BR102017020789A2 - Produção de ramnolipídeos por fermentação semissólida estática em sistema de difusão controlada de nutrientes - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a um processo de produção de ramnolipídeos por fermentação semissólida estática com sistema de difusão controlada de nutrientes em minirreatores de cubos de ágar. através deste processo pode-se controlar a liberação de nutrientes e indutores de síntese proporcionando grandes incrementos nas taxas de produção, e evitando os efeitos inibitórios acarretados da utilização direta de altas concentrações destes compostos no crescimento microbiano e consequentemente na produção do biossurfactante. este processo ainda evita a formação de espumas e reduz os custos de produção, já que não há gasto excedente de energia para aeração e agitação dos cultivos. a invenção também provê a utilização de indutores de produção de baixo custo como óleo de soja e torta de milho, além da extração e dosagem dos ramnolipídeos produzidos por esta tecnologia.

Description

PRODUÇÃO DE RAMNOLIPÍDEOS POR FERMENTAÇÃO SEMISSÓLIDA ESTÁTICA EM SISTEMA DE DIFUSÃO CONTROLADA DE NUTRIENTES

Campo da Invenção [001] A presente invenção refere-se a um processo de produção de ramnolipídeos por fermentação semissólida estática com sistema de difusão controlada de nutrientes (minirreatores de cubos de ágar). A invenção também provê a utilização de indutores de produção de baixo custo como óleo de soja e torta de milho, além da extração e dosagem dos ramnolipídeos produzidos por esta tecnologia.

Antecedentes da Invenção [002] Os surfactantes são moléculas anfipáticas capazes de reduzir as tensões das interfaces óleo/água e ar/água, através da adsorção sobre as superfícies ou interfaces do sistema. Esses compostos apresentam aplicações em diversos segmentos industriais como na indústria agrícola, alimentícia, farmacêutica, cosmética, produtos de limpeza e de química fina, além de aplicações em processos de biorremediação e aumento de recuperação de óleo (MAIER, R.M.; SOBERÓN-CHÁVEZ, G. Pseudomonas aeruginosa rhamnolipids: biosynthesis and potential applications. Applied Microbiology Biotechnology, v. 54, p. 625-633, 2000). Devido aos efeitos ambientais tóxicos dos surfactantes de origem química, busca-se cada vez mais a substituição destes por surfactantes de origem biológica; os quais apresentam baixa toxicidade e alta biodegradabilidade, além de alta seletividade e atividade específica a temperaturas extremas e pH (LOVAGLIO, R. B.; SILVA, V. L.; FERREIRA, H.; HAUSMANN, R.; CONTIERO, J. Rhamnolipids know-how: Looking for strategies for its industrial dissemination. Biotechnology Advances, v.33, p. 1715-1726, 2015). Dentre os surfactantes de origem biológica encontram-se os ramnolipídeos, que constituem uma importante classe de biossurfactantes, podendo ser produzidos em altas taxas e com excelentes propriedades tensoativas pelo microrganismo Pseudomonas aeruginosa.

[003] Comercialmente, o processo de produção de biossurfactantes ainda não alcançou grande reconhecimento. Os processos biotecnológicos apresentam

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2/12 um custo de produção mais elevado em relação aos processos químicos de produção de surfactantes. A aplicação de procedimentos trabalhosos e os relativos baixos rendimentos obtidos pelas fermentações são os principais causadores da baixa competitividade destes processos (MARCHANT, R.; BANAT, I.M. Microbial biosurfactants: challenges and opportunities for future exploitation Trends in Biotechnology 30, 558-565, 2012). Adicionalmente, a produção de biossurfactantes por fermentação submersa apresenta graves problemas causados pela grande formação de espumas durante as fermentações. A formação de espuma é causada pela presença dos biossurfactantes no meio de cultivo e agravada pelo método de aeração e agitação dos reatores de fermentação submersa.

[004] A formação de espuma acarreta em dificuldades operacionais além de perda de rendimento e produtividade, devido ao arraste de biomassa, nutrientes e do próprio produto de interesse para fora do reator junto da espuma. Duas estratégias básicas vêm sendo empregadas de modo a conter a formação de espuma nos processos fermentativos: utilização de compostos químicos antiespumantes e a contenção física/mecânica da espuma. Todavia a aplicação de tais estratégias pode ocasionar algumas desvantagens. A utilização de antiespumantes, por exemplo, pode provocar reações inibitórias e efeitos tóxicos ao microrganismo, e reduzir a transferência de O2 e CO2 entre as fases líquida e gasosa. Os métodos mecânicos de contenção e recuperação da espuma formada, por sua vez, diminuem a eficiência do processo e encarecem os custos da produção (KRIEGER, N.; CAMILIOS NETO, D.; MITCHELL, D.A. Production of Microbial Biosurfactants by Solid-State Cultivation. Advances in Experimental Medicine and Biology., v.672, p.203 210, 2010).

[005] A patente CN106755031-A refere-se à construção do plasmídeo DJ202 objetivando um aumento na produção de ramnolipídeos por Escherichia coli. Esta síntese baseia-se na inserção do códon otimizado do gene SyrhlA (ramnosiltransferases) em um plasmídeo de expressão pET21a (+) de Escherichia coli, dando origem ao plasmídeo DJ201. A este plasmídeo inserese um fragmento contendo um sítio de ligação de ribossomo (RBS) ligado ao códon otimizado do gene SyrhlB (ramnosiltransferase), originando o plasmídeo

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DJ202. A inserção do fragmento SyrhlA-RBS-SyrhlB, contido no plasmídeo DJ202, em plasmídeos contendo SyrhlC, origina novos plasmídeos que ao serem inseridos na bactéria Escherichia coli juntamente com demais plasmídeos carregando genes importantes para a síntese de ramnolipídeos, propiciam a obtenção de cepa capaz de produzir maiores concentrações deste composto.

[006] A invenção CN106801075-A descreve um método de produção de ramnolipídeos a partir da adição de resíduo de mandioca, sacarificado com celulase, ao meio de fermentação. Os ramnolipídeos foram precipitados com ácido clorídrico (pH 1.6-2.2) e extraídos com acetato de etila (1:1). Os autores relatam uma produção uma produção de 11,49 g/L de ramnolipídeos através da aplicação do método desenvolvido.

[007] O processo CN106591399-A propõe a utilização de um meio de pericito (célula endotelial humana) adicionado de caseinato e ácido glutâmico para a produção de ramnolipídeos. Segundo os autores, este meio apresenta as vantagens de reduzir os riscos à saúde durante o processo de produção, além de ser de fácil operação e possuir baixo custo.

[008] A invenção WO 2016/139127 A1 refere-se ao desenvolvimento de um método mais eficiente de extração de componentes de ramnolipídeos a partir do meio de fermentação. Este método possibilita a extração de pelo menos um tipo de ramnolipídeo a partir de uma mistura desta classe de biossurfactantes por meio de etapas que envolvem a utilização de um suporte inerte de adsorção, solventes orgânicos associados a temperaturas e pressões variadas.

[009] A patente PI0705327-4 (BR1120160272900) descreve o uso de diferentes linhagens de Pseudomonas aeruginosa incluindo um mutante deficiente na biossíntese de poli-hidroxialcanoatos e com capacidade aumentada de produção de ramnolipídeos. Diferentes fontes de carbono derivadas de óleos vegetais e carboidratos foram utilizadas em processo de fermentação submersa em batelada alimentada em reator de fermentação submersa. Os autores relatam uma produção controlada para obtenção de

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4/12 diferentes relações da porção de ramnose com a porção de 3-hidroalcanoatos dos congêneres obtidos.

[010] A invenção BR102013029433-0A2/ US2014/0148588A1/ US9434755B2 refere-se a um método para o isolamento de ramnolipídeos. Este processo relata diferentes formas de se obter ramnolipídeos pré-purificados com reduzido uso de solventes orgânicos. Entre os exemplos utilizados encontramse separações de ramnolipídeos de antiespumante a base de silicone, e também de óleo de girassol, ambos compostos hidrofóbicos contaminantes das fases orgânicas dos diferentes métodos de separação descritos na literatura científica.

[011] O processo BR1120160272900 / WO2015180907A1 descreve a produção de pelo menos um congênere de ramnolipídeo através de bactérias recombinantes (Pseudomonas putida) com atividades aumentadas de pelo menos uma das três enzimas do final da biossíntese dos ramnolipídeos [ie, α/β hidrolase (RhlA), ramnosiltransferase I (RhlB) e ramnosiltransferase II (RhlC)]. Este processo utilizou fontes de carbonos com apenas quatro átomos de carbono (C4) (i.e, butano, 1-butanol, 2-butanol, 1-butanal, butanona ou ácido butírico). Para habilitar estes microrganismos ao metabolismo das referidas fontes, também foram inseridas oxirredutases do tipo mono-oxigenases (AlqG) e álcool desidrogenases (ADH), importantes para o metabolismo de butano e butanol, respectivamente. Os processos descritos foram fermentações submersas em batelada alimentada em reator de fermentação de 300 mL contendo 180 mL de meio de cultivo. Os cultivos foram alimentados com solução de glicose ou com compostos C4 acima citados. Os melhores resultados foram obtidos com 1-butanol, 1,1 g/L de di-ramnolipídeos.

[012] A patente WO2016131801A1 descreve a produção de pelo menos um congênere de ramnolipídeo através de bactérias recombinantes que quando comparadas com as estirpes selvagens apresentam atividade aumentada de pelo menos uma das três enzimas do final da biossíntese dos ramnolipídeos [ie, α/β hidrolase (RhlA), ramnosiltransferase I (RhlB) e ramnosiltransferase II (RhlC)];utilizando fontes de carbonos como alcanos e/ou ácidos alcanóicos de seis a dez átomos de carbono.

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5/12 [013] A patente BR1120130021241 / DE 10 2010 032 484-1 trata da produção de ramnolipídeos através de bactérias recombinantes não patogênicas. Estas bactérias carregam genes homólogos aos genes rhlA, rhlB e rhlC (genes de P. aeruginosa responsáveis pelos passos finais da via síntese) e apresentam aumento de atividade de pelo menos um dos produtos destes referidos genes.

[014] A invenção WO2013041670A1 descreve a produção de ramnolipídeos através de bactérias geneticamente modificadas carregando uma cópia do gene rhlA ou um ortólogo deste, e uma cópia do gene rhlB ou um gene ortólogo, em ambos os casos os genes estão sob o controle de um promotor heterólogo. Esta célula hospedeira é capaz de produzir ramnolipídeos em uma relação molar de mais de 0,18 Cmol de ramnolipídeos por Cmol de substrato.

[015] A invenção WO2016115048A1 descreve diferentes processos de obtenção de composições de ramnolipídeos ou de misturas de ramnolipídeos isoladas por métodos que não utilizam solventes orgânicos. Processos como repouso de 24 a 48 horas do sobrenadante de cultivo seguidos de esterilização por autoclave, filtração e redução com peróxido de hidrogênio estão descritas nesta invenção, assim como precipitação com ácido.

[016] A invenção WO2016/179249A1 trata de um método de fermentação submersa semi-contínua para produção de ramnolipídeos. O processo é caracterizado por fermentações sequenciais em batelada, assim no final de cada fermentação (quatro ou cinco dias) uma fração de pelo menos 70% do meio fermentado é retirado e substituído por meio fresco. Este processo é repetido por aproximadamente um mês. Este processo otimiza a capacidade de utilização do fermentador diminuindo o tempo gasto com limpeza quando comparada a estratégias de batelada e batelada alimentada.

[017] As patentes encontradas descrevem: 1) desenvolvimento de plasmídeo para produção heteróloga de ramnolipídeos; 2) utilização de meios de cultivo de células humanas para produção de ramnolipídeos; 3) aproveitamento de resíduos para obtenção de meios de produção; 4) processos de fermentação submersa, por batelada, batelada alimentada e também por processos semicontínuos; 5) processos de produção controlada para obtenção de diferentes relações da porção de ramnose com a porção de 3-hidroalcanoatos dos

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6/12 congêneres obtidos; 6) processos de obtenção de mutantes a partir de bactérias GRAS (do inglês: Generally Recognized as Safe, que significa substância ou produto que pode ser intencionalmente adicionado a alimentos e não trazem nenhum mal à saúde) e com maior capacidade de produção de ramnolipídeos quando comparado com as respectivas estirpes selvagens; 7) processos de obtenção de mutante de Pseudomonas aeruginosa deficiente na biossíntese de poli-hidroxialcanoatos e com capacidade aumentada de produção de ramnolipídeos; 8) diferentes processos de separação dos ramnolipídeos, sendo que os maiores problemas relatados a serem resolvidos pelas invenções relacionam-se com a separação dos ramnolipídeos de compostos hidrofóbicos como óleos vegetais e antiespumantes a base de silicone. Cada um destes processos apresenta vantagens e também limitações.

[018] O presente invento, por sua vez, refere-se ao desenvolvimento de um processo de produção de ramnolipídeos por Pseudomonas aeruginosa em fermentação semissólida estática com sistema de difusão controlada de nutrientes, minirreatores de cubos de ágar. Através deste processo pode-se evitar a formação de espumas, decorrente da aeração/agitação do sistema, sem diminuir a eficiência do processo ou acarretar em aumento de custo decorrente da aplicação de métodos de contenção de espuma. Além disso, culmina na diminuição dos custos operacionais pela não necessidade de gastos de energia para aeração/agitação dos cultivos. Deste modo este processo apresenta potencial para viabilizar a obtenção biotecnológica de surfactantes.

Sumário da Invenção [019] O objetivo do presente invento é produzir ramnolipídeos por Pseudomonas aeruginosa em fermentações semissólidas estáticas utilizando um sistema de difusão controlada de nutrientes (minirreatores de cubos de ágar). Através deste processo pode-se controlar a liberação de nutrientes e indutores de síntese proporcionando grandes incrementos nas taxas de produção, e evitando os efeitos inibitórios acarretados da utilização direta de altas concentrações destes compostos (nutrientes e indutores) no crescimento microbiano e consequentemente na produção do biossurfactante.

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Adicionalmente, este processo evita a formação de espumas sem diminuir a eficiência do processo, uma vez que, na ausência de aeração e agitação não há formação de espuma. Por fim, apresenta a vantagem de reduzir custos, já que não há gasto excedente de energia com agitação e aeração dos cultivos. Somadas essas vantagens, este processo pode viabilizar a obtenção biotecnológica de surfactantes.

Descrição Detalhada da Invenção [020] A produção de ramnolipídeos por fermentação semissólida estática (FSSE) em minirreatores de ágar (MRA) pode ser definida como uma técnica que envolve um sistema de difusão controlada de nutrientes e uma superfície de adesão para a bactéria. Assim, os minirreatores de ágar apresentam duas funções básicas, (i) servem como suporte para o crescimento bacteriano e (ii) servem como reserva de excedente de nutrientes e indutores de produção.

[021] Os ensaios de fermentação semissólida (FSSE) em minirreatores de ágar [(MRA) - (FSSE-MRA)] foram realizados em frascos Erlenmeyer de 80 mL, contendo volume de 3 - 8 mL de solução de sais (contendo, por litro: 3,0 g KH2PO4; 7,0 g K2HPO4; 0,2 g MgSO4.7H₂O e 1,0 g (NH4)2SO4) adicionada de glicerol 3 - 6 % (v/v). A cada ensaio adicionou-se 50 MRA com área de 0,175 o

0,252 cm³, constituídos por cerca de 320 pL de meio sólido cada, totalizando 16 mL de meio sólido por cultivo. Os diferentes cultivos avaliados variaram quanto à composição dos MRA, sendo estes: (1) ágar 1,5 % em água; (2) ágar

1,5 % (m/v) + solução de sais + glicerol 3 % (v/v) (MSM G3); (3) ágar 1,5 % (m/v) + solução de sais + glicerol 6 % (v/v) (MSM G6); (4) ágar 1,5 % (m/v) + solução de sais + glicerol 3 % (v/v) + torta de milho 5 - 10 % (MSM G3/TM); (5) ágar 1,5 % (m/v) + solução de sais + glicerol 3% (v/v) + torta de milho 5 - 10% + óleo de soja 1 - 5 % (MSM G3/TM+OS).

[022] Os cultivos foram inoculados com volume de 2 - 4 % de inóculo (v/v) e incubados em estufa bacteriológica em temperaturas de 30 a 40°C. Os préinóculos foram realizados em frascos Erlenmeyer contendo meio Luria-Bertani (composição por litro: 10 g NaCl, 10 g triptona e 5 g extrato de levedura), adicionados de 3 a 5 colônias bacterianas obtidas de cultivo em meio LuriaBertani adicionado de 1,5 % (m/v) de ágar.

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8/12 [023] Os cultivos foram interrompidos, após o tempo de cultivo apropriado, e os ramnolipídeos extraídos com 30 - 60 mL de água destilada em agitador orbital a 100 - 300 rpm por 15-60 minutos. Os extratos resultantes foram centrifugados a 8.000 - 12.500 g por 5-10 min, e os sobrenadantes submetidos à extração orgânica com solução de clorofórmio/metanol (CHCl₃:CH₃OH), na proporção de 3:1. As fases orgânicas, recuperadas por meio de funil de separação, foram concentradas em evaporador rotatório e os extratos resultantes solubilizados em água para quantificação indireta dos ramnolipídeos pelo método de fenol-sulfúrico.

[024] As etapas do processo são mostradas na Figura 1, onde as letras representam os produtos e os números representam os processos. O processo 1 é caracterizado pelo inóculo do meio de cultivo (B) a partir do pré-inóculo (A). Na sequência, o meio de cultivo contendo ágar (C) é utilizado no processo 2 para a obtenção dos minirreatores de cubos de ágar (D). O reator experimental (E) é obtido através da transferência de cinquenta unidades de D em um Erlenmeyer de 80 mL mais 5 mL de B, processos 3A e 3B, respectivamente. O produto E adicionado de meio de cultivo inoculado (processo 3B) é incubado em temperatura de 30 ^oC a 40 ^oC por tempo de cultivo de 24 a 216 horas (processo 4A - FSSE-MRA). O produto obtido do processo 4A é submetido às extrações aquosa (4B) e orgânica (5A) [a última utilizando-se uma mistura de clorofórmio/metanol (CHCl₃:CH₃OH, 3:1)]. Os extratos orgânicos são recuperados em funil de separação, e em seguida submetidos a evaporador rotatório (processo 5B) obtendo-se assim um extrato orgânico concentrado de ramnolipídeos (G). O produto G pode ser submetido à dissolução em água (processo 6) obtendo-se H, sendo este utilizado para o processo 7, quantificação indireta dos ramnolipídeos.

[025] A Figura 2 mostra: (A) minirreatores de cubos de ágar (MRA) e (B) fôrma utilizada para obtenção dos cubos. Os MRA mostrados nesta figura o

apresentam área de aproximadamente 0,200 cm³ e volume de cerca de 300 pL de meio sólido. O meio sólido foi composto por ágar 1,5 % (m/v) + solução de sais (contendo, por litro: 3,0 g KH₂PO₄; 7,0 g K₂HPO₄; 0,2 g MgSO₄.7H₂O e 1,0 g (NH₄)₂SO₄) adicionados de glicerol 3 % (v/v).

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9/12 [026] A Figura 3 mostra um “reator experimental” de produção de ramnolipídeos. Frasco Erlenmeyer de 80 mL contendo 50 minirreatores de cubo de ágar (descritos na Figura 2).

[027] A Figura 4 mostra um cultivo feito em “reator experimental” (mostrado na Figura 3). Este cultivo foi realizado através da transferência de 5 mL de meio de cultivo (produto B - Figura 1) inoculado com 2 % (v/v) de inóculo [previamente realizado em frasco Erlenmeyer de 125 mL contendo 30 mL de meio Luria-Bertani (composição por litro: 10 g NaCl, 10 g triptona e 5 g extrato de levedura). O cultivo foi incubado em estufa bacteriológica em temperatura de 37°C por 24 horas.

[028] A produção de ramnolipídeos obtida por três diferentes processos pode ser vista na Figura 5: (1) fermentação submersa [(FSb) - frascos Erlenmeyer de 250 mL contendo 50 mL de meio de cultivo inoculados com P. aeruginosa, incubados a 37 ^oC/200 rpm por 9 dias]; (2) fermentação semissólida estática, em minirreatores de ágar [(FSSE-MRA) - frascos Erlenmeyer de 80 mL contendo 50 minirreatores de cubo de ágar e 5 mL de meio de cultivo, previamente inoculados com P. aeruginosa, incubados a 37 ^oC por 9 dias]; e (3) fermentação semissólida estática, em minirreatores de ágar submersos [(FSSE-MRA-Sub) - frascos Erlenmeyer de 80 mL contendo 50 minirreatores de cubo de ágar e 16 mL de meio de cultivo, previamente inoculados com P. aeruginosa, incubados a 37 ^oC por 9 dias]. A produção de ramnolipídeos é significativamente maior no processo de fermentação semissólida estática em minirreatores de cubos de ágar (p<0,0001 para comparação com ambos os outros processos). A produção neste modelo (FSSE-MRA) além de apresentar uma concentração de ramnolipídeos bem superior ao processo clássico de produção (FSb), ainda apresenta a vantagem de não necessitar de agitação e aeração forçada, o que diminui os custos de produção dos ramnolipídeos, além de evitar a formação de espuma. Adicionalmente, pode se notar que o excesso de meio líquido no processo de fermentação semissólida estática, em minirreatores de cubos de ágar submersos (FSS-MRA-Sub) diminui a produção obtida de ramnolipídeos. Deste modo o processo de FSS-MRA mostrou-se mais promissor.

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10/12 [029] A avaliação da composição dos minirreatores de cubos de ágar pode ser vista na Figura 6. Fermentações semissólidas estáticas, em minirreatores de cubos de ágar [(FSSE-MRA) - frascos Erlenmeyer de 80 mL contendo 50 mini reatores de cubos de ágar e 5 mL de meio de cultivo, previamente inoculados com P. aeruginosa, incubados a 37 ^oC por 9 dias] com diferentes composições: (1) ágar 1,5 % (m/v) em água; (2) ágar 1,5 % (m/v) + solução de sais + glicerol 3 % (v/v) (MSM G3); e (3) ágar 1,5 % (m/v) + solução de sais + glicerol 6 % (v/v) (MSM G6). A presença de meio de cultivo, dentro dos minirreatores, mostrou significativo efeito na produção de ramnolipídeos. A composição (2) ágar 1,5 % (m/v) + solução de sais + glicerol 3 % (v/v) (MSM G3) apresentou uma significativa maior produção do tensoativo [p<0,0001 para comparação tanto com a condição (1) como com a (3)]. O presente resultado sugere que o aumento da produção de ramnolipídeos alcançado com a presença do meio de cultivo, dentro dos minirreatores, esteja relacionado com a possível entrega controlada dos nutrientes contidos neste meio. Adicionalmente, é possível concluir com estes resultados que a concentração de glicerol de 6 % promoveu um efeito inibidor da produção de ramnolipídeos quando comparado a condições MSM G3.

[030] Com o intuito de avaliar a capacidade de entrega controlada de nutriente foram feitos experimentos com adição de torta de milho (subproduto residual sólido proveniente da extração do óleo de milho) e também de óleo de soja ao sistema (Figura 7). Ambos, torta de milho e óleo de soja, apresentam efeito positivo como indutores de produção de ramnolipídeos (CAMILIOS-NETO, D.; BUGAY, C.; SANTANA-FILHO, A. P.; JOSLIN, T.; SOUZA, L.M.; SASSAKI, G.L.; MITCHELL, D.A.; KRIEGER, N. Production of rhamnolipids in solid-state cultivation using a mixture of sugarcane bagasse and corn bran supplemented with glycerol and soybean oil. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 89, p. 1395-1403, 2011). Os resultados sugerem que o sistema de entrega de nutrientes funcionou bem para todas as combinações (Figura 7). Um grande incremento na produção de ramnolipídeos foi alcançado tanto com a adição de torta de milho como com a adição de torta de milho mais óleo de soja, sendo a última bem mais promissora. A produção de ramnolipídeos por fermentações semissólidas estáticas em minirreatores de ágar, contendo os indutores torta

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11/12 de milho e óleo de soja, alcançou concentrações superiores a 50 g/L. O presente processo mostrou-se muito viável atingindo grandes níveis de produção em um sistema não aerado, portanto, não há formação de espuma. Adicionalmente, apresenta uma menor complexidade no processo de separação dos ramnolipídeos, já que os compostos indutores (óleo de soja e torta de milho) estão retidos dentro de cubos de ágar.

[031] Finalmente, para avaliar o efeito da área de superfície de adesão dos minirreatores, foram feitos experimentos comparando a utilização do “reator experimental” (com dezenas de minirreatores de cubos de ágar, mostrado na Figura 3) com reatores experimentais contendo um único minirreator na forma de pastilha [MSM G3 PA e MSM G3/TM+OS PA, Figura 8 (A) e (B), respectivamente]. Para ambas as condições testadas os cubos de ágar apresentaram maior produção de ramnolipídeos do que a pastilha, sugerindo que a área de superfície faz muita diferença na obtenção do produto.

Legenda das Figuras

Figura 1 Modelo esquemático do processo de produção, extração e quantificação de ramnolipídeos obtidos por fermentação semissólida estática em minirreatores de cubos de ágar

Figura 2 Minirreatores de cubos de ágar (A) e fôrma utilizada para obtenção (B) dos minirreatores

Figura 3 Reator experimental de produção de ramnolipídeos

Figura 4 Fermentação semissólida estática em minirreatores de cubos de ágar

Figura 5 Produção de ramnolipídeos obtida por três diferentes processos

FSb, fermentação submersa; FSSE-MRA, fermentação semissólida estática em mini reatores de cubos de ágar; e FSSE-MRA-Sub, fermentação semissólida estática, em minirreatores de cubos de ágar submersos.

Figura 6 Fermentações semissólidas estáticas em minirreatores de cubos de ágar. Avaliação da composição dos reatores.

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12/12 (1) ágar 1,5 % (m/v) em água (água); (2) ágar 1,5 % (m/v) + solução de sais + glicerol 3 % (v/v) (MSM G3); e (3) ágar 1,5 % (m/v) + solução de sais + glicerol 6 % (v/v) (MSM G6).

Figura 7 Fermentações semissólidas estáticas em minirreatores de cubos de ágar. Avaliação da adição de agentes indutores da produção de ramnolipídeos, torta de milho (TM) e óleo de soja (OS).

MSM G3, ágar 1,5 % (m/v) + solução de sais + glicerol 3 % (v/v); MSM G3/TM, ágar

1,5 % (m/v) + solução de sais + glicerol 3 % (v/v) + torta de milho 5 %; e MSM G3/TM+OS, ágar 1,5 % (m/v) + solução de sais + glicerol 3% (v/v) + torta de milho 5 % + óleo de soja 1 %.

Figura 8 Fermentações semissólidas estáticas em minirreatores de cubos de ágar. Avaliação da área de superfície de adesão.

A- MSM G3 (minirreatores de cubos de ágar), ágar 1,5 % (m/v) + solução de sais + glicerol 3 % (v/v); MSM G3-PA (reator único em pastilha), ágar 1,5 % (m/v) + solução de sais + glicerol 3 % (v/v);

B- MSM G3/TM+OS (minirreatores de cubos de ágar), ágar 1,5 % (m/v) + solução de sais + glicerol 3% (v/v) + torta de milho 5 % + óleo de soja 1 %; e MSM G3/TM+OS-PA (reator único em pastilha), ágar 1,5 % (m/v) + solução de sais + glicerol 3% (v/v) + torta de milho 5 % + óleo de soja 1 %.

Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. PRODUÇÃO DE RAMNOLIPÍDEOS POR FERMENTAÇÃO SEMISSÓLIDA ESTÁTICA EM SISTEMA DE DIFUSÃO CONTROLADA DE NUTRIENTES, caracterizada pelo processo de fermentação estática em suporte sólido para obtenção de ramnolipídeos produzidos e excretados por Pseudomonas aeruginosa (FIG. 1)
2. 2. PRODUÇÃO DE RAMNOLIPÍDEOS POR FERMENTAÇÃO SEMISSÓLIDA ESTÁTICA EM SISTEMA DE DIFUSÃO CONTROLADA DE NUTRIENTES, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela utilização de minirreatores de cubos de ágar, como suporte sólido, para obtenção de ramnolipídeos produzidos e excretados por Pseudomonas aeruginosa (FIG 1, FIG 2 e FIG 3)
3. 3. PRODUÇÃO DE RAMNOLIPÍDEOS POR FERMENTAÇÃO SEMISSÓLIDA ESTÁTICA EM SISTEMA DE DIFUSÃO CONTROLADA DE NUTRIENTES, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizada pela utilização de minirreatores de cubos de ágar, como sistema de difusão controlada de nutrientes, para obtenção de ramnolipídeos produzidos e excretados por Pseudomonas aeruginosa (FIG 3, FIG 4, FIG 5 e FIG 6)
4. 4. PRODUÇÃO DE RAMNOLIPÍDEOS POR FERMENTAÇÃO SEMISSÓLIDA ESTÁTICA EM SISTEMA DE DIFUSÃO CONTROLADA DE NUTRIENTES, de acordo com as reivindicações de 1 a 3, caracterizada pela utilização de glicerol como fonte de carbono e indutor de síntese de ramnolipídeos produzidos e excretados por Pseudomonas aeruginosa (FIG 3, FIG 4, FIG 5, FIG 6, FIG 7 e FIG 8)
5. 5. PRODUÇÃO DE RAMNOLIPÍDEOS POR FERMENTAÇÃO SEMISSÓLIDA ESTÁTICA EM SISTEMA DE DIFUSÃO CONTROLADA DE NUTRIENTES, de acordo com as reivindicações de 1 a 4, caracterizada pela utilização de torta de

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   2/3 milho como fonte de carbono e indutor de síntese de ramnolipídeos produzidos e excretados por Pseudomonas aeruginosa (FIG 7 e FIG 8)
6. 6. PRODUÇÃO DE RAMNOLIPÍDEOS POR FERMENTAÇÃO SEMISSÓLIDA ESTÁTICA EM SISTEMA DE DIFUSÃO CONTROLADA DE NUTRIENTES, de acordo com as reivindicações de 1 a 5, caracterizada pela utilização de óleo de soja como fonte de carbono e indutor de síntese de ramnolipídeos produzidos e excretados por Pseudomonas aeruginosa (FIG 7 e FIG 8)
7. 7. PRODUÇÃO DE RAMNOLIPÍDEOS POR FERMENTAÇÃO SEMISSÓLIDA ESTÁTICA EM SISTEMA DE DIFUSÃO CONTROLADA DE NUTRIENTES, de acordo com as reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo processo de extração aquosa dos ramnolipídeos; Este processo é conduzido através da adição de água ao sistema, sendo o conjunto submetido à agitação de 100 a 300 rpm de 15 a 60 minutos em agitador orbital, seguido por centrifugação do extrato aquoso a fim de se obter um extrato aquoso livre de células (FIG. 1)
8. 8. PRODUÇÃO DE RAMNOLIPÍDEOS POR FERMENTAÇÃO SEMISSÓLIDA ESTÁTICA EM SISTEMA DE DIFUSÃO CONTROLADA DE NUTRIENTES, de acordo com as reivindicações de 1 a 7, caracterizado por processo de extração e purificação parcial dos ramnolipídeos, a partir do extrato aquoso livre de células obtido na reivindicação 7, sendo este submetido a extração líquido-líquido com clorofórmio:metanol e recuperação dos ramnolipídeos a partir da fase orgânica (FIG. 1)
9. 9. PRODUÇÃO DE RAMNOLIPÍDEOS POR FERMENTAÇÃO SEMISSÓLIDA ESTÁTICA EM SISTEMA DE DIFUSÃO CONTROLADA DE NUTRIENTES, de acordo com as reivindicações de 1 a 8, caracterizada pelo processo de quantificação dos ramnolipídeos produzidos por fermentação estática em minirreatores de cubos de ágar recuperados na fase orgânica; Uma vez que, o extrato aquoso livre de células apresenta grande quantidade de interferentes; Assim, faz-se necessário a solubilização em água do extrato orgânico recuperado

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   3/3 para a posterior dosagem indireta dos ramnolipídeos por método de açúcares redutores totais (FIG. 1)