BR112013015141A2 - métodos para isolamento, acúmulo, caracterização e/;ou identificação de micro-organismos com o uso de um dispositivo de transferência de amostra e filtração - Google Patents

Abstract

MÉTODOS PARA ISOLAMENTO, ACÚMULO, CARACTERIZAÇÃO E/OU IDENTIFICAÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS COM O USO DE UM DISPOSITIVO DE TRANSFERÊNCIA DE AMOSTRA E FILTRAÇÃO A presente invenção é direcionada a métodos, dispositivos e kits para separar, acumular, caracterizar e/ou identificar micro-organismos conhecidos por estarem presentes ou que podem estar presentes em uma amostra de teste. O método da invenção compreende Iisar opcionalmente células e/ou particulados sem micro-organismo que podem estar presentes em uma amostra de teste, seguido por uma etapa de filtração subsequente para isolamento e/ou acúmulo de micro-organismos. Em uma modalidade, um dispositivo de transferência de amostra e filtração é usado para isolamento e/ou acúmulo de micro-organismos por filtração. Uma vez que os micro-organismos foram filtrados para isolamento e/ou acúmulo de micro-organismos, os micro-organismos isolados e/ou acumulados podem ser analisa- dos para adquirir medições para a caracterização e/ou a identificação dos ditos micro- organismos.

Description

“MÉTODOS PARA ISOLAMENTO, ACÚMULO, CARACTERIZAÇÃO E/OU IDENTIFICAÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS COM O USO DE UM DISPOSITIVO DE TRANSFERÊNCIA DE AMOSTRA E FILTRAÇÃO”. Referência Cruzada Ao Pedido Relacionado Este pedido reivindica o benefício do pedido de patente provisório nº US61/424.418, intitulado “Methods for the Isolation, Accumulation, Characterization e/ou Identification of Microorganisms Using a Filtration and Sample Transfer Device”, depositado em 17 de dezembro de 2010, que é incorporado no presente documento.

Campo Da Invenção A presente invenção refere-se a métodos e dispositivos para isolar, acumular, ca- racterizar e/ou identificar micro-organismos em uma amostra de teste.

Em um aspecto, a presente invenção é direcionada a um método que emprega o uso de um dispositivo de transferência de amostra e filtração para o isolamento, acúmulo, transferência e caracteriza- ção e/ou identificação subsequente de micro-organismos em uma amostra de teste.

Em um outro aspecto, a presente invenção é direcionada a métodos e kits para isolar, acumular e/ou purificar micro-organismos de uma amostra.

Antecedentes Da Invenção A detecção de micro-organismos patogênicos em fluidos biológicos deve ser execu- tada no mais curto tempo possível, em particular, no caso de septicemia para a qual a mor- talidade permanece alta apesar da ampla faixa de antibióticos que estão disponíveis para os médicos.

A presença de agentes biologicamente ativos tal como um micro-organismo em um fluido corporal do paciente, especialmente sangue, é geralmente determinado com o uso de garrafas de cultura de sangue.

As infecções da corrente sanguínea estão associadas a morbidez e mortalidade altas, ainda os métodos de diagnostico atuais de cultura seguidos por identificação bioquímica e teste de suscetibilidade a antibiótico, podem levar vários dias para serem executados.

Tipicamente, a terapia empírica é iniciada com base em sintomas clínicos, e os resultados de teste apenas impactam em decisões clinicas quando a terapia inicial falha.

A capacidade de caracterizar as infecções de corrente sanguínea dentro das primeiras poucas horas, de preferência dentro de uma hora após um resultado de cultura de sangue positivo intensificaria significativamente a relevância clínica da informação de diag- nóstico fornecida.

Os métodos de amplificação molecular têm sido propostos para preencher essa necessidade, mas sérios desafios para essa abordagem perduram.

O próprio caldo de cultura de sangue positivo representa uma população naturalmente amplificada de micro- organismos com potencial para uso em uma variedade de testes de identificação rápida (ID). Os testes de ID fenotípicos automatizados tradicionais, tais como os sistemas Vi- tek®, PhoenixTM e Microscan®, ou testes fenotípicos manuais tal como API requerem que os micro-organismos estejam em uma fase de crescimento apropriada e livres de meios e pro-

dutos sanguíneos interferentes a fim de fornecer resultados robustos.

Esses sistemas usam colônias desenvolvidas a partir do caldo positivo por 18 a 24 horas em meios plaqueados.

Entretanto, em um esforço para obter resultados mais rápidos, alguns laboratórios relataram o uso desses sistemas com micro-organismos isolados de garrafas de cultura de sangue positivas.

Esses testes diretos da garrafa não são apropriados para todos os micro- organismos (por exemplo, cocci gram-positivo), não são validados pelos fabricantes de teste e geralmente levam de 3 a 8 horas para fornecer resultados.

Os testes mais rápidos e mais amplamente específicos são urgentemente necessários a fim de fornecer ao médico resul- tados clinicamente relevantes dentro das primeiras poucas horas, de preferência dentro de uma hora após um resultado de cultura positivo.

Os métodos de espectrometria de massa têm o potencial de permitir a identificação de micro-organismos muito rapidamente, mas podem encontrar interferência dos muitos compostos presentes em meios de cultura microbiológicos líquidos e em amostras clínicas tal como sangue ou combinações das mesmas.

Os métodos mais comumente empregados para recuperar os micro-organismos diretamente de caldo de cultura de sangue positivo são centrifugação diferencial de duas etapas e centrifugação em um tubo separador de soro.

Outros métodos para separação, caracterização e/ou identificação de micro- organismos foram descritos, os quais incluem: A Patente nº US6.177.266 revela um método para a classificação quimiotaxonômi- ca de bactérias com biomarcadores específicos de gênero, espécie e cepa gerados pela análise por espectrometria de massa de tempo de voo de ionização de dessorção a laser associada à matriz (MALDI-TOF-MS) de extratos de proteína celular ou células inteiras.

Na Patente nº US7.070.739 é apresentado um método para extrair, separar e purifi- car micróbios incluindo vírus por ultracentrifugação bidimensional diretamente de fluidos corporais ou tecido homogeneizado.

Em uma primeira etapa de centrifugação, todas as par- tículas são removidas, as quais têm uma velocidade de sedimentação mais que aquelas dos micróbios a serem identificados.

Na segunda etapa de ultracentrifugação, a bandagem iso- pícnica é usada em líquidos preenchidos para formar um gradiente de densidade de faixa ampla, com o uso de tubos de centrífuga dentados especiais.

De acordo com a patente, a técnica de separação pode ser usada para detectar partículas com bandagem por difusor de luz ou fluorescência com o uso de corantes específicos de ácido nucleico, e para recuperar as partículas com bandagem em volumes muito pequenos para caracterização por espec- trometria de massa de subunidades de proteína viral e partículas virais intactas, e por de- terminação citométrica de fluxo de fluorescência tanto de massa de ácido nucleico quanto das massas de fragmentos produzidos por enzimas de restrição.

O documento EP0533912A descreve um aparelho de pré-tratamento de amostra e um método para diálise de fluido e urina.

O pedido de patente descreve o uso de um pré-

filtro de tamanho de poro grande para remover sedimentos urinários típicos tais como célu- las sanguíneas, células epiteliais, petrificações, muco e cristais.

Quaisquer bactérias presen- tes atravessam o pré-filtro e são capturadas em um segundo filtro a jusante.

As bactérias capturadas são, então, acessadas através da desmontagem manual do aparelho empilhado.

A Publicação de pedido de patente nº US2007/0175278 descreve o uso de um meio de cultura líquido para cultivar uma amostra de interesse, incluindo, por exemplo, sangue, urina, fezes, catéteres intravenosos etc., linhas de produção industrial, sistemas de água, um produto alimentício, um produto cosmético, um produto farmacêutico e uma forensic amostra.

Subsequentemente, os micro-organismos pode ser colhidos do meio líquido por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, por centrifugação.

Os micro-organismos con- centrados podem, então, ser transferidos para material de carga, opcionalmente após a se- cagem, para obter um espectro de vibração.

O pedido de patente discute vários métodos para identificar e classificar micro-organismos, incluindo espectroscopia vibracional, tal como espectroscopia Raman.

Entretanto, esses métodos possuem várias desvantagens quando se tenta separar e caracterizar os micro-organismos de algumas amostras clínicas de teste (por exemplo, amostras complexas tais como meios de cultura que contêm sangue). No caso de meios de cultura que contêm sangue, as preparações microbianas resultante muitas vezes contêm células sanguíneas vermelhas contaminantes, plaquetas, partículas de lipídeo, enzimas de plasma e detritos celulares, que podem ocasionar resultados deficientes.

Esses métodos são também muito trabalhosos e inseguros devido às etapas que podem resultar em exposi- ção de aerossol de patógenos potencialmente perigosos para o usuário.

A publicação de pedido de patente de propriedade comum nº US2010/0120085 descreve métodos para separar, caracterizar e/ou identificar micro-organismos em uma amostra de teste.

O método descreveu um procedimento de preparação de amostra que compreende uma etapa de lise seletiva e etapa de separação subsequente para o isolamen- to e a purificação de um micro-organismo desconhecido de uma amostra de teste para a identificação do micro-organismo com o uso de espectrometria de massa.

O pedido também descreve o uso de filtração para o isolamento e a purificação de um micro-organismo des- conhecido de uma amostra de teste.

Consequentemente, perdura uma necessidade por métodos de preparação de amostra aprimorados, dispositivos e/ou kits para o isolamento e/ou o acúmulo de micro- organismos de amostras clínicas de teste, que são compatíveis com tecnologias de identifi- cação rápida tal como espectrometria de massa.

Adicionalmente, perdura uma necessidade por métodos de preparação de amostra aprimorados, dispositivos e/ou kits para isolamento e/ou acúmulo simultâneo de uma pluralidade de micro-organismos de uma pluralidade de amostras clínicas de teste, que são compatíveis com técnicas rápidas e automatizadas para a identificação de micro-organismos.

Os métodos e os dispositivos descritos na presente invenção produzem uma amostra concentrada e limpa de micro-organismos que é ideal para análise, por exemplo, por espectrometria de massa, especialmente para análise MALDI-TOF MS.

Sumário Da Invenção A presente invenção fornece métodos, dispositivos e kits para o isolamento, a sepa- ração e/ou o acúmulo para caracterização e/ou identificação subsequente de micro- organismos em uma amostra.

Os métodos permitem a caracterização e/ou a identificação de micro-organismos mais rapidamente que as técnicas anteriores, resultando em diagnósti- co mais rápido (por exemplo, em um indivíduo que tem ou suspeito de ter septicemia, me- ningite ou uma infecção de trato urinário) e identificação de materiais contaminados (por exemplo, alimentos e produtos farmacêuticos) ou água.

As etapas envolvidas nos métodos da invenção, a partir da obtenção de uma amostra para caracterização e/ou identificação de micro-organismos, podem ser executadas em um período de tempo muito curto para produ- zir informação factível clinicamente relevante, por exemplo, em menos que cerca de 120 minutos.

Em um aspecto, a presente invenção é direcionada a um método para isolar e sub- sequentemente caracterizar e/ou identificar um micro-organismo de uma amostra de teste que compreende: (a) obter uma amostra de teste conhecida por conter ou que pode conter micro- organismos; (b) lisar opcionalmente células e/ou particulados sem micro-organismo na dita amostra de teste que produz uma amostra lisada; (c) isolar e acumular os ditos micro-organismos de outros componentes da dita amostra de teste ou da dita amostra lisada por filtração com o uso de um dispositivo de transferência de amostra e filtração integrado; (d) transferir a dita amostra de micro-organismo isolada para um recipiente ou lâmina apropriada para analisar e/ou interrogar a dita amostra de micro-organismo isolada e acumulada; (e) analisar a dita amostra isolada ou acumulada dos ditos micro-organismos pa- ra adquirir as medições para a caracterização e/ou a identificação do dito micro-organismo; e (f) caracterizar e/ou identificar os ditos micro-organismos na dita amostra isolada e acumulada com base nas medições adquiridas.

Em um outro aspecto, a presente invenção é direcionada a um método para isolar, e subsequentemente caracterizar e/ou identificar um micro-organismo de uma cultura de sangue que compreende:

(a) obter uma amostra de uma cultura de sangue conhecida por conter ou que pode conter micro-organismos; (b) lisar opcionalmente células e/ou particulados sem micro-organismo na dita amostra para produzir uma amostra lisada; (c) isolar e acumular dito micro-organismos de outros componentes da dita amostra lisada por filtração com o uso de um dispositivo de transferência de amostra e filtra- ção integrado; (d) transferir a dita amostra de micro-organismo isolada para uma espectrometria de massa placa; (e) analisar a dita amostra isolada e acumulada dos ditos micro-organismos por espectrometria de massa para adquirir um espectro de massa do dito micro-organismo; e (f) caracterizar e/ou identificar os ditos micro-organismos na dita amostra isolada e acumulada através da comparação do espectro de massa adquirido com espectros de massa de referência.

Ainda em um outro aspecto, a presente invenção é direcionada a um método para isolar, e subsequentemente caracterizar e/ou identificar um micro-organismo de um espéci- me de urina que compreende: (a) obter uma amostra de urina conhecida por conter ou que pode conter micro- organismos; (b) lisar opcionalmente células e/ou particulados sem micro-organismo na dita amostra de urina para produzir uma amostra lisada; (c) isolar e acumular dito micro-organismos de outro componentes da dita amos- tra opcionalmente lisada por filtração com o uso de um dispositivo de transferência de amos- tra e filtração integrado; (d) transferir a dita amostra de micro-organismo isolada para um recipiente ou lâmina apropriada para analisar e/ou interrogar a dita amostra de micro-organismo isolada e acumulada; (e) analisar a dita amostra isolada ou acumulada dos ditos micro-organismos pa- ra adquirir medições para a caracterização e/ou a identificação do dito micro-organismo; e (f) caracterizar e/ou identificar os ditos micro-organismos na dita amostra isolada e acumulada com base nas medições adquiridas.

Em uma modalidade, a amostra isolada ou acumulada dos ditos micro-organismos pode ser analisada com o uso de interrogação espectroscópica, por exemplo, com base nas características intrínsecas dos micro-organismos (por exemplo, fluorescência intrínseca) ou estrutura vibracional de moléculas constituintes (por exemplo, espectroscopia Raman). Em uma outra modalidade, os micro-organismos isolados ou acumulados podem ser analisados por espectrometria de massa (por exemplo, MALDI-TOF-MS).

De acordo com uma outra modalidade da invenção, o dispositivo de transferência de amostra e filtração integrado pode compreender um corpo oco alongado (por exemplo, um tubo oco alongado cilíndrico, hexagonal ou de formato similar) que tem uma primeira extremidade ou ponta que é dotada de, ou terminada com um material de filtração (por exemplo, uma membrana de filtração), em que o dito material de filtração é localizado adja- cente a e externo em relação à dita primeira extremidade ou ponta, e uma segunda extremi- dade operável para fornecer fluxo de fluido para filtração.

Por exemplo, a segunda extremi- dade pode ser adaptada para conexão com um sistema de vácuo, uma seringa, um êmbolo ou dispositivo similar para gerar um vácuo.

Em uma outra modalidade, o corpo cilíndrico oco compreende um corpo estreito e longo feito de vidro, plástico, metal, ou outro material simi- lar.

Ainda em uma outra modalidade, como uma alternativa para uma fonte de vácuo, o dis- positivo de transferência de amostra e filtração pode usar um adsorvente internamente com- primido para fornecer ação capilar e/ou força de trabalho suficiente para filtração e lavagem.

Por exemplo, o adsorvente pode fornecer filtração passiva através do fornecimento de uma ação capilar ou força de trabalho para fluxo de fluido.

Em uma outra modalidade, a presente invenção também é direcionada a uma mon- tagem de transferência de amostra e filtração integrada que compreende uma pluralidade de dispositivos de transferência de amostra e filtração integrados para o isolamento e/ou o acúmulo de uma pluralidade de amostras de teste e para a transferência simultânea da plu- ralidade de micro-organismos isolados e/ou acumulados para um recipiente, lâmina ou placa para analisar os ditos micro-organismos isolados ou acumulados.

Ainda em uma outra modalidade, a presente invenção também é direcionada a um sistema de filtração e transferência de amostra de duas partes que compreende uma mon- tagem de filtração operável para o isolamento e/ou acúmulo de micro-organismos para uma pluralidade de amostras de teste por filtração e uma montagem de transferência operável para a transferência simultânea da dita pluralidade de micro-organismos isolados e/ou acu- mulados para uma lâmina ou placa para análise.

Ainda em um outro aspecto, a presente invenção é direcionada a um kit para o iso- lamento, acúmulo e/ou purificação de micro-organismos de uma amostra de teste que com- preende em uma combinação comprimida: (a) opcionalmente um tampão de lise seletivo para a lise seletiva de micro- organismos não conhecidos por estarem presentes ou que não podem estar presentes em uma amostra de teste; (b) um dispositivo de transferência de amostra e filtração integrado em que o dito dispositivo é operável para isolamento, acúmulo e/ou purificação de micro-organismos de uma amostra de teste, e para a transferência subsequente de micro-organismos para um recipiente, lâmina ou placa para análise; e

(c) pelo menos um tampão ou fluido de lavagem para lavar a amostra de micro- organismo isolada, acumulada e/ou purificada.

Em uma modalidade, o dispositivo de trans- ferência de amostra e filtração integrado compreende um corpo oco com formato alongado que tem uma primeira extremidade ou ponta que é dotada de, ou terminada com um materi- al de filtração, em que o dito material de filtração é localizado adjacente a e externo em rela- ção à dita primeira extremidade ou ponta, e uma segunda extremidade operável para forne- cer fluxo de fluido para filtração.

A presente invenção é explicada em maiores detalhes nas figuras da presente in- venção e na descrição apresentada abaixo.

Breve Descrição Das Figuras A Figura 1A mostra uma vista frontal de um dispositivo de transferência de amostra e filtração integrado, de acordo com a presente invenção.

A Figura 1B mostra uma vista em seção transversal do dispositivo de transferência de amostra e filtração integrado mostrado na Figura 1A.

A Figura 2A mostra uma vista frontal do segundo conceito de projeto de um disposi- tivo de transferência de amostra e filtração integrado, de acordo com a presente invenção.

A Figura 2B mostra uma vista em seção transversal do dispositivo e a Figura 2C mostra uma vista detalhada de uma primeira extremidade do dispositivo.

A Figura 3A mostra uma vista explodida do dispositivo de transferência de amostra e filtração integrado ilustrado na Figura 2 e a Figura 3B mostra uma vista detalhada de uma primeira extremidade do dispositivo.

A Figura 4 mostra uma vista em perspectiva de uma montagem de transferência de amostra e filtração para o isolamento e/ou acúmulo de micro-organismos de uma pluralidade de amostras de teste.

A Figura 5 mostra uma vista explodida da montagem de transferência de amostra e filtração ilustrada na Figura 4. A Figura 6 mostra uma vista explodida de uma montagem de filtração, que compre- ende a primeira parte de um sistema de filtração e transferência de amostra de duas partes.

A Figura 7 mostra uma vista em perspectiva da montagem de filtração ilustrada na Figura 6. A Figura 8 mostra uma vista explodida parcial da montagem de filtração ilustrada na Figura 6. As Figuras 9A a D mostram vistas em perspectiva de uma montagem de transfe- rência, de acordo com a presente invenção.

A Figura 9A mostra uma vista em perspectiva de uma lâmina ou placa que é colocada sobre a placa de gaxeta de fundo.

A Figura 9B mos- tra uma vista em perspectiva da gaxeta de fundo e lâmina ou placa.

A Figura 9C mostra uma vista explodida da gaxeta de fundo em alinhamento com o bloco de pino de transferência.

A

Figura 9D mostra uma vista em perspectiva da placa de gaxeta de fundo posição no topo de e em alinhamento com o bloco de pino de transferência.

A Figura 10 mostra uma vista de fundo da superfície de fundo da placa superior da montagem de filtração ilustrada na Figura 6. A Figura 11 mostra uma vista explodida da placa superior, gaxeta ou fita média e um bloco superior da montagem de filtração ilustrado na Figura 6. A Figura 12 mostra uma vista em seção transversal e explodida da placa superior, gaxeta ou fita média e um bloco superior da montagem de filtração ilustrada na Figura 6. A Figura 13 mostra uma representação esquemática de um método que compreen- de uma etapa de lise, etapa de separação e etapa de transferência, facilitadas com o dispo- sitivo de transferência de amostra e filtração integrado da Figura 1. Descrição Detalhada Da Invenção A presente invenção pode ser incorporada em diferentes formas e não deve ser in- terpretada como limitada às modalidades apesentadas no presente documento.

De prefe- rência, essas modalidades são fornecidas de modo que essa revelação seja essencial e completa, e conduza completamente o escopo da invenção para aqueles elementos versa- dos na técnica.

Por exemplo, os recursos ilustrados em relação a uma modalidade podem ser incorporados em outras modalidades, e os recursos ilustrados em relação a uma moda- lidade particular podem ser deletados daquela modalidade.

Além disso, várias variações e adições às modalidades sugeridas no presente documento serão evidentes para aqueles elementos versados na técnica á luz da presente revelação, que não se afastam da presen- te invenção.

Salvo se definido de outro modo, todos os termos técnicos e específicos usados no presente documento têm o mesmo significado conforme comumente compreendido por um elemento de conhecimento comum na técnica à qual esta invenção pertence.

A terminologia usada na descrição da invenção no presente documento tem o propósito de descrever ape- nas modalidades particulares e não pretende limitar a invenção.

Definições.

Conforme usado no presente documento, “um”, “uma”, ou “o(a)” pode significar um ou mais que um.

Por exemplo, “uma (artigo indefinido)” célula pode significar uma única cé- lula ou uma multiplicidade de células.

Também conforme usado no presente documento, "e/ou" se refere a e abrange qualquer e todas as combinações possíveis de um ou mais dos itens mencionados associa- dos, bem como a ausência de combinações quando interpretadas na alternativa ("ou"). Adicionalmente, o termo "cerca de”, conforme usado no presente documento quan- do se refere a um valor mensurável tal como uma quantidade de um composto ou agente desta invenção, dose, tempo, temperatura e similares, abrange variações de ± 20%, ± 10%,

± 5%, ± 1%, ± 0,5%, ou ainda ± 0,1% da quantidade especificada.

Conforme usado no presente documento, o termo “micro-organismo” se destina a abranger organismos que são geralmente unicelulares, que podem ser multiplicados e ma- nipulados no laboratório, incluindo, mas sem limitação a, bactérias gram-positivas ou gram- negativas, leveduras, bolores, parasitas e molicutes.

Os exemplos não limitantes de bacté- rias gram-negativas desta invenção incluem bactéria dos seguintes gêneros: Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Campilobac- ter, Haemophilus, Morganella, Vibrio, Yersinia, Acinetobacter, Stenotrophomonas, Brevun- dimonas, Ralstonia, Achromobacter, Fusobacterium, Prevotella, Branhamella, Neisseria, Burkholderia, Citrobacter, Hafnia, Edwardsiella, Aeromonas, Moraxella, Brucella, Pasteurel- la, Providencia e Legionella.

Os exemplos não limitantes de bactérias gram-positivas desta invenção incluem bactérias dos seguintes gêneros: Enterococcus, Streptococcus, Staphilo- coccus, Bacillus, Paenibacillus, Lactobacillus, Listeria, Peptostreptococcus, Propionibacte- rium, Clostridium, Bacteroides, Gardnerella, Kocuria, Lactococcus, Leuconostoc, Micrococ- cus, Mycobacteria e Corynebacteria.

Os exemplos não limitantes de leveduras e bolores desta invenção incluem aqueles dos seguintes gêneros: Candida, Cryptococcus, Nocardia, Penicillium, Alternaria, Rhodotorula, Aspergillus, Fusarium, Saccharomyces e Trichosporon.

Os exemplos não limitantes de parasitas desta invenção incluem aqueles dos seguintes gê- neros: Trypanosoma, Babesia, Leishmania, Plasmodium, Wucheria, Brugia, Onchocerca, e Naegleria.

Os exemplos não limitantes de molicutes desta invenção incluem aqueles dos seguintes gêneros: Mycoplasma e Ureaplasma.

Em uma modalidade, conforme descrito em detalhes adicionais no presente docu- mento, os micro-organismos de uma amostra ou meio de crescimento podem ser “separa- dos” ou “isolados” e subsequentemente interrogados para caracterizar e/ou identificar o mi- cro-organismo presente na amostra.

Conforme usado no presente documento, o termo “se- parar” se destina a abranger qualquer amostra de micro-organismos que foi removida, con- centrada ou de outro modo afastada de seu estado original, ou de um meio de cultura ou crescimento.

Por exemplo, de acordo com esta invenção, os micro-organismos podem ser separadas (por exemplo, como uma amostra ou massa separada de micro-organismo) de não micro-organismo ou componentes sem micro-organismo que podem de outro modo in- terferir com a caracterização e/ou identificação.

O termo pode incluir uma camada de micro- organismos coletados em uma superfície sólida (por exemplo, uma membrana de filtro). Como tal, uma amostra de micro-organismo separada (ou massa ou filme fino de micro- organismo) pode incluir qualquer coleta ou camada de micro-organismos e/ou componentes dos mesmos que é mais concentrada que, ou de outro modo, separada da amostra original, e pode estar na faixa de um conglomerado denso essencialmente comprimido de micro- organismos para uma camada difusa de micro-organismos.

Os componentes de micro-

organismo que podem ser compreendidos em uma forma separada ou amostra incluem, sem limitação, bactérias, flagela, fimbria e cápsulas em qualquer combinação.

Os compo- nentes sem micro-organismo que são separados dos micro-organismos podem incluir célu- las sem micro-organismo (por exemplo, células sanguíneas e/ou outras células de tecido), petrificações ou cristais de urina e/ou quaisquer componentes dos mesmos.

Conforme usa- do no presente documento, o termo “isolado” se destina a abranger qualquer amostra de micro-organismos que foi pelo menos parcialmente purificada de seu estado original, ou de um meio de cultura ou crescimento, e qualquer não micro-organismos ou componentes sem micro-organismo contidos nisso.

Por exemplo, de acordo com esta invenção, os micro- organismos podem ser isolados (por exemplo, como uma amostra isolada) de não micro- organismos ou componentes sem micro-organismo que podem de outro modo interferir na caracterização e/ou identificação.

Os componentes sem micro-organismo que são separa- dos dos micro-organismos podem incluir células sem micro-organismo (por exemplo, células sanguíneas e/ou outras células de tecido) e/ou quaisquer componentes das mesmas.

Em uma modalidade, conforme descrito em detalhes adicionais no presente docu- mento, os micro-organismos de uma amostra ou meio de crescimento podem ser “acumula- dos” ou “capturados” em ou sobre um material de filtro (por exemplo, uma membrana de filtro), e interrogados subsequentemente para caracterizar e/ou identificar o micro-organismo presente na amostra.

Conforme usado no presente documento, o termo “acumulado” ou “capturado” se destina a abranger qualquer amostra de micro-organismos que foi comprimi- da ou depositada em uma massa ou filme de micro-organismos.

Por exemplo, os micro- organismos de uma amostra podem ser comprimidos ou depositados em uma massa ou filme em um material de filtração (por exemplo, uma membrana de filtro) por filtração.

O ter- mo inclui uma coleta de micro-organismos (e/ou componentes dos mesmos) na superfície de um material de filtro (por exemplo, uma membrana de filtro) seguinte à filtração (por exemplo, filtração a vácuo). Os componentes de micro-organismo que podem ser compre- endidos em massa comprimida ou depositada de micro-organismos incluem, sem limitação, bactérias, flagela, fimbria e cápsulas em qualquer combinação.

De acordo com esta inven- ção, os micro-organismos podem ser comprimidos ou depositados em uma massa (por exemplo, como uma massa de micro-organismo substancialmente purificada), de não micro- organismo ou componentes sem micro-organismo que podem de outro modo interferir na caracterização e/ou identificação do micro-organismo (por exemplo, por espectrometria de massa). Os componentes sem micro-organismo que são isolados ou separados dos micro- organismos podem incluir células sem micro-organismo (por exemplo, células sanguíneas e/ou outras células de tecido) e/ou qualquer componentes das mesmas.

Conforme usado no presente documento, o termo “analisar a dita amostra isolada ou acumulada” se destina a abranger todos os métodos ou meios bem conhecidos para ana-

lisar, interrogar, obter ou de outro modo adquirir medições ou dados que podem ser usados para a caracterização e/ou a identificação de micro-organismos (por exemplo micro- organismos desconhecidos). Por exemplo, uma massa isolada ou acumulada de micro- organismos pode ser analisada ou interrogada por métodos espectroscópicos, por exemplo, com base em características intrínsecas dos micro-organismos (por exemplo, fluorescência intrínseca) ou na estrutura vibracional de moléculas constituintes (por exemplo, espectros- copia Raman). Em uma outra modalidade, uma massa isolada ou acumulada de micro- organismos pode ser analisada ou interrogada por métodos de espectrometria de massa (por exemplo, MALDI-TOF-MS) para a aquisição de medições ou dados que podem ser usados para a caracterização e/ou identificação de micro-organismos desconhecidos, con- forme discutido em detalhes adicionais no presente documento.

A presente invenção fornece métodos para isolar ou separar micro-organismos, e subsequentemente caracterizar e/ou identificar micro-organismos em uma amostra.

Além disso, o método pode ser particularmente útil para o isolamento ou a separação, e caracteri- zação e/ou identificação subsequente de micro-organismos de amostras complexas tais co- mo meios de cultura que contêm sangue ou amostras de urina.

Os métodos rápidos também permitem a caracterização e/ou a identificação de micro-organismos mais rapidamente que as técnicas anteriores, resultando em diagnósticos mais rápidos, por exemplo, em um indi- víduo que tem ou suspeito de ter septicemia, meningite ou uma infecção de trato urinário) e caracterização/identificação de materiais contaminados (por exemplo, alimentos e produtos farmacêuticos) ou água.

As etapas envolvidas nos métodos da invenção, de obtenção de uma amostra para caracterização/identificação de micro-organismos, podem ser executadas em um período de tempo muito curto para obter informação factível clinicamente relevante.

Em certas modalidades, os métodos da invenção podem ser executados em menos que cerca de 120 minutos, por exemplo, em menos que cerca de 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5 minutos.

A ótima rapidez dos métodos da invenção representa um aprimoramento sobre os métodos anteriores.

Os métodos podem ser usados para caracteri- zar e/ou identificar qualquer micro-organismo conforme descrito no presente documento.

Em uma modalidade, o micro-organismo é uma bactéria.

Em uma outra modalidade, o micro- organismo é uma levedura.

Ainda em uma outra modalidade, o micro-organismo é um bolor.

Em uma modalidade adicional, o micro-organismo é um parasita.

Em uma outra modalidade, o micro-organismo é um molicute.

Adicionalmente, os métodos da invenção podem ser completamente automatizados, reduzindo por meio disso o risco de manipulação de materi- ais infecciosos e/ou contaminação das amostras.

Amostras As amostras que podem ser testadas (isto é, uma amostra de teste) pelos métodos da invenção incluem tanto amostras clínicas quanto amostras não clínicas em que a presen-

ça e/ou crescimento de micro-organismo é ou pode ser suspeita, bem como amostras de materiais que são rotineira ou ocasionalmente testados em relação à presença de micro- organismos.

A quantidade de amostra utilizada pode variar consideravelmente devido à ver- satilidade e/ou sensibilidade do método.

A preparação de amostra pode ser executada por inúmeras técnicas conhecidas por aqueles elementos versados na técnica embora uma das vantagens da presente invenção é que os tipos de amostra complexa, tal como, por exem- plo, sangue, fluidos corporais, e/ou outras substâncias opacas, podem ser testados direta- mente que utiliza o sistema com pouco ou nenhum pré-tratamento intenso.

Em uma modali- dade, a amostra é retirada de uma cultura.

Em uma outra modalidade, a amostra é retirada de uma cultura microbiológica (por exemplo, uma cultura de sangue). Em uma outra modali- dade, a amostra é suspeita de, ou conhecida por, conter os micro-organismos nisso.

As amostras clínicas que podem ser testadas incluem qualquer tipo de amostra tipi- camente testada em laboratórios clínicos ou de pesquisa, incluindo, mas sem limitação a, sangue, soro, plasma, frações de sangue, fluido de junta, urina, sêmen, saliva, fezes, fluido cerebrospinal, conteúdos gástricos, secreções vaginais, homogenatos de tecido, aspirados de medula óssea, homogenatos ósseos, cuspe, aspirados, exsudatos e produtos de rinsa- gem de exsudato, outros fluidos corporais, e similares.

Em uma outra modalidade, a amostra clínica pode ser cultivada, e uma amostra de cultura usada.

A presente invenção encontra uso em pesquisa bem como aplicações veterinárias e médicas.

Os indivíduos adequados dos quais as amostras clínicas podem ser obtidas são geralmente indivíduos mamíferos, mas podem ser qualquer animal.

O termo “mamífero” con- forme usado no presente documento inclui, mas não é limitado a, humanos, primatas não humanos, gado, ovelha, cabras, porcos, cavalos, gatos, cães, coelhos, roedores (por exem- plo, ratos ou camundongos), etc.

Os indivíduos humanos incluem recém-nascidos, crianças, jovens, adultos e indivíduos geriátricos.

Os indivíduos dos quais as amostras podem ser obtidas incluem, sem limitação, mamíferos, pássaros, répteis, anfíbios e peixes.

As amostras não clínicas que podem ser testadas também incluem substâncias, que abrangem, mas sem limitação a, alimentos, bebidas, produtos farmacêuticos, cosméti- cos, água (por exemplo, água potável, água não potável e água de desperdício), lastros de agua do marar, solo, esgoto, material vegetal (por exemplo, sementes, folhas, troncos, raí- zes, flores, frutas), produtos sanguíneos (por exemplo, plaquetas, soro, plasma, frações ce- lulares de glóbulo branco, etc.), amostras de tecido ou de órgão de doador, amostras de guerra biológica e similares.

O método também é particularmente nem adequado para teste em tempo real para monitorar níveis de contaminação, controle de processo, controle de qualidade e similares em instalações industriais.

Em uma outra modalidade, a amostra não clínica pode ser cultivada, e uma amostra de cultura usada.

Em uma modalidade da invenção, as amostras são obtidas a partir de um indivíduo

(por exemplo, um paciente) que tem ou suspeito de ter uma infecção microbiana.

Em uma modalidade, o indivíduo tem ou é suspeito de ter septicemia, por exemplo, bacteremia ou fungemia.

A amostra pode ser uma amostra de sangue diretamente do indivíduo.

A amostra pode ser de uma cultura de sangue desenvolvida de uma amostra do sangue do paciente, por exemplo, uma cultura de sangue BacT/ALERT®. A amostra de cultura de sangue pode ser de uma cultura de sangue positiva, por exemplo, um cultura de sangue que indica a pre- sença de um micro-organismo.

Em certas modalidades, a amostra é retirada de uma cultura de sangue positiva dentro de um período curto se torna positiva, por exemplo, dentro de cerca de 6 horas, por exemplo, dentro de cerca de 5, 4, 3 ou 2 horas, ou dentro de cerca de 60 minutos, por exemplo, cerca de 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5 minutos.

Em uma modalidade, a amostra é retirada de uma cultura em que os micro-organismos estão em crescimento de fase log.

Em uma outra modalidade, a amostra é retirada de uma cultura em que os micro-organismos estão em uma fase estacionária.

Em algumas modalidades, para auxiliar a recuperação de micro-organismos ade- rentes, por exemplo, de partículas adsorventes, etapas de pré-tratamento bem conhecidas para amostras que contêm adsorvente podem ser usadas.

Por exemplo, um tensoativo (por exemplo, Tween 80) pode ser adicionado e a amostra é misturada em vórtice.

Em outras modalidades, a amostra também pode ser sonicada para romper os biofilmes e liberar mi- cro-organismos intactos.

Os exemplos incluem S. aureus ligado a partículas de carvão vege- tal.

O volume da amostra deve ser suficientemente grande para produzir uma amostra isolada e/ou acumulada de micro-organismos ou uma massa de micro-organismos que pode ser analisada ou interrogada para adquirir as medições para a caracterização e/ou a identifi- cação do dito micro-organismo após a etapa de separação/isolamento dos métodos da in- venção ser executada.

Os volumes apropriados irão depender da fonte da amostra e do ní- vel antecipado de micro-organismos na amostra.

Por exemplo, uma cultura de sangue posi- tiva irão conter um nível superior de micro-organismos por volume que uma amostra de água potável a ser testada em relação à contaminação, então, um volume menor de meio de cultura de sangue pode ser necessário em comparação à amostra de água potável.

Em ge- ral, o tamanho de amostra pode ser menor que cerca de 50 ml, por exemplo, menor que cerca de 40, 30, 20, 15, 10, 5, 4, 3, ou 2 ml.

Em certas modalidades, o tamanho de amostra pode ser cerca de 1 ml, por exemplo, cerca de 0,75, 0,5, ou 0,25 ml.

Em certas modalidades em que a separação é executada em uma microescala, o tamanho de amostra pode ser menor que cerca de 200 l, por exemplo, menor que cerca de 150, 100, 50, 25, 20, 15, 10, ou 5 l.

Em algumas modalidades (por exemplo, quando espera-se que a amostra compre- enda um número pequeno de micro-organismos), o tamanho de amostra pode ser cerca de 100 ml ou mais, por exemplo, cerca de 250, 500, 750, ou 1000 ml ou mais.

Etapa de Lise Opcional Em algumas modalidades, após obter uma amostra, a próxima etapa no método da presente invenção é lisar ou dissolver seletivamente células e/ou particulados indesejados que podem estar presentes na amostra, por exemplo, células sanguíneas e/ou células de tecido.

As células e/ou particulados podem ser lisadas ou dissolvidas para permitir a separa- ção e/ou o isolamento de micro-organismos de outros componentes da amostra.

A separa- ção e/ou o isolamento de micro-organismos de outros componentes impede a interferência durante a etapa de análise ou interrogação.

Se não for esperado que as células sem micro- organismo estejam presentes na amostra ou interferiram na etapa de interrogação, a etapa de lise pode não precisar ser executada.

Em uma modalidade, as células a serem lisadas são células sem micro-organismo que estão presentes na amostra.

Tipicamente, nenhuma célula de micro-organismo que pode estar presente na amostra são lisadas.

Entretanto, em algumas modalidades, a lise seletiva de classes específicas de micro-organismos pode ser desejável e, dessa forma, pode ser executada de acordo com os métodos descritos no pre- sente documento e bem conhecidos na técnica.

Por exemplo, uma classe de micro- organismos indesejados pode ser seletivamente lisada, por exemplo, levedura é lisada en- quanto as bactérias não são ou vice versa.

Em uma outra modalidade, os micro-organismos desejados são .lisados a fim de separar um componente subcelular particular dos micro- organismos, por exemplo, membranas ou organelas de célula.

Em uma modalidade, todas as células não microbianas são lisadas.

Em outras modalidades, uma porção das células não microbianas é lisada, por exemplo, bastante células parta impedir a interferência com a etapa de interrogação.

A lise de células pode ser executada por quaisquer método conheci- do na técnica para ser eficaz lisar seletivamente células com ou sem lise de micro- organismos, incluindo, sem limitação, adição de uma solução de lise, sonicação, choque osmótico, tratamento clínico, e/ou uma combinação dos mesmos.

Uma solução de lise é capaz de lisar células, por exemplo, células sem micro- organismo (por exemplo, através da solubilização ou dissolução de membranas de célula eucariótica) e/ou células de micro-organismo.

Em uma modalidade, a solução de lise pode compreender um ou mais detergentes, opcionalmente uma ou mais enzimas, ou uma com- binação de um ou mais detergentes e uma ou mais enzimas, e pode incluir adicionalmente agentes adicionais.

Em uma modalidade, o detergente pode ser um detergente lítico sem desnaturação, tal como Triton® X-100 Triton® X-100-R, Triton® X-114, NP-40, Genapol® C- 100, Genapol® X-100, Igepal® CA 630, Arlasolve™200, Brij® 96/97, CHAPS, octil β-D- glicopiranosídeo, saponina e éter de nonaetileno glicol monododecil (C12E9, polidocenol). Opcionalmente, os detergentes líticos de desnaturação podem ser incluídos, tal como sulfa- to de sódio dodecil, N-laurilsarcosina, desoxicolato de sódio, sais de bile, brometo de hexa- deciltrimetilamônio, SB3-10, SB3-12, amidosulfobetaína-14, e C7BzO.

Opcionalmente, os solubilizantes também podem ser incluídos, tal como Brij® 98, Brij® 58, Brij® 35, Tween® 80, Tween® 20, Pluronic® L64, Pluronic® P84, sulfobetaínas não detergentes (NDSB 201), anfi- póis (PMAL-C8), e metil-β-ciclodextrina.

Tipicamente, os detergentes e solubilizantes sem desnaturação são usados em concentrações acima de sua concentração molecular crítica (CMC), enquanto os detergentes de desnaturação podem ser adicionados em concentra- ções abaixo de sua CMC.

Por exemplo, os detergentes líticos sem desnaturação podem ser usados em uma concentração de cerca de 0,010% a cerca de 10%, por exemplo, cerca de 0,015% a cerca de 1,0%, por exemplo, cerca de 0,05% a cerca de 0,5%, por exemplo, cerca de 0,10% a cerca de 0,30% (concentração final após a diluição com a amostra). Em uma outra modalidade, os detergentes que compreendem um grupo “superior” de polioxietileno hidrofílico ligado a um grupo “inferior” de alcano ou alceno hidrofóbico por uma ligação de éter pode ser preferencial.

Esses detergentes são comumente especificados com o uso de notação da forma CxEy, em que “x” é igual ao número de carbonos na cadeia de alcano ou alceno, enquanto “y” é o número de monômeros de oxietileno (CH2CH2O) na cadeia de poli- oxietileno.

Os detergentes desse tipo em que x se situa na faixa de 10 a 20 e y se situa na faixa de 8 a 12 são preferenciais.

Ainda mais preferencial são os detergentes desse tipo em que x se situa na faixa de 12 a 18 e y se situa na faixa de 9 a 11. Por exemplo, o detergente de alcano-polioxietileno ou alceno-polioxietileno pode ser selecionado do grupo que consiste em Brij® 97, Brij® 96V, Genapol® C-100, Genapol® X-100, éter de nonaetileno glicol monodo- decil (polidocanol), ou uma combinação dos mesmos.

As enzimas que podem ser usadas em soluções de lise incluem, sem limitação, en- zimas que digerem ácidos nucleicos e outros materiais de obstrução de membrana (por exemplo, proteinase, DNase, neuraminidase, polissacarídeo, Glucanex®, e Pectinex®). Ou- tros aditivos que podem ser usados incluem, sem limitação, agentes de redução tal como 2- mercaptoethanol (2-Me) ou ditiotreitol (DTT) e agentes de estabilização tal como magnésio, piruvato, e umectantes.

A solução de lise pode ser tamponada em qualquer pH que é ade- quado para lisar as células desejadas, e irá depender de múltiplos fatores, incluindo sem limitação, o tipo de amostra, as células a serem lisadas e o detergente usado.

Em algumas modalidades, o pH pode estar em uma faixa de cerca de 2 a cerca de 13, por exemplo, cer- ca de 6 a cerca de 13, por exemplo, cerca de 8 a cerca de 13, por exemplo, cerca de 10 a cerca de 13. Os tampões de pH adequados incluem qualquer tampão capaz de manter um pH na faixa desejada, por exemplo, cerca de 0,05 M a cerca de 1,0 M CAPS.

Para alguns tipos de amostra (por exemplo, urina), o pH ideal para a dissolução de células e/ou particu- lados indesejados pode ser de cerca de 2 a cerca de 8. Em uma modalidade, a amostra e a solução de lise são misturadas e, então, incu- badas por um tempo suficiente para que a lise e a solubilização de membranas celulares ocorram, por exemplo, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, ou 60 segundos, ou cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, ou 20 minutos ou mais, por exemplo, cerca de 1 se- gundo a cerca de 20 minutos, cerca de 1 segundo a cerca de 5 minutos, ou cerca de 1 se- gundo a cerca de 2 minutos.

Em uma outra modalidade, a amostra e a solução de lise são incubadas por cerca de 30 segundos a cerca de 5 minutos, ou cerca de 1 minuto a cerca de 3 minutos.

O tempo de incubação irá depender da resistência da solução de lise, por exem- plo, da concentração do detergente e/ou enzimas.

Em geral, os tampões de lise mais sua- ves irão requerer mais tempo e uma diluição maior da amostra para solubilizar completa- mente as células não microbianas.

A resistência da solução de lise pode ser selecionada com base nos micro-organismos conhecidos por estarem ou suspeitos de estarem na amos- tra.

Para os micro-organismos que são mais suscetíveis à lise, uma solução de lise suave pode ser usada.

A lise pode ocorrer em uma temperatura de cerca de 0°C a cerca de 60°C, de cerca de 15°C a cerca de 40°C, de cerca de 20°C a cerca de 40°C, ou de cerca de 30°C a cerca de 40°C.

Em algumas modalidades, as condições de lise (por exemplo, a solução ou o tempo de incubação), bem como as etapas de separação e/ou interrogação etapas, podem ser suficientes para exterminar algum ou todos os micro-organismos na amostra.

Os métodos da presente invenção são altamente versáteis e não requerem que todos os micro- organismos estejam vivos para que o isolamento e a identificação ocorram.

Em certas mo- dalidades, alguns ou todos os micro-organismos podem estar mortos, com a morte ocorren- do antes, durante e/ou após as etapas dos métodos que são executadas.

Os detalhes adicionais e a descrição dos tampões de lise contemplados na prática desta invenção são revelados no ,pedido de patente pendente sob o número de série US12/589.929 (agora publicado como US 2010/0129857 A1), depositado em 30 de outubro de 2009, intitulado “Methods for Isolation and Identification of Microorganisms”, cujos conte- údos são incorporados no presente documento a título de referência.

Os detalhes adicionais e a descrição dos tampões de lise contemplados podem ser encontrados no pedido de pa- tente pendente sob o número de série US12/589.936 (agora publicado como US 2010/0120085 A1), depositado em 30 de outubro de 2009, intitulado “Methods for Separa- tion, Characterization and/or Identification of Microorganisms Using Mass Spectrometry”, cujos conteúdos são incorporados no presente documento a título de referência.

Tipicamente, na prática desta invenção, a etapa de lise é executada dentro de um recipiente (por exemplo, um tubo de microcentrífuga). O recipiente pode ser qualquer recipi- ente com volume suficiente para conter uma amostra de teste e opcionalmente uma solução de lise.

Em uma modalidade, o recipiente pode ser um tubo de microcentrífuga.

Em uma outra modalidade, o dispositivo de separação revelado no pedido de patente relacionado sob o número de série US12/589,969 (agora publicado como US 2010/0120133 A1), deposi- tado em 30 de outubro de 2009, intitulado “Separation Device for Use in the Separation,

Characterization e/ou Identification of Microorganisms”, pode ser usado na prática desta in- venção.

O volume do recipiente pode ser cerca de 0,1 ml a cerca de 25 ml, por exemplo, cerca de 1 ml a cerca de 10 ml, por exemplo, cerca de 2 ml a cerca de 8 ml.

Se a etapa de lise e a etapa de isolamento ou separação subsequente forem feitas em uma microescala, o volume do recipiente pode ser cerca de 2 l a cerca de 100 l, por exemplo, cerca de 5 l a cerca de 50 l.

O recipiente pode ter um dispositivo de fechamento fixado ou pode ser ros- queado para aceitar um dispositivo de fechamento (por exemplo, uma tampa) de tal modo que o recipiente possa ser hermeticamente vedado durante o uso.

A presença de um fe- chamento diminui os riscos de manipulação de micro-organismos que são ou podem ser infecciosos e/ou perigosos, bem como o risco de contaminação da amostra.

Adicionalmente, uma outra vantagem possível dos métodos da presente invenção é a capacidade de execu- tar uma ou mais das etapas (por exemplo, etapas de lise ou filtração) com os micro- organismos em um recipiente vedado (por exemplo, um recipiente hermeticamente vedado). Os presentes métodos podem evitar os riscos de segurança e saúde associados à manipu- lação de micro-organismos altamente virulentos, tal como ocorre com a recuperação de mi- cro-organismos a partir das amostras para teste direto.

Dispositivos de Transferência de Amostra e Filtração Conforme discutido anteriormente em qualquer parte do presente documento, a presente invenção também é direcionada a um dispositivo de transferência de amostra e filtração operável para separação, captura e acúmulo de micro-organismos de uma amostra de teste por filtração a vácuo, e transferência subsequente dos micro-organismos captura- dos e acumulados (por exemplo, como uma massa ou filme) para uma lâmina ou placa de teste para análise ou interrogação dos micro-organismos (por exemplo, por espectrometria de massa). Em uma modalidade, o dispositivo de transferência de amostra e filtração com- preende um dispositivo de transferência de amostra e filtração integrado que tem um corpo oco alongado (por exemplo, um tubo oco alongado cilíndrico, hexagonal ou de formato simi- lar) que tem uma primeira extremidade ou ponta que é dotada de, ou terminada com um material de filtração (por exemplo, uma membrana de filtração) e uma segunda extremidade adaptada para conexão com um sistema ou dispositivo de vácuo.

Em uma modalidade pre- ferencial, o material de filtração (por exemplo, uma membrana de filtro) é localizado adjacen- te a, e se estende a partir de, primeira extremidade ou ponta do dispositivo de transferência de amostra e filtração integrado.

Por exemplo, o material de filtração pode ser externo (isto é, se estendendo ou se projetando a partir de) em relação à primeira extremidade ou ponta do corpo alongado.

Os presentes depositantes concluíram que o uso de um material de fil- tração que se estende a partir de ou se projeta a partir da primeira extremidade do dispositi- vo de transferência de amostra e filtração integrado permite para a transferência de quais- quer micro-organismos isolados e/ou acumulados, por exemplo, por unção ou reconheci-

mento da amostra em uma placa ou lâmina.

Em uma modalidade, o corpo oco alongado é feito de vidro.

Em uma outra modali- dade, o corpo oco alongado é feito de a material rígido, semirrígido ou plástico, tal como, polipropileno (PP), policarbonato (PC), tereftalato de polietileno (PET), ou outro material plástico.

Em geral, o dispositivo de transferência de amostra e filtração integrado compreen- de um corpo alongado geralmente cilíndrico que tem um diâmetro de ponta de filtração de cerca de 0,5 mm a cerca de 10 mm, de cerca de 1 mm a cerca de 5 mm, ou de cerca de 1,5 mm a cerca de 3 mm.

Em uma outra modalidade, o barril do cilindro pode se alargar out pa- ra um diâmetro ainda maior para ser capaz de conter um volume ainda maior de filtrado.

O dispositivo de transferência e filtração pode ter um comprimento de cerca de 2 cm a cerca de 20 cm, de cerca de 3 cm a cerca de 15 cm, ou de cerca de 4 cm a cerca de 10 cm.

Em uma modalidade, o dispositivo de transferência de amostra e filtração integrado compreende um corpo cilíndrico alongado que tem um diâmetro de cerca de 1,5 mm a cerca de 3 mm, e um comprimento de cerca de 4 cm a cerca de 10 cm.

Em uma outra modalidade, o dispositi- vo de transferência de amostra e filtração integrado compreende um corpo cilíndrico alonga- do que tem um volume interno de cerca de 0,5 cm3 a cerca de 10 cm3, de cerca de 1 cm3 a cerca de 5 cm3, ou de cerca de 1,5 cm3 a cerca de 3,5 cm3. Ainda em uma outra modalida- de, o dispositivo de transferência de amostra e filtração integrado compreende um corpo cilíndrico alongado que tem um diâmetro de cerca de 1,5 mm a cerca de 3 mm e a compri- mento de cerca de 4 cm a cerca de 10 cm (ou um volume de cerca de 0,9 cm3 a cerca de 4,7 cm3). Em uma modalidade, o tubo cilíndrico, oco e alongado do dispositivo de transferên- cia de amostra e filtração integrado pode ser preenchido, ou comprimido, com um adsorven- te.

A compressão de um material absorvente atrás da membrana é útil em duas maneiras.

Primeiro, isso fornece suporte, que permitiu que a membrana se projetasse levemente além da ponta, que os depositantes concluíram que permite uma transferência mais eficiente de micro-organismos do material de filtro (por exemplo, uma membrana de filtro) para uma lâ- mina ou placa alvo.

Segundo, o uso de um adsorvente no dispositivo de transferência e fil- tração também permite a adsorção do lisato (isto é, meios de cultura e/ou materiais celula- res) que passaram através do material de filtração.

Além disso, os depositantes concluíram que o material de compressão fornece um zona de separação clara entre o lisato de amos- tra e a membrana de filtro, impedindo por meio disso remistura do filtrado de lisato de volta em contato com a membrana durante e após a lavagem, impedindo dessa forma a reconta- minação dos micróbios limpos.

Em geral, qualquer material adsorvente conhecido pode ser usado.

Por exemplo, em uma modalidade, o adsorvente pode ser um poliéster, fibra de vidro ou celulose, ou material particulado.

Em uma outra modalidade, o adsorvente poderia ser uma resina adsorvente, um gel de sílica, um hidrogel, derivados de ácido poliacrílico ou poli-

acrilamida, gomas vegetais, uma peneira molecular, zeólito, ou outros adsorventes bem co- nhecidos por aqueles elementos versados na técnica.

De acordo com a presente invenção, a primeira extremidade ou ponta do dispositivo de transferência de amostra e filtração integrado é dotada de, ou terminada com, um materi- al de filtro (ou material de filtração). Por exemplo, conforme discutido em qualquer parte do presente documento, o material de filtração (por exemplo, uma membrana de filtro) é locali- zado adjacente a, e se estende a partir de, primeira extremidade ou ponta do dispositivo de transferência de amostra e filtração integrado.

Em geral, qualquer material de filtro que tem tamanhos de poro que retêm pelo menos algumas porções dos micro-organismos e permi- tem que o lisato atravesse, pode ser usado na prática desta invenção.

Os materiais de filtro usados na prática desta invenção podem compreender, membranas de filtro ou filtros de profundidade bem conhecidos na técnica.

Em uma modalidade, a membrana de filtro terá um tamanho de poro de cerca de 0,1 m a cerca de 30,0 m, ou de cerca de 0,1 m a cerca de 10,0 m, ou de cerca de 0,1 m a cerca de 1,0 m.

As membranas exemplificadas po- dem incluir, membranas de polieterssulfona (PES) (por exemplo, Supor® 200, Supor® 450, Supor® MachV (Pall-Gelman, Port Lavarton, NY, EUA), Millipore Express PLUS® (Millipore)). Outros materiais de filtro possíveis podem incluir, HT Tuffryn® (polissulfona), GN Metricel® (éster de celulose misturado), Nilaflo® (Nilon), FP Verticel (PVDF), todos da Pall-Gelman (Port Lavarton, NY, EUA), e Nuclepore (policarbonato) da Whatman (Kent, Reino Unido). Os materiais de filtro de profundidade exemplificados podem incluir, tipo GF/F, GF/C e GMF150 (fibra de vidro, Whatman), Metrigard® (fibra de vidro, Pall-Gelman), AP15 (fibra de vidro, Mil- lipore), bem como uma variedade de celulose, poliéster, polipropileno ou outros filtros de fibra ou particulado, desde que os meios de filtro possam reter um número suficiente dos micro-organismos alvo para viabilizar a análise.

Em uma outra modalidade, um material de filtro particulado ou de fibra carregado ou modificado, por exemplo, uma membrana carrega- da com zeta, pode ser usado.

Conforme anteriormente descrito, a segunda extremidade do tubo alongado oco, oposta à primeira extremidade ou ponta, do tubo alongado oco pode ser fixada a uma fonte de vácuo ou sistema de vácuo, que é operável para fornecer um vácuo para filtração (isto é, para filtração a vácuo). Em geral, qualquer meio conhecido na técnica para conectar o dis- positivo de transferência de amostra e filtração ao sistema de vácuo pode ser usado.

Por exemplo, o dispositivo de transferência e filtração pode ser conectado a um sistema de vá- cuo com o uso de um tubo de vácuo simples, conforme é bem conhecido na técnica.

Ainda em uma outra modalidade, o dispositivo de transferência de amostra e filtra- ção pode compreender adicionalmente um bulbo de aperto para aplicação manual de um vácuo para filtração a vácuo.

O uso de um bulbo de aperto também pode permitir o uso de uma técnica de retrocorrente para transferir uma quantidade suficiente de micróbios para uma lâmina ou placa para análise por espectrometria de massa, conforme descrito em qual- quer parte no presente documento. Em uma outra modalidade, uma seringa e um êmbolo podem ser usados para gerar um vácuo. Ainda em uma outra modalidade, o dispositivo de transferência de amostra e filtração integrado pode usar o adsorvente internamente compri- mido para fornecer ação capilar e/ou força de trabalho suficiente para filtração e lavagem (isto é, permitindo por meio disso a filtração passiva). Em referência agora à Figura 1, uma modalidade exemplificada do dispositivo de transferência de amostra e filtração integrado é mostrada. A Figura 1 ilustra um dispositivo de transferência de amostra e filtração integrado 2 que compreende um tubo ou corpo cilín- drico, oco e alongado 4 que tem uma primeira extremidade ou ponta 6 e uma segunda ex- tremidade 8. A primeira extremidade ou ponta 6 é dotada de, ou terminada com um filtro ou material de filtração 9, que opera para capturar ou acumular micro-organismos quando um vácuo ou sucção é aplicado ao dispositivo de transferência de amostra e filtração integrado

2. Em uma modalidade preferencial, o material de filtração 9 é adjacente a, e externo em relação (isto é, se estende ou se projeta a partir de) à primeira extremidade ou ponta 6 do corpo ou tubo cilíndrico alongado 4. A segunda extremidade 8 é tipicamente conectada a uma fonte ou sistema de vácuo (não mostrado). Em outras modalidades, a segunda extre- midade 8 pode ser dotada de um bulbo ou um êmbolo para fornecer uma força de sucção ou fluxo de fluido para filtração. Também conforme mostrado, em uma modalidade possível, o corpo oco em formato cilíndrico pode ser preenchido, ou comprimido, com um adsorvente 10, conforme discutido no presente documento acima. De acordo com essa modalidade, o próprio adsorvente pode fornecer uma ação capilar ou força de trabalho que fornece o fluxo de fluido para filtração. Um outro conceito de projeto é exemplificado nas Figuras 2 a 3. As Figuras 2 a 3, ilustram um dispositivo de transferência de amostra e filtração integrado 12 que compreende um tubo ou corpo cilíndrico, oco e alongado 14 que tem uma primeira extremidade 15 e uma segunda extremidade 16. A primeira extremidade 15 é dotada de, ou terminada com um material de filtro 17, que opera para capturar ou acumular micro-organismos quando um vácuo ou sucção é aplicado ao dispositivo de transferência de amostra e filtração integrado

12. Em uma modalidade preferencial, omaterial de filtração 17 é adjacente a, e externo (isto é, se estende ou projeta a partir da) em relação à primeira extremidade ou ponta 15 do cor- po ou tubo cilíndrico alongado 14. A primeira extremidade 15 do dispositivo de transferência de amostra e filtração integrado 12 pode compreender adicionalmente uma porção afunilada 18 e uma ponta aplainada ou alargada 19. Em outras modalidades, a segunda extremidade 16 pode ser dotada de um bulbo ou um êmbolo para fornecer uma força de sucção para filtração. Também conforme mostrado, em uma modalidade possível, o corpo oco em forma- to cilíndrico pode ser preenchido, ou comprimido, com um adsorvente 10, conforme discuti-

do no presente documento acima.

De acordo com essa modalidade, o próprio adsorvente pode fornecer uma ação capilar ou força de trabalho que fornece fluxo de fluido para filtra- ção.

Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece uma montagem de transfe- rência de amostra e filtração que compreende uma pluralidade de dispositivos de transfe- rência de amostra e filtração integrados para o isolamento e/ou acúmulo de uma pluralidade de amostras de teste e para a transferência simultânea da pluralidade de micro-organismos isolados e/ou acumulados para um recipiente, lâmina ou placa para analisar a dita amostra isolada ou acumulada dos ditos micro-organismos para adquirir medições para a caracteri- zação e/ou a identificação do dito micro-organismo.

Tal dispositivo é exemplificado nas Figu- ras 4 a 5. Conforme mostrado nas Figuras 4 a 5, a montagem de transferência de amostra e filtração 20 compreende uma placa base 22, uma placa superior 24 e um par de hastes de suporte verticais 26 localizado entre e separando a placa superior 24 da dita placa base 22. A placa superior 24 compreende adicionalmente um par de mancais 28 que permitem que a placa superior seja movida “para cima” e “para baixo” em um plano vertical ao longo das hastes de suporte 26. Conforme mostrado, a montagem de transferência de amostra e filtração 20 pode compreender adicionalmente um par de trilhos de base 30 e um par correspondente de bar- ras de guia de suporte 32, que suportam uma montagem de suporte 34 que tem uma plura- lidade de cavidades 36 para segurar uma pluralidade de tubos individuais (por exemplo, tu- bo de microcentrífugas) 38. Conforme mostrado, os trilhos de base 30 pode compreender entalhes 40 que suportam as barras de guia de suporte 32 e permitem que as barras de guia de suporte 32 e, dessa forma, a montagem de suporte 34 seja laminadas em um plano hori- zontal em relação à placa base 22 e aos trilhos de base 28. Também conforme mostrado, a montagem de suporte 34 pode ser dotada de um manípulo 42 que permite que usuário ou técnico lamine a montagem de suporte 34 para frente e para trás em um plano horizontal, conforme guiado pelos entalhes 40, ao longo dos trilhos de base 30. Adicionalmente, conforme mostrado nas Figuras 4 a 5, a montagem de transferên- cia de amostra e filtração 20 pode compreender adicionalmente uma forquilha de eixo geo- métrico vertical 44 e um estágio vertical 46, que permite que a forquilha de eixo geométrico vertical 44 seja movida “para cima” e “para baixo” (isto é, em um plano vertical) ao longo do estágio vertical 46. Esse movimento vertical permite que a placa superior seja movida “para cima” e “para baixo” (isto é, verticalmente) ao longo das hastes de suporte 26. A placa superior 24 suporta uma montagem de vácuo 50 que suporta e fornece um vácuo para uma pluralidade de dispositivos de transferência de amostra e filtração integra- dos 52. Conforme mostrado nas Figuras 4 a 5, a montagem de vácuo 50 também pode compreender uma barra de alinhamento horizontalmente orientada 54 que compreende uma pluralidade de localizações ou orifícios igualmente espaçados 56 para segurar uma plurali- dade de dispositivos de transferência de amostra e filtração integrados removíveis 52. Con- forme mostrado, em uma modalidade, a barra de alinhamento 54 contém ou suporta uma pluralidade de (por exemplo, doze (12)) dispositivos de transferência de amostra e filtração integrados 52. Conforme mostrado, um ou mais postes de espaçamento (por exemplo, qua- tro (4)) 58 podem ser usados para espaçar ou suportar a barra de alinhamento 54 da placa superior 24. A montagem de vácuo 50 compreende adicionalmente uma tubulação de válvula 60 que compreende uma pluralidade de válvulas 62 e acessórios 64 que suportam e conectam individualmente um dispositivo de transferência de amostra e filtração integrado 52 à monta- gem de vácuo 50. Cada válvula individual 62 e acessório 64 suportados na tubulação de válvula 60 é individualmente conectado a uma tubulação de vácuo 66 por tubos de vácuo individuais 68. A tubulação de vácuo 66 é conectada a um sistema de vácuo (não mostrado) através de um tubo de vácuo principal 70. Em operação, é fornecido um vácuo para cada um dos dispositivos de transferência de amostra e filtração integrados individuais 52 de uma fonte de vácuo (não mostrado) atra- vés de um canal de vácuo.

O canal de vácuo compreende, em série a partir da fonte de vá- cuo, o tubo de vácuo principal 70 e a tubulação de vácuo 66. A partir da tubulação de vácuo 66, o canal de vácuo se conecta a e supre um vácuo para canais de vácuo individuais, em que cada canal de vácuo individual compreende, em série a partir da fonte de vácuo, os tu- bos de vácuo individuais 68, válvulas 62, tubulação de válvula 60, acessórios 64, e finalmen- te cada dispositivo de transferência de amostra e filtração integrado individual 52. Ainda em um outro conceito de projeto, a presente invenção fornece um sistema de filtração e transferência de amostra de duas partes.

O sistema de filtração e transferência de amostra de duas partes compreende uma primeira parte, ou uma montagem de filtração, para o isolamento e/ou o acúmulo de uma pluralidade de amostras de teste (isto é, amostras de teste que contêm ou são suspeitas de conter micro-organismos) por filtração e uma se- gunda parte, ou montagem de transferência, para a transferência simultânea da pluralidade de amostra isolada e/ou acumulada de micro-organismos para uma lâmina ou placa para analisar a dita amostra isolada ou acumulada dos ditos micro-organismos para adquirir me- dições para a caracterização e/ou a identificação do dito micro-organismo.

Tal dispositivo é exemplificado nas Figuras 6 a 9. De acordo com esta modalidade, o sistema de filtração e transferência de amostra de duas partes 100 compreende uma primeira parte, ou uma montagem de filtração 102 (consulte, por exemplo, Figura 6), e uma segunda parte, ou montagem de transferência 104 (consulte, por exemplo, Figura 9D). Conforme exemplificado nas Figuras 6 a 12, o sistema de filtração e transferência de amostra de duas partes 100 pode compreender uma monta- gem de filtração de 48 cavidades 102 (Figura 6) e uma montagem de transferência corres- pondente 104 (Figura 9D) para transferir até 48 amostras de filtrado (isto é, massas de mi- cro-organismo isoladas e/ou acumuladas) para uma lâmina ou placa de 48 cavidades (por exemplo, uma placa de MALDI-TOF de 48 cavidades) para análise e caracterização e/ou identificação subsequente de até 48 amostras de teste individuais (isto é, 48 massas de mi- cro-organismo isolado e/ou acumulado individuais). Conforme seria evidente para um ele- mento versado na técnica, outras configurações de cavidade são possíveis e consideradas parte da presente invenção.

Conforme mostrado nas Figuras 6 a 8, a montagem de filtração 102 compreende uma placa base de vácuo 106, um bloco de gaxeta inferior 108 e um bloco superior 110. A placa base 106 é dotada de um acessório de vácuo 120 para fixar um conduto de vácuo (por exemplo, uma tubulação de vácuo) para fornecer um vácuo para o sistema de filtração e transferência de amostra de duas partes 100 de uma fonte de vácuo (não mostrado). A mon- tagem de filtração 102 compreende adicionalmente uma pluralidade de cavilhas removíveis 112 e orifícios vazados de cavilha 114 que são fornecidos através da placa base de vácuo 106, de um bloco de gaxeta inferior 108 e de um bloco superior 110. As cavilhas 112 e orifí- cios vazados de cavilha 114 permitem o travamento de ou preensão da montagem de filtra- ção 102, antes e durante a filtração.

A montagem de filtração 102 também é dotada de um par de pinos de alinhamento 116 e orifícios vazados de alinhamento 118 que permitem a montagem da montagem de filtração 102 antes do travamento ou preensão da montagem 102 através das cavilhas 112. Conforme mostrado na Figura 6, os orifícios vazados de ali- nhamento 118, como os orifícios vazados de cavilha 114, também são fornecidos através da placa base de vácuo 106, de um bloco de gaxeta inferior 108 e de um bloco superior 110. A montagem de filtração 102 compreende adicionalmente uma gaxeta de vácuo 122 que fornece uma vedação impermeável a ar entre a placa base de vácuo 106 e o bloco de gaxeta inferior 108. Conforme mostrado na Figura 6, o bloco de gaxeta inferior 108 contém uma cavi- dade de filtração 124 que compreende uma reentrância na superfície de topo do bloco de gaxeta inferior 108 e contém nisso uma pluralidade de orifícios vazados de filtração 140. A cavidade de filtração 124 aloja nisso uma gaxeta inferior 128 e uma gaxeta superior 130, que “ensanduicham” um material de filtro 132 (por exemplo, uma membrana de filtro). Como a cavidade de vácuo 124, as gaxetas inferior 128 e superior 130 compreendem nisso uma pluralidade de orifícios vazados de filtração 140, que correspondem aos orifícios vazados de filtração contidos na cavidade de filtração 124. Conforme exemplificado na Figura 6, a cavi- dade de filtração 124, a gaxeta inferior 128 e a gaxeta superior 130 podem compreender 48 oríficios vazados de vácuo correspondentes 140 (novamente outras configurações de cavi-

dade de amostra são possíveis e contempladas como parte da presente invenção). As gaxe- tas inferior 128 e superior 130 fornecem uma vedação impermeável a ar que permite a filtra- ção através do material de filtro em resposta ao vácuo que é puxado através do acessório de vácuo 120 e da fonte de vácuo (não mostrado). O bloco superior 110 pode compreender adicionalmente uma gaxeta ou fita média 136 e uma placa superior 138, conforme mostrado por exemplo na Figura 6. Como a cavi- dade de filtração 124, a gaxeta inferior 128 e a gaxeta superior 130, a gaxeta ou fita média 136 do bloco superior 110 e uma placa superior 138 compreendem uma pluralidade de orifí- cios ou cavidades de amostra 142, aos quais uma amostra de teste pode ser adicionada e filtrada para isolamento e/ou acúmulo de quaisquer micro-organismos contidos nisso.

Cada um da pluralidade de orifícios ou cavidades de amostra 142 corresponde ou se alinha com cada um dos orifícios vazados de vácuo 140 contidos na cavidade de filtração 124, na ga- xeta inferior 128 e na gaxeta superior 130. Através do uso de uma gaxeta ou fita média 136, o bloco superior 110 e a placa superior 138 podem ser feitos em duas partes separadas e, então, montados com a gaxeta ou fita média 136, permitindo dessa forma que os canais de fluxo de fluido rebaixados (conforme mostrado nas Figuras 10 a 12) sejam feitos em cada parte.

Conforme mostrado na Figura 10, a superfície de fundo 180 da placa superior 138 pode compreender um primeiro canal de fluxo de fluido 182. O primeiro canal de fluxo de fluido 182 ilustrado nas Figuras 10 e 12 compreende uma entrada 184 localizada em uma borda lateral da placa superior 138 e uma pluralidade de canais de distribuição 186 que for- necem comunicação fluida entre a entrada 184 e uma pluralidade de individual orifícios ou cavidades de amostra 142 fornecidas na placa superior 138. Conforme mostrado mais cla- ramente na Figura 12, o primeiro canal de fluxo de fluido 182 leva a ou fornece para fluxo de fluido da entrada 184 para a borda de topo dos orifícios ou cavidades de amostra individuais 142 formados pelo bloco superior 110, gaxeta ou fita média 136 e uma placa superior 138. O primeiro canal de fluxo de fluido 182 pode ser usado para fornecer uma amostra de líquido para os orifícios ou cavidades de amostra individuais, por exemplo, as cavidades de amostra 142 podem ser preenchidas com uma solução lítica ou um tampão de lavagem através do primeiro canal de fluxo de fluido 182 (conforme mostrado por exemplo pela seta 188). Conforme mostrado na Figura 11, a superfície de topo 190 do bloco superior 110 pode compreender um segundo canal de fluxo de fluido 192. O segundo canal de fluxo de fluido ilustrado nas Figuras 11 a 12 compreende uma pluralidade de canais de saída 194 que levam ou conectam o fundo da pluralidade de individual orifícios ou cavidades de amos- tra 142 a uma pluralidade de canais de distribuição 196 contida na superfície de topo 190 do bloco superior 110 que, por sua vez, leva a uma porta de saída 198 contida em uma borda lateral do bloco superior 110. O segundo canal de fluxo de fluido 192 pode ser usado para remover fluido das cavidades de amostra individuais 142 (conforme mostrado, por exemplo, pela seta 200). Por exemplo, se uma ou mais das cavidades se tornarem bloqueadas ou entupidas devido ao acúmulo de micro-organismos no material de filtro, a fonte de vácuo pode ser desligada, e um segundo meio (por exemplo, um segundo vácuo) para fornecer uma força ou sucção para retirar o excesso de fluido das cavidades de amostra 142 através do segundo canal de fluxo de fluido 192. Em operação, uma pluralidade de amostras de teste (por exemplo, amostras de cul- tura de sangue lisadas, de acordo com uma modalidade possível da presente invenção) po- de ser filtrada através da montagem de filtração 102 e do micro-organismo contido nisso isolado e/ou acumulado no material de filtro 132. De acordo com essa modalidade, uma amostra de teste individual (não mostrado) pode ser adicionada às cavidades de amostra individuais 142 e um vácuo aplicado à montagem de filtração 102 de uma fonte de vácuo (não mostrado) através do acessório de vácuo 120 para filtração do lisato através do materi- al de filtro 132, isolando e/ou acumulando por meio disso quaisquer micro-organismos no material de filtro 132. Esse processo pode ser repetido com amostras de teste diferentes fornecidas em cada um dos orifícios ou cavidades de amostra individuais 142 fornecidas no bloco superior 110. Conforme mostrado nas Figuras 9A a 9D, a montagem de transferência 104 com- preende um bloco de pino de transferência 150 que compreende uma base 152, um par de pinos de alinhamento 154 e uma pluralidade de pinos de transferência 156. De acordo com essa modalidade, os pinos de transferência 156 operam para transferir uma massa de mi- cro-organismo isolada e/ou acumulada para uma lâmina ou placa 160 (por exemplo, um pla- ca MALDI-TOF) através do pressionamento do material de filtro (por exemplo, membrana de filtro) firmemente contra a lâmina ou placa 160, transferindo por meio disso os micro- organismos isolados e/ou acumulados.

A transferência de micro-organismos isolados e/ou acumulados para uma lâmina ou placa 160 é ilustrada nas Figuras 9A a 9D.

Em operação, após a filtração, o bloco de gaxeta inferior 108 é removido da montagem de filtração 102. A gaxeta superior 130 é removida da cavidade de vácuo 124 do bloco de gaxeta inferior 108 e uma lâmina ou placa 160 (por exemplo, uma placa MALDI-TOF) é colocada na cavidade de vácuo sobre o material de filtro 132 (vide Figuras 9A e 9B). Para fornecer para a colocação precisa da lâmina ou placa 160 na cavidade de vácuo 124, um guia 162 e um lábio 164 são fornecidos na superfície de topo do bloco de gaxeta inferior 108. O alinhamento da lâmina ou placa 160 com o guia 162 e o lábio 164 assegura que os pontos de amostra 166 contidos na superfície da lâmina ou placa 160 sejam apropriadamente alinhados com os pontos de micro-organismo correspondentes (não mostrado) resultantes da filtração de amostras de teste individuais através dos orifícios ou cavidades de amostra individuais 142 fornecidas no bloco superior 110 (isto é, cada um orifícios ou cavidades de amostra 142 é alinhado com um ponto de amostra correspondente 166). A seguir, o bloco de gaxeta inferior 108, o material de filtro 132 e a lâmina ou placa 160, são transferidos e alinhados no topo do bloco de pino de transferência 150 com o uso dos pinos de alinhamento 154 e orifícios vazados de alinhamento 118 fornecidos no bloco de gaxeta inferior 108 (vide Figura 9C). Os pinos de alinhamento 154 e os orifícios vazados de alinhamento 118 permitem que os pinos de transferência 156 sejam apropriadamente alinhados com os orifícios vazados 140 contidos no bloco de gaxeta inferior 108 e, dessa forma, permitem o alinhamento apropriado em série dos pinos de transferência, dos micro- organismos isolados e/ou acumulados no material de filtro 132 e dos pontos de amostra cor- respondentes 166 contidos na superfície da lâmina ou placa 160. Finalmente, os pinos de transferência 156 podem ser pressionados no material de filtro 132 e lâmina ou placa 160, por meios conhecidos na técnica, para transferir os micro- organismos isolados e/ou acumulados (resultantes da filtração de amostras de teste indivi- duais através de um ou mais dos orifícios ou cavidades de amostra individuais correspon- dentes 142) para os pontos de amostra correspondentes 166 contidos na superfície da lâmi- na ou placa 160 (vide Figura 9D). Subsequentemente, a lâmina ou placa 160 pode ser anali- sada ou interrogada para adquirir as medições para a caracterização e/ou a identificação do dito micro-organismo, de acordo com a presente invenção.

Etapa de Separação, Isolamento e/ou Acúmulo A próxima etapa no método da presente invenção (por exemplo, a etapa após a amostra ter sido lisada, se uma etapa de lise ou dissolução for executada) é uma etapa de separação, isolamento e/ou acúmulo.

A etapa de separação, isolamento e/ou acúmulo pode ser executada para separar e isolar ou purificar os micro-organismos de outros componen- tes da amostra (por exemplo, não micro-organismos ou componentes dos mesmos) e para acumular ou capturar os micro-organismos em uma massa que pode ser transferida para uma lâmina ou placa espectrometria de massa e subsequentemente interrogada para pro- pósitos de identificação e/ou caracterização.

A separação, isolamento e/ou acúmulo não precisa ser completa, isto é, não é requerido que 100% da separação ocorra.

Tudo que é requerido é que a separação, isolamento e/ou acúmulo dos micro-organismos de outros componentes da amostra seja suficiente para permitir a análise ou interrogação dos micro- organismos sem interferência substancial dos outros componentes.

Por exemplo, a separa- ção/isolamento pode resultar em uma massa de micro-organismo acumulada ou capturada que é pelo menos cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, ou 99% ou mais pura.

Em uma modalidade, a etapa de separação, isolamento e/ou acúmulo é executada como uma etapa de filtração em que um dispositivo de transferência de amostra e filtração

(conforme descrito em qualquer parte no presente documento) é colocado na amostra (por exemplo, uma amostra lisada) em um recipiente e um vácuo é aplicado ao dispositivo de transferência e filtração, o que permite que os micro-organismos sejam separados, isolados e/ou acumulados (por exemplo, os micro-organismos podem ser acumulados ou capturados no material de filtração (por exemplo, uma membrana de filtro) do dispositivo de transferên- cia e filtração) dos outros componentes que podem estar presentes na amostra.

De acordo com essa modalidade, outros componentes da amostra (por exemplo, não micro-organismos ou componentes dos mesmos que podem estar presentes no meio de amostra) passam através do filtro ou do material de filtração.

Consequentemente, essa etapa de filtração isola, separa e/ou acumula os micro-organismos dos materiais na amostra, tais como meio, detri- tos de célula, e/ou outros componentes que podem interferir na análise ou na interrogação dos micro-organismos (por exemplo, por espectrometria de massa). Consequentemente, em uma modalidade, essa revelação descreve um método ino- vador para processar rapidamente micro-organismos de uma amostra (por exemplo, uma cultura de líquido positiva), facilitado por um dispositivo de transferência de amostra e filtra- ção, para caracterização e/ou identificação do micro-organismo.

Em uma modalidade, o mé- todo envolve capturar e acumular micro-organismos sobre ou em um material de filtro, e transferir subsequentemente os micróbios acumulados para uma lâmina ou placa alvo para análise espectrométrica de massa.

Em referência agora à Figura 13, um método exemplifi- cado para a separação/isolamento, captura e acúmulo, e transferência subsequente de mi- cro-organismos para análise espectrométrica de massa é mostrado.

Conforme mostrado na Figura 13, o método envolve as seguintes etapas: (1) obter uma amostra de teste conhecida por conter ou que pode conter um micro-organismo (por exemplo, uma cultura de sangue positiva) (identificada como etapa 1); (2) lisar seletivamente as células sem micro-organismo na amostra de teste, produzindo por meio disso uma amostra lisada (etapa 2); (3) imergir um dispositivo de transferência de amostra e filtração (conforme descrito em qualquer parte no presente documento) na amostra lisada (etapa 3); (4) aplicar um vácuo ao dispositivo de transferência de amostra e filtração, filtrando por meio disso a amostra lisada através do filtro, capturando por meio disso o micro-organismo no material de filtro do dispositivo de transferência e filtração integrado (etapa 4); (5) transferir o dispositivo de transferência e filtração para um tampão ou fluido de lavagem, para lavar o filtro (etapa 5); (6) lavar o filtro através da aplicação ou puxamento de um vácuo no dispositivo de transferência e filtração, puxando por meio disso o tampão ou fluido de lavagem para cima através do filtro e, dessa forma, lavando quaisquer micro-organismos capturados no material de filtro (etapa 6); (7) transferir o dispositivo de transferência e filtração parta uma placa alvo MALDI-TOF (descrito em maiores detalhes abaixo) (etapa 7); (8) depositar os micro-organismos na superfície da placa alvo MALDI-TOF (por exemplo, com o uso de uma técnica de golpeamento) (etapa 8);

(9) adicionar solução de matriz à amostra de micro-organismo na placa (descrito em maiores detalhes abaixo) (etapa 9); e (10) adquirir espectros de massa da amostra de micro- organismo com o uso de MALDI-TOF (conforme descrito abaixo) (não mostrado). Etapa de Transferência Opcional Após acumular ou capturar os micro-organismos no material de filtração (por exem- plo, uma membrana de filtro) do dispositivo de transferência e filtração, a próxima etapa, em uma modalidade do processo, é a transferência e o depósito dos micro-organismos acumu- lados (isto é, como uma massa ou filme) em uma lâmina ou placa alvo para análise e/ou interrogação (por exemplo, por espectrometria de massa). De acordo com a presente inven- ção, o dispositivo de transferência de amostra e filtração, além de fornecer um dispositivo para capturar e acumular micro-organismos de uma amostra de teste, também serve como um dispositivo de transferência, para a transferência e a aplicação de micro-organismos so- bre uma lâmina ou placa alvo para análise de espectrometria de massa.

Em uma modalidade, os micro-organismos acumulados no dispositivo de transfe- rência e filtração podem ser aplicados ou diretamente depositados em/sobre um recipiente, lâmina ou placa alvo.

De acordo com essa modalidade, o dispositivo de transferência e fil- tração pode ser golpeado (por exemplo, de uma maneira vertical para cima e para baixo) em/sobre um recipiente, lâmina ou placa alvo, uma ou mais vezes, para permitir que uma quantidade suficiente de micróbios seja transferida para o recipiente, a lâmina ou a placa para análise.

Em alguns casos, a transferência de micróbios suficientes para análise pode requerer golpeamento repetido.

Em uma outra modalidade, os micro-organismos acumulados no dispositivo de transferência e filtração podem ser aplicados ou diretamente depositados sobre uma lâmina ou placa alvo com o uso de uma técnica de retrocorrente.

A técnica de retrocorrente envolve aplicar retropressão moderada através do dispositivo de transferência e filtração integrado (por exemplo, com um bulbo de aperto ou tubulação dobrada) de modo que uma pequena quantidade de líquido saia da ponta.

A retropressão pode ser aplicada enquanto se unta o dispositivo verticalmente em ou sobre o recipiente, lâmina ou placa alvo até que bastante líquido seja liberado para deixar aproximadamente 1 a 2 l de suspensão de retrocorrente atrás, transferindo por meio disso uma quantidade suficiente de micróbios para análise por espectrometria de massa.

Ainda em uma outra modalidade, os micro-organismos acumulados no dispositivo de transferência e filtração podem ser aplicados ou diretamente depositados sobre uma lâ- mina ou placa alvo com o uso de uma técnica de unção.

A técnica de unção envolve untar ou limpar o material de filtro do dispositivo por toda a superfície de uma lâmina ou placa al- vo, uma ou mais vezes, para permitir que uma quantidade suficiente de micróbios seja trans- ferida para a lâmina ou placa para espectrometria de massa análise.

Em alguns casos, a transferência de micróbios suficientes para análise de espectrometria de massa pode reque- rer unção ou limpeza repetida do dispositivo sobre a superfície da lâmina ou placa alvo.

Etapa de Análise, Medição e/ou Interrogação Uma vez que os micro-organismos foram filtrados (por exemplo, com o uso dos dis- positivos de transferência de amostra e filtração revelados no presente documento) para isolamento e/ou acúmulo do micro-organismo desconhecido, a massa de micro-organismo isolada e/ou acumulada pode ser analisar para adquirir as medições para a caracterização e/ou a identificação do dito micro-organismo.

Em uma modalidade, a amostra isolada ou acumulada dos ditos micro-organismos pode ser analisada com o uso de interrogação es- pectroscópica, por exemplo, com base em características intrínsecas dos micro-organismos (por exemplo, fluorescência intrínseca) ou estrutura vibracional de moléculas constituintes (por exemplo, espectroscopia Raman). Em uma outra modalidade, os micro-organismos isolados ou acumulados podem ser analisados por espectrometria de massa (por exemplo, MALDI-TOF-MS). Os detalhes adicionais e a descrição de métodos preferenciais para ad- quirir as medições para a caracterização e/ou a identificação dos ditos micro-organismo po- dem ser encontrados nos seguintes pedidos de patente copendentes sob os números de série (1) US12/589.952 (agora publicado como US 2010/0129858 A1), depositado em 30 de outubro de 2009, intitulado “Methods for Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms Using Spectroscopy”, cujos conteúdos são incorporados no presente docu- mento a título de referência; (2) US12/589.976 (agora publicado como US 2010/0156609 A1), depositado em 30 de outubro de 2009, intitulado “Methoos for Separation, Characteriza- tion and/or Identification of Microorganisms Using Raman Spectroscopy”, cujos conteúdos são incorporados no presente documento a título de referência; e (3) US12/589.936 (agora publicado como US 2010/0120085 A1), depositado em 30 de outubro de 2009, intitulado “Methods for Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms Using Mass Spectrometry”, cujos conteúdos são incorporados no presente documento a título de referência.

Em algumas modalidades, a massa de amostra ou micro-organismo isolada e/ou acumulada pode ser interrogada espectroscopicamente.

Em uma modalidade, os métodos espectroscópicos ópticos podem ser usados para analisar uma ou mais propriedades intrín- secas dos micro-organismos, por exemplo, uma propriedade presente dentro do micro- organismo na ausência de agentes adicionais, tais como colorações, corantes, agente de ligação, etc.

Em outras modalidades, os métodos espectroscópicos ópticos podem ser usa- dos para analisar uma ou mais propriedades extrínsecas dos micro-organismos, por exem- plo, uma propriedade que pode apenas ser detectada com o auxílio de agentes adicionais.

A interrogação pode ser executada com o uso de, por exemplo, espectroscopia de fluorescên- cia, espectroscopia de refletância difusa, espectroscopia infravermelha, espectroscopia te-

rahertz, espectroscopia de transmissão e absorbância, espectroscopia Raman, incluindo Espectroscopia Raman Intensificada em Superfície (SERS), Espectroscopia Raman Espaci- almente Deslocada (SORS), espectroscopia Raman de transmissão e/ou espectroscopia Raman de ressonância.

Para intensificar os sinais de fluorescência e de Raman (SERS), os micro-organismos podem ser revestidos com nanopartículas de ouro e/ou prata antes da centrifugação, e/ou a superfície óptica interna poderia ser pré-revestida com coloides metáli- cos de tamanho e formato particulares (referências: Lakowicz, Anal.

Biochem. 337:171 (2005) para fluorescência; Efrima et al., J.

Phys.

Chem.

B. (Letter) 102:5947 (1998) para SERS). Em uma modalidade, a massa de amostra ou micro-organismo isolada e/ou acumu- lada é analisada para obter medições úteis para a caracterização e/ou a identificação do micro-organismo desconhecido, enquanto a amostra ou massa permanece em/sobre o dis- positivo de transferência de amostra e/ou filtração.

Em uma outra modalidade, conforme discutido em qualquer parte no presente documento, a massa de amostra ou micro- organismo pode ser analisada após a transferência para um recipiente, placa ou lâmina.

Em outras modalidades, após a amostra ter sido filtrada (por exemplo, com o uso de um dispositivo de transferência de amostra e filtração, conforme revelado em qualquer parte no presente documento), uma porção da amostra é transferida para/sobre um recipien- te, placa ou lâmina para introdução em um espectrômetro de massa.

Um substância alta- mente absortiva é depositada no topo da amostra (por exemplo, matriz); esse material tem um coeficiente de absorção óptica muito alto em relação à frequência de laser que é usada para ionizar a amostra (por exemplo, para um laser de nitrogênio o comprimento de onda de emissão é 337 nm, então, o material absortivo teria um coeficiente de absorção grande em um comprimento de onda de 337 nm). Após a amostra e a substância absortiva terem seca- do, a placa é inserida no espectrômetro de massa.

Após o tempo requerido para bombear a amostra para baixo (isto é, remover gases atmosféricos da amostra de modo que está em um ambiente de 10-5 a 10-7 torr), a amostra é introduzida na câmara de ionização do es- pectrômetro de massa.

A amostra é alinhada com o sistema.

Quando o alinhamento ideal é alcançado, o laser de nitrogênio é pulsado.

A absorção da energia de laser pela matriz oca- siona a ablação da superfície da placa devido à alta energia depositada.

Como um efeito colateral, as porções da célula do micro-organismo são também vaporizadas e ionizadas no processo.

Esses íons são acelerados para uma energia cinética conhecida pela geração de um campo eletrostático entre a placa e a entrada para o tubo de voo do espectrômetro de massa (isto é, essa porção do sistema é o discriminador de massa/carga). Todos os íons de carga única, independentemente de massa, terão a mesma energia cinética na entrada do tubo de voo, mas possuem velocidades que são inversamente proporcionais a suas massas.

A partir disso, os íons se movem para baixo do tubo de voo em direção ao detector, e os íons mais leves irão chegar antes dos íons mais pesados (o tubo de voo é o discriminador de massa/carga). O detector gera um carga elétrica a cada instante que um íon impacta o detector.

A saída do detector é expresso em dígitos e a saída exibe a razão de massa/carga em um eixo geométrico e número de impactos no outro eixo geométrico.

Em outras modali- dades, os micro-organismos transferidos na massa pode ser interrogada com o uso de téc- nicas de espectrometria de massa, tal como espectrometria de massa MALDI-TOF, espec- trometria de massa de ionização de eletropulverização de dessorção (DESI), espectrometria de massa GC, espectrometria de massa LC, espectrometria de massa de ionização de ele- tropulverização (ESI) e espectrometria de Tubo de Fluxo de Íon Selecionado (SIFT). Em algumas modalidades da invenção, a caracterização e/ou a identificação dos micro-organismos na amostra ou massa isolada não precisa envolver a identificação de uma espécie exata.

A caracterização abrange a categorização ou a classificação ampla de partí- culas biológicas bem como a identificação real de uma única espécie.

A classificação de micro-organismo de uma amostra ou massa isolada pode compreender a determinação de características fenotípicas, morfológicas e/ou metabólicas para o micro-organismo.

Por exemplo, a caracterização das partículas biológicas pode ser realizada com base em dife- renças observáveis, tal como, composição, formato, tamanho, agrupamento e/ou metabo- lismo.

Em algumas modalidades, a classificação das partículas biológicas de interesse pode não requerer conhecimento prévio das características de uma determinada partícula biológi- cas, mas apenas requer correlações consistentes com medições empíricas tornando dessa forma esse método mais geral e prontamente adaptável em comparação aos métodos com base em eventos de ligação específicos ou reações metabólicas.

Conforme usado no pre- sente documento “identificação” significa determinar a qual família, gênero, espécie e/ou cepa um micro-organismo anteriormente desconhecido pertence.

Por exemplo, a identifica- ção de um micro-organismo anteriormente desconhecido para o nível de família, gênero, espécie e/ou cepa.

Em alguns casos, a caracterização abrange os modelos de classificação que forne- cem informações uteis suficientes para a ação a ser tomada.

Os detalhes adicionais e a descrição de modelos de classificação contemplados podem ser encontrados no pedido de patente copendente sob o número de série US12/589,936 (agora publicado como US 2010/0120085 A1), depositado em 30 de outubro de 2009, intitulado “Methoos for Separa- tion, Characterization and/or Identification of Microorganisms Using Raman Spectroscopy”, cujos conteúdos são incorporados no presente documento a título de referência.

Conforme descrito nisso, os modelos de classificação preferenciais compreendem o agrupamento em um ou mais dos seguintes: (1) Grupos Gram; (2) Grupos Gram Clínicos; (3) Grupos Tera- pêuticos; e (4) Grupos Funcionais.

Kit.

A presente invenção também é direcionada a um kit para o isolamento, o acúmulo e/ou a purificação de micro-organismos de uma amostra de teste.

Em sua forma mais sim- ples, o kit da presente invenção irá incluir: (1) opcionalmente uma solução de lise ou tampão para a lise seletiva de micro-organismo não conhecido por estar presente ou que pode estar presente em uma amostra de teste; (2) um dispositivo de transferência de amostra e filtra- ção integrado (conforme descrito em qualquer parte no presente documento) para o isola- mento, acúmulo e/ou purificação de micro-organismos que podem estar na amostra de tes- te, e para a colheita e transferência subsequentes de micro-organismos; e (3) pelo menos um tampão ou fluido de lavagem para lavar a amostra de micro-organismo isolada, acumu- lada e/ou purificada.

O dispositivo de transferência de amostra e filtração integrado usado no kit é descrito em detalhes em qualquer parte no presente documento.

Opcionalmente, o kit pode incluir uma solução ou tampão de lise seletiva para lisar ou dissolver seletivamente células e/ou particulados indesejadas que podem estar presentes na amostra de teste, por exemplo, células sanguíneas e/ou células de tecido.

As células e/ou particulados podem ser lisadas ou dissolvidas para permitir a separação e/ou o isola- mento de micro-organismos de outros componentes da amostra.

A separação e/ou o isola- mento de micro-organismos de outros componentes impede a interferência durante qualquer aplicações de teste direto subsequente, por exemplo, análise ou interrogação para a carac- terização e/ou a identificação do micro-organismo (por exemplo, por espectrometria de mas- sa) ou desempenho de PCR microbial de ampla faixa em caldo de cultura de sangue.

Entre- tanto, se não for esperado que as células sem micro-organismo estejam presentes na amos- tra ou interfiram em qualquer teste subsequente, a etapa de lise pode não precisar ser exe- cutada.

Tipicamente, a solução de lise seletiva pode ser usada para lisar ou dissolver célu- las sem micro-organismo que podem estar presentes na amostra de teste.

Entretanto, em algumas modalidades, a lise seletiva de classes específicas de micro-organismos pode ser desejável e, dessa forma, pode ser executada de acordo com os métodos descritos no pre- sente documento e bem conhecidos na técnica.

Por exemplo, uma classe de micro- organismos indesejados pode ser seletivamente lisada, por exemplo, as leveduras são lisa- das enquanto as bactérias não são ou vice versa.

Em uma outra modalidade, os micro- organismos desejados são lisados a fim de separar um componente subcelular particular dos micro-organismos, por exemplo, membranas celulares ou organelas.

Em uma modali- dade, todas as células não microbianas são lisadas.

Em outras modalidades, uma porção das células não microbianas é lisada, por exemplo, células suficientes para impedir a interfe- rência na etapa de interrogação.

A lise de células pode ser executada por qualquer método conhecido na técnica como eficaz para lisar seletivasmente as células com ou sem lise de micro-organismos, incluindo, sem limitação, a adição de uma solução de lise, sonicação, choque osmótico, tratamento clínico, e/ou uma combinação dos mesmos.

A solução de lise é capaz de lisar células, por exemplo, células sem micro- organismo (por exemplo, através da solubilização ou dissolução de membranas celulares eucarióticas) e/ou células de micro-organismo.

Em uma modalidade, a solução de lise pode compreender um ou mais detergentes, opcionalmente uma ou mais enzimas, ou uma com- binação de um ou mais detergentes e uma ou mais enzimas, e pode incluir adicionalmente agentes adicionais.

Em uma modalidade, o detergente pode ser um detergente lítico sem desnaturação, tal como Triton® X-100, Triton® X-100-R, Triton® X-114, NP-40, Genapol® C- 100, Genapol® X-100, Igepal® CA 630, Arlasolve™200, Brij® 96/97, CHAPS, octil β-D- glicopiranosídeo, saponina, e éter de nonaetileno glicol monododecil (C12E9, polidocenol). Opcionalmente, os detergentes líticos de desnaturação podem ser incluídos, tal como sulfa- to de sódio dodecil, N-laurilsarcosina, desoxicolato de sódio, sais de bile, brometo de hexa- deciltrimetilamônio, SB3-10, SB3-12, amidosulfobetaína-14, e C7BzO.

Opcionalmente, os solubilizantes também podem ser incluídos, tais como Brij® 98, Brij® 58, Brij® 35, Tween® 80, Tween® 20, Pluronic® L64, Pluronic® P84, sulfobetaínas não detergentes (NDSB 201), amfi- póis (PMAL-C8), e metil-β-ciclodextrina.

Tipicamente, os detergentes e solubilizantes sem desnaturação são usados em concentrações acima de sua concentração molecular crítica (CMC), enquanto os detergentes de desnaturação podem ser adicionados em concentra- ções abaixo de sua CMC.

Por exemplo, os detergentes líticos sem desnaturação podem ser usados em uma concentração de cerca de 0,010% a cerca de 10%, por exemplo, cerca de 0,015% a cerca de 1,0%, por exemplo, cerca de 0,05% a cerca de 0,5%, por exemplo, cerca de 0,10% a cerca de 0,30% (concentração final após a diluição com a amostra). Em uma outra modalidade, os detergentes que compreendem um grupo “superior” de polioxietileno hidrofílico ligado a um grupo “inferior” de alcano ou alceno hidrofóbico por uma ligação de éter pode ser preferencial.

Esses detergentes são comumente especificados com o uso de notação da forma CxEy, em que “x” é igual ao número de carbonos na cadeia de alcano ou alceno, enquanto “y” é o número de monômeros de oxietileno (CH2CH2O) na cadeia de poli- oxietileno.

Os detergentes desse tipo em que x se situa na faixa de 10 a 20 e y se situa na faixa de 8 a 12 são preferenciais.

Ainda mais preferencial são os detergentes desse tipo em que x se situa na faixa de 12 a 18 e y se situa na faixa de 9 a 11. Por exemplo, o detergente de alcano-polioxietileno ou alceno-polioxietileno pode ser selecionado do grupo que consiste em Brij® 97, Brij® 96V, Genapol® C-100, Genapol® X-100, éter de nonaetileno glicol monodo- decil (polidocanol), ou uma combinação dos mesmos.

As enzimas que podem ser usadas em soluções de lise incluem, sem limitação, en- zimas que digerem ácidos nucleicos e outros materiais de obstrução de membrana (por exemplo, proteinase, DNase, neuraminidase, polissacarídeo, Glucanex®, e Pectinex®). Ou- tros aditivos que podem ser usados incluem, sem limitação, agentes de redução tal como 2- mercaptoethanol (2-Me) ou ditiotreitol (DTT) e agentes de estabilização tal como magnésio,

piruvato, e umectantes.

A solução de lise pode ser tamponada em qualquer pH que é ade- quado para lisar as células desejadas, e irá depender de múltiplos fatores, incluindo sem limitação, o tipo de amostra, as células a serem lisadas e o detergente usado.

Em algumas modalidades, o pH pode estar em uma faixa de cerca de 2 a cerca de 13, por exemplo, cer- ca de 6 a cerca de 13, por exemplo, cerca de 8 a cerca de 13, por exemplo, cerca de 10 a cerca de 13. Os tampões de pH adequados incluem qualquer tampão capaz de manter um pH na faixa desejada, por exemplo, cerca de 0,05 M a cerca de 1,0 M CAPS.

Para alguns tipos de amostra (por exemplo, urina), o pH ideal para a dissolução de células e/ou particu- lados indesejados pode ser de cerca de 2 a cerca de 8. O kit também irá incluir pelo menos um tampão ou fluido de lavagem para lavar a massa de micro-organismo ou micro-organismo isolado, acumulado e/ou purificado sobre o material de filtro.

O tampão de lavagem pode ser usado para adicionalmente separar, isolar ou purificar os micro-organismos acumulados ou capturados por meio da remoção por “la- vagem” de outros componentes (por exemplo, meios, componentes de meio, fragmentos de célula, não micro-organismos ou componentes dos mesmos) que podem estar presentes na amostra de teste.

Conforme um elemento versado na técnica iria observar prontamente, o uso de um tampão de lavagem permite, ou facilita, a remoção por lavagem (ou passar atra- vés do material de filtro) meios, componentes de meios, fragmentos de célula, não micro- organismos ou componentes dos mesmos, os quais podem de outro modo interferir com o teste subsequente (por exemplo, análise espectrométrica de massa). O tampão de lavagem também pode ser usado para neutralizar rapidamente o pH alcalino da solução de lise.

Em geral, qualquer tampão ou fluido de lavagem conhecido pode ser incluído no kit.

Por exem- plo, o tampão de lavagem poderia ser água destilada.

Em uma outra modalidade, o tampão de lavagem poderia ser um tampão de pH capaz de manter um pH adequado para micro- organismos, tal como um tampão de fosfato, MOPS ou TRIS.

Por exemplo, o tampão de lavagem poderia ser uma solução de fosfato de 0,01 M a cerca de 0,2 M, pH 6,0 a 7,5 Adicionalmente, o kit também pode compreender um dispositivo de filtração, fonte de vácuo e/ou uma interface de vácuo.

O dispositivo de filtração pode ser adaptado para a fixação a uma fonte de vácuo ou sistema de vácuo, o qual é operável para fornecer um vá- cuo para filtração (isto é, para filtração a vácuo). Em geral, qualquer meio conhecido na téc- nica para conectar o dispositivo de transferência de amostra e filtração ao sistema de vácuo pode ser usado.

Por exemplo, o dispositivo de transferência e filtração pode ser conectado a um sistema de vácuo com o suo de um simples tubo de vácuo, conforme é bem conhecido na técnica.

Por exemplo, o kit pode compreender frascos de vácuo de braço lateral (vide Figuras 2 a 3, número 2) com retentor de filtro reutilizável ou um arcabouço (vide Figura 3, número 4) com um reservatório de filtrado e uma pluralidade de retentores de filtro reutilizá- veis (vide Figura 3, número 6). Em mais outras modalidades, o kit pode compreender adici-

onalmente componentes adicionais para filtração, por exemplo, o kit pode compreender um ou mais tubos, grampos, válvulas ou armadilhas de vácuo.

Em uma outra modalidade, o kit pode compreender um ou mais dispositivos de filtração descartáveis que têm uma constru- ção em membrana de filtração.

Nestes dispositivos descartáveis, a filtração pode ser condu- zida por uma fonte de vácuo ou por centrifugação.

O kit também pode incluir um recipiente (por exemplo, um tubo), em que a etapa de lise pode ser executada.

O recipiente pode ser qualquer recipiente com volume suficiente para reter uma amostra de teste e opcionalmente uma solução de lise.

Em uma modalidade, o recipiente pode ser um tubo.

Em uma outra modalidade, o dispositivo de separação apre- sentado no pedido de patente U.S. relacionado, no. serial 12/589.969 (agora publicado como US 2010/0120133 A1), depositado em 30 de outubro de 2009, intitulado “Separation Device For Use in the Separation, Characterization e/ou Identification of Micro-organisms”, pode ser incluído no kit.

O volume do recipiente pode ser de cerca de 0,1 ml a cerca de 25 ml, por exemplo, cerca de 1 ml a cerca de 10 ml, por exemplo, cerca de 2 ml a cerca de 8 ml.

Se a etapa de lise e o isolamento subsequente ou etapa de separação forem feitos em uma mi- croescala, o volume do recipiente pode ser cerca de 2 l a cerca de 100 l, por exemplo, cerca de 5 l a cerca de 50 l.

O recipiente pode ter um dispositivo de fechamento fixado ou pode ser rosqueado para receber um dispositivo de fechamento (por exemplo, uma tampa) de tal modo que o recipiente possa ser hermeticamente vedado durante o uso.

A presença de um fechamento diminui os riscos de manusear os micro-organismos que são ou podem ser infecciosos e/ou perigosos, assim como o risco de contaminar a amostra.

Por exemplo, o kit pode conter a partir de 1 a 500 recipientes (por exemplo, tubos), em que a etapa de lise pode ser executada.

Em outras modalidades, o kit pode conter a partir de 1 a 100, a partir de 10 a 80, ou a partir de 10 a 50, recipientes em que a etapa de lise pode ser executada.

Em outras modalidades, o kit pode conter 20, 50, 75 ou 100 recipientes nos quais a etapa de lise pode ser executada.

O kit também pode incluir uma ou mais lâminas de teste ou placas-alvo para análise ou interrogação dos micro-organismos (por exemplo, por meio de espectrometria de massa). De acordo com esta modalidade, os micro-organismos acumulados no dispositivo de trans- ferência e filtração integrada podem ser aplicados ou diretamente depositados dentro/sobre uma lâmina de teste ou placa-alvo para o teste subsequente.

De acordo com esta modalida- de, os micro-organismos isolados, acumulados e/ou purificados sobre o dispositivo de trans- ferência e filtração integrada podem ser transferidos ou depositados sobre uma lâmina ou placa (por exemplo, com o uso de uma técnica de tamponamento, retrolavagem e/ou unção) sobre a lâmina ou placa-alvo para permitir o teste e/ou análise subsequente, conforme des- crito em maiores detalhes em outra parte no presente documento.

Por exemplo, o kit pode conter a partir de 1 a 500 lâminas de teste ou placas-alvo.

Em outras modalidades, o kit po-

de conter a partir de 1 a 100, ou a partir de 10 a 80, ou a partir de 20 a 50 lâminas de teste ou placas-alvo. Em outras modalidades, o kit pode conter 20, 50, 75 ou 100 lâminas de teste ou placas-alvo para teste e/ou análise subsequente. Em geral, o kit pode ser configurado para o processamento de qualquer número de amostras de teste (isto é, para o isolamento, acúmulo e/ou purificação de micro-organismos a partir de qualquer número específico de amostras de teste). Por exemplo, o kit pode ser configurado para o processamento (isolar, acumular e/ou purificar micro-organismos) a partir de cerca de 1 a cerca de 1000 amostras de teste, a partir de cerca de 10 a cerca de 500 amostras de teste, ou a partir de cerca de 10 a cerca de 100 amostras de teste. Em uma outra modalidade, o kit poderia ser configurado para o processamento a partir de cerca de 10 a cerca de 80 amostras de teste, a partir de cerca de 20 a cerca de 60 amostras de teste, ou cerca de 50 amostras de teste. A presente invenção é adicionalmente detalhada nos seguintes exemplos, os quais são oferecidos a título de ilustração e não é destinado a limitar a invenção de maneira algu- ma. As técnicas padrão bem conhecidas na técnica ou as técnicas especificamente descri- tas abaixo são utilizadas.

EXEMPLOS Exemplo 1. Espectrometria de massa por Filtração-lise Com o uso de um Dispositi- vo de transferência e filtração integrada Os micro-organismos foram “semeados” com um inoculo de aproximadamente 40 ou 400 CFU em uma suspensão de 1,0 ml de cada cepa de teste em garrafas BacT/ALERT® SA ou SN contendo 10 mL de sangue humano. As amostras de teste semeadas foram, en- tão, misturadas mediante a inversão das garrafas várias vezes incubadas em uma câmara BacT/ALERT® 3D Combo e monitoradas para a detecção de crescimento microbiano com dentro da garrafa. As amostras de cultura de caldo de sangue foram removidas a partir das garrafas dentro de alguns minutos de serem marcadas positivas pelo sistema de detecção microbia- na BacT/ALERT® 3D. Se a garrafa não foi processada imediatamente, foi armazenada a 2 a 8 °C, e mais tarde aqueceu-se o caldo a temperatura ambiente mediante a colocação da garrafa em um banho de água a 37 °C por 5 a 15 minutos antes do teste. As amostras de caldo de cultura de sangue positivas foram processadas para separar os micro-organismos a partir do sangue e componentes do meio que poderiam interferir com a análise subse- quente, conforme exposto a seguir: (1) com o uso de uma seringa de 1 mL e agulha de 18G, 0,5 mL de caldo positivo foi transferido para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml transparente; (2) 0,25 ml de Tampão de lise (0,45% em peso por volume de Brij-97 + 0,3M de CAPS, pH 11,7 (0,2 µm filtrado, armazenado a 2 a 8 °C)) foi adicionado ao caldo, e mistura-

do por aspiração/dispensação delicada 5 a 6 vezes, sendo cuidados para evitar a formação de bolhas tanto como possível, e a mistura foi incubada por 2:00 a 2:15 minutos em tempe- ratura ambiente, gerando, assim, uma amostra lisada, ou lisato; (3) após a incubação de lise, a ponta de um dispositivo de transferência e filtração integrada foi imersa aproximadamente 3 a 5 mm no lisato e aspirado a vácuo por 2:00 a 2:15 minutos em temperatura ambiente, à medida que o líquido é atraído, a profundidade do dispositivo de transferência e filtração integrada foi ajustada para manter uma profundidade de aproximadamente 3 a 5 mm; (4) depois que a amostra foi filtrada a vácuo por 2:00 a 2:15 minutos, o dispositivo de transferência e filtração foi movido para um recipiente contendo uma primeira solução de lavagem (Brij/solução salina (0,45% em peso por volume de NaCl + 0,05% de Brij 97)), imersa, e aspirada a vácuo por 4:00 a 4:15 minutos em temperatura ambiente; (5) depois da primeira etapa de lavagem, o dispositivo de transferência e filtração foi movido para um segundo recipiente contendo uma segunda solução de lavagem (água deionizada), imersa na primeira solução de lavagem, e aspirada a vácuo por 4:00 a 4:15 minutos em temperatura ambiente; (6) os micróbios lavados foram, então, aplicados a um ou mais pontos sobre as pla- cas-alvo MALDI-TOF com o uso de uma técnica tamponamento de tamponamento vertical repetido, ou alternativamente retrolavagem, até que um resíduo visível ou 1 a 2 l de sus- pensão fosse depositado; (7) os pontos foram secos e, então, 1 l de matriz foi adicionado; (8) depois que todas as amostras para um determinada placa-alvo foram aplicadas e secas, os pontos foram analisados por MALDI-TOF MS.

Exemplo 2: Espectrometria de massa por Lise-Filtração Com o uso de um Dispositi- vo de transferência e filtração integrada que compreende Filtros de membrana Quarenta e quatro (44) isolados de micro-organismo foram cultivados, processados e analisados por MALDI-TOF MS conforme descrito no Exemplo 1, com o uso de um dispo- sitivo de transferência de amostra e filtração integrado que emprega Supor® 450 (Pall- Gelman, Port Lavarton, NY) como um material de filtro e com o uso de uma técnica de retro- lavagem para depositar o micro-organismo acumulado sobre uma placa MALDI-TOF.

Depois que todas as amostras de micro-organismo tinham se secado completamen- te, os espectros de massa MALDI-TOF foram adquiridos para cada uma sobre uma faixa de massa/carga de 2.000 a 34.000 em um espectrômetro de massa Axima Assurance MALDI- TOF (Shimadzu Biotech North America, Maryland). Depois da aquisição de cada espectro de massa, uma tabela de picos de massa foi inserida no software de identificação de micro-organismo “Saramis” (bioMerieux Inc., USA) para análise.

Este software é construído sob uma base de dados de espectros de massa

MALDI-TOF coletados de micro-organismos cultivados em ágar. A tabela 1 abaixo mostra os resultados de ID com o uso de um dispositivo de trans- ferência e filtração integrada feito com uma membrana Supor 450. Tabela 1 - Dispositivo Supor 450 – Técnica de retrolavagem – Garrafas SA Isolado config. de Isolado config. de ID

ID E. coli, 104471 3 S. epidermidis, D055 2 E. coli, 100257 4 S. epidermidis, D069 0 E. coli, D104 4 S. epidermidis, D082 4 E. coli, D168 4 S. epidermidis, D092 3 P. aeruginosa, 105716 4 E. faecalis, D149 4 P. aeruginosa, 107930 4 E. faecalis, D135 3 E. aerogenes, 104098 3 E. faecium, 13243 0 E. aerogenes, 107930 3 E. faecium, 14334 0 K. pneumoniae, 108902 4 E. faecium, D068 0 K. pneumoniae, 105245 4 S. pneumoniae, 7265 2 S. aureus, 10754 0 S. pneumoniae, 14226 0 S. aureus, 8816 4 S. pneumoniae, D013 0 S. aureus, 7537 4 S. pyogenes, 11629 0 S. aureus, 7623 0 S. pyogenes, 11620 0 S. aureus, D164 2 S. pyogenes, 11631 0 S. aureus, D076 2 S. pyogenes, 12897 0 S. aureus, D116 3 C. albicans, 303070 4 S. aureus, D176 2 C. albicans, 18804 3 S. epidermidis, 13298 0 C. albicans, 302611 4 S. epidermidis, D011 0 C. albicans, 304765 0 S. epidermidis, D036 3 C. albicans, 304771 0 S. epidermidis, D042 0 C. albicans, 304776 3 Classificação de confiança de ID 4 = 99,9% 3 = 85 a 99,8% 2 = ID de espécie < 85%, ou gênero ou família >85% 0 = Nenhuma ID Conforme mostrado na Tabela 1, a 22/44 (50%) foi dada uma ID correta a boa con- fiança, enquanto que 61% foram identificados a pelo menos algum nível. Embora a taxa de sucesso com este experimento ainda não foi perfeita, isto de- monstra que conceito é muito promissor. Este conjunto de micro-organismos foi escolhido devido ao fato de que desafiantes para ID diretamente a partir da cultura de sangue por meio de métodos de centrífuga anteriores e, portanto, fornecem um teste rigoroso. Existem muitas razões pelas quais estes primeiros testes possam não ter fornecido IDs fortes em todos os casos. Uma possibilidade é que houve massa de insuficiente, outra possibilidade é que as células depositadas eram de pureza insuficiente, ou poderia ser uma combinação de ambas. Se a massa de célula consistir no problema, então, outras membranas, ou até filtros de profundidade não investigados ainda, poderiam capturar um número maior de células. Outra possibilidade consiste em aumentar o tempo/volume de captura a fim de acumular uma massa maior.

Exemplo 3: Espectrometria de massa por Lise-Filtração com o uso de um Dispositi- vo de transferência e filtração integrada que compreende Filtros de profundidade Quarenta e seis (46) isolados de micro-organismo foram cultivados, processados e analisados por MALDI-TOF MS conforme descrito no Exemplo 1, com o uso de um dispositi- vo de transferência de amostra e filtração integrado que emprega filtros de profundidade (filtro Whatman GF/F (nominal 0,7 mícron) e filtros Metrigard (Pall-Gelman) (nominal 0,5 mí- cron com aglutinante acrílico)) como um material de filtro em vez de membranas.

Os dispositivos de transferência de amostra e filtração integrado feitos com os filtros Pall-Gelman Metrigard (nominal 0,5 mícron com aglutinante acrílico) foram somente testa- dos em um pequeno número das amostras mais problemáticas, mas proporcionou resulta- dos tão bons quanto, ou melhor do que, os filtros GF/F.

Depois que todas as amostras de micro-organismo tinha se secado completamente, os espectros de massa MALDI-TOF foram adquiridos para cada uma sobre uma faixa de massa/carga de 2.000 a 34.000 em um espectrômetro de massa Axima Assurance MALDI- TOF (Shimadzu Biotech North America, Maryland). Após a aquisição de cada espectro de massa, uma tabela de picos de massa foi in- serida no software de identificação de micro-organismo “Saramis” (bioMerieux Inc., USA) para análise.

Este software é construído sob uma base de dados de espectros de massa MALDI-TOF coletados de micro-organismos cultivados em ágar.

A tabela 2 abaixo mostra os resultados de ID com o uso de um dispositivo de trans- ferência e filtração integrada feito com um filtro Whatman GF/F ou os filtros Pall-Gelman Metrigard.

Tabela 2 - Culturas semeadas em garrafas SA processadas com dispositivo do tipo filtro de profundidade Dispositivo Dispositivo Dispositivo Isolado GF/F Isolado GF/F Mertigard E. coli, 104471 4 S. epidermidis, D055 3 ND E. coli, 100257 4 S. epidermidis, D069 3 ND E. coli, D104 4 S. epidermidis, D082 4 ND E. coli, D168 4 S. epidermidis, D092 4 ND P. aeruginosa, 105716 4 E. faecalis, D149 4 ND P. aeruginosa, 107930 4 E. faecalis, D135 4 ND E. aerogenes, 104098 4 E. faecium, 13243 4 ND E. aerogenes, 107930 4 E. faecium, 14334 4 ND K. pneumoniae, 108902 4 E. faecium, D068 3 ND K. pneumoniae, 105245 4 S. pneumoniae, 7265 3 ND S. aureus, 10754 3 S. pneumoniae, 14226 3 3 S. aureus, 8816 4 S. pneumoniae, D013 3 ND S. aureus, 7537 3 S. pneumoniae, D002 3 ND S. aureus, 7623 4 S. pyogenes, 11629 2 3 S. aureus, D164 4 S. pyogenes, 11620 0 2 S. aureus, D076 4 S. pyogenes, 11631 3 ND S. aureus, D116 4 S. pyogenes, 12897 3 ND S. aureus, D176 4 C. albicans, 303070 4 ND

S. epidermidis, 13298 3 C. albicans, 18804 4 ND S. epidermidis, D011 4 C. albicans, 302611 2 4 S. epidermidis, D036 3 C. albicans, 304765 4 ND S. epidermidis, D042 4 C. albicans, 304771 3 ND C. albicans, 304776 4 ND Classificações de confiança de ID 4 = 99,9% 3 = 85 a 99,8% 2 = ID de espécie < 85%, ou gênero ou família >85% 0 = Nenhuma ID ND = Não determinado Conforme mostrado na Tabela 2, os resultados de culturas semeadas cultivadas em garrafas SA e processadas com dispositivo de filtro feito a partir de filtros de profundidade em vez de membranas.

Em geral, os resultados são muito bons, e similares ao melhor que tem se obtido por meio de outros métodos de processamento.

O dispositivo feito com o filtro Whatman GF/F (nominal 0,7 mícron) proporcionou IDs confiantes (>85% de confiança) para o nível de espécie (incluindo resultados de discriminação baixa típica com S.pneumoniae e C.albicans) com 43 de 46 isolados (93.5%), e ID para pelo menos o gênero, ou espécie em um nível de confiança menor, com 45 de 46 isolados (97,8%). Consequentemente, o uso de filtros de profundidade mostraram um aprimoramento sobre os experimentos anteriores com filtros de membrana.

É provável que os números de célula maiores que podem ser capturados em um filtro de profundidade contribuiriam para os resultados aperfeiçoados, mas a lavagem aperfeiçoada também poderia ser um fator.

As cepas Gram e/ou contagens de célula dos organismos capturados podem ajudar a distinguir entre as duas possibilidades.

Outra diferença dos testes anteriores é que o programa de aquisição de MALDI- TOF foi reajustado (conforme é exigido ocasionalmente devido ao envelhecimento do ins- trumento/detector) entre os dois experimentos.

O reajuste provavelmente teria aperfeiçoado os resultados do dispositivo de membrana também, mas não se levaria somente em conta a magnitude da diferença observada com os filtros de profundidade.

Exemplo 4: Espectrometria de massa por Lise-Filtração com o uso de um Dispositi- vo de transferência e filtração integrada que compreende Filtros de profundidade com garra- fas de meio contendo resina.

Cinquenta e um (51) isolados de micro-organismo foram cultivados, processados e analisados por MALDI-TOF MS conforme descrito no Exemplo 3, com o uso de um dispositi- vo de transferência de amostra e filtração integrado que emprega filtros de profundidade Metrigard® exceto pelo fato de que a) as culturas semeadas foram cultivadas em garrafas contendo meio aeróbico com resinas em vez de garrafas BacT/ALERT® SA, b) o tampão de lise tinha a seguinte composição (0,6% em peso por volume de Brij-97 + 0,4M de CAPS, pH

11,7), e c) a primeira solução de lavagem tinha a seguinte composição (20 mM de fosfato de sódio, 0,05% em peso por volume de Brij 97, 0,45% em peso por volume de NaCl, pH 7,2). Depois que todas as amostras de micro-organismo tinham se secado completamen- te, os espectros de massa MALDI-TOF foram adquiridos para cada uma sobre uma faixa de massa/carga de 2.000 a 34.000 em um espectrômetro de massa Axima Assurance MALDI- TOF (Shimadzu Biotech North America, Maryland). Após a aquisição de cada espectro de massa, uma tabela de picos de massa foi in- serida no software de identificação de micro-organismo “Saramis” (bioMerieux Inc., USA) para análise.

Este software é construído sob uma base de dados de espectros de massa MALDI-TOF coletados de micro-organismos cultivados em ágar.

A Tabela 3 abaixo mostra os resultados de ID com o uso de um dispositivo de transferência e filtração integrada feito com filtros Pall-Gelman Metrigard a partir de culturas cultivadas em meio contendo resina aeróbico.

Tabela 3 - Culturas semeadas em garrafas de meio de resina aeróbica processadas com dispositivo do tipo filtro de profundidade Isolado Conf. de ID Isolado Conf. de ID E.coli, 104471 4 S.epidermidis, 13298 4 E.coli, 100257 4 S.epidermidis, D011 4 E.coli, D104 4 S.epidermidis, D036 4 E.coli, D168 4 S.epidermidis, D055 4 E. coli-101262 4 S.epidermidis, D069 4 E. aerogenes, 104098 4 S.epidermidis, D082 4 E. aerogenes, 107930 4 S.epidermidis, D092 4 K.pneumoniae, 108902 4 E.faecalis, D149 4 K.pneumoniae, 105245 4 E.faecalis, D135 4 K. pneumoniae-104143 3 E. faecalis-15268 4 K. pneumoniae-108904 3 E. faecalis-15282 4 P.aeruginosa, 105716 4 E.faecium, 13243 4 P.aeruginosa, 108042 4 E.faecium, 14334 4 P. aeruginosa-104104 4 E.faecium, D050 4 P. aeruginosa-108937 4 E.faecium, D068 4 S.aureus, 10754 4 S.pneumoniae, 7265 3 S.aureus, 8816 4 S.pneumoniae, 14226 3 S.aureus, 7537 4 S.pneumoniae, D013 3 S.aureus, 7623 4 S.pneumoniae, D002 3 S.aureus, D164 4 S.pyogenes, 11629 3 S.aureus, D076 4 S.pyogenes, 11620 3 S.aureus, D116 4 S.pyogenes, 11631 3 S.aureus, D176 4 S.pyogenes, 12897 1 C.albicans, 303070 4 H.influenzae, 500891 3 C.albicans, 304771 2 H.influenzae, 500893 0 C.albicans, 304776 0 Classificações de confiança de ID 4 = 99,9% 3 = 85 a 99,8% 2 = ID de espécie < 85%, ou gênero ou família >85% 0 = Nenhuma ID

Conforme mostrado na Tabela 3, os resultados de culturas semeadas cultivadas em garrafas contendo resina e processadas com dispositivo e filtro feito a partir de filtros de pro- fundidade são muito bons.

Estas culturas processadas proporcionaram IDs confiantes (>85% de confiança) para o nível de espécie (incluindo resultados de discriminação baixa típica com S.pneumoniae e C.albicans) com 47 de 51 isolados (92,2%).

Claims (14)

REIVINDICAÇÕES

1. Dispositivo de transferência de amostra e filtração integrado CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: um corpo oco com formato alongado que tem uma primeira extremidade ou ponta que é dotada de ou terminada com um material de filtração, em que o dito material de filtra- ção é localizado adjacente a e externo em relação à dita primeira extremidade ou ponta; e uma segunda extremidade operável para fornecer fluxo de fluido para filtração.

2. Dispositivo de transferência de amostra e filtração integrado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita segunda extremidade é adapta- da para conexão a um sistema de vácuo, uma seringa ou um êmbolo para gerar um vácuo.

3. Dispositivo de transferência de amostra e filtração integrado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito corpo oco alongado é feito de um material rígido, semirrígido ou plástico, tal como, polipropileno (PP), policarbonato (PC), tereftalato de polietileno (PET) ou outro material plástico.

4. Dispositivo de transferência de amostra e filtração integrado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito corpo oco alongado compreende um corpo cilíndrico alongado que tem um diâmetro de cerca de 0,5 mm a cerca de 10 mm e um comprimento de cerca de 2 cm a cerca de 20 cm.

5. Dispositivo de transferência de amostra e filtração integrado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito corpo oco alongado tem um volume interno de cerca de 0,5 cm3 a cerca de 10 cm3.

6. Dispositivo de transferência de amostra e filtração integrado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito corpo oco alongado é preenchido, ou comprimido, com um adsorvente e em que o dito adsorvente fornece filtração passiva através do fornecimento de uma ação capilar ou força de trabalho para fluxo de fluido.

7. Dispositivo de transferência de amostra e filtração integrado, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito adsorvente é selecionado do grupo que consiste em algodão, poliéster, uma resina adsorvente, um gel de sílica, um hi- drogel, uma peneira molecular, zeólito ou outros materiais adsorventes.

8. Dispositivo de transferência de amostra e filtração integrado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito material de filtro tem um tamanho de poro de cerca de 0,1 m a cerca de 10,0 m.

9. Dispositivo de transferência de amostra e filtração integrado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito material de filtro é selecionado do grupo que consiste em membranas de polieterssulfona (PES) (Su- por® 200, Supor® 450, Supor® MachV (Pall-Gelman, Port Washington, NY), Millipore Express

PLUS® (Millipore)), polissulfona (HT Tuffryn®), éster de celulose misturado (GN Metricel®), PVDF (Nylaflo® FP Verticel), policarbonato (Nuclepore), materiais de filtro de profundidade selecionado do grupo que consiste no tipo GF/F, GF/C e GMF150 (fibra de vidro, Whatman), Metrigard® (fibra de vidro, Pall-Gelman), AP15 (fibra de vidro, Millipore), bem como uma va- riedade de celulose, poliéster, polipropileno ou outros filtros de particulado e de fibra, ou uma combinação dos mesmos.

10. Montagem de transferência de amostra e filtração CARACTERIZADA pelo fa- to de que compreende: uma pluralidade de dispositivos de transferência de amostra e filtra- ção integrados conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 para o isola- mento e/ou acúmulo de uma pluralidade de amostras de teste e para a transferência simul- tânea da pluralidade de micro-organismos isolados e/ou acumulados para um recipiente, lâmina ou placa para analisar os ditos micro-organismos isolados ou acumulados.

11. Montagem de transferência de amostra e filtração, de acordo com a reivindi- cação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita montagem compreende adicionalmen- te: uma placa base e uma placa superior separada da dita placa base, em que opcio- nalmente é fornecida pelo menos uma haste de suporte, de preferência um par de hastes de suporte verticais localizado entre e que separa a dita placa superior da dita placa base; uma montagem de suporte que tem uma pluralidade de rodas para segurar uma pluralidade de tubos individuais, em que opcionalmente a dita montagem de suporte é su- portada através de um par de trilhos de base e um par correspondente de barras de guia de suporte; uma forquilha de eixo geométrico vertical, opcionalmente associada a um estágio vertical, operável para permitir que a dita forquilha de eixo geométrico vertical seja movida “para cima” e “para baixo”, opcionalmente ao longo do estágio vertical, para elevar e abaixar a dita placa superior e a dita pluralidade de dispositivos de transferência de amostra e filtra- ção integrados; e uma montagem de vácuo que compreende uma barra de alinhamento horizontal- mente orientada que contém uma pluralidade de orifícios ou reentrâncias para segurar uma pluralidade de dispositivos de transferência de amostra e filtração integrados removíveis conforme definido nas reivindicações 1 a 9 e uma tubulação de válvula que tem associada a isso uma pluralidade de válvulas e acessórios que suportam individualmente e se conectam aos ditos dispositivos de transferência de amostra e filtração integrados.

12. Método de isolamento e identificação de um micro-organismo de uma amos- tra de teste CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) obter a amostra de teste conhecida por conter ou que pode conter micro- organismos;

(b) lisar opcionalmente as células e/ou particulados sem micro-organismo na dita amostra de teste que produz uma amostra lisada. (c) isolar e acumular os ditos micro-organismos de outros componentes da dita amostra de teste ou da dita amostra lisada por filtração com o uso do dispositivo de transfe- rência de amostra e filtração integrado conforme definido em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9; (d) transferir a dita amostra de micro-organismo isolada para um recipiente ou lâmina apropriada para analisar e/ou interrogar a dita amostra de micro-organismo isolada e acumulada; (e) analisar a dita amostra isolada ou acumulada dos ditos micro-organismos pa- ra adquirir medições para a caracterização e/ou identificação do dito micro-organismo; e (f) caracterizar e/ou identificar os ditos micro-organismos na dita amostra isolada e acumulada com base nas medições adquiridas.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita etapa de análise (e) é selecionada do grupo que consiste em espectroscopia de fluorescência, espectroscopia de refletância difusa, espectroscopia de absorção e transmis- são, espectroscopia infravermelha, espectroscopia terahertz, espectroscopia Raman, espec- troscopia Raman intensificada por superfície, espectroscopia Raman espacialmente deslo- cada, espectroscopia Raman de ressonância e qualquer combinação das mesmas, de prefe- rência em que a dita etapa de análise (e) é por espectrometria de massa e em que a dita espectrometria de massa é selecionada do grupo que consiste em espectrometria de massa MALDI-TOF, espectrometria de massa de ionização por eletropulverização por dessorção (DESI), espectrometria de massa GC, espectrometria de massa LC, espectrometria de mas- sa de ionização por eletropulverização (ESI) e espectroscopia de Tubo de Fluxo de Íon Se- lecionado (SIFT).

14. Método, de acordo com a reivindicação 12 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita amostra é uma amostra clínica ou não clínica e em que quando a dita amostra é uma amostra clínica, então, de preferência em que a dita amostra clínica é selecionada do grupo que consiste em sangue, soro, plasma, frações de sangue, fluido de junta, urina, sê- men, saliva, fezes, fluido cerebrospinal, conteúdos gástricos, secreções vaginais, homoge- natos de tecido, aspirados de medula óssea, homogenatos ósseos, cuspe, aspirados, exsu- datos e produtos de rinsagem de exsudato, fluidos corporais, uma amostra de cultura de sangue e uma amostra de urina.