BR112012026003B1 - Estrutura multimérica recombinante específica trail r2, seu uso, bem como composição - Google Patents

Estrutura multimérica recombinante específica trail r2, seu uso, bem como composição Download PDF

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Abstract

ESTRUTURA MULTIMÉRICA RECOMBINANTE ESPECÍFICA TRAIL R2, SEU USO, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO QUE A CODIFICA, BEM COMO COMPOSIÇÃO. A presente invenção refere-se a estruturas multiméricas a base de domínio Tenascina-3 FnIII que especificamente se ligam ao receptor TRAIL 2 (TRAIL R2), um receptor de membrana de célula envolvido na apoptose. A invenção ainda refere-se a variantes projetadas com afinidade aumentada para o alvo, aumenta a estabilidade e imunogenicidade reduzida. Além disso, a presente invenção refere-se a estruturas multivalentes projetadas como agentes profiláticos, de diagnóstico ou terapêuticos e seus usos contra doenças causadas por células que expressam TRAIL R2, em particular a um uso terapêutico contra câncer.

Description

ANTECEDENTE DA INVENÇÃO Referência à Listagem de Sequências
[001] Este pedido incorpora por referência uma Listagem de Sequências submetida com este pedido através de arquivo de texto EFS-Web intitulado “2943.011PC02_sequence_listing.txt” criado em 12 de abril de 2011 e tendo um tamanho de 211 kilobytes.
Campo da invenção
[002] A presente invenção refere-se em geral ao campo de miméticos de anticorpos, especificamente a estruturas multiméricas baseadas no domínio de fibronectina tipo III (Fn3) útil, por exemplo, para a geração de produtos contendo novas características de ligação. Em particular, a invenção refere-se a estruturas multiméricas específicas de TRAIL R2 derivada de terceiro domínio de FnIII de Tenascina C humana e seus usos para detecção de receptor TRAIL R2 e modulação de função mediada por TRAIL R2- como tratamento de câncer e outros distúrbios.
Técnica Anterior
[003] Biomoléculas capazes de ligação específica a um epítopo alvo desejado são de grande importância como terapêutico, pesquisa, e ferramentas de diagnóstico médico. Um exemplo bem conhecido desta classe de moléculas é o anticorpo. Anticorpos podem ser selecionados que se ligam especificamente e com afinidade a quase qualquer epítopo estrutural. No entanto, os anticorpos clássicos são moléculas heterotretaméricas estruturalmente complexas que são difíceis de expressarem em sistemas eucarióticos simples. Como resultado, a maior parte dos anticorpos é produzida usando sistemas de expressão de células mamíferas complexas e caros.
[004] As proteínas contendo estruturas tridimensionais relativamente definidas, comumente referidas como estruturas de proteínas, podem ser usadas como reagentes para o desenho de produtos projetados. Uma área particular em que sitas estruturas são úteis é o campo de desenho de mimético de anticorpo. Miméticos de anticorpos, ou seja, terapêuticos de proteínas não anticorpos pequenas, capitalizam as vantagens de anticorpos e fragmentos de anticorpos, como ligação de alta afinidade de alvos e baixa imunogenicidade e toxicidade, enquanto evitando algumas deficiências, como a tendência para fragmentos de anticorpos para agregar e ser menos estável do que IgGs de comprimento total.
[005] Estas desvantagens podem ser direcionadas usando fragmentos de anticorpo pela remoção de partes da dobra nativa do anticorpo. No entanto, isto geralmente causa agregação quando resíduos de aminoácidos que poderiam normalmente ser ocultado em um ambiente hidrofóbico como uma interface entre domínio variável e constante ficam expostos ao solvente. Um exemplo de mimético de anticorpo baseado na estrutura é baseado na estrutura de uma molécula de fibronectina de tipo III (FnIII), um domínio encontrado amplamente através de fila e classes de proteína, como em sangue de mamíferos e proteínas estruturais.
[006] TRAIL (ligador indutor de apoptose relacionado a fator de necrose tumoral, ainda referenciado na literatura como Apo2L e TNFSF10) pertence a superfamília de fator de necrose tumoral (TNF) e foi identificado como um ativador de morte celular programada, ou apoptose, em células tumorais. Ambas formas ligada a membrana e solúvel de TRAIL são capazes de disparar a apoptose através da interação com receptores TRAIL localizados nas células alvo. Em humanos, cinco receptores foram identificados por ter atividade de ligação para TRAIL. Na ligação de TRAIL a TRAIL R1 ou TRAIL R2, a morte celular relacionara a caspase é disparada. À luz desta atividade de morte celular, abordagens terapêuticas a base de TRAIL estão sendo buscadas. Várias abordagens terapêuticas baseadas em TRAIL ou TRAIL R1 ou anticorpos agonistas de R2 humano foram desenvolvidos, no entanto, TRAIL tem uma vida muito curta, se liga a receptores chamariz, e o tamanho grande de anticorpos pode limitar sua penetração de tumor. Assim, há uma necessidade para novas moléculas que podem se ligar a receptores TRAIL, composições farmacêuticas compreendendo aquelas moléculas, métodos de triagem para ditas moléculas, e métodos para uso de ditas moléculas no tratamento terapêutico de uma ampla variedade de cânceres.
[007] A citação ou discussão de uma referência aqui não deve ser interpretada como uma admissão de modo que é técnica anterior da presente invenção.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[008] A invenção fornece uma estrutura multimérica específica de TRAIL R2 compreendendo duas estruturas de monômero Tn3, em que (a) cada estrutura de monômero Tn3 compreende sete fitas beta designadas A, B, C, D, E, F, e G, se seis regiões de alça designadas AB, BC, CD, DE, EF, e FG, (b) as estruturas do monômero Tn3 são conectadas em tandem, e (c) a estrutura multimérica recombinante especificamente se liga a TRAIL R2. Em algumas modalidades, uma estrutura multimérica específica de TRAIL R2 compreende 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 estruturas de monômero Tn3. Em algumas outras modalidades, todas as estruturas de monômero Tn3 em uma estrutura multimérica específica de TRAIL R2 of da invenção estão em tandem.
[009] Em algumas modalidades, pelo menos uma estrutura de monômero Tn3 de uma estrutura multimérica específica de TRAIL R2 é conectada diretamente, por um ligador, ou por uma fração heteróloga a 1, 2, 3, 4, 5, 6, ou 7 outras estruturas de monômero Tn3. Em certas modalidades, pelo menos duas estruturas de monômero Tn3 de uma estrutura multimérica específica de TRAIL R2 são diretamente conectadas sem um ligador interposto entre as estruturas de monômero Tn3. Em algumas modalidades, pelo menos duas estruturas de monômero Tn3 de uma estrutura multimérica específica de TRAIL R2 são conectadas por um ligador. Em algumas modalidades, o ligador compreende um ligador de peptídeo. Em algumas modalidades, o ligador de peptídeo é um ligador de peptídeo flexível. Em certas modalidades, o ligador de peptídeo compreende uma sequência (GxS)y em que x e y são inteiros, em que x = 1, 2, 3 ou 4, e em que y = 1, 2, 3, 4, 5, 6, ou 7.
[0010] Em algumas modalidades, a ligação de uma estrutura multimérica específica de TRAIL R2 da invenção a TRAIL R2 é melhor do que a da estrutura de monômero Tn3 específica de TRAIL R2. Em algumas modalidades, a ligação de estrutura multimérica específica de TRAIL R2 a TRAIL R2 melhora a ação no alvo sobre uma estrutura de monômero Tn3 específica de TRAIL R2.
[0011] Em algumas modalidades, a melhora na ligação de uma estrutura específica de TRAIL R2 da invenção a TRAIL R2 sobre aquela da estrutura de monômero Tn3 específica de TRAIL R2 é uma melhora na afinidade de ligação e/ou uma melhora na avidez de ligação. Em outras modalidades, a afinidade de ligação para TRAIL R2 e estabilidade de proteína são melhoradas em relação à de uma estrutura de monômero Tn3 específica de TRAIL R2. Em algumas modalidades, a avidez de ligação para TRAIL R2 e estabilidade de proteína são melhoradas em relação às de uma estrutura de monômero Tn3 específica de TRAIL R2.
[0012] Em algumas modalidades, uma estrutura multimérica específica de TRAIL R2 contém um ligador compreendendo uma fração funcional. Em algumas modalidades, a fração funcional é uma imunoglobulina ou um fragmento da mesma. Em certas modalidades, a imunoglobulina ou fragmento da mesma é selecionada do grupo que consiste em: um fragmento Fab, um fragmento Fab’, um fragmento Fd, um fragmento Fd’, um fragmento Fv, um fragmento dAb, um fragmento F(ab’)2, um scFv, a diabody, um anticorpo linear, um anticorpo de comprimento total, uma região Fc, e uma combinação de duas ou mais de ditas frações. Em certas modalidades, a imunoglobulina ou fragmento da mesma compreende um domínio Fc e uma região em dobradiça de uma IgG. Em outras modalidades, a imunoglobulina ou fragmento da mesma ainda compreende um domínio CH1. Em algumas modalidades, a imunoglobulina ou fragmento da mesma compreende um domínio Ckappa ou um domínio Clambda de uma IgG.
[0013] Em algumas modalidades, pelo menos uma das estruturas de monômero Tn3 de uma estrutura multimérica específica de TRAIL R2 é fundida a uma fração heteróloga. Em algumas modalidades, a fração heteróloga compreende uma composição selecionada do grupo que consiste em: uma proteína, um peptídeo, um domínio de proteína, um ligador, um fármaco, uma toxina, um agente citotóxico, um agente de imagem, um radionuclídeo, um composto radioativo, um polímero orgânico, um polímero inorgânico, um polietilenoglicol (PEG), biotina, uma albumina sérica humana (HSA), uma porção de ligação a HSA FcRn, um anticorpos, um domínio de um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um anticorpo de cadeia simples, um anticorpo de domínio, um domínio de ligação de albumina, uma enzima, um ligador, um receptor, um peptídeo de ligação, uma estrutura não FnIII, um tag epitopo, um polímero polipeptídeo recombinante, uma citocina, e uma combinação de duas ou mais de ditas frações.
[0014] Em algumas modalidades específicas, uma estrutura multimérica específica de TRAIL R2 é conjugada a PEG. Em outras modalidades, mais do que duas das estruturas de monômero Tn3 são conectadas por ligadores e em que pelo menos um ligador é estruturalmente e/ou funcionalidade diferente de outros ligadores.
[0015] Em algumas modalidades, as estruturas de monômero Tn3 em uma estrutura multimérica específica de TRAIL R2 são conectadas em um formato ramificado. Em outras modalidades, algumas estruturas de monômero Tn3 em uma estrutura multimérica específica de TRAIL R2 da invenção são conectadas em um formato linear tandem e algumas estruturas de monômero Tn3 são conectadas em um formato ramificado. Em algumas modalidades, pelo menos duas estruturas de monômero Tn3 em uma estrutura multimérica específica de TRAIL R2 são idênticos. Em outras modalidades, pelo menos duas estruturas de monômero Tn3 em uma estrutura multimérica específica de TRAIL R2 são diferentes.
[0016] Em algumas modalidades, uma estrutura multimérica específica de TRAIL R2 da invenção se liga a pelo menos um alvo adicional, que pode ser um antígeno de célula T. Em algumas modalidades, este antígeno de célula T é CD40L.
[0017] Em algumas modalidades, uma estrutura multimérica específica de TRAIL R2 da invenção é um agonista receptor. Em algumas modalidades, pelo menos duas estruturas de monômero Tn3 em uma estrutura multimérica específica de TRAIL R2 da invenção liga o mesmo epitopo em TRAIL R2. Em outras modalidades, pelo menos duas estruturas de monômero Tn3 em uma estrutura multimérica específica de TRAIL R2 da invenção liga diferentes epitopos em TRAIL R2. Em algumas modalidades, os diferentes epitopo TRAIL R2 são epitopos não sobrepostos. Em outras modalidades, os diferentes epitopos TRAIL R2 são epitopos de sobreposição.
[0018] Em algumas modalidades, as fitas beta de pelo menos duas estruturas de monômero Tn3 em uma estrutura multimérica específica de TRAIL R2 da invenção têm pelo menos 90% identidade de sequência às fitas beta de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, pelo menos duas estruturas de monômero Tn3 em uma estrutura multimérica específica de TRAIL R2 da invenção compreendem a sequência de aminoácido: IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELX1YGI(XCD)nTTIX2L(XDE)nYSI(XEF )nYEVSLIC(XFG)nKX3TFTT
[0019] em que XAB, XBC, XCD, XDE, XEF, e XFG representam os resíduos de aminoácidos presentes nas alças AB, BC, CD, DE, EF, e FG, respectivamente, em que X1 representa resíduo de aminoácido A ou T, em que X2 representa resíduo de aminoácido D ou G, em que X3 representa aminoácido E ou G, e em que o comprimento da alça n é um inteiro entre 2 e 26. Em algumas modalidades, a alça AB compreende SEQ ID NO: 35, a alça CD compreende SEQ ID NO: 37, e a alça EF compreende SEQ ID NO: 39. Em algumas modalidades, a alça BC compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 97, 98, ou 168. Em algumas modalidades, a alça DE compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 102, 103, e 179. Em algumas modalidades, a alça FG compreende uma sequência selecionada dos grupos que consistem em SEQ ID NOs: 106, 108, 109, 169 e 170. Em algumas modalidades, a alça BC compreende SEQ ID NO: 97, a alça DE compreende SEQ ID NO: 179, e a alça FG compreende SEQ ID NO: 170. Em algumas modalidades, uma estrutura multimérica específica de TRAIL R2 da invenção compreende SEQ ID NO: 209 ou 204.
[0020] Em algumas modalidades, uma estrutura multimérica específica de TRAIL R2 da invenção liga a um receptor TRAIL R2 com uma afinidade (Kd) de 1 μM ou menos. Em outra modalidade, uma estrutura multimérica específica de TRAIL R2 da invenção liga a um receptor TRAIL R2 com uma afinidade (Kd) de 500 nM ou menos. Ainda em outra modalidade, uma estrutura multimérica específica de TRAIL R2 da invenção liga a um receptor TRAIL R2 com uma afinidade (Kd) de 100 nM ou menos.
[0021] A invenção ainda fornece uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica qualquer uma das estruturas multiméricas descritas acima. Em algumas modalidades, um vetor de expressão compreende o ácido nucleico. Em outras modalidades, uma célula hospedeira pode compreender o vetor.
[0022] A invenção ainda fornece um método de produzir uma estrutura multimérica específica de TRAIL R2 da invenção compreendendo cultivar uma célula hospedeira nas condições em que a estrutura multimérica codificado pela molécula de ácido nucleico é expressa. A invenção ainda fornece uma composição compreendendo uma estrutura multimérica específica TRAIL R2 recombinante da invenção em um excipiente farmaceuticamente aceitável. A invenção ainda fornece um método de prevenir, tratar, amenizar ou gerenciar câncer em um paciente em necessidade do mesmo administrando uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo uma estrutura multimérica específica de TRAIL R2 da invenção. Em algumas modalidades, o câncer é selecionado de câncer pulmonar, linfoma não Hodgkin, câncer ovariano, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer pancreático, e mieloma múltiplo.
[0023] A invenção ainda fornece um método para diagnosticar ou imagear uma doença em um paciente com uma composição compreendendo uma estrutura multimérica específica de TRAIL R2 da invenção. Ainda é fornecido um método de induzir apoptose em uma célula que expressa TRAIL R2 compreendendo contatar a célula com uma estrutura multimérica específica de TRAIL R2 da invenção. Em algumas modalidades, o método de prevenir, tratar, amenizar, ou gerenciar o câncer em um paciente em necessidade do mesmo compreende uma terapia adicional, em que dita terapia é imunoterapia, terapia biológica, quimioterapia, radioterapia, ou terapia de fármacos de moléculas pequenas.
[0024] Em algumas modalidades, a estrutura multimérica específica de TRAIL R2 especificamente se liga a um TRAIL R2 humano. Em algumas modalidades específicas, a estrutura multimérica específica de TRAIL R2 of da invenção liga TRAIL R2 e (a) agoniza o receptor TRAIL R2, (b) imita a ligação de TRAIL ao receptor TRAIL R2, (c) facilita a dimerização ou oligomerização do receptor TRAIL R2, (d) induz apoptose, (e) reduz ou inibe a viabilidade celular, ou (f) uma combinação de atividades (a), (b), (c), (d) e (e).
[0025] Em outras modalidades, a invenção fornece um método de alterar uma atividade em uma célula que expressa TRAIL R2 compreendendo contatar a célula com a estrutura multimérica específica TRAIL R2 de qualquer uma das reivindicações 1-47, em que a estrutura multimérica se liga TRAIL R2 e (a) agoniza o receptor TRAIL R2, (b) imitar a ligação de TRAIL a receptor TRAIL R2, (c) facilita dimerização ou oligomerização de receptor TRAIL R2, (d) induz apoptose, (e) reduz ou inibe a viabilidade celular, ou (f) uma combinação de atividades (a), (b), (c), (d), e (e).
[0026] Em algumas modalidades, PEG é conjugado a uma estrutura multimérica específica de TRAIL R2 da invenção em N-terminal ou C- terminal.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0027] Para fins de ilustração da invenção, são descritos nos desenhos certas modalidades da invenção. No entanto, a invenção não é limitada para precisar arranjos e instrumentalidades das modalidades descritas nos desenhos.
[0028] A figura 1 mostra formato linear, tipo anticorpo e de fusão de estruturas multivalentes Tn3. Estruturas multivalentes Tn3 contêm dois ou mais módulos Tn3 ligados por um espaçador indicado por um bloco octagonal preto, onde o espaçado pode ser, por exemplo, um ligador.
[0029] A figura 2 mostra estruturas Tn3 multivalentes específicas de TRAIL R2, designados como A2 a A9, que foram gerados de acordo com três formatos moleculares diferentes mostrados na figura 1 com valências (número de módulos Tn3) variando de 2 a 8.
[0030] A figura 3 mostra análise de SDS-PAGE não redutor de meio bacteriano bruto (gel à direita) e amostras purificadas de afinidade (gel a esquerda) correspondendo a construtos tandem lineares designados A1 a A5, com valências variando de 1 a 8, expresso em E. coli.
[0031] A figura 4 mostra um ELISA de competição medido ligação de estruturas monovalentes (A1) e multivalentes (A2, A3) Tn3 a TRAIL R2.
[0032] A figura 5 mostra um histograma de citometria de fluxo da estrutura multivalente específica de TRAIL R2 A9 ligação a células H2122 comparado a uma estrutura de controle cognato (B9) que não liga a TRAIL R2.
[0033] A figura 6A mostra o efeito de valência em morte específica de linhagem de célula H2122 que expressa TRAIL R2 por estruturas multivalentes.
[0034] A figura 6B mostra a especificidade de linhagem de célula de tumor H2122 sendo morta por estruturas multivalentes específicas de TRAIL R2.
[0035] A figura 7A mostra o efeito de formato molecular na morte de células H2122 por Estruturas multivalentes específicas de TRAIL R2 compreendendo 4 módulos Tn3.
[0036] A figura 7B mostra o efeito de formato molecular na morte de células H2122 por estruturas multivalentes específicas de TRAIL R2 compreendendo 8 módulos Tn3.
[0037] A figura 8A mostra a morte específica de linhagem de células de adenocarcinoma colorretal Colo205 que expressam TRAIL R2 por estruturas Tn3 linearmente fundidas tetra-(A3) e octavalentes (A5) específicas para TRAIL R2.
[0038] A figura 8B mostra a morte específica de células Jurkat de linhagem leucêmica que expressam TRAIL R2 por estruturas Tn3 linearmente fundidas tetra- (A3) e octavalentes (A5) específicas para TRAIL R2.
[0039] A figura 9A mostra o desenho de estruturas Tn3 murinas tandem específicas para CD40L (constructos M13).
[0040] A figura 9B mostra a análise de SDS-PAGE de um constructo M13 monovalente purificado (constructo Tn3 específico a CD40L), ou estruturas tandem bivalentes com ligadores contendo 1, 3, 5 ou 7 Gly4 unidades de Ser (denotado como GS) unindo dois módulos M13. Constructo M13 monovalente correu na faixa 2, Constructo C1 nas faixas 3 e 7, Constructo C2 nas faixas 4 e 8, constructo C3 nas faixas 5 e 9, e constructo C4 nas faixas 6 e 10. As amostras correram em condições não redutoras (faixas 2-6) ou condições reduzidas (faixas 710).
[0041] A figura 9C mostra a inibição competitiva de MuCD40L ligando a receptor CD40 murino imobilizado em um chip biossensor por estruturas tandem específicas a MuCD40L monovalentes (M13) ou bivalentes. A concentração inibitória máxima da metade (IC50) para os vários constructos é indicada.
[0042] A figura 9D mostra o efeito inibitório de estruturas tandem Tn 4 específicas a MuCD40L monovalentes (M13), ou anticorpo MR1 (um anticorpo anti-MuCD40L) em expressão de CD86 induzida por MuCD40Lem células B.
[0043] A figura 10 mostra os níveis de expressão de monovalentes solúveis e constructos de estrutura Tn3 bivalente tandem biespecíficas a TRAIL R2/CD40L recombinantemente expressos em E. coli analisados por SDS-PAGE do meio de cultura bacteriano. Estruturas monovalentes, A1 e 79 são mostrados nas faixas 2 e 3, respectivamente. Constructos de estrutura tandem compreendendo A1 e 79, unidos em tandem por um ligador de aminoácido Gly4Ser de comprimento crescente (cognato aos constructos C5, C6, C7 e C8) são mostrados nas faixas 4-7. Os constructos expressos são indicados no gel corado por um asterisco.
[0044] A figura 11A mostra a ligação de estruturas Tn3 biespecíficas a TRAIL R2 avaliadas usando ELISA de captura.
[0045] A figura 11B mostra a ligação de estruturas Tn3 biespecíficas a CD40L humano avaliado usando ELISA de captura.
[0046] A figura 12 mostra a ligação simultânea de estruturas Tn3 tandem biespecíficas C5, C6, C7, e C8 a TRAIL R2 e CD40L avaliadas usando um ensaio AlphaScreen™.
[0047] A figura 13 mostra a estabilidade de estruturas Tn3 na presença de guanidina-HCl. Cm (valor de ponto médio) para cada estrutura testada é indicado.
[0048] A figura 14 mostra a termoestabilidade de três diferentes estruturas com diferentes sequências de alça, mas o mesmo comprimento da alça FG (nove aminoácidos) comparado à estrutura Tn3 parental que tem uma alça FG maior analisada por calorimetria de varredura diferencial (DSC).
[0049] A figura 15 mostra o aumento na estabilidade na presença de guanidina-HCl de estruturas Tn3 contendo um comprimento de alça FG de nove aminoácidos (P1C01, A6, e 71) comparado à estrutura Tn 3 parental (WT).
[0050] A figura 16A mostra uma representação esquemática e expressão de uma estrutura Tn3 triespecífico/trivalente. A estrutura D1- 1E11-79 contém um domínio de ligação Synagis®(D1), seguido por um domínio de ligação a TRAIL R2-Fc (1E11), e um domínio Tn3 específico C-terminal para CD40L humano (79). Um ligador flexível (Gly4Ser)3 separa cada domínio.
[0051] A figura 16B mostra um gel SDS-PAGE (4-12% Bis-Tris) da estrutura D1-1E11-79 expressa e purificada. O peso molecular esperado deste constructo é aproximadamente 34.081 Dalton.
[0052] A figura 17A mostra a ligação simultânea de estrutura Tn3 triespecífica/trivalente D1-1E11-79 a huCD40L e TRAIL R2-Fc usando análise de ligação AlphaScreen. Sinal AlphaScreen (ASS) mostrado como uma função de concentração TrailR2-Fc.
[0053] A figura 17B mostra a ligação simultânea de estrutura Tn3 triespecífica/trivalente D1-1E11-79 a huCD40L e Synagis® usando análise de ligação AlphaScreen. Sinal AlphaScreen (ASS) mostrado como uma função de concentração Synagis®.
[0054] A figura 18 mostra a ligação simultânea de estrutura Tn3 triespecífica/trivalente D1-1E11-79 a TRAIL R2-Fc e Synagis® usando ELISA.
[0055] A figura 19 mostra um alinhamento de sequência de clone 1C12 de ligação a TRAIL R2 parental e suas afinidades de derivados maturados. A posição da ligação dissulfeto projetada é destacada, a seta indica a localização de uma mutação estrutural, e alterações nas alças que surgem durante a maturação da afinidade são mostrados nos blocos destacados A, B, C, e D.
[0056] A figura 20 mostra um ensaio de viabilidade celular CellTiter- Glo do clone 1C12 e sua afinidade a derivados maturados.
[0057] A figura 21 mostra concentração de tandems G6 como uma função de tempo em soro de camundongo.
[0058] A figura 22A mostra um alinhamento de sequência correspondendo à melhora projetada de reatividade cruzada a cyno para o clone F4. A característica mais comum entre todos estes clones é a mutação de D para G dois aminoácidos antes da alça DE.
[0059] A figura 22B mostra medições de ELISA da inibição da ligação de humano ou cyno TRAIL R2-Fc a F4mod1 em placas revestidas por monômero F4 ou F4mod1.
[0060] A figura 23A mostra um alinhamento de sequência corres pondendo à linhagem germinativa do clone F4mod1, especificamente uma comparação de linhagem germinativa F4, F4mod1 e F4mod12 a TN3.
[0061] A figura 23B mostra medições de ELISA da inibição da ligação de humano ou cyno TRAIL R2-Fc a F4mod1 em placas revestidas por monômero F4, F4mod1 ou F4mod12.
[0062] A figura 23C mostra um ensaio de morte de célula Colo205 comparando G6 tandem 6 a F4mod12 tandem 6.
[0063] A figura 23D mostra um ensaio de morte de célula Colo205 comparando G6 tandem 8 a F4mod12 tandem 8.
[0064] A figura 24 mostra um ensaio de morte celular HT29 compa rando a atividade de G6 tandem 8 a F4mod12 tandem 8 na linhagem de célula HT29 resistente a TRAIL.
[0065] A figura 25 mostra um alinhamento de sequência correspon dente aos clones testados em análises de imunogenicidade Antitope EpiScreen. As diferenças com relação ao clone F4mod12 são destacadas.
[0066] A figura 26A mostra traços SEC de G6 tandem 8 não purificado em SEC.
[0067] A figura 26B mostra traços SEC de G6 tandem 8 purificados em SEC.
[0068] A figura 27 mostra alterações em volume de tumor em modelos xenoenxertos de câncer colorretal Colo205 em resposta a diferentes doses de agonistas Tn3 TRAIL R2 G6 tandem 6 e G6 tandem 8.
[0069] A figura 28 mostra alterações em peso corporal em modelos xenoenxertos de câncer colorretal Colo205 em resposta a diferentes doses de agonistas Tn3 TRAIL R2 G6 tandem 6 e G6 tandem 8.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições
[0070] Antes da descrição da presente invenção em detalhe, deve ser entendido que esta invenção não é limitada a composições específicas ou etapas de processo, como tal podem variar. Deve ser notado que, como usado nesta especificação e reivindicações anexadas, as formas singulares “um”, “uma” e “o/a” incluem referentes plurais salvo se o contexto claramente indicar de outra forma. Os termos "um" (ou "uma"), bem como os termos "um ou mais," e "pelo menos um" pode ser usado de modo intercambiável aqui.
[0071] Além disso, e/ou” onde usado aqui deve ser tomado como revelação específica de cada uma de duas características especificadas ou componentes com ou sem o outro. Assim, o termo "e/ou" como usado em uma frase como "A e/ou B" aqui pretende incluir "A e B," "A ou B," "A," (isolado) e "B" (isolado). Da mesma forma, o termo "e/ou" como usado em uma frase como "A, B, e/ou C" pretende incluir cada uma das seguintes modalidades: A, B, e C; A, B, ou C; A ou C; A ou B; B ou C; A e C; A e B; B e C; A (isolado); B (isolado); e C (isolado).
[0072] Salvo se definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos têm o mesmo significado que comumente entendido por um especialista na técnica a que esta invenção se refere. Por exemplo, o Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei- Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; e Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, revisado, 2000, Oxford University Press, fornecem a um especialista com um dicionário geral de muitos destes termos usados nesta invenção.
[0073] Unidades, prefixos, e símbolos são denotados em sua forma aceita no Sistema Internacional de Unidades (SI). As faixas numéricas são inclusivas dos números definindo a faixa. Salvo se indicado de outra forma, sequências de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita na orientação amino a carboxi. Os títulos fornecidos aqui não são limitações de vários aspectos ou modalidades da invenção, que podem ser tidos por referência à especificação como um todo. Assim, os termos definidos imediatamente abaixo são mais totalmente definidos por referência à especificação em sua totalidade.
[0074] É entendido que sempre que modalidades são descritas aqui com a linguagem "compreendendo," de outra forma modalidades análogas descritas em termos de "consiste em" e/ou "que consiste essencialmente de" são ainda fornecidos.
[0075] Aminoácidos são referenciados aqui por seus símbolos de três letras comumente conhecidos ou por símbolos de uma letra recomendados pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica IUPAC- IUB. Nucleotídeos, também, são referenciados por seus códigos de uma única letra comumente aceitos.
[0076] O termo "epitopo" conforme usado aqui refere-se a uma proteína determinante capaz de ligação a uma estrutura da invenção. Epitopos geralmente consistem em agrupamentos de moléculas de superfície quimicamente ativas como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e geralmente têm características estruturas tridimensionais, bem como características de carga específicas. Epitopos conformacionais e não conformacionais são distinguidos de modo que a ligação ao anterior mas não o último é perdida na presença de solventes desnaturantes.
[0077] Os termos "domínio de fibronectina tipo III (FnIII)" e "domínio FnIII" referem-se aos polipeptídeos homólogos ao domínio de fibronectina tipo III humana contendo pelo menos sete fitas 7 beta que são distribuídas entre duas folhas beta, que por si só empacotam contra cada outra para formar o centro da proteína, e ainda contendo alças expostas ao solvente que conectam as fitas beta a cada outra. Há pelo menos três ditas alças em cada borda do sanduiche de folha beta, onde a borda é o limite da proteína perpendicular à direção de cada fita beta. Em certas modalidades, um domínio FnIII compreende 7 fitas beta designadas A, B, C, D, E, F, e G ligadas a seis regiões de alça designadas AB, BC, CD, DE, EF, e FG, em que uma região de alça se conecta a cada fita beta.
[0078] O termo "DNA" refere-se a uma sequência de dois ou mais deoxirribonucleotídeos covalentemente ligados, de ocorrência natural ou modificados.
[0079] O termo "proteína de fusão" refere-se à proteína que inclui (i) uma ou mais estruturas da invenção unida a (ii) uma segunda proteína diferente (ou seja, uma proteína "heteróloga").
[0080] O termo "fração heteróloga" é usado aqui para indicar a adição de uma composição a uma estrutura da invenção em que a composição não é normalmente parte de um domínio FnIII. Frações heterólogas exemplares incluem proteínas, peptídeos, domínios de proteína, ligadores, fármacos, toxinas, agentes de imagem, compostos radioativos, polímeros orgânicos e inorgânicos, e qualquer outra composição que pode fornecer uma atividade que não é inerente ao próprio domínio de FnIII, incluindo, entre outros, polietileno glicol (PEG), um agente citotóxico, um radionuclídeo, agente de imagem, biotina, um domínio de dimerização (por exemplo, domínio zíper leucina), albumina sérica humana (HSA) ou uma porção de ligação a FcRn do mesmo, um domínio ou fragmento de um anticorpo (por exemplo, domínio variável de anticorpo, um domínio CH1, um domínio Ckappa, um domínio Clambda, um domínio CH2, ou CH3), um anticorpo de cadeia simples, um anticorpo de domínio, um domínio de ligação a albumina, uma molécula IgG, uma enzima, um ligador, um receptor, um peptídeo de ligação, uma estrutura não FnIII, um epitopo tag, um polímero de polipeptídeo recombinante, uma citocina, e semelhantes.
[0081] O termo "ligador" conforme usado aqui refere-se a qualquer montagem molecular que une ou conecta duas ou mais estruturas. O ligador pode ser uma molécula cuja função é atuar como um "espaçador" entre módulos em uma estrutura, ou este pode ser ainda uma molécula com uma função adicional (ou seja, uma "fração funcional"). Uma molécula incluída na definição de "fração heteróloga" pode ainda funcionar como um ligador.
[0082] Os termos "ligado" e "fundido" são usados de modo intercambiável. Estes termos referem-se à junção de duas ou mais estruturas, frações heterólogas, ou ligadores por qualquer meio incluindo conjugação química ou meio recombinante.
[0083] Os termos "multímero," "estrutura multimérica" e "estrutura multivalente" referem-se a uma molécula que compreende pelo menos duas estruturas FnIII em associação. As estruturas que formam uma estrutura multimérica podem ser ligadas através de um ligador que permite que cada estrutura funcione independentemente. "Multimérico" e "multivalente" podem ser usados de modo intercambiável aqui. Uma estrutura multivalente pode ser monoespecífica ou biespecífica.
[0084] Os termos "domínio" ou "domínio de proteína" referem-se a uma região de uma proteína que pode se dobrar em uma estrutura estável tridimensional, geralmente independentemente do resto da proteína, e que pode ser dotado com uma função particular. Esta estrutura mantém uma função específica associada com a função do domínio dentro da proteína original, por exemplo, atividade enzimática, criação de um motivo de reconhecimento para outra molécula, ou para fornecer compostos estruturais necessários para uma proteína sair em um ambiente particular de proteínas. Ambos dentro de uma família de proteína e dentro de superfamílias de proteínas relacionadas, domínios de proteína podem ser regiões evolucionalmente conservadas. Quando descreve-se o componente de uma estrutura multimérica, os termos "domínio." "Estrutura monomérica" e "módulo" podem ser usados de modo intercambiável. Por “domínio nativo FnIII” significa qualquer domínio FnIII não recombinante que é codificado por um organismo vivo.
[0085] Uma "sequência de proteína" ou "sequência de aminoácido" significa uma representação linear dos constituintes aminoácidos em um polipeptídeo em uma direção amino-terminal a carboxil-terminal em cujos resíduos que avizinham cada outro na representação são contíguos na estrutura primária de polipeptídeo.
[0086] O termo "ácido nucleico" refere-se a qualquer dois ou mais nucleotídeos covalentemente ligados ou análogos de nucleotídeos ou derivados. Conforme usado aqui, este termo inclui, entre outros, DNA, RNA, e PNA. “Ácido nucleico” e “polinucleotídeo” são usados de modo intercambiável aqui.
[0087] O termo "polinucleotídeo" pretende incluir um ácido nucleico singular bem como ácidos nucleicos plurais, e refere-se a uma molécula de ácido nucleico isolada ou constructo, por exemplo, RNA mensageiro (mRNA) ou DNA plasmídeo (pDNA). O termo ácido nucleico "isolado" ou polinucleotídeo pretende referir-se a uma molécula de ácido nucleico, DNA ou RNA que foi removido a partir de seu ambiente nativo. Por exemplo, um polinucleotídeo recombinante que codifica, por exemplo, uma estrutura da invenção contida em um vetor é considerado isolado para fins da presente invenção. Outros exemplos de um polinucleotídeo isolado incluem polinucleotídeos recombinantes mantidos em células hospedeiras heterólogas ou purificadas (parcialmente ou substancialmente) polinucleotídeos em solução. Moléculas isoladas de RNA incluem in vivo ou in vitro transcritos RNA de polinucleotídeos da presente invenção. Polinucleotídeo isolados ou ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção incluem ainda ditas moléculas produzidas sinteticamente. Além disso, um polinucleotídeo ou um ácido nucleico pode ser ou pode incluir um elemento regulatório como um promotor, sítio de ligação a ribossomo ou um terminador de transcrição.
[0088] O termo "farmaceuticamente aceitável" refere-se a um composto ou proteína que pode ser administrada a um animal (por exemplo, um mamífero) sem consequência clínica adversa significativa.
[0089] O termo "veículo fisiologicamente aceitável" refere-se a um veículo que não tem um impacto detrimental significativo no hospedeiro tratado e que retém as propriedades terapêuticas do composto com o qual é administrado. Um veículo fisiologicamente aceitável exemplar é salina fisiológica. Outros veículos fisiologicamente aceitáveis e suas formulações são conhecias a um especialista na técnica e são descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences, (18a edição), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, Pa., incorporado aqui por referência.
[0090] Por um "polipeptídeo" entende-se qualquer sequência de dois ou mais aminoácidos linearmente ligados por ligações amidas (ligações peptídicas) independente do comprimento, modificação pós- tradução, ou função. "Polipeptídeo," "peptídeo," e "proteína" são usados de modo intercambiável. Assim, peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, ou oligopeptídeos são incluídos na definição de "polipeptídeo," e o termo "polipeptídeo" pode ser usado no lugar de, ou intercambiavelmente com qualquer um destes termos. O termo "polipeptídeo" é ainda pretendido para referir a produtos de modificações pós-expressão do polipeptídeo, incluindo, entre outros glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos de proteção/bloqueio, clivagem proteolítica, ou modificação por aminoácidos de ocorrência não natural. Um polipeptídeo pode ser derivado de uma fonte biológica natural ou produzido por tecnologia recombinante, mas não é necessariamente traduzida a partir de uma sequência de ácido nucleico designada. Um polipeptídeo pode ser gerado de qualquer modo, incluído por síntese química.
[0091] Ainda incluídos como polipeptídeos da presente invenção estão fragmentos, derivados, análogos, ou variantes dos polipeptídeos anteriores, e qualquer combinação dos mesmos. Variantes podem ocorrer naturalmente ou ser ocorrência não natural. Variantes de ocorrência não natural podem ser produzidos por técnicas de mutagênese conhecidas na técnica. Polipeptídeos variantes podem compreender substituições, deleções ou adições conservadoras ou não conservadoras. Ainda incluídos como "derivados" são aqueles peptídeos que contêm um ou mais derivados de aminoácidos de ocorrência natural de vinte aminoácidos padrões.
[0092] Por "randomizado" ou "mutado" entende-se incluindo uma ou mais alterações de aminoácidos, incluindo deleção, substituição ou adição, relativas a sequência molde. Por "randomizando" ou "mutando" entende-se o processo de introduzir, em uma sequência, dita alteração de aminoácido. A randomização ou mutação podem ser acompanhadas por variação de sequência intencional, cega ou espontânea, geralmente de uma sequência que codifica ácido nucleico, e pode ocorrer por qualquer técnica, por exemplo, PCR, PCR de tendência ao erro, ou síntese química de DNA. Os termos “randomizando”, “randomizado”, “mutando”, “mutado” e semelhantes são usados de modo intercambiável.
[0093] Por um “cognato” ou "proteína cognata, não mutada" entende-se uma proteína que é idêntica em sequência a uma proteína variante, exceto para as mutações de aminoácidos introduzidas na proteína variante, em que a proteína variante é randomizada ou mutada.
[0094] Por "RNA" entende-se uma sequência de dois ou mias ribonucleotídeos covalentemente ligados, de ocorrência natural ou modificados. Um exemplo de RNA modificado incluído neste termo é RNA fosforotioato.
[0095] Os termos "estrutura da invenção" ou "estruturas da invenção" conforme usado aqui, referem-se a estruturas multiméricas bem como estruturas monoméricas de FnIII. O termo “alvo” refere-se a um composto reconhecido por uma estrutura específica da invenção. Alvos típicos incluem proteínas, polissacarídeos, polinucleotídeos e moléculas pequenas. Os termos “alvo” e “antígeno” são usados de modo intercambiável. O termo "especificidade" conforme usado aqui, por exemplo, nos termos "especificamente se liga" ou "ligação específica," refere-se à afinidade relativa pela qual uma estrutura da invenção se liga a um ou mais antígenos através de um ou mais domínios de ligação a antígeno, e que a ligação implica em alguma complementariedade entre um ou mais domínios de ligação a antígeno e um ou mais antígenos. De acordo com esta definição, uma estrutura da invenção é dita como "especificamente se liga" a um epitopo quando este se liga àquele epitopo mais prontamente do que poderia se ligar a um epitopo aleatório, não relacionado.
[0096] O termo "afinidade" conforme usado aqui refere-se a uma medida da força da ligação de certa estrutura da invenção a um epitopo individual.
[0097] O termo "avidez" conforme usado aqui refere-se à estabilidade geral do complexo entre uma população de estruturas da invenção e certo epitopo, ou seja, a funcionalidade combinou força da ligação de uma pluralidade de estruturas com o antígeno. A avidez é relacionada à afinidade de domínios de ligação a antígeno individuais com epitopos específicos, e ainda a valência da estrutura da invenção.
[0098] O termo "ação no alvo" refere-se à ligação de uma estrutura multimérica da invenção a um ou mais alvos e aos efeitos biológicos resultando de dita ligação. Com relação a isto, unidades de ligação a vários antígenos em uma estrutura multimérica podem interagir com uma variedade de alvos e/ou epitopos e, por exemplo, trazer dois alvos fisicamente próximos, disparar cascatas metabólicas através da interação com alvos distintos, etc. Com referência a TRAIL R2, "ação no alvo" refere-se ao efeito alcançado, por exemplo, pela melhora, estímulo ou ativação, de uma ou mais atividades biológicas de TRAIL R2.
[0099] O termo "valência" conforme usado aqui refere-se ao número de módulos de ligação ao antígeno potencial, por exemplo, o número de módulos FnIII em uma estrutura da invenção. Quando uma estrutura da invenção compreende mais do que um módulo de ligação ao antígeno, cada módulo de ligação pode especificamente se ligar, por exemplo, ao mesmo epitopo ou um diferente epitopo, no mesmo alvo ou alvos diferentes.
[00100] O termo "ligação dissulfeto" conforme usado aqui inclui a ligação covalente formada entre dois átomos de enxofre. O aminoácido cisteína compreende um grupo tiol que pode formar uma ligação ou ponte dissulfeto com um segundo grupo tiol.
[00101] Os termos “módulo Tn3” e “estrutura Tn3” conforme usado aqui, refere-se a uma estrutura FnIII em que a fita beta A compreende SEQ ID NO: 42, a fita beta B compreende SEQ ID NO: 43, a fita beta C SEQ ID NO: 45 ou 131, a fita beta D compreende SEQ ID NO: 46, a fita beta E compreende SEQ ID NO: 47, a fita beta F compreende SEQ ID NO: 49, e a fita beta G compreende SEQ ID NO: 52, em que pelo menos uma alça é uma variante de ocorrência na natural das alças na “estrutura Tn3 tipo selvagem.” Em certas modalidades, uma ou mais das fitas beta de um módulo Tn3 compreende pelo menos uma substituição de aminoácido exceto que os resíduos de cisteína na fita beta C (por exemplo, a cisteína nas SEQ ID NOs: 45 ou 131) e fitas beta F (SEQ ID NO: 49) não são substituídas.
[00102] O termo “estrutura Tn3 tipo selvagem” conforme usado aqui refere-se a uma estrutura FnIII compreendendo SEQ ID NO: 1, ou seja, uma estrutura FnlII projetada derivada de 3a FnlII de tenascina C humana.
[00103] O termo “imunoglobulina” e "anticorpo" compreendem várias amplas classes de polipeptídeos que podem ser distinguidos bioquimicamente. Os especialistas na técnica apreciarão que cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alpha, delta, ou épsilon. É a natureza desta cadeia que determina a "classe" do anticorpo como IgG, IgM, IgA IgG, ou IgE, respectivamente. Versões modificadas de cada uma dessas classes são prontamente discerníveis aos especialistas na técnica. Conforme usado aqui, o termo "anticorpo" incluem, entre outros, a um anticorpo intacto, um anticorpo modificado, um domínio VL ou VL de anticorpo, um domínio CH1, um domínio Ckappa, um domínio Clambda, um domínio Fc (ver supra), um domínio CH2, ou CH3.
[00104] Conforme usado aqui, o termo "anticorpo modificado" inclui formas sintéticas de anticorpos que são alterados de modo que não sejam de ocorrência natural, por exemplo, anticorpos que compreendem pelo menos duas porções de cadeia pesada, mas nas duas cadeias pesadas completas (como, por exemplo, anticorpos ou minicorpos com domínios apagados); formas multiespecíficas de anticorpos (por exemplo, biespecíficas, triespecífica, etc.) alterados para ligar a dois ou mais antígenos ou a diferentes epitopos de um antígeno simples). Além disso, o termo "anticorpo modificado" inclui formas multivalentes de anticorpos (por exemplo, trivalente, tetravalente, etc., anticorpos que para três ou mais cópias do mesmo antígeno). (Ver, por exemplo, Antibody Engineering, Kontermann & Dubel, eds., 2010, Springer Protocols, Springer).
[00105] O termo “meia-vida in vivo” é usado em seu significado normal, ou seja, o tempo em que 50% da atividade biológica de um polipeptídeo é ainda presente no corpo/órgão alvo, ou o tempo em que a atividade do polipeptídeo é 50% de seu valor inicial. Como uma alternativa para determinar a meia-vida funcional in vivo, "a meia-vida sérica" pode ser determinada, ou seja, o tempo em que 50% das moléculas de polipeptídeo circulam no plasma ou corrente sanguínea antes de ser eliminado. A determinação de meia-vida sérica é geralmente mais simples do que a determinação da meia-vida funcional in vivo e a magnitude de meia-vida sérica é geralmente uma boa indicação da magnitude de meia-vida funcional in vivo. Os termos alternativos para meia-vida incluem meia-vida plasmática, meia-vida de circulação, meia-vida circulatória, depuração sérica, depuração plasmática, e meia-vida de depuração. A funcionalidade a ser retido é normalmente selecionada a partir de pró-coagulante, proteolítico, ligação a cofator, atividade de ligação a receptor, ou outro tipo de atividade biológica associada com a proteína particular.
[00106] O termo "aumentado" com relação à meia-vida funcional in vivo ou meia-vida plasmática é usado para indicar que a meia-vida relevante do polipeptídeo é estatisticamente significativamente aumentada em relação àquela de uma molécula de referência (por exemplo, um polipeptídeo não modificado), como determinado nas condições comparáveis.
[00107] O termo "expressão" conforme usado aqui refere-se a um processo pelo qual um gene produz uma estrutura bioquímica, por exemplo, uma estrutura da invenção ou um fragmento do mesmo. O processo inclui qualquer manifestação da presença funcional do gene dentro da célula incluindo, entre outros, knockdown de gene bem como a expressão transitória e a expressão estável. Inclui, sem limitação, transcrição do gene em um ou mais mRNAs, e a tradução de ditos mRNAs em um ou mais polipeptídeos. Se o produto desejado é bioquímico, a expressão inclui a criação daquele bioquímico e qualquer precursor.
[00108] Um “produto de expressão” pode ser um ácido nucleico, por exemplo, um RNA mensageiro produzido por transcrição de um gene, ou um polipeptídeo. Produtos de expressão descritos aqui ainda incluem ácidos nucleicos com modificações pós-transcrição, por exemplo, poliadenilação, ou polipeptídeos com modificações pós-tradução, por exemplo, metilação, glicosilação, a adição de lipídeos, associação com outras subunidades de proteína, clivagem proteolítica, e semelhantes.
[00109] O termo "vetor" ou "vetor de expressão" é usado aqui para significar vetores usados de acordo com a presente invenção como um veículo para introdução em e expressão de um produto de expressão desejado em uma célula hospedeira. Como conhecidos aos especialistas na técnica, ditos vetores podem facilmente ser selecionados a partir do grupo que consiste em plasmídeos, fagos, vírus e retrovírus. Em geral, vetores compatíveis com a presente invenção irão compreender um marcador selecionado, sítios de restrição apropriados para facilitar a clonagem do ácido nucleico desejado e a capacidade de entrar e/ou replicar em células eucarióticas ou proca- rióticas.
[00110] O termo "células hospedeiras" referem-se às células que colhem vetores construídos usando técnicas de DNA recombinante e codificam em pelo menos um produto de expressão. Nas descrições de processos para isolamento de um produto de expressão a partir de hospedeiros recombinantes, os termos "célula" e "cultura de célula" são usados intercambiavelmente para denotar a fonte de produto de expressão salvo se claramente indicado de outra forma, ou seja, recuperação do produto de expressão a partir das "células" significa recuperação de células inteiras fiadas, ou recuperação de cultura de célula contendo ambos o meio e as células suspensas.
[00111] Os termos "tratar" ou "tratamento" conforme usado aqui refere-se a ambos tratamento terapêutico e profilático ou medidas preventivas, em que o objeto é prevenir ou reduzir (diminuir) uma alteração fisiológica indesejada ou distúrbio em um sujeito, como progressão de uma doença ou condição inflamatória. Os resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, entre outros, alívio de sintomas, diminuição da extensão da doença, estado estabilizado (ou seja, não pior) da doença, atraso ou redução da progressão da doença, amenização ou paliação do estado da doença, e remissão (parcial ou total), seja detectável ou não detectável.
[00112] O termo "tratamento" ainda significa prolongar a sobrevida como comparado à sobrevida esperada se não recebendo tratamento. Aqueles em necessidade de tratamento incluem aquelas já com a condição ou doença bem como aqueles com tendência a ter a condição ou doença em que a condição ou doença deve ser prevenida.
[00113] Os termos "sujeito," "indivíduo," "animal," "paciente," ou "mamífero" refere-se a um indivíduo, paciente ou animal, em particular um sujeito mamífero, para o qual o diagnóstico, prognóstico ou terapia é desejado. Sujeitos mamíferos incluem humanos, animais domésticos, animais de fazenda, e zoológico, animais de esportes ou de estimação como cães, gatos, cobaias, coelhos, ratos, camundongos, cavalos, gado, vacas e assim por diante.
[00114] O termo “receptor TRAIL” conforme usado aqui refere-se a uma proteína que se liga a TRAIL e, na ligação a TRAIL, ativa a morte celular programada (apoptose) em células de tumor. Um exemplo não limitante de um receptor TRAIL inclui o receptor TRAIL-R2.
[00115] Os termos “TRAIL R2” ou “receptor TRAIL R2” são usados de modo intercambiável para referir-se à sequência de receptor TRAIL de comprimento completa e solúvel, formas de domínio extracelular do receptor descrito em Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997); Pan et al., Science, 277:815-818 (1997), Patente US 6.072.047 e 6.342.369: Publ. PCT N.° WO98/51793, WO98/41629, WO98/35986, WO99/02653, WO99/09165, WO98/46643, and WO99/11791; Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997). Sequências de receptores TRAIL de comprimento completo representativas são disponíveis em Nos de Acessão de GenBank AAC51778.1 e O14763.2.
[00116] O termo “agonista de receptor TRAIL” ou “agonista” é usado no sentido mais amplo, e inclui qualquer molécula que parcialmente ou completamente melhora, estimula ou ativa uma ou mais atividades biológicas de TRAIL R2, e variantes biologicamente ativas das mesmas, in vitro, in situ, ou in vivo. Exemplos de ditas atividades biológicas incluem apoptose bem como aqueles reportados na literatura. Um agonista pode funcionar em um modo direto ou indireto. Por exemplo, um agonista de receptor TRAIL pode funcionar para parcial ou totalmente aumentar, estimular ou ativar uma ou mais atividades biológicas de um ou mais receptores TRAIL R2, ou um ou mais receptores TRAIL R2 e outros alvos, in vivo, in vitro ou in situ, como um resultado de sua ligação a TRAIL R2 que causa ativação de receptor ou transdução de sinal.
[00117] “TRAIL” ou “TRAIL polipeptídeo” refere-se a um ligador que se liga a um ou mais receptores TRAIL, incluindo TRAIL R2, bem como fragmentos biologicamente ativos dos mesmos. Sequências representativas de TRAIL estão disponíveis em N.° de Acessão de GenBank AAH32722.1 e P50591.1. Os fragmentos incluem, entre outros, sequências contendo cerca de 5 a cerca de 50 resíduos de aminoácidos, ou cerca de5 a cerca de 25, ou cerca de 10 a 20 resíduos, ou cerca de 12 a cerca de 20 resíduos de aminoácidos de uma sequência de polipeptídeo TRAIL. Opcionalmente, o peptídeo TRAIL consiste em não mais do que 25 resíduos de aminoácidos (por exemplo, 25, 23, 21, 19, 17, 15 ou menos resíduos de aminoácidos).
[00118] Os termos “apoptose” e “atividade apoptótica” são usados em um sentido amplo e referem-se à forma ordenada ou controlada de morte de célula em mamíferos que é tipicamente acompanhada por uma ou mais alterações de células características, incluindo condensação de citoplasma, perda de microvilos de membrana plasmática, segmentação de núcleos, degradação de DNA cromossômica ou perda de função mitocondrial. Esta atividade pode ser determinada e medida usando métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, por ensaio de viabilidade celular, análise de FACS ou eletroforese de DNA, ligação a anexina V, fragmentação de DNA, encolhimento da célula, dilatação de retículo endoplasmático, fragmentação de célula, e/ou formação de vesículas de membrana (corpos apoptóticos). Introdução
[00119] A proteína TRAIL-R2 é codificada por um membro de gene de superfamília de receptor TNF, e contém um domínio de morte intracelular. Em alguns casos, pode ainda ser conhecida como TNFRSFl0B; CD262, DR5, KILLER, KILLER/DR5, TRAILR2, TRICK2, TRICK2A, TRICK2B, TRICKB, ou ZTNFR9. Este receptor pode ser ativado por ligador que induz apoptose relacionada ao fator de necrose tumoral (TNFSF 10/TRAIL/APO-2L), e traduz um sinal apoptótico. Ainda, apoptose induzida por TRAIL-R2 envolve caspases e a molécula adaptadora intracelular FADD/MORT1 (Walczak et al. EMBOJ, (1997), 16, 5386- 97).
[00120] Embora vários tipos de células normais expressam TRAIL R2, a sinalização de apoptose através deste receptor parece ser principalmente restrito às células de tumor, que se tornam mais susceptíveis à apoptose mediada por receptor de morte no contexto de suas transformações por oncogenes como Myc ou Ras (Wang et al., Cancer Cell 5:501-12 (2004); Nesterov et al., Cancer Res. 64:3922-7 (2004)). TRAIL-R2 é frequentemente expresso por linhagens de células de câncer humano como tumores primários.
[00121] A presente invenção fornece uma família de estruturas de proteína recombinante de ocorrência não natural capazes de se ligar a TRAIL R2. Em particular, as proteínas descritas aqui podem ser usadas para apresentar alças definidas que são análogas às regiões determinantes de complementariedade ("CDRs") de uma região variável de anticorpo. Estas alças podem ser submetidas a randomização ou evolução restrita para gerar diversidade capaz de ligar a uma multitude de compostos alvos. As proteínas podem ser montadas em estruturas multiespecíficas capazes de ligar a TRAIL R2 e a diferentes alvos.
[00122] Em modalidades específicas, a invenção fornece ligadores específicos a TRAIL-R2 que são úteis para prevenir, amenizar, detectar, diagnosticar, ou monitorar doenças, como, entre outras, câncer. Em outras modalidades específicas, estruturas de ligação específicas a TRAIL-R2 da invenção são úteis para o tratamento de cânceres em cujas células de câncer expressam TRAIL-R2. Em algumas modalidades, os cânceres podem incluir, entre outros, câncer pulmonar, linfoma não Hodgkin, câncer ovariano, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer pancreático, e mieloma múltiplo. A invenção ainda fornece métodos de uso das estruturas para depletar uma população de células. Em uma modalidade, métodos da invenção são úteis na depleção dos seguintes tipos de células: eosinófilos, basófilos, neutrófi- los, célula T, célula B, mastócito, monócitos e células de tumor.
[00123] As estruturas da invenção são estruturas multiméricas compreendendo estruturas monoméricas derivadas de terceiro domínio FnIII de tenascina C humana, em que pelo menos uma ligação dissulfeto intramolecular de ocorrência não natural foi projetada. As estruturas Tn3 que criam as estruturas multiméricas da invenção corretamente se dobram independentemente de cada outra, retêm sua especificidade e afinidade de ligação, e cada uma das estruturas monoméricas retêm suas propriedades funcionais. Quando as estruturas Tn3 que criam as estruturas multiméricas da invenção são montadas em estruturas multiméricas de alta valência, por exemplo, estruturas hexavalentes ou octavalentes, as estruturas de monômero corretamente se dobram independentemente de cada outra, retêm suas especificidades e afinidades de ligação, e cada uma das estruturas de monômero retêm suas propriedades funcionais.
[00124] Estruturas Tn3 multiméricas, incluindo estruturas de alta valência (por exemplo, hexavalente ou octavalente), se dobram corretamente mesmo quando a topologia do constructo não é linear, por exemplo, quando as estruturas monoméricas Tn3 ou Tn3 multimérica são montadas em estruturas ramificadas complexas (por exemplo, constructos de fusão Fc ou constructos tipo anticorpos).
[00125] Domínios FnIII nativos como o 10° domínio FnIII de fibronectin humana e a ampla maioria de domínios FnIII de ocorrência natural não contém ligações dissulfeto ou cisteínas livres. Quando proteínas de multidomínio são projetadas introduzindo várias cisteínas, ausência de expressão de proteína, precipitação de proteínas resultantes, ou produção de proteínas não funcionais, são ocorrências comuns. Estes efeitos deletérios são devido à formação incorreta de intradomínio intramolecular e/ou ligações dissulfeto interdomínio, e/ou a formação incorreta de ligações dissulfeto intermoleculares, que resultam em uma dobra incorreta de proteína. Estes efeitos são geralmente intensificados quando nenhum número de cisteínas e/ou domínios de proteínas são aumentados.
[00126] Por exemplo, uma estrutura linear multimérica compreendendo 8 estruturas Tn3 tipo selvagem (SEQ ID NO: 1) poderiam conter 16 cisteínas junto com uma única sequência de aminoácido de polipeptídeo. Em outra modalidade exemplar, um constructo tipo anticorpo compreendendo 4 módulos Tn3, em que dois módulos Tn3 são ligados a cadeias pesadas de IgG e dois Tn3 são ligados a cadeias leves de IgG, poderia compreender 8 cisteínas distribuídas entre 4 diferentes cadeias de polipeptídeos. Estruturas multiméricas da presente invenção, como aquelas contendo 4, 6, ou 8 módulos Tn3 lineares, compreendendo dito número de cisteínas e dita complexidade estrutura de dobra corretamente e apresentam estabilidade melhorada e propriedades de ligação quando comparados a seus respectivos monômeros.
[00127] Quando as estruturas Tn3 compreendendo uma ou mais ligações dissulfeto projetadas são montadas em formatos multiméricos de alta valência, cada estrutura de monômero individual se dobra corretamente retendo sua especificidade e estabilidade de ligação, bem como suas propriedades funcionais. Além disso, as estruturas monoméricas são capazes de formar estruturas multiméricas estáveis, funcionais e corretamente dobradas.
[00128] Uma vantagem das estruturas multiméricas da invenção é suas capacidades de se ligar a vários epitopos, por exemplo, (i) ligação a vários epitopos em um único alvo, (ii) ligação a um único epitopo em vários alvos, (iii) ligação a vários epitopos localizados em diferentes subunidades de um alvo, ou (iv) ligação a vários epitopos em vários alvos, assim aumentando a avidez.
[00129] Além disso, devido à flexibilidade de estruturas multiméricas e a possibilidade de variar a distância entre vários monômeros Tn3 através de ligadores, as estruturas multiméricas Tn3 são capazes de ligação a várias moléculas alvo em uma superfície (seja na mesma célula/superfície ou em diferentes células/superfícies).
[00130] Como resultado de suas capacidades de se ligarem simultaneamente a mais do que um alvo, as estruturas multiméricas da invenção podem ser usadas para modular várias vias, receptores de ligação cruzada em uma superfície de célula, se ligam a receptores de superfície de célula em células separadas, e/ou ligar em moléculas alvo ou células a um substrato.
[00131] A partir da análise de sequência anterior de domínios FnIII, grandes variações foram observadas nas alças BC e FG, sugerindo que estas alças não são cruciais à estabilidade (ver, por exemplo, Publicação PCT WO 2009/058379). A presente invenção fornece estruturas Tn3 contendo estabilidade melhorada, que variam na sequência de aminoácido mas que compreendem uma alça FG contendo um comprimento mais curto do que aquela da alça correspondente FG do terceiro FnIII de tenascina C humana. Foi observado que o encurtamento das alças FG resulta em uma estrutura Tn3 mutada que aumentou a estabilidade. Consequentemente, outro aspecto da invenção fornece variantes da estrutura Tn3 tipo selvagem (SEQ ID NO: 1) contendo estabilidade de proteína aumentada.
[00132] Em certas modalidades, uma estrutura de monômero Tn3 da invenção compreende uma alça FG contendo 9 aminoácidos e uma estabilidade aumentada comparado a uma estrutura compreendendo o terceiro domínio FnIII nativo de tenascina C humana que tem um comprimento de alça FG de 10 aminoácidos. Além disso, a presente invenção fornece bibliotecas de diversas estruturas Tn3 contendo comprimentos de alça FG especificadas que são úteis para isolar estruturas Tn3 contendo estabilidade aumentada.
[00133] Além disso, a presente invenção fornece estruturas multiespecíficas que podem se ligar a TRAIL R2 e um ou mais alvos adicionais, estruturas maturadas de afinidade em que a afinidade de uma estrutura para um alvo específico é modulado através da mutação, e estruturas cuja imunogenicidade e/ou reatividade cruzada entre espécies animais é modulado através da mutação. Ainda, a invenção fornece métodos para produzir as estruturas da invenção bem como métodos para projetar estruturas com propriedades desejáveis físico- químicas, farmacológicas, ou imunológicas. Além disso, a presente invenção fornece usos para aquelas estruturas e métodos para uso terapêutico, profilático e diagnóstico. O motivo estrutural FnIII
[00134] As estruturas Tn3 da presente invenção são baseadas na estrutura da um módulo de fibronectina de tipo III (FnIII), um domínio encontrado amplamente através de três domínios de vida e vírus, e em multitude de classes de proteína.
[00135] Em modalidades específicas, as estruturas da invenção são derivadas de um terceiro domínio FnIII de tenascina C humana (SEQ ID NO: 4). Em uma modalidade específica, as estruturas da invenção compreendem um módulo Tn3. A dobra tridimensional geral deste domínio é intimamente relacionado àquela do menor fragmento de anticorpo funcional, a região variável de cadeia pesada (VH), que nos anticorpos de domínios únicos de camelos e camelídeos (por exemplo, lhamas) compreendem a unidade de reconhecimento do antígeno inteiro.
[00136] As estruturas Tn3 monoméricas da invenção e o domínio FnIII nativo de tenascina C são caracterizados pela mesma estrutura tridimensional, isto é uma estrutura beta-sanduiche com estas três fitas beta (A, B, e E) em um lado e quatro fitas beta (C,D, F, e G) do outro lado, conectadas por seis regiões de alça. Estas regiões de alça são designadas de acordo com as fitas beta conectadas à N- e C- terminais de cada alça. Assim, a alça AB está localizada entre fitas beta A e B, a alça BC está localizada entre as fitas B e C, a alça CD está localizada entre as fitas beta C e D, a alça DE está localizada entre as fitas beta D e E, a alça EF está localizada entre as fitas beta E e F, e a alça FG está localizada entre as fitas beta F e G. Domínios FnIII possuem alças expostas às solventes tolerantes de randomização, que facilita a geração de grupos diversos de estruturas de proteína capazes de se ligar a alvos específicos com alta afinidade.
[00137] Em um aspecto da invenção, domínios Tn3 são usados como estruturas que são sujeitos para evolução direcionada designada para randomizar uma ou mais das alças que são análogas às regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de uma região variável de anticorpo. Dita abordagem de evolução direta resulta na produção de moléculas tipo anticorpo com altas afinidades para alvos de interesse, por exemplo, TRAIL R2. Além disso, em algumas modalidades as estruturas descritas aqui podem ser usadas para apresentar alças definidas expostas (por exemplo, alças anteriormente randomizadas e selecionadas na base de ligação alvo) para direcionar a evolução de moléculas que se ligam a ditas alças introduzidas. Este tipo de seleção pode ser conduzido para identificar moléculas de reconhecimento para qualquer alça tipo CDR individual ou, alternativamente, para o reconhecimento de duas ou todas as três alças tipo CDR combinadas em uma fração de ligação ao epitopo não linear.
[00138] As estruturas da invenção são moléculas baseadas no terceiro domínio FnIII de motivo estrutural de tenascina C humana descrito na Publicação PCT No: WO 2009/058379. Um conjunto de três alças (designada BC, DE, e FG), que pode conferir ligação alvo específica, corre entre fitas B e C; fitas D e E, e fitas F e G beta, respectivamente. As alças BC, DE, e FG do terceiro domínio FnIII de tenascina C humana são 9, 6, e 10 resíduos de aminoácidos de comprimento, respectivamente. O comprimento destas alças está dentro da faixa estreita de alças de reconhecimento de antígeno cognato encontrado em cadeias pesadas de anticorpo, ou seja, 7-10, 4-8, e 4-28 aminoácidos em comprimento, respectivamente. De modo semelhante, um segundo conjunto de alças, as alças AB, CD, e EF (7, 7, e 8, aminoácidos em comprimento respectivamente) correm entre as fitas A e B beta; as fitas C e D beta; e as fitas E e F beta, respectivamente.
[00139] Uma vez randomizado e selecionado para afinidade de ligação alta a um alvo, as alças no domínio Tn3 podem gerar contatos com alvos equivalentes aos contatos das alças CDR de cognato nos anticorpos. Assim, em algumas modalidades as alças AB, CD, e EF são randomizadas e selecionadas para ligação de alta afinidade a um ou mais alvos, por exemplo, TRAIL R2. Em algumas modalidades, esta randomização e processo de seleção podem ser realizados em paralelo com a randomização de alças BC, DE, e FG, enquanto que em outras modalidades esta randomização e processo de seleção é realizado em série. Estruturas Monoméricas da invenção
[00140] A invenção fornece estruturas FnIII de ocorrência não natural recombinantes compreendendo, uma pluralidade de domínios de fita beta ligados a uma pluralidade de regiões de alça, em que uma ou mais de ditas regiões de alça variam por deleção, substituição ou adição de pelo menos um aminoácido das alças de cognato em Tn3 tipo selvagem (SEQ ID NO: 1).
[00141] Para gerar módulos Tn3 melhorados com novas características de ligação, um Tn3 tipo selvagem é submetido a adições, deleções ou substituições de aminoácidos. Deve ser entendido que, quando comparando a sequência de uma estrutura melhorada à sequência de Tn3, a mesma definição das fitas beta e alças é utilizada. As estruturas de Tn3 melhoradas podem ser gerados usando o terceiro domínio FnIII de tenascina C humana, a estrutura Tn3 tipo selvagem, ou uma estrutura Tn3 anteriormente melhorada. Em algumas modalidades, as estruturas monoméricas da invenção compreendem a sequência de aminoácido: IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELX1YGI(XCD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)n YEVSLIC(XFG)nKETFTT, em que XAB, XBC, XCD, XDE, XEF, e XFG representam os resíduos de aminoácidos presentes nas alças AB, BC, CD, DE, EF, e FG, respectivamente, em que X1 representa resíduo de aminoácido A ou T, e em que n = 2-26.
[00142] Em uma modalidade, XAB consiste em SEQ ID NO: 35. Em uma modalidade, XBC consiste em SEQ ID NO: 36. Em uma modalidade, XCD consiste em SEQ ID NO: 37. Em uma modalidade, XDE consiste em SEQ ID NO: 38. Em uma modalidade, XEF consiste em SEQ ID NO: 39. Em uma modalidade, XFG consiste em SEQ ID NO: 40.
[00143] Em uma modalidade, XAB compreende SEQ ID NO: 35. Em uma modalidade, XBC compreende SEQ ID NO: 36. Em uma modalidade, XCD compreende SEQ ID NO: 37. Em uma modalidade, XDE compreende SEQ ID NO: 38. Em uma modalidade, XEF compreende SEQ ID NO: 39. Em uma modalidade, XFG compreende SEQ ID NO: 40.
[00144] Em certas modalidades, XAB consiste em SEQ ID NO: 35, XCD consiste em SEQ ID NO: 37, e XEF consiste em SEQ ID NO: 39. Em uma modalidade, XBC consiste em SEQ ID NO: 36, XDE consiste em SEQ ID NO: 38, and XFG consiste em SEQ ID NO: 40.
[00145] Em certas modalidades, XAB compreende SEQ ID NO: 35, XCD compreende SEQ ID NO: 37, e XEF compreende SEQ ID NO: 39. Em uma modalidade, XBC compreende SEQ ID NO: 36, XDE compreende SEQ ID NO: 38, e XFG compreende SEQ ID NO: 40.
[00146] Em algumas modalidades, as estruturas monoméricas da invenção compreendem um módulo Tn3. Ainda em outras modalidades, estruturas da invenção compreendem um módulo Tn3 (SEQ ID NO: 1), em que a fita veta C de um terceiro domínio FnIII de tenascina C humana (SEQ ID NO; 4) é substituída por uma variante de fita beta C (SEQ ID NO: 45 ou SEQ ID NO; 131) compreendendo uma cisteína N-terminal e em que a fita beta F de um terceiro domínio FnIII de tenascina C humana (SEQ ID NO: 48) é substituído por uma fita beta variante F (SEQ ID NO: 49) compreendendo uma cisteína C-terminal. Em algumas modalidades as estruturas da invenção compreendem um módulo Tn3 em que uma ou mais fitas beta compreendem pelo menos uma substituição de aminoácido exceto que os resíduos de cisteína nas fitas beta C e F (SEQ ID NOs: 45 ou 131; e SEQ ID NO: 49, respectivamente) podem ser substituídas.
[00147] As alças conectando as várias fitas beta das estruturas da invenção podem ser randomizadas para comprimento e/ou diversidade de sequência. Em uma modalidade, as estruturas da invenção têm pelo menos uma alça que é randomizada para comprimento e/ou diversidade de sequência. Em uma modalidade, pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou pelo menos seis alças de uma estrutura são randomizadas para comprimento e/ou diversidade de sequência. Em uma modalidade, pelo menos uma alça das estruturas da invenção é mantida constante enquanto pelo menos uma alça adicional é randomizada para comprimento e/ou diversidade de sequência. Em outra modalidade, pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três alças AB, CD, e EF são mantidas constantes enquanto pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três alças BC, DE, e FG são randomizadas para comprimento ou diversidade de sequência. Em outra modalidade, pelo menos uma, pelo menos duas, ou pelo menos todas as três alças AB, CD, e EF são randomizadas enquanto pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três alças BC, DE, e FG são randomizadas para comprimento e/ou diversidade de sequência. Ainda em outra modalidade, pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três das alças, pelo menos 4, pelo menos cinco, ou todas as seis alças AB, CD, EF, BC, DE, e FG são randomizadas para comprimento ou diversidade de sequência.
[00148] Em algumas modalidades, um ou mais resíduos dentro de uma alça são mantidos constantes enquanto que outros resíduos são randomizados para comprimento e/ou diversidade de sequência. Em algumas modalidades, um ou mais resíduos dentro de uma alça são mantidos a um número predeterminado e limitado de diferentes aminoácidos enquanto outros resíduos são randomizadas para comprimento e/ou diversidade de sequência. Assim, estruturas da invenção podem compreender uma ou mais alças contendo uma sequência consenso degenerada e/ou um ou mais resíduos invariantes de aminoácidos. Em uma modalidade, as estruturas da invenção compreendem uma alça AB que é randomizada com a seguinte sequência consenso: K-X-X-X-X-X-a, em que X representa asparagina, ácido aspártico, histidina, tirosina, isoleucina, valina, leucina, fenilalanina, treonina, alanina, prolina, ou serina, e em que (a) representa serina, treonina, alanina, ou glicina. Em outra modalidade, as estruturas da invenção compreendem uma alça AB que é randomizada com a seguinte sequência consenso: K-X-X-X-X-X-X-X-a, em que X representa asparagina, ácido aspártico, histidina, tirosina, isoleucina, valina, leucina, fenilalanina, treonina, alanina, prolina, ou serina, e em que (a) representa serina, treonina, alanina, ou glicina.
[00149] Em outra modalidade, as estruturas da invenção compreendem uma alça BC que é randomizada com a seguinte sequência consenso: S-X-a-X-b-X-X-X-G, em que X representa qualquer aminoácido, em que (a) representa prolina ou alanina e em que (b) representa alanina ou glicina. Em outra modalidade, as estruturas da invenção compreendem uma alça BC que é randomizada com a seguinte sequência consenso: S-P-c-X-X-X-X-X-X-T-G, em que X representa qualquer aminoácido e em que (c) representa prolina, serina ou glicina. Ainda em outra modalidade, as estruturas da invenção compreendem uma alça BC que é randomizada com a seguinte sequência consenso: A-d-P-X-X-X-e-f-X-I-X-G, em que X representa qualquer aminoácido, em que (d) representa prolina, glutamato ou lisina, em que (e) representa asparagina ou glicina, e em que (f) representa serina ou glicina.
[00150] Em uma modalidade, as estruturas da invenção compreendem uma alça CD que é randomizada com a seguinte sequência consenso: Xn, em que X representa qualquer aminoácido, e em que n=6, 7, 8, 9, ou 10. Em outra modalidade, as estruturas da invenção compreende uma alça que é randomizada com a seguinte sequência consenso: Xn, em que X representa asparagina, ácido aspártico, histidina, tirosina, isoleucina, valina, leucina, fenilalanina, treonina, alanina, prolina, ou serina, e em que n=7, 8, ou 9.
[00151] Em uma modalidade, as estruturas da invenção compreende uma alça DE que é randomizada com a seguinte sequência consenso: X-X-X-X-X-X, em que X representa qualquer aminoácido.
[00152] Em uma modalidade, as estruturas da invenção compreendem uma alça ED que é randomizada com a seguinte sequência consenso: X-b-L-X-P-X-c-X, em que X representa asparagina, ácido aspártico, histidina, tirosina, isoleucina, valina, leucina, fenilalanina, treonina, alanina, prolina, ou serina, em que (b) representa asparagina, lisina, arginina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ou glicina, e em que (c) representa isoleucina, treonina, serina, valina, alanina, ou glicina.
[00153] Em uma modalidade, as estruturas da invenção compreendem uma alça FG que é randomizada com a seguinte sequência consenso: X-a-X-X-G-X-X-X-b, em que X representa qualquer aminoácido, em que (a) representa asparagina, treonina ou lisina, e em que (b) representa serina ou alanina. Em outra modalidade, as estruturas da invenção compreendem uma alça FG que é randomizada com a seguinte sequência consenso: X-X-X-X-X-X-X-X-X (X9), em que X representa qualquer aminoácido. Ainda em outra modalidade, as estruturas da invenção compreendem uma alça FG que é randomizada com a seguinte sequência consenso: X-a-X-X-X-X- b-N- P-A, em que X representa qualquer aminoácido, em que (a) representa asparagina, treonina ou lisina e em que (b) representa serina ou glicina. Em uma modalidade específica, as estruturas da invenção compreendem uma alça FG que é randomizada com a seguinte sequência consenso: X-a-X-X-G-X-X-S-N-P-A, em que X representa qualquer aminoácido, e em que (a) representa asparagina, treonina ou lisina.
[00154] Em certas modalidades, as estruturas da invenção compreendem uma alça FG que é mantida para ser pelo menos um resíduo de aminoácido menor do que a alça FG cognato do terceiro domínio FnIII de tenascina C humana e é ainda randomizada em uma ou mais posições.
[00155] Em modalidades específicas, pelo menos uma das alças BC, DE, e FG é randomizada, em que as fitas beta A compreendem SEQ ID NO:41 ou 42, a fita beta B compreende SEQ ID NO:43, a fita beta C compreende SEQ ID NO:44, a fita beta D compreende SEQ ID NO:46, a fita beta E compreende SEQ ID NO:47, a fita beta F compreende SEQ ID NO:48, 49, 50, ou 51, e a fita beta G compreende SEQ ID NO:52 ou 53, a alça AB compreende SEQ ID NO:35, a alça CD compreende SEQ ID NO:37 e a alça EF compreende SEQ ID NO:39.
[00156] Em outras modalidades específicas, pelo menos uma das alças AB, CD, e EF são randomizadas, em que a fita beta A compreende SEQ ID NO:41 ou 42, a fita beta B compreende SEQ ID NO:43, a fita beta C compreende SEQ ID NO:44 ou 45, a fita beta D compreende SEQ ID NO:46, a fita beta E compreende SEQ ID NO:47, a fita beta F compreende SEQ ID NO:48, 49, 50, ou 51, e a fita beta G compreende SEQ ID NO:52 ou 53, a alça BC compreende SEQ ID NO:36, a alça DE compreende SEQ ID NO:38 e a alça FG compreende SEQ ID NO:40. Estabilidade Melhorada da Estrutura Ligações Dissulfeto de Ocorrência Não natural
[00157] A estabilidade de estruturas Tn3 da invenção pode ser aumentada por muitas abordagens diferentes. Em algumas modalidades, estruturas da invenção podem ser estabilizadas alongando as regiões N- e/ou C-terminal. As regiões N- e/ou C-terminal podem ser alongadas por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais do que 10 aminoácidos. Em outras modalidades, as estruturas Tn3 da invenção podem ser estabilizadas introduzindo uma alteração que aumenta a meia-vida sérica,como descrito aqui. Ainda em outra modalidade, as estruturas Tn3 da invenção compreendem uma adição, deleção ou substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido para estabilizar o centro hidrofóbico da estrutura.
[00158] Estruturas Tn3 da invenção podem ser efetivamente por ligações dissulfeto não naturais projetadas. Ditas estruturas projetadas podem ser eficientemente expressa como parte de estruturas multiméricas. A formação correta de ligações dissulfeto e a dobra correta da estrutura projetada são evidenciadas pela preservação da atividade biológica da estrutura. O fato que uma estrutura projetada compreendendo ligações dissulfeto não naturais podem se ligar simultaneamente a pelo menos dois alvos (ver, por exemplo, Exemplo 8) ou três alvos (ver, por exemplo, Exemplo 12) fornece evidência que a estrutura tridimensional da estrutura não é significativamente alterada ligações dissulfeto projetadas e que as posições relativas das alças de ligação alvo são preservadas. Em algumas modalidades, estruturas da invenção compreendem ligações dissulfeto de ocorrência não natural, como descrito na Publicação PCT WO 2009/058379. Uma abordagem bioinformática pode ser utilizada para identificar posições candidatas para ligações dissulfeto projetadas.
[00159] Em uma modalidade, uma estrutura de monômero Tn3 da invenção compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, ou pelo menos cinco ligações dissulfeto intramolecular de ocorrência não natural. Em uma modalidade específica, da invenção fornece um método para obter uma estrutura Tn3 contendo estabilidade aumentada quando comparado ao terceiro domínio FnIII de tenascina C humana compreendendo duas, três, quatro, ou mais ligações dissulfeto intramoleculares projetadas.
[00160] Em uma modalidade, uma estrutura de monômero Tn3 da invenção compreende pelo menos uma ligação dissulfeto intramolecular de ocorrência não natural, em que dita pelo menos uma ligação dissulfeto de ocorrência não natural estabiliza uma estrutura de monômero.
[00161] Em outra modalidade, estruturas multiméricas da invenção compreendem pelo menos uma ligação dissulfeto de ocorrência não natural, em que a ligação está localizada entre duas estruturas monoméricas distintas na mesma estrutura multimérica. Ainda em outra modalidade, estruturas da invenção compreendem pelo menos uma ligação dissulfeto de ocorrência não natural, em que a ligação está localizada entre duas estruturas multiméricas, ou seja, a ligação dissulfeto é uma ligação dissulfeto intermolecular. Por exemplo, uma ligação dissulfeto ode ligar a estruturas distintas (por exemplo, duas estruturas de monômero Tn3 isoladas, uma estrutura de monômero Tn3 isolada e uma estrutura multimérica, ou duas estruturas multiméricas), uma estrutura Tn3 e um ligador, uma estrutura Tn3 e um domínio Fn, ou uma estrutura Tn3 e um anticorpo ou fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, estruturas da invenção compreendem pelo menos uma ligação dissulfeto intermolecular de ocorrência não natural que se liga a uma estrutura e uma fração heteróloga isolada, uma estrutura e uma fração heteróloga fundidas ou conjugadas à mesma estrutura, ou uma estrutura e fração heteróloga fundidas ou conjugadas a uma diferente estrutura.
[00162] Em algumas modalidades, estruturas da invenção compreende uma ligação dissulfeto que forma uma estrutura multimérica de pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4 ou mais estruturas.
[00163] Em outra modalidade, estruturas da invenção podem compreender um alongamento das regiões the N e/ou C terminal. Em uma modalidade, as estruturas da invenção compreendem uma alteração para aumentar a meia-vida sérica, conforme descrito aqui. Ainda em outra modalidade, as estruturas da invenção compreendem uma adição, deleção ou substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido para estabilizar o centro hidrofóbico da estrutura.
[00164] Em uma modalidade específica, estruturas da invenção compreende pelo menos uma ligação dissulfeto intramolecular de ocorrência não natural, em que o domínio de fita A compreende SEQ ID NO:42, a fita beta B compreende SEQ ID NO:43, a fita beta C compreende SEQ ID NO:45, a fita beta D compreende SEQ ID NO:46, a fita beta E compreende SEQ ID NO:47, a fita beta F compreende SEQ ID NO:49, e a fita beta G compreende SEQ ID NO:52.
[00165] Em uma modalidade específica, estruturas da invenção compreendem pelo menos uma ligação dissulfeto intramolecular de ocorrência não natural, em que o domínio de fita beta A consiste em SEQ ID NO:42, a fita beta B consiste em SEQ ID NO:43, a fita beta C consiste em SEQ ID NO:45, a fita beta D consiste em SEQ ID NO:46, a fita beta E consiste em SEQ ID NO:47, a fita beta F consiste em SEQ ID NO:49, e a fita beta G consiste em SEQ ID NO:52.
[00166] Em uma modalidade específica, estruturas da invenção compreendem pelo menos uma ligação dissulfeto intramolecular de ocorrência não natural, em que o domínio de fita beta A consiste essencialmente de SEQ ID NO:42, a fita B beta consiste essencialmente de SEQ ID NO:43, a fita beta C consiste essencialmente de SEQ ID NO:45, a fita beta D consiste essencialmente de SEQ ID NO:46, a fita E beta consiste essencialmente de SEQ ID NO:47, a fita F beta consiste essencialmente de SEQ ID NO:49, e a fita G beta consiste essencialmente de SEQ ID NO:52. Estabilidade Melhorada da Estrutura: Comprimento de Alça FG
[00167] Os inventores descobriram que o comprimento da alça FG desempenha um papel na estabilidade de estruturas Tn3. Em particular, estruturas Tn3 compreendendo alças FG de ocorrência não natural que são pelo menos um aminoácido menor do que o encontrado na alça FG de um FOI apresentam ter estabilidade melhorada. Em certas modalidades, estruturas da invenção compreendem uma alça FG variante de ocorrência não natural que é pelo menos um resíduo de aminoácido menor do que a alça FG do terceiro domínio FnIII de tenascina C humana.
[00168] Em uma modalidade específica, a estabilidade de uma estrutura Tn3 é melhorada por deleção de pelo menos um aminoácido na alça FG. Em outra modalidade, a estabilidade de uma estrutura Tn3 pode ser melhorada por deleção de pelo menos 1, ou pelo menos 2, ou pelo menos 3, ou pelo menos 4, ou pelo menos 5, ou pelo menos 6, ou pelo menos 7, ou pelo menos 8, ou pelo menos 9, ou pelo menos 10 aminoácidos na alça FG. É especificamente contemplado que a estrutura Tn3 estabilizada pode compreender pelo menos uma ligação dissulfeto de ocorrência não natural.
[00169] Em certas modalidades, a estrutura Tn3 variante ainda compreende pelo menos uma alça, (ou seja, AB, BC, CD, DE, EF, e/ou FG) que foi randomizada para comprimento e/ou sequência. É especificamente contemplado que a estrutura Tn3 variante pode compreender pelo menos uma ligação dissulfeto de ocorrência não natural.
[00170] Em certas modalidades, uma estrutura Tn3 variante compreende uma alça FG que é pelo menos uma, ou pelo menos duas, ou pelo menos 3, ou pelo menos 4, ou pelo menos 5, ou pelo menos 6, ou pelo menos 7, ou pelo menos 8, ou pelo menos 9, ou pelo menos 10 resíduos de aminoácidos maior do que a alça FG da estrutura Tn3 tipo selvagem, em que a estrutura Tn3 variante ainda compreende pelo menos uma substituição de aminoácido. Medições de estabilidade
[00171] O aumento na estabilidade de estruturas FnIII estabilizadas da invenção, isoladas como parte de uma estrutura multimérica, pode ser prontamente medido por técnicas bem conhecidas na técnica, como desnaturação térmica (Tm) e caotrópica (como tratamento com ureia, ou sais de guanidina), tratamento com protease (como tratamento com termolisina) ou outra metodologia aceita na técnica para determinar estabilidade de proteína. Uma revisão compreensiva de técnicas usadas para medir a estabilidade de proteína pode ser encontrada, por exemplo, em "Current Protocols in Molecular Biology" e "Current Protocols in Protein Science" por John Wiley and Sons. 2007. Estruturas Multiméricas
[00172] Um aspecto da presente invenção fornece estruturas multiméricas compreendendo pelo menos duas estruturas de monômero Tn3 da invenção unidas em tandem. Ditas estruturas multiméricas podem ser montadas em vários formatos. Em algumas modalidades as estruturas de monômero Tn3 são montadas em formatos lineares enquanto que em outras modalidades as estruturas são montadas em formatos ramificados (ver, por exemplo, figura 1). Em um aspecto específico, a invenção fornece estruturas multiméricas, em que pelo menos duas estruturas Tn3 são conectadas em tandem através de uma ligação peptídica. Em algumas modalidades, uma estrutura Tn3 nas estruturas multiméricas da invenção se ligam a TRAIL R2, enquanto que uma segunda estrutura Tn3 se liga a um alvo diferente, assim demonstrando várias funções, e/ou ao mesmo alvo, assim aumentando a valência e/ou avidez de ligação alvo, outra ação dos alvos. Em algumas modalidades, o aumento na valência e/ou avidez de ligação alvo é conseguido quando várias estruturas se ligam ao mesmo alvo. Em algumas modalidades, o aumento na valência melhora uma ação específica no alvo, como aumentando a dimerização de uma proteína alvo.
[00173] Em uma modalidade específica, a estrutura multimérica da invenção compreende pelo menos duas estruturas Tn3 da invenção conectadas em tandem, em que cada estrutura Tn3 liga pelo menos um alvo, e em que cada estrutura Tn3 compreende uma pluralidade de fitas beta ligadas a uma pluralidade de regiões de alça, em que pelo menos uma alça é uma variante de ocorrência não natural de alça cognato em um domínio de Tn3 tipo selvagem. Estruturas Multiméricas Tandem
[00174] Em uma modalidade, as estruturas multiméricas da invenção compreendem duas, três, quatro, cinco, seis, oito ou mais estruturas de monômero Tn3 da invenção. Em algumas modalidades algumas das estruturas de monômero Tn3 são conectadas em tandem. Ainda em outra modalidade, algumas das estruturas de monômero Tn3 são conectadas em tandem e algumas das estruturas de monômero Tn3 não estão conectadas em tandem. Em uma modalidade específica, as estruturas multiméricas da invenção compreendem duas, ou três, ou quatro, ou cinco, ou seis, ou sete, ou oito, ou nove, ou dez, ou mais estruturas da invenção conectadas em tandem (ver, por exemplo, figura 1 e figura 2).
[00175] Em uma modalidade, as estruturas multiméricas são geradas através de ligação covalente entre estruturas de monômero Tn3, por exemplo, por diretamente ligando as estruturas Tn3, ou pela inclusão de um ligador, por exemplo, um ligador de peptídeo. Em exemplos particulares, estruturas ligadas covalentemente são geradas por construção de genes de fusão que codificam as estruturas monoméricas Tn3 ou, alternativamente, projetando códons para resíduos de cisteína em estruturas Tn3 de monômero e permitindo a formação de ligação dissulfeto ocorrendo entre os produtos de expressão.
[00176] Em uma modalidade, as estruturas multiméricas da invenção compreendem pelo menos duas estruturas Tn3 que são conectadas diretamente a cada outro sem quaisquer aminoácidos adicionais intervenientes. Em outra modalidade, as estruturas multiméricas da invenção compreendem pelo menos duas estruturas Tn3 que são conectadas em tandem através de um ligador, por exemplo, um ligador de peptídeo. Em uma modalidade específica, as estruturas multiméricas da invenção compreendem pelo menos duas estruturas Tn3 que são conectadas em tandem através de um ligador de peptídeo, em que o ligador de peptídeo compreende 1 a cerca de 1000, ou 1 a cerca de 500, ou 1 a cerca de 250, ou 1 a cerca de 100, ou 1 a cerca de 50, ou 1 a cerca de 25, aminoácidos. Em uma modalidade específica, as estruturas multiméricas da invenção compreendem pelo menos duas estruturas Tn3 que são conectadas em tandem através de um ligador de peptídeo, em que o ligador de peptídeo compreende 1 a cerca de 20, ou 1 a cerca de 15, ou 1 a cerca de 10, ou 1 a cerca de 5, aminoácidos.
[00177] Em uma modalidade específica, as estruturas multiméricas da invenção compreendem pelo menos duas estruturas Tn3 que são conectadas em tandem através de um ligador, por exemplo, um ligador de peptídeo, em que o ligador é uma fração funcional. A fração funcional será selecionada baseada na função desejada e/ou características da estrutura multimérica. Por exemplo, uma fração funcional útil para purificação (por exemplo, um tag histidina) pode ser usado como um ligador. Frações funcionais úteis como ligadores incluem, entre outros a, polietileno glicol (PEG), um agente citotóxico, um radionuclídeo, agente de imagem, biotina, um domínio de dimerização, albumina sérica humana (HSA) ou uma porção de ligação a FcRn da mesma, um domínio ou fragmento de um anticorpo, um anticorpo de cadeia simples, um domínio de anticorpo, um domínio de ligação a albumina, uma molécula IgG, uma enzima, um ligador, um receptor, um peptídeo de ligação, uma estrutura não Tn3, um tag de epitopo, um polímero polipeptídeo recombinante, uma citocina, e semelhantes. Ligantes de peptídeo específicos e frações funcionais que podem ser usados como ligadores são revelados infra.
[00178] Em algumas modalidades, a estrutura multimérica Tn3 compreende pelo menos duas estruturas Tn3 que são conectadas através de um ou mais ligadores, em que os ligadores interpostos entre cada estrutura Tn3 pode ser os mesmos ligadores ou diferentes ligadores. Em algumas modalidades, um ligador pode compreender vários ligadores, que podem ser o mesmo ligador ou ligadores diferentes. Em algumas modalidades, quando uma pluralidade de ligadores é concatenada, alguns de todos os ligadores podem ser frações funcionais. Estequiometria de Ligação a Estruturas Multiméricas
[00179] Em algumas modalidades, a estrutura multimérica Tn3 compreende estruturas que são especificas para TRAIL R2. Em outras modalidades, as estruturas multiméricas da invenção compreendem estruturas que são específicas para diferentes epitopos, que podem ser diferentes epitopos em TRAIL R2 ou em diferentes alvos.
[00180] Em uma modalidade específica, a estrutura multimérica Tn3 pode se ligar a dois ou mais diferentes epitopos (por exemplo, epitopos não sobrepostos) na mesma molécula TRAIL R2. Em outra modalidade específica, a estrutura multimérica Tn3 pode se ligar a dois ou mais diferentes epitopos em TRAIL R2. Ainda em outra modalidade específica, a estrutura multimérica Tn3 pode se ligar a dois ou mais diferentes epitopos em TRAIL R2 e adicionalmente, ligar pelo menos uma epitopo em uma ou mais diferentes moléculas alvo. Ainda em outra modalidade específica, a estrutura multimérica Tn3 pode se ligar ao mesmo epitopo em um dímero TRAIL R2. Ainda em outra modalidade, a estrutura multimérica Tn3 pode se ligar ao mesmo epitopo em pelo menos duas moléculas TRAIL R2. Em certas modalidades, a estrutura multimérica Tn3 pode se ligar ao mesmo epitopo em duas ou mais cópias de molécula TRAIL R2 em uma superfície de célula adjacente. Em algumas modalidades, a estrutura multimérica Tn3 pode se ligar ao mesmo epitopo ou diferentes epitopos em TRAIL R2 ou em diferentes alvos com as mesmas ou diferentes afinidades de ligação e/ou avidezes.
[00181] Em outra modalidade, as estruturas de monômero em uma estrutura multimérica Tn3 podem se ligar aos epitopos em uma ou mais cópias de TRAIL R2 de acordo com um padrão de ligação específico projetado para obter ou melhorar (por exemplo, sinergisticamente) uma ação desejada no alvo, por exemplo, dimerização alvo. Por exemplo, as estruturas Tn3 em uma estrutura linear multimérica podem se ligar a um único TRAIL R2 ou a vários TRAIL R2 de acordo com certo padrão, por exemplo, estruturas Tn3 em um módulo 6 linear de estrutura multivalente pode ligar a dois alvos TRAIL R2 A e B de acordo com um padrão AAABBB, um padrão AABBAA, um padrão ABABAB, um padrão AAAABB, etc.; a três alvos de acordo com um padrão AABBCC, um padrão ABCABC, e padrão ABCCBA, etc.; a quatros alvos de acordo com padrões ABCDDA, padrão ABCADA, etc.; etc. Além disso, quando uma estrutura multimérica da invenção compreende uma pluralidade de projetada (por exemplo, dissulfeto projetada, alça projetada, ou ambos dissulfeto e alça projetadas) e não estruturas projetadas, como estruturas monoméricas podem ser arranjadas de acordo com certo padrão para obter ou melhorar certo efeito biológico. Ditas combinações de estruturas monoméricas Tn3 podem ser combinatoriamente montados e subsequentemente avaliados usando métodos conhecidos na técnica.
[00182] Em algumas modalidades, as estruturas multiméricas Tn3 em constructos ramificados, por exemplo, estruturas multiméricas em uma fusão Fc ou formato tipo anticorpo, pode ainda se ligar a um único TRAIL R2 ou a vários TRAIL R2 alvos de acordo com certo padrão. Por exemplo, em certas modalidades um formato de estrutura Tn3 linear fundido a cadeias pesadas de IgG em uma formato tipo anticorpo de estrutura Tn3 multimérica podem se ligar a um primeiro alvo enquanto que uma estrutura multivalente Tn3 linear fundida a cadeias leves IgG em um formato tipo anticorpo de estrutura Tn3 pode se ligar a um segundo alvo. Em outra modalidade, estruturas de formato linear Tn3 fundidas a cadeias pesadas IgG de uma estrutura Tn3 de formato tipo anticorpo pode se ligar a um alvo com certe afinidade enquanto que as estruturas de formato lineares fundidos a cadeias leves de IgG de uma estrutura de formato tipo anticorpo pode se ligar ao mesmo alvo com uma afinidade diferente. Em algumas modalidades, as estruturas Tn3 fundidas às cadeias no braço esquerdo de "Y" de um anticorpo pode se ligar a um primeiro alvo, enquanto que as estruturas Tn3 fundidas às cadeias da direita de "Y" de um anticorpo pode se ligar a um segundo alvo. Fusões
[00183] A invenção ainda fornece estruturas multiméricas Tn3 compreendendo pelo menos duas estruturas de monômero Tn3, em que pelo menos uma estrutura de monômero Tn3 podem ser fundidas a uma fração heteróloga. Neste contexto a fração heteróloga não é usada para ligar as estruturas como um espaçador mas pode fornecer funcionalidade adicional à estrutura Tn3 multimérica. Por exemplo, em algumas modalidades, uma estrutura Tn3 multimérica que se liga a TRAIL R2 pode ser fundida a um agente citotóxico para facilitar a morte celular específica alvo. Em algumas modalidades, uma fração heteróloga pode funcionar como um ligador.
[00184] A presente invenção inclui o uso de estruturas multimérica Tn3 conjugadas ou fundidas a uma ou mais frações heterólogas, incluindo, entre outras, peptídeos, polipeptídeos, proteínas, proteínas de fusão, moléculas de ácido nucleico, moléculas pequenas, agentes miméticos, fármacos sintéticos, moléculas inorgânicas, e moléculas orgânicas. A presente invenção inclui o uso de estruturas multimérica Tn3 recombinantemente fundidas ou quimicamente conjugadas a uma proteína heteróloga ou polipeptídeo ou fragmento do mesmo. A conjugação inclui tanto a conjugação covalente quanto a não covalente. Em algumas modalidades, uma estrutura Tn3 multimérica pode ser fundida ou quimicamente conjugada a um polipeptídeo de pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 500, ou pelo menos 1000 aminoácidos para gerar proteínas de fusão.
[00185] A fusão ou conjugação de uma estrutura Tn3 multimérica a uma ou mais frações heterólogas pode ser direta, ou seja, sem um ligador interposto entre uma estrutura Tn3 and e uma fração heteróloga, ou através de um ou mais sequências de ligadores descritas aqui. Em algumas modalidades, as estruturas podem ser usadas para polipeptídeos heterólogos alvos em particular tipos de células, seja in vitro ou in vivo, fundindo ou conjugando as estruturas Tn3 a anticorpos específicos para receptores de superfícies de células particulares nas células alvo, como TRAIL R2. Estruturas multiméricas Tn3 fundidas ou conjugadas a polipeptídeos heterólogos podem ainda ser usados em imunoensaios in vitro e métodos de purificação usando métodos conhecidos na técnica. Ver por exemplo, publicação internacional WO 93/21232; patente europeia EP 439.095; Naramura et al. Immunol. Lett. 39:91-99, 1994; patente US 5.474.981; Gillies et al., PNAS 89:1428- 1432, 1992; e Fell et al., J. Immunol. 146:2446-2452, 1991, que são incorporados por referência em suas totalidades.
[00186] Em algumas modalidades, as estruturas multimérica Tn3 podem ser integradas com a resposta humana imune por fusão ou conjugando uma estrutura com uma imunoglobulina ou domínio do mesmo incluindo, entre outros, a região constante de uma IgG (Fc), por exemplo, através de N ou C-terminal. De modo semelhante, uma fusão entre uma estrutura e uma proteína de complemento, como CIq, podem ser usadas para células alvo. Uma fusão entre uma estrutura Tn3 multimérica e uma toxina pode ser usada para especificamente destruir células que conduzem um antígeno particular conforme descrito aqui.
[00187] Várias publicações descrevem métodos para obter moléculas fisiologicamente ativas cujas meias-vidas são modificadas introduzindo um polipeptídeo de ligação a FcRn nas moléculas (ver, por exemplo, WO 97/43316; patente US 5.869.046; patente US 5.747.035; WO 96/32478; e WO 91/14438), fundindo as moléculas com anticorpos cujas afinidades de ligação FcRn são preservados mas as afinidades para outros receptores Fc foram muito reduzidos (ver, por exemplo, WO 99/43713), ou fundindo as moléculas com domínio de ligação a FcRn de anticorpos (ver, por exemplo, WO 00/09560; patente US 4.703.039). Técnicas específicas e métodos de aumentar a meia-vida de moléculas fisiologicamente ativas podem ainda ser encontradas na patente US 7.083.784. Especificamente, é contemplado que as estruturas multimérica Tn3 podem ser fundidas a uma região Fc de uma IgG, em que a região Fc compreende mutações de resíduos de aminoácidos M252Y/S254T/T256E ou H433K/N434F/Y436H, em que as posições dos aminoácidos são designadas de acordo com o esquema de numeração de Kabat. Em algumas modalidades, a meia-vida da estrutura multimérica Tn3 pode ser aumentada por geneticamente fundindo a estrutura multivalente Tn3 com um polipeptídeo recombinante não estruturado intrinsecamente (por exemplo, um polipeptídeo XTEN™) ou por conjugação com polietileno glicol (PEG).
[00188] Em algumas modalidades, a estrutura multimérica Tn3 pode ser fundida com moléculas que aumentam ou estendem a meia-vida sérica ou in vivo. Em algumas modalidades, a estrutura podem ser fundidas ou conjugadas com albumina, como albumina sérica humana (HSA), um receptor neonatal Fc (FcRn) fragmento de ligação do mesmo, PEG, polissacarídeos, anticorpos, complemento, hemoglobina, um peptídeo de ligação, lipoproteínas e outros fatores para aumentar sua meia-vida na corrente sanguínea e/ou sua penetração de tecido. Qualquer uma destas fusões pode ser gerada por técnicas padrões, por exemplo, por expressão da proteína de fusão a partir de um gene de fusão recombinante construídos usando sequências de gene publicamente disponíveis.
[00189] Além disso, as estruturas da invenção podem ser fundidas a sequências marcadoras, como um peptídeo para facilitar a purificação. Em algumas modalidades, o marcador de sequência de aminoácido é um poli-histidina peptídeo (His-tag), por exemplo, u octa-histidina-tag (His-8-tag) ou hexa-histidina-tag (His-6-tag) como o tag fornecido em um vetor de expressão pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif, 91311), entre outros vetores, muitos dos quais são comercialmente disponíveis. Como descrito em Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824, 1989, por exemplo, poli-histidina fornece purificação conveniente da proteína de fusão. Outros peptídeos tags úteis na purificação incluem, entre outros, um marcador hemaglutinina ("HA"), que corresponde a um epitopo derivado de proteína hemaglutinina de influenza (ver, por exemplo, Wilson et al., Cell 37:767, 1984), um marcador FLAG, um Strep-tag, um myc-tag, um V5 tag, um GFP-tag, um AU1-tag, um AU5-tag, um ECS-tag, um GST-tag, ou um OLLAS tag.
[00190] Proteínas de fusão adicionais compreendendo estruturas da invenção podem ser geradas através das técnicas de embaralhamento de gene, embaralhamento de motivo, embaralhamento de éxon, e/ou embaralhamento de códon (coletivamente referenciado como "embaralhamento de DNA").
[00191] Embaralhamento de DNA pode ser empregado para alterar a ação de estruturas Tn3 no alvo (por exemplo, gera estruturas com maiores afinidades e taxas de dissociação menores, ou estrutura com capacidade aumentada para dimerizar TRAIL R2). Estruturas Tn3 podem ser alteradas por mutagênese aleatória por PCR error-prone, inserção de nucleotídeo aleatória, ou outros métodos antes de recombinação. Uma ou mais porções de um polinucleotídeo que codifica uma estrutura, que se liga a um alvo específico pode ser recombinado com um ou mais componentes, motivos, seções, partes, domínios, fragmentos, etc. de uma ou mais moléculas heterólogas. Estruturas multiméricas tipo anticorpo
[00192] Em algumas modalidades, a estrutura multimérica da invenção compreende pelo menos duas estruturas Tn3, em que pelo menos uma estrutura Tn3 é fundida a um domínio ou fragmento de um anticorpo (por exemplo, uma IgG), incluindo, entre outras a um anticorpo intacto, um domínio variável de anticorpo, um domínio CH1, um domínio Ckappa, um domínio Clambda, um domínio Fc, um domínio CH2, ou CH3.
[00193] Em algumas modalidades, uma estrutura Tn3 pode ser fundida a um domínio ou fragmento de um anticorpo. O domínio ou fragmento de um anticorpo pode ainda melhorar a avidez e/ou afinidade da estrutura multimérica fornecendo, de modo semelhante ao domínio Fc descrito abaixo, um domínio de dimerização ou multimerização que facilita a formação de estruturas multiméricas da invenção. Além disso, o domínio ou fragmento de um anticorpo pode ainda melhorar a ação da estrutura no alvo, por exemplo, mais eficientemente dimerizando ou multimerizando um alvo.
[00194] Em algumas modalidades, somente uma estrutura multimérica Tn3 tandem compreendendo dois domínios Tn3 é conjugado ou fundido a um domínio ou fragmento de um anticorpo. Por exemplo, uma estrutura única multimérica tandem pode ser fundida ao N-terminal de um polipeptídeo de um domínio ou fragmento de um anticorpo (por exemplo, uma cadeia pesada ou uma cadeia leve de um anticorpo). Em algumas modalidades, estruturas multimérica Tn3 são criadas fundindo ou conjugando uma ou mais estruturas Tn3 para o N- terminal e/ou o C-terminal um polipeptídeo de um domínio ou fragmento de um anticorpo (por exemplo, uma cadeia pesada e/ou uma cadeia leve de um anticorpo). Em algumas modalidades, algumas ou todas as estruturas Tn3 fundidas a um domínio ou fragmento de um anticorpo são idênticas. Em algumas outras modalidades, algumas ou todas as estruturas Tn3 fundidas a um domínio ou fragmento de um anticorpo são diferentes.
[00195] Em algumas modalidades, as estruturas Tn3 tandem usadas para gerar uma estrutura tipo anticorpo multivalente Tn3 pode conter o mesmo número de módulos Tn3. Em outras modalidades, as estruturas Tn3 tandem usadas para gerar uma estrutura tipo anticorpo multivalente Tn3 pode conter um número diferente de módulos Tn3. Por exemplo, uma estrutura tetravalente Tn3 pode ser formada, por exemplo, fundindo a estrutura de formato linear tetravalente Tn3 a uma única posição, ou fundindo uma estrutura de monômero Tn3 em uma posição e uma estrutura de formato trimérico linear Tn3 a outra posição, ou fundindo duas estruturas de formato linear dimérica Tn3 a duas posições diferentes, ou fundindo 4 estruturas de monômero Tn3, cada uma a uma única posição.
[00196] Em uma modalidade específica, estruturas Tn3 multimérica da invenção compreendem quatro estruturas Tn3 multiméricas lineares fundidas a um domínio ou fragmento de um anticorpo em que cada estrutura Tn3 multimérica linear compreende duas estruturas de monômero Tn3 que são conectadas em tandem através de um ligador (figura 1). Em outras modalidades, estruturas Tn3 multiméricas da invenção compreendem pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete ou pelo menos oito estruturas Tn3 monoméricas ou multiméricas da invenção fundidas a um domínio ou fragmento de um anticorpo.
[00197] Em uma modalidade específica, uma estrutura Tn3 tetravalente pode ser gerada fundindo uma estrutura Tn3 ao N-terminal de cada uma das cadeias leves e cadeias pesadas de um domínio ou fragmento de um anticorpo (ver, por exemplo, A9 constructo na figura 2).
[00198] Uma estrutura Tn3 tipo anticorpo de formato multivalente pode ser gerada fundindo qualquer combinação de Tn3 a um domínio ou fragmento de um anticorpo ou anticorpo modificado. Exemplos de anticorpos modificados incluem anticorpos com domínios apagados, minibodies (ver, por exemplo, patente US 5.837.821), minibodies tetravalentes, anticorpos tetravalentes (ver, por exemplo, Coloma & Morrison, Nature Biotechnol. 15:159-163, 1997; Publicação PCT WO 95/09917), anticorpos termicamente estabilizados, anticorpos humanizados, etc.
[00199] Cada uma das estruturas Tn3 lineares da invenção usados para gerar uma estrutura Tn3 multivalente tipo anticorpo de acordo com a figura 1 pode conter os mesmos ligadores e distribuições de ligadores, ou ligadores diferentes e diferentes distribuições de ligadores. Estruturas multiméricas de Fusão Fc
[00200] Em algumas modalidades, uma estrutura Tn3 multimérica da invenção compreende uma pluralidade de estruturas Tn3 multimérica ou monoméricas conectadas a um domínio Fc. A fusão de uma estrutura Tn3 multimérica da invenção a um fragmento de anticorpo compreendendo um domínio Fc ainda melhora a avidez e/ou atividade de estrutura FnIII multimérica fornecendo um domínio de dimerização que facilita a formação de dímeros da estruturas Tn3 multimérica.
[00201] Em algumas modalidades, somente uma estrutura Tn3 multimérica é fundida a um domínio Fc. Em uma modalidade específica, estruturas Tn3 multiméricas da invenção compreendem duas estruturas multimérica Tn3 fundidas a um domínio Fc em que cada estrutura Tn3 multimérica compreende duas ou mais estruturas Tn3 que são conectadas através de um ou mais ligadores (figura 1). Em uma modalidade específica, as estruturas multimérica Tn3 se fundem ao domínio Fc são estruturas de formato linear.
[00202] Em uma modalidade específica, duas estruturas Tn3 de formato linear compreendendo dois domínios Tn3 em tandem são fundidas a um domínio Fc para gerar uma estrutura Tn3 multimérica com uma valência de 4 (ver, por exemplo, A7 constructo na figura 2). Em outra modalidade específica, duas estruturas de formato linear, cada uma das quais compreendendo quatro estruturas de monômero Tn3 são fundidos a um domínio Fc para gerar uma estrutura Tn3 multimérica com uma valência de 8 (ver, por exemplo, A8 constructo na figura 2).
[00203] Em algumas modalidades, as estruturas Tn3 fundidas ao domínio Fc compreende o mesmo número de módulos Tn3. Em algumas modalidades, as estruturas Tn3 fundidas ao domínio Fc compreendem um número de módulos Tn3. Em algumas modalidades, as estruturas Tn3 fundidas ao domínio Fc compreendem os mesmos ligadores. Em outras modalidades, as estruturas Tn3 fundidas ao domínio Fc compreendem diferentes ligadores.
[00204] Em algumas modalidades, diferentes estruturas Tn3 multiméricas da invenção podem ser dimerizadas pelo uso de mutações no domínio Fc que favorece a formação de heterodímeros. Sabe-se na técnica que variantes da região Fc (por exemplo, substituições de aminoácidos e/ou adições e/ou deleções) aumenta ou diminui a função efetora do anticorpo e pode alterar as propriedades farmacocinéticas (por exemplo meia-vida) do anticorpo. Assim, em certas modalidades, as estruturas Tn3 multiespecíficas da invenção compreendem domínios Fc que compreendem uma região Fc alterada em que uma ou mais alterações foram feitas na região Fc para alterar as propriedades funcionais e/ou farmacocinéticas da estrutura Tn3 multimérica.
[00205] Sabe-se também que a glicosilação da região Fc pode ser modificada para aumentar ou reduzir a função efetora e/ou atividade anti-inflamatória. Assim, em uma modalidade as regiões Fc das estruturas FnIII multimérica da invenção compreendem glicosilação alterada de resíduos de aminoácidos para alterar a citotoxicidade e/ou propriedades anti-inflamatórias da estruturas multiméricas. Topologias de estruturas Multiméricas
[00206] Um especialista na técnica apreciará que as estruturas multiméricas discutidas acima, na figura 1 e figura 2, e através da especificação são justamente exemplos ilustrativos. As topologias do constructo ou formatos mostrados na figura 1 e figura 2 ilustram que em algumas modalidades as estruturas da invenção são fundidas a N- terminais dos polipeptídeos constituintes de domínios Fc e anticorpos. As estruturas da invenção podem ser fundidas ao C-terminal dos domínios Fc, cadeias leves de anticorpo, e cadeias pesadas de anticorpo em qualquer arranjo espacial apropriado. Por exemplo, em algumas modalidades uma estrutura tetravalente podem ser criadas fundindo uma estrutura de monômero FnIII ao N-terminal de cada cadeia pesada e uma estrutura de monômero FnIII ao domínio C- terminal de cada cadeia leve de um anticorpo, fundindo uma estrutura de monômero FnIII ao N-terminal de cada cadeia leve e uma estrutura FnIII monomérica ao C-terminal de cada cadeia pesada de um anticorpo, ou fundindo uma estrutura FnIII monomérica ao N-terminal de cada cadeia pesada e uma estrutura FnIII monomérica ao N-terminal de cada cadeia leve de um anticorpo. Estruturas FnIII monoméricas e/ou multiméricas podem ser fundidos a cadeia pesada completa e/ou cadeias leves compreendendo ambas regiões variáveis e regiões constantes. Alternativamente, as estruturas de monômero FnIII e/ou multímero podem ser fundidos a cadeias truncadas pesada e/ou leve compreendendo somente regiões constantes (por exemplo, como no constructo A9 mostrado na figura 2).
[00207] Estruturas multimérica Tn3 podem ser criados usando os formatos mostrados na figura 1 como blocos de construção. Por exemplo, os formatos tipo anticorpo e formatos de fusão Fc são combinações compreendendo módulos Tn3 de formato linear mais simples. Assim, em algumas modalidades estruturas mais complexas Tn3 de formatos multiméricas podem ser criadas combinando os blocos de construção mostrados figura 1.
[00208] As figuras 1 e 2 ainda ilustram que em algumas modalidades as estruturas multimérica Tn3 podem ser lineares ou ramificadas e apresentam níveis diferentes de ramificação. Por exemplo, o formato Fc fornece um exemplo de primeira ordem de formato ramificado, enquanto que o formato tipo anticorpo fornece um exemplo de um formato ramificado de segunda ordem. Constructos ramificados de maior ordem podem ser obtidos substituindo os blocos de construção de formato linear no formato tipo anticorpo ou o formato de fusão Fc com Blocos de construção de formato de fusão Fc ou blocos de construção tipo anticorpo, e conecta os mesmos a C-terminais ou N-terminais dos polipeptídeos constituintes de Fc ou anticorpo.
[00209] As figuras 1 e 2, e TABELA 1 ilustram o fato que em algumas modalidades os ligadores em uma estrutura Tn3 multimérica podem ser estruturalmente e funcionalmente diversos e podem fornecer uma pluralidade de pontos de ligação. Por exemplo, todos os módulos Tn3 em constructos A4 e A5 são conectados por ligadores (Gly4Ser)3Ala, exceto para os 4° e 5° módulos Tn3, que são conectados por um ligador (Gly4Ser)2GlyThrGlySerAlaMetAlaSer (Gly4Ser)1Ala. Por exemplo, no constructo A7, os primeiro e segundo domínios Tn3 e o terceiro e quarto domínio Tn3 são conectados por ligadores (Gly4Ser)3Ala, enquanto que o segundo e terceiro domínios Tn3 são conectados por um domínio Fc como um ligador de fração funcional.
[00210] A fusão Fc mostrada na figura 1 exemplifica que em algumas modalidades estruturas Tn3 multimérica ou monoméricas podem ser fundidas aos N-terminais dos polipeptídeos do ligador de fração funcional. Em algumas modalidades, estruturas Tn3 multiméricas ou monoméricas da invenção podem ser prontamente fundidas ao C- terminal do domínio Fc em um constructo de formato de fusão Fc.
[00211] De modo semelhante, o anticorpo ou anticorpo modificado em um constructo de formato tipo anticorpo é ainda um ligador de fração funcional. Neste caso, ao invés de dois pontos de ligação como em um ligador (Gly4Ser)3Ala ou em um ligador (Gly4Ser)2GlyThrGlySerAlaMetAlaSer (Gly4Ser)1Ala, ou quatro possíveis pontos de ligação como do caso de domínio Fc, o anticorpo mostrado no exemplo tipo anticorpo de figura 1 fornece 6 possíveis pontos de conexão. O formato tipo anticorpo mostrado na figura 1 exemplifica que em algumas modalidades somente os pontos de conexão N-terminal no ligador fração funcional são ocupados pelas estruturas Tn3. Em um constructo de formato tipo anticorpo algumas ou todas as estruturas Tn3 da invenção podem prontamente ser fundidas aos C-terminais das cadeias pesadas e as cadeias leves de um anticorpo ou domínio de anticorpo modificado. Outras estequiometrias de fusão podem ser aplicadas, ou seja, uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, ou mais estruturas Tn3 da invenção podem ser fundidas a um anticorpo ou anticorpo modificado.
[00212] As figuras 1 e 2 ainda ilustram que em algumas modalidades estruturas Tn3 multiméricas podem ser geradas combinando outras estruturas Tn3 multiméricas. Por exemplo, as estruturas de formato Fc A6, A7, e A8 da figura 2 são estruturas Tn3 homodiméricas em que a estrutura Tn3 multimérica é formada por duas cadeias de polipeptídeo, cada uma compreendendo uma estrutura Tn3 de formato linear fundido a um domínio Fc, que por sua vez são conectados através de ligações dissulfeto intermoleculares. A estrutura tipo anticorpo das figuras 1 e 2 exemplificam uma estrutura Tn3 heterotetramérica em que 4 polipeptídeos correspondendo a dois diferentes tipos de estruturas (2 estruturas Tn3 formadas fundindo uma estrutura de monômero Tn3 a uma região constante de cadeia leve IgG, e 2 estruturas Tn3 formadas fundindo uma estrutura de monômero Tn3 a uma região Fc em dobradiça de CH1 de uma IgG) são conectados através de ligações dissulfeto intermoleculares. Geração de estruturas da invenção
[00213] As estruturas Tn3 descritas aqui podem ser usadas em qualquer técnica para gerar novas ou melhoradas proteínas de ligação alvo. Em um exemplo particular, o alvo é imobilizado em um suporte sólido, como uma resina em coluna ou poço de placa de microtitulação, e o alvo contatado com uma biblioteca de proteínas de a base da estrutura candidata. Dita biblioteca pode consistir de clones construídos a partir de uma estrutura Tn3, através de randomização da sequência e/ou o comprimento de alças tipo CDR.
[00214] Com relação a isto, um display de bacteriófago (fago) é uma técnica bem conhecida que permite que sejam triadas grandes bibliotecas de oligopeptídeo para identificar membros daquelas bibliotecas que são capazes de especificamente se ligar a um alvo. O display de fago é uma técnica pela qual polipeptídeos variantes são apresentados como proteínas de fusão à proteína revestimento na superfície de partículas de bacteriófago (Scott, J. K. and Smith, G. P. (1990) Science 249: 386). Uma abordagem de bioinformática pode ser empregada para determinar o comprimento da alça e diversidade de preferências de domínios FnIII de ocorrência natural. Usando esta análise, as preferências para comprimento de alça e diversidade de sequência podem ser empregadas para desenvolver uma abordagem de "randomização restrita". Nesta randomização restrita, o comprimento de alça relativo e preferências de sequências são incorporados no desenvolvimento de uma estratégia de biblioteca. Integrando o comprimento da alça e diversidade de análise de sequência nos resultados de desenvolvimento de biblioteca resultam em uma randomização restrita (ou seja certas posições dentro da alça randomizada são limitadas em cujo aminoácido reside naquela posição).
[00215] A invenção ainda fornece bibliotecas recombinantes compreendendo diversas populações de estruturas Tn3 de ocorrência não natural. Em uma modalidade, as bibliotecas compreendem estruturas Tn3 de ocorrência não natural compreendendo, uma pluralidade de domínios de fita beta ligadas a uma pluralidade de regiões de alça, em que uma ou mais de ditas alças variam por deleção, substituição ou adição ou em pelo menos um aminoácido. Em uma modalidade específica, as bibliotecas compreendem estruturas Tn3 derivadas de estrutura Tn3 tipo selvagem.
[00216] Como detalhado acima, as alças conectando as várias fitas beta das estruturas podem ser randomizadas para comprimento e/ou diversidade de sequência. Em uma modalidade, as bibliotecas da invenção compreendem estruturas Tn3 contendo pelo menos uma alça que é randomizada para comprimento e/ou diversidade de sequência. Em uma modalidade, pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou pelo menos seis alças das estruturas Tn3 são randomizadas para comprimento e/ou diversidade de sequência. Em uma modalidade, pelo menos uma alça é mantida constante enquanto pelo menos uma alça adicional é randomizada para comprimento e/ou diversidade de sequência. Em outra modalidade, pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três alças AB, CD, e EF são mantidas constantes enquanto pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três alças BC, DE, e FG são randomizadas para comprimento ou diversidade de sequência. Em outra modalidade, pelo menos uma, pelo menos duas, ou pelo menos todas as três alças AB, CD, e EF são randomizadas enquanto pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três alças BC, DE, e FG são randomizadas para comprimento e/ou diversidade de sequência.
[00217] Foi demonstrado que alças FG que são pelo menos um aminoácido mais curto do que encontrado em uma alça FG de um FOI mostrou estabilidade aumentada. Assim, a presente invenção fornece bibliotecas compreendendo estruturas Tn3, em que pelo menos uma alça é randomizada para comprimento e/ou diversidade de sequência, exceto que o comprimento das alças FG são mantidos para ser pelo menos um aminoácido mais curto do que o cognato de alça FG do terceiro domínio FnIII de tenascina C humana compreende 10 resíduos de aminoácidos. Em algumas modalidades, as bibliotecas da invenção compreendem estruturas Tn3, em que cada estrutura compreende sete fitas beta designadas A, B, C, D, E, F, e G ligadas a seis regiões de alça, em que uma região de alça conecta cada fita beta é designada AB, BC, CD, DE, EF, e FG; e em que pelo menos uma alça é uma variante de ocorrência não natural de uma alça de estrutura Tn3 selvagem, e em que a alça FG é pelo menos um aminoácido mais curta do que a alça cognato na estrutura Tn3 tipo selvagem.
[00218] Em uma modalidade específica, as bibliotecas da invenção compreendem estruturas FnIII, em que a A fita beta compreende SEQ ID NO: 42, a fita beta B compreende SEQ ID NO: 43, a fita beta C compreende SEQ ID NO: 45, a fita beta D compreende SEQ ID NO: 46, a fita beta E compreende SEQ ID NO: 47, a fita beta F compreende SEQ ID NO: 49, e a fita G beta compreende SEQ ID NO: 52.
[00219] Em uma modalidade específica, as bibliotecas da invenção compreendem estruturas FnIII, em que a fita beta A consiste em SEQ ID NO: 42, a fita B beta consiste em SEQ ID NO: 43, a fita beta C consiste em SEQ ID NO: 45, a fita beta D consiste em SEQ ID NO: 46, a fita beta E consiste em SEQ ID NO: 47, a fita beta F consiste em SEQ ID NO: 49, e a fita beta G consiste em SEQ ID NO: 52.
[00220] Em uma modalidade específica, as bibliotecas da invenção compreendem estruturas FnIII, em que fita beta A consiste essencialmente de SEQ ID NO: 42, a fita beta B consiste essencialmente de SEQ ID NO: 43, a fita beta C consiste essencialmente de SEQ ID NO: 45, a fita beta D consiste essencialmente de SEQ ID NO: 46, a fita beta E consiste essen- cialmente de SEQ ID NO: 47, a fita beta F consiste essencialmente de SEQ ID NO: 49, e a fita beta G consiste essencialmente de SEQ ID NO: 52.
[00221] Como detalhado acima, um ou mais resíduos dentro de uma alça podem ser mantidos constantes enquanto outros resíduos são randomizados para comprimento e/ou diversidade de sequência. Opcionalmente ou alternativamente, um ou mais resíduos dentro de uma alça podem ser mantidos em um número predeterminado de diferentes aminoácidos enquanto outros resíduos são randomizados para comprimento e/ou diversidade de sequência. Assim, bibliotecas da invenção compreendem estruturas Tn3 que podem compreender uma ou mais alças contendo uma sequência consenso degenerada e/ou um ou mais resíduos invariantes de aminoácidos.
[00222] Em outra modalidade, as bibliotecas da invenção compreendem estruturas Tn3 contendo alças BC que são randomizadas com a seguinte sequência consenso: S-X-a-X-b-X-X-X- G, em que X representa qualquer aminoácido, em que (a) representa prolina ou alanina e em que (b) representa alanina ou glicina. Em outra modalidade, as bibliotecas da invenção compreendem estruturas Tn3 contendo alças BC que são randomizadas com a seguinte sequência consenso: S-P-c-X-X-X-X-X-X-T-G, em que X representa qualquer aminoácido e em que (c) representa prolina, serina ou glicina. Ainda em outra modalidade, as bibliotecas da invenção compreendem estruturas Tn3 contendo alças BC que são randomizadas com a seguinte sequência consenso: A-d-P-X-X-X-e-f-X-I-X-G, em que X representa qualquer aminoácido, em que (d) representa prolina, glutamato ou lisina, em que (e) representa asparagina ou glicina, e em que (f) representa serina ou glicina.
[00223] Em uma modalidade as bibliotecas da invenção compreendem estruturas Tn3 contendo alças DE que são randomizadas com a seguinte sequência consenso: X-X-X-X-X-X, em que X representa qualquer aminoácido.
[00224] Em uma modalidade, as bibliotecas da invenção compreendem estruturas Tn3 contendo alças FG que são randomizadas com a seguinte sequência consenso: X-a-X-X-G-X-X-X- b, em que X representa qualquer aminoácido, em que (a) representa asparagina, treonina ou lisina, e em que (b) representa serina ou alanina. Em outra modalidade, as bibliotecas da invenção compreendem estruturas FnIII contendo alças FG que são randomizadas com a seguinte sequência consenso: X-X-X-X-X-X-X-X- X (X9), em que X representa qualquer aminoácido.
[00225] Em uma modalidade específica, as bibliotecas da invenção compreendem estruturas, em que as estruturas compreendem a sequência de aminoácido: IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELX1YGI(XCD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)n YEVSLIC(XFG)nKETFTT, em que XAB, XBC, XCD, XDE, XEF, e XFG representam os resíduos de aminoácidos presentes nas alças AB, BC, CD, DE, EF, e FG, respectivamente, em que X1 representa resíduo de aminoácido A ou T, e que n = 2-26 e m = 1-9.
[00226] A invenção ainda fornece métodos para identificar uma estrutura Tn3 recombinante que se liga a um alvo, por exemplo, TRAIL R2, e tem estabilidade aumentada ou ação melhorada no alvo, por exemplo, TRAIL R2, comparado a uma estrutura Tn3 tipo selvagem triando as bibliotecas da invenção.
[00227] Em certas modalidades, o método para identificar uma estrutura Tn3 recombinante contendo estabilidade de proteína aumentada comparado a estrutura Tn3 tipo selvagem, e que especificamente se liga a um alvo, compreende: a. contatar o ligador alvo com uma biblioteca da invenção sob condições apropriados para formar um complexo:ligador alvo; b. obter a partir do complexo, a estrutura que se liga ao ligador alvo; c. determinar se a estabilidade da estrutura obtida na etapa (b) é maior do que aquela da estrutura Tn3 tipo selvagem.
[00228] O mesmo método pode ser usado para identificar estrutura Tn3 recombinante com afinidade de ligação melhorada, avidez, etc. ao alvo. Em uma modalidade, na etapa (a) uma biblioteca de estrutura da invenção é incubada com alvo imobilizado. Em uma modalidade, na etapa (b) o complexo estrutura:ligador alvo é lavado para remover ligadores não específicos, e os ligadores mais apertado são eluídos sob várias condições rígidas e submetidas a PCR para recuperar a informação de sequência. É especificamente contemplado que os ligadores e/ou informação de sequência obtida na etapa (b) pode ser usada para criar uma nova biblioteca usando os métodos revelados aqui ou conhecidos a um especialista na técnica, que pode ser usado para repetir o processo de seleção, com ou sem outra mutagênese da sequência. Em algumas modalidades, um número de rodadas de seleção pode ser realizado sob ligadores de suficiente afinidade para o antígeno obtido.
[00229] Outra modalidade da invenção é uma coleção de moléculas de ácidos nucleicos isoladas que codificam uma biblioteca compreendendo as estruturas da invenção e como descrito acima.
[00230] As estruturas da invenção podem ser submetidas a maturação de afinidade. Neste processo aceito na técnica, uma proteína de ligação específica é sujeita a um esquema que seleciona para afinidade aumentada por um alvo específico(ver Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95(11):6037-42). As estruturas da invenção resultantes podem apresentar características de ligação pelo menos tão alto quanto às estruturas antes da maturação de afinidade.
[00231] A invenção ainda fornece métodos de identificação da sequência de aminoácido de uma estrutura de proteína capaz de se ligar a alvo de modo que forme um complexo estrutura:alvo. Em uma modalidade, o método compreende: a) contatar uma biblioteca da invenção com um alvo imobilizado ou separável; b) separar complexos estrutura:alvo a partir de estruturas livres; c) causar a replicação de estruturas separadas de (b) de modo a resultar em nova biblioteca de display de polipeptídeo distinguidos de modo que em (a) contendo uma diversidade reduzida e sendo enriquecido em estruturas apresentadas capazes de se ligar ao alvo; d) opcionalmente repetir as etapas (a), e (b) com a nova biblioteca de (c); e e) determinar a sequência de ácido nucleico da região que codifica a estrutura apresentada de uma espécie de (d) e, assim, deduzir a sequência de peptídeo capaz de se ligar ao alvo.
[00232] Em outra modalidade, as estruturas da invenção podem ainda ser randomizadas após identificação de uma triagem de biblioteca. Em uma modalidade, métodos da invenção compreendem ainda randomizar pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou pelo menos seis alças de uma estrutura identificada a partir de uma biblioteca usando um método descrito aqui. Em outra modalidade, a outra estrutura randomizada é sujeita a um método subsequente de identificação de uma estrutura capaz de ligar a um alvo. Este método compreende (a) contatar dita estrutura randomizada com um alvo imobilizado ou separável, (b) separar os outros complexos randomizados de estrutura:alvo a partir de estruturas livres, (c) causar a replicação das estruturas separadas of (b), opcionalmente repetir as etapas (a)-(c), e (d) determinando a sequência de ácido nucleico da região que codifica dita estrutura randomizada e, portanto, deduzir a sequência de peptídeo capaz de se ligar ao alvo.
[00233] Em outra modalidade, as outras estruturas randomizadas compreendem pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, ou pelo menos seis alças randomizadas que foram anteriormente randomizadas na primeira biblioteca. Em outra modalidade alternada, as demais estruturas randomizadas compreendem pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, ou pelo menos seis alças randomizadas que não foram anteriormente randomizadas na primeira biblioteca.
[00234] A invenção ainda fornece um método para obter pelo menos duas estruturas Tn3 que se ligam a pelo menos um ou mais alvos. Este método permite a triagem de agentes que atuam de modo cooperativo para induzir uma resposta particular. Pode ser vantajoso usar dita triagem quando uma atividade agonista requer a cooperação de mais do que uma estrutura é requerida (por exemplo, entre outrs, agonismo de um receptor que pertence à família de receptores TNF). Este método permite a triagem de agentes cooperativos sem a reformatação da biblioteca para formar complexos multiméricos. Em uma modalidade, o método da invenção compreende contatar um ligador alvo com uma biblioteca da invenção sob condições que permite a formação do complexo estrutura:ligador alvo, engatando ditas estruturas com um agente de ligação cruzada (definido como um agente que traz junto, em íntima proximidade, pelo menos duas estruturas idênticas ou distintas) em que a ligação cruzada das estruturas induzem uma resposta detectável e obtendo a partir do complexo, ditas estruturas que se ligam ao alvo. Em outra modalidade, o agente de cruzamento de ligação é um anticorpo específico de estrutura, ou fragmento do mesmo, um tag de epitopo específico do anticorpo da um fragmento do mesmo, um domínio de dimerização, como região Fc, um motivo de rolo enovelado (por exemplo, entre outros, um zíper leucina), um ligador cruzado químico, ou outro domínio de dimerização conhecido na técnica.
[00235] A invenção ainda fornece métodos de detecção de um composto utilizando as estruturas da invenção. Baseado nas especificidades das estruturas obtidas por triagem de biblioteca, é possível usar ditas estruturas em ensaios para detectar o alvo específico em uma amostra, como para métodos de diagnóstico. Em uma modalidade, o método de detecção de um composto compreende contatar dito composto em uma amostra com uma estrutura da invenção, sob condições que permitem que um complexo composto: estrutura se forme e detecte dita estrutura, assim detectando dito composto em uma amostra. Em outras modalidades, a estrutura é rotulada (ou seja, radiomarcador, fluorescente, ligado a enzima ou marcador colorimétrico) para facilitar a detecção do composto.
[00236] A invenção ainda fornece métodos de captura de um composto utilizando as estruturas da invenção. Baseado nas especificidades de ligação das estruturas obtidas por triagem de biblioteca, é possível usar ditas estruturas em ensaios para capturar os alvos específicos em uma amostra, como para métodos de purificação. Em uma modalidade, o método de captura de um composto em uma amostra compreende contatar dito composto em uma amostra com uma estrutura da invenção sob condições que permitem a formação de um complexo composto:estrutura e remover dito complexo da amostra, assim capturando dito composto em dita amostra. Em outras modalidades, a estrutura é imobilizada para facilitar a remoção do complexo composto:estrutura.
[00237] Em algumas modalidades, as estruturas isoladas de bibliotecas da invenção compreendem pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, ou mais alças randomizadas. Em algumas modalidades, as sequências de alça da estrutura isolada podem ser trocados de uma estrutura doadora a qualquer alça em uma estrutura receptora (por exemplo, uma sequência de alça FG a partir de uma estrutura doadora pode ser transferida a qualquer alça em uma estrutura receptora). Em modalidades específicas, sequências de alça isoladas podem ser transferidas a alça cognata na estrutura receptora (por exemplo, uma sequência de alça FG de uma estrutura doadora pode ser transferida a uma estrutura receptora na posição da alça FG). Em algumas modalidades, sequências de alça isoladas podem ser "mistura e combinada" aleatoriamente com várias estruturas receptoras.
[00238] Em outras modalidades, sequências de estruturas isoladas podem ser identificadas pela sequência da alça. Por exemplo, uma biblioteca é usada para deslocar contra um alvo particular e uma coleção de ligadores específicos é isolada. As sequências de alça randomizadas podem ser caracterizadas como sequências específicas independentemente da estrutura de fundo (ou seja, a estrutura que se liga a alvo X em que dita estrutura compreende uma sequência de alça FG de SEQ ID NO:X). Em modalidades alternativas, onde uma estrutura apresenta duas sequências de alça que se ligam a alvo X, as sequências de alça podem ser caracterizadas como ligação ao alvo X na ausência da sequência da estrutura. Em outras palavras é contemplado que as estruturas isoladas de uma biblioteca que ligam a um alvo particular podem ser expressas como a sequências de alça variáveis que se ligam àquele alvo independente da estrutura de fundo. Este processo poderia ser análogo ao conceito de CDRs em regiões variáveis de anticorpos. Maturação de Afinidade
[00239] O desenvolvimento de estruturas Tn3 TRAIL R2 pode envolver uma ou mais etapas de maturação de afinidade in vitro ou in vivo. Qualquer abordagem de maturação de afinidade pode ser empregada que resulta em alterações de aminoácidos em um domínio Tn3 ou a alças de domínio Tn3 que melhoram a ligação de estrutura Tn3 ao antígeno desejado.
[00240] Estas alterações de aminoácidos podem, por exemplo, ser obtidos através de mutagênese aleatória, mutagênese "walk though", e mutagênese "look through". Dita mutagênese pode ser conseguida usando, por exemplo, PCR error-prone, cepas “mutadoras” de levedura ou bactéria, incorporação de mudanças de ácido nucleico aleatórias ou definidas durante síntese ab initio de todo ou parte de molécula de ligação baseado em FnIII. Os métodos para realizar maturação de afinidade e/ou mutagênese são descritos, por exemplo, em Patente US 7.195.880; 6.951.725; 7.078.197; 7.022.479; 5.922.545; 5.830.721; 5.605.793. 5.830.650; 6.194.550; 6.699.658; 7.063.943; 5.866.344 e Publicação PCT WO06023144.
[00241] Ditos métodos de maturação de afinidade podem ainda requerer que a rigidez do ensaio de triagem de ligação ao antígeno é aumentado para selecionar para estruturas Tn3 com afinidade melhorada para um antígeno. Métodos reconhecidos na técnica para aumentar a rigidez de um ensaio de interação de proteína-proteína podem ser usados aqui. Em uma modalidade, uma ou mais das condições do ensaio são variadas (por exemplo, a concentração de sal do tampão de ensaio) para reduzir a afinidade da estrutura Tn3 para o antígeno desejado. Em outra modalidade, a duração de tempo permitida para a estrutura Tn3 se ligar ao antígeno desejado é reduzida.
[00242] Em outra modalidade, uma etapa de ligação competitiva pode ser adicionada ao ensaio de interação proteína-proteína. Por exemplo, a estrutura Tn3 pode ser primeiro deixada se ligar a um antígeno imobilizado desejado. Uma concentração específica de antígeno não imobilizado é então adicionada que serve para competir para ligação com o antígeno imobilizado de modo que as estruturas Tn3 com a menor afinidade para o antígeno ser eluído a partir do antígeno imobilizado resultando em seleção de estruturas Tn3 com afinidade de ligação ao antígeno melhorado. A rigidez das condições do ensaio pode ainda ser aumentada aumentando a concentração de antígeno não imobilizado é adicionado ao ensaio.
[00243] Métodos de triagem podem ainda requerer várias rodadas de seleção para enriquecer para uma ou mais more estruturas Tn3 com ligação melhorada ao antígeno. Em uma modalidade, em cada rodada de seleção ainda mutações de aminoácidos são introduzidas na estrutura Tn3. Em outra modalidade, em cada rodada de seleção a rigidez de ligação ao antígeno desejado é aumentada para selecionar as estruturas Tn3 com afinidade aumentada para antígeno.
[00244] Em algumas modalidades, maturação de afinidade é realizada por mutagênese de saturação de porções de alças BC, DE, e FG de Tn3. Em algumas modalidades, mutagênese de saturação é realizada usando mutagênese de Kunkel. Em outras modalidades, mutagênese de saturação é realizada usando PCR.
[00245] Em algumas modalidades, pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, ou mais do que cinco rodadas de maturação de afinidade são aplicadas. Em algumas modalidades, mutagênese de saturação é aplicada a somente uma alça, enquanto que em algumas outras modalidades, somente uma alça ou uma porção de uma alça é mutada durante uma rodada de maturação de afinidade. Em algumas modalidades, mais do que uma alça ou porções de uma ou mais alças que são mutadas durante a mesma rodada de maturação de afinidade.
[00246] Em outras modalidades, as alças BC, DE, e FG mutadas simultaneamente durante a mesma rodada de maturação de afinidade.
[00247] No caso de estruturas Tn3 para montar nas estruturas multiméricas ligando a diferentes epitopos do mesmo alvo ou no caso de estruturas Tn3 biespecíficas, cada especificidade de ligação pode ser triada independentemente. Assim, em algumas modalidades, uma primeira triagem para identificar moléculas individuais de ligação a Tn3 que se ligam a um primeiro alvo, por exemplo, TRAIL R2, é realizada usando uma primeira biblioteca de estruturas Tn3, onde um ou mais aminoácidos em uma ou mais alças é alterado. Em algumas modalidades, triagens adicionais para identificar moléculas individuais Tn3 que se ligam a um alvo diferente ou a um diferente epitopo do mesmo alvo podem ser realizadas.
[00248] Em algumas modalidades, as alças são randomizadas usando uma biblioteca de display de fago. Em algumas modalidades, a ligação de uma estrutura Tn3 a um alvo desejado pode ser determinado usando métodos reconhecidos na técnica. Ainda, a sequência de aminoácidos das estruturas Tn3 identificadas nas triagens pode ser determinada usando métodos reconhecidos na técnica.
[00249] Em algumas modalidades, as estruturas da invenção monoméricas com afinidade maturada apresentam um aumento na afinidade para TRAIL R2 de pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 40 vezes, pelo menos 60 vezes, pelo menos 80 vezes, ou pelo menos 100 vezes ou mais comparado à mesma estrutura Tn3 antes da maturação da afinidade, como medido por ressonância de plasmon de superfície ou por outros ensaios conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, as estruturas da invenção monoméricas de afinidade maturada têm uma constante de dissociação (Kd) de menos do que 5 μM, menos do que 1 μM, menos do que 500 μM, menos do que 250 μM, menos do que 100 μM, ou menos do que 50 μM, como medido por ressonância de plásmon de superfície ou por outros ensaios conhecidos na técnica.
[00250] Estes métodos de maturação da afinidade podem ser aplicados para desenvolver estruturas Tn3 com propriedades de ligação melhoradas desejadas como afinidade melhorada ou outras características desejáveis, como propriedades farmacocinéticas favoráveis, potência alta, baixa imunogenicidade, reatividade cruzada aumentada ou reduzida com receptores TRAIL R2 a partir de outros organismos, etc. Geração de repetições tandem
[00251] A ligação de constructos tandem pode ser gerada por ligação de oligonucleotídeos em sítios de restrição usando enzimas de restrição conhecidas na técnica, incluindo, entre outras enzimas de restrição tipo II e tipo IIS.
[00252] As estruturas Tn3 multiméricas da invenção podem compreender um ligador em C-terminal e/ou the N-terminal e/ou entre domínios conforme descrito aqui. Ainda, estruturas da invenção compreendendo pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8 ou estruturas de polipeptídeo podem ser fundidas ou conjugadas a um domínio de dimerização, incluindo, entre outras a uma fração de anticorpo selecionada de: (i) um fragmento Fab, contendo domínios VL, CL, VH e CH1 ; (ii) um fragmento Fab’, que é um fragmento Fab contendo um ou mais resíduos de cisteína em C-terminal de domínios CH1; (iii) um fragmento Fd contendo domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fd’ contendo domínios VH e CH1 and um ou mais resíduos de cisteína em C-terminal do domínio CH1; (v) um fragmento Fv contendo os domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo; (vi) um fragmento dAb que consiste em um domínio VH; (vii) regiões isoladas CDR; (viii) Fragmentos F(ab')2, um fragmento bivalente incluindo dois fragmentos Fab' ligados por uma ponte dissulfeto na região em dobradiça; (ix) Moléculas de anticorpo de cadeia simples (por exemplo, cadeia simples Fv; scFv); (x) um "diabody" com dois sítios de ligação a antígeno, compreendendo um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo; (xi) um "anticorpo linear" compreendendo um par de segmentos tandem Fd (VH-CH1-VH-CH1) que, juntas com polipeptídeos de cadeia leve complementares, formam um parte de regiões de ligação a antígeno; (xii) um anticorpo de comprimento total; e (xiii) uma região Fc compreendendo CH2-CH3, que pode ainda compreender toda ou parte de uma região em dobradiça e/ou uma região CH1. Várias valências, afinidade, e esquemas de orientação espacial são exemplificados nos Exemplos. Produção de estrutura
[00253] A expressão recombinante de uma estrutura da invenção requer a construção de um vetor de expressão contendo um polinucleotídeo que codifica a estrutura. Uma vez que um polinucleotídeo que codifica uma estrutura obtida, o vetor para a produção de estrutura pode ser produzida por tecnologia de DNA recombinante usando técnicas bem conhecidas. Assim, métodos para a preparação de uma proteína por expressão de um polinucleotídeo contendo uma sequência de nucleotídeo que codifica a estrutura são descritos aqui. Os métodos que são bem conhecidos aos especialistas na técnica podem ser usados para vetores de expressão de constructo contendo sequências de polipeptídeo contendo a estrutura e sinais apropriados de controle de transcrição e tradução. Estes métodos incluem, por exemplo, técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas, e recombinação genética in vivo. A invenção, assim, fornece vetores de replicação compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica uma estrutura da invenção, operacionalmente ligada a um promotor.
[00254] O vetor de expressão é transferido a uma célula hospedeira por técnicas convencionais e as células transfectadas são então cultivadas por técnicas convencionais para produzir a estrutura da invenção. Assim, a invenção inclui células hospedeiras contendo um polinucleotídeo que codifica uma estrutura da invenção, operacionalmente ligada a um promotor heterólogo. Células hospedeiras apropriadas incluem, entre outras, micro-organismos como bactéria (por exemplo, E. coli e B. subtilis).
[00255] Uma variedade de sistemas de vetor de expressão- hospedeiro pode ser utilizada para expressar as estruturas da invenção. Ditos sistemas de expressão em hospedeiro representam veículos pelo qual as sequências de codificação de interesse podem ser produzidas e subsequentemente purificados, mas ainda representam células que podem, quando transformadas ou transfectadas com as sequências de codificação de nucleotídeo apropriadas, expressam uma estrutura da invenção in situ. Estes incluem, entre outros, micro-organismos como bactéria (por exemplo, E. coli e B. subtilis) transformados com DNA de bacteriófago recombinante, DNA de plasmídeo ou vetores de expressão de DNA cosmídeo contendo sequências de condição de estrutura ou sistemas de células mamíferas (por exemplo, células COS, CHO, BHK, 293, NSO, e 3T3).
[00256] Os métodos úteis para a produção de estruturas da invenção são revelados, por exemplo, na publicação No: WO 2009/058379. Uma vez que uma estrutura da invenção foi produzida por expressão recombinante, este pode ser purificado por qualquer método conhecido na técnica para purificação de uma proteína.
[00257] A produção de estruturas da invenção no laboratório de pesquisa pode ser escalonada para produzir estruturas em reatores de escala analítica ou reatores em escala de produção, como descrito na publicação de patente US 2010-0298541 A1. Produção escalonável de estruturas secretadas
[00258] As estruturas Tn3 da invenção podem ser produzidas intracelularmente ou como uma forma secretada. Em algumas modalidades, as estruturas secretadas são apropriadamente dobradas e totalmente funcionais. Estruturas Tn3 da invenção podem ser produzidas por um processo escalonável. Em algumas modalidades, estruturas podem ser produzidas por um processo escalonável da invenção no laboratório de pesquisa que pode ser escalonado para produzir as estruturas da invenção em biorreatores em escala analítica (por exemplo, entre outros, a biorreatores de 5L, 10L, 15L, 30L, ou 50L). Em outras modalidades, as estruturas Tn3 podem ser produzidas por um processo escalonável no laboratório de pesquisa que pode ser escalonável para produzir as estruturas Tn3 da invenção em biorreatores em escala de produção (por exemplo, entre outros de 75L, 100L, 150L, 300L, ou 500L). Em algumas modalidades, o processo escalonável da invenção resulta em pouca ou nenhuma redução na eficiência da produção como comparado ao processo de produção realizado no laboratório de pesquisa. Ligadores
[00259] As estruturas Tn3 em uma estrutura multimérica podem ser conectadas por ligadores de proteína e/ou não proteína, em que cada ligador é fundido a pelo menos duas estruturas Tn3 da invenção. Um ligador apropriado pode consistir de um ligador de proteína, um ligador não proteína, e combinações dos mesmos. As combinações de ligadores podem ser homoméricas ou heteroméricas. Em algumas modalidades, uma estrutura Tn3 multimérica da invenção compreende uma pluralidade de estruturas monoméricas Tn3 em que todos os ligadores são idênticos. Em outras modalidades, uma estrutura Tn3 multimérica compreende uma pluralidade de estruturas monoméricas Tn3 em que pelo menos um dos ligadores é funcionalmente ou estruturalmente diferente do resto dos ligadores. Em algumas modalidades, ligadores podem por si só contribuir para a atividade de uma estrutura FnIII multimérica participando direta ou indiretamente na ligação a um alvo.
[00260] Em algumas modalidades, o ligador de proteína é um polipeptídeo. O ligador polipeptídeo deve ter um comprimento, que é adequado para ligar duas ou mais estruturas monoméricas da invenção ou duas ou mais estruturas multiméricas da invenção de modo que assumam a correta conformação em relação a um outro de modo que retenha a atividade desejada.
[00261] Em uma modalidade, o ligador polipeptídeo compreende 1 a cerca de 1000 resíduos de aminoácidos, 1 a cerca de 50 resíduos de aminoácidos, 1-25 resíduos de aminoácidos, 1-20 resíduos de aminoácidos, 1-15 resíduos de aminoácidos, 1-10 resíduos de aminoácidos, 1- 5 resíduos de aminoácidos, 1-3 resíduos de aminoácidos. A invenção ainda fornece ácidos nucleicos, como DNA, RNA, ou combinações de ambos, codificando a sequência de ligador polipeptídeo. Os resíduos de aminoácidos selecionados para inclusão no ligador polipeptídeo deve apresentar propriedades que não interferem de modo significativo com a atividade ou função da estrutura Tn3 multimérica da invenção. Assim, um ligador polipeptídeo não deve no total apresentar uma carga que poderia ser inconsistente com a atividade ou função da estrutura multimérica da invenção, ou interferir com dobra interna, ou forma ligações ou outras interações com resíduos de aminoácidos em um ou mais domínios Tn3 que poderia seriamente impedir a ligação da estrutura multimérica da invenção a TRAIL R2.
[00262] O uso de ligadores peptídeo de ocorrência natural bem como artificiais para ligar polipeptídeos em novos polipeptídeos de fusão ligados é bem conhecido na literatura. Assim, os ligadores fundindo duas ou mais estruturas da invenção são ligadores naturais, ligadores artificiais, ou combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de todos os ligadores peptídeo presentes em uma estrutura multimérica da invenção é idêntica. Em outras modalidades, a sequência de aminoácidos de pelo menos dois dos ligadores peptídeos presentes em uma estrutura multimérica da invenção são diferentes.
[00263] Em algumas modalidades, um ligador polipeptídeo possui flexibilidade conformacional. Em uma modalidade específica, uma sequência de ligador polipeptídeo compreende a (G-G-G-G-S)x sequência de aminoácido onde x é um inteiro positivo. Em algumas modalidades, um ligador polipeptídeo é um polipeptídeo natural ou artificial inerentemente não estrutural (ver, por exemplo, Schellenberger et al., Nature Biotechnol. 27:1186-1190, 2009; ver também, Sickmeier et al., Nucleic Acids Res. 35:D786-93, 2007).
[00264] O ligador de peptídeo pode ser modificado de modo que um resíduo de aminoácido compreendendo um grupo de ligação para uma fração não polipeptídeo é introduzido. Exemplos de ditos resíduos de aminoácidos podem ser um resíduo de cisteina (à qual a fração não polipeptídeo é então subsequentemente unida) ou uma sequência de aminoácido pode incluir um sítio de N-glicosilação in vivo (assim unindo a fração de açúcar (in vivo) ao ligador de peptídeo).
[00265] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de todos os ligadores peptídeo presentes no polipeptídeo multímero é idêntica. Alternativamente, a sequência de aminoácidos de todos os ligadores peptídeo presentes no polipeptídeo multímero pode ser diferente. Marcação ou conjugação de estruturas
[00266] As estruturas da invenção podem ser usadas na forma não conjugada ou conjugada a pelo menos uma de uma variedade de frações heterólogas para facilitar a detecção alvo ou para imagear ou terapia. As estruturas podem ser marcadas ou conjugadas antes ou após a purificação, quando a purificação é realizada.
[00267] Muitas frações heterólogas são desprovidas de grupos funcionais apropriadas ao qual estruturas da invenção podem ser ligadas. Assim, em algumas modalidades, a molécula efetora é ligada a uma estrutura através de um ligador, em que o ligador contém grupos reativos para conjugação. Em algumas modalidades, a fração heteróloga conjugada a uma estrutura da invenção pode funcionar como um ligador. Em outras modalidades, a fração é conjugada a uma estrutura através de um ligador que pode ser clivável ou não clivável. Em uma modalidade, a molécula de ligação clivável é uma molécula de ligação clivável redox, de modo que a molécula de ligação é clivável em ambientes com um menor potencial redox, como o citoplasma e outras regiões com maiores concentrações de moléculas com grupos sulfidrila livres. Exemplos de moléculas de ligação que podem ser clivados devido a uma alteração no potencial redox incluem aquelas contendo dissulfetos.
[00268] Em algumas modalidades, estruturas da invenção são projetadas para fornecer grupos reativos para conjugação. Em ditas estruturas, o N-terminal e/ou C-terminal pode ainda servir para fornecer grupos reativos para conjugação. Em outras modalidades, o N-terminal pode ser conjugado a uma fração (como, entre outros, PEG) enquanto o C-terminal é conjugado a outra fração (como, entre outros, a biotina), ou vice versa.
[00269] O termo "polietileno glicol" ou "PEG" significa um composto polietileno glicol ou um derivado do mesmo, com ou sem agentes de acoplamento, frações de acoplamento de ativação (por exemplo, com tiol, triflato, tresilato, aziridina, oxirano, N-hidroxissuccinimida ou uma fração maleimida). O termo "PEG" pretende indicar polietileno glicol de um peso molecular entre 500 e 150.000 Da, incluindo análogos dos mesmos, em que por exemplo o grupo OH terminal foi substituído por um grupo metoxi (referenciado como mPEG).
[00270] As estruturas da invenção podem ser derivatizados com polietileno glicol (PEG). PEG é um polímero linear, solúvel em água de unidades repetidas de óxido de etileno com dois grupos hidroxi terminais. PEGs são classificados por seus pesos moleculares que tipicamente variam de cerca de 500 daltons a cerca de 40.000 daltons. Em uma modalidade específica, as PEGs empregadas têm pesos moleculares variando de 5.000 daltons a cerca de 20.000 daltons. PEGs acoplados às estruturas da invenção podem ser ramificados ou não ramificados. Ver, por exemplo, Monfardini, C. et al. 1995 Bioconjugate Chem 6:62-69. PEGs são comercialmente disponíveis de Nektar Inc., Sigma Chemical Co. e outras empresas. Ditos PEGs incluem, entre outros, monometoxipolietileno glicol (MePEG-OH), monometoxipolieti- leno glicol-succinato (MePEG-S), monometoxipolietileno glicol- succinimidil succinato (MePEG-S- NHS), monometoxipolietileno glicol- amina (MePEG-NH2), monometoxipolietileno glicol-tersilato (MePEG- TRES), e monometoxipolietileno glicol-imidazolil-carbonil (MePEG-IM).
[00271] Resumidamente, o polímero hidrofílico é empregado, por exemplo, PEG, é coberto em uma extremidade por um grupo não reativo como um grupo metoxi ou etoxi. Depois, o polímero é ativado na outra extremidade por reação com um agente de ativação apropriado, como haletos cianúricos (por exemplo, cloreto, brometo ou fluoreto cianúrico), carbonildiimidazol, um reagente anidreto (por exemplo, um anidreto succínico dihalo, como anidreto dibromossuccínico), acil azida, p- diazôniobenzil éter, 3-(p-diazônio-fenóxi)-2-hidroxipropiléter) e semelhantes. O polímero ativo é então reagido com um polipeptídeo conforme descrito aqui para produzir um polipeptídeo derivatizado com um polímero. Alternativamente, um grupo funcional nas estruturas da invenção pode ser ativado para reação com o polímero ou os dois grupos podem ser unidos em uma reação de acoplamento combinada usando métodos de acoplamento. Será prontamente apreciado que os polipeptídeos da invenção podem ser derivatizados com PEG usando uma miríade de outros esquemas de reação conhecidos e usados pelos especialistas na técnica. Um PEG pode ser acoplado a uma estrutura da invenção em um ou mais grupos funcionais em uma extremidade da estrutura ou dentro da estrutura. Em certas modalidades, PEG é acoplado a N-terminal ou C-terminal.
[00272] Em outras modalidades, estruturas da invenção, análogos ou derivados dos mesmos podem ser conjugados a um agente de diagnóstico ou detectável. Ditas estruturas podem ser úteis para monitorar ou prognosticar o desenvolvimento ou progressão de uma doença como parte de um procedimento de teste clínico, como determinando a eficácia de uma terapia particular.
[00273] A presente invenção ainda inclui o uso de estruturas conjugadas a uma fração terapêutica. Uma estrutura pode ser conjugada a uma fração terapêutica como uma citotoxina, por exemplo, um agente citostático ou citocida, um agente terapêutico ou íon de metal radioativo, por exemplo, emissores de alfa. Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que é detrimental às células. Estruturas de avaliação
[00274] A afinidade de ligação e outras propriedades de ligação de uma estrutura a um antígeno podem ser determinados por uma variedade de métodos de ensaio in vitro conhecidos na técnica incluindo por exemplo, métodos de equilíbrio (por exemplo, ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) ou cinética (por exemplo, análise BIACORE®), e outros métodos como ensaios de ligação indireta, ensaios de ligação competitiva, eletroforese em gel e cromatografia (por exemplo, filtração em gel). Estes e outros métodos podem utilizar um marcador em um ou mais dos componentes sendo avaliados e/ou empregam uma variedade de métodos de detecção incluindo, entre outras a marcadores cromogênicos, fluorescentes, luminescentes, ou isotópicos. Uma descrição detalhada de afinidades de ligação e cinética pode ser encontrada em Paul, W.E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999).
[00275] Em algumas modalidades, estruturas da invenção especificamente s e ligam a um alvo com cinética específica. Em algumas modalidades, estruturas da invenção podem ter uma constante de dissociação ou Kd (koff/kon) de menos do que 1x1Q-2M, 1x1Q-3M, 1x10—4M, 1X1Q-5M, 1x1Q-6M, 1x1Q-7M, 1x1Q-8M, 1x1Q-9M, 1x1Q-1QM, 1xio-11M, ixio-12M, 1X10-13M, 1xl0-14M ou menos do que 1xio-15M. Em modalidades específicas, estruturas da invenção têm um Kd de 500 μM, lOO μM, 500 nM, lOO nM, I nM, 500 pM, lOO pM ou menos como determinado por um ensaio BIAcore® ou por outros ensaios conhecidos na técnica. Em uma modalidade alternativa, a afinidade das estruturas da invenção é descrita em termos de constante de associação (Ka), que é calculada como a razão kon/koff, de pelo menos 1x102M-1, 1x103M-1, 1x104M-1, 1x105M-1, 1x106M-1, 1x107M-1, 1x108M-1, 1x109M-1, 1x1010M- 1 1x1011M-1 1x1012M-1, 1x1013M-1, 1x1014M-1, 1x1015M-1, ou pelo menos 5 X 1015 M-1. Em certas modalidades a taxa em que as estruturas da invenção dissociam de um epitopo alvo podem ser mais relevantes do que o valor de Kd ou Ka. Em algumas modalidades, as estruturas da invenção têm um a koff de menos do que 10-3 s-1, menos do que 5x10-3 s-1, menos do que 10-4 s-1, menos do que 5x10-4 s-1, menos do que 10-5 s-1, menos do que 5x10-5 s-1, menos do que 10-6 s-1, menos do que 5x10- 6 s-1, menos do que 10-7 s-1, menos do que 5x10-7 s-1, menos do que 108 s-1, menos do que 5x10-8 s-1, menos do que 10-9 s-1, menos do que 5x10-9 s-1, ou menos do que 10-10 s-1. Em certas outras modalidades, a taxa em que as estruturas da invenção se associam com um epitopo alvo pode ser mais relevante do que o valor de Kd ou Ka. Neste caso, as estruturas da invenção se ligam a um alvo com uma taxa de kon de pelo menos 105 M-1s-1, pelo menos 5x105 M-1s-1, pelo menos 106 M-1s-1, pelo menos 5 x 106 M-1s-1, pelo menos 107 M-1s-1, pelo menos 5 x 107 M-1s-1, ou pelo menos 108 M-1s-1, ou pelo menos 109 M-1s-1.
[00276] Estruturas da invenção podem ainda ser ligadas a suportes sólidos, que são particularmente úteis para imunoensaios ou purificação do antígeno alvo. Ditos suportes sólidos incluem, entre outros a, vidro, celulose, poliacrilamida, náilon, poliestireno, cloreto de polivinil ou polipropileno. Estruturas Tn3 específicas para TRAIL R2
[00277] A proteína TRAIL R2 é codificada por um membro do gene da superfamília de receptor TNF, e contém um domínio de morte intracelular. Em alguns casos, pode ainda ser conhecido como TNFRSFlOB; CD262, DR5, KILLER, KILLER/DR5, TRAILR2, TRICK2, TRICK2A, TRICK2B, TRICKB, ou ZTNFR9. Este receptor pode ser ativado por induz apoptose relacionado a fator de necrose tumoral (TNFSF 10/TRAIL/APO-2L), e traduz um sinal apoptótico. Ainda, apoptose induzida por TRAIL R2 envolve caspases e a molécula adaptadora intracelular FADD/MORT1 (Walczak et al. EMBOJ, (1997), 16, 5386- 97).
[00278] A invenção fornece estruturas Tn3 que especificamente se liga a TRAIL R2. Em modalidades específicas, estruturas da invenção especificamente se ligam a TRAIL R2 humano. Em outras modalidades específicas, Tn3 estruturas da invenção se ligam a homólogos TRAIL R2 a partir de camundongos, galinha, Rhesus, cynomolgus, rato, ou coelho. Em algumas modalidades, estruturas Tn3 da invenção se ligam a um epitopo exposto de TRAIL R2. Ditas modalidades incluem TRAIL R2 endogenamente expresso nas células e/ou células transfectadas para ectopicamente expressar o receptor.
[00279] Em outras modalidades, estruturas Tn3 da invenção reconhecem epitopos apresentados como TRAIL R2 monoméricos. Em outras modalidades, estruturas Tn3 da invenção reconhecem epitopos apresentados em uma forma homodimérica de TRAIL R2. Já em outras modalidades, estruturas Tn3 da invenção se ligam a TRAIL R2 monoméricas e facilitam a dimerização ou oligomerização de 2 ou mais moléculas TRAIL R2 (por exemplo, entre outras, estruturas multiméricas). Já outras modalidades, estruturas da invenção reduzem ou inibem a interação de TRAIL R2 com ligador TRAIL. Em outras modalidades, estruturas da invenção imitam a interação de ligador TRAIL com TRAIL R2. Em outras modalidades, estruturas Tn3 da invenção agonizam sinalização celular por TRAIL-R2.
[00280] A invenção ainda fornece métodos de modular atividade de R2 usando as estruturas Tn3 descritas aqui. Em algumas modalidades, métodos da invenção compreendem contatar uma célula que expressa TRAIL R2 com estruturas específicas de TRAIL R2 e interação de bloqueio com ligador TRAIL. Em outras modalidades, métodos da invenção compreendem contatar uma célula que expressa TRAIL R2 com uma estrutura Tn3 especifica de TRAIL R2 e imitando a interação de ligador TRAIL com TRAIL R2.
[00281] Em outras modalidades, os métodos da invenção compreendem agonizar TRAIL R2 contatando com uma estrutura Tn3 específica de TRAIL R2. Em outras modalidades, os métodos da invenção compreendem dimerização ou oligomerização de TRAIL R2 contatando um monômero de TRAIL R2 expresso em células com uma estrutura específica de TRAIL R2 e facilitando dimerização ou oligomerização. Ainda em outras modalidades, dimerização de TRAIL R2 pode ser conseguida através do uso de, por exemplo, entre outros, estruturas Tn3 multiméricas que: imitam dímeros TRAIL R2, estabilizam formação de dímero TRAIL, desestabilizam monômeros de TRAIL R2, ou somente reconhecem dímeros de TRAIL R2 apresentados nas células.
[00282] Em outras modalidades, dimerização ou oligomerização de TRAIL R2 pode ser conseguida através do uso de estruturas Tn3 mono- méricas acopladas com agentes de dimerização ou oligomerização da estrutura. Ditos agentes de dimerização ou oligomerização da estrutura podem incluir, por exemplo, entre outras, um anticorpo anti-estrutura, uso das estruturas com epitopo tags acoplados com anticorpos ao epitopo tag, ou a incorporação de vários motivos de dimerização ou oligomerização de proteínas descritos aqui e conhecidos na técnica. Em outra modalidade, dímeros ou oligômeros de TRAIL R2 podem ser induzidos pela administração de estruturas monoméricas seguido pela administração de um agente de dimerização ou oligomerização da estrutura.
[00283] Em algumas modalidades, os métodos da invenção compreendem a administração de uma estrutura específica de TRAIL R2 que reduz a viabilidade celular como medido por ensaios de rotina conhecidos na técnica. Em outras modalidades, a redução em viabilidade de célula é a ativação de apoptose como medido por ensaios conhecidos na técnica. Em outras modalidades, a redução em viabilidade celular é a inibição de divisão celular como medido por métodos aceitos na técnica. Em algumas modalidades, a viabilidade celular é reduzida em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou mais como comparado a viabilidade celular na ausência de tratamento.
[00284] Em algumas modalidades, estruturas Tn3 da invenção de ligação a TRAIL R2 agonizam TRAIL R2 com atividade semelhante à do ligador a TRAIL R2, conhecido como TRAIL. Em outras modalidades, estruturas Tn3 de ligação a TRAIL R2 da invenção são capazes de suficientemente ativar TRAIL R2 para resultar na ativação de uma ou mais vias de sinalização intracelular, incluindo a ativação de caspase 3, caspase 8, caspase 10, ou FADD. Em outras modalidades, estruturas Tn3 de ligação a TRAIL R2 da invenção ativam apoptose em pelo menos um tipo de célula de câncer. Em outras modalidades, estruturas Tn3 de ligação a TRAIL R2 da invenção demonstram uma ativação de apoptose melhorada em pelo menos um tipo de célula comparado a TRAIL.
[00285] Em outras modalidades, as estruturas Tn3 de ligação a TRAIL R2 da invenção podem se ligar ou competir com ligação para o mesmo epitopo em TRAIL R2 como TRAIL (ligador). Em ditas modalidades, as estruturas de ligação a TRAIL R2 são capazes de inibir a interação de TRAIL R2 com TRAIL em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou mais que pode ser determinado em um ensaio de competição in vitro usando um ligador TRAIL solúvel (como fragmento 114-281 de ligador TRAIL), estudos cristalográficos, ou outros estudos conhecidos in vivo ou in vitro. Métodos de uso de estruturas Tn3 específicas para TRAIL R2 na terapia
[00286] TRAIL R2 é conhecido por mediar a sinalização de apoptose. Embora vários tipos de células normais expressem TRAIL R2, a sinalização de apoptose através deste receptor parece ser principalmente restrito a células de tumor, que se tornam mais susceptíveis a apoptose mediada por receptor de morte no contexto de sua transformação por oncogenes como Myc ou Ras (Wang et al., Cancer Cell 5:501-12 (2004); Nesterov et al., Cancer Res. 64:3922-7 (2004)). TRAIL R2 é frequentemente expresso por linhagens de células de câncer humano como tumores primários.
[00287] Em algumas modalidades, estruturas da invenção específicas de TRAIL R2 são administradas a um sujeito em necessidade de tratamento (ou seja, um paciente com câncer). Em ditas modalidades, uma composição estéril livre de pirógeno compreendendo uma estrutura específica de TRAIL R2 é administrada a um sujeito em necessidade do mesmo. A eficiência de tratamento pode ser medida usando uma variedade de ensaios in vitro e in vivo bem conhecidos na técnica, como, entre outros, atividade apoptótica, usando ativação de caspases de ligação a Anexina V, bem como uma redução em carga ou volume de tumor.
[00288] Em outras modalidades, estruturas da invenção específicas de TRAIL R2 são úteis para o diagnóstico e detecção de câncer ou outras doenças associadas a TRAIL R2 . Em ditas modalidades, estruturas da invenção específicas a TRAIL R2 são ligadas por um agente de detecção, como, entre outros, um marcador radioisótopo, fluorescente ou quimioluminescente. Ditos ligadores ligados são úteis nos métodos que detectam ou diagnosticam câncer ou doenças associadas a TRAIL R2 em um sujeito, ou uma amostra tomada a partir daquele sujeito. Além disso, estruturas específicas de TRAIL R2 são úteis no diagnóstico e tratamento de outras condições patológicas associadas com TRAIL R2, como doenças relacionadas ao sistema imune em mamíferos, incluindo humano. Sequências de ligação especificas a TRAIL R2
[00289] Em algumas modalidades estruturas de monômero Tn3 específicas para TRAIL R2 da invenção compreendem pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, ou pelo menos seis sequências de alça que se ligam a TRAIL R2.
[00290] Em algumas modalidades, estruturas Tn3 específicas a TRAIL R2 compreendem pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, ou pelo menos seis sequências de alça de clones de estruturas de monômero de ligação a TRAIL R2 selecionadas de: 1C12 (SEQ ID NO: 132), G3 (SEQ ID NO: 133), 1E11 (SEQ ID NO: 134), C4 (SEQ ID NO: 135), C11 (SEQ ID NO: 136), F4 (SEQ ID NO: 137), e G6 (SEQ ID NO: 138).
[00291] Em algumas modalidades, estruturas de monômero Tn3 específicas a TRAIL R2 compreendem pelo menos uma sequência de alça selecionada das sequências de alça listas na tabela 4. Em outras modalidades, estruturas de monômero específicas a TRAIL R2 compreendem pelo menos uma sequência de alça BC selecionada de sequências de alça BC listadas na tabela 4. Em outras modalidades, estruturas de monômero específicas de TRAIL R2 compreendem pelo menos uma sequência de alça DE selecionada de sequências de alça DE listadas na tabela 4. Em outras modalidades, estruturas de monômero específicas de TRAIL R2 compreendem pelo menos uma sequência de alça FG selecionada de sequências de alça FG listadas na tabela 4.
[00292] Em algumas modalidades, estruturas Tn3 de monômero específicas a TRAIL R2 compreendem uma sequência de alça BC selecionada de sequências de alça BC listas na tabela 4; e uma sequência de alça DE selecionada de sequências de alça DE listadas na tabela 4. Em outras modalidades, estruturas de monômero específicas de TRAIL R2 compreendem uma sequência de alça BC selecionada de sequências de alça BC listas na tabela 4; e uma sequência de alça FG selecionada de sequências de alça FG listadas na tabela 4. Em outras modalidades, estruturas específicas de TRAIL R2 compreendem uma sequência de alça DE selecionada de sequências de alça DE listadas na tabela 4; e uma sequência de alça FG selecionada de sequências de alça FG listadas na tabela 4. Em algumas modalidades, uma estrutura de monômero Tn3 específica de TRAIL R2 compreende sequências de alça correspondendo a sequências de alça de um, dois ou três diferentes clones Tn3.
[00293] Em algumas modalidades, as estruturas Tn3 multiméricas específicas a TRAIL R2 são multímeros lineares, por exemplo, dímeros como estrutura 1E11 tandem 2 de SEQ ID NO: 139, tetrâmeros estrutura 1E11 tandem 4 de SEQ ID NO: 140 ou a estrutura G6 tandem 4 de SEQ ID NO: 143, hexâmeros como estrutura 1E11 tandem 6 de SEQ ID NO: 141, a estrutura G6 tandem 6 de SEQ ID NO: 144 ou F4mod12 tandem 6 de SEQ ID NO: 167, ou octâmeros como estrutura 1E11 tandem 8 de SEQ ID NO: 142, a estrutura G6 tandem 8 de SEQ ID NO: 145, ou a estrutura F4mod12 tandem 8 de SEQ ID NO: 166.
[00294] Em algumas modalidades, as estruturas Tn3 específicas a TRAIL R2 multiméricas são fusões Fc, por exemplo, a fusão 1C12 Fc de SEQ ID NO: 149, a fusão G3 Fc de SEQ ID NO: 150, a fusão 1E11 Fc de SEQ ID NO: 151, a fusão C4 Fc de SEQ ID NO: 152, ou a fusão G6 Fc de SEQ ID NO: 153.
[00295] Em algumas modalidades, as estruturas Tn3 específicas a TRAIL R2 multiméricas são fusões tipo anticorpo, por exemplo, a estrutura resultando de associação de estruturas de região constante de cadeia pesada de 1C12 IgG1 de SEQ ID NO: 154 com a estrutura de cadeia leve 1C12 kappa de SEQ ID NO: 155, a estrutura resultando de associação de estrutura de cadeia pesada de G3 IgG1 de SEQ ID NO: 156 com a estrutura de cadeia leve G3 kappa de SEQ ID NO: 157, a estrutura resultando de associação de estrutura de cadeia pesada de 1E11 IgG1 de SEQ ID NO: 158 com a estrutura de cadeia leve 1E11 kappa de SEQ ID NO: 159, a estrutura resultando de associação de estrutura de cadeia pesada de C4 IgG1 de SEQ ID NO: 160 com a estrutura de cadeia leve C4 kappa de SEQ ID NO: 161, ou a estrutura resultando de associação de estrutura de cadeia pesada de G6 IgG1 de SEQ ID NO: 162 com a estrutura de cadeia leve G6 kappa de SEQ ID NO: 163.
[00296] Em algumas modalidades, a estrutura multimérica Tn3 específica a TRAIL R2 combina um formato de fusão Fc com um formato linear, por exemplo, a fusão 1E11 tandem 2 Fc de SEQ ID NO: 164, ou a fusão 1E11 tandem 4 Fc de SEQ ID NO: 165.
[00297] Em certas modalidades, onde a sequência da estrutura multimérica Tn3 específica a TRAIL R2 contém um ligador e/ou a tag Histidina em C-terminal da sequência, este ligador C-terminal e/ou tag Histidina pode ser removido, a correspondente sequência de aminoácido assim contendo uma deleção de ligador C-terminal e sequências His tag.
[00298] Em algumas modalidades, estruturas Tn3 específicas a TRAIL R2 multiméricas são conjugadas a PEG. Em modalidades específicas, estruturas F4mod12 tandem 6 (SEQ ID NO: 167) ou F4mod12 tandem 8 (SEQ ID NO: 166) são conjugadas a PEG. Em outras modalidades, o PEG é conjugado a N-terminal ou C-terminal da molécula de estrutura multimérica. Composições farmacêuticas
[00299] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição, por exemplo, entre outras, uma composição farmacêutica, contendo uma ou uma combinação de estruturas ou estruturas multiméricas da presente invenção, formuladas juntas com um veículo farmaceuticamente aceitável. Ditas composições podem incluir uma ou uma combinação de, por exemplo, entre outras, duas ou mais diferentes estruturas da invenção. Por exemplo, uma composição farmacêutica invenção pode compreender uma combinação de estruturas que se ligam a diferentes epitopos em no antígeno alvo ou que têm atividades complementares. Em uma modalidade específica, uma composição farmacêutica compreende uma estrutura multimérica da invenção.
[00300] Composições farmacêuticas da invenção podem ainda ser administradas em terapia de combinação, como combinadas com outros agentes. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir a estrutura da presente invenção combinada com pelo menos uma outra terapia em que a terapia pode ser imunoterapia, quimioterapia, radioterapia, ou terapia com fármaco. Os compostos farmacêuticos da invenção podem incluir um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis. Dosagem farmacêutica e administração
[00301] Para preparar composições farmacêuticas ou estéreis incluindo uma estrutura Tn3 da invenção, uma estrutura é misturada com um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Selecionar um regime de administração para um terapêutico depende de vários fatores, incluindo taxa de turnover sérico ou tecidual, o nível de sintomas, a imunogenicidade da entidade, e a acessibilidade das células alvo na matriz biológica. Em certas modalidades, um regime de administração maximiza a quantidade de terapêutico liberada ao paciente consistente com o nível aceitável de efeitos colaterais. Os níveis de dosagem atuais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de modo que se obtenha uma quantidade de ingrediente ativo que é eficaz para obter a resposta terapêutica desejada para um paciente particular, composição e modo de administração, sem ser tóxico ao paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmaco- cinéticos incluindo a atividade de composições particulares da presente invenção empregada, ou o éster, sal ou amida do mesmo, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto particular sendo empregado, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares empregadas, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e histórico médico anterior do paciente sendo tratado, e fatores semelhantes conhecidos nas técnicas médicas.
[00302] Uma composição da presente invenção pode ainda ser administrada através de uma ou mais vias de administração usando uma ou mais de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Em certas modalidades, as estruturas Tn3 da invenção podem ser formuladas para garantir adequada distribuição in vivo. Métodos de uso das Estruturas
[00303] As estruturas Tn3 da presente invenção têm utilidades para diagnóstico e terapia in vitro e in vivo. Por exemplo, estas moléculas podem ser administradas às células em cultura, por exemplo in vitro ou ex vivo, ou em um sujeito, por exemplo, in vivo, para tratar, prevenir ou diagnosticar uma variedade de distúrbios.
[00304] Ainda, muitos receptores de superfície celular ativa ou desativam como uma consequência de ligação cruzada de subunidades. As estruturas Tn3 da invenção podem ser usadas para estimular ou inibir uma resposta em uma célula alvo por ligação cruzada de receptores de superfície celular como TRAIL R2. Em outra modalidade, as estruturas da invenção podem ser usadas para bloquear a interação de vários receptores de superfície celular com antígeno. Em outra modalidade, as estruturas Tn3 da invenção podem ser usadas para fortalecer a interação de vários receptores de superfície celular com antígeno. Em outra modalidade, pode ser possível realizar ligação cruzada de homo- ou heterodímeros de um receptor de superfície celular usando as estruturas Tn3 da invenção contendo domínios de ligação que compartilham especificidade para o mesmo antígeno, ou ligar dois diferentes antígeno. Em outra modalidade, as estruturas Tn3 da invenção poderiam ser usadas para liberar um ligador, ou análogo de ligador a um receptor de superfície celular específico.
[00305] A invenção ainda fornece métodos de marcar epitopos não facilmente conseguido com anticorpos tradicionais. Por exemplo, em uma modalidade, as estruturas Tn3 e da invenção podem ser usadas para primeiro marcar um antígeno adjacente e enquanto se ligam, outro domínio de ligação pode engatar ao antígeno críptico.
[00306] A invenção ainda fornece métodos de uso das estruturas Tn3 da invenção para juntar distintos tipos celulares. Em uma modalidade, as estruturas da invenção podem ser ligar a uma célula alvo com um domínio de ligação e recrutar outra célula através de outro domínio de ligação. Em outra modalidade, a primeira célula pode ser uma célula de câncer e a segunda célula é uma célula efetora imune como uma célula NK. Em outra modalidade, as estruturas Tn3 da invenção podem ser usadas para fortalecer a interação entre duas células distintas, como uma célula apresentadora de antígeno e uma célula T para possivelmente impulsionar a resposta imune.
[00307] A invenção ainda fornece métodos de uso das estruturas Tn3 para amenizar, tratar, ou prevenir câncer ou sintomas do mesmo. Em uma modalidade, a invenção fornece um método de uso das estruturas Tn3 da invenção depletam populações de células resistentes a TRAIL. Com relação a isto, estruturas Tn3 da invenção podem ser usadas para tratar alguns tipos de cânceres resistentes à terapia.
[00308] A invenção ainda fornece métodos de uso de estruturas Tn3 para depletar população celular. Em uma modalidade, os métodos da invenção são úteis na depleção dos seguintes tipos celulares: eosinófilos, basófilos, neutrófilos, célula T, célula B, mastócito, monócitos e células de tumor. A invenção ainda fornece métodos de uso de estruturas para inativar, inibir ou depletar citocinas. A invenção ainda fornece métodos de uso de estruturas Tn3 proteínas como reagentes de diagnóstico. Com relação a isto, em algumas modalidades a ligação das estruturas Tn3 da invenção a receptores TRAIL R2 podem ser usadas para diagnostica para detectar células que expressam TRAIL R2. Em outras modalidades, a capacidade das estruturas Tn3 da invenção em diferenciar entre populações de células resistentes a TRAIL,mas sensíveis a miméticos de TRAIL, e populações de células resistentes a TRAIL e ainda para miméticos de TRAIL (ver, por exemplo, Exemplo 19) pode ser usado para fins de diagnóstico. As estruturas Tn3 da invenção podem ser úteis nos kits ou reagentes onde antígenos diferentes precisam ser eficientemente capturados concomitantemente. É ainda contemplado que cânceres causados por aberrações em apoptose podem ainda ser tratados pelos métodos e composições da invenção.
[00309] Em outra modalidade, a invenção fornece métodos para prevenir, gerenciar, tratar ou amenizar câncer. Estrutura Tn3 multimérica específica a TRAIL R2 pode ser usada para tratar câncer, por exemplo, câncer pulmonar, linfoma não Hodgkin, câncer ovariano, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer pancreático, e mieloma múltiplo. O tratamento de câncer com Tn3 multimérica específica a TRAIL R2 ainda compreende uma terapia adicional, como imunoterapia, terapia biológica, quimioterapia, radioterapia, ou terapia com fármaco de pequenas moléculas.
[00310] Métodos para tratar câncer podem compreender a administração a um sujeito em necessidade do mesmo uma dose de uma quantidade profilaticamente ou terapeuticamente efetiva de uma ou mais estruturas Tn3 da invenção em combinação com cirurgia, isolado ou em combinação com a administração de uma quimioterapia padrão ou experimental, uma terapia hormonal, uma terapia biológica/imunoterapia e/ou uma radioterapia. De acordo com estas modalidades, as estruturas Tn3 da invenção utilizadas para prevenir, gerenciar, tratar ou amenizar câncer, doenças autoimunes, inflamatórias ou infecciosas ou um ou mais sintomas ou um ou mais sintomas dos mesmos podem ou não ser conjugados ou fundidos a uma fração (por exemplo, agente terapêutico ou fármaco). Equivalentes
[00311] Os especialistas na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar o uso de não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção descritas aqui. Ditos equivalentes pretendem estar incluídos pelas seguintes reivindicações
[00312] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes mencionados neste relatório descritivo são aqui incorporados na mesma extensão como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual estivesse especificamente e individualmente indicado como sendo incorporado aqui por referência. Este pedido reivindica o benefício de prioridade ao pedido provisório de patente US 61/323.708, depositado em 13 de abril de 2010, os conteúdos inteiros são incorporados aqui por referência. Além disso, Pedido PCT/US2008/012398, depositado em 10 de outubro de 2008 e publicado como pedido internacional WO 2009/058379 A2 é aqui incorporado por referência em sua totalidade para todos os fins. Tabela 1. Sequências e SEQ ID Nos de componentes moleculares para montar as estruturas representativas invenção:
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Exemplos
[00313] A invenção é agora descrita com referência aos seguintes exemplos. Estes exemplos são ilustrativos somente e a invenção não deve de forma alguma interpretada como limitada por estes exemplos, pelo contrário, deve ser interpretada para incluir toda e qualquer variação que se torne evidente como resultado dos ensinamentos fornecidos aqui. Exemplo 1 Desenho de vários formatos Tn3 multivalentes
[00314] Formatos multivalentes da estrutura Tn3 foram projetados. Os formatos multivalentes contêm um ou mais Tn3 módulos fundidos a si próprios, fundidos a outros motivos de proteínas que podem oligomerizar, são mostrados na figura 1. Em cada caso, a entidade molecular resultante contém pelo menos 2 módulos Tn3. Os ligadores de polipeptídeo se conectando aos módulos Tn3 a cada outro ou outros motivos de proteína podem ser estruturados ou desestruturados e com ou sem uma função. Estas classes exemplares de proteínas de estrutura Tn3 multivalente são especificamente fornecidas: (i) proteínas lineares (L) multivalentes contendo módulos Tn3 fundidos a cada outro através de um ligador polipeptídeo; (ii) proteínas multivalentes tipo anticorpo (Ig) contendo um ou mais módulos Tn3 linearmente fundidos às cadeias leve e pesada de um anticorpo ou fragmento de anticorpo e (iii) proteínas multivalentes contendo Fc contendo um ou mais módulos Tn3 linearmente fundidos a uma região Fc de anticorpo (figura 1). Exemplo 2 Expressão e purificação de proteínas contendo Tn3 específicas para TRAIL R2 multivalentes
[00315] Uma série de oito proteínas de estrutura contendo módulo Tn3 multivalente (também chamado de “proteínas Tn3” ou “estruturas Tn3”) com especificidade de ligação para TRAIL R2 humano foram preparadas. Exemplos foram preparados a partir de cada um de três formatos multivalentes descritos no Exemplo 1, e todas destas proteínas apresentaram 2 ou mais de Tn3 módulo A1 de ligação a TRAIL R2 (clone 1E11, G6 ou 1C12). Para várias proteínas Tn3 multivalentes específicas para TRAIL R2, uma proteína Tn3 de controle correspondente (clone D1, um domínio Tn3 específico para o anticorpo Synagis®) que não se liga a TRAIL R2 foi ainda gerada, isto diferindo somente na sequência e especificidade de ligação dos módulos Tn3 componentes. Tn3 clone D1 é uma proteína Tn3 em que as alças BC, DE, e FG de um clone 1E11 são substituídas com alças alternativas com sequências correspondendo a SEQ ID NO: 99, 38, e 107, respectivamente (ver tabela 4). Números de identidade de sequência de constructos de proteína Tn3 multivalente foram expressos são mostrados na tabela 2, e todos os possíveis constructos são representados esquematicamente na tabela 3 e figura 2. As sequências de alça para os clones são fornecidas na tabela 4. Tabela 2. Nomes, formatos, valências, e especificidades de proteínas contendo Tn3 expressa
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L = fusões lineares Tn3, Fc = fusões Fc-Tn3, Ig = fusões Tn3 tipo anticorpo Tabela 3. Representação esquemática de constructos de estrutura Tn3
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Tabela 4 Sequências de alça de clones Tn3 usados nestes estudos
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tClones compreendendo a fita beta C contendo a sequência CELAYGI (SEQ ID NO: 131), todos os outros clones compreendem a fita beta C contendo a sequência CELTYGI (SEQ ID NO: 45)
[00316] Preparação de constructos de expressão: As enzimas usadas de New England Biolabs (Ipswich, MA), kits de purificação de DNA foram da Qiagen (Germantown, MD), e iniciadores de DNA foram de IDT (Coralville, IA). Preparação e constructos de expressão que codificam 2 ou módulos Tn3 linearmente fundidos como a seguir. O DNA que codifica um módulo Tn3 específico a TRAIL R2 (por exemplo, 1E11; SEQ ID NO: 134; G6, SEQ ID NO: 138; etc.) foi amplificado por PCR com os iniciadores “Tn3 gly4ser1 módulo direto” (SEQ ID NO: 112) e “Tn3 gly4ser2 módulo reverso” (SEQ ID NO: 113) (Tabela 5).
[00317] Após limpeza do produto de PCR, o DNA amplificado foi dividido em dois, com metade digerida com BpmI, e a outra metade digerida com AcuI. As amostras digeridas foram purificadas usando um kit de limpeza e ligado com uma T4 DNA ligase para gerar um produto de DNA que codifica dois módulos Tn3 (A2). Este material foi purificado por eletroforese de gel agarose e novamente dividido em dois. A digestão com NcoI e KpnI seguida por ligação em NcoI/KpnI digeriu pSec-oppA(L25M) (descrito em WO 2009/058379 A2, Exemplo 18) gerou o constructo de expressão bacteriano para a proteína A2. A ligação de produto não digerido em vetor pCR 2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) gerou material genético para geração de maiores ordens de fusão. Para gerar um fragmento de DNA que codifica quatro módulos Tn3 (A3), o TOPO clonado A2 DNA foi amplificado em PCR com iniciadores “módulo amp direto” (SEQ ID NO: 114) e “módulo amp reverso” (SEQ ID NO: 115) (Tabela 5), purificado, e dividido em dois para digestão com AcuI ou BpmI. O resto do processo para produzir o constructo de expressão A3 foi o mesmo que o usado para produzir o constructo A2, em que o DNA que codifica A3 foi montado a partir de blocos de construção A2. Novamente, a clonagem corrente de montado A3 DNA em pCR 2.1-TOPO forneceu material genético para geração de maiores ordens de fusão.
[00318] Para a preparação de constructos de expressão bacterianos A4 e A5, um módulo adaptador foi introduzido na extremidade 3’ da sequência de codificação multi-Tn3 dentro do constructo de expressão A3. Para fazer isto, o vetor de expressão A3 foi primeiro digerido com KpnI e EcoRI, e o fragmento excisado foi substituído com um cassete duplex contendo os oligonucleotídeos “inserto BamHI in pSec direto” (SEQ ID NO: 116) e “inserto BamHI in pSec reverso” (SEQ ID NO: 117) (Tabela 5). Amplificação por PCR de sequências A2 e A3 a partir dos correspondentes constructos pCR 2.1 TOPO foi realizada com os iniciadores “módulo inserto BamHI direto” (SEQ ID NO: 118) e “módulo amp reverso” (SEQ ID NO: 115) (Tabela 5). Produtos amplificados foram digeridos duas vezes com BamHI/KpnI, e clonados em constructo de expressão A3 digerido de modo semelhante.
[00319] As proteínas A6-A9 foram expressas por transfecção transitória de células 293F, como descrito no Exemplo 16 de WO 2009/058379 A2. Resumidamente, os vetores de expressão foram gerados por amplificação de PCR do módulo Tn3 (ou módulos) a partir de constructos de expressão bacteriana, e clonando estes em vetores alojamentos que codificam a região Fc, a região constante de cadeia leve kappa e/ou a região constante de cadeia pesada CH1-dobradiça- CH2-CH3 para expressão de fusão Fc ou proteínas de anticorpo. Para a proteína A9, um módulo Tn3 substitui as regiões variáveis de anticorpo na cadeia pesada de IgG1 humana e cadeia leve kappa. Os iniciadores que adicionam sítios compatíveis NheI e KasI para gerar fusões Fc dos constructos tandem são mostrados na tabela 5. Tabela 5. Sequências de iniciador usadas na construção de proteínas Tn3 multivalentes
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[00320] Expressão e purificação de proteínas: Proteínas Tn3 monovalentes ou lineares foram expressas em BL21(DE3) E. coli (EMD/Novagen, Gibbstown, NJ) e as proteínas His-tagged foram purificadas a partir do meio de cultura usando resina Ni NTA Superflow (Qiagen). Surpreendentemente, apesar de grandes diferenças nos pesos moleculares, todos estes constructos expressaram em níveis médios a altos em E. coli e foram eficientemente secretados no meio (tabela 6 e figura 3).
[00321] Para expressão proteínas de fusão Fc e tipo anticorpo (A6- A9), as células 293F foram transitoriamente transfectadas com os constructos de expressão apropriados. A colheita do sobrenadante foi realizada nos dias 6 e 10 e a proteína foi purificada por cromatografia de afinidade à proteína A.
[00322] Todas as proteínas purificadas foram analisadas por SDS- PAGE em géis NuPage Novex 4-12% bis tris em tampão MES sem agente redutor, e foram visualizados usando Corante SimplyBlue Safe (Invitrogen, Carlsbad, CA). Cromatografia por exclusão de tamanho foi ainda usada para analisar proteínas purificadas e, onde necessário, material agregado foi removido em coluna Superdex 75 10/300GL ou Superdex 200 10/300GL (GE Healthcare, Piscataway, NJ), em um nível final abaixo de 10% de proteína total. Uma unidade Acrodisc com uma membrana Mustang E (Pall Corporation, Port Washington, NY) foi usada como indicado pelo fabricante para remover endotoxina de preparações de proteína bacterianamente expressas. Tabela 6. Rendimento após purificação de formatos de proteínas Tn3 multivalente representativas
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Exemplo 3
[00323] Afinidade de ligação a TRAIL R2 para proteínas Tn3 Mono e Polivalentes
[00324] Para medir o efeito de valência Tn3 em afinidade de ligação para uma série de proteínas Tn3 específicas para TRAIL R, um experimento de ELISA por competição foi realizado. Uma placa de 96 poços NUNC MaxiSorp (Thermo Fisher, Rochester, NY), foi revestida com A9(1C12) (SEQ ID NO: 154 + SEQ ID NO: 145) uma estrutura específica de TRAIl R2 em um formato tipo anticorpo, em PBS a 2 μg/ml durante a noite a 4oC. As placas foram bloqueadas com PBS 0,1% Tween 20 + 10 mg/ml BSA. As diluições de A1 (monômero 1E11), e formato linear A2 (1E11 bivalente) ou A3 (1E11 tetravalente) estruturas multiméricas foram incubadas na placa revestida com 0,75 nM de biotinilado TRAIL R2-Fc por duas horas em temperatura ambiente em PBS 0,1% Tween 20 + 1 mg/ml BSA, lavado. TRAIL R2 Fc biotinilado ligado foi detectado com estreptavidina HRP, TMB, e neutralizado com ácido. A absorbância foi lida em 450 nm. Os dados são mostrados na figura 4. As afinidades de ligação (IC50) são mostradas na tabela 7 e foram calculados como a concentração de proteína de competição requerida para reduzir a ligação máxima de TRAIL R2-Fc biotinilado em 50%.
[00325] Os valores de IC50 para A2 e A3 foram pelo menos 30 vezes menores do que àqueles do monômero A1 e estão no limite deste ensaio (ou seja, approx. igual à concentração de TRAIL R2-Fc biotinilado). A ligação de TRAIL R2-Fc biotinilado a Tn3 imobilizado específico para TRAIL R2 foi deslocado pelos constructos de ligação a TRAIL R2.
[00326] Em relação a proteínas monoméricas A1, as proteínas bi- e tetravalente A2 e A3 ligaram a TRAIL R2-Fc com 30-40 vezes maior afinidade, que é uma indicação que os vários módulos Tn3 retêm suas atividades de ligação e contribuem para maior afinidade através de efeito de avidez. A diferença real na afinidade entre proteínas Tn3 mono- e bi- ou tetravalentes pode ser maior do que 30-40 vezes dados os valores de IC50 para A2 e A3 foram aproximadamente iguais à concentração de TRAIL R2-Fc biotinilado usado no ensaio (0,75 nM). Tabela 7. Valores de IC50 para inibição de ligação de TRAIL R2-Fc a proteína Tn3 A9 de ligação a TRAIL R2 (1C12)
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Exemplo 4 Citometria de fluxo para confirmação de ligação à célula
[00327] A citometria de fluxo foi usada para confirmar a especificidade de ligação de uma proteína Tn3 específica a TRAIL R2 multivalente a TRAIL R2 endógenos expressos na superfície celular de células H2122. As células H2122 aderentes (uma linhagem de célula de adenocarcinoma de câncer pulmonar de célula não pequena) foram destacadas dos frascos de cultura de tecido usando Accutase (Innovative Cell Technologies, San Diego, CA). As células foram rinsadas com meio completo (meio RPMI 1640 complementado com 10% FBS) e ressuspenso em PBS/2% FBS em aproximadamente 2x106 células/mL. Proteína Tn3 A9(1E11) (SEQ ID NO: 158 + SEQ ID NO: 159), uma estrutura multimérica tetravalente de formato tipo anticorpo, ou a proteína Tn3 B9 de controle de formato combinado (clone D1), foram preparadas em concentrações de 40 nM em PBS/2% FBS.
[00328] As células foram plaqueadas em placas de fundo Ude 96 poços a 75 μl por poço, e as amostras de proteína foram adicionadas em 25 μl por poço (a uma concentração final de 10 nM). A placa foi incubada a 4oC por aproximadamente 1 hora, então lavada 3 vezes com PBS/2% FBS. Anticorpo secundário anti-IgG humana conjugada com Alexa Fluor 488 foi adicionado (100 μl/poço), e a placa foi incubada a 4oC por aproximadamente 30 minutos e lavada como descrito acima. As células foram ressuspensas em 100 μl de PBS/2% FBS, e análise de citometria de fluxo foi realizada usando um citômetro BD LSR II (BD Biosciences, San Jose, CA). Uma troca (aumento) nas células H2122 fluorescentemente marcadas quando incubadas com a proteína Tn3 especifica a TRAIL R2 em relação ao controle confirmou que a proteína Tn3 específica de TRAIL R2 poderia se ligar a TRAIL R2 celular (figura 5). Exemplo 5 Efeito de valência e formato em apoptose de células H2122 por proteínas Tn3 específicas de TRAIL R2
[00329] A morte celular por apoptose pode ser induzida em linhagens de células de câncer por ligação cruzada de TRAIL R2 de superfície celular. Este efeito pode ser determinado em ensaios de células que medem o número de células viáveis. Para este fim, linhagens de células de carcinoma pulmonar H2122 foram plaqueadas em placas de 96 poços em uma densidade de 10.000 células/poço em 75 μl de meio completo (meio RPMI 1640 complementado com 10% FBS). Após incubação durante a noite a 37oC, o meio foi complementado com 25 μl de meio adicional contendo uma diluição serial de proteínas Tn3 especificas para TRAIL R2 (clone 1E11) ou controle negativo (clone D1). Todos os tratamentos foram realizados em poços em duplicata. O ligador TRAIL comercialmente disponível (Chemicon/Millipore, Billerica, MA) foi usado como um controle positivo para morte celular induzida por receptor TRAIL. Após 72 h, o kit CellTiter-Glo da Promega (Madison, WI) foi usado de acordo com as instruções do fabricante para avaliar os níveis de ATP, que é uma medida do número de células viáveis na cultura. A luminescência do ensaio foi medida em um leitor de placa Envision (PerkinElmer, Waltham, MA). A inibição de viabilidade celular foi determinada dividindo os valores de luminescência para células tratadas pela luminescência média para células viáveis não tratadas. Os gráficos de dose-resposta de inibição vs. concentração do composto foram gerados, e a potência de morte de célula (EC50) foi determinada como a concentração de proteína requerida para inibir 50% da viabilidade celular.
[00330] Para testar o efeito de valência na atividade pró-apoptótica de proteínas multivalentes Tn3 específicas de TRAIL R2, as células H2122 foram tratadas com a proteína Tn3 monovalente A1 (clone 1E11), e a série de proteínas Tn3 A2-A5 linearmente fundidas (cada clone 1E11) que contêm 2, 4, 6 ou 8 módulos Tn3. Enquanto as proteínas Tn3 the mono- e bivalentes apresentaram nenhuma ou irrelevante atividade de morte, as proteínas contendo 4, 6 e 8 módulos Tn3 potencialmente inibiram a viabilidade de células H2122, com potência aumentada como uma função da valência (figura 6A; tabela 8). A proteína A3 (tetravalente) teve uma potência semelhante a TRAIL, o ligador natural TRAIL R2, enquanto as proteínas A4 (hexavalente) e A5 (octavalente) foram 1-2 logs mais potentes. É claro a partir deste ensaio que para certo formato molecular, a morte da célula melhora com maior valência, até um ponto onde o ensaio não pode mais ser discriminado. Tabela 8. Valores EC50 para morte de H2122 por Constructos Multivalentes
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[00331] Para demonstrar que a inibição de viabilidade celular é dependente de ligação a TRAIL R2, 100 pM de proteína A5 (clone G6) (ou seja, 167x EC50) foi incubado com células H2122 na presença de proteína solúvel TRAIL R2-Fc. A repressão dependente de dose de morte de célula por TRAIL R2-Fc solúvel é uma indicação de que a morte celular é dependente de ligação de proteína A5 à TRAIL R2 de superfície celular (figura 6B). Resultados semelhantes foram observados com proteína A5 compreendendo clone de alças 1E11 (dados não mostrados).
[00332] Além do número de módulos de ligação, a atividade de proteínas Tn3 multivalentes pode ainda ser afetada por formato molecular usado para apresentar as unidades de ligação individual. Para testar o efeito de formato molecular na atividade, as células H2122 foram tratadas com diferentes proteínas Tn3 específicas de TRAIL R2 apresentando o mesmo número de módulos de ligação a Tn3. A capacidade de proteínas tetravalentes A3, A7 e A9 (cada clone 1E11) em induzir a morte de células H2122 foi testada no ensaio de viabilidade celular, como foi o par de proteínas octavalentes Tn3 A5 e A8 (cada clone 1E11). Proteínas inativas mono- e bivalentes foram incluídas como controles negativos, e TRAIL como um controle positivo (figura 7; tabela 9 e tabela 10). Na figura 7A, para os três constructos testados com uma valência de quatro, é aparente que A3 (formato linear) e A7 (formato de fusão Fc) são semelhantes em suas atividades de morte celular e mais potentes em matar células H2122 do que A9 (formato de fusão tipo anticorpo). Isto claramente mostra que a orientação espacial de módulos Tn3 pode ter um efeito considerável na bioatividade, em que A3 é aproximadamente 150 vezes mais potente do que a proteína A9 em inibir a viabilidade de célula H2122 (tabela 9). A figura 7B mostra que ambos os formatos de proteínas Tn3 octavalentes de ligação a TRAIL R2, A5 (linear) e A8 (fusão a Fc), têm eficácia semelhante na inibição de viabilidade de células H2122. Os dados EC50 para estes constructos são mostrados na tabela 9. A capacidade de ajuste findo da afinidade, valência e orientação espacial proporciona grande flexibilidade em termos da capacidade de precisamente projetar um resultado terapêutico desejado. Tabela 9. Valores EC50 para morte de H2122 por Constructos Multivalentes com uma valência de quatro
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Tabela 10. Valores Multivalentes com u EC50 para morte de H2122 por Constructos a valência de oito
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Exemplo 6
[00333] Morte celular dependente de Dose nas linhagens de células Colo205 e Jurkat
[00334] Para demonstrar que proteínas multivalentes Tn3 específicas de TRAIL R2 poderiam matar linhagens de células de câncer de pele além de H2122, outras linhagens de células que expressam TRAIL R2 foram também testadas. A linhagem de célula de adenocarcinoma colorretal Colo205 (figura 8A) e linhagem de leucemia de célula T Jurkat (figura 8B) foram testadas para suas capacidades de serem mortas por proteínas A3 (tetravalente, formato linear) (SEQ ID NO: 143) e A5 (octavalente, formato linear) (SEQ ID NO: 145) (cada clone G6). Cada linhagem de célula foi incubada com A3, A5, o controle positivo TRAIL, ou uma proteína de controle negativo B5 (SEQ ID NO: 148) que não se liga a TRAIL R2, e o ensaio de viabilidade celular foi realizado como descrito para H2122. Em cada uma destas linhagens celulares, A5 mostra inibição extremamente potente de viabilidade celular. A proteína A3 de menor valência ainda induz morte celular, embora com menor potência do que A5. Assim, o constructo de maior valência mostra maior atividade. Como esperado, TRAIL poderia ainda inibir a viabilidade celular, mas não a proteína octavalente de controle negativo B5, que não se liga a TRAIL R2. Tabela 11. Valores EC50 para morte de Colo205 por Constructos lineares tandem
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Tabela 12. Valores de EC50 para morte de células Jurkat por constructos Lineares Tandem
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[00335] As células foram analisadas por ensaio CellTiter-Glo como no Exemplo 5. Exemplo 7
[00336] Desenho, expressão e atividade de estruturas tandem bivalentes especificas para CD40L de camundongo
[00337] Proteínas Tn3 específicas de CD40L murino bivalente (Tabela 13) foram preparadas fundindo um par de módulos Tn3 idênticos. M13 é uma proteína Tn3 que especificamente se liga a CD40L Murino. A sequência de M13 corresponde à sequência de Tn3 em que as sequências de alças BC, DE, e FG são substituídas com alças alternativas com sequências correspondendo a SEQ ID NOs: 100, 104, e 110, respectivamente (ver tabela 4). Os ligadores contendo 1 (Constructo C1(M13)), 3 (Constructo C2(M13)), 5 (Constructo C3(M13)), ou 7 (Constructo C4(M13)) cópias de unidade Gly4Ser (GS) foram usadas resultando em comprimentos de ligador total entre 13 e 43 aminoácidos (ver figura 9A e tabela 3). Tabela 13. Nomes, valências, e especificidades de proteínas contendo Tn3 expressa
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[00338] Resumidamente, os constructos de expressão foram gerados como a seguir: Fragmento A foi gerado por amplificação PCR de ligador CD40L Murino pSec-M13 clonado no vetor pSec-oppA(L25M) descrito no Exemplo 1 com um iniciador específico para o vetor pSec vector a montante de gene Tn3 e iniciador “1-3 GS ligador reverso” (SEQ ID NO: 123) (ver tabela 14 para sequências de iniciadores específicos de Tn3 usados). Fragmentos B1GS e B3GS foram gerados por amplificação PCR no mesmo molde com iniciadores “1 GS ligador” (SEQ ID NO: 121) ou “3 GS ligador” (SEQ ID NO: 122), respectivamente, e um iniciador específico para o vetor pSec a jusante do gene Tn3. Na purificação em gel dos fragmentos, Fragmento A e B1GS ou Fragmento A e B3GS foram misturados, e os constructos tandem foram gerados por sobreposição PCR em uma reação de PCR com os dois iniciadores específicos de vetor pSec. Os produtos foram digeridos com NcoI e KpnI e clonados de volta em um vetor pSec-oppA(L25M) como descrito no Exemplo 1, gerando os dois constructos: C1(M13) e C2(M13). Para gerar os constructos de ligador 5 e 7 GS, os insertos ligadores gerados por amplificação PCR dos oligonucleotídeos “5 GSLigante” (SEQ ID NO: 124) e “7 GSLigante” (SEQ ID NO: 125), respectivamente, com iniciadores “GS L Amp direto” (SEQ ID NO: 126) e “GS L Amp reverso” (SEQ ID NO: 127) foram digeridos com PstI e XmaI e clonados em um fragmento de vetor gerado por corte de pSecM13-1GS-M13 com PstI e XmaI gerando os constructos C3(M13) e C4(M13). Tabela 14. Sequências de Iniciadores usados na construção de constructos específicos de MuCD40L tandem bivalentes
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[00339] Constructos tandem mono e bivalentes compreendendo estruturas Tn3 idênticas foram recombinantemente expressos e purificados de E. coli como descrito no Exemplo 2. A figura 9B descreve uma análise SDS-PAGE de preparados da proteína purificada sob condições redutoras e não redutoras.
[00340] Para testar eficiência de ligação dos constructos bivalentes tandem M13-M13 e comparar os mesmos com a estrutura monovalente M13, suas inibições competitivas de CD40L Murino ligando a receptor de CD40 Murino imobilizado em um chip de biossensor foi testado.
[00341] Resumidamente, um fragmento de receptor CD40 Murino na forma de uma fusão quimérica com a região Fc de IgG1 foi imobilizado em um chip GLC (Bio-Rad) em uma densidade de cerca de 3000 unidades de resposta. Para ensaios de ligação competitivos, 3 vezes de diluições seriais de constructos monovalentes M13 ou M13 tandem bivalente com diferentes comprimentos de ligador foram incubados por 20 min com uma concentração fixa de E. coli produzi CD40L Murino recombinante (0,5μg/ml) em PBS contendo 0,1% (v/v) Tween-20 e 0,5 mg/mL BSA. Estas amostras foram então injetadas em chip GLC em uma vazão de 30μL/min por 300 segundos e o nível de CD40L ligado foi registrado em um ponto de tempo fixado dentro do sensorgrama e comparado ao nível correspondente de proteína ligada na ausência de qualquer competidor. Após cada medição de ligação, CD40L residual foi dessorvido da superfície do chip injetando 10 mM glicina-HCl (pH 2,0). Efeitos de ligação não específicos foram corrigidos por subtração de sensorgramas a partir de interspots do chip. Valores de IC50 correspondendo às concentrações de constructos Tn3 requeridos para deslocar 50% de CD40L Murino foram calculados usando GraphPad Prism.
[00342] Como mostrado na figura 9C, a concentração inibitória de metade da máxima (IC50) para o monômero M13 foi 71 nM enquanto o IC50 para o constructo bivalente tandem C1(M13) foi 29 nM. Valores IC50 semelhantes de 5 ou 6 nM foram obtidos para os constructos bivalentes contendo ligadores maiores (constructos C2(M13), C3(M13) e C4(M13), respectivamente). Devido à concentração de CD40L usado no ensaio, isto está em um limite inferior de IC50 que pode ser observado neste ensaio. Os constructos bivalentes tiveram um valor IC50 inferior comparado ao constructo monovalente, indicando atividade de ligação melhorada dos constructos bivalentes tandem comparados a um único módulo Tn3 M13. O comprimento do ligador nestes constructos bivalentes apresenta algum efeito na potência do ensaio, com o constructo de comprimento de ligador menor contendo potência intermediária, enquanto aqueles constructos com ligadores de 23 ou mais aminoácidos são equivalentes neste ensaio.
[00343] Para testar a atividade de constructos Tn3 bivalentes tandem em uma atividade baseada em célula e comparar à estrutura M13 monovalente, a inibição de expressão de CD86 induzida por CD40L Murinoem células B foi testada. Como um controle, o anticorpo específico anti-CD40L Murino comercialmente disponível (MR1) foi testado em paralelo.
[00344] O ensaio utiliza PBMC preparado a partir de sangue de voluntários saudáveis. Resumidamente, sangue recém-extraído foi coletado em tubo de preparação de célula BD Vacutainer® CPT™ com heparina. Após centrifugação, a camada de célula contendo PBMCs foi coletada e lavada duas vezes com PBS e uma vez com meio RPMI 1640. As células foram ressuspensas em meio completo RPMI 1640 (complementado com 10% de soro bovino fetal inativado,1% P/S) em uma concentração de 5 X 106 células/ml.
[00345] Linhagem de célula Th2 D10 expressando CD40L Murino.G4.1 foi lavado e ressuspenso em meio completo RPMI 160 em uma concentração de 1 X 106 células/ml.
[00346] M13, M13-M13 tandem bivalente constructos C1-C4, ou anticorpo MR1 (BioLegend Cat. No: 106508) foram serialmente diluídos (1:3) em meio completo RPMI 1640. Uma amostra de 50 μl de cada diluição foi adicionada aos poços em uma placa de cultura de tecido de fundo U de 96 poços. Cada placa então recebeu 50 μl de células D10.G4.1 (5x104), e após mistura, as placas foram incubadas a 37°C por 1hr. 100 μl de PBMC ressuspenso (5x105 células) foram então adicionados a cada poço e incubados a 37°C por 20-24 h.
[00347] PBMC foram coletados e corados com APC-anti-CD86 humano (BD bioscience, Cat# 555660) e FITC-anti-CD19 humano (BD bioscience, Cat# 555412) em tampão FACS (PBS pH 7.4, 1% BSA, 0.1% azida de sódio) a 4°C por 30 min no escuro. Após duas lavagens em tampão FACS, as amostras foram então analisadas por FACS LSRII (Becton Dickinson). A expressão de CD86 em células B CD19 gated foi avaliada. A análise de expressão de CD86 como uma função de proteína de teste foi realizada usando software GraphPad Prism.
[00348] Como mostrado na figura 9D, os constructos bivalentes M13M13 tandem todos inibiram a expressão de CD86 com um IC50 de 100 a 200 pM, comparável a IC50 de anticorpo MR1 (100 pM) e cerca de 3 logs mais potente do que a estrutura M13 monovalente por si só. Em contraste ao ensaio bioquímico, nenhum efeito de comprimento de ligador foi observado neste ensaio baseado em célula, e constructos bivalentes com ligadores variando de 13 a 43 aminoácidos em comprimento todos mostram capacidade equivalente para potência aumentada em relação à proteína monovalente. Exemplo 8 Expressão de estruturas Tandem Biespecíficas
[00349] Para gerar constructos Tn3 biespecíficos com especificidade para TRAIL R2 e CD40L Humano (HuCD40L), dois módulos Tn3, um com especificidade para TRAIL R2 (clone 1E11) e um com especificidade para CD40L humano (clone 79), foram fundidas junto com ligadores de comprimento variável separando os dois módulos (tabela 3 e tabela 15). A sequência de clone da proteína 79 (SEQ ID NO: 184) corresponde à sequência de um módulo Tn3 em que as alças BC, DE, e EF foram substituídas com alças alternativas correspondendo a SEQ ID NOs: 101, 105, e 111, respectivamente. Constructos de expressão para estruturas tandem biespecíficas contendo ligadores com 1 e 3 Gly4Ser (GS) repetições (constructos C6 e C8, respectivamente) foram gerados como descrito no Exemplo 7 exceto que plasmídeos conduzido as variantes Tn3 A1 e 79 foram usados inicialmente como moldes PCR. Constructo C5 (contendo um ligador curto derivado de sequência natural ligando o segundo e terceiro domínios FnIII em tenascina C humana, que pode ser considerado parte de fita beta A do terceiro domínio FnIII embora não requerido para ligação à estrutura) e constructo C7 foram gerados de modo semelhante a C6 e C8, usando os iniciadores adicionais listados na tabela 16, exceto que “0 GSligador reverso” foi usado no lugar d e“1-3 GSLigante reverso” para C5. Tabela 15. Nomes, valências, e especificidades de proteínas contendo Tn3 expressa
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Tabela 16. Sequências adicionais de Iniciadores usados na construção de constructos tandem biespecíficas
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[00350] Estruturas Tn3 monovalentes bem como tandem biespecíficas foram recombinantemente expressas em meio E. coli como descrito no Exemplo 2. Os níveis de expressão dos constructos solúveis foram analisados usando SDS-PAGE. A figura 10 demonstra níveis de expressão aceitáveis para os constructos testados. Exemplo 9 Ligação específica de estruturas Biespecíficas Tandem
[00351] Para medir a ligação de constructos Tn3 bioespecíficos a CD40L e TRAIL R2, um ensaio de ELISA de captura foi empregado. Resumidamente, constructos de proteína 8X His-tagged: A1, 79, C5, C6, C7 ou C8 (ver tabela 15 para detalhes) foram capturados de meio de E. coli em poços revestidos com anticorpo anti-His como a seguir. Uma placa de 96 poços MaxiSorb foi revestida com anticorpo anti-His Qiagen em 2 μg/ml durante a noite. A placa revestida foi bloqueada com PBS contendo 0,1% v/v Tween-20 e 4% p/v leite em pó desnatado (PBST 4% leite) por 1,5 horas. A placa revestida foi lavada com PBST e meio bacteriano diluído (diluído 30 vezes) contendo proteínas de expressão solúveis foi adicionado e as placas foram incubadas em temperatura ambiente por 2 horas. Após lavagem com PBST, os poços contendo os constructos capturados foram incubados por 1,5 hora com concentrações variadas de TRAIL R2 biotinilado (figura 11A) ou um complexo gerado por pré-incubação de E. coli produziu His-tagged HuCD40L com anticorpo biotinilado anti-His (figura 11B). Após lavagem com PBST, TRAIL R2 ligado ou complexo HuCD40L/anticorpo anti-His foi detectado com estreptavidina-peroxidase de rábano (RPN1231V; GE Healthcare; 1000x diluição de trabalho) por 20 min., lavando com PBST, e detectando colorimetricamente por adição de substrato TMB (Pierce). A absorbância foi lida em 450 nm.
[00352] A ligação de estruturas biespecíficas tandem específicas de TRAIL R2-HuCD40La TRAIL R2, e ligação a estruturas biespecíficas tandem específicas a TRAIL R2-HuCD40La HuCD40L são descritas em figura 11A e figura 11B, respectivamente. Estruturas biespecíficas tandem, designadas C5 a C8, compreendendo um domínio específico Tn3 a TRAIL R2 fundido a um domínio Tn3 específico a HuCD40L ligou TRAIL R2 e HuCD40L; no entanto, os constructos Tn3 monoméricos/monoespecíficos A1 e 79 ligaram TRAIL R2 ou HuCD40L de acordo com suas especificidades conhecidas mas não ambos os alvos.
[00353] A ligação simultânea de constructos específicos tandem de TRAIL R2-HuCD40L a TRAIL R2 e HuCD40L foi determinada usando um ensaio AlphaScreen™. As diluições de meio E. coli contendo proteínas A1, 79, C5, C6, C7 e C8 foram incubados com 10 nM de proteína de fusão TRAIL R2-Fc, 50 nM biotinilado HuCD40L (produzido em E. coli), esferas doadoras de estreptavidina AlphaScreen (0,02 mg/ml) e esferas aceptoras de proteína A AlphaScreen (0,02 mg/ml) em PBS + 0,01%Tween + 0,1%BSA. As amostras foram incubadas 1 h no escuro antes da leitura em um leitor PerkinElmer Envision. A população de esferas doadoras foi excitada com um laser a 680 nm causando a liberação de oxigênio singleto. O oxigênio singleto tem um tempo de vida limitado permitindo uma viagem de até 200 nm por difusão antes de voltar ao estado fundamental. O oxigênio singleto excita as esferas aceptoras causando emissão de luz entre 520-620 nm que é medido por leitor Envision. Somente quando o as esferas doadoras e aceptoras estão em proximidade um sinal é gerado. Assim, um aumento no sinal é observado quando dois tipos de esferas são postas juntas por moléculas que interagem com os dois alvos simultaneamente. Na ausência de ligação ao alvo nenhum sinal pode ser detectado.
[00354] Como mostrado na figura 12, os constructos tandem biespecíficos simultaneamente ligam TRAIL R2 e HuCD40L gerando um forte sinal AlphaScreen; no entanto, as estruturas monovalentes Tn3, A1 e 79, não geram um sinal indicando que não podem aproximar esferas doadoras e aceptoras por simultaneamente ligar ambos os alvos. Exemplo 10
[00355] Estabilidade aumentada de estruturas Tn3 Contendo 9 aminoácido de comprimento de alça FG
[00356] Para medir o efeito de comprimento da alça FG na estabilidade de Tn3, o desdobramento de seis estruturas Tn3 específicas de HuCD40L por cloridrato de guanidina (GuHCl) em pH 7,0 foi avaliado por fluorescência de triptofano intrínseca. Estas estruturas Tn3 monoméricas continham comprimentos de alça FG de 9, 10 ou 11 aminoácidos. Amostras de 0,05 mg/mL estrutura Tn3 contendo diferentes concentrações de cloridrato de guanidina foram preparadas em 50 mM de fosfato de sódio pH 7,0. O espectro de emissão de fluorescência foi adquirido em um espectrofluorômetro Horiba Fluoromax-4 em um comprimento de onda de excitação de 280 nm. A intensidade de emissão de fluorescência relativa em 360 nm foi plotado como uma função de concentração GuHCl para cada proteína. Cada estrutura continha sequências únicas de alça BC, DE, e FG. Clones A3 (SEQ ID NO:185; note que as estruturas monoméricas A3 neste exemplo é distinta de constructo designado A3 como fornecido na tabela 3), 71 (SEQ ID NO: 186), 79 (SEQ ID NO: 184), 127 (SEQ ID NO: 187), 252 (SEQ ID NO: 188), e 230 (SEQ ID NO: 189) foram mais do que 50% desdobrada em 3,0M GuHCl em pH 7,0, que é a concentração de GuHCl requerida para efetuar 50% de desdobramento (Cm) de Tn3 parental. Valores Cm para clones A3, 79, 127, 252, e 230 foram 2,2M, 2,7M, 2,4M, 2,7M, 2,4M, respectivamente. Comprimento de alça FG para estes é 11, 11, 11, 10 e 11 aminoácidos respectivamente, enquanto o comprimento de alça FG para Tn3 parental é 10 aminoácidos. Surpreendentemente, clone 71, o único variante contendo um comprimento de alça FG de 9 aminoácidos, apresentou um Cm de 4,2M, uma estabilidade significativamente maior do que a estrutura Tn3 parental ou as outras cinco variantes testadas. Os resultados são mostrados na figura 13.
[00357] Para determinar se a estabilidade melhorada de clone Tn3 71 foi intrínseca à sua sequência, ou uma consequência das alças encurtadas FG, este clone e duas proteínas de estrutura Tn monoméricas adicionais, (A6 (SEQ ID NO: 190; notar que a estrutura A6 monomérica neste exemplo é distinta do constructo designado A6 como fornecido na tabela 3) e P1C01 (SEQ ID NO: 191)) com um comprimento de alça FG de 9 aminoácidos (mas diferente sequências de alças BC, DE e FG) foram analisados por calorimetria de varredura diferencial (DSC) e comparado a estrutura Tn3 parental que contém uma alça FG que é 10 aminoácidos de comprimento. As amostras de proteína Tn3 em 1 mg/mL em PBS pH 7,2 foram analisadas. Em todos os casos, o ponto mediano de desdobramento térmico foi superior para clones com os 9 resíduos de alças FG como comparado ao Tn3 parental (WT), que tem um 10 resíduos de alça FG. O desdobramento térmico foi reversível, ou parcialmente reversível (clone A6) como evidenciado por termogramas superpostos quando a mesma amostra foi resfriada e reaquecida. Como mostrado na figura 14, a temperatura de fusão (Tm) para Tn3 parental foi 72,1 °C, para P1C01 a Tm foi 75,2°C, para A6 a Tm foi 77,5°C, e para 71 a Tm foi 74,4°C.
[00358] Estes achados foram corroborados por teste das mesmas variantes da proteína Tn3 em um experimento de estabilidade de cloridrato de guanidina. O desdobramento de Tn3 parental (WT), P1C01, A6, e 71 por cloridato de guanidina (GuHCl) em pH 7,0 foi avaliado por fluorescência de triptofano intrínseca como descrito acima. Como mostrado na figura 15, de acordo com os dados DSC na figura 14, clones Tn3 A6, 71, e P1C01 todos têm pontos medianos de desdobramento em concentrações significativamente superiores de GuHCl do que a estrutura de Tn3 parental (WT), indicando a estabilidade de proteínas Tn3 contendo alças FG que são 9 ami- noácidos em comprimento, ou seja mais curtas do a estrutura Tn3 parental, é aumentada. Exemplo 11 Análise de estabilidade de comprimento de alça FG
[00359] Como descrito acima, análise preliminar indicou que moléculas Tn3 contendo um comprimento de alça FG de 9 resíduos são significativamente mais estáveis do que aquelas contendo alças maiores FG. Nestes estudos, conduzimos análise de estabilidade em um conjunto de Tn3s aleatórios para avaliar o efeito do comprimento de alça FG em estabilidade térmica.
[00360] Uma biblioteca Tn3 foi subclonada em vetor de expressão pSEC. Esta biblioteca codifica Tn3s com alças BC, DE, e FG de sequência variada bem como variado, mas comprimento definido. A alça FG, que é o foco destes estudos, pode ser 9, 10, ou 11 resíduos de comprimento. A alça BC pode ser 9, 11, ou 12 resíduos de comprimento. A alça DE nesta biblioteca tem um comprimento fixo de 6 resíduos. A biblioteca subclonada foi usada para transformar células competentes DH5α, a partir da qual um pool de plasmídeo foi purificado e usado para transformar células BL21(DE3). As colônias BL21 formas sequenciadas para identificar 96 clones que codificaram para Tn3s de comprimento total. Os 96 clones finais foram crescidos em uma placa de 96 poços profundos em uma escala de 500 μl usando expressão padrão Magic Media (37°C agitação por 24 horas após a inoculação) e analisado em SDS-PAGE. 29 clones aleatórios contendo níveis de expressão moderado a alto foram escalonados até expressão em escala de 50 mL e purificados usando cromatografia de afinidade de metal imobilizado padrão. As identidades de todas as proteínas foram confirmadas por espectrometria de massa.
[00361] Os clones aleatórios foram analisados para estabilidade por DSC. Resumidamente, medições DSC foram conduzidas em VP- Capillary DSC (MicroCal). Proteínas foram trocadas em PBS (pH 7,2) através de diálise extensiva, e ajustada a uma concentração de 0,250,5 mg/ml para análise DSC. As amostras foram triadas a partir de 2095°C em uma taxa de varredura de 90°C/hora, sem varredura repetida. Os resultados são mostrados na tabela 17. Tabela 17. Comparação de valores Tm de Tn3s com FG9 vs FG10/11
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[00362] Neste estudo, a estabilidade térmica de Tn3s com comprimento de alça FG9 ou FG10 e 11 foi comparada. A tendência mostra que os domínios Tn3 contendo uma alça FG de comprimento 9 são mais termoestáveis com comprimento de alça FG10 ou 11. Um controle, o domínio tipo selvagem Tn3 (com uma alça FG de 10 resíduos) teve uma Tm de 72°C quando correu em paralelo com as amostras acima. A faixa de valores Tm observada com cada comprimento de alça indica que outros fatores ainda desempenham papel na determinação de temoestabilidade de domínio Tn3. Exemplo 12 Geração e caracterização de um Tn3Triespecífico
[00363] Nestes experimentos, uma molécula Tn3 contendo especificidade de ligação para três diferentes faixas foi gerada e caracterizada. D1, o domínio Tn3 específico para anticorpo Synagis®, foi ligado a 1E11, um domínio Tn3 específico para receptor TRAIL 2, e 79, um domínio Tn3 específico para CD40L, respectivamente (figura 16A). O constructo foi expresso em BL21(DE3) células E. coli e purificado usando métodos padrões (ver figura 16B).
[00364] Para confirmar que os constructos triespecíficos foram capazes de ligar pares de todos os três alvos simultaneamente, ambos experimentos AlphaScreen e ELISA foram conduzidos. Para experimentos AlphaScreen, Tn3 triespecíficos subconjuntos de duas ou mais moléculas alvo totais (uma biotinilada e a outra contendo uma região de anticorpo Fc), esferas doadoras de proteína A, e esferas aceptoras de estreptavidina foram combinadas em uma Optiplate branca de 384 poços, como descrito acima. Sinal AlphaScreen pode somente ser observado quando esferas doadoras de estreptavidina e esferas aceptoras de proteína Protein A estão em proximidade de cada outra (200 nm de cada outra), que neste ensaio é conseguido através de ponte entre a molécula triespecífica. A capacidade de D1-1E11-79 em simultaneamente ligar huCD40L e TRAIL R2-Fc (figura 17A), e para simultaneamente ligar huCD40L e Synagis® (figura 17B) foi confirmado por AlphaScreen como a seguir: em uma Optiplate branca de 384 poços, os seguintes componentes foram combinados em um volume total de 30 μl: 20mM purificado D1-1E11-79, 50mM biotinilado-huCD40L, (0, 1, 2,5, 5, 10, ou 42 nM) TrailR2-Fc (figura 18A) ou (0, 1, 2,5, 5, 10, ou 42 nM) Synagis (figura 18B), 5 μl cada de 1/50 diluições de esferas aceptoras de proteína A AlphaScreen e esferas doadoras de estreptavidina. Após 1 hora de incubação no escuro, a placa foi lida em um leitor de placa Envision em modo AlphaScreen.
[00365] Devido ao fato de Synagis® e TRAIL R2-Fc ambas conterem um domínio Fc, o ensaio AlphaScreen não pode ser usado para demonstrar ligação simultânea destas moléculas ao constructo triespecífico. No lugar disto, um experimento ELISA foi conduzido. Placas MaxiSorp foram revestidas com TRAIL R2-Fc (100 μl a 1 μg/ml), bloqueados com leite 4%, depois seguido por adição de concentrações variadas de constructo triespecífico. Synagis Biotinilado, o segundo ligador alvo, foi adicionado e detectado pela adição de HRP-estreptavidina (figura 18). de D1-1E11-79 ainda demonstrou ser capaz de ligar ambos TRAIL R2-Fc e Synagis® simultaneamente, como indicado pelos resultados de ELISA na figura 18. Portanto, concluímos que este constructo pode ligar todos os três pares de seus alvos simultaneamente. Exemplo 13 Isolamento de Líder
[00366] A primeira etapa no desenvolvimento de um Tn3 agonista é isolar um monômero Tn3 que pode se ligar a TRAIL R2 e quando ligado em um formato multivalente pode ligar dois ou mais domínios extracelulares de TRAIL R2 de modo que engate a via de apoptose. Uma vez que nem todos os ligadores podem atuar como agonistas, decidimos primeiro isolar um painel de ligadores e em seguida triar para agonismo em um ensaio secundário de morte celular in vitro. Primeiro triamos uma grande biblioteca de fago apresentado de Tn3’s com variação nas alças BC, DE, e FG em TRAIL R2-Fc recombinante para isolar um painel inicial de ligadores. A estrutura Tn3 escolhida como a base para esta biblioteca não foi um 3° domínio nativo FnIII de Tenascina C mas uma versão que teve um dissulfeto projetado para melhorar a estabilidade. Uma biblioteca de display de fago in house Tn3/gene 3 foi construída contendo randomização nas alças BC, DE, e FG. Vários ligadores foram encontrados por ELISA fago em que TRAIL R2 foi diretamente revestido em uma placa e ligação de 1:3 fago diluído em PBS + 0,1 % Tween 20 (PBST) 1% de leite foi detectado por anticorpo anti-M13-peroxidase conjugado (GE Healthcare Biosciences, Piscataway, NJ). Uma grande parte dos ligadores teve uma cisteína livre indesejável em uma das alças e não foram escolhidos para outro estudo. Um subconjunto de clones desprovidos de cisteína não pareadas foi clonado em vetores de expressão gerando constructo de fusão Fc ou tipo anticorpo (figura 1) e testado na linhagem de célula de tumor H2122 para morte celular (dados não mostrados). Embora o formato de fusão Fc tenha falhado em matar células independente de seu Tn3 fundido, o formato tipo anticorpo induziu uma resposta para mais do que um ligador. Exemplo 14 Maturação de Afinidade
[00367] Clone 1C12 (SEQ ID NO: 132) (ver figura 19) mostrou a melhor morte celular nos ensaios de triagem iniciais e foi, portanto, e escolhido para maturação de afinidade. Maturação de afinidade foi realizada por mutagênese de saturação de porções das alças usando mutagênese Kunkel ou PCR com oligonucleotídeos contendo randomização, montagem, e ligação no vetor de exibição de fago. A rodada um e três consistiram de mutagênese de saturação em partes de alças BC e FG respectivamente e a rodada 2 combinou mutagênese de saturação de partes de todas as três alças separadamente, panning, embaralhamento de gene, e em seguida panning de mutantes embaralhados para obter o clone resultante de maior afinidade. Pools de clones de maturidade de afinidade foram registrados após panning por PCR diretamente do fago ou preparando o DNA de fita simples usando um kit Qiagen (Qiagen, Valencia, CA) e então PCR. Produtos PCR foram digerido NcoI a KpnI (New England Biolabs, Ipswich, MA) e clonados em nosso vetor de expressão in house pSEC. Os clones foram expressos em MagicMedia (Invitrogen, Carlsbad, CA) e correram em um gel para verificar que a expressão não difere enormemente entre clones. Clones melhorados foram identificados por uma ELISA de competição em cujas placas foram revestidas 1C12 tetravalente, tipo anticorpo (SEQ ID NOs: 154 e 155), e a inibição na ligação de 0,75 nM TRAIL R2 biotina na presença de diluições de Tn3 em MagicMedia foi medido usando estreptavidina-peroxidase de rábano (GE Healthcare Biosciences, Piscataway, NJ). TMB (KPL, Gaithersburg, MD) foi adicionado e neutralizado com ácido. A absorbância foi lida em 450 nm.
[00368] As medições de afinidade foram realizadas em sistema de arranjo de interação de proteína ProteOn XPR36 (Bio-Rad, Hercules, CA) com GLC sensor chip a 25°C. Salina tamponada fosfato ProteOn com 0,005% Tween 20, pH 7,4 (PBS/Tween) foi usada como tampão de corrida. TRAIL R2 foi imobilizado no chip e uma diluição serial de duas vezes, 12 pontos de ligadores Tn3 (1C12 (SEQ ID NO: 132), 1E11 (SEQ ID NO: 134), G3 (SEQ ID NO: 133), C4 (SEQ ID NO: 135), e G6 (SEQ ID NO: 138)) foram preparados em PBS/Tween/0,5mg/ml BSA, pH 7,4 em concentração inicial variando de 36 μM a 700 nM. As amostras de cada concentração foram injetadas em seis canais de analito em uma vazão de 30 μl/min. por 300 segundos. O Kd foi determinado usando a análise de equilíbrio ajustada dentro do software ProteOn. As sequências dos melhores clones de cada rodada são mostradas na figura 19. A melhora total na afinidade após três rodadas de maturação de afinidade foi quase de duas ordens de magnitude com os melhores clones contendo afinidades na faixa de 40-50 nM (Tabela 18). Tabela 18. Constantes de ligação de equilíbrio de melhores clones monoméricos a partir de maturação de afinidade de clone líder 1C12 como medido por ressonância de plásmon de superfície (SPR).
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Exemplo 15 Efeito de afinidade Tn3 em potência em formato tipo anticorpo
[00369] Para avaliar o efeito de afinidade da subunidade TN3 individual em potência, todos os clones na tabela 18 foram reformatados em constructo tipo anticorpo descrito na figura 1. Para expressar as proteínas tipo anticorpo, as células 293F foram transitoriamente transfectadas com os constructos de expressão apropriados. A colheita do sobrenadante foi realizada nos dias 6 e 10 e a proteína foi purificada por cromatografia de afinidade a proteína A. Todas as proteínas purificadas foram analisadas por SDS-PAGE em géis NuPage Novex 412% bis tris em tampão MES sem agente redutor, e foram visualizados usando Corante SimplyBlue Safe (Invitrogen, Carlsbad, CA).
[00370] Cromatografia por exclusão de tamanho foi ainda usada para analisar proteínas purificadas e, onde necessário, material agregado foi removido em coluna Superdex 75 10/300GL ou Superdex 200 10/300GL (GE Healthcare, Piscataway, NJ), em um nível final abaixo de 10% de proteína total. Uma unidade Acrodisc com uma membrana Mustang E (Pall Corporation, Port Washington, NY) foi usada como indicado pelo fabricante para remover endotoxina de preparações de proteína bacterianamente expressas.
[00371] As células H2122 foram então testadas para sensibilidade aos constructos agonistas tipo anticorpo usando um ensaio de viabilidade celular CellTiter-Glo. Neste ensaio, luminescência é diretamente proporcional aos níveis de ATP dentro de certo poço de uma placa de 96 poços, que por sua vez é diretamente proporcional à quantidade de células viáveis metabolicamente ativas. Para a linhagem de célula H2122, as células foram plaqueadas em placas de 96 poços em uma densidade de 10.000 células/ poço em 75 μl de meio completo (meio RPMI 1640 complementado com 10% FBS). Após incubação durante a noite a 37oC, o meio foi complementado com 25 μl de meio adicional contendo uma diluição serial de proteínas especificas TRAIL R2 ou controle negativo. Todos os tratamentos foram realizados em poços em duplicata. O ligador TRAIL comercialmente disponível (Chemicon/Millipore, Billerica, MA) foi usado como um controle positivo para morte celular induzida por receptor TRAIL.
[00372] Depois de 72 horas, o kit CellTiter-Glo foi usado de acordo com as instruções do fabricante. A luminescência do ensaio foi medida em um leitor de placa Envision (PerkinElmer, Waltham, MA). A inibição de viabilidade celular foi determinada dividindo os valores de luminescência para células tratadas pela luminescência média para células viáveis não tratadas.
[00373] Duas variáveis determinam a potência: a concentração em que um constructo inibe a viabilidade de células em 50% (EC50) e a inibição máxima de viabilidade celular. A figura 20 mostra que uma tendência geral, maior afinidade de monômero Tn3 leva a uma EC50 inferior de constructos tipo anticorpo como G6 tem uma EC50 inferior a 1E11 e 1E11 tem uma EC50 inferior a 1C12. Exemplo 16 Farmacocinética de Tn3s lineares
[00374] Para determinar a meia-vida de Tn3 lineares tandems como uma função de número de módulos Tn3 por tandem, os monômeros G6 (SEQ ID NO: 138), G6 tandem 4 (SEQ ID NO: 143), G6 tandem 6 (SEQ ID NO: 192) e G6 tandem 8 (SEQ ID NO: 145) foram injetados em um camundongo e concentração sérica de Tn3s foi monitorada por ELISA. A via de administração foi injeção intraperitoneal (IP). O desenho experimental é mostrado na tabela 19. Os camundongos foram sangrados em 150 μL por ponto de tempo. Tn3s foram detectadas em soro por ELISA em cujas placas revestidas com TRAIL R2 produzidas in house foram incubadas com soro diluído em PBST 1% leite. Os ELISAs iniciais foram realizados para determinar por certo ponto de tempo a faixa de diluição correta para o sinal estar dentro da faixa dinâmica do ensaio. Tn3 ligado foi detectado com uma diluição de 1 em 1.000 de soro policlonal anti-Tn3 de coelho em PBST 1% leite (Covance, Princeton, NJ) seguido por uma diluição 1 em 10.000 em PBST 1% leite de HRP anti-coelho de burro (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). Para cada constructo, uma curva padrão foi preparada. Análise estatística foi realizada usando um programa de estatística in house.
[00375] O termo "concentração plasmática máxima" (“Cmax”) refere- se à maior concentração observada de Tn3 tandem em plasma após administração do material teste ao paciente.
[00376] O termo "Tmax" refere-se ao tempo de concentração plasmática máxima Cmax.
[00377] O termo "área sob a curva" (“AUC”) é a área sob a curva em um plot de concentração de Tn3 tandem em plasma contra o tempo. AUC pode ser uma medida de integral das concentrações plasmáticas instantâneas (Cp) durante um intervalo de tempo e tem unidades de massa *tempo/volume. No entanto, AUC é geralmente apresentada para intervalo de tempo zero ao infinito. Assim, conforme usado aqui "AUCinf" refere-se a uma AUC a partir de um período de tempo infinito.
[00378] O termo "meia-vida biológica" (“T1/2”) é definido como o tempo requerido para a concentração plasmática de Tn3 tandem atingir metade de seu valor original.
[00379] O termo "CL/F" refere-se ao depuração corporal total aparente calculado como Dose/ AUCinf.
[00380] A meia-vida biológica (T1/2) de Tn3 aumenta com o aumento do número de Tn3s tandem por molécula linear. Adicionar sete Tn3s para produzir um tandem 8 a partir de um monômero aumentou a meia- vida em quase 50%. Aumento em valência não afeta a Tmax. No entanto, aumentos na valência de 1 a 8 resultou em aproximadamente dez vezes e 7 de aumentos em Cmax e AUCinf, respectivamente. Além disso, quando a valência aumenta de 1 para 8, uma redução de aproximadamente 7 vezes em depuração (CL/F) foi observada. Tabela 19. Desenho experimental de ensaio de farmacocinética de anti-TRAIL R2 linear tandem.
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Tabela 20. Propriedades farmacocinéticas de Tn3s tandem
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Exemplo 17 Melhora projetada de reatividade cruzada a cyno
[00381] Para teste de toxicidade pré-clínica em macacos cynomolgus (Macaca fascicularis), é desejável desenvolver um anti-TRAIL R2-Tn3 que reage cruzado com TRAIL R2 cynomolgus (TRAIL R2 cyno). Os clones líderes com afinidade madura iniciais tiveram baixa reatividade cruzada com TRAIL R2 cyno, embora a homologia a TRAIL R2 humano seja s 88%. A reatividade cruzada foi aumentada gerando uma biblioteca baseada em clone F4 (SEQ ID NO: 137), que foi o clone com a melhor reatividade cruzada a cyno entre os clones que resultaram de maturação de afinidade.
[00382] Duas bibliotecas foram preparadas por mutagênese de saturação: uma com diversidade na alça FG isolada e uma com diversidade nas alças BC e FG. Um PCR mutagênico de baixa taxa de erro foi ainda usado para permitir mutações fora das alças que podem ser benéficas para ligação melhorada a TRAIL R2 cyno. Quatro rodadas de panning fago foram realizadas em TRAIL R2 cyno produzida in house, e os resultados foram clonados em vetor de expressão pSEC. Para triagem de hits iniciais em um formato ELISA, Tn3’s foram secretados em MagicMedia (Invitrogen, Carlsbad, CA) e foram capturados do sobrenadante usando um anticorpo anti-his tag (R and D Systems, Minneapolis, MN).
[00383] A ligação de TRAIL R2-Fc humano ou cyno em solução ao Tn3 capturado foi detectado por anti-humano-Fc-HRP. Os clones que tiveram ligação significativa a TRAIL R2 cyno-FC e não parecem perder ligação a TRAIL R2-Fc humana foram selecionados para triagem subsequente de ELISA em que TRAIL R2-Fc humano ou cyno foi revestido em uma placa e sobrenadantes Tn3 foram titulados e então detectados com anti-his tag HRP. Devido ao fato de o nível de variação em níveis de expressão do clone ao clone ser baixo, e ainda porque a avidez TRAIL R2-Fc contendo divalente em solução não poder mascarar diferenças em afinidade de Tn3, esta ELISA permitiu discriminação de afinidade. Foi demonstrado que uma mutação, uma mutação de D a G dois aminoácidos antes da alça DE, estava presente em todos os clones de reatividade cruzada cyno projetados (figura 22A). Esta mutação D para G foi projetada no F4 original para gerar um clone chamado F4mod1 (SEQ ID NO: 193) e a reatividade cruzada para cyno foi enormemente melhorada sem sacrificar a ligação a TRAIL R2 humano (figura 22B). Nete ELISA, a inibição de ligação de 0,75 nM de TRAIL R2 -Fc humano ou cyno a placas revestidas com F4mod1 por F4 ou F4mod1 purificado foi medida.
[00384] É desejado que a ligação de um clone com reatividade cruzada cyno melhorada a TRAIL-R2-Fc seja de até dez vezes de sua ligação a TRAIL R2-Fc humana. Ainda, é desejado que a ligação de um clone com reatividade cruzada cyno melhorada a TRAIL-R2-Fc seja de até dez vezes da ligação de F4 a TRAIL R2-Fc humana . A IC50 para ligação de F4mod1 a TRAIL R2 cyno difere em menos do que três vezes de IC50 para F4mod1 ligação a TRAIL R2 humana. Além disso, IC50 para ligação de F4mod1 a TRAIL R2 humano é seis vezes mais forte do que IC50 para ligação de F4 a TRAIL R2 humana. Assim, F4mod1 atinge os requisitos de reatividade cruzada pretendido. Exemplo 18 Linhagem germinativa projetada de clone de reatividade cruzada cyno melhorada
[00385] Clone F4mod1 foi ainda projetado para eliminar mutações não essenciais de linhagem germinativa para reduzir possíveis ricos de imunogenicidade. Um painel de doze diferentes modificações foi feito para determinar se houve um efeito de certa mutação na ligação a ambos TRAIL R2 humano e cyno. A figura 23A mostra uma comparação de clone final F4mod12 (SEQ ID NO: 194), que incorpora todas as mutações de linhagem germinativa testadas que não afetam a ligação, a outros constructos, ou seja, a linhagem germinativa Tn3, o parente original F4, e clone F4mod1 (de reatividade cruzada inicial aumentada projetada).
[00386] A sequência de aminoácido de F4mod12 começa com a sequência nativa Tn3 SQ, termina com L, tem uma reversão de mutação na estrutura 2 de A para T, e tem uma reversão ao final de dois aminoácidos da alça DE de TA par aNQ. A figura 23B mostra que F4, F4mod1, e F4mod12 todos estão dentro de seis vezes de cada outro em suas ligações a TRAIL R2 humana. Ainda mostra que F4mod1 e F4mod12 estão dentro de duas vezes de cada outro em suas ligações a TRAIL R2 cyno.
[00387] F4mod12 foi reformatado em um tandem 6 (SEQ ID NO: 167) e tandem 8 (SEQ ID NO: 166) constructo e testado para confirmar que não há perda em potência relativa a G6 tandem 6 (SEQ ID NO: 144) e tandem 8 (SEQ ID NO: 145). A figura 23C e figura 23D não mostram perda na potência para linhagem germinativa projetada, reatividade cruzada melhorada para cyno de F4mod12 tandems em comparação a G6 tandems em linhagem de célula Colo205. Exemplo 19
[00388] Atividade de G6 tandem 8 em linhagens de células resistentes a TRAIL
[00389] Várias linhagens de células são resistentes a morte por TRAIL. Assim, avaliamos se a potência melhorada de constructos G6 tandem 8 em relação a TRAIL em linhagens de células sensíveis a TRAIL irão traduzir em potência de G6 tandem 8 em linhagens de células resistentes a TRAIL. A sensibilidade a Apo2L/TRAIL em várias linhagens de câncer foi determinada com ensaio de viabilidade celular luminescente CellTiter-Glo (Promega, Madison, WI). Resumidamente, as células foram plaqueadas em placas de 96 poços, deixadas aderir durante a noite e então tratadas com várias concentrações de Apo2L/TRAIL humana recombinante e mimético de TRAIL G6 Tandem 8 em meio contendo 10% FBS. Após um período de 48-72 hrs, a viabilidade celular foi determinada seguindo protocolos do fabricante. A figura 24 mostra que para a linhagem de célula resistente a TRAIL HT29 G6 tandem 8 mostra potente atividade de morte celular enquanto TRAIL não. A tabela 21 mostra que G6 tandem 8 tem atividade de morte de célula em muitas, mas não todas as linhagens de células resistentes a TRAIL testadas. A potência melhorada pode ser devido à maior valência de tandem em relação a TRAIL, embora a orientação especial da ligação a módulos pode ainda ter um efeito. Tabela 21. Atividade de G6 tandem 8 e TRAIL em linhagens de células resistentes a TRAIL TRAIL IC50 [nM] G6 Tandem 8 IC50 [nM] TRAIL % Max Kill G6 Tandem 8 % Max Kill
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Exemplo 20
[00390] Estudo de imunogenicidade de monômeros de ligação a TRAIL R2
[00391] A imunogenicidade é uma questão potencial para qualquer proteína terapêutica mesmo se é humana em origem. As respostas imunogênicas podem limitar a eficácia através de neutralização de anticorpos que podem levar à inflamação. Um dos fatores mais importantes no desenvolvimento de uma resposta imune é a presença de epitopos que podem estimular a proliferação de célula T CD4+. No teste EpiScreen (Antitope, Cambridge, UK), células mononucleares de sangue periférico depletadas de célula CD8+ (PBMCs) são incubadas com proteínas teste e proliferação de célula CD4+ T e secreção de IL-2 são monitoradas (ver, Baker & Jones, Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 10:219-227, 2007; Jaber & Baker, J. Pharma. Biomed. Anal. 43:12561261, 2007;. Jones et al., J. Thrombosis and Haemostasis 3:991-1000, 2005; Jones et al., J. Interferon Cytokine Res. 24:560-72, 2004). Os PBMCs são isolados de um pool de doadores que representam os alótipos HLA-DR expressos na população mundial.
[00392] Os monômeros Tn3 mostrados na figura 25 foram expressos (com um GGGGHHHHHHHH ligador-His tag), purificado, e verificado para ser monomérica por SEC, e filtrado para remoção de endotoxina como descrito acima. Todos os clones tipos não selvagens foram de rodada projetada para melhorar a reatividade cruzada para cyno (figura 22A). No entanto, estes clones tiveram mutações a linhagem germinativa que demonstraram não afetar a ligação no F4mod1 de fundo. Estes clones foram testados em um ELISA para verificar que as mutações de linhagem germinativa não afetam a ligação. Em ambos os ensaios de proliferação de célula T e de secreção de IL-2, um índice de estímulo (SI) de mais do que dois foi anteriormente estabelecido como uma resposta positiva para certo doador. A SI média, ou média de SI da população que responde positivo, e indicativo de força da resposta. Uma proteína de controle conhecida por induzir uma resposta forte, keyhole limpet hemacinina (KLH), foi incluída em ambos os ensaios.
[00393] A tabela 22 mostra SI médio para todas as proteínas do teste, que são significativamente menores do que para KLH e foi maior do que o cutoff de 2 para uma média positiva de SI. Além disso, a frequência de resposta para as proteínas teste foi muito baixa (dez por cento ou menos para todas as proteínas testadas exceto para o controle que teve uma resposta em excesso de 90%). Estudos anteriores por Antitope revelaram que uma resposta EpiScreen de menos do que 10% é indicativo de baixo risco de imunogenicidade clínica. Assim, nossa observação que todos os Tn3s testados tiveram 10% ou menos frequência de resposta indica um baixo risco de iunogenicidade clínica. Tabela 22. Resultados de um ensaio de imunogenicidade de Antitope EpiScreen. Tn3s testados são classificados de 1 (mais imunogênico) a 4 (menos imunogênico). Média SI Frequência (%) de Resposta
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Exemplo 21 Estado de agregação de Tn3’s G6 tandem 8 purificado e não purificado
[00394] Sabe-se na técnica que proteínas contendo várias cisteínas, por exemplo, uma proteína feita de repetições tandem que contém uma ligação dussulfeto interna, geralmente não apresenta pareamento dissulfeto apropriado. Scrambling de dissulfetos pode reduzir ou eliminar a expressão no meio. Se a proteína não expressão no meio, pode ser uma mistura de proteína dobrada inadequadamente com pares dissulfetos intermoleculares bem como desemparelhados levando a agregação. Nossos dados SEC revelaram que a maior parte de proteínas tandem no meio de expressão bacteriano estava em um estado propriamente dobrado monomérico . Após purificação Ni-NTA de proteína Hi- tagged G6 tandem 8, aproximadamente 15% da proteína foi agregada. A agregação observada foi reduzida a 4% (figura 26A) pore redução com 2mM DTT, indicanto que a maior parte da agregação foi mediada por dissulfeto. A maior parte dos agregados foi removida por purificação SEC (figura 26B), como descrito acima. Exemplo 22 Determinação de mimético de TRAIL, G6TN6 e G6TN8, inibição de fator de crescimento de em modelos xenoenxerto de câncer colorretal Colo205
[00395] A atividade antitumor de miméticos Tn3 de TRAIL, G6 tandem 6 (G6TN6) (SEQ ID NO: 144) e G6 tandem 8 (G6TN8) (SEQ ID NO: 145), foram avaliados em Colo205, um modelo de xenoenxerto de carcinoma colorretal humano. As células Colo205 foram mantidas em uma cultura monocamada semiadesiva a 37°C sob 5% CO2 em Roswell Park Memorial Institute (RPMI) meio 1640 que continha 10% soro fetal bovino (FBS). As células coletadas por tripsinização foram ressuspensas em uma concentração final de 3x107 células/mL em solução de sal balanceado de Hank (HBSS). Camundongos fêmeas atímicas nude foram injetadas por via subcutânea (SC) no flanco direito com 3 x 106 de células Colo205. O estudo foi iniciado quando os tumores atingiram uma média de ~177 mm3. O desenho do estudo é sumarizado na tabela 23. TRAIL foi diluída de solução estoque com 20mM Tris-HCl 300mM Arginina-HCl PH 7 e administrada por via intravenosa (IV) em dose indicada na tabela 23, diariamente por um total de 5 doses de acordo com peso corporal (10 mL/kg). G6 tandem 6 (G6TN6) e G6 tandem 8 (G6TN8) foram cada um diluído de uma solução estoque com PBS e administrado por via intravenosa (IV) em doses indicadas na tabela 23, diariamente por um total de 5 doses de acordo com o peso corporal (10 mL/kg). Volumes de tumor e medidas de peso corporal foram registrados. As medidas de tumor foram feitas usando um paquímetro eletrônico e volume de tumor (mm3) foi calculado usando a fórmula volume de tumor = [comprimento (mm) x largura (mm)2]/2. A inibição de crescimento de tumor (TGI) foi calculada como percentual de TGI = (1 - T/C) x 100, onde T = volumes final de tumor de um grupo tratado após a última dose, and C = volumes final de tumor de cada grupo de controle após a última dose.
[00396] Durante a fase de dose (DP) (figura 27), 3 mg/kg e 30 mg/kg de G6TN6 resultou em TGI significativo de 92% (p<0,0001) e 93% (p<0,0001), respectivamente (tabela 24). De modo semelhante, após ajuste equimolar para concentração final, 2,25 mg/kg e 25,5 mg/kg de G6TN8 resultou em TGI significativo de 93% (p<0,0001) e 94% (p<0,0001), respectivamente (tabela 24). 30 mg/kg de TRAIL resultou em TGI de 60% (p<0,001), (tabela 24).
[00397] Pelo dia 34 da fase de crescimento (RP) (figura 27), enquanto 3 mg/kg G6TN6 não resultam em qualquer CR (CR; percentual de camundongos em grupo onde nenhum tumor palpável detectável para duas medidas sucessivas), 2,25 mg/kg G6TN8 resultou em um 90% CR. Em uma dose maior de 30 mg/kg G6TN6 50% CR foi conseguido. Por outro lado, 25,5 mg/kg G6TN8 resultou em 100% CR (tabela 25). Os resultados de ambas as doses sugerem que G6TN8 resultou em maior eficácia em comparação a G6TN6. No entanto, ambos G6TN6 e G6TN8 mostraram eficácia em certas doses. Mais importante, ambos os constructos significativamente superaram TRAIL que não resultaram em qualquer PR ou CR.
[00398] Como mostrado na figura 28, nenhuma perda de peso corporal foi observada para ambos G6TN6 e G6TN8 em todas as doses durante o doseamento e fase de recrescimento do estudo. Tabela 23. Desenho do estudo para TRAIL e mimético de TRAIL (G6TN6 e G6TN8) em modelo de xenoenxerto de tumor Colo205
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Tabela 24. Efeito de TRAIL e mimético de TRAIL (G6TN6 e G6TN8) em TGI durante fase de dosagem do estudo.
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Tabela 25. Efeito de TRAIL e mimético de TRAIL (G6TN6 e G6TN8) em TGI durante fase de recrescimento pelo dia 34 do estudo.
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a regressão parcial percentual (PR; percentual de camundongos em grupo onde volume de tumor é menos do que 50% de volume em tempo de classificação para duas medições sucessivas) b regressão completa percentual (CR; percentual de camundongos no grupo onde nenhum tumor palpável detectável para duas medições sucessivas)
[00399] Os exemplos mostraram vários aspectos ilustrativos da invenção e práticas de métodos da invenção. Estes exemplos não pretendem fornecer uma descrição exaustiva das muitas diferentes modalidades da invenção. Assim, embora a invenção tenha sido descrita em alguns detalhes por meio de ilustração e exemplo para fins de esclarecimento do entendimento, os especialistas na técnica irão prontamente realizar que muitas alterações e modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito ou escopo das reivindicações anexadas.
[00400] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes mencionados neste relatório descritivo são aqui incorporados como referência no relatório descritivo na mesma extensão como se cada publicação individual, patente ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado aqui por referência.
[00401] Os exemplos acima ilustram vários aspectos da invenção e prática dos métodos da invenção. Os exemplos não pretendem fornecer uma descrição exaustiva de muitas diferentes modalidades da invenção. Assim, embora a invenção acima tenha sido descrita em alguns detalhes por meio de ilustração e exemplo para fins de esclarecimento do entendimento, os especialistas na técnica irão prontamente perceber que muitas alterações e modificações podem ser feitas a esta sem se afastar do espírito ou escopo das reivindicações anexadas.
[00402] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes mencionados neste relatório descritivo são aqui incorporados como referência no relatório descritivo na mesma extensão como se cada publicação individual, patente ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado aqui por referência.

Claims (11)

1. Estrutura multimérica recombinante específica TRAIL R2, caracterizada pelo fato de que compreende seis estruturas de monômeros Tn3 específica TRAIL R2, em que (a) cada estrutura de monômero Tn3 compreende sete fitas beta designadas A, B, C, D, E, F, e G, ligadas a seis regiões de alça designadas AB, BC, CD, DE, EF, e FG, em que a alça AB compreende a SEQ ID NO: 35, a alça BC compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 97, 98, ou 168, a alça CD compreende a SEQ ID NO: 37, a alça DE compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 102, 103, e 179, a alça EF compreende a SEQ ID NO: 39, e a alça FG compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 106, 108, 109, 169, e 170, em que a fita beta A consiste de IEV, a fita beta B consiste de ALITW, a fita beta C consiste de CELX1YGI, a fita beta D consiste de TTIX2L, a fita beta E consiste de YSI, a fita beta F consiste de YEVSLIC, e a fita beta G consiste de KX3TFTT, em que X1 represente os resíduos de aminoácido A ou T, em que X2 representa os resíduos de aminoácido D ou G, e em que X3 representa os resíduos de aminoácidos E ou G; (b) as estruturas de monômero Tn3 são conectadas em formato de tandem linear, e (c) em que as estruturas de monômero Tn3 compreende pelo menos uma ligação dissulfeto intramolecular de ocorrência não natural, em que a ligação estabiliza a estruturas de monômero.
2. Estrutura multimérica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a estrutura de monômero compreende 7 ou 8 estruturas de monômeros Tn3 específica TRAIL R2.
3. Estrutura multimérica de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que pelo menos duas estruturas de monômeros Tn3 são conectadas por um ligador.
4. Estrutura multimérica de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o ligante compreende um ligador de peptídeo.
5. Estrutura multimérica de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o ligador de peptídeo compreende a sequência (GxS)y em que: x e y são números inteiros; x = 1, 2, 3 ou 4; em que y = 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7; e opcionalmente, x = 4 e y = 1.
6. Estrutura multimérica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a estrutura é conjugada a PEG em N-terminal ou C-terminal.
7. Estrutura multimérica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a alça BC consiste em SEQ ID NO: 97, a alça DE consiste em SEQ ID NO: 179, e a alça FG consiste em SEQ ID NO: 170.
8. Estrutura multimérica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a estrutura compreende a SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204 ou SEQ ID NO: 167.
9. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende a estrutura multimérica recombinante, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em um excipiente farmaceuticamente aceitável.
10. Uso de uma estrutura multimérica recombinante, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de ser para preparar uma composição para prevenir, tratar ou amenizar câncer em um paciente em necessidade do mesmo.
11. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que dito câncer é selecionado de câncer pulmonar, linfoma não Hodgkin, câncer ovariano, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer pancreático, e mieloma múltiplo.
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