BR102013032129B1 - Método para identificar a presença de um polinucleotídeo de dna doador exógeno inserido dentro de um único locus genômico eucariótico alvo - Google Patents

Método para identificar a presença de um polinucleotídeo de dna doador exógeno inserido dentro de um único locus genômico eucariótico alvo Download PDF

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Abstract

MÉTODOS DE DETECÇÃO DE DNA PARA ATIVIDADE DE NUCLEASE ESPECÍFICA DE SÍTIO. A presente invenção provê métodos para detecção e identificação de eventos de planta que contêm loci genômicos alvo de precisão e plantas e células de planta compreendendo tais loci genômicos alvo. O método pode ser implantado como um processo de alto rendimento utilizado para avaliação da integridade ou rompimento de loci genômicos alvo e opcionalmente para detecção da inserção de um polinucleotídeo de DNA doador nos loci genômicos alvo. Os métodos são prontamente aplicáveis para a identificação de eventos de planta produzidos via um método de direcionamento que resulta do uso de uma nuclease específica de sítio.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] O presente pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente Provisório U.S. No. 61/736856 depositado em 13 de dezembro de 2012. O conteúdo do acima em sua totalidade é aqui incorporado a título de referência.
REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIA ELETRONICAMENTE SUBMETIDA
[002] A cópia oficial da listagem de sequência é submetida eletronicamente via EFS-Web como uma listagem de sequência formatada ASCII com um arquivo nomeado "DNA DETECTION METHOD", criado em 26 de novembro de 2012, e tendo um tamanho de 3.640 bytes e é depositado concomitantemente com o relatório. A listagem de sequência contida neste documento formatado ASCII é parte do relatório e é aqui incorporada a título de referência em sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
[003] A presente invenção refere-se em parte a um método para avaliação de loci genômicos de eventos de planta. Mais particularmente, a presente invenção refere-se em parte a um método de alto rendimento para detecção e identificação de eventos de planta que contêm um rompimento dentro de um loci genômico alvo. Ainda, a presente invenção refere-se em partes a um método de alto rendimento para detecção e identificação de eventos de planta que contêm um polinucleotídeo DNA doador exógeno inserido em loci genômicos alvo. O método é prontamente aplicável para avaliação de eventos de planta produzidos via um método de direcionamento que resulta do uso de uma nuclease específica de sítio.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[004] Modificação de genoma alvo de plantas tem sido um objetivo de longa data e elusivo de ambas as pesquisas aplicada e básica. Métodos e composições para se direcionar a e clivar DNA genômico por nucleases específicas de sítio (Nucleases Dedo de Zinco - ZFNs (Zinc Finger Nucleases), Meganucleases, CRISPRS e TALENS) estão sendo desenvolvidos para atingir este objetivo. Esta clivagem específica de sítio de loci genômicos por ZFNs pode ser usada, por exemplo, para induzir mutagênese alvo, induzir deleções alvo de sequências de DNA celular e facilitar recombinação alvo de um polinucleotídeo DNA doador exógeno dentro de um locus genômico predeterminado. Vide, por exemplo, Publicação de Patente U.S. No. 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; e 20060188987 e Publicação de Patente Internacional No. WO 2007014275, cujos relatórios descritivos são aqui incorporados a título de referência em suas totalidades para todos os propósitos. A Publicação de Patente U.S. No.20080182332 descreve uso de nucleases dedo de zinco não canônicas (ZFNs) para modificação alvo de genomas de planta e a Publicação de Patente U.S. No. 20090205083 descreve modificação alvo mediada por ZFN de um locus genômico de EPSPs de planta. Ainda, Moehle e outros (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104(9): 3055-3060 descreve uso de ZFNs projetadas para adição de gene alvo em um locus genômico especificado. Métodos atuais de direcionamento tipicamente envolvem co-transformação de tecido de planta com um polinucleotídeo DNA doador contendo pelo menos um transgene e uma nuclease específica de sítio (por exemplo, ZFN) que é projetada para se ligar a e clivar um locus genômico específico. O polinucleotídeo DNA doador é estavelmente inserido no locus genômico clivado resultando em adição de gene alvo em um locus genômico especificado.
[005] Infelizmente, frequências relatadas e observadas de modificação genômica alvo indicam que direcionamento de um loci genômico dentro de plantas é relativamente ineficiente. A ineficiência relatada necessita de avaliação de um grande número de eventos de planta para identificar um evento específico contendo os loci genômicos alvo. A maioria das análises de evento de planta atualmente relatadas se apoia em um método analítico único para confirmação do direcionamento, o que pode levar à estimativa sem precisão de frequências de direcionamento e resultados de baixa confiança.
[006] Desta maneira, há uma necessidade na técnica de métodos de avaliação, opcionalmente aplicáveis como métodos de alto rendimento, para a identificação rápida de eventos de planta contendo loci genômicos alvo. Ainda, como inserção de gene alvo ocorre em conjunto com inserção de gene aleatória, métodos de avaliação desejáveis especificamente identificariam direcionamento de loci genômicos dentro de uma base de inserções aleatórias.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[007] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método para identificação da presença de um polinucleotídeo DNA doador inserido em um locus genômico alvo compreendendo amplificação em uma primeira reação de amplificação de uma amostra de DNA genômico compreendendo o locus genômico alvo usando uma primeira pluralidade de oligonucleotídeos que se ligam sob condições de hibridização proximais ao locus genômico alvo para então gerar um primeiro amplicon compreendendo o locus genômico alvo e detecção da presença ou ausência do primeiro amplicon, onde a ausência do primeiro amplicon indica a presença de polinucleotídeo DNA doador dentro do locus genômico alvo.
[008] Em uma modalidade adicional, o método compreende amplificação em uma segunda reação de amplificação da amostra do DNA genômico usando uma segunda pluralidade de oligonucleotídeos que se ligam sob condições de hibridização proximais ao locus genômico alvo e dentro do polinucleotídeo DNA doador para gerar um segundo amplicon compreendendo pelo menos uma poção do locus genômico alvo e pelo menos uma poção do polinucleotídeo DNA doador e detecção da presença ou ausência do segundo amplicon, onde a presença de um produto amplificado indica a presença do polinucleotídeo DNA doador dentro do locus genômico alvo.
[009] Em ainda outra modalidade, o método compreende identificação de um rompimento de um locus genômico de uma pluralidade de células de plantas compreendendo amplificação em uma primeira reação de amplificação de uma amostra de DNA genômico compreendendo o locus genômico rompido usando uma pluralidade de oligonucleotídeo que se ligam sob condições de hibridização proximais ao locus genômico rompido para gerar um primeiro amplicon compreendendo o locus genômico rompido, quantificação dos resultados da primeira reação de amplificação, amplificação em uma segunda reação de amplificação de uma amostra de DNA genômico compreendendo o locus genômico rompido usando uma pluralidade de oligonucleotídeos que se ligam sob condições de hibridização proximais ao locus genômico rompido, para então gerar um segundo amplicon compreendendo o locus genômico rompido, quantificação dos resultados da segunda reação de amplificação e comparação da quantidade das primeira e segunda reações de amplificação, onde a quantidade da primeira reação de amplificação compreende uma quantidade menor de produto amplificado comparado com a segunda reação de amplificação, desta maneira indicando o rompimento de um locus genômico nas primeiras amostras de amplicon.
[010] Em outra modalidade, a invenção descreve um método para identificação de um rompimento de um locus genômico compreendendo amplificação em uma primeira reação de amplificação de uma amostra de DNA genômico compreendendo o locus genômico rompido usando uma pluralidade de oligonucleotídeos que se ligam sob condições de hibridização proximais ao locus genômico rompido para gerar um primeiro amplicon compreendendo o locus genômico rompido e detecção da presença ou ausência do primeiro amplicon, onde a ausência do amplicon indica o rompimento de um locus genômico.
[011] Modalidades adicionais do método incluem quantificação dos resultados da primeira reação de amplificação, quantificação dos resultados da segunda reação de amplificação, comparação dos resultados das primeira e segunda reações de amplificação e determinação da presença ou ausência do polinucleotídeo DNA doador dentro do locus genômico alvo, onde o polinucleotídeo DNA doador é confirmado como inserido no locus genômico alvo se o primeiro amplicon estiver ausente e o segundo amplicon estiver presente.
[012] Como uma modalidade, a primeira ou segunda reação de amplificação é realizada em um tubo ou cavidade única em um formato multiplex.
[013] Em outro aspecto, uma modalidade da invenção inclui quantificação dos resultados das primeira e segunda reações de amplificação compreendendo produção de um perfil de assinatura para uma ou ambas as primeira e segunda reações de amplificação. Em um aspecto exemplar da modalidade, o perfil de assinatura pode ser selecionado do grupo consistindo em um perfil de assinatura de curva de temperatura de fusão e um perfil de assinatura de fluorescência.
[014] Modalidades adicionais incluem um perfil de assinatura produzido a partir de um corante de DNA de intercalação ou um corante fluorescente. Onde o corante de intercalação compreende um corante cianida tal como corante SYTO13®. Como uma modalidade, o corante SYTO13® é usado em uma reação de amplificação em uma concentração de menos de 10 μM, menos de 4 μM ou menos de 2,7 μM. Em modalidades adicionais, o corante fluorescente é selecionado do grupo consistindo em um corante fluorescente HEX, um corante fluorescente FAM, um corante fluorescente JOE, um corante fluorescente TET, um corante fluorescente Cy 3, um corante fluorescente Cy 3.5, um corante fluorescente Cy 5, um corante fluorescente Cy 5.5, um corante fluorescente Cy 7 e um corante fluorescente ROX. Em uma modalidade a primeira ou a segunda pluralidade dos oligonucleotídeos, ou ambas, compreende um corante fluorescente.
[015] Em modalidades, a presente invenção refere-se a métodos e composições para identificação da presença de uma inserção de doador em um locus genômico alvo e seleção de um evento transgênico compreendendo uma inserção de doador em um locus genômico alvo. Uma modalidade adicional inclui a planta compreendendo o evento transgênico.
[016] Modalidades adicionais podem compreender uma planta dicotiledônea, onde a planta dicotiledônea é selecionada do grupo consistindo em uma planta de soja, uma planta de canola e uma planta de algodão. Ainda, modalidades adicionais podem compreender uma planta monocotiledônea, onde a planta monocotiledônea é selecionada do grupo consistindo em uma planta de milho, uma planta de arroz e planta de trigo.
[017] Modalidades adicionais incluem um locus transgênico que é clivado por uma nuclease específica de sítio. Nucleases específicas de sítio exemplares podem compreender uma Nuclease Dedo de Zinco, uma Meganuclease, CRISPR ou uma nuclease TALEN ou qualquer outra nuclease específica de sítio.
[018] Em outro aspecto, as modalidades da invenção incluem uma reação de amplificação, onde a amplificação é completada usando uma reação em cadeia da polimerase.
[019] Modalidades adicionais da invenção incluem um amplicon compreendendo uma junção 5’ e uma junção 3’ do polinucleotídeo doador e do locus genômico alvo. Ainda, as modalidades da invenção incluem um amplicon compreendendo uma junção 5’ ou uma junção 3’ do polinucleotídeo DNA doador e do locus genômico alvo.
[020] As modalidades também incluem um polinucleotídeo DNA doador compreendendo pelo menos um cassete de expressão de gene.
[021] Em adição aos aspectos e modalidades exemplares descritos acima, aspectos e modalidades adicionais se tornarão aparentes através do estudo das descrições que seguem.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[022] A Figura 1 ilustra um processo analítico para identificação de eventos de planta compreendendo um locus genômico alvo.
[023] A Figura 2 mostra os resultados de um ensaio de rompimento por PCR quantitativa (qPCR) (quantitative PCR) de ZFN em um locus alvo: resultados de avaliação de um subconjunto de eventos. A seta indica um evento transgênico com um locus rompido conforme evidenciado por queda em sinal de qPCR detectável.
[024] A Figura 3 mostra a avaliação que é completada com o processo de amplificação por PCR In-Out. A Figura 3A mostra um locus genômico alvo ("Locus") sem nenhuma inserção de transgene. PCR In- Out não vai resultar em nenhum produto amplificado. A Figura 3B mostra o Locus com inserção de transgene alvo. PCR In-Out vai resultar em um amplicon de 2 kb da extremidade 5’ do locus e um amplicon de 1,5 kb da extremidade 3’.
[025] A Figura 4 mostra uma análise de PCR In-Out. A Figura 4A mostra um perfil de assinatura de sinal de fluorescência gerado a partir de reações de amplificação usando corante SYTO13® (Invitrogen, Carlsbad, CA), que pode ser usado para identificar eventos de inserção de transgene positivos. A Figura 4B mostra perfis de assinatura de temperatura de fusão geados a partir de reações de amplificação de amostras comparado com um controle positivo, que pode ser usado para confirmar os sinais de fluorescência positivos.
[026] A Figura 5 mostra eventos alvo que foram identificados usando o ensaio de rompimento e a reação de PCR In-Out da matéria objeto descrita aqui.
[027] A Figura 6 mostra um ensaio de rompimento de ZFN. Amostras mostradas no colchete superior não contêm um locus genômico rompido e as amostras mostradas no colchete inferior contêm um locus genômico rompido.
[028] A Figura 7 mostra outro ensaio de rompimento de ZFN. As amostras mostradas no colchete superior não contêm um locus genômico rompido e as amostras mostradas no colchete inferior contêm um locus genômico rompido.
[029] A Figura 8 mostra um ensaio de rompimento eZFN na região de locus de ELP. A Figura 8 (a) provê uma ilustração do fragmento genômico contendo o ELP que foi produzido através da integração de uma fita T de pDAB105818. Este esquema identifica a localização relativa de iniciadores e sondas (MAS621, MAS622 e sonda UPL67) usados para o ensaio de rompimento. A Figura 8 (b) provê os resultados de avaliação de 354 eventos positivos para pat. Um locus de ELP rompido é indicado pela queda em sinal de qPCR detectável. Desta maneira, amostras mostradas no colchete superior não contêm um locus genômico de ELP rompido e amostras mostradas no colchete inferior contêm um locus genômico de ELP rompido.
[030] A Figura 9 mostra uma análise de PCR In-Out. A Figura 9A mostra um perfil de sinal de temperatura de fusão gerado a partir das reações de amplificação da junção de doador 5’/ locus de ELP usando corante SYTO13® (Invitrogen, Carlsbad, CA), que pode ser usado para identificar eventos de inserção de transgene positivos. A Figura 9B mostra um perfil de sinal de temperatura de fusão gerado a partir de reações de amplificação da junção de doador 3’/ locus de ELP usando corante SYTO13® (Invitrogen, Carlsbad, CA), que pode ser usado para identificar eventos de inserção de transgene positivos.
[031] A Figura 10 provê uma ilustração de sequências de ligação de ZF com sondas de dedo de zinco e hidrólise correspondentes para uso no ensaio de rompimento de locus de ELP: a linhagem eZFN8 representa a sonda para detecção de atividades de eZF8 com GTGAGA espaçador entre as sequências de sítio de ligação, SBS15590 e SBS18473; e a linhagem eZFN1 representa a sonda para detecção de atividades de eZFN1 com GTGGAT espaçador entre o segundo conjunto de sequências de sítio de ligação, SBS15590 e SBS8196. A sequência superior é provida como SEQ ID NO:39 e a sequência complementar mostrada na parte inferior da figura é provida como SEQ ID NO:40.
[032] A Figura 11 ilustra um gráfico de sobreposição aad-1 normalizado (em círculos) e número de cópia de ELP (em sinais de adição). A Figura 11 (a) mostra os resultados de ensaio de rompimento de 1125 amostras cruzadas com extratores de eZFN1: 425 com número de cópia de ELP de menos de 0,05 (cortada), 95 entre 0,05 a 0,4 (quimérico). A Figura 11 (b) mostra os resultados do ensaio de rompimento de 697 amostras cruzadas com extratores de eZFN8: 488 com número de cópia de ELP de menos de 0,05, 1 entre 0,05 a 0,4.
[033] A Figura 12 provê um alinhamento de sequência para amostras de locus genômico de ELP cortadas com eZFN1 (pDAB105825) e eZFN8 (pDAB105828). Espaçadores de nucleotídeo entre sítios de reconhecimento de ZFN são indicados em caixas vermelhas. As bases mostradas como travessões ( - ) são deleções representando um mínimo de uma base faltante da sequência.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[034] Foram agora desenvolvidos novos métodos para avaliação, identificação e caracterização rápidas de eventos de planta direcionados à nuclease específica. Os métodos podem ser usados para analisar a integridade do locus alvo genômico via uma primeira reação de amplificação para determinar se o locus alvo genômico foi rompido. Eventos que são identificados conter um locus genômico rompido podem ser subsequentemente avaliados via uma segunda reação de amplificação para confirmar a presença de um polinucleotídeo DNA doador exógeno dentro do locus genômico alvo. Desta maneira, números grandes de eventos de planta podem ser analisados e avaliados para identificar e selecionar eventos específicos que têm um polinucleotídeo DNA doador inserido em um locus genômico alvo. A matéria objeto descrita aqui inclui ainda plantas e células de planta compreendendo eventos de planta direcionados à nuclease selecionados utilizando os novos métodos de avaliação.
[035] São demonstrados aqui novos métodos para avaliação de eventos de planta quanto ao rompimento de locus genômicos, que é um resultado de clivagem de DNA genômico por uma nuclease específica de sítio. O locus genômico rompido pode compreender a presença de um polinucleotídeo DNA doador ou o locus genômico rompido pode compreender inserções e/ deleções (também descritas como InDels). Os métodos utilizam duas reações de amplificação iniciais como um ensaio de avaliação. A primeira reação de amplificação é um ensaio de rompimento, onde a presença de um polinucleotídeo DNA doador inserido em um locus genômico alvo é identificada por uma reação de amplificação onde a ausência de um amplicon indica que um polinucleotídeo DNA doador está presente dentro do locus genômico alvo. A segunda reação de amplificação é uma reação de amplificação por PCR "In-Out" para avaliação das sequências de junção 3’ e/ 5’ de um locus genômico alvo de polinucleotídeo DNA doador. A presença de um produto amplificado que contém a sequência da junção 3’ e/ou 5’ indica que o polinucleotídeo DNA doador está presente dentro do locus genômico alvo.
[036] Ao implantar dois ensaios de avaliação de reação por amplificação distintos, a reação de amplificação de rompimento e a reação de amplificação por In-Out, a probabilidade de identificar um evento alvo positivo a partir do grande número de eventos não alvo é muito aumentada. A reação de amplificação por rompimento foi projetada para permitir análise rápida de um grande número de amostras de uma maneira de alto rendimento. Ainda, este ensaio pode identificar e caracterizar eventos para inserção de polinucleotídeo DNA doador ou clivagem de ZFN dentro de um locus genômico alvo. A reação de amplificação por In-Out provê uma abordagem analítica alternativa. Este ensaio é usado para identificar a presença das junções 3’ e 5’ para confirmar a presença de um polinucleotídeo DNA doador inserido em um locus genômico alvo. A reação por amplificação In-Out pode ser usada para confirmar que os eventos alvo identificados no ensaio de rompimento realmente contêm uma inserção alvo de comprimento integral, completa, dentro de um locus genômico. Quando a reação de amplificação por rompimento é realizada em conjunto com a reação de amplificação por In-Out, os dados compilados podem ser analisados para determinar os fatores limitantes para direcionamento de um polinucleotídeo DNA doador dentro de um locus genômico (por exemplo, clivagem de ZFN ou inserção de doador como um fator limitante para produção de eventos contendo um polinucleotídeo DNA doador dentro de um locus genômico alvo). Utilização de dois ensaios de avaliação diferentes com metodologias variáveis aumenta a probabilidade de encontrar um evento alvo que contém um polinucleotídeo DNA doador dentro de um locus genômico alvo. Além disso, os métodos revelados podem ser empregados como ensaios de alto rendimento que permitem identificação rápida e eficiente de um subconjunto de amostras que podem ser analisadas adicionalmente através de outros métodos de confirmação molecular. Os ensaios de avaliação descritos descrevem processos de alto rendimento, alta qualidade, para identificação e obtenção de eventos de inserção de transgene alvo. Ainda, a metodologia é prontamente aplicável para a análise de qualquer espécie de planta.
[037] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado que aquele conhecido por um versado comum na técnica à qual a presente invenção se refere. Em caso de conflito, o presente pedido incluindo as definições vão prevalecer. A menos que de outro modo requerido pelo contexto, todos os termos no singular devem incluir pluralidades e termos no plural deve incluir o singular. Todas as publicações, patentes e outras referências mencionadas aqui são incorporadas a título de referência em suas totalidades para todos os propósitos como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado ser incorporado a título de referência, a menos que apenas seções específicas de patente ou publicações de patente sejam indicadas ser incorporadas a título de referência.
[038] A fim de esclarecer mais a presente invenção, os termos, abreviações e definições que seguem são providos.
[039] Conforme aqui usado, os termos "compreende", "compreendendo", "inclui", "incluindo", "tem", "tendo", "contém" ou "contendo", ou qualquer variante dos mesmos, pretendem ser não exclusivos ou abertos. Por exemplo, uma composição, uma mistura, um processo, um método, um artigo, um aparelho que compreende uma lista de elementos não é necessariamente limitado apenas a esses elementos, mas pode incluir outros elementos não expressamente listados ou inerentes a tais composições, misturas, processo, método, artigo ou aparelho. Ainda, a menos que expressamente declarado o contrário, "ou" se refere a um ou inclusivo e não a um ou exclusivo. Por exemplo, uma condição A ou B é satisfeita por qualquer um do que segue: A é verdadeiro (ou presente) e B é falso (ou não presente), A é falso (ou não presente) ou B é verdadeiro (ou presente) e ambos A e B são verdadeiros (ou presentes).
[040] Também, os artigos indefinidos "um" e "uma" precedendo um elemento ou componente de uma modalidade da invenção pretendem ser não restritivos com relação ao número de casos, isto é, ocorrências do elemento ou componente. Desta maneira "um" ou "uma" deve ser lido incluir um ou pelo menos um e a forma da palavra no singular do elemento ou componente também inclui o plural a menos que o número for obviamente pretendido ser singular.
[041] O termo "invenção" ou "presente invenção" conforme aqui usado é um termo não limitante e não pretende ser referir a nenhuma modalidade única da invenção particular, mas compreende todas as modalidades possíveis conforme revelado no presente pedido.
[042] O termo "planta" conforme aqui usado inclui, mas não está limitado a, qualquer descendente, célula, tecido ou parte de uma planta.
[043] São descritos aqui métodos de identificação da presença de um polinucleotídeo DNA doador inserido em um loci genômico alvo. Polinucleotídeos DNA para inserção podem ser também referidos como, e pretendem incluir, polinucleotídeos "exógenos", polinucleotídeos "doadores" ou "moléculas" ou "transgenes".
[044] Em certas modalidades, o polinucleotídeo DNA doador inclui sequências (por exemplo, sequências de codificação, também referidas como transgene) maiores do que 1 kb de comprimento, por exemplo, entre 2 e 200 kb, entre 2 e 10 kb (ou qualquer valor entre eles). O polinucleotídeo DNA doador pode também incluir pelo menos um sítio alvo de nuclease específica de sítio, por exemplo, um sítio alvo de ZFN, Meganuclease, CRISPR ou TALEN pode estar incluído no polinucleotídeo DNA doador. O polinucleotídeo DNA doador pode incluir pelo menos 1 sítio alvo, por exemplo, para um par de ZFNs, CRISPR ou TALENs para reconhecer e se ligar e clivar. Tipicamente, os sítios alvo de nuclease estão fora das sequências de transgene, por exemplo, 5’ ou 3’ para as sequências de transgene, para clivagem e remoção do transgene interveniente, se desejado. O(s) sítio(s) de clivagem de nuclease podem ser para qualquer nuclease(s). Em certas modalidades, o(s) sítio(s) alvo de nuclease contido(s) no polinucleotídeo DNA doador de fita dupla são para as mesmas nuclease(s) usada(s) para clivar o alvo genômico alvo no qual o polinucleotídeo DNA doador está inserido.
[045] Os transgenes compreendidos dentro das sequências de polinucleotídeo DNA doador descritos aqui podem ser isolados de plasmídeos, células ou outras fontes usando técnicas padrão conhecidas no campo tal como PCR. As sequências de polinucleotídeo DNA doador para uso podem incluir tipos variáveis de topologia, incluindo superespiraladas, circulares relaxadas, lineares e similar. Alternativamente, elas podem ser quimicamente sintetizadas usando técnicas de síntese de oligonucleotídeo padrão. Ainda, as sequências de polinucleotídeo DNA doador podem ser metiladas ou não ter metilação. Sequências de polinucleotídeo DNA doador podem estar na forma de cromossomos artificiais bacterianos ou de levedura (BACs ou YACs) ou como vetores de plasmídeo. Sequências de polinucleotídeo DNA doador podem ser de uma fita T que é introduzida em uma célula de planta através de Agrobacterium tumefaciens.
[046] Os polinucleotídeos de DNA doador de fita dupla descritos aqui podem incluir uma ou mais bases e ou estruturas principais não naturais. Em particular, inserção de uma sequência de polinucleotídeo DNA doador com citosinas metiladas pode ser realizada usando os métodos descritos aqui para obter um estado de quiescência transcricional em uma região de interesse.
[047] O polinucleotídeo DNA doador pode compreender qualquer sequência exógena de interesse. Polinucleotídeos DNA doador exemplares incluem, mas não estão limitados a qualquer sequência de codificação de polipeptídeo, (por exemplo, cDNAs), sequências promotoras, sequências aumentadores, marcadores de epítopo, genes marcadores, sítios de reconhecimento de enzima de clivagem e vários tipos de construções de expressão. Genes marcadores incluem, mas não estão limitados a sequências codificando proteínas que fazem a mediação de resistência a herbicida (por exemplo, resistência a HPPD, resistência a 2,4-D, resistência a glufosinato ou resistência a glifosato, em adição a outras proteínas de resistência a herbicida conhecidas), sequências codificando proteínas coloridas ou fluorescentes ou luminescentes (por exemplo, proteína verde fluorescente, proteína fluorescente verde realçada, proteína fluorescente vermelha, luciferase) e proteínas que fazem a mediação de crescimento celular aumentado e/ou amplificação de gene (por exemplo, diidrofolato redutase). Marcadores de epítopo incluem, por exemplo, uma ou mais cópias de FLAG, HIS, MYC, TAP, HA ou qualquer sequência de aminoácido detectável.
[048] Os termos "polinucleotídeo", "ácido nucleico" e "molécula de ácido nucleico" pretendem compreender um ácido nucleico singular bem como ácidos nucleicos plurais, um fragmento de ácido nucleico, variante, ou derivado do mesmo, ou construção, por exemplo, RNA mensageiro (mRNA) ou DNA de plasmídeo (pDNA). Um polinucleotídeo ou ácido nucleico pode conter a sequência de nucleotídeo da sequência de cDNA de comprimento integral, ou um fragmento da mesma, incluindo as sequências não traduzidas 5’ e 3’ e as sequências de codificação. A menos que de outro modo especificado, um polinucleotídeo ou ácido nucleico pode ser composto de qualquer polirribonucleotídeo ou polidesoxirribonucleotídeo, que pode ser RNA ou DNA não modificado ou RNA ou DNA modificado. Por exemplo, um polinucleotídeo ou ácido nucleico pode ser composto de um DNA de fita simples ou dupla, DNA que é uma mistura de regiões de fita simples ou dupla, RNA de fita simples ou dupla e RNA que é mistura de regiões de fitas simples e dupla, moléculas hibridas compreendendo DNA ou RNA que podem ser de fita dupla ou, mais tipicamente, fita dupla ou uma mistura de regiões de fita simples ou dupla. Os termos também incluem formas quimicamente, enzimaticamente ou metabolicamente modificadas de um polinucleotídeo ou ácido nucleico.
[049] Uma sequência de polinucleotídeo ou ácido nucleico pode ser referida como "isolada", onde ela foi removida de seu ambiente nativo. Por exemplo, um polinucleotídeo ou ácido nucleico heterólogo codificando um polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo tendo atividade de tolerância a glifosato contido em um vetor é considerado isolado para os propósitos da presente invenção. Exemplos adicionais de um polinucleotídeo ou ácido nucleico isolado incluem polinucleotídeo recombinante mantido em células hospedeiro heterólogas ou um polinucleotídeo ou ácido nucleico purificado (parcialmente ou substancialmente) em solução. Um polinucleotídeo ou ácido nucleico isolado de acordo com modalidades da presente invenção inclui ainda tais moléculas produzidas sinteticamente. Um polinucleotídeo ou ácido nucleico isolado na forma de um polímero de DNA pode ser compreendido de um ou mais segmentos de cDNA, DNA genômico ou DNA sintético.
[050] O termo "gene" se refere a uma sequência de ácido nucleico que codifica moléculas de produto funcional, ou RNA ou proteína, opcionalmente incluindo sequências reguladores precedendo (sequências de não codificação 5’) e seguindo (sequências de não codificação 3’) a sequência de codificação.
[051] Conforme aqui usado, o termo "região de codificação" se refere a uma sequência de DNA que codifica uma sequência de aminoácido específica. "Sequências reguladoras adequadas" se referem a sequências de nucleotídeos localizadas a montante (sequências de não codificação 5’), dentro ou a jusante (sequências de não codificação 3’) de uma sequência de codificação, e que influenciam a transcrição, processamento ou estabilidade do RNA ou tradução da sequência de codificação associada. Sequências reguladoras podem incluir promotores, sequências líderes de tradução, íntrons, sequências de reconhecimento de poliadenilação, sítio de processamento de RNA, sítio de ligação de efetor e estruturas de tronco-alça.
[052] Conforme aqui usado, o termo "polipeptídeo" pretende compreender um "polipeptídeo" no singular bem como "polipeptídeos" no plural e fragmentos dos mesmos e se refere a uma molécula composta de monômeros (aminoácidos) ligados linearmente por ligações amida (também conhecidas como ligações de peptídeo). O termo "polipeptídeo" se refere a qualquer cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos e não se refere a um comprimento específico do produto. Desta maneira, peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeo, "proteína", "cadeia de aminoácido" ou qualquer outro termo usado para se referir a uma cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos estão incluídos na definição de "polipeptídeo", e o termo "polipeptídeo" pode ser usado ao invés de, ou intercomutavelmente com qualquer um desses termos. Um polipeptídeo pode ser derivado de uma fonte biológica natural ou produzido através de tecnologia recombinante, mas não é necessariamente traduzido de uma sequência de ácido nucleico designada. Ele pode ser gerado de qualquer maneira, incluindo através de síntese química.
[053] Por um polipeptídeo "isolado" ou um fragmento, variante ou derivado do mesmo quer dizer um polipeptídeo que não está em seu ambiente natural. Nenhum nível de purificação particular é requerido. Desta maneira, referência a "isolado" significa o envolvimento da "mão do homem" conforme aqui descrito. Por exemplo, um polipeptídeo isolado pode ser removido de seu ambiente nativo ou natural. Polipeptídeos e proteínas recombinantes expressos nas células hospedeiro são considerados isolados para propósitos da invenção, e são polipeptídeos nativos ou recombinantes que foram separados, fracionados ou parcialmente ou substancialmente purificados através de qualquer técnica adequada.
[054] Conforme aqui usado, "nativo" se refere à forma de um polinucleotídeo, gene ou polipeptídeo conforme encontrado na natureza com suas próprias sequências reguladoras, se presentes. Conforme aqui usado, "endógeno" se refere à forma nativa de um polinucleotídeo, gene ou polipeptídeo em sua localização natural no organismo ou no genoma de um organismo. "Polinucleotídeo endógeno" inclui um polinucleotídeo nativo em sua localização natural no genoma de um organismo. "Gene endógeno" inclui um gene nativo em sua localização natural no genoma de um organismo. "Polipeptídeo endógeno" inclui um polipeptídeo nativo em seu local natural no organismo.
[055] Conforme aqui usado, "heterólogo" se refere a um polinucleotídeo, gene ou polipeptídeo não encontrado normalmente no organismo hospedeiro, mas que é introduzido no organismo hospedeiro. "Polinucleotídeo heterólogo" inclui uma região de codificação nativa, ou porção da mesma, que é reintroduzida no organismo fonte em uma forma que é diferente do polinucleotídeo nativo correspondente. "Gene heterólogo" inclui uma região de codificação nativa, ou porções da mesma, que é reintroduzida no organismo fonte em uma forma que é diferente do gene nativo correspondente. Por exemplo, um gene heterólogo pode incluir uma região de codificação nativa que é uma porção de um gene quimérico incluindo regiões reguladoras não nativas que é reintroduzida no hospedeiro nativo. "Polipeptídeo heterólogo" inclui um polipeptídeo nativo que é reintroduzido no organismo hospedeiro em uma forma que é diferente do polipeptídeo nativo correspondente. Os genes e proteínas objetos podem ser fundidos a outros genes e proteínas para produzir proteínas quiméricas ou de fusão. Os genes e as proteínas úteis de acordo com modalidades da presente invenção incluem não apenas as sequências de comprimento integral especificamente exemplificadas, mas também porções, segmentos e/ou fragmentos (incluindo fragmentos contíguos e deleções internas e/ou terminais comparado com as moléculas de comprimento integral) dessas sequências, variantes, mutantes, quiméricos e fusões dos mesmos.
[056] Em uma modalidade, o polinucleotídeo DNA doador compreende um polinucleotídeo codificando qualquer polipeptídeo cuja expressão na célula é desejada, incluindo, mas não limitado a um cassete de expressão de gene compreendendo promotores, UTR’s 3’, características de resistência a herbicida, características de resistência a inseto, características de óleo modificadas e fragmentos funcionais de qualquer um dos acima. As sequências de codificação podem ser, por exemplo, cDNAs.
[057] O termo "promotor" se refere a uma sequência de DNA capaz de controlar a expressão de uma sequência de codificação ou RNA funcional. Em geral, uma sequência de codificação está localizada 3’ para uma sequência promotora. Promotores podem ser derivados em sua totalidade de um gene nativo ou ser compostos de elementos diferentes derivados de promotores diferentes encontrados na natureza ou até mesmo compreender segmentos de DNA sintético. É compreendido por aqueles versados na técnica que promotores diferentes podem direcionar a expressão de um gene em tecidos ou tipos de célula diferentes ou em estágios de desenvolvimento diferentes ou em resposta a condições ambientais ou fisiológicas diferentes. Promotores que fazem com que um gene seja expresso na maioria dos tipos de célula na maioria das vezes são geralmente referidos como "promotores constitutivos". É ainda reconhecido que uma vez que na maioria dos casos os limites exatos de sequências reguladoras não foram completamente definidos, fragmentos de DNA de comprimentos diferentes podem ter atividade de promotor idêntica.
[058] O termo "operavelmente ligado" se refere à associação de sequências de ácido nucleico em um fragmento de ácido nucleico único de maneira que a função de um é afetada pelo outro. Por exemplo, um promotor é operavelmente ligado com uma sequência de codificação quando ele é capaz de afetar a expressão desta sequência de codificação (por exemplo, que a sequência de codificação está sob o controle transcricional do promotor). Sequências de codificação podem ser operavelmente ligadas a sequências reguladoras na orientação senso ou antissenso.
[059] O termo "expressão", conforme aqui usado, se refere à transcrição e acúmulo estável de RNA senso (mRNA) ou antissenso derivado do fragmento de ácido nucleico das modalidades da invenção. Expressão pode também se referir à tradução de mRNA em um polipeptídeo.
[060] O termo "superexpressão", conforme aqui usado, se refere à expressão que é maior do que a expressão endógena do mesmo gene ou um relacionado. Um gene heterólogo é superexpresso se sua expressão for maior do que aquela de um gene endógeno comparável.
[061] Conforme aqui usado, o termo "transformação" se refere à transferência e à integração de um ácido nucleico ou fragmento em um organismo hospedeiro, resultando em herança geneticamente estável. Organismos hospedeiros contendo os fragmentos de ácido nucleico transformados são referidos como organismos "transgênicos" ou "recombinantes" ou "transformados". Métodos de transformação conhecidos incluem transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes, transformação com fosfato de cálcio, transformação com polibreno, fusão de protoplastos, eletroporação, métodos ultrassônicos (por exemplo, sonoporação), transformação de lipossomo, microinjeção, DNA nu, vetores de plasmídeo, vetores virais, biolística (bombardeamento de micropartícula), transformação mediada por carbida de silício WHISKERS®, feixe de aerossol ou transformação com PEG bem como outros métodos possíveis.
[062] Os termos "plasmídeo" e "vetor" conforme aqui usado se referem a um elemento cromossômico extra frequentemente carregando genes que não são parte do metabolismo central da célula e geralmente na forma de moléculas de DNA de fita dupla circulares. Tais elementos podem ser sequências de replicação autônomas, sequências de integração de gene, sequências de integração de genoma, sequências de fago ou nucleotídeo, lineares ou circulares, de um DNA ou RNA de fita simples ou dupla, derivadas de qualquer fonte, onde várias sequências de nucleotídeo foram unidas ou recombinadas em uma construção única que é capaz de introduzir um fragmento de promotor e sequência de DNA para um produto de gene selecionado junto com sequência não traduzida 3’ apropriada em uma célula.
[063] Conforme aqui usado, "degeneração do códon" se refere à natureza no código genético que permite variação da sequência de nucleotídeo sem afetar a sequência de aminoácido de um polipeptídeo codificado. O versado na técnica tem consciência das "inclinações de códon" exibidas por uma célula hospedeiro especifica em uso de códons de nucleotídeo para especificar um dado aminoácido. Desta maneira, quando sintetizando um gene para expressão aperfeiçoada em uma célula hospedeiro, é desejado projetar o gene de maneira que sua frequência de uso de códon se aproxime da frequência de uso de códon preferido da célula hospedeiro.
[064] O termo "códon otimizado", uma vez que ele se refere a genes ou regiões de codificação de moléculas de ácido nucleico para transformação de vários hospedeiros, se refere à alteração de códons no gene ou regiões de codificação das moléculas de ácido nucleico para refletir o uso de códon típico do organismo hospedeiro sem alterar o polipeptídeo codificado pelo DNA. Tal otimização inclui substituição de pelo menos um, ou mais de um, ou um número significante, de códons com um ou mais códons que são mais frequentemente usados nos genes deste organismo.
[065] O termo "identidade percentual" (ou "identidade %), conforme conhecido na técnica, é uma relação entre duas ou mais sequências de polipeptídeo ou duas ou mais sequências de polinucleotídeo, conforme determinado através de comparação das sequências. Na técnica, "identidade" significa também o grau de relação de sequência entre as sequências de polipeptídeo ou polinucleotídeo, conforme for o caso, conforme determinado pelas compatibilidades ente as fitas de tais sequências. "Identidade" e "similaridade" podem ser prontamente calculadas através de métodos conhecidos, incluindo, mas não limitado àqueles revelados em: 1) Computational Molecular Biology (Lesk, A., M., Ed.) Oxford University: NY (1988); 2) Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D.W., Ed.) Academic: NY (1993); 3) Computer Analysis of Sequence Data, Parte I (Griffin, A.M. e Griffing, H.G., Eds.) Humania: NJ (1994); 4) Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., Ed.) Academic (1987); e 5) Sequence Analysis Iniciador (Gribskov, M. e Devereux, J., Eds.) Stockton: NY (1991).
[066] Técnicas para determinação de identidade de sequência de ácido nucleico e aminoácido são conhecidas não campo. Tipicamente tais técnicas incluem determinação da sequência de nucleotídeo do mRNA para um gene e/ou determinação da sequência de aminoácido então codificada e comparação dessas sequências com uma segunda sequência de nucleotídeo ou aminoácido. Sequências genômicas podem ser também determinadas e comparadas desta maneira. Em geral, identidade se refere a uma correspondência de nucleotídeo-para- nucleotídeo ou aminoácido-para-aminoácido exata de duas sequências de polinucleotídeo ou peptídeo, respectivamente. Duas ou mais sequências (polinucleotídeo ou aminoácido) podem ser comparadas através da determinação de sua identidade percentual. A identidade percentual de duas sequências, sejam sequências de ácido nucleico ou aminoácido, é o número de combinações exatas entre duas sequências alinhadas dividido pelo comprimento das sequências mais curtas e multiplicado por 100. Vide Russell, R. e Barton, G., "Structural Features can be Unconserved in Proteins with Similar Folds", J. Mol. Biol. 244, 332-350 (1994), na pg. 337, que é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.
[067] Ainda, métodos para determinar identidade e similaridade são codificados em programas de computador publicamente disponíveis. Cálculos de alinhamentos de sequência e identidade percentual podem ser realizados, por exemplo, usando o programa AlignX do VECTOR NTI® suite (Invitrogen, Carlsbad, CA) ou MEGALIGN® program da LASERGENE® bioinformatics computing suite (DNASTAR Inc., Madison, WI). Alinhamento múltiplo das sequências é realizado usando o "Clustal method of alignment" que compreende várias variedades do algoritmo incluindo o "Clustal V method of alignment" correspondendo ao método de alinhamento identificado Clustal V (revelado por Higgins e Sharp, CABIOS, 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. e outros, Comput. Appl. Biosci., 8:189-191 (1992)) e encontrado no MEGALIGN® program da LASERGENE® bioinformatics computing suite (DNASTAR Inc., Madison, WI). Para alinhamentos múltiplos, os valores default correspondem a GAP PENALTY=10 e GAP LENGTH PENALTY=10. Parâmetros default para alinhamentos em par e cálculo de identidade percentual de sequências de proteína usando o método Clustal são KTUPLE=1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 e DIAGONALS SAVED=5. Para ácidos nucleicos esses parâmetros são KTUPLE=2, GAP PENALTY=5, WINDOW=4 e DIAGONALS SAVED=4. Após alinhamento das sequências usando o programa Clustal V, é possível obter uma "identidade percentual" observando a tabela de "distâncias de sequência" no mesmo programa. Ainda, o "método Clustal W de alinhamento" está disponível e corresponde ao método de alinhamento identificado Clustal W (descrito por Higgins e Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. e outros, Comput. Appl; Biosci. 8:189-191 (1993)) e encontrado no MEGALIGN® v6.1 program do LASERGENE® bioinformatics computing suite (DNASTAR Inc.). Parâmetros default para alinhamento múltiplo (GAP PENALTY=10, GAP LENGHT PENALTY=0,2, Delay Divergen Seqs(%)=30, DNA Transition Weight=0,5, Protein Weight Matrix=Gonnet Series, DNA Weight Matrix=IUB). Após alinhamento das sequências usando o programa Clustal W, é possível obter uma "identidade percentual" observando a tabela de "distâncias de sequência" no mesmo programa.
[068] As sondas e os iniciadores de ácido nucleico de modalidades da presente invenção podem hibridizar sob condições de hibridização para uma sequência de DNA alvo dentro de uma reação de amplificação. Qualquer método de hibridização ou amplificação de ácido nucleico convencional pode ser usado para identificar a presença de polinucleotídeo DNA doador inserido em um locus genômico alvo. Moléculas de ácido nucleico, oligonucleotídeos ou fragmentos dos mesmos são capazes de hibridizar especificamente para outras moléculas de ácido nucleico sob certas condições. Conforme aqui usado, duas moléculas de ácido nucleico são ditas ser capazes de especificamente hibridizar uma para a outra se as duas moléculas forem capazes de formar uma estrutura de ácido nucleico antiparalela, de fita dupla. Uma molécula de ácido nucleico é dita ser o "complemento" de outra molécula de ácido nucleico se as duas moléculas de ácido nucleico exibirem complementaridade completa. Conforme aqui usado, moléculas são ditas exibir "complementaridade completa" quando cada nucleotídeo de uma das moléculas é complementar a um nucleotídeo da outra. Moléculas que exibem complementaridade completa geralmente hibridizam uma para a outra com estabilidade suficiente para permitir que elas permaneçam aneladas uma para a outra sob condições de "alta adstringência" convencionais. Condições de alta adstringência convencionais são descritas por Sambrook e outros, 1989.
[069] Duas moléculas são ditas exibir "complementaridade mínima" se elas puderem hibridizar uma para a outra com estabilidade suficiente para permitir que elas permaneçam aneladas uma para a outra sob condições pelo menos de "baixa adstringência" convencionais. Condições de baixa adstringência convencionais são descritas por Sambrook e outros, 1989. A fim de que uma molécula de ácido nucleico sirva como um iniciador ou sonda, ela precisa apenas exibir a complementaridade mínima de sequência para ser capaz de formar uma estrutura de fita dupla estável sob as concentrações de solvente e sal particulares empegadas.
[070] Fatores que afetam a adstringência de hibridização são bem conhecidos daqueles de habilidade na técnica e incluem, mas não estão limitados a temperatura, pH, resistência iônica e concentração de solventes orgânicos tais como, por exemplo, formamida e óxido de dimetila. Como é conhecido daqueles versados na técnica, adstringência de hibridização é aumentada por temperaturas mais altas, resistência iônica menor e concentrações de solvente menores.
[071] O termo "condição de adstringência" ou "condições de adstringência" é funcionalmente definido com relação à hibridização de uma sonda de ácido nucleico para um ácido nucleico alvo (isto é, para uma sequência de ácido nucleico particular de interesse) através do procedimento de hibridização específico discutido em Sambrook e outros, 1989.
[072] Tipicamente, condições adstringentes serão aquelas onde a concentração de sal é menor do que cerca de 1,5 M de íon de Na+, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de íon de Na+ (ou outros sais) em pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30° C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60° C para sondas longas (por exemplo, maior do que 50 nucleotídeos). Condições adstringentes podem ser também obtidas com a adição de agentes de desestabilização tal como formamida. Condições de baixa adstringência exemplares incluem hibridização com uma solução tampão de 30 a 35% de formamida, NaCl 1,0 M, SDS 0,1% (dodecil sulfato de sódio) a 37° C e uma lavagem em SSC 1X a 2X (SSC 20X=NaCl 3,0 M/ citrato de sódio 0,3 M) a 50 a 55° C. Condições de adstringência moderadas exemplares incluem hibridização em formamida 40 a 45%, NaCl 1,0 M, SDS 0,1% a 37° C e lavagem em SSC 0,5X a 1X a 55 a 60° C. condições de alta adstringência exemplares incluem hibridização em formamida 50%, NaCl 1,0 M, SDS 0,1% a 37° C e uma lavagem em SSC 0,1X a 60 a 65° C.
[073] Especificidade é tipicamente uma função de lavagens pós- hibridização, os fatores críticos sendo a resistência iônica e a temperatura da solução de lavagem final. Para híbridos de DNA-DNA, a Tm pode ser aproximada da equação Tm = 81,5° C+16,6 (logM)+0,41(%GC)-0,61(%form.)-500/ L, onde M é a molaridade de cátions monovalentes, %GC é a porcentagem de nucleotídeos de guanosina e citosina no DNA, % form. é a porcentagem de formamida na solução de hibridização e L é o comprimento do híbrido em pares de base (Meinkoth e Wahl, 1984). A Tm é a temperatura (sob resistência iônica e pH definidos) na qual 50% de uma sequência alvo complementar hibridizam para uma sonda perfeitamente compatível. A Tm é reduzida em cerca de 1° C para cada 1% de incompatibilidade; desta maneira, Tm, hibridização e/ou condições de lavagem podem ser ajustadas para sequências da identidade desejada hibridizar. Por exemplo, se sequências com 90% de identidade forem desejadas, a Tm pode ser diminuída 10° C. Em geral, condições adstringentes são selecionadas para serem cerca de 5° C menores do que o ponto de fusão térmico (Tm) para a sequência específica e seu complemento em resistência iônica e pH definidos. No entanto, condições severamente adstringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3 ou 4° C menor do que o ponto de fusão térmico (Tm); condições moderadamente adstringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9 ou 10° C menor do que o ponto de fusão térmico (Tm); condições de baixa adstringência podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 11 a 20° C menor do que o ponto de fusão térmico (Tm). Usando a equação, composições de hibridização e lavagem e Tm desejada, aqueles de habilidade comum na técnica compreenderão que variações na adstringência de hibridização e/ou soluções de lavagem são inerentemente descritas. Se o grau desejado de incompatibilidade resultar em uma Tm de menos do que 45° C (solução aquosa) ou 32° C (solução de formamida), é preferido aumentar a concentração de SSC de maneira que uma temperatura maior pode ser usada. Um guia extensivo para hibridização de ácidos nucleicos é encontrado (1997) Ausubel e outros, Short Protocols in Molecular Biology, páginas 2-40, 3a Ed. (19977) e Sambrook e outros (1989).
[074] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se à introdução de um polinucleotídeo DNA doador que é inserido em um locus de genoma alvo. Técnicas de clonagem de DNA e molecular recombinantes padrão para a construção de um polinucleotídeo DNA doador que como uma modalidade compreende um cassete de expressão de gene conforme aqui usado são bem conhecidas no campo e são descritas, por exemplo, por Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989); e por Silhavy e outros, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1984); e por Ausubel e outros, Current Protocols in Molecular Biology, publicado por Greene Publishing Assoc. e Wiley-Interscience (1987).
[075] Em métodos revelados aqui, vários promotores que direcionam a expressão de um gene em uma planta podem ser empregados. Tais promotores podem ser selecionados de promotores constitutivos, quimicamente regulados, induzíveis, específicos de tecido e preferidos de semente. O promotor usado para direcionar a expressão de um ácido nucleico depende da aplicação particular. Por exemplo, um promotor constitutivo forte adequado para a célula hospedeiro é tipicamente usado para expressão e purificação de proteínas expressas.
[076] Exemplos não limitantes de promotores de planta preferidos incluem sequências promotoras derivadas de ubiquitina-10 (ubi-10) de A. thaliana (Callis, e outros, 1990, J. Biol. Chem., 265:12486-12493); manopina sintase de A. tumefaciens (Δmas) (Petolino e outros, Patente U.S. No. 6,730,824); e/ou Vírus do Mosaico Comum da Mandioca (CsVMV) (Cassava Vein Mosaic Virus) (Verdaguer e outros, 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139). Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, o promotor 35S do Vírus do Mosaico da Couve- flor (Odell e outros (1985) Nature 313:810-812); promotor da Actina do Arroz (McElroy e outros (1990) Plant Cell 2:163-171); promotor da Ubiquitina do Milho (Patente U.S. No. 5.510.474; Christensen e outros (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 e Christensen e outros (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); promotor pEMU (Last e outros (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); promotor ALS (patente U.S. Número 5.659.026); promotor da Histona do Milho (Chabouté e outros, Plant Molecular Biology, 8:179-191 (1987)); e similar.
[077] Outros promotores de planta aplicáveis incluem promotores específicos e induzíveis de tecido. Um promotor induzível é um que é capaz de ativar diretamente ou indiretamente transcrição de uma ou mais sequências ou genes de DNA em resposta a um indutor. Na ausência de um indutor as sequências de DNA ou genes não serão transcritos. Tipicamente, o fator de proteína que se liga especificamente a um elemento regulador induzível para ativar transcrição está presente em uma forma inativada que é então diretamente ou indiretamente convertida na forma ativa pelo indutor. O indutor pode ser um agente químico tal como uma proteína, metabolito, regulador de crescimento, herbicida ou composto fenólico ou um estresse fisiológico imposto diretamente por calor, frio, sal ou elementos tóxicos ou indiretamente através da ação de um patógeno ou agente de doença tal como um vírus. Tipicamente o fator de proteína que se liga especificamente a um elemento regulador induzível para ativar transcrição está presente em uma forma inativa que é então diretamente ou indiretamente convertida na forma ativa pelo indutor. O indutor pode ser um agente químico tal como uma proteína, metabolito, regulador de crescimento, herbicida ou composto fenólico ou um estresse fisiológico imposto diretamente por calor, frio, sal ou elementos tóxicos ou indiretamente através da ação de um patógeno ou agente de doença tal como um vírus. Uma célula de planta contendo um elemento regulador induzível pode ser exposta a um indutor aplicando externamente o indutor à célula ou planta tal como através de pulverização, rega, aquecimento ou métodos similares.
[078] Qualquer promotor induzível pode ser usado em modalidades da presente invenção. Vide Ward e outros, Plant Mol. Biol. 22: 361-366 (1993). Promotores induzíveis exemplares incluem promotores de receptor da ecdisona (Patente U.S. No. 6.504.082); promotores do sistema ACE1 que respondem a cobre (Mett e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 4567-4571 (1993)); genes In2-1 e In2-2 de milho que correspondem a protetores de herbicida benzenossulfonamida (Patente U.S. No. 5.364.780; Hershey e outros, Mol. Gen. Genetics 227: 229-237 (1991) e Gatz e outros, Mol. Gen. Genetics 243: 32-38 (1994)); repressor Tet de Tn10 (Gatz e outros, Mol. Gen. Genet. 227: 229-237 (1991); ou promotores de um gene de hormônio esteroide, cuja atividade transcricional é induzida por um hormônio glucocorticoide, Schena e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 10421 (1991) e McNellis e outros (1998) Plant J. 14(2):247-257; o promotor GST do milho, que é inativado por compostos eletrofílicos hidrofóbicos que são usados como herbicidas pré-emergentes (vide Patente U.S. No. 5.965.387 e Pedido de Patente Internacional, Publicação No. WO 93/ 001294); e promotor PR-1a do tabaco, que é ativado por ácido salicílico (vide Ono, S., Kusama, M., Ogura, R., Hiratsuka, K., "Evaluation of the Use of the Tobacco PR-1a Promoter to Monitor Defense Gene Expression by the Luciferase Bioluminescence Reporter System", Biosci. Biotechnol Biochem. Setembro de 2011;75(9):1796-800). Outros promotores regulados por química de interesse incluem promotores induzíveis da tetraciclina e repressores da tetraciclina (vide, por exemplo, Gatz e outros (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237; e Patentes U.S. Números 5.814.618 e 5.789.156).
[079] Outros promotores reguláveis de interesse incluem um elemento regulador responsivo a frio ou elemento regulador de choque térmico, cuja transcrição pode ser realizada em resposta à exposição a frio ou calor, respectivamente (Takahashi e outros, Plant Physiol. 99:383-390, 1992); o promotor do gene da desidrogenase do álcool (Gerlach e outros, PNAS USA 79:2981-2985 (1982); Walker e outros, PNAS 84(19):6624-6628 (1987)), induzível por condições anaeróbicas; e o promotor induzível por luz derivado do gene rbcS da ervilha ou gene psaDb da ervilha (Yamamoto e outros, (1997) Plant J. 12(2):255-265); um elemento regulador induzível por luz (Feinbaum e outros, Mol. Gen. Genet. 226:449, 1991; Lam e Chua, Science 248:471, 1990; Matsuoka e outros (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; Orozco e outros (1993) Plant Mol. Bio. 23(6):1129-1138), um elemento regulador induzível por hormônio de planta (Yamaguchi-Shinozaki e outros, Plant Mol. Biol. 15:905, 1990; Kares e outros, Plant Mol. Biol. 15:225, 1990) e similar. Um elemento regulador induzível também pode ser o promotor do gene In2-1 ou In2-2 do milho, que responde a protetores de herbicida benzenossulfonamida (Hershey e outros, Mol. Gen. Gene. 227:229-237, 1991; Gatz e outros, Mol. Gen. Genet. 243:32-38, 1994) e o repressor Tet de transposon Tn10 (Gatz e outros, Mol. Gen. Genet. 227:229-237, 1991). Promotores induzíveis por estresse incluem promotores induzíveis por estresse de sal/ água tal como P5CS (Zang e outros, (1997) Plant Sciences 129:81-89); promotores induzíveis pelo frio, tais como cor15a (Hajela e outros, (1990) Plant Physiol. 93:1246-1252), cor15b (Wilhelm e outros, (1993) Plant Mol Biol 23:1073-1077), wsc1 (Ouellet e outros (1998) FEBS Lett. 423-324-328), ci7 (Kirch e outros (1997) Plant Mol Biol. 33:897-909), ci21A (Schneider e outros (1997) Plant Physiol. 113:335-45); promotores induzíveis por seca, tais como Trg-31 (Chaudhary e outros, (1996) Plant Mol. Biol. 30:1247-57), rd29 (Kasuga e outros, (1999) Nature Biotechnology 18:287-291); promotores induzíveis osmóticos, tais como Rab17 (Vilardell e outros, (1991) Plant Mol. Biol. 17:985-93) e osmotina (Raghothama e outros, (1993) Plant Mol. Biol. 23:1117-28); e promotores induzíveis por calor, tais como as proteínas de choque térmico (Barros e outros, (1992) Plant Mol. 19:665-75; Marrs e outros, (1993) Dev. Genet. 14:27-41), smHSP (Waters e outros, (1996) J. Experimental Botany 47:325-338) e o elemento induzível por choque térmico do promotor da ubiquitina da salsa (WO 03/ 102198). Outros promotores induzíveis por estresse incluem rip2 (Patente U.S. No. 5.332.808 e Publicação U.S. No. 2003/0217393) e rd29a (Yamaguchi-Shinozaki e outros, (1993) Mol. Gen. Genetics 236:331-340). Certos promotores são induzíveis por ferimento, incluindo o promotor pMAS de Agrobacterium (Guevara- Garcia e outros, (1993) Plant J. 4(3):495-505) e o promotor ORF13 de Agrobacterium (Hansen e outros, (1997) Mol. Gen. Genet. 254(3):337- 343).
[080] Promotores preferidos de tecido podem ser utilizados para se direcionar à transcrição e/ou expressão aumentada dentro de um tecido de planta particular. Quando se referindo à expressão preferencial, o que quer dizer é expressão em um nível maior no tecido de planta particular do que em outro tecido de planta. Exemplos desses tipos de promotores incluem expressão preferida de semente tal como aquela provida pelo promotor da faseolina (Bustos e outros, (1989) The Plant Cell Vol. 1, 839-853) e o gene da globulina-1 do milho (Belanger, e outros (1991) Genetics 129:863-972). Para dicotiledôneas, promotores preferidos de semente incluem, mas não estão limitados a β-faseolina do feijão, β-conglicinina, lectina da soja, cruciferina e similar. Para monocotiledôneas, promotores preferidos de semente incluem, mas não estão limitados a zeína de 15 kDa de milho, zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa, Y-zeína, ceroso, shrunken 1, shrunken 2, globulina 1, etc. Promotores preferidos de semente também incluem aqueles promotores que direcionam expressão de gene predominantemente para tecidos específicos dentro da semente tais como, por exemplo, o promotor preferido do endosperma de Y-zeína, o promotor críptico do Tabaco (Fobert e outros, (1994) T-DNA tagging of a seed coat-specific cryptic promoter in tobacco. Plant J. 4: 567-577), o promotor do gene P de milho (Chopra e outros, (1996) Alleles of the maize P gene with distinct tissue specificities encode Myb-homologous proteins with C- terminal replacements. Plant Cell 7:1149-1158, Erratum in Plant Cell.1997, 1:109), o promotor da globulina-1 de milho (Belenger and Kriz (1991) Molecular basis for Allelic Polymorphism of the maize Globulin-1 gene. Genetics 129: 863-972) e promotores que direcionam a expressão do revestimento ou casca da semente de grãos de milho, por exemplo, o promotor da glutamina sintetase específica do pericarpo (Muhitch e outros, (2002) Isolation of a Promoter Sequence From the Glutamine Synthetase1-2 Gene Capable of Conferring Tissue-Specific Gene Expression in Transgenic Maize. Plant Science 163:865-872).
[081] Em adição ao promotor, o vetor de expressão contém tipicamente uma unidade de transcrição ou cassete de expressão que contém todos os elementos adicionais requeridos para a expressão do ácido nucleico em células hospedeiro, ou procarióticas ou eucarióticas. Um cassete de expressão típico então contém um promotor operavelmente ligado, por exemplo, a uma sequência de ácido nucleico codificando a proteína, e sinais requeridos, por exemplo, para poliadenilação eficiente do transcrito, terminação transcricional, sítios de ligação a ribossomo ou terminação de tradução. Elementos adicionais do cassete podem incluir, por exemplo, sinais de união aumentadores e heterólogos.
[082] Outros componentes do vetor podem ser incluídos, também dependendo do uso pretendido do gene. Exemplos incluem marcadores selecionáveis, sequências de direcionamento ou reguladoras, sequências de peptídeo de trânsito tal como a sequência de peptídeo de trânsito otimizada (vide Patente U.S. No. 5.510.471), sequências de estabilização tal como RB7 MAR (vide Thompson e Myatt (1997) Plant. Mol. Biol., 34: 687-692 e Publicação de Patente Internacional No. WO9727207) ou sequências líderes, íntrons, etc. Descrições e exemplos gerais de vetores de expressão de planta e genes repórteres podem ser encontrados em Gruber e outros, "Vectors for Plant Transformation" em Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al eds; CRC Press pp. 89-119 (1993). A seleção de um vetor de expressão apropriado vai depender do hospedeiro e do método de introdução do vetor de expressão no hospedeiro. O cassete de expressão incluirá também no terminal 3’ da sequência de nucleotídeo heterólogo uma região de terminação transcricional e traducional funcional em plantas. A região de terminação pode ser nativa da sequência de nucleotídeo promotora das modalidades da presente invenção, pode ser nativa da sequência de DNA de interesse ou pode ser derivada de outra fonte. Regiões de terminação convenientes estão disponíveis do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, tais como as regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase (nos) (Depicker e outros, Mol. and Appl. Genet. 1:561-573 (1982) e Shaw e outros (1984) Nucleic Acids Research vol. 12, No. 20 pp7831- 7846(nos)); vide também Guerineau e outros Mol. Gen. Genet. 262:141144 (1991); Proudfoot, Cell 64:671-674 (1991); Sanfacon e outros, Genes Dev. 5:141-149 (1991); Mogen e outros Plant Cell 2:1261-1272 (1990); Munroe e outros Gene 91:151-158 (1990); Ballas e outros, Nucleic Acids Res. 17:7891-7903 (1989); Joshi e outros Nucleic Acid Res. 15:9627-9639 (1987).
[083] Os cassetes de expressão podem conter ainda sequências líderes 5’. Tais sequências líderes podem agir para aumentar a tradução. Líderes de tradução são conhecidos na técnica e incluem, a título de exemplo, líderes de picornavírus, líder de EMCV (Região de não codificação da encefalomiocardite 5’) Elroy-Stein e outros, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:6126-6130 (1989); líderes de potyvirus, por exemplo, líder de TEV (Vírus Etch do Tabaco) Carrington e Freed, Journal of Virology, 64:1590-1597 (1990), líder de MDMV (Vírus do Mosaico Anão do Milho), Allison e outros, Virology 154:9-20 (1986); proteína de ligação à cadeia pesada da imunoglobulina humana (BiP) (Binding Protein) Macejak e outros, Nature 353:90-94 (1991); líder não traduzido do mRNA da proteína de revestimento do vírus do mosaico da alfafa (AMV RNA 4), Jobling e outros, Nature 325:622-625 (1987); líder do vírus do mosaico do Tabaco (TMV) (Tobacco Mosaic Virus Leader), Gallie e outros, (1989) Molecular Biology of RNA, páginas 237-256; e líder do vírus mosqueado clorótico do milho (Maize Chlorotic Mottle Virus Leader) (MCMV) Lommel e outros, Virology 81:382-385 (1991). Vide também Della-Cioppa e outros, Plant Physiology 84:965-968 (1987).
[084] A construção pode também conter sequências que aumentam tradução e/ou estabilidade do mRNA tais como íntrons. Um exemplo de tal íntron é o primeiro íntron do gene II da variante H3.III da histona de Arabidopsis thaliana. Chaubet e outros, Journal of Molecular Biology, 225:569-574 (1992).
[085] Naqueles casos onde é desejável ter o produto expresso da sequência de nucleotídeo heteróloga direcionado a uma organela particular, particularmente ao plastídeo, amiloplasto, ou ao retículo endoplásmico, ou secretado na superfície da célula ou extracelularmente, o cassete de expressão pode compreender ainda uma sequência de codificação para um peptídeo de trânsito. Tais peptídeos de trânsito são bem conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados ao, peptídeo de trânsito para a proteína carreadora de acila, a subunidade pequena de RUBISCO, EPSP sintase de planta e Helianthus annuus (Patente U.S. No. 5.510.417), peptídeo de trânsito de cloroplasto Brittle-1 de Zea mays (Nelson e outros, Plant Physiol 117(4):1235-1252 (1998); Sullivan e outros, Plant Cell 3(12):1337-48; Sullivan e outros, Planta (1995) 196(3):477-84; Sullivan e outros, J. Biol. Chem. (1992) 267(26):18999-9004) e similar. Ainda, peptídeos de trânsito de cloroplasto quiméricos são conhecidos na técnica, tal como o Peptídeo de Trânsito Otimizado (Patente U.S. No. 5.510.471). Peptídeos de trânsito de cloroplasto adicionais foram anteriormente descritos nas Patente U.S. No. 5.717.084 e Patente U.S. No. 5.728.925. Um versado na técnica vai compreender prontamente que muitas opções estão disponíveis na expressão de um produto a uma organela particular. Por exemplo, a sequência da alfa amilase da cevada é frequentemente usada para direcionar a expressão para o retículo endoplasmático (Rogers, J. Biol. Chem. 260:3731-3738 (1985)).
[086] Será compreendido por um versado na técnica que uso de tecnologias de DNA recombinante pode melhorar o controle de expressão de moléculas de ácido nucleico transfectadas através da manipulação, por exemplo, do número de cópias das moléculas de ácido nucleico dentro da célula hospedeiro, da eficiência com a qual essas moléculas de ácido nucleico são transcritas, da eficiência com a qual os transcritos resultantes são traduzidos e da eficiência de modificações pós-traducionais. Ainda, a sequência de promotor seria geneticamente engenheirada para aperfeiçoar o nível de expressão comparado com o promotor nativo. Técnicas recombinantes úteis para o controle da expressão das moléculas de ácido nucleico incluem, mas não estão limitadas a, integração estável das moléculas de ácido nucleico em um ou mais cromossomos da célula hospedeiro, adição de sequências de estabilidade de vetor a plasmídeos, substituições ou modificações de sinais de controle de transcrito (por exemplo, promotores, operadores, aumentadores), substituições ou modificações de sinais de controle traducionais (por exemplo, sítios de ligação a ribossomo, sequências Shine-Dalgarno ou Kozak), modificação de moléculas de ácido nucleico para corresponder ao uso de códon da célula hospedeiro e deleção de sequências que desestabilizam transcritos.
[087] Genes repórteres ou marcadores para seleção de células ou tecidos ou partes de plantas ou plantas transformadas podem ser incluídos nos vetores de transformação. Exemplos de marcadores selecionáveis incluem aqueles que conferem resistência a antimetabólitos tais como herbicidas ou antibióticos, por exemplo, diidrofolato redutase, que confere resistência a metotrexato (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13:143-149, 1994; vide também Herrera Estrella e outros, Nature 303:209-213, (1983); Meijer e outros, Plant Mol. Biol. 16:807-820, (1991)); neomicina fosfotransferase, que confere resistência aos aminoglicosídeos neomicina, canamicina e paromicina (Herrera-Estrella, EMBO J. 2:987-995, 1983 e Fraley e outros, Proc. Natl. Acad. Sci USA 80:4803 (1983)) higromicina fosfotransferase, que confere resistência à higromicina (Marsh, Gene 32:481-485, (1984); vide também Waldron e outros, Plant Mol. Biol. 5:103-108, (1985); Zhijian e outros, Plant Science 108:219-227, (1995)); trpB, que permite que as células utilizem indol no lugar de triptofano; hisD, que permite que as células utilizem histinol no lugar de histidina (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85:8047, (1988)); manose-6-fosfato isomerase que permite que as células utilizem manose (Pedido de Patente Internacional No. WO 94/ 20627); ornitina descarboxilase, que confere resistência ao inibidor de ornitina descarboxilase, 2-(difluormetil)-DL- ornitina (DMFO; McConlogue, 1987, Em: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.); e desaminase de Aspergillus terreus, que confere resistência a Blasticidin S (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59:2336-2338, (1995)).
[088] Marcadores selecionáveis adicionais incluem, por exemplo, uma acetolactato sintase mutante, que confere resistência à imidazolinona ou sulfonilureia (Lee e outros, EMBO J. 7:1241-1248, (1988)), um psbA mutante, que confere resistência à atrazina (Smeda e outros, Plant Physiol. 103:911-917, (1993)) ou uma protoporfirinogeno oxidase mutante (vide Patente U.S. No. 5.767.373), ou outros marcadores conferindo resistência a um herbicida tal como glufosinato. Exemplos de genes marcadores selecionáveis incluem, mas não estão limitados a genes codificando resistência a cloranfenicol (Herrera Estrella e outros, EMBO J. 2:987-992, (1983)); estreptomicina (Jones e outros, Mol. Gen. Genet. 210:86-91, (1987)); espectinomicina (Bretagne-Sagnard e outros, Transgenic Res. 5:131-137, (1996)); bleomicina (Hille e outros, Plant Mol. Biol. 7:171-176, (1990)); sulfonamida (Guerineau e outros, Plant Mol. Biol. 15:127-136, (1990)); bromoxinila (Stalker e outros, Science 242:419-423, (1988)); glifosato (Shaw e outros, Science 233:478-481, (1986)); fosfinotricina (DeBlock e outros, EMBO J. 6:25132518, (1987)) e similar.
[089] Uma opção para uso de um gene seletivo é um DNA de codificação de resistência a glufosinato e em uma modalidade pode ser fosfinotricina acetil transferase (pat), gene pat ou gene bar otimizado do milho sob o controle do promotor do Vírus do Mosaico Comum da Mandioca. Esses genes conferem resistência a bialafos. Vide (vide, Wohlleben e outros, (1988) Gene 70: 25-37); Gordon-Kamm e outros, Plant Cell 2:603; 1990; Uchimiya e outros, BioTechnology 11:835, 1993; White e outros, Nucl. Acids Res. 18:1062, 1990; Spencer e outros, Theor. Appl. Genet. 79:625-631, 1990; e Anzai e outros, Mol. Gen. Gen. 219:492, 1989). Uma versão do gene pat é o gene pat otimizado do milho, descrito na Patente U.S. No. 6.096.947.
[090] Ainda, marcadores que facilitam identificação de uma célula de planta contendo o polinucleotídeo codificando o marcador podem ser empregados. Marcadores que podem ser classificados e avaliados são úteis, onde a presença da sequência produz um produto mensurável e pode produzir o produto sem destruição da célula de planta. Exemplos incluem uma β-glucuronidase, ou gene uidA (GUS), que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5.268.463 e 5.599.670); cloranfenicol acetil transferase (Jefferson e outros The EMBO Journal vol. 6 No. 13 pp. 3901-3907); e fosfatases alcalinas. Em uma modalidade preferida, o marcador usado é beta-caroteno ou pró-vitamina A (Ye e outros, Science 287:303-305- (2000)). O gene tem sido usado para aumentar a nutrição de arroz, mas neste caso ele é empregado como um marcador que pode ser avaliado, e a presença do gene ligado a um gene de interesse é detectada pela cor dourado provida. Diferente da situação onde o gene é usado para sua contribuição nutricional para a planta, uma quantidade menor de proteína é suficiente para propósitos de marcação. Outros marcadores que podem ser selecionados incluem os genes da antocianina/ flavonoide em geral (vide discussão em Taylor e Briggs, The Plant Cell (1990)2:115-127) incluindo, por exemplo, um gene do locus R, que codifica um produto que regula a produção de pigmentos antocianina (cor vermelha) em tecidos de planta (Dellaporta e outros, em Chromosome Structure and Function, Kluwer Academic Publishers, Appels and Gustafson eds., pp. 263-282 (1988)); os genes que controlam biossíntese de pigmentos flavonoides, tais como o gene C1 do milho (Kao e outros, Plant Cell (1996) 8: 1171-1179; Scheffler e outros, Mol. Gen. Genet. (1994) 242:40-48) e C2 do milho (Wienand e outros, Mol. Gen. Genet. (1986) 203:202-207); o gene B (Chandler e outros, Plant Cell (1989) 1:1175-1183), o gene p1 (Grotewold e outros, Proc. Natl. Acad. Sci USA (1991) 88:4587-4591; Grotewold e outros, Cell (1994) 76:543-553; Sidorenko e outros, Plant Mol. Biol. (1999)39:11-19); os genes do locus do bronze (Ralston e outros, Genetics (1988) 119:185-197; Nash e outros, Plant Cell (1990) 2(11): 1039-1049), dentre outros.
[091] Exemplos adicionais de marcadores selecionáveis incluem o gene da proteína fluorescente ciano (CYP) (Bolte e outros, (2004) J. Cell Science 117: 943-54 e Kato e outros, (2002) Plant Physiol. 129: 91342), o gene da proteína amarelo fluorescente (PHIYFP® da Evrogen; vide Bolte e outros, (2004) J. Cell Science 117: 943-54); um gene lux, que codifica uma luciferase, cuja presença pode ser detectada usando, por exemplo, película de raio X, contagem por cintilação, espectrometria fluorescente, câmeras de vídeo de pouca luz, câmeras de contagem de fóton ou luminometria multicavidade (Teeri e outros (1989) EMBO J. 8:343); um gene da proteína verde fluorescente (GFP) (Green Fluorescente Protein) (Sheen e outros, Plant J. (1995) 8(5):777-84); e DsRed2 onde as células de planta transformadas como o gene marcador são de cor vermelha e então visualmente selecionáveis (Dietrich e outros, (2002) Biotechniques 2(2):286-293). Exemplos adicionais incluem um gene da β-lactamase (Sutcliffe, Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. (1978) 75:3737), que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênica); um gene xylE (Zukowsky e outros, Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. (1983) 80:1101), que codifica uma catecol dioxigenase que pode converter catecóis cromogênicos; um gene da α- amilase (Ikuta e outros, Biotech. (1990) 8:241); e um gene da tirosinase (Katz e outros, J. Gen. Microbiol. (1983) 129:2703), que codifica uma enzima capaz de oxidar tirosina em DOPA e dopaquinona, que por sua vez condensa para formar o composto facilmente detectável melanina. Claramente, muitos tais marcadores estão disponíveis e são conhecidos do versado na técnica.
[092] Em certas modalidades, a sequência de nucleotídeo pode ser opcionalmente combinada com outra sequência de nucleotídeo de interesse. O termo "sequência de nucleotídeo de interesse" se refere a uma molécula de ácido nucleico (que pode ser também referida como um polinucleotídeo) que pode ser uma molécula de RNA transcrita bem como molécula de DNA, que codifica um polipeptídeo ou proteína desejado, mas também pode se referir a moléculas de ácido nucleico que não constituem um gene inteiro, e que não necessariamente codifica um polipeptídeo ou proteína (por exemplo, um promotor). Por exemplo, em certas modalidades a molécula de ácido nucleico pode ser combinada ou "empilhada" com outra que provê resistência ou tolerância adicional a glifosato ou outro herbicida, e/ou provê resistência a insetos ou doenças selecionadas e/ou aumentos nutricionais e/ou características agronômicas aperfeiçoadas e/ou proteínas ou outros produtos úteis em usos para ração, alimento, industrial, farmacêutico ou outros. O "empilhamento" de duas ou mais sequências de ácido nucleico de interesse dentro de um genoma de planta pode ser realizado, por exemplo, via reprodução de planta convencional usando dois ou mais eventos, transformação de uma planta com uma construção que contém as sequências de interesse, retransformação de uma planta transgênica ou adição de novas características através da integração direcionada via recombinação homóloga.
[093] Tais sequências de nucleotídeo de interesse incluem, mas não estão limitadas àqueles exemplos providos abaixo: 1. Genes ou Sequência de Codificação (por exemplo, iRNA) Que Conferem Resistência a Pestes ou Doença (A) Genes de Resistencia à Doença de Planta. As defesas da planta são frequentemente ativadas por interação específica entre o produto de um gene de resistência à doença (R) na planta e o produto de um gene de avirulência (Avr) correspondente no patógeno. Uma variedade de planta pode ser transformada com gene de resistência clonado para engenheirar plantas que são resistentes a linhagens de patógeno específicas. Exemplos de tais genes incluem o gene Cf-9 do tomate para resistência a Cladosporium fulvum (Jones e outros, 1994 Science 266:789), gene Pto do tomate, que codifica uma proteína cinase, para resistência a
[094] Pseudomonas syringae pv. tomate (Martin e outros, 1993 Science 262:1432) e gene RSSP2 de Arabidopsis para resistência a Pseudomonas syringae (Mindrinos e outros, 1994 Cell 78:1089). (B) Uma proteína de Bacillus thuringiensis, um derivado da mesma ou um polipeptídeo sintético modelado na mesma, uma sequência de nucleotídeo de um gene da Bt δ-endotoxina (Geiser e outros, 1986 Gene 48:109), e um gene inseticida vegetativo (VIP) (Vegetative Inseticidal) (vide, por exemplo, Estruch e outros, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:5389-94). Além disso, moléculas de DNA codificando genes da δ-endotoxina podem ser compradas da American Type Culture Collection (Rockville, Md.), sob os números de acesso 40098, 67136, 31995 e 31998. (C) Uma lectina, tais como sequências de nucleotídeo de vários genes da lectina de ligação à manose de Clivia miniata (Van Damme e outros, 1994 Plant Molec. Biol. 24:825). (D) Uma proteína de ligação à vitamina, tais como avidina e homólogos de avidina que são úteis como larvicidas contra pestes de inseto. Vide Patente U.S. No. 5.659.026. (E) Um inibidor de enzima, por exemplo, um inibidor de protease ou um inibidor de amilase. Exemplos de tais genes incluem um inibidor de proteinase da cisteína do arroz (Abe e outros, 1987 J. Biol. Chem. 262:16793), um inibidor I da proteinase do tabaco (Huub e outros, 1993 Plant Molec. Biol. 21:985) e um inibidor de α-amilase (Sumitani e outros, 1993 Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243). (F) Um hormônio ou feromônio específico de inseto tal como um ecdisteroide e hormônio juvenil, uma variante do mesmo, um mimético baseado no mesmo ou um antagonista ou agonista do mesmo, tal como expressão de baculovírus de esterase do hormônio juvenil clonado, um inativador de hormônio juvenil (Hammock e outros, 1990 Nature 344:458). (G) Um peptídeo ou neuropeptídeo específico de inseto que, quando da expressão, rompe a fisiologia da peste afetada (J. Biol. Chem. 269:9). Exemplos de tais genes incluem um receptor de hormônio diurético de inseto (Regan, 1994), uma alostatina identificada em Diploptera punctata (Pratt, 1989) e neurotoxinas paralíticas, específicas de inseto (Patente U.S. No. 5.266.361). (H) Um veneno específico de inseto produzido na natureza por uma cobra, uma vespa, etc, tal como um peptídeo insectotóxico de escorpião (Pang (1992) Gene 116:165). (I) Uma enzima responsável por um hiperacúmulo de monoterpeno, um sesquiterpeno, um esteroide, um ácido hidroxâmico, um derivado de fenilpropanoide ou outra molécula não proteína com atividade inseticida. (J) Uma enzima envolvida na modificação, incluindo a modificação pós-traducional, de uma molécula biologicamente ativa; por exemplo, enzima glicolítica, uma enzima proteolítica, uma enzima lipolítica, uma nuclease, uma ciclase, uma transaminase, uma esterase, uma hidrolase, uma fosfatase, uma cinase, uma polimerase, uma elastase, uma quitinase e uma glucanase, seja natural ou sintética. Exemplos de tais genes incluem um gene callas (Pedido de Patente Publicado PCT WO 93/ 02197), sequências de codificação de quitinase (que podem ser obtidas, por exemplo, da ATCC sob números de acesso 3999637 e 67152), quitinase da larva do tabaco (Kramer e outros, (1993) Insect Molec. Biol. 23:691) e gene da poliubiquitina ubi4-2 da salsa (Kawalleck e outros, (1993) Plant Molec. Biol. 21:673). (K) Uma molécula que estimula transdução de sinal. Exemplos de tais moléculas incluem sequências de nucleotídeo para clones de cDNA da calmodulina do feijão mung (Botella e outros, (1994) Plant Molec. Biol. 24:757) e uma sequência de nucleotídeo de um clone de cDNA da calmodulina do milho (Griess e outros, (1994) Plant Physiol. 104:1467). (L) Um peptídeo de momento hidrofóbico. Vide Patentes U.S. Nos. 5.659.026 e 5.607.914; a última ensina peptídeos antimicrobianos sintéticos que conferem resistência à doença. (M) Uma permease de membrana, um formador de canal ou um bloqueador de canal, tal como um análogo de peptídeo lítico cecropina-β (Jaynes e outros, (1993) Plant Sci. 89:43) que torna plantas de tabaco transgênicas resistentes a Pseudomonas solanacearum. (N) Uma proteína invasiva-viral ou uma toxina complexa derivada da mesma. Por exemplo, o acúmulo de proteínas de revestimento virais em células de planta transformadas fornece resistência a desenvolvimento de infecção e/ou doença viral realizado pelo vírus a partir do qual o gene de proteína de revestimento é derivado, bem como por vírus relacionados. Resistência mediada por proteína foi conferida a plantas transformadas contra vírus do mosaico da alfafa, vírus do mosaico do pepino, vírus da risca do tabaco, vírus X da batata, vírus Y da batata, vírus etch do tabaco, vírus rattle do tabaco e vírus do mosaico do tabaco. Vide, por exemplo, Beachy e outros, (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451. (O) Um anticorpo específico de inseto ou uma imunotoxina derivada do mesmo. Desta maneira, um anticorpo direcionado a uma função metabólica crítica no intestino do inseto inativaria uma enzima afetada, matando o inseto. Por exemplo, Taylor e outros, (1994) Abstract #497, Seventh Int'l. Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions shows enzymatic inactivation in transgenic tobacco via production of single-chain antibody fragments. (P) Um anticorpo específico de vírus. Vide, por exemplo, Tavladoraki e outros, (1993) Nature 266:469, que mostra que plantas transgênicas expressando genes de anticorpo recombinantes são protegidas de ataque por vírus. (Q) Uma proteína de parada de desenvolvimento produzida na natureza por um patógeno ou parasita. Desta maneira, endo α-1,4-D poligalacturonases fúngicas facilitam a colonização fúngica e liberação de nutriente da planta através da solubilização da homo-α-1,4-D- galacturonase da parede da célula da planta (Lamb e outros, (1992) Bio/Technology 10:1436). A clonagem e a caracterização de um gene que codifica uma proteína de inibição de endopoligalacturonase do feijão são descritas por (Toubart e outros, (1992) Plant J. 2:367). (R) Uma proteína de parada do desenvolvimento produzida na natureza por uma planta, tal como o gene de inativação do ribossomo da cevada que provê uma resistência aumentada à doença fúngica (Longemann e outros, (1992). Bio/Technology 10:3305). (S) Interferência de RNA, onde um polinucleotídeo DNA codificando uma molécula de RNA é usado para inibir expressão de um gene alvo. Uma molécula de RNA em um exemplo é parcialmente ou integralmente de fita dupla, que dispara uma resposta de silenciamento, resultando em clivagem de dsRNA em RNAs de interferência pequenos, que são então incorporados a um complexo de direcionamento que destrói mRNAs homólogos. Vide, por exemplo, Fire e outros, Patente U.S. No. 6,506,559; Graham e outros, Patente U.S. No. 6.573.099. 2. Genes que Conferem Resistência a um Herbicida (A) Genes codificando resistência ou tolerância a um herbicida que inibe o ponto de crescimento ou meristema, tal como um herbicida imidazalinona, sulfoanilida ou sulfonilureia. Genes exemplares nesta categoria codificam uma enzima ALS mutante (Lee e outros, (1988) EMBO J. 7:1241), que é também conhecida como enzima AHAS (Miki e outros, (1990) Theor. Appl. Genet. 80:449). (B) Um ou mais genes adicionais codificando resistência ou tolerância a glifosato fornecida por genes EPSP sintase e aroA mutantes ou através de inativação metabólica por genes tal como GAT (glifosato acetiltransferase) ou GOX (glifosato oxidase) e outros compostos fosfono tais como glufosinato (genes pat e bar; DSM-2) e ácidos ariloxifenoxipropiônico e cicloexanodionas (genes de codificação do inibidor de ACCase). Vide, por exemplo, Patente U.S. No. 4.940.835, que revela a sequência de nucleotídeo de uma forma de EPSP que pode conferir resistência a glifosato. Uma molécula de DNA codificando um gene aroA mutante pode ser obtida sob Número de Acesso ATCC 39256 e a sequência de nucleotídeo do gene mutante é revelada na Patente U.S. No. 4.769.061. O Pedido de Patente Europeu No. 0 333 033 e a Patente U.S. No. 4.975.374 revelam sequências de nucleotídeo de genes da glutamina sintetase que conferem resistência a herbicidas tal como L-fosfinotricina. A sequência de nucleotídeo de um gene da fosfinotricina acetil-transferase é provida no Pedido de Patente Europeu No. 0 242 246. De Greef e outros (1989) Bio/ Technology 7:61 descrevem a produção de plantas transgênicas que expressam genes bar quiméricos codificando atividade de fosfinotricina acetil transferase. Exemplares de genes conferindo resistência a ácidos ariloxifenoxipropiônicos e cicloexanodionas, tais como setoxidim e haloxifope, são os genes Accl-S1, Accl-S2 e Accl-S3 descritos por Marshall e outros, (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435. (C) Genes codificando resistência ou tolerância a herbicida que inibe fotossíntese, tal como uma triazina (genes psbA e gs+) e uma benzonitrila (gene da nitrilase). Przibilla e outros, (1991) Plant Cell 3:169 descrevem o uso de plasmídeos codificando genes psbA mutantes para transformar Chlamydomonas. Sequências de nucleotídeo para genes da nitrilase são reveladas na Patente U.S. No. 4.810.648 e moléculas de DNA contendo esses genes estão disponíveis sob números de acesso ATCC 53435, 67441 e 67442. Clonagem e expressão de DNA codificando uma glutationa S-transferase são descritas por Hayes e outros, (1992) Biochem. J. 285:173. (D) Genes codificando resistência ou tolerância a um herbicida que se liga a hidroxifenilpiruvato dioxigenase (HPPD), enzimas que catalisam a reação onde para-hidroxifenilpiruvato (HPP) é transformado em homogentisato. Isso inclui herbicidas tais como isoxazóis (Patente Europeia No. 418175, Patente Europeia No. 470856, Patente Europeia No. 487352, Patente Europeia No. 527036, Patente Europeia No. 560482, Patente Europeia No. 682659, Patente Europeia No. 5.424.276), em particular isoxaflutol, que é um herbicida seletivo para milho, dicetonitrilas (Patente Europeia No. 496630 e Patente Europeia No. 496631) em particular 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-SO2CH3- 4-CF3 fenil) propano-1,3-diona e 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-SO2CH3-4- 2,3C12fenil) propano-1,3-diona, tricetonas (Patente Europeia No. 625505, Patente Europeia No. 625508, Patente U.S. No. 5.506.195), em particular sulcotriona, e pirazolinatos. Um gene que produz uma superabundância de HPPD em plantas pode prover tolerância ou resistência a tais herbicidas, incluindo, por exemplo, genes descritos na Patente U.S. Nos. 6.268.549 e 6.245.968 e Pedido de Patente U.S., Publicação No. 200300660102. (E) Genes codificando resistência ou tolerância a herbicidas fenoxi auxina, tal como ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4- D), e que podem também conferir resistência ou tolerância a herbicidas ariloxifenoxipropionato (AOPP). Exemplos de tais genes incluem o gene da enzima dioxigenase dependente de α-cetoglutarato (aad-1), descrito na Patente U.S. No. 7.838.733. (F) Genes codificando resistência ou tolerância a herbicidas fenoxi auxina, tal como ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4- D), e que podem também conferir resistência ou tolerância a herbicidas piridiloxi auxina, tais como fluroxipir ou triclopir. Exemplos de tais genes incluem gene da enzima dioxigenase dependente de α-cetoglutarato (aad-12), descrito no WO 2007/ 053482 A2. (G) Genes codificando resistência ou tolerância a dicamba (vide, por exemplo, Publicação de Patente U.S. No. 20030135879). (H) Genes provendo resistência ou tolerância a herbicidas que inibem protoporfirinogeno oxidase (PPO) (vide Patente U.S. No. 5.767.373). (I) Genes provendo resistência ou tolerância a herbicidas triazina (tal como atrazina) e herbicidas derivados de ureia (tal como diurom) que se ligam a proteínas de núcleo de centros de reação do fotossistema II (PS II) (Vide Brussian e outros, (1989) EMBO J. 1989, 8(4): 1237-1245. 3. Genes que Conferem ou Contribuem para uma Característica de Valor Agregado (A) Metabolismo de ácido graxo modificado, por exemplo, através da transformação de milho ou Brassica com um gene antissenso ou estearoil-ACP dessaturase para aumentar o teor de ácido esteárico da planta (Knultzon e outros, (1992) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:2624. (B) Teor de fitato menor (1) Introdução de um gene de codificação de fitase, tal como gene da fitase de Aspergillus niger (Van Hartingsveldt e outros, (1993) Gene 127:87), aumenta a quebra de fitato, adicionando mais fosfato livre à planta transformada. (2) Um gene poderia ser introduzido, o qual reduz o teor de fitato. Em milho, isto, por exemplo, poderia ser realizado através da clonagem e então reintrodução de DNA associado com o alelo único que é responsável por mutantes de milho caracterizados por níveis baixos de ácido fítico (Raboy e outros, (1990) Maydica 35:383). (C) Composição de carboidrato modificada realizada, por exemplo, por transformação de plantas com um gene codificando uma enzima que altera o padrão de ramificação de amido. Exemplos de tais enzimas incluem gene da fructosiltransferase de Streptococcus mucus (Shiroza e outros, (1988) J. Bacteriol. 170:810), gene da levansucrase de Bacillus subtilis (Steinmetz e outros, (1985) Mol. Gen. Genel. 200:220), α-amilase de Bacillus licheniformis (Pen e outros, (1992) Bio/Technology 10:292), genes da invertase do tomate (Elliot e outros, (1993), gene da amilase da cevada (Sogaard e outros, (1993) J. Biol. Chem. 268:22480) e enzima II de ramificação de amido do endosperma do milho (Fisher e outros, (1993) Plant Physiol. 102:10450).
[095] São descritos aqui métodos de identificação da presença de um polinucleotídeo DNA doador inserido em loci genômicos alvo. Como uma modalidade adicional uma nuclease específica de sítio pode ser usada para clivar um locus genômico de planta endógeno não modificado, um locus genômico de planta previamente direcionado ou um DNA exógeno previamente inserido. O direcionamento de loci genômicos endógenos é uma modalidade da invenção.
[096] Em modalidades, os métodos e as composições descritos aqui fazem uso de uma nuclease específica de sítio que compreende um Meganuclease engenheirada (de ocorrência não natural) (também descrita como endonucleases de alojamento). As sequências de reconhecimento de endonucleases ou meganucleases de alojamento tais como I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII e I-TevIII são conhecidas. Vide também Patente U.S. No. 5.420.032; Patente U.S. No. 6.833.252; Belfort e outros (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-30 3388; Dujon e outros (1989) Gene 82:115-118; Perler e outros (1994) Nucleic Acids Res. 22, 11127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble e outros (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast e outros (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 e o catálogo da New England Biolabs. Ainda, a especificidade de ligação de DNA de endonucleases e meganucleases de alojamento pode ser engenheirada para se ligar a sítios alvo não naturais. Vide, por exemplo, Chevalier e outros (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat e outros (2003) Nucleic Acids Res. 5 31:2952-2962; Ashworth e outros (2006) Nature 441:656-659; Paques e outros (2007) Current Gene Therapy 7:49-66; Publicação de Patente U.S. No. 20070117128. Os domínios de ligação de DNA das endonucleases e meganucleases de alojamento podem ser alterados no contexto da nuclease como um todo (isto é, de maneira que a nuclease inclua o domínio de clivagem cognato) ou podem ser fundidos a um domínio de clivagem heterólogo.
[097] Em outras modalidades, o domínio de ligação de DNA de uma ou mais das nucleases usadas nos métodos e composições descritos aqui compreende um domínio de ligação de DNA efetor TAL de ocorrência natural ou engenheirado (de ocorrência não natural). Vide, por exemplo, Publicação de Patente U.S. No. 20110301073 incorporada aqui a título de referência em sua totalidade. As bactérias patogênicas de planta do gênero Xanthomonas são conhecidas causar muitas doenças em plantas de cultura importantes. A patogenicidade de Xanthomonas depende de um sistema de secreção tipo III conservado (T3S) que injeta mais do que proteínas efetoras diferentes na célula da planta. Dentre essas proteínas injetadas estão efetores tipo ativador de transcrição (TALEN) (Transcription Activator-Like) que imitam ativadores transcripcionais de planta e manipulam transcriptoma (vide Kay et al (2007) Science 318:648-651). Essas proteínas contêm um domínio de ligação de DNA e um domínio de ativação transcricional. Um dos efetores TAL mais bem caracterizados é AvrBs3 de Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria (vide Bonas et al (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136 e WO2010079430). Os efetores TAL contêm um domínio centralizado de repetições em tandem, cada repetição contendo aproximadamente 34 aminoácidos, que são chave para a especificidade de ligação de DNA dessas proteínas. Ainda, eles contêm uma sequência de localização nuclear e um domínio de ativação transcricional ácido (para uma revisão vide Schornack S. e outros (2006) J. Plant Physiol. 163(3): 256-272). Ainda, nas bactérias patogênicas Ralstonia solanacearum dois genes, chamados brg11 e hpx17, foram encontrados, os quais são homólogos para a família AvrBs3 de Xanthomonas na linhagem biovar GMI1000 de R. solanacearum e na linhagem biovar 4 RS1000 (vide Heuer et al (2007) Appl and Enviro Micro 73(13): 4379-4384). Esses genes são 98,9% idênticos em sequência de nucleotídeo um ao outro, mas diferem por uma deleção de 1,575 pb no domínio de repetição de hpx17. No entanto, ambos os produtos de gene têm menos de 40% de identidade de sequência com as proteínas da família AvrBs3 de Xanthomonas. Vide, por exemplo, Publicação de Patente U.S. No. 20110301073 incorporada a título de referência em sua totalidade.
[098] A especificidade desses efetores TAL depende das sequências encontradas nas repetições em tandem. A sequência repetida compreende aproximadamente 102 pb e as repetições são tipicamente 91-100% homólogas umas às outras (Bonas e outros, ibid). Polimorfismo das repetições está geralmente localizado nas posições 12 e 13 e lá parece ser uma correspondência um-para-um entre a identidade dos dirresíduos hipervariáveis nas posições 12 e 13 com a identidade dos nucleotídeos contíguos na sequência alvo do efetor TAL (vide Moscou e Bogdanove, (2009) Science 326:1501 e Boch et al (2009) Science 326:1509-1512). Experimentalmente, o código natural para reconhecimento de DNA desses efetores TAL foi determinado de maneira que uma sequência HD nas posições 12 e 13 leva a uma ligação à citosina (C), NG se liga a T, NI a A, C, G ou T, NN se liga a A ou G e ING se liga a T. Essas repetições de ligação de DNA foram montadas em proteínas com novas combinações e números de repetição, para fazer fatores de transcrição artificiais que sejam capazes de interagir com novas sequências e ativar a expressão de um gene repórter não endógeno em células de planta (Boch e outros, ibid). Proteínas TAL engenheiradas foram ligadas a uma metade de domínio de clivagem FokI para fornecer uma fusão de nuclease de domínio de efetor TAL (TALEN) exibindo atividade em um ensaio repórter de levedura (alvo baseado em plasmídeo).
[099] O sistema de nuclease CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/ Cas (CRISPR Associated) é um sistema de nuclease recentemente engenheirado baseado em um sistema bacteriano que pode ser usado para engenharia de genoma. Ele é baseado em parte na resposta imune adaptativa de muitas bactérias e Archea. Quando um vírus ou plasmídeo invade uma bactéria, segmentos do DNA do invasor são convertidos em RNAs CRISPR (crRNA) pela resposta ‘imune’. Este crRNA então se associa, através de uma região de complementaridade parcial, com outro tipo de RNA chamado tracrRNA para guiar a nuclease Cas9 para uma região homóloga ao crRNA no DNA alvo chamado um "protoespaçador". Cas9 cliva o DNA para gerar extremidades cegas no DSB em sítios especificados por uma sequência de orientação de 20 nucleotídeos contida dentro do transcrito de crRNA. Cas9 requer ambos o crRNA e o tracrRNA para reconhecimento de DNA específico de sítio e clivagem. Este sistema foi agora engenheirado de maneira que o crRNA e o tracrRNA podem ser combinados em uma molécula (o "RNA de orientação único") e a porção equivalente de crRNA do RNA de orientação único pode ser engenheirada para guiar a nuclease Cas9 para se direcionar a qualquer sequência desejada (vide Jinek et al (2012) Science 337, p. 816-821, Jinek et al, (2013), eLife 2:e00471, e David Segal, (2013) eLife 2:e00563). Desta maneira, o sistema CRISPR/ Cas pode ser engenheirado para criar uma quebra de fita dupla (DSB) (Double-Stranded Break) em um alvo desejado em um genoma, e reparo de DSB pode ser influenciada pelo uso de inibidores de reparo para causar um aumento em reparo propenso a erro.
[0100] Em certas modalidades, proteína Cas pode ser um "derivado funcional" de uma proteína Cas de ocorrência natural. Um "derivado funcional" de um polipeptídeo de sequência nativa é um composto tendo uma propriedade biológica qualitativa em comum com um polipeptídeo da sequência nativa. "Derivados funcionais" incluem, mas não estão limitados a fragmentos de uma sequência nativa e derivados de um polipeptídeo de sequência nativa e seus fragmentos, contanto que eles tenham uma atividade biológica em comum com um polipeptídeo de sequência nativa correspondente. Uma atividade biológica compreendida aqui é a habilidade do derivado funcional em hidrolisar um substrato de DNA em fragmentos. O termo "derivado" compreende ambas as variantes de sequência de aminoácido de polipeptídeo, modificações covalentes e suas fusões. Derivados adequados de um polipeptídeo Cas ou um fragmento do mesmo incluem, mas não estão limitados a mutantes, fusões, modificações covalentes de proteína Cas ou um fragmento da mesma. Proteína Cas, que inclui proteína Cas ou um fragmento da mesma, bem como derivados de proteína Cas ou um fragmento da mesma podem ser obtidos a partir de uma célula ou quimicamente sintetizados ou por uma combinação desses dois procedimentos. A célula pode ser uma célula que produz naturalmente proteína Cas, ou uma célula que produz naturalmente proteína Cas e é geneticamente engenheirada para produzir a proteína Cas endógena em um nível de expressão mais alto ou produzir uma proteína Cas a partir de um ácido nucleico exogenamente introduzido, ácido nucleico que codifica uma Cas que é igual ou diferente da Cas endógena. Em alguns casos, a célula não produz naturalmente proteína Cas e é geneticamente engenheirada para produzir uma proteína Cas. A proteína Cas é destituída em células de mamífero (e putativamente dentro de células de planta) através de co-expressão da nuclease de Cas com RNA de orientação. Duas formas de RNAs de orientação podem ser usadas para facilitar clivagem de genoma mediada por Cas conforme revelado em Le Cong, F. e outros (2013) Science 339(6121):819-823.
[0101] Em certas modalidades, o domínio de ligação de DNA de uma ou mais das nucleases usadas para clivagem in vivo e/ou clivagem alvo do genoma de uma célula compreende uma proteína dedo de zinco. Em algumas modalidades, a proteína dedo de zinco é de ocorrência não natural pelo fato que ela é engenheirada para se ligar a um sítio alvo de escolha. Vide, por exemplo, Beerli e outros (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo e outros (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan e outros (2001) Nature Biotechnol. 19:656660; Segal e outros (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo e outros (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; Patentes U.S. Nos. 6.453.242; 6.534.261; 6.599.692; 6.503.717; 6689.558; 7.030.215; 6.794.136; 7.067.317; 7.262.054; 7.070.934; 7.361.635; 7.253.273; e Publicações de Patente U.S. Nos. 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061, todos aqui incorporados a título de referência em suas totalidades.
[0102] Um domínio de ligação a dedo de zinco engenheirada pode ter uma nova especificidade de ligação, comparado com uma proteína dedo de zinco de ocorrência natural. Métodos de engenharia incluem, mas não estão limitados a projeto racional e vários tipos de seleção. Projeto racional inclui, por exemplo, uso de bancos de dados compreendendo sequências de nucleotídeo tripleto (ou quadrupleto) e sequências de aminoácido de dedo de zinco individuais, onde cada sequência de nucleotídeo tripleto ou quadrupleto é associada com uma ou mais sequências de aminoácido de dedos de zinco que se ligam à sequência tripleto ou quadrupleto particular. Vide, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 6.453.242 e 6.534.261, incorporadas aqui a título de referência em suas totalidades.
[0103] Seleção de sítios alvo; ZFPs e métodos para projeto e construção de proteínas de fusão (e polinucleotídeos codificando as mesmas) são conhecidos daqueles versados na técnica e descritos em detalhes nas Patentes U.S. Nos. 6.140.0815; 789.538; 6.453.242; 6.534.261; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.200.759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 e WO 03/016496.
[0104] Ainda, conforme revelado nessas e em outras referências, domínios de dedo de zinco e/ou proteínas dedo de zinco com múltiplos dedos podem ser unidos usando quaisquer sequências ligantes adequadas, incluindo, por exemplo, ligantes de 5 ou mais aminoácidos de comprimento. Vide também Patentes U.S. Nos. 6.479.626; 6.903.185; e 7.153.949 para sequências ligantes exemplares de 6 ou mais aminoácidos de comprimento. As proteínas descritas aqui podem incluir qualquer combinação de ligantes adequados entre os dedos de zinco individuais da proteína.
[0105] Desta maneira, a nuclease específica de sítio compreende um domínio de ligação de DNA que se liga especificamente ao sítio alvo em qualquer gene no qual é desejado inserir um polinucleotídeo DNA doador (isto é, compreendendo pelo menos um transgene).
[0106] Qualquer domínio de clivagem adequado pode ser operativamente ligado a um domínio de ligação de DNA para formar uma proteína de fusão de nuclease. Por exemplo, domínios de ligação de DNA de ZFP foram fundidos a domínios de nuclease para criar ZFNs - uma entidade funcional que é capaz de reconhecer seu ácido nucleico pretendido alvo através de seu domínio de ligação de DNA engenheirado (ZFP) e faz com que o DNA seja cortado próximo do sítio de ligação de ZFP via a atividade de nuclease. Vide, por exemplo, Kim e outros (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(3):1156-1160. Mais recentemente, ZFNs têm sido usadas para modificação de genoma em uma variedade de organismos. Vide, por exemplo, Publicações de Patente dos Estados Unidos 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231; e Publicação Internacional WO 07/014275. Da mesma maneira, domínios de ligação de DNA TALEN foram fundidos a domínios de nuclease para criar TALENs. Vide, por exemplo, Publicação U.S. No. 20110301073.
[0107] Conforme acima mencionado, o domínio de clivagem pode ser heterólogo ao domínio de ligação de DNA, por exemplo, um domínio de ligação de DNA de dedo de zinco e um domínio de clivagem de uma nuclease diferente ou um domínio de ligação de DNA de TALEN e um domínio de clivagem de uma nuclease diferente, ou um domínio de ligação de DNA de meganuclease e domínio de clivagem de uma nuclease diferente. Domínios de clivagem heterólogos podem ser obtidos de qualquer endonucleases ou exonuclease. Endonucleases exemplares das quais um domínio de clivagem pode ser derivado incluem, mas não estão limitadas a endonucleases de restrição e endonucleases de alojamento. Vide, por exemplo, Catálogo 2002-2003, New England Biolabs, Beverly, MA; e Belfort e outros (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388. Enzimas adicionais que clivam DNA são conhecidas (por exemplo, Nuclease S1; nuclease de feijão mung; DNase I pancreática; nuclease micrococcal; endonucleases HO de levedura; vide também Linn e outros (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993). Uma ou mais dessas enzimas (ou fragmentos funcionais das mesmas) podem ser usadas como uma fonte de domínios de clivagem e uma metade de domínios de clivagem.
[0108] Similarmente, uma metade de domínio de clivagem pode ser derivada de qualquer nuclease ou porção da mesma, conforme acima descrito, que requeira dimerização para atividade de clivagem. Em geral, duas proteínas de fusão são requeridas para clivagem se as proteínas de fusão compreenderem metades de domínios de clivagem. Alternativamente, uma proteína única compreendendo duas metades de domínios de clivagem pode ser usada. As duas metades de domínios de clivagem podem ser derivadas da mesma endonucleases (ou fragmentos funcionais das mesmas) ou cada metade de domínio de clivagem pode ser derivada de uma endonuclease diferente (ou fragmentos funcionais da mesma). Ainda, os sítios alvo para as duas proteínas de fusão são preferivelmente dispostos, um com relação ao outro, de maneira que a ligação das duas proteínas de fusão aos seus respectivos sítios alvo posiciona as metades de domínio em uma orientação espacial uma com a outra que permite que as metades de domínio de clivagem formem um domínio de clivagem funcional, por exemplo, através de dimerização. Desta maneira, em certas modalidades, as bordas proximais dos sítios alvo são separadas por 58 nucleotídeos ou por 15-18 nucleotídeos. No entanto, qualquer número integral de nucleotídeos ou pares de nucleotídeo pode acontecer entre dois sítios alvo (por exemplo, de a partir de 2 a 50 pares de nucleotídeo ou mais). Em geral, o sítio de clivagem se encontra entre os dois sítios alvo.
[0109] Endonucleases de restrição (enzimas de restrição) estão presentes em muitas espécies e são capazes de ligação específica de sequência a DNA (em um sítio de reconhecimento) e clivagem de DNA no ou próximo do sítio de ligação. Certas enzimas de restrição (por exemplo, tipo IIS) clivam DNA em sítios removidos do sítio de reconhecimento e têm domínios de ligação e clivagem separáveis. Por exemplo, a enzima Fok I Tipo IIS catalisa clivagem de fita dupla de DNA, em 9 nucleotídeos de seu sítio de reconhecimento em uma fita e 13 nucleotídeos de seu sítio de reconhecimento na outra. Vide, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5.356.802; 5.436.150 e 5.487.994; bem como Li e outros (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li e outros (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim e outros (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim e outros (1994b) J. Biol. Chem. 269:31.978-31.982. Desta maneira, em uma modalidade, proteínas de fusão compreendem o domínio de clivagem (ou metade de domínio de clivagem) de pelo menos uma enzima de restrição Tipo IIS e um ou mais domínios de ligação de dedo de zinco, que podem ou não ser engenheirados.
[0110] Uma enzima de restrição Tipo IIS exemplar, cujo domínio de clivagem é separável do domínio de ligação, é Fok I. Esta enzima particular é ativa como um dímero. Bitinaite e outros, (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10.570-10.575. Desta maneira, para os propósitos da presente invenção, a porção da enzima Fok I usada nas proteínas de fusão reveladas é considerada uma metade de domínio de clivagem. Desta maneira, para clivagem de fita dupla direcionada e/ou substituição direcionada de sequências celulares usando fusões dedo de zinco-Fok I, duas proteínas de fusão, cada uma compreendendo uma metade de domínio de clivagem de Fok I, podem ser usadas para reconstituir um domínio de clivagem cataliticamente ativo. Alternativamente, uma molécula de polipeptídeo única contendo um domínio de ligação de dedo de zinco e duas metades de domínio de clivagem de Fok I pode ser também usada. Parâmetros para clivagem direcionada e alteração de sequência direcionada usando fusões de dedo de zinco-For I são providos em outro ponto no presente pedido.
[0111] Um domínio de clivagem ou metade de domínio de clivagem pode ser qualquer poção de uma proteína que retém atividade de clivagem ou que retém a habilidade em multimerizar (por exemplo, dimerizar) para formar um domínio de clivagem funcional.
[0112] Enzimas de restrição Tipo IIS exemplares são descritas na Publicação do Pedido de Patente Internacional WO 07/ 014275, aqui incorporada em sua totalidade. Enzimas de restrição adicionais também contêm domínios de ligação e clivagem separáveis, e esses são compreendidos pela presente invenção. Vide, por exemplo, Roberts e outros (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420.
[0113] Em certas modalidades, o domínio de clivagem compreende uma ou mais metades de domínio de clivagem engenheiradas (também referidas como mutantes de domínio de dimerização) que minimizam ou previnem homodimerização, conforme descrito, por exemplo, nas Publicações de Patente U.S. Nos. 20050064474; 20060188987; 20070305346 e 20080131962, cujas descrições são aqui incorporadas a título de referência em suas totalidades. Os resíduos de aminoácido nas posições 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537 e 538 de Fok I são todos alvos para influência de dimerização da metade de domínios de clivagem de Fok I.
[0114] Metade de domínios de clivagem engenheiradas exemplares de Fok I que formam heterodímeros obrigatórios incluem um par onde uma primeira metade de domínio de clivagem inclui mutações em resíduos de aminoácido nas posições 490 a 538 de Fok I e uma segunda metade de domínio de clivagem inclui mutações nos resíduos de aminoácido 486 a 499.
[0115] Desta maneira, em uma modalidade, uma mutação em 490 substitui Glu (E) com Lys (K); a mutação em 538 substitui Iso (I) com Lys (K); e mutação de 486 substitui Gln (Q) com Glu (E); e a mutação na posição 499 substitui Iso (I) com Lys (K). Especificamente, as metades de domínios de clivagem engenheiradas descritas aqui foram preparadas através de mutação das posições 490 (E^K) e 538 (I^K) em uma metade de domínio de clivagem para produzir uma metade de domínio de clivagem engenheirada designada "E490K:I538K" e por mutação das posições 486 (Q^E) e 499 (I^L) em outra metade de domínio de clivagem para produzir uma metade de domínio de clivagem engenheirada designada "Q486E:I499L". As metades de domínio de clivagem engenheiradas descritas aqui são mutantes de heterodímero obrigatórios onde clivagem aberrante é minimizada ou abolida. Vide, por exemplo, Publicação de Patente U.S. No. 2008/ 0131962, cuja descrição é aqui incorporada a título de referência em sua totalidade para todos os propósitos. Em certas modalidades, a metade de domínio de clivagem engenheirada compreende mutações nas posições 486, 499 e 496 (numeradas com relação à Fok I do tipo selvagem), por exemplo, mutações que substituem o resíduo Gln (Q) do tipo selvagem na posição 486 com um resíduo Glu (E), o resíduo Iso (I) do tipo selvagem na posição 499 com um resíduo Leu (L) e o resíduo Asn (N) do tipo selvagem na posição 496 com m resíduo Asp (D) ou Glu (E) (também referido como domínios "ELD" e "ELE", respectivamente). Em outras modalidades, a metade de domínio de clivagem engenheirada compreende mutações nas posições 490, 538 e 537 (numeradas com relação à Fok I do tipo selvagem), por exemplo, mutações que substituem o resíduo Glu (E) do tipo selvagem na posição 490 com um resíduo Lys (K), o resíduo Iso (I) do tipo selvagem na posição 538 com um resíduo Lys (K) e o resíduo His (H) do tipo selvagem na posição 537 com um resíduo Lys (K) ou um resíduo Arg (R) (também referido como domínios "KKK" e "KKR", respectivamente). Em outras modalidades, a metade de domínio de clivagem engenheirada compreende mutações nas posições 490 e 537 (numeradas com relação a Fok I do tipo selvagem), por exemplo, mutações que substituem o resíduo Glu (E) do tipo selvagem na posição 90 com um resíduo Lys (K) e o resíduo His (H) do tipo selvagem na posição 537 com um resíduo Lys (K) ou um resíduo Arg (R) (também referido como domínios "KIK" ou"KIR", respectivamente). (Vide Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 20110201055). Em outras modalidades, a metade de domínio de clivagem engenheirada compreende as mutações "Sharkey" e/ou "Sharkey" (vide Guo et al, (2010) J. Mol. Biol. 400(1):96-107).
[0116] Metades de domínios de clivagem engenheiradas descritas aqui podem ser preparadas usando qualquer método adequado, por exemplo, através de mutagênese direcionada a sítio de metades de domínios de clivagem do tipo selvagem (Fok I) conforme descrito nas Publicações de Patente U.S. Nos. 20050064474; 20080131962; e 20110201055.
[0117] Alternativamente, nucleases podem ser montadas in vivo no sítio alvo de ácido nucleico usando a chamada tecnologia "de enzima de separação" (vide, por exemplo, Publicação de Patente U.S. No. 20090068164). Os componentes de tais enzimas de separação podem ser expressos ou em construções de expressão separadas ou podem ser ligadas em uma estrutura de leitura aberta onde os componentes individuais são separados, por exemplo, por um peptídeo 2A de autoclivagem ou sequência IRES. Os componentes podem ser domínios de ligação de dedo de zinco individuais ou domínios de um domínio de ligação de ácido nucleico de meganuclease.
[0118] As nucleases podem ser avaliadas quanto à atividade antes do uso, por exemplo, em um sistema cromossômico à base de levedura conforme descrito no WO 2009/ 042163 e no 20090068164. As construções de expressão de nuclease podem ser prontamente projetadas usando métodos conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Publicações de Patente dos Estados Unidos 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231; e Publicação Internacional WO 07/ 014275. Expressão da nuclease pode estar sob o controle de um promotor constitutivo ou um promotor induzível.
[0119] Um "alvo" ou "sítio alvo" ou "locus genômico alvo" é uma sequência de ácido nucleico que define uma porção de um ácido nucleico ao qual uma molécula de ligação (por exemplo, nuclease específica de sítio) se ligará, contanto que condições suficientes para a ligação existam.
[0120] Em uma modalidade uma sequência de locus genômica inclui aquelas presentes em cromossomos, epissomos, genomas organelares (por exemplo, mitocôndria, cloroplasto), cromossomos artificiais e qualquer outro tipo de ácido nucleico presente em uma célula tais como, por exemplo, sequências amplificadas, cromossomos duplos minutos e os genomas de bactérias e vírus endógenos ou infectantes. Sequências de locus genômicas podem ser normais (isto é, do tipo selvagem) ou mutantes; sequências mutantes podem compreender, por exemplo, inserções (por exemplo, polinucleotídeos exógenos previamente inseridos), deleções, translocações, rearranjos e/ou mutações por ponto. Uma sequência de locus genômica pode também compreender vários alelos diferentes.
[0121] São também descritos aqui como uma modalidade da invenção métodos para inserção de uma sequência de polinucleotídeo DNA doador em loci genômicos. Frequências relatadas e observadas de modificação genômica alvo indicam que o direcionamento de loci genômicos dentro de plantas é relativamente ineficiente. A taxa de sucesso de tais métodos é baixa, devido em parte à eficiência pobre de recombinação homóloga e uma alta frequência de inserção não específica do DNA doador em regiões do genoma que não o sítio alvo. A presente invenção provê métodos para identificação de um polinucleotídeo DNA doador dentro de loci genômicos alvo.
[0122] Os métodos da presente invenção envolvem produção e uso de nucleases específicas de sítio (por exemplo, domínios de ligação de dedo de zinco engenheirados fundidos a domínios de clivagem) para produzir uma ou mais quebras de fita dupla alvo em DNA celular. Devido ao fato das quebras de fita dupla em DNA celular estimular mecanismos de reparo celular várias milhares de vezes na vizinhança do sítio de clivagem, tal clivagem direcionada permite a alteração ou substituição (via reparo direcionado por homologia) de sequências em virtualmente qualquer sítio no genoma.
[0123] Em adição às moléculas de fusão descritas aqui, substituição direcionada de uma sequência genômica selecionada também requer a introdução da sequência de polinucleotídeo de substituição ou DNA doador. A sequência de polinucleotídeo DNA doador pode ser introduzida em uma célula antes da, concomitantemente com ou subsequente à, expressão da(s) proteína(s) de fusão. O polinucleotídeo DNA doador contém homologia suficiente com uma sequência genômica para apoiar recombinação homóloga (ou reparo direcionado por homologia) entre ele e a sequência genômica para a qual ele carrega homologia. Aproximadamente 25, 50, 100, 200, 500, 750, 1.000, 1.500, 2.000 nucleotídeos ou mais de homologia de sequência entre um polinucleotídeo DNA doador e um locus genômico (ou qualquer valor integral entre 10 e 20.000 nucleotídeos, ou mais) vai apoiar recombinação homologa entre eles. As sequências de polinucleotídeo DNA doador podem variar em comprimento de a partir de 10 a 5.000 nucleotídeos (ou qualquer valor integral de nucleotídeos entre eles) ou maior. Será prontamente aparente que a sequência de polinucleotídeo DNA doador é tipicamente não idêntica à sequência genômica que ela substitui. Por exemplo, a sequência do polinucleotídeo DNA doador pode conter uma ou mais mudanças, inserções, deleções, inversões ou rearranjos de base únicas com relação à sequência genômica, contanto que homologia suficiente com sequências cromossômicas esteja presente. Alternativamente, a sequência de polinucleotídeo DNA doador pode conter uma sequência não homóloga flanqueada por duas regiões de homologia. Ainda, sequências de polinucleotídeo DNA doador podem compreender uma molécula de vetor contendo sequências que não são homólogas à região de interesse em cromatina celular. Em geral, a(s) região(ões) homólogas de uma sequência de polinucleotídeo DNA doador terá(ão) pelo menos 50% de identidade de sequência com um locus genômico com o qual recombinação é desejada. Em certas modalidades, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 99,9% de identidade de sequência estão presentes. Qualquer valor entre 1% e 100% de identidade de sequência pode estar presente, dependendo do comprimento do polinucleotídeo DNA doador.
[0124] Uma molécula de polinucleotídeo DNA doador pode conter várias regiões de homologia, descontínuas, para cromatina celular. Por exemplo, para inserção direcionada de sequências não normalmente presentes em uma região de interesse, as ditas sequências podem estar presentes em uma molécula de ácido polinucleico de DNA e flanqueadas por regiões de homologia com a sequência na região de interesse.
[0125] O polinucleotídeo doador pode ser DNA ou RNA, de fita simples ou fita dupla e pode ser introduzido em uma célula em forma linear ou circular. Se introduzido em forma linear, as extremidades da sequência doadora podem ser protegidas (por exemplo, de degradação exonucleotídica) através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica. Por exemplo, um ou mais resíduos de didesoxinucleotídeo são adicionados ao terminal 3’ de uma molécula linear e/ou oligonucleotídeos autocomplementares são ligados a uma ou ambas as extremidades. Vide, por exemplo, Chang e outros, (1987) Proc. Natl Acad. Sd. USA 84:4959- 4963; Nehls e outros, (1996) Science 272:886889. Métodos adicionais para proteção de polinucleotídeos exógenos contra degradação incluem, mas não estão limitados a adição de grupo(s) amino terminais e o uso de ligações internucleotídeo modificadas tais como, por exemplo, resíduos fosforotioatos, fosforamidatos e O-metil ribose ou desoxirribose.
[0126] Um polinucleotídeo DNA doador pode ser introduzido em uma célula como parte de uma molécula de vetor tendo sequências adicionais tais como, por exemplo, origens de replicação, promotores e genes codificando resistência a antibiótico. Além disso, polinucleotídeos DNA doadores podem ser introduzidos como ácido nucleico nu, como ácido nucleico complexado com um agente tal como um lipossomo ou um poloxâmero ou podem ser aplicados por bactérias ou vírus (por exemplo, Agrobacterium sp., Rhizobium sp. NGR234, Sinorhizoboium meliloti, Mesorhizobium loti, vírus do mosaico do tabaco, vírus X da batata, vírus do mosaico da couve-flor e vírus do mosaico comum da mandioca. Vide, por exemplo, Chung e outros (2006) Trends Plant Sd. 11(1): 1-4).
[0127] Sem ser limitado pela teoria, parece que a presença de uma quebra de fita dupla em uma sequência celular, acoplada com a presença de uma molécula de DNA exógena tendo homologia com uma região adjacente a ou circundando a quebra, ativa mecanismos celulares que reparam a quebra através de transferência de informação de sequência da molécula doadora para a sequência celular (por exemplo, genômica ou cromossômica); isto é, através de um processo de reparo direcionado por homologia, também conhecido como "conversão de gene". Os métodos da requerente combinam vantajosamente as capacidades de direcionamento poderosas de ZFPs engenheiradas com um domínio de clivagem (ou metade de domínio de clivagem) para especificamente direcionar uma quebra de fita dupla à região do genoma onde inserção de sequências exógenas é desejada.
[0128] Para alteração de uma sequência cromossômica, não é necessário que a sequência inteira do doador seja copiada no cromossomo, contanto que suficiente da sequência doadora seja copiado para realizar a alteração de sequência desejada.
[0129] A eficiência de inserção de sequências doadoras através de recombinação homóloga é inversamente relacionada à distância, no DNA celular, entre a quebra e fita dupla e o sítio no qual recombinação é desejada. Em outras palavras, eficiências de recombinação homóloga superiores são observadas quando a quebra de fita dupla está mais próxima do sítio no qual recombinação é desejada. Em casos onde um sítio de recombinação preciso não é predeterminado (por exemplo, o evento de recombinação desejado pode ocorrer em um intervalo de sequência genômica), o comprimento e a sequência do ácido nucleico doador, junto com o(s) sítio(s) de clivagem, são selecionados para obter o evento de recombinação desejado. Em casos onde o evento desejado é projetado para mudar a sequência de um par de nucleotídeo único em uma sequência genômica, cromatina celular é clivada dentro de 10.000 nucleotídeos em qualquer lado deste par de nucleotídeo. Em certas modalidades, a clivagem ocorre dentro de 1.000, 500, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 ou 2 nucleotídeos, ou qualquer valor integral entre 2 e 1.000 nucleotídeos, em qualquer lado do par de nucleotídeo cuja sequência deve ser modificada.
[0130] Conforme acima detalhado, os sítios de ligação para duas proteínas de fusão, cada um compreendendo um domínio de ligação dedo de zinco e uma metade de domínio de clivagem, podem estar localizados 5-8 ou 15-18 nucleotídeos separados, conforme medido a partir da borda de cada sítio de ligação mais próximo do outro sítio de ligação, e clivagem ocorre entre os sítios de ligação. Se clivagem ocorre em um sítio único ou em sítios múltiplos entre os sítios de ligação é irrelevante, uma vez que as sequências genômicas clivadas são substituídas pelas sequências doadoras. Desta maneira, para alteração eficiente da sequência de um par de nucleotídeo único através de recombinação direcionada, o ponto médio da região entre os sítios de ligação está dentro de 10.000 nucleotídeos deste par de nucleotídeo, preferivelmente dentro de 1.000 nucleotídeos ou 500 nucleotídeos ou 200 nucleotídeos ou 100 nucleotídeos ou 50 nucleotídeos ou 20 nucleotídeos ou 10 nucleotídeos ou 5 nucleotídeos ou 2 nucleotídeos ou um nucleotídeo ou no par de nucleotídeo de interesse.
[0131] Em certas modalidades, um cromossomo homólogo pode servir como o polinucleotídeo DNA doador. Desta maneira, por exemplo, correção de uma mutação em um heterozigoto pode ser obtida através de engenharia de proteínas de fusão que se ligam a e clivam a sequência mutante em um cromossomo, mas não clivam a sequência do tipo selvagem no cromossomo homólogo. A quebra de fita dupla no cromossomo carregando mutação estimula um processo de "conversão de gene" baseado em homologia onde a sequência do tipo selvagem do cromossomo homólogo é copiada no cromossomo clivado, desta maneira restaurando duas cópias da sequência do tipo selvagem.
[0132] São também providos métodos e composições que aumentam os níveis de recombinação direcionada incluindo, mas não limitado ao uso de fusões de ZFP-domínio funcional adicionais para ativar expressão de genes envolvidos em recombinação homóloga, tal como, por exemplo, membros do grupo epistasis RAD52 (por exemplo,
[0133] Rad50, Rad51, Rad51B, RadSIC, RadSID, Rad52, Rad54, Rad54B, Mrell, XRCC2, XRCC3), genes cujos produtos interagem com os produtos de gene mencionados acima (por exemplo, BRCA1, BRCA2) e/ou genes no complexo NBS1. Vide, por exemplo, Boyko e outros (2006) Plant Physiology 141 :488-497 e LaFarge e outros (2003) Nucleic Acids Res. 31(4): 1148- 1155. Similarmente, fusões ZFP- domínio funcional podem ser usadas, em combinação com os métodos e composições revelados aqui, para reprimir expressão de genes envolvidos em união de extremidade não homóloga (por exemplo, Ku70/80, XRCC4, poli(ADP ribose) polimerase, DNA ligase 4). Vide, por exemplo, Riha e outros (2002) EMBO 21 :2819- 2826; Freisner e outros (2003) Plant J. 34:427-440; Chen e outros (1994) European Journal of Biochemistry 224:135-142. Métodos para ativação e repressão de expressão de gene usando fusões entre um domínio de ligação de dedo de zinco e um domínio funcional são revelados, por exemplo, nas Patentes U.S. de co-propriedade 6.534.261; 6.824.978 e 6.933.113. Métodos de repressão adicionais incluem o uso de oligonucleotídeos antissenso e/ou RNA de interferência pequeno (siRNA ou RNAi) direcionados para a sequência do gene a ser reprimido.
[0134] As manipulações genéticas de um hospedeiro recombinante reveladas aqui podem ser realizadas usando técnicas genéticas padrão em qualquer célula hospedeiro que seja adequada para manipulação genética. Em algumas modalidades, uma célula hospedeiro recombinante revelada aqui pode ser qualquer organismo ou microrganismo hospedeiro útil para modificação genética e expressão de gene recombinante. Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante pode ser, mas não está limitado a qualquer planta superior, incluindo ambas as plantas dicotiledôneas e monocotiledôneas, e plantas consumíveis, incluindo plantas de cultura e plantas usadas para seus óleos. Desta maneira, espécie de planta ou célula de planta pode ser selecionada conforme descrito em detalhes abaixo.
[0135] Em algumas modalidades, plantas que compreendem um polinucleotídeo DNA doador inserido em um locus genômico alvo de acordo com a presente invenção (por exemplo, células de planta hospedeiro) incluem, mas não estão limitadas a quaisquer plantas superiores, incluindo ambas as plantas dicotiledôneas e monocotiledôneas, e particularmente plantas consumíveis, incluindo plantas de cultura. Tais plantas podem incluir, mas não estão limitadas a, por exemplo: alfafa, sojas, algodão, semente de colza (também descrita como canola), semente de linhaça, milho, arroz, braquiária, trigo, açafrões, sorgo, beterraba açucareira, girassóis, tabaco e gramas. Desta maneira, qualquer espécie de planta ou célula de planta pode ser selecionada. Em modalidades, células de planta usadas aqui, e plantas cultivadas ou derivadas das mesmas, incluem, mas não estão limitadas a, células obteníveis de semente de colza (Brassica napus); mostarda indiana (Brassica juncea); mostarda etiopiana (Brassica carinata); nabo (Brassica rapa); repolho (Brassica oleracea); soja (Glycine max); semente de linhaça/ cânhamo (Linum usitatissimum); milho (Zea mays); açafrão (Carthamus tinctorius); girassol (Helianthus annuus); tabaco (Nicotiana tabacum); Arabidopsis thaliana; castanha do Pará (Betholettia excelsa); mamoma (Ricinus communis); coco (Cocus nucifera); coentro (Coriandrum sativum); algodão (Gossypium spp.); noz (Arachis hypogaea); jojoba (Simmondsia chinensis); óleo de palma (Elaeis guineeis); oliva (Olea eurpaea); arroz (Oryza sativa); abóbora (Cucurbita maxima); cevada (Hordeum vulgare); cana-de-açúcar (Saccharum officinarum); arroz (Oryza sativa); trigo (Triticum spp. incluindo Triticum durum e Triticum aestivum); e lentilha d’água (Lemnaceae sp.).
[0136] "Partes de planta", conforme aqui usado, inclui quaisquer partes de uma planta, incluindo mas não limitado a, sementes (incluindo sementes maduras e sementes imaturas), um corte da planta, uma célula de planta, uma cultura de célula de planta, um órgão de planta, pólen, embriões, flores, frutas, brotos, folhas, raízes, caules, explantes, etc. Uma célula de planta é a unidade estrutural e fisiológica da planta, compreendendo um protoplasto e uma parede celular. Uma célula de planta pode estar na forma de uma célula única isolada ou agregado de células tais como calos friáveis, ou uma célula cultivada, ou pode ser parte de uma unidade organizada superior, por exemplo, um tecido de planta, um órgão de planta ou planta. Desta maneira, uma célula de planta pode ser um protoplasto, uma célula produtora de gameta ou uma célula ou coleção de células que podem regenerar em uma planta inteira. Desta maneira, uma semente, que compreende células de planta múltiplas e é capaz de regenerar em uma planta inteira, é considerada uma célula de planta para propósitos da presente invenção. Um tecido de planta ou órgão de planta pode ser uma semente, protoplasto, calo ou quaisquer outros grupos de células de planta que são organizados em uma unidade estrutura ou funcional. Partes particularmente úteis de uma planta incluem partes que podem ser colhidas e partes úteis para propagação de plantas progênies. Uma parte que pode ser colhida de uma planta pode ser qualquer parte útil de uma planta, por exemplo, flores, pólen, mudas, tubérculos, folhas, caules, fruta, sementes, raízes e similar. Uma parte de uma planta útil para propagação inclui, por exemplo, sementes, frutas, cortes, mudas, tubérculos, porta-enxertos e similar. A cultura de tecido será preferivelmente capaz de regenerar plantas tendo as características fisiológicas e morfológicas da planta de cruzamento entre a mesma espécie acima e de regenerar plantas tendo substancialmente o mesmo genótipo que a planta de cruzamento entre a mesma espécie acima. Em uma modalidade, as células regeneráveis em tais culturas de tecido serão embriões, protoplastos, células meristemáticas, calos, pólen, folhas, anteras, raízes, pontas de raiz, flores, grãos, espigas, sabugos, cascas ou pedúnculos. Ainda, modalidades da presente invenção proveem plantas regeneradas a partir das culturas de tecido de modalidades da invenção.
[0137] Com relação à produção de plantas compreendendo um polinucleotídeo DNA doador inserido em um locus genômico, métodos para a transformação de plantas são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, vários métodos para transformação de planta foram desenvolvidos, incluindo protocolos de transformação biológica e física para plantas dicotiledôneas bem como plantas monocotiledôneas (por exemplo, Goto-Fumiyuki e outros, Nature Biotech 17:282-286 (1999); Miki e outros, Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. e Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 67-88 (1993)). Ainda, vetores compreendendo cassetes de expressão de gene e métodos de cultura in vitro para transformação de célula ou tecido e regeneração de plantas estão disponíveis, por exemplo, em Gruber e outros, Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. e Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 89-119 (1993).
[0138] Um grande número de técnicas está disponível para inserção de DNA compreendendo um cassete de expressão de gene em uma célula hospedeiro de planta. Essas técnicas incluem transformação com T-DNA desarmado usando Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes como o agente de transformação, transfecção com fosfato de cálcio, transformação de polibreno, fusão de protoplastos, eletroporação, métodos ultrassônicos (por exemplo, sonoporação), transformação de lipossomo, microinjeção, DN nu, vetores de plasmídeo, vetores virais, biolística (bombardeamento de micropartícula), transformação mediada por carbida de silício WHISKERS®, feixe de aerossol ou transformação mediada por Poli Etileno Glicol bem como outros métodos possíveis.
[0139] Por exemplo, a construção de DNA compreendendo um cassete de expressão de gene pode ser introduzida diretamente no DNA genômico da célula de planta usando técnicas tais como eletroporação e microinjeção de protoplastos de célula de planta, ou as construções de DNA podem ser introduzidas diretamente no tecido de planta usando métodos biolísticos, tal como bombardeamento de partícula de DNA (vide, por exemplo, Klein e outros (1987) Nature 327:70-73). Métodos adicionais para transformação de célula de planta incluem microinjeção via absorção de DNA mediada por carbida de silício WHISKERS® (Kaeppler e outros (1990) Plant Cell Reporter 9:415-418). Alternativamente, a construção de DNA pode ser introduzida na célula de planta via transformação de nanopartícula (vide, por exemplo, Pedido de Patente U.S. No. 12/ 245.685, que é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade).
[0140] Outro método conhecido de transformação de planta é transformação mediada por microprojétil onde DNA é carregado na superfície de microprojéteis. Neste método, o vetor de expressão é introduzido em tecidos de planta com um dispositivo biolístico que acelera os microprojéteis para velocidades suficientes para penetrar nas paredes e membranas de célula de planta. Sanford e outros, Part. Sci. Technol. 5:27 (1987), Sanford, J. C., Trends Biotech. 6:299 (1988), Sanford, J. C., Physiol. Plant 79:206 (1990), Klein e outros, Biotechnology 10:268 (1992).
[0141] Alternativamente, métodos de transferência e transformação de gene incluem, mas não estão limitados a transformação de protoplastos através de precipitação com cloreto de cálcio, absorção de DNA mediada por poli etileno glicol (PEG) ou eletroporação (vide Paszkowski e outros (1984) EMBO J 3:2717-2722, Potrykus e outros (1985) Molec. Gen. Genet. 199:169-177; Fromm e outros (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:5824-5828; e Shimamoto (1989) Nature 338:274-276) e eletroporação de tecidos de planta (D'Halluin e outros (1992) Plant Cell 4:1495-1505).
[0142] Um método amplamente utilizado para introdução de um vetor compreendendo um cassete de expressão de gene em plantas é baseado no sistema de transformação natural de Agrobacterium. Horsch e outros, Science 227:1229 (1985). A. tumefaciens e A. rhizogenes são bactérias do solo patogênicas de planta conhecidas ser úteis para transformar plantas geneticamente. Os plasmídeos Ti e Ri de A. tumefaciens e A. rhizogenes, respectivamente, carregam genes responsáveis por transformação genética da planta. Kado, C. I., Crit. Rev. Plant. Sci. 10:1 (1991). Descrições de sistemas de vetor de Agrobacterium e métodos para transferência de gene medida por Agrobacterium estão também disponíveis, por exemplo, Gruber e outros, supra, Miki e outros, supra, Moloney e outros, Plant Cell Reports 8:238 (1989) e Patentes U.S. Nos. 4.940.838 e 5.464.763.
[0143] Se Agrobacterium for usada para a transformação, o DNA a ser inserido deve ser clonado em plasmídeos especiais, a saber ou em um vetor intermediário ou em um vetor binário. Vetores intermediários não podem replicar sozinhos em Agrobacterium. O vetor intermediário pode ser transferido para Agrobacterium tumefaciens por meio de um plasmídeo auxiliar (conjugação). O sistema Superbinário de Tabaco do Japão é um exemplo de tal sistema (revisto por Komari e outros, (2006) In: Methods in Molecular Biology (K. Wang, ed.) No. 343: Agrobacterium Protocols (2a Edição, Vol. 1) HUMANA PRESS Inc., Totowa, NJ, pp.1541; e Komori e outros, (2007) Plant Physiol. 145:1155-1160). Vetores binários podem replicar em ambos E. coli e Agrobacterium. Eles compreendem um gene marcador de seleção e um ligante ou poliligante que são estruturados pelas regiões de borda de T-DNA direita e esquerda. Eles podem ser transformados diretamente em Agrobacterium (Holsters, 1978). A Agrobacterium usada como células hospedeiro deve compreender um plasmídeo carregando uma região vir. O plasmídeo Ti ou Ri também compreende a região vir necessária para a transferência do T-DNA. A região vir é necessária para a transferência do T-DNA para a célula de planta. T-DNA adicional pode estar contido.
[0144] As funções de virulência do hospedeiro Agrobacterium tumefaciens vão direcionar a inserção de uma fita T contendo a construção e marcador adjacente no DNA da célula de planta quando a célula é infectada pela bactéria usando um vetor de T DNA binário (Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12:8711-8721) ou o procedimento de co- cultivo
[0145] (Horsch e outros (1985) Science 227:1229-1231). Em geral, o sistema de transformação de Agrobacterium é usado para engenheirar plantas dicotiledôneas (Bevan e outros (1982) Ann. Rev. Genet 16:357-384; Rogers e outros (1986) Methods Enzymol. 118:627641). O sistema de transformação de Agrobacterium pode também ser usado para transformar, bem como transferir, DNA para plantas monocotiledôneas e células de planta. Vide Patente U.S. No. 5. 591.616; Hernalsteen e outros (1984) EMBO J. 3:3039-3041; Hooykass- Van Slogteren e outros (1984) Nature 311:763-764; Grimsley e outros (1987) Nature 325:1677-179; Boulton e outros (1989) Plant Mol. Biol. 12:31-40; e Gould e outros (1991) Plant Physiol. 95:426-434.
[0146] Seguindo a introdução da construção genética compreendendo um cassete de expressão de gene em células de planta, células de planta podem ser cultivadas e quando da emergência de tecido de diferenciação tais como brotos e raízes, plantas maduras podem ser geradas. Em algumas modalidades, uma pluralidade de plantas pode ser gerada. Metodologias para regeneração de plantas são conhecidas daqueles de habilidade comum na técnica e podem ser encontradas, por exemplo, em: Plant Cell and Tissue Culture, 1994, Vasil and Thorpe Eds. Kluwer Academic Publishers e em: Plant Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology 111, 1999 Hall Eds Humana Press). A planta geneticamente modificada descrita aqui pode ser cultivada em um meio de fermentação ou cultivada em um meio adequado tal como solo. Em algumas modalidades, um meio de crescimento adequado para plantas superiores pode incluir qualquer meio de crescimento para plantas, mas não limitado a solo, areia, qualquer outro meio particular que apoie crescimento de raiz (por exemplo, vermiculita, perlita, etc) ou cultura hidropônica, bem como luz, água e suplementos nutricionais adequados que otimizem o crescimento da planta superior.
[0147] Células de planta transformadas que são produzidas através de qualquer uma das técnicas de transformação acima podem ser cultivadas para regenerar uma planta inteira que possui o genótipo transformado e então o fenótipo desejado. Tais técnicas de regeneração se apoiam na manipulação de certos fito-hormônios em um meio de crescimento de cultura de tecido, tipicamente se apoiando em um marcador biocida e/ou herbicida que foi introduzido junto com as sequências de nucleotídeo desejadas. Regeneração de planta a partir de protoplastos cultivados é descrita em Evans e outros, "Protoplasts Isolation and Culture" em Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983; e Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985. Regeneração pode ser também obtida a partir de calos, explantes, órgãos, pólens, embriões de plantas e suas partes. Tais técnicas de regeneração são descritas geralmente em Klee e outros (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486.
[0148] Ácidos nucleicos introduzidos em uma célula de planta podem ser usados para conferir características desejadas essencialmente em qualquer planta. Uma ampla variedade de plantas e sistemas de célula de planta pode ser engenheirada para as características fisiológicas e genômicas descritas aqui usando as construções de ácido nucleico da presente invenção e os vários métodos de transformação mencionados acima. Em modalidades preferidas, as plantas e células de planta para engenharia incluem, mas não estão limitadas a, aquelas plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas, tais como culturas incluindo culturas de grão (por exemplo, trigo, milho, arroz, painço, cevada), culturas de fruta (por exemplo, tomate, maçã, pera, morango, laranja), culturas de forragem (por exemplo, alfafa), culturas de vegetais de raiz (por exemplo, cenoura, batata, beterrabas açucareiras, inhame), culturas de vegetais folhosos (por exemplo, alface, espinafre); plantas de floração (por exemplo, petúnia, rosa, crisântemo), árvores coníferas e pinheiros (por exemplo, pinheiro, pinho); plantas usadas em fitorremediação (por exemplo, plantas de acúmulo de metal pesado); culturas de óleo (por exemplo, girassol, semente de colza) e plantas usadas para propósitos experimentais (por exemplo, Arabdopsis). Desta maneira, os métodos e as composições revelados têm uso em uma ampla faixa de plantas incluindo, mas não limitado a espécie dos gêneros Asparagus, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Cucurbita, Daucus, Erigeron, Glycine, Gossypium, Hordeum, Lactuca, Lolium, Lycopersicon, Malus, Manihot, Nicotiana, Orychophragmus, Oryza, Persea, Phaseolus, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Secale, Solanum, Sorghum, Triticum, Vitis, Vigna e Zea mays.
[0149] Uma célula de planta, calo, tecido ou planta transformado pode ser identificado e isolado através de seleção ou avaliação do material de planta engenheirado quanto a características codificadas pelos genes marcadores presentes no DNA transformante. Por exemplo, seleção pode ser realizada cultivando o material de planta engenheirado em meio contendo uma quantidade inibidora do antibiótico ou herbicida para o qual a construção de gene transformante confere resistência. Ainda, plantas e células de planta transformadas podem ser também identificadas através da avaliação quanto a atividades de quaisquer genes marcadores visíveis (por exemplo, a β- glucuronidase, luciferase ou genes gfp) que podem estar presentes nas construções de ácido nucleico recombinante. Tais metodologias de seleção e avaliação são bem conhecidas daqueles versados na técnica.
[0150] O termo "introduzido" no contexto de inserção de um ácido nucleico em uma célula inclui transformação na célula, bem como cruzamento de uma planta tendo a sequência com outra planta, de maneira que a segunda planta contém a sequência heteróloga, como em técnicas de cruzamento de planta convencionais. Tais técnicas de cruzamento são bem conhecidas do versado. Para uma discussão de técnicas de cruzamento de planta vide Poehlman (1995) Breeding Field Crops. AVI Publication Co., Westport Conn, 4a Edição. Métodos de retrocruzamento podem ser usados para introduzir um gene nas plantas. Esta técnica tem sido usada por décadas para introduzir características em uma planta. Um exemplo de uma descrição disto e outras metodologias de cruzamento de planta que são bem conhecidos podem ser encontrados em referências tal como Poehlman, supra, e Plant Breeding Methodology, edit. Neal Jensen, John Wiley & Sons, Inc. (1988). Em um protocolo de retrocruzamento típico, a variedade original de interesse (origem recorrente) é cruzada com uma segunda variedade (origem não recorrente) que carrega o gene único de interesse a ser transferido. As progênies resultantes deste cruzamento são então cruzadas novamente com a origem recorrente e o processo é repetido até que uma planta seja obtida onde essencialmente todas as características morfológica e fisiológicas desejadas da origem recorrente sejam recuperadas na planta convertida, em adição ao gene transferido único da origem não recorrente.
[0151] O termo "evento" transgênico se refere a uma planta recombinante produzida através de transformação e regeneração de uma célula de planta única com DNA heterólogo, por exemplo, um cassete de expressão que inclui um gene de interesse. O termo "evento" se refere ao transformante original e/ou progênie do transformante que inclui o DNA heterólogo. O termo "evento" também se refere à progênie produzida por um cruzamento sexuado entre o transformante e outra planta. Mesmo após retrocruzamento repetido com uma origem recorrente, o DNA inserido e o DNA de flanqueamento da origem transformada estão presentes na progênie do cruzamento no mesmo locus cromossômico. Normalmente, transformação de tecido de planta produz eventos múltiplos, cada um deles representa inserção de uma construção de DNA em um locus diferente no genoma de uma célula de planta. Com base na expressão do transgene ou outras características desejáveis, um evento particular é selecionado. Em modalidades da presente invenção o evento particular compreende um polinucleotídeo DNA doador inserido em um locus genômico alvo.
[0152] Um "transgene" se refere a um gene introduzido no genoma de um organismo através de manipulação genética a fim de alterar seu genótipo.
[0153] Uma "planta transgênica" é uma planta tendo uma ou mais células de planta que contêm um vetor de expressão compreendendo um cassete de expressão de gene. O termo "RNA Mensageiro (mRNA)" se refere ao RNA que está sem íntrons e que pode ser traduzido em proteína pela célula.
[0154] Conforme aqui usado, "DNA de inserção" se refere ao DNA heterólogo dentro do polinucleotídeo DNA doador compreendendo um cassete de expressão de gene usando para transformar o material de planta enquanto "DNA de flanqueamento" ou "DNA de junção" pode compreender ou DNA genômico naturalmente presente em um organismo tal como uma planta ou DNA estranho (heterólogo) introduzido via o processo de transformação que é exterior à molécula de DNA de inserção original, por exemplo, fragmentos associados com o evento de transformação. Uma "junção" ou "região de flanqueamento" ou "sequência de flanqueamento" conforme aqui usado se refere a uma sequência de pelo menos 20, 50, 100, 200, 300, 400, 1000, 1500, 2000, 2500 ou 5000 pares de base ou mais que está localizada ou imediatamente a jusante de e contígua a ou imediatamente a jusante de e contígua à molécula de DNA de inserção estranha original.
[0155] Em uma modalidade a invenção refere-se a um método para identificar a presença de um polinucleotídeo DNA doador dentro de um genoma alvo via uma reação de amplificação onde um amplicon é gerado. A detecção da ausência do amplicon é uma indicação de se loci genômicos foram rompidos. Em modalidades adicionais, a presença de um amplicon é uma indicação que um polinucleotídeo DNA doador foi inserido nos loci genômicos.
[0156] Vários ensaios podem ser empregados em relação à reação de amplificação de certas modalidades da invenção. As técnicas que seguem são úteis em uma variedade de situações e, em uma modalidade, são úteis na detecção da presença da molécula de ácido nucleico e/ou do polipeptídeo codificando em uma célula de planta. Por exemplo, a presença da molécula pode ser determinada em uma variedade de maneiras, incluindo uso de um iniciador ou sonda da sequência. O transgene pode ser seletivamente expresso em alguns tecidos da planta ou em alguns estágios do desenvolvimento, ou o transgene pode ser expresso em substancialmente todos os tecidos de planta, substancialmente ao longo de todo o seu ciclo de vida. No entanto, qualquer modo de expressão combinatorial é também aplicável.
[0157] Amplificação de uma sequência de ácido nucleico selecionada, ou alvo, pode ser realizada através de qualquer meio adequado. Vide em geral G. Walker e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 392-396 (1992); G. Walker e outros, Nucleic Acids Res. 20, 16911696 (1992)), amplificação baseada em transcrição (vide D. Kwoh e outros, Proc. Natl. Acad Sci. USA 86, 1173-1177 (1989)), replicação de sequência autossustentada (ou "3SR") (vide J. Guatelli e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874-1878 (1990)), o sistema de Qβ replicase (vide P. Lizardi e outros, BioTechnology 6, 1197-1202 (1988)), amplificação baseada em sequência de ácido nucleico (ou "NASBA") (vide R. Lewis, Genetic Engineering News 12 (9), 1 (1992)), a reação em cadeia de reparo (ou "RCR") (vide R. Lewis, supra) e amplificação de DNA boomerang (ou "BDA") (vide R. Lewis, supra). Reação em cadeia da polimerase é geralmente preferida.
[0158] "Amplificação" é um caso especial de replicação de ácido nucleico envolvendo especificidade de molde. Ela deve ser contrastada com replicação de molde não específica (isto é, replicação que é dependente de molde, mas não dependente de um molde específico). Especificidade de molde é aqui distinguida de fidelidade de replicação (isto é, síntese da sequência de polinucleotídeo apropriada) e especificidade de nucleotídeo (ribo- ou desoxirribo-). Especificidade de molde é frequentemente descrita em termos de especificidade "alvo". Sequências alvo são "alvos" no sentido que elas são pretendidas ser escolhidas de outro ácido nucleico. Técnicas de amplificação foram projetadas principalmente para esta escolha.
[0159] Conforme aqui usado, o termo "reação em cadeia da polimerase" e "PCR" geralmente se refere ao método para aumento da concentração de um segmento de uma sequência alvo em uma mistura de DNA genômico sem clonagem ou purificação (Patentes U.S. Nos. 4.683.195; 4.683.202; e 4.965.188; aqui incorporadas a título de referência). Este processo para amplificação da sequência alvo compreende introdução de um excesso de dois iniciadores de oligonucleotídeo na mistura de DNA contendo a sequência alvo desejada, seguido por uma sequência precisa de ciclização térmica na presença de uma polimerase de DNA. Os dois iniciadores são complementares as suas respectivas fitas da sequência alvo de fita dupla. Para realizar amplificação, a mistura é desnaturada e os iniciadores então anelados para suas sequências complementares dentro da molécula alvo. Seguindo anelamento, os iniciadores são prolongados com uma polimerase de maneira a formar um novo par de fitas complementares. As etapas de desnaturação, anelamento de iniciador e extensão de polimerase podem ser repetidas muitas vezes (isto é, desnaturação, anelamento e extensão constituem um "ciclo"; pode haver vários "ciclos") para obter uma concentração alta de um segmento amplificado da sequência alvo desejada. O comprimento do segmento amplificado da sequência alvo desejada é determinado pelas posições relativas dos iniciadores com relação um ao outro e, então, este comprimento é um parâmetro controlável. Em virtude do aspecto de repetição do processo, o método é referido como a "reação em cadeia da polimerase" (daqui em diante "PCR"). Devido ao fato dos segmentos amplificados desejados da sequência alvo se tornarem as sequências predominantes (em termos de concentração) na mistura, eles são ditos ser amplificadas por "PCR".
[0160] O termo "pluralidade" é usado aqui para significar dois ou mais, por exemplo, três, quatro, cinco ou mais, incluindo dez, vinte, cinquenta ou mais polinucleotídeos, sondas de ácido nucleico e similar.
[0161] O termo "transcriptase reversa" ou "RT-PCR" se refere a um tipo de PCR onde o material de partida é mRNA. O mRNA de partida é enzimaticamente convertido em DNA ou "cDNA" complementar usando uma enzima transcriptase reversa. O cDNA é então usado como um "molde" para uma reação de "PCR".
[0162] Em uma modalidade, a reação de amplificação é quantificada. Em outras modalidades, a reação de amplificação é quantificada usando um perfil de assinatura, onde o perfil de assinatura é selecionado do grupo consistindo em um perfil de assinatura de temperatura de fusão ou um de fluorescência.
[0163] A molécula de ácido nucleico de modalidades da invenção, ou seus segmentos, pode ser usada como iniciadores para amplificação por PCR. Na reação de amplificação por PCR, um certo grau de incompatibilidade pode ser tolerado entre iniciador e molde. Desta maneira, mutações deleções e inserções (especialmente adições de nucleotídeos à extremidade 5’ ou 3’) dos iniciadores exemplificados se encaixam no escopo da presente invenção. Mutações, inserções e deleções podem ser produzidas em um dado iniciador através de métodos conhecidos de um versado comum na técnica.
[0164] Sinais moleculares foram descritos para uso em detecção de sequência. Em suma, uma sonda de oligonucleotídeo FRET é projetada, a qual se sobrepõe à junção de DNA genômico de flanqueamento e de inserção. A estrutura única da sonda FRET resulta em ela conter uma estrutura secundária que mantém as porções fluorescente e de extinção em proximidade grande. A sonda FRET e os iniciadores de PCR (um iniciador na sequência de DNA de inserção e um na sequência genômica de flanqueamento) são ciclizados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPS. Seguindo a amplificação por PCR bem sucedida, hibridização da(s) sonda(s) FRET para a sequência alvo resulta na remoção da estrutura secundária da sonda e separação espacial das porções fluorescente e de extinção. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência genômica de flanqueamento/ de inserção de transgene devido à amplificação e hibridização bem-sucedidas. Tal ensaio de sinal molecular para detecção de uma reação de amplificação é uma modalidade da presente invenção.
[0165] Ensaio de sonda de hidrólise, conhecido também como TAQMAN® (Life Technologies, Foster City, Calif.), é um método de detecção e quantificação da presença de uma sequência de DNA. Em suma, uma sonda de oligonucleotídeo FRET é projetada com um oligo dentro do transgene e um na sequência genômica de flanqueamento para detecção específica de evento. A sonda de FRET e os iniciadores de PCR (um iniciador na sequência de DNA de inserção e um na sequência genômica de flanqueamento) são ciclizados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPS. Hibridização da sonda de FRET resulta em clivagem e liberação da porção fluorescente para longe da porção de extinção na sonda de FRET. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência de flanqueamento/ inserção de transgene devido à amplificação e hibridização bem-sucedidas. Tal ensaio de sonda de hidrólise para detecção de uma reação de amplificação é uma modalidade da presente invenção.
[0166] Ensaios KASPar são um método de detecção e quantificação da presença de uma sequência de DNA. Em suma, a amostra de DNA genômico compreendendo o locus genômico alvo é avaliada usando um ensaio baseado em reação em cadeia da polimerase (PCR) conhecido como um sistema de ensaio KASPar®. O ensaio KASPar® usado na prática da presente invenção pode utilizar uma mistura de ensaio de PCR KASPar® que contém iniciadores múltiplos. Os iniciadores usados na mistura de ensaio de PCR podem compreender pelo menos um iniciador avançado e pelo menos um iniciador reverso. O iniciador avançado contém uma sequência correspondendo a uma região específica do polinucleotídeo DNA doador e o iniciador reverso contém uma sequência correspondendo a uma região específica da sequência genômica. Ainda, os iniciadores usados na mistura de ensaio de PCR podem compreender pelo menos um iniciador avançado e pelo menos um iniciador reverso. Por exemplo, a mistura de ensaio de PCR KASPar® pode usar dois iniciadores avançados correspondendo a dois alelos diferentes e um iniciador reverso. Um dos iniciadores avançado contém uma sequência correspondendo à região específica da sequência genômica endógena. O segundo iniciador avançado contém uma sequência correspondendo a uma região específica do polinucleotídeo DNA doador. O iniciador reverso contém uma sequência correspondendo a uma região específica da sequência genômica. Tal ensaio KASPar® para detecção de uma reação de amplificação é uma modalidade da presente invenção.
[0167] Em algumas modalidades o sinal fluorescente ou corante fluorescente é selecionado do grupo consistindo em um corante fluorescente HEX, um corante fluorescente FAM, um corante fluorescente JOE, um corante fluorescente TET, um corante fluorescente Cy 3, um corante fluorescente Cy 3.5, um corante fluorescente Cy 5, um corante fluorescente Cy 5.5, um corante fluorescente Cy 7 e um corante fluorescente ROX.
[0168] Em outras modalidades a reação de amplificação é realizada usando segundos corantes de DNA fluorescentes adequados que são capazes de tingir DNA celular em uma faixa de concentração detectável através de citometria de fluxo e têm um espectro de emissão fluorescente que é detectável por uma termociclizador de tempo real. Deve ser compreendido por aqueles versados na técnica que outros corantes de ácido nucleico são conhecidos e estão sendo continuamente identificados. Qualquer corante de ácido nucleico adequado com espectros e excitação e emissão apropriados pode ser empregado, tais como YO-PRO-1®, SYTOX Green®, SYBR Green I®, SYTO11®, SYTO12®, SYTO13®, BOBO®, YOYO® e TOTO®. Em uma modalidade, um segundo corante de DNA fluorescente é SYTO13® usado em menos do que 10 μM, menos de 4 μM ou menos do que 2,7 μM.
[0169] As modalidades da presente invenção são definidas adicionalmente nos Exemplos que seguem. Deve ser compreendido que esses Exemplos são dados a título de ilustração apenas. A partir da discussão acima e desses Exemplos, um versado na técnica pode verificar as características essenciais da presente invenção, e sem se afastar do seu espírito e escopo, pode fazer várias mudanças e modificações das modalidades da invenção para adaptá-la a vários usos e condições. Desta maneira, várias modificações das modalidades da invenção, em adição àquelas mostradas e descritas aqui, serão aparentes àqueles versados na técnica a partir da descrição acima. Tais modificações pretendem também estar dentro do escopo das reivindicações apensas. O que segue é provido a título de ilustração e não pretende limitar o escopo da invenção.
EXEMPLOS Exemplo 1. Análise de Loci Alvos em Calos de Milho
[0170] Direcionamento de Loci Genômicos: O locus genômico para o evento de milho DAS-59132 que foi anteriormente discutido no WO2009100188 METHODS FOR DETECTION OF CORN EVENT DAS-59132, aqui incorporado em sua totalidade, foi direcionado usando uma nuclease dedo de zinco projetada para se ligar especificamente e clivar o DNA genômico que realiza este evento. Os transformantes resultantes foram mantidos até que uma análise para identificar e caracterizar o rompimento dos loci genômicos dentro de eventos específicos via uma reação de amplificação pudesse ser completada.
[0171] As proteínas dedo de zinco direcionadas contra sequências de DNA que compreendem o locus genômico para DAS-59132 foram projetadas conforme anteriormente descrito. Vide, por exemplo, Urnov e outros (2005) Nature 435:646-651. Os projetos de dedo de zinco DAS- 59132 foram incorporados a vetores codificando uma proteína tendo pelo menos um dedo com uma estrutura CCHC. Vide Publicação de Patente U.S. No. 2008/ 0182332. Em particular, o último dedo em cada proteína tinha uma estrutura principal CCHC para a hélice de reconhecimento. As sequências codificando dedo de zinco não canônicas foram fundidas ao domínio de nuclease da enzima de restrição tipo IIS, Fok I (aminoácidos 384-579 da sequência de Wah e outros (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10564-10569) via um ligante de quatro aminoácidos e um sinal de localização nuclear opaque- 2 derivado de Zea mays para formar nucleases dedo de zinco DAS- 59132 (ZFNs). Expressão das proteínas de fusão em uma construção de expressão bicistrônica utilizando um sinal de anomalia ribossomal 2A conforme descrito em Shukla e outros (2009) Nature 459:437-441 foi direcionada por um promotor relativamente forte, constitutivo e ectópico tal como o promotor CsVMV.
[0172] As ZFNs ótimas foram verificadas quanto à atividade de clivagem usando um sistema baseado em levedura de brotamento previamente mostrado identificar nucleases ativas. Vide, por exemplo, Publicação de Patente U.S. No. 20090111119; Doyon e outros (2008) Nat Biotechnol. 26:702-708; Geurts e outros (2009) Science 325:433. Das várias ZFNs que foram projetadas, produzidas e testadas se ligar aos sítios alvo de polinucleotídeo genômico DAS-59132 putativo, ZFNs preferidas foram identificadas como tendo atividade in vivo em níveis altos e selecionadas para experimentação adicional. Essas ZFNs foram caracterizadas como sendo capazes de se ligar e clivar eficientemente os sítios alvo de polinucleotídeo genômico DAS-59132 in planta.
[0173] Vetores de plasmídeo contendo construções de expressão de ZFN das nucleases dedo de zinco exemplares, que foram identificadas usando o ensaio de levedura, foram projetados e terminados usando habilidades e técnicas geralmente conhecidas no campo. Em seguida, a sequência de fusão de sinal de localização nuclear opaque-2::nuclease dedo de zinco foi emparelhada com a sequência de fusão de sinal de localização nuclear opaque-2::nuclease dedo de zinco complementar. Desta maneira, cada construção consistia em uma estrutura de leitura aberta única compreendida de duas sequências de fusão de sinal de localização nuclear opaque 2::nuclease dedo de zinco separadas pela sequência 2A do vírus Thosea assigna (Mattion e outros (1996) J. Virol. 70:8124-8127). Expressão da sequência de codificação de ZFN foi direcionada pelo Promotor da Ubiquitina 1 de Zea mays constitutivo de expressão alta (Christensen e outros (1992) Plant Mol. Biol. 18(4):675-89) e flanqueada pela região não traduzida 3’ polyA Per 5 de Zea mays (PAT U.S. NO. 6.699.984).
[0174] Uma construção doadora foi projetada para integrar no DNA genômico clivado de ZFN do locus genômico DAS-59132. O cassete de expressão de gene único é direcionado pelo promotor Actina 1 do Arroz (Promotor Os Act1) :: a sequência de codificação de fosfinotricina acetil transferase (PAT; Patente U.S. No. 7.838.733) :: e é terminado pela região não traduzida lipase 3’ de Zea mays (ZmLip 3’UTR). Ainda, o plasmídeo doador foi projetado com sequência de 1 kB (braços de homologia) em qualquer extremidade do gene PAT alvo que é homólogo à sequência em qualquer extremidade do sítio de corte de ZFN no locus genômico DAS-59132. Os braços de homologia serviram como o substrato que a máquina de recombinação homóloga usou para inserir o transgene no sítio de corte de ZFN genômico. Os vários elementos de gene foram montados em um plasmídeo à base de pUC de número de cópia alto.
[0175] Integração direcionada: Eventos transgênicos foram direcionados para o locus genômico endógeno de DAS-59132. Construções conforme anteriormente descrito incluem a sequência doadora (pDAB107855) e a DAS-59132 ZFN 6 (pDAB105906). Co- transformação desses dois plasmídeos resultou em 854 eventos PAT transgênicos que foram avaliados com o método para identificação da presença de um polinucleotídeo DNA doador dentro de um locus genômico direcionado da presente invenção.
[0176] Células de calo de milho, consistindo em 12 mL de volume de célula empacotada (PCV) (Packed Cell Volume) de uma linhagem de célula previamente criopreservada mais 28 mL de meio condicionado, foram subcultivadas em 80 mL de meio líquido GN6 em um frasco Erlenmeyer de 500 mL e postas em um agitador a 125 rpm a 28° C. Esta etapa foi repetida duas vezes usando a mesma linhagem de célula, de maneira que um total de 36 mL de PCV foram distribuídos entre os três frascos. Depois de 24 horas, o meio líquido GN6 foi removido e substituído com 72 mL de meio osmótico GN6 S/ M. O frasco foi incubado no escuro por 30-35 minutos a 28°C com agitação moderada (125 rpm). Durante o período de incubação, uma suspensão de 50 mg/mL de carbida de silício WHISKERS® (Advanced Composite Materials, LLC, Greer, SC) foi preparada adicionando 8,1 mL de meio líquido GN6 S/M a 405 mg de carbida de silício WHISKERS®, estéril.
[0177] Seguindo incubação em meio osmótico GN6 S/ M, os teores de cada frasco foram agrupados em uma garrafa de centrífuga de 250 mL. Depois de todas as células do frasco terem sedimentado no fundo, o volume de teor em excesso de aproximadamente 14 mL de líquido GN6 S/ M foi retirado e coletado em um frasco de 1 L estéril para uso futuro. A suspensão pré-umedecida de WHISKERS® foi misturada em velocidade máxima em um vórtex por 60 segundos, e então adicionada à garrafa da centrífuga.
[0178] Neste exemplo, DNA de plasmídeo pDAB107855 (sequência doadora) e pDAB105906 (ZFN) foram adicionados a cada garrafa. Uma vez o DNA de plasmídeo sendo adicionado, a garrafa foi imediatamente posta em um misturador de tinta comercial RED DEVIL 5400® modificado (Red Devil Equipment Co., Plymouth, MN) e agitada por 10 segundos. Seguindo a agitação, o coquetel de células, meio, WHISKERS® e DNA plasmídeo foi adicionado aos teores de um frasco de 1 L junto com 125 mL de meio líquido 6NG fresco para reduzir o osmótico. As células foram deixadas se recuperar em um conjunto de agitador a 125 rpm por 2 horas. 6 mL de suspensão dispersão foram filtrados em papel filtro Whatman No. 4 (5,5 cm) usando uma unidade coletora de célula de vidro conectada a uma linha de vácuo house-hose de maneira que 60 filtros foram obtidos por garrafa. Os filtros foram postos em placas de 60 x 20 mm de meio sólido GN6 e cultivados a 28° C sob condições no escuro por 1 semana.
[0179] Uma semana após aplicação de DNA, papéis filtro foram transferidos para placas de 60 x 20 mm de meio de seleção GN6 (1H) contendo um agente seletivo. Essas placas de seleção foram incubadas a 28° C por uma semana no escuro. Seguindo 1 semana de seleção no escuro, o tecido foi incrustrado em meio fresco ao esfregar 1/2 das células de cada placa em um tubo contendo 3,0 mL de meio de agarose GN6 mantido a 37-38° C.
[0180] A mistura de agarose/tecido foi quebrada com uma espátula e, subsequentemente, 3 mL de mistura de agarose/tecido foram despejados uniformemente na superfície de uma placa de petri de 100 x 25 mm contendo meio GN6 (1H). Este processo foi repetido para ambas as metades de cada placa. Uma vez todo o tecido sendo incrustrado, as placas incubadas a 28° C sob condições no escuro por até 10 semanas. Isolatos putativamente que cresceram sob essas condições de seleção foram removidos das placas incrustradas e transferidos para meio de seleção fresco em placas de 60 x 20 mm. Se crescimento sustentado fosse evidente após aproximadamente 2 semanas, um evento foi considerado ser resistente ao herbicida aplicado (agente de seleção) e uma alíquota de células foi subsequentemente colhida para análise de genótipo. Neste exemplo, um grande número de eventos foi recuperado das garrafas tratadas. Esses eventos foram avançados para análise molecular para confirmar a integração de um transgene dentro de um locus genômico de Evento de Milho DAS-59132.
[0181] Extração de DNA: Amostras de tecido de calo foram coletadas em placas de coleta de 96 cavidades (Qiagen, Valencia, CA) e então liofilizadas por 48 horas. Rompimento de tecido foi realizado com um pulverizador de tecido KLECKO® (Garcia Manufacturing, Visalia, CA) em tampão de lise BIOSPRINT96 AP1® (Qiagen) com um leito de aço inoxidável. Seguindo maceração do tecido, DNA genômico foi isolado em formato de alto rendimento usando o estojo de planta BIOSPRINT96® (Qiagen) usando o robô de extração BIOSPRINT96® (Qiagen). Uma amostra de DNA genômico foi então diluída para 2 ng/ μl antes do ajuste das reações de qPCR para obter classificações de Cp apropriadas (ciclo de quantificação) que resultaram na produção de um perfil de assinatura.
[0182] Ensaio de Rompimento de Locus DAS-59132: transformação mediada por WHISKER® de células de calo Hi-II com o DAS-59132-ZFN e plasmídeo doador resultou em inserções de transgene alvo e aleatória. Para distinguir eventos de inserção aleatória das populações de evento alvo, todos os 854 eventos gerados foram inicialmente avaliados usando um ensaio de rompimento de locus. Este ensaio determinou se o sítio de ligação a ZFN dentro do locus permanece intacto ou foi rompido através de clivagem de ZFN ou inserção de doador. Indicação de um rompimento dentro do loci genômico é evidência inicial que a ZFN clivou o locus alvo DAS-59132 endógeno e indica inserção direcionada da molécula de DNA doador. Os iniciadores foram projetados para amplificar a região alvo endógena que contém os sítios de reconhecimento de ZFN, e as amostras foram ajustadas para serem analisadas através de qPCR. Amplificação da região intacta, indicativa de um evento não alvo, resultou em um amplicon de 140 pares de base medido como um sinal de qPCR detectável. Integração direcionada bem-sucedida da molécula doadora resulta em rompimento do sinal de qPCR detectável e é mostrada como um sinal geral menor comparado com controle.
[0183] O ensaio de rompimento de locus DAS-59132 foi realizado através de PCR em tempo real usando o sistema LIGHTCYCLER®480 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Os ensaios foram projetados para monitorar as sequências de ligação ZFN DAS-59132 (25716/ 25717) no locus DAS-59132 (e o gene de referência interno IVF (No. Ac. Genbank: U16123.1|ZMU16123) usando LIGHTCYCLER® Probe Design Software 2.0. Para amplificação, mistura de LIGHTCYCLER®480 Probes Master (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) foi preparada em uma concentração final 1X em uma reação multiplex de volume de 10 μL contendo 0,4 μM de cada iniciador e 0,2 μM de cada sonda (Tabela 1). Uma reação de amplificação de duas etapas foi realizada com uma extensão a 55° C por 30 segundos com aquisição de fluorescência. Análise para o ensaio de rompimento foi realizada usando razão de alvo para referência.
[0184] Tabela 1: Sequências de Iniciador e Sonda de Oligonucleotídeo para Ensaio de Rompimento de Locus DAS-59132.
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[0185] Os 854 eventos gerados a partir de transformação de precisão foram avaliados com o ensaio de rompimento e classificados como rompidos com base em uma queda significante no sinal alvo para referência. Os resultados indicaram que 63 dos 854 eventos ensaiados tinham um sinal rompido no locus DAS-59132, indicativo de inserção de gene alvo (Figura 2). Apesar da medição quantitativa de um locus rompido que o ensaio de rompimento provê, este ensaio não pode determinar inserções alvo de mutações no sítio de clivagem resultantes de reparo de quebra propenso a erro. O desenvolvimento de um ensaio de PCR In-Out secundário para avaliação de eventos em paralelo para assegurar avaliação robusta e precisa de todos os eventos foi realizado.
[0186] Ensaio de PCR In-Out do Locus DAS-59132: Os eventos avaliados através do ensaio de rompimento foram também avaliados através de um ensaio de PCR de ponto final específico de locus no locus DAS-59132. Um iniciador de oligonucleotídeo é projetado para anelar para uma região de DNA genômico alvo fora do sítio de clivagem de ZFN e um segundo iniciador de oligonucleotídeo é projetado para anelar apenas para a região de transgene do DNA doador. Os primeiros são projetados para analisar as regiões de junção de DNA de inserção 5’ e 3’ do sítio alvo no locus DAS-59132. Muitos dos eventos gerados a partir de transformação são inserções aleatórias e então não são amplificados durante a PCR In-Out, uma vez que a sequência doadora não está em proximidade com a sequência alvo (Figura 3A). Como os iniciadores são projetados para apenas amplificar regiões de DNA doador e DNA genômico que são inseridas na região alvo, amplificação é um resultado de um evento de transgene alvo (Figura 3B). Esta análise de PCR, chamada PCR "In-Out", assegura que um quadro completo de inserção de gene direcionada seja obtido, uma vez que os iniciadores são projetados para se direcionar a ambas a sequência alvo e a sequência de doador inserida e ambas as junções 5’ e 3’ são analisadas. Seguindo PCR, amostras amplificadas são analisadas através de eletroforese e amostras com integração de transgene no sítio alvo no locus DAS- 59132 resultam em amplificação de duas faixas a 2 kb e 1,5 kb. Isso é indicativo de sequência alvo integrada nas junções 5’ e 3’ do transgene.
[0187] Reações de amplificação por PCR In-Out foram conduzidas usando um Takara Ex Taq HS kit® (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA). Cada reação de PCR foi realizada em 15 ou 20 μL de volume final, que continha tampão Taq Ex 1x, 20 nM de iniciadores avançado e reverso, 10 a 20 ng de molde de DNA genômico e uma concentração final de 0,05 unidade/ μL de polimerase Ex Taq HS. Para PCR In-Out de tempo real, um corante SYTO13® da Invitrogen (Grand Island, NY) foi incluído na mistura de reação de PCR em uma concentração final de 4 μM ou 2,67 μM. Inicialmente, o corante fluorescente verde SYTO13® foi usado em concentrações recomendadas pelo fabricante uma vez que ele tinha sido anteriormente mostrado aumentar a sensibilidade geral do ensaio e exibe inibição baixa de atividade de polimerase. Este corante resultou em um sinal mais forte e resultados mais consistentes, mas o sistema de alto rendimento ainda tinha limitações. Fluorescência de base continuou a ser problemática, uma vez que formações de iniciador-dímero ou anelamento de iniciador não específico (de iniciadores impuros) estavam gerando sinais falso positivos. Desta maneira, as concentrações que foram usadas no ensaio eram menores de 10 μM a 4 μM ou 2,67 μM. A redução em concentração do corante resultou em um perfil de assinatura que proveu detecção e quantificação confiáveis do ensaio de PCR.
[0188] PCR In-Out em tempo real foi realizada em um ABI VIIA7 PCR SYSTEM® (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA). Depois de desnaturação inicial, o programa de amplificação continha 40 ciclos de 98° C por 10 segundos, 66° C por 30 segundos e 68° C por 2 minutos com aquisição de fluorescência antes de um programa de análise de temperatura de fusão. Seguindo a etapa de amplificação, a reação foi mantida a 65° C por 30 segundos e 72° C por 10 minutos e finalmente a 4° C. Ambos os perfis de sinais de fluorescência direta e temperatura de fusão foram usados para análise de amostra. Amostras positivas identificadas no sistema de tempo real foram confirmadas adicionalmente usando um ensaio de mudança de gel padrão.
[0189] Tabela 2: Sequências de Iniciador e Sonda para Ensaio In- Out de Locus DAS-59132
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[0190] Em um esforço em diferenciar amplicons de PCR de inserção direcionada de falsos positivos, um protocolo foi planejado para designar um perfil de assinatura para cada produto de PCR gerado. Perfis de temperatura de fusão dos amplicons de PCR foram comparados com um controle positivo e curvas de compatibilidade identificaram produtos de PCR In-Out positivos (Figuras 4A e 4B). Correlação da análise de PCR In-Out usando um perfil de assinatura que compreende um perfil de temperatura de fusão de ambas as extremidades 3’ e 5’ é uma metodologia analítica nova que gera maior confiança na identificação de um evento de inserção de polinucleotídeo DNA doador direcionada mesmo dentro de um locus genômico.
[0191] Os resultados do ensaio de rompimento e do ensaio de PCR In-Out do locus DAS-59132 foram confirmados adicionalmente através de Southern blotting e sequenciamento (padrão de Sequenciamento de Nova Geração).
[0192] O novo ensaio resultou em um processo analítico robusto para identificar eventos de inserção de polinucleotídeo DNA doador alvo em um sítio de clivagem de ZFN em milho. Os loci genômicos alvo foram direcionados com sucesso e os eventos direcionados foram eficientemente identificados usando o novo ensaio. Um total de 854 amostras foi submetido à análise usando o ensaio revelado. O ensaio de rompimento foi realizado em todos os eventos putativos com 63 dos eventos mostrando rompimento. A PCR In-Out foi realizada em todos os eventos e 8 eventos positivos foram identificados. Como resultado, houve um total de 8 eventos que foram confirmados ser inserções direcionadas (Figura 5).
Exemplo 2. Análise de Loci Alvo em Plantas de Milho
[0193] Embriões B104 transgênicos de milho foram gerados, onde o locus DAS-59132 foi direcionado via a construção de Nuclease Dedo de Zinco, pDAB105906, e uma construção doadora, pDAB104179. Essas construções foram transformadas no tecido da planta usando um método de transformação biolístico conforme descrito no Exemplo 7 do Pedido de Patente U.S. No. 2011/ 0191899, aqui incorporado a título de referência em sua totalidade. Embriões putativamente transformados foram identificados via seleção do herbicida fosfinotricina.
[0194] Os embriões transgênicos putativamente identificados foram analisados usando o ensaio de rompimento para identificar eventos que continham a presença de um polinucleotídeo DNA doador inserido em um locus genômico alvo. O ensaio de rompimento de ZFN foi completado usando os protocolos e reagentes descritos acima. Nos eventos que não eram direcionados ou rompidos, um alvo para razão de referência na faixa de 0,4 a 0,6 foi observado; para amostras que foram rompidas ou direcionadas uma faixa de 0,2 a 0,35 (variação de placa para placa) foi relatada (Figura 6). Os eventos direcionados que não produziram um amplicon resultaram em uma quantidade menor de produto amplificado, conforme mostrado no gráfico.
[0195] Em seguida, PCR In-Out específica de locus foi completada usando o protocolo e reagentes descritos acima. Os resultados da PCR In-Out identificaram eventos específicos que continham uma inserção de transgene no locus DAS-59132.
[0196] Um total de 1.223 eventos de amostra foi submetido à análise. O ensaio de rompimento foi completado em cada evento e identificou 85 dos eventos mostrando rompimento. Esta PCR In-Out foi completada em todos os 1.223 eventos de amostra e identificou 11 eventos que eram positivos e 2 eventos positivos parciais. Southern blotting e sequenciamento foram completados para confirmar que os eventos identificados compreendiam inserções de transgene integrais no locus DAS-59132.
Exemplo 3. Análise de Loci Alvo em Plantas de Milho
[0197] Embriões B104 transgênicos de milho foram gerados, onde um locus de inserção no sítio alvo (landing pad) engenheirado (Pedido de Patente U.S. No. 2011/0191899, aqui incorporado a título de referência em sua totalidade) foi direcionado via uma Nuclease Dedo de Zinco e uma construção doadora foi transformada para o tecido de planta usando biolística. Transformações múltiplas foram completadas para se direcionar a uma construção doadora com o locus de inserção no sítio alvo engenheirado. A primeira série de transformações foi completada usando a construção doadora pDAB109714 e a construção de Nuclease Dedo de Zinco pDAB105941. Uma segunda série de transformações foi completada usando a construção doadora pDAB109715 e a construção de Nuclease Dedo de Zinco pDAB105943. Uma terceira séria de transformações foi completada usando a construção de doador pDAB109716 e a construção de Nuclease Dedo de Zinco pDAB105942. A série final de transformações foi completada usando a construção doadora pDAB109717 e a construção de Nuclease Dedo de Zinco pDAB105945. Embriões putativamente transformados foram identificados via seleção do herbicida fosfinotricina.
[0198] Ensaio de Rompimento de Locus de ELP: Iniciadores foram projetados para amplificar a região alvo endógena que contém os sítios de reconhecimento de ZFN e amostras foram ajustadas para serem analisadas através de qPCR. Amplificação da região intacta, indicativa de um evento não direcionado, resultou em um amplicon de 193 pares de base medido como um sinal de qPCR detectável. Integração direcionada com sucesso das moléculas doadoras dentro do respectivo evento de ELP resulta em rompimento do sinal de qPCR detectável e é mostrada como um sinal geral menor comparado com controle.
[0199] O ensaio de rompimento de locus de ELP foi realizado através de PCR em tempo real usando o sistema LIGHTCYCLER®480 (Roche Applied Science, Indianápolis, IN). Os ensaios foram projetados para monitorar as sequências de ligação de ZFN de ELP no locus de ELP e o gene de referência interno IVF usando LIGHTCYCLER® Probe Design Software 2.0). Para amplificação, mistura de LIGHTCYCLER®480 Probes Master (Roche Applied Science, Indianápolis, IN) foi preparada em concentração final 1X em uma reação multiplex de volume de 10 μL contendo 0,4 μM de cada iniciador e 0,2 μM de cada sonda (Tabela 3). Uma reação de amplificação de duas etapas foi realizada com uma extensão a 55° C por 30 segundos com aquisição de fluorescência. Análise para o ensaio de rompimento foi realizada usando a razão alvo para referência.
[0200] Tabela 3: Sequências de Iniciador e Sonda para Ensaio de Rompimento de Locus de ELP. As reações ELP1 e ELP2 foram multiplexadas com os iniciadores e sonda IVF, cujas sequências são descritas na Tabela 1.
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[0201] Os 1738 eventos gerados a partir de transformação com precisão foram avaliados com o ensaio de rompimento e classificados como rompidos com base em uma queda significante no sinal alvo para referência. Os resultados indicaram que 158 dos 1738 eventos ensaiados tinham um sinal rompido no locus de ELP, indicativo de inserção de gene alvo (Figura 7). Apesar da medição quantitativa de um locus rompido que o ensaio de rompimento provê, este ensaio não determina inserções direcionadas de mutações no sítio de clivagem resultantes de reparo de quebra propenso a erro. Desta maneira, o desenvolvimento de um ensaio de PCR In-Out secundário para avaliação de eventos em paralelo para assegurar avaliação robusta e precisa de todos os eventos foi realizado.
[0202] Ensaio de PCR In-Out de Loci de ELP: Os eventos avaliados pelo ensaio de rompimento foram também avaliados através de um ensaio de PCR de ponto final específico de locus recém-desenvolvido nos loci de ELP. Um iniciador foi designado anelar para uma região de DNA genômico alvo fora do sítio de clivagem de ZFN e um segundo iniciador foi designado anelar apenas para a região de transgene do DNA doador. Os iniciadores foram projetados para analisar as regiões 5’ e 3’ do sítio alvo no locus de ELP. Como os iniciadores foram projetados para amplificar apenas regiões do DNA doador e DNA genômico que estão inseridas na região alvo, amplificação é um resultado de um evento de transgene direcionado, ambas as junções 5’ e 3’ foram analisadas.
[0203] Reações de amplificação de PCR In-Out foram conduzidas usando um TAKARA EX TAQ HS KIT® (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA). Cada reação de PCR foi realizada em um volume final de 15 ou 20 μM, que continha tampão Ex Taq 1X, 200 nM de iniciadores avançado e reverso, 10 a 20 ng de molde de DNA genômico e uma concentração final de 0,05 unidade/ μL de polimerase Ex Taq HS. Para PCR In-Out em tempo real, um corante SYTO13® (Invitrogen Carlsbad, CA) foi incluído na mistura de reação de PCR em uma concentração final de 4 μM ou 2,67 μM.
[0204] PCR In-Out em tempo real foi realizada em um ABI VIIA7 PCR SYSTEM® (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA). Após desnaturação inicial, o programa de amplificação continha 40 ciclos de 98°C por 10 segundos, 66°C por 30 segundos e 68°C por 2 minutos com aquisição de fluorescência antes de um programa de análise de temperatura de fusão. Seguindo isso, a reação foi mantida a 65°C por 30 segundos e 72°C por 10 minutos, e finalmente mantida a 4°C. Ambos os sinais de fluorescência direto e perfis de temperatura de fusão foram usados para análise de amostra. Amostras positivas identificadas no sistema de tempo real foram confirmadas adicionalmente usado um ensaio de mudança de gel padrão.
[0205] Tabela 4: Sequências de Iniciador e Sonda para Ensaio In- Out de Locus de ELP.
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[0206] Em um esforço em identificar amplicons de PCR de falsos positivos, um protocolo foi projetado para designar um perfil de assinatura para cada produto de PCR gerado. Perfis de temperatura de fusão dos amplicons de PCR foram comparados com um controle positivo, e curvas de compatibilidade identificaram produtos de PCR In- Out positivos. Correlação da análise de PCR In-Out usando um perfil de assinatura que compreende um perfil de temperatura de fusão de ambas as extremidades 3’ e 5’ é uma metodologia analítica que gera maior confiança na identificação de um evento de inserção de transgene direcionada.
[0207] Um total de 1738 amostras positivas para PAT foi submetido para este projeto. O ensaio de rompimento e a PCR In-Out foi realizado em todos os eventos. Os resultados indicaram que 158/ 1738 eventos foram positivos para rompimento e 46/ 1738 desses eventos foram positivos para ambas as reações de amplificação de PCR In-Out 3’ e 5’.
Exemplo 4. Análise de Loci Alvo em Plantas de Milho
[0208] Plantas B104 c.v. de Zea Mays foram transformadas com uma construção de gene de inserção no sítio alvo engenheirada (pDAB105817 ou pDAB105818) conforme anteriormente descrito no Pedido de Patente U.S. No. 2011/ 0191899. As plantas de milho transformadas foram obtidas e confirmadas conter ELP. Quatro linhagens de milho ELP; 105817[1]-015.Sx001.Sx011, 105818[1]- 269.Sx001.Sx008, 105818[1]-271.Sx001.Sx005 e 105818[2]- 388.Sx001.Sx008 foram cruzadas com B104 c.v. de Zea mays para produzir como hemizigotos. As plantas progênies resultantes foram co- transformadas ou com plasmídeo pDAB105941 de eZFN codificando eZFN1 e plasmídeo doador correspondente pDAB104182 ou pDAB105948 de eZFN codificando eZFN8 e pDAB104183 doador. As transformações foram completadas via bombardeamento de embriões isolados que foram atingidos uma vez usando um PDS-1000 (Bio-Rad) de acordo com as especificações do fabricante. Um total de 20.896 embriões (cerca de 5000 embriões para cada linhagem alvo) foi bombardeado e selecionado quando à resistência a Bialaphos: 12.404 foram co-bombardeados com pDAB105941 e seu doador correspondente e 8.492 embriões foram co-bombardeados com pDAB105948 e seu doador correspondente.
[0209] Seguindo o bombardeamento, os embriões foram cultivados em meio e cultivados em mudas. Eventos transgênicos foram identificados via uma qPCR que foi desenvolvida para avaliar e detectar a presença do transgene pat. O número de cópia foi determinado através de comparação dos valores Alvo/ Referência (Invertase) de amostras desconhecidas (exibido pelo LightCycler 480®) com valores Alvo/ Referência de padrões de número de cópia conhecidos (1-Cópia: hemi, 2-Cópia: homo). Um total de 614 plantas regeneradas sobreviveu e 354 (ou 58%) das plantas foram identificadas como positivas para a presença do gene pat e retidas para análise adicional.
[0210] Ensaio de Rompimento de Locus de ELP: Um ensaio de rompimento de ZFN foi projetado para monitorar as mudanças no ELP integrado. Em um ELP não direcionado, iniciadores de PCR MAS621 e MAS622 (Tabela 5) amplificaram um produto de 214 pb compreendendo os sítios de ligação eZFN. Integração no (ou modificação do) sítio de ligação de eZFN no locus de ELP romperia a amplificação usando qPCR com tempo de extensão baixo resultando em ou nenhum sinal ou sinal significantemente menor sendo produzido na reação de qPCR. Uma reação de qPCR controle para a amplificação do gene Invertase foi também incluída como uma referência controle interna.
[0211] Para amplificação, mistura de LightCycler®480 Probes Master (Roche Applied Science, Indianápolis, IN) foi preparada em concentração final 1X em uma reação multiplex de volume de 10 μL contendo 0,4 μM de cada iniciador e 0,2 μM de cada sonda. Uma reação de amplificação de três etapas foi realizada com 10 segundos a 95° C para desnaturação, 35 segundos a 60° C para anelamento e 1 segundo a 72° C com aquisição de fluorescência. A porção fluorescente FAM foi excitada em uma densidade óptica de 465/ 510 nm e HEX a 533/ 580 nm. O número de cópia foi determinado através de comparação de valores Alvo/ Referência (Invertase) para amostras desconhecidas (exibidos pelo LightCycler 480®) com valores Alvo/ referência de hemizigotos de cópia única conhecidos.
[0212] Para distinguir eventos de inserção aleatórios de eventos direcionados a ELP, as 354 amostras que foram identificadas via a avaliação de qPCR de pat foram analisadas adicionalmente usando o ensaio de rompimento. O ensaio de rompimento de ELP foi projetado para monitorar as inserções/ deleções grandes no sítio de clivagem de eZFN. Em um ELP não alvo, um produto de PCR de 214 pb compreendendo os sítios de ligação de eZFN é amplificado e gera sinais fluorescentes fortes. Integração no (ou modificação do) sítio de ligação eZFN romperia amplificação e resultaria em ou nenhum sinal ou níveis de sinal fluorescente significantemente menores produzidos via a reação de PCR. Dos 354 eventos positivos para pat, cerca de 8% (28 eventos) pareciam estar rompidos (Figura 8b), indicando direcionamento potencial.
[0213] Tabela 5: Iniciador e sonda usados para ensaio de rompimento.
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[0214] PCR In-Out: O ensaio de rompimento identificou mudanças na região de ligação de eZFN no ELP. Qualquer variação nos sítios de ligação de iniciador ou inserções aleatórias no locus são possíveis indicações de rompimento para o locus que é causado por clivagem de ZFN. Em seguida, uma PCR In-Out foi usada para validar a presença de uma inserção de doador dentro do locus de ELP. Ambas as extremidades das sequências de junção compreendendo o locus alvo e o doador. Um iniciador foi projetado para anelar para uma região de ELP pré-integrada presente apenas nas linhagens alvo e um segundo iniciador foi projetado para anelar apenas para sequências de DNA doador que estão presentes apenas na construção doadora. Amplificação via PCR indicou um resultado de direcionamento do doador dentro do locus genômico ELP. Quaisquer eventos gerados a partir de inserções aleatórias não produzem uma amplificação por PCR.
[0215] Para a PCR In-Out da junção de doador 5’/ EL, o iniciador avançado foi projetado para se ligar à região OsAct1 (5OsF3, SEQ ID NO:23 ATTTCACTTTGGGCCACCTT) da inserção de doador, enquanto o iniciador reverso (5R3, SEQ ID NO:24 AGGCTCCGTTTAAACTTGCTG) foi projetado para se ligar à sequência de 193 pb única para a linhagem alvo no Braço Esquerdo de ELP. Para a PCR In-Out da junção de doador 3’/ locus de ELP, o iniciador avançado (3PAF1, SEQ ID NO:25 ATGGTGGATGGCATGATGTT) foi projetado para se ligar à região PATv6 da inserção de doador e o iniciador reverso (3R1, SEQ ID NO:26 TGGAGGTTGACCATGCTAGG) foi projetado para se ligar à sequência de 192 pb única para a linhagem alvo no Braço Direito do ELP. Amplificação resultou apenas quando os iniciadores avançado e reverso se ligaram a sequências em proximidade grande uma da outra. Integração aleatória das sequências doadoras não era detectável usando os iniciadores de PCR descritos acima. Para aumentar o rendimento da detecção de PCR In-Out, a análise da curva de fusão foi completada com o tingimento de ácido nucleico fluorescente verde, SYTO13®. A amplificação por PCR foi realizada em sistema de PCR em tempo real LightCycler 480® em uma reação de 15 μl contendo 0,75 unidade de polimerase de DNA TaKaRa Ex Taq® (Takara Bio Inc., Shiga, Japan), 200nM de dNTP, 200 nM de cada um dos iniciadores avançado e reverso, 2,67 μM de SYTO13® e 10 ng de DNA genômico. A amplificação iniciou com um ciclo de desnaturação de 2 minutos a 95° C, então 30 ciclos de 98° C por 20 segundos, 60° C por 30 segundos e 68° C por 90 segundos, seguido por análise da curva de fusão a 97° C com velocidade de aumento de 0,11° C/ s.
[0216] A reação de PCR resultou na análise de ambas as extremidades de flanqueamento 5’ e 3’. Um evento de locus de ELP alvo doador resulta em um fragmento de 1,1 kb para a reação de PCR In- Out 5’ e um fragmento de 1,4 kb para a reação de PCR In-Out 3’. Os resultados das reações de PCR foram determinados via análise de curva de fusão, que produz resultados gráficos diferentes dependendo do comprimento e da composição do amplicon (Figura 9). Amplicons de PCR curtos geralmente exibem uma curva de temperatura de fusão (Tm) de pico único que aparece como uma linha plana e produz níveis baixos de sinal fluorescente quando graficamente exibida. Mas para amplicons longos (isto é, fragmentos de 1-2 kb), o perfil de Tm parece mais complexo e resulta em picos múltiplos (dependendo das subsequências locais dos amplicon) e produz níveis altos de sinal fluorescente. Cinco eventos foram identificados ser positivos para ambas as reações de PCR 5’ e 3’. Cada uma das quatro linhagens alvo produziu um evento compreendendo um doador inserido no locus genômico ELP. Todos os positivos de PCR In-Out foram unidos em gel onde eles apenas mostraram uma faixa de amplicon de PCR, conforme esperado.
[0217] Confirmação molecular: Métodos de detecção molecular adicionais foram completados para confirmar que os resultados do ensaio de rompimento e reações de PCR In-Out não eram falso positivos. Uma análise Southern blot e sequenciamento das junções de inserção de doador 5’ e 3’/ locus genômico foram completados. Os resultados confirmaram que os eventos identificados via o ensaio de rompimento e análise de PCR In-Out continham uma inserção de doador no locus genômico de ELP.
Exemplo 5: Análise de Loci Rompidos em Plantas de Milho
[0218] Aplicação de ZFNs a um locus genômico de uma planta de linhagem alvo foi introduzida via uma estratégia de cruzamento de planta conforme previamente revelado na Publicação de Patente U.S. No. 20110191877. Eventos de planta alvo e extratores separados foram gerados em B104 c.v. de Zea mays. Cinco linhagens de planta alvo foram produzidas a partir de transformações com construções pDAB105816, pDAB105817, pDAB105818, pDAB105820 e pDAB105821. Essas construções continham uma pilha de transgenes, um gene marcador selecionável aad-1 e um ELP contendo os sítios de ligação eZF1 e eZF8. Em seguida, duas linhagens de plantas de extração foram produzidas a partir de transformação com construções pDAB105828 e pDAB105825. A construção pDAB105828 continha ZFN8 direcionada pelo promotor da Ubiquitina 1 de Zea mays e terminado por Per5 3’UTR de Zea mays. A construção pDAB105825 continha ZFN1 direcionada pelo promotor da Ubiquitina 1 de Zea mays e terminada por Per5 3’UTR de Zea mays. Ambos as construções de extrato também continham um marcador selecionável pat. Plantas transgênicas foram produzidas e confirmadas via ensaios de confirmação molecular. As plantas foram autocruzadas para produzir progênie homozigota. O alvo homozigoto resultante e os eventos de extrator foram cruzados produzindo progênie. As progênies foram ensaiadas para determinar se o transgene ZFN provido pelo evento extrator de origem clivou o locus alvo de ELP provido pelo outro evento alvo de origem. A maioria de todos os cruzamentos foi feita com linhagens alvo como fêmeas e linhagens extratores como machos. Apenas um cruzamento controle foi feito com a linhagem extratora como uma fêmea e a linhagem alvo como um macho. As plantas alvo e extratora foram cruzadas para produzir progênies que foram avaliadas através de aplicação de Assure II® (quizalofope) (184 g ae/ ha + COC 1%) e Ignite® 280 SL (glufosinato) (480 gae/ ha) no estágio V3 de desenvolvimento. Qualquer progênie sobrevivente foi selecionada para análise molecular adicional que compreendia avaliação quanto à presença de um transgene aad-1 via um método de qPCR. Um total de 1902 amostras foi genotipado quanto à presença de locus aad-1 usando um ensaio de qPCR utilizando invertase como o gene de referência. As razões de alvo aad-1 para referência foram calculadas e normalizadas para padrões conhecidos, onde uma razão de 2, 1 ou 0 indicou homozigosidase, hemisigozidade ou estado nulo, respectivamente. 1822 plantas foram confirmadas como hemizigotos aad-1.
[0219] Ensaio de rompimento de ZFN: Um ensaio de rompimento baseado em PCR foi projetado para uma medição indireta de atividade de corte de ZFN do locus genômico alvo de ELP. Os ensaios foram projetados de maneira que as sondas fluorescentemente marcadas ficaram por cima do espaçador requerido para a integridade das funções de ZFN (Figura 10). O ensaio de rompimento de eZFN1 resultou na detecção de um fragmento de 69 pb cobrindo toda a sequência do sítio de ligação de eZFN1. O ensaio de rompimento de eZFN8 resultou na detecção de um fragmento de 109 pb flanqueando a sequência do sítio de ligação de eZFN8. Ambos os ensaios utilizaram sondas MGB sintetizadas pela Life Technologies (Grand Island, NY). Quando ZFNs clivaram o locus genômico a clivagem foi reparada via NHEJ que resultou na incorporação de InDels nas sequências genômicas, desta maneira modificando a sequência genômica que tinha sido usada para projeto dos iniciadores de PCR. Como um resultado quaisquer reações de amplificação de PCR projetadas para amplificar e detectar um amplicon na sequência de ligação de ZFN dentro do locus genômico de ELP produziriam um sinal fluorescente (como as sequências genômicas seriam deletadas ou rearranjadas e os iniciadores não poderiam se ligar a essas sequências genômicas).
[0220] Ensaios bi-plex foram realizados com tempo real ou qPCR usando o sistema LightCycler®480 (Roche Applied Science, Indianápolis, IN). Uma reação controle foi completada com Invertase usada como um gene de referência endógeno. Para amplificação, mistura de LightCycler®480 Probes Master (Roche Applied Science, Indianápolis, IN) foi preparada em concentração final 1X em uma reação multiplex de volume de 10 μM contendo 0,4 μM de cada iniciador e 0,2 μM de cada sonda (Tabela 6). Uma reação de amplificação de três etapas começou com 10 segundos a 95° C para desnaturação, 35 segundos a 60° C para anelamento e 1 segundo a 72° C para aquisição de fluorescência. Análise para o ensaio de rompimento foi realizada usando razões de alvo para referência e normalizada para homozigotos conhecidos. Os resultados do ensaio de PCR são providos na Figura 11.
[0221] Tabela 6. Iniciadores usados para detecção de qPCR
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[0222] Para determinar a taxa de corte de eZFN do locus genômico de ELP, amostras de folha F1 de cruzamentos de planta foram primeiro analisadas quanto à zigosidade e foram então testadas quanto ao rompimento de ELP usando um ensaio qPCR que detecta sítios de ligação de eZFN intactos. Se o locus genômico ELP incorreu InDels durante reparo de DSB no sítio de ligação de eZF, houve uma perda ou diminuição em sinal detectável no ensaio qPCR. As razões de ELP normalizadas foram comparadas com suas linhagens irmãs. Se a razão estivesse entre 0 a 0,05, eles eram considerados ser cortados com o ZFN (com reparo imperfeito); se a razão estivesse entre 0,05 a 0,4, eles eram marcados como quiméricos, indicando que nem todas as cópias dos ELPs tinham sido cortadas com o ZFN; se a razão estivesse acima de 0,4, eles eram identificados como não sendo cortados com o ZFN (poderiam ter sido cortados também, mas com reparo perfeito). Considerando ambas classificações de corte e quimérica juntas, atividade de eZFN1 detectada com o ensaio de rompimento foi 46,6% (524 de 1125 eventos de planta) e a atividade de eZFN8 foi 70,2% (489 de 697 eventos de planta). (Tabela 7). O teste Tukey Kramer revelou diferenças significantes entre cruzamentos quanto às frequências de clivagem. A combinação de linhagens L2BG e extrator provou ser crucial para o sucesso da clivagem (p<0,0001).
[0223] Tabela 7. Atividades de clivagem de ZFN entre 5 progênies de linhagens alvo de ELP e linhagem extratora.
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[0224] Análise de sequência de clivagem de ZFN: Para confirmar os dados de rompimento de ELP com base em qPCR, amostras representativas de cruzamentos de progênie e dois controles negativos representados pelas linhagens alvo parentais foram selecionadas quanto a sequenciamento profundo de amplicon de NGS. Leituras de alta qualidade foram alinhadas contra a sequência de referência da construção de ELP e inserções e/ou deleções (InDels) foram identificadas. Conforme esperado, as duas linhagens parentais tinham porcentagem muito pequena (<0,1%) de indels no sítio de clivagem de ZFN quando comparando com a sequência de referência, mais provavelmente devido a erro de amplificação por PCR e/ou sequenciamento (Figura 12). Havia uma correlação entre os dados de qPCR e sequenciamento. Os quatro cruzamentos exibindo 100% de eficiências de corte com base em dados de qPCR tinham 91% ou mais de ELPs modificados com sequenciamento. Em suma, dados de sequenciamento de amplicon profundo de NGS concorreram com os dados de qPCR e provaram que o método de ensaio de rompimento era altamente sensível. Ainda, o ensaio de rompimento de ELP foi demonstrado ser um ensaio eficaz para estimativa das atividades de corte de ZFN (ou qualquer outra nuclease específica de sítio) in planta. [0225] Embora aspectos da invenção tenham sido descritos em certas modalidades, eles podem ser modificados adicionalmente dentro do espírito e escopo da presente invenção. O presente pedido pretende compreender quaisquer variações, usos ou adaptações de modalidades da invenção usando seus princípios gerais. Ainda, o presente pedido pretende compreender tais afastamentos da presente invenção que estiverem dentro da prática conhecida ou comum na técnica à qual essas modalidades pertencem e que estejam dentro dos limites das reivindicações apensas.

Claims (20)

1. Método para identificar a presença de um polinucleotídeo de DNA doador exógeno inserido dentro de um único locus genômico eucariótico alvo, caracterizado pelo fato de que compreendendo as seguintes etapas: a. clivagem do locus genômico eucariótico único com uma nuclease sítio-específica para produzir um locus genômico eucariótico clivado; b. inserção do DNA doador exógeno no locus genômico eucariótico clivado; c. amplificar em uma primeira reação de amplificação uma amostra de DNA genômico compreendendo o locus genômico eucariótico alvo usando uma primeira pluralidade de iniciadores que se ligam sob condições de hibridação próximas ao locus genômico eucariótico alvo, em que pelo menos um dos iniciadores se liga ao local de clivagem da nuclease sítio-específica, para assim gerar um primeiro amplicon compreendendo o locus genômico eucariótico alvo; d. detectar a presença ou ausência do primeiro amplicon, em que a ausência do primeiro amplicon indica a presença do polinucleotídeo de DNA doador exógeno dentro do locus genômico eucariótico alvo; e. amplificar em uma segunda reação de amplificação a amostra de DNA genômico usando uma segunda pluralidade de iniciadores que se ligam sob condições de hibridação próximas ao locus genômico eucariótico alvo e dentro do polinucleotídeo de DNA de doador exógeno, para assim gerar um segundo amplicon compreendendo pelo menos uma porção do alvo locus genômico eucariótico e pelo menos uma porção do polinucleotídeo de DNA de doador exógeno; e f. detectar a presença ou ausência do segundo amplicon, em que a presença do segundo amplicon indica a presença do polinucleotídeo de DNA doador exógeno dentro do locus genômico eucariótico alvo.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: a. quantificar os resultados da primeira reação de amplificação; b. quantificar os resultados da segunda reação de amplificação; c. comparar os resultados da primeira e segunda reações de amplificação; e d. determinar a presença ou ausência do polinucleotídeo de DNA de doador exógeno dentro do locus genômico eucariótico alvo, em que o polinucleotídeo de DNA de doador exógeno é confirmado como inserido no locus genômico eucariótico alvo se o primeiro amplicon estiver ausente e o segundo amplicon estiver presente.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma reação multiplex, em que a primeira e a segunda reações de amplificação são executadas em um único tubo ou poço.
4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a quantificação dos resultados da primeira e da segunda reações de amplificação compreende produzir um perfil de assinatura para uma ou ambas as primeira e segunda reações de amplificação.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o perfil de assinatura é selecionado do grupo que consiste em um perfil de assinatura de curva de temperatura de fusão e um perfil de assinatura de fluorescência.
6. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o perfil de assinatura é produzido a partir de um corante intercalante de DNA.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o corante intercalante de DNA compreende um corante de cianina.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o corante de cianina é usado em uma reação de amplificação a uma concentração inferior a 4 μM.
9. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o corante de cianina é usado em uma reação de amplificação a uma concentração inferior a 2,7 μM.
10. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o perfil de assinatura é produzido a partir de um corante fluorescente.
11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: a. selecionar um evento transgênico compreendendo o polinucleotídeo de DNA de doador exógeno dentro do locus genômico eucariótico alvo.
12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a nuclease compreende uma nuclease de dedo de zinco.
13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a nuclease compreende uma nuclease TALEN ou CRISPR.
14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amplificação compreende amplificar em uma reação em cadeia de polimerase.
15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o segundo amplicon compreende uma junção 5' do polinucleotídeo de DNA de doador exógeno e o locus genômico eucariótico alvo.
16. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o segundo amplicon compreende uma junção 3' do polinucleotídeo de DNA doador exógeno e o locus genômico eucariótico alvo.
17. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo de DNA de doador exógeno compreende pelo menos uma fita de expressão gênica.
18. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira ou a segunda pluralidade de iniciadores, ou ambos, compreendem um corante fluorescente.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o corante fluorescente é selecionado do grupo que consiste em um corante fluorescente HEX, um corante fluorescente FAM, um corante fluorescente JOE, um corante fluorescente TET, um corante Cy3 fluorescente, um corante fluorescente Cy 3.5, um corante fluorescente Cy 5, um corante fluorescente Cy 5.5, um corante fluorescente Cy 7 e um corante fluorescente ROX.
20. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os iniciadores compreendem ainda uma sonda.
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