BG67427B1 - Метод за криоконсервация на човешки клетки и тъкани посредством свръххидрофобни покрития от въглеродни сажди - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до метод за криоконсервация на човешки клетки и тъкани, приложимо в областта на регенеративната и репродуктивна медицина (криобиологията), и по-специално в технологиите за замразяване и размразяване на сперматозоиди, тестикуларни тъкани, яйцеклетки, стромални, стволови и епителни клетки. Съгласно предложения метод, клетъчната суспензия се поставя върху подложка покрита със свръххидрофобен слой от въглеродни сажди, нанесени чрез синтез от пламък на рапично олио в условия на контролирано горене, и се замразява/размразява при скорост от ~1°С/1 min. Предимствата на метода се състоят в това, че твърдотелната подложка остава в непосредствен контакт с консервираната жива материя, докато свръххидрофобният слой от въглеродни сажди играе ролята на естествен криопротектант и регулира скоростта на топлообмен (чрез минимизиране на контактната площ твърдо тяло-течност). Платформата за криоконсервация забавя топлообмена на граничната контактна повърхност и след размразяване благоприятства за възстановяване на до 80% от първоначалната подвижност на сперматозоидите, спрямо ~15-25% преживяемост при традиционния подход с хидрофилна подложка. Използваният свръххидрофобен слой от въглеродни сажди проявява антибактериален ефект, биосъвместим е и нецитотоксичен, което води до стерилност на работната среда, липса на биологично замърсяване, възможност за замразяване както на малки, така и на големи обеми клетъчни суспензии, и редукция на използваното количество криопротектанти, спомагайки за ефективното запазване на първоначалните морфокинетични характеристики на гаметите. Методът за криоконсервация на човешки клетки и тъкани може да намери широко практическо приложение в областта на регенеративната, репродуктивна и трансплатационна медицина, и криобиологията при замразяване и размразяване на жива материя, в случаи когато е необходима максимално добра преживяемост на клетките и тъканите и/или при предотвратяване на болезнени, опасни и скъпи хирургически интервенции с вероятност за причиняване на възпаления, фиброза, деваскуларизация или трайно увреждане на тестисите.

Description

(54) МЕТОД ЗА КРИОКОНСЕРВАЦИЯ НА ЧОВЕШКИ КЛЕТКИ И ТЪКАНИ ПОСРЕДСТВОМ СВРЪХХИДРОФОБНИ ПОКРИТИЯ ОТ ВЪГЛЕРОДНИ САЖДИ

Област на техниката

Изобретението се отнася до метод за криоконсервация на човешки клетки и тъкани посредством свръххидрофобни покрития от въглеродни сажди, приложим в областта на регенеративната и репродуктивна медицина (криобиологията), и по-специално в технологиите за замразяване и размразяване на сперматозоиди, тестикуларни тъкани, яйцеклетки, стромални, стволови и епителни клетки.

Предшестващо състояние на техниката

Известни са методи за криоконсервация на човешки клетки и тъкани чрез бавно замразяване или витрификация [1-3]. В процеса на замразяване и размразяване, клетките претърпяват осмотичен шок и/или се свиват под определен „прагов“ обем, което води до нарушаване на клетъчната мембрана, цитоскелета и клетъчните органели.

Известни са методи за криоконсервация на човешки клетки и тъкани, използващи среди за замразяване/размразяване, в състава на които влизат разнообразни по вид криопротектанти [4]. Това са вещества, които отместват точката на замръзване към по-ниски температури, минимизират образуването на ледени „ядра“, хидратират клетките, стабилизират клетъчната мембрана и подобряват осмотичната устойчивост на биологичната суспензия. Основен недостатък на посочения метод е цитотоксичността на криопротектантите, както и възможността за нежелани изменения в акрозомалната вътрешна мембрана, ядрото и митохондриалните гребени на клетките.

Съществуват методи и системи за замразяване и съхранение на малки количества човешки еякулат или сперматозоиди от пациенти с олигоастенозооспермия, включващи стерилизирана подложка, петри съд или отворена капсула от зона пелуцида (обвивка на яйцеклетката) и позволяващи криоконсервация на единични бройки активни гамети [5-7]. Възможността за нежелана промяна във функционалния статус на сперматозоидите, при взаимодействие със свързващи лиганди от зона пелуцида [7], загуба на част от замразения материал [7], както и липсата на данни за преживяемостта на гаметите [5, 6], налага разработването на нови подходи за консервация на жива материя, осигуряващи запазване на жизнените показатели на биологичните обекти след размразяване.

Техническа същност на изобретението

Съгласно предложения метод за криоконсервация на човешки клетки и тъкани, клетъчната суспензия (например, човешка семенна течност) се поставя върху подложка покрита със свръххидрофобен слой от въглеродни сажди, нанесени чрез синтез от пламък на рапично олио в условия на контролирано горене, и се консервира при скорост на замразяване/размразяване от ~1°C/min.

Предимствата на метода се състоят в това, че твърдотелната подложка остава в непосредствен контакт с консервираната жива материя, докато свръххидрофобният слой от въглеродни сажди играе ролята на естествен криопротектант и регулира скоростта на топлообмен (чрез минимизиране на контактната площ твърдо тяло течност). Така модифицираната платформа за криоконсервация забавя топлообмена на граничната контактна повърхност и след размразяване благоприятства за възстановяване на до 80 % от първоначалната подвижност на сперматозоидите, спрямо ~15-25 % преживяемост при традиционния подход с хидрофилна подложка. Използваният свръххидрофобен слой от въглеродни сажди проявява антибактериален ефект, биосъвместим е и нецитотоксичен [8-10], което води до стерилност на работната среда, липса на биологично замърсяване, възможност за замразяване както на малки, така и на големи обеми клетъчни суспензии, и редукция на използваното количество криопротектанти, спомагайки за ефективното запазване на първоначалните морфокинетични характеристики на гаметите.

Пояснение на приложените фигури

Изобретението се пояснява с помощта на приложените фигури и таблици, където:

на фигура 1 е представена експерименталната постановка за криоконсервация на човешки клетки и тъкани с помощта на свръххидрофобно покритие от въглеродни сажди;

на фигура 2 са представени морфологията и структурата на въглеродните сажди;

на фигура 3 е представена формата, която заема семиналната суспензия с човешки сперматозоиди при поставяне върху хидрофилна (дясна част) и свръххидрофобна (лява част) твърдотелна подложка.

Пример за изпълнение на изобретението

Съгласно едно примерно изпълнение на метода, въглеродни сажди 1 се нанасят върху повърхността на твърдотелна подложка 2, чрез синтез от пламък на рапично олио в условия на контролирано горене и третираната подложка се поставя редом до непокрит (хидрофилен) образец върху медна платформа 3 на охладителна камера 4, представена на Фиг. 1. Така полученият слой от въглеродни сажди 1 има свръххидрофобни свойства и вид, както на Фиг. 2. Той е механически устойчив, антибактериален, биосъвместим и не се отмива при контакт с работните суспензии. Върху непокритата и свръххидрофобна подложка се нанасят 0.1 mL капки семенна течност, съдържаща човешки сперматозоиди и криопротектант в съотношение 1:0.7 (Фиг. 3). Бавно замразяване (~1°C/min) се осъществява чрез топлообмен между метален (меден) прът 5, потопен в течен азот, и медната платформа 3 на охладителната камера 4 до достигане на Т — 15°С, след което замръзналите капки се поставят в криовиален съд и се съхраняват при -196°С. Непрекъснатият контакт между металния прът 5 и течния азот осигурява постоянна и регулируема скорост на криоконсервация, докато температурата на бавно замразяване и размразяване се отчита използвайки температурния сензор 6, показан на Фиг. 2.

Така нанесените въглеродни сажди 1 са в пряк контакт с твърдотелната подложка и биологичната суспензия. Свръххидрофобните свойства на саждите обуславят слаби физикохимични взаимодействия със семиналната суспензия и квазисферична форма на течността (Фиг. 3). Това от своя страна забавя топлообмена на границата сажди-течност, предизвиквайки осмотично движение от вътрешната към външната част на клетъчния матрикс и предотвратявайки внезапната дехидратация на гаметите, възникването на осмотичен шок и формирането на вътреклетъчни кристални структури.

Сравнението на кинетичните параметри на човешките сперматозоиди преди и след замразяване върху хидрофилна (дясна част на Фиг. 3) и свръххидрофобна (лява част на Фиг. 3) подложка показва, че използването на въглеродни сажди спомага за запазването на 3-5 пъти по-голям брой подвижни сперматозоиди в семиналната плазма в сравнение със случая на непокрита (хидрофилна) работна повърхност.

Ефективността на свръххидрофобния слой от въглеродни сажди (Фиг. 2) е тествана с циклично бавно замразяване и размразяване на човешки еякулат с различни характеристики (нормозооспермия, олигозооспермия), като благоприятният ефект върху преживяемостта на гаметите се наблюдава при всички изследвани пациенти.

Приложение на изобретението

Методът за криоконсервация на човешки клетки и тъкани може да намери широко практическо приложение в областта на регенеративната, репродуктивната и трансплатационна медицина, и криобиологията, при замразяване и размразяване на жива материя, в случаи когато е необходима максимално добра преживяемост на клетките и тъканите и/или при предотвратяване на болезнени, опасни и скъпи хирургически интервенции с вероятност за причиняване на възпаления, фиброза, деваскуларизация или трайно увреждане на тестисите.

Claims (1)

1. Метод за криоконсервация на човешки клетки и тъкани чрез използване на свръххидрофобно покритие от въглеродни сажди, непосредствено нанесени върху повърхността на твърдотелна подложка посредством синтез от пламък на рапично олио в условия на контролирано горене, характеризиращ се с това, че бавно замразяване (~1°C/min) на капки човешки еякулат се осъществява при поставянето им върху слой от въглеродните сажди до достигане на Т ~ -15°С, след което замръзналите сферични капки се разполагат в криовиален съд с течен азот с Т = -196°С, като свръххидрофобното покритие забавя по естествен начин топлообмена на границата твърдо тяло-течност и осигурява от 3-5 пъти по-добра преживяемост на замразените/размразените биологични клетки в сравнение с хидрофилна подложка