BR102021005680A2 - Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, composições farmacêuticas, método e kit para detectar a-toxina de staphylococcus aureus - Google Patents
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Abstract
anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, composições farmacêuticas, método e kit para detectar a-toxina de staphylococcus aureus. a presente divulgação refere-se a um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente à a-toxina de staphylococcus aureus. a presente divulgação também diz respeito a uma composição farmacêutica, a um método para tratar e/ou prevenir doenças e/ou distúrbios causados por infecção de staphylococcus aureus em um sujeito com tal necessidade e a um método para detectar a a-toxina de staphylococcus aureus em uma amostra.
Description
[001] A presente divulgação refere-se a um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que é específico para a toxina α de Staphylococcus aureus, e usos do mesmo.
[002] O Staphylococcus aureus é um patógeno oportunista frequentemente carregado de forma assintomática no corpo humano. As cepas patogênicas frequentemente promovem infecções ao produzir potentes proteínas toxinas e outros fatores virulentos que escapam ao sistema imunológico humano. O S. aureus pode causar uma série de doenças, desde pequenas infecções de pele até doenças fatais, como pneumonia, meningite, osteomielite, endocardite, síndrome do choque tóxico, bacteremia e sepse. O S. aureus ainda é uma das cinco causas mais comuns de infecções nosocomiais e costuma ser a causa de infecções de feridas pós-cirúrgicas.
[003] O surgimento de formas resistentes a antibióticos de S. aureus, como Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA), é um problema mundial na medicina clínica. Os conceitos atuais sobre os mecanismos de virulência do MRSA incluem um notável conjunto de fatores de virulência secretados e de superfície celular. Os fatores de virulência da superfície celular incluem componentes da superfície microbiana que reconhecem moléculas da matriz extracelular adesiva (MSCRAMMs), proteínas reguladas por ferro, polissacarídeos de adesão intercelular e polissacarídeos capsulares. Os fatores de virulência secretados são normalmente produzidos durante a fase pós-exponencial e estacionária e incluem exoenzimas, exotoxinas e toxinas α, β, γ e δ, leucocidina de Panton-Valentina (PVL), superantígenos e toxina-1 da síndrome do choque tóxico (TSST-1) e toxinas esfoliativas A e B. O documento US 20210079071 proporciona anticorpos monoclonais inibidores de coagulases tipo estafilocoagulase e vWbp para o tratamento de Staphylococcus aureus.
[004] A toxina alfa (AT) é uma toxina citolítica formadora de poros que é conservada entre isolados clínicos de S. aureus e tem demonstrado desempenhar um papel na pneumonia, dermonecrose, endocardite e sepse. A AT é secretada como uma proteína monomérica solúvel de 33 kDa que pode se montar em uma estrutura em anel na superfície das células eucarióticas. A toxina montada se insere na membrana celular, formando um poro que contribui para a lesão e morte celular ao interromper a integridade da membrana. O uso de toxinas como alvo para a imunoprofilaxia tem sido bem sucedido por décadas como parte de vacinas ou imunoterapia passiva contra doenças bacterianas, como a difteria, tétano e botulismo. Ao contrário da imunização ativa, que por vezes requer reforços repetidos e longos períodos de tempo para que as respostas imunológicas máximas sejam geradas, a imunização passiva forneceria tratamento imediato para pacientes não vacinados para ajudar a reduzir a gravidade da doença aguda causada por S. aureus.
[005] Assim, há necessidade de desenvolver uma nova abordagem para tratar ou prevenir a infecção por S. aureus.
[006] A presente divulgação provê um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente a um epítopo da toxina α de Staphylococcus aureus ou fragmento do mesmo. O anticorpo de acordo com a divulgação neutraliza a toxina α de Staphylococcus aureus e é, portanto, útil para o tratamento e/ou prevenção de doenças e/ou distúrbios causados por infecção de Staphylococcus aureus. O anticorpo da divulgação também é útil para a detecção de toxina α de Staphylococcus aureus.
[007] A presente divulgação fornece uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno mencionado acima e veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[008] A presente divulgação fornece um método para tratar e/ou prevenir doenças e/ou distúrbios causados por infecção por Staphylococcus aureus em um sujeito com tal necessidade, compreendendo a administração de uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como mencionado acima ao sujeito.
[009] A presente divulgação fornece um método para detectar toxina α de Staphylococcus aureus em uma amostra compreendendo o contato da amostra com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conforme mencionado acima.
[010] A presente divulgação também fornece um kit para detectar toxina α de Staphylococcus aureus em uma amostra, compreendendo um anticorpo descrito na presente invenção ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo
[011] A presente divulgação é descrita em detalhes nas seções a seguir. Outras características, objetivos e vantagens da presente divulgação podem ser encontrados na descrição detalhada e nas reivindicações.
[012] Figura 1: Anticorpos monoclonais anti-toxina α aumentaram a viabilidade celular das células A549 na presença de toxina α. Os anticorpos purificados na concentração de 4 e 40 µg/mL foram adicionados no ensaio citolítico na presença de 8 µg/mL de toxina α para obter a razão toxina α / anticorpo de 1:0,1 (4 µg/mL) ou 1:1 (40 µg/mL). A viabilidade celular foi analisada usando um kit de ensaio MTT colorimétrico. “＊” O anticorpo exibe a capacidade de prevenir a lise celular induzida pela toxina α.
[013] Figura 2: O anticorpo monoclonal de camundongo 25A1 liga-se à toxina α. Os perfis de ligação ao antígeno de 25A1 capturado em uma célula de fluxo ativa em um instrumento Biacore T100. As diferentes linhas representam a resposta de ligação de 25A1 à toxina α em várias concentrações de 1,56 ~ 50 nM.
[014] Figura 3 (A) Sequência de aminoácidos de vários domínios VH e VL de anti-toxina α. As sequências da linhagem germinativa humana IGHV1-2 e IGVK3-11 foram usadas para enxerto. A diferença de aminoácidos entre o anticorpo murino e a sequência da linhagem germinativa humana é mostrada em negrito e sublinhada; Os resíduos da CDR são apresentados em caixas; as mutações reversas são mostradas em realce cinza. Figura 3 (B) sensorgramas SPR da cinética de ligação de anticorpos que se ligam a toxina α recombinante. As cinéticas de ligação foram mensuradas pelo método cinético de ciclo único por BIAcore T200. Figura 3 (C) Sequência de aminoácidos de 25A1-B5B6AQT. A sequência de aminoácidos do peptídeo sinal está representada em negrito e sublinhada; regiões variáveis são marcadas em cinza.
[015] Figura 4: 25A1, 25A1-B2B4AQT e 25A1-B5B6AQT inibem a toxina α recombinante ou a lise induzida por toxina α nativa de células RBC de coelho. Diluições seriadas de anticorpos (100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,56 e 0,78 mg/mL) foram incubadas com toxina α recombinante (400 ng/mL) ou sobrenadante de bactéria bruto (diluição de 1: 8 ~ 1: 16) junto com RBC de coelho. A hemólise é medida pela quantidade de hemoglobina liberada no sobrenadante. O percentual de inibição de hemólise foi calculado como ((OD450 de TritonX-100 a 2% – OD450 do anticorpo teste)/OD450 de TritonX-100 a 2%) x 100%.
[016] Figura 5: Curva de sobrevida de Kaplan-Meir para camundongos infectados com S. aureus BAA-1717 tratados com SYN100. Os camundongos foram inoculados por via intravenosa com USA300 MRSA, BAA-1717 com um tamanho de inóculo de 8 x 107 CFU/camundongo no Dia 0. 25A1 foi administrado intraperitonealmente (IP) a 50, 25, 10 e 5 mg/kg vinte e quatro (24) horas antes da infecção. O anticorpo de controle a 25 e 10 mg/kg também foi administrado intraperitonealmente 24 horas antes da infecção. A mortalidade dos animais foi monitorada por 10 dias. A sobrevida de 50 por cento ou mais (50%) dos animais em relação ao grupo controle que foi tratado apenas com veículo indicou atividade anti-infecciosa significativa.
[017] Figura 6: Curva de sobrevida de Kaplan-Meir para camundongos infectados com S. aureus ATCC29213 tratados com SYN100. Os camundongos CD-1 foram inoculados intraperitonealmente com ATCC29213 em um tamanho de inóculo de 2,0 x107 UFC/camundongo no Dia 0. SYN100 foi administrado intraperitonealmente (IP) a 100, 50 e 10 mg/kg para os três grupos de camundongos vinte e quatro (24) horas antes da infecção. A sobrevida dos animais infectados foi monitorada durante 4 dias.
[018] Figura 7: Curva de sobrevida de Kaplan-Meir para camundongos infectados com S. aureus BAA-1556, NRS261 e SF8300 tratados com SYN100. A profilaxia SYN100 aumenta a taxa de sobrevida em um modelo de pneumonia murina. Camundongos C57BL/6J foram inoculados por via intranasal com BAA-1556 com um tamanho de inóculo de 1,62 x 107 UFC/camundongo; NRS261 com um tamanho de inóculo de 3,3 x107 UFC/camundongo ou SF8300 com um tamanho de inóculo de 2,82 x 107 UFC no Dia 0. SYN100 foi administrado intraperitonealmente (IP) a 10, 5 e 1 mg/kg para BAA-1556 infectado camundongos ou 100, 50 e 10 mg/kg vinte e quatro (24) horas antes da infecção. A sobrevida dos animais infectados foi monitorada durante 7 dias.
[019] Figura 8: Curva de sobrevida de Kaplan-Meir para camundongos infectados com S. aureus NRS261 tratados com SYN100 e/ou vancomicina. Camundongos C57BL/6J foram inoculados com NRS261 por via intranasal com um tamanho de inóculo de 5,0 x107 UFC/camundongo no Dia 0. SYN100 foi administrado intraperitonealmente (IP) a 10 mg/kg para os quatro grupos de camundongos vinte e quatro (24) horas antes da infecção. A vancomicina foi administrada a 30, 15 e 7,5 mg/kg duas horas após a infecção. Três grupos de camundongos receberam vancomicina e SYN100. A sobrevida dos animais infectados foi monitorada durante 5 dias.
[020] Figura 9: Curva de sobrevida de Kaplan-Meir para coelhos infectados com S. aureus ST20120426 tratados com SYN100. Coelhos Nova Zelândia foram inoculados por via intranasal com ST20120426 com tamanhos de inóculo entre 3,2 – 5,2 x107 UFC/coelho no Dia 0. SYN100 foi administrado por via intravenosa a 125, 100, 75, 50 e 25 mg/kg vinte e quatro (24) horas antes infecção. A sobrevida dos animais infectados foi monitorada durante 7 dias.
[021] Figura 10: (A) Curva de sobrevida de Kaplan-Meir para coelhos infectados com S. aureus ST20120426 tratados com SYN100 e/ou linezolida. Coelhos Nova Zelândia foram inoculados por via intranasal com ST20120426 com tamanhos de inóculo entre 2,9 – 4,1 x107 UFC/coelho no Dia 0. SYN100 foi administrado por via intravenosa a 30 mg/kg vinte e quatro (24) horas antes da infecção. A linezolida foi administrada 4 horas após a infecção a 50 mg/kg/8h. A sobrevida dos animais infectados foi monitorada durante 48 horas. Figura 10 (B) A inflamação pulmonar foi avaliada em termos de pontuações macroscópicas (escore macroscópico) para todos os grupos de tratamento, com uma pontuação mais elevada indicando danos mais graves devido à infecção bacteriana. Os círculos abertos representam animais mortos 30 horas após a infecção. Os círculos preenchidos representam animais vivos 30 horas após a infecção. A Figura 10(C) Razões de peso do pulmão (LW) sobre o peso corporal (BW). Figura 10 (D) Contagens bacterianas no tecido pulmonar. valor de p < 0,0083 indica significância.
[022] A presente divulgação provê um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente a um epítopo da toxina α de Staphylococcus aureus ou um fragmento do mesmo.
[023] Na descrição a seguir, uma série de termos são usados e as seguintes definições são fornecidas para facilitar a compreensão do objeto reivindicado. Os termos que não são expressamente definidos neste documento são usados de acordo com seus significados simples e comuns.
[024] A menos que especificado de outra forma, “um/uma” significa “um/uma ou mais”.
[025] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “epítopo” refere-se ao local no antígeno ao qual um anticorpo se liga.
[026] O termo “anticorpo”, tal como utilizado na presente invenção, significa qualquer molécula de ligação ao antígeno ou complexo molecular compreendendo pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) que se liga ou interage especificamente com um antígeno particular (por exemplo, toxina α). O termo “anticorpo” inclui moléculas de imunoglobulina compreendendo quatro cadeias polipeptídicas, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações de dissulfeto, bem como multímeros das mesmas (por exemplo, IgM). Cada cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada (aqui abreviada como HCVR ou VH) e uma região constante da cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada compreende três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve (aqui abreviada como LCVR ou VL) e uma região constante da cadeia leve. A região constante da cadeia leve compreende um domínio (CL1). As regiões VH e VL podem ainda ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDRs), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de arcabouço ou regiões estruturais (FR - do inglês framework). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas a partir da extremidade amino-terminal para a extremidade carboxi-terminal na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 Em diferentes exemplos de realização da divulgação, as FRs do anticorpo anti-toxina α (ou porção de ligação ao antígeno do mesmo) podem ser idênticas às sequências da linhagem germinativa humana ou podem ser modificadas natural ou artificialmente. Uma sequência de aminoácidos de consenso pode ser definida com base em uma análise lado a lado de duas ou mais CDRs.
[027] O termo “anticorpo monoclonal”, conforme utilizado na presente invenção, não se limita à presença de anticorpos produzidos através da tecnologia de hibridoma. Um anticorpo monoclonal é derivado de um único clone, incluindo qualquer clone eucariótico, procariótico ou fágico, por qualquer meio disponível ou conhecido no estado da técnica.
[028] O termo anticorpo “quimérico”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se a um anticorpo que possui sequências variáveis derivadas de uma imunoglobulina não humana e regiões constantes de imunoglobulina humana, tipicamente escolhidas a partir de um molde de imunoglobulina humana.
[029] Formas “humanizadas” de anticorpos não humanos são imunoglobulinas quiméricas que contêm uma sequência mínima derivada de uma imunoglobulina não humana. Em geral, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos dentre pelo menos um, e tipicamente dois domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as regiões CDRs correspondem a de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são de uma sequência de imunoglobulina humana.
[030] Conforme usado no presente documento, o termo “região determinante de complementaridade” (CDR) refere-se aos sítios de combinação ao antígeno não contíguo encontrados na região variável de ambos os polipeptídeos de cadeia pesada e leve. As CDRs foram descritas por Kabat et al., J. Biol. Chem. 252: 6609-6616 (1977); Kabat et al., US Dept. of Health and Human Services, “Sequences of protein of immunological interest” (1991); por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987); e MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996), onde as definições incluem sobreposição ou subconjuntos de resíduos de aminoácidos quando comparadas entre si.
[031] Os termos “porção de ligação ao antígeno” de um anticorpo, “fragmento de ligação ao antígeno” de um anticorpo e semelhantes, utilizados na presente invenção, incluem qualquer polipeptídeo ou glicoproteína de ocorrência natural, obtido de forma enzimática, sintética ou geneticamente modificado que se liga especificamente a um antígeno para formar um complexo.
[032] Conforme utilizado na presente invenção, os termos “tratamento”, “tratar” e semelhantes, abrangem qualquer tratamento de uma doença em um mamífero, particularmente em um humano, e inclui: (a) prevenir a ocorrência da doença em um sujeito que pode estar predisposto à doença, mas ainda não foi diagnosticado como portador; (b) inibir a doença, ou seja, interromper seu desenvolvimento; e (c) aliviar a doença, ou seja, causar a regressão da doença.
[033] Conforme utilizado na presente invenção de forma indistinta, os termos “indivíduo”, “sujeito”, “hospedeiro” e “paciente” referem-se a um mamífero, incluindo, mas não se limitando a, murinos (ratos, camundongos), primatas não humanos, humanos, caninos, felinos, ungulados (por exemplo, equinos, bovinos, ovinos, suínos, caprinos), etc.
[034] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “quantidade terapeuticamente eficaz” ou “quantidade eficaz” refere-se à quantidade de um anticorpo que, quando administrada a um mamífero ou outro sujeito para o tratamento de uma doença, é suficiente para efetuar esse tratamento para a doença.
[035] Conforme usado no presente documento, o termo “amostra” abrange uma variedade de tipos de amostras obtidas de um indivíduo, sujeito ou paciente e pode ser usado em um ensaio de diagnóstico ou monitoramento. A definição abrange sangue e outras amostras líquidas de origem biológica, amostras de tecidos sólidos, tal como biópsia ou culturas de tecidos ou células derivadas destes, e a progênie destas.
[036] A presente divulgação desenvolve um anticorpo monoclonal que neutraliza especificamente a toxina α, proporcionando imunoterapia passiva no contexto de infecções por S. aureus. A imunização passiva forneceria tratamento imediato para pacientes não vacinados para auxiliar a reduzir a gravidade da doença aguda por S. aureus. Funcionalmente, os anticorpos da presente divulgação exibem atividades inibidoras significativas para a citotoxicidade induzida por AT e mostraram potente eficácia in vivo na prevenção, tratamento profilático e/ou tratamento de infecções de S. aureus e/ou pneumonia.
[037] Particularmente, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de uma região variável de cadeia pesada e regiões determinantes de complementaridade de uma região variável de cadeia leve, em que as regiões determinantes de complementaridade da região variável de cadeia pesada compreendem regiões CDRH1, CDRH2 e CDRH3 e as regiões determinantes de complementaridade da região variável de cadeia leve compreendem as regiões CDRL1, CDRL2 e CDRL3, e em que:
a região CDRH1 compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo constituído pelas SEQ ID NOs: 1 a 2 ou uma sequência substancialmente semelhante; a região CDRH2 compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo constituído pelas SEQ ID NOs: 3 a 6 e 31 ou uma sequência substancialmente semelhante; a região CDRH3 compreende a sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo constituído pelas SEQ ID NOs: 7 a 9 ou uma sequência substancialmente semelhante; e
a região CDRL1 compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo constituído pelas SEQ ID NOs: 10 a 13 ou uma sequência substancialmente semelhante; a região CDRL2 compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo constituído pelas SEQ ID NOs: 14 a 15 ou uma sequência substancialmente semelhante; a região CDRL3 compreende a sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo constituído pelas SEQ ID NOs: 16 a 18 ou uma sequência substancialmente semelhante
a região CDRH1 compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo constituído pelas SEQ ID NOs: 1 a 2 ou uma sequência substancialmente semelhante; a região CDRH2 compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo constituído pelas SEQ ID NOs: 3 a 6 e 31 ou uma sequência substancialmente semelhante; a região CDRH3 compreende a sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo constituído pelas SEQ ID NOs: 7 a 9 ou uma sequência substancialmente semelhante; e
a região CDRL1 compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo constituído pelas SEQ ID NOs: 10 a 13 ou uma sequência substancialmente semelhante; a região CDRL2 compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo constituído pelas SEQ ID NOs: 14 a 15 ou uma sequência substancialmente semelhante; a região CDRL3 compreende a sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo constituído pelas SEQ ID NOs: 16 a 18 ou uma sequência substancialmente semelhante
[038] A listagem de sequências é mostrada na Tabela 1. 
[039] O anticorpo de acordo com a divulgação pode ser de comprimento total (completo) (por exemplo, um anticorpo IgG1 ou IgG4) ou pode compreender apenas uma porção de ligação ao antígeno (por exemplo, um fragmento Fab, F(ab')2 ou scFv) e pode ser modificado para afetar a funcionalidade conforme necessário
[040] O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a divulgação, liga-se especificamente à toxina α de Staphylococcus aureus. Assim como uma toxina citolítica formadora de poros, a toxina α é conservada entre os isolados clínicos de S. aureus. A toxina alfa (AT) é uma proteína monomérica solúvel de 33 kDa que pode montar em uma estrutura em anel na superfície de células eucarióticas e então as inserções de toxina montadas na membrana da célula, formando um poro que contribui para as lesões celulares e morte por perturbar a integridade da membrana.
[041] A presente divulgação inclui um anticorpo anti-toxina α e fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga às moléculas de toxina α monoméricas ou em estrutura de anel com alta afinidade.
[042] Várias técnicas conhecidas pelos versados no assunto podem ser usadas para determinar se um anticorpo “se liga especificamente a um ou mais aminoácidos” dentro de um polipeptídeo ou proteína. As técnicas exemplares incluem, por exemplo, ensaio de bloqueio cruzado de rotina, como o descrito “Antibodies”, Harlow e Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY), análise mutacional de varredura de alanina, análise de blots de peptídeos (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248: 443-463), e análise de clivagem de peptídeo. Adicionalmente, podem ser empregados métodos como a excisão de epítopo, extração de epítopo e modificação química de antígenos (Tomer (2000) Protein Science 9: 487 a 496). Outro método que pode ser usado para identificar os aminoácidos dentro de um polipeptídeo com o qual um anticorpo se liga especificamente é a troca de hidrogênio/deutério detectada por espectrometria de massa. Em termos gerais, o método de troca de hidrogênio/deutério envolve a marcação com deutério da proteína de interesse, seguida pela ligação do anticorpo à proteína marcada com deutério. Em seguida, o complexo proteína/anticorpo é transferido para água para permitir que a troca de hidrogênio-deutério ocorra em todos os resíduos, exceto para os resíduos protegidos pelo anticorpo (que permanecem marcados com deutério). Após a dissociação do anticorpo, a proteína alvo é submetida a clivagem por protease e análise de espectrometria de massa, revelando assim os resíduos marcados com deutério que correspondem aos aminoácidos específicos com os quais o anticorpo interage. Vide, por exemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267 (2): 252-259; Engen e Smith (2001) Anal. Chem. 73: 256A-265A.
[043] A presente divulgação inclui ainda um anticorpo anti-toxina α que se liga especificamente ao mesmo epítopo.
[044] É possível determinar facilmente se um anticorpo se liga especificamente ao mesmo epítopo que ou compete pela ligação com um anticorpo anti-toxina α de referência pelo uso de métodos de rotina conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, para determinar se um anticorpo de teste se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo anti-toxina α de referência da divulgação, o anticorpo de referência pode se ligar a uma proteína toxina α (por exemplo, uma estrutura monomérica ou em anel da toxina α). Em seguida, a capacidade de um anticorpo teste se ligar à molécula de toxina α é avaliada. Se o anticorpo teste for capaz de se ligar à toxina α após a ligação de saturação com o anticorpo anti -toxina α de referência, pode-se concluir que o anticorpo teste se liga a um epítopo diferente do anticorpo anti-toxina α de referência. Por outro lado, se o anticorpo teste não for capaz de se ligar à molécula de toxina α após a ligação de saturação com o anticorpo anti-toxina α de referência, então o anticorpo teste pode se ligar ao mesmo epítopo que o epítopo ligado pelo anticorpo anti-toxina α de referência da presente divulgação. A experimentação de rotina adicional (por exemplo, a mutação de peptídeo e a análise de ligação) pode ser executada para confirmar se a falta de ligação do anticorpo de teste observada é, de fato, devido à ligação ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência ou se o bloqueio estérico (ou outro fenômeno) é responsável pela falta de ligação observada. Os experimentos desse tipo podem ser realizados com o uso de ELISA, RIA, Biacore, citometria de fluxo ou qualquer outro ensaio de ligação de anticorpo quantitativo ou qualitativo disponível no estado técnica. De acordo com determinados exemplos de realização da presente divulgação, dois anticorpos se ligam ao mesmo (ou sobreposição) epítopo se, por exemplo, um excesso de 1, 5, 10, 20 ou 100 vezes de um anticorpo inibe a ligação do outro em pelo menos 50%, mas preferencialmente 75%, 90% ou mesmo 99% conforme medido em um ensaio de ligação competitiva. Alternativamente, considera-se que dois anticorpos ligam-se ao mesmo epítopo se essencialmente todas as mutações de aminoácidos no antígeno que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo reduzem ou eliminam a ligação do outro. Dois anticorpos são considerados como tendo “epítopos sobrepostos” se apenas um subconjunto das mutações de aminoácidos que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo reduz ou elimina a ligação do outro.
[045] O termo “anticorpo”, conforme utilizado na presente invenção, também inclui um fragmento de ligação ao antígeno de uma molécula de anticorpo completa. Um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo pode ser derivado, por exemplo, de moléculas de anticorpo completas usando quaisquer técnicas padrão adequadas, tais como digestão proteolítica ou técnicas de engenharia genética recombinante envolvendo a manipulação e expressão de DNA codificante de anticorpos variáveis e opcionalmente domínios constantes. Tal DNA é conhecido e/ou está prontamente disponível a partir de, por exemplo, fontes comerciais, bibliotecas de DNA (incluindo, por exemplo, bibliotecas de fago-anticorpo), ou pode ser sintetizado. O DNA pode ser sequenciado e quimicamente manipulado ou pode-se utilizar técnicas de biologia molecular para, por exemplo, organizar um ou mais domínios variáveis e/ou constantes em uma configuração adequada, ou para introduzir códons, criar resíduos de cisteína, modificar, adicionar ou excluir aminoácidos etc.
[046] Exemplos não limitantes de um fragmento de ligação ao antígeno incluem: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv de cadeia única (scFv); (vi) fragmentos dAb; e (vii) unidades de reconhecimento mínimo consistindo nos resíduos de aminoácidos que mimetizam a região hipervariável de um anticorpo (por exemplo, uma região determinante de complementaridade isolada (CDR), tal como um peptídeo CDR3), ou um peptídeo FR3-CDR3-FR4 restrito. Outras moléculas modificadas, como anticorpos específicos de domínio, anticorpos de domínio único, anticorpos de domínio excluído, anticorpos quiméricos, anticorpos enxertados com CDR, diabodies (diacorpos), triabodies (triacorpos), tetrabodies (tetracorpos), minibodies (minicorpos), nanobodies (nanocorpos) (por exemplo, nanocorpos monovalentes, nanocorpos bivalentes, etc.), pequenos imunofármacos modulares (SMIPs) e domínios IgNAR variáveis de tubarão também estão incluídos na expressão “fragmento de ligação ao antígeno”, como utilizado na presente invenção.
[047] Um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo compreende, tipicamente, de pelo menos um domínio variável. O domínio variável pode ser de qualquer tamanho ou composição de aminoácidos e geralmente compreenderá pelo menos uma CDR que é adjacente a ou na fase de leitura (in frame) com uma ou mais sequências estruturais. Em fragmentos de ligação ao antígeno tendo um domínio VH associado a um domínio VL, os domínios VH e VL podem estar situados um em relação ao outro em qualquer arranjo adequado. Por exemplo, a região variável pode ser dimérico e conter dímeros VH - VH, VH - VL ou VL - VL. Alternativamente, o fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo pode conter um domínio VH ou VL monomérico.
[048] Em determinados exemplos de realização, um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo pode conter pelo menos um domínio variável covalentemente ligado a pelo menos um domínio constante. Configurações exemplares não limitantes de domínios variáveis e constantes que podem ser encontrados dentro de um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo da presente divulgação incluem: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3, (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; e (xiv) VL-CL. Em qualquer configuração de domínios variáveis e constantes, incluindo qualquer uma das configurações exemplares listadas acima, os domínios variáveis e constantes podem ser diretamente ligados entre si ou podem ser ligados por uma dobradiça total ou parcial ou região ligante. Uma região de dobradiça pode consistir em pelo menos 2 (por exemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 ou mais) aminoácidos que resultam em uma ligação flexível ou semiflexível entre domínios variáveis e/ou constantes adjacentes em uma única molécula polipeptídica. Além disso, um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo da presente divulgação pode compreender um homodímero ou heterodímero (ou outro multímero) de qualquer uma das configurações de domínio variável e constante listadas acima em associação não covalente entre si e/ou com um ou mais domínios VH ou VL monoméricos (por exemplo, por ligação(ões) de dissulfeto).
[049] Tal como acontece com uma molécula de anticorpo completa, um fragmento de ligação ao antígeno pode ser monoespecífico ou multiespecífico (por exemplo, biespecífico). Um fragmento de ligação ao antígeno multiespecífico de um anticorpo compreenderá tipicamente pelo menos dois domínios variáveis diferentes, em que cada domínio variável é capaz de se ligar especificamente a um antígeno separado ou a um epítopo diferente no mesmo antígeno. Qualquer formato de anticorpo multiespecífico, incluindo os formatos de anticorpo biespecífico exemplares divulgados no presente documento, pode ser adaptado para uso no contexto de um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo da presente divulgação usando técnicas de rotina disponíveis na técnica.
[050] De preferência, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a divulgação, é um anticorpo de mamífero.
[051] O termo “anticorpo de mamífero” tal como utilizado no presente, pretende incluir anticorpos possuindo regiões variáveis e constantes derivadas da linhagem germinal de mamíferos a partir de sequências de imunoglobulina. Os anticorpos de mamíferos da divulgação podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa de mamíferos (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou sítio-específica in vitro ou por mutação somática in vivo) por exemplo, nas CDRs e, particularmente na CDR3.
[052] O termo “anticorpo de mamífero recombinante”, tal como utilizado na presente invenção, pretende incluir todos os anticorpos de mamífero que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos expressos usando um vetor de expressão recombinante transfectado em uma célula hospedeira (descrita mais abaixo), anticorpos isolados de uma biblioteca combinatória de anticorpos de mamíferos recombinantes (descritos mais abaixo), anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico para genes de imunoglobulinas de mamíferos ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva o splicing de sequências gênicas de imunoglobulinas de mamíferos para outras sequências de DNA. Esses anticorpos de mamíferos recombinantes têm regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa de mamíferos. Em determinados exemplos de realização, no entanto, tais anticorpos de mamíferos recombinantes são submetidos à mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para sequências de Ig humana é usado, mutagênese somática in vivo) e, portanto, as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas e relacionadas com as sequências VH e VL da linhagem germinativa humana, podem não existir naturalmente no repertório da linhagem germinativa de anticorpo de mamíferos in vivo.
[053] Os anticorpos de mamíferos, tal como os anticorpos humanos, podem existir em duas formas que estão associadas à heterogeneidade de dobradiça. Em uma forma, uma molécula de imunoglobulina compreende uma construção de quatro cadeias estável de aproximadamente 150-160 kDa na qual os dímeros são mantidos juntos por uma ligação dissulfeto de cadeia pesada intercadeia. Em uma segunda forma, os dímeros não estão ligados através de ligações dissulfeto entre cadeias e uma molécula de cerca de 75-80 kDa é formada composta por uma cadeia leve e pesada covalentemente acoplada (meio-anticorpo). Essas formas têm sido extremamente difíceis de separar, mesmo após a purificação por afinidade.
[054] O anticorpo anti-toxina α descrito pode compreender uma ou mais substituições de aminoácidos, inserções e/ou deleções no quadro e/ou CDR das regiões dos domínios variáveis de cadeia leve e pesada, em comparação com as sequências da linha germinativa correspondente a partir do qual os anticorpos foram derivados. Essas mutações podem ser facilmente verificadas comparando as sequências de aminoácidos aqui divulgadas com sequências da linhagem germinativa disponíveis, por exemplo, bases de dados públicas de sequências de anticorpos. A presente divulgação inclui um anticorpo e um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que são derivados de qualquer uma das sequências de aminoácidos aqui divulgadas, em que um ou mais aminoácidos dentro de uma ou mais regiões de framework e/ou CDR são mutados para o(s) resíduo(s) correspondente(s) da sequência da linhagem germinativa a partir da qual o anticorpo foi derivado, ou para o(s) resíduo(s) correspondente(s) de outra sequência da linhagem germinativa de mamífero, ou para uma substituição conservadora de aminoácidos do(s) resíduo(s) da linhagem germinativa correspondente (tais alterações de sequência são aqui referidos coletivamente como “mutações da linhagem germinativa”). Um versado na técnica, começando com as sequências da região variável de cadeia pesada e leve divulgadas no presente documento, pode facilmente produzir numerosos anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno que compreendem uma ou mais mutações individuais da linhagem germinativa ou suas combinações. Em determinados exemplos de realização, todos os resíduos de framework e/ou CDR dentro dos domínios VH e/ou VL são mutados de volta para os resíduos encontrados na sequência da linhagem germinativa original da qual o anticorpo foi derivado. Em outros exemplos de realização, apenas certos resíduos são mutados de volta para a sequência da linhagem germinativa original, por exemplo, apenas os resíduos mutados encontrados nos primeiros 8 aminoácidos de FR1 ou nos últimos 8 aminoácidos de FR4, ou apenas os resíduos mutados encontrados na CDR1, CDR2 ou CDR3. Em outros exemplos de realização, uma ou mais da estrutura e/ou resíduo(s) de CDR é(são) mutado(s) para o(s) resíduo(s) correspondente(s) de uma sequência de linhagem germinativa diferente (ou seja, uma sequência de linhagem germinativa que é diferente da sequência de linhagem germinativa a partir da qual o anticorpo foi derivado originalmente). Além disso, os anticorpos da presente divulgação podem conter qualquer combinação de duas ou mais mutações da linhagem germinativa dentro da estrutura e/ou regiões CDR, por exemplo, em que certos resíduos individuais são mutados para o resíduo correspondente de uma sequência particular da linhagem germinativa, enquanto outros resíduos que diferem da sequência da linhagem germinativa original são mantidos ou são mutados para o resíduo correspondente de uma sequência da linhagem germinativa diferente. Uma vez obtidos, os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno que contêm uma ou mais mutações da linhagem germinativa podem ser facilmente testados para uma ou mais propriedades desejadas, tais como especificidade de ligação melhorada, afinidade de ligação aumentada, propriedades biológicas agonísticas ou antagonistas melhoradas ou aumentadas (conforme o caso), imunogenicidade reduzida, etc. Os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno obtidos desta maneira geral estão incluídos na presente divulgação.
[055] A presente divulgação também inclui um anticorpo anti-toxina α compreendendo as variantes de qualquer uma das sequências de aminoácidos de VH, VL, e/ou CDRs aqui divulgadas possuindo uma ou mais substituições conservadoras. Por exemplo, a presente divulgação inclui um anticorpo anti-toxina α possuindo sequências de aminoácidos de VH, VL, e/ou CDR com, por exemplo, 10 ou menos, 8 ou menos, 6 ou menos, 4 ou menos, etc. substituições conservadoras de aminoácidos em relação a qualquer uma das sequências de aminoácidos de VH, VL e/ou CDR aqui divulgada.
[056] O termo “identidade substancial” ou “substancialmente idêntico”, quando se refere a um ácido nucleico ou fragmento do mesmo, indica que, quando alinhado de forma otimizada com inserções ou deleções de nucleotídeos apropriadas com outro ácido nucleico (ou sua fita complementar), há identidade de sequência de nucleotídeos em pelo menos cerca de 95%, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% das bases de nucleotídeos, conforme medido por qualquer algoritmo de identidade de sequência bem conhecido, tal como FASTA, BLAST ou Gap, como discutido abaixo. Uma molécula de ácido nucleico com identidade substancial com uma molécula de ácido nucleico de referência pode, em certos casos, codificar um polipeptídeo que possui a mesma sequência de aminoácidos ou substancialmente semelhante ao polipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico de referência.
[057] Conforme aplicado aos polipeptídeos, o termo “similaridade substancial” ou “substancialmente semelhante” significa que duas sequências de peptídeos, quando alinhadas de forma otimizada, como pelos programas GAP ou BESTFIT usando pesos de lacuna padrão, compartilham pelo menos 95% de identidade de sequência, ainda mais preferencialmente pelo menos 98% ou 99% de identidade de sequência. De preferência, as posições dos resíduos que não são idênticas diferem por substituições de aminoácidos conservadoras. Uma “substituição conservadora de aminoácido” é aquela em que um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido possuindo uma cadeia lateral (grupo R) com propriedades químicas semelhantes (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição conservadora de aminoácidos não alterará substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína. Nos casos em que duas ou mais sequências de aminoácidos diferem entre si por substituições conservadoras, o percentual de identidade de sequência ou grau de similaridade pode ser ajustado para cima para corrigir a natureza conservadora da substituição. Os meios para fazer este ajuste são bem conhecidos pelos profissionais versados na técnica. Exemplos de grupos de aminoácidos que possuem cadeias laterais com propriedades químicas semelhantes incluem (1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadeias laterais de hidroxila alifática: serina e treonina; (3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; (4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e triptofano; (5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina e histidina; (6) cadeias laterais ácidas: aspartato e glutamato, e (7) cadeias laterais contendo enxofre são cisteína e metionina. Os grupos de substituição conservadora de aminoácidos preferidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato e asparagina-glutamina. Alternativamente, uma substituição conservadora é qualquer mudança possuindo um valor positivo na matriz de verossimilhança logarítmica PAM250 divulgada em Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445, incorporado ao presente por referência. Uma substituição “moderadamente conservadora” é qualquer alteração que tenha um valor não negativo na matriz de verossimilhança de log do PAM250.
[058] A similaridade de sequência para polipeptídeos, que também é referida como identidade de sequência, é tipicamente medida usando o software de análise de sequência. O software de análise de proteínas combina sequências semelhantes usando medidas de similaridade atribuídas a várias substituições, deleções e outras modificações, incluindo substituições conservadoras de aminoácidos. Por exemplo, o software GCG contém programas como Gap e Bestfit, que podem ser usados com parâmetros padrão para determinar a homologia ou identidade de sequência entre polipeptídeos intimamente relacionados, tais como polipeptídeos homólogos de diferentes espécies de organismos ou entre uma proteína do tipo selvagem e um mutante da mesma. As sequências polipeptídicas também podem ser comparadas usando FASTA usando parâmetros padrão ou recomendados, um programa em GCG Versão 6.1. FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) fornece alinhamentos e porcentagem de identidade de sequência das regiões com melhor sobreposição entre as sequências de consulta e busca (Pearson (2000) supra). Outro algoritmo preferido ao comparar uma sequência da descrição a um banco de dados contendo um grande número de sequências de diferentes organismos é o programa de computador BLAST, especialmente BLASTP ou TBLASTN, usando parâmetros padrão. Vide, por exemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 e Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-402 cada um incorporado ao presente por referência.
[059] Em um exemplo de realização preferido da presente divulgação, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende regiões determinantes de complementaridade de uma região variável de cadeia pesada e regiões determinantes de complementaridade de uma região variável de cadeia leve, em que as regiões determinantes de complementaridade da região variável de cadeia pesada compreendem regiões CDRH1, CDRH2 e CDRH3 e as regiões determinantes de complementaridade da região variável de cadeia leve compreendem as regiões CDRL1, CDRL2 e CDRL3:
a região CDRH1 compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1 a 2 ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência;
a região CDRH2 compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 3 a 6 e 31 ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência;
a região CDRH3 compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 7 a 9 ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência;
a região CDRL1 compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 10 a 13 ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência;
a região CDRL2 compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 14 a 15 ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; e
a região CDRL3 compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 16 a 18 ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
a região CDRH1 compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1 a 2 ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência;
a região CDRH2 compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 3 a 6 e 31 ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência;
a região CDRH3 compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 7 a 9 ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência;
a região CDRL1 compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 10 a 13 ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência;
a região CDRL2 compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 14 a 15 ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; e
a região CDRL3 compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 16 a 18 ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[060] Em um exemplo de realização preferido da presente divulgação, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende regiões determinantes de complementaridade de uma região variável de cadeia pesada e regiões determinantes de complementaridade de uma região variável de cadeia leve, conforme mostrado na Tabela 2
[061] Em um exemplo de realização preferido da presente divulgação, um anticorpo 25A1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende a região CDRH1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência substancialmente semelhante desta; a região CDRH2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou uma sequência substancialmente semelhante desta; a região CDRH3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 ou uma sequência substancialmente semelhante desta; a região CDRL1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 ou uma sequência substancialmente semelhante desta; a região CDRL2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 ou uma sequência substancialmente semelhante desta; e a região CDRL3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 ou uma sequência substancialmente semelhante desta. De preferência, o anticorpo 25A1 compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência. De preferência, o anticorpo 25A1 compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[062] Em outro aspecto, o anticorpo de acordo com a divulgação é preferencialmente um anticorpo humanizado. Um “anticorpo humanizado” é uma proteína recombinante em que as CDRs de um anticorpo de uma espécie; por exemplo, um anticorpo de roedor, são transferidas das cadeias variáveis pesadas e leves do anticorpo de roedor para domínios variáveis pesados e leves humanos, incluindo as sequências da região estrutural humana (FR). Os domínios constantes da molécula de anticorpo são derivados daqueles de um anticorpo humano.
[063] A fim de melhorar a afinidade de ligação do anticorpo humanizado de acordo com a divulgação, alguns resíduos de aminoácidos na região de estrutura humana são substituídos pelos resíduos de aminoácidos correspondentes nas espécies de CDRs; por exemplo, um roedor.
[064] Preferencialmente, um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 21 a 23 ou uma sequência substancialmente semelhante desta possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência. Um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 24 a 26 ou uma sequência substancialmente semelhante desta pelo menos 90%, pelo menos 95%, em pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência ou uma sequência substancialmente semelhante da mesma.
[065] Em um exemplo de realização preferido da divulgação, um anticorpo humanizado 25A1-B2B4AQT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma; e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 8 ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma.
[066] Em um exemplo de realização preferido da divulgação, um anticorpo humanizado 25A1-B5B6AQT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma; e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma.
[067] De preferência, o anticorpo de acordo com a divulgação é um anticorpo monoclonal
[068] Os anticorpos da presente divulgação podem ser monoespecíficos, biespecíficos ou multiespecíficos. Os anticorpos multiespecíficos podem ser específicos para diferentes epítopos de um polipeptídeo alvo ou podem conter domínios de ligação ao antígeno específicos para mais de um polipeptídeo alvo. Os anticorpos anti-toxina α da presente divulgação podem ser ligados ou coexpressos com outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína. Por exemplo, um anticorpo ou fragmento do mesmo pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou similar) a uma ou mais outras entidades moleculares, como outro anticorpo ou fragmento de anticorpo para produzir um anticorpo biespecífico ou multiespecífico com uma segunda especificidade de ligação. Por exemplo, a presente divulgação inclui anticorpos biespecíficos em que um braço de uma imunoglobulina é específico para toxina α ou um fragmento da mesma, e o outro braço da imunoglobulina é específico para um segundo alvo terapêutico ou é conjugado a uma fração terapêutica.
[069] Em um exemplo de realização preferido da presente divulgação, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é conjugado com um agente terapêutico.
[070] Um exemplo do agente terapêutico é um antibiótico. Exemplos de antibióticos incluem, mas não estão limitados a dactinomicina, bleomicina, mitramicina, antramicina, estreptozotocina, gramicidina D ou mitomicinas.
[071] Em um exemplo de realização preferido da divulgação, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser produzido usando qualquer variedade de sistemas de expressão, incluindo sistemas de expressão procarióticos e eucarióticos. Em alguns exemplos de realização, o sistema de expressão é uma expressão de células de mamífero, como um hibridoma ou um sistema de expressão de células CHO. Muitos desses sistemas estão amplamente disponíveis em fornecedores comerciais. Em exemplos de realização em que um anticorpo compreende tanto uma região VH e VL, as regiões VH e VL podem ser expressas utilizando um vetor único, por exemplo, em uma unidade de expressão bicistrônica, ou sob o controle de diferentes promotores. Em outros exemplos de realização, a região VH e VL pode ser expressa usando vetores separados. A região VH ou VL aqui descrita pode opcionalmente compreender uma metionina N-terminal
[072] Os genes que codificam as cadeias pesadas e leves de um anticorpo de interesse podem ser clonados a partir de uma célula, por exemplo, os genes que codificam um anticorpo monoclonal podem ser clonados a partir de um hibridoma e usados para produzir um anticorpo monoclonal recombinante. Bibliotecas de genes que codificam cadeias pesadas e leves de anticorpos monoclonais também podem ser feitas a partir de hibridoma ou células plasmáticas. As combinações aleatórias dos produtos dos genes das cadeias pesadas e leves geram um grande conjunto de anticorpos com diferentes especificidades antigênicas (consulte, por exemplo, Kuby, Immunology (3.sup.rd ed. 1997)).
[073] As técnicas para a produção de anticorpos de cadeia única ou anticorpos recombinantes (Patente US 4.946.778, Patente US 4.816.567) podem ser adaptadas para produzir anticorpos para polipeptídeos da presente divulgação. Além disso, camundongos transgênicos, ou outros organismos, como outros mamíferos, podem ser usados para expressar anticorpos humanizados ou humanos (consulte, por exemplo, as Patentes US 5.545.807; US 5.545.806; US 5.569.825; US 5.625.126; US 5.633.425; US 5.661.016, Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); e Lonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)).
[074] Em um exemplo de realização preferido da presente divulgação, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é expresso sobre a superfície de uma célula. Mais preferencialmente, a célula é uma célula T.
[075] A divulgação fornece composições farmacêuticas compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da presente divulgação. As composições farmacêuticas da divulgação são formuladas com diluentes, transportadores, excipientes e outros agentes adequados que fornecem transferência, entrega, tolerância melhoradas e semelhantes. As composições podem ser formuladas para usos específicos, tais como usos veterinários ou usos farmacêuticos em humanos. A forma da composição e os excipientes, diluentes e/ou veículos usados dependerão dos usos pretendidos do anticorpo e, para usos terapêuticos, do modo de administração. Uma infinidade de formulações apropriadas pode ser encontrada no formulário conhecido por todos os químicos farmacêuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa. Estas formulações incluem, por exemplo, pós, pastas, pomadas, geleias, ceras, óleos, lipídios, lipídio (catiônico ou aniônico) contendo vesículas (como LIPOFECTIN®., Life Technologies, Carlsbad, Califórnia), conjugados de DNA, pastas de absorção anidras, emulsões óleo em água e água em óleo, emulsões carbowax (polietileno glicóis de vários pesos moleculares), géis semissólidos e misturas semissólidas contendo carbowax. Consulte também Powell et al. “Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52: 238-311.
[076] A dose de anticorpo administrada a um paciente pode variar dependendo da idade e do tamanho do paciente, doença alvo, condições, via de administração e semelhantes. A dose preferida é tipicamente calculada de acordo com o peso corporal ou área de superfície corporal. Quando um anticorpo da presente divulgação é usado para tratar uma condição ou doença associada à infecção por Staphylococcus aureus em um paciente adulto, pode ser vantajoso administrar por via intravenosa o anticorpo da presente divulgação. Dependendo da gravidade da condição, a frequência e a duração do tratamento podem ser ajustadas. As dosagens e horários eficazes para a administração do anticorpo podem ser determinados empiricamente; por exemplo, o progresso do paciente pode ser monitorado por avaliação periódica e a dose ajustada em conformidade. Além disso, a escala de dosagens interespécies pode ser realizada usando métodos bem conhecidos no estado da técnica (por exemplo, Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8: 1351).
[077] Vários sistemas de entrega são conhecidos e podem ser usados para administrar a composição farmacêutica da divulgação, por exemplo, encapsulação em lipossomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar os vírus mutantes, endocitose mediada por receptor (consulte, por exemplo, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432). Os métodos de introdução incluem, mas não estão limitados a, vias intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intranasal, epidural e oral. A composição pode ser administrada por qualquer via conveniente, por exemplo, por infusão ou injeção em bolus, por absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, mucosa retal e intestinal, etc.) e pode ser administrada juntamente com outros agentes biologicamente ativos. A administração pode ser sistêmica ou local.
[078] Uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser entregue por via subcutânea ou intravenosa com uma agulha e seringa padrão. Além disso, com relação à entrega subcutânea, um dispositivo de entrega com caneta tem aplicações prontas na entrega de uma composição farmacêutica da presente invenção. Tal como um dispositivo de entrega de caneta pode ser reutilizável ou descartável. Um dispositivo de entrega com caneta reutilizável geralmente utiliza um cartucho substituível que contém uma composição farmacêutica. Uma vez que toda a composição farmacêutica dentro do cartucho foi administrada e o cartucho está vazio, o cartucho vazio pode ser descartado e substituído facilmente por um novo cartucho que contém a composição farmacêutica. O dispositivo de entrega de caneta pode ser reutilizado. Em um dispositivo de entrega de caneta descartável, não há cartucho substituível. Em vez disso, o dispositivo de distribuição de caneta descartável vem pré-cheio com a composição farmacêutica mantida em um reservatório dentro do dispositivo. Uma vez que o reservatório é esvaziado da composição farmacêutica, todo o dispositivo é descartado.
[079] Em certas situações, a composição farmacêutica pode ser entregue em um sistema de liberação controlada. Em um exemplo de realização, pode ser utilizada uma bomba (Vide Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201). Em outro exemplo de realização, podem ser utilizados materiais poliméricos; vide, Medical Applications of Controlled Release, Langer e Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Flórida. Em outro exemplo de realização, um sistema de libertação controlada pode ser colocado na proximidade da composição alvo, requerendo assim apenas uma fração da dose sistêmica (vide, por exemplo, Goodson, 1984, em Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2 págs. 115-138). Outros sistemas de libertação controlada são discutidos na revisão de Langer, 1990, Science 249: 1527-1533.
[080] As preparações injetáveis podem incluir formas de dosagem para injeções intravenosas, subcutâneas, intracutâneas e intramusculares, infusões por gotejamento, etc. Essas preparações injetáveis podem ser preparadas por métodos publicamente conhecidos. Por exemplo, as preparações injetáveis podem ser preparadas, por exemplo, dissolvendo, suspendendo ou emulsionando o anticorpo ou seu sal descrito acima em um meio aquoso estéril ou em um meio oleoso convencionalmente usado para injeções. Como meio aquoso para injeções, existem, por exemplo, solução salina fisiológica, uma solução isotônica contendo glicose e outros agentes auxiliares, etc., que podem ser utilizados em combinação com um agente solubilizante apropriado, como um álcool (por exemplo, etanol), um álcool poliálico (por exemplo, propileno glicol, polietileno glicol), um tensoativo não iônico [por exemplo, polissorbato 80, HCO-50 (aduto de polioxietileno (50 mol) de óleo de mamona hidrogenado)], etc. Como meio oleoso, são empregados, por exemplo, óleo de gergelim, óleo de soja, etc., que pode ser utilizado em combinação com um agente solubilizante, como benzoato de benzila, álcool benzílico, etc. A injeção assim preparada é preferivelmente preenchida em uma ampola apropriada.
[081] Vantajosamente, as composições farmacêuticas para uso oral ou parenteral descritas acima são preparadas em formas de dosagem em uma dose unitária adequada para ajustar uma dose dos ingredientes ativos. Tais formas de dosagem em uma dose unitária incluem, por exemplo, comprimidos, pílulas, cápsulas, injeções (ampolas), supositórios, etc.
[082] A presente divulgação fornece um método para neutralizar a toxina α estafilocócica de Staphylococcus aureus, compreende a administração ao sujeito de um anticorpo da presente divulgação ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou uma composição farmacêutica da presente divulgação. Em um exemplo de realização, o anticorpo liga-se à toxina α com um valor KD variando de 1 x 10-7 a 1 x 10-10 M; de preferência, o KD varia de 1 x 10-8 a 1 x 10-10 M; mais preferencialmente, o KD varia de 1 x 10-9 a 1 x 10-10 M. Em um exemplo de realização, o método provê imunoterapia passiva no contexto de infecções por S. aureus.
[083] A presente divulgação fornece um método para tratar e/ou prevenir doenças e/ou distúrbios causados por infecção por Staphylococcus aureus em um sujeito com tal necessidade, compreendendo a administração de uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como mencionado acima ao sujeito. Em um exemplo de realização, a infecção por Staphylococcus aureus é pneumonia.
[084] Os termos “tratando” e “tratamento”, conforme usados no presente documento, referem-se à administração de um agente ou formulação a um indivíduo clinicamente sintomático que sofre de uma condição adversa, distúrbio ou doença, de modo a efetuar uma redução na gravidade e/ou frequência de sintomas, eliminar os sintomas e/ou sua causa subjacente e/ou facilitar a melhoria ou remediação do dano. Os termos “prevenindo” e “prevenção” referem-se à administração de um agente ou composição a um indivíduo clinicamente assintomático que é suscetível a uma determinada condição adversa, distúrbio ou doença e, portanto, refere-se à prevenção da ocorrência de sintomas e/ou sua causa subjacente. Como é entendido por um versado na técnica, a prevenção ou prevenção não precisa atingir o bloqueio absoluto (completo) ou evitar as condições. Em vez disso, a prevenção pode alcançar uma redução substancial (por exemplo, mais de cerca de 50%) ou evitar as doenças ou condições a serem evitadas. A menos que indicado de outra forma neste documento, seja explicitamente ou por implicação, se o termo “tratamento” (ou “tratando”) for usado sem referência a uma possível prevenção, pretende-se que a prevenção também seja englobada.
[085] A presente divulgação fornece um método para detectar toxina α de Staphylococcus aureus em uma amostra compreendendo o contato da amostra com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conforme mencionado acima.
[086] A presente invenção também fornece um agente de diagnóstico ou kit para detectar toxina α de Staphylococcus aureus em uma amostra, compreendendo um anticorpo descrito na presente invenção ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme mencionado acima.
[087] Assim, o anticorpo anti-toxina α da presente divulgação pode ser usado para detectar e/ou mensurar a toxina α, ou células que expressam toxina α em uma amostra, por exemplo, para fins de diagnóstico. Por exemplo, um anticorpo anti-toxina α, ou fragmento do mesmo, pode ser usado para diagnosticar uma condição ou doença caracterizada pela expressão aberrante (por exemplo, superexpressão, subexpressão, falta de expressão, etc.) de toxina α Ensaios de diagnóstico exemplares para toxina α podem compreender, por exemplo, o contato de uma amostra, obtida de um paciente, com um anticorpo anti-toxina α da presente divulgação, em que o anticorpo anti-toxina α é marcado com um marcador detectável ou molécula repórter. Alternativamente, um anticorpo anti-toxina α não marcado pode ser usado em aplicações de diagnóstico em combinação com um anticorpo secundário que é ele próprio marcado de forma detectável. O marcador detectável ou molécula repórter pode ser um radioisótopo, como 3H, 14C, 32P, 35S ou 125I; uma unidade fluorescente ou quimioluminescente, tal como isotiocianato de fluoresceína ou rodamina; ou uma enzima como a fosfatase alcalina, beta-galactosidase, peroxidase de rábano ou luciferase. Ensaios exemplares específicos que podem ser usados para detectar ou medir a toxina α em uma amostra incluem ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), radioimunoensaio (RIA) e classificação de células ativadas por fluorescência (FACS).
[088] Os exemplos a seguir são fornecidos para auxiliar aqueles versados na técnica na prática da presente divulgação.
[089] A sequência da toxina α mutante não tóxica, AT H35L, foi construída em um vetor pET27b in frame com um marcador His-tag 6X C-terminal ((pET27b TAC1p α-hemolisina-6His). A toxina alfa ATH35L foi expressa e purificada a partir da cepa BL21 de E. coli. Resumidamente, uma cultura fresca de 750 mL foi cultivada a 37ºC em uma OD600 de 0,67. IPTG (isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo) foi adicionado a uma concentração final de 0,25 mM para induzir a expressão da proteína durante 5 h a 30ºC. As células foram então coletadas e ressuspensas em 100 mL de tampão de lise, seguido por homogeneização utilizando uma prensa Francesa por 7 ciclos. O lisado de células T foi clarificado e em seguida, misturado com 2 mL de Ni-NTA. Após duas horas de ligação, a toxina α ATH35L His-tag recombinante foi eluída com uma solução de imidazol 20 ~ 150 mM e foi dialisada contra solução salina tamponada com fosfato.
[090] Camundongos BABL/c com oito a dez semanas de idade foram imunizados com toxina α ATH35L em adjuvante de Freud incompleto através de injeções intraperitoneais a cada 2 semanas durante 10 semanas. Após duas semanas da injeção final, reforços adicionais foram dados diariamente durante três dias antes do sacrifício. Uma biblioteca de fagos scFv anti-AT (um fragmento variável de cadeia única) foi produzida a partir de células de baço de camundongo. Em resumo, o baço do camundongo foi homogeneizado e lisado com o reagente TRIZOL® para o isolamento de RNA e, em seguida, o cDNA foi sintetizado usando SuperScript III®. A região variável de cadeia pesada (VH) e a região variável de cadeia leve (VL) dos fragmentos de DNA foram amplificadas pelo conjunto de iniciadores scFV. Para gerar VL-ligante-VH, a mistura de VL, VH e ligante flexível foi amplificada por reação de PCR. O fragmento VL-ligante-VH foi digerido com Sfi, as inserções cortadas foram ligadas com o vetor fagomídeo. As misturas de ligação foram eletroporadas em células competentes de E. coli TG1 para gerar uma biblioteca de fagos. A diversidade foi estimada em 1,24 x 109 transformantes.
[091] Os anticorpos anti-AT foram então selecionados a partir da biblioteca de fagos usando métodos baseados em solução e baseados em placa. Para a seleção (etapa de panning) baseada em solução, a toxina α biotinilada foi incubada com a biblioteca de fagos e esferas magnéticas de estreptavidina. Após a lavagem, os anticorpos de fagos ligados foram eluídos. Os fagos eluídos foram amplificados e usados nas rodadas de panning seguintes. Foi executado um total de três rodadas de panning. Para o panning baseado em placa, a toxina α foi revestida em microplacas e as placas foram incubadas com a biblioteca de fagos, um total de três rodadas de panning baseado em placa foi realizado. As partículas de fago foram inicialmente rastreadas quanto à capacidade de se ligar à toxina α, as partículas foram analisadas por ELISA usando fago (fago-ELISA) e o DNA foi sequenciado.
[092] Dez microlitros de cultura individual de fago cultivada de um dia para o outro foram cultivados em 150 μL de meio 2YT-A em microplacas de 96 poços por 2 h a 37ºC. A cultura foi então infectada com 50 μL de fago auxiliar (2 x 1010 PFU/mL) e incubada com agitação por mais 2 h a 37ºC. Cinquenta microlitros de meio 2YT-A suplementado com 125 μg/mL de canamicina foram adicionados às placas de cultura e incubados com agitação durante a noite a 30ºC. O sobrenadante da cultura contendo fagos de interesse foi obtido por centrifugação a 3.300 x g durante 30 minutos e utilizado para rastreio de fago–ELISA. 100 μL de sobrenadante de fagos foram adicionados a placas de ELISA revestidas com AT. Os ligantes positivos foram detectados com substrato de anti-M13 de camundongo-HRP e TMB. A absorbância foi medida a 450 nm utilizando leitor de placas ELISA.
[093] As cadeias leve e pesada foram amplificadas e tratadas com DraIII/BsiWI e MluI/NheI, respectivamente. As inserções foram ligadas em vetores contendo regiões constantes de cadeia leve e pesada, e as construções foram transfectadas em células F293 para expressão. Anticorpos de comprimento completo purificados foram testados e classificados por IC50 na neutralização de citólise A549 induzida por AT.
[100] A ressonância plasmônica de superfície (SPR) foi usada para determinar a cinética de ligação de 25A1 a AT recombinante. Resumidamente, aproximadamente 200 unidades de resposta (RU) de 25A1 foram imobilizadas em chips CM5 usando procedimentos de acoplamento de amina padrão. Posteriormente, AT parcialmente diluída nas concentrações de 1,5625, 3,125, 6,25, 12,5, 25 e 50 nM foi injetada a 30 μL/min por 180 segundos e dissociada por 480 segundos. Os parâmetros cinéticos (Kon e Koff) e afinidades (KD) foram calculados usando o software de avaliação Biacore T100 2.0 com um modelo de ligação de interação 1:1.
[101] A humanização foi conduzida por enxerto da região determinante de complementaridade (CDR). A sequência da proteína 25A1 de camundongo foi alinhada com as sequências da linhagem germinativa humana para identificar a sequência humana com alta identidade de sequência, sequências da família de cadeia leve IGVK3-11 e família de cadeia pesada IGHV1-2 foram adotadas como sequências estruturais (FR). Além do enxerto de CDRs. As sequências foram adicionalmente analisadas quanto ao potencial de cisteína livre, desaminação, corte de lisina e formação de sítios de corte de protease. Os anticorpos 25A1 quiméricos e humanizados foram expressos transitoriamente em células F293 e purificados.
[102] O ensaio funcional para os anticorpos anti-AT foi estabelecido. Células A549 foram semeadas em microplacas a 2 x 104 células/poço e cultivadas a 37ºC com 5% de CO2 durante a noite. No dia seguinte, o meio foi removido e as células foram lavadas com meio. Os anticorpos purificados foram adicionados às células a 0,4, 4 e 40 μg/mL e coincubados com 8 μg/mL de AT. No final da incubação, a viabilidade celular foi analisada usando um kit de ensaio MTT colorimétrico. Os resultados foram determinados com a absorbância de fundo em OD690 nm e subtraídos da medição em OD570 nm (Figura 1).
[103] Os sobrenadantes em bruto de S. aureus foram coletados a partir de 3 mL de meio de cultura caldo tríptico de soja (TSB) durante a noite por centrifugação a 6000 rpm durante 10 minutos. Os sobrenadantes de várias cepas foram então esterilizados por filtração e armazenados a -80ºC até uso posterior.
[104] As células RBC foram coletadas utilizando uma solução gradiente de iodixanol e o sedimento celular final foi ressuspenso em meio salino balanceado (NaCl a 0,85%, HEPES 10 mM, pH 7,4) e mantido a 4ºC. Foi avaliada a capacidade dos anticorpos em neutralizar a hemólise de hemácias de coelho induzida por AT. Especificamente, 25 μL de cada anticorpo na concentração de 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, e 1,56 e 0,78 foi adicionado ao poço em conjunto com 100 μL de 10% de glóbulos vermelhos de coelho, seguido pela adição de 25 μL de sobrenadante de cultura de S. aureus diluído 1: 8 ~ 1:16 de diversas cepas. Após a incubação de 45 ~ 60 minutos a 37ºC, as placas foram centrifugadas durante 5 min, 50 µL do sobrenadante foram removidos suavemente para uma nova placa de microtitulação e a absorbância foi lida a 450 nm. A potência do anticorpo é definida como a concentração de anticorpo na qual foi alcançada 50% de inibição da hemólise induzida por toxina α. 2% de TritonX-100 serviu como 100% de controle de hemólise. A inibição da hemólise foi calculada como ((OD450 de TritonX -100 a 2% – OD450 do anticorpo teste)/OD450 de TritonX-100 a 2%) x 100%.
[105] Grupos de 6 camundongos BALB/c ou CD-1 fêmeas foram imunizados passivamente por injeção intraperitoneal de anticorpo de controle ou 25A1 e, em seguida, desafiados depois de 24 por injeção intravenosa (iv) de dose letal de 90% de S. aureus BAA-1717, ou por injeção via intraperiotoneal da cepa ATCC29213. A mortalidade dos animais foi monitorada por 10 dias consecutivos. A sobrevida foi registrada e os resultados analisados usando o programa GraphPad Prism. A análise de significância estatística foi realizada com a análise de sobrevida de Kaplan-Meir com os testes Log-rank (Mantel-Cox) e Gehan-Breslow-Wilcoxon.
[106] Grupos de dez camundongos C57BL/6J fêmeas de 7 a 9 semanas de idade (Jackson Labs, Bar Harbor, MI) foram imunizados passivamente por injeção intraperitoneal de SYN100 (25A1-B5B6AQT) e, em seguida, desafiados depois de 24 h por administração intranasal (IN) com uma dose letal de cada isolado clínico de S. aureus. A vancomicina foi administrada por via subcutânea 2h após a infecção. Os animais foram monitorados quanto à sobrevida com um censo realizado 3 vezes por dia durante 7 dias após a infecção. A sobrevida foi registrada e os resultados analisados usando o programa GraphPad Prism. A análise de significância estatística foi realizada com a análise de sobrevida de Kaplan-Meir com os testes Log-rank (Mantel-Cox) e Gehan-Breslow-Wilcoxon.
[107] Grupos de três a nove coelhos da Nova Zelândia machos foram tratados com diferentes dosagens de SYN100 24 horas antes da infecção. Os tamanhos do inóculo das infecções foram mantidos entre 2,9–5,2 x 107 UFC/coelho. Linezolida, se usada, foi administrada quatro horas após a infecção por injeção subcutânea de 50 mg/kg/8h. Os animais foram monitorados quanto à sobrevida com um censo realizado 2 vezes por dia durante 7 dias após a infecção. A sobrevida foi registrada e os resultados analisados usando o programa GraphPad Prism. A análise de significância estatística foi realizada com a análise de sobrevida de Kaplan-Meir com os testes Log-rank (Mantel-Cox) e Gehan-Breslow-Wilcoxon.
[108] Os camundongos BABL/c foram imunizados com AT recombinante especificamente inativada pela introdução da mutação H35L. Em seguida, construímos uma biblioteca de fago de fragmento variável de cadeia única (scFv) e selecionados com AT de S. aureu purificada. Após três rodadas de seleção, 29 ligantes únicos foram identificados, produzidos e testados quanto à atividade de neutralização contra a citólise A549 induzida por AT. Os resultados mostraram que apenas 10 (25A1, 25A10, 25E4, 25E12, 25H3, 25B7, 25G1, 25G4, 5H9 e N2F6) dos 29 anticorpos purificados inibiram a citólise de A549 quando o anticorpo foi usado a 40 μg/mL (Figura 1). As atividades de neutralização dos 10 anticorpos estão resumidas na Tabela 3. Os anticorpos foram então convertidos em anticorpos de comprimento total e adicionalmente caracterizados quanto à ligação e confirmados quanto à atividade de neutralização. As sequências de CDR dos 10 clones são mostradas na Tabela 2 (como mostrado acima). Uma comparação das sequências CDR revelou que 9 dos 10 anticorpos inibidores eram quase idênticos na sequência de aminoácidos. Cinco deles (25A10, 25A1, 25E12, 25H3 e 25E4) tiveram atividade funcional muito semelhante na neutralização da citólise de A549 induzida por AT. O clone 25A1 foi selecionado com base na ligação e atividade funcional.
[109] A afinidade de 25A1 para AT recombinante foi avaliada por ressonância plasmônica de superfície. Como mostrado na Figura 2, 25A1 liga-se à toxina α com uma KD de 8.346 x 10-10 M. As constantes de associação e dissociação foram 7.608 x 105 M-1 s -1 e 6.349 x 10-4 s -1 , respectivamente. Estes dados indicam que 25A1 tem uma elevada afinidade para a AT.
[110] Para reduzir a imunogenicidade introduzida com anticorpos murinos, escolhemos enxertar as CDRs do anticorpo 25A1 murino na estrutura humana IGVK3-11*01F para a cadeia leve e IGHV1-2*02F para a cadeia pesada devido à sua sequência alta e conformacional ao 25A1 murino. Diferentes combinações de mutações reversas foram geradas e testadas quanto à ligação ao antígeno. Com base nas afinidades de ligação e no número de mutações reversas, duas variantes da cadeia pesada 25A1-VHB2 e 25A1-VHB5 e 2 de cadeia leve 25A1-VLB4 e 25A1-VLB6 foram selecionadas para construir as variantes 25A1-HuB2B4, 25A1-HuB5B4, 25A1HuB2B6 e 25A1-HuB5B6. As variações de sequência do anticorpo após enxerto de CDR e retromutação são apresentadas na Figura 3(A). A cinética de ligação (KD) dos anticorpos humanizados 25A1-HuB2B4, 25A1-HuB5B4, 25A1HuB2B6 e 25A1-HuB5B6 em relação à toxina α recombinante foi determinada por forteBio como sendo 1,1 x 10-9 M, 1,5 x 10-9 M, 1,1 x 10-9 M e 1,1 x 10-9 M, respectivamente, que são altamente semelhantes à KD do anticorpo murino parental 25A1, 1,5 x 10-9 M (Figura 3 (B)).
[111] Em seguida, selecionamos 25A1-B2B4 e 25A 1-B5B6 para a verificação da fiabilidade de sequência. Um potencial local de glicosilação foi identificado em N61 na região CDR2 da cadeia pesada (Figura 3 (C)). N61 foi, portanto, mutado para alanina para evitar complicações desnecessárias de glicosilação extra; os clones mutantes N61A foram nomeados como 25A1-B2B4AQT e 25A1-B5B6AQT.
[112] 25A1 humanizado, 25A1-B2B4AQT, e 25A1-B5B6AQT, foram, em seguida, produzidos e testados para a inibição da hemólise de hemácias de coelho induzida por toxina α nativa. Em resumo, o sobrenadante da bactéria em fase estacionária de crescimento (cultura durante a noite) foi coletado de cinco cepas clínicas de S. aureus (BAA-1717, BAA-1756, ATCC33592, BAA-42 e Wood 46) e adicionado às hemácias de coelho junto com vários anticorpos anti-AT em toda a faixa de concentração de 0,195 a 25 μg/mL. A porcentagem de inibição da hemólise de hemácias induzida com toxina α recombinante e nativa de cinco cepas testadas é mostrada na Figura 4. Os anticorpos 25A1, 25A1-B2B4AQT e 25A1-B5B6AQT foram capazes de se ligar a toxina α nativa das cepas testadas e exibiram inibição de ~ 50%–90% das várias lises de hemácias mediada por toxina α nativa. Os valores de IC50 de 25A1, 25A1-B2B4AQT e 25A1-B5B6AQT para inibir a hemólise induzida por toxina α recombinante foram 462,3, 442,9 e 304,2 pg/mL; para ATCC33592 foram 1518, 1801 e 1830 ng/mL; para BAA-1756 foram 6913, 7956 e 7322 ng/mL, para Wood46 foram 1299, 1707 e 1537 ng/mL e para BAA-42 foram 860,6, 910,8 e 996,3 ng/mL, sugerindo que 25A1-B2B4AQT e 25A1-B5B6AQT mantiveram a capacidade inibitória comparável ao do 25A1.
[113] S. aureus é uma causa comum de sepse, uma inflamação sistêmica com disfunções de múltiplos órgãos. AT desempenha um papel importante no modelo de sepse, uma vez que mutantes de S. aureus exibem um tempo de morte atrasado e aumentam a sobrevida em um modelo de sepse em camundongo. Portanto, testamos 25A1 quanto à capacidade de proteger camundongos contra a infecção por S. aureus. Como mostrado na Figura 5, foi observada a morte do controle tratado com veículo entre o dia 2 e no dia 5. Em contraste, grupos tratados com 25A1 apresentaram maior taxa de sobrevida; a taxa de sobrevida global para grupos de dose de 50, 25, 10 e 5 mg/kg foi de 83%, 67%, 33% e 50% (Figura 5), estes dados indicaram que a profilaxia com 25A1 fornece proteção contra a infecção por bacteriemia. Em outro modelo de sepse murina estabelecido com a cepa ATCC29213 de S. aureus sensível à meticilina, SYN100 também exibiu proteção como terapia profilática a 100, 50 e 10 mg/kg (Figura 6). Embora com alguma variação entre as diferentes cepas, essas eficácias observadas suportam o uso profilático de SYN100 na sepse e bacteremia por S. aureus.
[114] Uma vez que S. aureus é causa frequente de pneumonia associada à ventilação em pacientes, a eficácia protetora do SYN100 foi avaliada em modelos de pneumonia murina induzida por S. aureus. A infecção foi induzida por desafio intranasal com três isolados clínicos de S. aureus BAA1556 (USA300), SF8300 (USA300) ou NRS261 (USA200) 24 horas após a administração de SYN100. No modelo de pneumonia aguda, a morte do grupo de controle tratado com veículo ocorreu entre 18-20 horas após o desafio. Em contraste, a administração profiláxica de SYN100 resultou em extensão significativa da sobrevivência em todos os três modelos, demonstrando que SYN100 pode fornecer proteção contra diversos isolados clínicos de S. aureus (Figura 7).
[115] Em um experimento subsequente, foi testado como o SYN100 funciona em relação ao tratamento com antibióticos no modelo de pneumonia murino NRS261. A vancomicina é comumente prescrita para tratar infecções por MRSA na clínica; portanto, testamos a eficácia do SYN100 em combinação com o tratamento com vancomicina como padrão de tratamento. Conforme mostrado na Figura 8, nem SYN100 a 10 mg/kg nem a vancomicina até 30 mg/kg aumentaram significativamente a sobrevida dos camundongos. Entretanto, os três grupos de camundongos que receberam SYN100 e vancomicina exibiram sobrevida dependente da dose, o que é altamente indicativo de sinergia entre SYN100 e vancomicina.
[116] Em muitos aspectos, os coelhos são organismos modelo mais adequados para infecções por S. aureus do que os camundongos. Assim, testamos a eficácia de SYN100 em um modelo de pneumonia de coelho estabelecido com uma cepa de MRSA adquirida em hospital, ST20120426. ST20120406 é uma cepa altamente virulenta que secreta quantidades relativamente grandes de toxina α, fazendo com que os animais de controle entrem em colapso em 24 horas. Conforme mostrado na Figura 9, todas as dosagens de SYN100 testadas neste modelo, variando de 25 a 125 mg/kg, forneceram extensão significativa de sobrevivência, representando assim mais uma prova para a utilidade de SYN100 na pneumonia por S. aureus.
[117] O cotratamento de SYN100 com um antibiótico foi adicionalmente explorado no modelo de pneumonia ST20120426 em coelho. Os dados na Figura 10A mostram que o tratamento único com SYN100 a 30 mg/kg e linezolida (LZD) a 50 mg/kg/8h resultou em 56% e 33% de sobrevida global, respectivamente, enquanto o grupo que recebeu SYN100 e LZD teve 89% de sobrevida. Um exame mais aprofundado do tecido pulmonar revelou que apenas o grupo de tratamento combinado tinha reduzido significativamente o inchaço do pulmão, a carga bacteriana, e apareceu mais normal em aparência macroscópica. LZD inibe o início da síntese de proteína em bactérias e foi mostrado como sendo igualmente eficaz como a vancomicina, que é um bloqueador de síntese da parede celular. Em conjunto, estes resultados sugerem que SYN100 complementa as ações de ambos os antibióticos e fornece ainda mais a proteção contra infecções por MRSA em uma forma aditiva ou sinérgica.
[118] Embora a presente divulgação tenha sido descrita em conjunto com os exemplos de realização específicos estabelecidos acima, muitas alternativas e modificações e variações das mesmas serão evidentes para aqueles versados na técnica. Todas essas alternativas, modificações e variações são consideradas como estando dentro do escopo da presente divulgação.
Claims (15)
- ANTICORPO OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DO MESMO que se liga especificamente a um epítopo na toxina α estafilocócica de Staphylococcus aureus ou um fragmento do mesmo; caracterizado por compreender regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de uma região variável de cadeia pesada e regiões determinantes de complementaridade de uma região variável de cadeia leve, em que as regiões determinantes de complementaridade da região variável de cadeia pesada compreendem as regiões CDRH1, CDRH2 e CDRH3 e as regiões determinantes de complementaridade da região variável de cadeia leve compreendem as regiões CDRL1, CDRL2 e CDRL3, e em que:
a região CDRH1 compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo constituído pelas SEQ ID NOs: 1 a 2 ou uma sequência substancialmente semelhante; a região CDRH2 compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo constituído pelas SEQ ID NOs: 3 a 6 e 31 ou uma sequência substancialmente semelhante; a região CDRH3 compreende a sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo constituído pelas SEQ ID NOs: 7 a 9 ou uma sequência substancialmente semelhante; e
a região CDRL1 compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo constituído pelas SEQ ID NOs: 10 a 13 ou uma sequência substancialmente semelhante; a região CDRL2 compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo constituído pelas SEQ ID NOs: 14 a 15 ou uma sequência substancialmente semelhante; a região CDRL3 compreende a sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo constituído pelas SEQ ID NOs: 16 a 18 ou uma sequência substancialmente semelhante. - ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado;
- - pela região CDRH1 compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência substancialmente semelhante; pela região CDRH2 compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou uma sequência substancialmente semelhante; pela região CDRH3 compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 ou uma sequência substancialmente semelhante; e
- - pela região CDRL1 compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 ou uma sequência substancialmente semelhante da mesma; pela região CDRL2 compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 ou uma sequência substancialmente semelhante; pela região CDRL3 compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 ou uma sequência substancialmente semelhante
- ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 ou uma sequência substancialmente semelhante; e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 ou uma sequência substancialmente semelhante.
- ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 21 a 23 ou uma sequência substancialmente semelhante; e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 24 a 26 ou uma sequência substancialmente semelhante.
- ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 ou uma sequência substancialmente semelhante; e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 ou uma sequência substancialmente semelhante.
- ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 ou uma sequência substancialmente semelhante; e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 ou uma sequência substancialmente semelhante.
- ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser um anticorpo de mamífero, anticorpo monoclonal, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado ou anticorpo humano.
- COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, e excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.
- USO DO ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo uso ser para a fabricação de um medicamento para neutralizar a toxina α estafilocócica de Staphylococcus aureus em um sujeito com tal necessidade.
- USO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo anticorpo ligar-se à toxina α com um KD variando de 1 x 10-7 a 1 x 10-10 M.
- USO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo medicamento fornecer imunoterapia passiva no contexto de infecções por S. aureus.
- USO DO ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo uso ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento, tratamento profilático e/ou prevenção de doenças e/ou distúrbios causados por infecção estafilocócica por Staphylococcus aureus em um sujeito com tal necessidade.
- USO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pela doença e/ou distúrbio causado pela infecção por Staphylococcus aureus ser pneumonia.
- MÉTODO PARA DETECTAR TOXINA α DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS em uma amostra, caracterizado por compreender o contato da amostra com o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7
- KIT PARA A DETECÇÃO DE TOXINA α DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS em uma amostra, caracterizado por compreender o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
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