BR112013007699A2 - variante, polinucleotídeo isolado, célula hospedeira recombinante, métodos para produzir um variante, para degradar um material celulósico, para produzir um produto de fermentação, para fermentar um material celulósico, e, composição 5 enzimática, formulação do caldo completo ou composição de cultura de células - Google Patents

Abstract

VARIANTE, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODOS DE PRODUZIR UM VARIANTE, PARA OBTER UM VARIANTE, PARA DEGRADAR OU CONVERTER UM MATERIAL CELULÓSICO, PARA PRODUZIR UM PRODUTO DE FERMENTAÇÃO, DE FERMENTAR UM MATERIAL CELULÓSICO, PLANTA TRANSGÊNICA, PARTE DA PLANTA OU CÉLULA DE PLANTA TRANSFORMADA, COMPOSIÇÃO DETERGENTE, E, FORMULAÇÃO DO CALDO COMPLETO OU COMPOSIÇÃO DE CULTURA DE CÉLULAS. A presente invenção diz respeito aos variantes de polipeptídeo com melhor atividade celilolítica. A presente invenção também diz respeito aos polinucleotídeos que codificam os variantes; construtos de ácido nucléico, vetores, e células hospedeiras que compreendem os polinucleotídeos; e aos métodos de usar os variantes.

Description

“VARIANTE, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM VARIANTE, PARA DEGRADAR UM MATERIAL CELULÓSICO, PARA PRODUZIR UM PRODUTO DE FERMENTAÇÃO, PARA FERMENTAR UM 5 MATERIAL CELULÓSICO, E, COMPOSIÇÃO ENZIMÁTICA,

FORMULAÇÃO DO CALDO COMPLETO OU COMPOSIÇÃO DE CULTURA DE CÉLULAS” DECLARAÇÃO DOS DIREITOS PARA AS INVENÇÕES REALIZADAS EM PESQUISA E DESENVOLVIMENTO

PATROCINADAS PELO GOVERNO FEDERAL Esta invenção foi realizada com o auxílio do Governo no acordo de cooperação DE-FC36-08GO18080, concedida pelo Departamento de Energia. O Governo apresenta certos direitos nesta invenção.

REFERÊNCIA CRUZADA AO PEDIDO RELACIONADO Este pedido reivindica o benefício do pedido provisório U.S. número de série 61/388.527, depositado em 30 de setembro de 2010, que é aqui incorporado pela referência.

REFERÊNCIA A UMA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS Este pedido contém uma listagem de sequências na forma legível em computador, que é aqui incorporada pela referência.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito aos variantes de polipeptídeo com atividade intensificadora celulolítica, polinucleotídeos que codificam os variantes, métodos de produzir os variantes, e métodos de usar os variantes.

DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA A celulose é um polímero do açúcar simples glicose covalentente ligado por ligações do tipo beta-1,4. Muitos microrganismos produzem enzimas que hidrolisam beta-glicanas ligadas.

Estas enzimas incluem endoglucanases, celobioidrolases e beta-glicosidases.

As endoglucanases digerem o polímero de celulose em locais aleatórios, abrindo- 5 o para ataque por celobioidrolases.

As celobioidrolases liberam sequencialmente moléculas de celobiose a partir das extremidades do polímero de celulose.

A celobiose é um dímero ligado a 1,4-beta de glicose solúvel em água.

As beta-glicosidases hidrolisam celobiose em glicose.

A conversão de matérias-primas lignocelulíticas em etanol apresenta as vantagens da disponibilidade imediata de grandes quantidades de matéria prima, a vantagem de evitar queimar ou aterrar os materiais, e a limpeza do etanol combustível.

Madeira, resíduos agrícolas, culturas herbáceas e resíduos sólidos municipais são considerados matérias-primas para a produção de etanol.

Estes materiais consistem principalmente em celulose, hemicelulose, e lignina.

Uma vez que a lignocelulose é convertida em açúcares fermentáveis, por exemplo, glicose, os açúcares fermentáveis são facilmente fermentados por levedura em etanol.

WO 2005/074647, WO 2008/148131, WO 2011/035027 revelam polipeptídeos GH61 isolados com atividade intensificadora celulolítica e os polinucleotídeos destes a partir de Thielavia terrestris.

WO 2005/074656 e WO 2010/065830 revelam polipeptídeos GH61 isolados com atividade intensificadora celulolítica e os polinucleotídeos destes a partir de Thermoascus aurantiacus.

WO 2007/089290 revela um polipeptídeo GH61 isolado com atividade intensificadora celulolítica e o polinucleotídeo deste de Trichoderma reesei.

WO 2009/085935, WO 2009/085859, WO 2009/085864, e WO 2009/085868 revelam polipeptídeos GH61 isolados com atividade intensificadora celulolítica e os polinucleotídeos destes a partir de Myceliophthora thermophila.

WO 2010/138754 revela polipeptídeos GH61 isolados com atividade intensificadora celulolítica e os polinucleotídeos destes a partir de Aspergillus fumigatus.

WO 2011/005867 revela polipeptídeos GH61 isolados com atividade intensificadora celulolítica e os polinucleotídeos destes a partir de Penicillium pinophilum. WO 2011/039319 revela polipeptídeos GH61 isolados com atividade intensificadora celulolítica e os polinucleotídeos destes a partir de Thermoascus sp. WO 2011/041397 5 revela polipeptídeos GH61 isolados com atividade intensificadora celulolítica e os polinucleotídeos destes a partir de Penicillium sp. WO 2011/041504 revela polipeptídeos GH61 isolados com atividade intensificadora celulolítica e os polinucleotídeos destes a partir de Thermoascus crustaceous. WO 2008/151043 revela métodos de melhorar a atividade de um polipeptídeo GH61 com atividade intensificadora celulolítica, adicionando um cátion metálico divalente de ativação solúvel a uma composição que compreende o polipeptídeo. Pode ser vantajoso na técnica melhorar a capacidade dos polipeptídeos com atividade intensificadora celulolítica para melhora a degradação enzimática de matérias-primas lignocelulósicas. A presente invenção fornece variantes de um polipeptídeo que apresenta atividade intensificadora celulolítica com melhores propriedades.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito aos variantes isolados, compreendendo uma substituição em uma ou mais (por exemplo, várias) posições que correspondem às posições 75, 77, 179, 181 e 183 do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, em que os variantes apresentam atividade intensificadora celulolítica. A presente invenção também diz respeito aos polinucleotídeos isolados que codificam os variantes; construtos de ácido nucléico, vetores, e células hospedeiras que compreendem os polinucleotídeos; e aos métodos de produzir os variantes. A presente invenção também diz respeito aos métodos para degradar ou converter um material celulósico compreendendo: tratar o material celulósico com uma composição enzimática na presença de um variante como este com atividade intensificadora celulolítica. A presente invenção também diz respeito aos métodos para produzir um produto de fermentação compreendendo: (a) sacarificar um material celulósico com uma composição 5 enzimática na presença de um variante como este com atividade intensificadora celulolítica; (b) fermentar o material celulósico sacarificado com um ou mais (por exemplo, vários) microrganismos fermentadores para produzir o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação. A presente invenção também diz respeito aos métodos de fermentar um material celulósico compreendendo: fermentar o material celulósico com um ou mais (por exemplo, vários) microrganismos fermentadores, em que o material celulósico é sacarificado com uma composição enzimática na presença de um variante como este, com atividade intensificadora celulolítica.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DAS FIGURAS A figura 1 mostra a conversão de celulose inchada com ácido fosfórico (0,5 % de p/p) pela combinação de pirogalol e beta-glicosidase de A. fumigatus CEL3A; a combinação de pirogalol, polipeptídeo tipo selvagem GH61B de A. fumigatus e beta-glicosidase de A. fumigatus CEL3A; e a combinação de pirogalol, variante GH61B de A. fumigatus I75V + F77L + F179I + I181L + I183V e beta-glicosidase de A. fumigatus CEL3A. As figuras 2A e 2B mostram o efeito do polipeptídeo tipo selvagem GH61B de A. fumigatus e do variante GH61B de A. fumigatus I75V + F77L + F179I + I181L + I183V na conversão de palha de milho pré-tratada (PCS), pela combinação de uma composição de celulase de Trichoderma reesei e beta-glicosidase de A. fumigatus CEL3A tanto a 50 ºC quanto a 55 ºC.

As figuras 3A e 3B mostram o efeito do polipeptídeo tipo selvagem GH61B de A. fumigatus e do variante GH61B de A. fumigatus I75V + F77L + F179I + I181L + I183V na conversão de PCS, pela combinação de uma composição em temperatura elevada de celulase e beta-glicosidase de A. 5 fumigatus CEL3A a 50 ºC, 55 ºC, 60 ºC, ou 65 ºC.

As figuras 4A e 4B mostram a Td (temperatura de desnaturação) do polipeptídeo tipo selvagem GH61B de Aspergillus fumigatus e do variante GH61B I75V + F77L + F179I + I181L + I183V de Aspergillus fumigatus por calorimetria exploratória diferencial.

Definições Acetilxilano esterase: O termo “acetilxilano esterase” significa uma carboxilesterase (EC 3.1.1.72) que catalisa a hidrólise de grupos acetila a partir de xilana polimérica, xilose acetilada, glicose acetilada, acetato de alfa-naftila e acetato de p-nitrofenila.

Com propósitos da presente invenção, a atividade da acetilxilano esterase é determinada usando p- nitrofenilacetato 0,5 mM como substrato em acetato de sódio 50 mM pH 5,0, contendo 0,01 % de TWEEN™ 20 (monolaurato de polioxietileno e sorbitano). Uma unidade de acetilxilano esterase é definida como a quantidade de enzima capaz de liberar 1 µmol de ânion p-nitrofenolato por minuto em pH 5, 25 °C.

Variante alélico: O termo “variante alélico” significa qualquer de duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupa o mesmo locus cromossômico.

A variação alélica aumenta naturalmente por meio de mutação, e pode resultar em polimorfismo nas populações.

As mutações genéticas podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado,) ou podem codificar polipeptídeos com sequências de aminoácidos alteradas.

Um variante alélico de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por um variante alélico de um gene.

Alfa-L-arabinofuranosidase: O termo “alfa-L-

arabinofuranosidase” significa uma alfa-L-arabinofuranosídeo arabinofuranoidrolase (EC 3.2.1.55), que catalisa a hidrólise de resíduos de alfa-L-arabinofuranosídeo não redutores terminais em alfa-L-arabinosídeos.

A enzima age em alfa-L-arabinofuranosídeos, alfa-L-arabinanos contendo 5 ligações (1,3) e/ou (1,5), arabinoxilanos e arabinogalactanos.

A alfa-L- arabinofuranosidase também é conhecida como arabinosidase, alfa- arabinosidase, alfa-L-arabinosidase, alfa-arabinofuranosidase, polissacarídeo alfa-L-arabinofuranosidase, alfa-L-arabinofuranosídeo hidrolase, L- arabinosidase ou alfa-L-arabinanase.

Com propósitos da presente invenção, a atividade de alfa-L-arabinofuranosidase é determinada usando 5 mg de arabinoxilano de trigo com viscosidade média (Megazyme International Ireland, Ltd., Bray, Co.

Wicklow, Irlanda) por mL de acetato de sódio 100 mM pH 5, em um volume total de 200 µL por 30 minutos a 40 °C, seguido por análise de arabinose por cromatografia em coluna AMINEX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Alfa-glucuronidase: O termo “alfa-glucuronidase” significa uma alfa-D-glucosiduronato glucuronohidrolase (EC 3.2.1.139), que catalisa a hidrólise de uma alfa-D-glucuronoside em D-glucuronato e um álcool.

Com propósitos da presente invenção, a atividade de alfa-glucuronidase é determinada de acordo com de Vries, 1998, J.

Bacteriol. 180: 243-249. Uma unidade de alfa- glucuronidase é igual à quantidade de enzima capaz de liberar 1 µmol de ácido glucurônico ou 4-O-metilglucurônico por minuto em pH 5, 40 °C.

Beta-glicosidase: O termo “beta-glicosidase” significa uma beta-D-glicosídeo glicoidrolase (E.C. 3.2.1.21) que catalisa a hidrólise de resíduos de beta-D-glicose não redutores terminais, com a liberação de beta- D-glicose.

Com propósitos da presente invenção, a atividade de beta- glicosidase é determinada usando p-nitrofenil-beta-D-glicopiranosídeo como substrato, de acordo com o procedimento de Venturi et al., 2002, Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var.

coprophilum: production, purification and some biochemical properties, J.

Basic Microbiol. 42: 55-66. Uma unidade de beta-glicosidase é definida como 1,0 µmol de ânion p-nitrofenolato produzido por minuto a 25 °C, pH 4,8, a partir de p-nitrofenil-beta-D-glicopiranosídeo 1 mM como substrato em 5 citrato de sódio 50 mM contendo TWEEN® 20 a 0,01 %. Beta-xilosidase: O termo “beta-xilosidase” significa um beta- D-xilosídeo xiloidrolase (E.C. 3.2.1.37), que catalisa a exo-hidrólise de beta (1→4)-xilo-oligossacarídeos curtos, para remover sucessivos resíduos de D- xilose a partir das terminações não redutoras.

Com propósitos da presente invenção, uma unidade de beta-xilosidase é definida como 1,0 µmol de ânion p-nitrofenolato produzido por minuto a 40 °C, pH 5, a partir de p-nitrofenil- beta-D-xilosídeo 1 mM como substrato em citrato de sódio 100 mM contendo TWEEN® 20 a 0,01 %. DNAc: O termo "DNAc" significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa a partir de uma molécula de RNAm madura e unida, obtida de uma célula de eucarioto ou procarioto.

O DNAc não apresenta sequências intron que podem estar presentes no DNA genômico correspondente.

O transcrito de RNA inicial e primário é um precursor para o RNAm que é processado por meio de uma série de etapas, incluindo união, antes de aparecer como RNAm maduro e unido.

Celobioidrolase: O termo “celobioidrolase” significa uma 1,4- beta-D-glicano celobioidrolase (E.C. 3.2.1.91) que catalisa a hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, celo-oligossacarídeos, ou qualquer glicose ligada a beta-1,4 contendo polímero, que libera celobiose a partir das extremidades redutoras ou não redutoras da cadeia (Teeri, 1997, Crystalline cellulose degradation: New insight into the function of cellobiohydrolases, Trends in Biotechnology 15: 160-167; Teeri et al., 1998, Trichoderma reesei cellobiohydrolases: why so efficient on crystalline celullose?, Biochem.

Soc.

Trans. 26: 173-178). A atividade da celobioidrolase é determinada de acordo com os procedimentos descritos por Lever et al., 1972, Anal.

Biochem. 47: 273-279; van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Letters, 149: 152-156; van Tilbeurgh e Claeyssens, 1985, FEBS Letters, 187: 283- 288; e Tomme et al., 1988, Eur.

J.

Biochem. 170: 575-581. Na presente 5 invenção, o método de Tomme et al. pode ser usado para determinar a atividade da celobioidrolase.

Material celulósico: O termo “material celulósico” significa qualquer material contendo celulose.

O polissacarídeo predominante na parede celular primária da biomassa é a celulose, o segundo mais abundante é a hemicelulose, e o terceiro é a pectina.

A parede celular secundária, produzida após a célula parar de crescer, também contém polissacarídeos e é reforçado por lignina polimérica covalentemente reticulada à hemicelulose.

A celulose é um homopolímero de anidrocelobiose e é, assim, um beta-(1-4)-D- glicano linear, enquanto as hemiceluloses incluem um variedade de compostos, tais como xilanos, xiloglicanos, arabinoxilanos, e mananas em estruturas ramificadas complexas com um espectro de substituintes.

Embora seja em geral polimorfa, a celulose é encontrada em tecido vegetal principalmente como uma matriz cristalina insolúvel de cadeias paralelas de glicano.

As hemiceluloses em geral ligam o hidrogênio à celulose, bem como a outras hemiceluloses, que ajudam a estabilizar a matriz da parede celular.

A celulose é encontrada geralmente, por exemplo, nos caules, folhas, sépalas, cascas e sabugos de plantas ou folhas, ramos e madeira de árvores.

O material celulósico pode ser, mas sem limitação, resíduo agrícola, material herbáceo (incluindo cultivos destinados à produção de energia), resíduo sólido municipal, resíduo de polpa e papel moído, resíduo de papel e madeira (incluindo resíduo florestal) (ver, por exemplo, Wiselogel et al., 1995, em Handbook on Bioethanol (Charles E.

Wyman, editor), pp.105-118, Taylor & Francis, Washington D.C.; Wyman, 1994, Bioresource Technology 50: 3-16; Lynd, 1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25: 695-

719; Mosier et al., 1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, em Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T.

Scheper, editor executivo, Volume 65, pp.23-40, Springer-Verlag, Nova Iorque). Entende-se aqui que a celulose pode estar na forma de lignocelulose, 5 um material de parede celular vegetal contendo lignina, celulose e hemicelulose em uma matriz mista.

Em um aspecto preferido, o material celulósico é qualquer material da biomassa.

Em um outro aspecto preferido, o material celulósico é lignocelulose, que compreende celulose, hemiceluloses e lignina.

Em um aspecto, o material celulósico é resíduo agrícola.

Em um outro aspecto, o material celulósico é material herbáceo (incluindo cultivos destinados à produção de energia). Em um outro aspecto, o material celulósico é resíduo sólido municipal.

Em um outro aspecto, o material celulósico é resíduo de polpa e papel moído.

Em um outro aspecto, o material celulósico é resíduo de papel.

Em um outro aspecto, o material celulósico é madeira (incluindo resíduo florestal). Em um outro aspecto, o material celulósico é Arundo.

Em um outro aspecto, o material celulósico é bagaço.

Em um outro aspecto, o material celulósico é bambu.

Em um outro aspecto, o material celulósico é espiga de milho.

Em um outro aspecto, o material celulósico é fibra de milho.

Em um outro aspecto, o material celulósico é palha de milho.

Em um outro aspecto, o material celulósico é Miscanthus.

Em um outro aspecto, o material celulósico é casca de laranja.

Em um outro aspecto, o material celulósico é palha de arroz.

Em um outro aspecto, o material celulósico é painço amarelo.

Em um outro aspecto, o material celulósico é palha de trigo.

Em um outro aspecto, o material celulósico é álamo tremedor.

Em um outro aspecto, o material celulósico é eucalipto.

Em um outro aspecto, o material celulósico é pinheiro.

Em um outro aspecto, o material celulósico é pinho.

Em um outro aspecto, o material celulósico é álamo.

Em um outro aspecto, o material celulósico é abeto. Em um outro aspecto, o material celulósico é salgueiro. Em um outro aspecto, o material celulósico é celulose de algas. Em um outro aspecto, o material celulósico é celulose bacteriana. Em 5 um outro aspecto, o material celulósico é línter de algodão. Em um outro aspecto, o material celulósico é papel de filtro. Em um outro aspecto, o material celulósico é celulose microcristalina. Em um outro aspecto, o material celulósico é celulose tratada com ácido fosfórico. Em um outro aspecto, o material celulósico é uma biomassa aquática. Da maneira aqui usada o termo "biomassa aquática" significa biomassa produzida em um ambiente aquático por um processo de fotossíntese. A biomassa aquática pode ser de algas, plantas emergentes, plantas de folha flutuante, ou plantas submersas. O material celulósico pode ser usado como é, ou pode ser submetido ao pré-tratamento usando métodos convencionais conhecidos na técnica, da maneira aqui descrita. Em um aspecto preferido, o material celulósico é pré-tratado. Enzima celulolítica ou celulase: O termo “enzima celulolítica” ou “celulase” significa uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas que hidrolisam um material celulósico. Tais enzimas incluem endoglucanase(s), celobioidrolase(s), beta-glicosidase(s), ou combinações destas. As duas abordagens básicas para avaliar a atividade celulolítica incluem: (1) medir a atividade celulolítica total, e (2) medir o individual atividades celulolíticas (endoglucanases, celobioidrolases e beta-glicosidases) da maneira revisada em Zhang et al., Outlook for celullase improvement: Screening and selection strategies, 2006, Biotechnology Advances 24: 452-

481. A atividade celulolítica total é avaliada em geral usando substratos insolúveis, incluindo papel de filtro Whatman №1, celulose microcristalina, celulose bacteriana, celulose de algas, algodão, lignocelulose pré-tratada, etc.

O ensaio de atividade celulolítica total mais comum é o ensaio com papel de filtro usando papel de filtro Whatman №1 como o substrato.

O ensaio foi estabelecido pela União Internacional de Química Pura e Aplicada (IUPAC) (Ghose, 1987, Measurement of celullase activities, Pure Appl.

Chem. 59: 257- 5 68). Com propósitos da presente invenção, a atividade da enzima celulolítica é determinada medindo o aumento na hidrólise de um material celulósico por enzima(s) celulolítica(s) nas condições a seguir: 1-50 mg de proteína enzimática celulolítica/g de celulose em PCS (ou outro material celulósico pré-tratado) por 3-7 dias em uma temperatura adequada, por exemplo, 50 ºC, 55 ºC, ou 60 ºC, comparado a uma hidrólise controle sem a adição de proteína enzimática celulolítica.

As condições típicas são reações de 1 mL, PCS lavada ou não lavada, sólidos insolúveis a 5 %, acetato de sódio 50 mM pH 5, MnSO4 1 mM, 50 ºC, 55 ºC, ou 60 ºC, 72 horas, análise de açúcar por coluna AMINEX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Sequência codificante: O termo “sequência codificante” significa um polinucleotídeo, que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de um variante.

As extremidades da sequência codificante são em geral determinadas por um quadro aberto de leitura, que começa com um códon inicial tal como ATG, GTG ou TTG e termina com um códon de parada tal como TAA, TAG, ou TGA.

A sequência codificante pode ser um DNA genômico, DNAc, DNA sintético, ou uma combinação destes.

Sequências controle: O termo “sequências controle” significa sequências de ácidos nucléicos necessárias para a expressão de um polinucleotídeo que codifica um variante da presente invenção.

Cada sequência controle pode ser natural (isto é, do mesmo gene) ou estrangeira (isto é, de um gene diferente) ao polinucleotídeo que codifica o variante, ou natural ou estrangeira uma a outra.

Tais sequências controle incluem, mas sem limitação, uma sequência principal, sequência de poliadenilação, sequência de pró-peptídeo, promotor, sequência de peptídeo sinal e finalizador de transcrição.

No mínimo, as sequências controle incluem um promotor e sinais de parada transcricionais e translacionais.

As sequências 5 controle podem ser fornecidas com ligadores, com o propósito de introduzir sítios de restrição específicos que facilitam a ligação das sequências controle com a região codificante do polinucleotídeo que codifica um variante.

Endoglucanase: O termo “endoglucanase” significa uma endo-1,4-(1,3;1,4)-beta-D-glicano 4-glicanoidrolase (E.C. 3.2.1.4) que catalisa a endo-hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, derivados de celulose (tais como carboximetil celulose e hidroxietil celulose), liquenina, ligações beta-1,4 em beta-1,3 glicanos mistos tais como beta-D- glicanos ou xiloglicanos de cereal, e outro material vegetal contendo componentes celulósicos.

A atividade de endoglucanase pode ser determinada medindo a redução na viscosidade do substrato, ou o aumento nas extremidades redutoras determinadas por um ensaio de açúcar redutor (Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481). Com propósitos da presente invenção, a atividade de endoglucanase é determinada usando carboximetil celulose (CMC) como substrato, de acordo com o procedimento de Ghose, 1987, Pure e Appl.

Chem. 59: 257-268, em pH 5, 40 ºC.

Expressão: O termo “expressão” inclui qualquer etapa envolvida na produção de um variante incluindo, mas sem limitação, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós- translacional e secreção.

Vetor de expressão: O termo “vetor de expressão” significa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo que codifica um variante, e é operavelmente ligado às sequências controle que fornecem sua expressão.

Família glicosídeo hidrolase 61: O termo “Família glicosídeo hidrolase 61” ou “Família GH61” ou “GH61” significa um polipeptídeo que pertence à família glicosídeo hidrolase 61 de acordo com Henrissat B., 1991, A classification of glycosyl hidrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem.

J. 280: 309-316, e Henrissat B., e Bairoch A., 1996, 5 Updating the sequence-based classification of glycosyl hidrolases, Biochem.

J. 316: 695-696. As enzimas nesta família foram originalmente classificadas como uma família de glicosídeo hidrolase, com base na medição da atividade muito fraca de endo-1,4-beta-D-glicanoase em um elemento da família.

A estrutura e modo de ação destas enzimas são não canônicas e não podem ser consideradas como glicosidases autênticas.

Entretanto, são mantidas na classificação CAZy, com base em sua capacidade de melhorar a ruptura de lignocelulose quando usadas junto com uma celulase ou uma mistura de celulases.

Feruloil esterase: O termo “feruloil esterase” significa uma hidrólise do açúcar 4-hidróxi-3-metoxicinamoil (EC 3.1.1.73) que catalisa a hidrólise dos grupos 4-hidróxi-3-metoxicinamoil (feruloil) a partir do açúcar esterificado, que é em geral arabinose em substratos de biomassa natural, para produzir ferulato (4-hidróxi-3-metoxicinamato). A feruloil esterase também é conhecida como ácido ferílico esterase, hidroxicinamoil esterase, FAE-III, cinamoil éster hidrolase, FAEA, cinnAE, FAE-I, ou FAE-II.

Com propósitos da presente invenção, a atividade de feruloil esterase é determinada usando p- nitrofenilferulato 0,5 mM como substrato em acetato de sódio 50 mM, pH 5,0. Uma unidade de feruloil esterase equivale à quantidade de enzima capaz de liberar 1 µmol de ânion p-nitrofenolato por minuto em pH 5, 25 °C.

Fragmento: O termo “fragmento” significa um polipeptídeo com um ou mais (por exemplo, vários) aminoácidos ausentes na terminação amino e/ou carboxil de um polipeptídeo maduro; em que o fragmento apresenta atividade intensificadora celulolítica.

Em um aspecto, um fragmento contém pelo menos 200 resíduos de aminoácido, por exemplo, pelo menos

210 resíduos de aminoácido ou pelo menos 220 resíduos de aminoácido do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Enzima hemicelulolítica ou hemicelulase: O termo “enzima hemicelulolítica” ou “hemicelulase” significa uma ou mais (por exemplo, 5 várias) enzimas que hidrolisam um material hemicelulósico.

Ver, por exemplo, Shallom, D. e Shoham, Y.

Microbial hemicelullases.

Current Opinion in Microbiology, 2003, 6(3): 219-228). As hemicelulases são componentes chave na degradação de biomassa vegetal.

Exemplos de hemicelulases incluem, mas sem limitação, um acetilmanana esterase, uma acetilxilano esterase, uma arabinanase, uma arabinofuranosidase, uma ácido coumárico esterase, uma feruloil esterase, uma galactosidase, uma glicuronidase, uma glicuronoil esterase, uma mananase, uma manosidase, uma xilanase e uma xilosidase.

Os substratos destas enzimas, as hemiceluloses, são um grupo heterogêneo de polissacarídeos ramificados e lineares que são ligados por meio de ligações de hidrogênio às microfibrilas de celulose na parede celular vegetal, reticulando-os em uma rede forte.

As hemiceluloses também são covalentemente anexadas à lignina, formando junto com a celulose uma estrutura muito complexa.

A estrutura variável e a organização de hemiceluloses exigem a ação combinada de muitas enzimas para sua degradação completa.

Os módulos catalíticos de hemicelulases são tanto as glicosídeo hidrolases (GHs), que hidrolisam ligações glicosídicas, quanto carboidrato esterases (CEs), que hidrolisam ligações éster de acetato ou grupos laterais de ácido ferúlico.

Estes modos catalíticos, com base na homologia de sua sequência primária, podem ser determinados nas famílias GH e CE.

Algumas famílias, com um dobramento completo similar, podem ser agrupadas adicionalmente em clãs, marcados alfabeticamente (por exemplo, GH-A). Uma classificação mais informativa e a classificação atualizada destas e outras enzimas ativas no carboidrato são disponíveis na base de dados Carbohydrate-Active Enzymes (CAZy). As atividades da enzima hemicelulolítica podem ser avaliadas de acordo com Ghose e Bisaria, 1987, Pure & AppI.

Chem. 59: 1739-1752, em uma temperatura adequada, por exemplo, 50 ºC, 55 ºC, ou 60 ºC, e em pH, por exemplo, 5,0 ou 5,5. Condições de severidade alta: O termo “condições de 5 severidade alta” significa sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42 °C em SSPE 5X, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA desnaturado e cisalhado de esperma de salmão, e formamida a 50 %, seguindo procedimentos padrões de Southern blotting por 12 a 24 horas.

O material carreador é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2 % a 65 °C.

Célula hospedeira: O termo "célula hospedeira" significa qualquer tipo de célula que é susceptível à transformação, transfecção, transdução, ou similar com um construto de ácido nucléico ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção.

O termo “célula hospedeira” inclui qualquer progênie de uma célula parental que não é idêntica à célula parental em virtude das mutações que ocorrem durante a replicação.

Maior atividade térmica: O termo “maior atividade térmica” significa um perfil de atividade dependente da temperatura maior ou mais amplo de um variante, comparado ao perfil de atividade dependente da temperatura do parental.

A maior atividade térmica do variante melhora a catálise de uma reação em uma ou mais (por exemplo, várias) temperaturas específicas relacionadas ao parental.

Um variante mais termo ativo levará a uma diminuição no tempo exigida, e/ou uma diminuição na concentração enzimática exigida para catalisação da reação.

A maior atividade térmica do variante em relação ao parental pode ser avaliada, por exemplo, em condições de uma ou mais (por exemplo, várias) temperaturas.

Por exemplo, a uma ou mais (por exemplo, várias) temperaturas podem ser qualquer temperatura na faixa de 25 ºC a 95 ºC, por exemplo, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75,

80, 85, 90, ou 95 ºC (ou intermediárias) em um pH na faixa de 3 a 8, por exemplo, 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 ou 8,0 (ou intermediários). Em um aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao 5 parental é determinada em pH 3,0 e 40 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 3,0 e 45 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 3,0 e 50 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 3,0 e 55 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 3,0 e 60 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 3,0 e 65 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 3,0 e 70 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 3,0 e 75 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 3,0 e 80 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 3,0 e 85 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 3,0 e 90 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 3,5 e 40 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 3,5 e 45 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 3,5 e 50 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 3,5 e 55 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 3,5 e 60 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 3,5 e 65 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 3,5 e 70 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 3,5 e 75 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é 5 determinada em pH 3,5 e 80 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 3,5 e 85 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 3,5 e 90 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,0 e 40 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,0 e 45 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,0 e 50 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,0 e 55 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,0 e 60 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,0 e 65 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,0 e 70 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,0 e 75 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,0 e 80 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,0 e 85 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,0 e 90 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,5 e 40 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,5 e 45 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,5 e 50 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,5 e 55 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,5 e 60 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do 5 variante em relação ao parental é determinada em pH 4,5 e 65 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,5 e 70 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,5 e 75 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,5 e 80 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,5 e 85 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,5 e 90 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,0 e 40 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,0 e 45 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,0 e 50 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,0 e 55 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,0 e 60 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,0 e 65 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,0 e 70 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,0 e 75 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,0 e 80 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,0 e 85 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,0 e 90 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,5 e 40 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,5 5 e 45 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,5 e 50 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,5 e 55 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,5 e 60 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,5 e 65 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,5 e 70 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,5 e 75 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,5 e 80 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,5 e 85 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,5 e 90 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,0 e 40 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,0 e 45 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,0 e 50 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,0 e 55 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,0 e 60 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,0 e 65 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,0 e 70 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,0 e 75 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,0 e 80 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,0 e 85 ºC.

Em um 5 outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,0 e 90 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,5 e 40 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,5 e 45 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,5 e 50 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,5 e 55 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,5 e 60 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,5 e 65 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,5 e 70 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,5 e 75 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,5 e 80 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,5 e 85 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,5 e 90 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,0 e 40 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,0 e 45 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,0 e 50 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,0 e 55 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,0 e 60 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,0 e 65 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é 5 determinada em pH 7,0 e 70 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,0 e 75 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,0 e 80 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,0 e 85 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,0 e 90 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,5 e 40 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,5 e 45 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,5 e 50 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,5 e 55 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,5 e 60 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,5 e 65 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,5 e 70 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,5 e 75 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,5 e 80 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,5 e 85 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,5 e 90 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 8,0 e 40 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 8,0 e 45 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 8,0 e 50 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade 5 térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 8,0 e 55 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 8,0 e 60 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 8,0 e 65 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 8,0 e 70 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 8,0 e 75 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 8,0 e 80 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 8,0 e 85 ºC.

Em um outro aspecto, a atividade térmica do variante em relação ao parental é determinada em pH 8,0 e 90 ºC.

A maior atividade térmica do variante em relação ao parental pode ser determinada usando qualquer ensaio enzimático conhecido na técnica para polipeptídeos GH61 com atividade intensificadora celulolítica.

Ver, por exemplo, WO 2005/074647, WO 2008/148131 WO 2005/074656, WO 2010/065830, WO 2007/089290, WO 2009/085935, WO 2009/085859, WO 2009/085864, WO 2009/085868 e WO 2008/151043, que são aqui incorporados pela referência.

Alternativamente, a maior atividade térmica do variante em relação ao parental pode ser determinada usando qualquer ensaio de aplicação para o variante, onde o desempenho do variante é comparado ao parental.

Por exemplo, o ensaio de aplicação descrito no exemplo 12 ou 14 pode ser usado.

Em um aspecto, a atividade térmica do variante é pelo menos 1,01 vez, por exemplo, pelo menos 1,05 vez, pelo menos 1,1 vez, pelo menos

1,5 vez, pelo menos 1,8 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 15 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 25 vezes, e pelo menos 50 vezes amis termicamente ativa do que o parental.

Um variante com maior atividade térmica pode ou não 5 desempenhar melhor termoestabilidade em relação ao parental.

Por exemplo, um variante pode apresentar uma maior atividade térmica em relação ao parental, mas não apresentar melhor termoestabilidade.

Melhor termoestabilidade: O termo “melhor termoestabilidade” significa uma maior retenção da atividade intensificadora celulolítica de um variante, após um período de incubação em uma temperatura em relação ao parental.

A melhor termoestabilidade do variante em relação ao parental pode ser avaliada, por exemplo, em condições de uma ou mais (por exemplo, várias) temperaturas.

Por exemplo, a uma ou mais (por exemplo, várias) temperaturas podem ser qualquer temperatura na faixa de 45 ºC a 95 ºC, por exemplo, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, ou 95 ºC (ou intermediárias) em um pH na faixa de 3 a 8, por exemplo, 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 ou 8,0, (ou intermediários) por um período de incubação adequado, por exemplo, 1 minuto, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, ou 60 minutos, de maneira tal que o variante mantenha atividade residual.

Em um aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 3,0 e 50 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 3,0 e 55 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 3,0 e 60 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 3,0 e 65 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 3,0 e 70 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH

3,0 e 75 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 3,0 e 80 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 3,0 e 85 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação 5 ao parental é determinada em pH 3,0 e 90 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 3,5 e 50 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 3,5 e 55 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 3,5 e 60 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 3,5 e 65 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 3,5 e 70 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 3,5 e 75 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 3,5 e 80 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 3,5 e 85 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 3,5 e 90 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,0 e 50 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,0 e 55 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,0 e 60 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,0 e 65 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,0 e 70 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,0 e 75 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,0 e 80 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,0 e 85 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,0 e 90 ºC. 5 Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,5 e 50 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,5 e 55 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,5 e 60 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,5 e 65 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,5 e 70 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,5 e 75 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,5 e 80 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,5 e 85 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 4,5 e 90 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,0 e 50 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,0 e 55 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,0 e 60 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,0 e 65 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,0 e 70 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,0 e 75 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,0 e 80 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,0 e 85 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,0 e 90 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em 5 relação ao parental é determinada em pH 5,5 e 50 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,5 e 55 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,5 e 60 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,5 e 65 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,5 e 70 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,5 e 75 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,5 e 80 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,5 e 85 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 5,5 e 90 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,0 e 50 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,0 e 55 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,0 e 60 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,0 e 65 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,0 e 70 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,0 e 75 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,0 e 80 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH

6,0 e 85 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,0 e 90 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,5 e 50 ºC.

Em um outro aspecto, a 5 termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,5 e 55 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,5 e 60 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,5 e 65 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,5 e 70 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,5 e 75 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,5 e 80 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,5 e 85 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 6,5 e 90 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,0 e 50 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,0 e 55 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,0 e 60 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,0 e 65 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,0 e 70 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,0 e 75 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,0 e 80 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,0 e 85 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,0 e 90 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,5 e 50 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 5 7,5 e 55 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,5 e 60 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,5 e 65 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,5 e 70 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,5 e 75 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,5 e 80 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,5 e 85 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 7,5 e 90 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 8,0 e 50 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 8,0 e 55 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 8,0 e 60 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 8,0 e 65 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 8,0 e 70 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 8,0 e 75 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 8,0 e 80 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 8,0 e 85 ºC.

Em um outro aspecto, a termoestabilidade do variante em relação ao parental é determinada em pH 8,0 e 90 ºC.

Em cada um dos aspectos anteriores, a termoestabilidade do variante em relação ao parental pode ser determinada incubando o variante e parental por 1 minuto.

Em cada um dos aspectos anteriores, a termoestabilidade do variante em relação ao parental pode ser determinada incubando o variante e parental por 5 minutos.

Em cada um dos aspectos 5 anteriores, a termoestabilidade do variante em relação ao parental pode ser determinada incubando o variante e parental por 10 minutos.

Em cada um dos aspectos anteriores, a termoestabilidade do variante em relação ao parental pode ser determinada incubando o variante e parental por 15 minutos.

Em cada um dos aspectos anteriores, a termoestabilidade do variante em relação ao parental pode ser determinada incubando o variante e parental por 30 minutos.

Em cada um dos aspectos anteriores, a termoestabilidade do variante em relação ao parental pode ser determinada incubando o variante e parental por 45 minutos.

Em cada um dos aspectos anteriores, a termoestabilidade do variante em relação ao parental pode ser determinada incubando o variante e parental por 60 minutos.

A melhor termoestabilidade do variante em relação ao parental pode ser determinada por calorimetria exploratória diferencial (DSC), usando métodos padrões na técnica (ver, por exemplo, Sturtevant, 1987, Annual Review of Physical Chemistry 38: 463-488). A melhor termoestabilidade do variante em relação ao parental também pode ser determinada, usando qualquer ensaio enzimático conhecido na técnica para polipeptídeos GH61 com atividade intensificadora celulolítica.

Ver, por exemplo, WO 2005/074647, WO 2008/148131 WO 2005/074656, WO 2010/065830, WO 2007/089290, WO 2009/085935, WO 2009/085859, WO 2009/085864, WO 2009/085868 e WO 2008/151043, que são aqui incorporados pela referência.

Alternativamente, a melhor termoestabilidade do variante em relação ao parental pode ser determinada usando qualquer ensaio de aplicação para o variante onde o desempenho do variante é comparado ao parental.

Por exemplo, o ensaio de aplicação descrito no exemplo 12 ou 14 pode ser usado.

Em um aspecto, a termoestabilidade do variante com atividade intensificadora celulolítica é pelo menos 1,01 vez, por exemplo, pelo menos 1,05 vez, pelo menos 1,1 vez, pelo menos 1,5 vez, pelo menos 1,8 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 15 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 25 vezes, e pelo menos 50 vezes 5 mais termoestável que o parental.

Um variante com melhor termoestabilidade pode ou não desempenhar maior atividade térmica em relação ao parental.

Por exemplo, um variante pode apresentar uma maior capacidade de se redobrar após incubação em uma temperatura elevada em relação ao parental, mas não apresenta maior atividade térmica.

Isolado: O termo “isolado” significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza.

Exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância de ocorrência não natural, (2) qualquer substância incluindo, mas sem limitação, qualquer enzima, variante, ácido nucléico, proteína, peptídeo ou cofator que é pelo menos parcialmente removido de um ou mais, ou todos, os constituintes de ocorrência natural com os quais está associado na natureza; (3) qualquer substância modificada por manipulação humana relacionada àquela substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada pelo aumento da quantidade da substância relacionada a outros componentes com os quais está naturalmente associada (por exemplo, cópias múltiplas de um gene que codifica a substância; uso de um promotor mais forte que o promotor naturalmente associado ao gene que codifica a substância). Uma substância isolada pode estar presente em uma amostra de caldo de fermentação.

Condições de severidade baixa: O termo “condições de severidade baixa” significa sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42 °C em SSPE 5X, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA desnaturado e cisalhado de esperma de salmão, e formamida a 25 %, seguindo procedimentos padrões de Southern blotting por 12 a 24 horas.

O material carreador é finalmente lavado três vezes cada, por 15 minutos, usando SSC 2X, SDS a 0,2 % a 50 °C.

Polipeptídeo maduro: O termo “polipeptídeo maduro” significa um polipeptídeo em sua forma final após a tradução e qualquer das modificações pós-translacionais, tal como processamento N-terminal, 5 truncação C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc.

Em um aspecto, o polipeptídeo maduro apresenta aminoácidos 1 a 229 de SEQ ID NO: 2, com base no programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6) que prevê que os aminoácidos -1 a -21 de SEQ ID NO: 2 são um peptídeo sinal.

É conhecido na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeos maduros diferentes (isto é, com um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente), expressos pelo mesmo polinucleotídeo.

Sequência codificante de polipeptídeo maduro: O termo “sequência codificante de polipeptídeo maduro” significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro com atividade intensificadora celulolítica.

Em um aspecto, a sequência codificante de polipeptídeo maduro apresenta nucleotídeos 64 a 859 de SEQ ID NO: 1, com base no programa SignalP (Nielsen et al., 1997, supra) que prevê que os nucleotídeos 1 a 63 de SEQ ID NO: 1 codificam um peptídeo sinal.

Em um outro aspecto, a sequência codificante de polipeptídeo maduro é a sequência de DNAc contida em nucleotídeos 64 a 859 de SEQ ID NO: 1. Condições de severidade média: O termo “condições de severidade média” significa sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42 °C em SSPE 5X, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA desnaturado e cisalhado de esperma de salmão, e 35 % formamida, seguindo procedimentos padrões de Southern blotting por 12 a 24 horas.

O material carreador é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2 % a 55 °C.

Condições de severidade média-alta: O termo “condições de severidade média-alta” significa sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42 °C em SSPE 5X, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA desnaturado e cisalhado de esperma de salmão, e 35 % formamida, seguindo procedimentos padrões de Southern blotting por 12 a 24 horas.

O material carreador é finalmente lavado três vezes 5 cada por 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2 % a 60 °C.

Mutante: O termo “mutante” significa um polinucleotídeo que codifica um variante.

Construto de ácido nucléico: O termo "construto de ácido nucléico" significa uma molécula de ácido nucléico, tanto de fita simples quanto de fita dupla, que é isolada a partir de um gene de ocorrência natural, ou é modificada para conter segmentos de ácidos nucléicos de uma maneira que não poderia existir na natureza, ou que é sintética, que compreende uma ou mais sequências controle.

Operavelmente ligado: O termo “operavelmente ligado” significa uma configuração na qual uma sequência controle é colocada em uma posição apropriada com relação à sequência codificante de um polinucleotídeo, de maneira tal que a sequência controle direcione a expressão da sequência codificante.

Parental ou polipeptídeo parental com atividade intensificadora celulolítica: O termo “parental” ou “polipeptídeo parental com atividade intensificadora celulolítica” significa um polipeptídeo com atividade intensificadora celulolítica, no qual uma alteração é realizada para produzir os variantes da presente invenção.

O parental pode ser um polipeptídeo de ocorrência natural (tipo selvagem) ou um variante deste, ou um fragmento deste.

Polipeptídeo com atividade intensificadora celulolítica: O termo “polipeptídeo com atividade intensificadora celulolítica” significa um polipeptídeo GH61 que catalisa a melhoria da hidrólise de um material celulósico por enzima com atividade celulolítica.

Com propósitos da presente invenção, a atividade intensificadora celulolítica é determinada medindo o aumento em açúcares redutores, ou o aumento do total de celobiose e glicose a partir da hidrólise de um material celulósico por enzima celulolítica nas condições a seguir: 1-50 mg de proteína total/g de celulose em PCS, em que a 5 proteína total é compreendida de 50-99,5 % de p/p de proteína enzimática celulolítica e 0,5-50 % de p/p de proteína de um polipeptídeo com atividade intensificadora celulolítica por 1-7 dias em uma temperatura adequada, por exemplo, 50 ºC, 55 ºC, ou 60 ºC e pH, por exemplo, 5,0 ou 5,5, comparado a uma hidrólise controle com carga de proteína total sem atividade intensificadora celulolítica igual (1-50 mg de proteína celulolítica/g de celulose em PCS). Em um aspecto preferido, uma mistura de CELLUCLAST 1,5 L (Novozymes A/S, Bagsværd, Dinamarca), na presença de 2-3 % de peso total de proteína beta-glicosidase de Aspergillus oryzae (recombinantemente produzida em Aspergillus oryzae de acordo com WO 02/095014), ou 2-3 % de peso total de proteína beta-glicosidase de Aspergillus fumigatus (recombinantemente produzida em Aspergillus oryzae da maneira descrita em WO 2002/095014), da carga proteica de celulase é usada como a fonte da atividade celulolítica.

Os polipeptídeos GH61 com atividade intensificadora celulolítica melhoram a hidrólise de um material celulósico, catalisado por enzima com atividade celulolítica, reduzindo a quantidade de enzima celulolítica exigida para atingir o mesmo grau de hidrólise, preferivelmente pelo menos 1,01 vez, por exemplo, pelo menos 1,05 vez, pelo menos 1,10 vez, pelo menos 1,25 vez, pelo menos 1,5 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 20 vezes.

Palha de milho pré-tratada: O termo “PCS” ou “Palha de milho pré-tratada” significa um material celulósico derivado de palha de milho r tratamento com calor e ácido sulfúrico diluído, pré-tratamento alcalino ou pré-tratamento neutro.

Identidade de sequência: a relação entre duas sequências de aminoácido ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro “identidade de sequência”. 5 Com propósitos da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de aminoácido é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J.

Mol.

Biol. 48: 443-453), da maneira implementada no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferivelmente versão 3.0.0, 5.0.0 ou superior.

Os parâmetros usados são penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (EMBOSS versão de BLOSUM62). O rendimento de Needle marcado como “melhor identidade” (obtido usando a opção não resumida) é usada como a identidade percentual e é calculado da maneira a seguir: (Resíduos idênticos x 100)/(Tamanho de alinhamento – Número total de intervalos no alinhamento) Com propósitos da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de desoxirribonucleotídeo é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra), da maneira implementada no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferivelmente versão 3,0.0, 5,0.0 ou superior.

Os parâmetros usados são penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EDNAFULL (EMBOSS versão de NCBI NUC4.4). O rendimento de Needle marcado como “melhor identidade” (obtido usando a opção não resumida) é usada como a identidade percentual, e é calculado da maneira a seguir: (Desoxirribonucleotídeos idênticos x 100)/(Tamanho de alinhamento – Número total de intervalos no alinhamento) Subsequência: O termo “subsequência” significa um polinucleotídeo com um ou mais (por exemplo, vários) nucleotídeos ausentes a partir da extremidade 5' e/ou 3' de uma sequência codificante de 5 polipeptídeo maduro; em que a subsequência codifica um fragmento com atividade intensificadora celulolítica.

Em um aspecto, uma subsequência contém pelo menos 600 nucleotídeos, por exemplo, pelo menos 630 nucleotídeos ou pelo menos 660 nucleotídeos da sequência codificante de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1. Variante: O termo “variante” significa um polipeptídeo com atividade intensificadora celulolítica compreendendo uma alteração, isto é, uma substituição, inserção, e/ou eliminação, em uma ou mais (por exemplo, várias) posições.

Uma substituição significa alteração do aminoácido que ocupa uma posição por um aminoácido diferente; uma eliminação significa remoção do aminoácido que ocupa uma posição; e uma inserção significa adicionar um aminoácido adjacente e imediatamente após o aminoácido que ocupa uma posição.

Os variantes da presente invenção apresentam pelo menos 20 %, por exemplo, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, ou pelo menos 100 % da atividade intensificadora celulolítica do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Condições de severidade muito alta: O termo “condições de severidade muito alta” significa sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42 °C em SSPE 5X, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA desnaturado e cisalhado de esperma de salmão, e formamida a 50 %, seguindo procedimentos padrões de Southern blotting por 12 a 24 horas.

O material carreador é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2 % a 70 °C.

Condições de severidade muito baixa: O termo “condições de severidade muito baixa” significa sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42 °C em SSPE 5X, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA desnaturado e cisalhado de esperma de salmão, e formamida a 25 %, seguindo procedimentos padrões de Southern 5 blotting por 12 a 24 horas.

O material carreador é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2 % a 45 °C.

Material contendo xilano: O termo “material contendo xilano” significa qualquer material compreendendo um polissacarídeo de parede celular vegetal contendo uma parte principal de resíduos de xilose ligados a beta-(1-4). Os xilanos de plantas terrestres são heteropolímeros que possuem uma parte principal de beta-(1-4)-D-xilopiranose, que é ramificada por cadeias de carboidrato curto.

Eles compreendem ácido D-glucurônico ou seu 4-O-metil éter, L-arabinose, e/ou vários oligossacarídeos compostos de D- xilose, L-arabinose, D ou L-galactose, e D-glicose.

Os polissacarídeos do tipo xilano podem ser divididos em homoxilanos e heteroxilanos, que incluem glucuronoxilanos, (arabino)glucuronoxilanos, (glucurono)arabinoxilanos, arabinoxilanos e heteroxilanos complexos.

Ver, por exemplo, Ebringerova et al., 2005, Adv.

Polym.

Sci. 186: 1-67. Nos métodos da presente invenção, qualquer material contendo xilano pode ser usado.

Em um aspecto preferido, o material contendo xilano é lignocelulose.

Atividade que degrada o xilano ou atividade xilanolítica: O termo “atividade que degrada o xilano” ou “atividade xilanolítica” significa uma atividade biológica que hidrolisa material contendo xilano.

As duas abordagens básicas para avaliar a atividade xilanolítica incluem: (1) medir a atividade xilanolítica total, e (2) medir as atividades xilanolíticas individuais (por exemplo, endoxilanases, beta-xilosidases, arabinofuranosidases, alfa- glicuronidases, acetilxilano esterases, feruloil esterases, e alfa-glucuronil esterases). O progresso recente nos ensaios de enzimas xilanolíticas foi resumido em várias publicações, incluindo Biely e Puchard, Recent progress in the assays of xilanolytics enzymes, 2006, Journal of the Science of Food and Agriculture 86(11): 1636-1647; Spanikova e Biely, 2006, Glicuronoil esterase - Novel carbohydrate esterase produced by Schizophyllum commune, FEBS 5 Letters 580(19): 4597-4601; Herrmann, Vrsanska, Jurickova, Hirsch, Biely, e Kubicek, 1997, The beta-D-xylosidase of Trichoderma reesei is a multifunctional beta-D-xylan xylohydrolase, Biochemical Journal 321: 375-381. A atividade que degrada o xilano total pode ser avaliada determinando os açúcares redutores formados a partir de vários tipos de xilano incluindo, por exemplo, xilanos de espelta de aveia, madeira de faia e madeira de lariço, ou por determinação fotométrica de fragmentos de xilano corado liberados de vários xilanos covalentemente corados.

O ensaio de atividade xilanolítica total mais comum baseia-se na produção de açúcares redutores a partir de 4-O-metil glicuronoxilano polimérico maneira, descrito em Bailey, Biely, Poutanen, 1992, Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity, Journal of Biotechnology 23(3): 257-270. A atividade da xilanase também pode ser determinada com AZCL-arabinoxilano a 0,2 % como substrato em TRITON® X-100 (4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenil- polietileno glicol) a 0,01 %, e tampão de fosfato de sódio 200 mM pH 6 a 37 °C.

Uma unidade da atividade de xilanase é definida como 1,0 µmol de azurina produzida por minuto a 37 °C, pH 6, a partir de AZCL-arabinoxilano 0,2 % como substrato, em tampão de fosfato de sódio 200 mM pH 6. Com propósitos da presente invenção, a atividade que degrada o xilano é determinada medindo o aumento na hidrólise de xilano de vidoeiro (Sigma Chemical Co., Inc., St.

Louis, MO, USA) por enzima(s) que degrada(m) xilano nas condições típicas a seguir: reações de 1 mL, 5 mg/mL de substrato (sólidos totais), 5 mg de proteína xilanolítica/g de substrato, acetato de sódio 50 mM em pH 5, 50 °C, 24 horas, análise de açúcar usando o ensaio de hidrazida do ácido p-hidroxibenzóico (PHBAH) da maneira descrita por Lever, 1972, A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates, Anal. Biochem 47: 273-279. Xilanase: O termo “xilanase” significa uma 1,4-beta-D- xilano-xiloidrolase (E.C. 3.2.1,8) que catalisa a endo-hidrólise das ligações 5 1,4-beta-D-xilosídicas em xilanos. Com propósitos da presente invenção, a atividade de xilanase é determinada com AZCL-arabinoxilano a 0,2 % como substrato em TRITON® X-100 a 0,01 %, e tampão de fosfato de sódio 200 mM pH 6 a 37 °C. Uma unidade de atividade de xilanase é definida como 1,0 µmol de azurina produzida por minuto a 37 °C, pH 6, a partir de AZCL- arabinoxilano a 0,2 % como substrato em tampão de fosfato de sódio a 200 mM pH 6. Polipeptídeo tipo selvagem: O termo “polipeptídeo tipo selvagem” significa um polipeptídeo com atividade intensificadora celulolítica expressa por um microrganismo de ocorrência natural, tal como uma bactéria, levedura, ou fungo filamentoso encontrado na natureza.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito aos variantes isolados, compreendendo uma substituição em uma ou mais (por exemplo, várias) posições que correspondem às posições 75, 77, 179, 181 e 183 do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, em que os variantes apresentam atividade intensificadora celulolítica. Convenções para determinação de variantes Com propósitos da presente invenção, o polipeptídeo maduro revelado em SEQ ID NO: 2 é usado para determinar o resíduo de aminoácido correspondente em um outro polipeptídeo com atividade intensificadora celulolítica. A sequência de aminoácidos de um outro polipeptídeo com atividade intensificadora celulolítica é alinhada com o polipeptídeo maduro revelado em SEQ ID NO: 2 e, com base no alinhamento, o número da posição do aminoácido que corresponde a qualquer resíduo de aminoácido no polipeptídeo maduro revelado em SEQ ID NO: 2 é determinado usando o algoritmo de Needleman- Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J.

Mol.

Biol. 48: 443-453), da maneira implementada no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends 5 Genet. 16: 276-277), preferivelmente versão 5.0.0 ou superior.

Os parâmetros usados são penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (EMBOSS versão de BLOSUM62). A identificação do resíduo de aminoácido correspondente em um outro polipeptídeo com atividade intensificadora celulolítica pode ser determinado por um alinhamento de sequências múltiplas de polipeptídeos, usando vários programas de computador incluindo, mas sem limitação, MUSCLE (comparação de sequência múltipla por log-expectativa; versão 3.5 ou superior; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFFT (versão 6.857 ou superior; Katoh e Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh e Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh e Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899- 1900), e EMBOSS EMMA que empregam ClustalW (1,83 ou superior; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680), usando seus respectivos parâmetros padrões.

Quando o outro polipeptídeo divergir do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, de maneira tal que a comparação baseada na sequ~encia tradicional não consiga detectar sua relação (Lindahl e Elofsson, 2000, J.

Mol.

Biol. 295: 613-615), outros algoritmos de comparação de sequência aos pares pode ser usado.

A maior sensibilidade na pesquisa baseada em sequência pode ser atingida usando programas de pesquisa que utilizam representações probabilísticas de famílias de polipeptídeo (perfis) para pesquisar base de dados.

Por exemplo, o programa PSI-BLAST gera perfis por meio de um processo de pesquisa de base de dados iterativo, e é capaz de detectar homólogos remotos (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Uma sensibilidade ainda melhor pode ser atingida se a família ou superfamília do polipeptídeo tiver um ou mais representantes nas bases de dados de 5 estrutura proteica.

Os programas, tal como GenTHREADER (Jones, 1999, J.

Mol.

Biol. 287: 797-815; McGuffin e Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874- 881), utilizam informação a partir de uma variedade de fontes (PSI-BLAST, previsão de estrutura secundária, perfis de alinhamento estrutural e potenciais de resolução) como entrada em uma rede neural que prevê o dobramento estrutural para uma sequência em questão.

Similarmente, o método de Gough et al., 2000, J.

Mol.

Biol. 313: 903-919, pode ser usado para alinhar uma sequência de estrutura desconhecida com os modelos de superfamília presentes na base de dados SCOP.

Por sua vez, estes alinhamentos podem ser usados para gerar modelos de homologia para o polipeptídeo, e tais modelos podem ser avaliados com relação à precisão usando uma variedade de ferramentas desenvolvidas para este propósito.

Em relação às proteínas de estrutura conhecida, várias ferramentas e recursos são disponíveis para recuperar e gerar alinhamentos estruturais.

Por exemplo, as superfamílias de proteínas SCOP foram estruturalmente alinhadas, e estes alinhamentos são acessíveis e possíveis de baixar.

Duas ou mais estruturas de proteína podem ser alinhadas usando uma variedade de algoritmos, tal como a matriz de alinhamento de distância (Holm e Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) ou extensão combinatória (Shindyalov e Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), e a implementação destes algoritmos pode ser adicionalmente utilizada em bases de dados da estrutura em questão, com uma estrutura de interesse, a fim de descobrir possíveis homólogos estruturas (por exemplo, Holm e Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567). Na descrição dos variantes da presente invenção, a nomenclatura descrita a seguir é adaptada para facilitar a referência.

A abreviação do aminoácido com letra única, aceita pela IUPAC, ou com três letras é empregada.

Substituições.

Para uma substituição de aminoácido, a seguinte 5 nomenclatura é usada: Aminoácido original, posição, aminoácido substituído.

Dessa maneira, a substituição de treonina na posição 226 por alanina é determinada como “Thr226Ala” ou “T226A”. As mutações múltiplas são separadas por marcas de adição (“+”), por exemplo, “Gly205Arg + Ser411Phe” ou “G205R + S411F”, representando substituições nas posições 205 e 411 de glicina (G) por arginina (R) e serina (S) por fenilalanina (F), respectivamente.

Eliminações.

Para uma eliminação de aminoácido, a seguinte nomenclatura é usada: Aminoácido original, posição, *. Dessa maneira, a eliminação de glicina na posição 195 é determinada como “Gly195*” ou “G195*”. As eliminações múltiplas são separadas por marcas de adição (“+”), por exemplo, “Gly195* + Ser411*” ou “G195* + S411*”. Inserções.

Para uma inserção de aminoácido, a seguinte nomenclatura é usada: Aminoácido original, posição, aminoácido original, aminoácido inserido.

Dessa maneira, a inserção de lisina após a glicina na posição 195 é determinada “Gly195GlyLys” ou “G195GK”. Uma inserção de aminoácidos múltiplos é determinada [Aminoácido original, posição, aminoácido original, aminoácido inserido #1, aminoácido inserido #2; etc.]. Por exemplo, a inserção de lisina e alanina após a glicina na posição 195 é indicada como “Gly195GlyLysAla” ou “G195GKA”. Em tais casos, o(s) resíduo(s) de aminoácido inserido(s) é(são) numerado(s) pela adição de letras minúsculas no número da posição do resíduo de aminoácido, precedendo o(s) resíduo(s) de aminoácido inserido(s). No exemplo anterior, a sequência seria assim:

Parental: Variante: 195 195 195a 195b G G-K-A Alterações múltiplas.

Variantes compreendendo as alterações múltiplas são separados por marcas de adição (“+”), por exemplo, “Arg170Tyr+Gly195Glu” ou “R170Y+G195E”, representando uma 5 substituição de arginina e glicina nas posições 170 e 195 por tirosina e ácido glutâmico, respectivamente.

Alterações diferentes.

Onde as alterações diferentes podem ser introduzidas em uma posição, as alterações diferentes são separadas por uma vírgula, por exemplo, “Arg170Tyr,Glu” representa uma substituição de arginina na posição 170 por tirosina ou ácido glutâmico.

Assim, “Tyr167Gly,Ala + Arg170Gly,Ala” determina os seguintes variantes: “Tyr167Gly+Arg170Gly”, “Tyr167Gly+Arg170Ala”, “Tyr167Ala+Arg170Gly”, e “Tyr167Ala+Arg170Ala”. Variantes A presente invenção fornece variantes compreendendo uma substituição em uma ou mais (por exemplo, várias) posições que correspondem às posições 75, 77, 179, 181 e 183 do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, em que os variantes apresentam atividade intensificadora celulolítica.

Em uma modalidade, o variante apresenta identidade de sequência de pelo menos 60 %, por exemplo, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 81 %, pelo menos 82 %, pelo menos 83 %, pelo menos 84 %, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, mas menos de 100 %, com a sequência de aminoácidos do polipeptídeo parental com atividade intensificadora celulolítica.

Em uma outra modalidade, o variante apresenta pelo menos 60 %, por exemplo, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 80 %, pelo menos 81 %, pelo menos 82 %, pelo 5 menos 83 %, pelo menos 84 %, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, tal como pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, mas menos de 100 %, de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um aspecto, o número de substituições nos variantes da presente invenção é 1-5, tais como 1, 2, 3, 4, ou 5 substituições.

Em um outro aspecto, um variante compreende uma substituição em uma ou mais (por exemplo, várias) posições que correspondem às posições 75, 77, 179, 181 e 183. Em um outro aspecto, um variante compreende uma substituição em duas posições que correspondem a qualquer das posições 75, 77, 179, 181 e 183. Em um outro aspecto, um variante compreende uma substituição em três posições que correspondem a qualquer das posições 75, 77, 179, 181 e 183. Em um outro aspecto, um variante compreende uma substituição em quatro posições que correspondem a qualquer das posições 75, 77, 179, 181 e 183. Em um outro aspecto, um variante compreende uma substituição em cada posição que corresponde às posições 75, 77, 179, 181 e 183. Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste em uma substituição em uma posição que corresponde à posição 75. Em um outro aspecto, o aminoácido em uma posição que corresponde à posição 75 é substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, ou Val, preferivelmente por Val.

Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste na substituição I75V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste em uma substituição em uma posição que corresponde à posição 77. Em um outro aspecto, o aminoácido em uma posição que corresponde à posição 77 é 5 substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, ou Val, preferivelmente por Leu.

Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste na substituição F77L do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste em uma substituição em uma posição que corresponde à posição 179. Em um outro aspecto, o aminoácido em uma posição que corresponde à posição 179 é substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, ou Val, preferivelmente por Ile.

Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste na substituição F179I do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste em uma substituição em uma posição que corresponde à posição 181. Em um outro aspecto, o aminoácido em uma posição que corresponde à posição 181 é substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, ou Val, preferivelmente por Leu.

Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste na substituição I181L do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste em uma substituição em uma posição que corresponde à posição 183. Em um outro aspecto, o aminoácido em uma posição que corresponde à posição 183 é substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, ou Val, preferivelmente por Val.

Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste na substituição I183V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste em substituições nas posições que correspondem às posições 75 e 77, tais como aquelas descritas anteriormente.

Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste em 5 substituições nas posições que correspondem às posições 75 e 179, tais como aquelas descritas anteriormente.

Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste em substituições nas posições que correspondem às posições 75 e 181, tais como aquelas descritas anteriormente.

Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste em substituições nas posições que correspondem às posições 75 e 183, tais como aquelas descritas anteriormente.

Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste em substituições nas posições que correspondem às posições 77 e 179, tais como aquelas descritas anteriormente.

Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste em substituições nas posições que correspondem às posições 77 e 181, tais como aquelas descritas anteriormente.

Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste em substituições nas posições que correspondem às posições 77 e 183, tais como aquelas descritas anteriormente.

Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste em substituições nas posições que correspondem às posições 179 e 181, tais como aquelas descritas anteriormente.

Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste em substituições nas posições que correspondem às posições 179 e 183, tais como aquelas descritas anteriormente.

Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste em substituições nas posições que correspondem às posições 181 e 183, tais como aquelas descritas anteriormente.

Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste em substituições nas posições que correspondem às posições 75, 77, e 179, tais como aquelas descritas anteriormente. 5 Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste em substituições nas posições que correspondem às posições 75, 77, e 181, tais como aquelas descritas anteriormente.

Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste em substituições nas posições que correspondem às posições 75, 77, e 183, tais como aquelas descritas anteriormente.

Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste em substituições nas posições que correspondem às posições 75, 179, e 181, tais como aquelas descritas anteriormente.

Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste em substituições nas posições que correspondem às posições 75, 179, e 183, tais como aquelas descritas anteriormente.

Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste em substituições nas posições que correspondem às posições 75, 181 e 183, tais como aquelas descritas anteriormente.

Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste em substituições nas posições que correspondem às posições 77, 179, e 181, tais como aquelas descritas anteriormente.

Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste em substituições nas posições que correspondem às posições 77, 179, e 183, tais como aquelas descritas anteriormente.

Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste em substituições nas posições que correspondem às posições 179, 181 e 183, tais como aquelas descritas anteriormente.

Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste em substituições nas posições que correspondem às posições 77, 181 e 183, tais como aquelas descritas anteriormente.

Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste em substituições nas posições que correspondem às posições 75, 77, 179, e 181, 5 tais como aquelas descritas anteriormente.

Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste em substituições nas posições que correspondem às posições 75, 179, 181 e 183, tais como aquelas descritas anteriormente.

Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste em substituições nas posições que correspondem às posições 75, 77, 181 e 183, tais como aquelas descritas anteriormente.

Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste em substituições nas posições que correspondem às posições 75, 77, 179, e 183, tais como aquelas descritas anteriormente.

Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste em substituições nas posições que correspondem às posições 77, 179, 181 e 183, tais como aquelas descritas anteriormente.

Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste em substituições nas posições que correspondem às posições 75, 77, 179, 181 e 183, tais como aquelas descritas anteriormente.

Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste em uma ou mais (por exemplo, várias) substituições selecionadas do grupo que consiste em I75V, F77L, F179I, I181L e I183V.

Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste nas substituições I75V + F77L do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste nas substituições I75V + F179I do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste nas substituições I75V + I181L do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste nas substituições I75V + I183V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste nas substituições F77L + F179I do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. 5 Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste nas substituições F77L + I181L do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste nas substituições F77L + I183V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste nas substituições F179I + I181L do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste nas substituições F179I + I183V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste nas substituições I181L + I183V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste nas substituições I75V + F77L + F179I do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste nas substituições I75V + F77L + I181L do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste nas substituições I75V + F77L + I183V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste nas substituições I75V + F179I + I181L do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste nas substituições I75V + F179I + I183V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste nas substituições I75V + I181L + I183V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste nas substituições F77L + F179I + I181L do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste nas substituições F77L + F179I + I183V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste nas substituições F179I + I181L + I183V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste nas 5 substituições F77L + I181L + I183V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste nas substituições I75V + F77L + F179I + I181L do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste nas substituições I75V + F179I + I181L + I183V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste nas substituições I75V + F77L + I181L + I183V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste nas substituições I75V + F77L + F179I + I183V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste nas substituições F77L + F179I + I181L + I183V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, o variante compreende ou consiste nas substituições I75V + F77L + F179I + I181L + I183V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Os variantes da presente invenção podem compreender adicionalmente uma alteração, por exemplo, eliminação, inserção, e/ou substituição em uma ou mais (por exemplo, várias) outras posições.

As mudanças de aminoácido podem ser de uma natureza menor, isto é, substituições ou inserções conservativas de aminoácido que não afetam significativamente o dobramento e/ou atividade da proteína; pequenas eliminações, tipicamente de 1-30 aminoácidos; pequenas extensões terminais amino ou carboxil, tal como um resíduo de metionina amino-terminal; um peptídeo ligador pequeno de até 20-25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação alterando a carga da rede ou uma outra função, tal como um 5 trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

Exemplos de substituições conservativas estão nos grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos acídicos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e aminoácidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições de aminoácido que em geral não alteram a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H.

Neurath e R.L.

Hill, 1979, em, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque.

As substituições comuns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly.

Alternativamente, as trocas de aminoácido são de uma natureza tal que as propriedades físico-químicas dos polipeptídeos são alteradas.

Por exemplo, as mudanças de aminoácido podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alterar a especificidade do substrato, mudar o pH ideal e similares.

Os aminoácidos essenciais em um polipeptídeo podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese sítio-direcionada ou mutagênese de varredura de alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na última técnica, as mutações simples de alanina são introduzidas em cada resíduo na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas com relação ao polipeptídeo com atividade intensificadora celulolítica para identificar resíduos de aminoácido que são importantes para a atividade da molécula.

Ver também, Hilton et al., 1996, J.

Biol.

Chem. 271: 4699-4708. O sítio ativo do polipeptídeo com atividade intensificadora celulolítica, ou outra interação biológica, também pode ser determinado por análise física de estrutura, da 5 maneira determinada por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons, ou marcação por foto-afinidade, junto com a mutação dos aminoácidos do provável sítio de contato.

Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J.

Mol.

Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. A identidade dos aminoácidos essenciais também pode ser inferida a partir de um alinhamento com um polipeptídeo relacionado.

Os variantes podem consistir em 200 a 220 aminoácidos, por exemplo, 205 a 220, 210 a 220, e 215 a 220 aminoácidos.

Em uma modalidade, o variante apresenta maior atividade térmica.

Em uma modalidade, o variante apresenta melhor termoestabilidade.

Em uma modalidade, o variante apresenta maior atividade térmica e melhor termoestabilidade.

Polipeptídeos parentais com atividade intensificadora celulolítica O polipeptídeo parental com atividade intensificadora celulolítica pode ser (a) um polipeptídeo com pelo menos 60 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza em pelo menos condições de severidade baixa com (i) a sequência codificante de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de DNAc deste, ou (iii) o complemento de tamanho total de (i) ou (ii); ou (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 60 % de identidade de sequência com a sequência codificante de polipeptídeo maduro de SEQ ID

NO: 1 ou a sequência de DNAc deste.

Em um aspecto, o parental apresenta uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 60 %, por exemplo, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo 5 menos 80 %, pelo menos 81 %, pelo menos 82 %, pelo menos 83 %, pelo menos 84 %, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %, que apresenta atividade intensificadora celulolítica.

Em um aspecto, a sequência de aminoácidos do parental diferem em até 10 aminoácidos, por exemplo, em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos, do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, o parental compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, o parental compreende ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, o parental compreende ou consiste em aminoácidos 22 a 250 de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, o parental é um fragmento do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 contendo pelo menos 200 resíduos de aminoácido, por exemplo, pelo menos 210 resíduos de aminoácido ou pelo menos 220 resíduos de aminoácido.

Em um outro aspecto, o parental é um variante alélico do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, o parental é codificado por um polinucleotídeo que hibridiza em condições de severidade muito baixa, condições de severidade baixa, condições de severidade média, condições de severidade média-alta, condições de severidade alta, ou condições de severidade muito alta com (i) a sequência codificante de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de DNAc deste, ou (iii) o complemento de tamanho total de (i) ou (ii) (J.

Sambrook, E.F.

Fritsch, e T.

Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque). 5 O polinucleotídeo de SEQ ID NO: 1 ou uma subsequência deste, bem como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou um fragmento deste, pode ser usado para determinar as sondas de ácido nucléico para identificar e clonar o DNA que codifica um parental a partir das cepas de diferentes gêneros ou espécies, de acordo com métodos bem conhecidos na técnica.

Em particular, tais sondas podem ser usadas para hibridização com o DNA genômico ou DNAc de uma célula de interesse, seguindo procedimentos padrões de Southern blotting, a fim de identificar e isolar o gene correspondente nestas.

Tais sondas podem ser consideravelmente menores que a sequência completa, mas podem ter pelo menos 15, por exemplo, pelo menos 25, pelo menos 35, ou pelo menos 70 nucleotídeos em comprimento.

Preferivelmente, a sonda de ácido nucléico apresenta pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, por exemplo, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, ou pelo menos 900 nucleotídeos em comprimento.

Tanto as sondas de DNA quanto de RNA podem ser usadas.

As sondas são tipicamente marcadas para detectar o gene correspondente (por exemplo, com 32P, 3H, 35S, biotina ou avidina). Tais sondas são incluídas pela presente invenção.

Uma biblioteca de DNA genômico ou DNAc, preparada a partir de tais outras cepas, pode ser selecionada com relação ao DNA que hibridiza nas sondas descritas anteriormente e que codifica um parental.

O DNA genômico, ou de outro tipo, de tais outras cepas pode ser separado por eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida, ou outras técnicas de separação.

O DNA das bibliotecas, ou o DNA separado, pode ser transferido e imobilizado em nitrocelulose ou outro material carreador adequado.

A fim de identificar um clone ou DNA que hibridiza com SEQ ID NO: 1, ou uma subsequência desta, o material carreador é usado em um Southern blot. 5 Com propósitos da presente invenção, a hibridização indica que o polinucleotídeo hibridiza em uma sonda de ácido nucléico marcada que corresponde a (i) SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência codificante de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (iii) a sequência de DNAc deste, (iv) o complemento de tamanho total deste, ou (v) uma subsequência deste, em condições de severidade muito baixa a muito alta.

As moléculas nas quais a sonda de ácido nucléico hibridiza nestas condições podem ser detectadas usando, por exemplo, filme de raios-X ou qualquer outro meio de detecção conhecido na técnica.

Em um aspecto, a sonda de ácido nucléico é a sequência codificante de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou a sequência de DNAc deste.

Em um outro aspecto, a sonda de ácido nucléico apresenta nucleotídeos 64 a 859 de SEQ ID NO: 1 ou a sequência de DNAc destes.

Em um outro aspecto, a sonda de ácido nucléico é um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2; o polipeptídeo maduro deste; ou um fragmento deste.

Em um outro aspecto, a sonda de ácido nucléico é SEQ ID NO: 1 ou a sequência de DNAc deste.

Em um outro aspecto, o parental é codificado por um polinucleotídeo com um identidade de sequência com a sequência codificante de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou a sequência de DNAc deste, de pelo menos 60 %, por exemplo, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 81 %, pelo menos 82 %, pelo menos 83 %, pelo menos 84 %, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, um pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 %, que codifica um polipeptídeo com atividade intensificadora celulolítica.

Em um aspecto, a sequência codificante de polipeptídeo maduro apresenta nucleotídeos 64 a 859 de SEQ ID NO: 1. 5 O parental pode ser um polipeptídeo híbrido, no qual uma região de um polipeptídeo é fundida na terminação N ou na terminação C de uma região de um outro polipeptídeo.

O parental pode ser um polipeptídeo de fusão ou polipeptídeo de fusão clivável, em que um outro polipeptídeo é fundido na terminação N ou na terminação C do polipeptídeo da presente invenção.

Um polipeptídeo de fusão é produzido fundindo um polinucleotídeo que codifica um outro polipeptídeo a um polinucleotídeo da presente invenção.

Técnicas para produzir polipeptídeos de fusão são conhecidas na tecnologia, e incluem ligar as sequências codificantes que codificam os polipeptídeos, de maneira tal que elas estejam em alinhamento e que a expressão do polipeptídeo de fusão esteja no controle do(s) mesmo(s) promotor(s) e finalizador(s). Os polipeptídeos de fusão também podem ser construídos usando tecnologia de inteína na qual as fusões são criadas pós-translacionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779). Um polipeptídeo de fusão pode compreender adicionalmente um sítio de clivagem entre os dois polipeptídeos.

Mediante a secreção da proteína de fusão, o sítio é clivado liberando os dois polipeptídeos.

Exemplos de sítios de clivagem incluem, mas sem limitação, o sítios revelados em Martin et al., 2003, J.

Ind.

Microbiol.

Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J.

Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl.

Environ.

Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; e Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, e Genetics 6:

240-248; e Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48. O parental pode ser obtido a partir de microrganismos de qualquer gênero.

Com propósitos da presente invenção, o termo “obtido a partir de”, da maneira aqui usada, junto com uma dada fonte pode significar 5 que o parental codificado por um polinucleotídeo é produzido pela fonte ou por uma cepa na qual o polinucleotídeo da fonte foi inserido.

Em um aspecto, o parental é secretado extracelularmente.

O parental pode ser um polipeptídeo bacteriano com atividade intensificadora celulolítica.

Por exemplo, o parental pode ser um polipeptídeo de bactéria Gram-positiva, tal como um polipeptídeo de Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus ou Streptomyces, com atividade intensificadora celulolítica, ou um polipeptídeo de bactéria Gram-negativa, tal como um polipeptídeo de Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella ou Ureaplasma, com atividade intensificadora celulolítica.

Em um aspecto, o parental é um polipeptídeo de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis ou Bacillus thuringiensis com atividade intensificadora celulolítica.

Em um outro aspecto, o parental é um polipeptídeo de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, ou Streptococcus equi subsp.

Zooepidemicus com atividade intensificadora celulolítica.

Em um outro aspecto, o parental é um polipeptídeo de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus ou Streptomyces lividans com atividade intensificadora celulolítica.

O parental pode ser um polipeptídeo fúngico com atividade intensificadora celulolítica.

Por exemplo, o parental pode ser um polipeptídeo de levedura com atividade intensificadora celulolítica, tal como um 5 polipeptídeo de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia, com atividade intensificadora celulolítica.

Por exemplo, o parental pode ser um polipeptídeo de fungo filamentoso com atividade intensificadora celulolítica, tal como um polipeptídeo de Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella ou Xylaria, com atividade intensificadora celulolítica.

Em um outro aspecto, o parental é um polipeptídeo de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis ou Saccharomyces oviformis com atividade intensificadora celulolítica.

Em um outro aspecto, o parental é um polipeptídeo de Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, 5 Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia setosa, Thielavia spededonium, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei ou Trichoderma viride com atividade intensificadora celulolítica.

Em um outro aspecto, o parental é um polipeptídeo de Aspergillus fumigatus com atividade intensificadora celulolítica, por exemplo, o polipeptídeo compreendendo o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Será bem entendido que, para as espécies anteriormente mencionadas, a invenção inclui tanto os estados perfeitos quanto imperfeitos, e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos, independente do nome da espécie pelos qual são conhecidos.

Os versados na técnica reconhecerão facilmente a identidade de equivalentes apropriados.

As cepas destas espécies são facilmente acessíveis ao público em inúmeras coleções de cultura, tal como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und

Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL). O parental pode ser identificado e obtido a partir de outras fontes, 5 incluindo microrganismos isolados da natureza (por exemplo, solo, compostos, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente a partir de materiais naturais (por exemplo, solo, compostos, água, etc.), usando as sondas anteriormente mencionadas.

As técnicas para isolar microrganismos e DNA diretamente dos hábitats naturais são bem conhecidas na tecnologia.

Um polinucleotídeo que codifica um parental pode então ser obtido selecionando similarmente uma biblioteca de DNA genômico ou DNAc de um outro microrganismo ou amostras mista de DNA.

Uma vez que um polinucleotídeo que codifica um parental foi detectado com a(s) sonda(s), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado utilizando técnicas que são conhecidas pelos versados na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra). Preparação de Variantes A presente invenção também diz respeito aos métodos para obter um variante com atividade intensificadora celulolítica, compreendendo: (a) introduzir em um polipeptídeo parental com atividade intensificadora celulolítica uma substituição em uma ou mais (por exemplo, várias) posições que correspondem às posições 75, 77, 179, 181 e 183 do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, em que o variante apresenta atividade intensificadora celulolítica; e (b) recuperar o variante.

Os variantes podem ser preparados usando qualquer procedimento de mutagênese conhecido na técnica, tal como mutagênese sítio-direcionada, construção de gene sintético, construção de gene semissintético, mutagênese aleatória, embaralhamento, etc.

A mutagênese sítio-direcionada é uma técnica na qual uma ou mais (por exemplo, várias) mutações são introduzidas em um ou mais sítios definidos em um polinucleotídeo que codifica o parental.

A mutagênese sítio-direcionada pode ser realizada in vitro por PCR, envolvendo o uso de oligonucleotídeos iniciadores contendo a mutação desejada.

A mutagênese sítio-direcionada também pode ser realizada in vitro 5 por mutagênese de cassete, envolvendo a clivagem por uma enzima de restrição em um sítio no plasmídeo compreendendo um polinucleotídeo que codifica o parental, e subsequente ligação de um oligonucleotídeo contendo a mutação no polinucleotídeo.

Em geral, a enzima de restrição que digere o plasmídeo e o oligonucleotídeo é a mesma, permitindo extremidades aderentes do plasmídeo e na inserção para que se ligem um no outro.

Ver, por exemplo, Scherer e Davis, 1979, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 76: 4949-4955; e Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966. A mutagênese sítio-direcionada também pode ser realizada in vivo in vivo por métodos conhecidos na técnica.

Ver, por exemplo, publicação de pedido de patente U.S. 2004/0171154; Storici et al., 2001, Natureza Biotechnol. 19: 773-776; Kren et al., 1998, Nat.

Med. 4: 285-290; e Calissano e Macino, 1996, Fungal Genet.

Newslett. 43: 15-16. Qualquer procedimento de mutagênese sítio-direcionada pode ser usado na presente invenção.

Existem muitos estojos comerciais disponíveis que podem ser usados para preparar os variantes.

A construção do gene sintético implica na síntese in vitro de uma molécula de polinucleotídeo determinada para codificar um polipeptídeo de interesse.

A síntese do gene pode ser realizada utilizando inúmeras técnicas, tais como a tecnologia baseada em microchipe multiplex de Tian et al. (2004, Natureza 432: 1050-1054) e as tecnologias similares, em que os oligonucleotídeos são sintetizados e montados em chipes microfluidicos foto- programáveis.

As substituições, eliminações e/ou inserções de aminoácido simples ou múltiplo podem ser realizadas e testadas usando métodos de mutagênese conhecidos, recombinação e/ou embaralhamento, seguido por um procedimento de seleção relevante, tais como aqueles revelados por Reidhaar- Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros 5 métodos que podem ser usados incluem PCR propensa ao erro, exibição de fago (por exemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; patente U.S. 5.223.409; WO 92/06204) e mutagênese região direcionada (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127). Os métodos de mutagênese/embaralhamento podem ser combinados com métodos de seleção, automatizados e de alto rendimento, para detectar a atividade de polipeptídeos clonados e mutagenizados expressos por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). As moléculas mutagenizadas de DNA, que codificam polipeptídeos ativos, podem ser recuperadas a partir das células hospedeiras e sequenciadas rapidamente usando métodos padrões na técnica.

Estes métodos permitem a rápida determinação da importância de resíduos individuais de aminoácido em um polipeptídeo.

A construção do gene semissintético é realizada combinando aspectos da construção do gene sintético, e/ou mutagênese sítio-direcionada, e/ou mutagênese aleatória e/ou embaralhamento.

A construção semissintética é tipificada por um processo que utiliza fragmentos de polinucleotídeo que são sintetizados, em combinação com técnicas de PCR.

As regiões de genes definidas podem ser assim sintetizadas novamente, enquanto outras regiões podem ser amplificadas usando oligonucleotídeos iniciadores mutagênicos sítio-específicos, embora outras regiões ainda possam ser submetidas à amplificação por PCR propensa ao erro ou PCR não propensa ao erro.

As sequências de polinucleotídeo podem ser então embaralhadas.

Polinucleotídeos A presente invenção também diz respeito aos polinucleotídeos isolados que codificam um variante da presente invenção.

Construtos de ácido nucléico A presente invenção também diz respeito a construtos de ácido nucléico compreendendo um polinucleotídeo que codifica um variante da 5 presente invenção, operavelmente ligado a uma ou mais sequências controle que direcionam a expressão da sequência codificante em uma célula hospedeira adequada, em condições compatíveis com as sequências controle.

O polinucleotídeo pode ser manipulado em uma variedade de maneiras para fornecer a expressão de um variante.

A manipulação do polinucleotídeo antes de sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária, dependendo do vetor de expressão.

As técnicas para modificar os polinucleotídeos que utilizam métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na tecnologia.

A sequência controle pode ser um promotor, um polinucleotídeo que é reconhecido por uma célula hospedeira para a expressão do polinucleotídeo.

O promotor contém sequências controle transcricionais que medeiam a expressão do variante.

O promotor pode ser qualquer polinucleotídeo que mostra atividade transcricional na célula hospedeira incluindo promotores mutantes, truncados e híbridos, e pode ser obtido a partir de genes que codificam polipeptídeos extracelulares ou intracelulares, tanto homólogos quanto heterólogos para a célula hospedeira.

Os exemplos de promotores adequados para direcionar a transcrição dos construtos de ácido nucléico da presente invenção, em uma célula hospedeira bacteriana, são os promotores obtidos a partir do gene alfa- amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), gene alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyL), gene penicilinase de Bacillus licheniformis (penP), gene amilase maltogênica de Bacillus stearothermophilus (amyM), gene levansucrase de Bacillus subtilis (sacB), genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis (Agaisse e Lereclus, 1994,

Molecular Microbiology 13: 97-107), operon lac de E. coli, promotor trc de E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), gene agarase de Streptomyces coelicolor (dagA) e gene beta-lactamase de procarioto (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 75: 3727-3731), bem como o promotor tac 5 (DeBoer et al., 1983, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 80: 21-25). Os promotores adicioais são descritos em "Useful proteins from recombinant bacteria" em Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; e em Sambrook et al., 1989, supra.

Os exemplos de promotores em tandem são revelados em WO 99/43835. Exemplos de promotores adequados para direcionar transcrição do construtos de ácido nucléico da presente invenção, em uma célula hospedeira de fungo filamentoso, são promotores obtidos a partir dos genes para acetamidase de Aspergillus nidulans, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase estável ao ácido de Aspergillus niger, glicoamilase (glaA) de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori, TAKA amilase de Aspergillus oryzae, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglicosidase de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Fusarium venenatum Daria (WO 00/56900), Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900), lipase de Rhizomucor miehei, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glicosidase de Trichoderma reesei, celobioidrolase I de Trichoderma reesei, celobioidrolase II de Trichoderma reesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei, endoglucanase II de Trichoderma reesei, endoglucanase III de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, xilanase III de Trichoderma reesei, beta- xilosidase de Trichoderma reesei e fator de alongamento da tradução de Trichoderma reesei, bem como o promotor NA2-tpi (um promotor modificado de um gene de alfa-amilase neutra de Aspergillus, em que a sequência principal não traduzida foi substituída por uma região principal a partir de um gene de triose fosfato isomerase de Aspergillus; os exemplos não limitantes incluem promotores modificados a partir de um gene de alfa- amilase neutra de Aspergillus niger, em que a região principal não traduzida 5 foi substituída por uma sequência principal não traduzida de um gene de isomerase triose fosfato de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae) e promotores mutantes, truncados e híbridos destes.

Outros promotores são descritos na patente U.S. 6.011.147. Em uma levedura hospedeira, os promotores usados são obtidos dos genes para enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, galactoquinase (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH1, ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, triose fosfato isomerase (TPI) de Saccharomyces cerevisiae, metalotioneina (CUP1) de Saccharomyces cerevisiae e 3- fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae.

Outros promotores usados para células hospedeiras de leveduras são descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488. A sequência controle também pode ser um finalizador de sequência de transcrição, que é reconhecido por uma célula hospedeira para finalizar a transcrição.

A sequência finalizadora é operavelmente ligada na terminação 3’ do polinucleotídeo que codifica o variante.

Qualquer finalizador que é funcional na célula hospedeira pode ser usado.

Os finalizadores preferidos para as células hospedeiras bacterianas são obtidos dos genes para protease alcalina (aprH) de Bacillus clausii, alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis e RNA ribossomal (rrnB) de Escherichia coli.

Os finalizadores preferidos para células hospedeiras de fungos filamentosos são obtidos dos genes para acetamidase de Aspergillus nidulans, antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glicoamilase de Aspergillus niger,

alfa-glicosidase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae, protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum, beta-glicosidase de Trichoderma reesei, celobioidrolase I de Trichoderma reesei, celobioidrolase II de Trichoderma reesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei, 5 endoglucanase II de Trichoderma reesei, endoglucanase III de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, xilanase III de Trichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei e fator de alongamento da tradução de Trichoderma reesei.

Os finalizadores preferidos para as células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae, citocrome C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae e gliceraldeído-3- phosphate desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae.

Outros finalizadores usados para as células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, supra.

A sequência controle também pode ser uma região estabilizadora de RNAm, à jusante de um promotor e à montante da sequência codificante de um variante da presente invenção que aumenta a expressão do variante.

Os exemplos de regiões estabilizadoras de RNAm adequadas são obtidas de um gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) e um gene SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471). A sequência controle também pode ser uma sequência principal, uma região não traduzida de um RNAm que é importante para a tradução pela célula hospedeira.

A sequência principal é operavelmente ligada na terminação 5’ do polinucleotídeo que codifica o variante.

Qualquer sequência principal que é funcional na célula hospedeira pode ser usada.

As sequências principais preferidas para as células hospedeiras de fungos filamentosos são obtidas dos genes para TAKA amilase de

Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.

As sequências líderes adequadas para as células hospedeiras de leveduras são obtidas dos genes para enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, 3-fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae, fator alfa 5 de Saccharomyces cerevisiae e álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.

A sequência controle também pode ser uma sequência de poliadenilação, uma sequência operavelmente ligada na terminação 3’ do variante-sequência codificante e, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina ao RNAm transcrito.

Qualquer sequência de poliadenilação que é funcional na célula hospedeira pode ser usada.

As sequências de poliadenilação preferidas para células hospedeiras de fungo filamentoso são obtidas dos genes para antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glicoamilase de Aspergillus niger, alfa- glicosidase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae e protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

As sequências de poliadenilação usadas para as células hospedeiras de levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, Mol.

Cellular Biol. 15: 5983-5990. A sequência controle também pode ser uma região codificante de peptídeo sinal que codifica um peptídeo sinal ligado na terminação N de um variante, e direciona o variante na via secretória da célula.

A extremidades 5’ da sequência codificante do polinucleotídeo pode conter de maneira inerente uma sequência de peptídeo sinal codificante, naturalmente ligada ao quadro de aberto de leitura, com o segmento da sequência codificante que codifica o variante.

Alternativamente, a extremidade 5’ da sequência codificante pode conter uma sequência de peptídeo sinal codificante que é estrangeira à sequência codificante.

Uma sequência estrangeira de peptídeo sinal codificante pode ser exigida onde a sequência codificante não contém naturalmente uma sequência de peptídeo sinal codificante.

Alternativamente, uma sequência estrangeira de peptídeo sinal codificante pode simplesmente substituir a sequência natural de peptídeo sinal codificante, a fim de 5 melhorara a secreção do variante.

Entretanto, qualquer sequência de peptídeo sinal codificante, que direciona o variante expresso na via secretória de uma célula hospedeira, pode ser usado.

As sequências de peptídeo sinal eficiente que codificam as células hospedeiras bacterianas são as sequências de peptídeo sinal codificantes obtidas dos genes para amilase maltogênica de Bacillus NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, proteases neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) e prsA de Bacillus subtilis.

Os peptídeos sinais adicionais são descritos por Simonen e Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137. As sequências de peptídeo sinal eficientes que codificam células hospedeiras de fungo filamento são as sequências de peptídeo sinal codificantes obtidas dos genes para amilase de Aspergillus niger, glicoamilase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae, celulase de Humicola insolens, endoglucanase V de Humicola insolens, lipase de Humicola lanuginosa e proteinase aspártica de Rhizomucor miehei.

Os peptídeos sinais usados para as células hospedeiras de levedura são obtidas dos genes para fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertase de Saccharomyces cerevisiae.

Outras sequências de peptídeo sinal codificantes usadas são descritas por Romanos et al., 1992, supra.

A sequência controle também pode ser uma sequência de pró- peptídeo codificante que codifica um pró-peptídeo posicionado na terminação N de um variante.

O polipeptídeo resultante é conhecido como uma pró- enzima ou pró-polipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um pró-

polipeptídeo é em geral inativo, e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo por clivagem catalítica ou auto-catalítica do pró-peptídeo a partir do pró-polipeptídeo.

A sequência de pró-peptídeo codificante pode ser obtida dos genes para protease alcalina (aprE) de Bacillus subtilis, protease neutra 5 (nprT) de Bacillus subtilis, lacase (WO 95/33836) de Myceliophthora thermophila, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei e fator alfa de Saccharomyces cerevisiae.

Onde tanto o peptídeo sinal quanto a sequência de pró- peptídeos estão presentes, a sequência de pró-peptídeo é posicionada próxima à terminação N do variante, e a sequência de peptídeo sinal é posicionada próxima à erminação N da sequência de pró-peptídeo.

Também pode ser desejável adicionar sequências regulatórias que regulam a expressão do variante com relação ao crescimento da célula hospedeira.

Os exemplos de sequências regulatórias são aquelas que fazem com que a expressão do gene seja acionada e desativada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulatório.

As sequências regulatórias em sistemas procarióticos incluem os sistemas operadores lac, tac e trp.

Em levedura, o sistema ADH2 ou o sistema GAL1 pode ser usado.

Em fungos filamentosos, o promotor de glicoamilase de Aspergillus niger, promotor de TAKA alfa-amilase de Aspergillus oryzae e o promotor de glicoamilase de Aspergillus oryzae, promotor de celobioidrolase I de Trichoderma reesei, e promotor de celobioidrolase II de Trichoderma reesei podem ser usados.

Outros exemplos de sequências regulatórias são aquelas que permitem a amplificação do gene.

Em sistemas eucarióticos, estas sequências regulatórias incluem o gene diidrofolato redutase que é amplificado na presença de metotrexato, e os genes metalotioneina que são amplificados com metais pesados.

Nestes casos, o polinucleotídeo que codifica o variante pode ser operavelmente ligado à sequência regulatória.

Vetores de expressão

A presente invenção também diz respeito a vetores de expressão recombinantes compreendendo um polinucleotídeo que codifica um variante da presente invenção, um promotor, e sinais de parada transcricionais e translacionais.

As várias sequências de nucleotídeo e controle podem ser 5 unidas para produzir um vetor de expressão recombinante, que pode incluir um ou mais (por exemplo, vários) sítios de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição do polinucleotídeo que codifica o variante em tais sítios.

Alternativamente, o polinucleotídeo pode ser expresso inserindo o polinucleotídeo, ou um construto de ácido nucléico compreendendo o polinucleotídeo, em um vetor para a expressão apropriado.

Na criação do vetor de expressão, a sequência codificante está localizada no vetor, de maneira tal que a sequência codificante seja operavelmente ligada nas sequências controle apropriadas para a expressão.

O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que pode ser submetido convenientemente aos procedimentos de DNA recombinante, e podem resultar na expressão do polinucleotídeo.

A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira, na qual o vetor será introduzido.

O vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado.

O vetor pode ser um vetor que se replica autonomamente, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo, ou um cromossomo artificial.

O vetor pode conter qualquer meio para garantir a auto-replicação.

Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira é integrado no genoma e replicado junto com o(s) cromossomo(s) nos(s) qual(s) foi integrado.

Além do mais, um vetor simples, ou plasmídeo, ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que juntos contêm o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transposon, podem ser usados.

O vetor contém preferivelmente um ou mais (por exemplo, vários) marcadores selecionáveis que permitem a fácil seleção de células transformadas, transfectadas, transduzidas ou similares.

Um marcador 5 selecionável é um produto do gene que fornece resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxotróficos e similares.

Exemplos de marcadores bacterianos selecionáveis são os genes dal de Bacillus licheniformis ou Bacillus subtilis, ou os marcadores que conferem resistência aos antibióticos, tal como resistência à ampicilina, cloranfenicol, canamicina, neomicina, espectinomicina ou tetraciclina.

Os marcadores adequados para as células hospedeiras de levedura incluem, mas sem limitação, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 e URA3. Os marcadores selecionáveis para uso em uma célula hospedeira de fungo filamentoso incluem, mas sem limitação, adeA (fosforribosilaminoimidazol- succinocarboxamida sintase), adeB (fosforribosil-aminoimidazol sintase), amdS (acetamidase), argB (ornitina carbamoiltransferase), bar (fosfinotricina acetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato redutase), pyrG (orotidina-5’-fosfato decarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase), e trpC (antranilato sintase), bem como equivalentes destes.

São preferidos para uso em uma célula de Aspergillus os genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae, e um gene bar de Streptomyces hygroscopicus.

São preferidos para uso em uma célula de Trichoderma os genes adeA, adeB, amdS, hph e pyrG.

O marcador selecionável pode ser um sistema de marcador selecionável duplo, da maneira descrita em WO 2010/039889. Em um aspecto, o marcador selecionável duplo é um sistema de marcador selecionável duplo hph-tk.

O vetor contém preferivelmente um(s) elemento(s) que permite(s) a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou a replicação autônoma do vetor na célula independente do genoma. Para a integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode depender da sequência de variante que codifica o polipeptídeo, ou qualquer outro elemento do vetor para a integração no genoma por 5 recombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter polinucleotídeos adicionais para direcionar a integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em um(s) local(s) exato(s) no(s) cromossomo(s). Para aumentar a probabilidade de integração em um local preciso, os elementos integracionais podem conter um número suficiente de ácidos nucléicos, tais como 100 a 10.000 pares de bases, 400 a

10.000 pares de bases e 800 a 10.000 pares de bases, que apresenta um alto grau de identidade de sequência com a sequência alvo correspondente para melhorar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos integracionais podem ser qualquer sequência que é homóloga á sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Além do mais, os elementos integracionais podem ser polinucleotídeos não codificantes ou codificantes. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga. Para replicação autônoma, o vetor pode compreender adicionalmente uma origem de replicação que possibilita o vetor a replicar autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquer plasmídeo replicador que medeia a replicação autônoma que funciona em uma célula. O termo “origem de replicação” ou “plasmídeo replicador” significa um polinucleotídeo que possibilita que um plasmídeo ou vetor se replique in vivo. Exemplos de origens de replicação bacterianas são as origens de replicação de plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177, e pACYC184 que permitem a replicação em E. coli, e pUB110, pE194, pTA1060, e pAMß1 que permitem a replicação em Bacillus.

Exemplos de origens de replicação para uso em uma levedura como célula hospedeira são as origem de replicação de 2 micron, ARS1, ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3, e a combinação de ARS4 e CEN6. Exemplos de origens de replicação usadas em uma célula de 5 filamentoso são AMA1 e ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). O isolamento do gene AMA1 e a construção de plasmídeos ou vetores que compreendem o gene podem ser realizados de acordo com os métodos revelados em WO 00/24883. Mais de uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção pode ser inserida em uma célula hospedeira para aumentar a produção de um variante.

Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido integrando pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira, ou incluindo um gene marcador selecionável amplificável com o polinucleotídeo, onde as células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável e, por meio disso, cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas cultivando as células na presença do agente selecionável adequado.

Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos anteriormente para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos pelos versados na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra). Células hospedeiras A presente invenção também diz respeito às células hospedeiras recombinantes, compreendendo um polinucleotídeo que codifica um variante da presente invenção operavelmente ligado a uma ou mais (por exemplo, várias) sequências controle que direcionam a produção de um variante da presente invenção.

Um construto ou vetor compreendendo um polinucleotídeo é introduzido em um célula hospedeira, de maneira tal que o construto ou vetor seja mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor auto-replicante extra-cromossômico, da maneira descrita anteriormente.

O termo "célula hospedeira" inclui qualquer progênie de uma célula parental que não é idêntica à célula parental, em virtude das mutações que ocorrem durante a replicação.

A escolha de uma célula hospedeira dependerá, até uma certa extensão, do gene que 5 codifica o variante e da fonte do parental.

A célula hospedeira pode ser qualquer célula usada na produção de um variante recombinante, por exemplo, um procarioto ou um eucarioto.

A célula hospedeira procariota pode ser qualquer bactéria Gram-positiva ou Gram-negativa.

As bactérias Gram-positivas incluem, mas sem limitação, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus e Streptomyces.

As bactérias Gram-negativas incluem, mas sem limitação, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella e Ureaplasma.

A célula hospedeira bacteriana pode ser qq.

Células de Bacillus incluindo, mas sem limitação, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis e Bacillus thuringiensis.

A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptococcus incluindo, mas sem limitação, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis e Streptococcus equi subsp.

Zooepidemicus.

A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptomyces incluindo, mas sem limitação, células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus e Streptomyces lividans.

A introdução de DNA em uma célula de Bacillus pode ser realizada por transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Chang e Cohen, 1979, Mol.

Gen.

Genet. 168: 111-115), transformação de célula competente (ver, por exemplo, Young e Spizizen, 1961, J.

Bacteriol. 81: 823- 5 829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, J.

Mol.

Biol. 56: 209-221), eletroporação (ver, por exemplo, Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), ou conjugação (ver, por exemplo, Koehler e Thorne, 1987, J.

Bacteriol. 169: 5271-5278). O introdução de DNA em uma célula de E. coli pode ser realizada por transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Hanahan, 1983, J.

Mol.

Biol. 166: 557-580) ou eletroporação (ver, por exemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). A introdução de DNA em uma célula de Streptomyces pode ser realizada por transformação de protoplasto, eletroporação (ver, por exemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), conjugação (ver, por exemplo, Mazodier et al., 1989, J.

Bacteriol. 171: 3583-3585), ou transdução (ver, por exemplo, Burke et al., 2001, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 98: 6289-6294). A introdução de DNA em uma célula de Pseudomonas pode ser realizada por eletroporação (ver, por exemplo, Choi et al., 2006, J.

Microbiol.

Methods 64: 391-397), ou conjugação (ver, por exemplo, Pinedo e Smets, 2005, Appl.

Environ.

Microbiol. 71: 51-57). A introdução de DNA em uma célula de Streptococcus pode ser realizada por competência natural (ver, por exemplo, Perry e Kuramitsu, 1981, Infect.

Immun. 32: 1295-1297), transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Catt e Jollick, 1991, Microbes 68: 189-207), eletroporação (ver, por exemplo, Buckley et al., 1999, Appl.

Environ.

Microbiol. 65: 3800-3804) ou conjugação (ver, por exemplo, Clewell, 1981, Microbiol.

Rev. 45: 409-436). Entretanto, qualquer método conhecido na técnica para introduzir DNA em uma célula hospedeira pode ser usado.

A célula hospedeira também pode ser de um eucarioto, tal como uma célula de mamífero, inseto, planta ou fungo.

A célula hospedeira pode ser uma célula fúngica. “Fungos”, da maneira aqui usada, inclui os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota e Zygomycota, bem como Oomycota e todos os fungos mitospóricos (da maneira definida por Hawksworth et al., em, Ainsworth and 5 Bisby’s Dictionary of the Fungi, 8ª edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK). A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula de levedura. “Levedura”, da maneira aqui usada, inclui leveduras ascosporogêneas (Endomycetales), leveduras basidiosporogêneas e leveduras que pertencem aos fungos imperfeitos (Blastomycetes). Uma vez que a classificação de levedura pode mudar no futuro, com propósitos desta invenção, as leveduras podem ser definidas da maneira descrita em Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, e Davenport, R.R., editores, Soc.

App.

Bacteriol.

Symposium Series No. 9, 1980). A levedura como célula hospedeira pode ser uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia, tal como uma célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, ou Yarrowia lipolytica.

A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula de fungo filamentoso. “Fungos filamentosos” incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (da maneira definida por Hawksworth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são caracterizados em geral por uma parede de micélio composta de quitina, celulose, glicana, quitosana, manana e outros polissacarídeos complexos.

O crescimento vegetativo é por alongamento de hifas e o catabolismo do carbono é obrigatoriamente aeróbico.

Ao contrário, o crescimento vegetativo de leveduras, tal como Saccharomyces cerevisiae, é por brotamento de um talo unicelular e o catabolismo do carbono pode ser fermentativo.

As células hospedeiras de fungo filamentoso podem ser uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, 5 Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, ou Trichoderma.

Por exemplo, as células hospedeiras de fungo filamentoso podem ser uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.

As células fúngicas podem ser transformadas por um processo que envolve formação de protoplasto, transformação dos protoplastos e regeneração da parede celular de uma maneira conhecida por se.

Os procedimentos adequados para a transformação de células hospedeiras de 5 Aspergillus e Trichoderma são descritos em EP 238023 e Yelton et al., 1984, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 81: 1470-1474, e Christensen ET.

AL., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Os métodos adequados para transformar as espécies de Fusarium são descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147- 156, e WO 96/00787. A levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, Em Abelson, J.N. e Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., Nova Iorque; Ito et al., 1983, J.

Bacteriol. 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 75: 1920. Métodos de Produção A presente invenção também diz respeito a métodos de produzir um variante, compreendendo: (a) cultivar uma célula hospedeira da presente invenção em condições adequadas para a expressão do variante; e (b) recuperar o variante.

As células hospedeiras são cultivadas em um meio nutriente adequado para a produção do variante usando métodos conhecidos na técnica.

Por exemplo, as células podem ser cultivadas por cultivo em frasco de agitação, ou fermentação em pequena escala ou grande escala (incluindo fermentações contínuas, em lotes, em lote alimentado ou em estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais, realizada em um meio e condições adequadas que permitem que o variante seja expresso e/ou isolado.

O cultivo ocorre em um meio nutriente adequado que compreende fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando os procedimentos conhecidos na técnica.

Os meio adequados são disponíveis de fornecedores comerciais, ou podem ser preparados de acordo com as composições publicadas (por exemplo, em catálogos do American Type Culture Collection). Se o variante for secretado no meio nutriente, o variante pode ser recuperado diretamente do meio.

Se o variante não for secretado, ele pode ser recuperado de lisados celulares. 5 O variante pode ser detectado usando métodos conhecidos na técnica que são específicos para os variantes.

Estes métodos de detecção incluem, mas sem limitação, o uso de anticorpos específicos, a formação de um produto de enzima, ou o desaparecimento de um substrato de enzima.

Por exemplo, um ensaio de enzima pode ser usado para determinar a atividade do variante.

O variante pode ser recuperado usando métodos conhecidos na técnica.

Por exemplo, o variante pode ser recuperado do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas sem limitação, coleta, centrifugação, filtração, extração, secagem por aspersão, evaporação ou precipitação.

Em um aspecto, todo o caldo de fermentação é recuperado.

O variante pode ser purificado por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, mas sem limitação, cromatografia (por exemplo, de troca iônica, de afinidade, hidrofóbica, focagem isoelétrica e por exclusão de tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação de sulfato de amônio), SDS-PAGE, ou extração (ver, por exemplo, Protein Purification, J.-C.

Janson e Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para obter variantes substancialmente puros.

Composições A presente invenção também diz respeito a composições compreendendo um variante da presente invenção.

Preferivelmente, as composições são enriquecidas em um variante como este.

O termo "enriquecido" indica que a atividade intensificadora celulolítica da composição foi aumentada, por exemplo, com um fator de enriquecimento de pelo menos 1,1. As composições podem compreender um variante da presente invenção como o principal componente enzimático, por exemplo, uma composição mono-componente.

Alternativamente, as composições podem 5 compreender atividades enzimáticas múltiplas, tal como uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptídeo com atividade intensificadora celulolítica, uma hemicelulase, uma esterase, uma expansina, uma lacase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease e uma swolenina.

As composições podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica, e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca.

As composições podem ser estabilizadas de acordo com métodos conhecidos na técnica.

As composições podem ser uma formulação em caldo de fermentação ou uma composição de células da maneira aqui descrita.

Consequentemente, a presente invenção também diz respeito às formulações de caldo de fermentação e composições celulares compreendendo um variante da presente invenção.

Em algumas modalidades, a composição é um caldo completo de células mortas contendo ácido(s) orgânico(s), células mortas e/ou restos celulares, e meio de cultura.

O termo "caldo de fermentação", da maneira aqui usada, refere-se a uma preparação produzida por fermentação celular que se submete à mínima ou nenhuma purificação e/ou recuperação.

Por exemplo, os caldos de fermentação são produzidos quando as culturas microbianas são crescidas em saturação, incubadas em condições de limitação de carbono, para permitir a síntese proteica (por exemplo, expressão de enzimas por células hospedeiras) e secreção em um meio de cultura de células.

O caldo de fermentação pode conter conteúdos não fracionados ou fracionados, a partir dos materiais de fermentação derivados no final da fermentação.

Tipicamente,

o caldo de fermentação é não fracionado e compreende o meio de cultura usado e os restos celulares presentes após as células microbianas (por exemplo, células de fungo filamentoso) serem removidas, por exemplo, por centrifugação.

Em algumas modalidades, o caldo de fermentação contém 5 meio de cultura de célula usado, enzimas extracelulares e células microbianas viáveis e/ou não viáveis.

Em uma modalidade, a formulação do caldo de fermentação e as composições celulares compreendem um primeiro componente de ácido orgânico, compreendendo pelo menos um ácido orgânico de 1-5 carbonos e/ou um sal deste, e um segundo componente de ácido orgânico compreendendo pelo menos um ácido orgânico de 6 ou mais carbonos e/ou um sal deste.

Em uma modalidade específica, o primeiro componente do ácido orgânico é o ácido acético, ácido fórmico, ácido propiônico, um sal deste, ou uma mistura de dois ou mais dos anteriores, e o segundo componente do ácido orgânico é ácido benzóico, ácido cicloexanocarboxílico, ácido 4-metilvalérico, ácido fenilacético, um sal deste, ou uma mistura de dois ou mais dos precedentes.

Em um aspecto, a composição contém ácido(s) orgânico(s) e, opcionalmente, contém células mortas e/ou restos celulares adicionais.

Em uma modalidade, as células mortas e/ou restos celulares são removidos de um caldo completo com células mortas para fornecer uma composição que é livre destes componentes.

As formulações do caldo de fermentação ou composições celulares podem compreender, adicionalmente, um agente conservante e/ou anti-microbiano (por exemplo, bacteriostático), incluindo, mas sem limitação, sorbitol, cloreto de sódio, sorbato de potássio e outros conhecidos na técnica.

O caldo ou composição completa com células mortas podem compreender, adicionalmente, uma ou mais atividades de enzima tais como celobioidrolase, endoglucanase, beta-glicosidase, endo-beta-1,3(4)-glucanase,

glicoidrolase, xiloglucanase, xilanase, xilosidase, arabinofuranosidase, alfa- glicuronidase, acetil xilano esterase, mananase, manosidase, alfa- galactosidase, manana acetil esterase, galactanase, arabinanase, pectato liase, pectinase liase, pectato liase, poligalacturonase, pectina acetil esterase, 5 pectina metil esterase, beta-galactosidase, galactanase, arabinanase, alfa- arabinofuranosidase, ramnogalacturonase, ácido ferrílico esterases ramnogalacturonano liase, ramnogalacturonano acetil esterase, xilogalacturonosidase, xilogalacturonase, ramnogalacturonano liase, lignina peroxidases, peroxidases dependentes de manganês, peroxidases híbridas, peroxidases com propriedades de lignina combinadas e peroxidases dependentes de manganês, glicoamilase, amilase, protease e lacase.

Em algumas modalidades, o caldo ou composição completa de células mortas inclui enzima celulolíticas incluindo, mas sem limitação, (i) endoglucanases (EG) ou 1,4-D-glucan-4-glicanoidrolases (EC 3.2.1.4), (ii) exoglucanases, incluindo 1,4-D-glucan glicanoidrolases (também conhecida como celodextanases) (EC 3.2.1.74) e 1,4-D-glucan celobioidrolases (exo- celobioidrolases, CBH) (EC 3.2.1.91), e (iii) beta-glicosidase (BG) ou beta- glicosídeo glicoidrolases (EC 3.2.1.21). O caldo ou composição completa de células mortas pode conter os conteúdos não fracionados dos materiais de fermentação derivados do final da fermentação.

Tipicamente, o caldo ou composição completa de células mortas contém o meio de cultura usado e os restos celulares presentes após as células microbianas (por exemplo, células de fungo filamentoso) crescerem por saturação, são incubados em condições de limitação de carbono para permitir a síntese proteica (por exemplo, expressão da(s) enzima(s) celulase e/ou glicosidase). Em algumas modalidades, o caldo ou composição completa de células mortas contém o meio de cultura usado, enzimas extracelulares e células mortas de fungo filamentoso.

Em algumas modalidades, as células microbianas presentes no caldo ou composição completa de células mortas podem ser permeabilizadas e/ou lisadas usando métodos conhecidos na técnica.

Uma composição ou caldo completo de células, da maneira aqui descrita, é tipicamente um líquido, mas pode conter componentes insolúveis, tais 5 como células mortas, restos celulares, componentes do meio de cultura, e/ou enzima(s) insolúvel(s). Em algumas modalidades, os componentes insolúveis podem ser removidos para fornecer uma composição líquida límpida.

As formulações em caldo completo e composições celulares da presente invenção podem ser produzidas por um método descrito em WO 90/15861 ou WO 2010/096673. Os exemplos fornecidos a seguir são dos usos preferidos das composições da presente invenção.

A dosagem da composição, e outras condições nas quais a composição é usada, podem ser determinadas com base nos métodos conhecidos na técnica.

Usos A presente invenção também diz respeito aos métodos a seguir, para uso dos variantes ou composições destes.

A presente invenção também diz respeito aos métodos para degradar ou converter um material celulósico, compreendendo: tratar o material celulósico com uma composição enzimática na presença de um variante da presente invenção.

Em um aspecto, os métodos compreendem adicionalmente recuperar o material celulósico degradado ou convertido.

Os produtos de degradação solúveis ou a conversão do material celulósico podem ser separados a partir de material celulósico insolúvel, usando qualquer método bem conhecido na técnica tais como, por exemplo, centrifugação, filtração e/ou estabelecimento da gravidade.

A presente invenção também diz respeito aos métodos para produzir um produto de fermentação, compreendendo: (a) sacarificar um material celulósico com uma composição enzimática na presença de um variante da presente invenção; (b) fermentar o material celulósico sacarificado com um ou mais (por exemplo, vários) microrganismos fermentadores para produzir o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação. 5 A presente invenção também diz respeito aos métodos de fermentar um material celulósico, compreendendo: fermentar o material celulósico com um ou mais (por exemplo, vários) microrganismos fermentadores, em que o material celulósico é sacarificado com uma composição enzimática na presença de um variante da presente invenção.

Em um aspecto, a fermentação do material celulósico produz um produto de fermentação.

Em um outro aspecto, os métodos adicionais compreendem recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

Os métodos da presente invenção podem ser usados para sacarificar o material celulósico em açúcares fermentáveis, e converter os açúcares fermentáveis em muitos produtos de fermentação utilizáveis, por exemplo, combustível, etanol potável e/ou produtos químicos de plataforma (por exemplo, ácidos, álcoois, cetonas, gases e similares). A produção de um produto de fermentação desejado a partir do material celulósico envolve tipicamente o pré-tratamento, hidrólise enzimática (sacarificação) e fermentação.

O processamento de material celulósico, de acordo com a presente invenção, pode ser realizado usando processos convencionais na técnica.

Além do mais, os métodos da presente invenção podem ser implementados usando qualquer aparelho de processamento de biomassa convencional configurado para operar de acordo com a invenção.

A hidrólise (sacarificação) e fermentação, separadas ou simultâneas, incluem, mas sem limitação, hidrólise e fermentação separadas (SHF); sacarificação e fermentação simultânea (SSF); sacarificação e co- fermentação simultânea (SSCF); hidrólise e fermentação híbridas (HHF);

hidrólise e co-fermentação separadas (SHCF); hidrólise e co-fermentação híbridas (HHCF) e conversão microbiana direta (DMC), algumas vezes também denominada bioprocessamento consolidado (CBP). SHF usa etapas de processo separadas para hidrolisar de maneira enzimática primeiro o 5 material celulósico em açúcares fermentáveis, por exemplo, monômeros do tipo glicose, celobiose e pentose, e então fermentar os açúcares fermentáveis em etanol.

Em SSF, a hidrólise enzimática de material celulósico e a fermentação de açúcares em etanol são combinadas em uma etapa (Philippidis, G.

P., 1996, Cellulose bioconversion technology, em Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C.

E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212). SSCF envolve a co-fermentação de múltiplos açúcares (Sheehan, J., e Himmel, M., 1999, Enzymes, energy and the environment: A strategic perspective on the U.S.

Department of Energy’s research and development activities for bioethanol, Biotechnol.

Prog. 15: 817- 827). HHF envolve uma etapa separada de hidrólise e, além disso, um etapa simultânea de sacarificação e hidrólise que pode ser realizada no mesmo reator.

As etapas em um processo de HHF podem ser realizadas em diferentes temperaturas, isto é, sacarificação enzimática em alta temperatura seguida por SSF em uma temperatura menor que a cepa da fermentação possa tolerar.

DMC combina todos os três processos (produção, hidrólise e fermentação enzimática) em uma ou mais (por exemplo, várias) etapas, onde o mesmo organismo é usado para produzir as enzimas para a conversão do material celulósico em açúcares fermentáveis e para converter os açúcares fermentáveis em um produto final (Lynd, L.

R., Weimer, P.

J., van Zyl, W.

H., e Pretorius, I.

S., 2002, Microbial cellulose utilization: Fundamentals and biotechnology, Microbiol.

Mol.

Biol.

Reviews 66: 506-577). Entende-se aqui que qualquer método conhecido na técnica que compreende pré-tratamento, hidrólise enzimática (sacarificação), fermentação, ou uma combinação destes, pode ser usado na prática dos métodos da presente invenção.

Um aparelho convencional pode incluir um reator agitado com lote alimentado, um reator agitado em lotes, um reator agitado de fluxo contínuo com ultrafiltração e/ou um reator de coluna de fluxo em pistão contínuo (Fernanda de Castilhos Corazza, Flávio Faria de Moraes, Gisella 5 Maria Zanin e Ivo Neitzel, 2003, Optimal control in fed-batch reactor for the cellobiose hydrolysis, Acta Scientiarum. Technology 25: 33-38; Gusakov, A. V., e Sinitsyn, A. P., 1985, Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose:

1. A mathematical model for a batch reactor process, Enz. Microb. Technol. 7: 346-352), um reator de atrito (Ryu, S. K., e Lee, J. M., 1983, Bioconversion of waste cellulose using a attrition bioreactor, Biotechnol. Bioeng. 25: 53-65), ou um reator com agitação intensiva induzida por um campo eletromagnético (Gusakov, A. V., Sinitsyn, A. P., Davydkin, I. Y., Davydkin, V. Y., Protas, O. V., 1996, Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field, Appl. Biochem. Biotechnol. 56: 141-153). Os tipos de reatores adicionais incluem: reatores do tipo leito fluidizado, de manta com fluxo ascendente, imobilizado e extrudor para hidrólise e/ou fermentação. Pré-tratamento. Na prática dos métodos da presente invenção, qualquer processo de pré-tratamento conhecido na técnica pode ser usado para romper os componentes das paredes celulares das plantas do material celulósico (Chandra et al., 2007, Substrate pretreatment: The key to effective enzymatic hydrolysis enzimática of lignocellulosics? Adv. Biochem. Engin./Biotechnol. 108: 67-93; Galbe e Zacchi, 2007, Pretreatment of lignocellulosic materials for efficient bioethanol production, Adv. Biochem. Engin. / Biotechnol. 108: 41-65; Hendriks e Zeeman, 2009, Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass, Bioresource Technol. 100: 10-18; Mosier et al., 2005, Features of promising technologies for pretreatment od lignocellulosic biomass, Bioresource Technol. 96: 673-686; Taherzadeh e Karimi, 2008, Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production: A review, Int.

J. de Mol.

Sci. 9: 1621-1651; Yang e Wyman, 2008, Pretreatment: The key to unlocking low-cost cellulosic ethanol, Biofuels Bioproducts nd Biorefining-Biofpr. 2: 26-40). O material celulósico também pode ser submetido a redução 5 de tamanho de partícula, peneiração, pré-enxarcamento, umidificação, lavagem e/ou condicionamento antes do pré-tratamento usando os métodos conhecidos na técnica.

Os pré-tratamentos convencionais incluem, mas sem limitação, pré-tratamento com vapor (com ou sem explosão), pré-tratamento com ácido diluído, pré-tratamento com água quente, pré-tratamento alcalino, pré- tratamento com cal, oxidação úmida, explosão úmida, explosão com fibra de amônia, pré-tratamento com organosolv e pré-tratamento biológico.

Os pré- tratamentos adicionais incluem tratamentos com percolação com amônia, ultrassom, eletroporação, micro-ondas, CO2 supercrítico, H2O supercrítica, ozônio, líquido iônico e irradiação gama.

O material celulósico pode ser pré-tratado antes da hidrólise e/ou fermentação.

O pré-tratamento é preferivelmente realizado antes da hidrólise.

Alternativamente, o pré-tratamento pode ser realizado simultaneamente com hidrólise enzimática para liberar açúcares fermentáveis, tais como glicose, xilose e/ou celobiose.

Em muitos casos a etapa de pré- tratamento resulta ela mesma em alguma conversão de biomassa em açúcares fermentáveis (mesmo na ausência de enzimas). Pré-tratamento com vapor.

No pré-tratamento com vapor, o material celulósico é aquecido para romper os componentes das paredes celulares das plantas, incluindo lignina, hemicelulose e celulose, para tornar a celulose e outras frações, por exemplo, hemicelulose, acessíveis às enzimas.

O material celulósico passa por um vaso de reação onde o vapor é injetado para aumentar a temperatura para a temperatura e a pressão exigidas e é mantido ali pelo tempo de reação desejado.

O pré-tratamento com vapor é preferivelmente realizado a 140-250 °C, por exemplo, 160-200 °C ou 170-190 °C, onde a faixa de temperatura ideal depende da adição de um catalisador químico.

O tempo de permanência para o pré-tratamento com vapor é preferivelmente 1-60 minutos, por exemplo, 1-30 minutos, 1-20 minutos, 3-12 5 minutos ou 4-10 minutos, onde o tempo de permanência ideal depende da faixa de temperatura e da adição de um catalisador químico.

O pré-tratamento com vapor permite carregamentos sólidos relativamente altos, de maneira tal que o material celulósico seja úmido em geral apenas durante o pré- tratamento.

O pré-tratamento com vapor é frequentemente combinado com uma descarga explosiva do material após o pré-tratamento, que é conhecida como explosão de vapor, isto é, queima rápida em pressão atmosférica e fluxo turbulento do material para aumentar a área de superfície acessível por fragmentação (Duff e Murray, 1996, Bioresource Technology 855: 1-33; Galbe e Zacchi, 2002, Appl.

Microbiol.

Biotechnol. 59: 618-628; pedido de patente U.S. 20020164730). Durante o pré-tratamento com vapor, os grupos de acetil hemicelulose são clivados e o ácido resultante autocatalisa a hidrólise parcial da hemicelulose em monossacarídeos e oligossacarídeos.

A lignina é removida em apenas uma extensão limitada.

Pré-tratamento químico: O termo “tratamento químico” refere- se a qualquer pré-tratamento químico que promove a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina.

Um pré-tratamento como este pode converter a celulose cristalina em celulose amorfa.

Exemplos de processo de pré-tratamento químico adequados incluem, por exemplo, pré-tratamento com ácido diluído, pré-tratamento com cal, oxidação úmida, explosão de fibra com amônia/congelamento (AFEX), percolação com amônia (APR) líquido iônico e pré-tratamentos com organosolv.

Um catalisador, tal como H2SO4 ou SO2 (tipicamente 0,3 a 5 % p/p), é em geral adicionado ao pré-tratamento com vapor que diminui o tempo e a temperatura, aumenta a recuperação e melhora a hidrólise enzimática (Ballesteros et al., 2006, Appl.

Biochem.

Biotechnol. 129-132: 496-508; Varga et al., 2004, Appl.

Biochem.

Biotechnol. 113-116: 509-523; Sassner et al., 2006, Enzyme Microb.

Technol. 39: 756-762). No pré- tratamento com ácido diluído, o material celulósico é misturado com o ácido 5 diluído, tipicamente H2SO4, e água para formar uma lama, aquecido por vapor na temperatura desejada, e após um tempo de permanência é queimado em pressão atmosférica.

O pré-tratamento com ácido diluído pode ser realizado com inúmeros projetos de reator, por exemplo, reatores de fluxo em pistão, reatores contra corrente, ou reatores de leito agitado em contra corrente contínua (Duff e Murray, 1996, supra; Schell et al., 2004, Bioresource Technol. 91: 179-188; Lee et al., 1999, Adv.

Biochem.

Eng.

Biotechnol. 65: 93-115). Vários métodos de pré-tratamento em condições alcalinas também podem ser usados.

Estes pré-tratamentos alcalinos incluem, mas sem limitação, hidróxido de sódio, cal, oxidação úmida, percolação com amônia (APR), e explosão de fibra com amônia/congelamento (AFEX). O pré-tratamento com cal é realizado com óxido de cálcio ou hidróxido de cálcio em temperaturas de 85-150 ºC e tempo de permanência de 1 hora a vários dias (Wyman et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 1959- 1966; Mosier et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 673-686). WO 2006/110891, WO 2006/110899, WO 2006/110900, e WO 2006/110901 revelam métodos de pré-tratamento que usa amônia.

A oxidação úmida é um pré-tratamento térmico realizado tipicamente a 180-200 ºC por 5-15 minutos com a adição de um agente oxidante, tal como peróxido de hidrogênio ou super pressão de oxigênio (Schmidt e Thomsen, 1998, Bioresource Technol. 64: 139-151; Palonen et al., 2004, Appl.

Biochem.

Biotechnol. 117: 1-17; Varga et al., 2004, Biotechnol.

Bioeng. 88: 567-574; Martin et al., 2006, J.

Chem.

Technol.

Biotechnol. 81: 1669-1677). O pré-tratamento é realizado preferivelmente em 1-40 % de material seco, por exemplo, 2-30 % de material seco ou 5-20 % de material seco, e frequentemente o pH inicial aumenta pela adição de álcali, tal como carbonato de sódio.

Uma modificação do método de pré-tratamento com oxidação 5 úmida, conhecido como explosão úmida (combinação de explosão de oxidação úmida e vapor), pode manusear material seco até 30 %. Na explosão úmida, o agente oxidante é introduzido durante o pré-tratamento após um certo tempo de permanência.

O pré-tratamento é então finalizado queimando em pressão atmosférica (WO 2006/032282). A explosão de fibra com amônia (AFEX) envolve tratar o material celulósico com amônia líquida ou gasosa em temperaturas moderadas, tal como 90-150 ºC, e alta pressão tal como 17-20 bar por 5-10 minutos, onde o conteúdo do material seco pode ser tão alto quanto 60 % (Gollapalli et al., 2002, Appl.

Biochem.

Biotechnol. 98: 23-35; Chundawat et al., 2007, Biotechnol.

Bioeng. 96: 219-231; Alizadeh et al., 2005, Appl.

Biochem.

Biotechnol. 121: 1133-1141; Teymouri et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 2014-2018). Durante o pré-tratamento com AFEX, a celulose e as hemicelulose permanecem relativamente intactas.

Os complexos de lignina-carboidrato são clivados.

O pré-tratamento com organosolv delignifica o material celulósico por extração usando etanol aquoso (40-60 % etanol) a 160-200 ºC por 30-60 minutos (Pan et al., 2005, Biotechnol.

Bioeng. 90: 473-481; Pan et al., 2006, Biotechnol.

Bioeng. 94: 851-861; Kurabi et al., 2005, Appl.

Biochem.

Biotechnol. 121: 219-230). O ácido sulfúrico é em geral adicionado como um catalizador.

Em pré-tratamento com organosolv, a maioria da hemicelulose e lignina é removida.

Outros exemplos de métodos de pré-tratamento adequados são descritos por Schell et al., 2003, Appl.

Biochem. e Biotechnol.

Vol. 105-108, p. 69-85, e Mosier et al., 2005, Bioresource Technology 96: 673-686, e pedido publicado U.S. 2002/0164730. Em um aspecto, o pré-tratamento químico é preferivelmente realizado como um tratamento com ácido diluído, e mais preferivelmente como um tratamento contínuo com ácido diluído.

O ácido é tipicamente ácido 5 sulfúrico, mas outros ácidos também podem ser usados, tais como ácido acético, ácido cítrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido tartárico, ácido succínico, cloreto de hidrogênio ou misturas destes.

O tratamento com ácido fraco é conduzido na faixa de pH de preferivelmente 1-5, por exemplo, 1-4 ou 1-2,5. Em um aspecto, a concentração do ácido está na faixa de preferivelmente 0,01 a 10 % em peso de ácido, por exemplo, 0,05 a 5 % em peso de ácido ou 0,1 a 2 % em peso de ácido.

O ácido é colocado em contato com o material celulósico e mantido em uma temperatura na faixa de preferivelmente 140-200 ºC, por exemplo, 165-190 ºC, por períodos que variam de 1 a 60 minutos.

Em um outro aspecto, o pré-tratamento ocorre em uma lama aquosa.

Em aspectos preferidos, o material celulósico está presente durante o pré-tratamento em quantidades preferivelmente entre 10-80 % em peso, por exemplo, 20-70 % em peso ou 30-60 % em peso, tal como em torno de 40 % em peso.

O material celulósico pré-tratado pode ser não lavado ou lavado usando qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, lavado com água.

Pré-tratamento mecânico ou pré-tratamento físico: O termo “pré-tratamento mecânico“ ou “pré-tratamento físico” refere-se a qualquer pré-tratamento que promove redução do tamanho das partículas.

Por exemplo, tal pré-tratamento pode envolver vários tipos de trituração ou moagem (por exemplo, moagem a seco, moagem úmida, ou moagem com bola vibratória). O material celulósico pode ser pré-tratado tanto fisicamente (mecanicamente) quanto quimicamente.

O pré-tratamento mecânico ou físico pode ser acoplado com explosão vaporosa/de vapor, hidrotermólise,

tratamento com ácido fraco ou diluído, alta temperatura, tratamento com alta pressão, irradiação (por exemplo, irradiação por micro-ondas), ou combinações destes.

Em um aspecto, a pressão elevada significa pressão na faixa de preferivelmente cerca de 100 a cerca de 400 psi, por exemplo, cerca 5 de 150 a cerca de 250 psi.

Em um outro aspecto, temperatura elevada significa temperaturas na faixa de cerca de 100 a cerca de 300 ºC, por exemplo, cerca de 140 a cerca de 200 ºC.

Em um aspecto preferido, o pré- tratamento mecânico ou físico é realizado em um processo em lotes usando um sistema hidrolisador de arma a vapor que usa alta pressão e alta temperatura da maneira definida anteriormente, por exemplo, um hidrolisador Sunds disponível pela Sunds Defibrator AB, Suécia.

Os pré-tratamentos químicos ou físicos podem ser realizados sequencialmente ou simultaneamente, se desejado.

Dessa maneira, em um aspecto preferido, o material celulósico é submetido ao pré-tratamento físico (mecânico) ou químico, ou qualquer combinação destes, para promover a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina.

Pré-tratamento biológico: O termo “pré-tratamento biológico” refere-se a qualquer pré-tratamento biológico que promove a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina a partir do material celulósico.

As técnicas de pré-tratamento biológico podem envolver aplicar microrganismos e/ou enzimas que solubilizam lignina (ver, por exemplo, Hsu, T.-A., 1996, Pretreatment of biomass, em Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C.

E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212; Ghosh e Singh, 1993, Physicochemical e biological treatments for enzymatic/microbial conversion of cellulosic biomass, Adv.

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D., 1994, Pretreating lignocellulosic biomass: a review, em Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, M.

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eds., ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington, DC, capítulo 15; Gong, C.

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T., 1999, Ethanol production from renewable resources, em Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin 5 Heidelberg, Alamanha, 65: 207-241; Olsson e Hahn-Hagerdal, 1996, Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production, Enz.

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Tech. 18: 312-331; e Vallander e Eriksson, 1990, Production of ethanol from material lignocelullosics: State do art, Adv.

Biochem.

Eng./Biotechnol. 42: 63-95). Sacarificação.

Na etapa da hidrólise, também conhecida como sacarificação, o material celulósico, por exemplo, pré-tratado, é hidrolisado para quebrar a celulose e/ou hemicelulose em açúcares fermentáveis, tais como glicose, celobiose, xilose, xilulose, arabinose, manose, galactose, e/ou oligossacarídeos solúveis.

A hidrólise é realizada enzimaticamente por uma composição enzimática na presença de um variante da presente invenção.

Os componentes das composições podem ser adicionados simultaneamente ou sequencialmente.

A hidrólise enzimática é preferivelmente realizada em um ambiente aquoso adequado, em condições que podem ser facilmente determinada pelos versados na técnica.

Em um aspecto, a hidrólise é realizada em condições adequadas para a atividade dos componentes da enzima, isto é, ideal para os componentes da enzima.

A hidrólise pode ser realizada como um processo contínuo ou de lote alimentado, onde o material celulósico é alimentado gradualmente, por exemplo, a uma enzima contendo solução de hidrólise.

A sacarificação é realizada em geral em reatores ou fermentadores de tanque agitado em condições controladas de pH, temperatura e mistura.

As condições adequadas de tempo de processo, temperatura e pH podem ser facilmente determinadas pelos versados na técnica.

Por exemplo, a sacarificação pode durar até 200 horas, mas é tipicamente realizada por preferivelmente cerca de 12 a cerca de 120 horas, por exemplo, cerca de 16 a cerca de 72 horas ou cerca de 24 a cerca de 48 horas.

A temperatura está na faixa de preferivelmente cerca de 25 °C a cerca 5 de 70 °C, por exemplo, cerca de 30 °C a cerca de 65 °C, cerca de 40 °C a cerca de 60 °C, ou cerca de 50 °C a cerca de 55 °C.

O pH é na faixa de preferivelmente cerca de 3 a cerca de 8, por exemplo, cerca de 3,5 a cerca de 7, cerca de 4 a cerca de 6, ou cerca de 5,0 a cerca de 5,5. O teor de sólidos secos está na faixa de preferivelmente cerca de 5 a cerca de 50 % em peso, por exemplo, cerca de 10 a cerca de 40 % em peso ou cerca de 20 a cerca de 30 % em peso.

As composições de enzima podem compreender qualquer proteína usada na degradação do material celulósico.

Em um aspecto, a composição enzimática compreende ou compreende adicionalmente uma ou mais (por exemplo, várias) proteínas selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptídeo com atividade intensificadora celulolítica, uma hemicelulase, uma esterase, uma expansina, uma lacase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease e uma swolenina.

Em um outro aspecto, a celulase é preferivelmente uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma endoglucanase, uma celobioidrolase e uma beta- glicosidase.

Em um outro aspecto, a hemicelulase é preferivelmente uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma acetilmanana esterase, uma acetilxilano esterase, uma arabinanase, uma arabinofuranosidase, uma ácido coumárico esterase, uma feruloil esterase, uma galactosidase, uma glicuronidase, uma glicuronoil esterase, uma mananase, uma manosidase, uma xilanase e uma xilosidase.

Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma ou mais (por exemplo, várias) enzima celulolíticas.

Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende ou compreende adicionalmente uma ou mais (por exemplo, várias) enzima hemicelulolíticas.

Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma ou mais (por exemplo, várias) enzima celulolíticas e uma ou mais (por exemplo, 5 várias) enzima hemicelulolíticas.

Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas selecionadas do grupo de enzimas celulolíticas e enzimas hemicelulolíticas.

Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma endoglucanase.

Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma celobioidrolase.

Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma beta-glicosidase.

Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende um polipeptídeo com atividade intensificadora celulolítica.

Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma endoglucanase e um polipeptídeo com atividade intensificadora celulolítica.

Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma celobioidrolase e um polipeptídeo com atividade intensificadora celulolítica.

Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma beta- glicosidase e um polipeptídeo com atividade intensificadora celulolítica.

Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma endoglucanase e uma celobioidrolase.

Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma endoglucanase e uma beta-glicosidase.

Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma celobioidrolase e uma beta-glicosidase.

Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma endoglucanase, uma celobioidrolase, e um polipeptídeo com atividade intensificadora celulolítica.

Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma endoglucanase, uma beta-glicosidase, e um polipeptídeo com atividade intensificadora celulolítica.

Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma celobioidrolase, uma beta- glicosidase, e um polipeptídeo com atividade intensificadora celulolítica.

Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma endoglucanase, uma celobioidrolase, e uma beta-glicosidase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma endoglucanase, uma celobioidrolase, uma beta-glicosidase, e um polipeptídeo com atividade 5 intensificadora celulolítica. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma acetilmanana esterase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma acetilxilano esterase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma arabinanase (por exemplo, alfa-L-arabinanase). Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma arabinofuranosidase (por exemplo, alfa-L-arabinofuranosidase). Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma ácido coumárico esterase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma feruloil esterase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma galactosidase (por exemplo, alfa-galactosidase e/ou beta-galactosidase). Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma glicuronidase (por exemplo, alfa-D-glicuronidase). Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma glicuronoil esterase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma mananase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma manosidase (por exemplo, beta- manosidase). Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma xilanase. Em um aspecto preferido, a xilanase é uma xilanase da família

10. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma xilosidase (por exemplo, beta-xilosidase). Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma esterase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma expansina. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma lacase. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma enzima lignolítica. Em um aspecto preferido, a enzima lignolítica é um manganês peroxidase.

Em um outro aspecto preferido, a enzima lignolítica é uma lignina peroxidase.

Em um outro aspecto preferido, a enzima lignolítica é uma enzima produtora de H2O2. Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma pectinase.

Em um outro aspecto, a composição 5 enzimática compreende uma peroxidase.

Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma protease.

Em um outro aspecto, a composição enzimática compreende uma swolenina.

Nos métodos da presente invenção, a(s) enzima(s) pode(m) ser adicionada(s) antes ou durante a sacarificação, sacarificação e fermentação, ou fermentação.

Um ou mais (por exemplo, vários) componentes da composição enzimática podem ser proteínas tipo selvagem, proteínas recombinantes, ou uma combinação de proteínas tipo selvagem e proteínas recombinantes.

Por exemplo, um ou mais (por exemplo, vários) componentes podem ser proteínas naturais de uma célula, que são usadas como uma célula hospedeira para expressar recombinantemente um ou mais (por exemplo, vários) outros componentes da composição enzimática.

Um ou mais (por exemplo, vários) componentes da composição enzimática podem ser produzidos como monocomponentes, que são então combinados para formar a composição enzimática.

A composição enzimática pode ser uma combinação de preparações de proteína multicomponente e monocomponente.

As enzimas usadas nos métodos da presente invenção podem estar em qualquer forma adequada para uso, tal como, por exemplo, uma formulação de caldo de fermentação ou uma composição de células, um lisado celular com ou sem restos celulares, uma preparação de enzima semi- purificada ou purificada, ou uma célula hospedeira como uma fonte das enzimas.

A composição enzimática pode ser um pó ou granulado seco, um granulado que não está em pó, um líquido, um líquido estabilizado, ou uma enzima protegida estabilizada.

As preparações de enzima líquida, por exemplo, podem ser estabilizadas adicionado estabilizadores tal como um açúcar, um álcool de açúcar ou um outro poliol, e/ou ácido lático ou um outro ácido orgânico, de acordo com os processos estabelecidos.

As quantidades ideais das enzimas e um variante da presente 5 invenção dependem de vários fatores incluindo, mas sem limitação, a mistura de componentes de enzimas celulolítica e/ou hemicelulolíticas, o substrato celulósico, a concentração do substrato celulósico, o(s) pré-tratamento(s) do substrato celulósico, temperatura, tempo, pH, e inclusão de organismo fermentador (por exemplo, levedura para sacarificação e fermentação simultânea). Em um aspecto, uma quantidade eficiente de proteína enzimática celulolítica ou hemicelulolítica no material celulósico é cerca de 0,5 a cerca de 50 mg, preferivelmente em cerca de 0,5 a cerca de 40 mg, mais preferivelmente em cerca de 0,5 a cerca de 25 mg, mais preferivelmente em cerca de 0,75 a cerca de 20 mg, mais preferivelmente em cerca de 0,75 a cerca de 15 mg, ainda mais preferivelmente em cerca de 0,5 a cerca de 10 mg, e acima de tudo preferivelmente em cerca de 2,5 a cerca de 10 mg por g de material celulósico.

Em um outro aspecto, uma quantidade eficiente de um variante com atividade intensificadora celulolítica no material celulósico é cerca de 0,01 a cerca de 50,0 mg, preferivelmente cerca de 0,01 a cerca de 40 mg, mais preferivelmente cerca de 0,01 a cerca de 30 mg, mais preferivelmente cerca de 0,01 a cerca de 20 mg, mais preferivelmente cerca de 0,01 a cerca de 10 mg, mais preferivelmente cerca de 0,01 a cerca de 5 mg, mais preferivelmente em cerca de 0,025 a cerca de 1,5 mg, mais preferivelmente em cerca de 0.05 a cerca de 1,25 mg, mais preferivelmente em cerca de 0,075 a cerca de 1,25 mg, mais preferivelmente em cerca de 0,1 a cerca de 1,25 mg, ainda mais preferivelmente em cerca de 0,15 a cerca de 1,25 mg, e acima de tudo preferivelmente em cerca de 0,25 a cerca de 1,0 mg por g de material celulósico.

Em um outro aspecto, uma quantidade eficiente de um variante com atividade intensificadora celulolítica na proteína enzimática celulolítica é cerca de 0,005 a cerca de 1,0 g, preferivelmente em cerca de 0,01 a cerca de 1,0 g, mais preferivelmente em cerca de 0,15 a cerca de 0,75 g, mais 5 preferivelmente em cerca de 0,15 a cerca de 0,5 g, mais preferivelmente em cerca de 0,1 a cerca de 0,5 g, ainda mais preferivelmente em cerca de 0,1 a cerca de 0,5 g, e acima de tudo preferivelmente em cerca de 0,05 a cerca de 0,2 g por g de proteína enzimática celulolítica.

Os polipeptídeos com atividade da enzima celulolítica ou atividade da enzima hemicelulolítica, bem como outras proteínas/polipeptídeos usados na degradação do material celulósico, por exemplo, polipeptídeos GH61 com atividade intensificadora celulolítica (coletivamente daqui por diante “polipeptídeos com atividade enzimática”), podem ser derivados ou obtidos de qualquer origem adequada, incluindo de origem bacteriana, fúngica, levedura, planta ou mamífero.

O termo “obtido” também significa aqui que a enzima pode ter sido produzida recombinantemente em um organismo hospedeiro, empregando métodos aqui descritos, em que a enzima produzida recombinantemente é tanto natural quanto estrangeira ao organismo hospedeiro, ou apresenta uma sequência modificada de aminoácidos, por exemplo, com um ou mais (por exemplo, vários) aminoácidos que são eliminados, inseridos e/ou substituídos, isto é, uma enzima recombinantemente produzida que é um mutante e/ou um fragmento de uma sequência natural de aminoácidos, ou uma enzima produzida por processos de embaralhamento de ácido nucléico conhecidos na técnica.

São incluídos no significado de uma enzima natural os variantes naturais, e no significado de uma enzima estrangeira são os variantes obtidos recombinantemente, tal como por mutagênese sítio-direcionada ou embaralhamento.

Um polipeptídeo com atividade enzimática pode ser um polipeptídeo bacteriano.

Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de bactéria Gram positiva, tal como um polipeptídeo com atividade enzimática de Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridium, 5 Geobacillus, Caldicellulosiruptor, Acidothermus, Thermobifidia, ou Oceanobacillus, ou um polipeptídeo de bactéria Gram negativa tal como um polipeptídeo com atividade enzimática de E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, Ilyobacter Neisseria ou Ureaplasma.

Em um aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo com atividade enzimática de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis ou Bacillus thuringiensis.

Em um outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo com atividade enzimática de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberi, ou Streptococcus equi subsp.

Zooepidemicus.

Em um outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo com atividade enzimática de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus ou Streptomyces lividans.

O polipeptídeo com atividade enzimática também pode ser um polipeptídeo fúngico, e mais preferivelmente um polipeptídeo de levedura tal como um polipeptídeo com atividade enzimática de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia; ou mais preferivelmente um polipeptídeo de fungo filamentoso tal como um polipeptídeo com atividade enzimática de Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium,

Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, 5 Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella ou Xylaria.

Em um aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo com atividade enzimática de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis ou Saccharomyces oviformis.

Em um outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo com atividade enzimática de Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium inops, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia spededonium, Thielavia setosa, Thielavia 5 subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma viride ou Trichophaea saccata.

Os mutantes quimicamente modificados ou modificados por engenharia proteica também podem ser usados.

Um ou mais (vários) componentes da composição de enzima pode ser um componente recombinante, isto é, produzido por clonagem de uma sequência de DNA que codifica o componente único e a subsequente célula transformada com a sequência de DNA e expressa em um hospedeiro (ver, por exemplo, WO 91/17243 e WO 91/17244). O hospedeiro é preferivelmente um hospedeiro heterólogo (a enzima é estrangeira ao hospedeiro), mas o hospedeiro também pode, em certas condições, ser um hospedeiro homólogo (a enzima é natural do hospedeiro). As proteínas celulolíticas monocomponentes também podem ser preparadas purificando uma proteína como esta a partir de um caldo de fermentação.

Em um aspecto, a uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas celulolíticas compreendem uma preparação de enzima celulolítica comercial.

Os exemplos de preparações de enzima celulolítica comercial adequadas para uso na presente invenção incluem, por exemplo, CELLIC® CTec (Novozymes A/S), CELLIC® CTec2 (Novozymes A/S), CELLUCLAST™ (Novozymes A/S), NOVOZYM™ 188 (Novozymes A/S), CELLUZYME™ (Novozymes A/S), CEREFLO™ (Novozymes A/S), e ULTRAFLO™ (Novozymes A/S), ACCELERASE™ (Genencor Int.), LAMINEX™ (Genencor Int.), SPEZYME™ CP (Genencor Int.), FILTRASE® NL (DSM); METHAPLUS® S/L 100 (DSM), ROHAMENT™ 7069 W (Röhm GmbH),

FIBREZYME® LDI (Dyadic International, Inc.), FIBREZYME® LBR (Dyadic International, Inc.), ou VISCOSTAR® 150L (Dyadic International, Inc.). As enzimas celulase são adicionadas em quantidades eficientes de cerca de 0,001 a cerca de 5,0 % em peso de sólidos, por exemplo, cerca de 0,025 a 5 cerca de 4,0 % em peso de sólidos ou cerca de 0,005 a cerca de 2,0 % em peso de sólidos.

Os exemplos de endoglucanases bacterianas que podem ser usadas nos métodos da presente invenção incluem, mas sem limitação, uma endoglucanase de Acidothermus cellulolyticus (WO 91/05039; WO 93/15186; patente U.S. 5.275.944; WO 96/02551; patente U.S. 5.536.655, WO 00/70031, WO 05/093050); endoglucanase III d e Thermobifida fusca (WO 05/093050) e endoglucanase V de Thermobifida fusca (WO 05/093050). Os exemplos de endoglucanases fúngicas que podem ser usadas na presente invenção incluem, mas sem limitação, uma endoglucanase I de Trichoderma reesei (Penttila et al., 1986, Gene 45: 253-263; endoglucanase I de Trichoderma reesei Cel7B; acesso ao GENBANK™ M15665; SEQ ID NO: 4); endoglucanase II de Trichoderma reesei (Saloheimo, et al., 1988, Gene 63:11-22; endoglucanase II de Trichoderma reesei Cel5A; número de acesso ao GENBANK™ M19373; SEQ ID NO: 6); endoglucanase III de Trichoderma reesei (Okada et al., 1988, Appl.

Environ.

Microbiol. 64: 555-563; número de acesso ao GENBANK™ AB003694; SEQ ID NO: 8); endoglucanase V de Trichoderma reesei (Saloheimo et al., 1994, Molecular Microbiology 13: 219-228; número de acesso ao GENBANK™ Z33381; SEQ ID NO: 10); endoglucanase de Aspergillus aculeatus (Ooi et al., 1990, Nucleic Acids Research 18: 5884); endoglucanase de Aspergillus kawachii (Sakamoto et al., 1995, Current Genetics 27: 435-439); endoglucanase de Erwinia carotovara (Saarilahti et al., 1990, Gene 90: 9-14); endoglucanase de Fusarium oxysporuma (número de acesso ao GENBANK™ L29381); endoglucanase de Humicola grisea var. thermoidea

(número de acesso ao GENBANK™ AB003107); endoglucanase de Melanocarpus albomyces (número de acesso ao GENBANK™ MAL515703); endoglucanase de Neurospora crassa (número de acesso ao GENBANK™ XM_324477); endoglucanase V de Humicola insolens (SEQ ID NO: 12); 5 endoglucanase de Myceliophthora thermophila CBS 117.65 (SEQ ID NO: 14); endoglucanase de basidiomiceto CBS 495.95 (SEQ ID NO: 16); endoglucanase de basidiomiceto CBS 494.95 (SEQ ID NO: 18); endoglucanase de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL6B (SEQ ID NO: 20); endoglucanase de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL6C (SEQ ID NO: 22); endoglucanase de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7C (SEQ ID NO: 24); endoglucanase de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7E (SEQ ID NO: 26); endoglucanase de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7F (SEQ ID NO: 28); endoglucanase de Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373 CEL7A (SEQ ID NO: 30) e endoglucanase de cepa de Trichoderma reesei VTT-D-80133 (SEQ ID NO: 32; número de acesso ao GENBANK™ M15665). As endoglucanases de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, e SEQ ID NO: 32, descritas anteriormente são codificadas pela sequência codificante de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, e SEQ ID NO: 31, respectivamente.

Os exemplos de celobioidrolases usadas na presente invenção incluem, mas sem limitação, celobioidrolase I de Trichoderma reesei (SEQ ID NO: 34); celobioidrolase II d e Trichoderma reesei (SEQ ID NO: 36); celobioidrolase I de Humicola insolens (SEQ ID NO: 38); celobioidrolase II de Myceliophthora thermophila (SEQ ID NO: 40 e SEQ ID NO: 42);

celobioidrolase II de Thielavia terrestris (CEL6A) (SEQ ID NO: 44); celobioidrolase I de Chaetomium thermophiluma (SEQ ID NO: 46) e celobioidrolase II de Chaetomium thermophiluma (SEQ ID NO: 48), celobioidrolase I de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 50) e celobioidrolase 5 II de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 52). As celobioidrolases de SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, e SEQ ID NO: 52 descritas anteriormente são codificadas pela sequência codificante de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, e SEQ ID NO: 51, respectivamente.

Os exemplos de beta-glicosidases usadas na presente invenção incluem, mas sem limitação, beta-glicosidase de Aspergillus oryzae (SEQ ID NO: 54); beta-glicosidase de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 56); beta- glicosidase de Penicillium brasilianum IBT 20888 (SEQ ID NO: 58); beta- glicosidase de Aspergillus niger (SEQ ID NO: 60) e beta-glicosidase de Aspergillus aculeatus (SEQ ID NO: 62). As beta-glicosidases de SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, e SEQ ID NO: 61 descritas anteriormente são codificadas pela sequência codificante de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, e SEQ ID NO: 61, respectivamente.

Os exemplos de outras beta-glicosidases usadas na presente invenção incluem uma proteína de fusão variante beta-glicosidase de Aspergillus oryzae de SEQ ID NO: 64 ou a proteína de fusão beta-glicosidase de Aspergillus oryzae de SEQ ID NO: 66. As proteínas de fusão beta- glicosidase de SEQ ID NO: 64 e SEQ ID NO: 66 são codificadas por SEQ ID NO: 63 e SEQ ID NO: 65, respectivamente.

A beta-glicosidase de Aspergillus oryzae pode ser obtida de acordo com WO 2002/095014. A beta-glicosidase de Aspergillus fumigatus pode ser obtida de acordo com WO 2005/047499. A beta-glicosidase de Penicillium brasilianuma pode ser obtida de acordo com WO 2007/019442. A beta-glicosidase de Aspergillus niger pode ser obtida de acordo com Dan et al., 2000, J.

Biol.

Chem. 275: 4973-4980. A beta-glicosidase de Aspergillus 5 aculeatus pode ser obtida de acordo com Kawaguchi et al., 1996, Gene 173: 287-288. Outras endoglucanases, celobioidrolases e beta-glicosidases usadas são reveladas em várias famílias de glicosil hidrolase usando a classificação de acordo com Henrissat B., 1991, A classification of glycosyl hidrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem.

J. 280: 309- 316, e Henrissat B., e Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hidrolases, Biochem.

J. 316: 695-696. Outras enzimas celulolíticas que podem ser usadas na presente invenção são descritas em WO 98/13465, WO 98/015619, WO 98/015633, WO 99/06574, WO 99/10481, WO 99/025847, WO 99/031255, WO 2002/101078, WO 2003/027306, WO 2003/052054, WO 2003/052055, WO 2003/052056, WO 2003/052057, WO 2003/052118, WO 2004/016760, WO 2004/043980, WO 2004/048592, WO 2005/001065, WO 2005/028636, WO 2005/093050, WO 2005/093073, WO 2006/074005, WO 2006/117432, WO 2007/071818, WO 2007/071820, WO 2008/008070, WO 2008/008793, patente U.S. 5.457.046, patente U.S. 5.648.263 e patente U.S. 5.686.593. Em um aspecto, o polipeptídeo com atividade intensificadora celulolítica é usado na presença de um cátion metálico divalente de ativação solúvel de acordo com WO 2008/151043, por exemplo, sulfato de manganês.

Em um outro aspecto, o polipeptídeo com atividade intensificadora celulolítica é usado na presença de um composto dióxi, um composto bicíclico, um composto heterocíclico, um composto contendo nitrogênio, um composto de quinona, um composto contendo enxofre, ou um licor obtido de um material celulósico pré-tratado, tal como palha de milho pré-tratada

(PCS). O composto dióxi pode incluir qualquer composto adequado contendo dois ou mais átomos de oxigênio.

Em alguns aspectos, os compostos dióxi contêm uma fração arila substituída, da maneira aqui descrita.

Os 5 compostos dióxi podem compreender uma ou mais (por exemplo, várias) hidroxilas e/ou derivados de hidroxila, mas também incluem frações arila substituída que não apresentam hidroxila e derivados de hidroxila.

Os exemplos não limitantes dos compostos dióxi incluem pirocatecol ou catecol; ácido caféico; ácido 3,4-diidroxibenzóico; 4-terc-butil-5-metóxi-1,2- benzenodiol; pirogalol; ácido gálico; metil-3,4,5-triidroxibenzoato; 2,3,4- triidroxibenzofenona; 2,6-dimetoxifenol; ácido sinapínico; ácido 3,5- diidroxibenzóico; 4-cloro-1,2-benzenodiol; 4-nitro-1,2-benzenodiol; ácido tânico; galato de etila; metil glicolato; ácido diidroxifumárico; 2-butino-1,4- diol; (ácido crocônico; 1,3-propanodiol; ácido tartárico; 2,4-pentanodiol; 3- etióxi-1,2-propanodiol; 2,4,4’-triidroxibenzofenona; cis-2-buteno-1,4-diol; 3,4-diidróxi-3-ciclobuteno-1,2-diona; diidroxiacetono; acroleína acetal; metil- 4-hidroxibenzoato; ácido 4-hidroxibenzóico e metil-3,5-dimetoxi-4- hidroxibenzoato, ou um sal ou solvato destes.

O composto bicíclico pode incluir qualquer sistema de anel fundido substituído adequado, da maneira aqui descrita.

Os compostos podem compreender um ou mais (por exemplo, vários) anéis adicionais, e não são limitados a um número específico de anéis, a menos que de outra forma declarada.

Em um aspecto, o composto bicíclico é um flavonóide.

Em um outro aspecto, o composto bicíclico é um isoflavonóide opcionalmente substituído.

Em um outro aspecto, o composto bicíclico é um íon flavílio opcionalmente substituído, tal como uma antocianidina opcionalmente substituída ou antocianina opcionalmente substituída, ou derivados destes.

Os exemplos não limitantes dos compostos bicíclicos incluem epicatequina; quercetina; miricetina; taxifolina; caempferol; morina; acacetina; naringenina;

isoramnetina; apigenina; cianidina; cianina; curomanina; ceracianina ou um sal ou solvato destes.

O composto heterocíclico pode ser qualquer composto adequado, tal como um anel aromático ou não aromático opcionalmente 5 substituído compreendendo um heteroátomo, da maneira aqui descrita.

Em um aspecto, o heterocíclico é um composto compreendendo uma fração heterocicloalquila opcionalmente substituída, ou uma fração heteroarila opcionalmente substituída.

Em um outro aspecto, a fração de heterocicloalquila opcionalmente substituída, ou fração heteroarila opcionalmente substituída, é uma heterocicloalquila de 5 elementos opcionalmente substituída ou uma fração de heteroarila de 5 elementos opcionalmente substituída.

Em um outro aspecto, a heterocicloalquila opcionalmente substituída ou fração heteroarila opcionalmente substituída é uma fração opcionalmente substituída selecionada de pirazolila, furanila, imidazolila, isoxazolila, oxadiazolila, oxazolila, pirrolila, piridila, pirimidila, piridazinila, tiazolila, triazolila, tienila, diidrotieno-pirazolila, tianaftenila, carbazolila, benzimidazolila, benzotienila, benzofuranila, indolila, quinolinila, benzotriazolila, benzotiazolila, benzooxazolila, benzimidazolila, isoquinolinila, isoindolila, acridinila, benzoisazolila, dimetilidantoína, pirazinila, tetraidrofuranila, pirrolinila, pirrolidinila, morpholinila, indolila, diazepinila, azepinila, tiepinila, piperidinila, e oxepinila.

Em um outro aspecto, a fração de heterocicloalquila opcionalmente substituída, ou fração heteroarila opcionalmente substituída é uma furanila opcionalmente substituída.

Exemplos não limitantes dos compostos heterocíclicos incluem (1,2-diidroxietil)-3,4-diidroxifuran-2(5H)-ona; 4-hidróxi-5-metil-3-furanona; 5-hidróxi-2(5H)-furanona; [1,2-diidroxietil]furan-2,3,4(5H)-triona; α-hidróxi- γ-butirolactona; ribônico γ-lactona; ácido aldoexurônico γ-lactona; ácido glucônico δ-lactona; 4-hidroxicoumarina; diidrobenzofurano; 5- (hidroximetil)furfural; furoína; 2(5H)-furanona; 5,6-diidro-2H-piran-2-ona; e

5,6-diidro-4-hidróxi-6-metil-2H-piran-2-ona; ou um sal ou solvato destes.

O composto contendo nitrogênio pode ser qualquer composto adequado com um ou mais átomos de nitrogênio.

Em um aspecto, o composto contendo nitrogênio compreende uma amina, imina, hidroxilamina ou fração 5 de nitróxido.

Os exemplos não limitantes dos compostos contendo nitrogênio incluem acetona oxima; ácido violúrico; piridina-2-aldoxima; 2-aminofenol; 1,2-benzenodiamina; 2,2,6,6-tetrametil-1-piperidinilóxi; 5,6,7,8- tetraidrobiopterina; 6,7-dimetil-5,6,7,8-tetraidropterina e ácido maleâmico; ou um sal ou solvato destes.

O composto de quinona pode ser qualquer composto adequado que compreende uma fração de quinona da maneira aqui descrita.

Exemplos não limitantes dos compostos de quinona incluem 1,4-benzoquinona; 1,4- naftoquinona; 2-hidróxi-1,4-naftoquinona; 2,3-dimetoxi-5-metil-1,4- benzoquinona ou coenzima Q0; 2,3,5,6-tetrametil-1,4-benzoquinona ou duroquinona; 1,4-diidroxiantraquinona; 3-hidróxi-1-metil-5,6-indolinediona ou adrenocromo; 4-terc-butil-5-metóxi-1,2-benzoquinona; pirroloquinolina quinona; ou um sal ou solvato destes.

O composto contendo enxofre pode ser qualquer suitable composto compreendendo um ou mais átomos de enxofre.

Em um aspecto, o composto contendo enxofre compreende uma fração selecionada de tionila, tioéter, sulfinila, sulfonila, sulfamida, sulfonamida, ácido sulfônico, e éster sulfônico.

Os exemplos não limitantes dos compostos contendo enxofre incluem etanotiol; 2-propanotiol; 2-propeno-1-tiol; 2-ácido mercaptoetanossulfônico; benzenotiol; benzeno-1,2-ditiol; cisteína; metionina; glutationa; cistina; ou um sal ou solvato destes.

Em um aspecto, uma quantidade eficiente de um composto como este descrito anteriormente para o material celulósico como uma razão molar em unidades de glucosila de celulose é cerca de 10-6 a cerca de 10, por exemplo, cerca de 10-6 a cerca de 7,5, cerca de 10-6 a cerca de 5, cerca de 10-6 a cerca de 2.5, cerca de 10-6 a cerca de 1, cerca de 10-5 a cerca de 1, cerca de 10-5 a cerca de 10-1, cerca de 10-4 a cerca de 10-1, cerca de 10-3 a cerca de 10-1, ou cerca de 10-3 a cerca de 10-2. Em um outro aspecto, uma quantidade eficiente de um composto como este descrito anteriormente é cerca de 0,1 M 5 a cerca de 1 M, por exemplo, cerca de 0,5 M a cerca de 0,75 M, cerca de 0,75 M a cerca de 0,5 M, cerca de 1 M a cerca de 0,25 M, cerca de 1 M a cerca de 0,1 M, cerca de 5 M a cerca de 50 mM, cerca de 10 M a cerca de 25 mM, cerca de 50 M a cerca de 25 mM, cerca de 10 M a cerca de 10 mM, cerca de 5 M a cerca de 5 mM, ou cerca de 0,1 mM a cerca de 1 mM.

O termo “licor” significa a fase da solução, tanto aquosa, orgânica, quanto uma combinação destas, que surge a partir do tratamento de um material com lignocelulose e/ou hemicelulose em uma lama, ou monossacarídeos destes, por exemplo, xilose, arabinose, manose, etc., em condições da maneira aqui descrita, e os conteúdos solúveis destes.

Um licor para melhoria celulolítica de um polipeptídeo GH61 pode ser produzido tratando um material com lignocelulose ou hemicelulose (ou matéria prima), aplicando calor e/ou pressão, opcionalmente na presença de um catalisador, por exemplo, ácido, opcionalmente na presença de um solvente orgânico, e opcionalmente em combinação com interrupção física do material, e a seguir separando a solução dos sólidos residuais.

Tais condições determinam o grau de melhoria celulolítica, obtido por meio da combinação de licor e um polipeptídeo GH61, durante a hidrólise de um substrato celulósico por uma preparação de celulase.

O licor pode ser separado do material tratado usando um método padrão na técnica, tal como filtração, sedimentação ou centrifugação.

Em um aspecto, uma quantidade eficiente do licor para celulose é cerca de 10-6 a cerca de 10 g por g de celulose, por exemplo, cerca de 10-6 a cerca de 7,5 g, cerca de 10-6 a cerca de 5, cerca de 10-6 a cerca de 2.5 g, cerca de 10-6 a cerca de 1 g, cerca de 10-5 a cerca de 1 g, cerca de 10-5 a cerca de 10-1 g, cerca de 10-4 a cerca de 10-1 g, cerca de 10-3 a cerca de 10-1 g, ou cerca de 10-3 a cerca de 10-2 g por g de celulose.

Em um aspecto, a uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas hemicelulolíticas compreendem uma preparação de enzima hemicelulolítica 5 comercial.

Os exemplos de preparações comerciais de enzima hemicelulolítica adequadas para uso na presente invenção incluem, por exemplo, SHEARZYME™ (Novozymes A/S), CELLIC® HTec (Novozymes A/S), CELLIC® HTec2 (Novozymes A/S), VISCOZYME® (Novozymes A/S), ULTRAFLO® (Novozymes A/S), PULPZYME® HC (Novozymes A/S), MULTIFECT® Xilanase (Genencor), ACCELLERASE® XY (Genencor), ACCELLERASE® XC (Genencor), ECOPULP® TX-200A (AB Enzimas), HSP 6000 Xilanase (DSM), DEPOL™ 333P (Biocatalysts Limit, Wales, UK), DEPOL™ 740L. (Biocatalysts Limit, Wales, UK), e DEPOL™ 762P (Biocatalysts Limit, Wales, UK). Os exemplos de xilanases usadas nos métodos da presente invenção incluem, mas sem limitação, xilanases de Aspergillus aculeatus (GeneSeqP:AAR63790; WO 94/21785), Aspergillus fumigatus (WO 2006/078256; xil 3 SEQ ID NO: 67 [sequência de DNA] e SEQ ID NO: 68 [sequência deduzida de aminoácidos]), Penicillium pinophilum (WO 2011/041405), Penicillium sp. (WO 2010/126772), Thielavia terrestris NRRL 8126 (WO 2009/079210), e Trichophaea saccata GH10 (WO 2011/057083). Os exemplos de beta-xilosidases usadas nos métodos da presente invenção incluem, mas sem limitação, beta-xilosidase de Trichoderma reesei (número de acesso UniProtKB/TrEMBL Q92458; SEQ ID NO: 69 [sequência de DNA] e SEQ ID NO: 70 [sequência deduzida de aminoácidos]), Talaromyces emersonii (número de acesso SwissProt Q8X212), e Neurospora crassa (número de acesso SwissProt Q7SOW4). Os exemplos de acetilxilano esterases usados nos métodos da presente invenção incluem, mas sem limitação, acetilxilano esterases de

Aspergillus aculeatus (WO 2010/108918), Chaetomium globosum (número de acesso Uniprot Q2GWX4), Chaetomium gracile (número de acesso GeneSeqP AAB82124), Humicola insolens DSM 1800 (WO 2009/073709), Hypocrea jecorina (WO 2005/001036), Myceliophtera thermophila (WO 5 2010/014880), Neurospora crassa (UniProt accession número q7s259), Phaeosphaeria nodorum (número de acesso Uniprot Q0UHJ1), e Thielavia terrestris NRRL 8126 (WO 2009/042846). Os exemplos de feruloil esterases (ácido ferúlico esterases) usadas nos métodos da presente invenção incluem, mas sem limitação, feruloil esterases de Humicola insolens DSM 1800 (WO 2009/076122), Neosartorya fischeri (número de acesso UniProt A1D9T4), Neurospora crassa (número de acesso UniProt Q9HGR3), Penicillium aurantiogriseum (WO 2009/127729), e Thielavia terrestris (WO 2010/053838 e WO 2010/065448). Os exemplos de arabinofuranosidases usadas nos métodos da presente invenção incluem, mas sem limitação, arabinofuranosidases de Aspergillus niger (número de acesso GeneSeqP AAR94170), Humicola insolens DSM 1800 (WO 2006/114094 e WO 2009/073383), e M. giganteus (WO 2006/114094). Os exemplos de alfa-glicuronidases usadas nos métodos da presente invenção incluem, mas sem limitação, alfa-glicuronidases de Aspergillus clavatus (número de acesso UniProt alcc12), Aspergillus fumigatus (número de acesso SwissProt Q4WW45), Aspergillus niger (número de acesso Uniprot Q96WX9), Aspergillus terreus (número de acesso SwissProt Q0CJP9), Humicola insolens (WO 2010/014706), Penicillium aurantiogriseum (WO 2009/068565), Talaromyces emersonii (número de acesso UniProt Q8X211), e Trichoderma reesei (número de acesso Uniprot Q99024). Os polipeptídeos com atividade enzimática, usados nos métodos da presente invenção, podem ser produzidos por fermentação das cepas microbianas citadas anteriormente em um meio nutriente contendo fontes adequadas de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Bennett, J.W. e LaSure, L. (eds.), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 5 1991). Os meios adequados são disponíveis a partir de fornecedores comerciais, ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (por exemplo, em catálogos do American Type Culture Collection). As faixas de temperatura e outras condições adequadas para crescimento e produção de enzima são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Bailey, J.E., e Ollis, D.F., Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill Book Company, NY, 1986). A fermentação pode ser qualquer método de cultivo de uma célula que resulta na expressão ou isolamento de uma enzima ou proteína.

Portanto, a fermentação pode ser entendida como aquela que compreende cultivo em frasco de agitação, ou fermentação em pequena ou grande escala (incluindo fermentações contínuas, em lotes, em lote alimentado ou em estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industrial, realizada em um meio adequado e em condições que permitem que a enzima seja expressa ou isolada.

As enzimas resultantes produzidas pelos métodos descritos anteriormente podem ser recuperadas a partir do meio de fermentação e purificadas por procedimentos convencionais.

Fermentação.

Os açúcares fermentáveis obtidos do material celulósico hidrolisado podem ser fermentados por um ou mais (por exemplo, vários) microrganismos fermentadores capazes de fermentar os açúcares direta ou indiretamente em um produto de fermentação desejado. “Fermentação” ou “processo de fermentação” refere-se a qualquer processo de fermentação ou qualquer processo que compreende uma etapa de fermentação.

Processos de fermentação também incluem processos de fermentação usados na indústria de consumo de álcool (por exemplo, cerveja e vinho), indústria de panificação (por exemplo, produtos de panificação fermentados), indústria de couro e indústria do tabaco.

As condições de fermentação dependem do produto de fermentação desejado e do organismo fermentador, e podem ser facilmente determinadas pelos versados na técnica. 5 Na etapa de fermentação, os açúcares, liberados do material celulósico como um resultado das etapas de pré-tratamento e hidrólise enzimática e, são fermentados em um produto, por exemplo, etanol, por um organismo fermentador, tal como levedura.

A hidrólise (sacarificação) e fermentação podem ser separadas ou simultâneas, da maneira descrita aqui.

Qualquer material celulósico hidrolisado adequado pode ser usado na etapa de fermentação na prática da presente invenção.

O material é em geral selecionado com base no produto de fermentação desejado, isto é, a substância a ser obtida da fermentação, e no processo empregado, da maneira bem conhecida na técnica.

Entende-se aqui que o termo “meio de fermentação” refere-se a um meio antes do(s) microrganismo(s) fermentador(s) ser(m) adicionado(s), tal como um meio que resulta de um processo de sacarificação, bem como um meio usado em um processo de sacarificação e fermentação simultânea (SSF). “Microrganismo fermentador” refere-se a qualquer microrganismo, incluindo organismos bacterianos e fúngicos, adequados para uso em um processo de fermentação desejado para produzir um produto de fermentação.

O organismo fermentador pode ser organismos fermentadores de hexose e/ou pentose, ou uma combinação destes.

Tanto os organismos fermentadores de hexose quanto de pentose são bem conhecidos na técnica.

Os microrganismos fermentadores adequados são capazes de fermentar, isto é, convertes, açúcares, tais como glicose, xilose, xilulose, arabinose, maltose, manose, galactose e/ou oligossacarídeos, direta ou indiretamente no produto de fermentação desejado.

Exemplos de organismos fermentadores bacterianos e fúngicos que produzem etanol são descritos por Lin et al., 2006, Appl.

Microbiol.

Biotechnol. 69: 627-642. Exemplos de microrganismos fermentadores que podem fermentar os açúcares hexose incluem organismos bacterianos e fúngicos, tal 5 como levedura.

As leveduras preferidas incluem cepas de Candida, Kluyveromyces e Saccharomyces, por exemplo, Candida sonorensis, Kluyveromyces marxianus e Saccharomyces cerevisiae.

Exemplos de organismos fermentadores que podem fermentar os açúcares pentose em seu estado natural incluem organismos bacterianos e fúngicos, tais como algumas leveduras.

As leveduras fermentadoras de xilose preferidas incluem cepas de Candida, preferivelmente C. sheatae ou C. sonorensis; e cepas de Pichia, preferivelmente P. stipitis, tal como P. stipitis CBS 5773. As leveduras fermentadoras de pentose preferidas incluem cepas de Pachysolen, preferivelmente P. tannophilus.

Organismos que não são capazes de fermentar açúcares pentose, tais como xilose e arabinose, podem ser geneticamente modificados para realizar isto por métodos conhecidos na técnica.

Exemplos de bactérias que podem fermentar eficientemente hexose e pentose em etanol incluem, por exemplo, Bacillus coagulans, Clostridium acetobutilicum, Clostridium thermocellum, Clostridium phytofermentans, Geobacillus sp., Thermoanaerobacter saccharolyticum e Zymomonas mobilis (Philippidis, 1996, supra). Outros organismos fermentadores incluem cepas de Bacillus, tal como Bacillus coagulans; Candida, tais como C. sonorensis, C. methanosorbosa, C. diddensiae, C. parapsilosis, C. naedodendra, C. blankii, C. entomophilia, C. brassicae, C. pseudotropicalis, C. boidinii, C. utilis e C. scehatae; Clostridium, tais como C. acetobutilicum, C. thermocellum e C. phytofermentans; E. coli, especialmente cepas de E. coli que foram geneticamente modificadas para melhorar o rendimento do etanol;

Geobacillus sp.; Hansenula, tal como Hansenula anomala; Klebsiella, tal como K. oxytoca; Kluyveromyces, tal como K. marxianus, K. lactis, K. thermotolerans e K. fragilis; Schizosaccharomyces, tal como S. pombe; Thermoanaerobacter, tal como Thermoanaerobacter saccharolyticum e 5 Zymomonas, tal como Zymomonas mobilis.

Em um aspecto preferido, a levedura é uma Bretannomyces.

Em um aspecto mais preferido, a levedura é Bretannomyces clausenii.

Em um outro aspecto preferido, a levedura é uma Candida.

Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida sonorensis.

Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida boidinii.

Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida blankii.

Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida brassicae.

Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida diddensii.

Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida entomophiliia.

Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida pseudotropicalis.

Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida scehatae.

Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida utilis.

Em um outro aspecto preferido, a levedura é uma Clavispora.

Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Clavispora lusitaniae.

Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Clavispora opuntiae.

Em um outro aspecto preferido, a levedura é uma Kluyveromyces.

Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Kluyveromyces fragilis.

Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Kluyveromyces marxianus.

Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Kluyveromyces thermotolerans.

Em um outro aspecto preferido, a levedura é uma Pachysolen.

Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Pachysolen tannophilus.

Em um outro aspecto preferido, a levedura é uma Pichia.

Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é uma Pichia stipitis.

Em um outro aspecto preferido, a levedura é uma Saccharomyces spp.

Em um aspecto mais preferido, a levedura é Saccharomyces cerevisiae.

Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é

Saccharomyces distaticus.

Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Saccharomyces uvarum.

Em um aspecto preferido, a bactéria é um Bacillus.

Em um aspecto mais preferido, a bactéria é Bacillus coagulans.

Em um outro aspecto 5 preferido, a bactéria é um Clostridium.

Em um outro aspecto mais preferido, a bactéria é Clostridium acetobutilicum.

Em um outro aspecto mais preferido, a bactéria é Clostridium phytofermentans.

Em um outro aspecto mais preferido, a bactéria é Clostridium thermocellum.

Em um outro aspecto mais preferido, a bactéria é Geobacilus sp.

Em um outro aspecto mais preferido, a bactéria é um Thermoanaerobacter.

Em um outro aspecto mais preferido, a bactéria é Thermoanaerobacter saccharolyticum.

Em um outro aspecto preferido, a bactéria é uma Zymomonas.

Em um outro aspecto mais preferido, a bactéria é Zymomonas mobilis.

As leveduras comercialmente disponíveis e adequadas para a produção de etanol incluem, por exemplo, BIOFERM™ AFT e XR (NABC - North American Bioproducts Corporation, GA, USA), levedura ETANOL RED (Fermentis/Lesaffre, USA), FALI™ (Fleischmann’s Yeast, USA), FERMIOL™ (DSM Specialties), GERT STRAND™ (Gert Strand AB, Suécia), e levedura fresca SUPERSTART™ e THERMOSACC™ (Ethanol Technology, WI, USA). Em um aspecto preferido, o microrganismo fermentador foi geneticamente modificado para fornecer a capacidade de fermentar açúcares pentose, tais como microrganismos que utilizam xilose, que utilizam arabinose, e que co-utilizam xilose e arabinose.

A clonagem de genes heterólogos em vários microrganismos fermentadores levou à construção de organismos capazes de converter hexoses e pentoses em etanol (co-fermentação) (Chen e Ho, 1993, Cloning and improving the expression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae, Appl.

Biochem.

Biotechnol. 39-40: 135-147; Ho et al., 1998, Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose, Appl.

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Microbiol. 64: 1852-1859; Kotter e Ciriacy, 1993, Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae, Appl.

Microbiol.

Biotechnol. 38: 776-783; Walfridsson et al., 1995, Xylose- 5 metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing the TKL1 and TAL1 genes encoding the pentose fosfato pathway enzymes transketolase and transaldolase, Appl.

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Microbiol. 61: 4184-4190; Kuyper et al., 2004, Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation: a proof of principle, FEMS Yeast Research 4: 655-664; Beall et al., 1991, Parametric studies of ethanol production from xylose and other sugars by recombinant Escherichia coli, Biotech.

Bioeng. 38: 296-303; Ingram et al., 1998, Metabolic engineering of bacteria for ethanol production, Biotechnol.

Bioeng. 58: 204-214; Zhang et al., 1995, Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis, Science 267: 240-243; Deanda et al., 1996, Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering, Appl.

Environ.

Microbiol. 62: 4465-4470; WO 2003/062430, xilose isomerase). Em um aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Candida sonorensis.

Em um outro aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Escherichia coli.

Em um outro aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Klebsiella oxytoca.

Em um outro aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Kluyveromyces marxianus.

Em um outro aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Saccharomyces cerevisiae.

Em um outro aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Zymomonas mobilis.

É bem conhecido na técnica que os organismos descritos anteriormente também podem ser usados para produzir outras substâncias, da maneira aqui descrita.

O microrganismo fermentador é tipicamente adicionado ao material celulósico degradado ou hidrolisado, e a fermentação é realizada por 5 cerca de 8 a cerca de 96 horas, por exemplo, cerca de 24 a cerca de 60 horas.

A temperatura é tipicamente entre cerca de 26 °C a cerca de 60 °C, por exemplo, cerca de 32 °C ou 50 ºC, e cerca de pH 3 a cerca de pH 8, por exemplo, pH 4-5, 6, ou 7. Em um aspecto, a levedura e/ou um outro microrganismo são aplicados ao material celulósico degradado, e a fermentação é realizada por cerca de 12 a cerca de 96 horas, tal como tipicamente 24-60 horas.

Em um outro aspecto, a temperatura é preferivelmente entre cerca de 20 ºC a cerca de 60 ºC, por exemplo, cerca de 25 ºC a cerca de 50 ºC, cerca de 32 ºC a cerca de 50 ºC, ou cerca de 32 ºC a cerca de 50 ºC, e o pH é em geral cerca de pH 3 a cerca de pH 7, por exemplo, cerca de pH 4 a cerca de pH 7. Entretanto, alguns organismos fermentadores, por exemplo, bactérias, apresentam temperatura de fermentação ideal mais elevada.

A levedura ou um outro microrganismo é preferivelmente aplicado em quantidades de aproximadamente 105 a 1012, de maneira preferível em aproximadamente 107 a 1010, de maneira essencial aproximadamente contagens de 2 x 108 células viáveis por mL de caldo de fermentação.

Diretriz adicional com relação ao uso de levedura para a fermentação pode ser encontrada em, por exemplo, “The Alcohol Textbook” (Editors K.

Jacques, T.P.

Lyons e D.R.

Kelsall, Nottingham University Press, Reino Unido 1999), que é aqui incorporado pela referência.

Para a produção de etanol, após a fermentação, a lama fermentada é destilada para extrair o etanol.

O etanol obtido de acordo com os métodos da invenção pode ser usado, por exemplo, como combustível etanol, etanol para bebidas, isto é, espíritos neutros potáveis ou etanol industrial.

Um estimulador de fermentação pode ser usado em combinação com qualquer dos métodos aqui descritos para melhorar adicionalmente o processo de fermentação e, em particular, o desempenho do microrganismo fermentador, tal como, melhoria da taxa e rendimento de etanol.

Um “estimulador de fermentação” refere-se aos estimuladores para 5 crescimento dos microrganismos fermentadores, em particular, leveduras.

Os estimuladores de fermentação preferíveis para crescimento incluem vitaminas e minerais.

Exemplos de vitaminas incluem multivitaminas, biotina, pantotenato, ácido nicotínico, meso-inositol, tiamina, piridoxina, ácido para- aminobenzóico, ácido fólico, riboflavina e vitaminas A, B, C, D, e E.

Ver, por exemplo, Alfenore et al., Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process, Springer-Verlag (2002), que é aqui incorporado pela referência.

Exemplos de minerais incluem minerais e sais minerais que podem suprir nutrientes que compreendem P, K, Mg, S, Ca, Fe, Zn, Mn e Cu.

Produtos de fermentação: Um produto de fermentação pode ser qualquer substância derivada a partir da fermentação.

O produto de fermentação pode ser, sem limitação, um álcool (por exemplo, arabinitol, n- butanol, isobutanol, etanol, glicerol, metanol, etileno glicol, 1,3-propanodiol [propileno glicol], butanodiol, glicerina, sorbitol e xilitol); um alcano (por exemplo, pentano, hexano, heptano, octano, nonano, decano, undecano, e dodecano), um cicloalcano (por exemplo, ciclopentano, cicloexano, cicloeptano e ciclooctano), um alceno (por exemplo penteno, hexeno, hepteno e octeno); um aminoácido (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico, glicina, lisina, serina e treonina); um gás (por exemplo, metano, hidrogênio (H2), dióxido de carbono (CO2) e monóxido de carbono (CO)); isopreno; uma cetona (por exemplo, acetona); um ácido orgânico (por exemplo, ácido acético, ácido acetônico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido 2,5-diceto-D-glucônico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glucárico, ácido glucônico, ácido glucurônico, ácido glutárico, ácido 3-hidroxipropiônico,

ácido itacônico, ácido lático, ácido málico, ácido malônico, ácido oxálico, ácido oxaloacético, ácido propiônico, ácido succínico e ácido xilônico) e policetídeo.

O produto de fermentação também pode ser proteína como um produto de alto valor. 5 Em um aspecto preferido, o produto de fermentação é um álcool.

Será bem entendido que o termo “álcool” inclui uma substância que contém uma ou mais frações hidroxila.

Em um aspecto mais preferido, o álcool é n-butanol.

Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é isobutanol.

Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é etanol.

Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é metanol.

Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é arabinitol.

Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é butanodiol.

Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é etileno glicol.

Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é glicerina.

Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é glicerol.

Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é 1,3-propanodiol.

Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é sorbitol.

Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é xilitol.

Ver, por exemplo, Gong, C.

S., Cao, N.

J., Du, J., e Tsao, G.

T., 1999, Ethanol production from renewable resources, em Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Alemanha, 65: 207-241; Silveira, M.

M., e Jonas, R., 2002, The biotechnological production of sorbitol, Appl.

Microbiol.

Biotechnol. 59: 400- 408; Nigam, P., e Singh, D., 1995, Processs for fermentative production of xilitol – a sugar substitute, Process Biochemistry 30 (2): 117-124; Ezeji, T.

C., Qureshi, N. e Blaschek, H.

P., 2003, Production of acetone, butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BA101 e in situ recovery by gas stripping, World Journal of Microbiology and Biotechnology 19 (6): 595-603. Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um alcano.

O alcano pode ser um alcano não ramificado ou ramificado.

Em um outro aspecto mais preferido, o alcano é pentano.

Em um outro aspecto mais preferido, o alcano é hexano.

Em um outro aspecto mais preferido, o alcano é heptano.

Em um outro aspecto mais preferido, o alcano é octano.

Em um outro aspecto mais preferido, o alcano é nonano.

Em um outro aspecto mais preferido, o alcano é decano.

Em um outro aspecto mais preferido, o 5 alcano é undecano.

Em um outro aspecto mais preferido, o alcano é dodecano.

Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um cicloalcano.

Em um outro aspecto mais preferido, o cicloalcano é ciclopentano.

Em um outro aspecto mais preferido, o cicloalcano é cicloexano.

Em um outro aspecto mais preferido, o cicloalcano é cicloeptano.

Em um outro aspecto mais preferido, o cicloalcano é cicloctano.

Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um alceno.

O alceno pode ser um alceno não ramificado ou ramificado.

Em um outro aspecto mais preferido, o alceno é penteno.

Em um outro aspecto mais preferido, o alceno é hexeno.

Em um outro aspecto mais preferido, o alceno é hepteno.

Em um outro aspecto mais preferido, o alceno é octeno.

Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um aminoácido.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido aspártico.

Em um outro aspecto mais preferido, o aminoácido é ácido glutâmico.

Em um outro aspecto mais preferido, o aminoácido é glicina.

Em um outro aspecto mais preferido, o aminoácido é lisina.

Em um outro aspecto mais preferido, o aminoácido é serina.

Em um outro aspecto mais preferido, o aminoácido é treonina.

Ver, por exemplo, Richard, A., e Margaritis, A., 2004, Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poly(glutamic acid) production e other microbial biopolymers, Biotechnology and Bioengineering 87 (4): 501-515. Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um gás.

Em um outro aspecto mais preferido, o gás é metano.

Em um outro aspecto mais preferido, o gás é H2. Em um outro aspecto mais preferido, o gás é CO2. Em um outro aspecto mais preferido, o gás é CO.

Ver, por exemplo,

Kataoka, N., A.

Miya, e K.

Kiriyama, 1997, Studies on hidrogen production by continuous culture system of hidrogen-producing anaerobic bacteria, Water Science and Technology 36 (6-7): 41-47; e Gunaseelan V.N. em Biomassa and Bioenergy, Vol. 13 (1-2), pp. 83-114, 1997, Anaerobic 5 digestion of biomass for metano production: A review.

Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é isopreno.

Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é uma cetona.

Será bem entendido que o termo “cetona” inclui uma substância que contém uma ou mais frações de cetona.

Em um outro aspecto mais preferido, a cetona é acetona.

Ver, por exemplo, Qureshi e Blaschek, 2003, supra.

Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um ácido orgânico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido acético.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido acetônico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido adípico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido ascórbico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido cítrico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido 2,5- diceto-D-glucônico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido fórmico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido fumárico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido glucárico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido glucônico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido glucurônico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido glutárico.

Em um outro aspecto preferido, o ácido orgânico é ácido 3- hidroxipropiônico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido itacônico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido lático.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido málico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido malônico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido oxálico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido propiônico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido 5 succínico.

Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido xilônico.

Ver, por exemplo, Chen, R., e Lee, Y.

Y., 1997, Membrane- mediated extractive fermentation for lactic acid production from cellulosic biomass, Appl.

Biochem.

Biotechnol. 63-65: 435-448. Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é policetídeo.

Recuperação.

O(s) produto(s) de fermentação pode(m) ser opcionalmente recuperado(s) do meio de fermentação usando qualquer método conhecido na técnica incluindo, mas sem limitação, cromatografia, procedimentos eletroforéticos, solubilidade diferencial, destilação ou extração.

Por exemplo, o álcool é separado do material celulósico fermentado e purificado por métodos convencionais de destilação.

O etanol com uma pureza de até cerca de 96 vol. % pode ser obtido, o qual pode ser usado, por exemplo, como combustível etanol, etanol para bebidas, isto é, espíritos neutros potáveis ou etanol industrial.

Composições detergentes Os polipeptídeos variantes com atividade intensificadora celulolítica da presente invenção pode ser adicionados, e assim se tornarem um componente de uma composição detergente.

A composição detergente da presente invenção pode ser formulada, por exemplo, como uma composição detergente de lavar roupas a mão ou na máquina, incluindo uma composição adicional para lavar roupas adequada para pré-tratamento de tecidos corados e uma composição amaciante de tecido adicionado à lavagem, ou ser formulada como uma composição detergente para uso em operações de limpeza geral de superfície doméstica dura, ou ser formulada para operações de lavar louças na mão ou na máquina. Em um aspecto específico, a presente invenção fornece um aditivo de detergente compreendendo um polipeptídeo variante da invenção. 5 O aditivo de detergente, bem como a composição detergente, pode compreender uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas, tais como uma protease, lipase, cutinase, uma amilase, carboidrase, celulase, pectinase, mananase, arabinase, galactanase, xilanase, oxidase, por exemplo, uma lacase e/ou peroxidase. Em geral, as propriedades da(s) enzima(s) selecionada(s) pode(m) ser compatível(s) com o detergente selecionado, (isto é, pH-ideal, compatibilidade com outros ingredientes enzimáticos e não-enzimáticos, etc.), e a(s) enzima(s) pode(m) estar presente(s) em quantidades eficientes. Celulases: As celulases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica. Os mutantes quimicamente modificados ou modificados por engenharia proteica são incluídos. As celulases adequadas incluem as celulases dos gêneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por exemplo, as celulases fúngicas produzidas a partir de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila e Fusarium oxysporum, reveladas em U.S. 4.435.307, U.S. 5.648.263, U.S.

5.691.178, U.S. 5.776.757 e WO 89/09259. As celulases especialmente adequadas são as celulases alcalinas ou neutras, com benefícios de cuidado com a cor. Exemplos de tais celulases são as celulases descritas em EP 0 495 257, EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Outros exemplos são os variantes de celulase, tais como aqueles descritos em WO 94/07998, EP 0 531 315, U.S.

5.457.046, U.S. 5.686.593, U.S. 5.763.254, WO 95/24471, WO 98/12307 e PCT/DK98/00299. As celulases comercialmente disponíveis incluem

CELLUZYME, e CAREZYME (Novozymes A/S), CLAZINASE, e PURADAX HA (Genencor International Inc.), e KAC-500(B) (Kao Corporation). Proteases: As proteases adequadas incluem aquelas de origem 5 de animal, vegetal ou microbiana.

A origem microbiana é preferida.

Os mutantes quimicamente modificados ou modificados por engenharia proteica são incluídos.

A protease pode ser uma serina protease ou uma metaloprotease, preferivelmente uma protease microbiana alcalina ou uma protease do tipo tripsina.

Exemplos de proteases alcalinas são subtilisinas, especialmente aquelas derivadas de Bacillus, por exemplo, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 e subtilisina 168 (descrita em WO 89/06279). Os exemplos de proteases do tipo tripsina são tripsina (por exemplo, de origem porcina ou bovina) e a protease de Fusarium descrita em WO 89/06270 e WO 94/25583. Os exemplos de proteases usadas são os variantes descritos em WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116, e WO 98/34946, especialmente os variantes com substituições em um ou mais das seguintes posições: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 e 274. As enzimas protease comercialmente disponível preferidas incluem ALCALASE, SAVINASE, PRIMASE, DURALASE, ESPERASE, e KANNASE (Novozymes A/S), MAXATASE, MAXACAL, MAXAPEM, PROPERASE, PURAFECT, PURAFECT OXP, FN2, e FN3 (Genencor International Inc.). Lipases: As lipases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica.

Os mutantes quimicamente modificados ou modificados por engenharia proteica são incluídos.

Exemplos de lipases utilizáveis incluem lipases de Humicola (sinônimo Thermomyces), por exemplo, de H. lanuginosa (T. lanuginosus), da maneira descrita em EP 258 068 e EP 305 216, ou de H. insolens, da maneira descrita em WO 96/13580,

uma lipase de Pseudomonas, por exemplo, de P. alcaligenes ou P. pseudoalcaligenes (EP 218 272), P. cepacia (EP 331 376), P. stutzeri (GB

1.372.034), P. fluorescens, Pseudomonas sp. cepa SD 705 (WO 95/06720 e WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), uma lipase de Bacillus, 5 por exemplo, de B. subtilis (Dartois et al., 1993, Biochemica et Biophysica Acta, 1131: 253-360), B. stearothermophilus (JP 64/744992) ou B. pumilus (WO 91/16422). Outros exemplos são variantes de lipase, tais como aqueles descritos em WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 e WO 97/07202. As enzimas lipase comercialmente disponíveis preferidas incluem LIPOLASETM e LIPOLASE ULTRATM (Novozymes A/S). Amilases: As amilases adequadas (α e/ou β) incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica. Os mutantes quimicamente modificados ou modificados por engenharia proteica são incluídos. As amilases incluem, por exemplo, α-amilases obtidas de Bacillus, por exemplo, uma cepa especial de Bacillus licheniformis, descrita em mais detalhes em GB 1.296.839. Os exemplos de amilases usadas são os variantes descritos em WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873, e WO 97/43424, especialmente os variantes com substituições em uma ou mais das seguintes posições: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408 e 444. As amilases comercialmente disponíveis são DURAMILTM, TERMAMILTM, FUNGAMILTM e BANTM (Novozymes A/S), RAPIDASETM e PURASTARTM (da Genencor International Inc.). Peroxidases/Oxidases: As peroxidases/oxidases adequadas incluem aquelas de origem vegetal, bacteriana ou fúngica. Os mutantes quimicamente modificados ou modificados por engenharia proteica são incluídos. Os exemplos de peroxidases usadas incluem peroxidases de Coprinus, por exemplo, de C. cinereus e variantes destas, como aquelas descritas em WO 93/24618, WO 95/10602, e WO 98/15257. As peroxidases comercialmente disponíveis incluem 5 GUARDZYME (Novozymes A/S). A(s) enzima(s) detergente(s) pode(m) ser incluída(s) em uma composição detergente adicionando aditivos separados, contendo uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas, ou adicionando um aditivo combinado compreendendo todas estas enzimas. Um aditivo de detergente da invenção, isto é, um aditivo separado ou um aditivo combinado, pode ser formulado, por exemplo, como um granulado, líquido, lama, etc. As formulações de aditivo de detergente preferidas são granulados, em particular granulados sem formação de pó, líquidos, em particular líquidos estabilizados, ou lamas. Os granulados não formadores de pó podem ser produzidos, por exemplo, da maneira revelada em U.S. 4.106.991 e 4.661.452, e podem ser revestidos opcionalmente por métodos conhecidos na técnica. Os exemplos de materiais de revestimento ceroso são produtos de óxido de poli(etileno) (polietilenoglicol, PEG) com pesos molares médios de 1.000 a

20.000; nonilfenóis etoxilados com 16 a 50 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos etoxilados, em que o álcool contém de 12 a 20 átomos de carbono e em que existem 15 a 80 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos; ácidos graxos e mono, di e triglicerídeos de ácidos graxos. Os exemplos de materiais de revestimento formadores de filme, adequados para aplicação por técnicas de leito fluido, são fornecidos em GB 1483591. As preparações líquidas de enzima, por exemplo, podem ser estabilizadas adicionando um poliol, tal como propileno glicol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido lático ou ácido bórico, de acordo com os métodos estabelecidos. As enzimas protegidas podem ser preparadas de acordo com o método revelado em EP 238.216.

A composição detergente da invenção pode estar em qualquer forma conveniente, por exemplo, uma barra, um comprimido, um pó, um grânulo, uma pasta ou um líquido.

Um detergente líquido pode ser aquoso, tipicamente contendo até 70 % de água e 0-30 % de solvente orgânico, ou não aquoso. 5 A composição detergente compreende um ou mais (por exemplo, vários) agentes tensoativos, que podem ser não iônicos, incluindo semi-polar, e/ou aniônico, e/ou catiônico, e/ou zwiteriônico.

Os agentes tensoativos estão tipicamente presentes em um nível de 0,1 % a 60 % em peso.

Quando incluído aqui, o detergente conterá em geral de cerca de 1 % a cerca de 40 % de um agente tensoativo aniônico, tal como alquilbenzenossulfonato linear, alfa-olefinossulfonato, sulfato de alquila (sulfato de álcool graxo), álcool etóxi sulfato, alcanossulfonato secundário, metil éster do ácido graxo alfa-sulfo, ácido alquil ou alcenilsuccínico, ou sabão.

Quando aqui incluído, o detergente conterá em geral de cerca de 0,2 % a cerca de 40 % de um agente tensoativo não iônico, tal como álcool etoxilato, nonilfenol etoxilado, alquilpoliglicosídeo, alquildimetilaminóxido, monoetanolamida de ácido graxo etoxilado, monoetanolamida de ácido graxo, amida de ácido graxo poli-hidroxi alquila, ou derivados de N-acila N-alquila de glicosamina de (“glicamidas”). O detergente pode conter 0-65 % de um constituinte detergente ou agente de complexação, tal como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácido etilenodiaminotetracético, ácido dietilenotriaminepentacético, ácido alquil ou alcenil succínico, silicatos solúveis, ou silicatos em camadas (por exemplo, SKS-6 da Hoechst). O detergente pode compreender um ou mais (por exemplo, várias) polímeros.

Os exemplos são carboximetilcelulose, poli(vinilpirrolidona), poli (etileno glicol), álcool poli(vinílico), poli(vinilpiridina-N-óxido), poli(vinilimidazol), policarboxilatos tais como poliacrilatos, copolímeros de ácido maléico/acrílico, e copolímeros de lauril metacrilato/ácido acrílico.

O detergente pode conter um sistema de branqueamento que pode compreender uma fonte de H2O2, tal como perborato ou percarbonato, 5 que pode ser combinado com um ativador de branqueamento que forma perácido, tal como tetraacetiletilenodiamina ou nonanoiloxibenzenossulfonato.

Alternativamente, o sistema de branqueamento pode compreender peroxiácidos, por exemplo, do tipo amida, imida ou sulfona.

A(s) enzima(s) da composição detergente da invenção pode(m) ser estabilizada(s) usando agentes de estabilização convencionais, por exemplo, um poliol tal como propileno glicol ou glicerol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido lático, ácido bórico, ou um derivado de ácido bórico, por exemplo, um éster borato aromático, ou um derivado de ácido fenil borônico, tal como ácido 4-formilfenil borônico, e a composição pode ser formulada da maneira descrita em, por exemplo, WO 92/19709 e WO 92/19708. O detergente também pode conter outros ingredientes de detergente convencionais tais como, por exemplo, condicionadores de tecido, incluindo argilas, formadores de espuma, supressores da formação de bolhas, agentes anti-corrosivos, agentes de suspensão no solo, agentes anti- redeposição no solo, corantes, bactericidas, branqueadores óticos, hidrótropos, inibidores de mancha ou perfumes.

Nas composições de detergente, qualquer enzima pode ser adicionada em uma quantidade que corresponde a 0,01-100 mg de proteína enzimática por litro de licor de lavagem, preferivelmente 0,05-5 mg de proteína enzimática por litro de licor de lavagem, em particular 0,1-1 mg de proteína enzimática por litro de licor de lavagem.

Nas composições de detergente, um polipeptídeo variante da presente invenção com atividade intensificadora celulolítica pode ser adicionado em uma quantidade que corresponde a 0,001-100 mg de proteína, preferivelmente 0,005-50 mg de proteína, mais preferivelmente 0,01-25 mg de proteína, ainda mais preferivelmente 0,05-10 mg de proteína, acima de tudo preferivelmente 0,05-5 mg de proteína, e ainda acima de tudo 5 preferivelmente 0,01-1 mg de proteína por litro de licor de lavagem.

Um polipeptídeo variante da presente invenção com atividade intensificadora celulolítica também pode ser incorporado nas formulações de detergente reveladas em WO 97/07202, que é aqui incorporado pela referência.

Plantas A presente invenção também diz respeito às plantas, por exemplo, uma planta transgênica, parte da planta ou célula da planta, que compreendem um polinucleotídeo da presente invenção, de maneira a expressar e produzir o variante em quantidades recuperáveis.

O variante pode ser recuperado da planta ou parte da planta.

Alternativamente, a planta ou parte da planta que contém o variante pode ser usada como tal para melhorar a qualidade de um alimento ou ração, por exemplo, melhor valor nutricional, palatabilidade e propriedades reológicas, ou destruir um fator anti-nutritivo.

A planta transgênica pode ser dicotiledônea (uma planta dicotiledônea) ou monocotiledônea (uma planta monocotiledônea). Os exemplos de plantas monocotiledôneas são gramíneas, tais como erva de febra (grama azul, Poa), grama forrageira tal como Festuca, Lolium, gramíneas temperadas, tais como Agrostis e cereais, por exemplo, trigo, aveias, centeio, cevada, arroz, sorgo e milho (grão de milho). Exemplos de plantas dicotiledôneas são tabaco, legumes, tais como tremoços, batata, beterraba, ervilha, feijão e soja, e plantas crucíferas (família Brassicaceae) tais como couve flor, canola e o organismo modelo mais relacionado Arabidopsis thaliana.

Exemplos de partes da planta são caule, calo, folhas, raiz, frutas, sementes e tubérculos, bem como os tecidos individuais que compreendem estas partes, por exemplo, epiderme, mesófilo, parênquima, tecidos vasculares, meristemas.

Os compartimentos celulares específicos da planta, tais como cloroplastos, apoplastos, mitocôndria, vacúolos, peroxissomos e citoplasma também são considerados uma parte da planta. 5 Além do mais, qualquer célula da planta, qualquer que seja a origem do tecido, é considerada como uma parte da planta.

De fato, partes da planta, tais como tecidos e células, específicas isoladas para facilitar a utilização da invenção são também consideradas partes da planta, por exemplo, embriões, endospermas, aleurona e revestimentos de semente.

São também incluídas no escopo da presente invenção são a progênie de tais plantas, partes da planta e células da planta.

A planta transgênica ou célula da planta que expressa um variante pode ser construída de acordo com métodos conhecidos na técnica.

Em resumo, a planta ou célula da planta é construída incorporando um ou mais (por exemplo, vários) construtos de expressão que codificam o variante no genoma da planta hospedeira ou no genoma do cloroplasto, e propagando a planta ou célula da planta modificada resultante em uma planta transgênica ou célula da planta.

O construto de expressão é convenientemente um construto de ácido nucléico compreendendo um polinucleotídeo que codifica um variante operavelmente ligado às regulatórias apropriadas, exigidas para a expressão do polinucleotídeo na planta ou parte da planta de escolha.

Além do mais, o construto de expressão pode compreender um marcador selecionável usado para identificar as células vegetais, nas quais o construto de expressão foi integrado e as sequências de DNA são necessárias para a introdução do construto na planta em questão (a última depende do método de introdução de DNA a ser usado). A escolha de sequências regulatórias, tais como sequências promotoras e finalizadoras, e opcionalmente sequências sinal ou de trânsito, é determinada, por exemplo, co base em quando, onde, e como deseja-se que o variante seja expresso.

Por exemplo, a expressão do gene que codifica um variante pode ser constitutiva ou indutível, ou pode ser específica para o desenvolvimento, estágio ou tecido, e o produto do gene pode ser alvejado em 5 um tecido específico ou parte da planta, tais como sementes ou folhas.

As sequência regulatórias são, por exemplo, descritas por Tague et al., 1988, Plant Physiol. 86: 506. Para a expressão constitutiva, o 35S-CaMV, o promotor de ubiquitina 1 do milho e de actina 1 de arroz podem ser usados (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294; Christensen et al., 1992, Plant Mol.

Biol. 18: 675- 689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Os promotores específicos de órgãos podem ser, por exemplo, um promotor de tecidos reservatórios de armazenamento tais como sementes, tubérculos de batata e frutas (Edwards e Coruzzi, 1990, Ann.

Rev.

Genet. 24: 275-303), ou de tecidos reservatórios metabólicos tais como meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol.

Biol. 24: 863- 878), um promotor específico de semente tal como o promotor de glutelina, prolamina, globulina ou albumina de arroz (Wu et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 885-889), um promotor de Vicia faba da legumina B4 e o gene de proteína de semente desconhecido de Vicia faba (Conrad et al., 1998, J.

Plant Physiol. 152: 708-711), um promotor de uma proteína de corpo oleoso de semente (Chen et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 935-941), o promotor de armazenamento proteico napA de Brassica napus, ou qualquer outro promotor específico de semente conhecido na técnica, por exemplo, da maneira descrita em WO 91/14772. Além do mais, o promotor pode ser um promotor específico de folha, tal como o promotor rbcs de arroz ou tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiol. 102: 991-1000), o promotor do gene de adenina metiltransferase do vírus da Chlorella (Mitra e Higgins, 1994, Plant Mol.

Biol. 26: 85-93), o promotor do gene aldP de arroz (Kagaya et al., 1995, Mol.

Gen.

Genet. 248: 668-674), ou um promotor indutível de ferida, tal como o promotor pin2 de batata (Xu et al., 1993, Plant Mol.

Biol. 22: 573-588). Da mesma forma, o promotor pode ser induzido por tratamentos abióticos, tal coma temperatura, aridez ou alterações na salinidade, ou induzido por substâncias aplicadas exogenamente que ativam o promotor, por exemplo, 5 etanol, estrogênio, hormônios de planta tais como etileno, ácido abscísico e ácido giberélico, e metais pesados.

Um elemento melhorador de promotor também pode ser usado para atingir maior expressão de um variante na planta.

Por exemplo, o elemento melhorador de promotor pode ser um intron que é colocado entre o promotor e o polinucleotídeo que codifica um variante.

Por exemplo, Xu et al., 1993, supra, revelam o uso do primeiro intron do gene de actina 1 de arroz para melhorar a expressão.

O gene marcador selecionável e quaisquer outras partes do construto de expressão podem ser escolhidos a partir daqueles disponíveis na técnica.

O construto de ácido nucléico é incorporado no genoma da planta de acordo com técnicas convencionais conhecidas na tecnologia, incluindo transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por vírus, microinjeção, bombardeamento de partícula, transformação biolística e eletroporação (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274). Atualmente, a transferência de gene mediada por Agrobacterium tumefaciens é o método de escolha para gerar dicotiledôneas transgênicas (para uma revisão, ver Hooykas e Schilperoort, 1992, Plant Mol.

Biol. 19: 15-38), e também pode ser usada para transformar monocotiledôneas, embora outros métodos de transformação sejam frequentemente usados para estas plantas.

Atualmente, o método de escolha para gerar monocotiledôneas transgênicas é o bombardeamento de partícula (partículas microscópicas de ouro ou tungstênio revestidas com o DNA transformante) de calos embrionários ou embriões em desenvolvimento (Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Curr.

Opin.

Biotechnol. 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Um método alternativo para a transformação de monocotiledôneas baseia-se na 5 transformação de protoplasto, da maneira descrita por Omirulleh et al., 1993, Plant Mol.

Biol. 21: 415-428. Os métodos adicionais de transformação para uso de acordo com a presente revelação incluem aqueles descritos nas patentes U.S. 6.395.966 e 7.151.204 (ambas as quas são aqui incorporadas na íntegra pela referência). Após a transformação, os transformantes que incorporaram o construto de expressão são selecionados e regenerados nas plantas completas, de acordo com os métodos bem conhecidos na tecnologia.

Frequentemente, o procedimento da transformação é determinado para a eliminação seletiva de genes de seleção tanto durante a regeneração quanto nas gerações seguintes usando, por exemplo, co-transformação com dois construtos de DNA-T separados ou excisão específica de sítio do gene de seleção por uma recombinase específica.

Além da transformação direta de um genótipo de planta particular com um construto preparado de acordo com a presente invenção, as plantas transgênicas podem ser preparadas cruzando uma planta com o construto e uma segunda planta que não apresenta o construto.

Por exemplo, um construto que codifica um variante pode ser introduzido em uma variedade particular de planta por cruzamento, sem a necessidade de sempre transformar diretamente uma planta daquela variedade fornecida.

Portanto, a presente invenção inclui não apenas uma planta regenerada diretamente a partir das células que foram transformadas de acordo com a presente invenção, mas também da progênie de tais plantas.

Da maneira aqui usada, progênie pode se referir aos descendentes de qualquer geração de uma planta parental preparada de acordo com a presente invenção.

Tal progênie pode incluir um construto de DNA preparado de acordo com a presente invenção, ou uma porção de um construto de DNA preparada de acordo com a presente invenção.

O cruzamento resulta na introdução de um transgene em uma linhagem de planta por polinização cruzada de uma linhagem inicial com uma 5 linhagem de planta doadora.

Exemplos não limitantes de tais etapas são articulados adicionalmente na patente U.S. 7.151.204. As plantas podem ser geradas por meio de um processo de conversão por retrocruzamento.

Por exemplo, as plantas incluem plantas referidas como um genótipo convertido por retrocruzamento, linhagem natural ou híbrido.

Os marcadores genéticos podem ser usados para auxiliar na introgressão de um ou mais transgenes da invenção, a partir de uma base genética em uma outra.

A seleção auxiliada por marcador oferece vantagens com relação ao cultivo convencional, em que este pode ser usado para evitar erros causados por variações fenotípicas.

Adicionalmente, os marcadores genéticos podem fornecer dados com relação ao grau relativo de germoplasma de elite na progênie individual de um cruzamento particular.

Por exemplo, quando uma planta com uma característica desejada, que apresenta de outra forma uma base genética não agronomicamente desejável, é cruzada com uma elite parental, os marcadores genéticos podem ser usados para selecionar a progênie que não possui apenas a característica de interesse, mas também apresenta uma proporção relativamente grande do germoplasma desejado.

Desta maneira, o número de gerações exigido na introgressão de um ou mais características em uma base genética particular é minimizada.

A presente invenção também diz respeito aos métodos de produzir um variante da presente invenção compreendendo: (a) cultivar uma planta transgênica, ou uma célula de planta compreendendo um polinucleotídeo que codifica o variante, em condições que condizem a produção do variante; e (b) recuperar o variante.

A presente invenção é descrita adicionalmente pelos exemplos a seguir, que não devem ser interpretados como limitantes do escopo da invenção.

Exemplos Meios 5 As placas YT 2X foram compostas de 10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de cloreto de sódio, 15 g de Bacto ágar, e água deionizada para 1 litro.

As placas de PDA foram compostas de 39 g de ágar dextrose de batata e água deionizada para 1 litro.

O meio MDU2BP foi composto de 45 g de maltose, 1 g de MgSO4·7H2O, 1 g de NaCl, 2 g de K2HSO4, 12 g de KH2PO4, 2 g de ureia, 500 µL de solução de metais traço AMG, e água deionizada para 1 litro; o pH foi ajustado para 5,0, e a seguir foi esterilizado com uma unidade de filtração de 0,22 µm.

A solução de metais traço AMG foi composta de 14,3 g de ZnSO4·7H2O, 2,5 g de CuSO4·5H2O, 0,5 g de NiCl2·6H2O, 13,8 g de FeSO4·H2O, 8,5 g de MnSO4·7H2O, 3 g de ácido cítrico, e água deionizada para 1 litro.

O meio M410 foi composto de 50 g de maltose, 50 g de glicose, 2 g de MgSO4·7H2O, 2 g de KH2PO4, 4 g de pó de ácido cítrico anidro, 8 g de extrato de levedura, 2 g de ureia, 0,5 g de solução de metais traço AMG, 0,5 g de CaCl2, e água deionizada para 1 litro (pH 6,0). O meio LB foi composto de 10 g de Bacto-triptona. 5 g de extrato de levedura, 10 g de cloreto de sódio, e água deionizada para 1 litro.

As placas de LB foram compostas de 10 g de Bacto-triptona. 5 g de extrato de levedura, 10 g de cloreto de sódio, 15 g de Bacto-ágar, e água deionizada para 1 litro.

O meio YPG foi composto de 4 g de extrato de levedura, 1 g de K2HPO4, 0,5 g de MgSO4, 15,0 g de glicose, e água deionizada para 1 litro

(pH 6,0). O meio YPM foi composto de 1 % de extrato de levedura, 2 % de peptona, e 2 % de maltodextrina.

As placas de ágar SC foram compostas de 20 g de ágar por 5 litro de meio SC-URA.

O meio SC-URA com galactose foi composto de 100 mL de sais basais 10X, 25 mL de casaminoácidos sem vitaminas a 20 %, 10 mL de triptofano a 1 %, 4 mL de treonina a 5 % (esterilizada por filtração, adicionada após autoclavação), e 100 mL de glicose a 20 % ou 100 mL de galactose a 20 % (esterilizada por filtração, adicionada após autoclavação), e água deionizada para 1 litro.

A solução de sais basais 10X foi composta de 75 g de base de nitrogênio para leveduras, 113 g de ácido succínico, 68 g de NaOH, e água deionizada para 1 litro.

O meio YP foi composto de 10 g de extrato de levedura, 20 g de Bacto peptona, e água deionizada para 1 litro.

A solução de sal COVE foi composta de 26 g de KCl, 26 g de MgSO4·7H2O, 76 g de KH2PO4, 50 mL de solução de metais traço COVE, e água deionizada para 1 litro.

A solução de metais traço COVE foi composta de 0,04 g de NaB4O7·10H2O, 0,4 g de CuSO4·5H2O, 1,2 g de FeSO4·7H2O, 0,7 g de MnSO4 H2O, 0,8 g de Na2MoO2·2H2O, 10 g de ZnSO4·7H2O, e água deionizada para 1 litro.

As placas de COVE foram compostas de 342,3 g de sacarose, 20 mL de solução de sal COVE, 10 mL de acetamida 1 M, 10 mL de CsCl 1,5 M, 25 g de ágar nobre (Difco), e água deionizada para 1 litro.

As placas de COVE2 foram compostas de 30 g de sacarose, 20 mL de solução de sal COVE, 10 mL de acetamida 1 M, 25 g de ágar nobre (Difco), e água deionizada para 1 litro.

A solução de metais traço para Trichoderma foi composta de 216 g de FeCl3 6H2O, 58 g de ZnSO4 7H2O, 27 g de MnSO4 H2O, 10 g de CuSO4 5H2O, 2,4 g de H3BO3, 336 g de ácido cítrico, e água deionizada para 1 litro. 5 O meio CIM foi composto de 20 g de celulose, 10 g de sólidos de milho, 1,45 g de (NH4)2SO4, 2,08 g de KH2PO4, 0,28 g de CaCl2, 0,42 g de MgSO4 7H2O, 0,42 mL de solução de metais traço para Trichoderma, 1-2 gotas de anti-espuma, e água deionizada para 1 litro; pH ajustado para 6,0. Exemplo 1: Preparação de polipeptídeo GH61B de Aspergillus fumigatus com atividade intensificadora celulolítica Uma pesquisa tblastn (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402) da sequência do genoma parcial de A. fumigatus (The Institute for Genomic Research, Rockville, MD, USA) foi realizada usando como entrada vários polipeptídeos GH61 conhecidos, incluindo o polipeptídeo GH61A de Thermoascus aurantiacus (número de acesso ao GeneSeqP AEC05922). Vários genes foram identificados como prováveis homólogos da família GH61, com base em um grau elevado de similaridade com as sequências de entrada no nível do aminoácido.

Uma região genômica de aproximadamente 850 bp, com mais de 70 % de identidade de sequência com a sequência de polipeptídeos de Thermoascus aurantiacus GH61A no nível do aminoácido, foi escolhida para estudo adicional.

A. fumigatus NN051616 foi crescida e coletada da maneira descrita na patente U.S. 7.244.605. Os micélios congelados foram moídos, por almofariz e pilão, em um pó fino e o DNA genômico foi isolado usando um estojo DNEASY® Plant Maxi (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA) de acordo com as instruções do fabricante.

Os dois oligonucleotídeos iniciadores sintéticos mostrados a seguir foram determinados para amplificar por PCR o gene do polipeptídeo da família GH61B de A. fumigatus a partir do DNA genômico.

Um estojo de clonagem IN-FUSION® (BD Biosciences, Palo Alto, CA, USA) foi usado para clonar o fragmento diretamente no vetor de expressão pAlLo2 (WO 2004/099228), sem a necessidade de digestão por restrição e ligação.

Oligonucleotídeo iniciador sentido: 5 5’-ACTGGATTTACCATGACTTTGTCCAAGATCACTTCCA-3' (SEQ ID NO: 71) Oligonucleotídeo iniciador reverso: 5’-TCACCTCTAGTTAATTAAGCGTTGAACAGTGCAGGACCAG-3’ (SEQ ID NO: 72) As letras em negrito representam a sequência codificante.

A sequência que permanece é homóloga aos sítios de inserção de pAlLo2. Cinquenta picomols de cada um dos oligonucleotídeos iniciadores anteriores foram usados em uma reação de PCR composta de 204 ng de DNA genômico de A. fumigatus, tampão de amplificação Pfx 1X (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA), 1,5 µL de uma mistura 10 mM de dATP, dTTP, dGTP, e dCTP, 2,5 unidades de DNA polimerase Pfx PLATINUM® (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA), e 1 µL de MgSO4 50 mM em um volume final de 50 µL.

A amplificação foi realizada usando um EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333 epgradient S (Eppendorf Scientific, Inc., Westbury, NY, USA), programado para 1 ciclo a 94 °C por 3 minutos; e 30 ciclos cada a 94 °C por 30 segundos, 56 °C por 30 segundos, e 72 °C por 1 minuto.

O bloco aquecido foi então mantido a 72 °C por 15 minutos, seguido por um ciclo de absorção a 4 °C.

Os produtos de reação foram isolados por eletroforese em gel de agarose a 1,0 %, usando tampão Tris base 40 mM - acetato de sódio 20 mM – EDTA dissódico 1 mM (TAE), onde uma banda do produto de aproximadamente 850 bp foi cortada do gel e purificada usando um estojo de extração em gel um MINELUTE® (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA), de acordo com as instruções do fabricante.

O fragmento foi então clonado em pAlLo2 usando um estojo de clonagem IN-FUSION®. O vetor foi digerido com Nco I e Pac I.

O fragmento foi purificado por eletroforese em gel, da maneira anterior, e por um estojo de purificação em gel QIAQUICK® (QIAGEN Inc., Valencia, CA, 5 USA). O fragmento de gene e o vetor digerido foram combinados juntos em uma reação que resulta no plasmídeo de expressão pAG43, em que a transcrição do gene do polipeptídeo da família GH61B estava sob o controle do promotor NA2-tpi.

O promotor NA2-tpi é um promotor modificado a partir do gene de alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, em que a região principal não traduzida foi substituída por uma região principal não traduzida do gene de triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.

A reação de recombinação (20 µL) foi composta de tampão IN-FUSION® 1X (BD Biosciences, Palo Alto, CA, USA), BSA 1X (BD Biosciences, Palo Alto, CA, USA), 1 µL de enzima IN-FUSION® (diluição 1:10) (BD Biosciences, Palo Alto, CA, USA), 166 ng de pAlLo2 digerido com Nco I e Pac I, e 110 ng do produto de PCR purificado do polipeptídeo GH61B de A. fumigatus.

A reação foi incubada a 37 °C por 15 minutos, seguido por 15 minutos a 50 °C.

A reação foi diluída com 40 µL de um tampão Tris 10 mM - EDTA 0,1 M, e 2,5 µL da reação diluída foram usados para transformar células competentes de E. coli XL10 SOLOPACK® Gold (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Um transformante de E. coli contendo pAG43 (gene de proteína GH61B) foi identificado por digestão com enzima de restrição, e DNA plasmidial foi preparado usando um BIOROBOT® 9600 (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA). O sequenciamento do DNA do fragmento de PCR de 862 bp foi realizado com um sequenciador de DNA automatizado da Applied Biosystems Model 377 XL (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA), usando química finalizadora com corante (Giesecke et al., 1992, Journal of Virology Methods 38: 47-60), e a estratégia do oligonucleotídeo iniciador complementar.

Os seguintes oligonucleotídeos iniciadores específicos do vetor foram usados para o sequenciamento: pAllo2 5 Seq: 5'-TGTCCCTTGTCGATGCG 3' (SEQ ID NO: 73) pAllo2 3 Seq: 5 5'-CACATGACTTGGCTTCC 3' (SEQ ID NO: 74) Os dados da sequência de nucleotídeos foram examinados com relação à qualidade e todas as sequências foram comparadas umas com as outras, com auxílio do software PHRED/PHRAP (University of Washington, Seattle, WA, USA). Um modelo de gene para a sequência de A. fumigatus foi construído com base na similaridade da proteína codificada com o polipeptídeo GH61A de Thermoascus aurantiacus (número de acesso ao GeneSeqP AEC05922). A sequência de nucleotídeos e sequência deduzida de aminoácidos do gene de polipeptídeo GH61B de A. fumigatus são mostradas nas SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente.

O fragmento genômico codifica um polipeptídeo de 250 aminoácidos, interrompido por 2 introns de 53 e 56 bp.

O teor % de G+C do gene e a sequência codificante madura são 53,9 % e 57 %, respectivamente.

Usando o programa de software SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), um peptídeo sinal de 21 resíduos foi previsto.

A proteína madura prevista contém 229 aminoácidos com uma massa molecular prevista de 23,39 kDa.

Os protoplastos de Aspergillus oryzae JaL355 foram preparados de acordo com o método de Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Seis µg de pAG43 foram usados para transformar Aspergillus oryzae JaL355. Vinte e seis transformantes foram isolados em placas de PDA individuais.

As placas de PDA confluentes de 24 transformantes foram cada qual lavadas com 5 mL de TWEEN® 20 a 0,01 %, e os esporos foram cada um coletados.

Oito L de cada estoque de esporo foram adicionados a 1 mL dos meios YPG, YPM e M410, separadamente, em placas de 24 poços e incubados a 34 °C.

Após 3 dias de incubação, 7,5 µL de sobrenadante de quatro transformantes foram analisados usando um gel SDS-PAGE sem corante CRITERION®, com gradiente de 8-16 % (Bio-Rad Laboratories, Inc., 5 Hercules, CA, USA), de acordo com as instruções do fabricante.

Com base neste gel, o meio M410 foi escolhido como o melhor meio.

Cinco dias após incubação, 7,5 µL de sobrenadante de cada cultura de M410 foram analisados usando um gel SDS-PAGE sem corante CRITERION®, com gradiente 8-16 %. Os perfis de SDS-PAGE das culturas mostraram que vários transformantes apresentaram uma nova banda principal de aproximadamente 25 kDa.

Uma placa confluente de um transformante (crescido em placa de PDA) foi lavada com 5 mL de TWEEN® 20 a 0,01 %, e inoculada em quatro frascos Erlenmeyer de 500 mL contendo 100 mL de meio M410 para gerar o caldo para caracterização da enzima.

Os frascos foram coletados no dia 5 (300 mL), filtrados usando uma membrana de 0,22 m EXPRESS Plus (Millipore, Bedford, MA, USA), e armazenados a 4 °C.

O caldo do frasco de agitação filtrado contendo o polipeptídeo GH61B de A. fumigatus, produzido de maneira recombinante com atividade intensificadora celulolítica, foi concentrado primeiro por um concentrador de fluxo tangencial (Pall Filtron, Northborough, MA, USA) equipado com uma membrana de poliétersulfona de 10 kDa (Pall Filtron, Northborough, MA, USA), o tampão foi trocado para Tris-HCl 20 mM pH 8,0, e a seguir foi purificado usando uma coluna de filtração em gel HIGHLOAD™ 26/60 SUPERDEX™ 75 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA), com um gradiente isocrástico de 750 mL em NaCl 150 mM, Tris-HCl 20 mM pH 8,0. As frações foram coletadas e agrupadas com base na análise SDS-PAGE.

A concentração proteica foi determinada usando um estojo de ensaio proteico Microplate BCA™ (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA), em que a albumina sérica bovina foi usada como um padrão proteico.

Exemplo 2: Construção de variante GH61B de Aspergillus fumigatus I75V + F77L + F179I + I181L + I183V Um variante do polipeptídeo GH61B de Aspergillus fumigatus tipo selvagem com atividade intensificadora celulolítica foi construído com as 5 substituições I75V, F77L, F179I, I181L e I183V. A parte principal de GH61B de A. fumigatus tipo selvagem, a partir do plasmídeo pAG43 (Exemplo 2), foi usada como molde inicial nos quais as substituições foram introduzidas em várias etapas separadas, gerando intermediários até que os seguinte plasmídeo com as substituições de aminoácidos alvo finais foi obtido: pTH227 (I75V + F77L + F179I + I181L + I183V). Um estojo de mutagênese sítio-direcionada QUIKCHANGE® XL (Stratagene, La Jolla, CA, USA) foi usado para gerar as mutações por meio de reações mediadas por PCR, em que os pares de oligonucleotídeo iniciador sintético, da maneira mostrada na tabela 1, determinados com as mudanças alvo foram usados para incorporar as substituições desejadas. O variante do plasmídeo pTH221 foi gerado usando o par de oligonucleotídeo iniciador sentido e reverso 68337 e 68343 e pAG43 como o molde inicial. O variante do plasmídeo pTH227 foi gerado usando o par de oligonucleotídeo iniciador sentido e reverso 68335 e 68336, e variante do plasmídeo pTH221 como o molde inicial. Tabela 1 Mudanças Nome no ID do do aminoácid oligonucleotí plasmí o deo iniciador Sequências deo F179I, GCAGAACTACCCCCAGTGTATCAACCTGC I181L, AAGTGACCGGTGGCGGCAGTGCTCAGG pTH22 I183V 68337 (SEQ ID NO: 75) 1

CCTGAGCACTGCCGCCACCGGTCACTTGC

AGGTTGATACACTGGGGGTAGTTCTGC 68343 (SEQ ID NO: 76) I75V, GCAGCCGGTTCACAGGTGGAACTGCAGTG pTH22 F77L 68335 GACGACGTGG (SEQ ID NO: 77) 7

CCACGTCGTCCACTGCAGTTCCACCTGTG 68336 AACCGGCTGC (SEQ ID NO: 78)

Os DNAs plasmidiais mutantes resultantes foram preparados usando um BIOROBOT® 9600 e sequenciados usando um analisador genético 3130xl (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Exemplo 3: Expressão do variante GH61B de Aspergillus 5 fumigatus I75V + F77L + F179I + I181L + I183V em Aspergillus oryzae JaL250 Os protoplastos de Aspergillus oryzae JaL250 (WO 99/61651) foram preparados de acordo com o método de Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422, e foram transformados com 5 µg de pTH227 (ou pAllo2 como um controle). A transformação rendeu cerca de 20-25 transformantes.

Os transformantes tiveram então seu esporo purificado em placas de PDA seletivas individuais, e a seguir foram crescidos em placas de cultura de 24 poços contendo 1 mL de meio MDU2BP e foram incubadas a 34 °C em estado estacionário por 5 dias.

As amostras em caldo foram coletadas no dia 5 e analisadas por SDS-PAGE com Tris-glicina 8-16 % (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Uma vez que as culturas de cada transformante com esporo purificado foram confluentes e esporularam, os estoques de esporos foram realizado aplicando 5 mL de TWEEN® 80 a 0,01 % esterilizado por filtração (diluído com cristal de água destilada) no centro de cada placa de PDA, e usando um dispersor estéril para raspar os esporos na solução.

Os estoques de esporos dos transformantes com maior produção para cada lote foram identificados por SDS-PAGE, assim como as bandas mais fortes com o peso molecular previsto de 26 kDa foram usadas para inocular um frasco de agitação de 2 litros contendo 300 mL de meio MDU2BP.

Os frascos de agitação foram incubados por 5 dias a 34 °C, com agitação a 220 rpm.

Após a incubação, os caldos foram esterilizados por filtração usando uma membrana de poliétersulfona de 0,22 µm (Millipore, Bedford, MA, USA) para purificação.

A cepa de A. oryzae identificada a partir de análise de SDS-PAGE dos caldos de frasco de agitação, com a banda mais forte de 26 kDa, foi TH168 (variante GH61B de Aspergillus fumigatus I75V + F77L + F179I + I181L + I183V). Exemplo 4: Purificação do variante GH61B de Aspergillus fumigatus I75V + F77L + F179I + I181L + I183V 5 O variante GH61B de Aspergillus fumigatus recombinantemente produzido I75V + F77L + F179I + I181L + I183V foi concentrado primeiro por um concentrados de fluxo tangencial (Pall Filtron, Northborough, MA, USA), equipado com uma membrana de poliétersulfona de 10 kDa (Pall Filtron, Northborough, MA, USA), o tampão foi trocado por Tris-HCl 20 mM pH 8,0, e a seguir foi purificado usando uma coluna de alto desempenho (auto preenchimento) de 75 mL Q-SEPHAROSE® (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) com 800 mL de um gradiente linear de NaCl 0-600 mM em Tris-HCl 20 mM pH 8,0. As frações foram coletadas e agrupadas com base na análise SDS-PAGE.

A concentração proteica foi determinada usando um estojo de ensaio proteico Microplate BCA™, em que a albumina sérica bovina foi usada como um padrão proteico.

Exemplo 5: Preparação de endoglucanase II de Trichoderma reesei CEL5A O gene de endoglucanase II da família GH5A de Trichoderma reesei (SEQ ID NO: 5 [sequência de DNA] e SEQ ID NO: 6 [sequência deduzida de aminoácidos]) foi clonado em um vetor de expressão Aspergillus oryzae, da maneira descrita a seguir.

Dois oligonucleotídeos iniciadores sintéticos, mostrados a seguir, foram determinados para amplificar por PCR o gene da endoglucanase II do DNA genômico de T. reesei RutC30. O DNA genômico foi isolado usando um estojo DNEASY® Plant Maxi.

Um estojo de clonagem para PCR IN-FUSION™ foi usado para clonar o fragmento diretamente em pAILo2 (WO 2004/099228). Oligonucleotídeo iniciador sentido:

5’-ACTGGATTTACCATGAACAAGTCCGTGGCTCCATTGCT-3’ (SEQ ID NO: 79) Oligonucleotídeo iniciador reverso: 5’-TCACCTCTAGTTAATTAACTACTTTCTTGCGAGACACG-3’ (SEQ 5 ID NO: 80) As letras em negrito representam a sequência codificante.

A sequência que permanece contém identidade de sequência comparada com os sítios de inserção de pAlLo2 (WO 2004/099228). Cinquenta picomols de cada um dos oligonucleotídeos iniciadores anteriores foram usados em uma reação de PCR composta de 200 ng de DNA genômico de T. reesei, tampão de amplificação Pfx 1X, 6 µL de uma mistura 10 mM de dATP, dTTP, dGTP, e dCTP, 2,5 unidades de DNA polimerase Pfx PLATINUM®, e 1 µL de MgSO4 50 mM em um volume final de 50 µL.

A reação de amplificação foi incubada em um EPPENDORF® MASTERCICLOR® 5333 (Eppendorf Scientific, Inc., Westbury, NY, USA), programado para 1 ciclo a 98 °C por 2 minutos; e 35 ciclos cada a 94 °C por 30 segundos, 61 °C por 30 segundos, e 68 °C por 1,5 minutos.

Após os 35 ciclos, a reação foi incubada a 68 °C por 10 minutos e a seguir foi resfriada a 10 °C.

Um produto de reação de PCR de 1,5 kb foi isolado em um gel de agarose a 0,8 % GTG® (Cambrex Bioproducts, Rutherford, NJ, USA) usando tampão TAE e 0,1 µg de brometo de etídio por mL.

A banda de DNA foi visualizada com o auxílio de um DARKREADER™ (Clare Chemical Research, Dolores, CO, USA). A banda de DNA e 1,5 kb foi cortada com uma lâmina de barbear descartável e purificada usando um copo de centrifugação ULTRAFREE® DA (Millipore, Billerica, MA, USA) de acordo com as instruções do fabricante.

O plasmídeo pAlLo2 foi linearizado por digestão com Nco I e Pac I.

O fragmento de plasmídeo foi purificado por eletroforese em gel e ultrafiltração da maneira descrita anteriormente.

A clonagem do fragmento de

PCR purificado no vetor pAlLo linearizado e purificado foi realizada usando um estojo de clonagem por PCR IN-FUSION™. A reação (20 µL) continha tampão 1X IN-FUSION™, BSA 1X, 1 µL de enzima IN-FUSION™ (diluição 1:10), 100 ng de pAlLo2 digerido com Nco I e Pac I, e 100 ng do produto de 5 PCR de endoglucanase II de T. reesei CEL5A. A reação foi incubada em temperatura ambiente por 30 minutos. Uma amostra de reação de 2 µL foi usada para transformar células competentes de E. coli XL10 SOLOPACK® Gold, de acordo com as instruções do fabricante. Após um período de recuperação, duas alíquotas de 100 µL da reação de transformação foram colocadas em placas de YT 2X de 150 mm, suplementadas com 100 µg de ampicilina por mL. As placas foram incubadas por toda a noite a 37 °C. Um conjunto de 3 prováveis clones recombinantes foi recuperado a partir das placas de seleção, e o DNA plasmidial foi preparado a partir de cada um usando um BIOROBOT® 9600. Os clones foram analisados por digestão restrição com Pci I/Bsp LU11 I. Um clone com o padrão esperado de digestão por restrição foi então sequenciado para confirmar que não existem mutações na inserção clonada. O clone #3 foi selecionado e determinado pAlLo27. Os protoplastos de Aspergillus oryzae JaL250 (WO 99/61651) foram preparados de acordo com o método de Christensen et al., 1988, supra, e transformados com 5 µg de pAlLo27 (ou pAlLo2 como um controle). A transformação rendeu cerca de 50 transformantes. Onze transformantes foram isolados em placas de PDA individuais e incubados por cinco dias a 34 ºC. As placas com esporo confluente foram lavadas com 3 mL de TWEEN® 80 a 0,01 %, e a suspensão de esporo foi usada para inocular 25 mL de meio MDU2BP em frascos de vidro para agitação de 125 mL. As culturas de transformante foram incubadas a 34 ºC com agitação constante a 200 rpm. Em cinco dias após a inoculação, as culturas foram centrifugadas a

6.000 x g e seus sobrenadantes foram coletados. Cinco microlitros de cada sobrenadante foram misturados com um volume igual de tampão de corrida 2X

(10 % beta-mercaptoetanol), e corridos em um gel SDS-PAGE com Tris-Glicina 8 %-16 % de 1,5 mm e corados com SIMPLYBLUE™ SafeStain (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA). Os perfis de SDS-PAGE dos caldos da cultura mostrara que dez dos onze transformantes produziram uma nova banda de proteína de 5 aproximadamente 45 kDa.

O transformante número 1, determinado Aspergillus oryzae JaL250AlLo27, foi cultivado em um fermentador.

O meio do frasco de agitação foi composto de 50 g de sacarose, 10 g de KH2PO4, 0,5 g de CaCl2, 2 g de MgSO4·7H2O, 2 g de K2SO4, 2 g de ureia, 10 g de extrato de levedura, 2 g de ácido cítrico, 0,5 mL de solução de metais traço, e água deionizada para 1 litro.

A solução de metais traço foi composta de 13,8 g de FeSO4·7H2O, 14,3 g de ZnSO4·7H2O, 8,5 g de MnSO4·H2O, 2,5 g de CuSO4·5H2O, 3 g de ácido cítrico, e água deionizada para 1 litro.

Cem mL do meio do frasco de agitação foram adicionados a um frasco de agitação de 500 mL.

O frasco de agitação foi inoculado com dois plugues de A. oryzae JaL250AlLo27 a partir de uma placa de PDA, e incubado a 34 ºC em um agitador orbital a 200 rpm por 24 horas.

Cinquenta mL do caldo do frasco de agitação foram usados para inocular um vaso de fermentação de 3 litros.

O meio em módulo de fermentação foi composto de 10 g de extrato de levedura, 24 g de sacarose, 5 g de (NH4)2SO4, 2 g de KH2PO4, 0,5 g de CaCl2·2H2O, 2 g de MgSO4·7H2O, 1 g de ácido cítrico, 2 g de K2SO4, 0,5 mL de anti-espuma, 0,5 mL de solução de metais traço, e água deionizada para 1 litro.

A solução de metais traço foi composta de 13,8 g de FeSO4·7H2O, 14,3 g de ZnSO4·7H2O, 8,5 g de MnSO4·H2O, 2,5 g de CuSO4·5H2O, 3 g de ácido cítrico, e água deionizada para 1 litro.

O meio de alimentação para a fermentação foi composto de maltose.

Um total de 1,8 litro do meio em módulo de fermentação foi adicionado a um fermentador revestido de vidro de três litros da Applikon

Biotechnology (Applikon Biotechnology, Inc., Foster City, CA, USA). O meio de alimentação da fermentação foi dosado em uma taxa de 0 a 4,4 g/L/h por um período de 185 horas.

O vaso de fermentação foi mantido em uma temperatura de 34 ºC e pH foi controlado usando um sistema de controle 5 Applikon 1030 (Applikon Biotechnology, Inc., Foster City, CA, USA), em um ponto de ajuste de 6,1 +/- 0,1. O ar foi adicionado ao vaso em uma taxa de 1 vvm e o caldo foi agitado por rotação impulsora Rushton em 1.100 a 1.300 rpm.

No final da fermentação, todo o caldo foi coletado do vaso e centrifugado a 3.000 x g para remover a biomassa.

O sobrenadante foi esterilizado por filtração usando uma membrana Plus de 0,22 m EXPRESS, e armazenado a 4 °C.

O sobrenadante foi dessalinizado e o tampão foi trocado para Tris-HCl 20 mM pH 8,0 usando uma coluna de dessalinização de 400 mL SEPHADEX™ G25 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA), de acordo com as instruções do fabricante.

A endoglucanase II dessalinizada de Trichoderma reesei CEL5A foi preenchida uma coluna de troca iônica MONOQ™ HR 16/10 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA), e eluída com um gradiente de NaCl de 300 mL linear 0-300 mM em Tris-HCl 20 mM pH 8, com coleta de frações de 10 mL.

As frações foram agrupadas com base na análise SDS- PAGE.

A concentração proteica foi determinada usando um estojo de ensaio proteico em microplaca BCA™, em que a albumina sérica bovina foi usada como um padrão proteico.

Exemplo 6: Preparação de beta-glicosidase de Aspergillus fumigatus GH3A Uma beta-glicosidase de A. fumigatus (SEQ ID NO: 55 [sequência de DNA] e SEQ ID NO: 56 [sequência deduzida de aminoácidos]) foi preparada de acordo com a patente U.S. 7.244.605. A concentração proteica foi determinada usando um estojo de ensaio proteico Microplate BCA™, em que a albumina sérica bovina foi usada como um padrão proteico.

Exemplo 7: Preparação de celobioidrolase I de Aspergillus fumigatus NN055679 Cel7A Uma pesquisa tfasty (Pearson et al., 1997, Genomics 46:24-36) da sequência do genoma parcial de A. fumigatus (The Institute for Genomic 5 Research, Rockville, MD, USA) foi realizada usando como entrada uma sequência proteica de celobioidrolase Cel7 de Trichoderma reesei (Número de acesso P00725). Vários genes foram identificados como prováveis homólogos da família GH7, com base em um grau elevado de similaridade com a sequência de entrada no nível do aminoácido.

Uma região genômica com identidade de sequência significativa com a sequência de entrada foi escolhida para estudo adicional, e o gene correspondente foi denominado cel7A.

Os dois oligonucleotídeos iniciadores sintéticos mostrados a seguir foram determinados para amplificar por PCR o gene de celobioidrolase I de A. fumigatus NN055679 cel7A (SEQ ID NO: 49 [sequência de DNA] e SEQ ID NO: 50 [sequência deduzida de aminoácidos]), a partir do DNA genômico de A. fumigatus preparado da maneira descrita em WO 2005/047499. Oligonucleotídeo iniciador sentido: 5'-gggcATGCTGGCCTCCACCTTCTCC-3' (SEQ ID NO: 81) Oligonucleotídeo iniciador reverso: 5'-gggttaattaaCTACAGGCACTGAGAGTAA-3’ (SEQ ID NO: 82) As letras maiúsculas representam a sequência codificante.

O restante da sequência fornece sítios de endonuclease de restrição para Sph I e Pac I nas sequências sentido e reverso, respectivamente.

Usando estes oligonucleotídeos iniciadores, o gene de A. fumigatus cel7A foi amplificado usando métodos padrões de PCR, e o produto de reação foi isolado por eletroforese em gel de agarose a 1 % usando tampão TAE, e foi purificado usando um estojo de extração em gel QIAQUICK® Gel (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA) de acordo com as instruções do fabricante.

O fragmento foi digerido com Sph I e Pac I e ligado no vetor de expressão pAlLo2, também digerido com Sph I e Pac I, de acordo com procedimentos padrões.

Os produtos de ligação foram transformados em células competentes de E. coli XL10 SOLOPACK® Gold, de acordo com as 5 instruções do fabricante.

Um transformante de E. coli contendo um plasmídeo do tamanho correto foi detectado por digestão por restrição e o DNA plasmidial foi preparado usando um BIOROBOT® 9600. O sequenciamento de DNA da inserção a partir deste plasmídeo foi realizado com um sequenciador de DNA automatizado Perkin-Elmer da Applied Biosystems Model 377 XL (Perkin-Elmer/Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA), usando química finalizadora com corante (Giesecke et al., 1992, supra) e a estratégia do oligonucleotídeo iniciador complementar.

Os dados da sequência de nucleotídeos foram examinados com relação à qualidade e todas as sequências foram comparadas umas com as outras com auxílio do software PHRED/PHRAP (University of Washington, Seattle, WA, USA). A sequência de nucleotídeos foi mostrada para combinar com a sequência genômica determinada por TIGR (SEQ ID NO: 49 [sequência de DNA] e SEQ ID NO: 50 [sequência deduzida de aminoácidos]). O plasmídeo resultante foi denominado pEJG93. Os protoplastos de Aspergillus oryzae JaL250 foram preparados de acordo com o método de Christensen et al., 1988, supra, e transformados com 5 µg de pEJG93 (bem como pAlLo2 como um vetor controle). A transformação rendeu cerca de 100 transformantes.

Dez transformantes foram isolados em placas de PDA individuais.

As placas de PDA confluentes de cinco dos dez transformantes foram lavadas com 5 mL de TWEEN® 20 a 0,01 %, e inoculadas separadamente em 25 mL de meio MDU2BP em frascos de vidro para agitação de 125 mL e incubadas a 34 °C, 250 rpm.

Cinco dias após a incubação, 0,5 µL de sobrenadante de cada cultura foi analisado usando géis de SDS-PAGE com Tris-glicina 8-16 % (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA), de acordo com as instruções do fabricante.

Os perfis de SDS-PAGE das culturas mostraram que um dos transformantes apresentou uma banda principal de aproximadamente 70 kDa.

Este transformante foi denominado A. 5 oryzae JaL250EJG93. Cem mL do meio do frasco de agitação (Exemplo 5) foram adicionados a um frasco de agitação de 500 mL.

O frasco de agitação foi inoculado com dois plugues de A. oryzae JaL250EJG93 a partir de uma placa de PDA, e incubado a 34 ºC em um agitador orbital em 200 rpm por 24 horas.

Cinquenta mL do caldo do frasco de agitação foram usados para inocular um vaso de fermentação de 3 litros.

Um total de 1,8 litro do meio de fermentação em lotes (Exemplo 5) foi adicionado a um fermentador revestido de vidro de três litros da Applikon Biotechnology.

O meio de alimentação da fermentação (Exemplo 5) foi dosado em uma taxa de 0 a 4,4 g/L/h por um período de 185 horas.

O vaso de fermentação foi mantido em uma temperatura de 34 ºC e o pH foi controlado usando um sistema de controle Applikon 1030 em um ponto de ajuste de 6,1 +/- 0,1. O ar foi adicionado ao vaso em uma taxa de 1 vvm e o caldo foi agitado por rotação impulsora Rushton em 1.100 a 1.300 rpm.

No final da fermentação, todo o caldo foi coletado do vaso e centrifugado em 3.000 x g para remover a biomassa.

O sobrenadante foi esterilizado por filtração usando uma membrana Plus de 0,22 m EXPRESS™, e armazenado a 4 °C.

O caldo filtrado foi concentrado e o tampão foi trocado usando um concentrador de fluxo tangencial (Pall Filtron, Northborough, MA, USA), equipado com uma membrana de poliétersulfona de 10 kDa (Pall Filtron, Northborough, MA, USA) com Tris-HCl 20 mM pH 8., e a seguir foi purificado usando uma coluna de alto desempenho (auto preenchida) de 75 mL Q-SEPHAROSE® (com um 750 mL de gradiente linear NaCl 0-600 mM em Tris-HCl 20 mM pH 8,0, com coleta de 10 mL frações.

As frações foram agrupadas com base na análise SDS-PAGE.

A concentração proteica foi determinada usando um estojo de ensaio proteico Microplate BCA™, em que a albumina sérica bovina foi usada como um padrão proteico. 5 Exemplo 8: Preparação de celobioidrolase II de Aspergillus fumigatus Cel6A A celobioidrolase II de A. fumigatus NN055679 (CBHII) (SEQ ID NO: 51 [sequência de DNA] e SEQ ID NO: 52 [sequência deduzida de aminoácidos]) foi preparada de acordo com o procedimento a seguir.

Dois oligonucleotídeos iniciadores sintéticos, mostrados a seguir, foram determinados para amplificar por PCR o quadro aberto de leitura de tamanho completo de glicosil hidrolase da família 6A de A. fumigatus, a partir do DNA genômico.

Um estojo de clonagem TOPO® (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) foi usado para clonar o produto de PCR.

Um estojo de clonagem IN-FUSION™ foi usado para clonar o fragmento em pAILo2. Oligonucleotídeo iniciador sentido: 5’-ACTGGATTTACCATGAAGCACCTTGCATCTTCCATCG-3’ (SEQ ID NO: 83) Oligonucleotídeo iniciador reverso: 5’-TCACCTCTAGTTAATTAAAAGGACGGGTTAGCGT-3’ (SEQ ID NO: 84) As letras em negrito representam a sequência codificante.

A sequência que permanece contém identidade de sequência comparada com os sítios de inserção de pAlLo2. Cinquenta picomols de cada um dos oligonucleotídeos iniciadores anteriores foram usados em uma reação de PCR composta de 500 ng de DNA genômico de A. fumigatus, tampão de reação ThermoPol Taq 1X (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA), 6 µL de uma mistura 10 mM de dATP, dTTP, dGTP, e dCTP, 0,1 unidade de Taq DNA polimerase (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA), em um volume final de 50 µL.

Um EPPENDORF® MASTERCICLOR® 5333 foi usado para amplificar o fragmento programado para 1 ciclo a 98 °C por 2 minutos; e 35 ciclos cada a 5 96 °C por 30 segundos, 61 °C por 30 segundos, e 72 °C por 2 minutos.

Após os 35 ciclos, a reação foi incubada a 72 °C por 10 minutos, e a seguir foi resfriada a 10 °C até ser processada adicionalmente.

Para remover as caudas A produzidas por Taq DNA polimerase, a reação foi incubada por 10 minutos a 68 °C na presença de 1 unidade de Pfx DNA polimerase (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA). Um produto de reação de PCR de 1,3 kb foi isolado em um gel de GTG-agarose a 0,8 % (Cambrex Bioproducts, East Rutherford, NJ, USA), usando tampão TAE e 0,1 µg de brometo de etídio por mL.

A banda de DNA foi visualizada com o auxílio de um DARK READER™ (Clare Chemical Research, Dolores, CO, USA) para evitar as mutações induzidas por UV.

A banda de DNA de 1,3 kb foi excisada com uma lâmina de barbear descartável, e purificada com um copo de centrifugação ULTRAFREE® DA de acordo com as instruções do fabricante.

O produto de PCR purificado de 1,3 kb foi clonado em pCR®4Blunt-TOPO® (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA). Dois microlitros do produto de PCR purificado foram misturados com 1 µL de uma solução de cloreto de sódio 2 M e 1 µL do vetor pCR®4Blunt-TOPO®. A reação foi incubada em temperatura ambiente por 15 minutos, e a seguir 2 µL da reação foram usados para transformar células competentes de E. coli TOP10 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) de acordo com as instruções do fabricante.

Duas alíquotas de 100 microlitros cada da reação de transformação foram espalhadas em duas placas de YT 2X de 150 mm, suplementadas com 100 µg de ampicilina por mL, e incubadas por toda a noite a 37 °C.

Oito colônias recombinantes foram usadas para inocular as culturas líquidas contendo 3 mL de meio LB suplementado com 100 µg de ampicilina por mL.

O DNA plasmidial foi preparado a partir destas culturas usando um BIOROBOT® 9600. Os clones foram analisados por meio de 5 digestão por restrição.

O DNA plasmidial de cada clone foi digerido com Eco RI e analisado por eletroforese em gel de agarose da maneira anterior.

Seis dos oito clones apresentaram o padrão esperado de digestão por restrição e os clones 2, 4, 5, 6, 7 e 8 foram sequenciados para confirmar que não houve mutações na inserção clonada.

As análise de sequência de suas extremidades 5-principal e 3-principal indicaram que os clones 2, 6 e 7 apresentaram a sequência correta.

Estes três clones foram selecionados para re-clonagem em pAlLo2. Uma alíquota de um microlitro de cada clone foi misturada com 17 µL de EDTA 0,1 mM diluído 1:10 – Tris 10 mM pH 7,4, e 1 µL desta mistura foi usado para re-amplificar a região codificante 6A de glicosil hidrolase de A. fumigatus.

Cinquenta picomols de cada um dos oligonucleotídeos iniciadores anteriores foram usados em uma reação de PCR composta de 1 µL da mistura diluída de clones 2, 6 e 7, tampão de amplificação Pfx 1X, 6 µL de uma mistura 10 mM de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 2,5 unidades de DNA polimerase Pfx PLATINUM®, 1 µL de 50 mM MgSO4, em um volume final de 50 µL.

Um EPPENDORF® MASTERCICLOR® 5333 foi usado para amplificar o fragmento programado para 1 ciclo a 98 °C por 2 minutos; e 35 ciclos cada a 94 °C por 30 segundos, 61 °C por 30 segundos, e 68 °C por 1,5 minutos.

Após os 35 ciclos, a reação foi incubada a 68 °C por 10 minutos, e a seguir foi resfriada a 10 °C até ser processada adicionalmente.

Um produto de reação de PCR de 1,3 kb foi isolado em um gel de GTG-agarose a 0,8 %, usando tampão TAE e 0,1 µg de brometo de etídio por mL.

A banda de DNA foi visualizada com o auxílio de um transluminador DARKREADER™ para evitar mutações induzidas por UV.

A banda de DNA de 1,3 kb foi cortada do gel com uma lâmina de barbear descartável e purificada com um copo de centrifugação ULTRAFREE® DA, de acordo com as instruções do fabricante.

O vetor pAlLo2 foi linearizado por digestão com Nco I e Pac 5 I.

O fragmento foi purificado por eletroforese em gel e ultrafiltração, da maneira descrita anteriormente.

A clonagem do fragmento de PCR purificado no vetor pAlLo linearizado e purificado foi realizada com um estojo de clonagem IN-FUSION™. A reação (20 µL) foi composta de tampão IN- FUSION™ 1X, BSA 1X, 1 µL de enzima IN-FUSION™ (diluição 1:10), 100 ng de pAlLo2 digerido com Nco I e Pac I, e 50 ng do produto de PCR purificado de A. fumigatus GH6A.

A reação foi incubada em temperatura ambiente por 30 minutos.

Uma amostra de reação de 2 µL foi usada para transformar células competentes de E. coli TOP10, de acordo com as instruções do fabricante.

Após o período de recuperação, duas alíquotas de 100 µL da reação de transformação foram colocadas em placas de YT 2X de 15 mm suplementadas com 100 µg de ampicilina por mL.

As placas foram incubadas por toda a noite a 37 °C.

Um conjunto de oito prováveis clones recombinantes foi selecionado aleatoriamente a partir das placas de seleção, e o DNA plasmidial foi preparado a partir de cada uma usando um BIOROBOT® 9600. Os clones foram analisados por digestão por restrição Pst I.

Sete dos oito clones apresentaram o padrão esperado da digestão por restrição.

Os clones 1, 2 e 3 foram então sequenciados para confirmar que não havia mutações na inserção clonada.

O clone #2 foi selecionado e determinado pAlLo33. Os protoplastos de Aspergillus oryzae JaL355 foram preparados de acordo com o método de Christensen et al., 1988, supra, e transformados com 5 µg de pAlLo33 (bem como pAlLo2 como um vetor controle). A transformação rendeu cerca de 100 transformantes.

Dez transformantes foram isolados em placas de PDA individuais.

As placas de PDA confluentes de cinco dos dez transformantes foram lavadas com 5 mL de TWEEN® 20 a 0,01 %, e inoculadas separadamente em 25 mL de meio MDU2BP em frasco de vidro para agitação de 125 mL e incubadas a 34 °C, 250 rpm.

Cinco dias após a incubação, 0,5 5 µL de sobrenadante de cada cultura foi analisado usando géis SDS-PAGE com Tris-glicina 8-16 % (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA), de acordo com as instruções do fabricante.

Os perfis de SDS-PAGE das culturas mostraram que um dos transformantes apresentou uma banda principal de aproximadamente 70 kDa.

Este transformante foi denominado A. oryzae JaL355 AlLo33. Cem mL do meio do frasco de agitação (Exemplo 5) foi adicionado a um frasco de agitação de 500 mL.

Frasco de agitação foi inoculado com dois plugues de A. oryzae Jal355 ALlo33, a partir de uma placa de PDA, e incubadas a 34 ºC em um agitador orbital em 200 rpm por 24 horas.

Cinquenta mL do caldo no frasco de agitação foi usado para inocular um vaso de fermentação de 3 litros.

Um total de 1,8 litro do meio de fermentação em lotes (Exemplo 5) foi adicionado a um fermentador revestido de vidro de três litros da Applikon Biotechnology.

O meio de alimentação da fermentação (Exemplo 5) foi dosado em uma taxa de 0 a 4,4 g/L/h por um período de 185 horas.

O vaso de fermentação foi mantido em uma temperatura de 34 ºC, e o pH foi controlado usando um sistema de controle Applikon 1030 em um ponto de ajuste de 6,1 +/- 0,1. O ar foi adicionado ao vaso em uma taxa de 1 vvm e o caldo foi agitado por rotação impulsora Rushton em 1.100 a 1.300 rpm.

No final da fermentação, todo o caldo foi coletado do vaso e centrifugado em 3.000 x g para remover a biomassa.

O sobrenadante foi esterilizado por filtração usando uma membrana Plus de 0,22 m EXPRESS™, e armazenado a 4 °C.

O caldo foi filtrado usando um filtro de vidro de 0,7 µm GF/F

(Whatman, Piscataway, NJ, USA), e a seguir usando uma membrana Plus de 0,22 m EXPRESS. O caldo filtrado foi concentrado e o tampão foi trocado usando um concentrador de fluxo tangencial (Pall Filtron, Northborough, MA, USA), equipado com uma membrana de poliétersulfona de 10 kDa (Pall 5 Filtron, Northborough, MA, USA) com Tris-HCl 20 mM pH 8,0. O caldo dessalinizado foi preenchido em uma coluna de troca iônica MONOQ™ HR 16/10, e eluído com 300 mL de um gradiente linear de NaCl 0-300 mM em Tris-HCl 20 mM pH 8 com coleta de frações de 10 mL.

As frações foram agrupadas com base na análise SDS-PAGE.

As frações agrupadas foram ajustadas para (NH4)2SO4 1,2 M em Tris 20 mM, pH 8,0, e a seguir foram aplicadas em uma coluna de 75 mL auto preenchida FENIL SEPHAROSE™ FAST-FLOW® HIGH-SUB® (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA), e eluídas com 750 mL de um gradiente linear de (NH4)2SO4 1,2-0 M em Tris-HCl 20 mM pH 8 com coleta de frações de 10 mL.

As frações agrupadas com base em SDS-PAGE foram concentradas usando um concentrador centrífugo de 10 kDa MWCO VIVASPIN® (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). O material concentrado foi então purificado adicionalmente usando uma coluna de filtração em gel 26/60 Superdex 75 HIGHLOAD™, com 200 mL de um gradiente isocrático em NaCl 150 mM, Tris-HCl 20 mM pH 8,0. As frações foram coletadas e agrupadas com base em SDS-PAGE, e concentradas usando concentradores centrífugos de 10 kDa MWCO VIVASPIN®. A concentração proteica foi determinada usando um estojo de ensaio proteico Microplate BCA™, em que a albumina sérica bovina foi usada como um padrão proteico.

Exemplo 9: Preparação de xilanase de Aspergillus fumigatus GH10 A xilanase de Aspergillus fumigatus NN055679 GH10 (xyn3; SEQ ID NO: 67 [sequência de DNA] e SEQ ID NO: 68 [sequência deduzida de aminoácidos]) foi preparada recombinantemente, de acordo com WO

2006/078256, usando Aspergillus oryzae BECh2 como um hospedeiro.

O caldo filtrado foi dessalinizado e o tampão foi trocado usando um concentrador de fluxo tangencial (Pall Filtron, Northborough, MA, USA), equipado com uma membrana de poliétersulfona de 10 kDa (Pall 5 Filtron, Northborough, MA, USA) com Tris-HCl 25 mM pH 8,5. O material dessalinizado foi aplicado em coluna de 400 mL (preenchida manualmente) Q-SEPHAROSE™ Fast-Flow™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA), lavado com 400 mL de Tris 25 mM pH 8,5, e eluído com um 1.400 mL de gradiente linear de NaCl 0-600 mM em Tris 25 mM pH 8,5, com coleta de frações de 10 mL.

As frações foram agrupadas com base em SDS-PAGE, e ajustadas em (NH4)2SO4 1,5 M, Tris 20 mM pH 8,0, e aplicadas em uma coluna de 75 mL auto preenchida FENIL SEPHAROSE™ FAST-FLOW® HIGH-SUB®, lavadas com 75 mL de Tris-HCl 20 mM pH 8,0, e eluídas com um 1.500 mL de gradiente linear de (NH4)2SO4 1,5-0 M em Tris-HCl 20 mM pH 8, com coleta de frações de 10 mL.

As frações foram agrupadas com base na análise SDS-PAGE e concentradas usando um dispositivo de concentração celular com agitação de 300 mL (Millipore, Bedford, MA, USA), equipado com uma membrana de 10 kDa MWCO, e dessalinizadas em Tris-HCl 20 mM pH 8,0, NaCl 150 mM.

A concentração proteica foi determinada usando um estojo de ensaio proteico Microplate BCA™, com albumina sérica bovina como um padrão proteico.

Exemplo 10: Preparação de beta-xilosidase de Trichoderma reesei RutC30 GH3 Um gene de beta-xilosidase de Trichoderma reesei RutC30 (SEQ ID NO: 69 [sequência de DNA] e SEQ ID NO: 70 [sequência deduzida de aminoácidos]) foi isolado selecionando uma biblioteca Lambda ZAP®-CMR XR, preparada a partir do DNA genômico de T. reesei RutC30, usando um estojo de construção de bibliotecas Lambda ZAP®-CMR XR (Stratagene, La Jolla, CA, USA), de acordo com as instruções do fabricante.

O DNA genômico de T. reesei

RutC30 foi preparado usando métodos padrões.

Um segmento de DNA que codifica 2.300 bp da beta-xilosidase de T. reesei foi amplificado usando os oligonucleotídeos iniciadores de PCR mostrados a seguir.

Oligonucleotídeo iniciador sentido: 5 5’-gtgaataacgcagctcttctcg-3’ (SEQ ID NO: 85) Oligonucleotídeo iniciador reverso: 5’-ccttaattaattatgcgtcaggtgt-3’ (SEQ ID NO: 86) O oligonucleotídeo iniciador 994768 foi determinado para amplificar a partir da primeira base após o sítio inicial de beta-xilosidase, e o oligonucleotídeo iniciador 994769 foi determinado com um sítio Pac I na extremidade 5’. Cinquenta picomols de cada um dos oligonucleotídeos iniciadores anteriores foram usados em uma reação de PCR composta de 50 ng de DNA plasmidial a partir da biblioteca lamda zap, 1 µL de uma mistura 10 mM de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 5 µL de tampão de DNA polimerase Pfx PLATINUM® 10X, e 1 unidade de DNA polimerase Pfx PLATINUM®, em um volume final de 50 µL.

Um EPPENDORF® MASTERCICLOR® 5333 foi usado para amplificar o fragmento de DNA programado para 1 ciclo a 95 °C por 3 minutos; e 30 ciclos cada a 94 °C por 45 segundos, 55 °C por 60 segundos, e 72 °C por 1 minuto e 30 segundos.

Após os 30 ciclos, a reação foi incubada a 72 °C por 10 minutos e a seguir foi resfriada a 4 °C até o processamento adicional.

Um produto de PCR de 2,3 kb foi purificado por eletroforese em gel de agarose a 1 % usando tampão TAE, foi cortado do gel, e purificado usando um estojo de extração em gel QIAQUICK®. O produto de PCR de 2,3 kb foi então digerido com Pac I para facilitar a inserção em pAlLo1 (WO 2004/099228). O vetor pAlLo1 foi digerido com Nco I e a seguir preenchido usando T4 DNA polimerase (Roche Applied Science, Nutley, NJ, USA), de acordo com as instruções do fabricante.

Uma segunda enzima, Pac I, foi então usada para digerir a extremidade 5’ de pAlLo1 e a reação foi purificada por eletroforese em gel de agarose, da maneira descrita anteriormente, para isolar um fragmento de vetor de 6,9 kb. 5 O fragmento de beta-xilosidase de 2,3 kb foi então ligado ao fragmento do vetor de 6,9 kb e transformado em células competentes subclonadas de E. coli XL1-Blue (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA), de acordo com as instruções do fabricante.

Os transformantes foram selecionados usando análise com digestão por restrição, a fim de identificar aqueles com inserção correta.

Um novo vetor de expressão, pSaMe04, foi confirmado por sequenciamento usando um analisador de DNA ABI 3700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) e química finalizadora com corante (Giesecke et al., 1992, supra). Os dois oligonucleotídeos iniciadores sintéticos mostrados a seguir foram determinados para amplificar por PCR o gene de beta-xilosidase de Trichoderma reesei, a partir de pSaMe04, para construir um vetor de expressão de Trichoderma.

Um estojo de clonagem IN-FUSION™ foi usado para clonar o fragmento diretamente no vetor de expressão pMJ09 (WO 2005/056772), sem a necessidade de digestão por restrição e ligação.

TrBXIL-F (ID 064491): 5’-CGGACTGCGCACCATGGTGAATAACGCAGCTCT-3’ (SEQ ID NO: 87) TrBXIL-R (ID 064492): 5’-TCGCCACGGAGCTTATTATGCGTCAGGTGTAGCAT-3’ (SEQ ID NO: 88) As letras em negrito representam a sequência codificante.

A sequência que permanece é homóloga aos sítios de inserção de pMJ09. Cinquenta picomols de cada um dos oligonucleotídeos iniciadores anteriores foram usados em uma reação de PCR composta de 50 ng de pSaMe04, 1 µL de uma mistura 10 mM de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 5 µL de tampão de DNA polimerase 10X ACCUTAQ™ (Sigma-Aldrich, St.

Louis, MO, USA), e 5 unidades de DNA polimerase ACCUTAQ™ (Sigma- Aldrich, St.

Louis, MO, USA), em um volume final de 50 µL.

Um 5 EPPENDORF® MASTERCICLOR® 5333 foi usado para amplificar o fragmento de DNA programado para 1 ciclo a 95 °C por 3 minutos; e 30 ciclos cada a 94 °C por 45 segundos, 55 °C por 60 segundos, e 72 °C por 1 minuto e 30 segundos.

Após os 30 ciclos, a reação foi incubada a 72 °C por 10 minutos e então resfriada a 4 °C até o processamento adicional.

Os produtos de reação foram isolados por eletroforese em gel de agarose a 1,0 % usando tampão TAE, onde uma banda do produto de 1,2 kb foi cortada do gel e purificada usando um estojo de extração em gel QIAQUICK®, de acordo com as instruções do fabricante.

O fragmento de 1,2 kb foi então clonado em pMJ09 usando um estojo de clonagem IN-FUSION™. O vetor foi digerido com Nco I e Pac I e purificado por eletroforese em gel de agarose, da maneira descrita anteriormente.

O fragmento de gene e o vetor digerido foram ligados juntos em uma reação que resulta no plasmídeo de expressão pSaMe-TrBXIL, em que a transcrição do gene de beta-xilosidase estava sob o controle do gene promotor de T. reesei cbh1. A reação de ligação (50 µL) foi composta de tampão 1X IN-FUSION™, BSA 1X, 1 µL de enzima IN-FUSION™ (diluição 1:10), 100 ng de pMJ09 digerido com Nco I e Pac I, e 100 ng do produto de PCR purificado de beta-xilosidase de T. reesei.

A reação foi incubada em temperatura ambiente por 30 minutos.

Um µL da reação foi usado para transformar células competentes de E. coli XL10 SOLOPACK® Gold.

Um transformante de E. coli contendo pSaMe-TrBXIL foi detectado por digestão com enzima de restrição e o DNA plasmidial foi preparado usando um BIOROBOT® 9600. O sequenciamento do DNA do gene de beta-xilosidase de T. reesei, a partir de pSaMe-TrBXIL, foi realizado usando química finalizadora com corante (Giesecke et al., 1992, supra) e a estratégia do oligonucleotídeo iniciador complementar. O plasmídeo pSaMe-AaXIL foi construído para compreender o gene promotor e finalizador de celobioidrolase I de Trichoderma reesei, e a 5 sequência codificante de xilanase de Aspergillus aculeatus GH10. A clonagem da xilanase de A. aculeatus seguiu o protocolo de clonagem de expressão completa, da maneira destacada em H. Dalbøge et al., 1994, Mol. Gen. Genet. 243: 253-260. O RNA foi isolado a partir do micélio de A. aculeatus CBS

101.43. O RNA Poli(a)+ foi isolado do RNA total por cromatografia em oligo(dT)-celulose. O DNAc de fita dupla foi sintetizado da maneira descrita por Maniatis et al. (Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982). Após a síntese, o DNAc foi tratado com nuclease de feijão mungo, as extremidades foram cegas com T4 DNA polimerase e ligadas aos adaptadores não palindrômicos Bst XI (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA). O DNAc teve seu tamanho fracionado em eletroforese em gel de agarose a 1 % usando tampão TAE, onde os fragmentos que variam de 600 bp a 4.000 bp foram usados na construção da biblioteca. O DNA foi ligado em Bst digerido com XI, pYES 2,0 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA), entre o promotor GAL1 e o finalizador iso-1- citocromo c, e transformado em células de Escherichia coli MC1061 (Stratagene, La Jolla, CA, USA). A biblioteca foi colocada em placas LB e incubada por toda a noite a 37 °C. As colônias foram raspadas das placas e ressuspensas em meio LB suplementado com 100 µg de ampicilina por mL. O DNA plasmidial foi isolado usando um estojo de plasmídeo Midi (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA). O DNA plasmidial purificado foi agrupado. A mistura de DNA plasmidial agrupado foi transformada em células de Saccharomyces cerevisiae W3124 (MATa; ura 3-52; leu 2-3, 112; his 3-D200; pep 4-1137; prcl::HIS3; prbl:: LEU2; cir+; van den Hazel et al.,

1992, Eur.

J.

Biochem. 207: 277-283). O cultivo, transformação e os meios foram descritos por Guthrie et al., 1991, Meth.

Enzymol.

Vol 194, Academic Press.

As células transformadas foram colocadas em ágar completo sintético, contendo 2 % de glicose, por 3 dias a 30 °C.

Após 3 dias, as colônias foram 5 plaqueadas em réplica em placas de ágar SC com 2 % de galactose, e incubadas por 4 dias a 30 °C.

As colônias que expressam xilanase foram identificadas usando uma sobreposição de agarose a 1 %, com xilano de vidoeiro AZCL a 0,1 % em pH 4,5 (Dalbøge, 2006, FEMS Microbiology Reviews 21: 29-42). As colônias que expressam a atividade de xilanase foram circundadas por uma zona azul.

O DNA plasmidial, recuperado das colônias positivas, continha uma inserção de DNA de aproximadamente 1,3 kb.

O sequenciamento do fragmento de gene isolado revelou um quadro aberto de leitura de 1218 bp, que codifica um polipeptídeo com um peso molecular teórico de 43,0 kDa.

O fragmento de DNAc foi subclonado no vetor de expressão pHD464 de Aspergillus (Dalbøge e Heldt-Hansen, 1994, Mol.

Gen.

Genet. 243, 253–260), digerido com Bam HI e Xho I, digerindo o clone com Bam HI e Xho I e isolando a inserção de DNAc de 1,2 kb (Christgau et al., 1996, Biochem.

J. 319: 705-712) para gerar o plasmídeo pA2X2. A sequência codificante de xilanase de A. aculeatus GH10 foi amplificada por PCR usando o plasmídeo pA2x2 como molde e os oligonucleotídeos iniciadores 153505 e 153506 mostrados a seguir, usando métodos padrões para render um fragmento de aproximadamente 1,2 kb.

O fragmento de 1,2 kb foi digerido com Bam HI e Xho I (introduzido nos oligonucleotídeos iniciadores de PCR) e clonado no vetor pCaHj527 (WO 2004/099228). O plasmídeo resultante foi determinado pMT2155, em que o DNAc estava sob controle transcricional do promotor de amilase II neutra (NA2) de A. niger e do finalizador AMG de A. niger.

Oligonucleotídeo iniciador 153505: 5’-TCTTGGATCCACCATGGTCGGACTGCTTTCAATCACC-3’ (SEQ ID

NO: 89) Oligonucleotídeo iniciador 153506: 5’-TTAACTCGAGTCACAGACACTGCGAGTAATAGTC-3’ (SEQ ID NO: 90) 5 Os dois oligonucleotídeos iniciadores sintéticos mostrados a seguir foram determinados para amplificar por PCR o gene de A. aculeatus GH10, a partir do plasmídeo pMT2155, e introduzir regiões flanqueantes para a inserção no vetor de expressão pMJ09 (WO 2005/056772). As letras em negrito representam a sequência codificante e a sequência que permanece é homóloga aos sítios de inserção de pMJ09. Oligonucleotídeo iniciador sentido: 5’-cggactgcgcaccatggtcggactgctttcaat-3’ (SEQ ID NO: 91) Oligonucleotídeo iniciador reverso: 5’-tcgccacggagcttatcacagacactgcgagtaat-3’ (SEQ ID NO: 92) Cinquenta picomols de cada um dos oligonucleotídeos iniciadores anteriores foram usados em uma reação de PCR constituída de 50 ng de pMT2155, 1 µL de uma mistura 10 mM de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 5 µL de tampão de DNA polimerase 10X ACCUTAQ™, e 5 unidades de DNA polimerase ACCUTAQ™, em um volume final de 50 µL.

Um EPPENDORF® MASTERCICLOR® 5333 foi usado para amplificar o fragmento de DNA, programado para 1 ciclo a 95 °C por 3 minutos; e 30 ciclos cada a 94 °C por 45 segundos, 55 °C por 60 segundos, e 72 °C por 1 minuto e 30 segundos.

Após os 30 ciclos, a reação foi incubada a 72 °C por 10 minutos e a seguir resfriada a 4 °C, até o processamento adicional.

Os produtos de reação foram isolados por eletroforese em gel de agarose a 1 % usando tampão TAE, onde uma banda do produto de 1,2 kb foi cortada do gel e purificada usando um estojo de extração em gel QIAquick, de acordo com as instruções do fabricante.

O fragmento foi então clonado em pMJ09 usando um estojo de clonagem IN-FUSION™. O vetor foi digerido com Nco I e Pac I e purificado por eletroforese em gel de agarose da maneira descrita anteriormente.

O fragmento de gene de 1,2 kb e o vetor digerido foram ligados juntos em uma reação que resulta no plasmídeo de expressão pSaMe-AaXIL, em que a 5 transcrição do gene da família GH10 estava sob o controle do promotor cbh1 de T. reesei.

A reação de ligação (50 ul) foi composta de tampão 1X IN- FUSION™, BSA 1X, 1 µL de enzima IN-FUSION™ (diluição 1:10), 100 ng de pAlLo2 digerido com Nco I e Pac I, e 100 ng do produto de PCR purificado de GH10 xilanase de A. aculeatus.

A reação foi incubada em temperatura ambiente por 30 minutos.

Um µL da reação foi usada para transformar células competentes de E. coli XL10 SOLOPACK® Gold de acordo com o fabricante.

Um transformante de E. coli contendo pSaMe- AaGH10 foi detectado por digestão com enzima de restrição e o DNA plasmidial foi preparado usando um BIOROBOT® 9600. O sequenciamento de DNA do gene GH10 de A. aculeatus, a partir de pSaMe-AaXIL, foi realizado usando química finalizadora com corante (Giesecke et al., 1992, supra) e a estratégia do oligonucleotídeo iniciador complementar.

Os plasmídeos pSaMe-AaXIL, que codifica a endoglucanase de A. aculeatus GH10, e pSaMe-TrBXIL, que codifica a beta-xilosidase de T. reesei, foram co-transformados em Trichoderma reesei RutC30 por transformação mediada por PEG (Penttila et al., 1987, Gene 61 155-164) para gerar a cepa T. reesei SaMe-BXX13. Cada plasmídeo continha o gene amdS de A. nidulans para possibilitar que os transformantes pudessem crescer em acetamida como a única fonte de nitrogênio.

T. reesei RutC30 foi cultivada a 27°C e 90 rpm, em 25 mL de meio YP suplementado com 2 % (p/v) de glicose e uridina 10 mM por 17 horas.

Os micélios foram coletados por filtração usando um sistema de filtração descartável Vacuum Driven (Millipore, Bedford, MA, USA), e foram lavados duas vezes com água deionizada e duas vezes com sorbitol 1,2

M.

Os protoplastos foram gerados suspendendo os micélios lavados em 20 mL de sorbitol 1,2 M, contendo 15 mg de GLUCANEX™ (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) por mL e 0,36 unidades de quitinase (Sigma Chemical Co., St.

Louis, MO, USA) por mL, e incubando por 15-25 minutos 5 a 34°C com agitação suave a 90 rpm.

Os protoplastos foram coletados por centrifugação por 7 minutos a 400 x g e lavados duas vezes com sorbitol frio 1,2 M.

Os protoplastos foram contados usando um hemocitômetro e re- suspensos em STC em uma concentração final de 1 x 108 protoplastos por mL.

Os protoplastos em excesso foram armazenados em um recipiente de congelamento Cryo 1°C (Nalgene, Rochester, NY, USA) a -80°C.

Aproximadamente 4 µg dos plasmídeos pSaMe-AaXIL e pSaMe-TRBXIL foram digeridos com Pme I e adicionados a 100 µL de solução de protoplasto e misturados suavemente, seguido por 250 µL de CaCl2 10 mM - Tris-HCl 10 mM pH 7,5- PEG 4000 a 60 %, misturados e incubados em temperatura ambiente por 30 minutos.

STC (3 mL) foi então adicionado e misturado, e a solução de transformação foi colocada em placas COVE usando seleção de Aspergillus nidulans amdS.

As placas foram incubadas a 28°C por 5-7 dias.

Os transformantes foram sub-cultivados em placas COVE2 e crescidos a 28°C.

Mais de 40 transformantes foram subcultivados em placas novas contendo acetamida e esporularam naturalmente por 7 dias a 28°C.

Os transformantes de Trichoderma reesei foram cultivados em frascos de agitação com saliências no fundo 125 mL, contendo 25 mL de meio CIM em pH 6,0, inoculando esporos dos transformantes e incubando a 28°C e 200 rpm por 7 dias.

Trichoderma reesei RutC30 foi corrido como como um controle.

As amostras do caldo de cultura foram removidas no dia 5. Um mL de cada caldo de cultura foi centrifugado em 15.700 x g por 5 minutos em uma microcentrífuga, e os sobrenadantes foram transferidos para novos tubos.

SDS-PAGE foi realizada usando géis de Tris-HCl CRITERION® (resolução de 5 %) com um sistema CRITERION® (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Cinco µL dos sobrenadantes do dia 7 (ver anteriormente) foram suspensos em tampão de amostra de Laemmli com 5 concentração 2X (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA), e fervidos na presença de 5 % de beta-mercaptoetanol por 3 minutos.

As amostras do sobrenadante foram colocadas em um gel de poliacrilamida e submetidas à eletroforese com Tris/Glicina/SDS 1X como tampão de corrida (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). O gel resultante foi corado com corante Coomassie BIO-SAFE. O transformante que mostra a melhor expressão tanto da xilanase de A. aculeatus GH10 quanto da beta-xilosidase de T. reesei, com base no gel de proteína, foi determinado T. reesei SaMe- BXX13. Trichoderma reesei SaMe-BXX13 foi cultivado em frascos de 500 mL com saliências no fundo, contendo 250 mL de meio CIM em pH 6,0, inoculados com esporos de T. reesei SaMe-BXX13. Os frascos de agitação foram incubados a 28°C em 200 rpm por cinco dias.

O caldo de cultura foi então filtrado usando uma membrana Plus de 0,22 m EXPRESS™. O caldo filtrado foi concentrado e o tampão foi trocado usando um concentrador de fluxo tangencial (Pall Filtron, Northborough, MA, USA), equipado com uma membrana de poliétersulfona de 10 kDa (Pall Filtron, Northborough, MA, USA) em pH 4,0 com ácido acético.

A amostra foi colocada em uma coluna SP SEPHAROSE® (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA), equilibrada em acetato de sódio 50 mM pH 4,0, que elui proteínas ligadas com um gradiente de cloreto de sódio 0-1.000 mM.

As frações tiveram o tampão trocado para fosfato de sódio 20 mM pH 7,0, usando um concentrador de fluxo tangencial, e foram aplicadas em uma coluna FENIL SUPEROSE™ HR 16/10 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) equilibrada com (NH4)2SO4 1,5 M - fosfato de sódio 20 mM pH 7,0. As proteínas ligadas foram eluídas com um gradiente linear em volumes de coluna 20 de (NH4)2SO4 1,5 a 0 M em Tris-HCl 20 mM pH 7,0. As frações proteicas tiveram o tampão trocado para TEA HCl 20 mM pH 7,5 usando um concentrador de fluxo tangencial.

A amostra foi aplicada em uma coluna de 5 troca iônica MONOQ™ HR 16/10, equilibrada em TEA HCl 20 mM pH 7,5, eluindo proteínas ligadas com um gradiente de cloreto de sódio 0-300 mM.

O tampão das frações proteicas finais foi TEA 20 mM - cloreto de sódio 100 mM pH 7,5. A concentração proteica foi determinada usando um estojo de ensaio proteico Microplate BCA™, em que a albumina sérica bovina foi usada como um padrão proteico.

Exemplo 11: Preparação de celulose inchada com ácido fosfórico A celulose inchada com ácido fosfórico (PASC) foi preparada a partir de AVICEL® PH101 (FMC, Philadelphia, PA, USA), usando o protocolo descrito por Zhang et al., 2006, Biomacromolecules 7: 644–648. Exemplo 12: Celulose inchada com ácido fosfórico (PASC) hidrólise ensaio Uma lama de PASC a 1,0 %, preparada da maneira descrita no exemplo 11, foi completamente ressuspensa por agitação, e rapidamente transferida para um béquer de 100 mL e agitada de maneira rápida com um agitador magnético.

Alíquotas de quinhentos µL da lama de PASC a 1,0 % foram pipetados nos poços de uma placa de 96 poços fundos de 2,0 mL (Axygen, Union City, CA, USA) usando uma micropipeta de 1.000 µL com uma ponta com grande abertura (o final da ponta foi cortado em cerca de 2 mm a partir da base). Cem µL de MnSO4 10 mM - acetato de sódio 500 mM pH 5 foram então adicionados em cada poço.

Duzentos µL tanto de água deionizada quanto de uma solução de pirogalol a 1,0 % (p/p) (Sigma Chemical Co., Inc., St.

Louis, Mo, USA) foram adicionados em cada poço.

As misturas de enzimas foram preparadas e a seguir adicionadas simultaneamente em todos os poços em um volume de 200 µL, para um total de 1 mL em cada reação.

A placa foi então selada usando um selador aquecido de placas ALPS 300™ (Abgene, Epsom, Reino Unido), misturada completamente, e incubada tanto a 50 ºC quanto a 65 ºC por 5 aproximadamente 3 dias.

Todos os experimentos relatados foram realizados em triplicata.

A análise primária das reações de hidrólise foi realizada usando um AGILENT® 1100 HPLC (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA) com software CHEMSTATION® (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA) equipado com uma coluna AMINEX™ HPX- 87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Após aproximadamente 4 dias, a placa de poço fundo foi removida da incubadora e resfriada por toda a noite a 4 ºC.

A placa foi então bem misturada por inversão e centrifugada rapidamente a 52 x g em uma centrífuga SORVALL® RT7 por 10 segundos.

As amostras foram então misturadas com pipetação, e 200 µL de cada poço foram transferidos para um conjunto de placas com filtro de centrífuga MULTISCREEN® HV (Millipore, Bedford, MA, USA). O conjunto de placas com filtro de centrífuga foi centrifugado a 2.000 rpm em uma centrífuga SORVALL® RT7 por 20 minutos.

Os filtrados foram transferidos para uma placa de 96 poços de auto amostragem e diluídos 1:1 com H2SO4 5 mM, selados com esteira de selagem de silício, e inseridos em um módulo injetor de HPLC (ajustado a 4 ºC) para injeção de 20 L em uma coluna de guarda CATION H™, conectada a uma coluna de 4,6 x 250 mm AMINEX® HPX-87H, seguido por eluição com 0,05 % de p/p de ácido benzóico em H2SO4 5 mM.

Os açúcares foram detectados por detecção de índice de refração com quantificação pela integração, comparados aos padrões de açúcar purificado.

Todos os processamentos dos dados de HPLC foram realizados usando software MICROSOFT EXCEL™ (Microsoft, Richland,

WA, USA). As concentrações avaliadas de glicose foram ajustadas com relação ao fator de diluição apropriado.

Neste ensaio, apenas a glicose foi medida, uma vez que a beta-glicosidase estava em níveis elevados em todas as amostras, excluindo o controle.

A conversão percentual relativa foi 5 calculada usando a seguinte equação: % de conversão = [concentração da amostra de glicose] / [concentração de glicose na digestão limite] x 100 A fim de calcular o % de conversão, um ponto de conversão de 100 % foi ajustado, com base na celulase controle de 100 mg de celulase de Trichoderma reesei por grama de celulose (CELLUCLAST PLUS™, Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca), e todos os valores foram divididos por este número e a seguir multiplicado por 100. Os pontos de dados em triplicata tiveram a média calculada e o desvio padrão foi calculado.

Exemplo 13: Efeito da adição de variante GH61B de Aspergillus fumigatus I75V + F77L + F179I + I181L + I183V na conversão de celulose inchada com ácido fosfórico, por beta-glicosidase de Aspergillus fumigatus na presença de pirogalol a 50 ºC e 65 ºC O polipeptídeo tipo selvagem GH61B de A. fumigatus e o variante GH61B de A. fumigatus L90V I75V + F77L + F179I + I181L + I183V foram avaliados com relação a sua capacidade de melhorar a hidrólise de celulose inchada com ácido fosfórico por beta-glicosidase de A. fumigatus CEL3A na presença de pirogalol.

A celulose inchada com o ensaio de hidrólise de ácido fosfórico foi realizada da maneira descrita no exemplo 12. A conversão de celulose inchada com ácido fosfórico (0,5 % de p/p) pela combinação de pirogalol (0,2 % de p/p) e beta-glicosidase de A. fumigatus CEL3A (5 mg de proteína por grama de celulose); a combinação de (0,2 % de p/p) pirogalol, polipeptídeo tipo selvagem GH61B de A. fumigatus (10 mg de proteína por grama de celulose), e beta-glicosidase de A. fumigatus CEL3A (5 mg de proteína por grama de celulose); e a combinação de pirogalol (0,2 % de p/p), variante GH61B de A. fumigatus I75V + F77L + F179I + I181L + I183V (10 mg de proteína por grama de celulose) e beta- glicosidase de A. fumigatus CEL3A (5 mg de proteína por grama de celulose), foram determinadas de acordo com o ensaio descrito no exemplo 12. Os 5 dados foram coletados e analisados, da maneira descrita no exemplo 12, após 72 horas de incubação tanto a 50 oC quanto a 65 oC.

Os resultados são mostrados na figura 1. A combinação de pirogalol (0,2 % de p/p) e beta-glicosidase de A. fumigatus CEL3A (5 mg de proteína por grama de celulose) resultou na conversão de celulose inchada com ácido fosfórico de 2,1 ± 0,3 % e 2,2 ± 1,0 % a 50 oC e 65 oC, respectivamente.

A adição de polipeptídeo tipo selvagem GH61B de A. fumigatus (10 mg de proteína por grama de celulose) na combinação de pirogalol (0,2 % de p/p) e beta-glicosidase de A. fumigatus CEL3A (5 mg de proteína por grama de celulose) resultou na conversão de celulose inchada com ácido fosfórico de 23,8 ± 0,6 % e 16,8 ± 0,4 % a 50 oC e 65 oC, respectivamente.

A adição do variante GH61B de A. fumigatus I75V + F77L + F179I + I181L + I183V (10 mg de proteína por grama de celulose) na combinação de pirogalol (0,2 % de p/p) e beta-glicosidase de A. fumigatus CEL3A (5 mg de proteína por grama de celulose) resultou na conversão de celulose inchada com ácido fosfórico de 29,0 ± 1,0 % e 21,1 ± 0,3 % a 50 ºC e 65 ºC, respectivamente.

Exemplo 14: Ensaio de hidrólise de palha de milho pré- tratada A palha de milho foi pré-tratada no U.S.

Department of Energy National Renewable Energy Laboratory (NREL) usando 1,4 % em peso de ácido sulfúrico a 165 ºC e 107 psi por 8 minutos.

Os sólidos insolúveis em água na palha de milho pré-tratada (PCS) continham aproximadamente 59 % de celulose, 5 % de hemicelulose e 28 % de lignina.

A celulose e hemicelulose foram determinadas por uma hidrólise de ácido sulfúrico de dois estágios, com análise subsequente de açúcares por cromatografia líquida de alto desempenho, usando o procedimento analítico padrão NREL #002. A lignina foi determinada gravimetricamente após hidrolisar as frações de celulose e hemicelulose com ácido sulfúrico, usando o procedimento analítico 5 padrão NREL #003. A hidrólise de PCS foi conduzida usando placas de poço profundo de 2,2 mL (Axygen, Union City, CA, USA) em um volume de reação total de 1,0 mL.

A hidrólise foi realizada com 50 mg de PCS por mL de tampão acetato de sódio 50 mM pH 5,0, contendo sulfato de manganês 1 mM e várias cargas proteicas da composição de celulase (expressas como mg de proteína por grama de celulose). As misturas de enzimas foram preparadas e a seguir adicionadas simultaneamente a todos os poços em um volume de 100 µL, para um volume final de 1 mL em cada reação.

A placa foi então selada usando um selador aquecido de placas ALPS-300™, misturada completamente, e incubada a 50 ºC, 55 ºC, 60 ºC e/ou 65 ºC por 72 horas.

Todos os experimentos foram realizados em triplicata.

Após a hidrólise, as amostras foram filtradas usando uma placa de 96 poços com filtro de 0,45 µm MULTISCREEN® (Millipore, Bedford, MA, USA), e os filtrados foram analisados com relação ao teor de açúcar da maneira descrita a seguir.

Quando não usada imediatamente, as alíquotas de açúcar filtrado foram congeladas a -20 °C.

As concentrações de açúcar das amostras diluídas em H2SO4 0,005 M foram avaliadas usando uma coluna de 4,6 x 250 mm AMINEX® HPX-87H, por eluição com 0,05 % de p/p ácido benzóico - H2SO4 0,005 M em uma vazão de 0,6 mL por minuto a 65 °C, e a quantificação por integração sinal de glicose e celobiose a partir da detecção do índice de refração (CHEMSTATION®, AGILENT® 1100 HPLC, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) foi calibrada por amostras puras de açúcar.

Os equivalentes resultantes foram usados para calcular a conversão do percentual de celulose para cada reação.

O processamento do todos os dados de HPLC foi realizado usando o software MICROSOFT EXCEL™. As concentrações avaliadas de açúcar foram ajustadas para o fator de diluição apropriado.

A glicose e celobiose foram avaliadas individualmente.

Entretanto, para calcular a 5 conversão total, os valores de glicose e celobiose foram combinados.

A concentração de celobiose foi multiplicada por 1,053, a fim de converter em equivalentes de glicose, e adicionada à concentração de glicose.

O grau de conversão de celulose foi calculado usando a seguinte equação: % de conversão = [concentração de amostra de glicose] / [concentração de glicose em uma digestão limite] x 100 A fim de calcular o % de conversão, um ponto de conversão de 100 % foi ajustado com base em uma celulase controle de 100 mg, da composição de celulase por grama de celulose (CELLUCLAST PLUS™, Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca), e todos os valores foram divididos por este número e a seguir multiplicados por 100. Os dados em triplicata tiveram suas médias calculadas e o desvio padrão foi calculado.

Exemplo 15: Efeito da adição de variante GH61B de Aspergillus fumigatus I75V + F77L + F179I + I181L + I183V na conversão de PCS, por uma composição de celulase de Trichoderma reesei e beta-glicosidase de Aspergillus fumigatus CEL3A a 50 °C e 55 °C Uma composição de celulase de Trichoderma reesei cepa 981- O-8 (D4) foi preparada de acordo com protocolo de fermentação descrito a seguir.

T. reesei cepa 981-O-8 (D4) é uma cepa mutagenizada de Trichoderma reesei RutC30 (ATCC 56765; Montenecourt e Eveleigh, 1979, Adv.

Chem.

Ser. 181: 289-301). A composição da celulase é similar à CELLUCLAST (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca). A composição de celulase foi suplementada com beta-glicosidase de Aspergillus fumigatus.

A composição de celulase suplementada com beta-glicosidase de A. fumigatus é determinada nos exemplos como “composição de celulase de Trichoderma reesei”. O meio do frasco de agitação foi composto de 20 g de dextrose, 10 g de concentrados de água de lavagem de milho, 1,45 g de (NH4)2SO4, 2,08 g de KH2PO4, 0,36 g de CaCl2, 0,42 g de MgSO4·7H2O, 0,42 5 mL de solução de metais traço, e água deionizada para 1 litro.

A solução de metais traço foi composta de 216 g de FeCl3·6H2O, 58 g de ZnSO4·7H2O, 27 g de MnSO4·H2O, 10 g de CuSO4·5H2O, 2,4 g de H3BO3, 336 g de ácido cítrico, e água deionizada para 1 litro.

Cem mL do meio do frasco de agitação foram adicionados a um frasco de agitação de 500 mL.

O frasco de agitação foi inoculado com dois plugues a partir de uma cultura sólida em placa, e incubado a 28 ºC em um agitador orbital em 200 rpm por 48 horas.

Cinquenta mL do caldo frasco de agitação foi usado para inocular um vaso de fermentação de 2 litros.

O meio de fermentação em lotes foi composto de 30 g de celulose, 4 g de dextrose, 10 g de concentrados de água de lavagem de milho, 3,8 g de (NH4)2SO4, 2,8 g de KH2PO4, 2,64 g de CaCl2, 1,63 g de MgSO4.7H2O, 1,8 mL de anti-espuma, 0,66 mL de solução de metais traço, e água deionizada para 1 litro.

A solução de metais traço foi composta de 216 g de FeCl3·6H2O, 58 g de ZnSO4·7H2O, 27 g de MnSO4·H2O, 10 g de CuSO4·5H2O, 2,4 g de H3BO3, 336 g de ácido cítrico, e água deionizada para 1 litro.

O meio de alimentação da fermentação foi composto de dextrose.

Um total de 1,8 litro do meio de fermentação em lotes foi adicionado a um fermentador revestido de vidro de três litros da Applikon Biotechnology.

O meio de alimentação da fermentação foi dosado em uma taxa de 0 a 4 g/L/h por um período de 185 horas.

O vaso de fermentação foi mantido em uma temperatura de 28 ºC, e o pH foi controlado usando um sistema de controle Applikon 1030 em um ponto de ajuste de 4,5 +/- 0,1. O ar foi adicionado ao vaso em uma taxa de 1 vvm e o caldo foi agitado por rotação impulsora Rushton em 1.100 a 1.300 rpm.

No final da fermentação,

todo o caldo foi coletado do vaso e centrifugado em 3.000 x g para remover a biomassa.

O sobrenadante foi esterilizado por filtração e armazenado em 5 a 10 ºC.

O polipeptídeo tipo selvagem GH61B de A. fumigatus e o 5 variante GH61B de A. fumigatus I75V + F77L + F179I + I181L + I183V foram avaliados com relação à sua capacidade para melhorar a hidrólise de PCS pela combinação da composição de celulase de Trichoderma reesei e beta-glicosidase de A. fumigatus CEL3A, tanto a 50 ºC quanto a 55 ºC.

O ensaio de hidrólise de PCS foi realizado da maneira descrita no exemplo 14. A conversão de PCS pela combinação da composição de celulase de T. reesei (2,7 mg de proteína por grama de celulose) e beta- glicosidase de A. fumigatus CEL3A (0,3 mg de proteína por grama de celulose); a combinação da composição de celulase de T. reesei (2,7 mg de proteína por grama de celulose), polipeptídeo tipo selvagem GH61B de A. fumigatus (0,3 mg de proteína por grama de celulose), e beta-glicosidase de A. fumigatus CEL3A (0,3 mg de proteína por grama de celulose); a combinação da composição de celulase de T. reesei (2,7 mg de proteína por grama de celulose), polipeptídeo tipo selvagem GH61B de A. fumigatus (0,45 mg de proteína por grama de celulose), e beta-glicosidase de A. fumigatus CEL3A (0,3 mg de proteína por grama de celulose); a combinação da composição de celulase de T. reesei (2,7 mg de proteína por grama de celulose), polipeptídeo tipo selvagem GH61B de A. fumigatus (0,6 mg de proteína por grama de celulose), e beta-glicosidase de A. fumigatus CEL3A (0,3 mg de proteína por grama de celulose); a combinação de uma composição de celulase de Trichoderma (2,7 mg de proteína por grama de celulose), polipeptídeo tipo selvagem GH61B de A. fumigatus (0,75 mg de proteína por grama de celulose), e beta-glicosidase de A. fumigatus CEL3A (0,3 mg de proteína por grama de celulose); a combinação da composição de celulase de T. reesei (2,7 mg de proteína por grama de celulose), variante GH61B de A. fumigatus I75V

+ F77L + F179I + I181L + I183V (0,3 mg de proteína por grama de celulose), e beta-glicosidase de A. fumigatus CEL3A (0,3 mg de proteína por grama de celulose); a combinação da composição de celulase de T. reesei (2,7 mg de proteína por grama de celulose), variante GH61B de A. fumigatus I75V + 5 F77L + F179I + I181L + I183V (0,45 mg de proteína por grama de celulose), e beta-glicosidase de A. fumigatus CEL3A (0,3 mg de proteína por grama de celulose); a combinação da composição de celulase de T. reesei (2,7 mg de proteína por grama de celulose), variante GH61B de A. fumigatus I75V + F77L + F179I + I181L + I183V (0,6 mg de proteína por grama de celulose), e beta-glicosidase de A. fumigatus CEL3A (0,3 mg de proteína por grama de celulose); e a combinação da composição de celulase de T. reesei (2,7 mg de proteína por grama de celulose), variante GH61B de A. fumigatus I75V + F77L + F179I + I181L + I183V (0,75 mg de proteína por grama de celulose), e beta-glicosidase de A. fumigatus CEL3A (0,3 mg de proteína por grama de celulose) foram determinadas de acordo com o exemplo 15. Os dados foram coletados e analisados, da maneira descrita no exemplo 15, após 72 horas de incubação tanto a 50 ºC quanto a 55 ºC.

Os resultados para 50 ºC e 55 ºC são mostrados nas figuras 2A e 2B, respectivamente.

A combinação da composição de celulase de T. reesei (2,7 mg de proteína por grama de celulose) e beta-glicosidase de A. fumigatus CEL3A (0,3 mg de proteína por grama de celulose) resultou na conversão de PCS de 53,5 ± 0,2 % e 52,2 ± 0,3 % a 50 ºC e 55 ºC, respectivamente.

A combinação da composição de celulase de T. reesei (2,7 mg de proteína por grama de celulose), polipeptídeo tipo selvagem GH61B de A. fumigatus (0,3 mg de proteína por grama de celulose), e beta-glicosidase de A. fumigatus CEL3A (0,3 mg de proteína por grama de celulose) resultou em conversão de PCS de 62,6 ± 0,1 % e 61,5 ± 0,4 % a 50 ºC e 55 ºC, respectivamente.

A combinação da composição de celulase de T. reesei (2,7 mg de proteína por grama de celulose), polipeptídeo tipo selvagem GH61B de

A. fumigatus (0,45 mg de proteína por grama de celulose), e beta-glicosidase de A. fumigatus CEL3A (0,3 mg de proteína por grama de celulose) resultou em conversão de PCS de 64,3 ± 0,1 % e 63,4 ± 0,1 % a 50 ºC e 55 ºC, respectivamente. 5 A combinação da composição de celulase de T. reesei (2,7 mg de proteína por grama de celulose), polipeptídeo tipo selvagem GH61B de A. fumigatus (0,6 mg de proteína por grama de celulose), e beta-glicosidase de A. fumigatus CEL3A (0,3 mg de proteína por grama de celulose) resultou em conversão de PCS de 65,0 ± 0,5 % e 64,5 ± 0,6 % a 50 ºC e 55 ºC, respectivamente.

A combinação da composição de celulase de T. reesei (2,7 mg de proteína por grama de celulose), polipeptídeo tipo selvagem GH61B de A. fumigatus (0,75 mg de proteína por grama de celulose), e beta-glicosidase de A. fumigatus CEL3A (0,3 mg de proteína por grama de celulose) resultou em conversão de PCS de 66,4 ± 0,2 % e 66,1 ± 0,4 % a 50 ºC e 55 ºC, respectivamente.

A combinação da composição de celulase de T. reesei (2,7 mg de proteína por grama de celulose), variante GH61B de A. fumigatus I75V + F77L + F179I + I181L + I183V (0,3 mg de proteína por grama de celulose), e beta-glicosidase de A. fumigatus CEL3A (0,3 mg de proteína por grama de celulose) resultou em conversão de PCS de 63,3 ± 0,3 % e 62,3 ± 0,4 % a 50 ºC e 55 ºC, respectivamente.

A combinação da composição de celulase de T. reesei (2,7 mg de proteína por grama de celulose), variante GH61B de A. fumigatus I75V + F77L + F179I + I181L + I183V (0,45 mg de proteína por grama de celulose), e beta-glicosidase de A. fumigatus CEL3A (0,3 mg de proteína por grama de celulose) resultou em conversão de PCS de 65,0 ± 0,2 % e 64,5 ± 0,2 % a 50 ºC e 55 ºC, respectivamente.

A combinação da composição de celulase de T. reesei (2,7 mg de proteína por grama de celulose), variante GH61B de A. fumigatus I75V + F77L + F179I + I181L + I183V (0,6 mg de proteína por grama de celulose), e beta-glicosidase de A.

fumigatus CEL3A (0,3 mg de proteína por grama de celulose) resultou em conversão de PCS de 65,7 ± 0,2 % e 65,7 ± 0,5 % a 50 ºC e 55 ºC, respectivamente.

A combinação da composição de celulase de T. reesei (2,7 mg de proteína por grama de celulose), variante GH61B de A. fumigatus I75V 5 + F77L + F179I + I181L + I183V (0,75 mg de proteína por grama de celulose), e beta-glicosidase de A. fumigatus CEL3A (0,3 mg de proteína por grama de celulose) resultou em conversão de PCS de 67,0 ± 0,2 % e 66,9 ± 0,3 % a 50 ºC e 55 ºC, respectivamente.

Exemplo 16: Efeito da adição de variante GH61B de Aspergillus fumigatus I75V + F77L + F179I + I181L + I183V na conversão de PCS, por uma composição de celulase em temperatura elevada a 50 ºC, 55 ºC, 60 ºC, e 65 ºC Uma mistura de enzimas celulase, determinadas como “composição de celulase de temperatura elevada”, foi preparada misturando componentes da enzima preparados nas seguintes razões (de proteína total): 43,5 % de celobioidrolase I de Aspergillus fumigatus, 29,4 % de celobioidrolase II de Aspergillus fumigatus, 5,9 % de beta-glicosidase de Aspergillus fumigatus, 5,9 % de xilanase 3 de Aspergillus fumigatus GH10, 3,5 % de beta-xilosidase de Trichoderma reesei, e 11,8 % de CEL5A endoglucanase II de Trichoderma reesei.

A composição, quando usada no ensaio em 3 mg de proteína total por grama de celulose, apresentou as seguintes cargas de enzima por grama de celulose: 1,31 mg de celobioidrolase I de A. fumigatus por grama de celulose, 0,88 mg de celobioidrolase II de A. fumigatus por grama de celulose, 0,18 mg de beta-glicosidase de A. fumigatus por grama de celulose, 0,18 mg de xilanase 3 de Aspergillus fumigatus GH10 por grama de celulose, 0,11 mg de beta-xilosidase de T. reesei por grama de celulose, e 0,35 mg de endoglucanase II de T. reesei CEL5A por grama de celulose.

O polipeptídeo tipo selvagem GH61B de A. fumigatus e variante GH61B de A. fumigatus I75V + F77L + F179I + I181L + I183V foram avaliados com relação à sua capacidade de melhorar a hidrólise de PCS pela composição de celulase em temperatura elevada, a 50 ºC, 55 ºC, 60 ºC, e 65 ºC. o ensaio de hidrólise de palha de milho pré-tratada foi realizado da maneira descrita no exemplo 14. 5 A conversão de palha de milho pré-tratada pela composição de celulase em temperatura elevada (3 mg de proteína por grama de celulose); a combinação da composição de celulase em temperatura elevada (3 mg de proteína por grama de celulose) e polipeptídeo tipo selvagem GH61B de A. fumigatus (0,45 mg de proteína por grama de celulose); a combinação da composição de celulase em temperatura elevada (3 mg de proteína por grama de celulose) e polipeptídeo tipo selvagem GH61B de A. fumigatus (0,75 mg de proteína por grama de celulose); a combinação da composição de celulase em temperatura elevada (3 mg de proteína por grama de celulose) e variante GH61B de A. fumigatus I75V + F77L + F179I + I181L + I183V (0,45 mg de proteína por grama de celulose); e a combinação da composição de celulase em temperatura elevada (3 mg de proteína por grama de celulose) e variante GH61B de A. fumigatus I75V + F77L + F179I + I181L + I183V (0,75 mg de proteína por grama de celulose) foram ensaiadas da maneira descrita no exemplo 14. Os dados foram coletados e analisados, da maneira descrita no exemplo 14, após 72 horas de incubação, a 50 ºC, 55 ºC, 60 ºC e 65 ºC.

Os resultados para a adição de 0,45 mg de polipeptídeo GH61 por grama de celulose, e a adição de 0,75 mg de polipeptídeo GH61 por grama de celulose, são mostrados nas figuras 3A e 3B, respectivamente.

A composição de celulase em temperatura elevada (3 mg de proteína por grama de celulose) resultou em conversão de palha de milho pré- tratada de 48,5 ± 0,3 %, 52,0 ± 0,1 %, 43,7 ± 0,2 %, e 36,4 ± 0,1 % a 50 ºC, 55 ºC, 60 ºC e 65 ºC, respectivamente.

A combinação da composição de celulase em temperatura elevada (3 mg de proteína por grama de celulose) e polipeptídeo tipo selvagem GH61B de A. fumigatus (0,45 mg de proteína por grama de celulose) resultou em conversão de PCS de 60,4 ± 0,2 %, 65,8 ± 0,1 %, 55,8 ± 0,1 %, e 45,2 ± 0,2 % a 50 ºC, 55 ºC, 60 ºC, ou 65 ºC, respectivamente.

A combinação da composição de celulase em temperatura elevada (3 mg de 5 proteína por grama de celulose) e polipeptídeo tipo selvagem GH61B de A. fumigatus (0,75 mg de proteína por grama de celulose) resultou em conversão de PCS de 61,9 ± 0,1 %, 67,6 ± 0,2 %, 57,8 ± 0,3 %, e 45,5 ± 0,7 % a 50 ºC, 55 ºC, 60 ºC e 65 ºC, respectivamente.

A combinação da composição de celulase em temperatura elevada (3 mg de proteína por grama de celulose) e variante GH61B de A. fumigatus I75V + F77L + F179I + I181L + I183V (0,45 mg de proteína por grama de celulose) resultou em conversão de PCS de 51.4 ± 0,7 %, 66,9 ± 0,5 %, 56,8 ± 0,4 %, e 46,2 ± 0,1 % a 50 ºC, 55 ºC, 60 ºC e 65 ºC, respectivamente.

A combinação da composição de celulase em temperatura elevada (3 mg de proteína por grama de celulose) e variante GH61B de A. fumigatus I75V + F77L + F179I + I181L + I183V (0,75 mg de proteína por grama de celulose) resultou em conversão de PCS de 62,3 ± 0,2 %, 68,3 ± 0,2 %, 58,8 ± 0,4 %, e 46,2 ± 1,1 % a 50 ºC, 55 ºC, 60 ºC e 65 ºC, respectivamente.

Exemplo 17: Determinação de Td (temperatura de desnaturação) do polipeptídeo tipo selvagem GH61B de Aspergillus fumigatus e do variante GH61B de Aspergillus fumigatus I75V + F77L + F179I + I181L + I183V por calorimetria exploratória diferencial A termoestabilidade do polipeptídeo tipo selvagem GH61B de A. fumigatus e do polipeptídeo GH61 do variante do GH61B de Aspergillus fumigatus I75V + F77L + F179I + I181L + I183V foram determinadas por calorimetria exploratória diferencial (DSC), usando um calorímetro exploratório diferencial de capilaridade VP com auto-amostrador (MicroCal

Inc., GE Health Care, Piscataway, NJ, USA). A temperatura de desnaturação térmica, Td (°C), foi obtida como a parte mais elevada do pico de desnaturação (principal pico endotérmico) em termogramas (Cp vs. T), obtido após aquecer as soluções de enzima em acetato de sódio 50 mM pH 5,0, com 5 TRITON® X100 100 ppm adicionado em uma taxa de aquecimento programada constante. Aproximadamente 0,4 mL de amostra e as soluções de referências foram armazenadas a 10 ºC antes do carregamento das amostras no calorímetro. A amostra e as soluções de referência (referência: tampão sem enzima) foram carregadas automaticamente em DSC e pré-equilibradas termicamente por 20 minutos a 20 °C, antes da varredura DSC ser realizada de 20 °C a 90 °C, em uma taxa de varredura de 200 K/hr. As temperaturas de desnaturação foram determinadas em uma precisão de aproximadamente +/- 1 °C. Os resultados são mostrados nas figuras 4A e 4B. Por calorimetria exploratória diferencial, o polipeptídeo tipo selvagem GH61B de A. fumigatus apresenta uma Td de aproximadamente 68 °C em pH 5 (Figura 5A), enquanto o polipeptídeo GH61 do variante GH61B de Aspergillus fumigatus I75V + F77L + F179I + 181L + I183V apresenta uma Td de aproximadamente 74 °C em pH 5 (Figura 5B). A presente invenção é descrita adicionalmente pelos seguintes parágrafos numerados:

[1] Um variante, compreendendo uma substituição em uma ou mais posições que correspondem às posições 75, 77, 179, 181 e 183 do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, em que o variante apresenta atividade intensificadora celulolítica.

[2] O variante do parágrafo 1, que é um variante de um polipeptídeo parental com atividade intensificadora celulolítica selecionado do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo com pelo menos 60 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza em pelo menos condições de severidade baixa com (i) a sequência codificante de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de DNAc deste, ou (iii) o complemento de tamanho total de (i) ou (ii); (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 60 % de identidade de 5 sequência com a sequência codificante de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou a sequência de DNAc deste; e (d) um fragmento do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, que apresenta atividade intensificadora celulolítica.

[3] O variante do parágrafo 2, em que o polipeptídeo parental com atividade intensificadora celulolítica apresenta pelo menos 60 %, por exemplo, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 81 %, pelo menos 82 %, pelo menos 83 %, pelo menos 84 %, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[4] O variante do parágrafo 2, em que o polipeptídeo parental com atividade intensificadora celulolítica é codificado por um polinucleotídeo que hibridiza em condições de severidade baixa, condições de severidade média, condições de severidade média-alta, condições de severidade alta, ou condições de severidade muito alta com (i) a sequência codificante de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de DNAc deste, ou (iii) o complemento de tamanho total de (i) ou (ii).

[5] O variante do parágrafo 2, em que o polipeptídeo parental com atividade intensificadora celulolítica é codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 60 %, por exemplo, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 81 %, pelo menos 82 %, pelo menos 83 %, pelo menos 84 %, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 % de identidade de sequência com a sequência 5 codificante de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou a sequência de DNAc deste.

[6] O variante do parágrafo 2, em que o polipeptídeo parental com atividade intensificadora celulolítica compreende ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[7] O variante do parágrafo 2, em que o polipeptídeo parental com atividade intensificadora celulolítica é um fragmento do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, em que o fragmento apresenta atividade intensificadora celulolítica.

[8] O variante do parágrafo 2, que apresenta pelo menos 60 %, por exemplo, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 81 %, pelo menos 82 %, pelo menos 83 %, pelo menos 84 %, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, mas menos de 100 %, de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos do polipeptídeo parental com atividade intensificadora celulolítica.

[9] O variante de qualquer dos parágrafos 1-8, que apresenta pelo menos 60 %, por exemplo, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 81 %, pelo menos 82 %, pelo menos 83 %, pelo menos 84 %, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, mas menos de 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[10] O variante de qualquer dos parágrafos 1-9, em que o variante consiste em 200 a 220 aminoácidos, por exemplo, 205 a 220, 210 a 5 220, e 215 a 220 aminoácidos.

[11] O variante de qualquer dos parágrafos 1-10, em que o número de substituições é 1-5, por exemplo, tal como 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições.

[12] O variante de qualquer dos parágrafos 1-11, que compreende uma substituição em uma posição que corresponde à posição 75.

[13] O variante do parágrafo 12, em que a substituição é Val.

[14] O variante de qualquer dos parágrafos 1-13, que compreende uma substituição em uma posição que corresponde à posição 77.

[15] O variante do parágrafo 14, em que a substituição é Ser.

[16] O variante de qualquer dos parágrafos 1-15, que compreende uma substituição em uma posição que corresponde à posição

179.

[17] O variante do parágrafo 16, em que a substituição é Leu.

[18] O variante de qualquer dos parágrafos 1-17, que compreende uma substituição em uma posição que corresponde à posição

181.

[19] O variante do parágrafo 18, em que a substituição é Trp.

[20] O variante de qualquer dos parágrafos 1-17, que compreende uma substituição em uma posição que corresponde à posição

183.

[21] O variante do parágrafo 20, em que a substituição é Val.

[22] O variante de qualquer dos parágrafos 1-21, que compreende uma substituição em duas posições que correspondem a qualquer das posições 75, 77, 179, 181 e 183.

[23] O variante de qualquer dos parágrafos 1-21, que compreende uma substituição em três posições que correspondem a qualquer das posições 75, 77, 179, 181 e 183.

[24] O variante de qualquer dos parágrafos 1-21, que 5 compreende uma substituição em quatro posições que correspondem a qualquer das posições 75, 77, 179, 181 e 183.

[25] O variante de qualquer dos parágrafos 1-21, que compreende uma substituição em cada posição que corresponde às posições 75, 77, 179, 181 e 183.

[26] O variante de qualquer dos parágrafos 1-25, que compreende ou consiste em uma ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em I75V, F77L, F179I, I181L e I183V.

[27] O variante de qualquer dos parágrafos 1-25, que compreende ou consiste nas substituições I75V + F77L do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[28] O variante de qualquer dos parágrafos 1-25, que compreende ou consiste nas substituições I75V + F179I do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[29] O variante de qualquer dos parágrafos 1-25, que compreende ou consiste nas substituições I75V + I181L do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[30] O variante de qualquer dos parágrafos 1-25, que compreende ou consiste nas substituições I75V + I183V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[31] O variante de qualquer dos parágrafos 1-25, que compreende ou consiste nas substituições F77L + F179I do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[32] O variante de qualquer dos parágrafos 1-25, que compreende ou consiste nas substituições F77L + I181L do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[33] O variante de qualquer dos parágrafos 1-25, que compreende ou consiste nas substituições F77L + I183V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. 5 [34] O variante de qualquer dos parágrafos 1-25, que compreende ou consiste nas substituições F179I + I181L do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[35] O variante de qualquer dos parágrafos 1-25, que compreende ou consiste nas substituições F179I + I183V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[36] O variante de qualquer dos parágrafos 1-25, que compreende ou consiste nas substituições I181L + I183V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[37] O variante de qualquer dos parágrafos 1-25, que compreende ou consiste nas substituições I75V + F77L + F179I do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[38] O variante de qualquer dos parágrafos 1-25, que compreende ou consiste nas substituições I75V + F77L + I181L do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[39] O variante de qualquer dos parágrafos 1-25, que compreende ou consiste nas substituições I75V + F77L + I183V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[40] O variante de qualquer dos parágrafos 1-25, que compreende ou consiste nas substituições I75V + F179I + I181L do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[41] O variante de qualquer dos parágrafos 1-25, que compreende ou consiste nas substituições I75V + F179I + I183V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[42] O variante de qualquer dos parágrafos 1-25, que compreende ou consiste nas substituições I75V + I181L + I183V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[43] O variante de qualquer dos parágrafos 1-25, que compreende ou consiste nas substituições F77L + F179I + I181L do 5 polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[44] O variante de qualquer dos parágrafos 1-25, que compreende ou consiste nas substituições F77L + F179I + I183V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[45] O variante de qualquer dos parágrafos 1-25, que compreende ou consiste nas substituições F179I + I181L + I183V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[46] O variante de qualquer dos parágrafos 1-25, que compreende ou consiste nas substituições F77L + I181L + I183V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[47] O variante de qualquer dos parágrafos 1-25, que compreende ou consiste nas substituições I75V + F77L + F179I + I181L do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[48] O variante de qualquer dos parágrafos 1-25, que compreende ou consiste nas substituições I75V + F179I + I181L + I183V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[49] O variante de qualquer dos parágrafos 1-25, que compreende ou consiste nas substituições I75V + F77L + I181L + I183V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[50] O variante de qualquer dos parágrafos 1-25, que compreende ou consiste nas substituições I75V + F77L + F179I + I183V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[51] O variante de qualquer dos parágrafos 1-25, que compreende ou consiste nas substituições F77L + F179I + I181L + I183V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[52] O variante de qualquer dos parágrafos 1-25, que compreende ou consiste nas substituições I75V + F77L + F179I + I181L + I183V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[53] Um polinucleotídeo isolado que codifica o variante de 5 qualquer dos parágrafos 1-52.

[54] Um construto de ácido nucléico compreendendo o polinucleotídeo do parágrafo 53.

[55] Um vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo do parágrafo 53.

[56] Uma célula hospedeira compreendendo o polinucleotídeo do parágrafo 53.

[57] Um método de produzir um variante, compreendendo: (a) cultivar o célula hospedeira do parágrafo 56 em condições adequadas para a expressão do variante; e (b) recuperar o variante.

[58] Uma planta transgênica, parte da planta ou célula de planta transformada com o polinucleotídeo do parágrafo 53.

[59] Um método de produzir o variante de qualquer dos parágrafos 1-52, compreendendo: (a) cultivar um planta transgênica ou uma célula de planta compreendendo um polinucleotídeo que codifica o variante em condições condutivas para a produção do variante; e (b) recuperar o variante.

[60] Um método para obter um variante, compreendendo introduzir em um polipeptídeo parental uma substituição em uma ou mais posições que correspondem às posições 75, 77, 179, 181 e 183 do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, em que o variante apresenta atividade intensificadora celulolítica; e recuperar o variante.

[61] Um método para degradar ou converter um material celulósico, compreendendo: tratar o material celulósico com uma composição enzimática na presença do variante de qualquer dos parágrafos 1-52.

[62] O método do parágrafo 61, em que o material celulósico é pré-tratado.

[63] O método do parágrafo 61 ou 62, compreendendo adicionalmente recuperar o material celulósico degradado.

[64] O método de qualquer dos parágrafos 61-63, em que a 5 composição enzimática compreende uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptídeo com atividade intensificadora celulolítica, uma hemicelulase, uma expansina, uma esterase, uma lacase, uma enzima lignolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease e uma swolenina.

[65] O método do parágrafo 64, em que a celulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma endoglucanase, uma celobioidrolase e uma beta-glicosidase.

[66] O método do parágrafo 64, em que a hemicelulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma xilanase, uma acetilxilano esterase, uma feruloil esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase e uma glicuronidase.

[67] O método de qualquer dos parágrafos 61-66, em que o material celulósico degradado é um açúcar.

[68] O método do parágrafo 64, em que o açúcar é selecionado do grupo que consiste em glicose, xilose, manose, galactose e arabinose.

[69] Um método para produzir um produto de fermentação, compreendendo: (a) sacarificar um material celulósico com uma composição enzimática na presença do variante de qualquer dos parágrafos 1-52; (b) fermentar o material celulósico sacarificado com um ou mais microrganismos fermentadores para produzir o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

[70] O método do parágrafo 69, em que o material celulósico é pré-tratado.

[71] O método do parágrafo 69 ou 70, em que a composição enzimática compreende uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptídeo com atividade intensificadora celulolítica, uma hemicelulase, uma expansina, uma esterase, uma lacase, uma enzima lignolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease e uma 5 swolenina.

[72] O método do parágrafo 71, em que o celulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma endoglucanase, uma celobioidrolase e uma beta-glicosidase.

[73] O método do parágrafo 71, em que a hemicelulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma xilanase, uma acetilxilano esterase, uma feruloil esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase e uma glicuronidase.

[74] O método de qualquer dos parágrafos 69-73, em que as etapas (a) e (b) são realizadas simultaneamente em uma sacarificação e fermentação simultâneas.

[75] O método de qualquer dos parágrafos 69-74, em que o produto de fermentação é um álcool, um ácido orgânico, uma cetona, um aminoácido ou um gás.

[76] Um método de fermentar um material celulósico, compreendendo: fermentar o material celulósico com um ou mais microrganismos fermentadores, em que o material celulósico é sacarificado com uma composição enzimática na presença do variante de qualquer dos parágrafos 1-52.

[77] O método do parágrafo 76, em que o material celulósico é pré-tratado antes da sacarificação.

[78] O método do parágrafo 76 ou 77, em que a composição enzimática compreende uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptídeo com atividade intensificadora celulolítica, uma hemicelulase, uma expansina, uma esterase, uma lacase, uma enzima lignolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease e uma swolenina.

[79] O método do parágrafo 78, em que a celulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma endoglucanase, 5 uma celobioidrolase e uma beta-glicosidase.

[80] O método do parágrafo 78, em que a hemicelulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma xilanase, uma acetilxilano esterase, uma feruloil esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase e uma glicuronidase.

[81] O método de qualquer dos parágrafos 76-80, em que a fermentação do material celulósico sintetiza um produto de fermentação.

[82] O método do parágrafo 81, compreendendo adicionalmente recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

[83] O método de qualquer dos parágrafos 81 ou 82, em que o produto de fermentação é um álcool, um ácido orgânico, uma cetona, um aminoácido ou um gás.

[84] Uma composição detergente que compreende o variante de qualquer dos parágrafos 1-52 e um agente tensoativo.

[85] Uma formaulação de caldo completo ou composição de cultura de células que compreende o polipeptídeo de qualquer dos parágrafos 1-

52. A invenção aqui descrita e reivindicada não é limitada no escopo pelos aspectos específicos aqui revelados, uma vez que estes aspectos são pretendidos como ilustrações de vários aspectos da invenção. Qualquer dos aspectos equivalentes são pretendidos para estar no escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção, além daquelas aqui mostradas e descritas, se tornarão evidentes aos versados na técnica, a partir da descrição precedente. Também pretende-se que tais modificações estejam no escopo das reivindicações em anexo. No caso de conflito, a presente revelação, incluindo as definições, prevalecerá.

Claims (20)

REIVINDICAÇÕES

1. Variante, caracterizado pelo fato de que compreende uma substituição em uma ou mais posições que correspondem às posições 75, 77, 179, 181 e 183 do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, em que o variante 5 apresenta atividade intensificadora celulolítica e a variante apresenta pelo menos 60 %, por exemplo, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95%, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência, mas menos do que 100 % de identidade de sequência, com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

2. Variante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é um variante de um polipeptídeo parental com atividade intensificadora celulolítica selecionado do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo com pelo menos 60 %, por exemplo, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 81 %, pelo menos 82 %, pelo menos 83 %, pelo menos 84 %, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza em pelo menos condições de severidade baixa, por exemplo, condições de severidade média, condições de severidade média-alta, condições de severidade alta, ou condições de severidade muito alta com (i) a sequência codificante de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de DNAc deste, ou (iii) o complemento de tamanho total de (i) ou (ii); (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 60 %, por exemplo, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 81 %, pelo menos 82 %, pelo menos 83 %, pelo menos 84 %, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo 5 menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 % identidade de sequência com a sequência codificante de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou a sequência de DNAc deste; e (d) um fragmento do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, que apresenta atividade intensificadora celulolítica.

3. Variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a substituição em uma posição correspondendo à posição 75 é Val; a substituição em uma posição correspondendo à posição 77 é Ser; a substituição em uma posição correspondendo à posição 179 é Ile; a substituição em uma posição correspondendo à posição 181 é Trp; e a substituição em uma posição correspondendo à posição 183 é Val.

4. Variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende ou consiste na(s) substituição(ões) I75V; F77L; F179I; I181L; I183V; I75V + F77L; I75V + F179I; I75V + I181L; I75V + I183V; F77L + F179I; F77L + I181L; F77L + I183V; F179I + I181L; F179I + I183V; I181L + I183V; I75V + F77L + F179I; I75V + F77L + I181L; I75V + F77L + I183V; I75V + F179I + I181L; I75V + F179I + I183V; I75V + I181L + I183V; F77L + F179I + I181L; F77L + F179I + I183V; F179I + I181L + I183V; F77L + I181L + I183V; I75V + F77L + F179I + I181L; I75V + F179I + I181L + I183V; I75V + F77L + I181L + I183V; I75V + F77L + F179I + I183V; F77L + F179I + I181L + I183V; ou I75V + F77L + F179I + I181L + I183V do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

5. Variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que apresenta atividade térmica aumentada e/ou termoestabilidade aumentada em relação ao parental do variante.

6. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que 5 codifica o variante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.

7. Célula hospedeira recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 6.

8. Método para produzir um variante, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultivar a célula hospedeira recombinante como definida na reivindicação 7, em condições adequadas para a expressão do variante; e (b) recuperar o variante.

9. Método para produzir um variante tendo atividade intensificadora celulolítica, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultivar uma planta transgênica ou uma célula de planta transformada com o polinucleotídeo como definido na reivindicação 6, em condições condutivas para a produção do variante; e (b) recuperar o variante.

10. Método para degradar um material celulósico, caracterizado pelo fato de que compreende: tratar o material celulósico com uma composição enzimática na presença do variante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o material celulósico é pré- tratado.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente recuperar o material celulósico degradado.

12. Método de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o material celulósico degradado é um açúcar selecionado do grupo que consiste de glicose, xilose, manose, galactose, e arabinose.

13. Método para produzir um produto de fermentação, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) sacarificar um material celulósico com uma composição 5 enzimática na presença do variante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o material celulósico é pré-tratado; (b) fermentar o material celulósico sacarificado com um ou mais microrganismos fermentadores para produzir o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que as etapas (a) e (b) são realizadas simultaneamente em uma sacarificação e fermentação simultâneas.

15. Método para fermentar um material celulósico, caracterizado pelo fato de que compreende: fermentar o material celulósico com um ou mais microrganismos fermentadores, em que o material celulósico é sacarificado com uma composição enzimática na presença do variante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e em que o material celulósico é pré-tratado antes da sacarificação.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a fermentação do material celulósico produz um produto de fermentação.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13, 14, 16 e 17, caracterizado pelo fato de que o produto de fermentação é um álcool, um ácido orgânico, uma cetona, um aminoácido, ou um gás.

19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 18, caracterizado pelo fato de que a composição enzimática compreende uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptídeo com atividade intensificadora celulolítica, uma hemicelulase, uma expansina, uma esterase, uma lacase, uma enzima lignolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease e uma swolenina.

20. Composição enzimática, formulação do caldo completo ou composição de cultura de células, caracterizada pelo fato de que compreende o variante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.