BG98714A - Биометод за получаване на 7-аса и 7-аdас - Google Patents

Abstract

Биометодът се прилага за получаване на важни междинни съединения за производството на цефалоспоринови антибиотици, по-специално 7-амино-цефалоспоранова киселина (7-АСА) и 7-амино-деацетилспоранова киселина (7-ADAC). По него се култивира трансформиран щам от Penicillium chrysogenum в присъствието наадипатна хранителна среда за продуцирането на адипоил-6-АРА (6-амино-пеницилинова киселина), последвано от in situ експресия на следните гени, с които Р. chrysogenum е бил трансформиран: експандазен ген, даващ (адипоил-7-ADCA), хидроксилазен ген, даващ (7-ADAC), и ацетилтрансферазен ген, даващ (адипоил-7-АСА). Крайният продукт (7-АСА) се получава чрез отцепване на адипоиловата странична верига, като се използва адипоилацилаза.

Description

НОВИ БИОМЕТОДИ ЗА ПОЛУЧАВАНЕ НА 7-АСА И 7-ADAC

Представеното изобретение се отнася до нови биометоди за получаване на 7-АСА и 7-ADAC. Представеното изобретение е от областта на методите за синтез на търговски цефалоспоринови антибиотици, от които понастоящем съществуват голям брой; тези терапевтични агенти сега са четвърто поколение. Голямото разнообразие от странични вериги, което се среща в търговските цефалоспорини и значителното икономическо значение на цефалоспорините постави от особена важност въпроса за постигане на поикономични и по-ефективни методи за получаване на ключовите междинни съединения, които да позволят бърз синтез на различините цефалоспорини.

-2Едно от тези ключови междинни съединения е 7-амино-цефалоспориновата киселина (7-АСА), която може да се представи със следната формула;

Обикновено, 7-АСА се получава от цефалоспорин С. Самият цефалоспорин С е ферментационен продукт, който е изходната точка за почти всички продавани понастоящем цефалоспорини. Обаче, синтетичната обработка за получаването на тези различни търговски цефалоспорини в основата си започва, в повечето случай, от 7-амино-цефалоспорановата киселина, която трябва да се получи от цефалоспорин С чрез отцепване на 7-аминоадипоиловата странична верига. Типичните търговски цефалоспорини, получени синтетично от 7-АСА и, които поради тази причина притежават 3ацетилоксиметиленова странична верига, вкючват: цефотаксим, цефалоглицин, цефалотин и цефапирин.

Друго ключово междинно съединение е 7-амино-деацетилцефалоспоранова киселина (7-ADAC), която може да се представи с формулата: с

Понастоящем, 7-ADAC се получава също така от цефалоспорин С, чрез отстраняване на 7-0-а-аминоадипоиловата странична верига, едновременно с превръщането на 3-ацетилоксиметиленовата странична верига в 3хидроксиметил. 7-ADAC е полезно междинно съединение в синтеза на цефалоспорини, съдържащо модифицирани заместители на С-3 мястото.

-3Нормално, методът, който се избира за отцепване на 7-аминоадипоиловата странична верига, е химичен. Основният имино-халогениден метод изисква блокиране на амино и карбоксилната групи в 7-аминоадипоиловата странична верига и понастоящем се използуват няколко метода за това. Но, така както се използуват днес, химичните методи имат сериозни недостатъци. Като такива могат да се посочат изискванията за многостепенен и сложен процес, изключително ниски работни температури, скъпи химикали, получаването на значителни количества странични продукти, водещи до проблеми за изхвърлянето им и пречистване на силно онечистения изходен материал преди началото на химичната обработка. В резултат на това се стигна до непрекъснато търсене на микробиологичен или ферментационен процес, който би могъл да даде ензимно деацилиране на цефалоспорин С и да даде 7-амино-цефалоспоранова киселина на по-икономична основа от нормално използувания химичен процес.

Обаче, това търсене на успешен микробиологичен процес се оказа безуспешно. Причина за това е, както е изяснено в литературата, структурата и специално стереохимията на аминоадипоиловата странична верига на молекулата на цефалоспорин С, защото пеницилин е бил успешно деацилиран с ензимно отцепване като се използува пеницилин ацилаза, получена от голям брой микроорганизми. От друга страна, данните в литературата за успешно еднофазно ензимно деацилиране на цефалоспорин С са често неповторими или дават твърде ниски добиви.

Във връзка с горното, представеното изобретение е специално в областта на получаване на ключово цефалоспориново междинно съединение 7-АСА и по-точно, в областта на биопроцесите за получаване на 7-АСА.

До днес усиленото търсене на успешен биопроцес за получаване на 7АСА се е оказало безрезултатно, особено що се отнася до промишлен мащаб. Например, докато е възможно получаването на 6-аминопеницилинова киселина (6-АРА) чрез директна ферментация и/или с ензимна обработка на пеницилин G, що се отнася до необходимото разширение на пръстена, за да

-4се достигне до 7-ADCA, е установено, че за съжаление ензимите на Cephalosporium или Streptomyces, които извършват разширяването на пръстена при нормалния метаболитен ход на тези микроорганизми, не възприемат 6-АРА като субстрат. Тези ензими, които имат общо обозначение DAOCS или експандаза-ензими, се дефинират като ензими, които катализират разширяването на пръстенните структури на пенам-а, срещащи се в пеницилиновия тип молекули до пръстените цеф-3-ем, които са открити в цефалоспорините. По-нататък тези ензими ще се наричат общо експандазаензим.

Субстрат, върху който експандаза ензимът действува, е пеницилин N, който при разширяването на пръстена и хидроксилиране, дава деацетилцефалоспоранова киселина (DAC). Тук е необходимо само да се отцепи (D)-aаминоадипоиловата странична верига, за да се получи 7-ADAC, но тази странична верига се е оказала крайно неподатлива на ензимно отцепване, водейки само до неприемливо ниски добиви.

Съгласно представеното изобретение, беше възможно да се достигне до ефективен биометод, при който пеницилиново съединение (притежаващо адипоилна странична верига) е получено по нов ферментационен процес с високи титри, като споменатото пеницилиново съединение е приемлив субстрат за експандаза ензима, който е получен in situ (на място) от същия микроорганизъм, който продуцира пеницилиновото съединение, като е трансформиран, за да експресира споменатия експандаза ензим. След това експандаза ензимът действува, за да разшири пръстена на пеницилиновото съединение до цефалоспориново съединение с високи добиви.

Адипоил-7-ADCA получен от in situ действието на експандаза ензима, има З-метил (-СН3) странична верига, докато 7-АСА, крайният продукт, притежава 3-ацетилоксиметил [-СН2ОС(О)СНз] странична верига. С цел да се превърне 3-метиловата в З-ацетилоксиметилова странична верига, съгласно представеното изобретение, in situ бяха експресирани активностите още два други ензима в допълнение активността на експандазата. Те са, дадени

-5последователно: хидроксилаза и ацетилтрансфераза и двата са експресионни продукти на гени, с които са трансформирани микроорганизмите, продуциращи пеницилиновото съединение. Ензимът хидроксилаза превръща

3-метиловата странична верига на адипоил-7-ADCA в 3-хидроксиметил, а ензимът ацетилтрансфераза превръща тази 3-хидроксиметилова странична верига в З-ацетилоксиметиловата странична верига на 7-АСА.

И, което е най-важно, в последния, критичен етап на метода от представеното изобретение е, че страничната верига на пеницилиновото съединение, сега вече цефалоспориново съединение, е отстраняема от друга ензимна система, с очудващо високи добиви. Неочакваният резултат от този уникален, тотален биопроцес, който е включен в представеното изобретение, е получаването на 7-АСА с очудващо високи добиви, при това достатъчно икономично, за да представлява разумна алтернатива на сега използуваните методи на химична и биохимична обработка.

ПРЕДИШНО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

Новите биометоди от представеното изобретение дават уникален и очудващо ефективен метод за получаване на 7-АСА като икономически изгодна алтернатива на съществуващите химични синтези. Продължителните усилия в тази област за постигането на такъв биометод са в резултат на повтарящи се несполуки. Например, в ЕР-А-0 422 790 е описана ДНК кодираща активността на изопеницилин Ь1:ацил-СоА ацилтрансфераза от Aspergillus nidulans и приложението й в получаването на полезни цефалоспорини в пеницилин-продуциращи гъбички, което досега не е извършено. Но това е описано като деструкция или изместване на гена на ацилтрансферазата едновременно с прибавянето на гени, кодиращи ензимите епимераза и експандаза от цефалоспорин-продуциращи микроорганизми; още повече, не е постигната действително никаква полезна трасформация и експресия. Освен това, ако трансформацията е била успешна, тя все още не би могла да бъде полезна за целите на представеното изобретение, тъй като проблема за отстраняването на D-а-аминоадипоиловата странична верига, все

-6още остава. Такъв несполучлив опит в тази област за постигане на значителни резултати в промишленото получаване на цефалоспоринови междинни съединения от пеницилин-продуциращи гъбични култури е в пълен контраст с постигнатите при метода от представеното изобретение резултати.

Първият етап от ензимния биометод на представеното изобретение е разширяването на пръстена на адипоил-6-АРА, проведено с ензима експандаза, която е продукт на експресията на експандаза гена, с който е трансформиран нерекомбинантния приемник Р. chrysogenum. Използуването на такъв експандаза ензим е изследвано и преди. Например, Cantwell et al. Curr Genet (1990) 17& 213-221, са предложили биопроцес за получаване на 7-ADCA чрез разширяване на пръстена на пеницилин V, последвано от ензимна хидролиза на получения деацетоксицефалоспорин V за получаване на 7-ADCA. Това предложение се базира на наличието на клониран пеницилин експандаза ген (cefE) от S. clavuHgerus: Kovacevic et al. J. Bacteriol. (1989) 171: 754-760; Ingolia et al. U.S.Patent 5,070,020. Ho, тъй като експандазата действува на пеницилин N, нейния естествен субстрат, а не на пеницилин V, предложението изисква генно инженерство за получаването на модифициран експандаза ген, който ще може да разшири пръстена на пеницилин V. Необходимата модификация не е постигната от Cantwell et al., обаче те само са постигнали успех в трасформирането на Penicillium chrysogenum с cef Е ген от Streptomyces clavuHgerus и са получили слаба експресия на DAOCS (експандаза) ензима.

Ензимът експандаза е добре изследван, както по отношение на активността му, така и по отношение на генетичната последователност. Например, Wolfe в U.S.Pat. 4,510,246 и 4,536,476 е описал изолирането на циклаза, епимераза и ензими, разширяващи пръстена, от свободен от клетки екстракт на микроорганизми-продуценти на прокариотичен бета-лактам, включително Streptomyces clavuHgerus за получаването на стабилни ензимни реагенти. Dotzlaf в U.S.Pat. 5,082,772 (ЕР-А-О- 366 354) описва изолиран и пречистен ензим експандаза от S. clavuHgerus, който е охарактеризиран,

-7включително чрез крайния остатък и аминокиселинния състав и е определено молекулно тегло от около 34,600 далтона. Но това е в противоречие с молекулното тегло 29,000, присъдено на нещо, което би изглеждало като същия ензим в U.S.Pat. 4,536,476. ΕΡ-Α-0 233 715 описва изолирането и охарактеризираното с ендонуклеазна рестрикционна карта на експандаза ген, получен от S. clavuligerus и експресията на рекомбинантна експандазакодираща ДНК (даваща активен експандаза ензим) в щам от S. clavuligerus, при който липсва способността за продуциране на цефалоспорин. Ingolia et al. в U.S.Pat. 5,070,020 (EP-A-0 341 892) описват ДНК последователност, кодираща експандаза ензим, получена от S. clavurigerus и описва превръщането на щам от P.chrysogenum с експресионен вектор, съдържащ споменатата последователност на ДНК, при което по този начин се получава отделянето на ензима експандаза. Въпреки че се предполага, че този ензим е полезен за разширяването на пръстена на други субстрати, освен пеницилин N, досега няма действително демонстриране на такова разширяване.

Описаната по-горе работа е фокусирана върху ензима експандаза, получен от прокариотични S. clavuligerus. Ензим, притежаващ привидно същото действие на разширяване на пръстена, е експресиран също така от щамове на евкариотични Cephalosporium acremonium (също така означаван и като Acremonium chrysogenum). Обаче, в такива щамове активността на експандазата е експресирана от бифункционален ген (cefEF), който също така експресира DACS (хидроксилазна) активност, но чиято естествена функция е да превърне дезацетоксицефалоспорановата киселина (DAOC) - продукт на ензима експандаза, в деацетилцефалоспорин С (DAC). Резултатът от тази експресия е един, но бифункционален експандаза/хидроксилаза ензим. При все че са правени усилия за разделяне активностите на тези два генни продукта, досега нито едно от тях не е било успешно. Например, ЕР-А-0 281 391 описва изолирането и определянето на ДНК-последователността на гена DAOCS/DACS, получен от С. acremonium АТСС 11550 заедно със съответната аминокиселинна последователност на ензима. Penicillium е трансформиран и

-8експресира енизимите, обаче опитаното превръщане на пенецилини G и V в съответните цефалоспорини никога не е било демонстрирано. Освен това, въпреки предположението, че техниките на генното инженерство дават готови средства, за да се раздели генетичната информация кодираща DAOCS от DACS и отделното им експресиране, досега не е показано такова разделяне.

Ензимът DAOCS/DACS (експандаза/хидроксилаза) от С. acremonium е също така добре изследван, както по отношение на активността му и характеристиките, така и по отношение на генна последователност. Например, Demain в U.S.Pat. 4,178,210; 4,248,966 и 4,307,192 описва обработката на различни пеницилинов-тип изходни материали със свободен от клетки екстракт от С. acremonium, който епимеризира и разширява пръстена за получаване на цефалоспоринов антибиотичен продукт. Wu-Kuang Yeh в U.S.Pat 4,753,881 описва ензима на С. acremonium по отношение на изоелектричната му точка, молекулно тегло, аминокиселинни остатъци, отношение на активностите хидроксилаза към експандаза и пептидни фрагменти.

Ензимът ацетилтрансфераза от С. acremonium също така е описан по отношение на активността му, характеристиките му, рестрикционното му картиране и нуклеотидната и аминокиселинна последователности. Вижте например ЕР-А-0 437 378 и ЕР-А-0 450 758.

Разгледаните по-горе изследвания се занимават само с един единствен аспект на представеното изобретение, т.е. трансформирането на щама Р. chrysogenum с гени експресиращи ензимите експандаза и експандаза/ хидроксилаза и получаването експресия на тези ензими. В тези разглеждания експресираните ензими са използувани за разширяване на пръстена на пеницилин N, но не и за пеницилините G и V. Дори и в този случай, пеницилин N притежава странична верига на 7-позиция, която не може да бъде отцепена ензимно, за да даде свободна аминогрупа. Представеното изобретение е на базата на изненадващото откритие, че адипоиловата странична верига може да бъде ефективно добавена от щама Р. chrysogenum, че ензимът експандаза,

-9експресиран in situ може да използува това съединение като субстрат за разширяване на пръстена до адипоил-7-ADCA, че ензимите хидроксилаза и ацетилтрансфераза, също така експресирани in situ, могат да използуват адипоил-7-ADCA като субстрат за получаването на 3-ацетоксиметилова странична верига на 7-АСА и че адипоиловата странична верига може след това да бъда отстранена ефективно от друг ензим за получаването на 7-АСА. Докато в предишните описания могат да бъдат открити отделни фрагменти от представеното изобретение, то досега няма никаква идея, те да се обединят, за да се получат неочакваните резултати, постигнати с метода на представеното изобретение.

Например, известно е получаването на 6-адипоил пеницилиновата киселина, вижте Ballio, A et al. Nature (1960) 185, 97-99. Ензимното разширение на 6-адипоил пеницилиновата киселина е също така известно, но само in vitro, вижте Balwin et al. Tetrahedron (1987) 43,3009-3014 и ΕΡ-Α-0 268 343. Също така известно е и ензимното отцепване на адипоилови странични вериги, вижте например, Matsuda et al. J. Bact. (1987) 169, 5815-5820. Адипоиловата странична верига притежава следната структура: СООН-(СН2)4-СО-, докато други две странични вериги с близки структури са тези на глутарила, притежаваща следната формула: СООН-(СН2)з-СО- и на (О)-а-аминоадипоила, притежаващ формула: COOH-CH(NH2)-(CH2)3-CO-. Известно е ензимното отцепване на глутариловите странични вериги, вижте например Shibuya et al. Agric. Biol. Chem. (1981) 45, 1561-1567 и U.S.Pat. 3,960,662; Matsuda & Komatsu, J. Bact. (1985) 163, 1222-1228; Matsuda et al., J.Bact. (1987) 169, 5815-5820; Jap.Pat. 53086084 (1978 - Banyu Pharmaceutical Co.) и Jap.Pat. 52-128293 (1977 - Banyu Pharmaceutical Co.). Също така в ΕΡΑ-Α-0 453 048 са описани методи за подобряване на адипоил-отцепващата активност на глутарилацилаза, получена от Pseudomonas SY-77-1. Чрез заместване на различни аминокиселини на определени места в алфа-подверигата, е наблюдавано от три до пет пъти по-висока степен на адипоилово отцепване (от адипоил-серин). Трябва да се отбележи, че в ЕР-А-0 453 048, въпреки това, че е демонстрирана

-10ацилаза с подобрена активност спрямо адипоиловите странични вериги, никъде не са описани методи (нито химически, нито чрез биопроцес аналогичен на този в представеното изобретение), при които може да се получи на първо място адипоил-цефалоспорин.

Известно е, че там където е налице (0)-а-аминоадипоилова странична верига, първо се отстранява ензимно аминогрупата и се скъсява страничната верига с (0)-аминокиселинна оксидаза, оставяйки глутарилова (GL-7) странична верига, като отстраняването на страничната глутарилова верига се извършва с втори ензим (глутарил-ацилаза). Такова двустепенно отцепване е описано от Matsuda в U.S.Pat. 3,960,662; ЕР-А-0 275 901; Jap.Pat. 61-218057 (1988 - Komatsu, Asahi Chemical Industry Co.); WO 90/12110 (1990 - Wong, Biopure Corp.) и EP-A-0 436 355, Isogai et al. Biotechnology (1991) 9,188-191.

Известно е също така провеждането на едностепенно отцепване на (D)α-аминоадипоилова странична верига, специално с използуването на рекомбинантни техники. Например, вижте:

Едностепенно отцепване на (Р)-а-аминоадипоилова странична верига:

- Jap.Pat. 53-94093 (Meiji, Pseudomonas sp. BN-188);

- Jap.Pat. 52-143289 (= U.S.Pat. 4,141,790, Meiji, Aspergillus sp.);

- U.S.Pat. 4,774,179 (Asahi 1988 Pseudomonas sp. SE-83 и SE-495) = Jap.Pat. 6121097 и 61152286;

- Fr. Pat. 2,241,557 (Aries 1975, Bacillus cereus var. fluorescens);

- Jap.Pat. 52-082791 (Toyo Jozo 1977, Bacillus megaterium NRRL B 5385);

- EP-A-0 321 849 (Hoechst, Pseudomonas, Bacillus subtilis, гама-глутамил транспептидаза);

- EP-A-0 322 032, EP-A-0 405 846 и U.S.Pat. 5,104,800 (Merck, Bacillus megaterium);

- EP-A-0 283 218 и U.S.Pat. 4,981,789 (Merck, Arthrobacter viscosus);

Едностепенно рекомбинатно: Ceph C - 7-ACA:

- Jap.Pat. 60-110292 (Asahi 1985, Comamonas, рекомбинатни E.Coli c ген от Pseudomonas sp. SE 83, генната последователност е описана и защитена, едностепенен процес вече заявен в U.S.Pat. 4,774,179);

- Jap. Pat. 63-74488 (Asahi 1988, Trigonopsis Variabilis, Comamonas, рекомбинантни E.Coli отделяне на D-аминокисела оксидаза и GL-7-ACA ацилаза);

- ЕР-А-0 475 652 (Fujisawa, цефалоспорин С ацилаза и нейното получаване по рекомбинантна технология).

Известни са различни аспекти на методите за получаване на 7-ADCA. Например, вижте U.S.Pat. 3,304,236 и 3,972,774 (Eli Lilly & Co.); EP-A-0 454 478 (Shionogi & Co. Ltd.); и публикувания японски патент 53-499 (Shionogi & Co., Ltd.).

Справка за съзаявените приложения

Направена е справка за съзаявеното приложение сериен No. 07/933,469, изпълнено на 28 август 1992, което описва биометод за получаване на 7-ADCA, който почива на експресията на активността експандаза ензима в Р. chrisogenum, трансформиран по същия начин, както и биометода за получаване на 7-ADCA и 7-АСА, описан тук. Обаче, в представения биометод са използувани допълнителни трансформации за експресията на допълнителни ензимни активности, с цел да се постигне напълно различен рекомбинантен метаболичен път до крайните продукти, като нито един от тях не е използуван в съзаявеното приложение.

С цел да се улесни по-доброто разбиране на метода от представеното изобретение и уроците от предишните публикации, разгледани по-горе, подолу са дадени различните етапи на метаболитните пътища, водещи до получаването на адипоил-6-АРА, адипоил-7-ADCA, адипоил-7-АСА и 7-АСА, междинните продукти и ензимите, които извършват включените трансформации.

-12ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Представеното изобретение се отнася до нов биометод за получаване на 7-аминодеацетилцефалоспоранова киселина (7-ADAC), включващ следните етапи:

1) поддържане в културална среда, способна да поддържа растежа му, на щам от Penicillium chrysogenum, продуциращ изопеницилин N и прибавяне към споменатата културална среда на адипатна хранителна среда, включваща адипинова киселина, отделно или с нейните соли и естери, които са способни да бъдат асимилирани и оползотворени от споменатия щам на Penicillium chrysogenum за продуцирането на адипоил-6-аминопеницилинова киселина ^w (адипоил-6-АРА), при което се получава споменатият адипоил-6-АРА,

2) провеждане на следните ензимни превръщания, чрез in situ експресиране на съответния ген:

а) на адипоил-6-АРА се разширява in situ пръстена до образуването на адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоранова киселина (адипоил-7-ADCA) чрез ензима експандаза, при което споменатият щам от P.chrysogenum е трансформиран чрез ДНК, кодираща активността на ензима експандаза, така че да възприеме споменатата адипоил-6-АРА като субстрат, върху който, в резултат на експресията, на споменатата адипоил-6-АРА, получена от ζ* споменатия щам също така in situ се разширява пръстена, за да се образува адипоил-7-ADCA;

б) 3-метиловата странична верига на адипоил-7-ADCA се хидроксилира in situ за получаването на адипоил-7-аминодеацетил-цефалоспоранова киселина (адипоил-7-ADAC) чрез ензима хидроксилаза, при което споменатият щам е трансформиран чрез ДНК кодираща активността на ензима хидроксилаза, за да може да приеме споменатата адипоил-7-ADCA като субстрат върху който, в резултат на експресията, споменатата адипоил7-ADCA, получена от споменатия щам, след това също така се хидроксилира in situ до образуването на адипоил-7-ADAC; и

3) осъществяване на контакт между споменатата адипоил-7-ADAC с адипоиламидаза, при което адипоиловата странична верига се отстранява и се получава продукта 7-ADAC; и след това споменатият продукт се изолира.

Представеното изобретение се отнася по-нататък до нов биометод за получаване на 7-аминоцефалоспоранова киселина (7-АСА), включващ следните етапи:

1) поддържане в културална среда, способна да поддържа растежа му, на щам от Penicillium chrysogenum, продуциращ изопеницилин N и прибавяне към споменатата културална среда на адипатна храниителна среда, w включваща адипинова киселина, отделно или с нейните соли и естери, които са способни да бъдат асимилирани и оползотворени от споменатия щам на Penicillium chrysogenum за продуцирането на адипоил-6-аминопеницилинова киселина (адипоил-6-АРА), при което се получава споменатия адипоил-6-АРА,

2) провеждане на следните ензимни превръщания, чрез in situ експресиране на съответния ген:

а) на адипоил-6-АРА се разширява in situ пръстена до образуването на адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоранова киселина (адипоил-7-ADCA) чрез ензима експандаза, при което споменатият щам от P.chrysogenum е трансформиран чрез ДНК, кодираща активността на ензима експандаза, така че да възприеме споменатата адипоил-6-АРА като субстрат, върху който, в резултат на експресирането, на споменатата адипоил-6-АРА, получена от споменатия щам също така in situ се разширява пръстена, за да се образува адипоил-7-ADCA;

б) 3-метиловата странична верига на адипоил-7-ADCA се хидроксилира in situ за получаването на адипоил-7-аминодеацетил-цефалоспоранова киселина (адипоил-7-ADAC) чрез ензима хидроксилаза, при което споменатият щам от Penicilliun chrysogenum е трансформиран чрез ДНК, кодираща активността на ензима хидроксилаза, за да може да приеме споменатата адипоил-7-ADCA като субстрат върху който, в резултат на

13-1

L - алфа - аминоадипинова киселина L - цистеин + L-валин

(IPN)

IPN АМИДОЛИАЗА

13-2

АЦИЛ СоА: 6 - АРА АЦИЛТРАНСФЕРАЗА

ФЕНИЛАЦЕТИЛ СоА

ПЕНИЦИЛИН G

(IPN)

13-3

ИЗОПЕНИЦИЛИН Ν (ΙΡΝ)

ΙΡΝ ЕПИМЕРАЗА ( D) ФЕНИЛАЦЕТИЛ СоА

ПЕНИЦИЛИН Ν

ПЕНИЦИЛИН Ν ЕКСПАНДАЗА

13-4

CD)

ДЕЗАЦЕТОКСИЦЕфАЛОСПОРАНОВА КИСЕЛИНА (DAOC)

DAOC 3' - ХИДРОКСИЛАЗА

13-5

CD)

ДЕАЦЕТИЛЦЕФАЛОСПОРАНОВА КИСЕЛИНА (DAC)

DAC АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗА

V

13-6

CD)

ЦЕФАЛОСПОРИН С

-14експресирането, споменатата адипоил-7-ADCA, продуцирана от споменатия щам, след това също така се хидроксилира in situ до образуването на адипоил-7-ADAC; и

в) адипоил-7-ADAC се ацетилира in situ до получаването на адипоил-7аминоцефалоспоранова киселина (адипоил-7-АСА) с ензима ацетилтрансфераза, при което споменатият щам от Р. chrysogenum е трансформиран чрез ДНК, кодираща активността на ензима ацетилтрансфераза, способен да приеме споменатата адипоил-7-ADAC като субстрат, върху който, в резултат на експресирането, споменатата адипоил-7ADAC, продуцирана от споменатия щам, се ацетилира след това in situ, за да се получи адипоил-7-АСА и

3) осъществяване на контакт на споменатата адипоил-7-АСА с адипоиламидаза, при което адипоиловата странична верига се отстранява и се получава продукта 7-АСА, който след това се изолира.

Така, както са използувани тук, термините имат значенията, дадени подолу:

7-АСА означава 3-[(ацетоилокси)-метил]-7-амино-8-оксо-5-тиа-1азабицикло[4.2.0]окт-2-ен-2-карбонова киселина;

адипоил-6-АРА означава [28-(2алфа,5алфа,6бета)]-3,3-диметил-7-оксо&{(хексан-1,6-диоил)амино]-4-тиа-1-азабицикло(3.2.0]хептан-2-карбонова киселина;

адипоил-7-ADCA означава 3-метил-7-[(хексан-1,6-диоил)амино]-3метил-8-оксо-5-тиа-1-азабицикло[4.2.0]окт-2-ен-2-карбонова киселина и адипоил-7-ADAC означава 3-хидроксиметил-7-[(хексан-1,6-диоил) амино]-3-метил-8-оксо-5-тиа-1-азабицикло[ 4.2.0] окт-2-ен-2-карбонова киселина.

По-точно, представеното изобретение се отнася до нови биопроцеси за получаване на 7-аминодеацетилцефалоспоранова киселина (7-ADAC) и 7аминоцефалоспоранова киселина (7-АСА), цитирани по-горе, при които адипатната хранителна среда е двунатриев адипат, при които (процеси)

-15ДНКиселините кодиращи активностите на ензимите експандаза, хидроксилаза и ацетилтрансфераза са произлезли от Cephalosporium acremonium и в които (процеси) адипоилацилазата е получена от Pseudomonas sp.

По-нататък, представеното изобретение се отнася до рекомбинантни ДНК експресионни вектори, включващи ДНК-ни кодиращи активностите на ензимите експандаза, хидроксилаза и ацетил-трансфераза, получени от Cephalosporium acremonium и промотори, които управляват експресията на гените, кодирани за споменатите ензими, включващи плазмидите pPEN/CEPH1, pPENCACT и pTS-8, както са описани по-нататък.

Изобретението се отнася също така и до клетки-гостоприемници на Penicillium chrysogenum, трансформирани с рекомбинантни ДНК експресионни вектори, включващи ДНК-ни кодиращи активността на ензимите експандаза, хидроксилаза и ацетилтрансфераза, получени от Cephalosporium acremonium и промотор, които управлява експресията на споменатата ензим-кодираща ДНК, включващ промотор на гена на Penicillium chrysogenum IPNS. По-точно, представеното изобретение се отнася до клетки-гостоприемници от Penicillium chrysogenum, трансформирани с рекомбинантни ДНК експресионни вектори, включващи плазмидите pPEN/CEPH-1, pPENCACT и pTS-8, които са описани по-нататък.

Представеното изобретение се отнася и до метод за култивиране на рекомбинантни клетки-гостоприемници от Penicillium chrysogenum при условия, подходящи за генна експресия, при което споменатите рекомбинантни клетки-гостоприемници, включват експресионни вектори от рекомбинантна ДНК, включващи ДНК, кодиращи активността на ензимите експандаза, хидроксилаза и ацетилтрансфераза, получени от Cephalosporium acremonium и промотор, който управлява експресията на споменатите ензимкодиращи ДНК, включващ промотора на Penicillium chrysogenum IPNS гена. По-точно, представеното изобретение се отнася до метод за култивиране на рекомбинатни клетки-гостоприемници от Penicillium chrysogenum при условия, подходящи за генна експресия, при който метод, споменатите рекомбинантни

-16клетки-гостоприемници включват рекомбинантни ДНК експресионни вектори, включващи плазмидите pPEN/CEPH-1, рРепСАСТ и pTS-8, както са описани подолу.

Първият аспект на представеното изобретение е нов биометод за получаване на 7-аминоцефалоспоранова киселина (7-АСА) и 7-аминодеацетилспоранова киселина (7-ADAC) - ключови междинни съединения при получаването на синтетични търговски цефалоспорини, които могат да бъдат представени със следните структурни формули:

В допълнение към цефалоспориновото ядро, отличителните особености на 7-АСА са 7-аминогрупата и 3-ацетилоксиметиловата (или З-ацетоксиметил, както по-често се означава) група. 7-аминогрупата е тази, която може да се превърне във всякакъв брой производни странични вериги, като така създава база за синтезиране на различни търговски цефалоспорини. З-ацетилоксиметиловата група често ще бъде превръщана в някаква друга странична верига с цел да се синтезира търговски цефалоспорин.

Крайният продукт 7-АСА и междинният продукт адипоил-7-АСА от метода на представеното изобретение могат да бъдат противопоставени на цефалоспорин С, друг ключов цефалоспоринов междинен продукт, който може да бъде представен със следната структурна формула:

СООН

-17При това междинно съединение, 7-(0)-алфа-аминоадипоиловата странична верига не е приемлива за по-нататъшни синтетични производни и трябва да се отцепи, за да се получи приемливата 7-аминогрупа. За съжаление, 7-(D)-aаминоадипоиловата странична верига се е оказвала винаги трудна за отстраняване, както с химични, така и биохимични средства.

Дефиниции

Така, както са използувани в даденото описание и особено в глава Описание на предпочетените изпълнения, използуваните съкращения имат следните значения:

7-АСА 7-ADAC	7-аминоцефалоспоранова киселина 7-аминодеацетилцефалоспоранова киселина
7-ADCA	7-аминодезацетоксицефалоспоранова к-на
6-АРА	6-аминопенициланова киселина
DAOC	дезацетоксицефалоспоранова киселина
DAOCS	DAOC-синтетаза
DAC	деацетилцефалоспорин С (деацетилцефалоспоранова киселина)
DACS	DAC-синтетаза
IPNS	изопеницилин N синтетаза
F*· Tris EDTA	три[хидроксиметил]аминометан етилендиаминотетраоцетна киселина
DEPC	диетилпирокарбонат
ТЕ	Tris/EDTA буфер
SSC	буфер натриев хлорид/натриев цитрат
SDS	натриев додецилсулфат
PEG	полиетилен гликол

Култура Penicillium chrysogenum

Първият етап от метода на представеното изобретение включва поддържането в културална среда, способна да поддържа растежа му на щам

-18от Penicillium chrysogenum, продуциращ изопеницилин N и прибавянето към споменатата културална среда на адипатна хранителна среда, включваща адипинова киселина или нейните соли и естери, които са способни да бъдат асимилирани и оползотворени от споменатия щам на Penicillium chrysogenum, за да се получи адипоил-6-АРА. Адипатната хранителна среда може да се добави към културалната среда след инокулацията с Р.chrysogenum, но за предпочитане е да бъде вече в културалната среда по времето когато се

извършва инокулацията.

Други родове освен Penicillium, напр. Aspergillus nidulans, както и други видове от рода Penicillium, освен видовете chrysogenum, също така продуцират изопеницилин N. Обаче, исторически, най-високо продуктивните щамове на изопеницилин N, разработени с добре известните техники за подобряване на щамовете, са щамовете от видовете chrysogenum. Ето защо, от практическа гледна точка, представеното изобретение се е ограничило до щамовете на Penicillium chrysogenum, въпреки че приложимостта на изобретението спрямо други щамове е явна. Всеки депозиран щам от Penicillium chrysogenum или от друг достъпен източник на такъв щам е подходящ изходен материал за изпълнение на метода от представеното изобретение.

Културалната среда, способна да поддържа растежа на щама от Penicillium chrysogenum, продуцент на изопеницилин N е от типа, който е добре известен на специалистите в тази област. Например, култивирането ще се проведе по метода на вътрешна (дълбока) аеробна ферментация, а използуваната среда може да се подбере от голям брой налични подходящи среди. Типични такива среди са тези, използуващи източници на въглерод като захароза, глюкоза и нишесте, източници на азот като соево брашно и шротове, масло от памучено семе, фъстъчено брашно и различни аминокиселини, техните смеси и пептони. Изискванията на производството са висок добив и лесно изолиране, и поради тази причина предпочетените среди

-19за такива ситуации могат да бъдат меласите, като източник на въглерод и соевото брашно и аминокиселини, като източници на азот.

Към културалната среда обикновено се прибавят и хранителни неорганични соли, включващи соли, способни да доставят следните йони: натриеви, калиеви, амнониеви, калциеви, фосфатни, сулфатни, хлоридни, бромидни, нитратни, карбонатни, фери, феро, магнезиеви, манганови и др. Следи от някои елементи също така са от значение за растежа, развитието и метаболизма на Penicillium chrysogenum и могат да бъдат прибавени директно в културалната среда, освен ако не са попаднали като онечиствания, главно съпътствуващи другите съставки на средата.

Щамовете Penicillium chrysogenum могат да бъдат култивирани в съоръжения с малък обем, например в еднолитрови колби с разклащане, когато е желателно да се получат малки количества адипоил-7-АСА и евентуално 7-АСА. Когато се преследва получаването на големи количества адипоил-7-АСА, тогава ще се използуват големи ферментори за провеждане на дълбока аеробна ферментация.

При провеждане на голямомащабно получаване на адипоил-7-АСА, спорите на щама Penicillium chrysogenum се поддържат върху наклонен агар. Спорите от агара се използуват за заразяване на вегетативна среда с малък обем. Вегетативната среда се инкубира, за да се получи тежка, прясна, активно растяща култура от микроорганизми. Тази вегетативна среда след това се използува като инокулат за голямата ферментационна среда. В някои случаи е желателно да се включи и втора вегетативна среда като инокулат за ферментационната среда. Такива втори вегетативни среди обикновено се използуват, когато обема на ферментационната среда е значително по-голям от първата вегетативна среда. В този случай, спорите от микроорганизмите първоначално се култивират в малък обем вегетативна среда, за да се получи инокулат за вегетативна среда с по-голям обем. След това втората, по-голяма вегетативна среда притежава достатъчно висока концентрация от микроорганизми, за да предизвика бързо начало на ферментацията в

-20големите ферментори. Вегетативната среда може да има същия състав както и ферментационната среда или може да съдържа допълнителни съставки за стимулиране растежа и развитието на микроорганизмите в малък мащаб.

Използуваните при метода на представеното изобретение щамове от Penicillium chrysogenum се култивират най-ефективно при температури между около 20°С и 30°С, но оптимални добиви ще бъдат получени при около 22°С и 28°С, за препоръчване - около 25°С.

Максимално продуциране на адипоил-7-АСА се получава, когато щама от Penicillium chrysogenum се култивира в големи ферментори за период от време между около 10 и 30 дни, за предпочитане - между 15 и 20 дни. Обаче, когато е култивиран в малка апаратура, като напр. 250 мл колба, растежа на микроорганизмите е по-бърз и продуцират адипоил-7-АСА за по-малко време, напр. 4 до 15 дни, по-често 5 - 7 дни.

Ако крайното рН в големите ферментори достигне стойност 8,0 или повисока, добивът на адипоил-7-АСА ще бъде повлиян обратно. В такива ситуации, желателно е да се следи рН на културалната среда по време на ферментацията. Ако се стигне до там, че рН на средата достига тези нива преди достигане на времето за максимална продукция на азипоил-7-АСА, рН на средата може съответно да се намали с прибавянето във ферментационната среда на подходящ киселинен агент или буфер.

Продуцирането на адипоил-7-АСА може да се следи чрез хроматографско тестване на проби от ферментационната среда.

Както при повечете дълбоки аеробни ферментации, през културалната среда се пропуска стерилен въздух за получаване на по-ефективен растеж на щама Penicillium chrysogenum и повишаване производството на адипоил-7АСА. Обемът на въздух, преминаващ през средата обикновено е около 0,2 обема въздух на минута за обем културална среда. Обаче, по-голям обем преминаващ въздух често оказва благоприятен ефект върху продукцията на адипоил-7-АСА.

-21 Обикновено щама Penicillium chrysogenum продуцира, наред с адипоил7-АСА и много други странични продукти и метаболити. Тъй като някои от тях са лабилни спрямо киселина, желателно е при извличането на адипоил-7-АСА от ферментационната среда, цялата ферментационна хранителна среда да се обработи за кратко време при ниска стойност на pH (кисела), с цел да се разрушат някои от получените онечиствания. Продуктът на ферменатцията адипоил-7-АСА се извлича от така обработената и филтрувана ферментационна среда и обикновено може да бъде разделен от останалите съставки на ферментацията хроматографски или с йонообменна смола и по-нататък може да се пречисти, ако е необходимо, хроматографски, преди следващия етап на ензимно отцепване на адипоиловата странична верига. Също така е възможно това йонообменно или хроматографско пречистване да се извърши след като е проведено отцепването на страничната верига. Един от основните странични продукти, които представляват проблем при разделянето, е адипоил-6-АРА и, за да се улесни разделянето, възможно е този страничен продукт да бъде химично или ензимно разграден. Първоначално филтруваната ферментационна хранителна среда се подлага на предварително пречистване, което може да включва начална екстракция с несмесваем с водата органичен разтворител, като n-бутанол или амилацетат, за да се отстранят онечиставнията. След това екстрахираната хранителна среда може да се пречисти допълнително хроматографски или върху активен въглен.

Прибавяне на адипатната хранителна среда

Препоръчително е по времето, когато се създава ферментационната среда за Penicillium chrysogeneum, както е описано по-горе, т.е. преди инокулацията, към другите съставки на ферментационната културална среда да се прибави адипатна харнителна среда. Обикновено, адипатната хранителна среда може да се прибави известно време след инокулацията, например, след 1, 2 и/или 3 ден. Адипатната хранителна среда се дефинира като съставена от адипинова киселина отделно или в смес със солите й или естерите й, които са способни да бъдат асимилирани и оползотворени от

-22щама на Penicillium chrysogenum, който е култивиран, за да произведе адипоил-6-АРА. Адипиновата киселина, солите и естерите й могат да се използуват поотделно или в комбинация. Предпочетена е двунатриевата й сол, въпреки че калиевата и смесени соли с натрия ще бъдат също така подходящи. Би могъл да се използува метиловият естер, но етиловият естер е водонеразтворим. Солта или естера на адипиновата киселина трябва да бъдат такива, че да бъдат асимилирани и оползотворени от щама на Penicillium chrysogenum, за да се получи адипоил-6-АРА. Например, и самата адипинова киселина би могла да бъде подходяща, въпреки че е водонеразтворима, ако при дадено pH се образува асимиларащата й се сол.

Подходящи експандаза и/или хидроксилаза ензими

Щамът Penicillium chrysogenum, който е култивиран и осигурен с адипатна хранителна среда, както е описано по-горе, така че да продуцира адипоил-6-АРА, е също така този, който е трансформиран от ДНК кодираща активностите на ензимите експандаза и хидроксилаза, при което, в резултат от неговата експресия, на споменатата адипоил-6-АРА пръстена се разширява in situ, за да се получи адиопил-7-ADCA, а също така 3-метиловата странична верига се превръща в 3-хидроксиметилова.

Адипоил-6-АРА се продуцира вътрешноклетъчно от култивирания с адипатна хранителна среда Penicillium chrysogenum. В тази вътрешноклетъчна среда, т.е. на база in situ, трансформираният Penicillium chrysogenum също така експресира ДНК-ни, кодиращи активността на ензимите експандаза и хидроксилаза, при което ензимите действуват върху адипоил-6-АРА като субстрат и разширяват пръстена й за образуване на адипоил-7-ADCA, която след това се хидроксилира до адипоил-7-ADAC (адипоил-7-аминодеацетилцефалоспоранова киселина).

Новият биометод от представеното изобретение включва в обсега на действието си трансформирането на щама Penicillium chrysogenum, от типа описан по-горе, с някакви ДНК-ни, кодиращи активностите на ензимите експандаза и хидроксилаза, при което в резултат на експресията им на

-23адипоил-6-АРА in situ се разширява пръстена за превръщането й в адипоил-7ADCA и след това се хидроксилира до образуването на адипоил-7-ADAC. По такъв начин ДНК, с която е трансформиран Penicillium chrysogenum трябва да експресира ензими, притежаващи не само активността на ензима експандаза, както се подразбира, т.е. способността да разширява пръстена на изопеницилин N до DAOC, но и способността да разширява пръстена на адипоил-6-АРА до адипоил-7-ADCA. В допълнение, ензимът хидроксилаза трябва да бъде способен да хидроксилира адипоил-7-ADCA до адипоил-7ADAC.

Два алтернативни пътя се разглеждат като подходящи изпълнения в обсега на действие на представеното изобретение по отношение на начина, по който се създават активностите на ензимите експандаза и хидроксилаза. В едно от изпълненията, което е предпочетено, функциите на експандазата и хидроксилазата се осъществяват от активността, експресирана от един, въпреки че по същество е бифункционален ген от Cephalosporium acremonium, с който е трансформиран Р. chrysogenum. Този ген, който експресира едновременно и двете активности на експандазата и хидроксилазата ще бъде означен като експандаза/хидроксилаза ген, а неговия продукт - като експандаза/хидроксилаза ензим (и). Типично, когато Р. chrysogenum е трансформиран с ДНК от С. acremonium кодираща активността на експандаза/хидроксилаза активността, експресията на тази активност ще се контролира от един единствен промор, което показва наличието на един ген.

Алтернативно изпълнение на представеното изобретение, което е еднакво подходящо, включва трансформирането на Р. chrysogenumгостоприемник с ДНК, кодираща активностите на експандазата и хидроксилазата като отделни гени, противно на единичния експандаза/ хидроксилаза ген. Трябва да се отбележи, че отделните експандаза и хидроксилаза гени и съответните ензимни активности, които те кодират, са установени в прокариотични микроорганизми, такива като S. ciavuligerus, отколкото в евкариотични микроорганизми, като С. acremonium, които

-24кодират единичния експандаза/хидроксилаза ген и ензим, както вече бе наблюдавано по-горе.

Последователността на прокариотичния хидроксилаза ензим и кодиращите го нуклеотиди, са описани от Kovacevic et al. в J. Bacteriol., 173(1), 398-400 (1991) и EP-A-0 465 189, като средство за изолиране на този ензим. Както ще забележи специалиста, от последователността на хидроксилазата, ще бъде възможно да се синтезира, с добре познатите ръчни методи или с автоматични ДНК-синтезатори, ДНК-кодираща ензима хидроксилаза. ДНК или съответната последователност, кодираща същата аминокисела последователност на хидроксилазата или техни фрагменти или производни, притежаващи еквивалентна хидроксилазна активност, на свой ред, могат да бъдат използувани като основата за получаване на различни клониращи и експресионни вектори, когато се комбинират с промотор и други регулиращи последователности, с които след това е възможно да се трансформира P.chrysogenum-гостоприемник с цел да се експресира ензима хидроксилаза и по такъв начин да се изпълни метода от представеното изобретение. Възможно е също така ДНК да се използува като сонда, с която да се провери генната библиотека на кандидат-щама, потенциално съдържащ полезния ензим хидроксилаза, с цел да се идентифицират хомоложните последователности чрез хибридизиране. Активността на всяка предполагаема хидроксилаза, идентифицирана по този начин, може да се потвърди, като се използува действителен адипоил-7-АОСА-субстрат по метода на представеното изобретение и изолиране на продукта от хидроксилирането с HPLC (високо чувствителна течна хроматография).

Когато се приложи това изпълнение на представеното изобретение, т.е. отделен ген, експресиращ само хидроксилазна активност, след това ще бъде необходимо също така отделно да се достави ДНК, кодираща активността на ензима експандаза, така че Р. chrysogenum може да бъде трансформиран с подходящ експресионен вектор, който позволява in situ експресия на функцията експандаза, за да се осигури етапа на разширяване на пръстена по

-25метода на изобретението. Известни са много експандаза-ензими и е стигнато до извода, на базата на приликата на страничните вериги, че много експандаза-ензими ще бъдат годни в новия биопроцес на представеното изобретение.

Други полезни изпълнения на представеното изобретение почиват на факта, че ДНК, кодираща активността на повече от една експанза и/или повече от една хидроксилаза, може да бъде използувана за да трансформира нерекомбинантен Р.chrysogenum щам. Възможно е с такива изпълнения да се постигне повишена експандаза и/или хидроксилаза активност, поради повишените количества експресиран ензимен протеин.

Вече беше отбелязано, в главата, описваща предишното състояние на техниката, че ензимът експандаза, получен от Streptomyces clavuligerus АТСС 27064 е напълно секвенциран, както и охарактерезиран чрез ендонуклеазно рестрикционно картиране. Обаче, това, което изглежда че е същият ензим, получен от S. clavuligerus NRRL 3585 е докладвано, че притежава различно молекулно тегло, но не бил секвенциран. И, както е описано в предишното състояние на техниката, по-горе, ензимът DAOCS/DACS от Cephalosporium acremonium АТСС 11550 е бил секвенциран [Samson et al., Bio/Technology (1987) 5:1207-1214 и ΕΡ-Α-0 281 391].

Тези експандаза-ензими, вече идентифицирани по-рано, са полезни в новия биометод от представеното изобретение. Други експандаза-ензими, все още не идентифицирани, произлезли от различни щамове на S. clavuligerus или C.acremonium или дори от микроорганизми от различни родове, могат също така покажат, че са подходящи за провеждане на новия биометод от представеното изобретение. Процедурите за идентифициране на такива нови щамове и родове полезни мокроорганизми и за изолиране на предполагаеми експандаза-ензими и установяване, че те са подходящи за приложение по метода от представеното изобретение са добре известни на специалистите в тази област. Скрийнигът на безклетъчните екстракти на новите кандидатщамове и родове полезни микроорганизми може да бъде извършен по

-26надежден и възпроизводим начин, чрез прибавяне на тези екстракти към адипоил-6-АРА субстрат в присъствието на известни DAOCS кофактори, които включват феро (Fe²+) йони, аскорбат, α-кетоглутарат и аденозинтрифосфат (АТР). Адипоил-6-АРА може да се получи в достатъчни количества чрез захранване с адипатна хранителна среда на трансформиран щам от Penicillium chrysogenum по начин, аналогичен на подробно описания малко подолу. Желаният ензим експандаза (или експандаза/хидроксилаза) е налице, ако се е образувала адипоил-7-ADCA и/или адипоил-7-ADAC, чието наличие се установява хроматографски.

Възможно е също така, като се използуват добреизвестните рекомбинантни техники, да се създадат ДНК-сонди, на базата на нуклеотидните последователности на гените на експандазата от S. clavuligerus и С. acremonium, например за скрийниг на ДНК съдържанията на кандидатмикроорганизма, който евентуално би могъл да продуцира експандаза, подходяща за използуване в метода на изобретението.

Възможни източници на ензимите експандаза, хидроксилаза и експанадаза/ хидроксилаза

Експандаза-ензимите, както вече беше отбелязано, са ензими, които катализират разширяването на пенамовите пръстенни структури (установени в пеницилиновия тип молекули), до цеф-3-ем пръстени (установени в цефалоспорините). Следователно, всеки организъм, продуциращ метаболити, съдържащи цефемов пръстен, е потенциален източник на експандазакодираща ДНК. По същия начин, всеки организъм, който продуцира цефалоспорини, съдържащи 3-хидроксиметилова група, е потенциален източник на хидроксилаза- (или експандаза/хидроксилаза)-кодираща ДНК. По-долу са дадени примери за такива микроорганизми, но този списък е само примерен и не трябва да се смята за изчерпателен:

-27ГЪБИЧКИ

Cephalosporium acremonium

Cephalosporium sp.

Emericellopsis

Paecilomyces

Scopulariopsis

Diheterospora

Spiroidium

Anoxiopsis

АКТИНОМИЦЕТИ

Streptomyces clavuligerus

S. lipmanii

S. wadayamensis

S. todorominensis

S. filipinensis cephamycini

S. heteromorphus

S. panayensis

S. griseus

S. cattleya

Nocardia lactamdurans

ДРУГИ БАКТЕРИИ

Flavobacterium sp.

Alcaligenes denitrificans

Mycoplana bullata

Providencia rettgeri

Lysobacter lactamgenus

Експандазите и хидроксилазите от организмите, изброени по-горе, са просто кандидати за по-нататъшни изследвания и може да се окаже, че не всяка от тях ще бъде подходяща за новия метод на представеното изобретение.

-28Изолиране на ДНК-фрагменти, кодиращи активността на експандазата

След като веднъж е открито наличието на желания ензим експандаза, по начина, описан по-горе, процедурите за изолиране на ДНК, кодираща активността на ензима експандаза, са също така добре известни на специалистите в тази област. Конструирани са ДНК-сонди, на базата на познати последователности и частични последователности на гените, кодиращи ензимите експандаза, които от своя страна ще хибридизират до желаната ензим-кодираща ДНК, за да бъде изолирана. Конструирането на такива сонди е на базата на познанията за последователността на аминокиселините и нуклеотидите, кодиращи ензима експандаза, както и на кодоновите префернции на отделния включен микроорганизъм. Подробно описание на типичните процедури от този тип, приложени към геномна ДНК на Streptomyces clavurigerus ATCC 27064 са описани по-долу.

Изолирането на ДНК кодираща активността на ензима експандаза се извършва като се използуват рестрикционни и лигиращи процедури, добре известни в технологията на рекомбинантната ДНК. Необходимо е да се притежава ендонуклеазна рестриктивна карта на генома на включения микроорганизъм, така че да могат да бъдат получени и изолирани правилни рестрикционни фрагменти. Рестрикционни карти за S. clavuligerus и С. acremonium са вече налице; така например, за първия са използувани рестрикционните ензими Bam HI и Sal I и електрофорезата дава желаните 1,8 до 2,2 кб (килобазови) фрагменти.

Източници на ензима ацетилтрансфераза и изолиране на ДНК фрагменти, кодиращи споменатата активност

Клонирането на гена на С. acremonium DAC ацетилтрансфераза може да се извърши по добре известни рекомбинантни техники, които са описано непосредствено по-долу.

С цел да се клонира гена ацетилтрансфераза, първо трябва да се създадат мутанти на С. acremonium с недостиг в способността да превръщат деацетилцефалоспорановата киселина (DAC) в цефалоспорин С. Такъв процес

-29се състои в подлагане на клетки от С. acremonium на действието на мутагени, каквито са N-нитрозогванидин, азотиста киселина или ултравиолетово облъчване, позволяващи събирането им върху подходяща хранителна среда и оценката им, например хроматографски или с биологични средства за натрупването на DAC.

След определянето на подходящ мутант, следващата стъпка в идентифицирането на гена, кодиращ ацетилтрансферазата, е изолирането на С. acremonuim-ДНК от щам, продуцент на цефалоспорин С. След разцепването, чрез рестрикционно ендонуклеазно смилане или с механично разкъсване на подходящо оразмерени фрагменти, тя се включва в плазмид или козмид, трансформационни вектори, съдържащи също така подходящ доминантен ген-маркер, като резистентен на хигромицин или флеомицин. Векторът трябва също така да съдържа ДНК-последователности, за да улесни последващото възстановяване на вмъкнатата ДНК, напр. ламбда cos места, които позволяват спасяване на клонираната ДНК чрез in vitro опаковане, последвано от инфектиране на Е. coli, което може да се извърши по добре разработените процедури.

Протопластите на щама-мутант на ацетилтрансфераза-минус, след това се трансформират като се използуват вектори, съдържащи случайни фрагменти от геномната ДНК и трансформанти, подбрани на базата на антибиотичнита резистентност. След това трансформантите могат да бъдат проверени за възстановяване на продукцията на цефалоспорин С, като това е индикация за успешното комплементиране с вектор-съдържащия ацетилтрансфераза ген. След това мутантите, които се очаква, че са приели клонирани копия от гена, могат да бъдат култивирани, тяхната ДНК се изолира и векторната ДНК да се събере по метода, описан по-горе. Потвърждение, че векторът наистина съдържа ацетилтрансфераза ген се получава чрез субклониране в Е. coli, като се използуват стандартните процедури и лесно достъпните вектори, последвано от ретрансформация на ацетилтрансферазаминус мутанта. След това гена може да се изолира, секвенцира и манипулира

-30както е описано в работните примери по-долу, като се използуват рутинните техники, известни на всеки работещ в областта на молекулярната генетика.

Следвайки алтернативни процедури, също така добре известни в науката Matsuda и сътр. изолираха и секвенцираха гена, кодиращ ацетилтрансферазната активност на С. acremonium, както и изведоха аминокиселинната последователност на самия ензим, което е описано в ЕР-АО 450 758. Тези алтернативни процедури се състоят в изолиране на ензима ацетилтрансфераза, секвенциране на аминокиселината от N-края и от тази информация е извадено заключение за нуклеотидната последователност, кодираща тази част на ензима. От тази информация, на свой ред са генерирани сонди, които хибридизират до пълната кодираща последователност, позволяваща изолирането й.

Трансформиране на щама PENICILLIUM CHRYSOGENUM

След като веднъж са получени фрагментите ДНК, кодиращи активностите на експандаза/хидроксилаза, експандаза и хидроксилаза и ацетилтрансфераза, те могат да бъдат вкарани (лигирани) в плазмид или друг експресионен вектор, заедно с ДНК фрагментите, включващи промотори, транслационни активиращи секвенции, резистентни маркери, регулиращи секвенции и всички други ДНК-секвенции, които позволяват или промотират трансформацията, управляват експресията на генните продукти и улесняват изолирането на трансформантите. Експресионните вектори, които са конструирани по този начин, след това се използуват за постигане на трансформиране на щама Penicillium chrysogenum и вътрешноклетъчна експресия на активността на ензимите експандаза/ хидроксилаза, експандаза и хидроксилаза и ацетилтрансфераза. Използуваните техники за постигане на трансформирането и експресията са добре известни и подробно описание на тези типични процедури е дадено по-нататък. Както беше вече дадено подробно по-горе, трансформираният щам Penicillium chrysogenum експресира вътрешноклетъчно активността на ензимите експандаза/

-31 хидроксилаза, експандаза и хидроксилаза и ацетилтрансфераза, които след това действуват in situ върху адипоил-6-АРА, за да разширят пръстена й до адипоил-7-ADCA, хидроксилират последната до адипоил-7-ADAC, която след това се ацетилира до адипоил-7-АСА.

Нови трансформанти

Специфичните трансформанти на Penicilliuim chrysogenum, ексепресиращи активностите, кодирани от гените експандаза/хидроксилаза и експандаза/хидроксилаза, които са предпочетените изпълнения на представеното изобретение, са нови по отношение на подобни конструкции, описани по-рано, като тези на Cantwell et al.(1990) Current genetics, 17, 213-221, ΕΡ-Α-0 281 391 и ЕР-А-0 437 378. Конструкцията на Cantwell притежава експандаза ген на Streptomyces clavuligerus, поставен под контрол на P.chrysogenum изопеницилин N синтетаза промотор и по този начин се различава от конструкциите на представеното изобретение в липсата на всякаква ДНК кодираща активностите на хидроксилаза или ацетилтрансфераза.

Ingolia и сътр. в ЕР-А-0 281 391 описват трансформационни вектори на Р. chrysogenum, които съдържат ДНК кодираща експандаза/хидроксилаза бифункционалния ензим на С. acremonium с експресия, управлявана от *** Penicillium IPNS промотор. В една от тези конструкции (pPS62), експандаза/ хидросилаза гена е свързан в посока на реплрикацията и е в рамката на хигромицин-фосфотрансфераза гена. Генният продукт, хигромицинфосфотрансфераза::експандаза/хидроксилаза свързан протеин, се различава от продукта на представеното изобретение - експандаза/ хидроксилаза ензим, в същност идентичен на продукта в С. acremonium. Друг вектор, описан в ЕР-А-0 281 391 е конструиран чрез екстензивни серии от молекулярни манипулации, включващи използуването на синтетични ДНК-линкери. Крайната конструкция (pPS61) използува 1,2 кб Ncol фрагмент на Penicillium IPNS промотора, за да експресира експандаза/хидроксилаза гена, както и Aspergillus nidulans ацетамидаза гена, като подбран маркер за трансформация на Penicillium.

-32Последователността на кодоните девет и десет в експандаза/хидроксилаза гена, кодиращи съответно аргинин и левцин, се променят от CGTCTC до CGCCTA, което не променя кодираната амнокиселинна последователност.

В конструкцията от представеното изобретение, 1,2 кб Ncol IPNS промоторния фрагмент е фузиран към експандаза/хидроксилаза гена без да променя природната експандаза/хидроксилаза генна последователност. IPNS промотора, използуван за конструкцията от представеното изобретение притежава две отделни четирибазови дупликации по отношение на естествения промотор, една на мястото Sall 760 базови двойки нагоре от ATG стартовия кодон, а другата на мястото Xbal, пет базови двойки нагоре от стартовия кодон и в 5' нетранслируемата лидерна последователност. Тези промени не оказват влияние върху високото ниво на експресия на експандаза/ хидроксилаза гена.

Друга разлика във векторите лежи в използуваните подбрани маркери. Конструкциите, описани в ЕР-А-0 281 391 използуват ацетамидаза и хигромицин като подбрани маркери. Това е в пълен контраст с експандаза/ хидроксилаза трансформационния вектор, използуван в представеното изобретение (pPEN/CEPH-1), който съдържа флеомицин (phleomycin) резистентен маркер. Щамът Penicillium chrysogenum трансформиран с вектора pPEN/CEPH-1 и способен да експресира експандаза/хидроксилаза активност, е идентифициран като РС200. Неговите таксономни характеристики включват продукцията на широко разпростаняващи се колонии, синьо-зелени до зелени на цвят, кадифено гладки с жълти капчици, жълто дифундиращи в агара, конидийни глави, разклонени, като всички части са гладки, конидиини, елиптични до сферични с дължина 3-4 мкм. Приемливи условия за култивиране на P.chrysogenum са използуването на твърда среда, включваща монохидратирана лактоза 1,5% (об.); екстракт от царевица 0,5% (об.); пептон, 0,5% (об.); NaCl, 0,4% (об.); MgSO₄.7H2O, 0,05% (об.); КН₂РО₄, 0,06% (об.); FeCl3.6H2O, 0,0005% (об.); CuSO₄.5H2O, 0,0002% (об.); агар, 3,0% (об.) в един литър дестилирана вода, рН 4,8. Току-що описаният щам Penicillium

-33chrysogenum и обозначен като РС200 е депозиран в American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, под номер на достъп ATCC 74186 (дата на депозиране: 23.09.1992.).

Вторият нов трансформант Penicillium chrysogenum от представеното изобретение, способен да продуцира адипоил-7-АСА, експресира двете активности експандаза/хидроксилаза и ацетилтрансфераза, поради това че е трансформиран с един вектор (pTS-8), включващ ДНК, кодираща и двата ензима. Този вектор, следователно, се различава от онези Penicilliumтрансформиращи вектори, споменати в ЕР-А-0 437 378, които включват ДНК кодираща или само ацетилтрасферазата на С. acremonium или във връзка с ДНК последователността, кодираща мутантен експандаза/хидроксилаза полипептид. В конструкцията pTS-8 експресията на гените експандаза/ хидроксилаза и ацетилтрансфераза се управляват поотделно от отделни копия на P.chrysogenum IPNS промотор; трето копие на IPNS промотора се използува, за да управлява транскрипцията на флеомицин резистентния ген, използуван като селективен маркер.

В алтернативно изпълнение на представеното изобретение, гените на експандаза/хидроксилаза и на ацетилтрансфераза могат да бъдат включени в отделни вектори и въведени в щама-гостоприемник Penicillium последователно. Редът, по който ДНК-фрагментите кодиращи активностите на ензимите експандаза/хидроксилаза и ацетилтрансфераза, са въведени в щама Penicillium е от значение само от практична гледна точка. Препоръчително е трансформирането на Penicillium-a с експандаза/хидроксилаза гена (гените) да предхожда въвеждането на ацетилтрансфераза гена, тъй като това е порядъка, по който ензимите действуват in vivo. Следователно, експресията на експандаза/хидроксилаза гена може да следи чрез проверка за продуциране на адипоил-7-ADAC. Тъй като адипоил-7-ADAC е субстратът за ензима ацетилтрансфераза, експресията на последоващо въведения ацетилтрансфераза-кодиращ ген се индицира от получаването на адипоил-7-АСА. Като се използува подходящ in vitro анализ за ацетилтрансфераза, е възможно

-34да се трансформира Penicillium първо с ацетилтрансфераза, да се потвърди експресията с in vitro анализ и след това да се премине към въвеждането на експандаза/хидроксилаза гена. Следователно, този път ще бъде подходящо изпълнение на метода от представеното изобретение за получаване на 7-АСА.

Обаче, при предпочетеното изпълнение на изобретението и трите ензимни активности се въвеждат едновроменно, чрез конструкцията на единичен плазмиден вектор, включващ ДНК кодираща експандаза/ хидроксилаза и ацетилтрансфераза активностите на С. acremonium. Щамът на Penicillium chrysogenum, трансформиран с такъв единичен плазмиден вектор, векторът pTS-8 и способен да експресира експандаза/хидроксилаза и ацетилтрансфераза активност, е идентифициран като РС300. Неговите таксономии характеристики са същите, както на описания по-горе РС200. Приемливите условия за култивирането на РС300 са същите, както тези за описания вече РС200. Щамът Penicillium chrysogenum, обозначен като РС300 е депозиран в АТСС под номер АТСС 74187 (дата на депозиране: 23.09.1992 г.).

Специфичният Penicillium chrysogenum, трансформиран с вектора pPenFTSO, експресиращ активността на S. clavuligerus експандаза гена, който е предпочетено изпълнение на представеното изобретение е нов по отношение на такива конструкции, описани по-рано, като например тази на Cantwell et al. (1990) Current Genetics, 17,213-221. И в двете конструкции е използувана in vitro мутагенеза, за да се свърже промотора с експандаза гена. В конструкцията на Cantwell манипулирането въвежда Nde I място при ATG на експандаза гена, който е свързан към Xba I място на 3' края на IPNS промотора с Xbal/Ndel линкер. В конструкцията от представеното изобретение е създадено Ncol място при ATG на експандаза гена и лигирано към Ncoi мястото на 3' края на IPNS линкера. Това създава следните последователности около промотор-ген преходите в тези конструкции:

Xbal Ncol

IPNS промотор 5' TCTAGACACCATGG 3' идент. поел. No.1

Strep експандаза 5' GTGAGAGTTGATGGAC 3' идент. поел. No.2

-35Cantwell 5' TCTAGACACTATGGAC 3' идент. поел. No.3

Изобретението 5' TCTAGACACCATGGAC 3' идент. поел. No.4

Конструкцията на Cantwell заменя С е Т, докато в конструкцията на изобретението С се запазва; по такъв начин последователността на IPNS промотора непосредствено съседна на ATG стартовия кодон съвпада точно с тази, която е установено в природния IPNS ген. Възможно е промотора, описан в предишното състояние на техниката, въпреки това че се различава само с една единствена нуклеотидна база, да може да доведе до по-ниска транслационна ефективност и оттук - до по-ниска степен на експресия на експандаза гена.

Други разлики са в областите на промотора или гена, включен в конструкциите. Конструкцията на Cantwell съдържа 5' Bam HI до Xbal 3' област от IPNS промотора, докато вектора на представеното изобретение съдържа 5' Neo I до Neo I 3' област от промотора. [Dietz et al. (1990), J. Biol.Chem., 265, 16358-16365]. В резултат на това се получават около 250 базови двойки допълнително в 5' края на IPNS промотора в конструкцията на Cantwell. Обаче, тази област е в отворената рамка на четене на ACV синтетаза гена нагоре от IPNS гена.

Конструкцията на Cantwell съдържа също така Streptomyces ген от ATG до Bam HI мястото 3' на гена, докато векторът от представеното изобретение съдържа ATG до Sal I място 3' на гена [Kovacevic et al. (1989), J. Bacteriol., 171, 754-760]. Това резултира в приблизително 1 000 основни двойки допълнително 3* края секвенцията в конструкцията на Cantwell. Конструкцията на представеното изобретение съдържа горната част на експандаза гена до Ват HI място 5' на ATG; обаче, е отделена от четящата рамка на експандаза гена от IPNS промотора.

Друга разлика между конструкцията pPenFTSO на представеното изобретение в сравнение с тази, описана по-рано, се отнася до селективният

-36използуван маркер. Използуването на Penicillium IPNS промотор:флеомицин ген фузията в конструкцията на представеното изобретениеима се стреми да подбере за интегриране на повторяеми копия или интегриране на локуса, което позволява висока степен на експресия и по този начин - потенциално повисок процент трансформанти, които експресират експандаза гена на високо ниво.

Отцепване на адипоиловата странична верига

Последният етап в новия биопроцес от представеното изобретение е отцепването на адипоиловата странична верига от адипоил-7-ADAC или адипоил-7-АСА, което изисква обработка на продуктите от предшествуващите етапи с ензима адипоиламидаза. Както вече беше отбелязано по-горе, едно от значителните постижения на представеното изобретение е способността му всички етапи, водещи до образуването на адипоил-7-ADAC и на адипоил-7-АСА да се провеждат в една и съща ферментационна културална среда. Това постижение осигурява изключително висока ефективност, поради това, че не се налага изолирането и частичното пречистване на междинните продукти в различните етапи от процеса. В този последен етап, обаче, системата на ензима адипоиламидаза не се намира в разтвора, т.е. не е генерирана in situ в първоначалната ферментационна среда, както от естествена, така и от рекомбинантна експресия на гените на Р. chrysogenum.

Ако новият биопроцес на представеното изобретение се провеждаше в отделни етапи, тогава щеше да бъде необходимо да се изолира и пречисти частично продукта от първия етап, а предварителните процедури за извършване на това са описани вече по-горе.

Въпреки това, процесът от изобртението може да се проведе по всеки метод, който осигурява ефективно осъществяване на контакт на адипоиламидазата с адипоил-7-ADAC или адипоил-7-АСА, така че да може да протече ензимно превръщане на тези съединения в 7-ADAC или 7-АСА. Това е дефиницията на терминът контакт в най-общия му смисъл. Възможно е като хранителна среда да се използува безклетъчна среда от суров адипоил-7-37ADAC или адипоил-7-АСА и този среда да се обработи в отделен етап с разтвор на адипоиламидаза. Това решение притежава някои добри страни, тъй като не изисква основно пречистване на изходните реагенти. Разбира се, възможни са модификации. Например, реагентите могат да бъдат пречистени до известна желана степен, преди да бъдат смесени. Също така, би било възможно процесът да се проведе непрекъснато, а не поотделно. Контактът между реагентите може да се осъществи по различни начини, като се запазват предимствата на технологията на метода. Така например, може да се използува имобилизиран ензим, например под формата на колона, съдържаща адипилацилаза, като адипоил-7-ADAC или адипоил-7-АСА се прекарват през колоната. Обездвиженият ензим може също така да се прибави под формата на суспензия към разтвор на адипоил-7-ADAC или адипоил-7-АСА. Тези системи на обездвижен ензим предлагат предимството на лесно възстановяване на ензима и многократното му използуване. Друг пример за технология е свързан с мембранни реактори. Препоръчителният метод на осъществяване на контакт между реагентите е метода на колона с обездвижен ензим.

Адипоиламидаза ензими, полезни в етапа отцепване

Съществуват голям брой ензими, с позната специфичност спрямо адипоиловите странични вериги. Резултатите, получени с търговски достъпната адипоиламидаза от фирмата RAEV Corp, са описани подробно в примерите, дадени по-долу. В литературата са докладвани седем други ензима, които отстраняват адипоиловите странични вериги от цефалоспоринов тип молекули. Шест от тези седем ензима са от видовете Pseudomonas, а седмият е от вида Bacillus. Съществуват известни прилики между някои от ензимите Pseudomonas, но всички седем се различават в известна степен по отношение физичните и биологоични свойства. Някои от характеристиките им са дадени по-долу:

ЕНЗИМ (Щамове Pseudomonas и Bacillus)	АИТ. ИЗТОЧНИК- 38 -	ПРИБЛ. МОЛ. ТЕГЛО
Р. SY-77-1	Shibuya et al.	Привидно същото както
(Toyo Jozo)	(1981)	GK16 по-долу
Р. GK16	Matsuda, Komatsu	16000
(Asahi)	(1985)	54 000
Р. SE 83 (ацил)	Matsuda et al.	38200
(Asahi)	(1987)	19900
Р. SE 83 (ацил I)	Matsuda et al.	25400
(Asahi)	(1987)	58 200
Р. diminuta N176	Aramori, et al.	58 000
(Fujisawa)	(1991a)*	26 000
Р. diminuta V 22	Aramori, et al.	?
(Fujisawa)	(1991a)*	?
Bacillus latero-	Aramori, et al.	70 000
sporus J1 (Fuji)	(1991b)**	(мономерен)
Pseudomonas sp.		16 000
(RAEV Corp.)		54 000

* Aramori et al., J. Ferment. Bioeng. (1991) 72: 232 - 243.

** Aramori et al., J. Bacteriol. (1991) 173:7848 - 7855.

Всички горепосочени адипоиламидаза ензими са полезни за новия биопроцес от представеното изобретение. Други адипоиламидази, от полза в метода на представеното изобретение могат да бъдат лесно открити, чрез тестване на кандидат-ензимите спрямо адипоил-7-ADAC и адипоил-7-АСА, действителните субстрати, върху които той трябва да действува. Един положителен резултат дава надежден и възпроизводим метод за определяне, че кандидат-ензима е наистина полезен за метода от представеното изобретение. Субстратът може да се получи при взаимодействието на адипинов анхидрид с 7-АСА, като се използува модификация на процедурата, докладвана от Szewczuk and Wellman-Bednawska - Clin. Chim. Acta (1978) 84,1926. Възможно е също така да се пригоди и метода, описан в Agric. Biol. Chem. (1981), 45(7), 1561-1567, който се отнася до получаването на глутарил-7-АСА.

-39Адипиновият анхидрид може да се получи и съгласно метода на Albertson & Lundmark, описан в J. Macromol. Sci. Chem. (1990) А(27), 397-412. 7-АСА може да се получи от няколко търговски източника, включително и от фирмата Sigma Chemical Co.

Ако е желателно да се проведе груб скрийнинг на кандидат- ензимите, като се използува бърз колориметричен метод, адипоил-7-АСА субстрата може да се замени с колориметричен субстрат, като например адипоил-РАВА (пара-аминобензоена киселина) или адипоил-pNA (пара-нитроанилин). Като такъв метод може да бъде адаптиран описания за гама-глутамил РАВА от Szewczuk et al., Clinica Chimica Acta, 84 (1978) 19-26. Отцепването на страничната верига дава видове, генериращи цветове, чието присъствие и концентрация се измерват лесно колориметрично. За по-подробна информация, отнасяща се до тези и други подходящи колориметрични методи, вижте Marelli, L.P. (1968) J. Pharm. Sci. 57:2172-2173; Szasz, G. (1969) Clin. Chem. 15:124-136; Szewczuk, A. et al. (1980) Anal. Biohem. 103:166-169; Reyes, F. et al. (1989) J. Pharma. Pharmacol. 41:136-137.

Направено е сравнение на N-края на аминокиселинната последователност на ензима от фирма RAEV с големи субединици на acyll и GK16 ензимите, дадени в таблицата по-горе. Резултатите от сравнението са дадени по-долу (скобите показват не завършена оценка):

RAEV - идентиф. послед. No. 5:

(S) N (S) (G) A V А Р G КТ А N G N A L (L) LQ N (Р)

GK16 - идентиф. послед. No. 6 SNSWAVAPGKTANGNALLLQNP acyll - идентиф. послед. No. 7 SNNWAVAPGRTATGRPILAGDP

От показаните последователности е ясно, че всичките тези три пептида са сродни. Обаче, протеин, притежаващ последователност на N-края, подобна на посочените по-горе, няма да притежава задължително адипоиламидазна активност, какъвто е слачаят с пеницилин G-ацилаза, получена от щам на

-40Arthrobacter. От друга страна, съществуват адипоиламидази, полезни за метода от представеното изобретение, които не показват забележима хомология с цитираната по-горе последователност на N-края. Например, ацилазата acyl на Asahi и В. laterosporus JI на Fujisawa, дадени в таблицата погоре, които са показали, че притежават известна адипоил-7-АСА ацилазна активност, не споделят нито една от хомоложните последователности с другите ензими, цитирани по-горе. Следователно, обсега на действие на представеното изобретение по отношение на адипоиламидазите, полезни в последния етап на новия биопроцес, се определя от това, дали даден кандидат-ензим е способен да отцепи адипоиловата странична верига от адипоил-7-АСА или не, нещо, което може да се определи бързо и лесно, както е описано с подробности по-горе.

ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Следват подробни описания на някои предпочетени изпълнения на изобретението, но те са само илюстративни и в никакъв случай не ограничават представеното изобретение.

ПРИМЕР 1

Условия за култивиране на Penicillium chrysogenum

Щамовете Penicillium chrysogenum, използувани при тези процедури се поддържат върху плаки съдържащи среда, съставена от монохидрат лактоза, 1,5% (об.); царевичен екстракт, 0,5% (об.); пептон, 0,5% (об.); NaCI, 0,4% (об.); MgSO4.7H2O, 0,05% (об.); КН₂РО₄, 0,06% (об.); FeCl3.6H2O, 0,0005% (об.); CUSO4.5H20,0,0002% (об.); агар, 3,0% (об.) в един литър дестилирана вода, pH 4,8. След 12 дни при температура 25°С и 65% относителна влажност отделните колонии бяха отстранени и прибавени в 2 мл стеризирана вода в епруветки с винтови запушалки, съдържащи стъклени перли. След мацерация на културалния растеж със завихряне, суспензията се използува за инокулация на оризови колби. Оризовите колби съдържат 25 г в 250 мл колба хидролизиран ориз Uncle Ben's, с естествена дължина на зърната, промит с три до четири обема дестилирана вода в продължение на 7 минути, разбъркван всеки 30

-41 секунди и след това отцеден, докато задържаната вода в ориза остане около 25%. След 12 дни при 25°С и 64% относителна влажност, спорите се отмиват от ориза с 50 мл стерилна вода. Споровата суспензия се използува за заразяване на течните културални среди и за лиофилизат, който се съхранява при 4°С. Спорите се прибавят към равен обем 5% обезмаслено мляко и се лиофилизират в стерилни ампули.

Използува се двуетапна ферментация на щама в разклащащи се колби за получаване на пеницилини или мицели, като източник на РНК или ДНК. Етапа на засяване се започва с прибавянето на 1.10® спори към 50 мл/500 млови колби със среда, съставена от глюкоза, 3,0% (об.); фармасреда, 1,0% (об.); царевичен екстракт, 3,0% (об.); амониев сулфат, 0,2% (об.); СаСОз, 0,5% (об.); безводен монокалиев фосфат, 0,05% (об.); лактоза, 1,0% (об.); първична суха мая, 1,0% (об.); в един литър дестилирана вода. Инкубирането се извършва при 25°С и 65% относителна влажност върху въртяща се клатачна машина с амплитуда 70 мм при 220 об/мин. След 48 часа инкубиране етапът на продуциране се инициализира чрез прехвърляне на 2 мл от вегетативната зародишна среда в 35 мл/500 мл колба със среда със следния състав: КН2РО4, 0,05% (об.); K2SO4, 0,5% (об.); (NN4)2604, 1,0% (об.); лактоза, 12,0% (об.); фармасреда, 2,75% (об.); СаСОз, (преципитат), 1,0% (об.); течна фракция от свинска мас, 1,0% (об.) в един литър дестилирана вода с pH 6,6. След автоклавирането, но преди инокулацията, се прибавя стерилен 25% натриев адипат (pH 6,6), за да се получи крайна концентрация на натриевия адипат 2,5%. Инкубирането, последващо инокулацията се продължава при същите условия, както и стадия на посяване в продължение на 5 до 7 дни.

Когато са необходими мицели за генериране на протопласти за трансформиране или като източник на ДНК, щамът се култивира в 50 мл/250 мл колба от пълна среда (СМ), съставена от: 50 мл от 20 X соли на Clutterbuck (120 г Na2NO3,10,4 г KCI, 10,4 г MgSO4.7H2O, 30,4 г КН2РО4), 2,0 мл следи на елементи Vogel, 0,03 М лимонена киселина, 0,2М ΖηβΟφ, 25mM Fe(NH4)2(SO4)2’6H20,10 тМ СивОд, ЗтМ МпвОд, 8 тМ борна киселина, 2 тМ

-42Na2MoO4-2H2O, 5 г триптон, 5 г дрождев екстракт, 10 г глюкоза в 1 д дестилирана вода. Инкубира се при 25°С върху въртяща се клатачна машина при 220 об/мин.

ПРИМЕР 2

Условия за култивиране на Cephalosporium acremonium

Щамовете от C.acremonium се поддържат върху полегат агар, съдържащ пълна среда, съставена от захароза, 20 г; агар, 20 г; пептон, 4 г; дрождев екстракт, 4 г; ΝβΝΟθ, 3 г; КН2РО4, 0,5 г; К2НРО4, 0,5 г; KCI, 0,5 г; MgSO4.7H2O, 0,5 г; FeSO4.7H2O, 0,01 г; в 1 литър дестилирана вода, рН 6,6. След 10 дни растеж при 28°С и 66% относителна влжност, към плаките се прибавя 6 мл стерилизирана вода и израстналата култура се изстъргва от повърхността на агара. Получената суспензия се прехвърля в стерилна епруветка с пълнеж от стъклени перли и винтова запушалка. След мацерация на културата чрез завихряне в продължение на няколкоминути, 3,5 мл от получената суспензия се използува за инокулиране на течните култури. Тази суспензия се използува също така и за получаване на лиофилизати от културите за съхранение при 4°С. Суспензията от мацерирана култура се центрофугира, утайката се ресуспендира в 5% обезмаслено мляко и аликвотите се лиофилизират в стерилни ампули.

Използува се двуетапен процес на ферментация на щамовете в колби от клатачна машина за продуцирането на цефалоспорини или за получаването на мицел като източник на ДНК и РНК. Етапът на закваска се инициализира с прибавянето на инокулат в 250 мл колби,всяка съдържаща 15 мл хранителна среда със следния състав: глюкоза, 5г; захароза, 40 г; царевично нишесте, 30 г; цвеклова меласа, 50 г; соево брашно, 65 г; CaSO4.2H2O, 15,8 г; амониев ацетат, 8 г; СаСОз (преципитат), 5 г; (NH4)2SO4, 7,5 г; MgSO4.7H2O, 3,5 г; КН2РО4,1 г; соево масло, 0,15 мл за колба, в 1 литър дестилирана вода при рН 6,2. Инкубирането се изъвршва при 25°С и 65% относителна влажност върху въртяща се клатачна машина с 70 мм амплитуда по диаметъра и скорост 220 об/мин. След инкубиране в продължение на 96 часа, продукционният етап се

-43инициализира с прехвърляне на 2 мл от вегетативната зародишна среда в 250 мл колба, съдържаща 15 мл свежа хранителна среда, описана по-горе. Инкубирането продължава допълнителни 96 часа при същите условия.

Когато е необходим мицел като източник на ДНК за трансформиране, щамовете се култивират в 100 мл/500 мл колби със среда със следния състав: глицерол, 20 г; пептон, 4 г; дрожден екстракт, 4 г; КН2РО4,0,5 г; К2НРО4, 0,5 г; KCI, 0,5 г; MgSO4.7H20,1 г; ΝβΝΟβ, 3 г; FeSO4.7H2O, 0,01 г в 1 л дестилирана вода. Инкубирането е при 30°С върху въртяща се клатачна машина при 200 об/мин.

ПРИМЕР 3

Изолиране на геномна ДНК и пълна РНК от Penicillium и Cephalosporium

Вегетативна мицелна среда от 48 часова култура, получена, както е описано по-горе, се събира чрез филтруване през сиренарско плътно, замразява се в течен азот и се лиофилизира една нощ. Изсушения мицел се стрива в хаван с пясък и се ресуспендира в 25 мл 100 mM LiCI, 50 mM EDTA, 10 mM Tris pH 8,0, 4% SDS. След нагряване на суспензията до 50-55°С в 60°С водна баня, сместа се екстрахира първо с 1М Tris (pH 8) наситен фенол, последвано от Tris-наситен фенол :хлороформ (1:1 об.) и накрая с хлороформ. РНК се утаява от водната фаза чрез прибавянето на равен обем студен 6М LiCI и след това сместа се оставя при -20°С в продължение на два до три часа. След центрофугиране при 12 000 g в продължение на 20 мин при 4°С, супернатанта се прави 66% (об.) етанол и се охлажда до -20°С в продължение на 15 минути, за да се утаи ДНК. След центрофугирането, както е описано погоре, ДНК-утайката се промива с 70% етанол, суши се и се ресуспендира в ТЕ-буфер (10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1 mM EDTA). Концентрацията на ДНК се оценява чрез сравняване с известни ДН К-стандарти при багрене с етидиум бромид в агарозна гелна елекрофореза.

За екстракция на РНК, културите от Penicillium chrysogenum и Cephalosporium acremonium, както описаните по-горе в Пример 1 и 2, се култивират в продължение на 96 часа в 35 мл ферментационна среда

-44(условията на ферментация са описани по-горе), при 25°С върху въртяща се клатачна машина при 220 об/мин. Мицелите се събират чрез филтруване през филтърна хартия Whatman No.1 под вакуум и се промиват с около 50 мл вода. Непосредствено след филтруването мицелите се изстъргват от филтъра, ресуспендират се в 5 мл спирачен буфер (50 mM Tris-HCI pH 7,4,150 тМ NaCI, 5 тМ EDTA pH 8,0, 5% SDS), замразяват се в течен азот и се лиофилизират. След лиофилизиране в продължение на една нощ, се прибавят 5 мл вода, съдържаща 0,1% DEPC и 5 мл 1М Tris (pH 8) наситен фенол:хлороформ:изоамил алкохол (50:50:1) и сместа се оставя при 37°С в продължение на 20 минути с разклащане. Сместа се центрофугира при 12 000 g в продължение на 10 мин при 4°С и водният слой се отстранява и реекстрахира първоначално с 1М Tris (pH 8) наситен фенол:хлороформ:изоамил алкохол (50:50:1) след това с 1М Tris (pH 8) наситен фенол и накрая с хлороформ. Крайният воден слой се смесва с равен обем 6М LiCI и разтворът се оставя при -20°С за минимум 4 часа. Тоталната РНК се утаява при 12 000 g в продължение на 20 мин при 4°С, утайката се разтваря в 0,3 мл ТЕ-буфер плюс 0,03 мл ЗМ натриев ацетат и се прибавят 2,5 обема етанол, за да се утаи отново РНК. Крайните гранули се разтварят в 0,1 мл ТЕ-буфер и концентрацията на РНК се определя спектрофотометрично, като се използува поглъщане при 260 нм.

ПРИМЕР 4

КОНСТРУКЦИЯ НА ГЕННАТА БИБЛИОТЕКА НА CEPHALOSPORIUM ACREMONIUM И ИЗОЛИРАНЕ НА С. ACREMONIUM ЕКСПАНДАЗА/ ХИДРОКСИЛАЗА И АЦЕТИЛТРАНСфЕРАЗА ГЕНИТЕ

Изолиране на С. acremonium експандаза/хидроксилаза гена

Геномната ДНК на С. acremonium се разгражда частично с SauSAI, за да се постигне средна големина на фрагментите от 10 до 20 кб и този диапазон от размери се обогатява чрез центрофугиране на разтвора върху 5 до 20% NaCI плътност на градиента. Така фракционираната ДНК се използува, за да се създаде геномна ДНК библиотека на С. acremonium през лигиране в Bam HI-45мястото на λ 2001 вектор, опаковайки във фага ДНК-частиците с използуването на Gigapak (Stratagene) и заразяване на Е. coli. Получените плакети се трансферират в нитроцелулоза и се извършва скрининг чрез хибридизация до олигонуклеотидна сонда, комплементарна на 3' края на публикуваната последователност на експандаза/хидроксилаза гена (Samson et al. 1987). Края на сондата е маркиран с [τ-32ρ]ΑΤΡ, с използуването на Т4 полинуклеотид киназа. Положителните клонове се изолират, картират за места на рестрикционна ендонуклеаза и ориентацията на гена се установява чрез Саудърн блот хибридизация на горния олигонуклеотид и на друг с последователност, комплементарна на 5' края на гена.

Изолиране на С. acremonium ацетилтрансфераза гена

Въпреки че това не е процедурата, използувана за изолиране на ацетилтрансфераза гена за следващите векторни конструкции, описани подолу в Примери 11 и 12, следващата процедура може да бъде използувана от всеки специалист, като използува информация от наличната в момента публикувана последователност на ДНК. От създадената геномна библиотека на С. acremonium, както е описано по-горе, се подбира клон, който кодира гена на ацетилтрансферазата на базата на хибридизация със синтетични олигонуклеотидни сонди, комплементарни на последователността на ацетилтрансферазата, както е описано от Matsuda et al. (1992) Biochem. Biophys. Res. Commun. 182:995-1001.

ПРИМЕР 5

Условия за култивиране на Streptomyoes clavuligerus

Щамът Streptomyces clavuligerus, използуван при тези процедури е АТСС 27064. Щамът се поддържа върху плаки, състоящи се от: дрожден екстракт, 4 г; малцов екстракт, 10 г; глюкоза, 4 г; агар, 20 г в един литър дестилирана вода, pH 7,2. След 5 дни растеж при 30°С, към плаките се прибавят 2 мл стерилна вода и културалната среда се изстъргва от повърхността на агара. Плучената суспенсия се прехвърля в стерилна епруветка със стъклени перли и винтова запушалка. След хомогенизиране на

-46културалната среда чрез въртене, суспензията се използува за инокулиране на течни култури. Суспензията се използува също така за перманентно съхраняване на култура при -70°С, чрез пибавяне на глицерол до 15% краен обем.

Когато мицелът е необходимо за получаване на протопласти за трансформиране или за източник на ДНК, щамовете се култивират в 200 мл/1 л колба със среда YEME, съставена от: дрожден екстрат, 3 г; пептон, 5 г; малцов екстракт, 3 г; глюкоза, 10 г; захароза, 340 г; MgCl2-6H2O, 1,02 г; глицин, 5 г; агар, 18 г; в един литър дестилирана вода. Инкубирането е при 28°С върху въртяща се клатачна машина при 220 об/мин.

ПРИМЕР 6

Изолиране на геномна ДНК от STREPTOMYCES

Вегетативна бактериална култура от 48 часова култура, приготвена по описания по-горе метод се събира при центрофугиране при 22 100 g в продължение на 10 минути. Клетките се ресуспендират в 10 мл ТЕ-буфер и се прибавят 10 мг лизозим, след което сместа се инкубира при 30°С в продължение на 15 минути. Прибавя се 1 мл 20% SDS, последвано непосредствено от 10 мл ТЕ (рН 8) наситен фенол и 1,5 мл 5М NaCI и сместа се инвертира бавно в продължение на 20 минути, фазите се разделят при 12 000 g в продължение на 10 мин, след което водният слой се отстранява и прехвърля в свежа епруветка. Внимателно се прибавят два обема изопропанол и утаената ДНК се навива и разтваря отново в минимален обем ТЕ-буфер. Прибавя се RNAseA до получаване на крайна концентрация 20 мкг/мл и разтворът се инкубира при 50°С в продължение на 1 час. След това се прибавя Протеаза К до достигане на крайна концентрация 100 мкг/мл, заедно с 100 mM NaCI и 0,4% SDS и сместа се инкубира при 37°С в продължение на 1 час. Разтворът се екстрахира отново с равен обем ТЕ (рН 8) наситен фенол, последвано от ново екстрахирано с хлороформ. След прибавянето на изопропанол, ДНК от

-47крайната екстракция се навива и концентрацията се определя спектрофотометрично, като се използува абсорбционно отчитане при 260 нм.

ПРИМЕР 7

КОНСТРУИРАНЕ НА ГЕННА БИБЛИОТЕКА И ИЗОЛИРАНЕ НА ДНКФРАГМЕНТИ, СЪДЪРЖАЩИ STREPTOMYCES CLAVULIGERUS ЕКСПАНДАЗА И ХИДРОКСИЛАЗА ГЕНИ

Изолиране на S. clavuligerus експандаза гена

Геномна ДНК, получена от Streptomyces clavuligerus по описания погоре начин се смила с рестрикционни ензими Bam HI и Sal I. Така обработената ДНК се подлага на електрофореза върху 0,8% агароза гел и се елюират фрагменти с размер 1,8 до 2,2 кб и се лигират към pUC18 ДНК, която е била ензимно смляна преди това с Bam HI и Sal I. Използуват се разреждания на лигационната смес за трансформиране на компетентните JM109 клетки, като се използува електропорация (Gene Pulser, Bio-Rad, Richmond, СА). Приготвянето на компетентните клетки и условията на електропорация са съгласно препоръките на производителя. Трансформационната смес се нанася върху LB плаки, съдържащи 100 мкг/мл ампицилин и 75 мкл 2% X-Gal. След инкубиране в продължение на една нощ при 37°С, рекомбинатните колонии се идентифицират по безцветния им вид, дължащ се на инактивирането на активността на плазмидния ген за векторна бетагалактозидазагенна. Безцветните колонии се прехвърлят върху свежи LB плаки, съдържащи 100 мкг/мл ампицилин. След култивиране в продължение на една нощ при 37°С, колониите се прехврлят върху нитроцелулоза и хибридизират със сонда, получена от полимеразна верижна реакция с съответствуващите на публикуваната за Streptomyces clavuligerus експандазагенна последователност от базите 52-918 [Kovacevic et al. (1989) J. Bacteriol. 171: 754-760; Ingolia et al. U.S.Pat. 5,070,020]. Маркирането на продуктите от верижната реакция на полимеразата се извършва с реакция със случайно удължаванена праймера с (32р) dCTP и комплект за олигомаркиране, съгласно инструкциите на производителя (Oligolabelling Kit; Pharmacia,

-48Piscataway, New Jersey). Хибридизиращата реакция се провежда в присъствието на 10θ СРМ радиомаркирана проба, 30% формамид 5Х SSC (0,15М натриев хлорид, 0,015 М натриев цитрат, pH 7), 0,1% SDS, 5Х Денхард (5 г фикол, 5 г поливинилпиролидон и 5 г BSA за 500 мл от 50 х материал) и 100 мкг/мл ДНК от телешки тимус при 37°С в продължение на една нощ. Няколко трансформанти хибридизират силно към сондата. Потвърдено е, че една колония съдържа вектор, носещ експандаза ген, чрез рестрикционен ензимен анализ и този плазмид е обозначен pFTSO-1.

Изолиране на S. clavuligerus хидроксилаза ген

Геномната ДНК от S. clavuligerus се смила частично с Bam HI и лигира в ламбда Dash II вектор от фирмата Stratagene. Получената геномна библиотека се скринира чрез хибридизация до 30 базов олигонуклеотид, притежаващ идентична последователност с първите 30 бази на публикуваната последователност на хидроксилаза гена (Kovacevic & Miller, 1991, J. Bact. 173: 398). Саудърн хибридизация със смляна с Bam HI ДНК от два позитивни фагови клона показва очаквания 6 кб фрагмент, който е субклониран. Този субклон дава набор от фрагменти, след смилане с Kpnl в съгласие с публикуваната рестрикционна карта за областта около хидроксилаза гена (Kovacevic & Miller, 1991).

ПРИМЕР 8

Изолиране на плазмид-ДНК

Култури от Е. coli, съдържащи интересуващият ни плазмид, са култивирани в 500 мл хранителна среда (20 г/л LB основа от фирмата Gibco, Paisley, Scotland) и 15 мкг/мл тетрациклин върху въртяща се клатачна машина при 220 об/мин, в продължение на 12 - 16 часа при 37°С. Клетките се утаяват чрез центрофугиране при 4 000 g за 10 минути при 4°С. Утаените клетки се ресуспендират в 18 мл глюкозен буфер (50 тМ глюкоза, 25 тМ Tris pH 8,0; ЮтМ EDTA) и 2 мл от 40 мг/мл лизозим (Sigma, StLouis, МО), смесват се и сместа се инкубира при стайна температура в продължение на 15 минути. Прибавят се 40 мл свежо приготвен разтвор на 0,2N NaOH, 1% SDS и сместа се

-49завихря внимателно и се поставя върху лед за 10 минути. След това се прибавят 30 мл 5М калиев ацетат pH 4,8, смесват се добре и получената смес се поставя върху лед за нови 10 минути. Клетъчните остатъци се утаяват чрез центрофугиране при 4 000 g за 10 минути при 4°С и полученият супернатантен разтвор се филтрува през сиренарско платно. Прибавя се изопропанол (0,6 обема) към избистрения супернатант, за да се утаи плазмид-ДНК и утайката се образува по време на инкубирането при стайна температура в продължение на 20 минути. Плазмид-ДНК се утаява при 4 000 g в продължение на 20 мин при 4°С и след това се промива с 70% етанол и се суши за кратко време. Утайката се ресуспендира в 9 мл ТЕ-буфер, след което се прибавят 10 г CsCI и 0,387 мл от 10 мг/мл разтвор на етидиум бромид. Този разтвор се центрофугира при 313,100 g в продължение на 24 часа. Получената плазмидна област в градиента от цезиев хлорид се визуализира с ултравиолетова светлина, изолира се, етидиум бромида се отстранява като се използува наситен с вода бутанол за екстракция. CsCI в плазмидния препарат се отстранява чрез диализа спрямо ТЕ-буфер и накрая ДНК се концентрира, като се използува PEG (MW 8000). ДНК-концентрацията се измерва спектрофотометрично с отчитане на абсорбцията при 260 нм.

ПРИМЕР 9

КОНСТРУКЦИЯ НА PENICILLIUM ТРАНСФОРМИРАЩИЯ ВЕКТОР pPenFTSO

Включване на флеомицин резистентен ген

Penicillium трансформиращият вектор се конструира с флеомицин резистентен ген, като доминиращ избираем маркер. Това се извършва първо чрез изолиране на фрагмент от 600 базови двойки, съдържащ флеомицин резистентен ген (флеомицин свързващ протеинов ген от Streptoalloteichus hindustanus) и се свързва също така към дрожден цитохром С1 терминатор от Bam Hl/Bgl II смилането на плазмид pUT713 (CAYLA, Toulouse Cedex, France),

-50чрез електрофореза върху и елюиране от агароза гелове. Изолираният фрагмент се лигира в Bam HI мястото на вектора pSELECT R 1 (Promega Corporation) и ориентацията на гена се определя чрез рестрикционно ензимен анализ. Уникалното място Hind III в получения плазмид се отстранява чрез рестриктиране с Hind III, запълване с полимераза на Кленов и повторно лигиране. След това се въвеждат 550 базови двойки от Pst I фрагмент, съдържащ ламбда cos място, който позволява векторът да бъде използуван за образуване на козмид, когато се включат включения със съответния размер. Този вектор се означава с pSCP4.

Геномна ДНК от Р. chrysogenum се смила частично с Sau ЗА и се използува за приготвяне на библиотека във фаговия вектор ламбда EMBL3. Клон, съдържащ изопеницилин N синтетаза гена се изолира от тази библиотека и се използува за получаването на серия от субклонове, един от които съдържа 3,6 килобазов фрагмент от първото Bam HI място по посока на реплицирането на IPNS гена до първото Hind III място в обратната посока на гена. Уникалното Sall място в този субклон се отстранява с рестриктиране със Sall, запълване на вдлъбнатите крайщата с Кленов-полимераза и повторно лигиране. След това, уникалното Xba I място се отстранява по подобен начин, чрез рестриктиране с Xba I, запълване и повторно лигиране. Полученият плазмид се обозначава като pSXF-1. Създаденият IPNS промотор е г изолиран от гел от pSXF-1, като 1,2 кб Ncol фрагмент и лигиран в Ncol мястото на pSCP4, описан по-горе. Ориентацията, определена чрез рестрикционно смилане е подбрана така, че промоторът е фузиран към флеомицин резистентния ген при ATG стартовия кодон. Този плазмид е обозначен с pUTZ-2.

Включване на S. clavuligerus експандаза гена

1,645 кб фрагмент, съдържащ експандаза гена на Streptomyces clavuligerus се пречиства от Bam HI и Sal I смилането на pFTSO-1 (вектор, описан по-рано), чрез електрофореза и се елюира от 0,8% агароза гел. Изолираният вектор се лигира във вектора pSELECT (Promega Corporation), също така смлян с Bam HI и Sal I. Този вектор се обозначава като pFTSO-1.

-51 Ново Neo I място се създава на ATG стартовия кодон на експандаза гена чрез насочена към мястото мутагенза на pFTSO-8, чрез използуването на Altered Sites (запазена марка) in vitro Mutagenesis System (Promega Corporation). Мутанегезата се провежда съгласно инструкциите на производителя. Конструира се олигонуклеотид, комплементарен на кодиращата последователност на ДНК областта в мястото на ATG стартовия кодон от публикуваната последователност на експандаза гена на Streptomyces (Kovacevic et al. (1990) Journal of Bacteriology, 171, p. 3952-3958). Олигонуклеотидът се синтезира чрез цианоетил фосфорамидитна химия (оборудването е Pharmacia Gene Assembler) и олигопоследователността е следната:

Идентиф. последователност No:8

3' CGAGAGGATCAGTGAGAGTCCATGGACACGACGG 5'.

Мутагенезата се потвърждава с рестрикционен ензимен анализ. След това, 1,2 кб Neo I фрагмент от pUTZ-2, съдържащ създадената Р. chrysogenum IPNS промоторна област, се изолира чрез рестрикция с Ncol, последвано от електрофореза в агарозен гел. IPNS-промоторната област се лигира в pFTSO8 вектора на новото Neo I място, създадено с мутагенеза на ATG стартовия кодон на експанадаза гена. Ориентирането на промотора към експандаза гена се установява чрез рестрикционен ензимен анализ. Тази IPNS-промотор: експандаза генна касета, след това се отстранява като Bam Hl/Sal I фрагмент в Bam Hl/Sal I отрязан Penicillium трансформационен вектор pUTZ-2, описан погоре. Крайната конструкция се обозначава като pPenFTSO.

ПРИМЕР 10

КОНСТРУКЦИЯ НА PENICILLIUM ТРАНСФОРМИРАЩИЯ ВЕКТОР pPEN/CEPH-1

Включване на IPNS промоторната област

IPNS промоторната област се изолира от pUTZ-2, описан по-горе в Пример 9, чрез ензимно смилане с Xho l/Sma I. pUTZ-2 векторът се отрязва с Bam HI и стърчащите краища се запълват, като се използуват dNTP и

-52фрагмент на Кленов, създаващи обли крайща, след това се смила с Xho I и изолираният Xho l/Sma IIPNS промоторен фрагмент се лигира в този отрязан вектор, давайки конструкция, която съдържа две IPNS проморни области. Този вектор се обозначава като pUTZ-7.

Включване на С. acremonium експандаза/хидроксилаза гена

След това една от IPNS промоторните области се изолира (чрез електрофореза и елюиране от агарозни телове) от pUTZ-7 като Xho l/Xba I фрагмент и се лигира в Xho l/Xba I орязания вектор pBluescript II SK (Stratagene, La Jolla, СА). Този вектор се обозначава като piPNSp/blue.

Изолира се Cephalosporium експандаза/хидроксилаза гена (чрез електрофореза и се елюира от агарозни гелове), като 1,2 кб Hindlll/Xba I фрагмент от един такъв геномен клон, идентифициран по-горе и лигиран в смляния с Hind Ill/Xba I вектор pSELECT. Създава се ново Bsp HI място на ATG стартовия кодон на експандаза/хидроксилаза гена чрез насочена към място мутагенеза, като се използува системата Altered Sites (зап.марка) In vitro Mutagenesis System (Promega Corp.). Мутагенезата се извършва съгласно инструкциите на пройзводителя. Конструира се олигонуклеотид, комплементарен на кодиращата последователност на ДНК областта при ATG стартовия кодон от публикуваната последователност на Cephalosporium acremonium експандаза/хидроксилаза гена (Samson et al., Biotechnology, Vol. 5, November, 1987). Олигонуклеотида се синтезира чрез цианоетил фосфорамидитна химия (оборудване: Pharmacia Gene Assembler) и олигопоследователността е следната:

Идентиф. последоват. No:9

3' GTTTTGGTGTCGTAGTAGTACTGAAGGTTCCAG 5'.

Мутагенезата се потвърждава чрез рестрикционен ензимен анализ. След това Cephalosporium acremonium гена се изолира (чрез електрофореза и се елюира от агарозни гелове) като Bsp Hl/Xba I фрагмент и се лигира в смлян с Neo l/Xba I вектор pIPNSp/blue, описан в Примера по-горе. Този вектор ссега съдържа промотора на Penicillium IPNS при ATG на Cephalosporium acremonium

-53експандаза/хидроксилаза гена. Този вектор е обозначен като pIPNSp/EXP/ blue. Тази IPNS промотор:експанадаза/хидроксилаза касета се смила частично с Xho I и напълно с Xba I и изолираният фрагмент се лигира в смляния с Xho Ι/Xba I вектор pUTZ-2, описан в Примера по-горе, за да се получи крайният трансформационен вектор pPEN/CEPH-1.

ПРИМЕРИ

Конструкция на PENICILLIUM трансформационен вектор, експресираш двата експандаза и хидроксилаза гени

Бета-тубулин ген от Р. chrysogenum се клонира от ламбда геномна библиотека, като се използува β-тубулин ген на Aspergillus niger като хибридизационна сонда. 2,0 кб Xba i/Hind III фрагмент, съдържащ Penicillium βтубулин промотор се лигира в Xba I/ Hind III местата на pSELSCT (Promega). Neo I място се въвежда при ATG стартовия кодон чрез насочена към място мутагенеза на последователността AAAATGCGT до ACCATGGGT. От получения вектор се изолира от гел 1,4 кб Bam Hl/Nco I фрагмент и се легира между местата Bam HI и Neo I на pUTZ-2 (описан преди това), за да се генерира вектора pCI-б. От геномния клон на Р. chrysogenum се изолира от гел 5,1 кб Sall фрагмент, съдържащ двата гена - IPNS и ацелитрансфераза и се лигира в Sall мястото на pUTZ-2, за да създаде pUTZ-5. 3' крайната последователност на IPNS гена се изолира от pUTZ-5, чрез рестрикция с Ват HI и Hind III, последвано от изолиране от гел на 1,3 кб фрагмент, който се лигира между Bam HI и Hind III местата на pCI-б (описано по-горе), за да се получи рС1-13. Уникалното Sal I място близо до мястото Bam HI в pCI -13, се отстранява чрез рестрикция, запълва се с полимераза на Кленов и се религира. От другата страна на Bam HI мястото се въвежда ново място Sal I, чрез насочена към място мутагенеза на последователността GGAAGACG до GGTCGACG. След това, ампицилин резистентния ген се отстранява от плазмида чрез рестрикция с Pvu I, гелно изолиране на по-големия фрагмент и религиране за получаване на рС1-15. Накрая, касетата IPNS промотор:

-54експандаза ген се изолира от гел от pPENFTSO като 2,4 кб Bam Hl/Sal I фрагмент и се лигира в рС1-15, за да даде рЕХР-1.

Конструкцията на вектор за експресиране на хидроксилаза и експандаза гените на S. clavuHgerus, включва следните етапи. 2,9 кб Κρη I фрагмента, съдържащ хидроксилаза гена се субклонира в pSELECT, така че Eco RI мястото в полилинкера е близо до 5' края на гена. Уникалното Ncol I място в плазмида се отстранява чрез насочена мутагенеза на последователността TCATGGGC до последователността TCGATGGGC и едновременно в стартовия кодон се въвежда ново Neo I място чрез промяна на последователността AACATGGC до ACCATGGC. Двете промени запазват кодираната аминокиселинна последователност. 1,0 кб фрагмент Eco Rl/Nco I, съдържащ конструирания IPNS промотор се изолира гелно от pUTZ-2 и селигира между местата Eco RI и Neo I на горния вектор, съдържащ променения хидроксилаза ген. След това, уникалното място Eco RI в получения вектор се променя до Hind III място чрез насочена мутагенеза. Конструкцията от сливането - 5'1РМ8:хидроксилаза се изолира от получения вектор като Hind III фрагмент, който се лигира в уникалното Hind III място на вектора рЕХР-1, описан по-горе. Крайният вектор съдържа експандаза и хидроксилаза гените, всеки управляван от IPNS промотор и флеомицин резистентен маркер, управляван от бета-тубулин промотора.

ПРИМЕР 12

КОНСТРУКЦИЯ НА ПЕНИЦИЛИН ТРАНСФОРМАЦИОННИЯ ВЕКТОР рРепСАСТ

Включване на хигромицин резистентен ген

Трасформационния вектор на Penicillium се конструира с хигромицин резистентен ген като доминиращ селективен маркер. Е. coli хигромицин В фосфотрансфераза ген се изолира като 1,15 кб Bam HI фрагмент от вектор pHph-1 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) и се лигира в Bam HI смлян вектор mp19. Ориентацията на хигромицин резистентния ген в тр19 се определя от рестрикционния ензимен анализ на RF ДНК. 5' Bam Hi мястото е

-55близо до ATG стартовия кодон на хигромицин резистентния ген. За да се улесни позиционирането на съответен промотор на това 5' Bam HI място, 3' Bam HI мястото се отстранява чрез насочена към място мутагенеза, като се използува Mutator ТМ Site Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolie, CA). Мутагенезата се провежда съгласно инструкциите на производителя. Олигонуклеотидът се конструира така, че да е комплементарен на ДНК областта при 3' Bam HI мястото от публикуваната последователност на Е. coli хигромицин В фосфотрансфераза ген (Gritz, L. and Davies, J., 1983, Gene, 179). Олигонуклеотидът се синтезира чрез цианоетил фосфорамидитен метод (Pharmacia Gene Assembler оборудване) и олиго-последователността е следната:

Идент. последователност No:10:

5' TACCCGGGGTTCCCGCGAATC 3'.

Мутагенезата се потвърждава от рестрикционен ензимен анализ. Мутагенезиралият хигромицин резистентен ген след това се изолира като Sma l/Xba I фрагмент (чрез електрофореза върху и елюиране от агарозни гелове) и се лигира в Sma l/Xba I смляния вектор pUC 18.

Penicillium IPNS промотора се изолира (чрез електрофореза и елюиране от агарозни гелове) като 1,2 кб фрагмент от Neo I отрязания вектор pUTZ-2 (векторът е описан по-рано). Синтезират се синтетични олигонуклеотидни линкери за създаване на Bam HI място от Neo I местата в краищата на IPNS промоторния фрагмент, така че промотора IPNS да се позиционира в 5' Ват HI мястото, близо до ATG на хигромицин резистентния ген. Олигонуклеотидите се синтезират чрез цианоетил фосфорамидитна химия, както е описано погоре, а последователностите на олигонуклеотидите е следната: Идентифик. последователност No: 11

5'CATGAAGAAG 3‘

Идентифик. последователност No: 12

3' TTCTTCCTAG 5'

-56Тази последователност запазва природната последователност на IPNS промотора, но вкарва две аминокиселини в хигромицин резистентния ген. Олигонуклеотидите се отвръщат, фосфорилират и лигират в Neo I отрязания IPNS промоторен фрагмент, и като резултат се получават Bam HI места в двата края - 5' и 3' на IPNS промотрония фрагмент. Този промотор с линкери се лигира в отрязания с Bam HI хигромицин резистентен ген в pUC 18 и ориентацията се потвърждава с рестрикционен ензимен анализ. Тази касета IPNS промоторгхигромицин резистентен ген, след това се изолира като 2,1 кб Xho l/Sal I (Xho I мястото е разположено в 5' края на IPNS промотора, a Sal I мястото е от pUC полилинкера) и се лигира в смляния със Sal I вектор pSELECT. Ориентацията на касетата се определя с рестрикционен ензимен анализ. Този вектор е обозначен като pIPNS/HYG.

Инкорпориране на Cephalosporium acremonium ацетилтрансфераза гена

Ацетилтрансфераза гена от Cephalosporium се изолира от геномен клон (описан по-горе) като 1,8 кб Bgl ll/Sal I фрагмент, чрез електрофореза върху и елюиране от агарозни гелове. Ацетилтрансфераза гена се лигира в смлян с Bam Hl/Sal I вектор pSELECT. За да се улесни позиционирането на Penicillium IPNS промотора при ATG на ацетилтрансфераза гена от Cephalosporium, в ATG на ацетилтрансфераза гена се създава ново място Neo I, а вътрешното място Neo I в структурния ген се отстранява чрез насочена към място мутагенеза по описания в предишните примери метод и оборудване. Конструират се олигонуклеотиди, комплементарни на кодиращата последователност на ДНК-областите от интерес, от последователността на Cephalosporium ацетилтрансфераза гена, дадена по-горе под идентификационни номера 1 и 2. Използуваната олигонуклеотидна последователност за отстраняване на вътрешното Neo I място в структурния ген е дадена по-долу:

Идентифик. последователност No: 13

3' GTCGGCGCATCGATGGGTGGAAT 5'

-57Използуваната последователност на олигонуклеотида за създаването на ново място Neo I в ATG стартовия кодон е Следната:

Идентифик. последователност No: 14

3' CGCCCACCATGGCGCCTCAGAT 5'

Тези олигонуклеотиди са синтезирани по описания по-горе начин. Мутагенезата е потвърдена от рестрикционен ензимен анализ. Този вектор е обозначен като pMUTACT.

Penicillium IPNS промотора е изолиран (чрез електрофореза и елюиране от агарозни телове) като 1,2 кб Neo I фрагмент от вектора pUTZ-2, описан в примера по-горе. Този промоторен фрагмент се лигира в Neo I отрязания вектор pMUTACT, който сега позиционира промотора директно при ATG на ацетилтрансфераза гена от Cephalosporium acremonium. Ориентирането на промотора се потвърждава с рестрикционен ензимен анализ. Тази касета IPNS промотор:ацетилтрасфераза ген се смила с Xho l/Sal I (мястото Xho I е разположено на 5* края на IPNS промотора и Sal I мястото е на 3* края на ацетилтрасфераза гена) и се лигира в Sal I смляния вектор pSELSCT. Ориентацията на фрагмента се определя с рестрикционен ензимен анализ. Този вектор се обозначава като pMUTACT/IPNS.

Използуваната мутагенеза за създаването на ново Neo I място при ATG на ецитлтрансфераза гена води до промяна във втората аминокиселина от серин в аланин. С цел да се запази кодиращата последователност идентична с естествения ген, провежда се насочена към място мутагенеза по описания в предишните примери метод. Олигонуклеотида се конструира така, че да бъде комплементарен на кодиращата последователност на представляващата интерес ДНК-област, от последователността на ацетилтрансфераза гена, дадена по-горе под идентификационни номера 1 и 2. Използуваната последователност на олигонуклеотида, за да промени втората аминокиселина от аланин в серин е следната:

Идентифик. последователност No: 15

3* TCTAGCTAGACACCATGTCGCCTCAGAT 5'.

-58Олигонуклеотидът е синтезиран по дадената в предишните примери методология и оборудване. Мутагенезата е потвърдена от ДНКпоследователността, като е използувана USB Секвеназа, версия 2.0 на ДНКсеквенциращ комплект (USB, Clivland, Ohio).

Секвенциращите праймери са синтезирани при използуването на цианоетил фосфорамидитен метод (оборудване Pharmacia Gene Assembler instrumentation). Този вектор е обозначен като pMUTACT/IPNS.

Касетата IPNS промотор:хигромицин резистентен ген се отстранява от вектора pIPNS/HYG като Xba I фрагмент и се лигира в Xba I смлян вектор pMUTACT/IPNS-2, за да се получи крайният трансформационен вектор pPEN/CACT. Ориентацията на хигромициновата касета се определя с рестрикционен ензимен анализ.

ПРИМЕР 13

КОНСТРУИРАНЕ НА ТРАНСФОРМАЦИОННИЯ ВЕКТОР НА PENICILLIUM - pTS8, ЕКСПРЕСИРАЩ ЕДНОВРЕМЕННО ЕКСПАНДАЗА/ХИДРОКСИЛАЗА И АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗА ГЕНИТЕ НА CEPHALOSPORIUM ACREMONIUM Ацетилтрансфераза гена на Cephalosporium се изолира (чрез електрофореза и елюиране от агарозни галове) като 1,8 кб Bgl ll/Sal I фрагмент от геномен клон и се лигира в Bam Hl/Sal I смлян вектор pSELECT (Promega Corp.). За да се улесни позиционирането на Penicillium IPNS промотора при ATG на Cephalosporium ацетилтрасфераза гена, създава се ново място Neo I на ATG кодона, разположен при база -42 (Mathison et al., Current Genetics, предоставена) и вътрешното Neo I място на структурния ген се отстранява чрез насочена към място мутагенеза, като се използува метода, описан в предишните примери. Мутагенезата се провежда съгласно инструкциите на производителя. Олигонуклеотидите се конструират да бъдат комплементарни на кодиращата последователност на интересната за нас ДНК-област, но включват няколко промени, за да се създаде или отстрани Neo i мястото. Последователността на олигонуклеотида, използувана за да се отстрани вътрешното Neo I място в структурния ген е следната:

-59Идентифик. последователност No: 16

3' GTCGGCGCATCGATGGGTGGAAT 5'.

Последователността на олигонуклеотида, използувана, за да се създаде ново Neo I място на ATG при база -42 е следната:

Идентифик. последователност No: 17

5* CTCCGATAGGGCGTGGTACCCGGCCCTACTCTTAT 3*.

Олигонуклеотидите са синтезирани по метода и с оборудването, описани в предишните примери. Двете мутагенези се потвърдени с рестрикционен ензимен анализ. Този вектор е означен с pMUTACT. Penicillium IPNS-промотора се изолира (чрез електрофореза и елюиране от агарозни гелове) като 1,2 кб Neo I фрагмент от вектора pUTZ-2, описан по-горе. Този промоторен фргмент се лигира в отрязания с Neo I вектор pMUTACT, който сега позиционира IPNS промотора директно на -42 ATG място на Cephalosporium ацетилтрансфераза гена. Ориентирането на промотора се потвърждава с рестрикционен ензимен анализ. Този вектор се означава с pMUTACT/IPNS. От този вектор, по описания по-горе начин, се изолира 2,5 кб Xho l/Sal I фрагмент, който съдържа касета IPNS промотор: ацетилтрансфераза и се лигира в смлян с Sal I вектор pUTZ-2 (описан преди). Този междинен вектор, след това се смила с Xba I и се лигира с 2,1 кб Xba I фрагмент от вектора pPEN/CEPH-1 (описан преди), съдържащ касетата IPNS промотор:експандаза/хидроксилаза, за да се получи крайният трансформационен вектор рТ-8.

ПРИМЕР 14

ТРАНСФОРМАЦИЯ НА PENICILLIUM CHRYSOGENUM

Протопласти от щам на Penicillium chrysogenum, описани по-горе, се генерират чрез инокулация на 50 мл пълна хранителна среда с 1.10⁷ спори в продължение на 67 часа при 25°С върху въртяща се клатачна машина при 220 об/мин. Мицелите се събират чрез филтруване върху сиренарско платно, прехвърлят се в 500 мл колби и се ресуспендират в 25 мл среда (КМР, със следния състав: 0,7М KCI, 0,8М манитол, 0.02М КРО4, рН 6,3), съдържаща 100

-60мг Novozyme 234 (Novo BioLabs, Bagsvaerd, Denmark) и се оставят да се инкубират при 30°С и 100 об/мин. Сферопластите се отделят чрез филтруване през филтри от сиренарско платно/стъклена вата и се утаяват чрез центрофугиране при 350 g в продължение на 10 минути. След това се промиват трикратно с по 10 мл КМР-буфер (вижте по-горе) и се ресуспендират в КМРС (КМР + 50 мл СаС1г) до концентрация 5.10⁷ клетки/мл и се оставят при стайна температура в продължение на 20 мин. За трансформацията на Penicillium 200 мкл от суспензията на сферопластите се прибавят към ДНК (5 мкг векторна ДНК в 6,2 мкл КМРС с 5 мкг/мл хепарин) заедно с 50 мкл РРС (40% PEG MW 3500, 20mM КРО4, pH 6,3, 5% CaCfc се прибавят непосредствено преди употреба) и трансформационната смес се инкубира върху лед в продължение на 30 минути. Прибавя се 1 мл свежоприготвен РРС и сместа се прехвърля в 50 мл стопен (50°С) регенерационен агар (пълна хр.среда плюс 1,ЗМ манитол и 3% агар). След това трансформационната смес се разпределя в 5 петриеви стъкла. След регенериране в продължение на 24 часа при 25°С, плаките се заливат с покритие (1% пептон и 1% агар), съдържащо 100 мкг/50 мл флеомицин. Количеството на покритието е равно на количеството на регенерационния агар. Плаките се инкубират при 25°С в продължение на 7-14 дни и се наблюдават за генерирането на трансформантни колонии.

ПРИМЕР 15

ОЦЕНКИ НА БИОАКТИВНОСТТА

За пределяне на антибиотичната активност на изолирани с HPCL адипоил-6-АРА и адипоил-7-ADCA ферментационни продукти, е използувана биооценка с дифузия в агар. 20 мкл от изолираният продукт се нанася в 5-мм дисскове върху LB-агарни плаки (20 г/л хранителна среда LB с 3% агар (Gibco, Paisley, Scotland) засят с Bacillus subtilus ATCC 33677 или c E.Coli - супер чувствителен щам (доставен от проф. Arnold L. Domain, MIT). Bacillus subtilus се използува като индикаторен щам за оценка на адипоил-6-АРА продукта, а E.coli-cynep чувств. щам е използуван като индикаторен щам за оценка на продукта адипоил-7-ADCA. След 15 часа инкубиране при 37°С ореол на

-61 инхибиран растеж на индикаторните бактерии около диска е показателен за биоактивността на продукта. Контролите в този експеримент включват деацетокси-цефалоспорин С, цефалоспорин С, пеницилин V и агар, съдържащ пеницилиназа или без пеницилиназа, като контрол за потвърждаване на беталактамни структури.

ПРИМЕР 16

HPLC-МЕТОД ЗА ЕДНОВРЕМЕНЕН АНАЛИЗ НА АДИПОИЛ-: 6-АРА, 7-ADCA, 7ADAC И 7-АСА

Ферментационитепродукти от трансформираните щамове Penicillium (адипоил-6-АРА, адипоил-7-ADCA, адипоил-7-ADAC и адипоил-7-АСА) са анализирани едновременно с използуването на висококачествена течна хроматография (HPLC). Системата за HPLC се състои от следните компоненти на фирмата Waters: подаваща разтворителя система 625, детектор с променлива дължина на вълната 409Е (настроен на 220 нм и 260 нм), Система за данни Maxima 825. Стационарната фаза е Nova-Pak C-|g 5 х 100 мм радиален компресионен патрон с пълнеж Nova-Pak C-jg Guard-Pak. Подвижната фаза (при поток 1 мл/мин) обхваща 10 мин линеен градиент от началните условия на 5% метанол и 95% 10тМ КРОд, pH 5 до 40% метанол и 60% КРОд, pH 5.

САдипоил-6-АРА се определя количествено чрез сравняване със стандартна крива на пеницилин N при 220 нм. Продуктите с разширен пръстен се определят количествено чрез сравняване със стандартни криви при 260 нм на синтетичен адипоил-7-ADCA и адипоил-7-АСА.

ПРИМЕР 17 ОЦЕНКА С ЕНЗИМ RAEV

Използувани са химично синтезирани адипоил-7-ADCA и адипоил-7-АСА като субстрати за определяне на сепицифичната активност на ензима RAEV (търговски достъпен от RAEV Corp.). Реакционната смес, съдържаща ЮтМ субстрат, 1мкг RAEV ензим, 5% глицерол в 0,16М К2РО4 в общ обем 50 мкл се инкубира при 37°С. (По-оптимални реакционни условия са използуването на

-6220mM или повече субстрат в 20-50 тМ калиев фосфатен буфер). 5 мкл аликвотни количества се вземат на 0,1, 2, 3, 5, 10, 20 и 30 минута, разреждат се с 35 мкл 0,01 ОМ КН2РО4, pH 3,5 и се замразяват при -70°С преди анализа с HPLC при условия, описани по-горе.

Активността на ензима RAEV спрямо субстрат от колориметрична адипоил-Р-аминобензоена киселина се оценява като се използува 5тМ субстрат, 8,25 мкг RAEV ензим, 10% глицерол в 0.065М КН2РО4 pH 7,0 в общ обем 50 мкл в продължение на 30 минути при 37°С. Реакцията се провежда в 96 гнездова микротитрова плоча. 50 мкл от 1/100 разреждане на 1М NaNO2 в 0.25М оцетна киселина се прибавят, за да се прекрати реакцията, след което реакцията се оставя при стайна температура още 3 минути. 100 мкл 1/100 разреден 10 мг/мл 4-амино-5-хидрокси-2,7-нафтален-дисулфонова киселина мононатриева сол във вода в 0,5М NagCOs се прибавят и се наблюдава цветовото развитие, първоначално при 515 нм, като се използува устройство за отчитане на биокинетиката EL 312 на фирмата Bio-Tek Instruments.

ПРИМЕР 18

ОЦЕНКА НА АЛТЕРНАТИВНИ АДИПОИААЦИЛАЗИ

В допълнение към изследванията, използуващи RAEV ензима, отстраняването на адипоиловата странична верига от адипоил-7-ADCA (и други адипоилови съединения) е демонстрирано с ензими, получени от голям брой микробиологични източници. В едно ранно изследване на Asahi, щамове Pseudomonas sp. SE-83 и SE-495 (депозирани в Fermentation Research Inst, под номера FERM ВР-817 и FERM ВР-818) и щам Pseudomonas SY-77-1 на Toyo Jozo (депозиран в Northern Regional Research Laboratory под номер NRRL В-8070) са култивирани в продължение на 72 часа в среда, съдържаща HyCase SF, 2,0% (об.); натриев глутамат, 0,5% (об.); дрожден екстракт, 0,5% (об.); царевично масло, 0,2% (об.); масло от памучно семе, 0,5% (об.) и глутарова киселина, 0,1% (об.) Клетките се събират чрез центрофугиране и се промиват с 50 тМ фосфатен буфер, pH 8,0; след това се ресуспендират в буфер и външните

-63мембрани се правят пропускливи чрез прибавянето на малък обем хлороформ. Аликвотни количества от клетъчната суспензия се смесват с адипоил-пара-нитроанилид (ad-pNA) и се инкубират при 30°С в продължение на 2 до 18 часа. След инкубацията, смесите се подкиселяват с прибавянето на 10% (об.) оцетна киселина. Освободеният пара-нитроанилин след това се открива колориметрично, следвайки превръщането му в диазосъединение, като се използуват реагенти под формата на комплект реактиви, доставяни от фирмата Sigma Chemical Company за оценка на гама-глутамил-трансфераза (продукт на Sigma номер 545-А). Относителните активности на трите щама са: 100%, 85% и 48%, съответно за Se-495, SE-83 и SY-77-1. Като се използуват *** методи, описани за ензима на RAEV, се демонстрира също така активността на ензимите SE-83 и SE-495 върху адипоил-7-ADCA. ПРодуцирането на беталактамаза от SY-77-1 предотвратява демонстрирането на деацилиращата активност на този щам върху адипоил-7-ADCA.

С подобни средства е демонстрирано също така продуцирането на адипоилацилаза за два гъбични щама (Alternaria sp. МА-133, ATCC No. 20492 и Aspergillus sp. МА-13, ATCC No. 20491; U.S.Pat. 4,141,790 - Meiji Seika Kaisha Ltd.) и три допълнителни бактериални щама (Brevibacterium, ATCC No. 14,649; Achromobacterium, ATCC No. 14,648; Flavobacterium, ATCC No. 14,650, които са описани като продуценти на цефалоспорин С ацилаза в U.S.Pat. 3,239,394 Merck & Co., Inc.).

СПИСЪК НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ (1) ОБЩА ИНФОРМАЦИЯ (I) ЗАЯВИТЕЛ: Conder, Michael J.

McAda, Phyllis Ramboseck, John Reeves, Christopher D.

(II) ЗАГЛАВИЕ HA ИЗОБРЕТЕНИЕТО: Нови биометоди за получаване на 7-АСА и 7-ADAC (III) БРОЙ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ: 17 (IV) АДРЕС ЗА КОРЕСПОНДЕЦИЯ:

(A) АДРЕСАТ: Merck & Co., Inc.

(Б) УЛИЦА: 126 Е. Lincoln Ave (B) ГРАД: Rahway (Г) ЩАТ: New Jersey (Д) СТРАНА; USA (Е) ПОЩЕНСКИ КОД: 07065 (V) КОМПЮТЪРНА ФОРМА НА ДОСТЪП:

(A) СРЕДА: флопи диск (Б) КОМПЮТЪР: IBM PC Съвместим (B) ОПЕРАЦИОННА СИСТЕМА: PC-DOS/MS-DOS (Г) СОУфТУЕЪР: Patentin Release # 1.0, Version # 1.25 (VI) ДАТА НА ЗАЯВЯВАНЕ:

(A) НОМЕР НА ПРИЛОЖЕНИЕ:

(Б) ДАТА НА ЗАПЪЛВАНЕ:

(B) КЛАСИФИКАЦИЯ:

(VIII) ОТОРИЗАЦИЯ/ИНфОРМАЦИЯ ЗА АГЕНТА:

(A) ИМЕ: Speer, Raymond Μ.

(Б) РЕГИСТРАЦИОНЕН НОМЕР: 26,810 (B) РЕфЕРЕНТЕН/ДОКУМНТ. НОМЕР: 18572ΙΑ (IX) ТЕЛЕКОМУНИКАЦИОННА ИНФОРМАЦИЯ:

(А) ТЕЛЕФОН: (908) 594-4481 (Б) ТЕЛЕФАКС: (908) 594-4720

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИДЕНТИф. ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ Νο.1:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 14 базови двойки (Б) ТИП: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: двойна (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейна (II) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна) (XI) ОЗНАЧЕНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:1

TCTAGACACCATGG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИДЕНТИф. ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ No. 2:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(А) ДЪЛЖИНА: 16 базови двойки (Б) ТИП: нуклеинова киселина (В) ВЕРИЖНОСТ: двойна (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейна (II) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна) (XI) ОЗНАЧЕНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:2:

GTGAGAGTTG ATGGAC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИДЕНТИф. ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ No. 3 (I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 16 базови двойки (Б) ТИП: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: двойна (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейна (II) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна) (XI) ОЗНАЧЕНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:3 TCTAGACACTATGGAC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИДЕНТИф. ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ No. 4 (I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 16 базови двойки (Б) ТИП: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: двойна (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейна (II) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна) (XI) ОЗНАЧЕНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:4 TCTAGACACC ATGGAC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИДЕНТИф. ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ No. 5 (I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 22 аминокиселини (Б) ТИП: аминокиселинен (B) ВЕРИЖНОСТ: единична (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейна (II) МОЛЕКУЛЕН ТИП: пептид (XI) ОЗНАЧЕНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:5

- 67 Ser Asn Ser Gly Ala Vai Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn Ala Leu

5 10 15

Leu Leu Gin Asn Pro (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИДЕНТИф. ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ No. 6 (I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 22 аминокиселини (Б) ТИП: аминокиселинен (B) ВЕРИЖНОСТ: единична (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейна (II) МОЛЕКУЛЕН ТИП: пептид (XI) ОЗНАЧЕНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:6:

Ser Asn Ser Trp Ala Vai Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn Ala Leu

10 15

Leu Leu Gin Asn Pro (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИДЕНТИф. ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ No. 7:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 22 аминокиселини (Б) ТИП: аминокиселинен (B) ВЕРИЖНОСТ: единична (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейна (II) МОЛЕКУЛЕН ТИП: пептид (XI) ОЗНАЧЕНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:7

Ser Asn Asn Trp Ala Vai Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg Pro lie 15 10 15

Leu Ala Gly Asp Pro (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИДЕНТИф. ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ No. 11:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 10 базови двойки (Б) ТИП: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: единична (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейна (II) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна) (XI) ОЗНАЧЕНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:11: CATGAAGAAG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИДЕНТИф. ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ No. 12:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 10 базови двойки (Б) ТИП: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: единична (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейна (II) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна) (XI) ОЗНАЧЕНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:12: TTCTTCCTAG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИДЕНТИф. ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ No. 13:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 23 базови двойки (Б) ТИП: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: единична (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейна (II) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна) (XI) ОЗНАЧЕНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:13: GTCGGCGCAT CGATGGGTGG ААТ

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИДЕНТИф. ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ No.14:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 22 базови двойки (Б) ТИП: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: единична (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейна (II) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна) (XI) ОЗНАЧЕНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 14: CGCCCACCAT GGCGCCTCAG AT (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИДЕНТИф. ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ No.15:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 28 базови двойки (Б) ТИП: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: единична (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейна (II) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна) (XI) ОЗНАЧЕНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:15:

TCTAGCTAGA CACCATGTCG CCTCAGAT (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИДЕНТИф. ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ No.16:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 23 базови двойки (Б) ТИП: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: единична (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейна (II) МОЛЕКУЛЕН ТИП: кДНК до ср.РНК (XI) ОЗНАЧЕНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:16 GTCGGCGCAT CGATGGGTGG ААТ

7.1 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИДЕНТИф. ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ No. 17:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 35 базови двойки (Б) ТИП: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: единична (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейна (II) МОЛЕКУЛЕН ТИП: кДНК до ср.РНК (XI) ОЗНАЧЕНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:17:

CTCCGATAGG GCGTGGTACC CGGCCCTACT СТТАТ

Claims (13)

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

1) поддържане в културална среда, способна да поддържа растежа му, на щам от Penicillium chrysogenum, продуциращ изопеницилин N и прибавяне към споменатата културална среда на адипатна хранителна среда, включваща адипинова киселина отделно или с нейни соли и естери, които са способни да бъдат асимилирани и оползотворени от споменатия щам от Penicillium chrysogenum, за да продуцира адипоил-6-аминопеницилинова киселина (адипоил-6-АРА), при което е продуцирана споменатата адипоил-6-АРА;

1) поддържане в културална среда, способна да поддържа растежа му, на щам от Penicillium chrysogenum, продуциращ изопеницилин N и прибавяне към споменатата културална среда на адипатна хранителна среда, включваща адипинова киселина отделно или с нейни соли и естери, които са способни да бъдат асимилирани и оползотворени от споменатия щам от Penicillium chrysogenum, за да продуцира адипоил-6-аминопеницилинова киселина (адипоил-6-АРА), при което е продуцирана споменатата адипоил-6-АРА;

1. Биометод за получаване на 7-аминодеацетилцефалоспоранова киселина (7ADAC), характеризиращ се с това, че включва следните етапи:

2) осъществяване на следните ензимни превръщания, чрез in situ експресия на съответния ген:

а) на адипоил-6-АРА се разширява пръстена in situ до образуването на адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоранова киселина (адипоил-7ADCA) чрез ензима експандаза, при което споменатият щам от Penicillium chrysogenum е трансформиран чрез ДНК, кодираща активността на ензима експандаза, способен да приеме споменатата адипоил-6-АРА като субстрат, върху който, в резултата на експресията му, на споменатата адипоил-6-АРА,

-3продуцирана от споменатия щам също така се разширява пръстена in situ до образуването на адипоил-7-ADCA;

б) 3-метиловата странична верига на адипоил-7-ADCA се хидроксилира in situ и дава адипоил-7-аминодеацитилцефалоспоранова киселина (адипоил-7-ADAC) чрез ензима хидроксилаза, при което споменатият щам от Р. chrysogenum е бил трансформиран чрез ДНК, кодираща активноста на ензима хидроксилаза, способен да приеме споменатата адипоил-7-ADCA като субстрат, върху който, в резултат на експресията му, споменатата адипоил-7-ADCA, продуцирана от споменатия щам, след това също така се хидроксилира in situ до образуването на адипоил-7-ADAC;

в) адипоил-7-ADAC се ацетилира in situ до адипоил-7-аминоцефалоспоранова киселина (адипоил-7-АСА) чрез ензима ацетилтрансфераза, при което споменатият щам от Р. chrysogenum е трансформиран чрез ДНК, кодираща активността на ензима ацетилтрансфераза, способен да приеме споменатата адипоил-7-ADAC, като субстрат, върху който, в резултат на експресията му, споменатата адипоил-7-ADAC, продуцирана от споменатия щам е ацетилирана също така in situ до образуването на адипоил-7-АСА и

2. Биометод, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че адипатната хранителна среда е двунатриев адипат.

2) осъществяване на следните ензимни превръщания, чрез in situ експресия на съответния ген:

а) на адипоил-6-АРА се разширява пръстена in situ до образуването на адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоранова киселина (адипоил-7ADCA) чрез ензима експандаза, при което споменатият щам от Penicillium chrysogenum е трансформиран чрез ДНК, кодираща активността на ензима експандаза, способен да приеме споменатата адипоил-6-АРА като субстрат, върху който, в резултата на експресията му, на споменатата адипоил-6-АРА, продуцирана от споменатия щам също така се разширява пръстена in situ до образуването на адипоил-7-ADCA;

б) 3-метиловата странична верига на адипоил-7-ADCA се хидроксилира in situ и дава адипоил-7-аминодеацитилцефалоспоранова киселина (адипоил-7-ADAC) чрез ензима хидроксилаза, при което споменатият щам от Р. chrysogenum е бил трансформиран чрез ДНК, кодираща активноста на ензима хидроксилаза, способен да приеме споменатата адипоил-7-ADCA като субстрат, върху който, в резултат на експресията му, споменатата адипоил-7ADCA, продуцирана от споменатия щам, след това също така се хидроксилира in situ до образуването на адипоил-7-ADAC и

3) осъществяване на контакт между споменатата адипоил-7-АСА с адипоиламидаза, при което адипоиловата странична верига се отстранява и се получава продуктът 7-АСА, след което споменатия продукт се изолира.

3. Биометод, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че ДНКкодираща активността на ензимите експандаза и хидроксилаза е получена от Cephalosporium acremonium.

3) осъществяване на контакт между споменатата адипоил-7-ADAC с адипоиламидаза, при което адипоиловата странична верига се отстранява и се получава продуктът 7-ADAC, след което споменатия продукт се изолира.

4. Биометод, съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че е използуван единичен бифункционален ензим експандаза/хидроксилаза.

5. Биометод, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че адипоиламидазата е получена от видовете Pseudomonas.

6. Биометод за получаване на 7-аминоцефалоспоранова киселина (7-АСА) характеризиращ се с това, че включва следните етапи:

7. Биометод, съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че адипатната хранителна среда е двунатриев адипат.

8. Биометод, съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че ДНК, кодираща активността на ензимите експандаза, хидроксилаза и ацетилтрансфераза е извлечена от Cephalosporium acremonium.

9. Биометод, съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че е използуван единичен бифункционален ензим експандаза/хидроксилаза.

10. Биометод, съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че адипоиламидазата е извлечена от видовете Pseudomonas.

11. Рекомбинантни ДНК експресионни вектори, плазмиди (1) PEN/CEPH-1, (2) pPENCACT и (3) pTS-8, които са способни да бъдат интегрирани в хромозомна ДНК от рекомбинантен щам на Penicillium chrysogenum, съставени главно от ДНК, кодираща експанадаза/хидроксилаза и/или ацетилтрансфераза активността, получени от Cephalosporium acremonium и промотор, който управлява експресията на споменатата експандаза/хидроксилаза и/или ацетилтрансфераза активност-кодираща ДНК, съставен главно от промотора на Penicillium chrysogenum изопеницилин N синтетаза гена.

12. Клетка-гостоприемник от Penicillium chrysogenum, означена като РС200, АТСС 74186 или РС300, АТСС 74187, трансформирана, съответно с рекомбинантна-ДНК експресионен вектор, плазмид pPEN/CEPH-1 или плазмид pTS8, интегриран в хромозомна ДНК на споменатата клетка-гостоприемник и е съставен главно от съответно ДНК-кодираща експандаза/хидроксилаза активност и споменатата активност, заедно с ацетилтрансферазната активност, получена от Cephalosporium acremonium и промотор, който управлява експресията на споменатата експандаза/хидроксилаза и ацетилтрансфераза активност-кодираща ДНК, съставен главно от промотора на Penicillium chrysogenum изопеницилин N синтетаза гена.

13. Метод, включващ етап на култивиране на рекомбинантна клетка-

С гостоприемник от Penicillium chrysogenum при условия, подходящи за генна експресия, характеризиращ се с това, че споменатата рекомбинантна клеткагостоприемник включва рекомбинантна-ДНК експресионен вектор, плазмид pPEN/CEPH-1 или плазмид pTS-8, интегриран в хромозомна ДНК на споменатата клетка-гостоприемник и е съставен главно от съответно ДНКкодираща експандаза/хидроксилаза активност и споменатата активност, заедно с ацетилтрансферазната активност, получена от Cephalosporium acremonium и промотор, който управлява експресията на споменатата експандаза/хидроксилаза и ацетилтрансфераза активност-кодираща ДНК, съставен главно от промотора на Penicillium chrysogenum изопеницилин N синтетаза гена.