BR112012013205B1 - mutante de uma cepa parental de trichoderma reesei, e, métodos para produzir um polipeptídeo de interesse e para obter um mutante de uma cepa parental de trichoderma - Google Patents

Abstract

MUTANTE DE UMA CEPA DE TRICHODERMA PARENTAL, E, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO E PARA OBTER UMA MUTANTE DE UMA CEPA DE TRICHODERMA PARENTAL. A presente invenção refere- se aos mutantes de uma cepa de Trichoderma parental, compreendendo um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo e um ou mais (vários) genes selecionados do grupo consistindo de um primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina, um primeiro gene de protease aspártica, uma gene de serina protease semelhante à tripsina, um segundo gene de serina protease semelhante à subtilisina, e um segundo gene de protease aspártica, sendo que os um ou mais (vários) genes são modificados tornando a cepa mutante deficiente na produção de uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo de uma primeira serina protease semelhante à subtilisina, uma primeira protease aspártica, uma serina protease semelhante à tripsina, uma segunda serina protease semelhante à subtilisina, e uma segunda protease aspártica, respectivamente, comparada com a cepa de Trichoderma parental quando cultivada sob condições idênticas. A presente invenção também se refere aos métodos de produzir um polipeptídeo em tais mutantes e aos métodos de produzir tais mutantes.

Description

Referência à Listagem de Sequências

[0001] Este pedido contém uma Listagem de Sequências na forma legível por computador, que é aqui incorporada como referência.

Fundamentos da Invenção Campo da Invenção

[0002] A presente invenção refere-se aos métodos de produzir polipeptídeos em cepas mutantes de Trichoderma deficientes em protease, às cepas mutantes de Trichoderma deficientes em protease, e aos métodos de obter as cepas mutantes de Trichoderma deficientes em protease.

Descrição da Arte Relacionada

[0003] Tem sido demonstrado que Trichoderma é útil como uma célula hospedeira para a produção recombinante de polipeptídeos tendo atividade biológica (WO 96/00787, WO 97/26330). Hospedeiros Trichoderma com as feições desejáveis de expressão e secreção de proteína aumentadas necessariamente podem não ter as características mais desejáveis para fermentação bem sucedida. A fermentação pode não ser ótima por causa da produção de substâncias biológicas, por exemplo, enzimas, prejudiciais para a produção, recuperação, ou aplicação de um polipeptídeo específico de interesse.

[0004] Martinez et al., 2008, Nature Biotechnology 26:553-560, descrevem o sequenciamento e a análise de genoma do fungo degradador de biomassa Trichoderma reesei. Dienes et al., 2007, Enzyme and Microbial Technology 40: 1087-1094, revelam a identificação de uma serina protease semelhante à tripsina de Trichoderma reesei QM9414. Eneyskaya et al., 1999, Appl. Microbiol. Biotechnol. 52: 226-231, descrevem uma protease ácida de Trichoderma reesei. Haub et al., 1990, J. Biotechnology 16: 187- 198, revelam a formação de proteases extracelulares de Trichoderma reesei QM9414. Hagspiel et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 61-67, revelam a atividade de protease e a modificação proteolitica de celulases de uma Trichoderma reesei QM9414 seletora. WO 2006/073839 revela proteases ácidas fúngicas.

[0005] WO 2007/045248 descreve o uso de mutantes fúngicas para expressão de polipeptídeos heterólogos.

[0006] A presente invenção refere-se aos hospedeiros Trichoderma aperfeiçoados que combinam a capacidade para expressão de quantidades comerciais de um polipeptídeo de interesse simultaneamente sendo eficientes na produção de protease(s) que podem complicar a recuperação e o processamento posterior do polipeptídeo.

Sumário da Invenção

[0007] A presente invenção refere-se aos mutantes de uma cepa de Trichoderma parental, compreendendo um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo e um ou mais (vários) genes selecionados do grupo consistindo de um primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina, um primeiro gene de protease aspártica, um gene de serina protease semelhante à tripsina, um segundo gene de serina protease semelhante à subtilisina, e um segundo gene de protease aspártica, sendo que os um ou mais (vários) genes são modificados tornando a cepa mutante deficiente na produção de uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo de uma primeira serina protease semelhante à subtilisina, uma primeira protease aspártica, uma serina protease semelhante à tripsina, uma segunda serina protease semelhante à subtilisina, e uma segunda protease aspártica, respectivamente, comparada com a cepa de Trichoderma parental quando cultivada sob condições idênticas.

[0008] A presente invenção também se refere aos métodos de produzir um polipeptídeo, compreendendo: (a) cultivar um mutante de uma cepa de Trichoderma parental em um meio para a produção do polipeptídeo, sendo que a cepa mutante compreende um polinucleotídeo codificador do polipeptídeo e um ou mais (vários) genes selecionados do grupo consistindo de um primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina, um primeiro gene de protease aspártica, um gene de serina protease semelhante à tripsina, um segundo gene de serina protease semelhante à subtilisina, e um segundo gene de protease aspártica, sendo que os um ou mais (vários) genes são modificados tornando a cepa mutante deficiente na produção de uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo de uma primeira serina protease semelhante à subtilisina, uma primeira protease aspártica, uma serina protease semelhante à tripsina, uma segunda serina protease semelhante à subtilisina, e uma segunda protease aspártica, respectivamente, comparada com a cepa de Trichoderma parental quando cultivada sob condições idênticas; e (b) recuperar o polipeptídeo do meio de cultivo.

[0009] A presente invenção adicionalmente se refere aos métodos de obter mutantes de uma cepa de Trichoderma parental, compreendendo: (a) modificar um ou mais (vários) genes selecionados do grupo consistindo de um primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina, um primeiro gene de protease aspártica, um gene de serina protease semelhante à tripsina, um segundo gene de serina protease semelhante à subtilisina, e um segundo gene de protease aspártica; e (b) identificar uma cepa mutante da etapa(a) sendo que os um ou mais (vários) genes selecionados do grupo consistindo de um primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina, um primeiro gene de protease aspártica, um gene de serina protease semelhante à tripsina, um segundo gene de serina protease semelhante à subtilisina, e um segundo gene de protease aspártica são modificados tornando a cepa mutante deficiente na produção de uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo de uma primeira serina protease semelhante à subtilisina, uma primeira protease aspártica, uma serina protease semelhante à tripsina, uma segunda serina protease semelhante à subtilisina, e uma segunda protease aspártica, respectivamente, comparada com a cepa de Trichoderma parental quando cultivada sob condições idênticas. Descrição Breve das Figuras Figura 1 mostra um mapa de restrição de pDM156.2. Figura 2 mostra um mapa de restrição de pEmY21. Figura 3 mostra um mapa de restrição de pEmY23. Figura 4 mostra um mapa de restrição de pWTY1470-19-07. Figura 5 mostra um mapa de restrição de pWTY 1515-2-01. Figura 6 mostra um mapa de restrição de pJaL504-[Bαm Hl], Figura 7 mostra um mapa de restrição de pJaL504-[BgZ II], Figura 8 mostra um mapa de restrição de pJaL574. Figura 9 mostra um mapa de restrição de pWTY1449-02-01. Figura 10 mostra um mapa de restrição de pJfyS 1540-75-5. Figura 11 mostra um mapa de restrição de pJfyS 1579-1-13. Figura 12 mostra um mapa de restrição de pJfyS 1579-8-6. Figura 13 mostra um mapa de restrição de pJfyS 1579-21-16. Figura 14 mostra um mapa de restrição de pAILo 1492-24. Figura 15 mostra um mapa de restrição de pJfyS 1579-35-2. Figura 16 mostra um mapa de restrição de pJfyS1579-41-ll. Figura 17 mostra um mapa de restrição de pDAtwl8. Figura 18 mostra um mapa de restrição de pSaMc-AaXYL. Figura 19 mostra um mapa de restrição de pAgJgl 11. Figura 20 mostra um mapa de restrição de pAgJgl 16. Figura 21 mostra um mapa de restrição de pAgJgl 15. Figura 22 mostra um mapa de restrição de pAgJgl 17. Figura 23 mostra um mapa de restrição de pAgJgl 18. Figura 24 mostra atividade de celulase residual a 40°C por duas semanas de caldos de Trichoderma reesei AgJgll7-3-10A e Trichoderma reesei AgJgll8-02-2E comparados com o caldo da cepa parental sob as mesmas condições. Figura 25 mostra um mapa de restrição de pJfyS152. Figura 26 mostra um mapa de restrição de pJfyS153.

Definições

[0010] Serina protease semelhante à subtilisina: O termo “serina protease semelhante à subtilisina” significa uma protease com uma especificidade por substrato similar à de subtilisina que usa um resíduo de serina para catalisar a hidrólise de ligações peptídicas em peptídeos e proteínas. Proteases similares à subtilisina (subtilases) são serina proteases caracterizadas por uma tríade catalítica dos três aminoácidos aspartato, histidina, e serina. O arranjo destes três resíduos catalíticos é compartilhado com a subtilisina prototípica de Bacillus licheniformis (Siezen e Leunissen, 1997, Protein Science 6: 501-523). Para os propósitos da presente invenção, atividade de serina protease semelhante à subtilisina é determinada de acordo com o procedimento descrito em Exemplo 13.

[0011] Protease aspártica: O termo “protease aspártica” significa uma protease que usa um resíduo(s) de aspartato para catalisar a hidrólise de ligações peptídicas utilizam um resíduo de aspartato para catalisar a hidrólise de ligações peptídicas em peptídeos e proteínas. Proteases aspárticas são uma família de enzimas protease que usam um resíduo de aspartato para catálise de seus substratos de peptídeo. Em geral, têm dois aspartatos elevadamente conservados no sítio ativo e são otimamente ativas em pH ácido (Szecsi, 1992, Scand. J. Clin. Lab. In vest. Suppl. 210: 5-22). Para os propósitos da presente invenção, atividade de protease aspártica é determinada de acordo com o procedimento descrito por Aikawa et al., 2001, J. Biochem. 129: 791- 794.

[0012] Serina protease semelhante à tripsina: O termo “serina protease semelhante à tripsina” significa uma protease com uma especificidade por substrato similar à de tripsina que usa um resíduo de serina para catalisar a hidrólise de ligações peptídicas em peptídeos e proteínas. Para os propósitos da presente invenção, atividade de serina protease semelhante à tripsina é determinada de acordo com o procedimento descrito por Dienes et al., 2007, supra, ou Exemplo 20.

[0013] Deficiente: O termo “deficiente” significa uma cepa mutante de Trichoderma que produz no nenhuma atividade detectável de uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo de uma primeira serina protease semelhante à subtilisina, uma primeira protease aspártica, uma serina protease semelhante à tripsina, e uma segunda protease aspártica comparada com a cepa de Trichoderma parental quando cultivada sob condições idênticas, ou, alternativamente, produz preferivelmente pelo menos 25% menos, mais preferivelmente pelo menos 50% menos, ainda mais preferivelmente pelo menos 75% menos, e muito mais preferivelmente pelo menos 95% menos de uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo de uma primeira serina protease semelhante à subtilisina, uma primeira protease aspártica, uma serina protease semelhante à tripsina, uma segunda serina protease semelhante à subtilisina, e uma segunda protease aspártica do que a cepa de Trichoderma parental quando cultivada sob condições idênticas. O nível de protease produzido por uma cepa mutante de Trichoderma da presente invenção pode ser determinado usando métodos aqui descritos ou conhecidos na arte.

[0014] Isolado ou purificado: O termo “isolado” ou “purificado” significa um polipeptídeo ou polinucleotídeo que é removido de pelo menos um componente com o qual está naturalmente associado. Por exemplo, um polipeptídeo pode ser pelo menos 1% puro, por exemplo, pelo menos 5% puro, pelo menos 10% puro, pelo menos 20% puro, pelo menos 40% puro, pelo menos 60% puro, pelo menos 80% puro, pelo menos 90% puro, ou pelo menos 95% puro, como determinado por SDS-PAGE, e um polinucleotídeo pode ser pelo menos 1% puro, por exemplo, pelo menos 5% puro, pelo menos 10% puro, pelo menos 20% puro, pelo menos 40% puro, pelo menos 60% puro, pelo menos 80% puro, pelo menos 90% puro, ou pelo menos 95% puro, conforme determinado por eletroforese em agarose.

[0015] Polipeptídeo maduro: O termo “polipeptídeo maduro” significa um polipeptídeo em sua forma final após a tradução e quaisquer suas modificações após a tradução, tais como processamento N-terminal, truncamento C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro é de aminoácidos 20 a 882 de SEQ ID NO: 2 baseado no programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6) que prediz que aminoácidos 1 a 19 de SEQ ID NO: 2 são um peptídeo de sinal. Em outro aspecto, o polipeptídeo maduro é de aminoácidos 21 a 407 de SEQ ID NO: 4 baseado no programa SignalP que prediz que aminoácidos 1 a 20 de SEQ ID NO: 4 são um peptídeo de sinal. Em outro aspecto, o polipeptídeo maduro é de aminoácidos 20 a 259 de SEQ ID NO: 6 baseado no programa SignalP que prediz que aminoácidos 1 a 19 de SEQ ID NO: 6 são um peptídeo de sinal. Em outro aspecto, o polipeptídeo maduro é de aminoácidos 16 a 540 de SEQ ID NO: 100 baseado no programa SignalP que prediz que aminoácidos 1 a 15 de SEQ ID NO: 100 são um peptídeo de sinal. Em outro aspecto, o polipeptídeo maduro é de aminoácidos 18 to 395 de SEQ ID NO: 108 baseado no programa SignalP que prediz que aminoácidos 1 a 17 de SEQ ID NO: 108 são um peptídeo de sinal.

[0016] Sequência codificadora de polipeptídeo: O termo “sequência codificadora de polipeptídeo maduro” significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro tendo atividade de enzima. Em um aspecto, a sequência codificadora de polipeptídeo maduro é de nucleotídeos 58 a 2774 de SEQ ID NO: 1 baseado no programa SignalP (Nielsen et al., 1997, supra) que prediz que nucleotídeos 1 a 57 de SEQ ID NO: 3 codificam um peptideo de sinal. Em outro aspecto, a sequência codificadora de polipeptídeo maduro é de nucleotídeos 61 a 1299 de SEQ ID NO: 3 baseado no programa SignalP que prediz que nucleotídeos 1 a 60 de SEQ ID NO: 1 codificam um peptídeo de sinal. Em outro aspecto, a sequência codificadora de polipeptídeo maduro é de nucleotídeos 58 a 930 de SEQ ID NO: 5 baseado no programa SignalP que prediz que nucleotídeos 1 a 57 de SEQ ID NO: 5 codificam um peptídeo de sinal. Em outro aspecto, a sequência codificadora de polipeptídeo maduro é de nucleotídeos 46 a 1681 de SEQ ID NO: 99 baseado no programa SignalP que prediz que nucleotídeos 1 a 45 de SEQ ID NO: 99 codificam um peptídeo de sinal. Em outro aspecto, a sequência codificadora de polipeptídeo maduro é de nucleotídeos 52 a 1339 de SEQ ID NO: 107 baseado no programa SignalP que prediz que nucleotídeos 1 a 51 de SEQ ID NO: 107 codificam um peptídeo de sinal.

[0017] Identidade: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro “identidade”.

[0018] Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidade entre duas sequências de aminoácidos é determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) conforme implementado pelo programa Needle do pacote EMBOSS (“EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite”, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276-277), preferivelmente versão 3.0.0 ou superior. Os parâmetros ótimos usados são penalidade de abertura de lacuna de 10, penalidade de extensão de lacuna de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (EMBOSS versão de BLOSUM62). A informação de Needle chamada de “identidade mais longa” (obtida usando a opção -nobrief ) é usada como a identidade percentual e é calculada como segue: (Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento de Alinhamento - Número Total de Lacunas em Alinhamento)

[0019] Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidade entre duas sequências de desoxirrobonucleotídeos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch(Needleman e Wunsch, 1970, supra) conforme implementado pelo programa Needle do pacote EMBOSS (“EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite”, Rice et al., 2000, supra), preferivelmente versão 3.0.0 ou superior. Os parâmetros ótimos usados são penalidade de abertura de lacuna de 10, penalidade de extensão de lacuna de 0.5, a matriz de substituição EDNAFULL (EMBOSS versão de NCBI NUC4.4). A informação de Needle chamada de “identidade mais longa” (obtida usando a opção -nobrief) é usada como a identidade percentual e é calculada como segue: (Desoxirribonucleotídeos Idênticos x 100)/(Comprimento de Alinhamento - Número Total de Lacunas em Alinhamento)

[0020] Fragmento de polipeptídeo: O termo “fragmento de polipeptídeo” significa um polipeptídeo tendo um ou mais (vários) aminoácidos deletados da terminação amino e/ou carboxila de um polipeptídeo maduro, sendo que o fragmento tem atividade de enzima, por exemplo, atividade de serina protease semelhante à subtilisina, protease aspártica, ou serina protease. Em um aspecto, um fragmento contém pelo menos 740 resíduos de aminoácidos, por exemplo, pelo menos 780 resíduos de aminoácidos ou pelo menos 820 resíduos de aminoácidos do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou uma sua sequência homóloga. Em outro aspecto, um fragmento contém pelo menos 320 resíduos de aminoácidos, por exemplo, pelo menos 340 resíduos de aminoácidos ou pelo menos 360 resíduos de aminoácidos do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4 ou uma sua sequência homóloga. Em outro aspecto, um fragmento contém pelo menos 210 resíduos de aminoácidos, por exemplo, pelo menos 220 resíduos de aminoácidos ou pelo menos 230 resíduos de aminoácidos do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6 ou uma sua sequência homóloga. Em outro aspecto, um fragmento contém pelo menos 460 resíduos de aminoácidos, por exemplo, pelo menos 480 resíduos de aminoácidos ou pelo menos 500 resíduos de aminoácidos do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 100 ou uma sua sequência homóloga. Em outro aspecto, um fragmento contém pelo menos 320 resíduos de aminoácidos, por exemplo, pelo menos 340 resíduos de aminoácidos ou pelo menos 360 resíduos de aminoácidos do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 108 ou uma sua sequência homóloga.

[0021] Subsequência: O termo “subsequência” significa uma sequência de nucleotídeos tendo um ou mais (vários) nucleotídeos deletados da extremidade 5’ e/ou 3’ de uma sequência codificadora de polipeptídeo maduro, sendo que a subsequência codifica um fragmento de um polipeptídeo tendo atividade de enzima, por exemplo, serina protease semelhante à subtilisina, protease aspártica, ou serina protease. Em um aspecto, a subsequência contém pelo menos 2220 nucleotídeos, por exemplo, pelo menos 2340 nucleotídeos ou pelo menos 2460 nucleotídeos da sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou a sequencia de cDNA do mesmo, ou uma sua sequência homóloga. Em outro aspecto, a subsequência contém pelo menos 960 nucleotídeos, por exemplo, pelo menos 1020 nucleotídeos ou pelo menos 1080 nucleotídeos da sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 ou de sua sequência de cDNA, ou uma sua sequência homóloga. Em outro aspecto, a subsequência contém pelo menos 630 nucleotídeos, por exemplo, pelo menos 660 nucleotídeos ou pelo menos 690 nucleotídeos da sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5 ou de sua sequência de cDNA, ou uma sua sequência homóloga. Em outro aspecto, a subsequência contém pelo menos 1380 nucleotídeos, por exemplo, pelo menos 1440 nucleotídeos ou pelo menos 1500 nucleotídeos da sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 99 ou de sua sequência de cDNA, ou uma sua sequência homóloga. Em outro aspecto, a subsequência contém pelo menos 960 nucleotídeos, por exemplo, pelo menos 1020 nucleotídeos, ou pelo menos 1080 nucleotídeos da sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 107 ou de sua sequência de cDNA, ou uma sua sequência homóloga.

[0022] Variante alélica: O termo “variante alélica” significa quaisquer duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo locus cromossômico. Variações alélicas provêm naturalmente de mutação, e podem resultar em polimorfismo dentro de populações. Mutações de gene podem ser silenciosas (sem mudança no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos tenda sequências de aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.

[0023] Sequência codificadora: O termo “sequência codificadora” significa um polinucleotídeo, que diretamente especifica a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo. Os limites da sequência codificadora são geralmente determinados por uma matriz de leitura aberta, que habitualmente inicia com o códon de iniciação ATG ou códons de iniciação alternativos tais como GTG e TTG e termina com um códon de terminação tais como TAA, TAG, e TGA. A sequência codificadora pode ser um DNA genômico, cDNA, DNA sintético, ou uma sua combinação.

[0024] cDNA: O termo “cDNA” significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa de uma molécula de mRNA, emendada, madura, obtida de uma célula eucariótica. cDNA é faltante de sequências de intron que podem estar presentes no DNA genômico correspondente. O transcrito de RNA primário, inicial é um precursor para mRNA que é processado por intermédio de uma série de etapas, incluindo emenda, antes de surgir como mRNA emendado maduro.

[0025] Construto de ácido nucleico: O termo “construto de ácido nucleico” significa uma molécula de ácido nucleico, de fita quer única quer dupla, que é isolada de um gene naturalmente ocorrente ou está modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos em uma maneira que de outro modo não existiria na natureza ou que é sintética . O termo construto de ácido nucleico é sinônimo do termo “cassete de expressão” quando o construto de ácido nucleico contém as sequências de controle exigidas para expressão de uma sequência codificadora.

[0026] Sequências de controle: O termo “sequências de controle” significa todos os componentes necessários para a expressão de um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo. Cada sequência de controle pode ser nativa ou estranha ao polinucleotídeo codificador do polipeptídeo ou nativa ou estranha uma em relação à outra. Tais sequências de controle incluem, mas não são limitadas a, uma sequência líder, sequência de poliadenilação, um promotor, uma sequência de peptídeo de sinal, e um terminador de transcrição. No mínimo, as sequências de controle incluem um promotor, e sinais de terminação de transcrição e de tradução. As sequências de controle podem estar munidas com ligadores para o propósito de introduzir sítios de restrição específicos facilitando a ligação das sequências de controle com a região codificadora do polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo.

[0027] Operacionalmente ligado: O termo “operacionalmente ligado” significa uma configuração na qual uma sequência de controle é posta em uma posição apropriada relativa à sequência codificadora de um polinucleotídeo de tal modo que a sequência de controle dirija a expressão da sequência codificadora.

[0028] Expressão: O termo “expressão” inclui qualquer etapa envolvida na produção de um polipeptídeo incluindo, mas não limitada a, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação de pós-tradução, e secreção.

[0029] Vetor de expressão: O termo “vetor de expressão” significa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo e está operacionalmente ligada em nucleotídeos adicionais que proporcionam sua expressão.

[0030] Célula hospedeira: O termo “célula hospedeira” significa qualquer célula que é suscetível as transformação, transfecção, transdução, e semelhantes com um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo. O termo “célula hospedeira” inclui qualquer progénie de uma célula parental que não é idêntica à célula parental devido às mutações que ocorrem durante a replicação.

[0031] Modificação: O termo “modificação” significa introdução, substituição, ou remoção de um ou mais (vários) nucleotídeos em um gene ou uma sequência de controle exigida para a sua transcrição ou tradução, ou disrrupção de gene, conversão de gene, deleção de gene, ou mutagênese específica ou aleatória de um gene, por exemplo, um primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina, um primeiro gene de protease aspártica, um gene de serina protease semelhante à tripsina, um segundo gene de serina protease semelhante à subtilisina, um segundo gene de protease aspártica, ou uma sua combinação. A deleção de um ou mais (vários) de o primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina, o primeiro gene da protease aspártica, o gene de serina protease semelhante à tripsina, o segundo gene da serina protease semelhante à subtilisina, e/ou o segundo gene da protease aspártica pode ser parcial ou completa. A modificação resulta em um decréscimo em ou eliminação (inativação) de expressão de a primeira serina protease semelhante à subtilisina, a primeira protease aspártica, a serina protease semelhante à tripsina, a segunda serina protease semelhante à subtilisina, a segunda protease aspártica, ou uma sua combinação. Em um aspecto preferido, um ou mais (vários) de o primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina, o primeiro gene da protease aspártica, o gene de serina protease semelhante à tripsina, o segundo gene da serina protease semelhante à subtilisina, e o segundo gene da protease aspártica estão inativados.

Descrição Detalhada de Invenção

[0032] A presente invenção refere-se aos mutantes de uma cepa de Trichoderma parental, compreendendo um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo e um ou mais (vários) genes selecionados do grupo consistindo de um primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina, um primeiro gene de protease aspártica, um gene de serina protease semelhante à tripsina, um segundo gene de serina protease semelhante à subtilisina, e um segundo gene de protease aspártica, sendo que os um ou mais (vários) genes são modificados tornando a cepa mutante deficiente na produção de uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo de uma primeira serina protease semelhante à subtilisina, uma primeira protease aspártica, uma serina protease semelhante à tripsina, uma segunda serina protease semelhante à subtilisina, e uma segunda protease aspártica, respectivamente, comparada com a cepa de Trichoderma parental quando cultivada sob condições idênticas.

[0033] A presente invenção também se refere aos métodos de produzir um polipeptídeo, compreendendo: (a) cultivar um mutante de uma cepa de Trichoderma parental em um meio para a produção do polipeptídeo, sendo que a cepa mutante compreende um polinucleotídeo codificador do polipeptídeo e um ou mais (vários) genes selecionados do grupo consistindo de um primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina, um primeiro gene de protease aspártica, um gene de serina protease semelhante à tripsina, um segundo gene de serina protease semelhante à subtilisina, e um segundo gene de protease aspártica, sendo que os um ou mais (vários) genes são modificados tornando a cepa mutante deficiente na produção de uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo de uma primeira serina protease semelhante à subtilisina, uma primeira protease aspártica, uma serina protease semelhante à tripsina, uma segunda serina protease semelhante à subtilisina, e uma segunda protease aspártica, respectivamente, comparada com a cepa de Trichoderma parental quando cultivada sob condições idênticas; e (b) recuperar o polipeptídeo do meio de cultivo.

[0034] A presente invenção adicionalmente se refere aos métodos de obter mutantes de uma cepa de Trichoderma parental, compreendendo: (a) modificar um ou mais (vários) genes selecionados do grupo consistindo de um primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina, um primeiro gene de protease aspártica, um gene de serina protease semelhante à tripsina, um segundo gene de serina protease semelhante à subtilisina, e um segundo gene de protease aspártica; e (b) identificar uma cepa mutante da etapa(a) sendo que os um ou mais (vários) genes são modificados tornando a cepa mutante deficiente na produção de uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo de uma primeira serina protease semelhante à subtilisina, uma primeira protease aspártica, uma serina protease semelhante à tripsina, uma segunda serina protease semelhante à subtilisina, e uma segunda protease aspártica, respectivamente, comparada com a cepa de Trichoderma parental quando cultivada sob condições idênticas.

[0035] Uma vantagem da presente invenção é a eliminação ou redução de uma ou mais (várias) atividades de enzima, que podem ser prejudiciais para a produção, o processamento posterior, por exemplo, recuperação, e/ou aplicação de um polipeptídeo específico de interesse.

[0036] Nos métodos da presente invenção, a cepa de Trichoderma parental pode ser qualquer cepa de Trichoderma tal como uma cepa de Trichoderma de tipo selvagem ou um seu mutante, a cepa de Trichoderma parenta pode ser Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride', ou a sua forma sexual alternativa, i.e., Hypocrea.

[0037] Em outro aspecto, a cepa de Trichoderma parental é Trichoderma harzianum. Em outro aspecto, a cepa de Trichoderma parental é Trichoderma koningii. Em outro aspecto, a cepa de Trichoderma parental é Trichoderma longibrachiatum. Em outro aspecto, a cepa de Trichoderma parental é Trichoderma reesei. Em outro aspecto, a cepa de Trichoderma parental é Trichoderma viride.

[0038] Em outro aspecto, a cepa de Trichoderma reesei parental é Trichoderma reesei RutC30. Em outro aspecto, a cepa de Trichoderma reesei parental é Trichoderma reesei TV10. Em outro aspecto, a cepa de Trichoderma reesei parental é um mutante de Trichoderma reesei. Em outro aspecto, a cepa de Trichoderma reesei parental é um mutante morfológico de Trichoderma reesei (veja WO 97/26330).

[0039] A cepa mutante de Trichoderma deficiente em protease pode ser construída por redução ou eliminação de um ou mais (vários) genes selecionados do grupo consistindo de um primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina, um primeiro gene de protease aspártica, um gene de serina protease semelhante à tripsina, um segundo gene de serina protease semelhante à subtilisina, e um segundo gene de protease aspártica usando métodos bem conhecidos na arte, tais como inserções, disrupções, substituições, ou deleções. Uma porção do gene pode ser modificada tal como a região codificadora ou uma sequência de controle exigida para a expressão da região codificadora. Uma tal sequência de controle do gene pode ser uma sequência de promotor ou uma sua parte funcional, i.e., uma parte que é suficiente para afetar a expressão do gene. Por exemplo, uma sequência de promotor pode ser inativada resultando em não expressão ou em um promotor mais fraco pode substituir a sequência de promotor nativa para reduzir a sequência codificadora. Outras sequências de controle para modificação possível incluem, mas não são limitadas a, uma sequência líder, uma sequência de propeptídeo, uma sequência de sinal, um terminador de transcrição, e um ativador de transcrição.

[0040] As cepas mutantes de Trichoderma podem ser construídas por técnicas de deleção de gene para eliminar ou reduzir expressão do gene. Técnicas de deleção de gene permitem a remoção parcial ou completa do gene eliminando deste modo sua expressão. Em tais métodos, deleção do gene é realizada por recombinação homóloga usando um plasmídeo que tem sido construído para contiguamente conter as regiões 5’ e 3’ flanqueando o gene.

[0041] As cepas mutantes de Trichoderma também podem ser construídas por introdução, substituição, e/ou remoção de um ou mais (vários) nucleotídeos no gene ou numa sua sequência de controle exigido(a) para a sua transcrição ou tradução. Por exemplo, nucleotídeos podem ser inseridos ou removidos para a introdução de um códon de terminação, a remoção do códon de iniciação, ou um deslocamento de matriz da matriz de leitura aberta. Uma tal modificação pode ser realizada por mutagênese sítio-direcionada ou mutagênese gerada por PCR de acordo com métodos conhecidos na arte. Veja, por exemplo, Botstein e Shortle, 1985, Science 229: 4719; Lo et al., 1985, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 2285; Higuchi et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 7351; Shimada, 1996, Meth. Mol. Biol. 57: 157; Ho et al., 1989, Gene 77: 61; Horton et al., 1989, Gene 77: 61; e Sarkar e Sommer, 1990, BioTechniques 8: 404.

[0042] As cepas mutantes de Trichoderma também podem ser construídas por técnicas de disrupção de gene pela inserção no gene de um construto de ácido nucleico disruptive compreendendo um fragmento de ácido nucleico homólogo ao gene que produzirá uma duplicação da região de homologia e incorporará construto de DNA entre as regiões duplicadas. Uma tal disrupção de gene pode eliminar a expressão de gene se o construto inserido separa o promotor do gene da região codificadora ou interrompe a sequência codificadora de tal modo que resulte um produto de gene não funcional. Um construto de disrupção pode ser simplesmente um gene marcador selecionável acompanhado pelas regiões 5’ e 3’ homólogas ao gene. O marcador selecionável permite a identificação de transformantes contendo o gene interrompido.

[0043] As cepas mutantes de Trichoderma também podem ser construídas pelo processo de conversão de gene (veja, por exemplo, Iglesias e Trautner, 1983, Molecular General Genetics 189: 73-76). Por exemplo, no método de conversão de gene, uma sequência de nucleotídeos correspondendo ao gene é mutada in vitro para produzir uma sequência de nucleotídeos defectiva, que é então transformada na cepa de Trichoderma parental para produzir um gene defective. Por recombinação homóloga, a sequência de nucleotídeos defectiva substitui o gene endógeno. Pode ser desejável que a sequência de nucleotídeos defectiva também compreenda um marcador para seleção de transformantes contendo o gene defective.

[0044] As cepas mutantes de Trichoderma também podem ser construídas por técnicas de antissenso estabelecidas usando uma sequência de nucleotídeos complementar à sequência de nucleotídeos do gene (Parish e Stoker, 1997, FEMS Microbiology Letters 154: 151-157). Mais especificamente, expressão do gene por uma cepa de Trichoderma pode ser reduzida ou inativada pela introdução de uma sequência de nucleotídeos complementar à sequência de nucleotídeos do gene, que pode ser transcrita na cepa e é capaz de hibridizar com o mRNA produzido na cepa. Sob condições que permitem que a sequência de nucleotídeos de antissenso complementar hibridize com o mRNA, a quantidade de proteína traduzida é por conseguinte reduzida ou eliminada.

[0045] As cepas mutantes de Trichoderma também podem ser construídas por técnicas de interferência de RNA (RNAi) estabelecidas (veja, por exemplo, WO 2005/056772 e WO 2008/080017).

[0046] As cepas mutantes de Trichoderma podem ser adicionalmente construídas por mutagênese aleatória ou específica usando métodos bem conhecidos na arte, incluindo, mas não limitados a, mutagênese química (veja, por exemplo, Hopwood, The Isolation of Mutants in Methods in Microbiology (J.R. Norris e D.W. Ribbons, eds.) pp. 363-433, Academic Press, New York, 1970). Modificação do gene pode ser realizada pela sujeição da cepa parental à mutagênese e à triagem para cepas mutantes nas quais a expressão do gene tem sido reduzida ou inativada. A mutagênese, que pode ser específica ou aleatória, pode ser conduzida, por exemplo, pelo uso de um agente mutagênico físico ou químico, pela utilização de um oligonucleotídeo adequado, ou pela sujeição da sequência de DNA à mutagênese gerada por PCR. Ademais, a mutagênese pode ser realizada pelo uso de qualquer combinação destes métodos de mutagênese.

[0047] Exemplos de um agente mutagênico físico ou químico adequado para o presente propósito incluem irradiação ultravioleta (UV), hidroxil- amina, N-metil-N’-nitro-N- nitroso-guanidina (MNNG), N-metil-N’-nitroso- guanidina (NTG), O-metil-hydroxil-amina, ácido nitroso, etil metano sulfonato (EMS), bissulfito de sódio, ácido fórmico, e análogos de nucleotídeo. Quando tais agentes são usados, a mutagênese é tipicamente realizada por incubação da cepa parental a ser mutada na presença do agente mutagênico escolhido sob condições apropriadas, e pela seleção de mutantes exibindo expressão do gene nula ou reduzida.

[0048] Em um aspecto, a modificação resulta na inativação de um ou mais (vários) genes selecionados do grupo consistindo de um primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina, um primeiro gene de protease aspártica, um gene de serina protease semelhante à tripsina, um segundo gene de serina protease semelhante à subtilisina, e um segundo gene de protease aspártica. Em outro aspecto, a modificação resulta em um decréscimo em expressão de um ou mais (vários) genes selecionados do grupo consistindo de um primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina, um primeiro gene de protease aspártica, um gene de serina protease semelhante à tripsina, um segundo gene de serina protease semelhante à subtilisina, e um segundo gene de protease aspártica. Em outro aspecto, a modificação resulta em expressão de um ou mais (vários) genes selecionados do grupo consistindo de um primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina, um primeiro gene de protease aspártica, um gene de serina protease semelhante à tripsina, um segundo gene de serina protease semelhante à subtilisina, e um segundo gene de protease aspártica sendo decrescida, inativada, ou uma sua combinação.

[0049] Em outro aspecto, o mutante compreende uma modificação de um primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina. Em outro aspecto, o mutante compreende uma modificação de um primeiro gene de protease aspártica. Em outro aspecto, o mutante compreende uma modificação de um gene de serina protease semelhante à tripsina. Em outro aspecto, o mutante compreende uma modificação de um segundo gene de serina protease semelhante à subtilisina. Em outro aspecto, o mutante compreende uma modificação de um segundo gene de protease aspártica.

[0050] Em outro aspecto, o mutante compreende uma modificação de um primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina e um primeiro gene de protease aspártica. Em outro aspecto, o mutante compreende uma modificação de um primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina e um gene de serina protease semelhante à tripsina. Em outro aspecto, o mutante compreende uma modificação de um primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina e um segundo gene de serina protease semelhante à subtilisina. Em outro aspecto, o mutante compreende uma modificação de um primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina e um segundo gene de protease aspártica. Em outro aspecto, o mutante compreende uma modificação de um primeiro gene de protease aspártica e um gene de serina protease semelhante à tripsina. Em outro aspecto, o mutante compreende uma modificação de um primeiro gene de protease aspártica e um segundo gene de serina protease semelhante à subtilisina. Em outro aspecto, o mutante compreende uma modificação de um primeiro gene de protease aspártica e um segundo gene de protease aspártica. Em outro aspecto, o mutante compreende uma modificação de um gene de serina protease semelhante à tripsina e um segundo gene de serina protease semelhante à subtilisina. Em outro aspecto, o mutante compreende uma modificação de um gene de serina protease semelhante à tripsina e um segundo gene de protease aspártica. Em outro aspecto, o mutante compreende uma modificação de um segundo gene de serina protease semelhante à subtilisina e um segundo gene de protease aspártica.

[0051] Em outro aspecto, o mutante compreende uma modificação de um primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina, um primeiro gene de protease aspártica, e um gene de serina protease semelhante à tripsina. Em outro aspecto, o mutante compreende uma modificação de um primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina, um gene de serina protease semelhante à tripsina, e um segundo gene de serina protease semelhante à subtilisina. Em outro aspecto, o mutante compreende uma modificação de um primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina, um segundo gene de serina protease semelhante à subtilisina, e um segundo gene de protease aspártica. Em outro aspecto, o mutante compreende uma modificação de um primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina, um primeiro gene de protease aspártica, e um segundo gene de serina protease semelhante à subtilisina. Em outro aspecto, o mutante compreende uma modificação de um primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina, um primeiro gene de protease aspártica, e um segundo gene de protease aspártica. Em outro aspecto, o mutante compreende uma modificação de um primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina, um gene de serina protease semelhante à tripsina, e um segundo gene de protease aspártica. Em outro aspecto, o mutante compreende uma modificação de um primeiro gene de protease aspártica, um gene de serina protease semelhante à tripsina, e um segundo gene de serina protease semelhante à subtilisina. Em outro aspecto, o mutante compreende uma modificação de um primeiro gene de protease aspártica, um segundo gene de serina protease semelhante à subtilisina, e um segundo gene de protease aspártica. Em outro aspecto, o mutante compreende uma modificação de um primeiro gene de protease aspártica, um gene de serina protease semelhante à tripsina, e um segundo gene de protease aspártica. Em outro aspecto, o mutante compreende uma modificação de um gene de serina protease semelhante à tripsina, um segundo gene de serina protease semelhante à subtilisina, e um segundo gene de protease aspártica.

[0052] Em outro aspecto, o mutante compreende uma modificação de um primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina, um primeiro gene de protease aspártica, um gene de serina protease semelhante à tripsina, e um segundo gene de serina protease semelhante à subtilisina. Em outro aspecto, o mutante compreende uma modificação de um primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina, um gene de serina protease semelhante à tripsina, um segundo gene de serina protease semelhante à subtilisina, e um segundo gene de protease aspártica. Em outro aspecto, o mutante compreende uma modificação de um primeiro gene de protease aspártica, um gene de serina protease semelhante à tripsina, um segundo gene de serina protease semelhante à subtilisina, e um segundo gene de protease aspártica. Em outro aspecto, o mutante compreende uma modificação de um primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina, um primeiro gene de protease aspártica, um segundo gene de serina protease semelhante à subtilisina, e um segundo gene de protease aspártica. Em outro aspecto, o mutante compreende uma modificação de um primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina, um primeiro gene de protease aspártica, um gene de serina protease semelhante à tripsina, e um segundo gene de protease aspártica.

[0053] Em outro aspecto, o mutante compreende uma modificação de um primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina, um primeiro gene de protease aspártica, um gene de serina protease semelhante à tripsina, um segundo gene de serina protease semelhante à subtilisina, e um segundo gene de protease aspártica.

[0054] Em um aspecto, o primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina codifica um polipeptídeo tendo atividade de serina protease semelhante à subtilisina compreendendo ou consistindo de uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2 ou o seu polipeptídeo maduro. Em outro aspecto, o primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina codifica um polipeptídeo tendo atividade de serina protease semelhante à subtilisina compreendendo ou consistindo de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, o primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina codifica um polipeptídeo tendo atividade de serina protease semelhante à subtilisina compreendendo ou consistindo do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[0055] Em outro aspecto, o primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina compreende um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo de uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60%, por exemplo, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1 ou a sua sequência codificadora de polipeptídeo maduro. Em outro aspecto, o primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina compreende um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo de SEQ ID NO: 1. Em outro aspecto, o primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina compreende um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo de a sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.

[0056] Em outro aspecto, o primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina compreende um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de estringência muito baixa, condições de estringência baixa, condições de estringência média, condições de estringência média-alta, condições de estringência alta, ou condições de estringência muito alta com (i) SEQ ID NO: 1; (ii) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (iii) a sequência de cDNA de (i) ou (ii), ou (iv) uma fita complementar de comprimento total de (i), (ii), ou (iii).

[0057] Em outro aspecto, a primeira serina protease semelhante à subtilisina compreende ou consiste de uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2 ou o seu polipeptídeo maduro. Em outro aspecto, a primeira serina protease semelhante à subtilisina compreende ou consiste de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, a primeira serina protease semelhante à subtilisina compreende ou consiste do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[0058] Em outro aspecto, a primeira serina protease semelhante à subtilisina é codificada por um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo de uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1 ou o seu cDNA, ou a sua sequência codificadora de polipeptídeo maduro. Em outro aspecto, a primeira serina protease semelhante à subtilisina é codificada por um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo de SEQ ID NO: 1. Em outro aspecto, a primeira serina protease semelhante à subtilisina é codificada por um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo de a sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.

[0059] Em outro aspecto, a primeira serina protease semelhante à subtilisina é codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de estringência muito baixa, condições de estringência baixa, condições de estringência média, condições de estringência média-alta, condições de estringência alta, ou condições de estringência muito alta com (i) SEQ ID NO: 1; (ii) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (iii) a sequência de cDNA de (i) ou (ii), ou (iv) uma fita complementar de comprimento total de (i), (ii), ou (iii).

[0060] Em outro aspecto, o primeiro gene da protease aspártica codifica um polipeptídeo tendo atividade de protease aspártica compreendendo ou consistindo de uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 4 ou o seu polipeptídeo maduro. Em outro aspecto, o primeiro gene da protease aspártica codifica um polipeptídeo tendo atividade de protease aspártica compreendendo ou consistindo de SEQ ID NO: 4. Em outro aspecto, o primeiro gene da protease aspártica codifica um polipeptídeo tendo atividade de protease aspártica compreendendo ou consistindo do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4.

[0061] Em outro aspecto, o primeiro gene da protease aspártica compreende um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo de uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3 ou o seu cDNA, ou a sua sequência codificadora de polipeptídeo maduro. Em outro aspecto, o primeiro gene da protease aspártica compreende ou consiste de SEQ ID NO: 3. Em outro aspecto, o primeiro gene da protease aspártica compreende ou consiste da sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3.

[0062] Em outro aspecto, o primeiro gene da protease aspártica compreende um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de estringência muito baixa, condições de estringência baixa, condições de estringência média, condições de estringência média-alta, condições de estringência alta, ou condições de estringência muito alta com (i) SEQ ID NO: 3; (ii) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, (iii) a sequência de cDNA de (i) ou (ii), ou (iv) uma fita complementar de comprimento total de (i), (ii), ou (iii).

[0063] Em outro aspecto, a primeira protease aspártica compreende ou consiste de uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 4 ou o seu polipeptídeo maduro. Em outro aspecto, a primeira protease aspártica compreende ou consiste de SEQ ID NO: 4. Em outro aspecto, a primeira protease aspártica compreende ou consiste do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4.

[0064] Em outro aspecto, a primeira protease aspártica é codificada por um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo de uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3 ou o seu cDNA, ou a sua sequência codificadora de polipeptídeo maduro. Em outro aspecto, a primeira protease aspártica é codificada por um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo de SEQ ID NO: 3. Em outro aspecto, a primeira protease aspártica é codificada por um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo de a sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3.

[0065] Em outro aspecto, a primeira protease aspártica é codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de estringência muito baixa, condições de estringência baixa, condições de estringência média, condições de estringência média-alta, condições de estringência alta, ou condições de estringência muito alta com (i) SEQ ID NO: 3; (ii) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, (iii) a sequência de cDNA de (i) ou (ii), ou (iv) uma fita complementar de comprimento total de (i), (ii), ou (iii).

[0066] Em outro aspecto, o gene de serina protease semelhante à tripsina codifica um polipeptídeo tendo atividade de serina protease semelhante à tripsina compreendendo ou consistindo de uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 6 ou o seu polipeptídeo maduro. Em outro aspecto, o gene de serina protease semelhante à tripsina codifica um polipeptídeo tendo atividade de serina protease semelhante à tripsina compreendendo ou consistindo de SEQ ID NO: 6. Em outro aspecto, o gene de serina protease semelhante à tripsina codifica um polipeptídeo tendo atividade de serina protease semelhante à tripsina compreendendo ou consistindo do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6.

[0067] Em outro aspecto, o gene de serina protease semelhante à tripsina compreende um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo de uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5 ou o seu cDNA, ou a sua sequência codificadora de polipeptídeo maduro. Em outro aspecto, o gene de serina protease semelhante à tripsina compreende um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo de SEQ ID NO: 5. Em outro aspecto, o gene de serina protease semelhante à tripsina compreende um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo de a sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5.

[0068] Em outro aspecto, o gene de serina protease semelhante à tripsina compreende um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de estringência muito baixa, condições de estringência baixa, condições de estringência média, condições de estringência média-alta, condições de estringência alta, ou condições de estringência muito alta com (i) SEQ ID NO: 5; (ii) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5, (iii) a sequência de cDNA de (i) ou (ii), ou (iv) uma fita complementar de comprimento total de (i), (ii), ou (iii).

[0069] Em outro aspecto, a serina protease semelhante à tripsina compreende ou consiste de uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 6 ou o seu polipeptídeo maduro. Em outro aspecto, a primeira protease aspártica compreende ou consiste de SEQ ID NO: 6. Em outro aspecto, a primeira protease aspártica compreende ou consiste do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6.

[0070] Em outro aspecto, a serina protease semelhante à tripsina é codificada por um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo de uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5 ou o seu cDNA, ou a sua sequência codificadora de polipeptídeo maduro. Em outro aspecto, a serina protease semelhante à tripsina é codificada por um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo de SEQ ID NO: 5. Em outro aspecto, a serina protease semelhante à tripsina é codificada por um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo de a sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5.

[0071] Em outro aspecto, a serina protease semelhante à tripsina é codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de estringência muito baixa, condições de estringência baixa, condições de estringência média, condições de estringência média-alta, condições de estringência alta, ou condições de estringência muito alta com (i) SEQ ID NO: 5; (ii) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5, (iii) a sequência de cDNA de (i) ou (ii), ou (iv) uma fita complementar de comprimento total de (i), (ii), ou (iii).

[0072] Em outro aspecto, o segundo gene da serina protease semelhante à subtilisina codifica um polipeptídeo tendo atividade de serina protease semelhante à subtilisina compreendendo ou consistindo de uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 100 ou o seu polipeptídeo maduro. Em outro aspecto, o segundo gene da serina protease semelhante à subtilisina codifica um polipeptídeo tendo atividade de serina protease semelhante à subtilisina compreendendo ou consistindo de SEQ ID NO: 100. Em outro aspecto, o segundo gene da serina protease semelhante à subtilisina codifica um polipeptídeo tendo atividade de serina protease semelhante à subtilisina compreendendo ou consistindo do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 100.

[0073] Em outro aspecto, o segundo gene da serina protease semelhante à subtilisina compreende um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo de uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 99 ou o seu cDNA, ou a sua sequência codificadora de polipeptídeo maduro. Em outro aspecto, o segundo gene da serina protease semelhante à subtilisina compreende ou consiste de SEQ ID NO: 99. Em outro aspecto, o segundo gene da serina protease semelhante à subtilisina compreende ou consiste da sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 99.

[0074] Em outro aspecto, o segundo gene da serina protease semelhante à subtilisina compreende um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de estringência muito baixa, condições de estringência baixa, condições de estringência média, condições de estringência média-alta, condições de estringência alta, ou condições de estringência muito alta com (i) SEQ ID NO: 99; (ii) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 99, (iii) a sequência de cDNA de (i) ou (ii), ou (iv) uma fita complementar de comprimento total de (i), (ii), ou (iii).

[0075] Em outro aspecto, a segunda serina protease semelhante à subtilisina compreende ou consiste de uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 100 ou o seu polipeptídeo maduro. Em outro aspecto, a segunda serina protease semelhante à subtilisina compreende ou consiste de SEQ ID NO: 100. Em outro aspecto, a segunda serina protease semelhante à subtilisina compreende ou consiste do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 100.

[0076] Em outro aspecto, a segunda serina protease semelhante à subtilisina é codificada por um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo de uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 99 ou o seu cDNA, ou a sua sequência codificadora de polipeptídeo maduro. Em outro aspecto, a segunda serina protease semelhante à subtilisina é codificada por um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo de SEQ ID NO: 99. Em outro aspecto, a segunda serina protease semelhante à subtilisina é codificada por um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo de a sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 99.

[0077] Em outro aspecto, a segunda serina protease semelhante à subtilisina é codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de estringência muito baixa, condições de estringência baixa, condições de estringência média, condições de estringência média-alta, condições de estringência alta, ou condições de estringência muito alta com (i) SEQ ID NO: 99; (ii) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 99, (iii) a sequência de cDNA de (i) ou (ii), ou (iv) uma fita complementar de comprimento total de (i), (ii), ou (iii).

[0078] Em um aspecto, o segundo gene da protease aspártica codifica um polipeptídeo tendo atividade de protease aspártica compreendendo ou consistindo de uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 108 ou o seu polipeptídeo maduro. Em outro aspecto, o segundo gene da protease aspártica codifica um polipeptídeo tendo atividade de protease aspártica compreendendo ou consistindo de SEQ ID NO: 108. Em outro aspecto, o segundo gene da protease aspártica codifica um polipeptídeo tendo atividade de protease aspártica compreendendo ou consistindo do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 108.

[0079] Em outro aspecto, o segundo gene da protease aspártica compreende um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo de uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 107 ou o seu cDNA, ou a sua sequência codificadora de polipeptídeo maduro. Em outro aspecto, o segundo gene da protease aspártica compreende ou consiste de SEQ ID NO: 107. Em outro aspecto, o segundo gene da protease aspártica compreende ou consiste da sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 107.

[0080] Em outro aspecto, o segundo gene da protease aspártica compreende um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de estringência muito baixa, condições de estringência baixa, condições de estringência média, condições de estringência média-alta, condições de estringência alta, ou condições de estringência muito alta com (i) SEQ ID NO: 107; (ii) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 107, (iii) a sequência de cDNA de (i) ou (ii), ou (iv) uma fita complementar de comprimento total de (i), (ii), ou (iii).

[0081] Em outro aspecto, a segunda protease aspártica compreende ou consiste de uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 108 ou o seu polipeptídeo maduro. Em outro aspecto, a segunda protease aspártica compreende ou consiste de SEQ ID NO: 108. Em outro aspecto, a segunda protease aspártica compreende ou consiste do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 108.

[0082] Em outro aspecto, a segunda protease aspártica é codificada por um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo de uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 107 ou o seu cDNA, ou a sua sequência codificadora de polipeptídeo maduro. Em outro aspecto, a segunda protease aspártica é codificada por um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo de SEQ ID NO: 107. Em outro aspecto, a segunda protease aspártica é codificada por um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo de a sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 107.

[0083] Em outro aspecto, a segunda protease aspártica é codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de estringência muito baixa, condições de estringência baixa, condições de estringência média, condições de estringência média-alta, condições de estringência alta, ou condições de estringência muito alta com (i) SEQ ID NO: 107; (ii) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 107, (iii) a sequência de cDNA de (i) ou (ii), ou (iv) uma fita complementar de comprimento total de (i), (ii), ou (iii).

[0084] As sequências de nucleotídeos aqui reveladas ou suas subsequências, bem como as suas sequências de aminoácidos ou os seus fragmentos, podem ser usadas(os) para planejar sondas de ácido nucleico para identificar e clonar DNA homólogo dos genes descritos acima a partir de cepas de espécies ou gêneros diferentes de acordo com métodos bem conhecidos na arte. Em particular, tais sondas podem ser usadas para hibridização com o DNA genômico ou cDNA do gênero ou da espécie de interesse, seguindo procedimentos de Southern blotting padrão, com o propósito de identificar e isolar o gene correspondente na mesma. Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a sequência inteira, mas devem ser pelo menos de 14, por exemplo, pelo menos 25, pelo menos 35, ou pelo menos 70 nucleotídeos em comprimento. Preferivelmente, a sonda de ácido nucleico é pelo menos de 100 nucleotídeos em comprimento, por exemplo, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, ou pelo menos 900 nucleotídeos em comprimento. Ambas as sondas de DNA e de RNA podem ser usadas. As sondas são tipicamente marcadas para detectar o gene correspondente (por exemplo, com 32P, 3H, 35S, biotina, ou avidina).

[0085] Assim, um DNA genômico ou uma biblioteca de cDNA preparado(a) a partir de tais outros organismos pode ser selecionado(a) para DNA que hibridiza com as sondas descritas acima. DNA genômico ou outro DNA de tais outros organismos pode ser separado por eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida, ou por outras técnicas de separação. DNA das bibliotecas ou o DNA separado pode ser transferido para e imobilizado sobre nitrocelulose ou outro material de suporte adequado. Com o propósito de identificar um clone ou DNA que é homólogo às sequências de nucleotídeos aqui reveladas ou suas subsequências, o material de suporte é usado em um Southern blot. Para os propósitos da presente invenção, hibridização indica que a sequência de ácido nucleico hibridiza com uma sonda de ácido nucleico marcada correspondendo às sequências de nucleotídeos aqui reveladas, sua fita complementar, ou uma sua subsequência, sob condições de estringência muito baixa a muito alta. Moléculas com as quais a sonda de ácido nucleico hibridiza sob estas condições são detectadas usando filme de raios-X.

[0086] Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, condições de estringência muito baixa a muito alta são definidas como pré-hibridização e hibridização a 42°C em 5X SSPE, SDS 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão desnaturado e cisalhado, e quer formamida 25% para estringências muito baixa e baixa, formamida 35% para estringências média a média-alta, ou formamida 50% para estringências alta a muito alta, seguindo procedimentos de Southern blotting padrão por 12 a 24 horas otimamente. O material de suporte é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando 2X SSC, SDS 0,2% a 45°C (estringência muito baixa), a 50°C (estringência baixa), a 55°C (estringência média), a 60°C (estringência média-alta), a 65°C (estringência alta), e a 70°C (estringência muito alta).

[0087] Para sondas curtas de cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 70 nucleotídeos em comprimento, condições de estringência são definidas como pré-hibridização e hibridização a cerca de 5°C a cerca de 10°C abaixo da Tm calculada usando o cálculo de acordo com Bolton e McCarthy (1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:1390) em NaCl 0,9 M, Tris-HCl 0,09 M pH 7,6, EDTA 6 mM, NP-40 0,5%, solução de Denhardt IX, pirofosfato de sódio 1 mM, fosfato de sódio monobásico 1 mM, ATP 0,1 mM, e 0,2 mg de RNA de levedura por mL seguindo procedimentos de Southern blotting padrão por 12 a 24 horas otimamente. O material de suporte é finalmente lavado uma vez em 6X SCC mais SDS 0,1% por 15 minutos e duas vezes cada por 15 minutos usando 6X SSC a de 5°C a 10°C abaixo de Tm calculada.

[0088] Uma sequência de nucleotídeos homóloga ou complementar a um gene aqui descrito pode ser usada de outras fontes microbianas para modificar o gene correspondente em uma cepa de Trichoderma escolhida.

[0089] Em outro aspecto, a modificação de um gene na cepa mutante de Trichoderma é não marcada [sic] com um marcador selecionável. Remoção do marcador selecionável pode ser realizada pela cultura dos mutantes sobre um meio de contrasseleção. Se o gene marcador selecionável contiver repetições flanqueando suas extremidades 5’ e 3’, as repetições facilitarão o looping out do gene marcador selecionável por recombinação homóloga quando a cepa mutante for submetida à contrasseleção. O gene marcador selecionável também pode ser removido por recombinação homóloga pela introdução na cepa mutante de um fragmento de ácido nucleico compreendendo regiões 5’ e 3’ do gene defective, mas faltante do gene marcador selecionável, seguida por seleção no meio de contrasseleção. Por recombinação homóloga, o gene dcfectivo contendo o gene marcador selecionável é substituído pelo fragmento de ácido nucleico faltante do gene marcador selecionável. Outros métodos conhecidos na arte também podem ser usados.

[0090] Será entendido que os métodos da presente invenção não são limitados a uma ordem específica para obter a cepa mutante de Trichoderma . A modificação de um gene pode ser introduzida na cepa parental em qualquer etapa na construção da cepa para a produção de um polipeptídeo de interesse. E preferido que a cepa mutante de Trichoderma já tenha sido tornada deficiente em protease antes de uma tal construção .

[0091] Em um outro aspecto da presente invenção, os mutantes de cepas de Trichoderma podem conter modificações adicionais, por exemplo, deleções ou disrupções, de outros genes, que podem codificar substâncias prejudiciais para a produção, recuperação, ou aplicação de um polipeptídeo de interesse.

[0092] Em um aspecto, a cepa de Trichoderma adicionalmente compreende uma modificação, por exemplo, disrupção ou deleção, de um ou mais (vários) genes codificadores de uma atividade proteolítica selecionada do grupo consistindo de uma amino-peptidase, dipeptidil-amino-peptidase, tripeptidil-amino-peptidase, carbóxi-peptidase, metaloprotease, cisteína- protease, e protease vacuolar .

[0093] Em outro aspecto, a cepa de Trichoderma adicionalmente compreende uma modificação, por exemplo, disrupção ou deleção, de um ou mais (vários) genes adicionais codificadores de uma óxidorredutase, uma transferase, uma hidrolase, uma liase, uma isomerase, ou uma ligase.

[0094] Em outro aspecto, a cepa de Trichoderma adicionalmente compreende uma modificação, por exemplo, disrupção ou deleção, de um ou mais (vários) genes adicionais codificadores de uma enzima selecionada do grupo consistindo de uma alfa-amilase, arabinofuranosidase, carboidrase, catalase, celobiohidrolase, celulase, quitinase, ciclodextrina-glicosil- transferasc, cutinase, ciclodextrina-glicosil-transferase, desoxirribonuclease, endoglucanase, esterase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, glicocerebrosidase, glicose-oxidase, alfa-glicosidase, beta-glicosidase, glicuronidases, haloperoxidase, hemicelulase, invertase, isomerase, lacase, ligase, lipase, manosidase, mutanase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase, fosfolipase, fitase, fenoloxidase, polifenoloxidase, ribonuclease, alfa-l,6-transglicosidase, transglutaminase, urocinase, xilanase, e beta- xilosidase.

[0095] Em outro aspecto, a cepa de Trichoderma adicionalmente compreende uma modificação, por exemplo, disrupção ou deleção, de um ou mais (vários) genes adicionais codificadores de uma enzima selecionada do grupo consistindo de an endoglicanase, a celobiohidrolase, e uma beta- glicosidase.

[0096] Nos métodos da presente invenção, a cepa mutante de Trichoderma preferivelmente produz pelo menos a mesma quantidade de um polipeptídeo biologicamente ativo de interesse que a da cepa de Trichoderma parental quando cultivada sob condições de produção idênticas. Em outro aspecto, a cepa mutante produz preferivelmente pelo menos 5% mais, mais preferivelmente pelo menos 10% mais, mais preferivelmente pelo menos 25% mais, mais preferivelmente pelo menos 50% mais, ainda mais preferivelmente pelo menos 75% mais, e muito mais preferivelmente pelo menos 100% mais do polipeptídeo biologicamente ativo do que a cepa de Trichoderma parental correspondente quando cultivada sob condições de produção idênticas.

[0097] As cepas mutantes de Trichoderma são cultivadas em um meio nutriente para produção do polipeptídeo de interesse usando métodos conhecidos na arte. Por exemplo, a cepa pode ser cultivada por cultivo em frasco agitado, fermentação em escala pequena ou em escala grande (incluindo fermentações contínua, em batelada, em batelada alimentada, ou no estado sólido) em fermentadores laboratoriais ou industriais realizada em um meio adequado e sob condições que permitem que o polipeptídeo seja expressado e/ou isolado. O cultivo ocorre em um meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e de nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na arte. Meios adequados estão disponíveis em fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas(por exemplo, em catálogos da “American Type Culture Collection”). O polipeptídeo secretado pode ser recuperado diretamente do meio. Se o polipeptídeo não for secretado, ele pode ser obtido de lisados celulares.

[0098] O polipeptídeo de interesse pode ser detectado usando métodos conhecidos na arte que são específicos para o polipeptídeo. Estes métodos de detecção podem incluir o uso de anticorpos específicos, cromatografia líquida de desempenho alto, cromatografia capilar, formação de um produto de enzima, desaparecimento de um substrato de enzima, ou SDS-PAGE. Por exemplo, um ensaio de enzima pode ser usado para determinar a atividade de uma enzima. Procedimentos para determinar a atividade de enzima são conhecidos na arte para muitas enzimas (veja, por exemplo, D. Schomburg e M. Salzmann (eds.), Enzyme Handbook, Springer-Verlag, New York, 1990).

[0099] O polipeptídeo resultante pode ser isolado por métodos conhecidos na arte. Por exemplo, um polipeptídeo de interesse pode ser isolado do meio de cultura por procedimentos convencionais incluindo, mas não limitados a, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação, ou precipitação. O polipeptídeo isolado pode ser então posteriormente purificado por uma variedade de procedimentos conhecidos na arte incluindo, mas não limitados a, cromatografia (por exemplo, de troca iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocalização, e exclusão de tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focalização isoelétrica preparativa (IEF), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação por sulfato de amónio), ou extração (veja, por exemplo, Protein Purification, J.-C. Janson e Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989).

[00100] O polipeptídeo de interesse pode ser qualquer polipeptídeo nativo ou estranho (heterólogo) para a cepa de Trichoderma . O polipeptídeo pode ser codificado por um gene único ou por dois ou mais genes. O termo “polinucleotídeo codificador de polipeptídeo” será entendido para incluir um ou mais (vários) genes envolvidos na produção do polipeptídeo. O termo “polipeptídeo heterólogo” é aqui definido como um polipeptídeo que não é nativo para a cepa hospedeira; um polipeptídeo nativo no qual modificações estruturais têm sido feitas para alterar o polipeptídeo nativo, por exemplo, a sequência de proteína de um polipeptídeo nativo; ou um polipeptídeo nativo cuja expressão é quantitativamente alterada como um resultado de uma manipulação do polinucleotídeo ou da cepa hospedeira por técnicas de DNA recombinante, por exemplo, um promotor mais forte, cópias múltiplas de um DNA codificador do polipeptídeo. Assim, a presente invenção também inclui, dentro do escopo do termo “polipeptídeos heterólogos”, tal produção recombinante de polipeptídeos nativos, na medida em que tal expressão envolva o uso de elementos genéticos não nativos para a cepa de Trichoderma , ou uso de elementos nativos que têm sido manipulados em uma maneira que não ocorre naturalmente na cepa hospedeira. Em um aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo nativo para a cepa de Trichoderma . Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo heterólogo para a cepa de Trichoderma .

[00101] O polipeptídeo pode ser qualquer polipeptídeo tendo uma atividade biológica de interesse. O termo “polipeptídeo” não significa aqui que se refere a um comprimento específico do produto codificado e, por conseguinte, inclui peptídeos, oligopeptídeos, e proteínas. O termo “polipeptídeo” também inclui dois ou mais polipeptídeos combinados para formarem o produto codificado. Polipeptídeos também incluem polipeptídeos de fusão, que compreendem uma combinação de sequências de polipeptídeo parciais ou completas obtidas de pelo menos dois polipeptídeos diferentes nos quais um ou mais (vários) podem ser heterólogos para a cepa de Trichoderma. Polipeptídeos adicionalmente incluem variações alélicas naturalmente ocorrentes e engenhadas dos polipeptídeos acima mencionados e polipeptídeos híbridos.

[00102] Em um aspecto, o polipeptídeo é um anticorpo, um antígeno, um peptídeo antimicrobiano, uma enzima, um fator de crescimento, um hormônio, um imunomodulador, um neurotransmissor, um receptor, uma proteína repórter, uma proteína estrutural, ou um fator de transcrição.

[00103] Em outro aspecto, o polipeptídeo é uma óxidorredutase, uma transferase, uma hidrolase, uma liase, uma isomerase, ou uma ligase. Em outro aspecto, o polipeptídeo uma acetil-manana-esterase, acetixilano- esterase, amino-peptidase, alfa-amilase, arabinanase, arabinofuranosidase, carboidrase, carbóxi-peptidase, catalase, celobiohidrolase, celulase, quitinase, ácido cumárico-esterase, ciclodextrina-glicosil-transferase, cutinase, ciclodextrina-glicosil-transferase, desoxirribonuclease, endoglicanase, esterase, feruloil-esterase, polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica, alfa-galactosidase, beta- galactosidase, glicocerebrosidase, glicose-oxidase, alfa-glicosidase, beta-glicosidase, glicuronidase, glicuronoil- esterase, haloperoxidase, hemicelulase, invertase, isomerase, lacase, ligase, lipase, mananase, manosidase, mutanase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase, fosfolipase, fitase, fenoloxidase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, alfa-l,6-transglicosidase, transglutaminase, urocinase, xilanase, ou beta-xilosidase.

[00104] Em outro aspecto, o polipeptídeo é uma albumina, um colágeno, uma tropoelastina, uma elastina, ou uma gelatina.

[00105] Em outro aspecto, o polipeptídeo é uma endoglicanase. Em outro aspecto, o polipeptídeo é uma celobiohidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo é uma beta-glicosidase. Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica. Em outro aspecto, o polipeptídeo é uma xilanase. Em outro aspecto, o polipeptídeo é uma beta-xilosidase. Em outro aspecto, o polipeptídeo é uma acetil-xilana- esterase. Em outro aspecto, o polipeptídeo é uma feruloil-esterase. Em outro aspecto, o polipeptídeo é uma arabinofuranosidase. Em outro aspecto, o polipeptídeo é uma glicuronidase. Em outro aspecto, o polipeptídeo é uma acetil-manana-esterase. Em outro aspecto, o polipeptídeo é uma arabinanase. Em outro aspecto, o polipeptídeo é uma ácido cumárico-esterase. Em outro aspecto, o polipeptídeo é uma galactosidase. Em outro aspecto, o polipeptídeo é uma glicuronoil-esterase. Em outro aspecto, o polipeptídeo é uma mananase. Em outro aspecto, o polipeptídeo é uma manosidase.

[00106] Nos métodos da presente invenção, o mutante da cepa de Trichoderma é uma cepa recombinante, compreendendo um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo heterólogo, que é vantajosamente usado na produção recombinante do polipeptídeo. A cepa é preferivelmente transformada com um vetor compreendendo o polinucleotídeo codificador do polipeptídeo heterólogo seguido pela integração do vetor no cromossomo. “Transformação” significa introdução de um vetor compreendendo o polinucleotídeo em uma cepa hospedeira de modo que o vetor seja mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extra-cromossômico autorreplicante. Integração é geralmente considerada como uma vantagem porque o polinucleotídeo mais provavelmente é estavelmente mantido na cepa. Integração do vetor no cromossomo pode ocorrer por recombinação homóloga, recombinação não homóloga, ou transposição.

[00107] O polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo heterólogo pode ser obtido de qualquer fonte procariótica, eucariótica, ou outra fonte, por exemplo, archaeabactéria. Para os propósitos da presente invenção, o termo “obtido de” como aqui usado em conexão com uma determinada fonte deve significar que o polipeptídeo é produzido pela fonte ou por uma cepa na qual um gene da fonte tem sido inserido.

[00108] Nos métodos da presente invenção, o polipeptídeo também pode ser um polipeptídeo fusionado ou polipeptídeo de fusão clivável no qual outro polipeptídeo está fusionado na terminação-N ou na terminação-C do polipeptídeo da presente invenção. Um polipeptídeo fusionado é produzido pela fusão de um polinucleotídeo codificador de outro polipeptídeo em um polinucleotídeo da presente invenção. Técnicas para produzir polipeptídeos de fusão são conhecidas na arte, e incluem ligação das sequências codificadoras dos polipeptídeos de modo que elas estejam em matriz e que a expressão do polipeptídeo fusionado esteja sob o controle do(s) mesmo(s) promotor(es) e terminador. Proteínas de fusão também podem ser construídas usando a tecnologia intein na qual fusões são produzidas após a tradução (Cooper et al., 1993, EMBOJ. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).

[00109] Um polipeptídeo de fusão pode adicionalmente compreender um sítio de clivagem entre os dois polipeptídeos. Sob secreção da proteína de fusão, o sítio é clivado liberando os dois polipeptídeos. Exemplos de sítios de clivagem incluem, mas não são limitados aos, sítios revelados em Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488- 3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; e Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982- 987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240- 248; e Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

[00110] Nos métodos da presente invenção, uma cepa de Trichoderma mutante da presente invenção também pode ser usada para a produção recombinante de um polipeptídeo que é nativo para a cepa de Trichoderma . O polipeptídeo nativo pode ser produzido por meio recombinante, por exemplo por colocação do gene codificador do polipeptídeo sob o controle de um promotor diferente para intensificar a expressão da substância, priorizando sua exportação para fora da cepa pelo uso, por exemplo, de uma sequência de sinal, ou aumentando o número de cópias de um gene codificador do polipeptídeo normalmente produzido pela cepa de Trichoderma .

[00111] As técnicas usadas para isolar ou clonar um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo de interesse são conhecidas na arte e incluem o isolamento de DNA genômico, a preparação de cDNA, ou uma sua combinação. A clonagem de um tal polinucleotídeo de tal DNA genômico pode ser realizada, por exemplo, pelo uso da bem conhecida reação em cadeia da polimerase (PCR). Veja, por exemplo, Innis et ah, 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Os procedimentos de clonagem podem envolver a excisão de um fragmento de ácido nucleico desejado compreendendo o polinucleotídeo codificador do polipeptídeo, inserção do fragmento em uma molécula de vetor, e incorporação do vetor recombinante em uma cepa de Trichoderma mutante da presente invenção onde múltiplas cópias ou múltiplos clones do polinucleotídeo serão replicadas(os). O polinucleotídeo pode ser de origem genômica, cDNA, RNA, semissintética, sintética, ou quaisquer suas combinações.

[00112] Um polinucleotídeo isolado codificador de um polipeptídeo heterólogo pode ser manipulado em uma variedade de maneiras para proporcionar a expressão do polipeptídeo em uma cepa mutante de Trichoderma da presente invenção. Manipulação da sequência de polinucleotídeo antes de sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificar as sequências de polinucleotídeo utilizando métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na arte.

[00113] Um construto de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo pode estar operacionalmente ligado em uma ou mais (várias) sequências de controle capazes de dirigirem a expressão da sequência codificadora em uma cepa mutante de Trichoderma da presente invenção sob condições compatíveis com as sequências de controle.

[00114] A sequência de controle pode ser uma sequência de promotor apropriada, uma sequência de nucleotídeos que é reconhecida por uma cepa mutante de Trichoderma da presente invenção para a expressão do polinucleotídeo codificador do polipeptídeo. A sequência de promotor contém sequências de controle de transcrição que medeiam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer sequência de nucleotídeos que mostre atividade de transcrição na cepa mutante de Trichoderma , incluindo promotores mutantes, truncados, e híbridos, e pode ser obtido de genes codificadores de polipeptídeos extracelulares ou intracelulares quer nativos quer heterólogos (estranhos) para a cepa mutante de Trichoderma .

[00115] Exemplos de promotores adequados para dirigir a transcrição do construto de ácido nucleicos nos métodos da presente invenção são promotores obtidos dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase estável a ácido de Aspergillus niger, glicoamilase (glaA) de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori, lipase de Rhizomucor miehei, fosfatase alcalina de Aspergillus oryzae, triose-fosfato-isomerase de Aspergillus oryzae, acetamidase de Aspergillus nidulans, amiloglicosidase de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Fusarium vertenatum Daria (WO 00/56900), Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900), protease semelhante à tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), beta-glicosidase de Trichoderma reesei, celobiohidrolase I de Trichoderma reesei, celobiohidrolase II de Trichoderma reesei, endoglicanase I de Trichoderma reesei, endoglicanase II de Trichoderma reesei, endoglicanase III de Trichoderma reesei, endoglicanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei, bem como o promotor NA2-tpi (um promotor modificado incluindo um gene codificador de uma alfa-amilase neutra em Aspergilli na qual a sequência líder não traduzida tem sido substituída por uma sequência líder não traduzida de um gene codificador de triose-fosfato- isomerase em Aspergilli, exemplos não limitantes incluem promotores modificados incluindo o gene codificador de alfa-amilase neutra em Aspergillus niger no qual a sequência líder não traduzida tem sido substituída por uma sequência líder não traduzida do gene codificador de triose-fosfato- isomerase em Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae), e seus promotores mutantes, truncados, e híbridos.

[00116] A sequência de controle também pode ser uma sequência de terminador de transcrição, uma sequência reconhecida por uma cepa mutante de Trichoderma da presente invenção para terminar a transcrição. A sequência de terminador está operacionalmente ligada na terminação 3’ da sequência de nucleotídeos codificadora do polipeptídeo heterólogo. Qualquer terminador que é funcional em uma cepa de Trichoderma pode ser usada na presente invenção.

[00117] Terminadores preferidos são obtidos dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae, glicoamilase de Aspergillus niger, antranilato- sintase de Aspergillus nidulans, alfa-glicosidase de Aspergillus niger, e protease semelhante à tripsina de Fusarium oxysporum.

[00118] A sequência de controle também pode ser uma sequência líder adequada, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para tradução por uma cepa mutante de Trichoderma da presente invenção. A sequência líder está operacionalmente ligada na terminação 5’ da sequência de nucleotídeos codificadora do polipeptídeo heterólogo. Qualquer sequência líder que seja funcional na cepa mutante de Trichoderma pode ser usada na AΠ/VIQ presente invenção.

[00119] Sequências líderes preferidas para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidas dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae e triose-fosfato-isomerase de Aspergillus nidulans.

[00120] A sequência de controle também pode ser uma sequência de poliadenilação, uma sequência operacionalmente ligada na terminação 3’ da sequência de nucleotídeos e, quando transcrita, é reconhecida pela cepa mutante de Trichoderma como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina no mRNA transcrito. Qualquer sequência de poliadenilação que seja funcional na cepa mutante de Trichoderma pode ser usada na presente invenção.

[00121] Sequências de poliadenilação para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidas dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae, glicoamilase de Aspergillus niger, antranilato-sintase de Aspergillus nidulans, protease semelhante à tripsina de Fusarium oxysporum, c alfa- glicosidase de Aspergillus niger.

[00122] A sequência de controle também pode ser uma sequência de peptídeo de sinal codificadora que codifica uma sequência de aminoácidos ligada na terminação amino de um polipeptídeo e dirige o polipeptídeo codificado para dentro da rota secretória da célula. A extremidade 5’ da sequência codificadora da sequência de nucleotídeos pode inerentemente conter uma sequência de peptídeo de sinal codificadora naturalmente ligada em matriz de leitura de tradução com o segmento da sequência codificadora que codifica o polipeptídeo secretado. Alternativamente,a extremidade 5’ da sequência codificadora pode conter uma sequência de peptídeo de sinal codificadora que é estranha à sequência codificadora. A sequência de peptídeo de sinal estranha codificadora pode ser exigida se a sequência codificadora não naturalmente contiver uma sequência de peptídeo de sinal codificadora. Alternativamente, a sequência de peptídeo de sinal estranha codificadora pode simplesmente substituir a sequência de peptídeo de sinal codificadora com o propósito de intensificar a secreção do polipeptídeo. Contudo, qualquer sequência de peptídeo de sinal codificadora que direciona o polipeptídeo expressado para dentro da rota secretória da cepa mutante de Trichoderma , i.e., secretado para dentro de um meio de cultura, pode ser usada na presente invenção.

[00123] Regiões codificadoras de peptídeo de sinal efetivas para as cepas mutantes de Trichoderma são as regiões codificadoras de peptídeo de sinal obtidas dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae, amilase neutra de Aspergillus niger, glicoamilase de Aspergillus niger, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, celulase de Humicola insolens, endoglicanase V de Humicola insolens, e lipase de Humicola lanuginosa .

[00124] A sequência de controle também pode ser uma região codificadora de propeptídeo, que codifica uma sequência de aminoácidos posicionada na terminação amino de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma proenzima ou um propolipeptídeo (ou um zimógeno em alguns casos). Um propolipeptídeo está geralmente inativado e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo, maduro por clivagem catalítica ou autocatalítica do propeptídeo do propolipeptídeo. A região codificadora de propeptídeo pode ser obtida de genes para fator alfa de Saccharomyces cerevisiae, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, e lacase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836).

[00125] Se ambas as sequências de propeptídeo e peptídeo de sinal estiverem presentes na terminação amino de um polipeptídeo, a sequência de propeptídeo estará posicionada ao lado da terminação amino de um polipeptídeo e a sequência de sinal está posicionada ao lado da terminação amino da sequência de propeptídeo.

[00126] Os construtos de ácido nucleico também podem conter um ou mais (vários) polinucleotídeos que codificam um ou mais (vários) fatores que são vantajosos para dirigir a expressão do polipeptídeo heterólogo, por exemplo, um ativador de transcrição (por exemplo, uma fator írans-ativo), uma chaperona, e uma protease de processamento. Qualquer fator que seja funcional na cepa mutante de Trichoderma pode ser usado na presente invenção. Os ácidos nucleicos codificadores de um ou mais (vários) destes fatores não estão necessariamente em tandem com a sequência de nucleotídeos codificadora do polipeptídeo heterólogo.

[00127] Também pode ser desejável adicionar sequências regulatórias ou de controle que permitem a regulação da expressão do polipeptídeo relativa ao crescimento da cepa mutante de Trichoderma . Exemplos de sistemas regulatórios são aqueles que causam ligação e desligação da expressão do gene em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulatório. Sistemas regulatórios em fungos filamentosos tais como o promotor TAKA alfa-amilase, promotor glicoamilase de Aspergillus niger, e promotor glicoamilase de Aspergillus oryzae podem ser usados como sequências regulatórias. Outros exemplos de sequências regulatórias são aquelas que permitem a amplificação do gene. Em sistemas eucarióticos, estas sequências regulatórias incluem o gene de di-hidro-folato-redutase que é amplificado na presença de metotrexato, e os genes de metalotioneína que são amplificados com metais pesados. Nestes casos, a sequência de nucleotídeos codificadora do polipeptídeo estaria operacionalmente ligada na sequência regulatória.

[00128] Nos métodos da presente invenção, um vetor de expressão recombinante compreendendo uma sequência de nucleotídeos, um promotor, e sinais de terminação de transcrição e de tradução pode ser usado para a produção recombinante de um polipeptídeo de interesse. Os vários ácidos nucleicos e as diversas sequências de controle aqui descritos(as) podem ser unidos(as) juntos(as) para produzirem um vetor de expressão recombinante que pode incluir um ou mais (vários) sítios de restrição convenientes para permitir a inserção ou a substituição da sequência de nucleotídeos codificadora do polipeptídeo em tais sítios. Alternativamente, a sequência de nucleotídeos pode ser expressada pela inserção da sequência de nucleotídeos ou de um construto de ácido nucleico compreendendo a sequência em um vetor apropriado para expressão. Na preparação do vetor de expressão, a sequência codificadora está localizada no vetor de modo que a sequência codificadora esteja operacionalmente ligada nas sequências de controle apropriadas para expressão.

[00129] O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que pode ser convenientemente submetido aos procedimentos de DNA recombinante e pode ocasionar a expressão da sequência de nucleotídeos. A escolha do vetor tipicamente dependerá de sua compatibilidade com a cepa mutante de Trichoderma para dentro da qual o vetor é para ser introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado.

[00130] O vetor pode ser um vetor autonomamente replicante, i.e., uma vetor que existe como uma entidade cromossômica, cuja replicação é independente de replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo, ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter qualquer meio para garantir a autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na cepa mutante de Trichoderma , é integrado no genoma e replicado junto com o(s) cromossomo(s) para dentro do(s) qual(quais) ele tem sido integrado. Ademais, pode(m) ser usado(s) um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que juntos contêm o DNA total a ser introduzido no genoma da cepa mutante de Trichoderma , ou um transposon.

[00131] O vetor preferivelmente contém um ou mais (vários) marcadores selecionáveis que permitem a seleção fácil de cepas mutantes de Trichoderma transformadas. Um marcador selecionável é um gene cujo produto proporciona resistência viral ou a biocida, resistência a metais pesados, prototrofia a auxótrofos, e semelhantes.

[00132] Exemplos de marcadores selecionáveis para uso na cepa mutante de Trichoderma incluem, mas não são limitados a, amdS (acetamidase), argB (ornitina-carbamoil-transferase), bar (fosfmotricina-acetil-transferase), hpt (higromina-fosfo-transferase), niaD (nitrato-redutase), pyrG (orotidina-5’- fosfato-descarboxilase), sC (sulfato-adenil-transferase), e trpC (antranilato- sintase), bem como seus equivalentes. Preferidos para uso na cepa mutante de Trichoderma são o gene amdS de Aspergillus nidulans e o gene bar de Streptomyces hygroscopicus.

[00133] Os vetores preferivelmente contêm um elemento(s) que permite(m) integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independente do genoma.

[00134] Para integração no genoma da cepa mutante de Trichoderma , o vetor pode depender da sequência de polinucleotídeo codificadora do polipeptídeo ou de qualquer outro elemento do vetor para integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter sequências de nucleotídeos adicionais para direcionar a integração por recombinação homóloga para dentro do genoma da cepa mutante de Trichoderma em uma localização(ões) precisa(s) no(s) cromossomo(s). Para aumentar a possibilidade de integração em uma localização precisa, os elementos integrantes devem preferivelmente conter um número suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10.000 pares de bases, preferivelmente 400 a 10.000 pares de bases, e muito mais preferivelmente 800 a 10.000 pares de bases, que têm um grau alto de identidade com a sequência alvo correspondente para aumentar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos integrantes podem ser qualquer sequência que é homóloga à sequência alvo no genoma da cepa mutante de Trichoderma . Ademais, os elementos integrantes podem ser sequências de nucleotídeos codificadoras ou não codificadoras. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da cepa mutante de Trichoderma por recombinação não homóloga.

[00135] Para replicação autônoma, o vetor pode adicionalmente compreender uma origem de replicação permitindo que o vetor se replique autonomamente na cepa mutante de Trichoderma . A origem de replicação pode ser qualquer replicador plasmídeo mediando replicação autônoma que funciona em uma célula. O termo “origem de replicação” ou “replicador plasmídeo” é aqui definido como uma sequência de nucleotídeos que permite que um plasmídeo ou vetor se replique in vivo.

[00136] Exemplos de origens de replicação úteis na cepa mutante de Trichoderma são AMAI e ANSI (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; WO 00/24883). Isolamento do gene AMAI e construção de plasmídeos ou vetores compreendendo o gene podem ser realizados de acordo com os métodos revelados em WO 00/24883.

[00137] Os procedimentos usados para ligar os elementos aqui descritos para construir os vetores de expressão recombinantes são bem conhecidos por uma pessoa experiente na arte (veja, por exemplo, J. Sambrook, E.F. Fritsch, e T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor, New York).

[00138] Um vetor compreendendo a sequência de nucleotídeos pode ser introduzido, por exemplo, por transformação, na cepa mutante de Trichoderma de modo que o vetor seja mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extra-cromossômoco autorreplicante. Integração é geralmente considerada em ser vantajosa porque é mais provável que a sequência de nucleotídeos seja estavelmente mantida na cepa. Integração do vetor no cromossomo ocorre por recombinação homóloga, recombinação não homóloga, ou transposição.

[00139] A introdução de um vetor de expressão na cepa mutante de Trichoderma pode envolver um processo consistindo de formação de protoplasto, transformação dos protoplastos, e regeneração da parede da cepa em uma maneira per se conhecida. Procedimentos adequados para transformação de cepas de Trichoderma são descritos em Malardier et ah, 1989, Gene 78: 147- 156, e WO 96/00787.

[00140] A presente invenção é adiante descrita pelos seguintes exemplos que não devem ser entendidos como limitando o escopo da invenção.

Exemplos Cepa

[00141] Cepa 981-0-8 (D4) de Trichoderma reesei é uma cepa mutada de Trichoderma reesei RutC30 (ATCC 56765; Montenecourt e Eveleigh, 1979, Adv. Chem. Ser. 181: 289- 301).

Meios e Soluções Tampão

[00142] Meio LB foi composto de 10 g de triptona, 5 g de extrato de levedo, e 5 g de cloreto de sódio, e água deionizada para 1 litro.

[00143] Placas LB foram compostas de 10 g de triptona, 5 g de extrato de levedo, 5 g de NaCl, 15 g de ágar Bacto, e água deionizada para 1 litro.

[00144] Placas PDA foram compostas de 39 g de Ágar de Dextrose de Batata (Difco) e água deionizada para 1 litro.

[00145] Agarose NZY top foi composta de 5 g de NaCl, 5 g de extrato de levedo, 10 g de amina NZ, 2 g de MgSO4, 7 g de agarose, e água deionizada para 1 litro.

[00146] Meio YEG foi composto de 5 g de extrato de levedo, 20 g de glicose, e água deionizada para 1 litro.

[00147] Placas de ágar 2X YT foram compostas de 16 g de triptona, 10 g de extrato de levedo, 5 g de cloreto de sódio, 15 g de Bactoagar, e água deionizada para 1 litro.

[00148] Placas de meio mínimo para Trichoderma foram compostas de 30 g de sacarose, 20 mL de solução de sal COVE, 0,6 g de CaC12,2H2θ, 6 g de (NH4)2SO4, 25 g de ágar Noble, e água deionizada para 1 litro.

[00149] Placas COVE foram compostas por litro de 342,3 g de sacarose, 25 g de ágar Noble, 20 mL de solução de sais COVE, acetamida 10 mM, e CsCl 15 mM ou 20 mM . A solução foi ajustada para pH 7,0 antes da autoclavagem.

[00150] Placas COVE2 foram compostas de 30 g de sacarose, 20 mL de solução de sal COVE, acetamida 10 mM, 25 g ou 30 g de ágar Noble, e água deionizada para 1 litro.

[00151] Solução de sal COVE foi composto de 26 g de KC1, 26 g de MgSO4.7H2O, 76 g de KH2PO4, 50 mL de solução de traços de metal COVE, e água deionizada para 1 litro.

[00152] Solução de metais traço COVE foi composta de 0,04 g de NaB4O7.10H2O, 0,4 g de CuSO4.5H2O, 1,2 g de FeSO4.7H2O, 0,7 g ou 1 g de MnSO4.H2O, 0,8 g de Na2MoO2.2H2O, 10 g de ZnSO4.7H2O, e água deionizada para 1 litro.

[00153] Agarose COVE top foi composta de 342,3 g de sacarose, 20 mL de solução de sal COVE, acetamida 10 mM, 10 g de agarose de fusão lenta, e água deionizada para 1 litro.

[00154] Meio indutor de celulase foi composto de 20 g de fibras de celulose natural Arbocel (J. Rettenmaier USA LP, Schoolcraft, Ml, USA), 10 g de sólidos de licor de macerado de milho (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), 1,45 g de (NH4)2SO4, 2,08 g de KH2PO4, 0,28 g de CaCl2, 0,42 g de MgSO4.7H2O, 0,42 mL de solução de metais traço, 2 gotas de ácido plurônico, e água deionizada para 1 litro. O pH foi ajustado para 6,0 com NaOH 10 N antes da autoclavagem.

[00155] Meio para frasco agitado foi composto de 20 g de dextrose, 10 g de sólidos de licor de macerado de milho, 1,45 g de (NH4)2SO4, 2,08 g de KH2PO4, 0,36 g de CaCU, 0,42 g de MgSO4.7H2O, e 0,42 mL de solução de metais traço.

[00156] Meio para fermentação em batelada foi composto por litro de 30 g de celulose, 4 g de dextrose, 10 g de sólidos de licor de macerado de milho, 3,8 g de (NH4)2SO4, 2,8 g de KH2PO4, 2,64 g de CaCl2, 1,63 g de MgSO4.7H2O, 1,8 mL de antiespumante, 0,66 mL de solução de metais traço, e água deionizada para 1 litro.

[00157] Meio de alimentação de fermentação foi composto de dextrose.

[00158] Solução de metais traço foi composta de 216 g de FeC13.6H2O, 58 g de ZnSO4.7H2O, 27 g de MnSO4.H2O, 10 g de CuSO4.5H2O, 2,4 g de H3BO3, 336 g de ácido cítrico, e água deionizada para 1 litro.

[00159] Meio YP foi composto de 10 g de extrato de levedo, 20 g de peptona Bacto, e água deionizada para 1 litro.

[00160] Meio de glicose YP+2% foi composto de 1% de extrato de levedo, 2% de peptona e 2% de glicose em água deionizada.

[00161] Meio de maltodextrina YP+2% foi composto de 2% de peptona, 2% de maltodextrina, e 1% de extrato de levedo em água deionizada.

[00162] Meio DAP-2C-1 foi composto de 2% de glicose, 1,1% de sulfato de magnésio, 1,0% de maltose, 0,52% de fosfato de tripotássio, 0,2% ácido cítrico, 0,1% de di-hidrogeno-fosfato de potássio, 0,1% Dowfax 63N10, 0,05% de extrato de levedo, e 0,05% de uma solução de elementos traço (1,39% de sulfato ferroso, 0,845% de sulfato de manganês, 0,68% de cloreto de zinco, 0,3% ácido cítrico, 0,25% de sulfato de cobre, e 0,013% de cloreto de níquel) em água deionizada.

[00163] Tampão PEG foi composto de 500 g de PEG 4000, CaCl2 10 mM, Tris-HCl 10 mM pH 7,5, e água deionizada para 1 litro; esterilizado por filtro.

[00164] STC foi composto de sorbitol 0,8 M ou 1 M, CaCl2 10 mM ou 25 mM, e Tris-HCl 10 mM ou 25 mM, pH 7,5 ou pH 8; esterilizado por filtro.

[00165] Tampão TE foi composto de Tris 1 M pH 8,0 e EDTA 0,5 M pH 8,0

[00166] 20X SSC foi composto de 175,3 g de NaCl, 88,2 g de citrato de sódio, e água deionizada para 1 litro.

Exemplo 1: Construção de plasmídeo pDM156,2

[00167] Uma sonda de um gene de orotidina-5’-monofosfato- descarboxilase (pyr-4) de Neurospora crassa (SEQ ID NO: 7 para a sequência de DNA e SEQ ID NO: 8 para a sequência de aminoácidos deduzida) foi preparada por PCR incorporando desoxi-uridina-trifosfato (deoxyuridine-triphosphate, dUTP) marcada com digoxigenina usando usando os iniciadores descritos abaixo. Iniciador (senso): 5’-GTCAGGAAACGCAGCCACAC-3’ (SEQ ID NO: 9) Iniciador (antissenso): 5’-AGGCAGCCCTTGGACGACAT-3’ (SEQ ID NO: 10)

[00168] Plasmídeo pFB6 (Buxton et al, 1983, Molecular and General Genetics 190: 403-405) foi digerido com Hind III e a digestão foi purificada por eletroforese em gel de agarose 1% usando tampão (TAE) base Tris 40 mM - acetato de sódio 20 mM - EDTA dissódico 1 mM . Um fragmento pyr-4 de 1,1 kb foi excisado do gel e extraído usando um QIAQUICK® Gel Extraction Kit (QIAGEN Inc., Valencia CA, USA) de acordo com os protocolos sugeridos pelo fabricante.

[00169] A reação de amplificação (50 pL) foi composta de IX Taq DNA Polimerase Buffer (New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA), 5 pL de PCR DIG Labeling Mix (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, USA), 10 ng do fragmento Hind III pyr-4 de 1,1 kb, 1 pmols de iniciador de senso, 10 pmols de iniciador de antissenso, e 1 unidade de Taq DNA polimerase (New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA). A reação foi incubada em um ROBOCYCLER® (Stratagene, La Jolla, CA, USA) programado para 1 ciclo a 95°C por 3 minutos seguido por 35 ciclos cada a 95°C por 30 segundos, 55°C por 1 minuto, e 72°C por 1 minuto. A extensão final foi realizada por 5 minutos a 72°C.

[00170] Os produtos da reação de amplificação foram purificados por eletroforese em gel de agarose 1% usando tampão TAE. Uma sonda marcada com digoxigenina (DIG) de aproximadamente 0,78 kb foi excisada do gel e extraída usando um QIAQUICK® Gel Extraction Kit.

[00171] Uma biblioteca de DNA genômico de cepa A3/5 de Fusarium venenatum foi gerada e clonada em vetor lambda EMBU4 como descrito em WO 99/60137.

[00172] A sonda marcada com DIG foi usada para selecionar a biblioteca genômica de Fusarium venenatum A3/5 DNA clonado em vetor lambda EMBL4. Fagos lambda foram plaqueados com células de E. coli K802 (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) sobre placas LB com agarose NZY top. Plaque lifts foram preparados em membranas de náilon HYBOND™ N (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) usando a técnica de Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition', J. Sambrook, E.F. Fritsch, e T. Maniatis; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). DNA foi ligado nas membranas por reticulação por UV usando um UV STRATALINKER™ (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Filtros foram então hibridizados com a sonda N. crassa pyr-4 de 0,78 kb marcada com DIG. Hibridização e detecção de clones pyrG foram realizadas de acordo com o GENIUS™ System User’s Guide (Boehringer Hammheim, Manheim, Alemanha) a 42°C com uma solução de hibridização composta de 5X SSC, formamida 35%, L-lauroil-sarcosina 0,1%, SDS 0,02%, e reagente de bloqueio 1% (Boehringer Hammheim, Manheim, Alemanha). A concentração de sonda marcada com DIG usada foi de 2,5 ng por mF da solução de hibridização. DNA hibridizado foi imuno-detectado com um anticorpo anti- digoxigenina conjugado com fosfatase alcalina (Boehringer Hammheim, Manheim, Alemanha) e visualizado com Lumiphos 530, um substrato quimioluminescente (Boehringer Hammheim, Manheim, Alemanha). Preparações de DNA foram feitas a partir dos clones lamba positivos putativos usando um Lambda Midi Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA).

[00173] Lambda DNA de um clone identificado acima foi digerido com Eco RI e e submetido à eletroforese em gel de agarose 1% em tampão TAE. Um fragmento de 3,9 kb foi excisado e extraído usando um QIAEX® Gel Extraction Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA). O fragmento foi então clonado no sítio Eco RI de pUC18 (Viera e Messing, 1987, Methods in Enzymology 153: 3-11) e células competentes ONE SHOT® TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) foram transformadas com 2 pL da reação de clonagem. DNA plasmideo de oito dos transformantes resultantes foi analisado por sequenciamento de DNA. um clone com a sequência desejada foi selecionado e designado pDM156.2 (Figura 1). O fragmento pyrG hospedou a região codificadora inteira mais 1,3 kb do promotor e 1,5 kb do terminador.

Exemplo 2: Construção de plasmídeo pEmY21

[00174] Um gene de higromicina-fosfo-transferase (hpf) de E. coli (SEQ ID NO: 11 para a sequência de DNA e SEQ ID NO: 12 para a sequência de aminoácidos deduzida) foi amplificado de plasmídeo pPHTI (Cummings et al., 1999, Current Genetics 36: 371-382) usando os seguintes iniciadores: Iniciador direto: 5 ’ -GGGttc gaaTTCATTTAAACGGCT-3 ’ (SEQ ID NO: 13) Iniciador inverso: 5 ’-GGGagcgctCAATATTCATCTCTC-3 ’ (SEQ ID NO: 14)

[00175] Os sítios de enzima de restrição Bst BI (iniciador direto) e Eco 47III (iniciador inverso) foram engenhados para dentro dos iniciadores, representados pela sequência sublinhada, para clonagem.

[00176] A reação PCR (para amplificar o gene hpf) foi composta de tampão de reação IX ThermoPol (New England Biolabs, Inc, Ipswich, MA, USA), dNTPs 200 pM, 50 pmols de iniciadores direto e inverso, 100 pg de pPHTI, 1 unidade de VENT® DNA polymerase (New England Biolabs Inc., Ipswich, MA USA), e água destilada estéril em um volume total de 100 pE. A reação de amplificação foi realizada usando um ROBOCYCLER® programado para 1 ciclo a 95°C por 2 minutos; 25 ciclos cada a 95°C por 1 minuto, 51 °C por 1 minuto, e 72°C por 2 minutos; e 1 ciclo a 72°C por 7 minutos.

[00177] Produtos de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose 1% em tampão TAE. Um fragmento de 1,8 kb foi excisado do gel e extraído usando um QIAQUICK® Gel Extraction Kit. O fragmento purificado em gel foi então clonado em pCR®-BluntII-TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) usando um TOPO® Blunt Cloning Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). O plasmídeo resultante foi designado pEmYlO.

[00178] O sítio Eco RI foi então removido da sequência codificadora do gene hpt em pEmYlO usando um QUIKCHANGE® Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, Ea Jolla, CA, USA) de acordo com as instruções do fabricante usando os iniciadores mostrados abaixo, nos quais as letras minúsculas representam os nucleotídeos não-mutados do sítio Eco RI alvo e as letras sublinhadas representam os nucleotídeos mutados. O plasmídeo resultante foi designado pBK3. Iniciador direto: 5 ’ -GGGTACCCCAAGGGCgTattcTGCAGATGGG-3 ’ (SEQ ID NO: 15) Iniciador inverso: 5 ’ -CCC ATCTGC Agaat AcGCCCTTGGGGT ACCC-3 ’ (SEQ ID NO: 16)

[00179] O gene hpt resultante sem o sítio Eco RI foi amplificado por PCR a partir de pBK3 usando iniciadores direto e inverso mostrados abaixo. Iniciador direto: 5 ’ -GGg gt ac cTTCATTTAAACGGCTTCAC-3 ’ (SEQ ID NO: 17) Iniciador inverso: 5’-GGggtaccCGACCAGCAGACGGCCC-3’ (SEQ ID NO: 18) As porções sublinhadas representam sítios Kpn I introduzidos para clonagem.

[00180] Porções do gene pyrG de Aspergillus oryzae foram usadas para gerar repetições diretas e foram amplificadas por PCR a partir de pSO2 (WO 98/12300) usando os seguintes iniciadores: Repetição 1: Iniciador direto: 5’-TCCçççgggTCTCTGGTACTCTTCGATC-3’ (SEQ ID NO: 19) Iniciador inverso: 5’-GGggtaççCGACCAGCAGACGGCCC-3’ (SEQ ID NO: 20) Repetição 2: Iniciador direto: 5’-GGggtaççT CT CTGGTACT CTT CG AT C-3’ (SEQ ID NO: 21) Iniciador inverso: 5 ’ -TCCcccgggCGACC AGC AG ACGGCCC-3’ (SEQ ID NO: 22)

[00181] As porções sublinhadas representam sítios de restrição Sma I (cccggg) ou Kpn I (ggtacc) introduzidos para clonagem.

[00182] Os três fragmentos (hpt, repetição #1 e repetição #2) foram amplificados em reações separadas (50 pL cada) compostas de tampão de reação IX ThermoPol, dNTPs 200 pM, cada iniciador 0,25 pM, 50 ng de DNA modelo, e 1 unidade de VENT® DNA polimerase. A reação de amplificação foi realizada usando um ROBOCYCLER® programado para 1 ciclo a 95°C por 2 minutos; 30 ciclos cada a 95°C por 1 minuto, 61°C por 1 minuto, e 72°C por 2 minutos; e 1 ciclo a 72°C por 7 minutos.

[00183] Os produtos de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,5% em tampão TAE. O fragmento hpt amplificado de aproximadamente 2 kb e os fragmentos de repetição de aproximadamente 0,2 kb foram excisados dos geles e extraídos usando um MINELUTE® Gel Extraction Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA). Os dois fragmentos de repetição pyrG foram digeridos com KpriL, desfosforilados com fosfatase de intestino de bezerro (New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA), e tratados com um MINELUTE® Reaction Cleanup Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA) de acordo com as instruções do fabricante. Os fragmentos hospedando repetição #1 e gene hpt foram então ligados juntos usando um QUICK LIGATION™ Kit (New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA) de acordo com as instruções do fabricante, e tratados com um MINELUTE® Reaction Cleanup Kit, e a ligação resultante foi clonada em pCR®II Blunt usando um TOPO® Blunt Cloning Kit. Análise de sequência confirmou um clone no qual a repetição #1 e o fragmento hpt estavam ligados juntos em pCR®II Blunt. Este plasmídeo foi designado pEmY18.

[00184] Com o objetivo de clonar a segunda repetição em pEmY18, pEmyl8 foi digerido com Eco RV e a digestão foi purificada por eletroforese em gel de agarose 1% em tampão TAE. Um fragmento de 5,6 kb foi excisado do gel e extraído usando um QIAQUICK® Gel Extraction Kit. O fragmento de Repetição 2 de 0,2 kb (descrito acima) e pEmY18 digerido foram ligados juntos usando um QUICK LIGATION ™ Kit. A mistura de ligação foi usada para transformar Células supercompetentes SOLOPACK® Gold Super competent Cells (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Análise de sequência identificou um plasmídeo no qual os três componentes (repetição #1, hpt e repetição #2) estavam nas ordem e orientação desejadas e eram desprovidos de erros de PCR. O plasmídeo resultante foi designado pEmY20.

[00185] Para garantir que a digestão subsequente de pEmY20 com Eco RI liberaria um fragmento único, um sítio Eco RI foi removido usando um QUIKCHANGE® Site-Directed Mutagenesis Kit de acordo com as instruções do fabricante e iniciadores direto e inverso mostrados abaixo. O plasmídeo resultante foi designado pEmY21 (Figura 2) após verificação de sequência. Iniciador direto: 5 ’ -GGGTACCCC A AGGGCQTATTCTGC AGATGGG-3 ’ (SEQ ID NO: 23) Iniciador inverso: 5 ’ -CCC ATCTGC AG A ATACGCCCTTGGGGTACCC-3 ’ (SEQ ID NO: 24)

Exemplo 3: Construção de plasmídeo pEmY23

[00186] A sequência Fusarium venenatum pyrG codificadora (2.678 pb) foi excisada de pDM 156.2 (Exemplo 1) por digestão com endonucleases de restrição Eco RV e Stu I, e o vetor de 4.398 pb restante foi purificado em gel usando um QIAQUICK® Gel Extraction Kit de acordo com as orientações do fabricante. O fragmento Sma I de pEmY21 foi isolado e purificado em gel usando um QIAQUICK® Gel Extraction Kit e os dois fragmentos purificados em gel foram ligados juntos. Foram selecionados para orientação de inserto, sequenciados para a ausência de erros, e um dos clones com a sequência de inserto correta foi selecionada e designada pEmY23 (Figura 3).

Exemplo 4: Construção de plasmídeo pWTY1470-19-07

[00187] Plasmídeo pJRoy40 (Patente U.S. de N° 7.332.341), que hospeda sequências flanqueadoras 5’ e 3’ de um gene de tricodieno-sintase (tri5) de Fusarium venenatum (SEQ ID NO: 25 para a sequência de DNA e SEQ ID NO: 26 para a sequência de aminoácidos deduzida), foi usado como modelo para a amplificação de uma porção da sequência flanquedora 5’de gene tri5. A reação PCR continha dNTPs 200 pM, tampão IX Taq DNA polimerase, 125 pg de pJRoy40 DNA, 50 pmols de cada iniciador mostrado abaixo, e 1 unidade de Taq DNA polimerase em um volume final de 50 pL. Iniciador direto: 5 ’ -GGGAGATCTTCGTTATCTGTGCC-3' (SEQ ID NO: 27) Iniciador inverso: 5 ’-GGGAGATCTTAGTAGTCGGCATTTGAAAC-3 ’ (SEQ ID NO: 28) (Nucleotídeos sublinhados indicam sítios Bgl II introduzidos).

[00188] A reação de amplificação foi incubada em um ROBOCYCLER® programado para 1 ciclo a 95°C por 3 minutos; 10 ciclos cada a 95°C por 30 segundos, 52°C por 45 segundos, e 7°C por 2 minutos; 20 ciclos cada a 95°C por 30 segundos, 52°C por 45 segundos, e 72°C for 5 minutos; e 1 ciclo a 72°C por 7 minutos.

[00189] Produtos de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,5% usando tampão TBE. Um fragmento de aproximadamente 600 pb foi excisado do gel e extraído usando um MINELUTE® Gel Extraction Kit. O fragmento foi inserido em pCR®2,l (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) usando um TOPO® TA Cloning Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) e células competentes ONE SHOT® TOP10 foram transformadas com 2 pL da reação de clonagem TOPO® TA. DNA plasmídeo de oito dos transformantes resultantes foi digerido com Eco RI e Bgl II em reações separadas e os insertos para três transformantes com os padrões de digestão de restrição corretos foram confirmados por sequenciamento de DNA. Um clone com a sequência desejada foi selecionado e designado pWTY1470-09-05.

[00190] Um fragmento Bgl II de 608 pb hospedando repetição 5’ de gene tri5 foi liberado de pWTYl470-09-05 por digestão com Bgl II, purificado por eletroforese em gel de agarose 1,0% usando tampão TBE, excisado do gel, e extraído usando um MINELUTE® Gel Extraction Kit.

[00191] Plasmídeo pJRoy40 foi linearizado por digestão com Bgl II, após o qual foi desfosforilado usando fosfatase alcalina de camarão (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA) de acordo com as instruções do fabricante, e purificado usando um QIAQUICK® PCR Purification Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA). PJRoy40 linearizado e o fragmento Bgl II purificado em gel foram ligados juntos usando T4 DNA ligase (New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA) de acordo com as instruções do fabricante. Transformação de células de E. coli quimicamente competentes SURE® (Stratagene, La Jolla, CA, USA) foi realizada de acordo com as orientações do fabricante. Um transformante foi confirmado por sequenciamento de DNA para conter o vetor desejado, i.e., hospedando as sequências flanqueadoras 5’ e 3’ de tri5 e uma repetição de uma porção da sequência flanqueadora 5’. O plasmídeo resultante foi designado pWTY1470- 19-07 (Figura 4).

Exemplo 5: Construção de plasmídeo pWTY 1515-02-01

[00192] Plasmídeo pWTY 1470-19-07 foi submetido à mutagênese in vitro usando um QUIKCHANGE® Site-Directed Mutagenesis Kit de acordo com as instruções do fabricante e iniciadores direto e inverso mostrados abaixo. Iniciador direto: 5’- CAAGTAACAGACGCGACAGCTTGCAAAATCTTCGTTATCTGTG-3’ (SEQ ID NO: 29) Iniciador inverso: 5’- CACAGATAACGAAGATTTTGCAAGCTGTCGCGTCTGTTACTTG-3’ (SEQ ID NO: 30)

[00193] A mutagênese removeu o sítio Bgl II em 1779 pb e tornou o sítio Bgl II em 2386 pb exclusivo e utilizável em manipulações subsequentes para inserir fragmentos hospedando cassetes de genes de timidina-cinase (í/c) e de higromicina-fosfo-transferase {hpt). A reação de mutagênese foi usada para transformar as células de E. coli ultracompetentes XLIO-GOLD® fornecidas pelo kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante.

[00194] Um transformante hospedando as mutações indicadas acima, conforme verificadas por análise de sequência, foi designado pWTY1515-2- 01 (Figura 5) e usado como a estrutura principal em Exemplo 8.

Exemplo 6: Construção de plasmídeo pJaL574

[00195] Plasmídeo pDV8 (Patente U.S. de N° 6.806.062) hospeda o gene de timidina-cinase de vírus do Herpes Simples de tipo 1 (HSV1-TK', tk) (SEQ ID NO: 31 para a sequência de DNA e SEQ ID NO: 32 para a sequência de aminoácidos deduzida) como um fragmento Bgl IVBam HI de 1,2 kb inserido entre um fragmento Xho VBgl II de 1,0 kb do promotor gliceraldeído-3- fosfato-desidrogenase (gpdA) de Aspergillus nidulans e um fragmento Bam WJHind III de 1,8 kb hospedando o terminador de transcrição trifuncional indol-glicerol-fosfato sintase, fosfo-ribosil-antranilato-isomerase, e glutamina-amido-transferase (trpC) de Aspergillus nidulans. Plasmídeo pDV8 foi digerido com Bam Hl, extraído com fenol-clorofórmio, precipitado em etanol, e então inserido usando Klenow polimerase (Stratagene, La Jolla, CA, USA). O plasmídeo digerido foi religado usando um QUICK LIGATION ™ Kit seguindo o protocolo do fabricante, tratado com um MINELUTE® Gel Extraction Kit, e os produtos de ligação resultantes foram clonados em pCR®4Blunt-TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) usando um TOPO® Blunt Cloning Kit de acordo com as instruções do fabricante. A reação de clonagem foi transformada em células de E.coli ONE SHOT® quimicamente competentes TOP10 de acordo com as orientações do fabricante. DNA plasmídeo foi extraído de oito dos transformantes resultantes usando um BIOROBOT® 9600 (QIAGEN Inc, Valencia, CA, USA) e selecionado por digestão por restrição usando Xho VBam HI e Xho \/Hind III. Sequenciamento de DNA de DNA plasmídeo dos dois transformantes com o padrão de digestão por restrição correto confirmou que ambos hospedavam a sequência desejada. Um foi nomeado pJaL504-[Bam Hl] (Figura 6).

[00196] Plasmídeo pJaL504-[Bαm Hl] foi digerido com Bgl II, extraído com fenol-clorofórmio, precipitado em etanol, e então inserido usando Klenow polimerase. O plasmídeo digerido foi religado usando um QUICK LIGATION™ Kit seguindo o protocolo do fabricante, tratados com um MINELUTE® Reaction Cleanup Kit, e a ligação resultante foi clonada em pCR®4Blunt-TOPO® usando um TOPO® Blunt Cloning Kit de acordo com as instruções do fabricante. A reação de clonagem foi transformada em células de E. coli ONE SHOT® TOP10 Quimicamente Competentes de acordo com as orientações do fabricante. DNA plasmídeo foi extraído de oito dos transformantes resultantes usando um BIOROBOT® 9600 e selecionado por digestão por restrição usando Xho I/Bgl II e Xho I/Hind III. Sequenciamento de DNA de DNA plasmídeo dos dois transformantes com o padrão de digestão por restrição correto confirmou que ambos hospedavam a sequência desejada. Um foi nomeado pJaL504-[Bgl II] (Figura 7). Punt et al. (1990, Gene 3: 101-109) têm previamente mostrado que 364 pb do promotor gpdA de Aspergillus nidulans poderia ser deletado sem afetar o comprimento do promotor. Baseando nas observações destes autores, iniciador #172450 mostrado abaixo foi designado para truncar o promotor gpdA de Aspergillus nidulans e reduzir o tamanho do vetor. Iniciador 172450: 5’- GACGAATTCTCTAGAAGATCTCTCGAGGAGCTCAAGCTTCTGTAC AGTGACCGGTGACTC-3 ’ (SEQ ID NO: 33)

[00197] A sequência sublinhada corresponde à sequência do promotor gpdA. A sequência restante é um handle hospedando os seguintes sítios de restrição: Eco RI, Xba I, Bgl II, Xho I, e Hind III.

[00198] Para truncamento o terminador trpC de Aspergillus nidulans (de novo para reduzir o tamanho do vetor), iniciador #172499, mostrado abaixo, foi designado hospedando um handle Eco RI. Iniciador 172499: S’-GACGAATTCCGATGAATGTGTGTCCTG-S’ (SEQ ID NO: 34)

[00199] A sequência sublinhada corresponde à sequência de terminador trpC. Amplificação usando iniciadores 172499 e 172450 trunca o promotor em 364 pb e a sequência de terminador trpC em 239 pb.

[00200] PCR foi realizada com os dois iniciadores indicados acima usando pJaL504-[Bgl II] como modelo para gerar um fragmento de 2.522 pb composto de uma versão truncada do promotor gpdA de A. nidulans, a sequência codificadora do gene HSV1-TK, e uma versão truncada do terminador trpC de A. nidulans.

[00201] A reação de amplificação consistiu de 5 pL de Tampão 10X (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 0,4 pL de dNTPs 25 mM, 1,25 pL de iniciador 172450 (100 ng/pL), 1,25 pL de iniciador 172499 (100 ng/pL), 0,5 pL de pJaL504-[Bgl II] (100 ng/pL), 2 pL de Pfu DNA polimerase (Promega Corporation, Madison, Wl, USA) (2,5 U/pE), e 39,6 pL de água destilada estéril A reação de amplificação foi incubada em um ROBOCYCLER® programado por 1 ciclo a 95°C por 45 segundos; e 28 ciclos cada a 95°C por 45 segundos, 57°C por 45 segundos, e 72°C por 5 minutos. Uma extensão final foi realizada por 10 minutos a 72°C.

[00202] A reação de amplificação foi submetida à eletroforese em gel de agarose 1% usando agarose de temperatura de fusão baixa em tampão (TBE) Tris 50 mM - ácido bórico 50 mM - EDTA sódico 1 mM. Um fragmento de 2.522 pb foi excisado do gel e extraído usando um QIAQUICK® Gel Extraction Kit. O DNA purificado em gel foi então inserido em pCR®4Blunt- TOPO® usando um TOPO® Blunt Cloning Kit de acordo com as instruções do fabricante. A reação de clonagem foi transformada em células de E. coli ONE SHOT® TOPIO Quimicamente Competentes de acordo com as orientações do fabricante. DNA plasmídeo foi extraído de oito dos transformantes resultantes usando um BIOROBOT® 9600 e selecionado por digestão por restrição usando Eco RI e Bgl II. Sequenciamento de DNA de DNA plasmídeo dos dois transformantes com o padrão de digestão por restrição correto confirmou que ambos hospedavam a sequência desejada. Um foi designado pJaL574 (Figura 8).

Exemplo 7: Construção de plasmídeo pWTY 1449-02-01

[00203] Plasmídeo pJaL574 foi transformado em células competentes E. coli SCSI 10 (Stratagene, La Jolla, CA, USA) seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante. DNA plasmídeo foi extraído dos vinte e quatro dos transformantes resultantes usando um BIOROBOT® 9600, e então submetido à digestão analítica usando Eco RI e Bgl II. Análise de sequência de DNA subsequente resultou na identificação de um clone com a sequência correta, que foi designado pWTY1449-02-01 (Figura 9).

Exemplo 8: Geração de vetor de deleção de tri5, pJfyS 1579-21-16

[00204] Um cassete de gene de higromicina-fosfo-transferase (hpt) de E. coli foi amplificado por PCR a partir de plasmídeo pEmY23 usando um ADVANTAGE® GC Genomic PCR Kit (Clontech, Paio Alto, CA, USA) e iniciadores direto e inverso gene-específicos mostrados abaixo. A porção sublinhada no iniciador inverso é um sírio Bgl II para clonagem. Iniciador direto: 5’- TTGAACTCTCAGATCCCTTCATTTAAACGGCTTCACGGGC-3’ (SEQ ID NO: 35) Iniciador inverso: 5’- CAGATAACGAAGATCTACGCCCTTGGGGTACCCAATATTC-3 ’ (SEQ ID NO: 36)

[00205] A reação de amplificação continha 362 ng de pEmY23 como DNA modelo, dNTPs 200 pM, acetato de magnésio 1,1 mM, iniciadores 0,4 pM, Tampão de Reação IX GC (Clontech, Palo Alto, CA, USA), GC Melt 0,5 M (Clontech, Palo Alto, CA, USA), e IX GC Genomic Polymerase Mix (Clontech, Palo Alto, CA, USA) em um volume final de 50 pL. A reação de amplificação foi incubada em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf, Munique, Alemanha) programado para 1 ciclo a 95°C por 2 minutos; 25 ciclos cada a 94°C por 30 segundos e 66°C por 3 minutos; e 1 ciclo a 66°C por 3 minutos; e mantido a 4°C.

[00206] Produtos de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose 1% usando tampão TAE. Um fragmento de aproximadamente 1,9 kb foi excisado do gel e extraído usando um MINIELUTE® Gel Extraction Kit. O fragmento foi clonado em pCR®2,l usando um TOPO® TA Cloning Kit de acordo com as instruções do fabricante. Células competentes ONE SHOT® TOP10 foram transformadas com 2 pL da reação TOPO® TA. Análise de sequência de DNA plasmídeo de 8 transformantes confirmou que não houve desvios da sequência esperada e o plasmídeo foi designado pJfyS 1540-75-5 (Figura 10).

[00207] O inserto hpt foi liberado de pJfyS 1540-75-5 por digestão com Bam HI e Bgl II e purificado por eletroforese em gel de agarose 1% em tampão TAE. Um fragmento de 1,9 kb foi excisado e extraído usando um MINIELUTE® Gel Extraction Kit. Um Kit de ligação de DNA rápido foi usado para ligar o fragmento em vetor vazio pWTY1515-2-01 com deleção de tri5 linearizado por Bgl II (Exemplo 5) que havia sido desfosforilado usando fosfatase de intestino de bezerro. Células de E. coli quimicamente competentes SURE® foram transformadas com a reação de ligação e DNA plasmídeo de 24 dos transformantes resultantes foi analisado por digestão por restrição com Eco RI para confirmar a orientação do inserto. Um dos transformantes hospedando o inserto na orientação desejada foi selecionado e designado pJfyS1579-l-13 (Figura 11).

[00208] Um gene de timidina-cinase (tk) de vírus do Herpes Simples (SEQ ID NO: 31 para a sequência de DNA e SEQ ID NO: 32 para a sequência de aminoácidos deduzida) foi amplificado por PCR usando pWTYl449-02-01 como modelo e iniciadores gene-específicos direto e inverso mostrados abaixo. A sequência em negrito representa o sítio Bgl II introduzido. Iniciador direto: 5’- GCCGACTACTAGATCGACCGGTGACTCTTTCTGGCATGCG-3 ’ (SEQ ID NO: 37) Iniciador inverso: 5’- CAGATAACGAAGATCTGAGAGTTCAAGGAAGAAACAGTGC-3’ (SEQ ID NO: 38)

[00209] A reação de amplificação continha tampão de reação IX HERCULASE® (Stratagene, La Jolla, CA, USA), 200 pM dNTPs, 55 ng de pWTY1449-02-01, 0,2 pM iniciadores, 2% DMSO, e 2,5 unidades de HERCULASE® DNA polimerase (Stratagene, La Jolla, CA, USA) em um volume final de 50 pL. A reação de amplificação foi incubada em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® programado para 1 ciclo a 95°C por 1 minuto; 25 ciclos cada a 94°C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos, e 68°C por 2 minutos e 45 segundos; e 1 ciclo a 68°C por 2 minutos e 45 segundos; e a mantido a 4°C.

[00210] Produtos de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose 1% usando tampão TAE. Um fragmento de aproximadamente 2,8 kb foi excisado do gel e purificado usando um MINIELUTE® Gel Extraction Kit. O fragmento foi clonado em pCR®2,1 usando um TOPO® TA Cloning Kit. Células competentes ONE SHOT® TOPIO foram transformadas com 2 pL da reação TOPO® TA. Análise de sequência de DNA plasmídeo de um dos transformantes identificou uma mutação na sequência codificadora tk (C1621G) resultando em uma mudança de aminoácido de glicina para alanina. Esta mutação foi corrigida usando um QUIKCHANGE® II XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA) de acordo com as instruções do fabricante e iniciadores direto e inverso mostrados abaixo. As letras minúsculas indicam a mudança desejada. Análise de sequência de 16 clones resultou na seleção cujo um dos clones foi designado pJfyS 1579-8-6 (Figura 12). Iniciador direto: 5 ’ -CCCTGTTTCGGGgCCCCGAGTTGCTGG-3 ’ (SEQ ID NO: 39) Iniciador inverso: 5 ’ -CCAGCAACTCGGGGcCCCGAAACAGGG-3 ’ (SEQ ID NO: 40)

[00211] Plasmídeo pJfyS 1579-8-6 foi digerido com Bam HI e Bgl II para liberar o fragmento tk de 2,8 kb e o fragmento foi purificado como descrito acima. Este fragmento foi ligado em pJfyS1579-l-13, que havia sido linearizado com Bgl II e tratado com fosfatase de intestino de bezerro, usando um QUICK LIGATION ™ Kit e usado para transformar células de E. coli quimicamente competentes SURE® de acordo com o protocolo do fabricante. O plasmídeo resultante foi designado pJfyS 1579-21-16 (Figura 13) e usado como o cassete de deleção de tri5.

Exemplo 9: Construção de um vetor de deleção hospedando o marcador de seleção negativa timidina-cinase (tk) e o marcador de seleção positiva higromicina-fosfo-transferase (hpt)

[00212] Um vetor de deleção universal hospedando ambos os marcadores timidina-cinase (tk) e higromicina-fosfo-transferase (hpt) foi construído para facilitar a montagem de plasmídeos de deleção subsequentes. Sequências flanqueadoras para regiões 5’ e 3’ do gene selecionado para deleção podem ser facilmente ligadas no vetor após digestão do último com Pme I ou Asc I (para sequências flanqueadoras 5’) e Sbfl ou Swa I (para sequências flanqueadoras 3’).

[00213] Com o propósito de amplificar por PCR as repetições diretas derivadas da região fianquedora 5’ o gene pyrG de Fusarium venenatum, 50 picomols dos iniciadores mostrados abaixo foram usados em duas reações PCR contendo 50 ng de pDM 156.2, tampão IX Pfa Amplification Buffer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 6 pL de uma mistura 10 mM de dNTPs, 2,5 unidades de PLATINUM® Pfx DNA polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), e 1 pL de MgSCL 50 mM em um volume total de 50 pL. Iniciadores: Repetição #1 Iniciador de senso : 5’- GTTTAAACGGCGCGCCCGACAAAACAAGGCTACTGCAGGCAGG -3’ (SEQ ID NO: 41) Iniciador de antissenso: 5 ’ -TTGTCGCCCGGGAATACTCCAACTAGGCCTTG- 3’ (SEQ ID NO: 42) Repetição #2 Iniciador de senso: 5’- AGTATTCCCGGGCGACAAAACAAGGCTACTGCA-3 ‘ (SEQ ID NO: 43) Iniciador de antissenso : 5’- ATTTAAATCCTGCAGGAATACTCCAACTAGGCCTTG-3’ (SEQ ID NO: 44)

[00214] As reações de amplificação foram incubadas em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® programado como segue. Para repetição #1: 1 ciclo a 98°C por 2 minutos; e 5 ciclos cada a 94°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos, e 68°C por 1 minuto. Isto foi seguido por 35 ciclos cada a 94°C por 30 segundos, 59°C por 30 segundos, e 68°C por 1 minuto. Para repetição #2 os parâmetros de ciclo foram: 1 ciclo a 98°C por 2 minutos; e 5 ciclos cada a 94°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos, e 68°C por 1 minuto. Isto foi seguido por 35 ciclos cada a 94°C por 30 segundos, 56°C por 30 segundos, e 68°C por 1 minuto. Após os 35 ciclos ambas as reações (i.e., repetições # 1 e #2) foram incubadas a 68°C por 10 minutos e então esfriadas a 10°C até serem mais adiante processadas.

[00215] Produtos de PCR de ambas as reações foram separados por eletroforese cm gel de agarose-GTG 0,8% (Cambrex Bioproducts, East Rutherford, NJ, USA) usando tampão TAE. Para repetição #1 e repetição #2, fragmentos de aproximadamente 0,26 kb foram excisados dos geles e purificados usando Ultrafree®-DA spin cups (Millipore, Billerica, MA, USA) de acordo com as instruções do fabricante. Dez microlitros de cada repetição purificada foram então usados em uma reação de PCR de sobreposição única contendo tampão IX Pfx Amplification Buffer, 6 pL de uma mistura 10 mM de dATP, dTTP, dGTP, e dCTP, 2,5 unidades de PLATINUM® Pfx DNA polymerase, e 1 pL de MgSOj 50 mM em um volume total de 50 pL. A reação de amplificação foi incubada em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® programado para 1 ciclo a 98°C por 2 minutos; e 5 ciclos cada a 94°C por 30 segundos, 50°C por 30 segundos, e 68°C por 1 minuto. A reação foi então misturada com uma solução preaquecida contendo 50 picomols do iniciador de senso para repetição #1 e 50 picomols do iniciador de antissenso para repetição #2, tampão IX Pfx Amplification Buffer, 6 pL de uma mistura 10 mM de dNTPs, 2,5 unidades de PLATINUM® Pfic DNA polymerase, e 1 pL de MgSCL 50 mM em um volume final de 50 pL.

[00216] A nova reação de amplificação de 100 pL foi incubada em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® programado para 35 ciclos cada a 94°C por 30 segundos, 58°C por 30 segundos, e 68°C por 1 minuto. Após 35 ciclos, a reação foi incubada a 68°C por 10 minutos e então esfriada a 10°C até ser mais adiante processada. Um produto de PCR de 0,5 kb (hospedando a montagem de repetição) foi isolado por eletroforese em gel de agarose-GTG 0,8% como descrito acima.

[00217] Plasmídeo pCR4 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) foi usado como a fonte da estrutura principal de vetor para a construção do vetor de deleção universal. Para as porções não essenciais do pCR4 DNA, 2,5 pg de plasmídeo pTterólC (WO 2005/074647) foram digeridos sequencialmente com Bsp LU 11 I e Bst XI. O vetor digerido foi então tratado com fosfatase Antarctic (New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA). A estrutura principal digerida de 3,1 kb foi isolada por eletroforese em gel de agarose-GTG 0,8% como descrito acima. A montagem de repetição purificada foi então ligada na estrutura principal de vetor purificada com um Kit de ligação rápida (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA). A reação de ligação consistiu de: 75 ng de estrutura principal de vetor purificada e 3 pL da montagem de repetição purificada. Um microlitro desta reação de ligação foi usado para transformar células quimicamente competentes SOLOPACK® Supercompetent cells (Stratagene, Carlsbad, CA, USA) usando o protocolo do fabricante. Vinte e quatro transformantes foram analisados por digestão por restrição com Nco \/Pme I. Vinte e três dos vinte e quatro transformantes tiveram o padrão de digestão por restrição esperado. Clone pFvRs #10 foi selecionado aleatoriamente para sequenciamento para confirmar se não havia erros induzidos por. Análise de sequenciamento mostrou que a montagem de repetição em clone pFvRs #10 tinha a sequência esperada, e foi designada pAILo 1492-24 (Figura 14).

[00218] O cassete hospedando o gene de higromicina-fosfo- transferase (hpt) foi amplificado por PCR a partir de pEmY23 usando os iniciadores direto e inverso gene-específicos mostrados abaixo. A sequência sublinhada representa um sítio xma I site e as Letras em negrito representam um sítio Bgl II site. Os quatro “a”s em cada extremidade 5’ permitem a digestão subsequente das extremidades terminais do produto de PCR. Iniciador direto: 5 ’ -aaaaçççgggCCTTC ATTTA AACGGCTTC ACGGGC-3 ’ (SEQ ID NO: 45) Iniciador inverso: 5’- aaaaçççgggAGATCTACGCCCTTGGGGTACCC AATATTC-3 ’ (SEQ ID NO: 46)

[00219] A reação de amplificação continha 60 ng de pEmY23, dNTPs 200 pM, acetato de magnésio 1 mM, iniciadores 0,4 pM, tampão IX Pfx Amplification Buffer, GC Melt 0,5 M, e 2,5 unidades de PLATINUM® Pfx DNA polymerase em um volume final de 50 pL. A reação foi incubada em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® programado para 1 ciclo a 95°C por 2 minutos; 10 ciclos cada a 94°C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos, e 68°C por 1 minuto 50 segundos; e 1 ciclo a 68°C por 7 minutos seguido por manutenção a 4°C.

[00220] Produtos de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose 1% usando tampão TAE. Um fragmento de aproximadamente 1,8 kb foi excisado do gel e extraído usando um MINIELUTE® Gel Extraction Kit. O produto de PCR purificado em gel foi subsequentemente digerido com Xma I e corrido sobre um gel de agarose 1% agarose e purificado em gel de novo como acima. Um QUICK LIGATION ™ Kit foi usado para ligar o produto de PCR hpt em pAILo 1492-24 linearizado por Xma I, que havia sido tratado com fosfatase de intestino de bezerro. O plasmídeo resultante foi designado pJfyS 1579-35-2 (Figura 15) e foi usado como o recipiente para a inserção do gene de timidina-cinase.

[00221] A fonte do cassete tk de vírus do Herpes Simples foi o plasmídeo pJfyS 1579-8-6 (Exemplo 8), cujo inserto foi liberado por digestão com Bam HI e Bgl II. Os produtos de digestão foram separados por eletroforese em gel de agarose 1% usando tampão TAE, e um fragmento correspondendo ao inserto de gene tk de 2,8 kb foi excisado e extraído usando um MINELUTE® Gel Extraction Kit. Um QUICK LIGATION™ Kit foi usado para ligar o cassete de gene tk em pJfyS 1579-35-2 linearizado por Bgl II, que havia sido tratado com fosfatase de intestino de bezerro. O plasmídeo resultante foi designado pJfyS1579-41-ll (Figura 16).

Exemplo 10: Extração de DNA genômico de cepa 981-0-8 de Trichoderma reesei

[00222] Cepa 981-0-8 de Trichoderma reesei foi crescida em 50 mL de meio YEG em um frasco agitado contendo defletores a 28°C por 2 T//r/o dias com agitação a 200 rpm. Micélios foram colhidos por filtração usando MIRACLOTH® (Calbiochem, La Jolla, CA, USA), lavados duas vezes em água deionizada, e congelados sob nitrogênio líquido. Micélios congelados foram moídos, por um almofariz com pilão, para um pó fino, e o DNA total foi usinado usando um DNEASY® Plant Maxi Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA).

Exemplo 11: Construção de plasmídeo pDAtwlδ de deleção de gene de serina protease semelhante à subtilisina de Trichoderma reesei

[00223] Para construir um cassete de deleção de gene de serina protease semelhante à subtilisina de Trichoderma reesei, um fragmento de 1,4 kb da região não codificadora a jusante do gene de serina protease semelhante à subtilisina de Trichoderma reesei (SEQ ID NO: 1 para a sequência de DNA e SEQ ID NO: 2 (para a sequência de aminoácidos deduzida) foi amplificado por PCR usando oligonucleotídeos 067375 e 067376 mostrados abaixo. Iniciador 067375: 5’- AAAAAACCTGCAGGGATGTAAGAGGGTTTCTTGAGGGGT-3’ (SEQ ID NO: 47) Iniciador 067376: 5’- AAAAAAÇCTGCAGGGCGGCCGCTGATAGTGACATGATACTG-3’ (SEQ ID NO: 48)

[00224] Letras sublinhadas representam um sítio Sbf I adicionado nos iniciadores de senso e de antissenso para facilitar a clonagem do fragmento amplificado e a região em negrito representa um sítio Not I introduzido para digestão por restrição posterior para remover um gene de β-lactamase para transformação fúngica.

[00225] A reação de amplificação foi composta de 300 ng do DNA genômico da cepa 981-0-8 de Trichoderma reesei (Exemplo 10), dNTPs 300 pM, 50 pmols de iniciador 067375, 50 pmols de iniciador 067376, tampão de reação IX, MgSÜ4 1 mM e 2,5 unidades de PLATINUM® Pfx DNA polymerase (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA). A reação foi incubada em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333 (Eppendorf Scientific, Inc., Westbury, NY, USA) programado para 1 ciclo a 98°C por 5 minutos; 30 ciclos cada a 98°C por 30 segundos, 58°C por 30 segundos, e 72°C por 1,6 minutos; e 1 ciclo a 72°C por 15 minutos. Um fragmento de PCR de 1442 pb foi isolado por eletroforese em gel de agarose 1% usando tampão TAE, excisado do gel, e extraído usando um MINELUTE® Gel Extraction Kit. O produto de PCR de 1442 pb foi clonado em pCR®2.1 TOPO® (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) e transformado em células de E. coli quimicamente competentes de acordo com as instruções do fabricante. Transformantes foram selecionados sobre placas de ágar 2X YT suplementado com 100 pg de ampicilina por mL e incubados a 37°C por 16 horas. A sequência de DNA do fragmento clonado foi verificada por sequenciamento de DNA com iniciadores direto e inverso Ml3. O plasmídeo resultante foi designado pClonelO.

[00226] Similarmente, um fragmento de 1,5 kb da região não codificadora a montante do gene de serina protease semelhante à subtilisina de Trichoderma reesei (SEQ ID NO: 1 para a sequência de DNA e SEQ ID NO: 2 para a sequência de aminoácidos deduzida) foi amplificado por PCR usando iniciadores 067377 e 067374 mostrados abaixo. Iniciador 067377: 5’- AAAAAAGGCGCGCCGCGGCCGCAATGGATAGCTAATAATCAA- 3’ (SEQ ID NO: 40) Iniciador 067374: 5’- AAAAAAGGCGCGCCACTGTGGGAGGGCTGTATGGAC A-3 ’ (SEQ ID NO: 50) Letras sublinhadas representam um sítio Asc I adicionado nos iniciadores de senso e de antissenso para facilitar a clonagem do fragmento amplificado e a região em negrito representa um sítio Not I.

[00227] A amplificação por PCR foi realizada sob as mesmas condições descritas acima exceto que foram usados os iniciadores 067377 e 067374. Um fragmento de PCR de 1530 pb foi isolado por eletroforese em gel de agarose 1% usando tampão TAE, excisado do gel, e extraído usando um MINELUTE® Gel Extraction Kit. O fragmento amplificado de 1530 pb foi clonado em vetor pCR®2.1 TOPO® e transformado em células de E. coli quimicamente competentes de acordo com as instruções do fabricante. Transformantes foram selecionados sobre placas de ágar 2X YT suplementadas com 100 pg de ampicilina por mL e incubados a 37°C por 16 horas. A sequência de DNA do fragmento clonado foi verificada por sequenciamento de DNA com iniciadores direto e inverso Ml3. O plasmídeo resultante foi designado pClonel.

[00228] Plasmídeo pClonel foi digerido com Asc I e a digestão foi purificada por eletroforese em gel de agarose 1% em tampão TAE. Um fragmento de 1415 pb contendo a região não codificadora a montante do fragmento de gene de serina protease semelhante à subtilisina de Trichoderma reesei foi excisado do gel e extraído usando um MINELUTE® Gel Extraction Kit. Este inserto foi ligado em pjfysi579-41- 11 digerido por Asc I e desfosforilado com fosfatase de intestino de bezerro (CIP) (Exemplo 9) usando um QUICK LIGATION™ Kit (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. Análise de restrição foi usada para identificar os transformantes contendo o inserto na orientação desejada e a análise da sequência foi realizada para confirmar a ausência de erros de PCR. O plasmídeo resultante foi designado pClonel4.

[00229] O cassete de deleção de gene de serina protease semelhante à subtilisina de Trichoderma reesei final, pDAtwl8 (Figura 17), foi preparado por digestão de pClonelO com Sbfl para liberar a região não codificadora a jusante de 1,5 kb do fragmento do gene de serina protease semelhante à subtilisina de Trichoderma reesei, que foi então ligado em pClonel4 digerido por Sbfl e desfosforilado por fosfatase de intestino de bezerro (CIP) usando um QUICK LIGATION™ Kit de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. Um fragmento linear de 7,7 kb contendo o alelo TrSpd::hpt/tk pôde então ser gerado por digestão com Not I.

Exemplo 12: Geração e transformação de protoplasto de Trichoderma reesei

[00230] Preparação e transformação de protoplaso foram realizadas usando um protocolo modificado por Penttila et al., 1987, Gene 61: 155- 164. Resumidamente, cepa 981-0-8 de Trichoderma reesei foi cultivada em 25 mL de meio YP suplementado com 2% (p/v) de glicose e uridina 10 mM a 27°C por 17 horas com agitação suave a 90 rpm. Micélios foram colhidos por filtração usando um Sistema de Filtração Descartável Acionado por Vácuo da Millipore (Millipore, Bedford, MA, USA) e lavados duas vezes com água deionizada e duas vezes com sorbitol 1,2 M. Protoplastos foram gerados por suspensão dos micélios lavados em 20 mL de sorbitol 1,2 M contendo 15 mg de GLUCANEX® 200 G (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) por mL e 0,36 unidade de quitinase (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) por mL por 15-25 minutos a 34°C com agitação suave a 90 rpm. Protoplastos foram colhidos por centrifugação por 7 minutos a 400 x g e lavados duas vezes com sorbitol 1,2 M frio. Os protoplastos foram contados usando um hemacitômetro e ressuspensos para uma concentração final de 1 x 108 protoplastos/mL em STC. Protoplasts em excesso foram armazenados em um Recipiente de Congelamento Cryo 1°C (Nalgene, Rochester, NY, USA) a -80°C.

[00231] Aproximadamente 10 ng de cada um dos cassetes de deleção descritos nos exemplos seguintes foram digeridos quer com Not I (Exemplos 13 e 20) quer com Hind III/Bgl II (Exemplo 17). Cara reação de digestão foi purificada por eletroforese em gel de agarose 1% em tampão TAE, uma banda de DNA foi excisada do gel, e extraída usando um QIAQUICK® Gel Extraction Kit. O DNA purificado resulte foi adicionado em 100 pL da solução de protoplasto e suavemente misturado. Tampão PEG (250 pL) foi adicionado, misturado, e incubado a 34°C por 30 minutos. STC (3 ml) foi então adicionado, misturado e plaqueado sobre meio PDA suplementado com sacarose 1 M. Após incubação a 28°C por 16 horas, 15 mL de um meio de PDA de sobreposição suplementado com 100 pg de higromicina B por mL foram adicionados em cada placa. As placas foram incubadas a 28°C por 4-6 dias.

Exemplo 13: Geração de cepa DAtwl8-97 de Trichoderma reesei por deleção de gene de serina protease semelhante à subtilisina

[00232] Protoplastos de cepa 981-0-8 de Trichoderma reesei foram transformados com pDAtwl8 linearizado por Not I usando o método descrito em Exemplo 12 para deletar o gene de serina protease semelhante à subtilisina. Seiscentos e sessenta e seis transformantes foram selecionados sobre placas PDA contendo 25 pg de higromicina B por mL. Os transformantes foram subeultivados em placas PDA para gerar esporos. Cada transformante foi cultivado em um frasco de agitação de 125 mL com defletor contendo 25 mL de meio indutor de celulase em pH 6,0 e incubado a 28°C por 7 dias com agitação a 200 rpm. Cepa 981-0-8 de Trichoderma reesei foi cultivada como um controle. Amostras de caldo de cultura foram removidas 7 dias após inoculação, centrifugadas a 15.700 x g por 5 minutos em uma microcentrífuga, e os sobrenadantes foram transferidos para tubos novos..

[00233] Um ensaio de protease usando um substrato sintético, N- Succinil-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitro-anilida (AAPF) (Bachem AG, Bubendorf, Suíça), foi realizado nos sobrenadantes acima para determinar se alguns dos transformantes tiveram deletado o gene de serina protease semelhante à subtilisina. O substrato foi inicialmente dissolvido em dimetil-sulfóxido em uma concentração de 100 mg/mL. O substrato dissolvido foi então diluído 50 vezes em NaCl 100 mM- MOPS 100 mM pH 7,0. A reação foi iniciada pela adição de 10 pL de cada sobrenadante de transformante emlOO pL do substrato diluído em uma placa de 96 cavidades de fundo plano (Corning Inc., Acton, MA, USA). A placa de reação foi incubada a 50°C por 3 horas e então a absorbância a 405 nm foi medida usando um SPECTRAMAX® Microplate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Atividades de protease dos transformantes DAtwl8 de Trichoderma reesei foram comparadas com aquela da cepa parental 981-0-8 de Trichoderma reesei.

[00234] Quinze transformantes exibindo atividades de protease extracelular mais baixas em comparação com a cepa 981-0-8 de Trichoderma reesei foram então analisados por análise Southern. DNA genômico de cada um dos 15 transformantes foi extraído como descrito em Exemplo 11 e 2 pg de cada um foram digeridos com 20 unidades de Nco I-HF™ (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA, USA) por 16 horas a 37°C. DNA digerido foi fracionado por eletroforese em gel de agarose 0,7% usando tampão TAE por 4 horas e transferido como mancha (blotted) para cima de uma membrana NYTRAN™ Supercharge membrane (Schleicher & Schuell BioScience, Keene, NH, USA) usando um TURBOBLOTTER™ (Schleicher & Schuell BioScience, Keene, NH, USA) por 16 horas seguindo as recomendações do fabricante. A membrana foi hibridizada com uma sonda de gene de serina protease semelhante à subtilisina de 502 pb marcado com digoxigenina, que foi sintetizado pela incorporação de digoxigenina-11- dUTP por PCR usando iniciadores 067911 (senso) e 067912 (antissenso) mostrados abaixo. Iniciador 067911 (senso): GCGGTCATTTACAGTGCCTCGAATA (SEQ ID NO: 51) Iniciador 996117 (antissenso): CTGCTCTGTTAGCAATCCTCAAGCA (SEQ ID NO: 52)

[00235] A reação de amplificação (50 pL) foi composta de Tampão de Reação IX ThermoPol, 5 pL de PCR DIG Labeling Mix, 10 ng de pDAtwl8, iniciador 067911 0,3 pM, iniciador 067912 0,3 pM, e 2,5 unidades de Taq DNA polimerase. As reações foram incubadas em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333 programado por 30 ciclos cada a 95°C por 30 segundos, 56°C por 30 segundos, e 72°C por 40 segundos (extensão final por 15 minutos). Cinco microlitros do produto de PCR foram selecionados por tamanho por eletroforese em gel de agarose 1,5% usando tampão TAE, corados com brometo de etidio, e visualizados sob um transiluminador de UV. Incorporação de digoxigenina foi indicada pelo aumento da massa molecular.

[00236] Hibridização foi realizada em tampão DIG Easy Hyb (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, USA) a 42°C por 17 horas. A membrana foi então lavada sob condições de estringência alta em 2X SSC mais SDS 0,1% por 5 minutos na temperatura ambiente seguido por duas lavagens em 0,5X SSC mais SDS 0,1% por 15 minutos cada a 65°C. Os híbridos de sonda-alvo foram detectados por ensaio quimioluminescente (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, USA) seguindo as instruções do fabricante. Análise Southern indicou que todos os 15 transformantes continham uma única integração do cassete de deleção em um local de gene de serina protease semelhante à subtilisina sem qualquer outra integração do fragmento de deleção em outros locais. Uma cepa designada Trichoderma reesei DAtwl8-97 foi escolhida para transformações subsequentes.

Exemplo 14: Construção de plasmídeo pSaMe-AaXYL

[00237] Plasmídeo pSaMe-AaXYL foi construído para compreender o promotor e o terminador de gene de celobiohidrolase I de Trichoderma reesei e a sequência codificadora de xilanase GH10 de Aspergillus aculeatus.

[00238] Clonagem da xilanase de Aspergillus aculeatus seguiu o protocolo de expressão total como descrito em H. Dalb0ge et al., 1994, Mol. Gen. Genet. 243: 253-260.

[00239] RNA foi isolado de micélio de Aspergillus aculeatus CBS 101.43. Poli(A)+ RNA foi isolado de RNA total por cromatografia sobre oligo(dT)-celulose. CDNA de fita dupla foi sintetizado como descrito por Maniatis et al. (Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Eaboratory Press, 1982). Após a síntese cDNA foi tratado com nuclease de feijão-mungo, sua extremidade foi cegada com T4 DNA polimerase, e ligado em adaptadores Bst XI não-palindrômicos (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). O cDNA foi fracionado por tamanho por eletroforese em gel de agarose 1% usando tampão TAE onde fragmentos variando de 600 pb a 4000 pb foram usados na construção de biblioteca. O DNA foi ligado empYES digerido por Bst XI entre o promotor GAL e o terminador iso-l-citocrome c e transformado em células de Escherichia coli MC1061 (Stratagene, La Jolla, CA, USA). A biblioteca foi plaqueada sobre placas LB e incubada durante a noite a 37°C. As colônias foram raspadas das placas e ressuspensas em meio LB suplementado com 100 pg de ampicilina por mL. DNA plasmídeo foi isolado usando um Plasmid Midi Kit (QIAGEN Inc., Valenicia, CA, USA). O DNA plasmídeo purificado foi reunido.

[00240] A mistura de DNA plasmídeo purificada foi transformada em células de Saccharomyces cerevisiae W3124 (MATa; ura 3-52; leu 2- 3, 112; his 3-D200; pep 4-1137; prcl::HIS3; prbl:: LEU2; cir+; van den Hazel et al., 1992, Eur. J. Biochem. 207: 277-283). Cultivo, transformação e meios foram como descritos por Guthrie et al., 1991, Meth. Enzymol. Vol 194, Academic Press. As células transformadas foram plaqueadas sobre ágar completo sintético contendo 2% de glicose por 3 dias a 30°C. Após 3 dias as colônias foram duplamente plaqueadas sobre meio SC (Sherman, 2002, Methods Enzymol. 350: 3-41) com 2% de galactose e incubadas por 4 dias a 30°C. Colônias expressando xilanase foram identificadas por sobreposição em agarose 1% agarose com AZCL-Birch-Xilan 0,1% em pH 4,5 (Dalb0ge, 2006, FEMS Microbiology Reviews 21: 29-42). Colônias expressando atividade de xilanase foram circundadas por uma zona azul . DNA plasmídeo, recuperado das colônias positivas, continha um inserto de DNA de aproximadamente 1,3 kb. Sequenciamento do fragmento de gene isolado revelou uma matriz de leitura aberta de 1218 pb codificadora de um polipeptídeo com um peso molecular teórico de 43,0 kDa. O fragmento de cDNA fragmento foi subclonado no vetor de expressão pHD464 de Aspergillus (Dalbpge e Heldt-Hansen, 1994, Mol. Gen. Genet. 243, 253-260) digerido com Bam HI e Xho I pelo corte do clone com Bam HI e Xho I e isolando o inserto de cDNA de 1,2 kb (Christgau et al., 1996, Biochem. J. 319: 705-712) para gerar o plasmídeo pA2X2.

[00241] A sequência codificadora de xilanase GH10 de Aspergillus aculeatus foi amplificada por PCR usando plasmídeo pA2x2 como modelo e iniciadores 153505 e 153506 mostrados abaixo usando métodos padrão para dar um fragmento de aproximadamente 1,2 kb. O fragmento de 1,2 kb foi digerido com Bam HI e Xho I (introduzido nos iniciadores PCR) e clonado em vetor pCaHj527 (WO 2004/099228). O plasmídeo resultante foi designado pMT2155 no qual o cDNA esteve sob controle transcricional do promotor amilase neutra II (NA2) de A. niger e do terminador AMG de A. niger. Iniciador 153505: 5’- TCTTGGATCC ACC ATGGTCGGACTGCTTTCAATCACC-3 ’ (SEQ ID NO: 53) Iniciador 153506: 5’- TTAACTCGAGTCACAGACACTGCGAGTAATAGTC-3’ (SEQ ID NO: 54)

[00242] Dois oligonucleotídcos iniciadores sintéticos mostrados abaixo foram planejados para amplificar por PCR O gene GH10 de Aspergillus aculeatus de plasmídeo pMT2155 e introduz regiões flanqueadoras para inserção no vetor de expressão pMJ09 (WO 2005/056772). Letras em negrito representam a sequência codificadora e a sequência restante é homóloga aos sítios de inserção de pMJ09. Iniciador direto: 5’-cggactgcgcaccatggtcggactgctttcaat-3’ (SEQ ID NO: 55) Iniciador inverso: 5’-tcgccacggagcttatcacagacactgcgagtaat-3’ (SEQ ID NO: 56)

[00243] A reação de amplificação foi composta de 50 picomols de cada um dos iniciadores acima, 50 ng de pMT2155, 1 gL de mistura 10 mM de dATP, dTTP, dGTP, e dCTP, 5gL de tampão 10X ACCUTAQ™ DNA polymerase Buffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), e 5 unidades de ACCUTAQ™ DNA polymerase (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), em um volume final de 50 gL. Um EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333 foi usado para amplificar o fragmento de DNA programado para 1 ciclo a 95°C por 3 minutos; e 30 ciclos cada a 94°C por 45 segundos, 55°C for 60 segundos, e 72°C por 1 minuto 30 segundos. Depois de 30 ciclos, a reação foi incubada a 72°C por 10 minutos e então esfriado para 4°C até processamento mais adiante.

[00244] Os produtos de reação foram isolados por eletroforese em gel de agarose 1,0% usando tampão TAE onde uma banda de produto 1,2 kb foi excisada do gel e purificada usando um QIAQUICK® Gel Extraction Kit de acordo com as instruções do fabricante.

[00245] O fragmento foi então clonado em pMJ09 usando um INFUSION™ Cloning Kit (Clontech, Inc., Palo Alto, CA, USA). O vetor foi digerido com Neo I e Pac I e purificado por eletroforese em gel de agarose como descrito acima. O fragmento de gene de 1,2 kb e o vetor digerido estavam ligados juntos em uma reação resultando na expressão de plasmídeo pSaMe-AaXYL no qual a transcrição do gene da Família GH10 esteve sob o controle do promotor cbhl de T. reesei. A reação de ligação (50 gL) foi composta de tampão IX IN-FUSION™ Buffer (Clontech, Inc., Paio Alto, CA, USA), IX BSA, 1 gL de enzima INFUSION™ (diluída a 1:10) (Clontech, Inc., Paio Alto, CA, USA), 100 ng de pAILo2 digerido com Neo I e Pac I, e 100 ng de produto de PCR purificado xilanase GH10 de Aspergillus aculeatus. A reação foi incubada na temperatura ambiente por 30 minutos. Um gL da reação foi usado para transformar células de E. coli XL 10 SOLOPACK® Gold (Stratagene, La Jolla, CA, USA) de acordo com o fabricante. Um transformante de E. coli contendo pSaMe-AaXYL (Figura 18) foi detectado por digestão por enzima de restrição e DNA plasmídeo foi preparado usando um BIOROBOT® 9600. Sequenciamento de DNA do gene GHO de pSaMe-AaXYL de Aspergillus aculeatus foi realizado usando a química de corante-terminador (Giesecke et al., 1992, JournaL de Virology Methods 38: 47-60) e a estratégia de caminhada em iniciador

Exemplo 15: Expressão de xilanase GH10 de Aspergillus aculeatus em cepa DAtw 18-97 deficiente em serina protease semelhante à subtilisina

[00246] Protoplastos foram gerados da cepa DAtwl8-97 de Trichoderma reesei deficiente em serina protease semelhante à subtilisina de acordo com o procedimento descrito em Exemplo 12 e transformados com construto de expressão pSaMe-AaXYL de Trichoderma reesei (Exemplo 14) contendo a sequência codificadora de xilanase GH10 de Aspergillus aculeatus para determinar a estabilidade de xilanase GH10 de A. aculeatus expressada por T. reesei DAtwl8-97. Transformação foi realizada pela adição de aproximadamente3 pg de pSaMe-AaXYL digerido por Pme I e purificado em gel em 100 pL de solução de protoplasto e misturando suavemente. Tampão PEG (250 pL) foi adicionado e misturado, e incubado a 37°C por 30 minutos. STC (3 ml) foi então adicionado, misturado, e plaqueado sobre placas COVE. As placas foram incubadas a 28°C por 7-10 dias. Após uma rodada única de purificação de esporos sobre placas COVE2, 20 transformantes foram crescidos em frascos de agitação em escala pequena contendo 25 mL de meio indutor de celulase por 5 dias a 28°C, após os quais o sobrenadante foi colhido por centrifugação a 15.700 x g por 10 minutos em uma microcentrífuga.

[00247] Expressão da xilanase GH10 de Aspergillus aculeatus foi analisada usando geles CRITERION™ Tris-HCl 8-16% (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) com uma célula CRITERION™ Cell (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Cinco pL de cada uma de 5 amostras foram suspensos em concentração 2X de Tampão de Amostra Laemmli (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) e aquecidos a 95°C por 5 minutos na presença de 5% de β-mercapto- etanol. Todas as amostras foram carregadas para cima dos geles CRITERION™ Tris-HCl e submetidas à eletroforese em tampão de corrida IX Tris/Glicina/SDS (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Os geles resultantes foram corados com BIO-SAFE™ Coomassie Stain (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Perfis de SDS-PAGE das culturas mostraram predominantemente a presença de proteína xilanase GH10 de Aspergillus aculeatus de comprimento completo mas também um fragmento menor presente em quantidades mais baixas. Os resultados sugeriram que a deleção de um gene de serina protease semelhante à subtilisina para a produção de xilanase GH10 de Aspergillus aculeatus não preveniu completamente a proteólise da proteína.

Exemplo 16: Construção de plasmídeo pAgJglll de deleção de gene de protease aspártica de Trichoderma reesei

[00248] O vetor de deleção pAgJglll foi construído para interromper a expressão de uma protease aspártica de 42 kDa de Trichoderma reesei (SEQ ID NO: 3 para a sequência de DNA e SEQ ID NO: 4 para a sequência de aminoácidos deduzida) em cepa 981-0-8 de Trichoderma reesei. Plasmídeo pAgJgllO foi gerado primeiro pela amplificação da região codificadora de protease aspártica mais ou menos 600 pb a montante e a jusante da região codificadora usando iniciadores 066694 (senso) e 066695 (antissenso) mostrados abaixo. Iniciador 066694 (senso): ACGAATGGTCAAAGGACTATGTATCAT (SEQ ID NO: 57) Iniciador 066695 (antissenso): CACATACCCAGAGTCAGGCCCTGCG (SEQ ID NO: 58)

[00249] A região de protease aspártica foi amplificada por PCR em uma reação composta de 316 ng de DNA genômico de cepa 981-0-8 ^Trichoderma reesei (Exemplo 10), 1 pL de Herculase II Fusion DNA polymerase (Stratagene, LaJolla, CA, USA), 50 pmols de iniciador 066694, 50 pmols de iniciador 066695, 5 pL de dNTPs 10 mM, 5 pL de tampão de reação 5X Herculase II (Stratagene, LaJolla, CA, USA), e 35 pL de água. A reação foi incubada em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333 programado para 1 ciclo a 95°C por 2 minutos; 30 ciclos cada a 95°C por 20 segundos, 60°C por 20 segundos, e 72°C por 1 minuto 30 segundos; 1 ciclo a 72°C por 3 minutos; e a mantida a 4°C. Um fragmento de PCR de 2,5 kb foi purificado por eletroforese em gel de agarose 1% usando tampão TAE, excisado do gel, e extraído usando um QIAQUICK® Gel Extraction Kit de acordo com as instruções do fabricante.

[00250] O fragmento de PCR purificado em gel foi tratado com Taq DNA polimerase para adicionar saliências-A 3’ no fragmento em uma reação composta de 5 pL de fragmento purificado por PCR, 1 pL de Tampão I0X Thermopol (New England Biolabs, Inc, Ipswich, MA, USA), 0,5 pL de dNTPs 10 mM, 0,5 pL de Taq DNA polimerase, e 3 pL de água. A reação foi incubada a 72°C por 15 minutos. O fragmento de gene de protease aspártica foi clonado em pCR®2.1-TOPO® de acordo com a instrução do fabricante para gerar pAgJgllO. A reação de clonagem foi composta de 2 pL de fragmento de PCR de protease aspártica, 1 pL de Solução Salina (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 2 pL de água, e 1 pL de pCR®2.1-TOPO®.

[00251] Para construir o plasmídeo pAgJglll, pAgJgllO foi digerido com Bmg I e BstE II em uma reação composta de 5 pg de pAgJgllO DNA, 3 pL de Bmg I, 3 pL de BstE II, 10 pL de Tampão 10X NEB Buffer 3 (New England Biolabs, Inc, Ipswich, MA, USA), 1 pL de 100X BSA, e 53 pL de água. A digestão de pAgJgllO foi incubada a 37°C por 1 hora, e então a 60°C por 1 hora. O pAgJgllO digerido teve então sua extremidade cegada pela adição de 10 pL de ÓNTPS 10 mM, e 12,5 unidades de DNA polimerase I, Fragmento Grande (Klenow) (New England Biolabs, Inc, Ipswich, MA, USA). A reação foi incubada a 37°C por 15 minutos. O pAgJgllO de extremidade cega digerido foi purificado por eletroforese em gel de agarose 1% usando tampão TAE, excisado do gel, e extraído usando um QIAQUICK® Gel Extraction Kit de acordo com as instruções do fabricante. Plasmídeo pHT (Cummings et al., 1999, Current Genetics 36: 371-382) foi digerido com Hind III e Ava I em uma reação composta de 1,86 pg de pHT DNA, 3 pL de Hind III, 3 pL de Ava I, 10 pL de tampão 10X NEB Buffer 2 (New England Biolabs, Inc, Ipswich, MA, USA), e 51 pE de água a 37°C por 2,5 horas e então sua extremidade foi cegada pela adição de 10 pL de dNTPs 10 mM e 12,5 unidades de DNA polimerase I, Fragmento Grande (Klenow) e incubando a 37°C por 15 minutos. O pHT de extremidade cega digerido foi purificado por eletroforese em gel de agarose 1% usando tampão TAE e um fragmento de 1,9 kb foi excisado do gel e extraído usando um QIAQUICK® Gel Extraction Kit de acordo com as instruções do fabricante.

[00252] Os fragmentos resultantes de pAgJgllO e pHT foram ligados juntos para formarem pAgJglll (Figura 19) usando T4 DNA ligase em reação composta de 88 ng de fragmento pHT, 106 ng de fragmento pAgJgllO, 1,5 pL de tampão 10X T4 DNA ligase Buffer (New England Biolabs, Inc, Ipswich, MA, USA), 1 pL de T4 DNA ligase (New England Biolabs, Inc, Ipswich, MA, USA), e 0,5 pL de água.

Exemplo 17: Geração cepa AgJgl 11-50 de Trichoderma reesei por deleção de gene de protease aspártica

[00253] Protoplastos de cepa 981-0-8 de Trichoderma reesei foram transformados com pAgJglll linearizado com Hind 111/Bgl I usando o método descrito em Exemplo 12 para deletar o gene de protease aspártica. Noventa transformantes foram selecionados sobre placas PDA contendo 25 pg de higromicina B por mL. Os transformantes foram subcultivados em placas PDA para gerar esporos.

[00254] Possíveis candidatos de cepa 981-0-8 de Trichoderma reesei contendo o vetor de deleção pAgJglll no local de protease aspártica, disruptando deste modo a expressão da protease aspártica, foram selecionados por PCR de Colônia Fúngica usando um protocolo modificado de Suzuki et al., 2006, J. Bioscience e Bioengineering 102: 572-574. Uma quantidade pequena de esporos de cada candidato foi suspensa em 25 pL de tampão TE e aquecida em temperatura alta em um forno de micro-ondas por 1 minuto. A suspensão de espostos aquecida em micro-ondas foi usada como um modelo em uma reação PCR para selecionar a deleção de protease aspártica. A reação foi composta de 1 pL de suspensão de esporos, 1 pL de dNTPs 10 mM, 12,5 pL de tampão 2X ADVANTAGE® GC-Melt LA Buffer (Clontech, Mountain View, CA, USA), 25 pmols de iniciador 066694 (16), 25 pmols de iniciador 066695 (Exemplo 16), 1,25 unidades de ADVANTAGE® GC Genomic LA Polymerase Mix (Clontech, Mountain View, CA, USA), e 9,25 pL água. A reação foi incubada em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® programado para 1 ciclo a 95°C por 10 minutos; 35 ciclos cada a 95°C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos, e 72°C for 4 minutos 30 segundos; 1 ciclo a 72°C por 5 minutos; e uma manutenção a 4°C. Os iniciadores usados nesta seleção foram originalmente utilizados para amplificar a região de protease aspártica. Se o vetor de deleção foi inserido no local de protease aspártica, o fragmento de PCR amplificado deve ser maior do que o fragmento de tipo selvagem porque ele contém o cassete hph usado para interromper o gene de protease aspártica. Os candidatos que exibiram uma banda mais larga na primeira seleção por PCR de Colônia Fúngica foram submetidos a uma segunda seleção por PCR usando os iniciadores mostrados abaixo. Iniciador 068331 (senso): ATATCTCTCTCGAGGCCTGCTTATT (SEQ ID NO: 59) Iniciador 067947 (antissenso): CTACATCGAAGCTGAAAGCACGAGA (SEQ ID NO: 60)

[00255] Iniciador 068331 está a montante da região 5’ do gene de protease aspártica contido na cepa de deleção, e iniciador 067947 está no cassete hph. Apenas aqueles candidatos que contêm a disrupção de protease aspártica produziriam um fragmento de PCR. A reação de amplificação foi composta de 1 pL de DNA genômico do candidato (extraído de acordo com Exemplo 10), 1 pL de dNTPs 10 mM, 12,5 pL de tampão 2X ADVANTAGE® GC-Melt LA Buffer, 25 pmols de iniciador 068331, 25 pmols de iniciador 067947, 0,25 pL de 1,25 unidades de ADVANTAGE® GC Genomic LA Polymerase Mix, e 9,25 pL de água. A reação foi incubada em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® programado para 1 ciclo a 95°C por 2 minutos; 30 ciclos cada a 95°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos, e 72°C por 2 minutos; 1 ciclo a 72°C por 5 minutos; e uma manutenção a 4°C.

[00256] Análise de Southern blot foi realizada para confirmar a disrupção do gene de protease aspártica pelo plasmídeo pAgJglll. DNA genômico foi extraído da cepa de deleção e cepa 981-0-8 de Trichoderma reesei como descrito em Exemplo 10. Dois pg de DNA genômico da cepa de deleção e da cepa 981-0-8 de Trichoderma reesei, bem como 1 ng de DNA plasmídeo de pAgJglll, foram digeridos com Neo I e Pvu II. Cepa 981-0-8 de T. reesei e pAgJglll foram incluídos em Southern blot como controles. A reação de digestão de DNA foi composta de 2 pg de DNA genômico, 1 pL de Neo I, 1 pL de Pvu II, 5 pL de tampão 10X NEB Buffer 2, e água para 50 pL. Ambas as digestões de DNA foram incubadas a 37°C por aproximadamente 14-16 horas. Plasmídeo pAgJglll foi digerido em uma reação composta de 1 ng de pAgJglll DNA, 0,5 pL de Neo I, 0,5 pL de Pvu II, 2 pL de tampãoJOX NEB Buffer 2, e água to 20 pL. A digestão foi incubada a 37°C por aproximadamente 1 hora.

[00257] As digestões foram submetidas à eletroforese em gel de agarose 0,7% usando tampão TAE e transferidas como manchas (blotted} para membrana NYTRAN® Supercharge blotting membrane usando um TURBOBLOTTER® por 14-16 horas seguindo as recomendações do fabricante. A membrana foi hibridizada com uma sonda de 500 pb de protease aspártica de 42 kDa de Trichoderma reesei marcada com digoxigenina, que foi sintetizada pela incorporação de digoxigenina-11-dUTP por PCR usando iniciadores 068128 (senso) e 068129 (antissenso) mostrados abaixo. Iniciador 068128 (senso): AGTCAGGTTCAGCAGATCGCCAGGGATGG (SEQ ID NO: 61) Iniciador 068129 (antissenso): GTGGTTCTCCAACGCCGCCAGCAGC (SEQ ID NO: 62)

[00258] A reação de amplificação foi composta de 5 gL de tampão 10X ThermoPol Reaction Buffer, 2,5 gL de PCR DIG Labeling Mix, 2 ng de pAgJglll, 50 pmols de iniciador 068128, 50 pmols de iniciador 068129, 2,5 pL de dNTPs 10 mM, 5 unidades de Taq DNA polimerase, e 35,5 pL de água. As reações foram incubadas em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333 programado para 1 ciclo a 95°C por 2 minutos; 30 ciclos cada a 95°C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos, e 72°C por 40 segundos; 1 ciclo a 72°C por 15 minutos; e uma manutenção a 4°C. O produto de reação PCR foi purificado por eletroforese em gel de agarose 1% usando tampão TAE, excisado do gel, e extraído usando um QIAQUICK® Gel Extraction Kit de acordo com as instruções do fabricante. Incorporação de digoxigenina foi indicada pelo aumento da massa molecular.

[00259] Hibridização foi realizada em tampão DIG Easy Hyb a 42°C por 15-17 horas. A membrana foi então lavada sob condições de estringência alta em 2X SSC mais SDS 0,1% por 5 minutos na temperatura ambiente seguido por duas lavagens em 0,5X SSC mais SDS 0,1% por 15 minutos cada a 65°C. Os híbridos de sonda-alvo foram detectados por ensaio quimioluminescente (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, USA) seguindo as instruções do fabricante. A cepa contendo a deleção de protease aspártica foi designada Trichoderma reesei AgJgl 11-50.

Exemplo 18: Expressão de xilanase GH10 de Aspergillus aculeatus em cepa AgJgl 11 -50 deficiente em protease aspártica

[00260] Para determinar se deleção da protease aspártica de 42 kD foi efetiva na eliminação da degradação da xilanase GH10 de Aspergillus aculeatus, plasmídeo pSaMe-AaXYL (Exemplo 14), que contém a sequência codificadora de xilanase GH10 de Aspergillus aculeatus, foi transformado em Trichoderma reesei AgJgl 11-50. Protoplastos de T. reesei AgJgl 11-50 foram gerados como descrito em Exemplo 12 e transformados com plasmídeo pSaMe-AaXYL. Vinte transformantes contendo a xilanase GH10 de Aspergillus aculeatus foram aleatoriamente selecionados de placas COVE e cultivados em frascos de agitação de 125 mL contendo 25 mL de meio indutor de celulase em pH 6,0 inoculado com esporos dos transformantes e incubados a 28°C por 5 dias com agitação a 200 rpm. Cepa 981-0-8 de Trichoderma reesei e Trichoderma reesei AgJgl 11-50 foram ambas cultivadas como controles. Amostras de caldo de cultura foram removidas 5 dias após a inoculação, centrifugadas a 15.700 x g por 10 minutos em uma microcentrífuga, e os sobrenadantes foram transferidos para tubos novos.

[00261] Os sobrenadantes foram analisados por SDS-PAGE usando um gel CRITERION ™ Tris-HCl 8-16% com uma célula CRITERION ™ Cell. Cinco pL de cada uma das 5 amostras foram suspensos em concentração 2X de Tampão de Amostra Laemmli e aquecidos a 95°C por 5 minutos na presença de β-mercapto-etanol 5%. Todas as amostras foram carregadas para cima dos geles de SDS-PAGE e submetidas à eletroforese em tampão de corrida IX Tris/Glicina/SDS. Os geles resultantes foram corados com BIO-SAFE™ Coomassie Stain. Análise por SDS-PAGE sugeriu que a deleção do gene de protease aspártica para a produção de xilanase GH10 de Aspergillus aculeatus não preveniu completamente a proteólise da proteína. Cepa T. reesei AgJgl 11-50 com deleção de protease aspártica não exibiu nenhuns padrões de expressão incomuns de alguma proteína e se comportou similarmente à cepa parental, cepa 981-0-8 de Trichoderma reesei.

Exemplo 19: Construção de plasmídeo pAgJglló de deleção de gene de serina protease semelhante à tripsina de Trichoderma reesei

[00262] O vetor de deleção pAgJglló foi construído para interromper a expressão de um gene de serina protease semelhante à tripsina Trichoderma reesei de 25 kDa (SEQ ID NO: 5 para a sequência de DNA e SEQ ID NO: 6 para a sequência de aminoácidos deduzida). Plasmídeo pAgJglló foi gerado primeiro por amplificação de regiões flanqueadoras 5’ e 3’ e sua clonagem no vetor pCR®2.1-TOPO®. A região flanqueadora 5’ contém uma região a montante da região codificadora de serina protease de 25 kDa e parte da região codificadora de serina protease semelhante à tripsina de 25 kDa. A região flanqueadora 5’ foi amplificada usando os iniciadores 067518 (senso) e 067519 (antissenso) mostrados abaixo. Iniciador 067518 foi engenhado para conter sítios Asc I e Not I na extremidade 5’ do iniciador. Iniciador 067519 foi engenhado para conter um sítio Asc I site na extremidade 5’ do iniciador. Iniciador 067518 (senso): AAAGGCGCGCCGCGGCCGCGAAGAAGAAGAAGA ACGTGAAAGAG (SEQ ID NO: 63) Iniciador 067519 (antissenso): AAAGGCGCGCCCGGTCGAGCCGGCCACGGGGTCG GA (SEQ ID NO: 64)

[00263] A região 5’ da serina protease semelhante à tripsina foi amplificada por PCR em uma reação composta de 175 pg de DNA genômico de T. reesei (Exemplo 10), 1 pL de Herculase 11 Fusion DNA polymerase, 50 pmols de iniciador 067518, 50 pmols de iniciador 067519, 5 pL de dNTPs 10 mM, 5 pL de tampão de reação 5X Herculase II (Stratagene, LaJolla, CA, USA), e 31 pL de água. A reação foi incubada em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® programado para 1 ciclo a 95°C por 2 minutos; 30 ciclos cada a 95°C por 20 segundos, 60°C por 20 segundos, e 72°C por 45 segundos; 1 ciclo a 72°C por 3 minutos; e uma manutenção a 4°C. Um fragmento de PCR de 1,5 kb foi purificado por eletroforese em gel de agarose 1% usando tampão TAE, excisado do gel, e extraído usando QIAQUICK® Gel Extraction Kit de acordo com as instruções do fabricante. O fragmento de PCR purificado em gel foi tratado com Taq DNA polimerase para adicionar saliências- A 3’ no fragmento em uma reação composta de 5 pL de fragmento purificado por PCR, 1 pL de Tampão 10X Thermopol, 0,5 pL de dNTPs 10 mM, 0,5 pL de Taq DNA polimerase, e 3 pL de água. A reação foi incubada a 72°C por 15 minutos. A região 5’ do fragmento de serina protease semelhante à tripsina was clonado em pCR®2.1-TOPO® em uma reação composta de 2,5 pL do fragmento de PCR da região 5’ de de the 5’ serina protease semelhante à tripsina, 1 pL de Solução Salina, 1,5 pL de água, e 1 pL de pCR®2.1-TOPO®. O plasmídeo resultante foi designado 5’SP-TOPO.

[00264] A região 3’ do fragmento de serina protease semelhante à tripsina foi clonada em pCR®2.1-TOPO® usando iniciadores 067520 (senso) e 067521 (antissenso) mostrados abaixo. Iniciador 067520 foi engenhado para conter um sítio Sbfl na extremidade 5’ do iniciador. Iniciador 067521 foi engenhado para conter sítios Sbf I e Not I na extremidade 5’ do iniciador. Iniciador 067520 (Senso): AAACCTGCAGGTCACCACCGCTGGCTGGTAAGCAT CATC (SEQ ID NO: 65) Iniciador 067521 (Antissenso): AAACCTGCAGGCGGCCGCACAAAGCTAGGAGTCT TGACGTGAT (SEQ ID NO: 66)

[00265] A região 3’ do gene de serina protease semelhante à tripsina foi amplificada por PCR em uma reação composta de 175 pg de DNA genômico de T reesei (Exemplo 10), 1 pL de Herculase II Fusion DNA polymerase, 50 pmols de iniciador 067520, 50 pmols de iniciador 067521, 5 pL de dNTPs 10 mM, 5 pL de tampão de reação 5X Herculase II, e 31 pL de água. A reação foi incubada em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® programado para 1 ciclo a 95°C por 2 minutos; 30 ciclos cada a 95°C por 20 segundos, 60°C por 20 segundos, e 72°C por 45 segundos; 1 ciclo a 72°C por 3 minutos; e uma manutenção a 4°C. Um fragmento de PCR de 1,5 kb foi purificado por eletroforese em gel de agarose 1% usando tampão TAE, excisado do gel, e extraído usando um QIAQUICK® Gel Extraction Kit de acordo com as instruções do fabricante. O fragmento de PCR purificado em gel foi tratado com Taq DNA polimerase para adicionar saliências-A 3’ no fragmento em uma reação composta de 5 pL de fragmento purificado por PCR, 1 pL de tampão 10X ThermoPol, 0,5 pL de dNTPs 10 mM, 0,5 pL de Taq DNA polimerase, e 3 pL de água. A reação foi incubada a 72°C por 15 minutos. A região 5’ do fragmento de serina protease semelhante à tripsina foi clonada em pCR®2.1-TOPO® de acordo com a instrução do fabricante em uma reação composta de 2,5 pL do fragmento de PCR da região 5’ de serina protease semelhante à tripsina, 1 pL de Solução Salina, 1,5 pL de água, e 1 pL de pCR®2.1-TOPO®. O plasmídeo resultante foi designado 3’SP-TOPO.

[00266] Plasmídeo 5’SP-TOPO foi digerido com Asc I e clonado em plasmídeo pJfyS 1579-41-11 digerido com Asc I (Exemplo 9) em uma reação composta de 12,4 pg de DNA plasmídeo 5’SP-TOPO digerido, 5 pL de Asc I, 10 pL de tampão 10X NEB Buffer 4 (New England Biolabs, Inc, Ipswich, MA, USA), e 55 pL de água. A digestão por enzima de restrição foi incubada a 37°C por 2 horas. A digestão foi purificada por eletroforese em gel de agarose 1% usando tampão TAE, onde um fragmento de 1,5 kb foi excisado do gel e extraído usando um QIAQUICK® Gel Extraction Kit de acordo com as instruções do fabricante. O fragmento 5’SP-TOPO digerido com Asc I foi ligado em pJfyS 1579-49-1 Idigerido com Asc I em uma reação composta de 282 ng de 5’SP-TOPO digerido com Asc I, 120 ng de JfyS 1579-49-1 Idigerido com Asc I, 2 gL de Quick Ligase (New England Biolabs, Inc, Ipswich, MA, USA), 15 gL de tampão 2X Quick Ligase Buffer (New England Biolabs, Inc, Ipswich, MA, USA), e 2 gL de água. A reação de ligação foi incubada na temperatura ambiente por 15 minutos. O plasmídeo resultante foi designado pJfyS1579+5’SP.

[00267] Para construir plasmídeo pAgJglló, plasmídeos 3’SP- TOPO e pJfyS1579+5’SP foram digeridos com Sbf I. As digestões foram compostas de 7,5 gg de pJfyS1579+5’SP ou 12,5 gg de 3’SP- TOPO, 5 gL de Sbf\, 10 gL de tampão 10X NEB Buffer 4, e 55 gL de água. Ambas as reações de digestão foram incubadas a 37°C durante a noite. Dois gL de fosfatase alcalina de intestino de bezesso (CIP) foram adicionados na reação de digestão de pJfyS1579+5’SP e incubados a 37°C por uma hora adicional. Um fragmento de 9,5 kb de pJfyS1579+5SP/Sbf I e um fragmento de 1,5 kb de 3SP-TOPO/Sbf I foram purificados por eletroforese em gel de agarose 0,8% usando tampão TAE, excisados do gel, e extraídos usando um QIAQUICK® Gel Extraction Kit de acordo com as instruções do fabricante. O fragmento 3’SP-TOPO digerido com Sbf I foi ligado no fragmento pJfyS1579+5’SP digerido com Sbf I em uma reação composta de 767 ng de 3’SP-TOPO digerido com Sbf I, 380 ng de pJfyS1579+5’SP digerido com Sbf I, 2 gL de Quick Ligase, 15 gL de tampão 2X Quick Ligase Buffer, e 1 gL de água. A reação de ligação foi incubada na temperatura ambiente por 20 minutos. O plasmídeo resultante foi designado pAgJgllõ (Figura 20).

Exemplo 20: Geração de cepa AgJgl 16-19 de Trichoderma reesei com deleção de gene de serina protease semelhante à tripsina

[00268] Protoplastos de cepa 981-0-8 de Trichoderma reesei foram transformadas com pAgJglló linearizado com Not I usando o método descrito em Exemplo 12 para deletar o gene de serina protease semelhante à tripsina. Noventa transformantes foram selecionados sobre placas PDA contendo 25 pg de higromicina B por mL. Os transformantes foram subcultivados em placas PDA para gerar esporos.

[00269] Transformantes de cepa 981-0-8 de Trichoderma reesei contendo o vetor de deleção pAgJglló foram cultivados em frascos de agitação de 125 mL contendo 25 mL de meio indutor de celulase em pH 6,0 inoculado com esporos dos transformantes e incubados a 28°C por 5 dias com agitação a 200 rpm. Cepa 981-0-8 de Trichoderma reesei foi cultivada como um controle. Amostras de caldo de cultura foram removidas 5 dias após a inoculação, centrifugadas a 15.700 x g por 10 minutos em uma microcentrífuga, e os sobrenadantes foram transferidos para tubos novos.

[00270] Os sobrenadantes de cada transformante foram ensaiados para atividade de protease usando o substrato sintético Val-Leu-Lys 4- nitro-anilida (Bachem AG, Bubendorf, Suíça). O substrato foi inicialmente dissolvido em dimetil-suifóxido em uma concentração de 100 mg/mL. O substrato dissolvido foi então diluído 200-vezes em NaCl 100 mM - MOPS 100 mM pH 7,0. A reação foi iniciada pela adição de 10 pL de cada sobrenadante de transformante em 100 pL do substrato diluído em uma placa de 96 cavidades de fundo plano. A placa de reação foi incubada a 50°C por 30 minutos e então a absorbância a 405 nm foi medida usando um SPECTRAMAX® Microplate Reader. Transformantes exibindo pouca ou nenhuma atividade de protease foram submetidos a uma seleção por PCR usando os iniciadores mostrados abaixo. Iniciador 068155 (senso): GCTGTTTGGCCCTCGAAACTGCCGG (SEQ ID NO: 67) Iniciador 067947 (antissenso): CTACATCGAAGCTGAAAGCACGAGA (SEQ ID NO: 68)

[00271] liniciador 068155 está a montante da região 5’ do gene de serina protease semelhante à tripsina continha na cepa de deleção, e iniciador 067947 está no cassete hph. Apenas aqueles candidatos que contêm uma disrupção de serina protease semelhante à tripsina produziriam um fragmento de PCR. A seleção de PCR foi realizada por PCR de Colônia Fúngica de acordo com o protocolo modificado descrito em Exemplo 17. Uma quantidade pequena de esporos de de cada candidato foi suspensa em 25 pL de tampão TE e aquecida em temperatura alta em um forno de micro-ondas por 1 minuto. A suspensão de esporos aquecida em micro-ondas foi usada como um modelo em uma reação PCR para selecionar a deleção de protease aspártica. A reação foi composta de 1 pL de suspensão de esporos, 1 pL de dNTPs 10 mM, 12,5 pL de tampão 2X ADVANTAGE® GC-Melt LA Buffer, 25 pmols de iniciador 068155, 25 pmols de iniciador 067947, 1,25 unidades de ADVANTAGE® GC Genomic LA Polymerase Mix, e 9,25 pL água. A reação foi incubada em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® programado para 1 ciclo a 95°C por 10 minutos; 35 ciclos cada a 95°C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos, e 72°C por 2 minutos 30 segundos; 1 ciclo a 72°C por 5 minutos; e uma manutenção a 4°C.

[00272] Análise de Southern blot foi realizada para confirmar a disrupção do gene de serina protease semelhante à tripsina de 25 kDa pelo vetor pAgJgl 16. DNA genômico foi extraído das cepas de deleção e cepa 981-0-8 de Trichoderma reesei de acordo com Exemplo 10. Dois pg de DNA genômico das cepas de deleção e cepa 981-0-8 de Trichoderma reesei, juntamente com 1 ng de DNA plasmídeo de pAgJglló foram digeridos com Neo I e Sac I. Cepa 981-0-8 de Trichoderma reesei e pAgJglló foram incluídos em Southern blot como controles. O DNA genômico foi digerido em uma reação composta de 2 pg de DNA genômico, 1 pL de Neo I, 1 pL de Sac I, 5 pL de tampãoJOX NEB Buffer 1 (New England Biolabs, Inc, Ipswich, MA, USA), 0,5 pL de 100X BSA, e água em uma reação de 50 pL. Ambos os digestos foram incubados a 37°C por aproximadamente 14-16 horas. Plasmídeo pAgJglló foi digerido em uma reação composta de 1 ng de pAgJglló DNA, 0,5 pL de Neo I, 0,5 pL de Sac I, 2 pL de tampão 10X NEB Buffer 1, 0,2 pL de 100X BSA, e água em uma reação de 20 pL. A digestão foi incubada a 37°C por aproximadamente 1 hora c 30 minutos.

[00273] Os digestos foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 0,7% usando tampão TAE e transportados como mancha (blotted) para membrana NYTRAN® Supercharge blotting membrane usando um TURBOBLOTTER® por 14-16 horas seguindo as recomendações do fabricante. A membrana foi hibridizada com uma sonda de 500 pb de serina protease semelhante à tripsina de 25 kDa de Trichoderma reesei marcada com digoxigenina, que foi sintetizada pela incorporação de digoxigenina-11-dUTP durante PCR usando iniciadores 068128 (senso) e 068129 (antissenso) mostrados abaixo. Iniciador 068233 (senso): CAACCCAAAGATATCGCCAGATCCA (SEQ ID NO: 69) Iniciador 068234 (antissenso): ACGATAAACTCCCCCACGGCTGAAG (SEQ ID NO: 70)

[00274] A reação de amplificação foi composta de 5 pL de tampão 10X ThermoPol Reaction Buffer, 2,5 pL de PCR DIG Labeling Mix, 2 ng de pAgJglló, 50 pmols de iniciador 068233, 50 pmols de iniciador 068234, 2,5 gL de dNTPs 10 mM, 5 unidades de Taq DNA polimerase, e 35,5 pL de água. A reação foi incubada em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® programado para 1 ciclo a 95°C por 2 minutos; 30 ciclos cada a 95°C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos, e 72°C por 40 segundos; 1 ciclo a 72°C por 15 minutos; e uma manutenção a 4°C. O produto de PCR foi selecionado por tamanho por eletroforese em gel de agarose 1,5% usando tampão TAE, excisado do gel, e extraído usando um QIAQUICK® Gel Extraction Kit de acordo com as instruções do fabricante. Incorporação de digoxigenina foi indicada pelo aumento da massa molecular.

[00275] Hibridização foi realizada em tampão DIG Easy Hyb a 42°C por 15-17 horas. A membrana foi então lavada sob condições de estringência alta em 2X SSC mais SDS 0,1% por 5 minutos na temperatura ambiente seguido por duas lavagens em 0,5X SSC mais SDS 0,1% por 15 minutos cada a 65°C. Os híbridos de sonda-alvo foram detectados por ensaio quimioluminescente seguindo as instruções do fabricante, foi confirmado que vários transformantes contêm uma deleção de serina protease semelhante à tripsina. Um transformante foi selecionado e designado Trichoderma reesei AgJg 116-19.

Exemplo 21: Expressão de xilanase GH10 de Aspergillus aculeatus em cepa AgJgl 16-19 deficiente em serina protease semelhante à tripsina

[00276] Para determinar se deleção da serina protease semelhante à tripsina de 25 kDa foi efetiva na prevenção da degradação de xilanase GH10 de Aspergillus aculeatus recombinantemente expressada, plasmídeo pSaMe-AaXYL (Exemplo 14), que contém a sequência codificadora de GH10 xilanase de Aspergillus aculeatus, foi transformado na cepa AgJgl 16-19 de Trichoderma reesei. Protoplastos de Trichoderma reesei foram gerados como descrito em Exemplo 12 e transformados com plasmídeo pSaMe-AaXYL. Trinta e seus transformantes contendo a xilanase GH10 de Aspergillus aculeatus foram aleatoriamente selecionados de placas COVE e cultivados em frascos de agitação de 125 mL contendo 25 mL de meio indutor de celulase em pH 6,0 inoculado com esporos dos transformantes e incubados a 28°C por 5 dias com agitação a 200 rpm. Cepa 981-0-8 de Trichoderma reesei e Trichoderma reesei AgJgl 16-19 foram ambas cultivadas como controles. Amostras de caldo de cultura foram removidas 5 dias após a inoculação, centrifugadas a 15.700 x g por 10 minutos em uma microcentrífuga, e os sobrenadantes foram transferidos para tubos novos.

[00277] Os sobrenadantes foram analisados por SDS-PAGE usando um gel CRITERION™ Tris-HCl 8-16% com uma célula CRITERION ™ Cell. Cinco pL de cada uma das 5 amostras foram suspensos em concentração 2X de Tampão de Amostra Laemmli e aquecidos a 95°C por 5 minutos na presença de β-mercapto-etanol 5%. Todas as amostras foram carregadas para cima dos geles de SDS-PAGE e submetidas à eletroforese em tampão de corrida IX Tris/Glicina/SDS. Os geles resultantes foram corados com BIO-SAFE™ Coomassie Stain. Análise por SDS-PAGE indicou que nenhum dos transformantes expressando a xilanase GH10 de Aspergillus aculeatus produziu qualquer traço de degradação da xilanase. Também, a cepa de deleção de serina protease semelhante à tripsina Trichoderma reesei AgJgl 16-19 não exibiu quaisquer padrões de expressão incomuns de qualquer proteína e se comportou similarmente à cepa parental, cepa 981-0-8 de Trichoderma reesei. A deleção do gene de serina protease semelhante à tripsina de 25 kDa em cepa 981-0-8 de Trichoderma reesei pareceu efetiva na eliminação da degradação da xilanase GH10 de Aspergillus aculeatus.

Exemplo 22: Construção de um plasmídeo pAgJgll5 de deleção de gene ku70 de Trichoderma reesei

[00278] O vetor de deleção pAgJgll5 foi construído para interromper o gene ku70 de Trichoderma reesei. Disrupção (interrupção) do ku70 foi exigida para aumentar a eficiência de seleção do gene em Trichoderma reesei.

[00279] Plasmídeo pAgJgll5 foi gerado primeiro por amplificação de regiões flanqueadoras 5’ e 3’ e sua clonagem no vetor pCR®2.1- TOPO®. O flanco 5’ de 1,5 kb contém uma região a montante do gene ku70 bem como parte da sequência codificadora ku70. A região flanqueadora 5’ foi amplificada usando iniciadores 067491 (senso) e 067492 (antissenso) mostrados abaixo. Iniciador 067491 foi engenhado para conter sítios Asc I e Not I na extremidade 5’ do iniciador. Iniciador 067492 foi engenhado para conter um sítio Asc I site na extremidade 5’ do iniciador. Iniciador 067491 (senso): 5’- AAAGGCGCGCCGCGGCCGCCCATGGTGAGAAGCCGGGTTCGG GAG-3’ (SEQ ID NO: 71) Iniciador 067492 (antissenso): 5’-AAAGGCGCGCC AGCCCTTGACAGTGATCTTGAGTCC-3’ (SEQ ID NO: 72)

[00280] A região 5’ do gene ku70 foi amplificada por PCR em uma reação composta de 175 pg de DNA genômico de T. reesei, 1 pL de Herculase II Fusion DNA polymerase, 50 pmols de iniciador 067491, 50 pmols de iniciador 067492, 5 pL de dNTPs 10 mM, 10 pL de tampão de reação 5X Herculase II (Stratagene), e 31 pL de água. A reação foi incubada em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® programado para 1 ciclo a 95°C por 2 minutos; 30 ciclos cada a 95°C por 20 segundos, 61°C por 20 segundos, e 72°C por 45 segundos; 1 ciclo a 72°C por 3 minutos; e uma manutenção a 4°C.

[00281] Um fragmento de PCR de 1,5 kb foi purificado por eletroforese em gel de agarose 1% usando tampão TAE, excisado do gel, e extraído usando QIAQUICK® Gel Extraction Kit de acordo com as instruções do fabricante. O fragmento de PCR purificado em gel foi tratado com Taq DNA polimerase para adicionar saliências-A 3’ no fragmento em uma reação composta de 5 pL de fragmento purificado por PCR, 1 pL de tampão 10X Thermopol Buffer, 0,5 pL de dNTPs 10 mM, 1 pL de Taq DNA polimerase, e 3 pL de água. A reação foi incubada a 72°C por 15 minutos. A região 5’ do fragmento ku70 foi clonada em pCR®2.1-TOPO® em uma reação composta de 2,5 pL do fragmento de PCR do flanco ku70 5’, 1 pL de Solução Salina, 1 pL de água, e 1 pL de pCR®2.1-TOPO® e 2 pL da reação foram transformados em células de E. coli ONE SHOT® TOP10 Quimicamente Competentes (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA, USA) de acordo com as instruções do fabricante. Transformantes foram selecionados sobre placas de ágar 2X YT suplementado com 100 pg de ampicilina por mL e incubados a 37°C por 16 horas. O plasmídeo resultante foi designado 5’ku70-TOPO.

[00282] A região 3’ do fragmento ku70 foi clonada em pCR®2.1- TOPO® usando iniciadores 067493 (senso) e 067494 (antissenso) mostrados abaixo. Iniciador 067493 foi engenhado para conter um sítio Sbfl na extremidade 5’ do iniciador. Iniciador 067494 foi engenhado para conter sítios Sbfl e Not I na extremidade 5’ do iniciador. Iniciador 067493 (Senso): 5’- AAACCTGC AGGACAAC ATTGTGC ATCGGC AA ACGCC-3 ’ (SEQ ID NO: 73) Iniciador 067494 (Antissenso): 5’- AAACCTGCAGGCGGCCGCAAAGTGCCGGGGGTGCCCCAAGTCG -3’ (SEQ ID NO: 74)

[00283] A região 3’ do gene ku70 foi amplificada por PCR em uma reação composta de 175 pg de DNA genômico de T. reesei, 1 pL de Herculase II Fusion DNA polymerase, 50 pmols de iniciador 067493, 50 pmols de iniciador 067494, 5 pL de dNTPs 10 mM, 10 pL de tampão de reação 10X Thermopol Buffer, e 31 pL de água. A reação foi incubada em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® programado para 1 ciclo a 95°C por 2 minutos; 30 ciclos cada a 95°C por 20 segundos, 61°C por 20 segundos, e 72°C por 45 segundos; 1 ciclo a 72°C por 3 minutos; e uma manutenção a 4°C.

[00284] Um fragmento de PCR de 1,5 kb foi purificado por eletroforese em gel de agarose 1% usando tampão TAE, excisado do gel, e extraído usando QIAQUICK® Gel Extraction Kit de acordo com as instruções do fabricante. O fragmento de PCR purificado em gel foi tratado com Taq DNA polimerase para adicionar saliências-A 3’ no fragmento em uma reação composta de 5 pL de fragmento purificado por PCR, 1 pL de Tampão 10X ThermoPol, 0,5 pL de dNTPs 10 mM, 1 pL de Taq DNA polimerase, e 3 pL de água. A reação foi incubada a 72°C por 15 minutos. A região 3’ do fragmento ku70 foi clonada em pCR®2.1-TOPO® em uma reação composta de 2,5 pL do fragmento de PCR ku70 de flanco 3’, 1 pL de Solução Salina, 1 pL de água, e 1 pL de pCR®2.1-TOPO® e 2 pL da reação foram transformados em células de E. coli ONE SHOT® TOP10 Quimicamente Competentes de acordo com as instruções do fabricante. Transformantes foram selecionados sobre placas de ágar 2X YT suplementado com 100 pg de ampicilina por mL e incubados a 37°C por 16 horas. O plasmídeo resultante foi designado 3’ku70-TOPO.

[00285] Plasmídeo 5’ku70-TOPO foi digerido com Asc I com o objetivo de ser clonado em plasmídeo pJfyS 1579-41-11 digerido com Asc I (Exemplo 9) em uma reação composta de 14,6 pg de plasmídeo 5’ku70-TOPO DNA, 5 pL de Asc I, 10 pL de tampão 10X NEB Buffer 4, e 55 pL de água. A digestão por enzima de restrição foi incubada a 37°C por aproximadamente 14-16 horas. A digestão foi purificada por eletroforese em gel de agarose 1% usando tampão TAE, onde um fragmento de 1,5 kb foi excisado do gel e extraído usando um QIAQUICK® Gel Extraction Kit de acordo com as instruções do fabricante. O fragmento 5’ku70-TOPO digerido com Asc I foi ligado no JfyS 1579-49-1 Idigerido com Asc I em uma reação composta de 329,6 ng de 5’ku70-TOPO digerido com Asc I, 120 ng de JfyS 1579-49- 1 Idigerido com Asc I, 2 pL de Quick Ligase, 15 pL de tampão 2X Quick Ligase Buffer, e 2 pL de água. A reação de ligação foi incubada na temperatura ambiente por 15 minutos e 4 pL da reação de ligação foram transformados em células de E. coli ONE SHOT® TOP10 Quimicamente Competentes de acordo com as instruções do fabricante. Transformantes foram selecionados sobre placas de ágar 2X YT suplementado com 100 pg de ampicilina por mL e incubados a 37°C por 16 horas. O plasmídeo resultante foi designado pJfyS 1579+5ku70.

[00286] Para construir plasmídeo pAgJgll5, plasmídeos 3’ku70- TOPO e pJfyS1579+5ku70 foram digeridos com Sbf I. A digestão de pJfyS 1579+5ku70 foi composta de 3,98 pg de pJfyS 1579+5ku70, 5 pL de Sbf I, 30 pL de tampão 10X NEB Buffer 4, e 165 pL de água. A digestão de 3’ku7()-TOPO foi composta de 13,8 pg de 3’ku70-TOPO, 5 pL de Sbf I, 10 pL de tampão 10X NEB Buffer 4, e 55 pL de água. Ambas as reações de digestão foram incubadas a 37°C for 4 horas. Um fragmento de 9,5 kb de pJfyS 1579+5ku70/S/?/I e um fragmento de 1,5 kb de 3’ku70-TOPO/Sbf I foram purificados por eletroforese em gel de agarose 1% usando tampão TAE, excisado do geles, e extraídos usando um QIAQUICK® Gel Extraction Kit de acordo com as instruções do fabricante. O fragmento 3’ku70-TOPO digerido com Sbf I foi ligado no fragmento ku70 de pJfyS 1579+5 digerido com Sbf I em uma reação composta de 335,8 ng de 3’ku70-TOPO digerido com Sbf I, 69,76 ng de pJfyS 1579+5ku70 digerido com Sbf I, 2 pL de Quick Ligase, 20 pL de tampão 2X Quick Ligase Buffer, e 2 pL de água. A reação de ligação foi incubada na temperatura ambiente por 20 minutos e 5 pL da reação de ligação foram transformados em células de E. coli ONE SHOT® TOP10 Quimicamente Competentes de acordo com as instruções do fabricante. Transformantes foram selecionados sobre placas de ágar 2X YT suplementado com 100 pg de ampicilina por mL e incubados a 37°C por 16 horas O plasmídeo resultante foi designado pAgJgll5 (Figura 21).

Exemplo 23: Geração de uma disrupão de gene ku70 em Trichoderma reesei

[00287] Proplastos de cepa 981-0-8 de Trichoderma reesei foram transformadas com pAgJgll5 linearizado por Not I usando o método previamente descrito em Exemplo 12. Transformações foram plaqueadas sobre PDA + sacarose 1 M e então sobrepostas com uma camada fina contendo PDA + uridina 10 mM + higromicina (100 pg/mL). Cento de vinte nove transformantes foram subcultivados sobre placas PDA para gerar esporos.

[00288] Possíveis candidatos de cepa 981-0-8 de Trichoderma reesei contendo o vetor de deleção the pAgJgll5 no local ku70, interrompendo deste modo o gene ku70 , foram selecionados por PCR de esporo fúngico usando um protocolo modificado de Suzuki et al., 2006, supra. Uma quantidade pequena de esporos de de cada candidato foi suspensa em 25 pL de Tampão TE e aquecida em temperatura alta em um forno de micro-ondas por 1 minuto. A suspensão de esporos aquecida em micro-ondas foi usada como um modelo em uma reação PCR para selecionar a deleção de serina protease. A reação foi composta de 1 pL de suspensão de esporos, 1 pL de dNTPs 10 mM, 12,5 pL de tampão 2X ADVANTAGE® GC-Melt LA Buffer, 25 pmols de iniciador 067946, 25 pmols de iniciador 067947, 1,25 unidades de ADVANTAGE® GC Genomic LA Polymerase Mix, c 9,25 pL água. A reação foi incubada em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® programado para 1 ciclo a 95°C por 10 minutos; 35 ciclos cada a 95°C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos, e 72°C por 2 minutos 30 segundos; 1 ciclo a 72°C por 5 minutos; e uma manutenção a 4°C. Iniciador 067946 está localizado a montante da região flanqueadora 5’ e iniciador 067947 está localizado no marcador hpt, apenas as cepas com o cassete de deleção no local correto produziriam um produto de PCR. Foi identificada cepa AgJgl 18-02 de Trichoderma reesei na qual o gene ku70 havia sido interrompido. Iniciador 067946 (senso): 5’- GCCAGGTGTCTGGCATGGCTGGCAAGCTGCGAC-3’ (SEQ ID NO: 75) Iniciador 067947 (antissenso): 5’-CTACATCGAAGCTGAAAGCACGAGA-3’ (SEQ ID NO: 76)

[00289] Oito candidatos foram adicionalmente avaliados por análise de Southern blot para confirmar a disrupção do gene ku70 de Trichoderma reesei. DNA genômico foi extraído das cepas de deleção e cepa 981-0-8 de Trichoderma reesei como descrito em Exemplo 10. Dois pg de DNA genômico das cepas de deleção e cepa 981-0-8 de Trichoderma reesei, bem como 1 ng de DNA plasmídeo de pAgJglló, foram digeridos com Hind III e Bam Hl. Cepa 981-0-8 de T. reesei e pAgJgll5 foram incluídos em Southern blot como controles. A reação de digestão de DNA genômico foi composta de 2 pg de DNA genômico, 1 pL de Hind III, 1 pL de Bam Hl, 5 pL de tampão 10X NEB Buffer 2, 0,5 pL de 100X BSA, e água para 50 pL. Ambas as digestões de DNA genômico foram incubadas a 37°C por aproximadamente 14-16 horas. Plasmídeo pAgJgll5 foi digerido em uma reação composta de 1 ng de pAgJglll DNA, 0,5 pL de Hind III, 0,5 pL de Bam Hl, 2 pL de tampão 10X NEB Buffer 2, 0,2 pL de 100X BSA, e água to 20 pL. A digestão foi incubada a 37°C por aproximadamente 1 hora.

[00290] As digestões foram submetidas à eletroforese em gel de agarose 0,7% usando tampão TAE e transportadas como mancha {blotted) para membrana NYTRAN® Supercharge blotting membrane usando um TURBOBLOTTER® por 14-16 horas seguindo as recomendações do fabricante. A membrana foi hibridizada com uma sonda de 500 pb de gene ku70 deTrichoderma reesei marcada com digoxigenina, que foi sintetizada pela incorporação de digoxigenina-11- dUTP por PCR usando iniciadores 068067 (senso) e 068068 (antissenso) mostrados abaixo. Iniciador 068067 (senso): 5’-CATCCACTCGGAGATGCTGA-3’ (SEQ ID NO: 77) Iniciador 068068 (antissenso): 5’-CGGAACTTGGTCTTTTCTGT-3’ (SEQ ID NO: 78)

[00291] A reação de amplificação foi composta de 5 pL de tampão 10X ThermoPol Reaction Buffer, 2,5 pL de PCR DIG Labeling Mix, 1 ng de pAgJgll5, 50 pmols de iniciador 068067, 50 pmols de iniciador 068068, 2,5 pL de dNTPs 10 mM, 5 unidades de Eaq DNA polimerase, e 35,5 pL de água. As reações foram incubadas em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333 programado para 1 ciclo a 95°C por 2 minutos; 30 ciclos cada a 95°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos, e 72°C por 40 segundos; 1 ciclo a 72°C por 15 minutos; e uma manutenção a 4°C. O produto de reação PCR foi purificado por eletroforese em gel de agarose 1% usando tampão TAE, excisado do gel, e extraído usando um QIAQUICK® Gel Extraction Kit de acordo com as instruções do fabricante. Incorporação de digoxigenina foi indicada pelo aumento da massa molecular.

[00292] Hibridização foi realizada em tampão DIG Easy Hyb a 42°C por 15-17 horas. A membrana foi então lavada sob condições de estringência alta em 2X SSC mais SDS 0,1% por 5 minutos na temperatura ambiente seguido por duas lavagens em 0,5X SSC mais SDS 0,1% por 15 minutos cada a 65°C. Os híbridos de sonda-alvo foram detectados por ensaio quimioluminescente (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, USA) seguindo as instruções do fabricante. A cepa contendo a disrupção do gene ku70 foi designada Trichoderma reesei AgJgl 15-104.

[00293] O construto de disrupção pAgJgll5 contém o gene de higromicina-fosfo-transferase (hpt) de E. coli e o gene de timidina- cinase (tk) de virus do Herpes Simples flanqueados por repetições diretas. As repetições diretas foram inseridas para facilitar a excisão dos marcadores selecionáveis hpt e tk.

[00294] Esporos de T reesei AgJgl 15-104 foram plaqueados sobre placas de meio mínimo para Trichoderma contendo 5-fluoro-2’-desoxi- uridina (FdU) 1 pM em concentrações de 1 x 105 e lx 106 e incubados a 28°C. Quinze isolados foram subcultivados sobre placas de meio mínimo para Trichoderma contendo FdU 1 pM e incubados a 28°C. Os quinze isolados foram então testados para a sensibilidade à higromicina por sua subcultura sobre placas PDA com 25 pg/mL de higromicina e sua incubação a 28°C. Nenhuns dos isolados cresceram sobre as placas de higromicina, sugerindo que os marcadores hpt e tk têm sido excisados da cepa.

[00295] Para confirmar a ausência dos marcadores hpt e tk em cepa AgJgl 15-104 de T. reesei, dois isolados foram avaliados por Southern blot. DNA genômico foi extraído das cepas de disrupção livres de marcador e da cepa 981-0-8 de T. reesei como descrito em Exemplo 10. Dois pg de DNA genômico das cepas de deleção e cepa 981-0-8 de Trichoderma reesei foram digeridos com Hind III e Bam Hl. Cepa 981-0- 8 de T reesei foi incluída no Southern blot como um controle. A reação de digestão de DNA genômico foi composta de 2 pg de DNA genômico, 1 pL de Hind III, 1 pL de Bam Hl, 5 pL de tampão 10X NEB Buffer 2, 0,5 pL de 100X BSA, e água para 50 pL. Ambas digestões de DNA genômico foram incubadas a 37°C por aproximadamente 14-16 horas

[00296] As digestões foram submetidas à eletroforese em gel de agarose 0,7% usando tampão TAE e transportadas como mancha (blotted) para membrana NYTRAN® Supercharge blotting membrane usando um TURBOBLOTTER® por 14-16 horas seguindo as recomendações do fabricante. A membrana foi hibridizada com uma sonda de 500 pb de gene ku70 de Trichoderma reesei marcada com digoxigenina como descrito acima.

[00297] Hibridização foi realizada em tampão DIG Easy Hyb a 42°C por 15-17 horas. A membrana foi então lavada sob condições de estringência alta em 2X SSC mais SDS 0,1% por 5 minutos na temperatura ambiente seguido por duas lavagens em 0,5X SSC mais SDS 0,1% por 15 minutos cada a 65°C. Os híbridos de sonda-alvo foram detectados por ensaio quimioluminescente (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, USA) seguindo as instruções do fabricante. A cepa livre de marcador contendo a disrupção de gene ku70 foi designada Trichoderma reesei AgJgl 15-104-7B1.

Exemplo 24: Geração de uma cepa SMai-TrSP-30-22 ^Trichoderma reesei com deleção única de protease

[00298] Protoplastos de cepa AgJgll5-104-7Bl de Trichoderma reesei deficiente em KU70 foram transformados com pDAtwl8 linearizado com Not I (Exemplo 11) usando o método descrito em Exemplo 12 para deletar o gene de serina protease semelhante à subtilisina de Trichoderma reesei. Sessenta e seis transformantes foram selecionados sobre placas PDA contendo 10 pg de higromicina B por mL. Os transformantes foram subcultivados em placas PDA para gerar esporos.

[00299] PCR de esporo fúngico usando o protocolo modificado de Suzuki et al., 2006, supra foi usada para selecionar transformantes possuindo deleção putativa usando iniciador de senso (067871) que foi designado na 5’-UTR de gene de serina protease semelhante à subtilisina e um iniciador de antissenso (067872) dentro da 3’-UTR. Iniciador 067871 (iniciador e sendo): 5 ’ - ACTTCGGGGGATGGA AGTAC ATAA ACTG-3 ’ (SEQ ID NO: 79) Iniciador 067872 (iniciador de antissenso): 5 ’ -CTCG ATTCGCC ATT AG ATGTTTTATACCTG-3 ’ (SEQ ID NO: 80)

[00300] Um produto de PCR de 5 kb PCR seria gerado apenas sob a ocorrência da substituição precisa do gene em um local de gene de serina protease semelhante à subtilisina. Se o cassete estivesse integrado alhures no genoma, resultaria a amplificação do gene de serina protease semelhante à subtilisina de 3 kb de tipo selvagem.

[00301] Uma quantidade pequena de esporos de cada candidato foi suspensa em 25 pL de Tampão TE e aquecida em temperatura alta em um forno de micro-ondas por 1 minuto. A suspensão de esporos aquecida em micro-ondas foi usada como um modelo em uma reação PCR para selecionar a deleção de gene de serina protease semelhante à subtilisina. A reação foi composta de 1 pL de suspensão de esporos, 1 pL de dNTPs 10 mM, 12,5 pL de tampão 2X ADVANTAGE® GC-Melt LA Buffer, 25 pmols de iniciador 067871, 25 pmols de iniciador 067872, 1,25 unidades de ADVANTAGE® GC Genomic LA Polymerase Mix, e 9,25 pL de água. A reação foi incubada em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® programado para 1 ciclo a 95°C por 10 minutos; 35 ciclos cada a 94°C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos, e 72°C por 5 minutos 30 segundos; 1 ciclo a 72°C por 15 minutos; e uma manutenção a 4°C.

[00302] Foi identificado que a cepa SMai-TrSP-30 de Trichoderma reesei tinha o gene de serina protease semelhante à subtilisina detetado.

[00303] O construto de deleção pDAtwlδ contem o gene de higromicina-fosforil-transferase (hpt) positivamente selecionável e o outro codificador do gene de timidina-cinase (tk) ncgativamente selecionável, flanqueados por repetições. As repetições diretas foram inseridas para facilitar a excisão dos marcadores selecionáveis hpt e tkc gerar uma cepa livre de marcador de modo que ela pudesse ser usada como uma hospedeira para deletar um segundo gene de protease.

[00304] Esporos de T reesei SMai-TrSP-30 foram plaqueados sobre placas de meio mínimo para Trichoderma contendo 5-fluoro-2’-desoxi- uridina (FdU) 1 pM em concentrações de 1 x 105 e 1 x 106 e incubados a 28°C. Vinte e três isolados foram subcultivados sobre placas de meio mínimo para Trichoderma contendo FdU 1 pM e incubados a 28°C. Todos os 23 isolados foram então selecionados para a ausência dos marcadores hpt e tk por PCR de esporo fúngico na mesma maneira que a descrita em Exemplo 26.

[00305] Análise de Southern blot foi realizada para confirmar a deleção de um gene de serina protease semelhante à subtilisina e a ausência dos marcadores hpt e tk. DNA genômico foi extraído das cepas de deleção e da cepa AgJgl 15-104-7B1 de deleção de ku70 de T. reesei como previamente descrito em Exemplo 10 e 2 pg de cada foram digeridos com 20 unidades de Nco I-HF™ por 16 horas a 37°C. DNA digerido foi fracionado por eletroforese em gel de agarose 0,7% usando tampão TAE por 4 horas e transportado como mancha {blotted) para uma membrana NYTRAN™ Supercharge membrane usando um TURBOBLOTTER™ por 16 horas seguindo as recomendações do fabricante. A membrana foi hibridizada com uma sonda de 502 pb de gene de serina protease semelhante à subtilisina marcado com digoxigenina, que foi sintetizada pela incorporação de digoxigenina-11- dUTP por PCR usando iniciadores 067911 (senso) e 067912 (antissenso) descritos acima.

[00306] A reação de amplificação (50 pL) foi composta de tampão IX ThermoPol Reaction Buffer, 5 pL de PCR DIG Labeling Mix, 10 ng de pDAtwl8, iniciador 067911 0,3 pM, iniciador 067912 0,3 pM, e 2,5 unidades de Taq DNA polimerase. As reações foram incubadas em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333 programado por 30 ciclos cada a 95°C por 30 segundos, 56°C por 30 segundos, e 72°C por 40 segundos (extensão final por 15 minutos). Cinco microlitros do produto de PCR foram selecionados para tamanho por eletroforese em gel de agarose 1,5% usando tampão TAE, corados com brometo de etidio, e visualizados sob um transiluminador de UV. Incorporação de digoxigenina foi indicada pelo aumento da massa molecular.

[00307] Hibridização foi realizada em tampão DIG Easy Hyb (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, USA) a 42°C por 17 horas. A membrana foi então lavada sob condições de estringência alta em 2X SSC mais SDS 0,1% por 5 minutos na temperatura ambiente seguido por duas lavagens em 0,5X SSC mais SDS 0,1% por 15 minutos cada a 65°C. Os híbridos de sonda-alvo foram detectados por ensaio quimioluminescente (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, USA) seguindo as instruções do fabricante. A cepa livre de marcador contendo uma deleção de gene de serina protease semelhante à subtilisina foi designada Trichoderma reesei SMai-TrSP- 30-22.

Exemplo 25: Construção de plasmídeo pAgJgll7 de deleção de gene de serina protease semelhante à tripsina de Trichoderma reesei

[00308] O vetor de deleção pAgJgll7 foi construído para deletar o gene de serina protease semelhante à tripsina de 25 kDa de Trichoderma reesei. Plasmídeo pAgJgll7 foi gerado primeiro por amplificação de regiões flanqueadoras 5’ e 3’ e sua clonagem no vetor pCR®2.1- TOPO®. A região flanqueadora 5’ contém uma região dei,5 kb a montante da região codificadora de serina protease de 25 kDa. A região flanqueadora 5’ foi amplificada usando iniciadores 068616 (senso) e 068617 (antissenso) mostrados abaixo. Iniciador 068616 foi engenhado para conter sítios Asc I e Not I na extremidade 5’ do iniciador. Iniciador 068617 foi engenhado para conter um sítio Asc I na extremidade 5’ do iniciador. Iniciador 068616 (senso): 5’- AAAGGCGCGCCGCGGCCGCAAAACACACACAATAACCAACCC CCA-3’ (SEQ ID NO: 81) Iniciador 068617 (antissenso): 5’- AAAGGCGCGCCTGCGATGGAGGAAAAGCTGCGAGGGATGA-3’ (SEQ ID NO: 82)

[00309] A região 5’ da serina protease semelhante à tripsina foi amplificada por PCR em uma reação composta de 175 pg de DNA genômico de T. reesei, 1 gL de PLATINUM® Pfx DNA polymerase, 50 pmols de iniciador 068616, 50 pmols de iniciador 068617, 1,5 pL de dNTPs 10 mM, 10 pL de tampão 10X Pfx Amplification Buffer, e 33,5 pL de água. A reação foi incubada em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® programado para 1 ciclo a 98°C por 3 minutos; 30 ciclos cada a 98°C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos, e 72°C por 1 minuto 30 segundos; 1 ciclo a 72°C por 15 minutos; e uma manutenção a 4°C. Um fragmento de PCR de 1,5 kb foi purificado por eletroforese em gel de agarose 1% usando tampão TAE, excisado do gel, e extraído usando QIAQUICK® Gel Extraction Kit de acordo com as instruções do fabricante. O fragmento de PCR purificado em gel foi tratado com Taq DNA polimerase para adicionar saliências-A 3’ no fragmento em uma reação composta de 5 pL de fragmento purificado por PCR, 1 pL de tampão 10X ThermoPol Buffer, 0,5 pL de dNTPs 10 mM, 0,5 pL de Taq DNA polimerase, e 3 pL de água. A reação foi incubada a 72°C por 15 minutos. A região 5’ do fragmento de serina protease semelhante à tripsina foi clonada em pCR®2.1-TOPO® em uma reação composta de 3 pL do fragmento de PCR da região 5’ de serina protease semelhante à tripsina, 1 pL de Solução Salina, 1 pL de água, e 1 pL de pCR®2.1-TOPO®. O plasmídeo resultante foi designado Serina 5’.

[00310] A região 3’ do fragmento de serina protease semelhante à tripsina foi clonada em pCR®2. 1-TOPO® usando iniciadores 068618 (senso) e 068619 (antissenso) mostrados abaixo. Iniciador 068618 foi engenhado para conter sítio Sbf I na extremidade 5’ do iniciador. Iniciador 0668619 foi engenhado para conter sítios Sbfl e Not I na extremidade 5’ do iniciador. Iniciador 068618 (Senso): 5’- AAACCTGCAGGGCGATTCCCTGTGTTGGCAACCAAA-3’ (SEQ ID NO: 83) Iniciador 068619 (Antissenso): 5’- AAACCTGCAGGCGGCCGCAAGAAATACTCAGGAAAGGTGCCC A-3’ (SEQ ID NO: 84)

[00311] A região 3’ do gene de serina protease semelhante à tripsina foi amplificada por PCR em uma reação composta de 175 pg de DNA genômico de T. reesei, 1 pL de PLATINUM® Pfx DNA polymerase, 50 pmols de iniciador 068618, 50 pmols de iniciador 068619, 1,5 pL de dNTPs 10 mM, 10 pL de tampão/OX Pfx Amplification Buffer, e 33,5 pL de água. A reação foi incubada em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® programado para 1 ciclo a 98°C por 3 minutos; 30 ciclos cada a 98°C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos, e 72°C por 1 minuto 30 segundos; 1 ciclo a 72°C por 15 minutos; e uma manutenção a 4°C. Um fragmento de PCR de 1,5 kb foi purificado por eletroforese em gel de agarose 1% usando tampão TAE, excisado do gel, e extraído usando QIAQUICK® Gel Extraction Kit de acordo com as instruções do fabricante. O fragmento de PCR purificado em gel foi tratado com Taq DNA polimerase para adicionar saliências-A 3’ no fragmento em uma reação composta de 5 pL de fragmento purificado por PCR, 1 pL de tampão 10X ThermoPol Buffer, 0,5 pL de dNTPs 10 mM, 0,5 pL de Taq DNA polimerase, e 3 pL de água. A reação foi incubada a 72°C por 15 minutos. A região 3’ do fragmento de serina protease semelhante à tripsina foi clonada em pCR®2.1-TOPO® em uma reação composta de 3 pL do fragmento de PCR da região 5’ de serina protease semelhante à tripsina, 1 pL de Solução Salina, 1 pL de água, e 1 pL de pCR®2.1-TOPO®. O plasmídeo resultante foi designado serina 3’.

[00312] Plasmídeo serina 5’ foi digerido com Asc I com o objetivo de ser clonado em plasmídeo pJfyS1579-41-11 digerido com Asc I (Exemplo 9) em uma reação composta de 12,4 pg de DNA plasmídeo serina 5’, 5 pL de Asc I, 10 pL de tampão 10X NEB Buffer 4, e 55 pL de água. A digestão por enzima de restrição foi incubada a 37°C por 2 horas. A digestão foi purificada por eletroforese em gel de agarose 1% usando tampão TAE, onde um fragmento de 1,5 kb foi excisado do gel e extraído usando um QIAQUICK® Gel Extraction Kit de acordo com as instruções do fabricante. O fragmento de serina 5’ digerido com Asc I foi ligado no JfyS 1579-49-1 Idigerido com Asc I em uma reação composta de 233,7 ng de 5’SP-TOPO digerido com Asc I, 160 ng de JfyS1579-49-l 1 digerido com Asc I, 3 pL de Quick Ligase, 25 pL de tampão 2X Quick Ligase Buffer, e 3 pL de água. A reação de ligação foi incubada na temperatura ambiente por 15 minutos. O plasmídeo resultante foi designado serina 5’+pJfyS1579.

[00313] Para construir plasmídeo pAgJgll7, plasmídeos serina 3’ e serina 5’+pJfyS1579 foram digeridos com Sbf I. As digestões foram compostas de 3,96 pg de serina 5’+pJfyS1579 ou 8,85 pg de serina 3’, 4 pL de Sbf\, 10 pL de tampão 10X NEB Buffer 4, e 56 pL de água. Ambas as reações de digestão foram incubadas a 37°C por duas horas. Um pL de fosfatase alcalina de intestino de bezesso (CIP) foi adicionado na reação de digestão de serina 5’+pJfyS1579 e incubado a 37°C por uma hora adicional. Um fragmento de 9,5 kb de serina 5’+pJfyS1579 /Sbf I e um fragmento de 1,5 kb de 3SP-TOPO/SZ?/I foram purificados por eletroforese em gel de agarose 0,8% usando tampão TAE, excisados do gel, c extraídos usando um QIAQUICK® Gel Extraction Kit de acordo com as instruções do fabricante. O fragmento de serina 3’ digerido com Sbf I foi ligado no fragmento serina 5’+pJfyS1579 digerido com Sbf I em uma reação composta de 486 ng de serina 3’ digerido com Sbf I, 252 ng de serina 5’+pJfyS1579 digerido com Sbf I, 1 gL de Quick Ligase, 10 gL de tampão 2X Quick Ligase Buffer, e 1,5 gL de água. A reação de ligação foi incubada na temperatura ambiente por 20 minutos. O plasmídeo resultante foi designado pAgJgll7 (Figura 22).

Exemplo 26: Geração de uma cepa AgJgl 17-3-10A de Trichoderma reesei com deleção dupla de gene de protease

[00314] Protoplascos de cepa SMai-TrSP-30-22 de deleção de gene de serina protease semelhante à subtilisina de Trichoderma reesei foram gerados e transformados com pAgJgll7 linearizado com Not I usando o método previamente descrito em Exemplo 12 e plaqueados sobre PDA + sacarose 1 M + 10 gg/mL de higromicina. Seis transformantes foram subcultivados sobre placas PDA para gerar esporos.

[00315] Possíveis candidatos de cepa SMai-TrSP-30-22 de Trichoderma reesei contendo o vetor de deleção pAgJgll7 no local de serina protease de 25 kDa, deletando deste modo a serina protease, foram selecionados por PCR de esporo fúngico usando um protocolo modificado de Suzuki et al., 2006, supra. Uma quantidade pequena de esporos de cada candidato foi suspensa em 25 gL de Tampão TE e aquecida em temperatura alta em um forno de micro-ondas por 1 minuto. A suspensão de esporos aquecida em micro-ondas foi usada como um modelo em uma reação PCR para selecionar a deleção de serina protease. A reação foi composta de 1 gL de suspensão de esporos, 1 gL de dNTPs 10 mM, 12,5 gL de tampão 2X ADVANTAGE® GC-Melt LA Buffer, 25 pmols de iniciador 068980, 25 pmols de iniciador 067556, 1,25 unidades de ADVANTAGE® GC Genomic LA Polymerase Mix, e 9,25 gL de água. A reação foi incubada em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® programado para 1 ciclo a 95°C por 10 minutos; 35 ciclos cada a 95°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos, e 72°C por 5 minutos 45 segundos; 1 ciclo a 72°C por 15 minutos; e uma manutenção a 4°C. Os iniciadores usados nestas seleção foram originalmente utilizados como iniciadores de sequenciamento; iniciador 067556 está localizado na extremidade da região flanqueadora 5’ e iniciador 068980 está localizado no início da região flanqueadora 3. Se o vetor de deleção estivesse inserido em um local de serina protease, o fragmento de PCR amplificado deveria ser maior do que o fragmento de tipo selvagem porque ele contém o cassete hpt e tk usado para deletar o gene de serina protease. Foi identificada a cepa AgJgl 17-3 de Trichoderma reesei na qual a serina protease havia sido deletada. Iniciador 067556 (senso): 5’-CTTCTCTTTCTGGCATTGAC-3’ (SEQ ID NO: 85) Iniciador 068980 (antissenso): 5’-CTCGGAATCCTGCGGTTGCC-3’ (SEQ ID NO: 86)

[00316] O construto de deleção pAgJgll7 contém o gene de higromicina-fosfo-transferase (hpt) de E. coli e o gene de timidina- cinase (tk) do vírus do Herpes Simples flanqueados por repetições diretas. As repetições diretas foram inseridas para facilitar a excisão dos marcadores selecionáveis hpt e tk e gerar uma cepa livre de marcador de modo que ela possa ser usada como uma hospedeira para deletar um terceiro gene de protease.

[00317] Esporos de AgJgl 17-3 foram plaqueados sobre placas de meio mínimo para Trichoderma contendo 5-fluoro-2’-desoxi-uridina (FdU) 1 pM em concentrações de 1 x 105 e lx 106 e incubados a 28°C. Dezessete isolados foram subcuitivados sobre placas de meio mínimo para Trichoderma contendo FdU 1 pM e incubados a 28°C. Dos dezessete isolados, apenas sete haviam esporulado, aqueles sete isolados foram então subcultivados sobre placas PDA e incubados a 28°C. Os sete isolados foram então selecionados para a ausência dos marcadores hpt e tk por PCR de esporo fúngico na mesma maneira descrita acima.

[00318] Análise de Southern blot foi realizada para confirmar a deleção do gene de serina protease de 25 kDa e a ausência dos marcadores hpt e tk . DNA genômico foi extraído das cepa de deleção e cepa SMai-TrSP-30-22 de T. reesei como previamente descrito em Exemplo 10. Dois pg de DNA genômico da cepa de deleção, cepa SMai- TrSP-30-22 de T. reesei, e cepa 981-0-8 de T. reesei foram cada um digeridos com Hind III e Neo I. Cepa 981-0-8 de T. reesei e cepa SMai- TrSP-30-22 de T reesei foram incluídos em Southern blot como controles. A reação de digestão de DNA genômico foi composta de 2 pg de DNA genômico, 1 pL de Neo I, 1 pL de Hind III, 3,5 pL de tampão 10X NEB Buffer 2, e água para 35 pL. Ambas digestões de DNA genômico foram incubadas a 37°C por aproximadamente 3,5 horas.

[00319] As digestões foram submetidas à eletroforese em gel de agarose 0,8% usando tampão TAE e transportadas como manchas {blotted) para membrana NYTRAN® Supercharge blotting membrane usando um TURBOBLOTTER® por aproximadamente 5 horas seguindo as recomendações do fabricante. A membrana foi hibridizada com uma sonda de 500 pb de serina protease de 25 kDa T. reesei marcada com digoxigenina, que foi sintetizada pela incorporação de digoxigenina-11-dUTP por PCR usando iniciadores 069279 (senso) e 069280 (antissenso) mostrados abaixo. Iniciador 069279 (senso): 5’-GGCGCCTCAATCCAGAAGGTCGCAC-3’ (SEQ ID NO: 87) Iniciador 069280 (antissenso): 5 ’ -GTGTATGTAGTGAAACG AAGC ATTCG-3 ’ (SEQ ID NO: 88)

[00320] A reação de amplificação foi composta de 5 pL de tampão 10X ThermoPol Buffer Reaction Buffer, 2,5 pL de PCR DIG Labeling Mix, 1 ng de pAgJgll7, 50 pmols de iniciador 069279, 50 pmols de iniciador 069280, 2,5 pL de dNTPs 10 mM, 5 unidades de Taq DNA polimerase, e 35,5 pL de água. As reações foram incubadas em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333 programado para 1 ciclo a 95°C por 2 minutos; 30 ciclos cada a 95°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos, e 72°C por 40 segundos; 1 ciclo a 72°C por 15 minutos; e uma manutenção a 4°C. O produto de reação PCR foi purificado por eletroforese em gel de agarose 1% usando tampão TAE, excisado do gel, e extraído usando um QIAQUICK® Gel Extraction Kit de acordo com as instruções do fabricante. Incorporação de digoxigenina foi indicada pelo aumento da massa molecular.

[00321] Hibridização foi realizada em tampão DIG Easy Hyb a 42°C por 15-17 horas. A membrana foi então lavada sob condições de estringência alta em 2X SSC mais SDS 0,1% por 5 minutos na temperatura ambiente seguido por duas lavagens em 0,5X SSC mais SDS 0,1% por 15 minutos cada a 65°C. Os híbridos de sonda-alvo foram detectados por ensaio quimioluminescente (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, USA) seguindo as instruções do fabricante. A cepa contendo a deleção de serina protease de 25 kDa foi designada Trichoderma reesei AgJgl 17-3-10A.

Exemplo 27: Construção de um plasmídeo pAgJgll8a de deleção de gene de protease aspártica de Trichoderma reesei

[00322] O vetor de deleção pAgJgll8 foi construído para deletar o gene de protease aspártica de 42 kDa de Trichoderma reesei. Plasmídeo pAgJgll8 foi gerado primeiro por amplificação de regiões flanqueadoras 5’ e 3’ e sua clonagem no vetor pCR®2.1-TOPO®. A região flanqueadora 5’ contém uma região dei,5 kb a montante da região codificadora de protease aspártica de 42 kD. A região flanqueadora 5’ foi amplificada usando iniciadores 068620 (senso) e 068621 (antissenso) mostrados abaixo. Iniciador 068620 foi engenhado para conter sítios Asc I e Not I na extremidade 5’ do iniciador. Iniciador 068621 foi engenhado para conter um sítio Asc I na extremidade 5’ do iniciador. Iniciador 068620 (senso): 5’- AAAGGCGCGCCGCGGCCGCTCGCTGTAACGAACTTCTGTCCGC A-3’ (SEQ ID NO: 89) Iniciador 068621 (antissenso): 5’- AAAGGCGCGCCCTTGAATATCGGAGAAGGTTGCTCACGG-3’ (SEQ ID NO: 90)

[00323] A região 5’ do gene de protease aspártica foi amplificada por PCR em uma reação composta de 175 pg de DNA genômico de T. reesei, 1 pL de PLATINUM® Pfx DNA polymerase, 50 pmols de iniciador 068620, 50 pmols de iniciador 068621, 1,5 pL de dNTPs 10 mM, 10 pL de tampãoJOX Pfx Amplification Buffer, e 33,5 pL de água. A reação foi incubada em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® programado para 1 ciclo a 98°C por 3 minutos; 30 ciclos cada a 98°C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos, e 72°C por 1 minuto 30 segundos; 1 ciclo a 72°C por 15 minutos; e uma manutenção a 4°C. Um fragmento de PCR de 1,5 kb foi purificado por eletroforese em gel de agarose 1% usando tampão TAE, excisado do gel, e extraído usando QIAQUICK® Gel Extraction Kit de acordo com as instruções do fabricante. O fragmento de PCR purificado em gel foi tratado com Taq DNA polimerase para adicionar saliências-A 3’ no fragmento em uma reação composta de 5 pL de fragmento purificado por PCR, 1 pL de tampão 10X ThermoPol Buffer, 0,5 pL de dNTPs 10 mM, 1 pL de Taq DNA polimerase, e 3 pL de água. A reação foi incubada a 72°C por 15 minutos. A região 5’ do fragmento de protease aspártica foi clonada em pCR®2.1-TOPO® em uma reação composta de 3 pL do fragmento de PCR da região 5’de protease aspártica, 1 pL de Solução Salina, 1 pL de água, e 1 pL de pCR®2.1-TOPO®. O plasmídeo resultante foi designado Aspartico 5’.

[00324] A região 3’ do fragmento de protease aspártica foi clonada em pCR®2.1-TOPO® usando iniciadores 068622 (senso) e 068623 (antissenso) mostrados abaixo. Iniciador 068622 foi engenhado para conter sítio Sbfl na extremidade 5’ do iniciador. Iniciador 068623 foi engenhado para conter sítios Sbf I e Not I na extremidade 5’ do iniciador. Iniciador 068622 (Senso): AAACCTGCAGGGCGGCGATGGTGGACTTGTTTATG A-3’ (SEQ ID NO: 91) Iniciador 068623 (Antissenso): AAACCTGCAGGCGGCCGCAGCAAGTGAGTATCGA GTTTGTAGG-3’ (SEQ ID NO: 92)

[00325] A região 3’ do gene de protease aspártica foi amplificada por PCR em uma reação composta de 175 pg de DNA genômico de T. reesei, 1 pL de PLATINUM® Pfx DNA polymerase, 50 pmols de iniciador 068622, 50 pmols de iniciador 068623, 1,5 pL de dNTPs 10 mM, 10 pL de tampão 10X Pfx Amplification Buffer, e 33,5 pL de água. A reação foi incubada em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® programado para 1 ciclo a 98°C por 3 minutos; 30 ciclos cada a 98°C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos, e 72°C por 1 minuto 30 segundos; 1 ciclo a 72°C por 15 minutos; e uma manutenção a 4°C. Um fragmento de PCR de 1,5 kb foi purificado por eletroforese em gel de agarose 1% usando tampão TAE, excisado do gel, e extraído usando QIAQUICK® Gel Extraction Kit de acordo com as instruções do fabricante. O fragmento de PCR purificado em gel foi tratado com Taq DNA polimerase para adicionar saliências-A 3’ no fragmento em uma reação composta de 5 pL de fragmento purificado por PCR, 1 pL de tampão 10X ThermoPol Buffer, 0,5 pL de dNTPs 10 mM, 1 pL de Taq DNA polimerase, e 3 pL de água. A reação foi incubada a 72°C por 15 minutos. A região 3’ do fragmento de protease aspártico foi clonada em pCR®2.1-TOPO® em uma reação composta de 3 pL do fragmento de região 3’ de protease aspártica, 1 pL de Solução Salina, 1 pL de água, e 1 pL de pCR®2.1-TOPO®. O plasmídeo resultante foi designado Aspártico 3’.

[00326] Plasmídeo Aspártico 5’ foi digerido com Asc I com o objetivo de ser clonado em plasmídeo pJfyS 1579-41-11 digerido com Asc I (Exemplo 9) em uma reação composta de 6,45 pg de plasmídeo DNA Aspártico 5’, 5 pL de Asc I, 10 pL de tampão iox NEB Buffer 4, e 61 pL de água. A digestão por enzima de restrição foi incubada a 37°C por 4 horas. A digestão foi purificada por eletroforese em gel de agarose 1% usando tampão TAE, onde um fragmento de 1,5 kb foi excisado do gel e extraído usando um QIAQUICK® Gel Extraction Kit de acordo com as instruções do fabricante. O fragmento Aspártico 5’ digerido com Asc I foi ligado no JfyS 1579-49-1 Idigerido com Asc I em uma reação composta de 307,2 ng de Aspártico 5’ digerido com Asc I, 160 ng de JfyS 1579-49-1 Idigerido com Asc I, 3 pL de Quick Ligase, 25 pL de tampão 2X Quick Ligase Buffer, e 3 pL de água. A reação de ligação foi incubada na temperatura ambiente por 15 minutos. O plasmídeo resultante foi designado Aspártico 5’ + pJfyS1579.

[00327] Para construir plasmídeo pAgJgllδ, plasmídeos Aspártico 3’ e Aspártico 5’ + pJfyS1579 foram digeridos com Sbf\. As digestões foram compostas de 3,5 pg de Aspártico 5’ + pJfyS 1579 ou 5,3 pg de Aspartico 3’, 4 pL de Sbfl, 10 pL de tampão 1 OX NEB Buffer 4, e 56 pL de água. Ambas as reações de digestão foram incubadas a 37°C por 1,5 horas. Um pL de fosfatase alcalina de intestino de bezesso (CIP) foi adicinado na reação de digestão de Aspartico 5’ + pJfyS 1579 e incubado a 37°C por uma hora adicional. Um fragmento de 9,5 kb de Aspartico 5’ + pJfyS 1579/Sbf I e um fragmento de 1,5 kb de Aspartico y/Sbfl foram purificados por eletroforese em gel de agarose 0,8% usando tampão TAE, excisados do gel, e extraídos usando um QIAQUICK® Gel Extraction Kit de acordo com as instruções do fabricante. O fragmento Aspartico 3’ digerido com Sbfl foi ligado no fragmento Aspartico 5’ + pJfyS1579 digerido com Sbfl em uma reação composta de 349,5 ng de Aspartico 3’ digerido com Sbfl, 122,35 ng de Aspartico 5’ + pJfyS 1579 digerido com Sbfl, 2 pE de Quick Ligase, 20 pL de tampão 2X Quick Ligase Buffer, e 3 pL de água. A reação de ligação foi incubada na temperatura ambiente por 20 minutos e 3 pL da reação de ligação foram transformados em células de E. coli ultracompetentes SOLOPACK® Gold de acordo com as instruções do fabricante. Transformantes foram selecionados sobre placas de ágar 2X YT suplementado com 100 pg de ampicilina por mL e incubados a 37°C por 16 horas. O plasmídeo resultante foi designado pAgJgll8 (Figura 23).

Exemplo 28: Geração de uma cepa AgJgl 18-02-2E de Trichoderma reesei com deleção tripla de gene de protease

[00328] Protoplastos de cepa AgJgl 17-3-10A de Trichoderma reesei com deleção dupla de protease foram transformados com pAgJgll8 linearizado por Not I usando o método previamente descrito em Exemplo 12 e plaquados sobre placas PDA mais sacarose 1 M com 10 pg de higromicina por mL. Seis transformantes foram subcultivados sobre placas PDA para gerar esporos.

[00329] Possíveis candidatos de cepa AgJgl 17-3-10A de T. reesei contendo o vetor de deleção pAgjgiis no local de protease aspártica de 42 kDa, deletando deste modo a protease aspártica, foram selecionados por PCR de esporo fúngico usando o protocolo modificado de Suzuki et al., 2006, supra. Uma quantidade pequena de esporos de cada candidato foi suspensa em 25 pL de Tampão TE e aquecida em temperatura alta em um forno de micro-ondas por 1 minuto. A suspensão de esporos aquecida em micro-ondas foi usada como um modelo em uma reação PCR para selecionar a deleção de serina protease. A reação foi composta de 1 pL de suspensão de esporos, 1 pL de dNTPs 10 mM, 12,5 pL de tampão 2X ADVANTAGE® GC-Melt LA Buffer, 25 pmols de iniciador 069858, 25 pmols de iniciador 069859, 1,25 unidades de ADVANTAGE® GC Genomic LA Polymerase Mix, c 9,25 pL de água. A reação foi incubada em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® programado para 1 ciclo a 95°C por 10 minutos; 35 ciclos cada a 95°C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos, e 72°C por 5 minutos 30 segundos; 1 ciclo a 72°C por 15 minutos; e uma manutenção a 4°C. Iniciador 069858 está localizado na extremidade da região flanqueadora 5’ e iniciador 069859 está localizado no início da região flanqueadora 3. Se o vetor de deleção foi inserido no local de protease aspártica, o fragmento de PCR amplificado deve ser maior do que o fragmento de tipo selvagem porque ele contém o cassete hpt e tk usado para deletar o gene de serina protease. Foi identificada Trichoderma reesei AgJgl 18-02 na qual a protease aspártica havia sido deletada. Iniciador 069858 (senso): 5’- TCGGGGAGGATGGCGCAAACCGACCTTCCTAAA-3’ (SEQ ID NO: 93) Iniciador 069859 (antissenso): 5’-GCACCTTACCCCTACGGACCACGAT-3’ (SEQ ID NO: 94)

[00330] O construto de deleção pAgJgllδ contém o gene de higromicina-fosfo-transferase (hpt) de E. coli e o gene de timidina- cinase (tk) do virus do Herpes Simples flanqueados por repetições diretas. As repetições diretas foram inseridas para facilitar a excisão dos marcadores selecionáveis hpt e tk e gerar uma deleção total da protease aspártica de 42 kD.

[00331] Esporos de T. reesei AgJgl 18-02 foram plaqueados sobre placas de meio mínimo para Trichoderma contendo 5-fluoro-2’-desoxi- uridina (FdU) 1 pM em concentrações de 1 x 105 e 1 x 106 e incubados a 28°C. Dez isolados foram subcultivados sobre placas PDA e incubados a 28°C. Os dez isolados foram então selecionados para a ausência dos marcadores hpt e tk por PCR de esporo fúngico na mesma maneira descrita acima acima.

[00332] Análise de Southern blot foi realizada para confirmar a deleção da protease aspártica de 42 kD gene e a ausência dos marcadores hpt e tk . DNA genômico foi extraído da cepa de deleção e cepa 981-0-8 de T. reesei como previamente descrito em Exemplo 10. Dois pg de DNA genômico da cepa de deleção e cepa 981-0-8 de T. reesei foram digeridos com Neo I. Cepa 981-0-8 de T. reesei foi incluída em Southern blot como um controle. A reação de digestão de DNA genômico foi composta de 2 pg de DNA genômico, 1 pL de Neo I, 5 pL de 10X NEB Buffer 3, e água para 50 pL. Ambas digestões de DNA genômico foram incubadas a 37°C por aproximadamente 14-16 horas.

[00333] As digestões foram submetidas à eletroforese em gel de agarose 0,8% usando tampão TAE e transportadas como manchas (blotted) para membrana NYTRAN® Supercharge blotting membrane usando um TURBOBLOTTER® por aproximadamente 12-16 horas seguindo as recomendações do fabricante. A membrana foi hibridizada com uma sonda de 500 pb de protease aspártica de 42 kDa de T. reesei marcada com digoxigenina, que foi sintetizada pela incorporação de digoxigenina-11-dUTP por PCR usando iniciadores 069860 (senso) e 069861 (antissenso) mostrados abaixo. Iniciador 069860 (senso): 5 ’ -CTTCTATCTTGGG ATGCTTC ACGATACGTGA-3 ’ (SEQ ID NO: 95) Iniciador 069861 (antissenso): 5’-CGCGCCCTTGAATATCGGAGAAGGT-3’ (SEQ ID NO: 96)

[00334] A reação de amplificação foi composta de 5 pL de 10X Taq Buffer, 2,5 pL de PCR DIG Labeling Mix, 5 ng de pAgJgl 18, 10 pmols de iniciador 069860, 10 pmols de iniciador 069861, 2,5 pL de dNTPs 10 mM, 5 unidades de Taq DNA polimerase, e 36,5 pL de água. As reações foram incubadas em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333 programado para 1 ciclo a 95°C por 2 minutos; 30 ciclos cada a 95°C por 30 segundos, 56°C por 30 segundos, e 72°C por 40 segundos; 1 ciclo a 72°C por 15 minutos; e uma manutenção a 4°C. O produto de reação PCR foi purificado por eletroforese em gel de agarose 1% usando tampão TAE, excisado do gel, e extraído usando um QIAQUICK® Gel Extraction Kit de acordo com as instruções do fabricante. Incorporação de digoxigenina foi indicada pelo aumento da massa molecular.

[00335] Hibridização foi realizada em tampão DIG Easy Hyb a 42°C por 15-17 horas. A membrana foi então lavada sob condições de estringência alta em 2X SSC mais SDS 0,1% por 5 minutos na temperatura ambiente seguido por duas lavagens em 0,5X SSC mais SDS 0,1% por 15 minutos cada a 65°C. Os híbridos de sonda-alvo foram detectados por ensaio quimioluminescente (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, USA) seguindo as instruções do fabricante. A cepa contendo a deleção de protease aspártica foi designada Trichoderma reesei AgJgl 18-02-2E.

Exemplo 29: Fermentação de Trichoderma reesei AgJgl 17-3-10A e Trichoderma reesei AgJgl 18-02-2E

[00336] Esporos de Trichoderma reesei AgJgl 17-3-10 A e Trichoderma reesei AgJgl 18-02-2E de placas PDA foram inoculados em frascos de agitação de 500 mL, contendo too mL de Meio Shake Flask. Cepa 981-0-8 de Trichoderma reesei foi cultivada como um controle sob as mesmas condições. Os frascos foram deixados em um vascolejador orbital a 28°C por aproximadamente 48 horas em cujo tempo 50 mL da cultura foram adicionados em um fermentador de vidro encamisado de três litros APPLIKON® (Applikon Biotechnology, Inc., Foster City CA USA) que contém 1,8 litros de Meio de Fermentação em Batelada. Meio de Alimentação de Fermentação foi adicionado em uma taxa de 0 a 4 g/L/hora por um período de 185 horas. O vaso de fermentação foi mantido em uma temperatura de 28°C e o pH foi controlado usando um sistema de controle APPLIKON® 1030 (Applikon Biotechnology, Inc., Foster City CA USA) em ponto de ajuste de de 4,5 ± 0,1. Ar foi adicionado no vaso em uma taxa de 1 vvm e o caldo foi agitado por um impulsor Rushton girando a de 1.100 rpm a 1300 rpm. No final da fermentação, todo o caldo foi colhido do vaso e centrifugado a3000 x g para remover a biomassa. O sobrenadante foi esterilizado por filtração e armazenado a de 5°C a 10°C.

Exemplo 30: Preparaçao de beta-xilosidase GH3 de cepa CBS 186.67 de Aspergillus aculeatus

[00337] A beta-xilosidase GH3 de cepa CBS 186.67 de Aspergillus aculeatus foi recombinantemente preparada de acordo com o seguinte procedimento.

[00338] Para gerar DNA genômico por PCR amplificação, Aspergillus aculeatus CBS 186.67 foi propagado sobre placas de ágar PDA pelo crescimento a 26°C por 7 dias. Esporos colhidos das placas PDA foram inoculados em 25 mL de meio de glicose YP+2% em um frasco de agitação com defletor e incubados a 26°C por 48 horas com agitação a 200 rpm.

[00339] DNA genômico foi isolado de acordo com um protocolo modificado de FastDNA® SPIN (Qbiogene, Inc., Carlsbad, CA, USA). Resumidamente, um FastDNA® SPIN Kit for Soil (Qbiogene, Inc., Carlsbad, CA, USA) foi usado em um sistema de homogeneização FastPrep® 24 Homogenization System (MP Biosciences, Santa Ana, CA, USA). Dois mL de material fúngico foram colhidos por centrifugação a 14.000 x g por 2 minutos. O sobrenadante foi removido e a pelota foi ressuspensa em 500 pL de água deionizada. A suspensão foi transferida para um tubo Lysing Matrix E FastPrep® (Qbiogene, Inc., Carlsbad, CA, USA) e 790 pL de tampão fosfato de sódio e 100 pL de Tampão MT do FastDNA® SPIN Kit foram adicionados no tubo. A amostra foi então mantida em um instrumento FastPrep® (Qbiogene, Inc., Carlsbad, CA, USA) e processada por 60 segundos em uma velocidade de 5,5 m/s. A amostra foi então centrifugada a 14.000 x g por duas minutos e o sobrenadante foi transferido para um tubo limpo EPPENDORF®. Um volume de 250 pL de reagente PPS do FastDNA® SPIN Kit foi adicionado e então a amostra foi misturada suavemente por inversão. A amostra foi de novo centrifugada a 14.000 x g por 5 minutos. O sobrenadante foi transferido para um tubo de 15 mL seguido por 1 mL de suspensão Binding Matrix do FastDNA® SPIN Kit e então misturado por inversão por dois minutos. A amostra foi colocada em uma estante estacionária de tubos e a matriz de sílica foi permitida sedimentar por por 3 minutos. Um volume de 500 pL do sobrenadante foi removido e rejeitado e então a amostra restante foi ressuspensa na matriz. A amostra foi então transferida para um tubo de filtro SPIN do FastDNA® SPIN Kit e centrifugada a 14.000 x g por 1 minuto. O tubo de captura foi esvaziado e a suspensão de matriz restante foi adicionada no tubo de filtro SPIN. A amostra foi de novo centrifugada (14.000 x g, 1 minuto). Um volume de 500 pL de solução SEWS-M do FastDNA® SPIN Kit foi adicionado no tubo de filtro SPIN a amostra foi centrifugada na mesma velocidade por 1 minuto. O tubo de captura foi esvaziado e o filtro SPIN foi substituído no tubo de captura. A unidade foi centrifugada a 14.000 x g por 2 minutos para “secar” a matriz da solução de lavagem residual SEWS-M. O filtro SPIN foi posicionado em um tubo de captura novo e permitido secar ao ar por 5 minutos na temperatura ambiente. A matriz foi suavemente ressuspensa em 100 pL de DES (DNase/Água livre de pirogênio) com uma ponta de pipeta. A unidade foi centrifugada (14.000 x g, 1 minuto) para eluir o DNA genômico seguido por eluição com 100 pL de Tris 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 8,0 por centrifugação renovada a 14.000 x g por 1 minuto e os eluatos foram combinados. A concentração do DNA colhido do tubo de captura foi medida por um espectrofotômetro UV a 260 nm.

[00340] O gene de beta-xilosidase de Aspergillus aculeatus foi isolado por PCR usando dois iniciadores de clonagem GH3-101f e GH3- 10lr, mostrados abaixo, que foram planejados baseando-se na sequência de comprimento total de xyl2 de Aspergillus aculeatus publicamente disponível (GenBank AB462375.1) para clonagem direta usando a estratégia IN-FUSION ™. Iniciador GH3-101E 5’-acacaactggggatccaccatggctgtggcggctcttgctctgctgg-3’ (SEQ ID NO: 97) Iniciador GH3-l()lr: 5’- agatctcgagaagcttaCTCATCCCCCGCCACCCCCTGCACCTCC-3’ (SEQ ID NO: 98)

[00341] Uma reação PCR foi realizada com DNA genômico preparado de Aspergillus aculeatus CBS 186.67 com o objetivo de para amplificar o gene de comprimento total. A reação PCR foi composta de 1 pL de DNA genômico, 0,75 pL de iniciador GH3-101.1f (10 pM), 0,75 pL de iniciador GH3-101.1r (10 pM), 3 pL de tampão 5X HF Buffer (Finnzymes Oy, Finland), 0,25 pF de MgCU 50 mM, 0,3 pU de dNTP 10 mM, 0,15 pU de PHUSION® DNA polymerase (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA), e água de grau PCR para até 15 pF. A reação PCR foi realizada usando uma DYAD® PCR machine (Bio-Rad Eaboratories, Inc., Hercules, CA, USA) programada por 2 minutos a 98°C seguidos por 10 ciclos touchdown a 98°C por 15 segundos, 70°C (-UC/ciclo) por 30 segundos, e 72°C por 2 minutos 30 segundos; e 25 ciclos cada a 98°C por 15 segundos, 60°C por 30 segundos, 72°C por 2 minutos 30 segundos, e 5 minutos a 72°C.

[00342] Os produtos de reação foram isolados por eletroforese em gel de agarose 1,0% usando tampão TAE onde uma banda de produto de PCR de aproximadamente 2,4 kb foi excisada do gel e purificada usando um GFX® PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, USA) de acordo com as instruções do fabricante. DNA correspondendo ao gene de beta- xilosidase de Aspergillus aculeatus foi clonado no vetor de expressão pDAulO9 (WO 2005042735) linearizado com Bam HI e Hind III, usando um IN-FUSION™ Dry-Down PCR Cloning Kit (BD Biosciences, Paio Alto, CA, USA) de acordo com as instruções do fabricante.

[00343] Um volume de 2,5 gL da mistura de ligação diluída foi usado para transformar células quimicamente competentes ONE SHOT® TOPIO. Três colônias foram selecionadas sobre placas de ágar LB contendo 100 gg de ampicilina por mL e cultivadas durante a noite em 3 mL de meio LB suplementado com 100 gg de ampicilina por mL. DNA plasmídeo foi purificado usando um E.Z.N.A.® Plasmid Mini Kit (Omega Bio-Tek, Inc., Norcross, GA, USA) de acordo com as instruções do fabricante. A sequência de gene de beta-xilosidase de Aspergillus aculeatus foi verificada por sequenciamento de Sanger antes da expressão heteróloga.

[00344] A sequência codificadora é de 2454 pb incluindo o códon de terminação. O gene não contém introns. A proteína predita codificada é de 817 aminoácidos. Usando o programa SignalP (Nielsen et al.., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), foi predito um peptídeo de sinal de 17 resíduos. A proteína madura predita contém 800 aminoácidos.

[00345] Protoplastos de Aspergillus oryzae MT3568 foram preparados como descrito em WO 95/02043. A. oryzae MT3568 é um derivado de Aspergillus oryzae JaL355 com gene amdS (acetamidase) interrompido (WO 2002/40694) na qual a auxotrofia pyrG foi restaurada pela disrupção do gene de acetamidase (amdS) de A. oryzae com o gene pyrG. Cem microlitros de suspensão de protoplasto foram misturados com 2,5-15 gg do vetor de expressão em Aspergillus e 250 gL de PEG 4000 60%, CaCl2 10 mM, e 10 mM Tris-HCl pH 7,5 foram adicionados e susvemente misturados. A mistura foi incubada a 37°C por 30 minutos e os protoplastos foram espalhados sobre placas de sacarose COVE (1 M) (Cove, 1996, Biochim. Biophys. Acta 133: SI-56) suplementado com acetamida 10 mM e CsCl 15 mM para seleção de transformante. Após incubação por 4-7 dias a 37°C esporos de vários transformantes foram semeados sobre meio de maltodextrina YP-2%. Após cultivo de 4 dias a 30°C o caldo de cultura foi analisado com o propósito de identificar os melhores transformantes baseado-se em sua capacidade para produzir uma quantidade grande de beta-xilosidase ativa de Aculeatus aculeatus. A seleção foi baseada na intensidade da banda correspondendo à proteína expressada heteróloga determinada por SDS-PAGE e atividade da enzima sobre 4-nitro-fenil-beta-D-xilo- piranosídeo (pNPX) como segue. Dez pL de caldo de cultura foram misturados com 90 pL de reagente de ensaio contendo 10 pL de TWEEN® 20 0,1% , 10 pL de citrato de sódio 1 M de pH 5, 4 pL de substrato pNPX 100 mM (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) solubilizado em DMSO (0,4% do volume final em solução de estoque), e água filtrada. O ensaio foi realizado por 30 minutos a 37°C e absorbância foi determinada a 405 nm antes da e após a adição de 100 pL de carbonato de sódio 1 M de pH 10. Os valores mais altos de absorbância a 405 nm foram correlacionados com os dados de SDS- PAGE para a seleção do melhor transformante.

[00346] Esporos de do melhor transformante designado A. oryzae EXP3611 foram espalhados sobre placas COVE contendo TRITON® X-100 0,01% com o propósito de isolar colônias individuais . O espalhamento foi repetido duas vezes no total sobre meio de sacarose COVE (Cove, 1996, Biochim. Biophys. Acta 133: 51-56) contendo sacarose 1 M e nitrato de sódio 10 mM, suplementado com acetamida 10 mM e CsCH 5 mM. Fermentação foi então realizada em frascos de agirtação de 250 mL usando meio DAP-4C-1 por 4 dias a 30°C com agitação a 100 rpm. O caldo de fermentação foi filtrado usando métodos padrão. Concentração de proteína foi determinada usando um Microplate BCA ™ Protein Assay Kit (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA) no qual albumina de soro bovino foi usada como uma proteína padrão.

Exemplo 31: Capacidade de armazenagem de caldos de Trichoderma reesei AgJgll7-3-10A e de Trichoderma reesei AgJgll8-02-2E em temperaturas elevadas

[00347] Os caldos de Trichoderma reesei Agjgii7-3-10A, Trichoderma reesei AgJgl 18-02-2E, e cepa 981-0-8 de Trichoderma reesei (controle) foram avalidados para a capacidade de armazenagem em temperaturas elevadas e comparados com a estabilidade da cepa parental. Caldos de fermentação obtidos de Exemplo 29 foram esterilizados por filtração (filtro de seringa de 0,2 pm, membrana de poli(éter-sulfona), GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA), aliquotados para dentrro de Frascos Nunc CRYOTUBE™ de 1,8 mL (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) e subitamente congelados em nitrogênio líquido. Os frascos foram armazenados a 40°C ou -80°C (como um controle) por duas semanas. Após incubação, as amostras foram ensaiadas para atividade de hidrólise de PCS.

[00348] Hidrólise de PCS foi conduzida usando placas de cavidade profunda de 2,2 mL (Axygcn, Union City, CA, USA) em um volume de reação total de 1,0 mL. A hidrólise foi realizada com 50 mg de PCS por mL de tampão acetato de sódio 50 mM de pH 5,0 contendo sulfato de manganês 1 mM e uma resposta à dose das cepas com deleção de protease e da cepa parentas (2, 4, 8, e 12 mg per grama de celulose). Cada reação foi suplementada com adição de 5% de proteína de uma beta-glicosidase de Aspergillus aculeatus (Exemplo 30). Ensaios de hidrólise foram realizados três vezes por72 horas a 50°C. Após a hidrólise, as amostras foram filtradas com uma placa de filtro de 96 cavidades Multiscreen de 0,45 gm (Millipore, Bedford, MA, USA) e os filtrados foram analisados para o teor de açúcar como descrito abaixo.

[00349] Concentrações de açúcar das amostras diluídas em H2SO4 0,005 M foram medidas após eluição por H2SO4 0,005 M com ácido benzóico 0,05% p/p em uma vazão de fluxo de 0,6 mL/min de uma coluna AMINEX® HPX-87H de 4,6 mm x 250 mm (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) a 65°C com quantificação por integração dos sinais de glicose e de celobiose do detector de índice de refração (CHEMSTATION®, AGILENT® 1100 HPLC, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) calibraado por amostras de açúcar puro. Os equivalentes resultantes foram usados para calcular a percentagem de conversão de celulose para cada reação. O grau de conversão de celulose foi calculado usando a seguinte equação:

[00350] % conversão = [concentração de glicose + 1,053 x (concentração de celobiose)] / [(concentração de glicose + 1,053 x (concentração de celobiose ) em um digesto limite]. O fator 1,053 para a celobiose considera o aumento em massa quando celobiose é convertida em glicose. Sessenta mg da preparação de proteína celulolítica de T. reesei por g de celulose foram usados para o digesto limite.

[00351] Os resultados mostrados em Figura 24 demonstraram que as atividades de celulase residual a 40°C por duas semanas de caldos de Trichoderma reesei AgJgl 17-3-10A e Trichoderma reesei AgJgl 18-02-2E foram superiores em comparação com as do caldo da cepa 981-0-8 de Trichoderma reesei sob as mesmas condições. Para alcançar conversão de 80% do substrato foi exigido um aumento de 76 vezes em carregamento de proteína para a cepa parental com as amotras incubadas a 40°C em comparação com a amostra de controle incubadas a -80°C. Sob as mesmas condições, há um aumento de 43 e 1,61 vezes em carregamento de proteína para os caldos de cdepa de deleção de protease tripla e dupla, respectivamente. Consequentemente, o caldo de cepa de deleção de protease tripla mostrou uma melhoria de 19% em estabilidade na armazenagem por duas semanas a 40°C. O caldo de deleção de protease dupla mostrou uma melhoria de 8,5% quando armazenado a 40°C por duas weeks.

Exemplo 32: Geração de vetor pJfyS 152 de deleção de serina protease semelhante à subtilisina

[00352] A sequência flanqueadora 5’ do gene de serina protease semelhante à subtilisina (pepC) de T. reesei 981-0-8 e (SEQ ID NO: 99 para a sequência de DNA e SEQ ID NO: 100 para a sequência de aminoácidos deduzida) foi amplificada usando PHUSION® Hot Start High-Fidelity DNA polymerase (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) e iniciadores direto e inverso gene-específicos mostrados abaixo. A porção sublinhada é um sítio Asc I introduzido para clonagem e a região em itálico representsa uma extensão introduzida correspondendo a uma região homóloga do sítio da inserção de vetor necessária para clonagem IN-FUSION® Cloning (Clontech, Paio Alto, CA, USA). Iniciador direto: 5’- /cacatggOTaaacggçgçgççGGTACTATATTAGAAAGGGGTTCC-3’ (SEQ ID NO: 101) Iniciador inverso: 5’- íigccftgftftg/cgggçgçgççGAAGAAGAGAAGAGGAGGAGGATG-3’ (SEQ ID NO: 102)

[00353] A reação de amplificação continha 150 ng de DNA genômico de T. reesei 981-0-8, dNTP’s 200 pM, iniciadores 0,4 pM, tampão IX PHUSION® GC Buffer (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA), e 2 unidades de PHUSION® DNA polymerase em um volume final de 50 pL. A reação de amplificação foi incubada em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® programado para 1 ciclo a 98°C por 2 minutos; 30 ciclos cada a 98°C por 30 segundos, 57°C por 30 segundos, e 72°C por 1 minuto 30 segundos; e um ciclo a 72°C por 7 minutos. Produtos de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose 1% usando tampão TAE e um fragmento de 2,2 kb foi excisado e agarose foi extraída usando um NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Machery-Nagel, Dueren, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante.

[00354] O produto de PCR de 2,2 kb foi inserido em pJfyS1579-41- 11 digerido com Asc I (Exemplo 9) usando um IN-FUSION® ADVANTAGE® PCR Cloning Kit (Clontech, Paio Alto, CA, USA) de acordo com o protocolo do fabricante. A reação IN-FUSION® continha tampão IX INFUSION® Reaction Buffer (Clontech, Palo Alto, CA, USA), 150 ng de pJfyS1579-41-ll, 100 ng de PCR product, e 1 pE de IN-FUSION® Enzyme (Clontech, Paio Alto, CA, USA) in a 10 pL reaction volume. A reação foi incubada por 15 minutos a 37°C e 15 minutos a 50°C. Na reação 40 pL de TE foram adicinados. 2 pL foram usados para transcormar células competentes ONE SHOT® TOP10 de acordo com o protocolo do fabricante. Transformantes foram selecionados por sequenciamento e um clone contendo o inserto sem erros de PCR foi identificado e chamado pJfyS 152A. Plasmídeo pJfyS152A foi usado para inserir o flanco 3’ do gene pepC.

[00355] A sequência flanqueadora pepC 3’ foi amplificada de DNA genômico de T. reesei 981-0-8 (Exemplo 13) usando PHUSION® Hot Start High-Fidelity DNA polymerase e iniciadores direto e inverso gene- específicos mostrados abaixo. A porção sublinhada é o sítio Sbf I introduzudo para clonagem c a região em itálico representa uma extensão introduzida correspondendo a uma região homóloga do sírio da inserção de vetor necessára para clonagem IN-FUSION® Cloning, e a porção em negrito é um sítio Pme I introduzxido para a remoção posterior da porção de propagação bacteriana do plasmídeo. Iniciador direto: 5’- cctααtfαaaatattcctgcaggTCTATCTCTTTTG AGTAGTCCCC A-3 ’ (SEQ ID NO: 103) Iniciador inverso: 5’- tggccata fflW/6/rcctgcagggtttaaac AGCT AGTG ACTC GCG ATTT ATC GT-3 ’ (SEQ ID NO: 104)

[00356] A reação de amplificação continha 150 ng de DNA genômico de T. reesei 981-0-8, dNTP’s 200 pM, iniciadores 0,4 pM, tampão IX PHUSION® HF Buffer (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) com MgCl2 5 mM, e 2 unidades de PHUSION® DNA polymerase em um volume final de 50 pL. A reação de amplificação foi incubada em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® programado para 1 ciclo a 98°C por 2 minutos; 30 ciclos cada a 98°C por 30 segundos, 56°C por 30 segundos, e 72°C por 1 minuto 30 segundos; e um ciclo a 72°C por 7 minutos. Produtos de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose 1% usando tampão TAE onde um fragmento de 2,2 kb foi excisado e agarose foi extraída usando um NUCLEOSPIN® Extract II Kit de acordo com o protocolo do fabricante.

[00357] O produto de PCR de 2,2 kb PCR foi inserido em digerido com pJfyS 152A Sbf I usando um INFUSION® ADVANTAGE® PCR Cloning Kit de acordo com o protocolo do fabricante. A reação INFUSION® continha tampão IX IN-FUSION® Reaction Buffer, 150 ng de pJfyS 1579-41-11, 100 ng do produto de PCR, e 1 pL de enzima INFUSION® Enzyme em um volume de reação de 10 pL.

[00358] A reação foi incubada por 15 minutos a 37°C e 15 minutos a 50°C. Na reação 40 pL de TE foram adicionados e 2 pL foram usados para transformar células competentes ONE SHOT® TOP 10 de acordo com o protocolo do fabricante. Transformantes foram selecionados por sequenciamento e um clone contendo o inserto sem erros de PCR foi identificado designado pJfyS 152 (Figura 25). Plasmídeo pJfyS 152 foi usado para deletar o gene pepC.

Exemplo 33: Geração de cepa JfyS 152-1 de Trichoderma reesei com serina protease semelhante à subtilisina deletada

[00359] Seis transformantes de T. reesei AgJgl 15-104-7B1 (Exemplo 23) transformados com pJfyS 152 digerido com Pme I e purificado em gel de acordo com o procedimento descrito em Exemplo 11, foram transferidos das placas de transformação com circuitos de inoculação estéreis par placas novas contendo meio PDA e crescidos a 28°C por 7 dias. Todos os 6 transformantes foram então analisados por análise Southern. DNA genômico de cada um dos 6 transformantes foi extraído como descrito em Exemplo 21 e 2,5 pg de cada um foram digeridos com 20 unidades de Nsi II e 20 unidades de Bgl II por 16 horas. Digestões foram submetidas à eletroforese em gel de agarose 0,9% e transportadas como manchas (blotted) para membrana NYTRAN® Supercharge blotting membrane usando um TURBOBLOTTER® por aproximadamente 12-16 horas seguindo as recomendações do fabricante. Uma sonda de PCR, hibridizando com a sequência flanqueadora 3 do gene pepC, foi gerada usando um PCR DIG Probe Synthesis Kit de acordo com o protocolo do fabricante com os seguintes iniciadores direto e inverso: Iniciador direto: 5’-TGATTTCGTGGACAGCGTTTCTCGC-3’ (SEQ ID NO: 105) Iniciador inverso: 5’-TTGCCTT AC AG CT G G C AAC A AT GGCGTC-3’ (SEQ ID NO: 106)

[00360] A reação de amplificação foi incubada em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® programado para 1 ciclo a 95°C por 2 minutos; 30 ciclos cada a 94°C por 30 segundos, 59°C por 30 segundos, e 72°C por 40 segundos, e um ciclo a 72°C por 7 minutos. Produtos de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose 1% usando tampão TAE e um fragmento de 0,3 kb foi excisado e agarose foi extraída usando um NUCLEOSPIN® Extract II Kit de acordo com o protocolo do fabricante. A incorporação de digoxigenina foi confirmada pelo deslocamento do peso molecular da sonda marcada que se estendeu por aproximadamente 0,5 kb.

[00361] Hibridização foi realizada em tampão DIG Easy Hyb a 42°C por 15-17 horas. A membrana foi então lavada sob condições de estringência alta em 2X SSC mais SDS 0,1% por 5 minutos na temperatura ambiente seguido por duas lavagens em 0,5X SSC mais SDS 0,1% por 15 minutos cada a 65°C. Os híbridos de sonda-alvo foram detectados por ensaio quimioluminescente (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, USA) seguindo as instruções do fabricante

[00362] Análise Southern indicou que 3 dos 6 transformantes hospedavam o cassete de deleção em uma cópia única. A cepa contendo a deleção de pepC foi designada Trichoderma reesei JfyS152-l.

Exemplo 34: Geração do vetor vetor pJfyS 153 de deleção de protease aspártica semelhante à pepsina deletion

[00363] A sequência flanqueadora 5’ do gene protease aspártica semelhante à pepsina de Trichoderma reesei 981-0-8 (SEQ ID NO: 107 para a sequência de DNA e SEQ ID NO: 108 para a sequência de aminoácidos deduzida) foi amplificada usando PHUSION® Hot Start High-Fidelity DNA polymerase (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) e iniciadores direto e inverso gene-específicos mostrados abaixo. A porção sublinhada é um sítio Asc I introduzido para clonagem e a região em itálico representa homologia de vetor ao sítio de inserção para IN-FUSION®. Iniciador direto: 5’- tcacatggtttaaacggcgcgccTTCCGGCTTCTTTTTATGTATACCT-3' (SEQ ID NO: 109) Iniciador inverso: 5’- agrcftgíWcgggcgcgccAAGCTAGGAACCAGCCTCTTTGTA-3 ’ (SEQ ID NO: 110)

[00364] A reação de amplificação continha 150 ng de DNA genômico de Trichoderma reesei 981-0-8, dNTP’s 200 pM, iniciadores 0,4 pM, tampão IX PHUSION® GC Buffer (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) e 2 unidades de PHUSION® DNA polymerase (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) em um volume final de 50 pL.

[00365] A reação de amplificação foi incubada em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® programado para 1 ciclo a 95°C por 2 minutos; 30 ciclos cada a 95°C por 30 segundos, 57°C por 30 segundos, e 72°C por 1 minuto 30 segundos; e um ciclo a 72°C por 7 minutos.

[00366] Produtos de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose 1% usando tampão TAE e um fragmento de 2,2 kb foi excisado e agarose foi extraída usando um NUCLEOSPIN® Extract 11 Kit de acordo com o protocolo do fabricante.

[00367] O produto de PCR de 2,2 kb PCR foi inserido em pJfyS1579-41-l 1 digerido com Asc 1-usando um IN-FUSION® ADVANTAGE® PCR Cloning Kit de acordo com o protocolo do fabricante. A reação IN-FUSION® continha tampão IX IN-FUSION® Reaction Buffer, 150 ng de pJfyS1579-41-ll, 100 ng de produt de PCR e 1 pL de enzima IN-FUSION® Enzyme em um volume de reação de 10 pL. A reação foi incubada por 15 minutos a 37°C e 15 minutos a 50°C. Na reação 40 pL de TE foram adicionados e 2 pU foram usados para transformar células competentes ONE SHOT® TOP 10 de acordo com o protocolo do fabricante. Transformantes foram selecionados por sequenciamento e um clone contendo o inserto sem erros de PCR foi identificado e designado pJfyS 153A, e foi usado como o plasmídeo para inserir o flanco 3’ do gene de protease aspártica semelhante à pepsina.

[00368] A sequência flanqueadora 3’ do gene de protease aspártica semelhante à pepsina foi amplificada de DNA genômico Trichoderma reesei 981-0-8 (Exemplo 13) usando PHUSION® Hot Start High- Fidelity DNA polymerase (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) e iniciadores direto e inverso gene-específicos mostrados abaixo. A porção sublinhada é sítio Sbfl introduzido para clonagem e a região em itálico representa homologia de vetor ao sítio de inserção para INFUSION®, e a porção em negrito é um sítio Pme I introduzido para remoção posterior da porção de propagação bacteriana do plasmídeo. Iniciador direto: 5’-ctagttggagtattcctecαg.gaGCCGAGCTCCTGAACGCTGAGATT-3’ (SEQ IP NO: IIP Iniciador inverso: 5’-taaccatatttaaatcctecqgGTTTAAACGAGGGAAAAGGGCCGCTGCACGAT-3’ (SEQ IP NO: 112)

[00369] A reação de amplificação continha 150 ng de DNA genômico de Trichoderma reesei 981-0-8, dNTP’s 200 pM, iniciadores 0,4 pM, tampão IX PHUSION® HF Buffer com MgCU 5 mM, e 2 unidades de PHUSION® DNA polymerase em um volume final de 50 pL.

[00370] A reação de amplificação foi incubada em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® programado para 1 ciclo a 95°C por 2 minutos; 30 ciclos cada a 95°C por 30 segundos, 59°C por 30 segundos, e 72°C por 1 minuto 30 segundos; e um ciclo a 72°C por 7 minutos.

[00371] Produtos de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose 1% usando tampão TAE e um fragmento de 1,5 kb foi excisado e agarose foi extraída usando um NUCLEOSPIN® Extract II Kit de acordo com o protocolo do fabricante.

[00372] O produto de PCR de 1,5 kb foi inserido em pJfyS 153A digerido com Sbf I usando um INFUSION® ADVANTAGE® PCR Cloning Kit de acordo com o protocolo do fabricante. A reação INFUSION® continha tampão IX IN-FUSION® Reaction Buffer, 150 ng de pJfyS1579-41, 100 ng de produto de PCR, e 1 gL de enzima INFUSION® Enzyme em um volume de reação de 10 pL. A reação foi incubada por 15 minutos a 37°C e 15 minutos a 50°C. Na reação 40 pL de TE foram adicionados e 2 gL foram usados para transformar células competentes ONE SHOT® TOP 10 de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Transformantes foram selecionados por sequenciamento e um clone contendo o inserto sem erros de PCR foi identificado e designado pJfyS 153 (Figura 26), e foi usado para deletar o gene de protease aspártica semelhante à pepsina.

Exemplo 35: Geração de cepa JfyS153-6 de Trichoderma reese com protease aspártica semelhante à pepsina deletada

[00373] Dezesseis transformantes de Trichoderma reesei AgJgl 15- 104-7B1 (descrito em Exemplo 23) foram combinados quando protoplastos foram transformados com pJfyS 152 digerido com Pme I e purificado em gel de acordo com o procedimento descrito em Exemplo 12. Todos os 16 transformantes foram transferidos para placas de transformação com circuitos de inoculação estéreis contendo meio PDA e crescidos a 28°C por 4 dias. Os 16 transformantes foram analisados por PCR de esporo fúngico de acordo com o método descrito em Exemplo 23 com os seguintes iniciadores: Iniciador direto: 5’-CGCGGAGGT GAGGT GTT GAT GAT G-3’ (SEQ ID NO: 113) Iniciador inverso 1 (de tipo selvagem): 5’-CGGCGGTCTTTAAGGTGATGTCGC-3’ (SEQ ID NO: 114) Iniciador inverso 2 (deletado): 5’-GTTTCAGGCAGGTCTTGCAACG-3’ (SEQ ID NO: 115)

[00374] A reação foi incubada em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® programado para 1 ciclo a 98°C por 5 minutos; 35 ciclos cada a 98°C por 20 segundos, 53°C por 30 segundos, e 72°C por 3 minutos 30 segundos; 1 ciclo a 72°C por 7 minutos; e uma manutenção a 4°C. Reações de PCR foram submetidas à eletroforese em gel de agarose 1% em tampão TAE.

[00375] Os iniciadores de PCR foram planejados de modo que se o gene de tipo selvagem estivesse intacto os Iniciadores direto e inverso 1 anelariam resultando em um fragmento de 2,5 kb e se o gene estivesse deletado os Iniciadores direto e inverso 2 anelariam resultando em um fragmento de 3,5 kb. A PCR de esporo fúngico sugeriu que apenas um dos 16 transformantes continha a deleção mostrando apenas o fragmento de 3,5 kb. Esta cepa foi subsequentemente analisada pela análise Southern.

[00376] DNA genômico foi extraído como descrito em Exemplo 21 e 2 pg foram digeridos com 21,4 unidades de Neo I e 21,4 unidades de Bgl II por 16 horas. Digestões foram submetidas à eletroforese em gel de agarose 0,9% em tampão TAE e transportadas como manchas {blotted) para membrana NYTRAN® Supercharge blotting membrane usando um TURBOBLOTTER® por aproximadamente 12-16 horas seguindo as recomendações do fabricante. Uma sonda de PCR, hibridizando com a sequência flanqueadora 3’ do gene de protease aspártica semelhante à pepsina, foi gerada usando um PCR DIG Probe Synthesis Kit de acordo com o protocolo do fabricante (Roche Diagnostics, Indianapolis, ID) com os seguintes iniciadores direto e inverso: Iniciador direto: 5’-GAAGACAGTCCTACTGCTGCGGAG-3’ (SEQ ID NO: 116) Iniciador inverso: 5’-GTAGCTCTCCCCGTATAATGCAGG-3’ (SEQ ID NO: 117)

[00377] A reação de amplificação foi incubada em um EPPENDORF® MASTERCYCLER® programado para 1 ciclo a 95°C por 2 minutos; 30 ciclos cada a 95°C por 20 segundos, 57°C por 30 segundos, e 72°C por 40 segundos; e um ciclo a 72°C por 7 minutos.

[00378] Produtos de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,2% usando tampão TAE e um fragmento de 0,6 kb foi excisado e agarose foi extraída usando um NucleoSpin Extract II® Kit de acordo com o protocolo do fabricante. A incorporação de digoxigenina foi confirmada pelo deslocamento do peso molecular da sonda marcada que se estendeu por aproximadamente 0,6 kb. Hibridização foi realizada em tampão DIG Easy Hyb a 42°C por 15-17 horas. A membrana foi então lavada sob condições de estringência alta em 2X SSC mais SDS 0,1% por 5 minutos na temperatura ambiente seguido por duas lavagens em 0,5X SSC mais SDS 0,1% por 15 minutos cada a 65°C. Os híbridos de sonda-alvo foram detectados por ensaio quimioluminescente (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, USA) seguindo as instruções do fabricante.

[00379] Análise Southern indicou que a cepa hospedava o cassete de em uma cópia única no local intencionado. A cepa contendo a deleção de protease semelhante à pepsina foi designada Trichoderma reesei JfyS153-6.

[00380] A presente invenção é adiante descrita pelos seguintes parágrafos numerados: [1] Um mutante de uma cepa de Trichoderma parental, compreendendo um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo e um ou mais (vários) genes selecionados do grupo consistindo de um primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina, um primeiro gene de protease aspártica, um gene de serina protease semelhante à tripsina, um segundo gene de serina protease semelhante à subtilisina, e um segundo gene de protease aspártica, sendo que os um ou mais (vários) genes são modificados tornando a cepa mutante deficiente na produção de uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo de uma primeira serina protease semelhante à subtilisina, uma primeira protease aspártica, uma serina protease semelhante à tripsina, uma segunda serina protease semelhante à subtilisina, e uma segunda protease aspártica, respectivamente, comparada com a cepa de Trichoderma parental quando cultivada sob condições idênticas. [2] O mutante do parágrafo 1, que compreende uma modificação do primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina. [3] O mutante do parágrafo 1 ou 2, que compreende uma modificação do primeiro gene da protease aspártica. [4] O mutante de qualquer um dos parágrafos 1-3, que compreende uma modificação do gene de serina protease semelhante à tripsina. [5] O mutante de qualquer um dos parágrafos 1-4, que compreende uma modificação do segundo gene da serina protease semelhante à subtilisina. [6] O mutante de qualquer um dos parágrafos 1-5, que compreende uma modificação do segundo gene da protease aspártica. [7] O mutante do parágrafo 1-6, que compreende uma modificação do primeiro gene da serina protease semelhante à subtilisina, o primeiro gene da protease aspártica, o gene de serina protease semelhante à tripsina, o segundo gene da serina protease semelhante à subtilisina, e o segundo gene da protease aspártica. [8] O mutante de qualquer um dos parágrafos 1-7, no qual o polipeptídeo é nativo ou alheio à cepa de Trichoderma . [9] O mutante de qualquer um dos parágrafos 1-8, no qual ã Cepa de Trichoderma é selecionada do grupo consistindo de Trichoderma harzíanum, Trichoderma koningü, Trichoderma longíbrachíatum, Trichoderma reesei, eTrichoderma víríde. [10] O mutante de qualquer um dos parágrafos 1-9, no qual a cepa de Trichoderma é Trichoderma reesei. [11] O mutante de qualquer um dos parágrafos 1-10, que produz pelo menos 25% menos das uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo de a primeira serina protease semelhante à subtilisina, a primeira protease aspártica, a serina protease semelhante à tripsina, a segunda serina protease semelhante à subtilisina, e a segunda protease aspártica comparada com a cepa de Trichoderma parental quando cultivada sob condições idênticas. [12] O mutante de qualquer um dos parágrafos 1-10, que é completamente deficiente em uma ou mais (várias) enzimas selecionada do grupo consistindo de a primeira serina protease semelhante à subtilisina, a primeira protease aspártica, a serina protease semelhante à tripsina, a segunda serina protease semelhante à subtilisina, e a segunda protease aspártica comparada com a cepa de Trichoderma parental quando cultivada sob condições idênticas. [13] O mutante de qualquer um dos parágrafos 1-12, no qual o primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina é selecionado do grupo consistindo de: (a) polipeptídeo compreendendo ou consistindo de uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2 ou o seu polipeptídeo maduro; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de pelo menos estringência baixa, sob condições de pelo menos estringência média, sob condições de pelo menos estringência média-alta, sob condições de pelo menos estringência alta, ou sob condições de pelo menos estringência muito alta com (i) SEQ ID NO: 1; (ii) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (iii) a sequência de cDNA de (i) ou (ii), ou (iv) uma fita complementar de comprimento total de (i), (ii), ou (iii); e (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo de uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1 ou o seu cDNA, ou a sua sequência codificadora de polipeptídeo maduro. [14] O mutante de qualquer um dos parágrafos 1-13, no qual a primeira serina protease semelhante à subtilisina compreende ou consiste de SEQ ID NO: 2 ou o seu polipeptídeo maduro. [15] O mutante de qualquer um dos parágrafos 1-14, no qual o primeiro gene da protease aspártica é selecionado do grupo consistindo de: (a) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 4 ou o seu polipeptídeo maduro; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de pelo menos estringência baixa, sob condições de pelo menos estringência média, sob condições de pelo menos estringência média-alta, sob condições de pelo menos estringência alta, ou sob condições de pelo menos estringência muito alta com (i) SEQ ID NO: 3; (ii) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, (iii) a sequência de cDNA de (i) ou (ii), ou (iv) uma fita complementar de comprimento total de (i), (ii), ou (iii); e (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3 ou o seu cDNA, ou a sua sequência codificadora de polipeptídeo maduro. [16] O mutante de qualquer um dos parágrafos 1-15, no qual a primeira protease aspártica compreende ou consiste de SEQ ID NO: 4 ou o seu polipeptídeo maduro. [17] O mutante de qualquer um dos parágrafos 1-16, no qual o gene de serina protease semelhante à tripsina é selecionado do grupo consistindo de: (a) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 6 ou o seu polipeptídeo maduro; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de pelo menos estringência baixa, sob condições de pelo menos estringência média, sob condições de pelo menos estringência média-alta, sob condições de pelo menos estringência alta, ou sob condições de pelo menos estringência muito alta com (i) SEQ ID NO: 5; (ii) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5, (iii) a sequência de cDNA contida em (i) ou (ii), ou (iv) uma fita complementar de comprimento total de (i), (ii), ou (iii); e (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5 ou o seu cDNA, ou a sua sequência codificadora de polipeptídeo maduro. [18] O mutante de qualquer um dos parágrafos 1-17, no qual a serina protease semelhante à tripsina compreende ou consiste de SEQ ID NO: 6 ou o seu polipeptídeo maduro. [19] O mutante de qualquer um dos parágrafos 1-18, no qual o segundo gene da serina protease semelhante à subtilisina é selecionado do grupo consistindo de: (a) um polipeptídeo compreendendo ou consistindo de uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 100 ou o seu polipeptídeo maduro; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de pelo menos estringência baixa, sob condições de pelo menos estringência média, sob condições de pelo menos estringência média-alta, sob condições de pelo menos estringência alta, ou sob condições de pelo menos estringência muito alta com (i) SEQ ID NO: 99; (ii) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 99, (iii) a sequência de cDNA de (i) ou (ii), ou (iv) uma fita complementar de comprimento total de (i), (ii), ou (iii); e (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo de uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 100 ou o seu cDNA, ou a sua sequência codificadora de polipeptídeo maduro. [20] O mutante de qualquer um dos parágrafos 1-19, no qual a segunda serina protease semelhante à subtilisina compreende ou consiste de SEQ ID NO: 100 ou o seu polipeptídeo maduro. [21] O mutante de qualquer um dos parágrafos 1-20, qual o segundo gene da protease aspártica é selecionado do grupo consistindo de: (a) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 108 ou o seu polipeptídeo maduro; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de pelo menos estringência baixa, sob condições de pelo menos estringência média, sob condições de pelo menos estringência média-alta, sob condições de pelo menos estringência alta, ou sob condições de pelo menos estringência muito alta com (i) SEQ ID NO: 3; (ii) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 107, (iii) a sequência de cDNA de (i) ou (ii), ou (iv) uma fita complementar de comprimento total de (i), (ii), ou (iii); e (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 107 ou o seu cDNA, ou a sua sequência codificadora de polipeptídeo maduro. [22] O mutante de qualquer um dos parágrafos 1-21, no qual a segunda protease aspártica compreende ou consiste de SEQ ID NO: 108 ou o seu polipeptídeo maduro. [23] Um método de produzir um polipeptídeo, compreendendo: cultivar um mutante de uma cepa de Trichoderma parental em um meio para a produção do polipeptídeo, sendo que a cepa mutante compreende um polinucleotídeo codificador do polipeptídeo e um ou mais (vários) genes selecionados do grupo consistindo de um primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina, um primeiro gene de protease aspártica, um gene de serina protease semelhante à tripsina, um segundo gene de serina protease semelhante à subtilisina, e um segundo gene de protease aspártica, sendo que os um ou mais (vários) genes são modificados tornando a cepa mutante deficiente na produção de uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo de uma primeira serina protease semelhante à subtilisina, uma primeira protease aspártica, uma serina protease semelhante à tripsina, uma segunda serina protease semelhante à subtilisina, e uma segunda protease aspártica, respectivamente, comparada com a cepa de Trichoderma parental quando cultivada sob condições idênticas; e recuperar o polipeptídeo do meio de cultivo. [24] O método de parágrafo 23, no qual o mutante compreende uma modificação do primeiro gene da serina protease semelhante à subtilisina. [25] O método de parágrafo 23 ou 24, no qual o mutante compreende uma modificação do primeiro gene da protease aspártica. [26] O método de qualquer um dos parágrafos 23-25, no qual o mutante compreende uma modificação do gene de serina protease semelhante à tripsina. [27] O método de qualquer um dos parágrafos 23-26, no qual o mutante compreende uma modificação do segundo gene da serina protease semelhante à subtilisina. [28] O método de qualquer um dos parágrafos 23-27, no qual o mutante compreende uma modificação do segundo gene da protease aspártica. [29] O método de qualquer um dos parágrafos 23-28, no qual o mutante compreende uma modificação do primeiro gene da serina protease semelhante à subtilisina, o primeiro gene da protease aspártica, o gene de serina protease semelhante à tripsina, o segundo gene da serina protease semelhante à subtilisina, e o segundo gene da protease aspártica. [30] O método de qualquer um dos parágrafos 23-29, no qual o polipeptídeo é nativo ou alheio à cepa de Trichoderma . [31] O método de qualquer um dos parágrafos 23-30, no qual ã CCpa de Trichoderma é selecionada do grupo consistindo de Trichoderma harzianum, Trichoderma koningü, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, eTrichoderma viride. [32] O método de qualquer um dos parágrafos 23-31, no qual de que a cepa de Trichoderma é Trichoderma reesei. [33] O método de qualquer um dos parágrafos 23-32, no qual de que a cepa mutante produz pelo menos 25% menos das uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo de a primeira serina protease semelhante à subtilisina, a primeira protease aspártica, a serina protease semelhante à tripsina, a segunda serina protease semelhante à subtilisina, e a segunda protease aspártica comparada com a cepa de Trichoderma parental quando cultivada sob condições idênticas. [34] O método de qualquer um dos parágrafos 23-32, no qual a cepa mutante é completamente deficiente em uma ou mais (várias) enzimas selecionada do grupo consistindo de a primeira serina protease semelhante à subtilisina, a primeira protease aspártica, a serina protease semelhante à tripsina, a segunda serina protease semelhante à subtilisina, e a segunda protease aspártica comparada com a cepa de Trichoderma parental quando cultivada sob condições idênticas. [35] O método de qualquer um dos parágrafos 23-34, no qual o primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina é selecionado do grupo consistindo de: (a) um polipeptídeo compreendendo ou consistindo de uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2 ou o seu polipeptídeo maduro; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de pelo menos estringência baixa, sob condições de pelo menos estringência média, sob condições de pelo menos estringência média-alta, condições de estringência alta, ou condições de estringência muito alta com (i) SEQ ID NO: 1; (ii) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (iii) a sequência de cDNA de (i) ou (ii), ou (iv) uma fita complementar de comprimento total de (i), (ii), ou (iii); e (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo de uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1 ou o seu cDNA, ou a sua sequência codificadora de polipeptídeo maduro. [36] O método de qualquer um dos parágrafos 23-35, no qual a primeira serina protease semelhante à subtilisina compreende ou consiste de SEQ ID NO: 2 ou o seu polipeptídeo maduro. [37] O método de qualquer um dos parágrafos 23-36, no qual o primeiro gene da protease aspártica é selecionado do grupo consistindo de: (a) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 4 ou o seu polipeptídeo maduro; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de pelo menos estringência baixa, sob condições de pelo menos estringência média, sob condições de pelo menos estringência média-alta, sob condições de pelo menos estringência alta, ou sob condições de pelo menos estringência muito alta com (i) SEQ ID NO: 3; (ii) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, (iii) a sequência de cDNA de (i) ou (ii), ou (iv) uma fita complementar de comprimento total de (i), (ii), ou (iii); e (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3 ou o seu cDNA, ou a sua sequência codificadora de polipeptídeo maduro. [38] O método de qualquer um dos parágrafos 23-37, no qual a primeira protease aspártica compreende ou consiste de SEQ ID NO: 4 ou o seu polipeptídeo maduro. [39] O método de qualquer um dos parágrafos 23-38, no qual o gene de serina protease semelhante à tripsina é selecionado do grupo consistindo de: (a) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 6 ou o seu polipeptídeo maduro; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de pelo menos estringência baixa, sob condições de pelo menos estringência média, sob condições de pelo menos estringência média-alta, sob condições de pelo menos estringência alta, ou sob condições de pelo menos estringência muito alta com (i) SEQ ID NO: 5; (ii) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5, (iii) a sequência de cDNA contida em (i) ou (ii), ou (iv) uma fita complementar de comprimento total de (i), (ii), ou (iii); e (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5 ou o seu cDNA, ou a sua sequência codificadora de polipeptídeo maduro. [40] O método de qualquer um dos parágrafos 23-39, no qual a serina protease semelhante à tripsina compreende ou consiste de SEQ ID NO: 6 ou o seu polipeptídeo maduro. [41] O método de qualquer um dos parágrafos 23-40, no qual o segundo gene da serina protease semelhante à subtilisina é selecionado do grupo consistindo de: (a) um polipeptídeo compreendendo ou consistindo de uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 100 ou o seu polipeptídeo maduro; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de pelo menos estringência baixa, sob condições de pelo menos estringência média, sob condições de pelo menos estringência média-alta, sob condições de pelo menos estringência alta, ou sob condições de pelo menos estringência muito alta com (i) SEQ ID NO: 99; (ii) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 99, (iii) a sequência de cDNA de (i) ou (ii), ou (iv) uma fita complementar de comprimento total de (i), (ii), ou (iii); e (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo de uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 100 ou o seu cDNA, ou a sua sequência codificadora de polipeptídeo maduro. [42] O método de qualquer um dos parágrafos 23-41, no qual a segunda serina protease semelhante à subtilisina compreende ou consiste de SEQ ID NO: 100 ou o seu polipeptídeo maduro. [43] O método de qualquer um dos parágrafos 23-42, no qual o segundo gene da protease aspártica é selecionado do grupo consistindo de: (a) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 108 ou o seu polipeptídeo maduro; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de pelo menos estringência baixa, sob condições de pelo menos estringência média, sob condições de pelo menos estringência média-alta, sob condições de pelo menos estringência alta, ou sob condições de pelo menos estringência muito alta com (i) SEQ ID NO: 107; (ii) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 107, (iii) a sequência de cDNA de (i) ou (ii), ou (iv) uma fita complementar de comprimento total de (i), (ii), ou (iii); e (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 107 ou o seu cDNA, ou a sua sequência codificadora de polipeptídeo maduro. [44] O método de qualquer um dos parágrafos 23-43, no qual a segunda protease aspártica compreende ou consiste de SEQ ID NO: 108 ou o seu polipeptídeo maduro. [45] A method for obtaining um mutante de uma cepa de Trichoderma parental, compreendendo: modificar um ou mais (vários) genes selecionados do grupo consistindo de um primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina, um primeiro gene de protease aspártica, um gene de serina protease semelhante à tripsina, um segundo gene de serina protease semelhante à subtilisina, e um segundo gene de protease aspártica; e identificar uma cepa mutante da etapa(a) sendo que os um ou mais (vários) genes selecionados do grupo consistindo de a primeirum gene de serina protease semelhante à subtilisina, o primeiro gene da protease aspártica, e o gene de serina protease semelhante à tripsina são modificados tornando a cepa mutante deficiente na produção de uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo de uma primeira serina protease semelhante à subtilisina, uma primeira protease aspártica, uma serina protease semelhante à tripsina, uma segunda serina protease semelhante à subtilisina, e uma segunda protease aspártica, respectivamente, comparada com a cepa de Trichoderma parental quando cultivada sob condições idênticas. [46] O método de parágrafo 45, no qual o mutante compreende uma modificação do primeiro gene da serina protease semelhante à subtilisina. [47] O método de parágrafo 45 ou 46, no qual o mutante compreende uma modificação do primeiro gene da protease aspártica. [48] O método de qualquer um dos parágrafos 45-47, no qual o mutante compreende uma modificação do gene de serina protease semelhante à tripsina. [49] O método de qualquer um dos parágrafos 45-48, no qual o mutante compreende uma modificação do segundo gene da serina protease semelhante à subtilisina. [50] O método de qualquer um dos parágrafos 45-49, no qual o mutante compreende uma modificação do segundo gene da protease aspártica. [51] O método de qualquer um dos parágrafos 45-50, no qual o mutante compreende uma modificação do primeiro gene da serina protease semelhante à subtilisina, o primeiro gene da protease aspártica, o gene de serina protease semelhante à tripsina, o segundo gene da serina protease semelhante à subtilisina, e o segundo gene da protease aspártica. [52] O método de qualquer um dos parágrafos 45-51, no qual o polipeptídeo é nativo ou alheio à cepa de Trichoderma . [53] O método de qualquer um dos parágrafos 45-52, no qual a cepa de Trichoderma é selecionada do grupo consistindo de Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ^Trichoderma viride. [54] O método de qualquer um dos parágrafos 45-53, no qual a cepa de Trichoderma c Trichoderma reesei. [55] O método de qualquer um dos parágrafos 45-54, no qual a cepa mutante produz pelo menos 25% menos das uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo de a primeira serina protease semelhante à subtilisina, a primeira protease aspártica, a serina protease semelhante à tripsina, a segunda serina protease semelhante à subtilisina, e a segunda protease aspártica comparada com a cepa de Trichoderma parental quando cultivada sob condições idênticas. [56] O método de qualquer um dos parágrafos 45-54, no qual a cepa mutante é completamente deficiente em uma ou mais (várias) enzimas selecionada do grupoconsistindo de a primeira serina protease semelhante à subtilisina, a primeira protease aspártica, a serina protease semelhante à tripsina, a segunda serina protease semelhante à subtilisina, e a segunda protease aspártica comparada com a cepa de Trichoderma parental quando cultivada sob condições idênticas. [57] O método de qualquer um dos parágrafos 45-56, no qual o primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina é selecionado do grupo consistindo de: (a) um polipeptídeo compreendendo ou consistindo de uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2 ou o seu polipeptídeo maduro; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de pelo menos estringência baixa, sob condições de pelo menos estringência média, sob condições de pelo menos estringência média-alta, sob condições de pelo menos estringência alta, ou sob condições de pelo menos estringência muito alta com (i) SEQ ID NO: 1; (ii) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (iii) a sequência de cDNA de (i) ou (ii), ou (iv) uma fita complementar de comprimento total de (i), (ii), ou (iii); e (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo de uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1 ou o seu cDNA, ou a sua sequência codificadora de polipeptídeo maduro. [58] O método de qualquer um dos parágrafos 45-57, no qual a primeira serina protease semelhante à subtilisina compreende ou consiste de SEQ ID NO: 2 ou o seu polipeptídeo maduro. [59] O método de qualquer um dos parágrafos 45-58, no qual o primeiro gene da protease aspártica é selecionado do grupo consistindo de: (a) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 4 ou o seu polipeptídeo maduro; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de pelo menos estringência baixa, sob condições de pelo menos estringência média, sob condições de pelo menos estringência média-alta, sob condições de pelo menos estringência alta, ou sob condições de pelo menos estringência muito alta com (i) SEQ ID NO: 3; (ii) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, (iii) a sequência de cDNA de (i) ou (ii), ou (iv) uma fita complementar de comprimento total de (i), (ii), ou (iii); e (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3 ou o seu cDNA, ou a sua sequência codificadora de polipeptídeo maduro. [60] O método de qualquer um dos parágrafos 45-59, no qual a primeira protease aspártica compreende ou consiste de SEQ ID NO: 4 ou o seu polipeptídeo maduro. [61] O método de qualquer um dos parágrafos 45-60, no qual o gene de serina protease semelhante à tripsina é selecionado do grupo consistindo de: (a) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 6 ou o seu polipeptídeo maduro; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de pelo menos estringência baixa, sob condições de pelo menos estringência média, sob condições de pelo menos estringência média-alta, condições de estringência alta, ou condições de estringência muito alta com (i) SEQ ID NO: 5; (ii) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5, (iii) a sequência de cDNA contida em (i) ou (ii), ou (iv) uma fita complementar de comprimento total de (i), (ii), ou (iii); e (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5 ou o seu cDNA, ou a sua sequência codificadora de polipeptídeo maduro. [62] O método de qualquer um dos parágrafos 45-61, no qual a serina protease semelhante à tripsina compreende ou consiste de SEQ ID NO: 6 ou o seu polipeptídeo maduro. [63] O método de qualquer um dos parágrafos 45-62, no qual o segundo gene da serina protease semelhante à subtilisina é selecionado do grupo consistindo de: (a) um polipeptídeo compreendendo ou consistindo de uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 100 ou o seu polipeptídeo maduro; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de pelo menos estringência baixa, sob condições de pelo menos estringência média, sob condições de pelo menos estringência média-alta, sob condições de pelo menos estringência alta, ou sob condições de pelo menos estringência muito alta com (i) SEQ ID NO: 99; (ii) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 99, (iii) a sequência de cDNA de (i) ou (ii), ou (iv) uma fita complementar de comprimento total de (i), (ii), ou (iii); e (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo de uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 100 ou o seu cDNA, ou a sua sequência codificadora de polipeptídeo maduro. [64] O método de qualquer um dos parágrafos 45-63, no qual a segunda serina protease semelhante à subtilisina compreende ou consiste de SEQ ID NO: 100 ou o seu polipeptídeo maduro. [65] O método de qualquer um dos parágrafos 45-64, no qual o segundo gene da protease aspártica é selecionado do grupo consistindo de: (a) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 108 ou o seu polipeptídeo maduro; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de pelo menos estringência baixa, sob condições de pelo menos estringência média, sob condições de pelo menos estringência média-alta, sob condições de pelo menos estringência alta, ou sob condições de pelo menos estringência muito alta com (i) SEQ ID NO: 3; (ii) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 107, (iii) a sequência de cDNA de (i) ou (ii), ou (iv) uma fita complementar de comprimento total de (i), (ii), ou (iii); e (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 107 ou o seu cDNA, ou a sua sequência codificadora de polipeptídeo maduro. [66] O método de qualquer um dos parágrafos 45-65, no qual a segunda protease aspártica compreende ou consiste de SEQ ID NO: 108 ou o seu polipeptídeo maduro.

[00381] A invenção aqui descrita e reivindicada não é para ser limitada em escopo pelos aspectos específicos aqui revelados, porque estes aspectos são intencionados como ilustrações de vários aspectos da invenção. Quaisquer aspectos equivalentes são intencionados para estarem dentro do escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção em adição àquelas aqui mostradas e descritas se tornarão evidentes para aquelas pessoas experientes na arte a partir da descrição precedente. Tais modificações também são intencionadas para cairem dentro do escopo das reivindicações anexadas. No caso de conflito, a presente revelação incluindo as definições predominará. Várias referências são aqui citadas, cujas revelações são incorporadas em suas totalidades como referências.

Claims (8)

1. Mutante de uma cepa parental de Trichoderma reesei , caracterizado pelo fato de compreender um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo de interesse e um primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina compreendendo SEQ ID NO: 1, em que o primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina é modificado tornando a cepa mutante completamente deficiente na produção de uma primeira serina protease semelhante à subtilisina, comparada com a cepa parental de Trichoderma reesei quando cultivada sob condições idênticas, em que a modificação é selecionada do grupo que consiste de inserções, disrupção gênica, substituição gênica, deleção gênica, conversão gênica, técnicas antisenso, interferência de RNA e mutações aleatórias ou específicas.

2. Mutante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de interesse é heterólogo ao mutante da cepa parental de Trichoderma reesei.

3. Mutante, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é completamente deficiente na primeira serina protease semelhante à subtilisina comparada com a cepa parental de Trichoderma reesei quando cultivada sob condições idênticas.

4. Mutante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina de SEQ ID NO: 1 codifica a primeira serina protease semelhante à subtilisina de SEQ ID NO: 2.

5. Método para produzir um polipeptídeo de interesse, caracterizado pelo fato de compreender: (a) cultivar o mutante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 em um meio para a produção do polipeptídeo de interesse; e (b) recuperar o polipeptídeo de interesse do meio de cultivo.

6. Método para obter um mutante de uma cepa parental de Trichoderma como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de compreender: (a) modificar um primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina compreendendo a SEQ ID NO: 1, em que a modificação é selecionada do grupo que consiste de inserções, disrupção gênica, substituição gênica, deleção gênica, conversão gênica, técnicas antisenso, interferência de RNA e mutações aleatórias ou específicas; e (b) identificar uma cepa mutante da etapa(a) sendo que o primeiro gene da serina protease semelhante à subtilisina é modificado tornando a cepa mutante completamente deficiente na produção de uma primeira serina protease semelhante à subtilisina comparada com a cepa parental de Trichoderma reesei quando cultivada sob condições idênticas.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a cepa mutante é completamente deficiente na primeira serina protease semelhante à subtilisina, comparada com a cepa parental de Trichoderma reesei quando cultivada sob condições idênticas.

8. Método, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o primeiro gene de serina protease semelhante à subtilisina de SEQ ID NO: 1 codifica a primeira serina protease semelhante à subtilisina de SEQ ID NO: 2.

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