal, vegeral e microbiana, é possível calcular as frequências relativas de uso do códon. As tabelas de uso do códon estão prontamente disponíveis, por exemplo, na “Base de Dados de Uso do Códon” disponível em http://www. kazusa.or.jip/codon/ [visitado em 20 de março de 2008), e essas tabelas podem ser adaptadas de várias maneiras. Vide Nakamuraet al., Nucl.

. Acids Res. 28:292 (2000).

(0080) Usar as tabelas de uso do códon, um técnico no assunto pode aplicar as frequências para qualquer dada sequência de polipeptídeo, e produzir um fragmento de ácido nucleico de uma região de codificação de códon otimizado que codifica o polipeptiídeo, mas que usa códons ideais para expressar uma sequência de interesse em um hospedeiro de interesse.

[0081] Os códons de atribuição aleatória em uma frequência otimizada para codificar uma dada sequência de polipeptideo podem ser feitos manualmente calculando as ' frequências do códon para cada amincácido, e então atribuir os côdons à sequência de polipeptideo aleatoriamente, Ú Adicionalmente, vários algoritmos é programas de computador estão prontamente disponíveis para os técnicos no assunto. Por exemplo, a função “EditSeqg” no Pacote Lasergene, disponível de DNAstar, Inc., Madison, WI, a função tradução de volta no Conjunto VectorNTI, disponível de InforMax, InC., Bethesda, MD, e à função “traduzir de volta” no Pacote GCG- Wisconsin, disponível de Accelrys, Inc., San Diego, CA. Além disso, vários recursos estão disponíveis publicamente para otimizar por códon as sequências de região de codificação,

por exemplo, a função “tradução de volta” em http: “entelechon.com/bioinformatics/ backtranslation.php?lang=eng e a função “backtranseq" disponível em http “bioinfo.pbi,nre.ca:8090/EMBOSS/index,.html,.” Construir um algoritmo rudimentar para atribuir os códons com base em uma dada frequência também pode ser facilmente realizado com funções matemáticas básicas por um técnico no assunto. Além disso, as regiões de codificação de códon otimizado podem ser . designadas por vários métodos conhecido do técnico no assunto incluindo pacotes de software tais como “designer de gene sintético” tendo um http: that of “phenotype.biosci,umbe, edu/codon/sgd/ index.php.”

[0082] Em algumas realizações, a invenção engloba polinucleotideos que são códons otimizados para expressar os polipeprtídeos de interesse em um hospedeiro de interesse. Assim, por exemplo, embora os polinucleotídeos da invenção possam ser expressos em ambas as espécies de planta monccotiledônea e dicotiledônea, as sequências de polinucleotídeo podem ser modificadas para explicar as ' preferências de códon específicas e preferências de teor de GC para uma planta monocotiledônea ou planta dicotiledônea de interesse. Às tabelas de uso do códon e programas de software úteis para orientação no códon que otimizam qualquer dada sequência para expressão em uma célula hospedeira de interesse estão prontamente disponíveis e podem ser aplicadas rotineiramente usando as técnicas descritas aqui ou de outra forma conhecida na técnica. Para orientação de utilização do códon exemplar, vide, por exemplo, Murray et al., Nucleic Acids Res. 17:477-98 (1989), o qual e incorporado por referência em sua totalidade, Os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos da invenção podem igualmente ser recombinantemente designados para remover sequências de desestabilização potencial e estrutura secundária potencial que podem ser prontamente identificas e modificadas usando técnicas conhecidas na técnica.

[0083] Como usado aqui, uma “planta de controle” significa uma planta que não contém uma sequência de polinucleotídeo da invenção. As plantas de controle adequadas . incluem a planta não transgênica da linhagem parental usada para gerar uma planta transgênica ou uma planta não transgênica que é a mesma variedade da planta transgênica, que pode geralmente ser aqui referida como uma planta “tipo selvagem”,

[0084] Como usado aqui, um “traço melhorado” significa uma característica de uma planta transgênica que inclui, entre outros, um traço agronômico melhorado caracterizado pela morfologia, fisiologia, crescimento &e desenvolvimento de planta melhorada, produtividade, melhora nutricional, resistência à doença ou praga ou tolerância química e ambiental. Em aspectos mais específicos dessa invenção, o traço melhorado é selecionado do grupo de traços melhorados consistindo em eficácia melhorada no uso da água (por exemplo, “tolerância à estiagem”), tolerância melhorada à salinidade, tolerância melhorada ao frio, produtividade aumentada, e efícácia melhorada no uso de nitrogênio.

[0085) Como usado aqui, “condições reduzidas de água” ou condições de “não escassez de água” são usados alternadamente e se referem às condições nas quais as plantas ou células são cultivadas sem limitações de água e para as quais a célula, planta, ou a maioria das plantas não exibe sinais ou sintomas visíveis associados com condições de déficit de água. Em contrapartida, “condições restritas de água,” “condições de déficit de água” e “condições de escassez de água” são usados alternadamente para se referir às condições nas quais as plantas ou células são cultivadas em condições de limitação de água e para as quais a célula, planta, ou maiória das plantas exibe sinais e sintomas i visíveis associados com a estiagem e a escassez de água.

. [0086] Como usado aqui, “condições reduzidas de água” ou condições de “não escassez de água” são usados alternadamente e se referem às condições nas quais as plantas ou células são cultivadas em limitações de água e para as quais a célula, planta, ou a maioria das plantas não exibe sinais e sintomas visíveis associados com condições de déficit de água. Em contrapartida, “condições restritas de água,” “condições de déficit de água” e “condições de escassez de água” são usados alternadamente para se referir às condições nas quais as plantas ou células são cultivadas em condições de limitação de água e para as quais a célula, planta, ou maioria das plantas exibe sinais e sintomas visíveis associados com a estiagem e à escassez de água, i [0987] O termo “produtividade aumentada", como usado aqui, pretende conformar com a maneira que esse termo seria tipicamente usado e entendido nos campos da agricultura e/ou pesquisa. À produtividade aumentada de uma planta transgênica da invenção pode ser medida em diversas maneiras, incluíndo peso de teste, número de semente por planta, peso da semente, número de semente ou peso por unidade de área (por exemplo, sementes, ou peso das sementes, por acre). Em uma realização particular, a produtividade aumentada refere-

se a um aumento estatisticamente significativo na produção de ' semente ou paso do grão por uma planta ou grupo de plantas Ipor unidade de área). De acordo com uma realização, à produtividade da semente ou peso do grão de um tamanho de amostra estatisticamente significativo das plantas transgênicas da invenção (por exemplo, n= 10 ou mais) é aumentáda pelo menos 5% quando comparado à produtividade da semente ou peso do grão de um número comparável de plantas de - controle.

[0088] O termo “taxa de fotossíntese aumentada”, como usado aqui, pretende se conformar com a maneira que esse termo seria tipicamente usado e entendido nos campos da agricultura e/ou pesquisa. A fotossíntese aumentada de uma planta transgênica da invenção pode ser medida em diversas maneiras, incluindo medição da troca de gás CO; da folha. Em uma realização particular, à taxa de fotossíntese aumentada refere-se a um aumento estatisticamente significativo na troca de gás CO; da folha através de uma planta ou grupo de plantas (por unidade de área). De acordo com uma realização, B a taxa de fotossíntese de um tamanho de amostra estatisticamente signifícativo das plantas transgênicas da i invenção (por exemplo, n= 10 ou mais) é aumentada pelo menos 5% quando comparado à taxa de fotossíntese de um número comparável das plantas de controle.

POLINUCLEOTÍDEOS E POLIPEPTÍDEOS DE HAHB4

MODIFIÇADOS

[10089] A invenção refere-se à descoberta que às modificações da sequência do fator de transcrição HaHB4 surpreendentemente resultam em traços melhorados em plantas transgênicas que foram transformadas com as sequências de polimucleotídeo que codificam à proteína HaHB4 modificada. O gene de HaHB4 (incluindo promotor e sequências regulatórias), proteina, e hospedeiros transgênicos de HaHB4 também são descritos e caracterizados no documento de Patente Norte- Americana nº 7.674.955, incorporado aqui por referência em sua totalídade.

[0020] Em algumas realizações, à invenção provê | moléculas de ácido nucleico compreendendo sequências de . polinucleotideo que codificam uma proteina de HaHB4d modificado. Em realizações adicionais, a invenção provê moléculas de ácido nucleico compreendendo sequências de polinucleotideo que codificam um fragmento ou variante funcionalmente ativo de HaHB4 modificado tendo uma sequência que é distinta de HaHB4 (SEQ ID Nº: 2). As proteínas codificadas por esses e outros polinucleotídeos da invenção também são englobadas pela invenção.

[090391] Conforme aqui revelado, as plantas transgênicas transformadas com proteina de HaHB4 modificado ImodHaHB4) tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID Nº: 4 e 7 SEO ID Nº: 8 exibem inesperadamente traços melhorados incluindo produtividade aumentada quando cultivadas em condições de escassez de água ou não escassez de água como comparado às plantas de controle. Similarmente, conforme aqui revelado, as plantas transgênicas transformadas com proteína de HaHB4 modificado (modHaHB4) tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID Nº: 4 e SEQ ID Nº: & exibem inesperadamente traços melhorados incluíndo fotossíntese aumentada quando cultivada em condições de escassez de áqua ou não escassez de água como comparado às plantas de controle. Assim, em uma realização, a invenção é direcionada às moléculas de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeo quê codifica à proteína de Helianthus annuus HB-4 modificado (modiHaHB4) tendo uma sequência de amincácido de SEQ TD Nº; 4, Em uma realização particular, o ácido nucleiço compreende a sequência de polinucleotídeo de SEQ ID Nº: 3, SEQ ID Nº: 12, SEQ ID Nº: 13, SEQ ID Nº: 15 ou SEQ ID Nê: 16, Em outra realização, à invenção é direcionada às moléculas de ácido nucleico compreendendo uma sequência de . polinucleotídeo que codifica uma proteina de Helianthus annuus HB4 modificado (mod2HafiB4) tendo a sequência de amincécido de SEQ ID Nº: 8. Em realizações particulares, o ácido nucleico compreende a sequência de polinucleotídeo de SEQ ID Nº: 14 ou SEQ ID Nº: 17.

[9092] As plantas transgênicas transformadas com proteína de HaHB4 modificado (modHaHB4) tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID Nº: 38 e SEQ ID Nº: 39 também são englobadas pela invenção. Em realizações particulares, essas plantas exibem traços melhorados incluindo produtividade aumentada e/ou fotossíntese aumentada quando cultivadas em ' condições de escassez de água Ou não escassez de água Como comparado às plantas de controle. Assim, em uma realização, à invenção é direcionada às moléculas de ácido mnucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica uma proteina de mod3HaHB4 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID Nº: 38. Em outra realização, a invenção é direcionada às moléculas de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica uma proteina de mod4HaHB4 tendo à sequência de aminoácido de SEQ ID Nº: 39.

10093) A invenção ainda provê polinucleotídeos que codificam fragmentos funcionalmente ativo de modlHaHB4 (HaHBá.2 (SEQ ID Nº: 4)) compreendendo uma sequência de mod1HaRB4 que não está presente na sequência correspondente de HaHB4 (SEQ ID Nº: 2). Em algumas realizações, os fragmentos funcionalmente ativos compreendem pelo menos 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 125, 150, ou 175 resíduos de aminoácido consecutivos da sequência de aminoácido de modifRaHB4 (SEQ ID Nº: 4). Em outras i realizações, os fragmentos compreendem 10 a 50, 25 a 75, 50 a ' 100, 75 a 125, ou 100 a 175 Tesíduos de aminoácido consecutivos da sequência de aminoácido de modlHaHB4 (SEQ ID Nê: 4). Em realizações adicionais, os fragmentos compreendem a sequência de 2 a 10 resíduos de aminoácido da SEQ ID Nº: 4, 13 à 25 resíduos de aminoácido da SEQ ID:4, ou 150 a 170 residuos de aminoácido da SEQ ID:4,

[0094] A invenção ainda provê políinucleotídeos que codificam fragmentos funcionalmente ativos de mod2HaHB4 (HaHBA4.3 (SEQ ID Nº: &8)) compreendendo uma sequência de mod2HaHB4 que não está presente em HaHB4 (SEQ ID Nº: 2). Em algumas realizações, os fragmentos funcionalmente atívos Í compreendem pelo menos 15, 20, 25, 30, 40, $0, 60, 75, 100, 125, 150, ou 175 resíduos de aminoácidos consecutivos da sequência de aminoácido de mod2HafB4 (SEQ ID Nº: 8). Em realizações adicionais, os fragmentos compreendem 10 a 50, 25 a 75, 50 à 100, 75 a 125, ou 100 a 175 resíduos de aminoácidos consecutivos da sequência de aminoácido de mod?HaHB4 (SEQ ID Nº: 8). Em realizações adicionais, os fragmentos compreendem a sequência de 2 a 10 resíduos de aminoácido da SEQ ID Nº: 8.

[00535] A invenção ainda provê polinucleotídeos que codificam fragmentos funcionalmente ativos de mod3HaHB4

(HaHB4,.4 (SEQ ID Nº: 38)) compreendendo uma sequência de mod3HaHB4 que não está presente em HaHB4 (SEQ ID Nº: 2). Em algumas realizações, os fragmentos funcionalmente ativos compreendem a sequência de 2 a 15 ou 165 a 175 resíduos de amincácido da SEQ ID Nº: 3B e compreendem pelo menos 15, 20, 253, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 125, 150, ou 175 resíduos de : aminoácidos consecutivos da sequência de aminoácido de mod3HaHB4A (SEQ ID Nº: 38). Em realizações adicionais, OS - fragmentos funcionalmente ativos compreendem à sequência de 2 a 15 ou 165 a 175 resíduos de aminoácidos da SEQ ID Nº: 38 e compreendem 10 a 50, 25 a 75, 50 à 100, 75 a 125, ou 100 a 175 resíduos de aminoácidos consecutivos da sequência de aminoácido de mod3HaHB4 (SEQ ID Nº: 38).

[0096] A invenção ainda provê polinucleotídeos que codificam fragmentos funcionalmente ativos de mod4HaHB4 (SEQ ID Nº: 39)) compreendendo uma sequência de mod4HaHB4 que não está presente em HaHB4 (SEQ ID Né: 2). Em algumas realizações, os fragmentos funcionalmente ativos compreendem a sequência de 2 a 10 resíduos de aminoácidos de SEQ ID Nº; ' 32 e compreendem pelo menos 15, 20, 25, 30, 40, SO, 60, 75, 100, 125, 150, ou 175 resíduos de aminoácidos consecutivos da sequência de amincácido de modiHaHB4 (SEQ ID Nº: 39). Em realizações adicionais, os fragmentos compreendem a sequência de 2 a 10 resíduos de aminoácidos da SEQ ID Nº: 39 e compreendem 10 a 50, 25 a 75, 50 a 100, 75 a 125, Ou 100 a 175 resíduos de aminoácidos consecutivos da sequência de aminoácido de mod4HaHB4 (SEQ ID Nº: 39).

[00297] Em outra realização, os polinuceleotídeos da invenção codificam os fragmentos funcionalmente ativos correspondentes às exclusões do terminal N e/ou terminal C de modiHaHB4 (SEQ ID Nº: 4). Assim, de acordo com algumas realizações, os polinucleotídeos da invenção codificam os fragmentos funcionalmente ativos de modiHaHB4 tendo pelo menos 1, mas menos que 5, 10, 15, ou 20 aminoácidos excluídos do terminal N de modliHfaHB4 (SEQ ID Nº: 4), Em realizações adicionais, os polinuoleotídeos da invenção codificam os : fragmentos funcionalmente ativos de modlHaHB4 (SEQ ID Nº; 4) tendo pelo menos 1, mas menos que 10, 25, 50, 75, ou 100 . aminoácidos excluídos do terminal C de modlHaHB4 (SEQ ID Nº: 4), Em outras realizações, os polinucleotídeos da invenção codificam os fragmentos funcionalmente ativos de modlHaHB4 tendo pelo menos 1, mas menos que 5, 10, 15, ou 20 aminoácidos excluídos do terminal N e pelo menos 1, mas menos que 10, 25, 50, 75, ou 100 aminoácidos excluídos do terminal C de modlHaHB4 (SEQ ID Nº: 4).

[9098] Em outra realização, os polinucleotídeos da invenção codificam os fragmentos funcionalmente ativos correspondentes às exclusões do terminal N e/ou terminal C de mod2HaHB4 (SPEQ ID Nº: 8). Assim, de acordo com algumas : realizações, os polinucleotídeos da invenção codificam os fragmentos funcionalmente ativos de mod2HaHB4 tendo pelo menos 1, mas menos que 5, 10, 15, ou 20 amincácidos excluídos do terminal N de mod2HaHB4 (SEQ ID Nº: 8). Em realizações adicionais, os polinucleotídeos da invenção codificam os fragmentos funcionalmente ativos de mod2HaHB4 (SEQ ID Nº: 8) tendo pelo menos l, mas menos que 10, 25, 50, 75, ou 100 aminoácidos excluídos do terminal C de mod2HaHB4 (SEQ ID Nº: 8). Em outras realizações, os polinucleotídeos da invenção codificam os fragmentos funcionalmente atívos de mod2HaHB4 tendo pelo menos 1l, mas menos que 5, 10, 15, ou 20 aminoácidos excluídos do terminal N e pelo menos 1, mas menos que 10, 25, 50, 75, ou 100 aminoácidos excluídos do terminal C de mod2HaHB4 (SEQ ID Nó: 8).

[00399] Em outra realização, os polinucieotídeos da invenção codificam os fragmentos funcionalmente ativos correspondentes às exclusões do terminal N e/ou terminal C de . modiHaHBA4 (HaHB4,3 (SEQ ID Nº: 38)). Assim, de acordo com * algumas realizações, os polinucileotideos da invenção *. codificam os fragmentos funcionalmente ativos de mod3HaHB4 tendo pelo menos 1, mas menos que 9, 10, 15, ou 20 aminoácidos excluídos do rerminal N de mod4HaHB4 (SEQ ID Nº: 38). Em realizações adicionais, os polinucleotídeos da invenção codificam os fragmentos funcionalmente ativos de mod3HaHB4 (SEQ ID Nº: 38) tendo pelo menos 1, mas menos que 9 aminoácidos excluídos do terminal C de mod3HaHB4 (SEQ ID Nº: 38). Em outras realizações, os polinucleotídeos da invenção codificam os fragmentos funcionalmente ativos de mod3HaHBA4 tendo pelo menos 1, mas menos que 5, 10, 15, ou 20 aminoácidos excluídos do terminal N e pelo menos 1, mas menos ' que 10, 25, 50, 75, ou 100 aminoácidos excluídos do terminal . C de mod3HaHB4 (SEQ ID Nº: 38).

[00100] Em outra realização, os polinucleotídeos da invenção codificam os fragmentos funcionalmente ativos correspondentes às exclusões do terminal N e/ou terminal C de mod4HaHB4 (SEQ ID Nº: 39). Assim, de acordo com algumas realizações, os polinucleotídeos da invenção codificam os fragmentos funcionalmente ativos de mod4iHaHB4 tendo pelo menos 1, mas menos que 5, 10, 15, ou 20 aminoácidos excluídos do termínal N de mod4HaHB4 (SEQ ID Nº: 39). Em realizações adicionais, os polinucleotídeos da invenção codificam os fragmentos funcionalmente ativos de mod4HaHB4 (SEQ ID Nº: 39) tendo pelo menos 1, mas menos que 10, 25, 50, 75, Su 100 amincácidos excluídos do terminal C de mod4HaHB4 (SEQ ID Nº: 39). Em outras realizações, os polinucleotídeos da invenção codificam os fragmentos funcionalmente ativos de mod4HaHB4 tendo pelo menos 1, mas menos que 5, 10, 15, ou 20 aminoácidos excluídos do terminal N e pelo menos 1, mas menos 7 que 7 aminoácidos excluídos do terminal C de mod4tHiaHB4 (SEQ

. ID Nº: 39). ' [00101] As regiões de proteínas de modHaHB4 (por exemplo, modlHaHBl11 (SEQ ID Nº: 4)) e mod2HaHB1l (SEQ ID Nº: 8)) incluem a região amino terminal (“YNTR”: SEQ ID Nº: 6 ou SEQ ID Nº; 9); homeodomínio (“HD”": 13 a 78 resíduos de amincácidos da SEQ ID Nº: 4; 12 à 77 resíduos de aminoácidos da SEQ ID Nº: 8); fecho de leucina (“LZ”“: 79 a 108 residuos de aminoácidos da SEQ ID Nº: 4 ou 78 à 107 resíduos de amiíncácidos da SEQ ID Nº: 8); e a região carbóxi terminal (PCTR": 109 a 177 resíduos de aminçácidos da SEQ ID Nº; 4 ou 108 a 176 resíduos de aminoácidos da SEQ ID Nº: 8). De acordo ' com algumas realizações, os polinucleotídeos incluem proteínas compreendendo uma Ou mais regiões da proteína de modlHaHB4 selecionada do grupo consistindo em: a NTR (SEQ ID Nº: 6 ou SEQ ID Nº: 9), homeodománio (13 a 78 resíduos de amincácidos da SEQ ID Nº: 4 ou 12 a 77 resíduos de amincácidos da SEQ ID Nº: 8); fecho de leucina (79 a 108 residuos de aminoácidos da SEQ ID Nº: 4; ou 78 à 107 resíduos de aminoácidos da SEQ ID Nº: 8); e CTR (109 a 177 resíduos de aminoácidos da SEQ ID Nº: 4 ou 108 a 176 resíduos de aminoácidos da SEQ ID Nº: 8). Também são providos polinuciectídeos que codificam qualquer combinação de duas ou mais regiões de modHaHB4 selecionadas do grupo consistindo em: a NTR (SEQ ID Nº: 6 ou SEQ ID Nº: 9), homeodomínio (13 a 78 resíduos de aminoácidos da SEQ TD Nº: 4); fecho de leucina 179 a 108 resíduos de aminoácidos da SEQ ID Nº: 4); e CTR (109 a 177 resíduos de aminoácidos da SEQ ITD Nº: 4).

[00102] Às regiões da proteína de mod3HaHB4 (SEQ : ID Nº: 38) incluem o homeodomínio (“HD”: 13 a 78 resíduos de " aminoácidos da SEQ ID Nº: 38); a região carbóxi terminal . (“CTR": 109 à 177 resíduos de aminoácidos da SEQ ID Nº: 38). i De acordo com algumas realizações, os polinucleotídeos incluem proteínas compreendendo uma ou mais regiões da proteina de mod3iHaHB4 selecionada do grupo consistindo em: o homeodomínio (13 a 78 resíduos de aminoácidos da SEQ ID Nº: 368; e CTR (108 a 177 resíduos de aminoácidos da SEQ ID Nº: 38).

[00103] Em realizações adicionais, a invenção engloba polinucleotídeos que codificam as variantes funcionalmente ativas de modlfiaHB4á (SEQ ID Nº: 4) ou mod2HaHB4 (SEQ ID Nº: 8), em que a sequência da variante não é aquela de HaHB4 (SEQ 1D Nº: 2). Em realizações adicionais, : a invenção engloba polinucleotídeos que codificam às variantes funcionalmente atívas de mod3HaHB4 (SEQ TD Nº: 38) ou modiHaHB4 (SEQ ID Nº: 39), em que à sequência da variante não é aquela de HaHB4 (SEQ ID Nº: 2), As variantes da invenção incluem adições, substituições nas sequências de modliHaHB4 ou mod2HaHBA. As variantes da invenção incluem adições, substituições nas sequências de mod3HaHB4 ou mod4HaHB4. As “substituíções” de aminoácido podem resultar na substituição de um aminoácido com outro aminoácido que tenha propriedades estruturais e/ou químicas similares, por exemplo, substituição de aminoácido conservador. As substituições de aminoácido “conservador” podem ser feitas com base na similaridade ná polaridade, carga, solubilidade, hidroefobicidade, hidrofilicidade e/ou na natureza anfipática dos resíduos envolvidos. Por exemplo, aminoácidos não polares (nidrofóbicos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano, e metionina; aminoácidos 7 neutros polares incluem glicina, serina, treonina, cisteína, . tirosina, asparagina, e glutamina; aminoácidos carregados positivamente (básicos) incluem arginina, lisina, e histidina; e aminoácidos carregados negativamente (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico. “Inserções” ou “exclusões” estão geralmente na faixa de cerca de l1 a cerca de 20 aminoácidos, mais especificamente cerca de 1 a cerca de amíincácidos, e ainda mais especificamente, cerca de 2 a cerca de 5 aminoácidos. As substituições não conservadoras implicam na troca de um meémbro de uma dessas classes por outra classe. Por exemplo, as substituições de amincácido também podem resultar na substituição de um aminoácido com outro aminoácido tendo diferentes propriedades estruturais . e/ou químicas, por exemplo, substituindo um aminoácido de um grupo (por exemplo, polar) com outro aminoácido de um grupo diferente (por exemplo, básico). A variação permitida pode ser determinada experimentalmente ao fazer sistematicamente inserções, exclusões ou substituições de aminoácidos em uma molécula de polipeptídeo usando técnicas de DNA recombinante e ensaiando as variantes recombinantes resultantes para atividade.

[00104] Em realizações particulares, os polinucleotídeos da invenção codificam as variantes

| 63/107 funcionalmente ativas de modiHaHB4 ou mod?HaHB4 que contêm 1, 2, 3, 4, 8, 10, ou mais substituições, inserções, OU exclusões quando comparado à sequência correspondente da proteina de modlHaHB4 (SEQ ID Nº: 4) ou proteína de mod2HaHB4 (SEQ ID Nº: 8), em que as variantes não contém a sequência de amincácido correspondente de HaHB4 (SEQ ID Nº: 2). Em algumas : realizações, os polinucleotideos codificam as variantes í funcionalmente ativas de modlHaHB4 ou mod2HaHB4 que contêm 1, . 2, 3, 4, 5, 10, Ou mais substituições conservadoras quando comparado à sequência correspondente de proteina de modiHaHB4 (SEQ ID Nº: 4) ou proteína de mod2HaHB4 (SEQ ID Nº: 8). Em outras realizações, os polinucleotiídeos codificam as variantes funcionalmente ativas de modlHaHB4 ou modZHaHB4 que contêm 1, 2, 3, 4, 5, 10, ou mais substituições não conservadoras quando comparado à sequência correspondente da proteína de modlHaHB4 (SEQ ID Nº: 4) ou proteina de mod2HaHB4 (SEQ ID Nº: 8).

[00105] Em realizações adicionais, os polimucleotídeos codificam as variantes funcionalmente ativas da proteíria de modlHaHB4 ou mod2HaHB4 que contêm 1 a 10, l1 a : 20 ou 1 a 25 substituições, inserções, ou exclusões quando comparado à sequência correspondente da proteína de modliHaHB4 (SEQ 1D Nº: 4) ou proteína de mod2HaHBE4 (SEQ ID Nº: 8), em que às variantes não contém à sequência correspondente de aminoácido de HaHBá (SEQÇ ID Nº: 2). Em algumas realizações, os polinucleotídeos codificam as variantes funcionalmente ativas da proteína de modiHaHB4 ou mod2HaHB4 que contêm 1 à 10, 1 a 20 ou 1 a 25 substituições conservadoras quando comparado à sequência correspondente da proteina de modlHaHB4 (SEQ ID Ni: 4) ou proteína de mod2HaHB4 (SEQ ID Nº: 8). Em

| 64/107 realizações adicionais, os polinucleotídeos codificam as variantes funcionalmente ativas da proteína de modlHaHB4 ou mod2HaHB4 que contêm 1 a 10, 1 a 20 ou 1 a 25 substituições não conservadoras quando comparado à sequência correspondente da proteína de modiHkalB4 (SEQ ID Nº: 4) ou proteína de mod2HaHB4 (SEQ ID Nº; 8).

[00106] Em realizações particulares, os - polinucleotídeos codificam as variantes funcionalmente ativas . da proteina de modliHaHBA que contêm uma inserção de uma Ú serina na posição 7, uma substituição de treonina com serina na posição 9, substituição de arginina com lisina na posição 16, ou substituição de lisina com fenilalanina na posição

155.

[00107] Em realizações particulares, a proteína de HaHBA4 modificado funcionalmente ativo que Contém substituição de treonina com serina na posição 9 da proteína de HaHB4 nativo (SEQ ID Nº: 2), substituição de treonina com serina na posição 13 de proteína de HaHB4 nativo (SEQ ID Nº: 2), substituição de lisina com arginina na posição 22 da proteina de HaHB4 nativo (SEQ TD Nº: 2), substituição de fenilalanina com lisina na posição 159 da proteína de HaHB4 nativo (SEG ID Nº: 2), ou substituição de leucina na posição 175 da proteína de HaHB4 nativo (SEQ ID Nº: 2).

[00108] Em realizações adioionais, a invenção engloba polinucleotídeos que codificam as variantes funcionalmente ativas da proteína de modiHaHB4 em que a dita variante compreende uma sequência de amincácido que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de aminoácido da proteína de modlHaHBA4 (SEQ ID Nº: 4), e em que as variantes não contêm a sequência i 65/107 de aminoácido correspondente de HaHB4 (SEQ ID Nº: 2). Além disso, o& fragmentos de polinucleotídes adequados tendo as homologias acima codificam um polipeptídeo que tem pelo menos 50 aminoácidos, pelo menos 100 aminoácidos, pelo menos 150 aminoácidos, em que a sequência correspondente não está presente em HaHB4 (SEQ ID Nº: 2). Os fragmentos de : polinucleotideo adequados tendo as hómologias acima codifícam 7 um polipeptídeo que tem pelo menos 50 amincácidos, pelo menos . 100 aminoácidos, pelo menos 150 aminoácidos e não contêm a i sequência de aminoácido correspondente de HaHB4 (SEQ ID Nº: 2).

[00109] Em realizações adicionais, a invenção engloba polinucleotideos que codificam as variantes funcionalmente ativas da proteína de mod2HaHB4, em que a dita variante compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequéncia de aminoácido da proteína de mod2HafB4 (SEQ ID Nº: 8), é em que as variantes não contêm a sequência de aminoácido correspondente de HaHB4 (SEQ ID Nº: 2). Os fragmentos de polinucleotideo adequados tendo às homologias : acima codificam um polipeptídeo que tem pelo menos 50 aminoácidos, pelo menos 100 aminoácidos, ou pelo menos 150 aminoácidos e não contêm a sequência de aminoácido correspondente de HaHB4 (SEQ TD Nº: 2).

[00110] Em outras realizações, à invenção engloba uma variante de polinucleotídeo que é pelo menos 60%,85%, 90%, 92%, 95%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 3, SEQ ID Nº: 12, SEQ ID Nº: 13, SEQ ID Nº: 15 ou SEQ ID Nº: 16 SEQ ID Nº: 14, ou SEQ ID Nº: 17, ou a cadeia complementar de qualquer uma i 66/107 sequências, ou fragmentos da mesma, em que a sequência de polinucleotídeo não está presente na sequência de polinucleotideo correspondente de HaHB4 (SEQ ID Nº: 1) e não codifica HaHB4 (SEQ ID Nº: 2). os fragmentos de polinucleotíideo adequados tendo as homologias acima incluem fragmentos que são pelo menos 20 nucleotideos, pelo menos 30 nucleotídeos, pelo menos 40 nucleotídeos, pelo menos 50 , nucleotídeos, pelo menos 75 nucleotídeos, ou pelo menos 100 . nucleotídeos de comprimento.

' [00111] Em uma realização adicional, a invenção engloba uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica (a) moditaHB4 (SEQ ID Nº: 4); (b) um fragmento funcionalmente ativo da difa proteína modificada em que a sequência de aminoácido do dito fragmento está ausente em HaHB4 (SEQ ID Nº: 2j; Ou (Cc) uma variante funcionalmente ativa da proteína de HaHB4 modificado em que à dita variante compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de aminoácido da SEQ 1D Nº: 4; em que à sequência de aminoácido do dito fragmento ou variante não : está presente na sequência de aminoácido de HaHB4 da SEQ ID Nº: 2.

[00112] Em outra realização, a invenção engloba uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica (a) modlHaHB4 (SEQ ID Nº: 4); (bj) um fragmento funcionalmente ativo de modliHaHBá em que a sequência de aminoácido do dito fragmento está ausente em HaHB4 (SEQ 1D Nº: 2); ou (0) uma variante funcionalmente ativa de modlHaHBd4 em que a dita variante compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 55%,

96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID Ni: 4 e em que a sequência de amincácido do dito fragmento ou variante não está presente no HaHB4 (SEQ ID Nº: 2).

[00113] A invenção ainda provê ácidos nucleicos compreendendo uma sequência de polinucleotideo (incluindo . fragmentos de modHaHB4 que codificam os polinucleotídeos 7 descritos aqui) que hibridiza em condições de hibridização . rigorosas, para um ácido nucleico contendo uma cadeia complementar de um polinucleotiídeo que codifica modliHaHB4 (SEQ ID Nº: 4d) ou mod2HaHB4 (SEQ ID Nº: 8), em que os polinucleotídeos de hibridização codificam um polipeptídeo funcionalmente ativo que não é HaHB4 (SEQ ID Nº: 2). Em realizações adicionais, os polinucleotídeos hibridizam em condições de hibrídização rigorosas, para um ácido nucleico contendo uma cadeia complementar da sequência de polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 3 ou SEQ ID Nº: 14, em que o polinucleotideo de hibridização codifica um polipeptídeo funcionalmente ativo que não é HaHB4 (SEQ ID Nº: 2). Ú [00114] Como usado aqui, um polinucleotídeo que é . “hibridizável” para outro polinucleotídeo ou fragmento de ácido nucleico, tal como uma molécula de cDNA, DNA genômico, ou RNA, quando uma forma de cadeia única do polinucleotídeo ou fragmento de ácido nucleico pode fundir em outro fragmento de ácido nucleico em condições apropriadas de temperatura e força iônica da solução. Hibridização e condições de lavagem são bem conhecidas e exemplificadas em Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2” ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989), particularmente Capítulo 11 e Tabela 11.1 ali (que é incorporado por referência em sua totalidade). As condições de temperatura e força iônica determinam à “rigidez” da hibridização. As condições de rigidez podem ser ajustadas para triagem de fragmentos moderadamente similares (tais como sequências homôlogas de organismos distantemente relacionados), para fragmentos altamente similares (tais como : genes que duplican às enzimas funcionais de organismos - intimamente relacionados). As lavagens pós-hibridização - determinam as condições de rigidez. Um conjunto de condições B usa uma série de lavagens começando com 6X SSC, 0,5% de SDS à temperatura ambiente por 15 min, então repetida com 2X SSC, 0,5% de SDS a 45 ºC por 30 min, e então repetido duas vezes com 0,2XK SSC, 0,5% de SDS a 50 “*C por 30 min. Outro conjunto de condições rigorosas usa temperaturas mais altas nas quais as lavagens são idêntica âquelas acima, exceto a temperatura das duas lavagens finais de 30 min em 0.2X SSC, 0,5% de SDS que foi elevada para 60 ºC. Ainda, outro conjunto de condições altamente rigorosas usa duas lavagens finais em 0,1X SSC, 0,1% de SDS a 65 ºC. Um conjunto adicional de condições rigorosas inclui hibridização a 0,1X SSC, 0,1% de : SDS, 65 “C e lavages com 2X SSC, 0,1% de SDS seguidas por 0,1X SSC, 0,1% de SDS, por exemplo.

[00115] A hibridização requer que dois ácidos nucleicos contenham sequências complementares, embora dependendo da rigidez da hibridização, desajustes entre as bases são possíveis. A rigidez apropriada para hibridização dos ácidos nucleiçcos depende do comprimento dos ácidos mnucleicos e o grau de complementação, variáveis bem conhecidas na técnica. Quanto maior o grau de similaridade Ou homologia entre duas sequências de nucleotídeo, maior o valor de Tm para híbridos de ácidos nucleicos que têm aquelas sequências. A estabilidade relativa (correspondente a Tm maior) de hibridizações de ácido nucleico diminui na sequinte ordem: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Para híbridos de mais de 100 nucleotídeos de comprimento, equações para calcular Tm foram derivadas (vide, Sambrook et al., supra, 9.50-9.51),. . Para hibriídizações com ácidos nucleicos mais curtos, isto é, - oligonucleotídeos, a posição de desajustes se torna mais + importante, e o comprimento do oligonucleotídeo determina sua ' especificidade (vide Sambrook et al., supra, 11.7-11.8). Em uma realização, 0 comprimento para um ácido mnucleico hibridizável é pelo menos cerca de 10 nucleotídeos. Em outra realização, um comprimento minimo para um ácido nucleico hibridizável é pelo menos cerca de 15 nucleotídeos, Ainda em outra realização, um comprimento mínimo para um ácido nucleico hibridizável é pelo menos cerca de 20 nucleotídeos ou pelo menos cerca de 30 nucleotídeos. Além disso, o técnico no assunto reconhecerá que a temperatura e a concentração de sal na solução de lavagem podem ser ajustadas conforme ] necessário de acordo com os fatores tais como comprimento da ' sonda.

[00116] O DNA recombinante padrão e as técnicas de clonagem molecular usados aqui são bem conhecidos na técnica e são descritos por Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) (doravante “Maniatis”); e por Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1984); e por Ausubel, F. M. et al., Current

Protocols in Molecular Biology, publicado por Greene Publishing Assoc. e Wiley-Interscience (1587); Frohman (Frooman Cloning PCR products. In The Polymerase Chain Reaction, eds. K. 8, Mullis, F. Fre, & R. A. Gibas, pages l4- 37; cada qual é incorporado por referência em sua totalidade), para gerar proteínas que tenham uma sequência de : aminoácido diferente, por exemplo, para criar substituíções, : exclusões e/ou inserções de aminoácido.

- VETORES E CÉLULAS HOSPEDEIRAS

[00117] Vetores (incluindo cassetes de expressão) contendo os polinucleotídeos de modHaHB4 também “são englobados pela invenção.

[00118] os vetores da invenção podem ser compostos de DNA ou RNA, e podem ser lineares ou um plasmídeo circular fechado. Os vetores podem ser vetores de clonagem, amplificação, transporte ou expressão. O sistema vetor pode ser um vetor simples ou plasmídeo qu dois ou mais vetores que juntos contêm ou controlam a replicação, integração e/ou expressão dos polinucleotiídeos da invenção na célula ] hospedeira. Os polinucieotídeos da invenção podem ser : inseridos no vetor em uma orientação pára frente ou reversa com respeito à qualquer sequência particular do promotor contida no vetor.

[00119] os componentes do vetor para transformação da célula hospedeira (por exemplo, bacteriana ou vegetal) geralmente incluem, entre outros, um ou mais dos seguintes: uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores selecionáveis e opcionalmente um promotor, tal como um promotor induzível, permitindo a expressão de DNA exógeno. Geralmente, os genes marcadores selecionáveis codificam uma proteína necessária para à sobrevivência ou crescimento de células hospedeiras transformadas cultivadas em um meio de cultura seletivo. Os genes de seleção típicos codificam as proteínas que conferem resistência aos antibióticos ou outras toxinas (por exemplo, ampicilina, canamicina, tetraciclina, neomicina, trimetoprim, : estreptomicina, sulfonamidas ou metotrexato), (b) - complementam as deficiências auxotróficas, ou (c) fornecem . mutrientes críticos não disponíveis dos meios complexos. ' Aquelas células que são transformadas com sucesso com uma proteína herteróloga ou fragmento da mesma produzem uma proteina conferindo resistência à droga e assim sobrevivem ao regime de seleção.

[090120] A construção de vetores adequados contendo um ou mais dos componentes listados acima e os polinucleotideos da invenção emprega técnicas padrão de DNA recombinante e pode ser prontamente preparada usando os métodos e reagentes disponíveis na técnica. Vide, por exemplo, Sambrook et al., supra, e Ausubel et al., supra. Geralmente, os plasmídeos de ácido nucleico isolado Ou fragmentos de DNA são rotineiramente clivados, adaptados e religados para formar um contruto vetor contendo os componentes associados necessários de modo a prover o construto com à função e propriedades desejadas. Numerosos vetores e promotores adequados estão comercialmente disponíveis e/ou são conhecidos na fécnica e podem ser rotineiramente usados ou modificados para uso de acordo com à invenção. Os exemplos representatívos de vetores bacterianos incluem: pQOE70, poEBOL, poESIL, poEB2L, poESO, e por-9 (Qiagen); pBS, pDlIO, phagescript, psiXxl74, pBS.RTM. SK,

pPBS.RTM. KS, pNHSA, pNHiG6a, pNHIBSA, pNH4A6GA; pGEX-3X, pGEX-4T- 1 a pEEX-4T7-3, pGEX-5X-1 a pGEX-5X-3, e pGEX-6P-1 a pGEX-6P- 3; pBluescript SK e pBluescripr KS, e pBluescripr II (Stratagene, La Jolla, California), vetores pIN (Van Heeke and Schuster, 1989), pTRC99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, e PRIT5 (Pharmacia Uppsala, Sweden) . os exemplos : representativos de vetores eucarióticos incluem: pWLNEO, - pSvZ2CAT, poc44d, pxXTl, pSG (Stratagene), pSG5S, pSVK3, pBPV, . pMSG, pSVL, GEM1 (Promega Biotec, Madison, Wis.) e pSVLSV40,.

[00121] Em algumas realizações, os polinucleotídeos da invenção são inseridos em um vetor em ligação operável com um promotor adequado que funciona em uma planta hospedeira para acionar a expressão da sequência de polinucleotídeo. Muitos vetores são conhecidos na técnica para essa finalidade e podem ser rotineiramente selecionados pará construção e usados de acordo com a invenção com base nos fatores que incluem, por exemplo, o tamanho da sequência de polimucleotideo à ser inserida no vetor e a célula hospedeira particular à ser transformada com o vetor. Os : vetores de transformação da planta da invenção também podem : conter um HaHB4 funcional ou sequência heteróloga de íntron posicionada a montante da sequência de codificação ou mesmo dentro da sequência de codificação dos polinucleotídeos da invenção, e também podem conter uma sequência líder não traduzida de cinco iniciadores (5') (isto é, um UTR ou 5'- UTR) posicionada entre o promotor e o ponto de início da tradução.

[00122] Os vetores da invenção preferencialmente contêm um marcador selecionável que confere um fenótipo selecionável que permite a identificação de células transformadas que expressam e/ou contêm os polinucleotídeos da invenção.

For exemplo, em várias realizações, o gene do marcador selecionável codifica uma próteina que confere resistência a biocida, resistência à antibiótico (por exemplo, canamicina, bleomicina G418, higromicina eto.), ou resistência à herbicida (por exemplo, glifosato etc.). Exemplos de marcadores selecionáveis que podem ser usados de - acordo com as composições e métodos da invenção incluem, . entre outros, um gene neo que codifica resistência à B canamicina e pode ser selecionado para usar a canamicina, o gene nptlIlI, que confere resistência à canámicina e antibióticos relacionados (Messing et al., Gene 19:259-268 11982); Bevan et al., Nature 304:184-187 (1983)), o gene bar, que confere resistência ao herbicida fosfimotricina (White et al., Nucl.

Acids Res. 18:1062 (1990), Spencer et al., Theor.

Appl.

Genet. 79:625-631 (19390)), o gene hph, que confere resistência ao antibiótico higromicina (Blochinger et al., Mol, Célula.

Biol. 4:2529-2931 (1984); G418, um gene sintase EPSP mutante que codifica resistência ao glifosato (Patentes ' Norte-Americana nºs 4.940.835 e 5.188.642); um gene sintase . acetolactato mutante (ALS) que confere resistência à imidazolinona ou sulfonilureia; um gene nitrilase que confere resistência à bromoxinila; e um gene DHFR resistente a metotrexato.

Adicionalmente, múltiplos marcadores selecionáveis estão disponíveis para conferir resistência à ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, canamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina, espectinomicina, rifampicina, e tetraciclina.

Exemplos de tais marcadores selecionáveis estão ilustrados nos documentos de Patente Norte-Americana nº

' 74/107

5.550.318; 5.633.435; 5.780.708 e 6.118.047, os conteúdos completos dos quais estão incorporados por referência em sua totalidade.

[00123] De acordo com algumas realizações, à invenção é direcionada aos ácidos nucleicos, incluindo vetores e cassetes de expressão, compreendendo os polinucleotídeos da invenção operacionalmente associados com - um promotor. Em algumas realizações, os polinucleotídeos da : invenção estão operacionalmente associados com um promotor constitutivo. Em realizações particulares, o promotor constitutivo é o promotor 358 CaMV ou o promotor Ubi. De acordo com outras realizações, os polinucleotiíideos da invenção estão operacionalmente associados com um promotor induzível. Em realizações particulares, o promotor induzível é um promotor induzível por estresse. Em outras realizações, o promotor induzível é a versão modificada do promotor HaHB4 fundido com o primeiro iíntron de Arabidopsis Cox2-c.

[00124] Em realizações adicionais, os vetores da invenção contêm a sequência do promotor de alelo pequeno ' HaHB4 (SEQ ID Nº: 20), a sequência do promotor de alelo maior . HaHB4 (SEQ ID Nº: 21), ou um fragmento funcionalmente ativo ou derivado da sequência do promotor de alelo grande ou pequeno do promotor HaHB4. De acordo com uma realização, o promotor compreende as sequências de nucleotídeo 805 a 1221, 904 a 1221, 1011 a 1221, ou 15 a 622 da sequência do promotor de alelo pequeno HaHB4 (SEQ ID Nº: 20). De acordo com outra realização, o promotor compreende a sequência dos polinucleotídeos 15 a 409 ou 805 a 1221 da sequência do promotor de alelo grande HaHB4 (SEQ ID Nº: 21). De acordo com outra realização, o promotor compreende a sequência dos

B 75/107 polinucileotídeos 15 a 409 ou 8BOS a 1221! da sequência do promotor de alelo grande HaHB4 (SEQ ID Nº: 21). Em outra realização, o promotor compreende a sequência de um fragmento de pelo menos 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, ou 800 nucleotídeos da sequência do promotor de alelo pequeno HaHB4 (SEQ ID Nº: 20). Em uma realização : adicional, o promotor compreende a sequência de um fragmento , de pelo menos 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, * 500, 600, 700, ou 8900 nucleotídeos da sequência do promotor ' de alelo grande HaHB4 (SEQ ID Nº: 21).

[00125] Os numerosos promotores adicionais que estão ativos nas células de planta são conhecidos na técnica e são providos nos vetores de expressão de planta de acordo com várias realizações da invenção. Esses promotores incluem promotores presentes nos genomas da planta bem como promotores de vírus, bactérias e outras fontes, incluindo promotor de nopalina sintase (NOS) e promotores de octopina sintase (OCS) realizados em plasmídeos de indução de tumor de A. tumefaciens e promotores caulimovírus tais como promotores : do vírus do mosaico da couve-flor ou vírus do mosaico da BR escrofulária, Vide, por exemplo, os documentos de Patente Norte-Americana nº 5.858.742 e 5.322.938 que divulgam versões do promotor constitutivo derivado do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV35S), documento de Patente Norte-Americana nº 5.378.619 que divulga um promotor 358 do Vírus do Mosaico da Escrofulária (FMV), documento de Patente Norte-Americana nº 6,.437,217 que divulga um promotor RS81 do milho), documento de Patente Norte-Americana nº 5.641.876 que divulga um promotor actina do arroz, documento de Patente Norte- Americana nº 6,426,446 que divulga um promotor RS324 do milho, documentc de Patente Norte-Americana nº 6.429.362 que divulga um promotor PR-l1 do milho, documento de Patente Norte-Americana nº 6.232.526 que divulga um milho A3 promotor, U.S. Pat. No. 6,177,611 que divulga constitutive milho promotores, documento de Patente Norte-Americana nº

6.433.252 que divulga um promotor oleosina L3 do milho, : documento de Patente Norte-Amerícana nº 6.429.357 que divulga - um promotor actina 2 do arroz e íintron, documento de Patente . Norte-Americana nº 5.637.848 que divulga um promotor específico da raíz, documento de Patente Norte-Americana nº

6.084.089 que divulga promotores induzíveis ao frio, documento de Patente Norte-Americana nº 6.294.714 que divulga promotores induzíveis à luz, documento de Patente Norte- Americana nº 6.140.078 que divulga promotores induzíveis ão sal, documento de Patente Norte-Americana nº 6.252.138 que divulga promotores induziíveis por patógeno, documento de Fatente Norte-Americana nº 6.175.060 que divulga promotores induzíveis por deficiência de fósforo, Publicação do Pedido de Patente Norte-Americana nº 2002/01928613Al que divulga 5", ' 3' e elementos de íntron úteis no projeto de vetores de . expressão de planta eficazes, Pedido de Patente Norte- Americana nº 09/078,972 que divulga um promotor coixina, Pedido de Patente Norte-Americana nº 09/757,089 que divulga um promotor cloroplasto aldolase de milho, e Pedido de Patente Norte-Americana nº 10/739,565 que divulga promotores induzíveis por déficit de água, cada qual é incorporado aqui. por referência. Esse e outros numerosos promotores que funcionam nas células de planta são conhecidos na técnica e podem ser operacionalmente ligados aos polinucleotídeos da invenção e/ou usados nos vetores da invenção para acionar € i 77/107 controlar a expressão das sequências de polinucleotídeo em células de planta transgênica.

[001286] Em realizações adicionais, os polimucleotídeos da invenção (sozinhos ou em associação com sequência do vetor) estão operacionalmente ligados a um prometor derivado da região regulatória de um gene de planta : que é superexpresso em condições de défícit de água. Em - realizações particulares, os polinucleotiídeos da invenção estão operacionalmente ligados à um promotor derivado da região regulatória 5' correspondente a um gene selecionado de: proteina de choque térmico 17.5 (HSP17.5), HVAZ2 (HVAZ2), Rabl7, ou 4-hidroxilase de ácido cinâmico (CA4H)., Os promotores exemplares induzíveis ao déficit de água são revelados no decumento do Pedido de Patente nº 10/739,5465, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

[00127] Em outras realizações, os BpBolinucleotídeos da invenção estão operacionalmente ligados à um promotor que é, por sua vez, ligado operacionalmente à uma ou mais “sequências potenciadoras"” que elevam a expressão de 1 gene acionada pelo promotor. Tais potenciadores podem . normalmente ser inseridos na orientação para frente ou reversa 5' ou 3'” para a sequência de codificação e podem estar presentes no íntron. Numerosos potenciadores são conhecidos e/ou podem prontamente ser identificados usando reagentes e técnicas conhecidas na técnica. Os potenciadores exemplares que podem estar operacionalmente associados com os polinuceleotídeos da invenção incluem os íntrons 3' dos genes actina 1 do arroz e actins 2 do arroz, 2€ elementos do promotor CaMV 358 (Odell et al., Nature 6:810-812 (1985), genes octopina sintasse, o gene de alcohol desidrogenase de

Ú 78/107 milho, oc gene shrunken 1 de milho, o íntron Adh 1 (Callis et al., Genés and Develop., 1:1183 (1987)), íntron sacarose sintase (Vasil et al., Plant Physicl. 91:1575 (1989)) e elemento ômega TMV (Gallie et al., Célula de planta 1:301 (1989) ).

[00128] Em realizações adicionais, os polinucleotídeos da invenção (sozinhos ou em associação com - sequência do vetor) estão operacionalmente ligados a um - terminador de transcrição que é responsável por encerrar a 7 transcrição além dos polinucleotídeos da invenção e corrigir a poliadenilação do mRNA. Os terminadores de transcrição adequados exemplares conhecidos por funcionar em plantas incluem, entre outros, o terminador CaMV 35S, o rerminador tml, o terminador nopalina sintase derivado de A. tumefaciens (Bevan et al., Nucl. Acids Res., 11:369 (1983), Depicker et al., J. Mol. Appl. Genet. 1:561-573 (1982)), o terminador para rbcS E9, o terminador para a transcrição T7 do gene octopina sintase de A, rumefaciens, e a extremidade 3' dos genes do inibidor protease 1 ou II da batata ou tomate. ' [00129] Os vetores de tránsformação de planta R preferidos incluem aqueles derivados de um plasmídeo Ti de A, tumefaciens (por exemplo, conforme descrito nos documentos de Patente Norte-Amerícana nºs 5.981.840, 5.501.967, 4.536.475,

4.658.082, 4.693.977, e 4.886.937, e Simpson et al., Plant Mol. Biol. 6:403-15 (1986) e EP O 122 791)), os conteúdos de cada um são incorporados por referência em sua totalidade). Outros vetores de transformação de planta preferidos incluem aqueles revelados, por exemplo, por Herrera-Estrella et al., Nature 303:209-213 (1983); Bevan, M., Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721 (1984), e EP O 120 516, os conteúdos de cada um são

Ú 79/107 incorporados por referência em sua totalidade. Para à. tumefaciens com base no sistema de transformação de planta, os elementos adicionais presentes no construto do vetor de transformação incluem sequências de borda direita e esquerda do T-DNA para facilitar a incorporação do polínucleotídeo recombinante no genoma de planta. As descrições dos sistemas e métodos de vetor Agrobacterium para transferência de gene . mediada por Agrobacterium são providas em, por exemplo, - Gruber at al., “Vectors for Plant Transformation,” in Methods , in Plant Molecular Biology and Biotechnology supra; e Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238 (1989). De acordo com outras realizações, os vetores são parte do sistema de vetor binário, tal como pBini9S, pC22, pGA4S82, pcv0O0l, pJJI18S1, pPZP111, pPVP, pGreendo29, DCGNI547, BPMON10098, pBI1l21i (Bevan, Nuel. Acids Res. 12:8711-8721 (1984), pBI101 (Jefferson er al., EMBO J. 6:3901-3907 (1987)) Risch et al,, Plant Mol. Biol, 27:405-409 (1995), e Rothstein et al., Gene 53:153-161 (1987)), ver também, Becker et al., Plant Mol. Biol. 20:11955-1197 (1992) e Hajdukiewicz et al., Plant Mol. ' Biol. 25:989-994 (1994), cada qual é incorporado por . referência em sua totalidade.

[00130] Os vetores adicionais (incluíndo cassetes de expressão) e métodos e reagentes de cultura in vitro para célula de planta ou transformação de tecido e regeneração das plantas são conhecidos na técnica e podem prontamente ser aplicados ou modificados para praticar a invenção. A clonagem, manipulação E síntese do ácido nucleico, construções do vetor e outras técnicas recombinantes necessárias — para fazer e usar os polinucieotídeos, polipeptídeos, células hospedeiras, e plantas transgênicas da

Ú 80/107 invenção são geralmente conhecidos na técnica, por exemplo, conforme descrito em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y., (1989); and Kriegler, Gene Transfer and : Expressão: A Laboratory Manual (1990), que é incorporado por ' referência em sua totalidade : [00131] Em geral, pode ser preferido introduzir . um DNA recombinante funcional em uma localização não específica em um genoma de planta. Em casos especiais, pode ser útil inserir um construto de DNA recombinante através de integração de local específico. Existem diversos sistemas de recombinação de local específico, os quais são conhecidos por funcionar em plantas incluem cre-lox conforme revelado em, por exemplo, documento de Patente Norte-Americana nº

4.959.317 e FLP-FRT conforme revelado no documento de Patente Norte-Americana nº 5.527.695, os conteúdos de ambos são incorporados por referência em sua totalidade. ' [00132] A invenção também provê células : hospedeiras compreendendo os vetores (incluindo cassetes de expressão) e/ou polinucleotídeos da invenção. As células hospedeiras “compreendendo polinucleotiídeos da invenção incluem, entre outros, células de bactérias (por exemplo, E. coli), de fungos, de inseto, de planta e animal. Os polinucleotídeos da invenção podem ser integrados no genoma da célula hospedeira ou existir extracromossomicamente fo hospedeiro (por exemplo, um plasmídeo de replicação autônoma com uma origem de replicação). De acordo com algumas i 81/107 realizações, a sequência de polinucleotídeo da invenção está operacionalmente ligada à um promotor,

[00133] Acredita-se que os métodos adequados para transformação das células hospedeiras para uso com à invenção atual incluem virtualmente qualquer método conhecido na téonica através do qual o DNA pode ser introduzido : (transiente ou estavelmente) em uma célula. Por exemplo, os ' polinucieotideos da invenção podem ser rotineiramente - transformados nas células hospedeiras bacterianas, tais como ' E coli, & outros hospedeiros através da transfecção de fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-Dextrano, ou eletroporação (Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) ).

[00134] Alternativamente, as células hospedeiras podem ser transformadas com polinucleotídeos da invenção usando técnicas tais como, absorção direta de DNA em protoplastos usando precipitação de call, álcool polivinílico ou poli-L-ornitina (vide, por exemplo, Hain et al., Mol. Gen, Genet, 199:161 (1985); e Draper et al., Plant ' Cell Physiol. 23:451 (1982)).

[00135] Em realizações adicionais, as células hospedeiras são transformadas com polinucleotídeos da invenção usando uma técnica conhecída na técnica, As técnicas exemplares para transformar as células hospedeiras incluem transformação de protoplasto (vide, por exemplo, documento de Patente Norte-Americana nº 5.508.184), microinjeção (Crossway, et al., Biotechniques 4:320-334 (1986); e documento de Patente Norte-Americana nº 6.300.543), eletroporação (Riggs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5602-5606 (1986) Fromm, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA

' 82/107 82:5824-5828 (1985) ), transferência direta de gene (Paszkowski et ali., EMBO J. 3:2717-2722 (1984)), métodos de sonicação (Bao et al., Ultrasound in Medicine & Biology 23;953-959 (1997); Finer et al., Lett. Appl. Microbiol. 30:406-10 (2000); Amoah et al., J. Exp. Bot. 52:1135-42 (2001) ); métodos de polietilenoglicol (Krens et al., Nature : 296: 72-77 (1982)); absorção de DNA mediada por . dessecação/inibição (Potrykus et al., Molec. Genet. 199:183 . (1985), eletroporação (documento de Patente Norte-Americana ' nº 5.384.253), agitação com fibras de carboneto de silício (documentos de Patente Norte-Americana nºs 5.302.523 e

5.464.765), através da transformação mediada por Agrobacterium (documentos de Patente Norte-Americana nºs

5.563.055; 5.591.616; 5.693.512; 5.824,877; 5.981.840;

6.384,301) e através de bombardeamento de microprojéteis revestidos com DNA (documentos de Patente Norte-Americana nºs

6.399.861; 6:160.208; 6.403.865; 5.015.580; 5.550.318;

5.538.880; 4.945.050; Publicação do Pedido de Patente Internacional nº WO 91/10725; e McCabe et al., Biotechnology ' 6:923-926 (1988)), Sanford, Physiol, Plant 79:206 (1990); e : Klein er al., Biotechnology 10:268 (1992)), Tomes et al., “Direct DNA Transfer into Intact Cell Plants Via Microprojectile EBombardment” pp. 197-213 in Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods. eds. O. L. Gamborg & G, C. Phillips. Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York, 1995; Padgette ef al., 1995).

[00136] No caso de espécies multicelulares, as células transgênicas podem ser regeneradas em organismos transgênicos usando técnicas conhecidas na técnica tais como aquelas descritas em Christou et al., Plant Physiol. 87:671-

674 (1988) (soybean); Datta et al., Biotechnology 8:736-740 (1990) (arroz); Klein et al., Proc.

Natl.

Acad, Sci.

USA B5:4305-4309 (1988) (milho); Klein et àal., Biotechnology 6:559-563 (1988) (milho); Int.

App.

Pub.

No.

WOS1/10725 (milho); Klein et al., Plant Physiol. 91:440-444 (1968) (milho); e Gordon-Kamm et al., Cell Plant 2:603-618 (1990) : (milho). : [00137] Os polinucleotídeos da invenção podem . geralmente ser introduzidos (transiente ou estavelmente) nas B plantas através de uma ou mais técnicas tipicamente usadas para distribuição direta nas células.

Tais protocolos podem variar dependendo do tipo de planta, pOr exemplo, menocotiledônea ou dicotiledônea, e a parte da planta marcada para a modificação do gene.

Numerosos métodos para produção dos núcleos da célula de planta com DNA recombinante são conhecidos e podem ser usados de acordo com a invenção.

Dois mérodos comumente usados para transformação da planta são transformação mediada por Agrobacterium e bombardeamento de microprojétil.

Os métodos exemplares de bombardeamento de ' microprojétil são revelados nos documentos de Patente Norte- . Americana nºs 5.015.580 (soja); 5.550.318 (milho); 5.538.880 (milho); 5.914.451 (soja); 6.160.208 (milho); 6.399.861 (milho) e 6.153.812 (trigo). Os mérodos exemplares de transformação mediada por Agrobacterium são descritos nos documentos de Patente Norte-Americama nºs 5.159.135 (algodão); 5,824.877 (soja); 5.591.616 (milho); r 6.384.301 (soja), e Horsch et al., Science 227:1229-31 (1985)), os conteúdos de cada qual são incorporados por referência em sua totalidade, Em realizações adicionais, à transformação mediada por Agrobacterium é realizada de acordo com os

: 84/107 métodos revelados em Hofgen et al., Nucleic Acid Research 16: 9977 (1998), ou usando um método de imersão (imersão floral), tal como descrito por Clough et al., Plant J. 16:735-743 (1998), os conteúdos de cada qual são incorporados por referência em sua totalidade.

[00138] Os recipientes de célula de planta dos . polinucleotideos da invenção incluem, entre outros, cultura : de célula de planta, células de meristema, calo, embriões . imaturos e pólen e células somáticas. De acordo com algumas - realizações, a célula de planta hospedeira é uma dicotiledônea. De acordo com outras realizações, a célula de planta hospedeira é uma monocotiledôênea. Uma vez transformada, as células de planta podem ser usadas para regenerar às plantás transgênicas. Os reagentes e métodos de transformação exemplares para fazer plantas transgênicas são descrito, por exemplo, nos documentos de Patente Norte- Americana nºs 6,.194,636, 6.232.526, e 4,659,082, e Shahin, Thecor. Appl. Genet. 69:235-40 (1985); os conteúdos de cada um são incorporados por referência em sua totalidade, 1 [00139] A semente de plantas transgênicas, pólen e partes da planta compreendendo um polinucleotideo Ou polipeptídeo da invenção estão englobados pela invenção. Em algumas realizações, os polinucleotídeos da invenção estão integrados no DNA da planta transgênica. Em realizações específicas, os polinucleotídeos da invenção estão estavelmente integrados no DNA genômico do hospedeiro. Em realizações adicionais, os polinucleotíideos da invenção existem extracromossomicamente (por exemplo, um plasmídeo de replicação autônoma com uma origem de replicação) dentro da célula de planta hospedeira. De acordo com algumas

Ú 85/107 realizações, os polinucleotídeos da invenção estão operacionalmente ligados a um promotor. Em outras realizações, pelo menos uma célula em uma planta transgênica, célula de planta, semente, pólen ou parte da planta expressa ou é Capaz de expressar um polipeptídeo da invenção. Ainda em outra realização, pelo menos uma célula em uma planta . transgênica, célula de planta, semente, pólen ou parte da . planta expressa ou é capaz de expressar uma proteína da . invenção que é capaz de se ligar à sequência de DNA de não codificação endógena da célula de planta hospedeira in vitro.

[00140] As plantas “hospedeiras”, célula de plantas, semente, pólen e partes da planta que podem ser usadas e produzidas de acordo com os métodos da invenção (bem como sua progenia de reprodução sexuada ou assexuada) incluem virtualmente qualquer espécie na qual os polinucleotídeos da invenção podem ser introduzidos (transiente ou estavelmente), As plantas hospedeiras e células de planta hospedeira da invenção incluem plantas de cultura ou plantas usadas para produzir alimento e ração. De acordo com algumas realizações, ' a planta hospedeira, célula de planta, semente, pólen e parte de planta é uma monocotiledônea. Em algumas realizações, à planta hospedeira, célula de planta, semente, pólen, parte de planta, ou produto transgênico da mesma é soja (Glycine max). Em algumas realizações, a planta hospedeira, célula de planta, semente, pólen, parte da planta, ou produto transgênico da mesma é trigo (Triticunm aestivum). Em realizações adicionais, a planta hospedeira, cêlula de planta, semente, pólen, parte da planta, ou produto transgênico da mesma é milho (Zea mays). Em realizações adicionais, a planta hospedeira, célula de planta, semente,

pólen, parte da planta, ou produto transgênico da mesma é arroz (Oryza sativa). Em outras realizações, a planta hospedeira, célula de planta, semente, pólen, parte da planta, ou produto transgênico da mesma é algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum). Em outras realizações, a planta hospedeira, célula de planta, semente, pólen, parte da planta, ou produto transgênico da mesma é cana de açúcar i (Saccharum spp.). Em realizações adicionais, àa planta . hospedeira, célula de planta, semente, pólen, parte da : planta, ou produto transgênico da mesma é Arabidopsis (por exemplo, Arabidopsis thaliana).

[00141] De acordo com as realizações adicionais, a planta hospedeira, célula de planta, semente, pólen, parte da planta, ou produto transgênico da mesma é selecionada do grupo consistindo em: alfalfa (Medicago sativa), Brassica sp. (por exemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea): particularmente aquelas espécies Brassica úteis como fontes de óleo de semente incluindo, canola, girassol (Helianthus annuus), açafrão (Carthamus tinctorius), amendoins (Arachis hypogaea, : sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare)), aveia, centeio (Secale cereale), painço (por exemplo, mi lheto-pérola (Pennisetum glaucum)), milheto proso (Panicum miliaceum), milheto rabo de raposa (Setaria italica), milheto em forma de dedo (Eleusine coracana), tabaco (Nicotiana tabacum), cevada (Hordeum), avelas tAvena sátival), tomates (Lycopersicon esculentum), abóbora, melões (por exemplo, melão rendilhado (IC. melon), e cantalupo (C. cantalupensis)), cana de açúcar (Saccharun spp.), uma leguminosa diferente de soja, e tubérculo/raízes ricos em amido, por exemplo, batata (Solânum

" 87/107 tuberosum), batata-doce (Ipomosea batatus), cassaya (Manihot esculenta), inhame, cana, e beterrabas (Beta vulgaris).

[100142] Em outras realizações, a planta hospedeira, célula de planta, semente, pólen, parte da planta, ou produto transgênico da mesma é um legume, As células hospedeiras dos legumes (plantas) da invenção . incluem, por exemplo, alface (por exemplo, Lactuca sativa), - vagens (Phaseolus vulgaris), feijões lima (Phaseolus . limensis), ervilhas (Lathyrus sbpp.), e membros do gênero : Cucumis tal como pepino (C. sativus).

[00143] Em outras realizações, a planta hospedeira, célula de planta, semente, pólen, parte da planta, ou produto transgênico da mesma é selecionada do grupo consistindo em: café (Cofea sSpp.l, coco (Cocos nucifera), abacaxi (Ananas comosus), árvores cítricas (Citrus sSpp.), cacau ([Theobroma cacao), chá (Camellia sinensis), banana (Musa Spp.), abacate (Persea ameericana), figo (Ficus cTasica), goiaba (Psidium guajava), manga (Mangijera indica), azeitona (Olea europaea), papaia (Carica papava), caju (Anacardium occidentale), macadâmia (Macadamia integrifolia), . e amêndoa (Prunus amygdalus).

[00144] Semente, pólen, tecido, células e progenia das plantas transgênicas e células da invenção também estão dentro do escopo da invenção.

[00145] Em uma realização, a invenção engloba uma planta transgênica transformada com uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de polinucleotídeo da invenção, em que a sequência de polinucleotídeo é expressa de modo a produzir uma proteína recombinante na planta e em que a proteina recombinante provê uma produtividade aumentada da

. 88/107 planta como comparado à uma variedade tipo selvagem da planta sob às mesmas condições. De acordo com algumas realizações, a planta é uma monocotiledônea. Em outra realização, a planta é milho. Em uma realização adicional, a plánta é trigo. Em outra realização, a planta é arroz. De acordo com outras realizações, à planta transgênica é uma dicotiledônea. Em uma realização, a planta transgênica é soja. Em uma adicional realização, a planta transgênica é Arabidopsis.

[900146] Em outra realização, a invenção engloba . uma semente de planta transgênica transformada com uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de polinucleotideo da invenção, Em due a sequência de polinucleotídeo é expressa de modo a produzir uma proteína recombinante na semente da planta e em que a dita proteína recombinante provê uma tolerância aumentada à estiagem como comparado à uma variedade tipo selvagem da semente da planta sob às mesmas condições. De acordo com algumas realizações, a semente de planta transgênica é uma monocotiledônea. Em uma realização, a semente de planta transgênica é milho. Em uma : realização, a semente de planta transgênica é trigo. Em outra realização, à semente de planta transgênica é arroz. De acordo com outras realizações, a semente de planta transgênica é uma dicotiledônea. Em uma realização, a semente de planta transgênica é soja. Em uma realização adicional, a semente de planta transgênica é Arabidopsis.

[00147] Em outra realização, a invenção engloba um método de produção de um hospedeiro transgênico de maior produtividade compreendendo (a) transformar estavelmente uma célula de planta com uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeo da invenção,

- 89/107 em que 0 ácido nucleico é capaz de ser expresso na célula de planta, e (b) regenerar a célula em uma planta. De acordo com uma realização, a célula de planta é uma monocotiledônea. Em outra realização, a célula de planta é milho. Em uma realização, a célula de pianta é trigo. Em outra realização, a célula de planta é arroz. De acordo com outras realizações, a célula de planta é uma diçotiledônea. Em uma realização, a célula de planta é soja. Em uma realização adicional, a ] célula de planta é Arabidopsis.

[00148] Os métodos e reagentes para regenerar às plantas e tecido de planta da célula transgênica são conhecidos na técnica e variam de espécie para espécie de plantas, Geralmente, a célula é cultivada para formação do calo, e à formação de brotos é induzida a partir do calo e subsequentemente enraizada. Alternativamente, à formação de embriões pode ser induzida no recido do calo. Esses embriões germinam como embriões naturais para formar as plantas. Os meios de cultura geralmente contêm componentes suficientes para sustentar o crescimento e à dívisão da célula, e incluem, por exemplo, aminoácidos e hormônios tais como, auxginas e citocininas, para sustentar o crescimento e induzir a diferenciação celular. É previsto que após à integração estável de polinucleotídeos da invenção no DNA genômico do hospedeiro, os polinmucleotídeos podem ser transferidos para outras plantas através de cruzamento sexual. Qualquer uma de várias técnicas de reprodução padrão pode ser usada, dependendo da espécie a ser cruzada. Uma vez que às plantas transgênicas desse tipo são produzidas, as próprias plantas podem ser cultivadas de acordo com o procedimento convencional, de modo que o construto de ácido nucleico

. 30/107 esteja presente nas plantas resultantes. Alternativamente, às sementes ou propáguios transgênicos (por exemplo, mudas) são recuperados das plantas transgênicas. Essas sementes podem então ser plantadas no solo e cultivadas usando procedimentos convencionais para produzir as plantas transgênicas.

[00149] Em algumas realizações, a invenção provê um método de cultivo de uma planta transgênica compreendendo, (a) plantar uma semente transgênica compreendendo um ácido i nucleico, vetor e/ou cassete de expressão da invenção e (b) : cultivar uma planta transgênica a partir da semente transgênica. Em algumas realizações, o método ainda compreende a etapa de colheita da planta transgênica. Em realizações adicionais, o método ainda compreende a etapa de replantio da semente a partir da planta transgênica. Em algumas realizações, a planta transgênica é uma monocotiledônea, Em realizações adicionais, a planta transgênica é milho. Em outras realizações, à planta transgênica é trigo. Em algumas realizações, a planta transgênica é arroz. Em outras realizações, à planta transgênica é uma dicotiledônea. Em algumas realizações, a planta transgênica é soja.

[00150] A planta transgênica formada usando métodos de transformação de Agrobacterium tipicamente pode conter uma sequência DNA recombinante simples única inserida em um cromossomo, referido como um evento transgênico. Tais plantas transgênicas podem ser referidas como sendo heterozigotas para à sequência exógena inserida. Uma planta transgênica homozigota com relação à um transgene pode ser obtida pelo acasalamento sexual (“autopolinização”) de uma planta transgênica segregante independente que contém uma

' 91/107 sequência de gene exógeno único para ela mesma, por exemplo, uma planta FO, para produzir semente Fl, Um quarto da semente Fl produzida será homozigotoe com relação ao transgene, Germinar semente F1 resulta em plantas que podem ser testada para heterozigosidade, tipicamente usando um ensaio SNP ou um ensaio de amplificação térmica que permite a distinção entre heterozigotos e homozigotos (isto é, um ensaio de . zigosidade). Cruzar uma planta heterozígota com ela mesma ou outra planta heterozigota resulta em progenia heterozigota, ' bem como progenia transgênica homozigota e nula homozigota.

[00151] Além disso, para a transformação direta de uma planta com um polinucleotídeo da invenção, as plantas transgênicas podem ser preparadas pelo cruzamento de uma primeira planta que tenha um polinucleotídeo da invenção com uma segunda planta que falta o polinucleotídeo da invenção. Por exemplo, um polinucleotideo da invenção pode ser estavelmente introduzido (isto é, integrado no DNA genômico) na primeira linhagem de planta que é favorável à transformação para produzir uma planta transgênica que possa ser cruzada com uma segunda linhagem de planta para introduzir o polinucleotídeo da invenção na segunda linhagem de planta.

[00152] Também são providos métodos de uso dos polinucleotiídeos da invenção para produzir uma plâánta caracterizada por ter um traço melhorado, compreendendo as etapas de introdução de um polinucleotídeo da invenção em uma célula de planta hospedeira, seleção da presença da molécula de polinucleotídeo para produzir uma célula de planta transgênica, e regenerar uma planta transgênica a partir da célula de planta transgênica, por meio de que a planta transgênica tem um traço melhorado quando comparado a uma planta tipo selvagem comparável ou uma planta transgênica de HaHBd em que HaHB4 está sob o mesmo promotor. Os traços melhorados das plantas transgênicas que podem ser selecionadas de acordo com os métodos da invenção incluem, entre ceutros, eficácia melhorada do uso da água (por exemplo, “tolerância à estiagem”), tolerância melhorada à salinidade, : tolerância melhorada ão estresse osmótico, produtividade aumentada, e combinações da mesma.

PRODUTOS DE PLANTA, SEMENTE E PARTE DA PLANTA

[00153] Em realizações adicionais, a invenção refere-se a produtos de base de planta e métodos para produzir produtos de base de planta, produzidos a partir de uma planta ou parte da planta conforme descrito aqui, Os produtos de base contendo sequências de polinucieotídeo ou polipeprídeo da invenção, e produzidos a partir de uma planta ou semente transgênica contendo as sequências de polinucleotídeo da invenção são especificamente contemplados como realizações da invenção, Om produto de base contendo um polinucleotídeo ou polipeptídeo da invenção pretende incluir, entre outros, refeições, óleos, grãos triturados ou integrais ou sementes de uma planta, ou qualquer produto alimentício compreendendo qualquer refeição, óleo ou grão triturado ou integral de uma planta ou semente recombinante contendo uma ou mais das sequências da presente invenção. Assim, de acordo com uma realização, a invenção engloba produto de planta processado “contendo uma quantidade detectável de um polinucleotídeo ou polipeptídeo da invenção em que o produto de planta compreende um alimento, uma refeição, uma farinha, um extrato ou homogenato obtido de pelo menos uma parte de

' 933/107 uma planta. Em uma realização adicional, a invenção engloba um produto de planta processado contendo uma quantidade detectável de um polinucleotídeo ou políipeptideo da invenção em que o produto de planta compreende um alimento, uma refeição, uma farinha, extrato ou homogenato de uma semente. A detecção dos polinucleotídeos e polipeptídeos da invenção em produtos de planta processados pode ser realizada usando ' técnicas e regentes conhecidos na técnica incluíndo, por exemplo, PCR, é análise Northern, Southern, e Western.

EMPILHAMENTO DO GENE

[00154] A presente invenção “também engloba sementes é plantas que têm um ou mais eventos transgênicos, A invenção também contempla que os polinucleotídeos e polipeptídeos da invenção podem ser usados em combinação com outros “eventos” transgênicos para criar plantas com múltiplos traços desejados ou ainda um traço melhorado, Esses eventos transgênicos “empilhados” podem ser eventos que são direcionados ao mesmo organismo ou traço alvo, ou eles podem ser direcionados a diferentes patógenos, pragas ou traços alvo. Além disso, os eventos empilhados podem ser criados por qualquer método incluindo, entre outros, cruzamento de plantas transgênicas, ou múltipla transformação genética.

[00155] Em algumas realizações, uma semente ou planta transgênica da invenção adicionalmente tem um evento transgênico empilhado que provê tolerância à herbicida. Exemplos de herbicidas para os quais a expressão recombinante provê resistência incluem, entre outros, dicamba, glufosinato-amônio e glifosato e N-(fosfonometil) glicina, incluindo sua forma de sal de isopropilamina.

[00156] Em realizações adicicnais, uma semente ou planta transgênica da invenção adicionalmente tem um evento transgênico empilhado que provê resistência a insetos, Exemplos de genes para os quais a expressão recombinante provê resistência à insetos incluem, entre outros, variantes do Bacillus thuringiensis Cry (por exemplo, CrylA, CrylAc, Cry2A, CrylF-lAc, Cry3A, Cry3Bb, Cry35Abl) e/ou famílias do . Cyt.

[00157] Em outras realizações, uma Semente Ou ' planta transgênica da invenção adicionalmente tem um evento transgênico empilhado que provê resistência À doença fúngica, doença viral ou doença bacteriana ou infestação (por exemplo, infestação por nematoide).

100158] Em outras realizações, uma semente ou planta transgênica da invenção adicionalmente tem um evento transgênico empilhado que provê resistência a um estresse ambiental selecionado do grupo consistindo em: condições de estiagem, condições de salinidade, estresse osmótico, exposição E) temperatura fria, exposição ao calor, disponibilidade reduzida de nutriente de nitrogênio, disponibilidade reduzida de nutriente de fósforo, e alta densidade da planta,

[00159] Em outras realizações, uma semente ou planta transgênica da invenção adicionalmente tem um evento transgênico empilhado que provê eficácia ou produtividade aumentada do uso de nitrogênio.

EXEMPLOS

[00160] A invenção é ainda descrita nos Exemplos a seguir. Deve ser entendido que esses Exemplos são providos a título de ilustração apenas. Da discussão acima e dos

Exemplos a seguir, pode-se determinar as características essenciais dessa invenção, e sem se afastar do espírito e escopo da mesma, pode-se fazer várias mudanças e modificações da invenção para adaptá-los à vários usos e condições.

EXEMPLO 1

[00161] Geração e Caracterização dos Construtos de Expressão de HaHB4.2 Modificado . [00162] O quadro de leitura aberta de cDNA que codifica HaHBA4 de comprimento total (SEQ ID Nº: 1) clonado nos locais de BamHl/Sacl do vetor pBlueScript SK (Stratagene, Upsala, Sweden) foi usado como um modelo para uma série de reações de PCR para criar HaHB4 modificado. Em uma primeira etapa, uma reação de PCR foi realizada usando o iniciador dianteiro Hám-F (5'-ATGTCTCTTCAACAAGTAACAACCACCAGG- 3'; SEÇG ID Nº: 22) e o iniciador reverso Transf2 (5'- GCCGAGCTCTTAGAACTCCCACCACTTTTG-3'; SEQ ID Nº: 23) para gerar um primeiro produto PCR amplificado. O projeto do iniciador para essa execução de ampliação amplificou um produto que contém um local de iniciação de transcrição recêém-introduzido e local de encerramento da transcrição. O primeiro produto de amplificação de PCR foi clonado em um vetor pGEMO-T-Easy (Promega, Madison, Wisconsin) e chamado “pTHaHB4.2a.”

[00163] pPTHaHB4.2a foi, por sua vez, usado comoôó o modelo em uma segunda reação de amplificação de PCR usando o iniciador dianteiro HAm-=F (5' =ATGTCTCTTCAACAAGTAACAACC ACCAGG-3'; SEQ 1D Nº: 22) e um iniciador reverso designado H4m-R (S-TTAGAACTCCC ACCACTTTTIGAABGGTCTGG-3'; SEQ ID Nº: 24) para gerar um segundo produto de amplificação de PCR que foi então clonado em um vetor pGEMGO-T-Easy e chamado pTHaHB4.2b.

[00164] Em uma terceira reação de amplificação de PCR, pTHaHB4.2b foi usado como um modelo em uma reação de PCR usando dois conjuntos de iniciadores, um conjunto de iniciadores correspondendo ao iniciador dianteiro Transf-l (5' =-GCSGGATCCACCATGTCTCTTCAACABGTA-3'; SEQ ID Nº: 26) e um iniciador reverso designado H4m-R1 (8'- GTTTCCTTCTTCAAGGTACGCAAAAC CGTCGC-3'; SEQ ID NE: 27) e um segundo conjunto de iniciadores consistindo no iniciador ' dianteiro H4m-Fl (5'-CGGTTTTGCGTACCTTGAAGAAGGAAACAGTTTG-3'; SEQ ID Nº: 25) e o iniciador reverso Transf-2 (58'- GCCGAGCTCTTAGAACTCCAACCACTT TTG-3'; SEQ TD Nº: 23). Os produtos amplificados dos 2 conjuntos de iniciadores foram então fundido em uma sequência de polinucleotídeo quimérica contígua usando técnicas recombinantes convencional. Vide, por exemplo, Silver J, Limjoco T, Feinstone S (1995) Site- specific mutagenesis using the polymerase chain reaction. Ini Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ (eds.) PCR Strategies. Academic Press Inc, San Diego, pp 179-188. Brevemente, a estratégia incluiu à desnaturação de ambos os produtos de PCR seguidos pela mistura e etapas de hibridização. Os produtos de hibridização foram estendidos com a enzima Klenow e em outra reação de PCR foi realizada a sequência de polinucleotídeo —quimérica como o modelo, o iniciador dianteiro Transf-1 (SEQ ID Nº: 26) e os iniciadores reversos Transf-2 (SEQ 1D Nº: 23). O produto de PCR ampiifícado dessa reação foi então clonado em um vetor pGEMG-T-Easy e chamado pTHaHB4.2c,

[00165] Uma análise de sequência dos produtos amplificados em cada etapa do processo de geração do construto de expressão de pTHaHB4.2c revelou o seguinte

: 97/107 quando comparado com a sequência de polinucleotídeo HaHB4 dá SEQ ID Nº: 1: (a) o produto de FCR amplificado codificou um polipeptídeo contendo uma exclusão de quatro aminoácidos na região amino terminal (7 alO resíduos de aminoácidos da SEQ ID Nº: 2); (b) o segundo produto de PCR amplifícado continha uma mutação de F175L em uma região que codifica o domínio de ativação putativo de HaHB4i, e uma exclusão de quatro nucleotídeos localizados no 5º” UTR; (c) o produto da terceira ' reação de PCR continha uma mutação L159F em uma região que . codifica a porção carbóxi terminal de HaHB4; e (d) o produto amplificado da última reação de PCR descrita acima continha uma mutação conservadora R22K.

[90166] A inserção em pTHaHB4,2c foi então amplificada em uma reação de PCR à fim de introduzir uma mudança de aminoácido conservador K22R. A sequência correspondente à inserção amplificada em PpTHaHB4.2c foi sequenciada e determinada para corresponder ao polinucleotídeo SEQ ID Nº: 3 e para codificar a sequência de polipeptídeo reveladas na Figura 1A-B (SEQ ID Nº: 4). A Figura 1A-B apresenta um alinhamento indicando as diferenças de sequência de HaHB4 (SEQ ID Nº: 2), HaHB4.2 (modlHaHB4 (SEQ ID Nº: 4)) e um fator de transcrição HaHB4 modificado adicional (mod2HaRB4 (SEQ ID Nº: 8)).

CONSTRUTOS DE EXPRESSÃO DE HaHB4,.2

[00167] As sequências de polinucleotídeo pTHaHB4.,2c (HaHB4,.2) geradas acima foram clonadas em ligação operacional nos vetores de milho, soja e trigo pará gerar os construtos de expressão de soja (figuras. 2A-2C), trigo (figuras 2D-2G) e milho (figuras 2H-2J4) esquematicamente descritos nas figuras 2A-27. Cada um dos construtos de expressão descritos nas figuras 2A-2J, contém à sequência de HaHB4.2 que codifica uma proteína de modlHaHB4 de comprimento total de 177 amincácidos (isto é, HaHB4,.2 (SEQ ID Nº: 4)) e está operacionalmente ligada com (a) um promotor constitutivo, tal como o promotor 35S CaMV (pZzmHaHB4.2, pGmHaHB4.2) ou promotor Ubi (pTaHaHB4.2), ou (b) um promotor induziível composto de uma versão modificada do promotor HaHB4 fundido com o primeiro íntron do gene de Arabidopsis Cox5c-2 ' (LPF-Cox) (pzmPrInhBH4,2, pGmPrinHB4.2, e pTaPrInHB4,2), Cada um dos construtos de expressão descritos nas figuras 2A-20 também contém um marcador de seleção e um terminador nos a jusante do cDNA de HaHB4,2.

EXEMPLO 2

[00168] Produção de Plantas transgênicas de HaHB4 Modificado

GERAÇÃO E SELEÇÃO DE EVENTOS TRANSGÊNICOS DE SOJA modlHaHB4

[00169] Os eventos transgênicos de soja modlHaHB4 foram gerados usando um protocolo mediado por Agrobacterium e o cultivar Williams 82. As sementes T, foram obtidas para 35 eventos independentes usando três diferentes cassetes de expressão refletindo estratégias, uma constitutiva e duas induzíveis. A expressão da sequência de codificação do cDNA de modlHafiBiá nos eventos constitutivos foi acionada pelo promotor 35S CaMV. A expressão da sequência de codificação do CDNA de modlHaHB4 nos eventos induzíveis foi direcionada pelo alelo longo do promotor nativo HaHB4 ou uma sequência de polimucleotideo quimérica contendo 5 mesmo alelo longo do promotor HaHB4 e o íntron AtCOX5c2.

: 292/107 (00170) A primeira multiplicação das células transformadas foi conduzida em uma estufa durante o tempo que T, individuais derivados de cada evento foram amostrados por um teste de segregação através da determinação de PCR. As línhagens derivadas de selfings de indivíduos a partir de eventos selecionados (segregação 3:1 em T1) foram semeadas e as plantas foram amostradas usando análise de PCR para identificar as linhagens homozigotas, conforme indicado pela ausência de segregantes negativos dentre a progenia amostrada ' (pelo menos 5 indivíduos amostrados por linhagem). Alguns segregantes negativos identificados durante o processo de triagem foram mantidos como “linhagens nulas” de controle.

[00171] O aumento da semente (semente T;) de linhagens nulas e de homozigoto de cópia única foi conduzido em uma estufa durante a qual às sementes de linhagens de homozigoto modlHaHB4 selecionado foram usadas para confirmar a insensibilidade de etileno e para quantificar Hahb4 e os níveis de expressão de gene à jusante (LOX2 e CSD-l1) nas linhagens selecionadas. As linhagens de homozigoro de modlHaHB4 selecionado também foram avaliadas para tolerância ao estresse de estiagem em condições de laboratório. Vinte e duas linhagens de célula de homozigoto modliHaHBá de cópia única foram identificadas para estudo posterior.

ENSAIOS DE CAMPO DE SOJA TRANSGÊNICA modlHaHB4

[00172] A soja transgênica (modlHaHB4 (SEQ ID Nº: 4)) e às linhagens de controle foram avaliadas em condições de campo em Liborio Luna (33º35'15”S, 65º38'09”W), San Luis, Argentina. O sólo foi um franco arenoso com um pH de 5,99 e conteúdo de matéria orgânica de 1,41 %. A precipitação média anual é de 800 mm.

- 100/107

[00173] Quinze linhagens transgênicas, sete linhagens de segregantes negativos (nulos) e o tipo selvagem (Williams 82) foram plantadas em uma taxa de 28 plantas por m”. O projeto experimental foi um bloco aleatério completo, subparcelas com 3 replicações com à irrigação como a principal parcela e às linhagens de soja como as subparcelas. Dois níveis (alto e baixo) de regime e irrigação foram aplicados. Para o regime de irrigação baixo, o fornecimento de água foi suspenso dos estágios reprodutivos da planta R1 a - R6, Portanto, esse regime consistiu em apenas duas aplicações de água, uma nó começo da estação e o outro no final da estação. Conforme indicado na Tabela l, o alto regime de irrigação consistiu em aplicações de água mensais.

[100174] As parcelas tinham 5 m de comprimento com 4 filas espaçadas em 0,7 m. Os pesticidas e fertilizantes foram aplicados de acordo com as práticas locais. Os dados de produtividade foram obtidos a partir de duas filas centrais em cada parcela. As plantas foram recortadas à mão e debulhadas com 5 equipamento estacionário, O peso e umidade da semente foram gravados. A produtividade para cada replicação é apresentada na Tabela 2. Tabela 1: Regime de Irrigação e Precipitação Durante Estação Crescente do Ensaio de Campo

- 101/107

[00175] os dados de produtividade foram analisados como subparcela, usando procedimento GLM (SAS software) que permite análises de variação para os conjuntos de dados com valores omissos. Às diferenças significativas foram detectadas em um nível alfa de 0,05. O tratamento (irrigação alta e baixa) foi a parcela principal e as linhagens de soja foram as subparcelas. Os dados de produtividade são apresentados na Tabela 2.

' [00176] Houve tratamento siaúnificativo (p=0,0079) 2 e efeitos principais da linhagem (p<0,000!1). O regime de baixa irrigação causou uma redução da produtividade de 35% comparada ao regime de alta irrigação (de 2900 Kg ha a 1897 Kg ha). Dado que nem todas as linhagens de homozigote tiveram suas contrapartes nulas, as comparações entre as linhagens nulas e de Hhomozigoto foram realizadas dentro ou entre as construções. As linhagens transgênicas de modlHaHB4 homozigoto dentro ou entre as construções e dentro da mesma linhagem tiveram produtividade maior do que as linhagens nulas, exceto à linhagem a3H. Essa linhagem de homozigoto teve rendimento menor que seis linhagens nulas (a7N, a9N, b1N, bêN, blON, c4N). Não houve diferenças significativas de produtividade entre as linhagens transgênica e nula para eventos transgênicos induzíveis dentro da mesma linhagem. Entretanto, os eventos transgênicos constitutivos modlHaHB4 a'H e a%iH tiveram produtividade maior do que suas contrapartes nulas respectivamente, em ambos os regimes de alta e baixa irrigação. Os eventos nulos à9N, a7N e uma linhagem de homozigoto (a3H) teve uma redução de produtividade significativa quando comparado a Williams 82.

- 102/107 Tabela 2: Dados de produtividade (kg.na")) para as condições de alto me baixo crescimento Íírrigado para as linhagens de soja transgênica constitutiva modlHaHB4 testadas, (NA= não disponível). Trata- Produtividade Linha-| mento |n15co 1 [Bloco 2| Bloco 3 | Média gem Irri- gado | a3H | Baixo [1063,11 |1221,52 | JJ ate [1672,54 1725,13| 52,59 : | a5H | Baixo [1931,31 |2021,73]2271,80 | 2074,95| 101,83 | "| alto [2704,24 |3355,42]3562,40 [3207,35]258,55 2253,47 |1566,59]2192,43 | 2004,83/ 218,83 o AIto |3004,71 |3285,00] 3001,79 | 3097,17] 93, 92 1975,54 /1901,83/2106,19 | 1994,52] 59,75 [ae [3073,30 [3315,00]3070,29 [3152,86 681,07 | 2170,36 | 1997,26; 1872,34 | 2013,32] 86,40 | [| alto [J2979,64 |3056,01]28059,58 /2948,41/72,83 | 2088,8681 |1935,13| 1905,47 | 1976,47] 56, 82 | | a1o |2260,03 [2827,00]3333,66 | 2806, 90] 310,09 1874,16 1802,11 [1853,82] 26,05 | [| | alto [1957,21 [2292,51]/2690,64 [2313,46/211,598 | a9N | Baixo [1607,35 | 1694,60/1656,00 [1652,65] 25,24 [ [am | 2218,5] 2756, | 3072,3] 2681, | 250,87

[109177] As fíguras 3A-3D proveem gráficos em barra indicando melhora na produtividade em culturas transgênicas em condições de campo irrigado (sem limitações de água em condições de não escassez de água) em um ambiente de alta produtividade. As figuras 3A-3B apresentam gráficos em barra retratando a melhora da produtividade de duas linhagens de milho transgênico de homozigoto (expressando HaHB4,2 (SEQ ID Nº: 4) sob o controle de um promotor constitutivo 355) como comparado ac campo do milho de controle tipo selvagem (WT). Os dados foram coletados de lotes de campo replicados em duas localizações com diferentes tipos de solo: em um $olo argiloso sedimentoso com 626 mm de chuva recebida em todo o período de cultivo (Figura 3A), e em um solo argiloso sedimentoso bem drenado com 545 mm de chuva recebida durante o ciclo de cultura (Figura 3B). A figura 3C apresenta um gráfico em barra retratando a melhora da produtividade de uma linhagem de trigo transgênico de homozigoto (expressando HaHB4,2 (SEQ ID Nº: 4) sob o controle de um promotor constitutivo 358) como comparado à produtividade do trigo de controle tipo selvagem (WT). Os dados na figura 3C foram obtidos dos lotes de campo replicados em uma localização com solo arenoso bem drenado (pH 7,14%, OM 1.57%). A irrigação suplementar para prover 755 mm de água durante tódo o cioló de cultura. A figura 3D ' apresenta um gráfico em barra retratando melhora da é produtividade de duas linhagens de soja transgênica de homozigoto (expressando HaHB4.2 (SEQ ID Nº: 4) sob o controle de um promotor constitutivo 355) como comparado à produtividade de soja de controle tipo selvagem (WT). Os dados na figura 3D foram obtidos de lotes de campo replicados na localização com solo arenoso (pH 5,99%, OM 1,41%). A irrigação suplementar foi aplicada para prover 579 mm de água por todo o ciclo de cultura.

PROCEDIMENTO PARA CARACTERIZAÇÃO DE TRANSGENES DE LINHAGENS DE MILHO E SOJA

[00178] A análise Northern foi inicialmente conduzida usando métodos e materiais conhecidos na técnica para confirmar a expressão de HaHBA4 nas linhagens transgênicas de milho e soja. As sequências de codificação dos transgenes correspondentes às linhagens de planta transformadas de HaHBá homozigoto foram então amplificadas usando métodos de PCR convencionais e materiais conforme geralmente descrito aqui. O DNA genômico transgênico de milho e soja foi preparado usando métodos conhecidos na técnica e foi usado como o modelo nas reações de PCR. Os transgenes correspondentes aos cassetes de expressão constitutivos (promotor 35S CaMV) foram amplificados nas reações de PCR usando o iniciador dianteiro 358 PrimF (5º = TGACGCACAATCCCACTATO-3' (SEQ ID Nº: 3M) e o iniciador reverso NOSI21R (5-GAATTCCCGATCTAGTAACA TA-3' (SEQ ID Nº: 35). Os transgenes correspondentes aos cassetes de expressão induzíveis (promotor TRANSF1Xba) foram amplificados naãs reações de PCR usando o iniciador dianteiro TRANSFlXba (5'- ' ATGTCTCTTCAACAAGTACCÇAC=3" (SEQ ID Nº: 32)), o iniciador reverso NOS121R (5'-GAATTCCCGATCTAGTAACATA-3' (SEQ ID Nê: - 33), e DNA genômico transgênico de milho ou soja como o modelo.

[00179] A análise de sequência dos polinucleotídeos de HaHB4 amplificados identificou múltiplas variações entre a sequência amplificada e a sequência de HaHB4 (SEQ ID Nº: 1) nativo. A figura 1 provê um alinhamento entre HaHB4 nativo e a sequência codificada pelo modlHaHB4 (HaHB4.2 (SEQ ID Nº; 4)) e mod2HaHB4á (HaHB4.3 ((SEQ ID Nº: 8)) identificado por essa análise.

EXEMPLO 3 Transativação por HaHB4 Modificado em Levedura

[00180] os polinucieotídeos que codificam proteínas de HaHB4 modificado (HaHB4,2 (modlHaHB4)HaHB4.3 (mod2HaHB4), ou HaHB4.4 (mod3HaHB4)) foram clonados ne vetor PpGBKT7 em associação operativa com o domínio de ligação de DNA GAL4 no vetor e a levedura transformada com os construtos de expressão resultantes foram ensaiados em um ensaio hibrido simples de levedura para determinar a transativação pelo HaHB4 modificado codificado. A transativação por HaHBd modificado (e proteina HaHB4 de controle) foi determinada pela medição da atividade de B-galactosidase para a levedura contendo proteínas de HaHB4 modificado fe proteína de HaHB4 de controle) usando ONPG como substrato. A figura 4 provê um gráfico em barra mostrando que todas as proteínas de HaHB4d modificado agem como um ativador no sistema de ensaio híbrido simples de levedura.

[00181] Similarmente, a fim de determinar a habilidade da proteína de HaHB4 modificado para . heterodimerizar, dois ensaios híbridos foram realizados. O CcDNA de HaHBA.2 foi clonado no vetor pGAD e fundido para o B domínio de ativação do fator de transcrição GAL4 de levedura. O construto de expressão resultante foi então transformado na cepa S, cerevisiae AH109, e um ensaio de dois híbridos foi realizado usando a levedura expressando a proteína modificada e quatro proteínas de Arabidopsis HD-Zip com terminais carbóxi excluídos que foram previamente clonados ne vetor pGBK7 e fundidos com o domínio de ligação GALA aqui. As interações putativas foram avaliadas por auxotrofia em um meio SD (-HIS). Os resultados indicaram que HaHB4.2 agiu como um fator de transcrição e foi capaz de interagir com AtHB1l, AtHBT e AtLHB12. (dados não mostrados)

[00182] Esses resultados indicam que à interação com proteínas endógenas podem constituir um mecanismo parcial de modlHaHB4 (HaHB4.2) para exercer sua função.

EXEMPLO 4

[00183] Morfologia e Taxa de Fotossíntese de Plantas Transgênicas Arabidopsis

[900184] AS plántas Arabidopsis foram transformadas com 358S::H4,2 (um construto de expressão compreendendo —“modlHaHB4 (SSQ ID Nº: 4) operacionalmente associado com um promotor constitutivo 3558) através de técnica de imersão floral para gerar plantas transgênicas de Arabidopsis. AS medições de troca de gás CO; na folha foram feitas em três plantas por vaso. Uma folha destacada de cada planta da amostra foi colocada na cuba da folha de um sistema de fotossíntese Licor 6400 XT. As folhas foram iluminadas pela fonte de luz de LED Licor 6400 provendo uma densidade de . fluxo de fóton fotosssintético por volta de 1000 umol m-2 s-12

[90185] A taxa de fotossíntese (umol m-2 s-1) foi, medida quando a absorção de CO; foliar foi constante, enquanto o ar fluindo da cuba da folha foi regulado pelo sistema Licor 6400 para manter a temperatura por volta de 24 ºC e uma concentração de CO2 por volta de 500 umol mol-l., A figura 5 provê um gráfico em barras mostrando a taxa de fotossíntese nas plantas transgênicas expressando vetor vazio (PBIlI21) 6& plantas transgênicas expressando modlHaHB4 (HaHB4.2 Line 30) em dois experimentos independentes. Foi observado que as plantas transgênicas expressando modlHaHB4 tiveram uma taxa de fotossíntese significativamente maior do que as plantas de controle expressando o vetor vazio. Esse aumento pode ser responsável pela produtividade aumentada observada nas culturas transformadas com modlHaHB4 modificado,

[00186] Esse pedido de patente reivindica o benefício do Pedido Provisório de Patente Norte-Americana nº

61/601.335, depositado em 21 de fevereiro de 2012, que é incorporado por referência em sua totalidade. Além disso, todas as publicações referenciadas aqui são incorporadas por referência em sua totalidade.

[00187] A descrição mencionada acima das realizações específicas revelarão completamente a natureza geral da invenção que outros podem, ao aplicar o conhecimento dentro da técnica, prontamente modificar e/ou adaptar para várias aplicações tais realizações específicas, sem experimentação indevida, sem se afastar do conceito geral da presente invenção. Portanto, tais adaptáções e modificação pretendem estar dentro do significado e faixa dos . equivalentes das realizações divulgadas, com base no ensinamento e orientação apresentados aqui. Deve ser ' entendido que à fraseologia ou terminologia daqui é para à finalidade de descrição e não de limitação, de modo que a terminologia ou fraseologia do presente relatório descritivo seja interpretada pelo técnico no assunto à luz dos ensinamentos e orientações.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, caracterizada por compreender uma sequência de polinucleotídeo que codifica modlHaHB4 (SEQ ID Nº: 4).

2. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, de acordo com à reivindicação 1, caracterizado por codificar um polipeptides capaz de ligar ao DNA in vitro.

3. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por aumentar à produtividade de uma planta transformada com a molécula de ácido nucleico.

4. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, de acordo . com a reivindicação 1, caracterizada por estar operacionalmente ligada a um promotor.

7 5. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por estar operacionalmente ligada a um promotor constitutivo,

6. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por o promotor é o promotor 35S CaMV,.

7. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, de acordo com àa reivindicação 5, caracterizada por o promotor é o promotor 358 CaMY ou o promotor Ubl.

8. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por estar operacionalmente ligada a um promotor induzível.

9. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o promotor compreender pelo menos 200 nucleotídeos do promotor HakB4.

10. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, de acordo com à reivindicação 9, caracterizada por o promotor ser fundido com o primeiro íntron da Arabidopsis Cox5c2.

11. VETOR, caracterizado por compreender a molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1.

12. VETOR, de acordo com à reivindicação 11, ainda caracterizado por compreender um promotor operacionalmente ligado à molécula de ácido nucleico.

13. VETOR, de acordo com à reivindicação 12, caracterizado por o vetor expressar um polipeptídeo recombinante capaz de se ligar ao DNA in vitro.

14. CÉLULA HOSPEDEIRA, caracterizada por . compreender à molécula de ácido mnucleico de acordo com a reivindicação 1.

' 15. CÉLULA HOSPEDEIRA, caracterizada por compreender o vetor de acordo com a reivindicação 11.

16. CÉLULA HOSPEDEIRA, caracterizada por compreender o vetor de acordo com a reivindicação 13.

17. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 14, caracterízadá por a molécula de ácido nucleico estar integrada no DNA da célula hospedeira.

18. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por a célula hospedeira ser uma célula bacteriana, fúngica, de inseto, planta ou animal.

18, CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada por à célula hospedeira ser uma célula bacteriana, fúngica, de inseto, planta ou animal.

20. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com à reivindicação 14, caracterizada por à célula hospedeira ser uma célula de planta.

21. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada por ser uma monocotiledônea.

22. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada por ser uma célula de milho.

23. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada por ser uma célula de trigo.

24. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada por ser uma célula de arroz.

25; CÉLULA —HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada por ser uma dicotiledônea.

26. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada por ser uma célula de soja.

- 27. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada por a molécula de ácido 7 nucleico estar integrada no DNA da célula de planta.

28. CULTURA DE TECIDO, caracterizada por compreender à célula hospedeira, conforme descrita ma reivindicação 20.

29. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada por à sequência de polinucleotídeo estar operacionalmente ligada a um promotor.

30. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada por expressar uma proteína recombinante.

31. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada por a proteina recombinante ser capaz de se ligar ao DNA in vitro.

32. SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, PÓLEN OU PARTE DA PLANTA, caracterizada por compreender a sequência de polinucleotídeo, conforme descrito na reivindicação 1.

33. SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, PÓLEN OU PARTE DA PLANTA, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada por ser uma monocotiledônea.

34. SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, PÓLEN OU PARTE DA PLANTA, de acordo com à reivindicação 33, caracterizada por ser milho,

35. SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, PÓLEN OU PARTE DA PLANTA, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada por ser trigo,

36. SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, PÓLEN OU PARTE DA PLANTA, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pOr ser arroz.

- 37. SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, PÓLEN OU PARTE DA PLANTA, de acordo com à reivindicação 32, caracterizada : por ser uma dicotiledônea.

38. SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, PÓLEN OU PARTE DA PLANTA, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada por ser soja.

39. SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, PÓLEN OU PARTE DA PLANTA, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada por a molécula de ácido nucleico estar integrada no DNA da célula de planta transgênica.

40. SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, PÓLEN OU PARTE DA PLANTA, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada por a sequência de polinucleotídeo estar operacionalmente lígada a um promotor.

41, SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, PÓLEN OU PARTE DA PLANTA, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada por expressar uma proteína recombinante.

42. SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, PÓLEN OU PARTE DA PLANTA, de acordo com a reivindicação 41, caracterizada por expressar uma proteína recombinante capaz de se ligar ao DNA in vitro.

43, SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, PÓLEN OU PARTE DA PLANTA, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada por ter empilhamento de gene.

44. CÉLULA DE PLANTA TRANSGÊNICA ESTAVELMENTE TRANSFORMADA — COM UMA — MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, caracterizada por compreender a sequência de polinucleotídeo, conforme descrita na reivindicação 1, em que à sequência de polinucleotídeo é expressa de modo a produzir uma proteína . recombinante na dita célula de planta e em que àa dita proteína recombinante é capaz de se ligar ao DNA in vitro.

7 45. CÉLULA DE PLANTA TRANSGÊNICA, de acordo com a reivindicação 44, caracterizada por ser uma monocotiledônea.

46, CÉLULA DE PLANTA TRANSGÊNICA, de acordo com a reivindicação 45, caracterizada por ser milho.

47, CÉLULA DE PLANTA TRANSGÊNICA, de acordo com a reivindicação 45, caracterizada por ser trigo,

48. CÉLULA DE PLANTA TRANSGÊNICA, de acordo com a reivindicação 45, caracterizada por ser arroz, 49, CÉLULA DE PLANTA TRANSGÊNICA, de acordo com a reivindicação 44, caracterizada por ser uma dícotiledônea.

50. CÉLULA DE PLANTA TRANSGÊNICA, de acordo com à reivindicação 49, caracterizada por ser soja.

51, CÉLULA DE PLANTA TRANSGÊNICA, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada por ter empilhamento de gene.

52. SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, PÓLEN OU PARTE

DA PLANTA ESTAVELMENTE TRANSFORMADA COM UMA MOLÉCULA DE ÁCIDO

NUCLEICO, caracterizada por compreender a sequência de polinucleotídeo, conforme descrita na reivindicação 1, em que a sequência de polinucleotídeo é expressa de modo a produzir uma proteína recombinante na dita semente da planta, pólen, ou parte da planta e em que à dita proteína recombinante é capaz de se ligar ao DNA in vitro,

53. SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, PÓLEN OU PARTE DA PLANTA, de acordo com a reivindicação 52, caracterizada por ser uma monocotiledônea.

54, SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, PÓLEN OU PARTE DA PLANTA, de acordo com à reivindicação 53, caracterizada por ser milho.

. 55, SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, PÓLEN OU PARTE DA PLANTA, de acordo com a reivindicação 53, caracterizada 1 por ser trigo.

56. SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, FPÓLEN OU PARTE DA PLANTA, de acordo com a reivindicação 53, caracterizada por ser arroz.

57. SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, PÓLEN OU PARTE DA PLANTA, de acordo com à reivindicação 52, caracterizada por ser uma dicotiledônea.

58. SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, PÓLEN OU PARTE DA PLANTA, de acordo com à reivindicação 57, caracterizada por ser soja.

59. SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, PÓLEN OU PARTE DA PLANTA, de acordo com a reivindicação 52, caracterizada por ter empilhamento de gene,

60. PLANTA TRANSGÊNICA TRANSFORMADA COM UMA MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, caracterizada por compreender à sequência de polinmucleotiídeo, conforme descrita na reivindicação 1, em que a sequência de polinucleotídeo é expressa de modo a produzir uma proteína recombinante na dita planta e em que a dita proteína recombinante provê uma produtividade aumentada da dita planta como comparado à uma variedade tipo selvagem de tal planta sob as mesmas condições.

61. SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, PÓLEN OU PARTE DA PLANTA, de acordo com a reivindicação 60, caracterizada por ser uma monocotiledônea.

62. SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, PÓLEN OU PARTE DA PLANTA, de acordo com à reivindicação 61, caracterizada por ser milho.

- 63. SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, PÓLEN OU PARTE DA PLANTA, de acordo com à reivindicação 61, caracterizada 7 por ser trigo.

64, SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, PÓLEN OU PARTE DA PLANTA, de acordo com a reivindicação 61, caracterizada por ser arroz.

65. SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, PÓLEN OU PARTE DA PLANTA, de acordo com à reivindicação 60, caracterizada por ser uma dicotiledônea,

66. SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, PÓLEN OU PARTE DA PLANTA, de acordo com à reivindicação 65, caracterizada por ser soja,

67. SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, PÓLEN OU PARTE DA PLANTA, de acordo com à reivindicação 60, caracterizada por ter um empilhamento de gene,

68. SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA TRANSFORMADA COM UMA MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEIÇO, caracterizada por compreender a sequência de polinucleotideo, conforme descrita na reivindicação 1, em que à sequência de polinucleotídeo é expressa de modo a produzir uma proteína recombinante na dita planta semente e em que à dita proteína recombinante provê uma tolerância elevada à estiagem como comparado à uma variedade tipo selvagem de tal semente da planta sob as mesmas condições.

69. SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, de acordo com a reivindicação 68, caracterizada por ser uma monocotiledônea.

70. SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, de acordo com à reivindicação 69, caracterizada por ser milho.

71. SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, de acordo com a reivindicação 69, caracterizada por ser trigó.

xr 72. SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, de acordo com à reivindicação 69, caracterizada por ser arroz.

73. SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, de acordo com a reivindicação 68, caracterizada por ser uma dicotiíledônea.

74. SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, de acordo com a reivindicação 73, caracterizada por ser soja.

75. SEMENTE DE PLANTA TRANSGÊNICA, de acordo com à reivindicação 68, caracterizada por ter um empilhamento de gene.

176. PLANTA TRANSGÊNICA, caracterízada por compreender uma pluralidade de células que compreende a sequência de polinmucleotídeo, conforme descrita na reivindicação 1.

TT. PLANTA TRANSGÊNICA, de acordo com a reivindicação 76, caracterizada por ser uma monocotiledônea,

78. PLANTA TRANSGÊNICA, de acordo com a reivindicação 77, caracterizada por ser milho,

79. PLANTA TRANSGÊNICA, de acordo com a reivindicação 78, caracterizada por ser trigo.

80. PLANTA TRANSGÊNICA, de acordo com a reivindicação 78, caracterizada por ser arroz.

81. PLANTA TRANSGÊNICA, de acordo com a reivindicação 76, caracterizada por ser uma dicotiíledônea.

82. PLANTA TRANSGÊNICA, de acordo com a reivindicação Bl, caracterizada por ser soja.

83. PLANTA TRANSGÊNICA, de acordo com a reivindicação 76, caracterizada por a molécula de ácido nucleico estar integrada no DNA da planta.

aa. PLANTA .— TRANSGÊNICA, de acordo com à . reivindicação 76, caracterizada por a sequência de polinucleorídeo estar operacionalmente ligada à um promotor.

' 85, PLANTA TRANSGÊNICA, de acordo com a reivindicação 76, caracterizada por expressar uma proteina recombinante.

86. PLANTA TRANSGÊNICA, de acordo com à reivindicação 85, caracterizada por expressar uma proteína recombinante capaz de se ligar ao DNA in vitro,

87. PLANTA TRANSGÊNICA, de acordo com a reivindicação 76, caracterizada por ter uma produtividade aumentada como comparado à variedade tipo selvagem da dita planta.

88. PLANTA TRANSGÊNICA, de acordo com a reivindicação 87, caracterizada por ter uma produtividade aumentada em condições de não escassez de água como comparado à variedade tipo selvagem da dita planta.

89. PLANTA TRANSGÊNICA, de acordo com a reivindicação 87, caracterizada por ter uma produtividade aumentada em condições de escassez de água como comparado à variedade tipo selvagem da dita planta.

90. SEMENTE OU GRÃO DE PÓLEN, caracterizada por ser da planta transgênica, conforme descrita na reivindicação 76.

391. PLANTA TRANSGÊNICA, caracterizada por ser cultivada a partir da semente, conforme descrita na reivindicação 76.

92. PLANTA DE PROGENIA DE QUALQUER GERAÇÃO DA PLANTA TRANSGÊNICA, conforme descrita na reivindicação 76, caracterizada por a dita planta de progenia compreender uma sequência de polinucleotídeo que codifica modiHaHB4 (SEQ ID Nº: 4).

. 93. GRÃO, caracterizado por compreender a semente, conforme descrita na reivindicação 90, ' 4, PLANTA TRANSGÊNICA, de acordo com a reivindicação 76, caracterizada por ter um empilhamento de gene.

95, PROTEÍNA, caracterizada por ser codificada pela molécula de ácido nucleico, conforme descrita na reivindicação 1,

96. PRODUTO DE PLANTA PROCESSADO, caracterizado por compreender uma quantidade detectável do polinucleotídeo, conforme descrito na reivindicação 1.

97, PRODUTO DE PLANTA PROCESSADO, de acordo com à reivindicação 96, caracterizado compreender um alimento, uma refeição, uma farinha, extrato ou homogenado obtido de pelo menos uma parte de uma planta.

398. PRODUTO DE PLANTA PROCESSADO, de acordo com à reivindicação 96, caracterizado por compreender um alimento,

uma refeição, uma farinha, extrato ou homogenado obtido a partir da semente da planta.

99. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA CÉLULA DE PLANTA TRANSGÊNICA COM UMA MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, caracterizado por compreender uma sequência de polinucleotideo que codifica modlHaHB4 (SEQ ID Nº: 4).

100. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 99, caracterizado por ainda envolver triagem da célula de planta transformada usando análise Northern, Western, Southern, ou PCR para confirmar que a dita célula de planta contém a molécula de ácido nucleico.

101. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 99, & caracterizado por ainda incluir a expressão da sequência de polinucleotídeo na célula de planta.

' 102. MÉTODO, de acordo com à reivindicação 99, caracterizado por a sequência de polinucleotideo estar integrada no DNA da célula de plânta.

103. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 99, caracterizado por a célula de planta ser uma monocotiledônea.

104. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 103, caracterizado por a célula de planta ser milho.

105. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 103, caracterizado por a célula de planta ser trigo.

106. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 103, caracterizado por a célula de planta ser arroz.

107. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 599, caracterizado por a célula de planta ser uma dicotiledônea.

108. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 107, caracterizado por a célula de planta ser soja.

109. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 99, caracterizado por a sequência de polinucleotídeo estar operacionalmente associada com um promotor.

110. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 299, caracterizado por a célula de planta expressar modlHaHB4 (SEQ ID Nº: 4).

111. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 99, caracterizado por a célula de planta ou progenia da dita célula expressar uma proteína recombinante capaz de se ligar ao DNA in vitro.

112. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 99, caracterizado por ainda incluir a expressão da sequência de J polinucleotídeo na célula de planta transgênica.

113. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 299, 7 caracterizado por ainda incluir a regeneração da célula de planta em uma planta.

114. CÉLULA DE PLANTA TRANSGÊNICA, caracterizada por ser produzida de acordo com o método, conforme descrito na reivindicação 99,

115. CÉLULA DE PLANTA TRANSGÊNICA, de acordo com a reivindicação 114, caracterízada por ter um empilhamento de gene.

116. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM HOSPEDEIRO TRANSGÊNICO DE MAIOR PRODUTIVIDADE, caracterizado por compreender (a) estavelmente a transformação de uma célula de planta com uma molécula «de ácido nucieico compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica modliHaHB4á (SEQ ID Nº: 4), em que o ácido nucleico é capaz de ser expresso na célula de planta, e

(b) à regeneração da célnla em uma planta.

117. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado por a célula de planta ser uma monocotiledônea.

118. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 117, caracterizado por a célula de planta ser milho.

119. MÉTODO, de acordo com à reivindicação 117, caracterizado por a célula de planta é trigo.

120. MÉTODO, de acordo com à reivindicação 117, caracterizado por a célula de planta ser arroz.

121. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado por a célula de planta ser uma dicotiledônea.

122. MÉTODO, de acordo com à reivindicação 2121, “ caracterizado por à célula de planta ser soja.

123. MÉTODO DE CULTIVO DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA, 7 caracterizado por compreender (a) a plantação de uma semente transgênica compreendendo um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10 ou o vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 à 13; e (b) o cultivo de uma planta transgênica a partir da semente transgênica.

124. MÉTODO, de acordo com à reivindicação 123, caracterizado por ainda compreender a etapa de colheita da planta transgênica.

125. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 124, caracterizado por ainda compreender a etapa de replantio da semente colhida da planta transgênica.

126. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 123 a 125, caracterizado por a planta ser uma monocotiledônea,

127. MÉTODO, de acordo com à reivindicação 126, caracterizado por a planta ser milho.

128. MÉTODO, de acordo com à reivindicação 126, caracterizado por a planta ser trigo.

129. MÉTODO, de acordo com à reivindicação 126, caracterizado por à planta ser arroz.

130. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 123 a 125, caracterizado por à planta ser uma dicotiledênea.

131. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 130, caracterizado por à planta ser soja.

132. USO DE UM ÁCIDO NUCLEICO, conforme descrito em . qualquer uma das reivindicações 1 a 10, ou do vetor, conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado por transformar uma célula de planta.

133. USO DE UM ÁCIDO NUCLEICO, conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1 à 10, ou do vetor, conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 11 a 13, ou da célula, conforme descrita com quálquer uma das reivindicações 14 a 27, 29 a 31, 44 a 51, 114 Ou 115, caracterizado por produzir uma planta transgênica.

134. USO, de acordo com à reivindicação 133, caracterizado por a planta transgênica conter eventos transgênicos empilhados,