BR102015014499A2 - biotransformation process of phenolic compounds of soybean extract in equol and bioactive isoflavones through fermentation and / or enzymatic application, composition thus obtained and use - Google Patents

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Abstract

processo de biotransformação de compostos fenólicos do extrato de soja em equol e isoflavonas bioativas através de fermentação e/ou aplicação enzimatica, composição assim obtido e uso a presente invenção refere-se a um processo de biotransformação de compostos fenólicos de extrato hidrossolúvel de soja em isoflavonas bioativas e equal com alto rendimento e alta produção para aplicação na área biotecnológica, principalmente para a indústria alimentícia como ingrediente alimentar. a invenção foi capaz de biotransformar as formas glicosiladas (daidzina e genistina) das isoflavonas em suas respectivas formas agliconas (daidzeína e genisteína). a hidrólise de isoflavonóides glicosilados pelo processo da presente invenção, bem como a formação de equal, é um inédito por resultar em um processo in vitro para a obtenção deste composto bioativo, sem a presença de bactérias intestinais, utilizando apenas uma biotransformação enzimática.Biotransformation process of soybean extract phenolic compounds in equol and bioactive isoflavones by fermentation and / or enzymatic application, composition thus obtained and use of the present invention relates to a biotransformation process of water soluble soybean extract phenolic compounds in isoflavones bioactive and equal with high yield and high production for biotechnological application, mainly for the food industry as a food ingredient. The invention was able to biotransform the glycosylated forms (daidzine and genistin) of isoflavones into their respective aglycone forms (daidzein and genistein). The hydrolysis of glycosylated isoflavonoids by the process of the present invention, as well as the formation of equal, is unprecedented in that it results in an in vitro process for obtaining this bioactive compound without the presence of intestinal bacteria using only an enzymatic biotransformation.

Description

“PROCESSO DE BIOTRANSFORMAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS DO EXTRATO DE SOJA EM EQUOL E ISOFLAVONAS BIOATIVAS ATRAVÉS DE FERMENTAÇÃO E/OU APLICAÇÃO ENZIMATICA. COMPOSIÇÃO ASSIM OBTIDO E USO" CAMPO DA INVENÇÃO“BIO-TRANSFORMATION PROCESS OF PHENOLIC COMPOUNDS FROM EQUOL SOYA EXTRACT AND BIOACTIVE ISOFLAVONES THROUGH ENZYMATIC FERMENTATION AND / OR APPLICATION. SO OBTAINED COMPOSITION AND USE "FIELD OF INVENTION

[001] A presente invenção refere-se a um processo de biotransformação de compostos fenóiicos de extrato hidrossolúvel de soja em isoflavonas bioativas e equoí com alto rendimento e alta produção: composição assim obtido e uso.[001] The present invention relates to a process of biotransformation of water soluble soybean extract phenolic compounds into high yield, high yield bioactive isoflavones: composition thus obtained and use.

[002] O presente processo tem aplicação na área bíotecnológica, principalmente para a indústria alimentícia, como ingrediente alimentar, e indústria de nutricosméticos e suplementos dietéticos.[002] The present process has application in the biotechnological area, mainly for the food industry, as a food ingredient, and the nutricosmetics and dietary supplements industry.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃOBACKGROUND OF THE INVENTION

[003] A principal aplicação da presente invenção consiste na biotransformação de compostos fenóiicos de extrato hidrossolúvel de soja (EHS) para obtenção de produto rico em compostos bioativos. O propósito é aumentar o conteúdo de isoflavonas bioativas (agliconas) e produzir equol em extrato de soja através da aplicação de culturas iniciadoras e bactérias lácticas probíóticas na fermentação do EHS, aliado à ação do extrato bruto de tanase obtido a partir de Paecilomyces variotti [004] A presente invenção proporciona uma composição sob a forma de um ingrediente alimentício, o qual contém alto teor de isoflavonas bioativas e equol biodisponíveis.[003] The main application of the present invention is the biotransformation of water soluble soybean extract (EHS) phenolic compounds to obtain product rich in bioactive compounds. The purpose is to increase the content of bioactive isoflavones (aglycone) and to produce equol in soybean extract by applying starter cultures and probiotic lactic acid bacteria in the fermentation of EHS, allied to the action of crude tanase extract obtained from Paecilomyces variotti [004] The present invention provides a composition in the form of a food ingredient which contains high bioavailable bioactive isoflavones and equol content.

[005] Outro possível uso é o da bíoatividade do extrato hidrossolúvel de soja antes e após biotransformação com o extrato semipurificado de tanase de P. variotii para modelos anti-inflamatórios e de quimioprevenção, [006] Além disso também é interessante a atuação do extrato semipurificado de tanase de P. variotii em outras classes de flavonoídes glicosílados em alimentos com grande quantidade de flavonoídes na forma glisocílada.Another possible use is the bioactivity of water-soluble soybean extract before and after biotransformation with P. variotii tanase semipurified extract for anti-inflammatory and chemoprevention models. [006] semipurified tannase of P. variotii in other classes of glycosylated flavonoids in foods with large amounts of flavonoids in the glycated form.

[007] O documento de patente US8765445B2 refere-se a um processo empregando cepas de Lactobacillus no processo para produção de produto para consumo direto, ressaltando-se que este processo já se encontra em fase comercial.US8765445B2 relates to a process employing Lactobacillus strains in the process for producing product for direct consumption, it is noted that this process is already in the commercial phase.

[008] O documento de patente W02Q12033150 refere-se â produção de equol por fermentação em meio de fermentação complexo com adição de daizetna em meio gasoso O processo usa a cepa de Streptococcus. Este documento ensina que o uso de hidrogênio na fermentação aumenta a produção de equol. O processo de acordo com este documento é adequado para produção industrial· obtendo-se alto rendimento de isoflavonas.W02Q12033150 relates to the production of equol by fermentation in complex fermentation medium with addition of daizetna in gaseous medium. The process uses the Streptococcus strain. This document teaches that the use of hydrogen in fermentation increases equol production. The process according to this document is suitable for industrial production with high yield of isoflavones.

[009] O documento de patente US20120094336 descreve a produção de equol sem mistura racêmica. por síntese química. Descreve a síntese por catalisadores químicos específicos para produção do isômero preferencial de tipo S.US20120094336 describes the production of equol without racemic mixing. by chemical synthesis. Describes synthesis by specific chemical catalysts for the production of the preferred type S isomer.

[0010] O documento de patente US20110189134 descreve a produção de uma bebida fermentada à base de leite de soja, com adição de Lactobacillus vivos para produzir equol durante o tempo de prateleira íshetf Itfe) do produto. O processo de acordo com os ensinamentos deste documento já se encontra em escala industrial. Destaca-se. ainda, que a adição de ácido ascórbico para a manutenção da produção é descrita, [0011 ] O documento de patente JP2011083273 descreve um processo de produção de isoflavonas de soja e equol por fermentação utilizando Lactoccoccus isolados do produto japonês ekuoru, O processo de acordo com este documento se vale do uso de bactérias lácticas (Lactococcus gatviaes).US20110189134 describes the production of a fermented soy milk-based beverage with the addition of live lactobacillus to produce equol during the shelf life of the product. The process according to the teachings of this document is already on an industrial scale. It stands out. furthermore, that the addition of ascorbic acid to maintain production is described, Patent Document JP2011083273 describes a process for producing soy isoflavones and equol by fermentation using Lactoccoccus isolated from the Japanese ekuoru product. The process according to This document uses lactic acid bacteria (Lactococcus gatviaes).

[0012] O documento de patente US2013231291 descreve a produção de extrato de isoflavonas. equol e lunasil peptideo por fermentação utilizando bactérias lácticas isoladas. O processo de acordo com este documento tem como foco o uso em cosméticos.US2013231291 describes the production of isoflavone extract. equol and lunasil peptide by fermentation using isolated lactic acid bacteria. The process according to this document focuses on the use in cosmetics.

[0013] O documento de patente CN102021130 descreve o uso de Clostndium bifermentans zx-7 para a produção de equol por fermentação.Patent document CN102021130 describes the use of Clostndium bifermentans zx-7 for the production of equol by fermentation.

[0014] O documento de patente TW200712211 revela a produção de equol com uma coleção de microorganismos da flora intestinal encontrados na flora intestinal humana.Patent document TW200712211 discloses equol production with a collection of intestinal flora microorganisms found in the human intestinal flora.

[0015] O documento de patente CN104031875 traz a produção de equol por bactéria modificada geneticamente a partir de Lactococcus.Patent document CN104031875 discloses the production of equol by genetically modified bacteria from Lactococcus.

[0016] Ressalta-se que os processos descritos no estado da técnica sâo, em majoníariameníe baseados em processos fermentatívos, utilizando cepas de Lactobacillus (bactérias entéricas) diferentes, isoladas ou em grupos. Alguns dos documentos fazem a fermentação com os meios de cultivo sintéticos, adicionando o precursor de equol daizeina. outros formulam o meio de cultivo com leite de soja. estratégia também utilizada na presente invenção.It is noteworthy that the processes described in the prior art are mainly based on fermentative processes using different strains of Lactobacillus (enteric bacteria), isolated or in groups. Some of the documents ferment with synthetic culture media by adding the equol daizein precursor. others formulate the culture medium with soy milk. strategy also used in the present invention.

[0017] Já a presente invenção se vale de processos distintos que são diferentes dos anteriormente descritos no estado da técnica. Um deles utiliza uma mistura de Lactobacillus (estratégia também utilizada no estado da técnica), com o diferencial de utilizar uma enzima isolada de fungo à tanase. um efeito técnico novo e inventivo.Already the present invention uses different processes which are different from those previously described in the prior art. One of them uses a mixture of Lactobacillus (strategy also used in the state of the art), with the advantage of using an isolated fungus enzyme to tanase. a new and inventive technical effect.

[0018] Em um dos processos de acordo com a presente invenção utiliza-se somente um tratamento enzímátíco. outro efeito técnico novo e inventivo. Destaca-se que o preparado enzimático de acordo com a presente invenção (de fungo, outro efeito aspecto inovador) não é purificado e possui tanto enzimas conhecidas quanto ainda desconhecidas. Este é um processo novo. não tendo sido encontrado qualquer relato ou sugestão neste sentido no estado da técnica. {0019] A enzima de acordo com a presente invenção foi extraída de fungo GRAS, que pode ser usado em alimentos.In one of the processes according to the present invention only one enzymatic treatment is used. another new and inventive technical effect. It is noteworthy that the enzyme preparation according to the present invention (fungus, other novel aspect effect) is not purified and has both known and unknown enzymes. This is a new process. no report or suggestion to this effect has been found in the state of the art. The enzyme according to the present invention was extracted from GRAS fungus, which can be used in food.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃOBRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0020] O presente invento consistiu no desenvolvimento de processos biotecnológicos in vitro capazes de biotransformar as isoflavonas em suas formas bioativas e aumentar o teor de equol em extrato hidrossolúvel de soja através da fermentação deste substrato por bactérias íníciadoras e bactérias ácido láctícas probióticas e aplicação da enzima tanase. obtida a partir de Paecilomyces variotti; composição assim obtido e uso na industria alimentícia, como ingrediente alimentar, e indústria de nutricosméticos e suplementos dietéticos.[0020] The present invention has been the development of in vitro biotechnological processes capable of biotransforming isoflavones into their bioactive forms and increasing the equol content in water-soluble soybean extract by fermentation of this substrate by probiotic initiatory bacteria and lactic acid bacteria and application of the same. tannase enzyme. obtained from Paecilomyces variotti; composition thus obtained and use in the food industry as a food ingredient and in the nutricosmetics and dietary supplements industry.

[0021] Após os processos de biotransformação. obteve-se um ingrediente alimentar derivado de soja que apresentou grande teor de isoflavonas bioativas e equol, demonstrando, assim, que os processos biotecnológicos desenvolvidos consistiram em estratégias eficientes para melhorar o potencial bioativo do extrato de soja e demonstraram um potencial de aplicação do equol como agente nutracêutico para populações não produtoras deste isofiavonoide. {0022} Produtos à base de soja são uma forma de incluir substâncias bioativas como as isoflavonas na dieta, sendo que o extrato hidrossolúvel de soja (EHS) é um substrato que tem se apresentado com potencial para produção de novos alimentos com apelo saudável. Desse modo, com o propósito de aumentar o conteúdo de isoflavonas bioativas e avaliar a viabilidade de um processo biotecnológico para produção de equol m vitro. foi desenvolvido o processo descrito neste documento, Foi investigada a aplicação de culturas micíadoras e bactérias láctícas probíóticas na fermentação do EHS, aliado à ação do extrato bruto de enzima tanase obtido a partir do fungo Paeciiomyces varíotti. Além disso, também foi avaliada a biotransformação dos compostos fenôlicos e atividade antioxidante do produto obtido, O teor de fenóis totais foi avaliado por metodologia baseada na reação com o reagente de Folin-Ciocalteau. a atividade antioxidante pelos métodos in vítro ORAC e de sequestro de radicais DPPH e a especificidade do extrato semipurifícado de tanase frente aos padrões comerciais de isfolavonas, bem como as alterações no perfil fenólico do extrato hfdrossolúvei de soja foram avaliadas por CLAE-DAD Após o processo fermentativo e/ou tratamento enzímático do extrato hidrossoluvel de soja, houve um significativo aumento no teor de fenólicos totais e capacidade antioxidante. por ambos métodos testados (ORAC e DPPH), quando comparados com o controle de EHS sem reação. Além disso, foi verificada uma modificação no perfil polifenólíco das amostras de EHS biotransformadas obtido por CLAE-DAD. resultando em um aumento na concentração das formas agticonas em relação às glicosiladas. bem como o aumento da concentração de equol após os processos de biotransformação propostos. Os resultados obtidos, indicam que o extrato de tanase de P. variotty foi capaz de biotransformar as formas glicosiladas (daidzina e genistina) das isoflavonas em suas respectivas formas agticonas (daidzeína e genísteína). Pelo que se tem conhecimento, a hídrólíse de isoflavonóides glicosilados por tanase. bem como a formação cie equol, é um relato inédito na literatura demonstrando que é possível desenvolver um processo ín vitro para a obtenção deste composto bioativo. sem a presença de bactérias intestinais, utilizando apenas uma biotransformação enzimática. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 apresenta cromatogramas obtidos por HPLC-DAD da reação dos padrões de isoflavonas glicosiladas (A) daidzina e (B) genistina com extrato semipurifícado de tanase de Paeciiomyces variotii a 40° C por 30 minutos.Following biotransformation processes. A soybean-derived food ingredient was obtained which presented high bioactive isoflavone and equol content, thus demonstrating that the biotechnological processes developed consisted of efficient strategies to improve the bioactive potential of soybean extract and demonstrated a potential for equol application as nutraceutical agent for populations not producing this isophyvonoid. Soy-based products are a way to include bioactive substances such as isoflavones in the diet, and water-soluble soy extract (EHS) is a substrate that has been shown to have the potential to produce novel foods with healthy appeal. Thus, with the purpose of increasing the bioactive isoflavone content and to evaluate the viability of a biotechnological process for in vitro equol production. The process described in this document was developed. The application of mycotic cultures and probiotic lactic acid bacteria in the fermentation of the EHS was investigated, together with the action of the crude enzyme extract tanase obtained from the fungus Paeciiomyces varíotti. In addition, the biotransformation of phenolic compounds and antioxidant activity of the obtained product were also evaluated. The total phenol content was evaluated by a methodology based on the reaction with the Folin-Ciocalteau reagent. antioxidant activity by in vitro ORAC and DPPH radical sequestration methods and the specificity of the semipurified tannase extract against commercial isfolavone standards, as well as changes in the phenolic profile of the soybean soluble extract were evaluated by HPLC-DAD. fermentative and / or enzymatic treatment of water soluble soybean extract, there was a significant increase in the total phenolic content and antioxidant capacity. by both tested methods (ORAC and DPPH), when compared with unresponsive EHS control. In addition, a modification in the polyphenolic profile of biotransformed EHS samples obtained by HPLC-DAD was verified. resulting in an increase in the concentration of agticone forms relative to glycosylated forms. as well as the increase of equol concentration after the proposed biotransformation processes. The results indicate that P. variotty tanase extract was able to biotransform the glycosylated forms (daidzine and genistin) of isoflavones into their respective agticone forms (daidzein and genistine). To the best of our knowledge, the hydrolysis of tanase glycosylated isoflavonoids. as well as equie formation, is an unpublished report in the literature showing that it is possible to develop an in vitro process to obtain this bioactive compound. without the presence of intestinal bacteria, using only enzymatic biotransformation. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS Figure 1 shows HPLC-DAD chromatograms of the reaction of the glycosylated isoflavone (A) daidzine and (B) genistin standards with Paeciiomyces variotii tannase extract at 40 ° C for 30 minutes.

A Figura 2 apresenta cromatogramas obtidos por HPLC-DAD do (A) EHS padrão. (B) EHS fermentado. (C) EHS fermentado reagido com 1.8 U de tannase e (D) EHS padrão reagido com 1,8 U de tannase a 40 C por 30 minutos. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃOFigure 2 shows chromatograms obtained by standard (A) EHS HPLC-DAD. (B) Fermented EHS. (C) fermented EHS reacted with 1.8 U tannase and (D) standard EHS reacted with 1.8 U tannase at 40 C for 30 minutes. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0023] A presente invenção refere-se ao processo de biotransformação de compostos fenólicos do extrato solúvel de soja para obtenção de produto rico em equol e isoflavonas bioativas através de fermentação com bactérias iniciadoras e bactérias ácido lácticas probióticas e aplicação da enzima tanase: composição assim obtido e uso. Para tanto, o processo pode utilizar formas biotransformação que compreendem na aplicação de cepas de bactérias iniciadoras e bactérias ácido lácticas probióticas e/ou reação com a enzima tanase de Paecilomyces variottiem hidrossolúvel de soja, [0024] O processo compreende as etapas descritas a seguir: A, Macerar os grãos de soja íntegros a temperatura ambiente em água destilada {grãos de soja/água; 1:3 p/v); B. Descartar a agua utilizada para maceração; C Adicionar agua destilada: D. Aquecer os grãos em água entre 90 a 110°C. preferencialmente a 1GGC'C. {grãos de soja/água. 1:2 p/v) por 3 a 10 minutos, preferencialmente 5 minutos: E. Adicionar agua destilada F Triturar os gráos de soja com água destilada (grãos de soja/água; 1:4 p/v); G. Centrifugar a massa obtida entre 9000 a 10000 x g. preferencialmente 9630 x g. por 10 a 20 minutos, preferencialmente 15 minutos a temperatura ambiente (±25°C); H. Aquecer o extrato hidrossolúvel de soja (EHS) até ebulição entre 96 °C e 100°C por 10 a 15 minutos, preferencialmente 10 minutos; I Esterilizar por aquecimento a temperatura de 121 C. durante 15 a 20 minutos, preferencialmente 15 minutos: a Manter o extrato hidrossolúvel de soja estéril sob refrigeração a 4 a 12°C. por até 10 dias, ou congelar o extrato a -80°C até sua utilização; J, Realizar os processos de biotransformação do extrato hidrossolúvel de soja que podem ser realizados por qualquer uma das seguintes formas: Processo 1 - Biotransformação fermentativa Bactéria inicíadoras Streptococcus ssp, Thermophilus (YF-L811} e Lactohacillus delbrueckíi ssp, Bulgancus (LB-340) e bactérias ácido lácticas probiótícas Bifkiobacterium animales ssp. Lactis (Bb-12) e Lactobacillus acidophiilus (LA-05); í. Inocular as culturas iniciadoras na concentração de 0.5 - 2% (v/v). preferencialmente 1% (v/v). e de bactérias ácido lácticas probiótícas na concentração de 5 a 15% (v/v), preferencialmente 5% (v/v). e contagem mínima de 106 -10' log UFC/mL e máxima de 1014 log UFC/mL no EHS obtido em (t); e ii. Incubar a solução obtida em (i) entre 30 e 40°C, preferencialmente a 37°C. por 10 a 24 horas, preferencialmente 12 horas, em condições de anaerobiose: Processo 2 - Biotransformação fermentativa seguida por enzimática i, inocularas culturas iniciadoras na concentração de 0.5 - 2% (v/v), preferencialmente 1% (v/v), e de bactérias ácido lácticas probiótícas na concentração de 5 - 15% (v/v). preferencialmente a 5% (v/v), e contagem mínima de 106 -107 tog UFC/mL e máxima de 10’4 log UFC/mL no EHS obtido em (í); ii. Incubar ao EHS com as culturas obtida ein (i) entre 30 e 40°C. preferencialmente a 37°C. por 10 a 24 horas, preferencialmente 12 horas, em condições de anaerobiose: th. Inocular em solução obtida em (tt) com 1 a 5 U de tanase, preferencialmente 1,8 U de tanase. por 1m! de EHS fermentado (íi); iv. Incubar a solução de (iií) entre 35 a 455C. preferencialmente 40°C. por 20 a 50 minutos, preferencialmente 30 minutos: e v. Incubar a solução de (iv) entre -2 a 2°C, preferencialmente 0°C (em banho de gelo) por 10 a 30 min. preferencialmente 15 minutos: Processo 3 - Biotransformação enzimatíca i Inocular em EHS obtida em (!) com 1 a 5 U de tanase, preferencialmente 1,8 U de tanase. por fmf de EHS (l): ii Incubar a solução em (í) entre entre 35 a 455C, preferencíalmente 40°C, por 20 a 50 minutos, preferencíalmente 30 minutos; e ui. Incubar a solução de (ii) entre -2 a 2-C, preferencíalmente 0°C (em banho de gelo) por 10 a 30 min, preferencíalmente 15 minutos: K, Manter o produto EHS com isoflavonas bíoativas e equol congelado a -80°C.[0023] The present invention relates to the biotransformation process of soluble soybean extract phenolic compounds to obtain equol rich product and bioactive isoflavones by fermentation with starter bacteria and probiotic lactic acid bacteria and application of the tanase enzyme: composition as follows: obtained and use. To this end, the process may utilize biotransformation forms comprising application of strains of starter bacteria and probiotic lactic acid bacteria and / or reaction with the water-soluble soybean enzyme Paecilomyces variottiem, The process comprises the following steps: A, Macerate whole soya beans at room temperature in distilled water (soya beans / water; 1: 3 w / v); B. Discard the water used for maceration; C Add distilled water: D. Heat the beans in water at 90 to 110 ° C. preferably at 1GGC'C. {soybeans / water. 1: 2 w / v) for 3 to 10 minutes, preferably 5 minutes: E. Add distilled water F Crush the soy beans with distilled water (soy beans / water; 1: 4 w / v); G. Centrifuge the mass obtained between 9000 to 10000 x g. preferably 9630 x g. for 10 to 20 minutes, preferably 15 minutes at room temperature (± 25 ° C); H. Heat the water-soluble soybean extract (EHS) to boiling at 96 ° C to 100 ° C for 10 to 15 minutes, preferably 10 minutes; I Sterilize by heating at 121 ° C for 15 to 20 minutes, preferably 15 minutes: a Keep the sterile water-soluble soybean extract refrigerated at 4 to 12 ° C. for up to 10 days, or freeze the extract at -80 ° C until use; J, Carry out the water-soluble soybean extract biotransformation processes which may be carried out in any of the following ways: Process 1 - Fermentative biotransformation Starter bacteria Streptococcus ssp, Thermophilus (YF-L811} and Lactohacillus delbruecki ssp, Bulgancus (LB-340) and probiotic lactic acid bacteria Bifkiobacterium animales ssp Lactis (Bb-12) and Lactobacillus acidophiilus (LA-05) I. Inoculate starter cultures at a concentration of 0.5 - 2% (v / v), preferably 1% (v / v) ) and probiotic lactic acid bacteria at a concentration of 5 to 15% (v / v), preferably 5% (v / v), and a minimum count of 106 -10 'log CFU / mL and a maximum of 1014 log CFU / mL (e) Incubate the solution obtained in (i) at 30 to 40 ° C, preferably at 37 ° C for 10 to 24 hours, preferably 12 hours under anaerobic conditions: Fermentative biotransformation followed by enzymatic i, inoculate early cultures concentrations of 0.5 - 2% (v / v), preferably 1% (v / v), and probiotic lactic acid bacteria at a concentration of 5 - 15% (v / v). preferably at 5% (v / v), and a minimum count of 106 -107 tog CFU / mL and a maximum of 10'4 log CFU / mL in the EHS obtained in (i); ii. Incubate to EHS with cultures obtained in (i) at 30 to 40 ° C. preferably at 37 ° C. for 10 to 24 hours, preferably 12 hours, under anaerobic conditions: th. Inoculate in a solution obtained in (tt) with 1 to 5 U tanase, preferably 1.8 U tanase. for 1m! fermented EHS (ii); iv. Incubate the solution of (ii) at 35 to 45 ° C. preferably 40 ° C. for 20 to 50 minutes, preferably 30 minutes: and v. Incubate the solution of (iv) at -2 to 2 ° C, preferably 0 ° C (in an ice bath) for 10 to 30 min. preferably 15 minutes: Process 3 - Enzyme Biotransformation I Inoculate in EHS obtained in (!) with 1 to 5 U tanase, preferably 1.8 U tanase. by incubating EHS (l): ii Incubate the solution in (i) at 35 to 45 ° C, preferably 40 ° C, for 20 to 50 minutes, preferably 30 minutes; and wow. Incubate the solution of (ii) at -2 to 2 ° C, preferably 0 ° C (in an ice bath) for 10 to 30 min, preferably 15 minutes: K, Maintain the EHS product with bioactive isoflavones and frozen equol at -80 ° C. ° C.

[0025] As composições obtidas do processo descrito compreendem as características segundo o tipo de biotransformação conforme a tabela 1 abaixo e têm aplicação na indústria alimentícia, como ingrediente alimentar, e indústria de nutricosméticos e suplementos dietéticos Tabela 1: Composições obtida a partir do processo descrito Exemplificação Preparo do extrato hidrossolúvel de soja [0026] O extrato hidrossolúvel de soja foi preparado de acordo com metodologia descrita por Mandarino e Carrão-Panizzi (1999), Foram utilizados grãos de soja (Glycme max) da marca ‘Natu s ' [0027] O processo pode ser representado pelas etapas a seguir: 1 Macerar os grãos de soja íntegros por 6 horas a temperatura ambiente em água destilada em água destilada (grãos de soja/água; 1:3 p/v), 2 Descartar a agua utilizada para maceração 3, Ferver grãos em água (grãos de soja/água: 1:2 p/v) por cinco minutos. 4. Triturar os grãos de soja com auxílio de liquidificador, com água destilada (grãos de soja/água: 1.4 p/v) por 3 minutos, 5 Centrifugar a massa obtida a 9630 x g por 15 minutos a temperatura ambiente. 6 Aquecer o sobrenadante obtido, conhecido como extrato hidrossolúvel de soja. até ebulição por 10 minutos, 7 Distribuir o extrato de soja em frascos e esterilizar por aquecimento a 121 C durante 15 minutos, 8. Manter o extrato hidrossolúvel de soja estéril sob refrigeração até sua utilização nas análises.The compositions obtained from the process described comprise the characteristics according to the type of biotransformation according to table 1 below and have application in the food industry as a food ingredient, and the nutricosmetics and dietary supplements industry. Table 1: Compositions obtained from the process described Example Water-soluble soybean extract preparation Water-soluble soybean extract was prepared according to the methodology described by Mandarino and Carrão-Panizzi (1999). 'Natu s' soybean grains (Glycme max) were used [0027] The process can be represented by the following steps: 1 Macerate whole soybeans for 6 hours at room temperature in distilled water in distilled water (soybean / water; 1: 3 w / v), 2 Discard the water used for maceration 3, Boil grains in water (soybean / water: 1: 2 w / v) for five minutes. 4. Crush the soybeans with a blender with distilled water (soybean / water: 1.4 w / v) for 3 minutes. 5 Centrifuge the mass obtained at 9630 x g for 15 minutes at room temperature. Heat the obtained supernatant, known as water soluble soy extract. until boiling for 10 minutes. 7 Distribute the soy extract in vials and heat sterilize at 121 ° C for 15 minutes. 8. Keep the water-soluble sterile soy extract refrigerated until use for analysis.

Obtenção de extrato semipurificado de tanase [0028]A enzima tanase (E.C: 3.1 1.20). obtida a partir do microorganismo Paecilomyces vatiotii, como descrito por Battestin e Macedo (2007a). foi utilizada neste estudo.Obtaining Semipurified Tanase Extract The enzyme tanase (E.C: 3.1 1.20). obtained from the microorganism Paecilomyces vatiotii, as described by Battestin and Macedo (2007a). was used in this study.

Este processo pode ser representado pelas etapas a seguir: a) Adicionar, em erlenmeyers de 250 ml. 10 g de farelo de trigo (Naíu s, Hortolândia, Brasil), 10 ml de água destilada e 10% de ácido tânico (p/p) (Tanat B. Prozyn BioSolution. São Paulo, Brasil) b) Esterilizar o meio de cultura a 121°C por 15 minutos. c) Inocular 2,5 ml (5.0x107 esporos/mL) da suspensão de pré-ínócufo em água destilada d) Incubar o meto a 30°C por 120 horas es Adicionar 80 mL de tampão acetato (20 mM. pH 5,0) ao meio f) Agitar o meio a 200 rpm por 1 hora. g; Filtrar a solução final e centrifugar a 9630 x g por 30 minutos a 4°C (Centrífuga Beckman J2-21. Beckman-Coulter, INC Fuilerton. CA. USA). h) Adicionar, ao sobrenadante, sulfato de amônio (Ectbra. Santo Amaro, São Paulo. Brasil) em concentração final de 80% de saturação (561 g/L). í) Manter sob refrigeração por 12 horas a 4°C. js Recolher o precipitado formado por centrifugação a (9630 x g por 30 minutos) e ressuspender o mesmo em água destilada ks Dialtsar por 48 horas em água destilada. l) Congelar a -18 C e liofilizar, em liofilizador de bancada (Líotop L101, Liobras irtd. Com, Serv Liofilizadores Ltda.. São Carlos, São Paulo, Brasil}, durante 24 horas, m) Manter o extrato semipurificado liofilizado a -18°C.This process can be represented by the following steps: a) Add in 250 ml conical flasks. 10 g wheat bran (Naíu s, Hortolândia, Brazil), 10 ml distilled water and 10% tannic acid (w / w) (Tanat B. Prozyn BioSolution. São Paulo, Brazil) b) Sterilize the culture medium at 121 ° C for 15 minutes. c) Inoculate 2.5 ml (5.0x10 7 spores / ml) of the pre-incubate suspension in distilled water d) Incubate the method at 30 ° C for 120 hours and add 80 ml acetate buffer (20 mM. ) to medium f) Stir medium at 200 rpm for 1 hour. g; Filter the final solution and centrifuge at 9630 x g for 30 minutes at 4 ° C (Beckman J2-21 Centrifuge. Beckman-Coulter, INC. Fuilerton. CA. USA). (h) Add to the supernatant ammonium sulphate (Ectbra. Santo Amaro, Sao Paulo. Brazil) at a final concentration of 80% saturation (561 g / l). e) Refrigerate for 12 hours at 4 ° C. Collect the precipitate formed by centrifugation at (9630 x g for 30 minutes) and resuspend it in Dialtsar distilled water for 48 hours in distilled water. l) Freeze at -18 ° C and lyophilize in a bench-top lyophilizer (Líotop L101, Liobras irtd. Com, Serv Liofilizantes Ltda., São Carlos, São Paulo, Brazil} for 24 hours, m) Keep the freeze-dried semipurified extract at - 18 ° C.

Determinação de atividade enzmiática [0029] A medida de atividade enzimática do extrato semipurificado de tanase foi realizada de acordo com metodologia proposta por Battestin & Macedo (2007b). O substrato consistiu em urna solução de ácido tânico (Sigma-Aldrich, Steínhetm. Alemanha) 0.7% (p/v) em tampão acetato (0,2 M, pH 5,5). Para a realização da reação foram seguidos os seguintes passos: a) Adicionar 0,3 mt da solução de substrato a 0.5 ml de extrato de enzima. bs Incubar a 60 C durante 10 minutos. c) Paralisar a reação pela adição de 3 ml de uma solução de albumina de soro bovino (BSA) a 1.0 mg/ml preparada em solução de cloreto de sódio 0,17 M em tampão acetato (0,2 M, pH 5.0), d) Filtrar e centrifugar a solução a 10,070 x g por 15 mm a 4"C. e) Dissolver o precipitado a 3 ml em SDS-triethanoiamina f) Adicionar 1 ml do reagente FeCi3. g) Manter em repouso por 15 minutos para a estabilização da cor. h} Medir a absorbância a 530 nm (Mondai, Banerjee, Jana, & Pati, 2001). 0 Calcular a atividade enzimática por Abs530 = Abscontrole-Absteste.Determination of Enzymatic Activity The measurement of enzymatic activity of the semipurified tanase extract was performed according to the methodology proposed by Battestin & Macedo (2007b). The substrate consisted of a 0.7% (w / v) tannic acid solution (Sigma-Aldrich, Steinhetm. Germany) in acetate buffer (0.2 M, pH 5.5). To carry out the reaction the following steps were followed: a) Add 0.3 mt of substrate solution to 0.5 ml of enzyme extract. bs Incubate at 60 ° C for 10 minutes. (c) Stop the reaction by adding 3 ml of a 1.0 mg / ml bovine serum albumin (BSA) solution prepared in 0.17 M sodium chloride solution in acetate buffer (0.2 M, pH 5.0), d) Filter and centrifuge the solution at 10.070 xg by 15 mm at 4 ° C. e) Dissolve the precipitate to 3 ml in SDS-triethanoylamine. f) Add 1 ml of FeCi3 reagent. g) Rest for 15 minutes for stabilization h} Measure absorbance at 530 nm (Mondai, Banerjee, Jana, & Pati, 2001) 0 Calculate enzymatic activity by Abs530 = Abscontrol-Abstest.

Uma unidade de atividade de tanase foi definida como a quantidade de ácido tânico hidrolisado por 1 mL de enzima por minuto de reação. Biotransformação enzimática dos isoflavonoides [0030] Os padrões comerciais de isoflavonoides genistina, daidzína, gemsteína e daidzeína (Sigma-Aldrich. Steinheim. Alemanha) foram utilizados como substrato para hídrólise enzimática por tanase isolada a partir de Paecilomyces variotti (Battestin & Macedo, 2007a) [0031] Este processo pode ser representado pelas etapas a seguir: a) Dissolver 1 mg dos padrões de isoflavonoidess em 1 ml de tampão fosfato (pH 7,4. 75 mM). b) Incubar a solução com 0.18U de tanase, por 30 minutos a 4°C em banho termostatizado (modelo B12D. Micronal, São Paulo, Brasil), c) Paralisar o processo de hídrólise em banho de gelo por 15 minutos. d) Avaliar, por HPLC-DAD, os produtos finais dos padrões de isoflavonoides.One unit of tanase activity was defined as the amount of hydrolyzed tannic acid per 1 mL enzyme per minute reaction. Enzymatic Biotransformation of Isoflavonoids The commercial patterns of isoflavonoids genistin, daidzine, gemsteine and daidzein (Sigma-Aldrich. Steinheim. Germany) were used as substrate for tanase enzymatic hydrolysis isolated from Paecilomyces variotti (Battestin & Macedo, 2007a) This process can be represented by the following steps: a) Dissolve 1 mg of isoflavonoid standards in 1 ml phosphate buffer (pH 7.4.75 mM). b) Incubate the solution with 0.18U of tanase for 30 minutes at 4 ° C in a thermostated bath (model B12D. Micronal, São Paulo, Brazil); c) Paralyze the hydrolysis process in an ice bath for 15 minutes. d) Evaluate, by HPLC-DAD, the end products of the isoflavonoid standards.

Processos de bíotransformação do extrato hídrossolúvel de soja Processo 1 - Bíotransformação fermentativa [0032] Foram utilizadas culturas comerciais liofilizadas (Chrisíian Hansen Lab, Ind, e Com, lida) de culturas iniciadoras Streptococcus ssp. Thermophitus (YF-1811) e Lactohacíllus delbrueckii ssp, Bulgaricus (LB-340) e bactérias ácido lácticas probióticas Bifídobacterium animales ssp, Lactis (Bb-12) e Lactohacitlus acidophílkis (LA-05). Todas as culturas liofilizadas foram reativadas, individualmente, em extrato hídrossolúvel de soja estéril a 37°C por 12 horas em condições de anaerobíose utilizando uma jarra de anaerobiose. As culturas iniciadoras foram tnoculadas na concentração de 1% (v/v) e as bactérias ácido láctícas probióticas na concentração de 5% (v/v), garantindo uma contagem mínima de 1G6 - 1G7 log UFC/mL (Cruz et ai,, 2013), [0033] A fermentação do extrato hídrossolúvel de soja fermentado foi conduzida de acordo com metodologia tradicional (Tamime e Robinson, 2007) de acordo com as seguintes etapas: a) Inocular, assepticamente. o extrato hídrossolúvel de soja estéril com o conteúdo total de cada cultura bacteriana reativada, b) Incubar o EHS inoculado a 37°C por 24 horas em condições de anaerobiose utilizando uma jarra de anaerobíose.Water soluble soybean extract biotransformation processes Process 1 - Fermentative biotransformation Lyophilized commercial cultures (Chrisíian Hansen Lab, Ind, and Com. Lida) from starter cultures Streptococcus ssp. Thermophitus (YF-1811) and Lactohacillus delbrueckii ssp, Bulgaricus (LB-340) and probiotic lactic acid bacteria Bifídobacterium animales ssp, Lactis (Bb-12) and Lactohacitlus acidophílkis (LA-05). All lyophilized cultures were reactivated individually in sterile water soluble soybean extract at 37 ° C for 12 hours under anaerobic conditions using an anaerobic jar. Starter cultures were inoculated at a concentration of 1% (v / v) and probiotic lactic acid bacteria at a concentration of 5% (v / v), ensuring a minimum count of 1G6 - 1G7 log CFU / mL (Cruz et al. 2013), [0033] Fermentation of fermented water soluble soybean extract was conducted according to traditional methodology (Tamime and Robinson, 2007) according to the following steps: a) Inoculate, aseptically. water soluble soybean extract with the total contents of each reactivated bacterial culture, (b) incubate the inoculated EHS at 37 ° C for 24 hours under anaerobic conditions using an anaerobic jar.

As amostras do EHS fermentado foram avaliadas quanto ao perfil químico (teor de fenóis totais e HPLC) e capacidade antioxidante (ORAC e DPPH) Processo 2 - Bíotransformação fermentativa seguida por enzimática [0034] O EHS fermentado (1 mL) obtido no processo 1, foi inoculado com 1.8 U de tanase, a 40°C por 30 minutos. O processo de hidrólise foi paralisado em banho de gelo por 15 minutos, [0035] As amostras do EHS biotransformadas foram avaliadas quanto ao perfil químico (teor de fenóis totais e HPLC) e capacidade antioxidante (ORAC e DPPH), Processo 3 - Bíotransformação enzimatica [0036] O EHS não fermentado (1 mL) foi inoculado com 1,8 U de tanase, a 40°C por 30 minutos. O processo de hidrólise foi paralisado em banho de gelo por 15 minutos.Fermented EHS samples were evaluated for chemical profile (total phenol content and HPLC) and antioxidant capacity (ORAC and DPPH). Process 2 - Fermentative biotransformation followed by enzymatic [0034] Fermented EHS (1 mL) obtained in process 1, was inoculated with 1.8 U tanase at 40 ° C for 30 minutes. The hydrolysis process was stopped in an ice bath for 15 minutes. Biotransformed EHS samples were evaluated for chemical profile (total phenol content and HPLC) and antioxidant capacity (ORAC and DPPH), Process 3 - Enzymatic Biotransformation. Unfermented EHS (1 mL) was inoculated with 1.8 U tanase at 40 ° C for 30 minutes. The hydrolysis process was stopped in an ice bath for 15 minutes.

[0037] As amostras do EHS bíotransformados foram avaliadas quanto ao perfil químico (teor de fenóis totais e HPLC) e capacidade antioxidante (ORAC e DPPH).Biotransformed EHS samples were evaluated for chemical profile (total phenol content and HPLC) and antioxidant capacity (ORAC and DPPH).

Avaliação do perfil químico Teor de fenólicos totais [0038] O teor de fenólicos totais nas amostras foi determinado com o reagente Folin-Ciocalteu (Dinâmica Química Contemporânea, Brasil) de acordo com o método de Chandier and Doods (1983), com algumas modificações, [0039] Este processo pode ser representado pelas etapas a seguir; a) Diluir uma alíquota de 1 mL das amostras, na proporção de 1:5, com metanol 70%. b) Adicionar 5 mL de água destilada, seguido por 0,5 mL de reagente de Folin-fenol Ciacalteu 1 M (Dinâmica Química Contemporânea, Brasil). c) Agitar as amostras. d) Manter em repouso por 5 minutos. e) Adicionar 1 mL de solução de carbonato de sódio 5% (m/v) ao meio reacional de cada amostra. f) Agitadas e incubar as amostras no escuro a temperatura ambiente por 1 hora. g) Agitar novamente as amostras. h) Realizar leitura das absorbâncias a 725 nm em espectrofotômetro (modelo DU®640, Beckman CoulterTM, EUA).Chemical profile evaluation Total phenolic content The total phenolic content in the samples was determined with the Folin-Ciocalteu reagent (Contemporary Chemical Dynamics, Brazil) according to the method of Chandier and Doods (1983), with some modifications, [0039] This process can be represented by the following steps; a) Dilute 1 mL aliquot 1: 5 with 70% methanol. b) Add 5 mL of distilled water, followed by 0.5 mL of 1 M Folin-phenol Ciacalteu reagent (Contemporary Chemical Dynamics, Brazil). c) Shake the samples. d) Keep at rest for 5 minutes. e) Add 1 ml of 5% (w / v) sodium carbonate solution to the reaction medium of each sample. f) Shake and incubate samples in the dark at room temperature for 1 hour. g) Shake the samples again. h) Take absorbance readings at 725 nm in spectrophotometer (model DU®640, Beckman CoulterTM, USA).

As concentrações de fenólicos totais foram determinadas por comparação de absorbância dasamostras com uma curva de calibração utilizando catequina como padrão. Os resultados foram expressos em pg de catequina por mL de amostra.Total phenolic concentrations were determined by comparing the absorbance of the samples with a calibration curve using catechin as standard. Results were expressed as pg catechin per ml sample.

Análise dos isoflavonoides por HPLCHPLC isoflavonoid analysis

[0040] As isoflavonas glicosídicas (daidzina e genistina), agliconas (daidzeína e genisteína) e equol foram identificados e quantificados em todas as amostras por HPLC-DAD.Glycosidic isoflavones (daidzine and genistine), aglycones (daidzein and genistein) and equol were identified and quantified in all samples by HPLC-DAD.

[0041] A extração dos isoflavonoides das amostras do extrato de soja foi realizada de acordo com metodologia proposta por Aguiar (2003), com modificações de acordo com as seguintes etapas: a) Misturar 1 ml das amostras dos extratos de soja biotransformados com 5 ml de metanol 70% a 25°C, por 60 minutos, a 100 rpm, bi Centrifugar a mistura por 10 minutos a 5790 x g, c) Filtrar o sobrenadante através de urna membrana de 0,45 pm. antes de ser injetado num HPtC de fase invertida, [0042] As condições cromatográficas utilizadas foram previamente descritas por Park et aí. (2001), Foi utilizado o equipamento Dionex Ulitmate 3000 (Alemanha) equipado com uma coluna C18 Atlantis® (Waters, 5 pm, 4,6 x 150 mm) mantida a 30°C. A detecção foi realizada utilizando um detector de arranjo de diodos UVA/tS (DAD-3000). As fases móveis consistiram em água deionízada (solvente A) e metanol (solvente B), O gradiente de eluíção foi o seguinte: 20% B (0-15 min). 20-80% B í15-75mtn). 80-100% B (75-80min), 100-20% B (80-90 min) e 20% B (90-35 min) com vazão de 0,5 mt/min. O volume de injeção de amostra foi de 20 μΐ e todas as amostras foram analisadas em tripiicaía, Os espectros foram obtidos entre 190 e 480 nm e os cromatogramas processados a 254 nm.The extraction of isoflavonoids from soybean extract samples was carried out according to the methodology proposed by Aguiar (2003), with modifications according to the following steps: a) Mix 1 ml of the samples of biotransformed soybean extracts with 5 ml. of 70% methanol at 25 ° C for 60 minutes at 100 rpm, bi Centrifuge the mixture for 10 minutes at 5790 xg, c) Filter the supernatant through a 0.45 pm membrane. before being injected into a reversed phase HPtC, The chromatographic conditions used were previously described by Park et al. (2001), Dionex Ulitmate 3000 equipment (Germany) equipped with a C18 Atlantis® column (Waters, 5 pm, 4.6 x 150 mm) maintained at 30 ° C was used. Detection was performed using a UVA / tS diode array detector (DAD-3000). The mobile phases consisted of deionized water (solvent A) and methanol (solvent B). The elution gradient was as follows: 20% B (0-15 min). 20-80% B (15-75mtn). 80-100% B (75-80min), 100-20% B (80-90 min) and 20% B (90-35 min) with a flow rate of 0.5 mt / min. The sample injection volume was 20 μΐ and all samples were analyzed in tripionic. Spectra were obtained between 190 and 480 nm and the chromatograms processed at 254 nm.

[0043] Os isoflavonoides foram identificados individualmente por comparação dos seus tempos de retenção e o espectro dos seus padrões: daidzina, genistina. daidzeína, genisteina e equol, A quantificação individual dos isfolavonoides foi realizada por integração das áreas dos picos utilizando curvas de calibração que foram estabelecidas no intervalo de concentração de 0,01-1,0 mg/mt dos padrões de isoftavonas e equol. Os resultados foram expressos em pg de cada composto fenólico por mt de amostra.Isoflavonoids were individually identified by comparing their retention times and the spectrum of their patterns: daidzine, genistine. daidzein, genistein and equol. Individual quantification of isfolavonoids was performed by integrating the peak areas using calibration curves that were established within the concentration range of 0.01-1.0 mg / mt of the isoftavone and equol standards. Results were expressed in pg of each phenolic compound per mt of sample.

Atividade antioxidante dos pohfenóis do extrato de soja bsotransformaóo Capacidade de absorção do radical oxigênio (ORAC) [0044] A determinação da capacidade antioxidante pelo método do ORAC foi realizada conforme metodologia descrita por Macedo et al, (2011), utilizando fluoresceína (FL) como sinalizador, O teste automatizado de ORAC foi realizado em leitor de microplacas Fluostar Optima (Fíuostar Optima - Labtech BMG, Alemanha) com filtros de fluorescência para um comprimento de onda de excitação de 485 nm e de emissão de 520 nm As medidas foram realizadas em placas pretas opacas Costar® (Corning Costar Corporation, Cambridge. EUA) com 96 poços.Antioxidant activity of soybean extract polyphenols bsotransformation Oxygen radical absorption capacity (ORAC) [0044] The determination of the antioxidant capacity by the ORAC method was performed according to the methodology described by Macedo et al, (2011), using fluorescein (FL) as Automated ORAC testing was performed on a Fluostar Optima Microplate Reader (Fuostar Optima - Labtech BMG, Germany) with fluorescence filters for an excitation wavelength of 485 nm and emission of 520 nm. Black opaque Costar® (Corning Costar Corporation, Cambridge, USA) with 96 wells.

Antes da reação várias etapas de preparo das soluções devem ser seguidas: a) Decompor, a 37''C, o AAPH (2,2'-azínobiS(2-amidinopropano) dihidroctoreto) em tampão fosfato (75 mM, pH 7,4). Obs tat fato ocorre devido á sensibilidade da FL ao pH. b) Preparar diariamente a solução de FL (70 nM). em tampão de fosfato (PBS) (75 mM. pH 7,4). O Armazenar no escuro. d) Preparar (diariamente) em PBS uma solução de Trolox (6-hidroxe2,5,7,8-tetrametitcromo-2-carboxylic acid) 75 μΜ (utilizada como padrão de referência). e) Construir uma curva padrão de Trolox diluindo a solução de 1.5-1500 pmoi/mL. A reação foi realizada de acordo com as seguintes etapas: a) Diluir 1 mi de cada amostra utilizando metanol 70% na proporção de 1 '5. b) Misturar, em cada poço, 120 pl de solução FL com 20 pL de amostra, branco (PBS) ou solução padrão (Trolox). c) Adicionar 60 pL de AAPH (12 mM).Prior to the reaction several steps of solution preparation should be followed: a) Decompose at 37''C AAPH (2,2'-azinobi (2-amidinopropane) dihydroctoride) in phosphate buffer (75 mM, pH 7.4 ). Note This is due to the sensitivity of FL to pH. b) Prepare the FL solution (70 nM) daily. in phosphate buffer (PBS) (75 mM. pH 7.4). Store in the dark. (d) Prepare (daily) in PBS a solution of Trolox (6-hydrox2,5,7,8-tetramethitro-2-carboxylic acid) 75 μΜ (used as reference standard). e) Construct a standard Trolox curve by diluting the solution to 1.5-1500 pmoi / mL. The reaction was performed according to the following steps: a) Dilute 1 ml of each sample using 70% methanol at a ratio of 1'5. (b) Mix 120 µl of FL solution with 20 µl of sample, blank (PBS) or standard solution (Trolox) in each well. c) Add 60 µl AAPH (12 mM).

d) Realizar, em triplícata e a cada 6 minutos durante 87 minutos, a medida da fluorescência imediatamente após a adição do AAPH (0045] Os valores de ORAC foram definidos como sendo a diferença entre a área sob a curva de decaimento de FL e do branco (net AUC). Equações de regressão entre net AUC e concentração de antioxidantes foram calculadas para todas as amostras. Um controle de tanase foi realizado como uma amostra regular, e o valor de ORAC obtido foi subtraído das amostras tratadas com esta enzima. Os valores de ORAC-FL foram expressos em pmol equivalente de Trolox/L de extrato de soja.d) Perform in triplicate and every 6 minutes for 87 minutes the fluorescence measurement immediately after the addition of AAPH. The ORAC values were defined as the difference between the area under the FL and the decay curve. white (net AUC) Regression equations between net AUC and antioxidant concentration were calculated for all samples A tanase control was performed as a regular sample and the ORAC value obtained was subtracted from the samples treated with this enzyme. ORAC-FL values were expressed as pmol equivalent of Trolox / L soybean extract.

Sequestro dos radicais livres do DPPHDPPH Free Radical Hijacking

[0048] O potencial de atividade antioxidante do extrato hidrossolúvel de soja, fermentado e não fermentado, também foi avaliado pela atividade de sequestro do radical livre estável 1.1 -dífenil-2-picrilhidrazÍÍ (DPPH), como descrito por Macedo et ai. (2011) a) Preparar várias concentrações (0.01-0.1 mg/mL em metanol 70% (v/v)) de amostras testadas, b) Misturar 50 pL das amostras testes com 150 pL de DPPH 0,2 mM em metanol) em placas de 96 poços (BMG LABTECH 98. Alemanha). c) Realizar a leitura em um leitor de microplacas Fíuostar Optima (BMG Fluostar Optima - Labtech, Alemanha) com filtros de absorção para um comprimento de onda de excitação de 520 nm.The antioxidant activity potential of the fermented and unfermented water-soluble soybean extract was also evaluated by stable free radical sequestration activity 1.1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), as described by Macedo et al. (2011) a) Prepare various concentrations (0.01-0.1 mg / mL in 70% (v / v) methanol) of tested samples, b) Mix 50 µL of test samples with 150 µL of 0.2 mM DPPH in methanol) in 96-well plates (BMG LABTECH 98. Germany). c) Read on a Fíostar Optima Microplate Reader (BMG Fluostar Optima - Labtech, Germany) with absorption filters for an excitation wavelength of 520 nm.

[0047] G processo de decaimento da cor das amostras foi registado depois de 90 minutos de reação e comparado com um branco controle; para as amostras de cores e amostras tratadas com tanase, foi realizado um controlo adicional, que continha a solução de extrato (ou solução de tanase) e metanol puro, em vez de DPPH, As soluções foram preparadas e armazenadas no escuro. As medidas foram realizadas em triplicata e a atividade antioxidante foi calculada a partir da equação obtida por regressão linear determinada traçando a atividade antioxidante de soluções padrão de Trolox com concentrações conhecidas, A atividade antioxidante foi expressa em pmol equivalente de Trolox/L de extrato de soja.The color decay process of the samples was recorded after 90 minutes of reaction and compared with a control blank; for color samples and tanase-treated samples, an additional control containing extract solution (or tanase solution) and pure methanol instead of DPPH was performed. The solutions were prepared and stored in the dark. Measurements were performed in triplicate and antioxidant activity was calculated from the equation obtained by linear regression determined by plotting the antioxidant activity of standard Trolox solutions with known concentrations. The antioxidant activity was expressed as pmol equivalent of Trolox / L soybean extract. .

Análises estatísticas [0048] Os resultados foram expressos como médias aritméticas e desvios padrões. A signifícâncía estatística das diferenças entre os grupos foi analisada pelo teste de Tukey. As diferenças foram consideradas significativas quando p <0,05.Statistical analyzes Results were expressed as arithmetic means and standard deviations. Statistical significance of differences between groups was analyzed by Tukey test. Differences were considered significant when p <0.05.

Efeitos dos hioprocessos no teor de fenólicos totais e atividade antioxidante [0049] Os efeitos da fermentação e/ou biotransformação enzimática no teor de fenólicos totais e atividade antioxidante do extrato hidrossolúvel de soja. medida pelos métodos do ORAC e DPPH, estão apresentados na Tabela 2. Diferenças significativas (p <0,05) no teor de fenólicos totais, ORAC e DPPH foram encontradas em todos os bioprocessos.Effects of hyoprocesses on total phenolic content and antioxidant activity The effects of fermentation and / or enzymatic biotransformation on total phenolic content and antioxidant activity of soybean water soluble extract. measured by the ORAC and DPPH methods, are presented in Table 2. Significant differences (p <0.05) in the total phenolic content, ORAC and DPPH were found in all bioprocesses.

Tabela 2 Teor de fenólicos totais e atividade antioxidante (ORAC e DPPH) das amostras do extrato hidrossolúvel de soja antes e após os processos de biotransformação.Table 2 Total phenolic content and antioxidant activity (ORAC and DPPH) of water soluble soybean extract samples before and after biotransformation processes.

Os resultados apresentados são médias (n = 3) ± DP, e aqueles com letras diferentes na mesma coluna são significativamente diferentes, com p < 0,05.The results presented are means (n = 3) ± SD, and those with different letters in the same column are significantly different, with p <0.05.

[0050] Os resultados mostraram que houve um aumento significativo no teor de fenólicos totais para todas as amostras biotransformadas (p <0.05), Após o processo fermentatívo com bactérias ácido láticas (processo 1). o teor de fenólicos totais do extrato hidrossoíúvel de soja aumentou significativamente de 101 para 254 pg catequína/mL, um aumento de cerca de 2,5 vezes comparado com o padrão (EHS não biotransformado). No processo 2. quando analisado a reação do EHS fermentado com a enzima tanase, também foi observado um aumento significativo no teor de fenólicos totais em que o aumento foi cerca de 3.8 vezes (101-387 pg catequina/mL), quando comparado com o padrão, O processo 3 mostrou o maior aumento em conteúdo de fenólicos totais (101-847 pg catequína/mL). aumento de cerca de 8,4 vezes após a reação do EHS com a enzima tanase. Estes resultados sugerem que o processo fermentatívo e de biotransformação enzimática com tanase melhora a liberação de compostos fenólicos do extrato de soja. Além disso, os resultados parecem indicar um maior potencial catalítico da tanase obre os fenólicos do extrato de soja quando comparado â ação fermentativa das bactérias ácido lácticas.The results showed that there was a significant increase in the total phenolic content for all biotransformed samples (p <0.05), following the fermentative process with lactic acid bacteria (process 1). The total phenolic content of the hydrosoluble soybean extract significantly increased from 101 to 254 pg catechin / mL, an increase of about 2.5 times compared to the standard (non-biotransformed EHS). In process 2. when analyzing the reaction of fermented EHS with the enzyme tanase, a significant increase in the total phenolic content was also observed where the increase was about 3.8 fold (101-387 pg catechin / mL) when compared with the By default, Process 3 showed the largest increase in total phenolic content (101-847 pg catechin / mL). about 8.4-fold increase after EHS reaction with the tanase enzyme. These results suggest that the fermentative and tannase enzymatic biotransformation process improves the release of phenolic compounds from soybean extract. Moreover, the results seem to indicate a higher catalytic potential of tannase over soybean extract phenolics when compared to the fermentative action of lactic acid bacteria.

[0051] A atividade antioxidante das amostras, antes e após os très processos de biotransformação do EHS, foi analisada pelos métodos do ORAC e DPPH, in vitro. Os resultados estão descritos na Tabela 2 e expressos em equivalentes de Trolox®. Os resultados demonstraram que houve um aumento significativo na atividade antioxidante das amostras biotransformadas em ambas as metodologias (p<0.05). correlacionando com os resultados encontrados para teor de fenóis totais.The antioxidant activity of the samples, before and after the three EHS biotransformation processes, was analyzed by ORAC and DPPH methods in vitro. Results are described in Table 2 and expressed as equivalents of Trolox®. The results showed that there was a significant increase in the antioxidant activity of biotransformed samples in both methodologies (p <0.05). correlating with the results found for total phenol content.

[0052] Os resultados da tabela 2 indicam que o processo de fermentação do EHS (processo 1) resultou no aumento significativo de cerca de 2.2 vezes na capacidade antioxídante pelo método ORAC e um aumento de aproximadamente 2,1 vezes pelo método de DPPH A fermentação seguida pela biotransformação enzimática (processo 2) levou a um aumento na atividade antioxídante de 2.7 e 5,4 vezes pelos ensaios ORAC e DPPH, respectivamente, Do mesmo modo, na biotransformação do EHS catalisada apenas pela tanase (processo 3). houve um aumento significativo na atividade antioxídante de 4 e 8 vezes por ORAC e DPPH, respectívainente, [0053] A soja e os produtos à base de soja são alimentos nutrícionalmente ricos e possuem vários bioquímicos (isoflavonas. fitoesteróis, saponinas, ácidos fenólicos, ácido fitico e inibidores de tripsma) que possuem propriedades funcionais, antioxidantes e de eliminação de radicais livres (Wardhani, Vázquez. e Pandtellaa, 2010), Os compostos fenólicos de soja apresentam atividade sequestradora de radicais livres (Shon et aL 2007). o que pode explicar a correspondência entre o aumento do teor de fenólicos totais com atividade antioxídante demonstrada na tabela 2.The results from table 2 indicate that the EHS fermentation process (process 1) resulted in a significant increase of about 2.2 times in the antioxidant capacity by the ORAC method and an increase of approximately 2.1 times by the DPPH method. followed by enzymatic biotransformation (process 2) led to a 2.7 and 5.4-fold increase in antioxidant activity by the ORAC and DPPH assays, respectively. Similarly, in the tanase-catalyzed EHS biotransformation (process 3). There has been a significant increase in 4 and 8-fold antioxidant activity by ORAC and DPPH, respectively. [0053] Soy and soy products are nutritionally rich foods and have various biochemicals (isoflavones, phytosterols, saponins, phenolic acids, acid phytochemicals and trypsma inhibitors) that have functional, antioxidant and free radical scavenging properties (Wardhani, Vázquez. and Pandtellaa, 2010). Soybean phenolic compounds exhibit free radical scavenging activity (Shon et al 2007). This may explain the correspondence between the increase in the total phenolic content with antioxidant activity shown in table 2.

[0054] Em resumo, os resultados da presente invenção indicam uma tendência do aumento do teor de fenólicos totais após os três bioprocessos propostos. Tal tendência foi semelhante à observada para a atividade antioxídante, tanto pelo método ORAC quanto peto DPPH, apoiando os resultados obtidos pela biotransformação microbiana e enzimática do EHS.In summary, the results of the present invention indicate a trend towards increased total phenolic content after the three proposed bioprocesses. This trend was similar to that observed for antioxidant activity by both the ORAC and peto DPPH methods, supporting the results obtained by the microbial and enzymatic biotransformation of the EHS.

Perfil das isoflavonas [0055] A concentração de genistina, daidzína, gemsteína, daidzeína e a formação de equol foram avaliadas, antes e após os três processos de biotransformação, utilizando HPLC-DAD (Tabela 3). As isoflavonas e equol foram separados e identificados de acordo com metodologia proposta por Aguiar (2003) Tabela 3. Concentrações dos isômeros de isoflavonas e equol (pg/mL) em extrato hidrossolúvel de soja antes (padrão) e após os processos de biotransformação. * n d. = Não detectado abaixo do limite de detecção para esta metodologia e equipamentos. Os resultados são expressos como média ± desvio padrão (n = 3). A média na mesma coluna com letras diferentes são significatívamente diferentes (p <0,05).Isoflavone Profile The concentration of genistine, daidzine, gemsteine, daidzein and equol formation were evaluated before and after the three biotransformation processes using HPLC-DAD (Table 3). Isoflavones and equol were separated and identified according to the methodology proposed by Aguiar (2003). Table 3. Concentrations of isoflavone and equol isomers (pg / mL) in water-soluble soybean extract before (standard) and after biotransformation processes. * n d. = Not detected below detection limit for this methodology and equipment. Results are expressed as mean ± standard deviation (n = 3). The mean in the same column with different letters is significantly different (p <0.05).

[0056] Os resultados demonstraram que todos os bioprocessos desenvolvidos foram capazes de aumentar significativamente o teor das formas agliconas (daídzeína e genisteína) e equol em extrato hídrossolúvei de soja. Devido à hidrólíse da datdzina e genístina. o conteúdo das suas correspondentes formas agliconas. daídzeína e genisteina. em EHS aumentou após o processo fermentativo e enzímátíco (p <0,05).The results showed that all bioprocesses developed were able to significantly increase the content of the aglycone (daidzein and genistein) and equol forms in soybean water soluble extract. Due to the hydrolysis of datdzine and genistine. the contents of their corresponding aglycone forms. daidzein and genistein. in EHS increased after the fermentative and enzymatic process (p <0.05).

[0057] Como demonstrado na tabela 3. as isoflavonas glicosidícas foram as formas predominantes no EHS padrão e fermentado. No entanto, as concentrações dos glicosídeos genistina e daidzina do EHS fermentado (processo 1) diminuiram cerca de 1,6 e 2 vezes, respectivamente, e as algiconas daídzeína e a genisteina aumentaram cerca de 3.5 e 5 vezes, respectivamente, quando comparado com o EHS padrão. Portanto, estes resultados sugerem que as isoflavonas glicosiladas foram transformadas em formas agliconas corno resultado do processo de fermentação. De acordo com Duenas et al.. (2012) este fato pode ser devido à atividade de β-glicostdase inerente aos microrganismos utilizados no processo fermentativo.As shown in table 3. glycosidic isoflavones were the predominant forms in standard and fermented EHS. However, concentrations of fermented EHS genistine and daidzine glycosides (process 1) decreased by about 1.6 and 2 fold, respectively, and daidzein and genistein algicones increased by 3.5 and 5 fold, respectively, when compared with EHS standard. Therefore, these results suggest that glycosylated isoflavones were transformed into aglycone forms as a result of the fermentation process. According to Duenas et al .. (2012) this fact may be due to the β-glycostdase activity inherent to the microorganisms used in the fermentation process.

[0058] Como pode ser observado na tabela 3, após os processos II e III. as formas glicosídicas (daidzina e genístina) não foram identificadas, mostrando que estas formas foram convertidas em suas respectivas formas agliconas, como mostrado por um aumento significativo nos niveis de daidzeina e genisteína após estes bioprocessos, [0059] As concentrações das formas agliconas do EHS fermentado, após o processo II. aumentaram significativamente cerca de 28 vezes (25,6 - 717.2 mg/mL) para a daidzeína e 25 vezes (10.2- 251,4 tng/mL) para a genisteína, comparado com o EHS padrão. No processo III as formas agliconas aumentaram signifícatfvamente. comparado com o EHS padrão, cerca de 37 vezes (25.6 -944.5 mg/mL) para a daidzeína e 32 vezes (10,2 - 321.6 mg/mL) para a genisteína. Estes resultados indicam que a reação enzimátíca com lanasse (processo III) apresentou o maior aumento das formas bioativas das ísoffavonas. o que também foi observado para os resultados do teor de fenóücos totais e capacidade antioxidante pelos métodos do ORAC e DPPH.As can be seen from table 3, after processes II and III. glycosidic forms (daidzine and genistin) have not been identified, showing that these forms have been converted to their respective aglycone forms, as shown by a significant increase in daidzein and genistein levels following these bioprocesses, [0059] Concentrations of the EHS aglycone forms fermented after process II. increased significantly by 28-fold (25.6 - 717.2 mg / mL) for daidzein and 25-fold (10.2- 251.4 tng / mL) for genistein compared with standard EHS. In process III the aglycone forms increased significantly. compared to the standard EHS, about 37 times (25.6 - 944.5 mg / mL) for daidzein and 32 times (10.2 - 321.6 mg / mL) for genistein. These results indicate that the enzymatic reaction with lanasse (process III) presented the largest increase of the bioactive forms of isoffavones. This was also observed for the results of total phenolic content and antioxidant capacity by ORAC and DPPH methods.

[0060] As isoflavonas agliconas foram reportadas por exibir maior função bioativa do que as formas glicosídicas (Cederroth, e Nef. 2009; Setchetl, 1998). Portanto, as agliconas são as principais responsáveis pela atividade antioxidante de alimentos à base de soja. embora outros componentes da soja, tais como compostos fenólicos também possam contribuir para a capacidade antioxidante em certa medida (Cheng. Lm. e Liu, 2011).Isoflavones aglycones have been reported to exhibit greater bioactive function than glycosidic forms (Cederroth, and Nef. 2009; Setchetl, 1998). Therefore, aglycones are primarily responsible for the antioxidant activity of soy-based foods. although other soy components such as phenolic compounds may also contribute to antioxidant capacity to some extent (Cheng. Lm. and Liu, 2011).

[0061] Portanto, a bioconversão das isoflavonas gicosiladas em suas formas agliconas após os três processos de bíofransformação propostos, provou ser muito eficaz para aumentar a capacidade antioxidante das amostras petos métodos testados, como foi demonstrado com os testes in vitro de atividade antioxidante (ORAC e DPPH), [0062] A habilidade da enzima tanase em biotransformar padrões comerciais de isoflavonas glicosídicas (daidzina e genistma) foi provada em ensaios realizados m vitro. A figura 1 apresenta os cromatogramas obtidos após de 30 minutos de ração, a 40 C. em que padrões comerciais de daidzina (A) e genisteína (B) foram reagidos com com extrato semípurtficado de tanase de P. variotti. Também são apresentados os tempos de retenção e os espectros de absorção dos produtos da reação, {0063} Como mostrado na figura 1, é possível constatar que a reação entre a tanase e os padrões de tsfoiavonas glicosiladas (daidzína e genistma). levou á formação das suas respectivas formas agticonas (A) dadizeina e (B) genisteína. Tal fato pode ser confirmado a partir da similaridade entre o tempo de retenção dos produtos das reações, Estes resultados provam que a tanase é capaz de atuar na hídrólise das ligações glicosídicas das isoflavonas, [0064] Como mostrado na tabela 3, a concentração de equoi após a fermentação do EHS com bactérias do ácido láctico {processo I) levou a um aumento significativo no teor de equot, cerca de 3,9 vezes, No processo II. o tratamento enzimático do EHS fermentado levou a um aumento significativo de cerca de cerca de 7.9 vezes deste composto bioativo, quando comparado ao EHS padrão, No processo III. após o tratamento enzimático do EHS bruto o aumento foi de cerca de 10 vezes, Estes resultados indicam que a tanase de P, variotm apresentou maior ação hidrolítica das isoflavonas glicosiladas em relação ao processo de fermentação e também foi capaz de melhorar o conteúdo de equoi em EHS.Therefore, the bioconversion of glycosylated isoflavones into their aglycone forms after the three proposed bio-transformation processes proved to be very effective in increasing the antioxidant capacity of the samples tested, as demonstrated by the in vitro antioxidant activity tests (ORAC). and DPPH), [0062] The ability of the tanase enzyme to biotransform commercial patterns of glycosidic isoflavones (daidzine and genistma) has been proven in in vitro assays. Figure 1 shows the chromatograms obtained after 30 minutes of ration at 40 ° C in which commercial standards of daidzine (A) and genistein (B) were reacted with P. variotti tanase semi-shortened extract. The retention times and absorption spectra of the reaction products are also shown. {0063} As shown in Figure 1, it can be seen that the reaction between the tanase and the glycosylated tsfoiavone patterns (daidzine and genistma). led to the formation of their respective agticone forms (A) dadizeine and (B) genistein. This fact can be confirmed from the similarity between the retention time of the reaction products. These results prove that the tanase is able to act in the hydrolysis of the isoflavone glycosidic bonds. [0064] As shown in table 3, the concentration of equo after fermentation of EHS with lactic acid bacteria (process I) led to a significant increase in equot content, about 3.9 times, in process II. Enzymatic treatment of fermented EHS led to a significant about 7.9-fold increase in this bioactive compound when compared to standard EHS In process III. After enzymatic treatment of crude EHS the increase was about 10-fold. These results indicate that P, variotm tannase showed higher hydrolytic action of glycosylated isoflavones in relation to the fermentation process and was also able to improve the content of EHS

[0065] A capacidade da tanase em biotransformar as isoflavonas glicosiladas e aumentar o conteúdo de equoi no EHS pode ser confirmada pelos cromatogramas presentes na figura 2, [0066] A figura 2 apresenta o perfil cromatográfico da composição geral dos polifenóís do EHS padrão (A) e do EHS fermentado por bactérias do ácido lácticas (B), bem como para o EHS fermentado (C) e EHS não fermentado (D) tratado com 1,8 U de extrato semi-purificado de tanase.The ability of the tanase to biotransform glycosylated isoflavones and increase the EHS equo content can be confirmed by the chromatograms in Figure 2, Figure 2 shows the chromatographic profile of the overall composition of the standard EHS polyphenols (A ) and EHS fermented by lactic acid bacteria (B), as well as fermented EHS (C) and unfermented EHS (D) treated with 1.8 U semi-purified tannase extract.

[0067] Na figura 2. é possível observar que ambos os processos de fermentação e tratamento enzimático foram capazes de aumentar sígnificativamente o conteúdo de isoflavonas agliconas (daidzeina e genisteína), Além disso, estes bioprocessos levaram á formação de equoi.In Figure 2 it can be seen that both fermentation and enzymatic treatment processes were able to significantly increase the content of isoflavones aglycones (daidzein and genistein). In addition, these bioprocesses led to the formation of equoi.

[0068] Os resultados da tabela 3 demonstraram que a tanase de P variotti foi capaz de sintetizar o equoi a um nível superior quando comparada às cepas microbianas utilizadas no processo de fermentação. Para o melhor do nosso conhecimento, estudos nessa área são raros e há pouca informação sobre a correlação entre a formação equoi e uso de enzimas.The results of table 3 demonstrated that P variotti tannase was able to synthesize equoi at a higher level compared to microbial strains used in the fermentation process. To the best of our knowledge, studies in this area are rare and there is little information on the correlation between equoi formation and enzyme use.

[0069] Também pode-se observar que a ação desta enzima não se limitou a uma deglicosilação da isoflavonas (figura 1). a tanase também foi capaz de aumentar o teor de equol. Estes resultados fazem desta enzima urna opção interessante para aplicação em alimentos à base de soja. com uma composição rica em polifenóis em que a tanase pode agir de diferentes maneiras no processo de biotransformação.It can also be observed that the action of this enzyme was not limited to a deglucosylation of isoflavones (Figure 1). Tanase was also able to increase equol content. These results make this enzyme an interesting option for application in soy foods. with a rich polyphenol composition in which tanase can act in different ways in the biotransformation process.

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Claims (19)

1, Processo de biotransformação enzimática de ssoflavona caracterizado pelo fato de compreender a fermentação de um substrato composto de extrato btdrossolúvel de soja por bactérias tniciadoras e bactérias ácido lácticas probiótícas e/ou de enzima tanase obtida a partir de Paeciíomyces variotti.e as etapas: A. Macerar os grãcs de soja íntegros em água destilada a temperatura ambiente: B. Descartar a agua utilizada para maceração, C. Adicionar agua destilada: D. Aquecer os grãos em água entre 90 a 110°C por 3 a 10 minutos: E. Adicionar agua destilada: F. Triturar os grãos de soja com água destilada: G. Centrifugar a massa obtida entre 9000 a 10OOOg por 10 a 20 minutos, preferenciaimente 15 minutos a temperatura ambiente; H. Aquecer o extrato hidrossolúvel de soja (EHS) até ebulição por entre 10 a 15 minutos; l. Esterilizar por aquecimento a temperatura de 121 °C por 15 a 20 minutos; J Realizar biotransformação: e K Manter o produto EHS com isoflavonas bioativas e equol conservado,1. The enzymatic biotransformation process of ssoflavone comprising the fermentation of a substrate composed of soy soluble extract by toniciator bacteria and probiotic lactic acid bacteria and / or enzyme tanase obtained from Paeciíomyces variotti.e steps: A Macerate the whole soybeans in distilled water at room temperature: B. Discard the water used for maceration, C. Add distilled water: D. Heat the beans in water at 90 to 110 ° C for 3 to 10 minutes: E. Add distilled water: F. Grind the soybeans with distilled water: G. Centrifuge the mass obtained between 9000 to 10000g for 10 to 20 minutes, preferably 15 minutes at room temperature; H. Heat the water soluble soybean extract (EHS) to boiling for 10 to 15 minutes; l. Sterilize by heating at 121 ° C for 15 to 20 minutes; J Perform biotransformation: e K Maintain the EHS product with bioactive isoflavones and conserved equol, 2, Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as bactérias íníciadoras serem Streptococcus ssp Thermophilus (YF-L811) e Lactohacillus clelhrueckti ssp. Bulgaricus (LB-340): e bactérias ácido láctícas probiótícas serem Bifidobacterium animales ssp. Lactis (Bb-12) e Lactobacilíus acidophillus,Process according to Claim 1, characterized in that the initiating bacteria are Streptococcus ssp Thermophilus (YF-L811) and Lactohacillus clelhrueckti ssp. Bulgaricus (LB-340): and probiotic lactic acid bacteria being Bifidobacterium animales ssp. Lactis (Bb-12) and Lactobacillus acidophillus, 3, Processo, de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por na etapa (A) a proporção de peso de grãos de soja e volume de agua ser de 1,3,Process according to Claim 1, characterized in that in step (A) the proportion of soybean weight and volume of water is 1.3, 4, Processo, de acordo com a reivindicação 1. caracterizado por na etapa (D) a proporção de peso de grãos de soja e volume de agua ser de 1:2 e as condições processuais serem 1G0;>C por 5 minutos,Process according to Claim 1, characterized in that in step (D) the ratio of soybean weight to volume of water is 1: 2 and the process conditions are 1G0;> C for 5 minutes, 5, Processo, de acordo com a reivindicação 1. caracterizado por na etapa (F) a proporção de peso de grãos de soja e volume de agua ser de 1:4Process according to Claim 1, characterized in that in step (F) the proportion of soybean weight and volume of water is 1: 4. 6 Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por na etapa (G) a centrifugação ocorrer a 9630 x g por 15 minutos a temperatura de 25°C,Process according to claim 1, characterized in that in step (G) the centrifugation takes place at 9630 x g for 15 minutes at 25 ° C, 7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por na etapa (H) a faixa preferencial de ebulição ser entre 96 e 100°C e tempo de 10 minutos.Process according to Claim 1, characterized in that in step (H) the preferred boiling range is between 96 and 100 ° C and a time of 10 minutes. 8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por na etapa (!) o tempo ser de 15 minutos.Process according to Claim 1, characterized in that in step (!) The time is 15 minutes. 9. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por na etapa (i) compreender opcíonalmente uma subetapa de armazenamento (l.a) em condição estéril do EHS.Process according to Claim 1, characterized in that in step (i) it optionally comprises a sterile EHS storage substep (1a). 10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por na subetapa etapa (l.a) as condições de armazenamento de EHS ser de refrigeração entre 4 a 12°C ou congelamento a -80°C.Process according to Claim 9, characterized in that in the substep step (1a) the EHS storage conditions are refrigerated at 4 to 12 ° C or freezing at -80 ° C. 11. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por na etapa (J) a biotrasnformação ser realizada por Biotransformação fermentativa, Biotransformação fermentativa seguida por enzimática ou Biotransformação enzimática.Process according to Claim 1, characterized in that in step (J) the biotransformation is carried out by fermentative biotransformation, fermentative biotransformation followed by enzymatic or enzymatic biotransformation. 12. Processo, de acordo com a reivindicação 11. caracterizado pela Biotransformação fermentativa ocorrer da seguinte forma: i. Inocular as culturas iniciadoras na concentração de 0.5 - 2% (v/v), preferenciaimente 1% (v/v), e de bactérias ácido láctícas probíótícas na concentração de 5 a 15% (v/v), preferencialmente 5% (v/v), e contagem mínima de 106 - 107 log UFC/mL e máxima de 1014 log UFC/ml no EHS obtido na etapa {i);e ií. incubar a solução obtida em (í) entre 30 e 4Q°C, preferenciaimente a 37°C. por 10 a 24 horas, preferencialmente 12 horas, em condições de anaerobiose,Process according to Claim 11, characterized in that the fermentative biotransformation takes place as follows: i. Inoculate starter cultures at a concentration of 0.5 - 2% (v / v), preferably 1% (v / v), and probiotic lactic acid bacteria at a concentration of 5 to 15% (v / v), preferably 5% (v / v), and a minimum count of 106 - 107 log CFU / mL and a maximum of 1014 log CFU / mL in the EHS obtained in step (i); incubate the solution obtained at (i) at 30 to 40 ° C, preferably at 37 ° C. for 10 to 24 hours, preferably 12 hours, under anaerobic conditions, 13. Processo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pela Biotransformação fermentativa seguida por enzimática ocorrer da seguinte forma: í. Inocular as culturas iniciadoras na concentração de 0.5 - 2% (v/v). preferencialmente 1% (v/v), e de bactérias ácido láctícas probíótícas na concentração de 5 -15% (v/v). preferencialmente a 5% (v/v). e contagem mínima de 106 - 107 log UFC/ml e máxima de 1014 log UFC/ml no EHS obtido na etapa 0); ii. Incubar ao EHS com as culturas obtida em (i) entre 30 e 40°C, preferencialmente a 37°C, por 10 a 24 horas, preferencialmente 12 horas, em condições de anaerobiose; iii. inocular em solução obtida em (ii) com 1 a 5 U de tanase. preferencialmente 1.8 U de tanase, por 1ml de EHS fermentado (ii): iv. Incubar a solução de (iii) entre 35 a 45oC. preferencialmente 40°C. por 20 a 50 minutos, preferencialmente 30 minutos: e v. Incubar a solução de (iv) entre -2 a 2oC. preferencialmente 0°C (em banho de gelo) por 10 a 30 min, preferencialmente 15 minutos:Process according to Claim 11, characterized in that the fermentative biotransformation followed by enzymatic occurs as follows: i. Inoculate starter cultures at a concentration of 0.5 - 2% (v / v). preferably 1% (v / v), and probiotic lactic acid bacteria at a concentration of 5-15% (v / v). preferably at 5% (v / v). and a minimum count of 106 - 107 log CFU / ml and a maximum of 1014 log CFU / ml in EHS obtained in step 0); ii. Incubate the EHS with the cultures obtained at (i) between 30 and 40 ° C, preferably at 37 ° C, for 10 to 24 hours, preferably 12 hours, under anaerobic conditions; iii. inoculate in a solution obtained in (ii) with 1 to 5 U of tanase. preferably 1.8 U tanase per 1 ml fermented EHS (ii): iv. Incubate the solution of (iii) at 35 to 45 ° C. preferably 40 ° C. for 20 to 50 minutes, preferably 30 minutes: and v. Incubate the solution of (iv) at -2 to 2 ° C. preferably 0 ° C (in ice bath) for 10 to 30 min, preferably 15 minutes: 14. Processo, de acordo com a reivindicação 11. caracterizado pela Biotransformação enzimãtica ocorrer da seguinte forma: i. Inocular em EHS obtida em (I) com 1 a 5 U de tanase, preferencialmente 1.8 U de tanase. por 1m! de EHS (I): ii. Incubar a solução em (i) entre entre 35 a 45oC, preferencialmente 40°C, por 20 a 50 minutos, preferencialmente 30 minutos: e iii. Incubar a solução de (ií) entre -2 a 2oC. preferencialmente 0°C (em banho de gelo) por 10 a 30 min. preferencialmente 15 minutos:Process according to Claim 11, characterized in that the enzymatic biotransformation takes place as follows: i. Inoculate in EHS obtained in (I) with 1 to 5 U tanase, preferably 1.8 U tanase. for 1m! of EHS (I): ii. Incubate the solution in (i) at 35 to 45 ° C, preferably 40 ° C, for 20 to 50 minutes, preferably 30 minutes: and iii. Incubate the solution of (ii) at -2 to 2 ° C. preferably 0 ° C (in ice bath) for 10 to 30 min. preferably 15 minutes: 15. Processo, de acordo com a reivindicação 1. caracterizado por na etapa (K) a conservação ocorrer preferencialmente por congelamento a -80CC.Process according to Claim 1, characterized in that in step (K) the preservation preferably takes place by freezing at -80 ° C. 16. Composição caracterizada por ser obtido de acordo o processo descrito nas reivindicações de 1 a 15 e compreender Daidzina na forma aglicona em concentração entre 90 e 948 pg/mL Genisteína na forma aglicona em concentração entre 50 e 323 pg/mL e Equol em concentração entre 0,30 e 0.83 pg/mLComposition according to the process described in claims 1 to 15 and comprising Daidzine in aglycone form at a concentration between 90 and 948 pg / ml. Genistein in aglycone form at a concentration between 50 and 323 pg / ml and Equol in concentration. between 0.30 and 0.83 pg / mL 17. Uso da composição conforme definida na reivindicação 18 caracterizado por ter aplicação em alimentos â base de soja.Use of the composition as defined in claim 18 characterized in that it has application in soy-based foods. 18. Uso da composição conforme definida na reivindicação 18 caracterizado por ser componente de produto nutracêutico,Use of the composition as defined in claim 18 characterized in that it is a nutraceutical product component, 19. Uso da composição conforme definida na reivindicação 18 caracterizado por ter aplicação na indústria alimentícia, como ingrediente alimentar, e indústria de nutncosméticos e suplementos dietéticos.Use of the composition as defined in claim 18 characterized in that it has application in the food industry as a food ingredient and the nutritional and dietary supplement industry.
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