BG64394B1 - Манипулиране на протопорфириноген оксидазната ензимна активност в еукариотични организми - Google Patents
Манипулиране на протопорфириноген оксидазната ензимна активност в еукариотични организми Download PDFInfo
- Publication number
- BG64394B1 BG64394B1 BG101115A BG10111597A BG64394B1 BG 64394 B1 BG64394 B1 BG 64394B1 BG 101115 A BG101115 A BG 101115A BG 10111597 A BG10111597 A BG 10111597A BG 64394 B1 BG64394 B1 BG 64394B1
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- protox
- plant
- herbicide
- gly
- plants
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y103/00—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3)
- C12Y103/03—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with oxygen as acceptor (1.3.3)
- C12Y103/03004—Protoporphyrinogen oxidase (1.3.3.4)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/04—Plant cells or tissues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Botany (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретението се отнася до нови еукариотични ДНК последователности, кодиращи природна протопорфириногеноксидаза (протокс) или модифицирани форми на ензима, които са хербицидно толерантни, и до растения с изменена протокс активност,придаваща толерантност спрямо хербициди. Растенията могат да се селекционират или създадат специално за резистентност спрямо протокс инхибитори чрез мутация на природния протокс ген в резистентна форма или чрез повишени нива на експресията му, или могат да бъдат трансформирани с модифицирани еукариотични или прокариотични кодиращи последователности, или див тип прокариотични протокс последователности, които са хербицидно толерантни. Изобретението се отнася също до диагностика и други приложения на новата еукариотична протокс последователност, до растителни гени,кодиращи див тип и изменен протокс, до пречистен растителен протокс, до методи за изолирането му от растения и за приложението на кодиращи протокс гени. а
Description
Изобретението се отнася предимно до манипулиране на ензимната активност, отговорна за превръщането на протопорфириноген IX в протопорфирин IX по време на биосинтезата на веществата, обща за всички еукариотични организми. В един аспект, изобретението е приложимо за развиване на хербицидна резистентност в растения, растителни тъкани и семена. В друг аспект, изобретението е приложимо за развиване на диагностиката и лечението при недостатъчност на тази ензимна активност при животни, и по-специално при хора.
Биосинтетичните пътища, които водят до получаване на хлорофил и хем споделят множество общи етапи. Хлорофилът е пигмент, който присъства във фотосинтезиращите организми и който може лесно да се получи от тях. Хемът е кофактор на хемоглобин, цитохроми, Р450 смесено- функциониращи оксигенази, пероксидази и каталази /виж, напр. Lehninger,Biochemistry, Worth Publishers, New York (1975), и поради това е необходим компонент за всички аеробни организми.
Последният общ етап в синтезата на хемоглобина и хема е окисляването на протопорфириноген IX в протопорфирин IX. Протопорфирин оксидаза (означена тук като “протокс”) е ензим, който катализира този последен етап на окисляване (Matringe et al., Biochem. J. 260:213 (1989)).
Ензимът протокс е пречистен частично или изцяло от много организми, включително дрождите Saccharomyces cerevisiae (Labbe-Bois and Labbe, в Biosynthesis of Heme and Chlorophyll, E.H.Dayley, ed McGraw Hill: New York, pp.235-285 (1990), ечемичени етиопласти (Jacobs and Jacobs, Biochem. J.244:219 (1987)), и миши черен дроб (Dailey and Karr, Biochem. 26:2697 (1987)). Гени, кодиращи протокс, са изолирани от два прокариотични организма, Echerichia coli (Sasarman et al., Can J.Microbiol. 39:1155 (1993)) и Bacillus subtilis (Dayley et al., J.Biol. Chem.269:813 (1994)). Тези гени не притежават секвенционно сходство, нито пък техните предполагаеми протеинови продукти проявяват сходство в аминокиселинната последователност. Е. coli протеинът е приблизи телно 21 kDa и се асоциира с клетъчната мембрана. B.subtilis протеинът е 51 kDa и е разтворим, с цитоплазматична активност.
Понастоящем твърде малко е известно за протокс ензима, така че да стане възможно изолиране на протокс кодиращи гени от висши еукариотични организми (напр. животни, растения и всички други многоклетъчни ядрени организми, различни от низши еукариотични организми като дрожди, от едноклетъчни водорасли, протозоа и др.) с помощта на известни похвати.
По-специално, много от стандартните техники за изолиране на нови протеини и гени са основани на предположението, че те ще са значително сходни по първичната си структура (напр. аминокиселина или ДНК последователност) с известни протеини и гени, които имат еднаква функция. Такива стандартни техники включват хибридизация на нуклеинови киселини и амплификация чрез полимеразна верижна реакция с помощта на олигонуклеотидни праймери, съответстващи на съхранени мотиви от аминокиселинни последователности. Тези техники не би трябвало да се очаква, че са полезни за изолиране на еукариотични протокс гени с помощта на известната понастоящем информация за структурата, която е ограничена до прокариотични протокс гени, доколкото няма значимо структурно сходство дори сред известните прокариотични протокс гени и протеини.
Друг подход, който е използван за изолиране на биосинтетични гени в други пътища на метаболизма у висши организми, е комплементацията на микробни мутанти, с недостатъчност на желаната активност. За този подход, сДНК библиотека от висшия еукариот се клонира във вектор, който може да насочи експресията на сДНК в микробен гостоприемник. Векторът след това се трансформира или с други думи се включва в мутантен микроб, и се прави подбор на колонии, които фенотипно не са вече мутантни.
Този подход е разработен за изолирани гени от висши еукариоти, които са включени в няколко метаболитни пътища, включително биосинтезата на хистидин (напр. US . 5290926 и WO 946 026909 на Ward et al., включени в приложената литературна справка), биосинтезата на лизин (напр. Aimi et al., Mol.Gen. Genet.228:287 (1991)), и синтезата на триптофан (напр.
Niyogy et al., Plant cell 5:1011 (1993)). Обаче, независимо от наличието на микробни мутанти, за които се счита, че са с недостатъчност на протокс активност ( напр. Е coli (Sasarman etal., J.Gen. Microbiol. 113:297 (1979), Salmonella typhimurium (Xu et al., J.Bacteriol 174:3953 (1992)), и Saccharomyces cerevisiae (Camadro et al., Biochem. Biophys Res Comm. 106:724 (1982)), прилагането на тази техника за изолиране на сДНКи, кодиращи еукариотична протокс ензимна активност е в най-добрия случай непредсказуемо на базата на наличната информация. За това има няколко причини. Най- напред, еукариотичната протокс сДНК последователност може да не бъде експресирана на съответни нива в мутантния микроб, например поради използването на кодон, несъвместим с предпочитанията на микробния гостоприемник. Второ, първичният транслационен продукт от клониранната еукариотична кодираща последователност може да не продуцира функционален полипептид, например ако активността изисква пост- транслационно модифициране, като гликозилиране, което не се осъществява от микроорганизма. Трето, еукариотичният протеин може да не успее да приеме своята активна конформация в микробния гостоприемник, например ако протеинът обикновено е насочен към специфична мембранна система на дадена органела, която в гостоприемника липсва.Тази последна възможност е особено сходна на растителния протокс ензим, който е асоцииран в растителната клетка с органели, които не присъстват в микробния гостоприемник, използван в комплементационното изпитване. По- специално, растителният протокс ензим се асоциира както с хлоропластната обвивка, така и с тилакоидни мембрани (Matringe et al., J.Biol. Chem., 267:4646 (1992)) и вероятно достига такива мембранни системи като резултат от пост- транслационно насочващ механизъм, включващ една Nкрайна транзитна (междинна) последователност, и присъщи за зрелия полипептид свойства (виж, напр. Kohorn and Tobin, Plant Cell 1:159 (1989);Liet al., Plant Cell 3:709 : 709 (1991); Li etal., J. Biol. Chem.267:267: (1992)).
Известно е, че протокс ензимът играе роля в определени условия при заболяване на човека. Пациенти, страдащи от variegate porphyria, едно автозомно доминантно нарушение, характеризиращо се с невропсихиатрични симптоми и лезии на кожата, притежават понижени нива на протокс активност (Brenner and Bloomer, New Engl/ J.Med.302:765 (1980)). Благодарение на знания за човешкия протокс ензим и съответстващия му ген, възможностите за диагностика и лечение на това заболяване понастоящем са много ограничени.
Използването на хербициди за контрол на нежелана вегетация, напр. на плевели или растения в пшеницата, е станало вече почти универсална практика. Съответната продажба възлиза на билион долари годишно. Освен това интензивно използване, контролът върху плевелите остава значим и скъп проблем за фермерите.
Ефективната употреба на хербициди изисква правилен мениджмънт. Например, времето и метод за приложение и стадия на развитие на плевела са критични за постигане на добър резултат на контролиране на плевелите с хербициди. Доколкото някои плевели са резистентни на хербициди, производството на ефективни хербициди става все по-необходимо.
За съжаление, хербициди, които проявяват по-висок потенциал, въздействие върху поширок спектър плевели и по-бързо разграждане в почвата, може също да притежават и повисока фитотоксичност. Едно решение на проблема е да се създадат растения, резистентни или толерантни на хербициди. Пшенични хибриди или сортове, резистентни на хербициди позволяват използването на хербициди без риск от увреждане на реколтата. Създаването на резистентност може да позволи прилагане на хербицид върху пшеницата, където тяхната употреба по-рано е била възпрепятствана или ограничена, дължащо се на чувствителността на пшеницата спрямо хербицида. Например, US 4 761 373 на Anderson at al. е насочен към растения, резистентни на различни имидазолинон или сулфонамидни хербициди. Резистентността се потвърждава с изменен ацетохидроксиацид синтазен (AHAS) ензим. US 4 975 374 на Goodman et al. се отнася до растителни клетки, съдържащи ген, кодиращ мутантна глутамин синтетазна (GS) резистентност по отношение на инхибиране от хербициди, за които се знае, че инхибират GS, напр. фосфинотрицин и метионин сулфоксимин. US 5 013 659 на Bedbrook et al., е насочен към растения, които експресират мутантна ацетолактат синтетаза, която ги превръща в резистентни по отношение на ин хибиране от хербициди на основата на сулфонилуреата. US 5 162 602 на Somers et al, описва растения, толерантни на инхибиране от хербициди на основата на циклохександион и арилоксифеноксипропанова киселина. Устойчивостта се потвърждава с една изменена ацетил коензим А карбоксилаза (АССаза).
Протокс ензимът служи като мишена за различни хербицидни съединения. Хербицидите, които инхибират протокса, включват много различни структурни класове молекули (Duke et al., Weeds Sci.39.-465 (1991); Nandihalli et al., Pesticide Biochem. Physiol. 43: 193 (1992); Matringe et al., FEBS Lett. 245: 35 (1989); Yanase and Andoh, Pesticide Biochem. Physiol. 35:70 (1989)). Тези хербицидни съединения включват дифенилетери { напр. ацифлуорфен, 5-[ 2- хлоро-
4- (трифлуорометил) фенокси]-2- нитробензоена киселина; нейни метилови естери; или оксифлуорен, 2-хлоро-1 - (З-етокси-4-нитрофенокси)-4- (трифлуоробензен)}, оксидиазоли, (напр. оксидиазон, 3- [2,4- дихлоро-4-(1- метилетокси) фенил]-(5- 5 (1,1-диметилетил)-1,3,4-оксадиазол- 2- (ЗН)-он), цикло имиди (напр. S- 23142, М-(4-хлорофенил)-3,4,5,6-тетрахидрафталимид), фенил пиразоли (напр. ТМРР-етил, етил 2-[1-(2,3,4- трихлорофенил)-4- нитропиразолил-
5- окси] пропионат; М&В 39279), пиридинови производни (напр. LS 82- 556) и фенопилат и неговите О-енилпиролидино- и пиперидинокарбаматни аналози. Много от тези съединения конкурентно инхбират обичайната реакция, катализирана от ензима, очевидно действайки като субстратни аналози.
Предполагаемият начин на действие на протокс-инхибиращите хербициди включва натрупване на протопорфириноген IX в хлоропласта. Счита се, че това натрупване води до изтичане на протопорфириноген IX в клетъчната среда, където се окислява от пероксидаза до протопорфирин ЕХ. Изложен на въздействието на светлината, протопорфирин IX може да причини образуване на атомен кислород в клетъчната среда. Този кислород на свой ред може да доведе до формиране на други реактивни на кислород видове, което може да причини липидно окисление до получаване на прекисно съединение и разрушаване на мембраната, което води до бърза клетъчна смърт (Lee et al., Plant Physiol. 102:881 (1993)).
He всички протокс ензими са чувствителни на хербициди, които инхибират расти телни протокс ензими. И двата протокс ензима, кодирани от гени, изолирани от Escherichia coli (Sasermanetal., Can. J.Microbiol.39:1155 (1993)) и Bacillus subtilis (Dailey et al., J.Biol. Chem. 269:813 (1994), са резистентни на тези инхибитори на хербициди. В допълнение, докладвано е за мутанти на едноклетъчното водорасло Chlamidomonas reinhardtii, резистентни на фениламидния хербицид S- 23142 (Kataoka et al., J.Pesticide Sci. 15: 449 (1990); Shibata et al., In Research in Photosynthesis, Vol. Ill, N. Murata, ed.Kluwer: Nethwrlands, pp. 567-570 (1992)). Поне един от тези мутанти очевидно притежава изменена протокс активност, която е резистентна не само на хербицидния инхибитор, за който е селекциониран, но също и на други класове протокс инхибитори (Oshio et al., Z.Naturforsch. 48c:339 (1993); Sato et al., In ACS Symposium on Porphyric Pesticides, S. Duke, ed. ACS Press: Washington, D.C. (1994)). Докладвано е и за клетъчна линия от тютюн, резистентна на инхибитора S- 21432 (Che et al„Z. Naturforsch. 48c: 350 (1993).
Изобретението предлага изолирана ДНК молекула, кодираща протопорфириноген оксидазният (протокс) ензим от еукариотични организми, за предпочитане висши еукариотични организми. По-специално, изобретението предлага изолирана ДНК молекула, кодираща протопорфириноген оксидазният ензим от растителен или човешки източник.
Предпочитани в обхвата на изобретението са изолирани ДНК молекули, кодиращи протопорфириноген оксидазният (протокс) ензим от двусемеделни (Dicotiledonae) растения, поспециално от растението Arabidopsis, като тези, показани на SEQ ID NOS: 1,3 и 9.
Предпочитани са също изолирани ДНК молекули, кодиращи протопорфириноген оксидазният (протокс) ензим от едносемеделни (Monocotiledonae) растения, по-специално от царевични растения, като тези, показани на SEQ ID N0S: 5 и 7. Специално предпочитани в рамките на изобретението е изолирана ДНК молекула, кодираща протопорфириноген (протокс) ензимен прдшегн от двусемеделни растения, който протеин включва аминокиселинната последователност, подбрана от групата, състояща се от SEQ ID Nos 2,4 и 10. Предпочитана е и една изолирана ДНК молекула, кодираща протопорфириноген оксидазен (протокс) ензимен протеин от едносемеделно рас тение, който включва аминокиселинната последователност, подбрана от групата, състояща се от SEQ ID NOS 6 и 8.
С помощта на информацията, предоставена от изобретението, ДНК кодиращата последователност за протопорфириноген оксидазния (протокс) ензим от който и да е еукариотичен организъм може да бъде получена с помощта на стандартни методи. Така, един от вариантите на изобретението предоставя сонди, способни на специфична хибридизация към еукариотична ДНК последователност, кодираща протопорфириноген оксидазна активност или към съответната тРНК и методи за установяване на тези ДНК последователности в еукариотични организми с помощта на сондите съгласно изобретението.
Настоящето изобретение по-нататък предлага експресионни касети и рекомбинантни вектори, включващи посочените експресионни касети, съдържащи по същество промотор, и по-специално промотор, който се активира в растение, оперативно свързан към ДНК молекула, кодираща протопорфириноген оксидазният (протокс) ензим от еукариотичен организъм съгласно изобретението. Експресионната касета съгласно изобретението може в допълнение да съдържа сигнална последователност, оперативно свързана с посочената ДНК молекула, където сигналната последователност е способна да насочи към дадена мишена протеина, кодиран от посочената ДНК молекула в хлоропласта или в митохондрията.
Освен това, изобретението предвижда растения, растителни клетки, растителни тъкани и семена на растения с променена протокс активност, които са резистентни или поне толерантни на инхибиране от хербицид на нива, които нормално са инхибитори на природно срещаната протокс активност в растението. По-специално, изобретението предлага растения, чиято изменена протокс активност е потвърдена от супер-експресия на дивия тип ензим или от експресията на ДНК молекула, кодираща хербицид толерантен протокс ензим. Този хербицид толерантен протокс ензим може да бъде модифицирана форма на протокс ензим, който се среща обикновено в еукариотични или прокариотични организми; или модифицирана форма на протокс ензим, който обикновено се среща в прокариота. Растенията, обхванати от изобретението включват ед носемеделни или двусемеделни растения, и поспециално хибридни растения. Предпочитат се онези растения, които биха били потенциални мишени за протокс инхибиращи хербициди и по-специално, зърнени култури като царевица, пшеница, овес, ръж, сорго, ориз, ечемик, просо, торф и фуражни треви, и други подобни, а така също и памук, тютюн, захарна тръстика, захарно цвекло, зеле и соя.
Настоящето изобретение по-нататьк обхваща размножителен материал на растение, съгласно изобретението, за предпочитане семена на растението, третирано със защитно покритие и по- специално покритие, което съдържа продукт от групата, състояща се от хербициди, инсектициди, бактерициди, нематоциди, молюстициди или смеси от тях.
Изобретението е насочено още и към методи за получаването на растения, растителни клетки и растителни семена и тяхно трансгенно потомство, което съдържа протокс ензим резистентен на или толерантен на инхибиране от хербицида в концентрация, която инхибира природно срещаната протокс активност. Посочената резистентност или толерантност може да бъде получена чрез експресиране в посоченото трансгенно растение или на ДНК молекула, кодираща модифицирана форма на протокс ензим, който обикновено се среща в еукариотите, или модифицирана форма на протокс ензим, който обикновено се среща, в посоченото растение, или протокс ензим, който обикновено се среща, в прокариоти, или протокс ензим, който е модифицирана форма на протеина, който обикновено се среща в прокариотите.
Един специфичен вариант на изобретението е насочен към получаване на трансгенни царевични растения, царевична тъкан или царевични семена и техни трансгенни растения, които са стабилно трансформирани с рекомбинантна ДНК молекула, включваща подходящ промотор, функционален за растенията, оперативно свързан към структурен ген, кодиращ немодифициран прокариотичен протокс ензим, резистентен на хербицида.
Освен това, изобретението е насочено и към получаване на трансгенни растения, растителни клетки, растителна тъкан и семена на растенията, както и техни трансгенни потомства, които са стабилно трансформирани с рекомбинантна ДНК молекула, включваща под ходящ промотор, функционален за растенията и оперативно свързан към структурен ген кодиращ един немодифициран еукариотичен протокс ензим. Това води до суперекспресия на немодифицирания протокс в растението, достатъчна да избегне инхибирането на ензима от хербицида.
Настоящето изобретение включва и получаване на растения, които експресират изменен протокс ензим, толерантен на инхибиране от хербицид при концентрация, която обикновено инхибира активността на дивия тип, непроменен протокс. В този вариант на изпълнение, растението може да бъде стабилно трансформирано с рекомбинантна ДНК молекула, включваща структурен ген, кодиращ резистентността на протокс, или получено чрез директни селекционни техники, при които са изолирани, охарактеризирани, и развити хербицид резистентни линии.
Изобретението по-нататък е насочено към метод за контролиране растежа на нежелана вегетация, който включва прилагане към растителна популация с изменена протокс активност, резистентна на инхибиране от хербицида при нива, които обикновено са инхибитори на природната протокс активност в посоченото растение, на ефективно количество протокс- инхибиращ хербицид. Растения за защита по желания начин са онези, които биха били потенциални мишени на протокс инхибиращи хербициди, и по-специално важни селскостопански растения като например, царевица и други зърнени култури като пшеница, овес, ечемик, ръж, сорго, просо, торф и фуражни треви, и други подобни, както и памук, захарна тръстика, захарно цвекло, зеле и соя. Хербициди с качеството на протокс инхибитори са онези, подбрани от групата, състояща се от арилурацил, дифенилетер, оксидазол, имид, фенил пиразол, пиридинови производни, фенопилат и 0-фенилпиролидино- и пиперидинокарбамат аналози на посочения фенопилат.
Изобретението включва също получаването на протокс ензима по рекомбинантен път, и методи за приложение на рекомбинантно получения протокс. Изобретението се отнася още и до гостоприемникови клетки, по- специално клетки, подбрани от групата, състояща се от растителни клетки, бактериални клетки, дрождеви клетки и клетки на насекоми, стабилно трансформирани с рекомбинантна ДНК моле кула, която включва промотор, функционален за съответния гостоприемник, оперативно свързан към структурния ген, кодиращ един немодифициран или модифициран еукариотичен протокс ензим, където посоченият гостоприемник е способен да експресира посочената ДНК молекула.
Изобретението по-нататък предоставя методи за приложение на пречистен протокс за скрининг на нови хербициди, които въздействат на активността на протокса, и за идентифициране на хербицид-резистентни протокс мутанти.
По-специално, изобретението е насочено към метод за изпитване на химически вещества за инхибиране активността на растителен протокс ензим, който включва:
(а) комбиниране на посочения протокс ензим и протопорфириноген IX в първа реакционна смес при условия, при които посоченият протокс ензим е способен да катализира превръщането на дадения протопорфириноген IX в протопорфирин IX;
b) комбиниране на посочените химически вещества, посочения протокс ензим и протопорфириноген IX във втора реакционна смес при същите условия, както при първата реакционна смес;
c) възбуждане на посочената първа и посочената втора реакционни смеси при около 395 до около 410 пМ;
d) сравняване на флуоресценцията на посочената първа и посочената втора реакционна смеси при около 622 до около 635 пМ;
където посочените химически вещества са способни да инхибират активността на посочения протокс ензим, ако флуоресценцията на посочената втора реакционна смес е значително по-малка от флуоресценцията на посочената първа реакционна смес.
В друг вариант на изпълнение на изобретението се предоставя метод за идентифициране на модифицирани протокс ензими, резистентни на протокс инхибитора, присъстващ в популация от клетки, включващ етапите на:
a) култивиране на дадената популация в присъствието на посочения протокс инхибитор в количества, които инхибират немодифицирана форма на дадения протокс ензим;
b) подбор на онези клетки от етап а), чийто растеж не е инхибиран; и
c) изолиране и идентифициране на про токс ензима, присъстващ в клетките, подбрани в етап Ь).
В методите за трансформиране на растителните клетки може да бъдат използвани гени, кодиращи променен протокс ензим. Така настоящето изобретение предоставя метод за селекциониране на растения, растителни тъкани или клетки, трансформирани с желания трансген от нетрансформирани клетки, включващ следните етапи:
a) трансформиране на растение, растителна тъкан или растителна клетка с желан трансген, който се поддава на експресия от растението, и ген, кодиращ една променена протокс резистентност спрямо протокс инхибитор;
b) трансфер на така трансформираното растение или растителни клетки в среда, съдържаща протокс инхибитора; и
c) подбор на растения или растителни клетки, които оцеляват в средата.
Изобретението по-нататък е насочено към сонди и методи за установяване присъствието и формата на протокс гена и количественото определяне нивата на протокс транскрибти, които се асоциират с една променена форма на протокс ензима или променени нива на експресия на протокс ензима.
В един аспект, настоящето изобретение е насочено към изолирана ДНК молекула, която кодира еукариотична форма на протопорфириноген оксидаза (обозначена тук като “протокс”), ензимът който катализира окисляването на протопорфириноген IX в протопорфирин IX. ДНК кодиращите последователности и съответстветните им аминнкиселинни последователности за протокс ензими от Arabidopsis thaliana са предложени като SEQ ID NOS 1-4 и 9-10. ДНК кодиращите последователности и съответните им аминокиселинни последователности за царевични протокс ензими са предложени като SEQ ID N0S5-8.
Съгласно изобретението може да бъди изолирана която и да е желана ДНК кодираща протокс ензима. В пример 1 е представен един метод, чрез който се счита, че може да бъде изолирна еукариотична протокс кодираща последователност. Съгласно този метод, сДНК клонове, кодиращи протокс ензим се идентиичцират от библиотека на сДНК клонове, получени от желаният еукариот на базата на тяхната способност да снабдяват с протокс ензимна активност мутантният гостоприемни ков организъм с недостатъчност на такава активност. Подходящи за тази цел са такива гостоприемници, които може да бъдат използвани за скрининг на сДНК експресионни библиотеки и за което са на разположение или по рутинен път могат да бъдат получени мутанти, дефицитни на протокс активност. Такива гостоприемници са, но без да се ограничават до, E.coli (Sasarman et al., J.Gen.Microbiol. 113297 (1979)), almonella typhimurium (Xu et al., J.Bacteriol 174:3953(1992), и Saccharomyces cerevisiae (Camadro et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 106-724 (1982)).
Обратно, еукариотични протокс кодиращи последователности могат да бъдат изолирани съобразно добре познати техники, основаващи се на тяхната секвенционна хомоложност спрямо Arabidopsis thaliana (SEQ ID Nos. 1. 3 и 9) и Zea mays (SEQ ID Nos. 5 и 7) протокс кодиращи последователности, както посочва настоящето изобретение. Съгласно тези техники, цялата или част от познатата протокс кодираща последователност се използва като сонда, която селективно се хибридизира към техните протокс кодиращи последователности, присъстващи в популация от клонирани геномни ДНК фрагменти или сДНК фрагменти (напр. геномни или сДНК библиотеки) от избран организъм. Такива техники включват хибридизационен скрининг на посяти ДНК библиотеки (във вид на плаки или колонии; виж, напр Sambrook et al., Molecular Cloning, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989)) и амплификация c PCR. c помощта на олигонуклеотидни праймери, съответстващи на секвенционни области, съхранени между познати протокс аминокиселинни последователности (виж, напр. Innis et al., PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications eds., Academic Press (1990)). Тези методи са специално пригодени за изолиране на протокс кодиращи последователности от организми, свързани с организма, от който е получена последователността на сондата. Например, приложение на тези методи с помощта на Arabiodopsis или Zea mays кодиращи последователности като сонда би се очаквало да бъдат добре пригодени за изолиране на протокс кодиращи последователности от други растителни видове.
Изолираните еукариотични протокс последователности, съгласно настоящето изобретение могат да бъдат манипулирани съгласно стандартни техники на генното инженерство. Например цялата протокс последователност или част от нея може да бъде използвана като сонди, способни специфично да се хибридизират към протокс кодиращи последователности и информационни РНК. За постигане на специфична хибридизация при различни условия, такива сонди включват последователности, които са уникални сред протокс кодиращи последователности имат дължина поне 10 нуклеотида, за предпочитане поне 20 нуклеотида в дължина. Такива сонди могат да бъдат използвани за амплифициране и анализ на протокс кодиращи последователности от подбран организъм чрез добре познатия метод на полимеразна верижна реакция (PCR). Тази техника може да бъде полезна за изолиране на допълнителни протокс кодиращи последователности от желан организъм или като диагностично средство за определяне присъствието на протокс кодиращи последователности, в даден организъм и за асоцииране на променени кодиращи последователности при определени неблагоприятни условия като автозомни доминантни нарушения у хора, характеризиращи се както с неврофизиологични симптоми, така и с кожни лезии, притежават понижени нива на протокс активност (Brenner and Bloomer, New Engl. J. Med. 302: 765 (1980)).
Протокс специфични хибридизационни сонди може също да бъдат използвани за картиране локалиацията на природни еукариотични гени в генома на избран организъм с помощта на стандартни техники, основаващи се на селективна хибридизация на сондата спрямо геномни протокс последователности. Тези техники включват, но не са ограничени до, идентифициране на ДНК полиморфизъм, идентифициран или съдържащ се в протокс последователността, и приложението на такъв полиморфизъм за последване на сегрегация на протокс гена, релативен на други маркери от известна позиция на картата в картирана популация, получена от самоопрашванена хибрид от две полиморфни родителски линии (виж Hanp.Helentjaris et al., Plant Mol. Biol.5: 109 (1985), Sommer et al.,Biotechniques 12: 82 (1992); D’ Ovidio et al., Plant Mol.Biol. 15: 169 (1990)). Докато която и да е от еукариотичните протокс последователности се възприема като приложима за картиране на протокс гени от който и да е еукариотичен организъм, предпо читани содни са онези протокс последователности от организми по-близко родствени към избрания организъм, като особено предпочитани са такива протокс последователности от избрания организъм. Картирането на протокс гени по този начин се счита, че е особено приложимо при селекциониране на растения. Например, чрез познаване позициите на генетичната карта на мутантен протокс ген, който потвърждава хербицидната резистентност, могат да бъдат идентифицирани фланкиращи ДНК маркери от референтна генетична карта (виж напр. Helentjaris, Trends Genet. 3:217 (1987)). При интрогресия (получаване на гени от друг вид при междувидова хибридизация) , хербицидната резистентност преминава в новата селекционна линия, като тези маркери след това могат да се използват за наблюдаване разпространението на протокс- свързаната хромозомна ДНК, която все още присъства във възстановения родител след всеки етап от обратното кръстосване.
Протокс специфичните хибридизационни сонди също могат да бъдат използвани за количествено определяне нивата на протокс тРНК в даден организъм с помощта на стандартни техники като например Northern blot анализ. Тази техника може да е приложима като диагностична проба за установяване променените нива на протокс експресия, които могат да са свързани с определени неблагоприятни условия като автозомно доминантно нарушение у хора, характеризиращо се с невропсихиатрични симптоми и кожни лезии, при което има понижени нива на протокс активност (Benner and Bloomer, New Engl. J.Med. 302: 765 (1980)).
За рекомбинантно получаване на ензима в гостоприемников организъм, протокс кодиращата последователност може да бъде инсертирана в експресионна касета, конструирана за избрания гостоприемник и въведена в гостоприемника, където той продуцира рекомбинантно. Изборът на специфични регулаторни последователности като промотор, сигнална последователност., 5’ и 3’ нетранслирани последователности, и енхансер, е във възможностите на специалиста в областта. Получената в резултат молекула, съдържаща отделните елементи, свързани към определена четяща рамка, могат да бъдат инсертирани във вектор, който може да бъде трансформиран в гостоприемниковата клетка. Подходящи вектори за експресия и методи за получаване на протеини по рекомбинантен път са добре известни за гостоприемникови организми като Е. coli (Виж, напр. Stubier and Moffatt, J.Mol. Biol. 189:113 (1986); Brosius, DNA 8 759 (1989)),дрожди (виж, напр., Schneider and Guarente, Meth. Enzymol. 194:373 (1991)) и клетки на насекоми (виж, Hanp.Luckow and Summers, Bio Technol. 6:47 (1988)). Специфичните примери обхващат плазмиди като pBluescript (Stratagene, La Jolla, СА), pFLAG (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT), pTrcHis (Invitrogen, LaJolla, СА) и бакуловирусни вектори на експресия, напр. като получените от генома на Dutographica califomica ядрено полихедрозисен вирус (AcMNPV). Предпочитана бакуловирус/ инсектицидна система са pVIl 1392/ Sf21 клетки (Invitrogen, LaJolla, СА).
Полученият по рекомбинантен път еукариотичен протокс ензим е приложим за различни цели. Например, той може да се използва за осигуряване на протокс ензимната активност in vitro. Може да бъде използван освен това и в in vivo изпитване за скрининг на известни хербициди, за които не е определено дали инхибират протокса. Такива in vivo изпитвания могат да бъдат използвани като пообщо скриниране за идентифициране на съединения, които инхибират протокс активността и които поради това са кандидат хербициди. Обратно, получен по рекомбинантен път протокс ензим може да бъде използван за понататъшно охарактеризиране на неговото асоцииране с известни инхибитори за рационално конструиране на нови инхибиторни хербициди, като хербицид толерантни форми на ензима.
Обикновено, инхибиторният ефект на протокса се определя чрез измерване на флуоресценцията при 622 до 635 пт, след възбуждане при около 395 до 410 пМ (виж, напр. Jacobs and Jacobs, Enzyme 28: 206 (1982); Sherman et al., Plant Physiol. 97: 280 (1991)). Тава изпитване се основава на факта, че протопорфирин IX е флуоресцентен пигмент, а протопорфирин IX е нефлуоресцентен. Протеинови екстракти се получават от подбрани субклетъчни фракции, напр. етиопласти, митохондрии, микрозоми, или плазмени мембрани, чрез диференциално центрофугиране (виж, напр. Lee et al., Plant Physiol. 102: 881 (1993); Prado et al, Plant Physiol. 65: 956 (1979); Jackson and
Moore, in Plant Organelles. Reid, ed., pp-1-12; Jacobs, Plant Physiol. 101:1181 (1993)). Протопорфириноген се получава чрез редукция на протопорфирин с натриева амалгама както е описано от Jacobs, and Jacobs. (1982). Реакционните смеси обикновено се състоят от 100 mM Hepes (pH 7. 5), 5 mM EDTA, 2 mM DTT, около 2 М Протопорфириноген IX и около 1 mg/ml протеинов екстракт. Инхибторни разтвори в различни концентрации, напр. 1 пПр 100 uM, 10 иМ, 1иМ, 100 пМ, 10 пМ, 1 пМ, 100 рМ се добавят към ензимния екстракт преди инициирането на ензимната реакция. След като веднъж протеиновият екстракт е добавен, наблюдава се флуоресценция в продължение на няколко минути, и скоростта на реакцията се изчислява от участъка на линеарност. 1С50 се определя чрез сравняване скоростта на реакцията на инхибиране спрямо контролната реакция.
Друг вариант на настоящето изобретение включва използването на протокс в проба за идентифициране на инхибитор- резистентните протокс мутанти. Обичайните изследвания са следните:
a) инкубиране на първа проба от протокс и неговия субстрат, протопорфириноген IX, в присъствие на втора проба, включваща протокс инхибитор;
b) измерване на ензимната активност на протокса от етап (а);
c) инкубиране на първата проба от мутиралия протокс и неговия субстрат в присъствието на втора проба, съдържаща същия протокс инхибитор;
d) измерване на ензимната активност на мутиралия протокс от етап (с); и
e) сравняване на ензимната активност на мутиралия протокс с тази на немутиралия протокс.
Реакционната смес и условията на протичане на реакцията са същите, както за изследването за идентифициране на инхибитори на протокс (инхибиторна проба) със следните модификации. Първо, протокс мутант, получен както е описано по-горе, е заместен в една от реакционните смеси за дивия тип протокс от инхибиторната проба. Второ, един инхибитор или див тип протокс присъства в двете реакционни смеси. Трето, мутиралата активност (ензимна активност в присъствие на инхибитор и мутирал протокс) и немутиралата активност (ензимна активност в присъствие на инхибитор и див тип протокс) се сравняват за определяне дали се наблюдава значително повишаване на ензимната активност в мутиралата активност при сравнение с немутиралата активност. Мутирала активност е която и да е измерена ензимна активност на мутиралия протокс ензим, независимо от присъствието на подходящ субстрат и инхибитора. Немутирала активност е която и да е измерена ензимна активност на дивия тип протокс ензим независимо от присъствието на подходящ субстрат и инхибитора. Значителното повишение е определено като едно повишаване на ензимната активност, което е по-голямо от размера на грешката, допустима за дадената техника на измерване, за предпочитане повишение от около 2 пъти от активността на дивия тип ензим в присъствие на инхибитор, по-добре повишаване от около 5 пъти, и най-добре повишение повече от около 10 пъти.
Хербицидът, който инхибира протокс, включва много различни структурни класове молекули (Duke et al., Weed Sci. 39: 465 (1991); Nandihalli et al., Pesticide Biochem. Physiol. 43:193 (1992); Matringe et al., FEBS Lett. 245: 35 (1989); Yanase and Andoh, Pesticide Biochem. Phisiol. 35: 70 (1989), включително дифенилетери {напр. ацифлуорофен, 5-[2-хлоро-4-(трифлуорометил) фенокси] - 2- нитробензоена киселина; нейният метилов естер; или оксифлуорфен, 2-хлоро-1 - (З-етокси-4-нитрофенокси) -4(трифлуоробензен)}, оксидазоли (напр. оксидазон, 3-[2,4-дихлоро-5-(1-метилетокси) фенил] -
5-(1,1 -диметилетил) -1,3,4-оксадиазол-2- (ЗН) он), цикло имиди (напр. S-23142, N-(4- хлоро2- флуоро- 5-пропаргилоксифенил)-3,4,5,6-тетрахидрофталимид; хлорофталим,М-(4-хлорофенил)- 3,4,5,6- тетрахидрофталимид), фенил пи разоли (като напр. TNPP- етил 2-[1- (2,3,4трихлорофенил)-4-нитропиразолил-5-окси] [пропионат:39279). пиридинови производни (като LS 82-556) и фенопилат и неговите 5 О-фенилпиролидино- и пиперидинокарбаматни аналози.
Дифенилетерите със специално значение са онези, притежаващи общата формула:
където R е -COONa (формула II), - CON 15 HSO2CH3 (формула III) или -СООСН2 СООС2Н5 (формула IV): виж Maigrot el al., Brighton Crop Protection Conference - Weeds: 47-51 (1989)).
Допълнителни желани диефенилетери са 20 тези, където R е NOCH2COOCH3
ССН2ОСН3 (Формула Iva; виж Hayashi et al., Brighton Crop Protection Conference - Weeds: 53-58 (1989)).
Допълнително желан дифенилетер е този с формулата:
(Формула IVb; бифенокс, виж Dest et al., Proc Northeast Weed Sci. Conf. 27:31 (1973)).
От особено значение е класът хербициди, известни като имиди, притежаващи обща формула:
о А- о | Cv ОЯ N— ОН | CFjyV° V' О OR | HFjC 1 О |
(ФорнрщУЛ!) | i-Pc|i«fnQ IX) |
Ct 'П-0'· Ήί λ
CHj фоьмуц ixa)
(виж Hemper etal., (1995) in “Proceedings of the Eighth International Congress of Pesticide Chemistry”, Ragdale et al., eds. Amer. Chem Soc, Washington, D.C., pp.42-48 (1994)).
и където R] е H, Cl, или F, Rj e Cl и R3 e оптимално заместен етер, тиоетер, естер, амино или алкилна група. Обратно, R2h R3 заедно може да се формат 5-или 6-членно хетероциклено ядро. Примери за имидни хербициди от особен интерес са
(Формула X)
(формула XI)
Н5С2ООССНгО
OCHFz ((1>ормула XII) (Виж Мигга <7 й/.. 2?.· (ч7,44.--7 ( ><·/? Prtflccfiun Confr-rettce- Wrrdx: .!?- 4() ο
(формула ХШ) (формула XIV·
ОСНСйСН СЦ| oAh
Hc»c-ctfe ο
Хербицидната активност на горните съединения е описана в Proceedings of the 1991 Brighton Crop Protection Conference. Weeds (British Crop Protection Council) (Формули XII и XVI). Proceedings of the 1993 Brighton Crop 20 Protection Conference, Weeds (British Crop Protection Council) (Формули XII и XIII). USA (формула XV]
Patent № 4746352 (Формула XI) и Abstracts of the Weeds Science Society of America vol. 33, pp. 9 (1993) (формула XIV).
Най-предпочитаните имидни хербициди са тези, класифицирани като арилурацилови и притежаващи общата формула:
COOR където R обозначава групата (С2 6-алкенилокси)карбонил-С14-алкил, както е описано в US 5 183 492, включен в литературната справка.
(формула XVII)
От особена значимост са хербицдите с обща формула:
(формула XVIII, лшарщипмин;
Виж Ши/гг л‘, SrifAtoH I'rap ίίΐ.'ί.ΐ.Λνκΐ’ Ufvrf» ρο. Λ· ίΓΑΐ.ί,.ι
/формуъя XIX; кярфснФряздИ) lisr ijKC ί.· ji . Brighi&ii Ct-vc .hvayvmi
(формула XX) (ΊΛIni. Pai. ГиЬ1. ШСХМчкДО.
Wu ν.ΜΟίϋΰ. ιι USFat. \o. лОДЯСУна bhejinj.
N -фенил пиразол и
ί Формули ХХЬ нши|м1с»аф*нк ж 6Ζ1 ли' ‘'the Petdcsdc Mamd**, fth ed.. by CЛ.
Ifcnrthm., Onlrtb Crop Vcw^tintlQwMl.SlBIYytl*)!));
и З-заместени-2-арил- 4, 5, 6, 7- тетрахидроиндазоли (Lyga et al. Pesticide Sci 42:2936 (1994)).
Нивата на хербицидите, които обикновено са инхибитори на протокс активността, включват норми на приложения, известни за специалистите, които зависят частично от външни фактори като околна среда, време и метод на прилагане. Например, в случая с имидните хербициди, представени с формули от V до IX, по- специално тези, представени с формули от X до XVII, нормите на прилагане варират от 0. 0001 до 10 kg/ha, за предпочитане от 0. 005 до 2 kg/ha. Тази доза или концентрация на хербицида може да бъде различна, в зависимост от желаното действие и използваното съединение, и може да бъде определено с методите, известни в областта.
Изобретението по-нататък е насочено към растения, растителни тъкани и семена на растения, толерантни към хербициди, които инхибират природно срещаната протокс активност в тези растения, където толерантността се дължи на изменена протокс ензимна активност. Представителните растения включват тези от тях, към които споменатите хербициди са при30 ложими за тяхното нормално очаквано предназначение. Предпочитат се такива важни селскостопански растения, като напр. покритосеменни и голосеменни растения като памук, соя, ряпа, захарно цвекло, царевица, ориз, пшеница, ечемик, овес, ръж, сорго, просо, торф, фураж, торфени треви и др.
Под “изменена протокс ензимна активност” се разбира протокс ензимна активност, различна от тази, която обикновено се среща в растенията (напр. протокс активност, която се среща при липса на директно или индиректно манипулиране на тази активност от страна на човека), която е резистентна на хербицидите, инхибиращи природно срещаната активност. Изменение на протокс ензимната активност може да бъде постигната съгласно изобретението чрез повишаване експресията на дивия тип, хербицид-сензитивен протокс, експресиращ един изменен, хербицид-толерантен еукариотичен протокс ензим в растението, експресиращо модифицирана или немодифицирана бактериална форма на протокс ензима, която е хербицид резистентен в растението, или чрез комбинация от тези техники.
Постигането на изменена протокс ензимна активност посредством повишаване на експресията води до нива на протокса в растителната клетка най- малкото достатъчни да бъде заобиколена инхибицията на растежа, причинено от хербицида. Нивото на експресирания протокс е обикновено поне два пъти, за предпочитане пет пъти и най-вече поне десет пъти по-голямо от природно експресираното количество. Повишената експресия може да се дължи на множеството копия на дивия тип протокс ген; множеството от срещани протокс кодиращи последователности в рамките на протокс гена (напр. ген амплификация) или на мутация в некодиращата, регулаторна последователност на ендогенния протокс ген в растителната клетка. Растения, свързващи такава променена протокс ензимна активност може да бъдат получени чрез пряка селекция. Този метод е известен в областта. Виж, напр. Somers et al. in US 5 162 602 and Anderson et al. in US 4 761373 и литературата, цитирана там. Тези растения също могат да бъдат получени посредством генно инженерни техники, познати в областта.
Повишена експресия на чувствителен на хербицид протокс може да бъде осъществена още и чрез стабилно трансформиране на растителна клетка с рекомбинантна или химерна ДНК молекула, съдържаща промотор, способен да води експресията на асоцииран структурен ген в растителна клетка, присъединен към хомоложен или хетероложен структурен ген, кодиращ протокс. Под “хомоложен” се разбира онзи протокс ген, който е изолиран от организъм, таксономично идентичен на мишенната растителна клетка. Под “хетероложен” се разбира онзи протокс ген, който е получен от организъм, таксономично отличим от мишенната растителна клетка. Хомоложни протокс гени могат да бъдат получени чрез допълване на бактериален или дрождев мутант с сДНК експресионна библиотека от мишенното растение. Виж, напр. пример 1 и Snustad et al, Genetics 120: 11111114 (1988) (царевична глутамин синтаза); Delauney et al., Mol Genet.221-305 (1990) соева - пиролин- 5- карбоксилат редуктаза; Frisch et al., Mol.Gen. Genet.G 228:287- 293 (1991) (царевична дихидродипиколинат синтетаза); Eller et al., Plant Mol.Biol.l 18: 557- 566 (1992) (хлоропластна 3-изопропилмалат дехидрогеназа); Proc. Natl. Acad. Sci, USA 88:1731-1735 (1991); Minet et al., Plant J.. 2:417- 422 (1992) (дихидрооротат дехидрогеназа) и литература та, цитирана там. Други познати методи включват скрининг на геномни или сДНК библиотеки на висши растения, например, за последователности, които се хибридизират кръстосано със специфични сонди от нуклеинови киселини, или чрез скрининг на експресионни библиотеки за получаване на протокс ензими, които реагират кръстосано със специфични антитяло сонди. Един предпочитан метод включва допълване на един E.coli hemG ауксотрофен мутант с царевична или Arabidopsis thalina сДНК библиотека.
Примери на промотори, способни да функционират в растения или растителни клетки, напр. онези, способни да водят експресия на асоциирани структурни гени като напр. протокс в растителни клетки, обхващат вируса на мозаичната болест по цветното зеле (CaMV) 19S или 35S промотори и CaMV двойни промотори; нопалин синтетазни промотори; свързани с патогенезата (PR) протинови промотори; малки субединици на рибулоза бисфосфат карбоксилазни (ssuRUBISCO) промотори и др. подобни. Предпочитани са оризовият актинов промотор (McElroy et al., MolGen. Genet. 231: 150 (1990)), царевичен убиквитинов промотор (ЕР 0 342 926; Taylor et al., Plant Cell Rep. 12: 491 (1993)), и Pr-1 промотор от тютюн, Arabidopsis, или царевица ( виж Междунар. патентна публ. NPCT/IB95/ 00002 на Ryals et.al., включена изцяло в приложената литературна справка). Предпочита се също и 35S промотора и един усилен или удвоен 35S промотор като този, описан от Kay et al., Science 236:1299-1302 (1987) и удвоеният 35S промотор, клониран в pCGN2113, депозиран като АТСС 40587, които са описани в ЕР-А 0 392 225, релевантно разкритие на които е направено в приложената литературна справка. Промоторите сами по себе си могат да бъдат модифицирани за манипулиране на промоторната сила с оглед повишение на протокс експресията, в съответствие с известни в областта методики. За получаване на химерни ДНК структури съгласно изобретението, към протокс кодиращата последователност могат да бъдат сляти сигнални или транзитни пептиди с оглед насочване транспортирането на експресирания протокс ензим към желаното място на действие. Примери за сигнални пептиди включват онези, присъединени към растителните свързани с патогенезата протеини, като напр. PR.-l, PR- 2 и др. подобни. Виж, напр. Payne et al., Plant Mol.Biol. 11:89- 94 (1988). Примери за транзитни пептиди са напр. описаните от Von Heijne et al., Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126 (1991) Mazur et al., Plant Physiol. 85: 1110 (19087); Vorst et al., Gene 65:59 (1988), и митохондриални транзитни пептиди, описани от Boutry et al., Nasture 328:340-342 (1987). Счита се съгласно изобретението, че хлоропластни и митохондриални транзитни пептиди са специално приложими, тъй като протокс ензимната активност обикновено се среща в митохондриите и хлоропластите. Особено предпочитани са хлоропластните транзитни пептиди, тъй като инхибицията на протокс ензимната активност в хлоропластите се счита като първична основа за действието на протокс инхибиращите хербициди (Witkowski and Hailing, Plant Physiol. 87: 632 (1988); Lenen et al., Pestic. Biochem. Physiol., 37:239 (1990); Duke et al., Weed Sci.39: 465 (1991)). Включени са също и последователности, които водят до локализация на кодирания протеин в различни участъци на вакуолата. Виж, напр. Neuhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10362-10366 (1991) and Chrispeels, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42:21- 53 (1991). Релевантно разкрити, тези публикации са включени в приложената към настоящето описание литературна справка.
Химерните ДНК структури от изобретението могат да съдържат множество копия на протокс структурните гени. В допълнение, структурите може да включват кодиращи последователности за маркери и кодиращи последователности за други пептиди като напр. сигнални или транзитни пептиди, всеки в определена четяща рамка с другите функционални елементи в ДНК молекулата. Получаването на такива структури е във възможностите на специалиста в областта.
Полезните за целта маркери съдържат пептиди, предоставящи хербицидна, антибиотична или лекарствена резистентност, като напр. резистентност спрямо хигомицин, канамицин, С418, гентамицин, линкомицин, метотрексат, глифосфат, фосфинотрицин, или подобни. Тези маркери могат да бъдат използани за подбор на клетки, трансформирани с химерните ДНК структури съгласно изобретението от нетрансформирани клетки. Други полезни маркери са пептидни ензими, които могат лесно да бъдат открити чрез визуални реакции, напр. цветна реакция, като луцифераза, β- глюкуронидаза или β-галактозидаза. Изменена протокс ензимна активност може да бъде постигната още и чрез генериране или идентифициране на модифицирани форми на изолираната еукариотична протокс кодираща последователност, притежаваща поне едно амино киселинно заместване, добавяне или делеция, което кодира изменена протокс ензимна резистентност спрямо хербицид, който инхибира неизменена, природно срещана форма (напр. форми, които се срещат обикновено в даден еукариотичен организъм без да бъде манипулиран, както директно чрез рекомбинантна ДНК методика или индиректно чрез селекция напр. от човека). Гени, кодиращи такива ензими могат да бъдат получени чрез множество известни похвати. Първата от тях включва директна или индиректна мутагенеза на микроорганизми. Например, микроорганизми, които може да бъде подлагани на генетично манипулиране като Е. coli или S. cerevisiae, могат да бъдат подложени на случайна мутагенеза in vivo, например чрез UV светлина или етил или метил метан сулфонат. Мутагенетичните процедури са описани, например от Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1972); Davis et al., Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1980); Shrman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1983); and US 4 975 374 (Goodman et al.). Микроорганизмите, подбрани за мутагенеза, съдържат обикновено чувствителен на хербицид еукариотичен протокс ген и са в зависимост от протокс активността, дължаща се на този ген. Мутиралите клетки са култивирани в присъствие на хербицида при концентрации, които инхибират немодифицирания протокс ензим. Колонии от мутирали микроорганизми, които са се развили по- добре от немутиралите в присъствие на инхибитора (т. е. проявили резистентност спрямо инхибитора), се подбират за по-нататъшен анализ. Протокс гените от тези колонии се изолират или чрез клониране, или чрез амплификация с полимеразна верижна реакция, и се уточняват техните последователности. Последователности, които кодират един изменен протокс ензим след това се клонират обратно в микроорганизма за потвърждаване способността им да придават резистентност към инхибитора.
Друг (втори) метод за получаване на мутанти хербицид- резистентни апели на еукариотичния протокс ензим включва директна селекция в растения. Например, въздействието на протокс инхибитор като онези, описани по-горе, върху инхибирането на развитието на растения като Arabidopsis, соя или царевица, може да бъде определено чрез посяване на семена, предварително стерилизирани чрез известни техники, върху минимална хранителна среда, съдържаща повишено количество концентрация на инхибитора. Такива концентрации са 0.001,0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 110, 300, 1000 и 3000 части на милион (ppm). По-ниските дози при които може да се установи значително инхибиране на растежа, се използва за последващи експерименти.
Мутагенезата на растителен материал може да се използва за повишаване честотата, при която се срещат резистентни алели в подбраните популации. Мутирал семенен материал може да бъде получен от различни източници, включително химична или физична мутагенеза на семена, или химична или физична мутагенеза на полен (Neuffer, In maize for Biological Research. Sheridan, ed. Univ. Press. Grand Fores, ND., pp. 61-64 (1982)), които след това се използват за оплождане на растенията и получените в резултат М! мутантни семена се събират обикновено, за Arabinosis. М2 семена (Lehle Seeds, Tucson, AZ), т. е. поколение на семена на растения, култивирани от химични мутанти на семена, като етил метан сулфонат, или с физични агенти, като гама лъчи или бързи неутрони, се посяват при плътност до 10 000 семена/паничка (10 cm в диаметър) върху минимална хранителна среда съдържаща подходяща концентрация от инхибитора за подбор на резистентността. Прорастъците, които продължават да се развиват и остават зелени 7-21 дни след посяването, се трансплантират в почвата и растат до зрялост и образуване на семена. Поколението на тези семена след това се тестуват за резистентност на хербицида. Ако придобитата резистентност е доминантна, растения чиито семена се разпадат по схемата 3:1:: резистентност: чувствителност се приемат за хетерозиготни по отношение резистентността в поколение М2. Растения, които всички са резистентни, се приемат за хомозиготни по отношение ре зистентността в поколението М2. Такава мутагенеза на интактни семена и скрининга на техните поколения семена М2 може да бъде проведен и върху други видове, например соеви семена (виж, напр. US Patent No 5 084 082 (Sebasrian)). Скринингьт на мутантни семена за хербицидна толерантност се осъществява също като резултат от оплождане с мутантен полен, получен с въздействието на химични или физични средства.
Могат да бъдат възприети два подхода, с които да се потвърди, че генетичната основа на резистентността е изменението на протокс гена. Първо, алели на протокс гена от растения, проявяващи резистентност спрямо инхибитора могат да бъдат изолирани с помощта на PCR с праймери, основани или на съхранени участъци в Arabinosis и царевична протокс сДНК последователност, показана на SEQ ID Nos: ,3, 5,7 о- долу, или за предпочитане, основани на непроменена протокс генни последователности от растенията, използвани за получаване на резистентни алели. След съгласуване на алелите за определяне присъствието на мутации в кодиращите последователности, алелите могат да бъдат тествани за тяхната способност да придадат резистентност спрямо инхибитора у растения, в които вероятните причиняващи резистентността алели са трансформирани. Тези растения може да са Arabinosis или които и да са други растения, чието развитие се влияе от инхибитора. Второ, протокс гените могат да бъдат картирани по отношение на известни рестрикционни фрагменти с различна дължина (RFLP3) (Виж, например, Chang et al. Proc. Natl. Acad. Sci, USA 85: 6856-6860 (1988); Natetal., Plant Cell 1: 699705 (1989). Признаците на резистентност могат да бъдат картирани независимо с помощта на същите маркери. Ако резистентността се дължи на мутация в протокс гена, признаците на резистентност ще се картират при позиция, която не би могла да се отличи от позицията на протокс гена.
Третият метод за получаване на хербицид- резистентни алели на протокс, се основава на подбор на растителни клетъчни култури. Тъканно-културални експланти, напр. зародиши, листни дискове, а така също и активно растящи калуси или суспензионии култури на желаното растение, се култивират върху дефинирана хранителна среда в отсъствие на хем и при повишени концентрации на инхибиторният хербицид или аналогов инхибитор, подходящ за употреба в лабораторна среда. Варирането в степента на растежа се провежда на различни култури. При определени култури, се появяват бързо растящи колонии, които продължават да растат дори в присъствието на нормални концентрации от инхибитора. Честотата, с която такива бързо растящи варианти се появяват може да бъде повишена чрез въздействие с химичен или физичен мутаген преди излагането на тъканите или клетките на въздействието на хербицида. Предполагаеми причиняващи резистентността алели на протокс гена са изолирани и тестувани както е описано в следващите параграфи. Онези алели, идентифицирани като причинители на хербицидната резистентност, след това могат да бъдат конструирани за оптимална експресия и да бъдат трансформирани в растението. Обратно, от тъканните или клетъчни култури, съдържащи тези алели могат да бъдат регенерирани растения, съдържащи тези алели.
Четвърти метод включва мутагенезис на див тип, хербицид-сензитивни протокс гени в бактерии или дрожди, последвано от култивиране на микроорганизма върху среда без хем, но която съдържа инхибиторни концентрации на инхибитора и след това подбор на онези клонове, които растат в присъствието на инхибитора. По-специално, растителна сДНК, като тази на Arabidopsis или царевична сДНК кодиращи протокс се клонира в микроорганизъм, който в друг случай не притежава протокс активност. Примери за такива микроорганизми включват Е. coli, S. Typhimurium и S. cerevisiae ауксотрофни мутанти, включително щамът Е. coli SASX38 (Sasarman et al., J. Gen. Microbiol. 113: 297 (1979), S. typhimurium, щам TE2483 или TT13680 _Xi et al., J. Bacteriol. 174:3953 (1992)), и хем 14-1 дрождев мутант (Camadro et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 106: 724 (1982)). Трансформираният микроорганизъм след това се подлага на in vivo мутагенеза чрез която и да е от множеството ензимни или химични методи, известни на специалистите в областта, напр. натриев бисулфит (Shortle et al., Methods Enzymol. 100: 457-468 (1983); олигонуклеотид-насочена сатурационна мутагенеза (Hutchinson et al., Proc. Natl. Acad/ Sci. USA, 83: 710-714 (1986); или различни похвати, основани на полимеразни реакции (виж, напр. Shortle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 1588-1592 (1982); Shiraishi et al., Gene 64: 313-319 (1988); и Leung et al., Technique 1& 11-15 (1989). Взимат се колонии, които се развиват в присъствие на нормални инхибиторни концентрации на инхибитора и се пречистват чрез повторна рестрикция. Техните плазмиди се пречистват и тестуват за способността им да придават резистентност спрямо инхибитора чрез ретрансформирането им в микроорганизъм, в който липсва протокс. След това се определят ДНК последователности на протокс сДНК инсерти от плазмиди, които преминават този тест.
След като веднъж хербицид резистентните алели бъдат идентифицирани, те могат да бъдат обработени по генно-инженерен път за оптимално експресиране в зърнени растения. Това може да включва увеличаване на кодиращата последователност на резистентният алел за оптимална експресия в желаните видове зърнените растения. Методите за модифициране на кодиращи последователности за постигане оптимална експресия в определени зърнени растения са добре известни (виж, напр. Perlak et al., Proc. Natl. Acad.Csi. USA 88: 3324 (1991); Koziel et al., Bio/technol. 11: 194 (1993)). Генно-инженерното модифициране на протокс алелите за оптимална експресия може да включва също оперативно свързване на подходящи регулаторни последователности (като промотори, сигнални последователности, транскрибционни терминатори). Предпочитани промотори биха били онези, които придават високо ниво на конститутивна експресия или, още попредпочитани са онези, които придават специфично високо ниво на експресия в тъканите, податливи на увреждане от хербицида.
Рекомбинантните ДНК молекули могат да бъдат въведени в растителната клетка по много известни начини. За специалиста в областта изборът на метода зависи от типа на растението, напр. едно- или двусемеделно, подложено на трансформация. Подходящи методи за трансформиране на растителни клетки са напр. микроинжектиране (Crossway et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5602-5606 (1986), Agrobacterium опосредствана трансформация (Hinchee et al., Biotechnology 6: 915-921 (1988)), насочен генен трансфер (Paszkowski et al., EMBO J. 3: 2717-2722 (1984)), и балистично ускорение на частици с помощта на съоръже ния, доставени от Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin and Dupont, Inc., Wilmington, Delaware (виж напр. Sanford et al., USA Patent 4 945 050; and McCabe et al., Biotechnology 6: 923926 (1988)). Виж също Weissingen et al., Annual Rev. Genet. 22: 421-477 (1988); Sanford et al. Particulate Science and Technology 5: 27-37 (1987) (onion); Christou et al., Plant Physiol. 87: 671-674 (1988) (соя); McCabe et al., Bio/ Technology 6: 923-926 (1988) (соя); Datta et al., Bio/Technology 8: 736-740 (1990) (ориз); Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 43054309 (1988) (царевица); Klein et al., Bio/Technology 6: 559-563 (1988) (царевица); Klein et al., Plant Physiol. 91: 440-444 (1988) (царевица); Fromm et al., Bio/Technology 8: 833-839 (1990); and Godon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603-618 (1990) (царевица).
По-нататък в обхвата на изобретението са трансгенни растения, по-специално трансгенни растения, трансформирани посредством описаните по-горе методи и тяхното безполово и/ или полово поколение, което е все още резистентно или поне толерантно на инхибиране чрез хербицид при нива, които обикновено са инхибитори на природно срещана протокс активност в растението.
Трансгенното растение съгласно изобретението може да бъде двусемеделно или едносемеделно растение. Предпочитани са едносемеделните растения от семейство Graminaceae, включващо растенията Lolium, Zea, Triticum, Triticale, Sorghum, Bromus, Orizae, Avena, Hordeum, Secale и Setaria.
Особено предпочитани са трансгенните царевица, пшеница, ечемик, сорго, ръж, овес, торфени треви и ориз.
Сред двусемеделните растения - соя, памук, тютюн, захарно цвекло, ряпа и слънчоглед са особено предпочитани.
Изразът тук “поколение” се разбира, че включва както “полово”, така и “безполово” получено поколение на трансгенни растения. Това определение означава също, че включва всички мутанти и варианти, получавани чрез известни методи, като например клетъчна фузия или подбор на мутанти и които все още проявяват характеризиращите свойства на първоначално трансформираното растение, заедно с всички продукти от кръстосване и сливане на трансформирания растителен материал.
Друг обект на изобретението се отнася до пролиферативния материал на трансгенните растения.
Пролиферативният материал на трансгенни растения се определя съгласно изобретението като какъвто и да е растителен материал, който може да бъде размножен полово или безполово in vivo или in vitro. Специално предпочитани в обхвата на изобретението са протопласти, клетки, калуси, тъкани, органи, семена, зародиши, полен, зародишни клетки, зиготи, заедно с какъвто и да е материал за размножаване, получен от трансгенни растения.
Части на растения, като например цветове, стъбла, листа, корени, произхождащи от трансгенните растения или техни потомства, по-рано трансформирани посредством метода по изобретението и поради това състоящи се поне частично от трансгенни клетки, са също обект на настоящето изобретение.
Преди растителният размножителен материал /плодове, грудки, зърна, семена/, поспециално семена да бъдат продавани като търговски продукти, те обикновено се третират със защитно покритие, включващо хербициди, инсектициди, фунгициди, бактерициди, нематоциди, молюсцициди или смеси от няколко от тези препарати, по желание заедно с някои носители, повърхностно активни вещества или подобряващи приложението аджуванти, обичайно използвани за целта, за да обезпечат защита срещу разрушения, причинени от бактерии, гъби или паразити.
За третиране на семената, защитното покритие може да бъде приложено спрямо семената или чрез импрегниране на грудките или зърната с течна форма, или чрез покриването им с комбинирана влажна или суха форма. В допълнение, при специални случаи, са възможни и други методи на приложение , напр. третиране, насочено към пъпките или плодовете.
Семената съгласно изобретението, включващи ДНК последователност, която кодира протеин от еукариотично растение, съдържащо протопорфириноген оксидазна (протокс) активност съгласно изобретението, може да бъдат третирани със защитни покрития, включващи вещества за третиране на семената, Като например, каптан, карбоксин, тиарам (TMTD®), металаксил (Apron®) и пиримифосметил (Actellic®) и други, които са общоприети за третиране на семена.
Друг обект на настоящето изобретение е да се предостави размножителен материал за култивиране на растения, по-специално семена на растения, които са третирани със защитно покритие, обичайно приложимо за третиране на семена.
Когато хербицид резистентен протокс алел е получен чрез директна селекция в зърнено растение или растителна клетъчна култура, от която зърненото растение може да бъде регенерирано, то може да бъде развито в търговски необходим сорт с помощта на традиционните методи за селекция за развитие на хербицид толерантни растения без необходимостта от обработване по генно инженерен път на алела и от трансформирането му в растението. Обратно, хербицид резистентният алел може да бъде изолиран, генетично манипулиран и след това трансформиран в желан сорт.
Гени, кодиращи изменена протокс резистентност на протокс инхибитор също може да бъдат използвани като селективни маркери в методите за трансформация на растителни клетки. Например, растения, растителни тъкани или растителни клетки трансформирани с трансген могат също да бъдат трансформирани с ген, кодиращ един изменен протокс, способен на експресиране от растението. Трансформираните по този начин клетки се прехвърлят в среда, съдържаща протокс инхибитора, където ще оцелеят само трансформираните клетки. Протокс инхибиторите, за които се счита, че са особено приложими като селективни агенти, са дифенилетери {напр. ацифлуорфен, 5- [2-хлоро-4-(трифлуорометил)фенокси] -2-нитробензоена киселина; нейният метилов естер; или оксифлуорфен, 2-хлоро-1 - (З-етокси-4-нитрофенокси) -4- (трифлуоробензен)}, оксидазоли (като напр. оксидазин, 3-[2,4-дихлоро-5-(1-метилетокси) фенил] -5-(1,1 -диметилетил) -1,3,4-оксадиазол-2-(ЗН)-он), циклични имиди (напр. S23142, N- (4-хлоро-2-флуоро-5-пропаргилоксифенил) -3,4,5,6-тетрахидрофталимид; хлорофталим, N-(4-хлорофенил)-3,4,5,6-тетрахидрофталимид), фенил пиразоли (като напр. TNPPетил, етил 2- [1-(2,3,4-трихлорофенил)-4-нитропиразолил-5-окси] пропионат; М&В 39279), пиридинови производни (като LS 82-556), и фенопилат и неговите О-фенилпиролидино- и пиперидинокарбаматни аналози. Методът е приложим спрямо която и да е растителна клетка, способна на трансформиране с изменен про токс-кодиращ ген, и може да бъде използван с който и да е желан ген. Експресията на трансгена и на протокс гена може да бъде проведена със същия промотор, функционален в растителните клетки, или с отделни промотори.
Изобретението по- нататък ще бъде описано, позовавайки се на следващите подробни примери. Тези примери се предоставени само за целите на илюстрацията и не следва да се тълкуват ограничително.
Депозити
Следните векторни молекули са депозирани в Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria Illinois 61604, USA на посочените подолу дати:
Протокс-1, в pBluescript SK вектор, е депозиран на 5 април 1994 като pWDC-2 (#В-21238).
Протокс-2, в pFL61 вектор, е депозиран на 5 април 1994 като pWDC-1 (NRRL #В-21237).
МгПротокс-1, в pBluescript SK вектор, депозиран на 20 май 1994 като pWDC-4 в NRRL(#B-21260), показано на SEQ ID N0:5.
MznpoTokc-1, в pBluescript SK вектор, повторно депозиран на 11 юли 1994 като pWDC-4e NRRL (#B-2160N), показано на SEQ ID N0:5.
МгПротокс-2, в pBluescript SK вектор, депозиран на 20 май 1994 като pWDC-З в NRRL (#В-21259), показано на SEQ ID N0:7.
Протокс-3, в pFL61 вектора, е депозиран на 10 юни 1994 катоpWDC-5 (NRRL#В-21280).
pMzC-1 Vai, в pBluescript SK вектор, е депозиран на 30 септември 1994 при означение pWDC-8 и му е даден депозитен номер NRRL #21340.
pAraC-2 Cys, в pFL61 вектора, е депозиран на 14 ноември 1994 при обозначение pWDC-7 и му е даден депозитен номер NRRL # 21339N.
Примери за изпълнение на изобретението
Използвани са добре известните стандартни техники на молекулярно клониране и рекомбинантни ДНК техники, описани от Т. Maniatis, Е. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982) и от T. J. Silhary, M. L. Berman, and L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984).
Пример 1
Изолиране на Arabidopsis сДНК, кодираща протокс гени чрез функцонално, допълване на един мутант на Е. coli
Получена е и е амплифицирана една с ДНК библиотека Arabidopsis thaliana (Landsberg) в плазмидния вектор pFL61 (Minet et al., Plant J. 2: 417-422 (1922)). Втора сДНК библиотека от Arabidopsis (Columbia) в UniZap ламбда вектор (Stratagene) е закупена и амплифицирана като pBluescript плазмиди чрез in vivo изрязване от щока на фага. Мутантът Е. coli hemG SASX38 (Sasarman et al., J. Gen Microbiol. 113: 297 (1979)) се получава и съхранява върху L хранителна среда, съдържаща 20 mg/ml хематин (United States Biochemicals). Плазмидните библиотеки се трансформират в SASX38 чрез електропорация с помощта на Bio-Rad Gene Pulser и при условията на производителя. Клетките се посяват върху L агар, съдържащ 100 mg/ml ампицилин при плътност приблизително 500 000 трансформанти/10 cm паничка. Клетките се инкубират при 37СС за 40 h на слаба светлина и се подбират за способността им да се развиват без добавяне на екзогенен хем. Хем прототрофи се възстановяват при честота 400/ 10’ от pFL61 библиотека и при честота 2/10 7 от библиотека Bluescript. Плазмидна ДНК е изолирана от 24 колонии за секвенционен анализ. Всеки от 24-те е трансформиран в SASX38 за проверка на способността за допълване.
Секвенционният анализ показа два класа предполагаеми протокс клона. Девет са от типа, обозначен като “Протокс-1”. Всеки е получен от същия ген, и два са клонове с пълна дължина. сДНК е 1719 Ьр в дължина и кодира протеин с молекулно тегло 57.7 kDa. N-крайната пептидна последователност притежава основната характеристика на хлоропластен транзитен пептид с приблизително 60 аминокиселини. Изследване на базата данни с програмата GAP (Deveraux et al., Nucleic Acids Res, 12: 387-395 (1984)) показва хомоложност c Вас. Subtilis hem Y (protox) протеин (Hansson and Hederstedt 1992, Dailey et al., J. Biol. Chem. 269: 813 (1994)). Двата протеина са сходни на 53%, 31% идентични с участъците на висока хомоложност, включително предложеният динуклеотиден участък на свързване на hem Y протеина (Dailey et al., J. Biol. Hem. 269: 813 (1994)).
Останалите 15 сДНК клона са от типа, обозначен като “Протокс-2”. Те също очевидно възникват от самостоятелен ген. Очевидно пълната дължина на сДНК е 1738 Ьр и кодира протеин с молекулно тегло 55.6 kD. Аминокраят е своето рода характеристика на митохондриалния транзитен пептид. Протокс-2 протеина притежава лимитирана хомоложност спрямо Протокс-1 (53% сходство, 28% идентичност) и спрямо протокс от Вас. subtilis (50% сходство, 27% идентичност).
Протокс-1, в pBluescript SK вектора, е депозиран на 5 април 1994 като pWDC-2 (NRRL #В-21238).
Протокс-2, в pFL61 вектора, е депозиран на 5 април 1994 г. като pWC-1 (NRRL # В-21237).
Arabidopsis сДНК кодираща протокс-1, която се съдържа в pWDC-2 и протокс-2, съдържаща се в pWDC-Ι са показани на SEQ ID Nos: 1 и 3, съответно, по-долу.
Пример 2
Изолиране на царевична сДНК кодираща, протокс гени чрез функционално допълване на един мутант на Е. coli сДНК библиотека на Zea Mays (В73) в ламбда UniZap е закупена от Stratagene и превърната в pBluescript библиотека чрез in vivo изрязване. Втора приготвена по обичайния начин UniZap царевична сДНК библиотека е закупена от Clontech и по сходен начин е превърната в pBluescript плазмиди. Подбора на функционални протокс гени от царевица се осъществява точно както е описано в Arabidopsis библиотеките по-горе в Пример 1.
Два прототрофа на хема в 10’ трансформанти се изолират от Stratagene библиотека, за повторно допълване и съгласуване. Тези сДНК са идентични и доказано хомоложни на Arabidopsis протокс-1. Този царевичен клон, обозначен като МгПротокс 1, е непълен. сДНК е с дължина 1698 Ьр и кодира само вероятния зрял протокс ензим; няма транзитна пептидна последователност и няма иницииращ метионинов кодон. Генът е 68% идентичен на Arab Протокс-1 при нуклеотидно ниво и 78% идентичен (87 % сходен) на аминокиселинно ниво (показано на таблица 1).
Получен е отделен хем прототроф в 10’ от библиотеката на Clontech, за повторно допълване и съгласуване. сДНК очевидно е пълна, има дължина 2061 и кодира протеин от 59 kDa. Този клон е царевичен хомолог на Arabidopsis Протокс-2 и е обозначен като МгПротокс-2. Генът е 58% идентичен на Arab Протокс-2 на нуклеотидно ниво и 58% идентичен (76% сходен ) на аминокиселинно ниво (показано на таблица 2). 5
Царевичният клон притежава N-крайна последователност, която е с 30 аминокиселини подълга от клона на Arabidopsis. Както с клоновете на Arabidopsis, хомологията между двата царевични протокс гена е твърде ниска, само с 31 % идентичност между двете протеинови последователности .
МгПротокс-1, в pBluescript SK вектор, е депозиран на 20 май 1994 като pWDC-4 в NRRL (#В21260), показано на SEQ ID N0:5.
МгПротокс-1 вектор, в pBluescript SK вектор, депозиран отново на 11 юли 1994 като WDC-4 в NRRL (#В-21260М), е показан на SEQ ID N0: 5.
MzIIpoTokc-2, в pBluescript SK вектор, депозиран на 20 май 1994 като pWDC-4 в NRRL (#В - 21260N), е показан на SEQ ID N0: 7.
Пример 3
Изолиране на допълнителни протокс гени, основано на секвенционна хомология на познати протокс кодиращи последователности Фагова или плазмидна библиотека се посява при плътност приблизително 10 000 плаки върху 10 cm петриева паничка, и филтърните посявки се изготвят след култивиране на растенията в продължение на една нощ при 37 С. Плаките се сондират с една от сДНК ите, представени на SEQ ID Nos: 1,3,5 или 7, белязани с 32P-dCTP по метода на случайно праймиране с помощта на Prime Time kum (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT). Условията на хибридизация са 7% додецил сулфат (SDS), 0.5 NaPO4 pH 7.0,1 тМ EDTA при 50 С. След хибридизация в продължение на една нощ, филтрите се промиват с 2xSSC, 1 % SDS. Позитивно хибридизиралите се плаки се откриват чрез авторадиографиране. След пречистване до единични плаки, сДНК инсертите се изолират, и техните последователности се определят по метода ва верино терминиране с помощта на дидезокси терминатори, белязани с флуоресцентни оцветители (Applied Biosystems, Inc., Foster City, СА).
Стандартният експериментален протокол, описан по-горе, може да бъде използван от специалиста в областта за получаване на протокс гени с хомоложна последователност на известните кодиращи протокс последователности от които и да са други еукариоти, по-специално други висши растения.
Едно подреждане на предполагаемите аминокиселини последователности от съответните протеини, кодирани от последователностите, показани на SEQ ID Nos: 2 и 6 , е показано на таблица 1. Едно подреждане на предполагаемите аминокиселинни последователности от съответните протеини, кодирано от последователностите, показани на SEQ ID Nos: 4 и 8 е показано на таблица 2.
Сравнение на Arabidopsis (SEQ ID No. 2) и царевични (SEQ ID No. 6) Протокс-1 аминокиселинни последователности
Процент на сходство: 87. 137 Процент на идентичност: 78. 008
Протокс-1. Pep х Mzprotox-1. Pep
GGITITTDCV7 VGGGISGLCIAQALATKHPDAAPNLIVTEAKDRVGGNII IGO - . I I I; 11 I I i I IJ I Μ I I I I: I . . ::: I I I I:. I , 11 I I .
- . , .NSADCVVVGGCtLSGZCTAQALATRH.-GVGbVLVTEARARPGGNIT 44
101 T. . REEWGFLWEEGPNSFQPSDPMi.TMWDSGLKDDLVLGDPTAPRFVLW 140 I I I 'Г : I I I I I I I I I I I I I I ; J I I . I I I 11 I I I II : I 11.1 I I I I I I
TVZRPEEGYLWEEGFNSFVPSDPVLTMAVDSGLKDPLVFGOPNAPRFVLW 94
149 NCKLRPVPSKL'TX>LrFFbl.MG16GXIRA<SFGAI<GIMS9PGReBSVBEFV 19B
- I I I 11 I I I I - i I i · I I I I I I . I I : I I I J I I I I 111 . I I I I I I i I I I I r
EGKLRPVPSkPAi:r.prFDl1HS:PGKLRAGLGAI<GIRPPPPGREESVEErV
199 RRkGGUEVFERLlii'J CSGV'i'AGQflS^Ll iKAAFGKVHKLEQKGGStlGG 24 У . I I I I I I I I I I I I I . . i I I I I ! I 1.1 I . ; J i I I I I I: I I:. I I I H I I
145 RRtiLGAEVFERLLEPECSGVYAGDPSKLSMKAAFGKVMRlEETGGSIIGG 194
249 TFKAIQERKNAP:<AUKH?RLPKPQGQ4VGSFRKGLRMLPEAXSARLGSKV
I ! I. J JI I ... Il!-I I : I I I I I . Η I I; I I I I I I 11 I : I I . .. J I I I I
195 TIKTIQERSXNPKpyRPARLPXPKGQTVASFRKGUMLPNAITSSLGSKV 244
299 KLSWXLSGrrXLISGGYNLTYtri’DGLVSVQSKSVVMTVPSKVaSGLLRP 348 111111-:111 : · II I . I I I I : I : I I II - Jf I : I I: I 1. 11 I .: I I I
245 KLSHKLTSITKSDDKGYVLEYETPEGVVSVQAKSVIMTIPSYVASNIERP 294
349 LSESAANALSKLYYPPVAAVSISYPXEAIRTECLIDGELkGFGQIHPRTQ 393 11..11:111::.....I I I - :! I I I : I I I - I I I 111 I I . I I I 1111 I - I
295 L.SSDAADALSR.FYY?? VAAVTVS YPKEAIRKeCLIDGELQGFGQLHPRSC 344
399 GVEIlGTIYSSSLFI?RRAPPGR.ILLLNYIGGSTHTGILSKSEGEI.VEAVD 44« I I I I I I I I II I I I I I I I I I · I I: I I ' I I I I I. ’ll I 1:11.1:1 I I IГ1 I
345 GVE'rLGTIYSSSLFPNRAPOGRVLLLNYIGGATHTGIVSKTESZLVEAVD 394
449 FDLRKMLIKPNSTOPLKLGVRVWPQAIPQFEvGHFDILDTAKSSLTSSGY 190
J I IГI I I I.....Ill I ' 1 I I I Μ I I I I I I I I I : 1: I : . | | . . I . . : I I
395 ROLRKHLIHSTAVDPLVi.GVRVWPQAIPQFLVGRLDmEAAKAALDRGGY 444
99 EGU'LGGNrVAGVALGRCVEGAYETMEVHUFHSRYAYK* 538 : I I II I I I I I I I I I I I I I I I I I I I . ' ::.:1:.:11111
445 OGLFLGGHYVAGVAt.GRCVEGAYESASQrSDyi.TKYAYK* 464
Идентичните остатъци са отбелязани с вертикална черта между двете последователности, подреждането е представено с помощта на GAP програмата, описано в Deveraux et al., Nucleic Acids Res. 12: 387-395 (1984).
Таблица 2
Сравнение на Arabidopsis (SEQ ID No. 4) и царевични (SEQ ID No. 8) протокс-2 аминокиселинни последователности
Процент на сходство: 75. 889 Процент на идентичност: 57. 905
Протокс-2. Pep х Mzprotox-2. Pep
............................МASGAVAD. HQ1EAVSGKHVAV 21 . 1 I : I : . 1..::.111
MLALTASASSASSHPYRHASAUTRRRKLRAVLAMAGSUDPRAAPARSVAV 50
VGAGVStLДЛА' YKr.F.PUGLUVTVFEAPGRVGRKbRSVMQWGI.IfrDeGAVT 71 ‘
I I I I I i......;i: . I : IiI 11 I I .: I . I I I : I - :.1::,.(11:
VGAGVSGLAAAYRLRUGGVNvrVFEAADRAGGKl RTNSEGGFVWCEGANT 109
MTEAEPEVGSbLDDL.GLREKQyFP1SOKKRYIVRNGVPVMLPTNPIELVT 121 111:1 I -:.1: I I I 11.:1 I I: I I I -1 11 I I :: I. I.:: 1.: I I . I:.
101 HTEGE*EASRlIDDLGLQDKQQYPNSQHKRYIVKDGAPAbIPSDPISl.MK 150
122 55УЬ5ТаЗКГ0И.ЬЕРПНКК. , . .KSSKVSDASAEESVSEFFQRHFGQE 167
I I I I I I .11: .:::11 I |:ll -1:111:. *1 11:. I : 111 I. I
151 SSVLSTKSKIALFFEPFLYKKANTRHSGKVSEEHLSESVGSFCERKFGRE 200
168 WDYLIDPFVGGTSAADPDSLSMKHSFPDbWHVEKSrGSIIVGAIRTKFA 217
I I I I :: I I I I : i 11 I : I 1: 111:: I - I I . 111 :1 :.: 11 :11 11 1 .1 : I
201 VVDYFVDPFVAGISAGDPESLSIRHArpALWHLERKYGSVIVGAILSKLA 250
210 AKGGKSRDTK$S£GTKKGSRGSFSFKGGHQILPt>TLCKSI,SaDEINIlDSlt 267
III:. . . .. I . I .:: -. I -1 I IL. И I I I :. I ..::.1::.1:..
251 AKGDPVKTRHDSSGKRRHRRVSFSFHGGMOSLIHALUHEVGDDWVKbGTE 300
268 VLSIS,.YHSGSRQENWSLSCVSKNETQRQ-..NPHYDAVIMTAPLCTVK 312
I I I I . ::: .. ;.1 It I . I . : . . : : : I . ; I I 11 ί I I I I : 11 :
301 VL$LACTFDGVPALGRWSISVDSKDSCDKOLASHQTFDAVlHTAPl>SklVR 350
313 EMKVMKGGQPFQLHFLPElHYMpLSVLITTFTKEKVKftPLEGFGVLIPSK 362
II. I I I.I. I :111 .::1:111:::1-1 . 1:. I I :)11 Hill I I I
351 ЙМКЕТКббАРУУЬОЕЕРКНиТЕРЕЗЕМУТАГККСОУККРЬЕСЕбЧЬТРУК 400
363 E .OKHGFKTLGTLFSSIWPDRSPSUVULYTTFIGGSRNQKLAKASTDEL 411
I I I ЕI: I I I 111 I I r I Η I I I . I . I I 1 I I I : I I I : I .: 11 I I I
401 EOQKHGl-KTLGTLFSSKrtFPDPAPODQYl.YTrrVGGSHNROLAGAPTSrL 4 50
-l 12 KQVVTSDLQRLUiVEGtfVSVNHYYWRKAfTIA’DSSYnyVHEAIDKHENIJ 4 61 I I : I I I I I . -· I I t I 1 I : I - I - I 11 I I I I I : . I . I I : F 11 : I I I :
kQ).VT$DI.KKLLGVEGQPTFVK«VYWGNAFP1.YGhDVSSVLEA1EKmEKH 500 •1(i2 LPGFFYAGNHRGGbSVGKSIASGCKAADLVlSYLKSCSNDKKrWDSL* 509
I 111 r I I I I -.:11.11. I I I I : 11 I I I · I I I 1 I I ......:
bMl bPyFFYAGNSKDGLAVGSVIASGSKAAOI.rtl ^YbESHTKHKHSU*- - - 545
Пример 4
Изолиране на контаминиращ дрождев Протокс клон от една Arabidopsis сДНК библиотека
В усилието да бъдат идентифицирани някои редки сДНК с протокс активност, се провежда втори скрининг на pFL61 Arabidopsis библиотека както по-горе, като отново се получават стотици комплементарни клона. Приблизително 600 от тях се поставят на решетести панички и се инкубират на 28 ПС за 18 h. Дупликатни филтълни проби се изготвят върху Colony/ Plaque (NEN) мембрани съгласно инструкциите на производителя. Протокс-1 и протокс-2 след това се отделят от техните вектори чрез разграждане с EcoRI/XhoI и Nol, съответно. Инсертите се разделят с гел електрофореза в 1.0% SeaPlaque GTG (FMC) агароза, изрязват се и се бележат с 32Р със случаен прайминг (Life Technologies). Един комплект от лифтинги се хибридизира с всяка сонда. Условията на хибридизиране и промиване са такива, каквито са описани в Churck and Gilbert, 1984.
Колонии (~ 20), които не показват ясна хибридизация с Протокс-1 или Протокс-2, се ампилифицират в течна култура и се изготвя плазмидна ДНК. Тази ДНК се разгражда с Notl, дупликатните проби се пропускат през 1.0% агарозен гел и след това се оцветяват по Southern върху Gene Screen Plus (NEN) филтър (New England Nuclear). Сонди от познатите Протокс гени се бележат и се хибридизират както по-горе. Налице са два идентични клона, които не са нито Протокс-1, нито Протокс-2. Показано е, че този клон отново допълва мутанта SASx38, макар той да се развива много бавно и се означава като Протокс-3.
Протокс 3, във вектора pFL61, е депозиран на 8 юни 1994 като pWDC-5 (NRRL #В21280). Установено е, че кодиращата последователност е получена от дрождева ДНК, която присъства в малко количество в Arabidopsis сДНК библиотека. Дрождевата ДНК, кодираща протокс-3 и съдържаща се в pWDC-5 е описана в SEQ ID No: 9 по-долу.
Пример 5
Демонстриране на чувствителността на растителен протокс клон спрямо протокс инхибиторни хербициди в бактериална система
Течни култури на Протокс-1/ SASX38, npoTokc-2/SASX38 и Bluescript/XLl-Blue се култивират в Lamp100. Еднакви части от по 1 стотна от всяка култура се посяват върху среда Lamp100, съдържаща различни концентрации (1.0 М - 10 тМ) от протокс инхибиращ арилурацилов хербицид от формула XVII. Дупликатни комплекси от паничките се инкубират о х за 18 h при 37 С на слабо осветление или в пълна тъмнина.
Щамът Е. coli XLl-Blue, който е протокс +, показа отсъствие на чувствителност спрямо хербицида при която и да е концентрация, което се съгласува с докладваната резистентност на нативния бактериален ензим спрямо сходни хербициди. Протокс-1/SASX38 е ясно чувствителен, с поле от бактерията, почти напълно елиминирана при концентрация на инхибитора възлизаща на 10 пМ. Протокс-2/ SASX38 също е чувствителен, но само при висока концентрация (10 М) от хербицида. Въздействието на хербицида върху двата растителни щама е по-драматично при слабо осветление, но е също очевидно върху паничките, съхранявани изцяло на тъмно. Токсичността на хербицида е изцяло елиминирана при добавяне на 20 mg/ml хематин към паничките.
Различната хербицидна толерантност между двата растителни Протокс щама вероятно е резултат на различна експресия от тези два плазмида, вместо която и да е наследствена разлика в ензимната чувствителност. ПроTokc-1/SASX38 се развива много по-бавно, отколкото npoTokc-2/SASX38, в която и да е хемдефицитна среда. В допълнение, МгПротокс-2/ SASX38 щамът с темпове на развитие, сравними с щама Arab Протокс-1/SASX38, е също много чувствителен спрямо хербицида при ниските (10- 100 пМ) концентрации. Изходната концентрация на дрождевия Протокс-3 клон показва, че е също и чувствителен на хербицид.
Пример 6
Подбор на растителни протокс гени, резистентни на протокс-инхибиращи хербициди в експресионна система на Е. coli
Инхибирането на растителни протокс ензими в бактериална система е приложимо за мащабно изследване на хербицид-резистентни мутации в растителните гени. Изходната доза за отговор в експериментите, осъществени чрез посявка от течна култура, води до висока честота на “резистентни” колонии дори при високи концентрации на хербицида. Тази резистентност не произхожда от плазмида, основава се на ретрансформационно/хербицид сензитивно изпитване. Трансформирането на Протокс плазмида в SASX38 мутанта и посяването му директно върху панички, съдържащи хербицид, редуцира този съществуващ проблем почти напълно.
Растителните протокс плазмиди се подлагат на мутация по различни начини, с помощта на публикувани процедури за химически съединения (като натриев бисулфит (Shortle et al., Methods Enzymol. 100: 457-468 (1983); метоксиламин (Kadonaga et al., Nucleic acids Res. 13: 1733-1745 (1985); олигонуклеотид- насочена сатурационна мутазенеза (Hutchinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 710-714 (1986); или различни полимеразни методики (виж напр. Shortle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 1588-1592 (1982); Shiraishi etal., Gene 64: 313-319 (1988); and Leung et al., Technique 1: 11-15 (1989)). Очакваните промоторни мутанти от мутагенезата на целия плазмид се отстраняват чрез повторно клониране на кодиращата последователност в див тип вектор и повторно тестуване. Показано е, че по-висока експресия като че води до по-добро култивиране в отсъствие на хербицид, при това визуално изследване за мутанти на кодираща последователност също е възможно.
Всеки растителен протокс ген експресиращ хербицидна резистентност в бактериалната система може да бъде конструирана за оптимална експресия и трансформирана в растения с помощта на стандартни техники, както е описано по-горе. Получените в резултат растения след това може да бъдат третирани с хербицид за потвърждаване и количествено определяне нивото на резистентност, което се дължи на въведения протокс ген.
Пример 7
Структури за експресия на хербицидрезистентни микробни протокс гени в растения
Кодиращите последователности за протокс гена на В. subtilis hem Y (Hansson and Hederstedt, J. Bacteriol. 174: 8081 (1992); Dayley et al., J. Biol. Chem. 269: 813 (1994)) и за протокс гена на Е. coli hemG (Sasarman et al., Can. J. Microbiol. 39: 1155 (1993)) се изолират от лабораторни щамове чрез PCR амплификация при стандартни условия и фланкиращи праймери, конструирани от публикуваните последователности. Знае се, че тези гени кодират хербицид-резистентни форми на протокс ензима.
С помощта на стандартни техники за припокриване на PCR фузия (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology. John & Sons, Inc. (1994)), двата бактериални гена се сливат до две Arabidopsis хларапластни транзитни пептидни последователности (CTPs). Първата е СТР от ацетохидрокси кисела синтетаза (AHAS, Mazur et al., Plant Physiol. 85: 1110 (1987)), които следва да позволят въвеждане до стромата на хлоропласта. Втората е Arabidopsis пластоцианинов ген (Vorst et al., Gene 65: 59 (1988)), който е транзитен пептид от две части. Амино крайната част от този СТР насочва протеина към хлоропласта, където карбокси края завършва в тилакоидните мембрани. Всички четири сливания на гена са клонирани зад 2X35S промотора в бинарно експресионен вектор, конструиран за получаване на трансгенни растения чрез трансформация на агробактериум.
След изолиране Arabidopsis и царевични протокс сДНК, хлоропластният транзитен пептид от Протокс-1 или МгПротокс-1 също може да бъде слят с двата бактериални протокс протеина по същия начин както по- горе.
Векторите, описани по-горе, след това могат да бъдат трансформирани в желаните растителни видове и получените в резултат трансформанти се изпитват за повишена резистентност към хербицида.
Пример 8
Участък превключващ между Arabidopsis/B. subtilis гени за получаване на химерен, хербицид резистентен протокс.
Един подход, който може да бъде използван за получаване на протокс ген, който е едновременно хербицид резистентен и способен да предостави ефективна протокс ензимна активност в растения, е да бъдат слети части (част) на бактериален и растителен протокс ген. Получените в резултат гени след това може да бъдат изследвани за такива, които са способни да предоставят хербицид резистентна протокс активност в растителната клетка. Например, Arabidopsis/B. subtilis (hemY) протокс пептидни последователности са колинеарни с участъци с висока хомоложност. HemY кодиращата последователност е клонирана в pBluescript и тестувана за способност да експресира хербицид-резистентна протокс активност в 5ASX38. Протокс-1/hemY химерни гени са конструирани с помощта на фузионни PCR техники, последвано от свързване обратно във вектора pBluescript. Изходното изменение е приблизително в средата на протеините. Тези сливания се тестуват за протокс функциониране чрез допълване, и след това се допълват за хербицидна резистентност чрез посяване върху хербицид с интактни Протокс-1 и hemY контроли.
Пример 9
Получаване на хербицид-толерантни растения чрез суперекспресия на растителни протокс гени
За експресия Arabidopsis или царевичен протеин в трансгенни растения, подходящи сДНК с пълната им дължина се инсертират в растителния експресионен вектор pCGN1761 ENX, който е получен от pCGN1761 както следва: pCGN1761 се разгражда при неговия уникален EcoRI сайт, и се присъединява към двойно верижен ДНК фрагмент, включен в два олигонуклеотида от последователността 5’ААТ ТАТ GAT GTA ACG TAG GAA TTA GCG GCCC GCT CTC GAG T3’ (SEQ ID NO: 11) и 5’ AAT TAC TCG AGA GCG GCC GCG AAT TCC TAC GTT ACG TCA T3’ (SEQ ID NO: 12). Полученият плазмид, pCGN1761ENX, съдържа уникални EcoRI, Notl, и Xhol сайтове, които са разположени между удвоения 35S промотор от вируса на мозаичната болест по цветното зеле (Kay et al., Science 236: 1299-1302 (1987)) и 3’ нетранслирани последователности от гена tml на Agrobacterium tumefacience. Този плазмид е разграден и присъединен към фрагмент, получен от разграждане на един от плазмидите с рестрикционни ензими, носещ протокс сДНК, такъв който носи пълната протокс сДНК. От този плазмид е изрязан един Xbal фрагмент, включващ протокс сДНК от Arabidopsis фланкирана от удвоения 35S промотор и 3’ нетранслираните последователности на гена tml от A. tumefaciens. Този Xbal фрагмент е инсертиран в бинарния вектор рС1В200 при неговия уникален Xbal сайт, който е разположен между Т-ДНК гранични последователности. Полученият в резултат плазмид, обозначен като рС1В200 протокс, е трансформиран в щам на A. tumefaciens CIB542. Виж, напр. Uknes et al., Plant Cell 5: 159-169 (1993).
Листни дискове от Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc се инфектират c A. tunefaciens CIB542, който носи pCIB200IGPD както е описано от Horsch et al., Science 227: 1229 (1985). Резистентни на канамицин покълнеци от 15 независими листни диска се прехвърлят в среда за вкореняване, след което се прехвърлят в почвата и получените в резултат растения се развиват до пълна зрелост в оранжерия. Семената от тези растения се събират и посяват в MS агарна среда, съдържаща канамицин. Множество отделни резистентни на канамицин покълнеци от всеки първичен трансформант се култивират до зрелост в оранжерията и техните семена се събират. Тези семена се отглеждат върху агарна среда, съдържаща канамицин.
Растителните линии, които водят до изключително канамицин резистентни покълнеци, са хомоложни на инсертирания ген и се подлагат на по-нататъшен анализ. Листните дискове от всеки от 15-те независими трансгенни линии се изрязват и се поставят върху MS агар, съдържащ различни повишаващи се концентрации от протокс инхибиторен хербицид.
След три седмици, два комплекса от 10 диска от всяка линия се претеглят и резултатите се записват. Трансгентните линии са порезистентни на инхибитора от дивия тип, нетрансформираните растения се подбират за понататъшен анализ.
РНК се екстрахира от листата на всяка такава линия. Общата РНК от всяка независима хомоложна линия, и от нетрансгенните контролни растения, се отделя чрез агарозна гел електрофореза в присъствието на формалдехид (Ausubel et al., Currnt protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, New York (1987)). Гелът се оцветява върху найлонова мембрана (Ausubel et al., supra.) и се хибридизира c радиоактивно белязана Arabidopsis протокс сДНК.
Филтърът се авторадиографира и интензивните РНК ивици, съответстващи на протокс трансгена се откриват във всички хербицид-толерантни трансгенни растителни линии.
За по-нататъшна оценка на резистентността на протокс-суперекспресиращата линия, растенията се култивират в оранжерия и се третират с различни концентрации от протокс-инхибиращ хербицид.
Пример 10
Култивиране на суспензионни култури от клетки на тютюн
Среда:
МХ1: Тази среда се състои от соли на Murashige and Skoog (“MS”, T. Murashige et al., Physiol. Plant. 15: 473-497, 1962) малки соли и Fe-EDTA Gibco # 500-117; 4. 3 g/1), 100 mg/1 мио-инозитол, 1 mg/1 никотинова киселина, 1 mg/1 пиридоксин-HCl, 10 mg/1 тиамин-Hcl, 2-3 g/1 захароза, 0.4 mg/1 2,4-дихлорофеноксиоцетна киселина, и 0.04 mg/1 1 кинетин, pH 5.8. Тази среда се стерилизира чрез автоклавиране.
N6: Тази среда включва микроелементи, макроелементи и Fe-EDTA както е описано от С-С. Chu et al., Scientia Sinica 18: 659 (1975), и следните органични съединения: ПиридоксинНс1 (0.5 mg/1), тиамин-Hcl (0.1 mg/1), никотинова киселина (0.5 mg/Ι), глицин (2.0 mg/Ι) и захароза (30.0 g/Ι). Разтворът се автоклавира. Крайното pH е 5.6.
Бележки: Микроелементите са изготвени като 10 х концентриран разтвор, а щокът от микроелементи като 1000 х концентриран разтвор. Щокът от витамини обикновено се изготвя като 100 х концентриран разтвор.
Суспенсия от култивирани клетки на Nicotiana tabacum, линия S3 [Harms and DiMaio, J. Plant Physiol. 137, 513-519, 1991] се култивира в течна културална среда MX1. 100 mlови Ерленмайерови колби, съдържащи 25 ml среда МХ1, се инокулират с 10 ml от клетъчната култура, предварително култивирана в продължение на 7 дни. Клетките се инкубират на 25 С на тъмно и на орбитален шейкър при 100 rpm (2 cm throw). Клетките се субкултивират в интервали от по 7 дни чрез инокулиране на еднакви проби в прясна хранителна среда, чрез отдекантиране или отпипетиране на около 90% от клетъчната суспенсия, последвано от повторно напълване с прясна среда за получаване на желания обем от суспенсията. 5-8 g от прасната клетъчна маса се продуцират в рамките на 10 дни култивиране от един инокулум от 250- 350 mg клетки.
Пример 11
Получаване на клетъчни култури от тютюн, толерантни на хербицидни протокс инхибитори чрез посяване на клетки върху твърда селекционна среда
Клетките се култивират предварително както в пример 1. Събират се, като бъдат оставени да седиментират, или чрез краткотрайно центрофугиране при 500 х g, и зрялата културална среда се отстранява. След това клетките се разреждат с прясна културална среда за получаване на плътност на клетките, достатъчна за посяване, около 10 000 колонии формиращи единици за ml. За посяване, клетките в малък обем от средата (прибл. 1 ml) се разпръскват по повърхността на твърдата културална среда (MX 1,0. 8% arap), съдържаща желаната концентрация от инхибитора. Около 20 - 30 ml от средата се използват за 10 cm Петриева паничка. Подходящата концентрация на инхибитора се определя от кривата за отговора на дадена доза (пример 14) и е поне двукратно по-висока от 1С50 на чувствителните див тип клетки.
Паничките с културата, съдържащи клетки, разпръснати върху селекционната среда, се инкубират при нормални условия за развитие при 25-28 С на тъмно до формиране на клетъчните колонии. Възникналите клетъчни колонии се прехвърлят в прясна хранителна среда, съдържаща инхибитора в желаната концентрация.
В предпочитана модификация на описания метод, предкултивационната суспенсия от култивираните клетки най- напред се разпръсква в малък обем течна среда на повърхността на твърдата среда. Добавя се равно количество топла течна агарна среда (1.2-1.6% о агар), съхранявана разтопена при около 40 С и паничката внимателно, но незабавно се завърта за разпръскване на клетките върху повърхността на средата и за смесване на клетките с агарната среда преди средата да се втвърди.
Обратно, клетките се смесват с разтопена агарна среда преди разпръскването им върху повърхността на селекционната среда. Този метод притежава преимуществото, че клетките са залети и имобилизирани в тънък слой от твърда среда на повърхността на селекци онната среда. Това позволява по- добра аерация на клетките в сравнение със залетите клетки в целия обем от 20 - 30 ml.
Пример 12
Получаване на клетъчни култури от тютюн, толерантни на хербицидния протокс инхибитор чрез култивиране на клетки в течна селективна среда
Клетъчни култури като тези от пример 10 се инокулират при подходяща плътност на клетките в течна среда МХ1, съдържаща желаната концентрация от хербицидния протокс инхибитор. Клетките се инкубират и растат както в пример 10. Клетките се култивират отново с помощта на прясна среда, съдържаща желаната инхибиторна концентрация след период от 7-10 дни.
В зависимост от използваната инхибиторна концентрация, развитието на клетките може да бъде по-бавно, отколкото при отсъствие на инхибитор.
Пример 13
Получаване на клетки от тютюн с повишени нива на протокс ензима
За получаване на клетъчни култури или калуси с повишени нива на протокс ензима, суспенсионни култури или калуси се прехвърлят поетапно до повишаване концентрациите на хербицидния протокс инхибитор. По-специално, преминава се през следните етапи:
Клетъчните колонии, възникнали от посятите клетки в пример 11 се прехвърлят в течна: N1 среда, съдържаща същата концентрация от протокс инхибитора, както се постъпва при селекцията в пример 11 за формиране на суспенсионни култури. Обратно, подбраните клетъчно културални суспенсии от пример 12 се култивират отново в течна МХ1 среда, съдържаща същата концентрация от протокс инхибитора както при селекцията съгласно пример 12.
Културите се култивират отново 1-20 пъти през седмични интервали и след това се култивират в МХ1 среда, съдържаща следващата по-висока хербицидна концентрация. Клетките се култивират за 1 - 10 субкултури в среда, съдържаща тази по-висока концентрация от хербицида, след което се прехвърлят в МХ1 среда, съдържаща следващата по стойност по-висока концентрация от хербицида.
Обратно, части от подбран калус по пример 11 се прехвърлят върху твърда МХ1 сре да, заместена с желаната хербицидна концентрация. Прехвърлянето в по-висока хербицидна концентрация следва процедурата, описана в предходния параграф с изключение на това, че се използва твърда хранителна среда.
Пример 14
Измерване развитието на клетките в суспенсионни култури в зависимост от дозата хербицид
За получаване на кривата на развитието в зависимост от дозата хербицид, се измерва растежа на клетките при различни концентрации от хербицида. Клетъчно културалните суспенсии от диви тютюневи S3 клетки, чувствителни на хербицидния протокс инхибор и хербицид толерантни селекционирани или трансгенни клетки, предварително се култивира в течна среда както в пример 11 при висока плътност в продължение на 2 - 4 дни. Клетките се промиват отделно от средата и се добавя прясна хранителна среда без хербицид за получаване на желаната клетъчна плътност (около 150 mg PW клетки за ml от суспенсията). Проба от 2.5 ml от клетъчната суспенсия, съдържаща приблизително 250-300 mg FW клетки, след това се инокулира в приблизително 30 ml течна среда с желаната концентрация на хербицида, съдържаща се в Ерленмайерови колби. Внимава се да се инокулира с еднакво количество клетки в една и съща колба. Всяка колба съдържа еднакъв обем среда. 3-6 колби се инокулират с различни концентрации на хербицида, като се започне от нула (= контрола), 0.1 ppb, 0.3 ppb, 1 ppb, 3 ppb, 10 ppb, 30 ppb, 100 ppb, 300 ppb, 1000 ppb, 3000 ppb и 10000 ppb. Различни проби от инокулирани клетки също се взимат по време на инокулирането, за да се определи масата клетки, инокулирани за колба.
След това клетките се инкубират при контролирани условия при 28 С на тъмно за 10 дни. Клетките се събират чрез отливане съдържимото на всяка колба върху дискове от филтърна хартия, прикрепени към вакуумно съоръжение за отстраняване на цялата течност и за получаване на маса от съответно изсушени пресни клетки. Последните се претеглят. Сухото тегло на пробите може да бъде получено след изсушаване.
Клетъчният растеж се определя и експресира в рамките на 10 дни и се изразява като процент относително клетъчният растеж в отсъствие на хербицид съгласно формулата:
(крайната маса на клетки, развивали се в присъствие на хербицид минус масата на инокулума х 100 разделено на крайната маса от клетки, развивали се без хербицид минус масата на инокулума). Стойността на ICJ0ce определя по данните от графиката (относително клетъчната маса срещу хербицидната концентрация). 1С30 определя концентрацията на хербицида, при която растежа на клетките е 50% от контролния растеж (клетките се развиват в отсъствие на хербицид).
В една модификация на метода, няколко парченца от калуса, получени от хербицид резистентна клетъчна култура, както е описано в примери 11 и 13, се прехвърлят върху твърда културална среда, съдържаща различни концентрации от хербицида. Относителен ръст се определя след култивационен период от 2-6 седмици чрез претегляне на парченцата от калуса и сравняването им с контролата в среда без хербицид. Независимо от това, суспенсионният метод се предпочита поради неговата по- висока точност.
Пример 15
Определяне на кръстосана толерантност
За определяне обхвата, при който клетките показват толерантност спрямо аналогични или други хербициди, пример 14 се повтаря при култивиране на клетките при повишени концентрации от подбрани хербициди. Относителният растеж на клетките и тяхната ICJ0 степен се определя за всеки хербицид за сравнение.
Пример 16
Определяне стабилността на хербицид толерантния фенотип във времето
За определяне дали хербицид толерантният фенотип от клетъчната култура се съхранява във времето, клетките се прехвърлят от хербицид съдържаща среда в среда без хербицид. Клетките се култивират, както е описано в пример 10 в отсъствие на хербицид за период от 3 месеца, при подходящи интервали (7-10 дни за суспенсионни култури; 3-6 седмици за калусни (култури). Познато количество от клетки след това се прехвърля обратно в хербицид съдържаща среда и се култивира в продължение на 10 дни (суспенсионни култури) или 4 седмици (калусни култури). Относителния, растеж се определя както в пример 14.
Пример 17
Индуциране и култура на ембриогенен калус от тъкан на скутелума от житни
От самоопрашили се житни растения от инбредната линия Funk 2717 се събират класове 12-14 дни след опрашването. Отстранява се шумата и класовете се стерилизират за около 15 min при разклащане в 20% разтвор от търговския продукт за избелване Chlorox с няколко капки детергент за по-добро овлажняване. След това класовете се изплакват няколко пъти със стерилна вода. Всички по-нататъшни етапи се осъществяват асептично в стерилен въздушен поток. Ембриони с дължина 1.5-2 mm се отстраняват от зърната с шпатула и се поставят с оста надолу в MS културална среда, съдържаща 2,4-дихлорофеноксиоцетна киселина (2,4-D) в количество 2 mg/1 и 3% захароза, втвърдена с 0.24% Gerlite*.
Ембриогенният калус се формира върху скутелумната тъкан от зародиша в рамките на 2-4 седмици от началото на култивирането при около 28 С на тъмно. Калусът се отстранява от експланта и се прехвърля в прясна твърда MS среда, съдържаща 2 mg/1 2,4-D. Субкултивирането на ембриогенния калус се повтаря на седмични интервали. Субкултивират се само части от калуса с ембриогенна морфология.
Пример 18
Подбор на клетъчни култури от зърнени растения, толерантни на хербицидни протокс инхибитори
а) подбор с помощта на ембриогенен калус: Ембриогенен калус от пример 17 се прехвърля в среда за съхранение на калуси, състояща се от среда N6, която съдържа 2 mg/1
2,4-D, 3% захароза и протокс инхибитор при концентрация, достатъчна да задържи растежа, но която не въздейства на ембриогенезата на културата, и се втвърдява с 0.24% Gerlite“. За повишаване честотата на хербицид толерантните мутации, културите могат да бъдат третирани преди селекцията с химичен мутаген, като напр. етилметан сулфонат, или физичен мутаген, напр. UV светлина, при концентрация под концентрацията, при която се наблюдава инхибиране на растежа, както е определена по пример 14. Културите се инкубират на тъмно. След 14 дни калусите се прехвърлят в прясна среда със същия състав. Подлагат се на субкултивиране само култури с желаната ембриогенна морфология, известни като рехав ембриогенен калус с морфология Тип II. Културите се размножават чрез субкултивиране на седмични интервали за две до десет субкултури върху прясна хранителна среда, където се субкултивират само най-бързо развиващите се култури. Бързо развиващите се калуси след това се прехвърлят в среда за съхранение на калуса, съдържаща протокс инхибиторен хербицид при подходяща концентрация както е определено на пример 11. Когато калусът расте добре при дадената хербицидна концентрация, обикновено след около 5 до 10 субкултури, калусът се прехвърля в среда за съхранение, съдържаща трикратно повисока концентрация от инхибитора, и се субкултивира до получаване на добре развиваща се култура. Този процес се повтаря с помощта на среда, съдържаща протокс инхибитор при концентрация 10-кратно по-висока от оригиналната подходяща концентрация, и отново със среда, съдържаща 20-кратно и 40-кратно по-висока концентрация.
След получаване на достатъчно добре развит калус, той се прехвърля в регенерационна среда, подходяща за съзряване на зародиша и за регенерация на растението. Ембриогенният калус, развиващ се върху всяка от хербицидните концентрации, се прехвърля в регенерационна среда.
Ь) Подбор с участието на ембриогенни суспенсионни култури:
Ембриогенни суспенсионни култури от зърнена инбредна линия Funk 2717 се изготвя съгласно пример 24 и се съхранява чрез субкултивиране в седмични интервали в прясна течна N6 среда, съдържаща 2 mg/1 2,4-D. За повишаване честотата на хербицидните толерантни мутации, културите могат същевременно да бъдат третирани с химичен мутаген, напр. етилметан сулфонат, при концентрация под тази, при която може да бъде установено инхибиране, както е определено в пример 14. За селекциониране, културите се прехвърлят в течна N6 среда, съдържаща 2 mg/1 2,4-D и концентрация на инхибитора, достатъчна да забави развитието, но да не въздейства на ембриогенезата на културата. Културите се развиват на шейкер при 120 rpm при 28 С на тъмно. На седмични интервали, хранителната среда се отстранява и се добавя прясна хранителна среда. Културите се разреждат с хранителна среда в съответствие с тяхното развитие за съхраняване на около 10 ml от клетките за 50 ml среда. При всяка следваща субкултура, културите се оглеждат и само бързо растящите от тях с желана рехава морфология се отделят за следващо субкултивиране. След 2 до 10 субкултури в среда N6, културите повишават скоростта на растежа си поне дву- до трикратно повече за всяка седмична субкултура. След това културите се прехвърлят в среда N6, съдържаща 2 mg/1 2,4-D и трикратно по-висока доза от инхибитора в сравнение с използваната отначало. Растящите култури повторно се субкултивират в тази среда за други две до десет субкултури, както е описано по-горе. Бързорастящите култури с желаната рехава ембриогенна молфология се подбират за по-нататъшно субкултивиране. Бързорастящите култури след това се прехвърлят в среда N6, съдържаща 2,4-D и десетократно по-висока концентрация на инхибитора в сравнение с използваната в началото, и процесът на субкултивиране на растящи култури с желана рехава ембриогенна морфология се повтаря за две до 10 субкултури, докато се получат бързорастящи култури. Тези култури след това се прехвърлят в среда N6, съдържаща 2 mg/1 2,4-D и 30кратно по-висока концентрация на инхибитора от използваната в началото.
За регенерация на растенията, от всяка ембриогенна суспенсионна култура, селекционирана с отбелязаното ниво на хербицидна концентрация, културите най-напред се прехвърлят в среда N6, втвърдена с 0.24% GerliteR и съдържаща 2 mg/1 2,4-Du, незадължително, концентрацията на инхибитор, при която културите са се развивали за продуциране на ембриогенен калус. Ембриогенният калус се подлага на субкултивиране в прясна среда за съхраняване на калуси до получаване на достатъчно количество калуси за регенерация. На субкултивиране се подлагат само култури с желаната ембриогенна морфология.
Пример 19
Регенерация на зърнени растения от селекционирани калуси или суспенсионна култура
От селекционирани ембриогенни калусни култури от пример 13 се регенерират растения чрез прехвърлянето им в прясна регенерационна среда. Използваните регенерационни среди са: 0N6 среда, състояща се от среда N6, която не съдържа 2,4-3, или N61, състояща се от 0.25 mg/1 2,4-D и 2,4-D и 10 mg/1 кинетин (6-фурфуриламинопурин), или N62, състояща се от среда N6, която съдържа 0.1 mg/1 2,4-D и 1 mg/1 кинетин, всички втвърдени с 0.24%
GerliteR. Културите се развиват при 28°С на светло (16 h на ден от 10-100 μ Einsteins/m2 sec от флуоресцентни лампи с бяла светлина). Културите се субкултивират всеки две седмици върху прясна хранителна среда. Прорастъците се развиват в рамките на 3 до 8 седмици. Прорастъци с поне 2 cm дължина се отделят от прилежащия му калус и се прехвърля в среда за развиване на корени. Използват се различни среди за развитие на корени. Състоят се от N6 или MS среда, без витамини с обичайното количество соли или със соли, редуцирани до една втора, захароза, редуцирана до 1 g/Ι, и понататък без регулиращи растежа съединения или съдържаща 0.1 mg/l α-нафталеноцетна киселина. След като веднъж корените се развият в достатъчен размер, прорастъците се прехвърлят в поддържаща смес, състояща се от вермикулит, торфено блато и градинска почва. При трансплантирането всички останали калуси се отстраняват, целият агар се изплаква и листата се притискат наполовина, прорастъците се развиват в оранжерия, покривана в продължение на няколко дни с прозрачно пластмасово покривало за запазване на влажността и за растеж в сянка. След аклиматизиране, растенията се пресаждат и се развиват до зрялост. При цъфтеж растенията се опрашват, предимно чрез самоопрашване.
Пример 20
Конструиране на растителни трансформационни вектори
Известни са множество трансформационни вектори за трансформация на растенията и гените по настоящето изобретение могат да бъдат използвани във връзка с който и да е от тези вектори. Подборът на вектори ще зависи от предпочитаната техника за трансформация и видовете, които се цели да бъдат трансформирани. За конкретните видове се предпочитат различни антибиотични или хербицид селективни маркери. Селекционните маркери, които обикновено се използват при трансформация включват гена nptll, който придава резистентността към канамицин и сродни антибиотици (Messing & Vierra, Gene 19: 259-168 (1982); Bevan et al., Nature 304: 184-187 (1983)), генът bar, който придава резистентност към хербицида фосфинотрицин (White etal., Nucl. Acids Res 18: 1062 (1990), Spencer et al. Theor. Appl. Genet 79: 625-631 (1990), генът hph, който придава резистентност спрямо антибиотика хигромицин (Blochinger & Diggelmann, Mol. Cell Biol. 4: 2929-2931), и генът dhfr, който придава резистентност спрямо метотрексат (Bourouis et al., EMBO J. 2(7): 1099-1104 (1983)).
(1) Конструиране на вектори, подходящи за трансформиране на Agrobacterium
За трансформиране на Agrobacterium tumefaciens са подходящи много вектори. Те обик-новено носят поне една Т-ДНК гранична последователност и включват вектори като pBIN19 (Bevan Nucl. Acids Res. (1984)). Подолу е описано конструирането на два типични вектора.
Конструиране на рС1В200 рС1В2001
Бинарните вектори рС1В200 и рС1В2001 се използват за конструирането на рекомбинантни вектори, необходими за трансформиране на Agrobacterium. Постъпва се по следния начин: pTJS75kan се създава чрез разграждане на pTJS75 с Narl (Schmidhauser & Helinski, J Bacteriol. 164: 446-455 (1985)), което позволява изрязването на тетрациклин резистентният ген, последвано от инсерция на едни Accl фрагмент от pUC4K, който носи един NPTII (Messing & Vierra, Gene 19: 259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304: 184-187 (1983); McBride et al., Plant Molecular Biology 14: 266-276 (1990). Линкерите Xhol се лигатират към EcoRV фрагмента от рС1В7, който съдържа лява и дясна Т-ДНК граници, растителен селективен nos/nptil химерен ген и pUC полилинкер (Rothstein et al., Gene 53: 153-161 (1987)), и разграден с Hhol фрагмент се клонира в разграден с Sall pTJS75kan за създаване на рС1В200 (виж също ЕР 0 332 104, пример 19 (1338). рС1В200 съдържа следните уникални полилинкерни сайтове на рестрикция: EcoRI, Sstl, Kpnl, BgHI, Xbal и Sall. pCIB2001 е производно на pCIB200, който е създаден чрез инсерция в полилинкера на допълнителни сайтове на рестрикция. Уникалните рестрикционни сайтове в полилинкера на рС1В2001 са EcoRI, Sstl, Kpnl, BgHI, Xbal, Sall, Mlul, Bell, Avril, Apal, Hpal и Stul. pCIB2001, в допълнение към тези уникални сайтове притежава също и такива за растителна и бактериална канамицинова селекция, лява и дясна ТДНК граници за медиирана от Agrobacterium трансформация, получена от RK2 trfA функция за мобилизация между Е. coli и други гостоприемници, и OriT и OriV функции също от RK2. рС1В2001 полилинкерът е подходящ за клониране от растителни експресионни касети, съдържащи техните собствени регулаторни сигнали.
Конструиране на pCIBlO и техните хигромицин селективни производни
Бинарният вектор pCIBlO съдържа ген кодиращ резистентност спрямо канамицин за селекция в растения, Т-ДНК лява и дясна гранични последователности и включва последователности от дивия гостоприемников плазмид pRK252, който позволява репликацията им както в Е. coli, така и в Agrobacterium. Техните структури са описани от Rothstein et al., Gene 53: 153-161 (1987). Конструирани са различни производни на pCIBlO, които включват гена за хигромицин В фосфотрансфераза, описан от Gritz. et al., Gene 25: 179-188 (1983)). Тези производни позволяват селекция на трансгенни растителни клетки само върху игромицин (рС1В743), или хигромицин и канамицин (pCIB715, pCIB717) [Rothstein et al., Gene 53: 153-161 (1987)].
(2) Конструиране на вектори, подходящи за трансформация, различна от Agrobacterium
Трансформация без използването на Agrobacterium tumefaciens нарушава изискването за Т-ДНК последователности в избрания трансформационен вектор и съответните вектори, в които липсват тези последователности, могат да бъдат използвани в допълнение към вектори, като описаните по-горе, които съдържат Т-ДНК последователности. Трансформационни техники, които не са зависими от Agrobacterium, включват трансформация чрез бомбардиране с частички, протопластно сливане (напр. PEG и електропорация) и микроинжектиране. Изборът на вектора зависи най-вече от предпочитанията за видовете, които следва да бъдат трансформирани. По-долу са описани структурите на някои типични вектори.
Конструиране на рС1В3064 рС1В3064 е получен от вектора pUC, подходящ за директни генни трансферни техники в комбинация със селекция от хербицида баста (или фосфинотрицин). Плазмидът рС1В246 включва промотора CaMV 35S, операционно слят с GUS гена от Е. coli и CaMV 35S транскрибционният терминатор и е описан в заявка за патент по РСТ, публикувана под номер WO 93/07278. Промотора 35S на този вектор съдържа две ATG последователности 5' от из ходния сайт. Тези сайтове са мутирали с помощта на стандартни PCR техники по начин, според който да бъдат отстранени ATG и да бъдат създадени рестрикционните сайтове Sspl и Pvull. Новите сайтове на рестрикция са 96 и 37 Ьр нагоре от уникалния сайт Sall и 101 и 42 Ьр нагоре от актуалния изходен сайт. Полученото в резултат производно на рС1В246 е обозначено рС1В3025. Генът GUS след това се изрязва от рС1В3025 чрез разграждане със Sall и Sacl, краищата им са завършени сляпо и отново са свързани за получаване на плазмида рС1В3060. Плазмидът рЛТ82 е получен от John Innes Centre, Norwick и малкият 400 bp Smal фрагмент, съдържащ гена bar Streptomyces viridochromogenes се изрязва и инсертира в Нра! мястото (сайта) на pCIB3060 (Thompson et al., EMBO J 6: 2519-2523 (1987)). Така се получава pCIB3064, който съдържа генът bar под контрола на промотора CaMV 35S и терминатор за хербицидна селекция, ген за резистентност спрямо ампицилин (за подбор в Е. coli) и полилинкер с уникалните сайтове Sph, Pstl, Hindlll и BamHI. Този вектор е подходящ за клониране на растителни експресионни касети, съдържащи техни собствени регулаторни сигнали.
Конструиране на pSOG19 и pSOG35 pSOG35 е вектор за трансформация, който използва Е. coli генът за дихидрофолат редуктаза (DHFR), като селективен маркер, придаващ резистентността към метотрексат. PCR се използва за амплификация на промотора 35S (~ 800 Ьр), интрон 6 от царевичен Adhl ген ( 550 bp) [Lou et al, Plant J. 3: 393-403, 1993; Dennis et al., Nucl. Acids Res. 12: 39834000, 1984] и 18 bp от GUS нетранслирана лидерна последователност от pSOGlO. 250 bp фрагмент, кодиращ генът за дихидрофолат редуктаза тип П от Е. coli също е амплифициран чрез PCR и тези два PCR фрагмента се комбинират с фрагмента Sacl-Pstl от рВ1221 (Clontech), който включва вектора pUC19 и терминатора за нопалин синтетаза. Комбинирането на тези фрагменти генерира pSOG19, който съдържа промотора 35S във фузия с интронната последователност 6, лидерът GUS, генът DHFR и терминаторът за нопалин синтетаза. Заместването на GUS лидера в pSOG19 с лидерната последователност от вируса на мозаичната хлороза по царевицата (MCMV) води до получаване на вектора pSOG35. pSOG19 и pSOG35 носят гена pRC за ампицилинова резистентност и притежават сайтовете Hindlll, Sphl, Pstl и EcoRI, подходящи за клониране на чужди последователности.
pSOG 10 5
Този β-глюкуронидазен (GUS) вектор на експресия е получен от плазмида рВ1121, закупен от Clontech Laboratories, Palo Alto, California. Интронът 6 от царевичния Adhl ген е маплифициран чрез PCR от плазмида р428, описан в Bennetzen et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 81: 4125-4128 (1987), c помощта на олигонуклеотидните праймери SON0003 и SON0004.
SON0003: 5'-CTCGGATCCAGCAGATTCGAAGAAGGTACAG-3’
SON0004: 5’-ACGGGATCCAACTTCCTAGCTGAAAAATGGG-3’
Продуктът от PCR реакцията се разгражда с рестрикционната ендонуклеаза BamHI, разцепвайки BamHI сайта, добавен в 5' края на всеки PCR праймер. Полученият в резултат ДНК фрагмент се пречиства върху агарозен гел и се лигатира в BamHI сайта на рВ1121, който е разположен между CaMV35S промотора и гена GUS. Присъединената по този начин ДНК се трансформира в Е. coli и се клонира с Adhl интрона 6 в същата ориентация, както е установено с рестрикционен анализ за гена GUS.
pSOG 19
Този хидролат редуктазен (DHFR) експресионен вектор е получен чрез фузия на 35S промотор и Adhl интраон 6 от pSOG 10 към DHFR ген от плазмида рНСО, описан в Bourous and Jarry, EMBOJ. 2: 1099-1104 (1983). Промоторът 35S и Adhl интрон 6 са получени чрез PCR амплификация на фрагмента от pSOGlO с помощта на праймерите SON0031 и SON0010.
SON0031: 5’-CATGAGGGACTGACCACCCGGGGATC-3’
SON0010: 5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’
Полученият в резултат фрагмент е кон- DHFR кодиращият участък е получен струиран с рестрикционни ендонуклеази Pstl и чрез PCR амплификация на рНСО с помощта BspHI и е пречистен върху агарозен зел. на праймерите SON0016 и SON0017.
SON0016: 5’-GCTACCATGGCCACATAGAACACC-3’
SON0017: 5’-CGAGAGCTCGCACTTCAACCTTG-3’
Полученият в резултат фрагмент е конструиран с рестрикционните ендонуклеази Nsol и Sacl и пречистен върху агарозен гел.
Двата фрагмента, описани по-горе са свързани във векторен фрагмент, изготвен от рВП 21 чрез разграждане с рестрикционните ендонуклеази Pstll и Sacl и пречистен върху 3 kb фрагмента, съдържащ Nos терминиращ участък и pUC19 участъка от рВИ 21 върху агарозен гел. Това трипосочно свързване слива 35S промотор - Adhl интрон 6 - DHFR ген-NOS терминатора в правилна посока и ориентация за функционална експресия в растения.
pSOG 30
Този GUS експресионен вектор е получен от pSOG 10 чрез инсерция на лидера от вируса на мозаичната полест по царевицата (MCMV), описан в Lommel et al., Virology 181: 382-385 (191), в 35S-GUS ген нетранслирания лидер чрез трипосочно свързване.
Синтезират се и се линеаризират двете вериги на 17 bp MCMV капсидна протеинова лидерна последователност плюс подходящи места на рестрикционни ендонуклеази. Полученият в резултат двойно верижен фрагмент се разгражда с BamHI и Ncol и се пречиства върху акриламиден гел.
Кодиращият участък на GUS гена се амплифицира чрез PCR с помощта на праймерите SON0039 и SON0041 и рВН 21 като мат45 рица.
SON0039: 5’-CGACATGGTACGTCCTGTAGAAACCCACA-3’ SON0041: 5’-ATCGCAAGACCGGCAACAGGATTC-3’
Тези праймери добавят един Ncol сайт към 5'-края на GUS и Sacl сайт към 3’ края на GUS. Полученият в резултат фрагмент се разгражда с рестрикционни ендонуклеази Ncol и Sacl и се пречиства върху агарозен гел.
GUS генът се отстранява от плазмида pSOG 10 чрез разграждане с рестрикционната ендонуклеаза Sacl и частично разграждане с рестрикционна ендонуклеаза BamHI. Полученият в резултат вектор, който притежава BamHI и Sacl сайтовете, в които да се реинсертира кодиращ участък зад 35S промотор - Adhl интрон 6, се пречиства върху агарозен гел.
Тези три описани по-горе фрагмента се свързват в трипосочна връзка за получаване на генно сливане със структурата: 35S промотор - Adhl интрон 6 - MCMV лидер - GUS Nos терминатор, всички в структурата на вектора pUC19.
pSOG 35
DHFR селективният маркерен вектор е идентичен на pSOG 19, с изключение на това, че MCMV лидерът е инсертиран в нетранслирания лидер на DHFR гена за усилване на транслацията. Той е създаден в два етапа. Първо GUS кодиращият участък в pSOG32, вектор идентичен на pSOG30 с изключение на това, че съдържа модифициран Adh промотор вместо 35S, се замества с DHFR кодиращ участък от pSOG 19 чрез изрязване на GUS с Ncol и Sacl и присъединяване в DHFR като един Ncol-Sacl фрагмент. Това води до получаване на вектор pSOG33, който притежава генната структура Adh промотор - Adhl интрон 6MCMV лидер - DHFR кодиращ участък - Nos терминатор, с Bglll сайт между промотора и интрона и Sacl сайт между кодиращия участък и терминатора. Фрагментът Bglll-Sacl се изолира чрез разграждане с рестрикционни ендонуклеази и пречист-ване на агарозен гел, и се присъединява в BamHI и Sacl местата от pSOG30, замествайки Adhl интрон Z6-MCMV лидер-GUS кодиращият участък от pSOG30 с Adhl интрон 6-MCMV лидер-DHFR кодиращ участък от pSOG33.
Пример 21
Конструиране на растителни експресионни касети
Гениите последователности, които са предназначени за експресия в трансгенни растения, най-напред се събират в експресионни касети зад подходящ промотор и нагоре от подходящ транскрибционен терминатор. Тези експресионни касети след това лесно могат да бъдат прехвърлени в растителни вектори за експресия, описани по-горе в пример 19.
Подбор на промотори
Изборът на промотора, използван в експресионните касети, ще определи пространството и преходността на образеца на експресия на трансгена в трансгенното растение. Избраните промотори ще експресират трансгени в специфични клетъчни типове (като листни епидермални клетки, мезофилни клетки, коренови кортикални клетки) или в специфични тъкани или органи (корени, листа или цветове, напр.) и тази селекция ще се отрази на желаното локализиране на експресията на трансгена. Обратно, избраният промотор може да насочи експресията на гена под светлинно-индуциран или друг временно регулиран промотор. Друга алтернатива е тази избраният промотор да бъде химически регулиран. Това би предоставило възможността от включване на експресия на трансгена само когато е желателно и е причинено от въздействие с химичен агент.
Транскрибционни терминатори
Множество транскрибционни терминатори са подходящи за приложение в експресионните касети. Те са отговорни за терминиране на транскрибцията зад трансена и неговата правилна полиаденилация. Подходящи транскрибционни терминатори са онези, които са известни, че функционират в растенията и включват терминатора CaCV 355, tml терминатор, нопалин синтетазния терминатор и терминатора rbcS Е9 от грах. Те могат да бъдат използвани както в едносемеделни, така и в двусемеделни растения.
Съгласуване за усилване или регулиране на експресията
Установено е за много последователности от транскрибционната единица, че усилват генната експресия и поради което могат да бъдат използвани заедно с гените от настоящето изобретение за повишаване експресията им в трансгенни растения. Например, установено е, че интроните от царевичния Adhl ген значително повишават експресията на природния ген под неговия сроден промотор при индуциране в царевични клетки. Установено е, че интрон 1 е особено ефективен и повишава експресията при сливане на структури с хлорамфеникол ацетилтрансферазния ген (Callis et al., Genes
Develop. 1: 1183-1200 (1987)). В същата експериментална система, интронът от царевичния bronzel ген притежава сходен ефект при повишаване на експресията (Callis et al., supra). Интронните последователности са включени по рутинен начин в растителните вектори за трансформация, обикновено с нетранслирания лидер.
Известни са множество нетранслирани лидерни последователности, получени от вируси, за повишаване на експресията, и те са особено ефективни в клетки на двусемеделни. По-специално, показано е, че ефективни за повишаване експресията са лидерни последователности от вируса на мозаичната болест по тютюна (TMV, “W-последователност”), вируса на мозаичната болест по царевицата (MCMV) и вируса на мозаичната болест по люцерната (AMV) (напр. Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15: 86938711 (1987); Skuzeski et al. Plant Molec. Biol. 15: 65-79 (1990)).
Насочване на гениите продукти към вътрешността на клетките
Известно е, че в растенията съществуват множество механизми за насочване на гениите продукти и в известна степен са охарактеризирани и последователностите, контролиращи функционирането на тези механизми. Например, насочването на гениите продукти към хлоропластите е контролирано от сигнална последователност, намерена при аминокрая на различни протеини и който е разцепен по време на импорта на зрелия продукт от хлоропласта (напр. Comai et al. J. Biol. Chem. 263: 15104-15109 (1988)). Тези сигнални последователности могат да бъдат сляти към хетероложни генни продукти за осъществяване импорта на хетероложните продукти в хлоропласта (van den Broeck et al., Nature 313: 358-363 (1985)). ДНК кодираща подходящите сигнални последователности могат да бъдат изолирани от 5' края на сДНК, кодиращи протеините RUBISCO, CAB, EPSP синтетазният ензим, протеина GS2 и много други протеини, за които е известно, че са локализирани в хлоропластите.
Други генни продукти са локализирани в други органели, като напр. митохондриите и пероксизомите (напр. Unger et al., Plant Molec. Biol. 13: 411-418 (1989)). сДНК, кодираща тези продукти могат също да бъдат манипулирани, за да въздействат на насочването на хетероложни генни продукти към тези органели. Примери за подобни последователности са яд рено-кодираните АТФази и специфичните аспартат амино трансферазни изоформи за митохондриите. Насочването към клетъчни протеинови тела е описано от Rogers et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 82: 6512-6516 (1985).
Охарактеризирани са и други последователности, които причиняват насочването на гениите продукти към други клетъчни части. Аминокрайните последователности са отговорни за насочване към ER, апопласта и екстрацелуларното секретиране от алеуронови клетки (Koehler & Но, Plant Cell 2: 769-783 (1990)). В допълнение, аминокрайни последователности, заедно с карбоксикрайни последователности са отговорни за вакуоларното насочване на генни продукти (Schinski et al., Plant Molec. Biol. 14: 357-368 (1990)).
Чрез сливане на подходящите насочващи последователности, описани по-горе, към желани трансгенни последователности, става възможно да бъде насочен генният продукт към която и да е органела или клетъчен отдел. За насочване към хлоропласта например, хлоропластна сигнална последователност от гена RUBISCO, гена САВ, синтетазният ген EPSP, или GS2 гена, се слива с в рамката на аминокрая ATG от трансгена. Избраната сигнална последователност следва да включва познат сайт на разцепване, а при сливането трябва да се има предвид всяка аминокиселина след сайта на разцепване, които са необходими за целта. В някои случаи това изискване може да бъде изпълнено чрез добавяне на малко количество аминокиселини между сайта на разцепване и трансгена ATG или обратно, чрез заместване на някои аминокиселини вътре в трансгенната последователност.
Сливанията, създадени за хлоропластен импорт могат да бъдат тествани за ефективността на хлоропластно потребление чрез in vitro транслация на in vitro транскрибирани структури, последвано от in vitro хлоропластно потребление с техниките (описани от Bartlett et al. In; Edelmann et al. (Eds.) Methods in Chloroplast Molekular Biology, Elsevier, pp 1081-1091 (1982); Wasmann et al. Mol. Gen. Genet. 205: 446-453 (1986)). Тези техники са добре познати на специалистите в областта и са еднакво приложими за митохондрии и пероксизоми. Изборът на насочването, необходимо за експресия на трансгените, зависи от клетъчната локализация на необходимия пре курсор като изходен пункт за конкретния цикъл на обмяна. Тя обикновено е цитозолна или хлоропластна, макар в някои случаи да е митохондриална или пероксизомна. Продуктите на трансгенна експресия обикновено не изисква насочване към ER, апопласта или вакуолата.
Описаните по-горе механизми на клетъчно насочване може да бъде използвано не само заедно с техни сродни промотори, а също и заедно с хетероложни промотори така, че да въздейства на специфичното клетъчно насочване под транскрибционно регулиране на промотор, който има експресионен образец различен от промотора, от който се получават сигналите за насочването.
Пример 22
Трансформация на двусемеделни растения Трансформационни техники за двусемеделни растения са добре известни на специалистите в областта и включват основани на Agrobacterium техники и техники, които не изискват Agrobacterium. He-Agrobacterium техниките включват потребление на екзогенен генетичен материал директно от протопластите или клетките. Това може да бъде осъществено чрез PEG или медиирано от електропорация потребление, разпределение чрез частично бомбардиране, или микроинжектиране. Примери за такива техники са описани от Paszkowski et al., EMBO J. 3: 2717-2722 (1984), Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199: 169-177 (1985), Reich et al., Biotechnology 4: 1001-1004 (1986), and Klein et al., Nature 327: 70-73 (1987). Във всеки случай трансформираните клетки са регенерирани до цели растения с помощта на известни в областта стандартни техники.
Медиираната от Agrobacterium трансформация се предпочита за трансформация на двусемеделни поради високата ефективност на трансформацията и широката приложимост върху много и различни видове. Много зърнени видове са рутинно трансформируеми с Agrobacterium, включително тютюн, домати, памук, картофи, соя, люцерна и топола (ЕР 0 317 511 (памук), ЕР 0 249 432 (домати, Calgene), WO 87/07299 (Brassica (зеле), Calgene), US 4 795 855 (топола)). Трансформацията с Agrobacterium обикновено включва трансфера на бинарния вектор, носител на желаната чужда ДНК (напр. рС1В200 или рС1В2001) в подходящ щам Agrobacterium, което може да е в зависимост от комплементните vir гени, носени от гостоп риемниковия щам Agrobacterium както в коезидентен Ti плазмид, така и хромозомно (напр. щам CIB542 за рС1В200 и pCIB2001 (Uknes et al. Plant Cell 5: 159-169 (1993)). Трансферът на рекомбинантния бинарен вектор в Agrobacterium се осъществява от трипарентална процедура на съзряване с помощта на Е. coli, носещ рекомбинантния бинарен вектор, хелперен Е. coli щам, който носи плазмид като pRK2013 и който е способен да мобилизира рекомбинантния бинарен вектор да насочи щама Agrobacterium. Обратно, рекомбинантният бинарен вектор може да бъде прехвърлен в Agrobacterium чрез ДНК трансформация (Hofgen & Willmitzer, Nucl. Acids Res. 16: 9877 (1988)).
Трансформирането на растителните видове чрез рекомбинантен Agrobacterium обикновено включва едновременно култивиране на Agrobacterium-a с експланти от растенията и следва протоколи, добре известни в областта. Трансформираните тъкани се регенерират върху селективна среда, носеща антибиотика или маркера за хербицидна резистентност, присъстващ между бинарните плазмидни Т-ДНК граници.
Пример 23
Трансформация на едносемеделни растения
Трансформацията на повечето едносемеделни видове растения вече също е рутинно. Предпочитани техники включват директен генен трансфер в протопласти с помощта на PEG или електропорационни техники, и частично бомбардиране в калусни тъкани. Трансформации могат да бъдат предприети с отделни ДНК видове или множество ДНК видове (напр. котрансформация) и тези две техники са подходящи за използване съгласно настоящето изобретение. Ко-трансформацията може да има преимуществото да заобиколи векторната структура и да генерира трансгенни растения с несвързани локуси за желания ген и за селективния маркер, позволявайки отстраняването на селективния маркер в последващи генерации, което следва да бъде считано като желано. Но недостатък на този метод е получаването на по-ниска от 100% честота на интеграция на отделни ДНК видове в генома (Schocher et al. Biotechnology 4:1093-1096 (1986)).
Патентните описания ЕР 0 292 435 (на Ciba-Geigy), ЕР 0 392 225 (Ciba-Geigy) и WO 93/07278 (Ciba-Geigy) описват техники за по лучаване на калус и протопласти от елитни инбредни линии царевица, трансформация на протопласти с помощта на PEG електропорация, и регенерация на царевични растения от трансформираните протопласти. Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603-618 (1990) and Fromm et al., Biotechnology 8: 833-839 (1990) са публикували техники за трансформация на получена от А188 царевична линия с помощта на частично бомбардиране. Нещо повече, описание WO 93/07278 (Ciba-Geigy) and Koziel et al., Biotechnology 11:194-200 (1993) описват техники за трансформация на елитни царевични линии чрез частично бомбардиране. Тази техника използва незрели царевични зародиши с
1.5-2.5 mm дължина, изрязани от царевичен клас 14-15 дни след опрашването и PDS - ЮООНе съоръжение Biolistics за бомбардиране.
Трансформирането на ориз може да бъде осъществено чрез директни ген трансферни техники с участието на протопласти или частично бомбардиране. Протопластмедиираната трансформация е описана за типовете Japonica и типовете Indica (Zhang et al., Plant Cell Rep 7: 379-384 (1988); Shimamoto et al. Nature 338: 274-277 (1989); Datta et al. Biotechnology 8: 736-740 (1990)). Двата типа са също рутинно трансформируеми с помощта на частично бомбардиране (Christou et al., Biotechnology 9: 957962 (1991)).
Патентно описание ЕР 0 332 581 (Ciba Geigy) описва техники за продуциране, трансформация и регенерация на протопласти на Pooideae. Тези техники позволяват трансформирането на Dactylis и пшеница. Нещо повече, трансформирането на пшеница е описано от Vasil et al., Biotechnology 10: 667-674 (1992)) и частично бомбардиране на клетки от типа С с продължително регенериращ се калус и също Vasil et al., Biotechnology 11: 1553-15558 (1993)) и Weeks et al., Plant Physiol. 102M 1077-1084 (1993) c помощта на частично бомбардиране на незрял ембрион и незрял получен от зародиша калус. Предпочитаните техники за трансформация на пшеница, обаче, включват трансформиране на пшеницата чрез частично бомбардиране на незрял зародиш и включва високо захарозен или високо малтозен етап преди доставянето на гена. Преди бомбардирането ембриони (0.75-1 mm), независимо от броя им, се посяват в среда MS с 3% захароза (Murashige & Skoog, Physiologya Plantarum 15: 473-497 (1962)) и 3 mg/1 2,4-D за индуциране на соматични зародиши, които се оставят да престоят на тъмно. В деня, избран за бомбардиране, зародишите се отделят от индукционната среда и се поставят върху осмотична среда (напр. индукционна среда с добавени захароза или малтоза в съответно желана концентрация, обикновено 15%). Зародишите се оставят да плазмолизират в продължение на 2-3 h и след това се бомбардират. Типичното количество е двадесет зародиша за паничка, но това количество не е критично. Един подходящ плазмид, носещ ген (като рС1В3064 или pSG35) преципитира върху микрометърни златни частици с помощта на стандартни процедури. Всяка паничка с ембриони се бомбардира със съоръжение на DuPont Biolistics с помощта на ударно налягане от “1000 psi и стандартен екран с 80 отвора. След бомбардирането, зародишите се поставят обратно на тъмно за възстановяване за около 24 h (все още осмотично). След 24 h, ембрионите се отстраняват от осмотичната и се поставят в индуктивна среда, където стоят около месец преди регенерацията. Приблизително месец по-късно ембрионалните експланти с развит ембриогенен калус се прехвърлят в регенерационна среда (MS + 1 mg/1 NAA, 5 mg/1 GA), понататък съдържаща подходящ селекционен агент (10 mg/Ι баста в случая на pCIB3064 2 mg/1 метотрексат в случая на pSOG35). След приблизително един месец, развитите покълнеци се прехвърлят в по-големи стерилни контейнери, известни като “GA7s”, които съдържат MS, 2% захароза и същата концентрация от селекционния агент. Патентно описание 08/ 147161 описва методи за трансформация на пшеница и е включен в приложената литературна справка.
Пример 24
Подбор на растителни протокс гени, резистентни на протокс-инхибиторни хербициди в експресионна система на Е. coli
Плазмидът pWDC-4, кодиращ царевичен хлоропластен протокс ензим, се трансформира в щам XLl-Red, резултат на случайна мутагенеза (Stratagene, La Jolla, СА).
Трансформантите се посяват на среда L, съдържаща 50 g/ml ампицилин и се инкубират в продължение на 48 h при 37 С. Полетата с трансформирани клетки се изстъргват от паничките и плазмидната ДНК се изготвя с помощта на кит Wizardd Megaprep (Promega, Madison, WI). Плазмидната ДНК, изолирана от този щам се предполага, че съдържа приблизително 2000 нуклеотида (виж Greener et al., Strategies 7(2): 32-34 (1994)).
Мутиралата плазмидна ДНК се трансформира в hemG мутант SASX38 (Sasarman et al., J. Gen. Microbiol. 113: 297 (1979) и се посява върху среда L, съдържаща 100 g/ml ампицилин и същата среда, съдържаща различни концентрации от протокс-инхибиращ хербицид. Паничките се инкубират в продължение на 2-3 дни при 37 С. Плазмидната ДНК се изолира от всички колонии, които растат в присъствие на хербицидни концентрации, които ефективно убиват дивия щам. Изолираната ДНК след това се трансформира в SASX38 и се посява отново върху хербицид за потвърждение на това, че резистентността е с плазмиден произход.
Мутиралата pWDC-4 плазмидна ДНК отново се изолира от резистентни колонии и протокс кодиращата последователност се изрязва чрез разграждане с EcoRI и Xhol. Изрязаната протокс кодираща последователност след това се реклонира във вектора pBluescript, който не е подлаган на мутация и отново се тестува за резистентност на протокс-инхибиращ хербицид по същия начин, като е описано погоре.
Този процес елиминира некодиращи секвенционни мутации, които придават резистентност като свръхпромоторни мутанти (т.е. мутанти, чиято резистентност се дължи на мутации, причиняващи експресия на немодифициран протокс) и оставя само мутанти, чиято резистентност се дължи на мутации в протокс кодиращите последователности. Определя се ДНК последователността за всички вероятни хербицид-толерантни протокс гени, идентифицирани посредством този процес и се идентифицират мутации чрез сравняване с дивия тип pWDC-4 протокс последователността.
С помощта на процедурите, описани погоре, е установена устойчива мутация, която превръща С в Т при нуклеотиди 498 в pWDC-4 последователност (SEQ ID No. 5). Тази промяна превръща GCT кодон за аланин при аминокиселина 166 (SEQ ID No. 6) в GTT кодон за валин и води до протокс ензим, който е поне 10Х по-устойчив на протокс-инхибиращ хербицид в бактериални проби. pMzC-lVal, в pBluescript SK вектор, е депозиран в Agricultural Research Culture Collection на 30 септември, 1994 и е обозначен pWDC-8, с депозитен номер NRRL #21340.
Същата методика е използвана за скрининг на хербицид-резистентни форми на Arabidopsis протокс-1 ген в различни вектори. Установена е една устойчива мутация С в Т като изменението е в нуклеотид 689 в pWDC-2 последователността (SEQ ID No. 1); този плазмид е означен pAraC-lVal. Това изменение е идентично на pMzC-lVal мутанта по-горе, превръщащ GCT кодон за аланин при аминокиселина 220 (SEQ ID No. 2) в GTT кодон за валин при съответната позиция в Arabidopsis протокс протеинова последователност.
Втори устойчив ген съдържа едно изменение А в G при нуклеотид 1307 в pWDC-2 последователността (SEQ ID No. 1); този плазмид е означен pAraC-2Cys. Това изменение превръща ТАС кодона за тирозин при аминокиселина 426 (SEQ ID No. 2) в TGC кодон за цистеин. Съответният тирозинов кодон в царевичната протокс - 1 последователност при нуклеотидна позиция 1115-1117 (SEQ ID No. 5; аминокиселинна позиция 372 от SEQ ID No. 6) може по същия начин да бъде подложен на мутация за получаване на хербицид резистентна форма за този ензим.
Трети резистентен мутант притежава G в А изменение при нуклеотид 691 в последователността pWDC-2 (SEQ ID No. 1); този плазмид е означен като pAraC-3Ser. Тази мутация превръща GGT кодон за глицин при аминокиселина 221 (SEQ ID No. 2) в един AGT кодон за серин при кодонова позиция съседна на мутацията при рАгаС-1. Съответстващият глицинов кодон в царевичната протокс-1 последователност при нуклеотидна позиция 497-499 (SEQ ID No. 5; аминокиселинна позиция 167 от SEQ ID No. 6) може по сходен начин да мутира за получаване на хербицид резистентна форма на този ензим.
Всички описани по-горе мутации водят до получаване на протокс ензим, който е поне 10Х по-устойчив на протокс-инхибиращ ензим в бактериалната проба.
pAraC-2Cys, в pFL61 вектора, е депозиран на 14 ноември 1994 под означението pWDC7 в Agricultural Research Culture Collection и му е даден депозитен номер NRRL # 21339N.
Пример 25
Допълнителни хербицид-резистентни кодонови замествания в позиции, идентифицирани при случаен скрининг
Аминокиселините, идентифицирани като хебицид резистентни места при случайния скрининг се заместват от други аминокиселини и се тестват за функциониране и за хербицидна толерантност в бактериалната система. Олигонуклеотид-насочена мутагенеза на Arabidopsis протокс-1 последователност се осъществява с кит на Clontech, Palo Alto, СА, наречен Transformer Site-Directed Mutagenesis. След потвърждаване на промените в аминокиселините чрез секвенционен анализ, мутиралите плазмиди се трансформират в SASX38 и се посяват върху среда L-атр100 за тестване за функционалност и върху различни концентрации от протокс-инхибиращ хербицид за тестване на толерантността.
Тази процедура се прилага при кодона за аланин при нуклеотиди 688-690 и при кодона за тирозин при нуклеотиди 1306-1308 от Arabidopsis протокс последователността (SEQ ID No. I). Полученият резултат показва, че аланиновият кодон при нуклеотиди 688-690 може да бъде изменен в кодон за валин, треонин, левцин или цистеин за получаване на хербицид-резистентен протокс ензим, който съхранява функционалността си. Резултатите показват още, че тирозиновият кодон при нуклеотиди 1306-1308 могат да бъдат изменени в кодон за цистеин, изолевцин, левцин, валин или треонин за получаване на хербицид-резистентен протокс ензим, който съхранява функционалността си.
Пример 26
Демонстрация на устойчива кръстосана толерантност, резултат от мутация, спрямо различни протокс-инхибиращи съединения
Устойчиви мутантни плазмиди, подбрани за резистентност спрямо отделен хербицид, се тестват срещу спектър от други протоксинхибиращи съединения. Резистентни мутантни плазмиди в SASX38 се посяват и изследват за способност да оцеляват в концентрации от всяко съединение, които са поне 10-кратно по-високи от леталните концентрации за SASX38 щам, съдържащ дивия тип плазмид.
Резултатите от тестването за кръстосана толерантност показват, че всяка от установените мутации допринася за толерантността спря мо различни протокс инхибиращи съединения. По-специално, резултатите показват, че 1) AraCl-Val мутациите водят до резистентност спрямо протокс инхибитори, включително, но без да се ограничава до тези с формули IV,
XI, XII, XIV, XV и XVII;
2) Ara-Cys мутацията придава резистентност спрямо протокс-инхибитори включително, но без необходимост от ограничение до тези с формули XI, XIII, XV и XVII; 3) MzClVal мутацията придава резистентност спрямо протокс инхибитори включително, но без да се ограничава до тези с формули XI, XII, XIII, XIV, XV, XVI и XVII; 4) AraC-3Ser мутацията придава резистентност спрямо протокс инхибитори включително, но без да се ограничава до бифенокс и тези с формули IV,
XII, XIII, XIV, XV и XVII.
Пример 27
Получаване на хербицид толерантни растения чрез суперекспресия на растителни протокс гени
Arabidopsis протокс-1 кодиращите последователности от дивия тип и резистентните AraC-1 Vai гени се изрязват чрез частично разграждане с EcoRI и Xhol и се клонират в pCGN1761ENX растителен експресионен плазмид. Експресионните касети, съдържащи 2X35S-npoTokc генни фузии, се изрязват чрез разграждане с Xbal и клонират в бинарния вектор рС1В200. Тези бинарни протокс плазмиди се трансформират чрез електропорация в Agrobacterium и след това в Arabidopsis с помощта на вакуум инфилтрационния метод (Bechtold et al., 1993). Трансформантите се селекционират върху канамицин и Т2 поколението се генерира от множество независими линии. Това поколение се посява върху среда GM, съдържаща различни концентрации протокс-инхибиращ хербицид и се наблюдава за развитие и оцеляване. Множество трансгенни линии, суперекспресиращи както дивия тип, така и устойчивия мутантен протокс продуцират значително количество зелени покълнеци върху хербицидни концентрации, които са летални за празна векторна контрола.
Различни модификации на изобретението, описани тук, са очевидни за специалиста в областта и влизат в обхвата на патентните претенции.
СЕКВЕНЦИОНЕН ЛИСТИНГ (1) ОБЩА ИНФОРМАЦИЯ:
(i) ЗАЯВИТЕЛ:
(A) ИМ& СОВА- GEIGY AG (B) УЛИЦА: Klybeekstr. 141 (C) ГРАД: Basel (E) ДЪРЖАВА: Switzerland (F) ПОЩЕНСКИ КОД (ZIP): 40X2 (G) ТЕЛЕФОН: +4161 & 1111 (X) ТЕЛЕФАКС: +4161696 79 76 (I) ТЕЛЕКС: 962991 (и) НАИМЕНОВАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО: МАНИПУЛИРАНЕ НА ПРОТОПОРФИРИНОГЕН СКСИДАЗНАТА ЕНЗИМНА АКТИВНОСТ В ЕУКАРИОГИЧНИ ОРГАНИЗМИ (iii) БРОЙ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ: 20 (fr) КОМПЮТЪРНО ЧИТАЕМА ФОРМА (A) СРЕДЕН КЛАС: флори gucfc.
(B) КОМПЮТЪР: ШМ PC coujMtibte (C) ОПЕРАТИВНО СИСТЕМА PC- DOS/ MS- DOS (D) СОфТУЕР: РяЬийп Release #1*0, Vertion # 1.2S (EPOJ (2) ИНФОРМАЦИЯ 3A SEQ ID NO 1:
(ix) ХАРАКТЕРИСТИКА:
{А) ИМЕ,· КЛЮЧ: CDS (В) ЛОКАЛИЗАЦИЯ; 31. 16*4 (t>) ДРУГА ИНФОРМАЦИЯ: /Забележки = “AraWdopm, ргстол-1 сДШЬ последователност от pWDC- 2* i»l ОПИСАНИЕ НА ПОСлЕДОвЛТЕАПОСГТЛ SEQ (D NO: 1:
TGACMAATT ОССЛЛТТСТС TGOGWTTCC AIG GAC TTA ТСТ CTT СТС OGT CQG 54
Mac Glu Leu Ser leu leu Arg Pro
5
ACG | ACT | CAA | TOG | CTT | CTT | COG | TCG | TTT | TCG | AAG | CCC | AAT | CTC | CGA | TTA | 102 |
Thr | Thr | Gin | Ser | Lau | leu | Pro | Ser | Phe | Ser | lye | Pro | Asn | Leu | Arg | leu | |
10 | 15 | 20 | ||||||||||||||
AAT | GTT | TAT | AAG | CCT | CTT | AGA | CTC | COT | TOT | TCA | GTG | GCC | GGT | GGA | CCA | 150 |
Asn | val | iyr | Lys | Pro | Ltu | Arg | leu | Arg | eye | Ser | Vai | AU | Gly | Gly | Pro | |
25 | 30 | 35 | 40 | |||||||||||||
ACC | src | GGA | TCI | TCA | ада | ATC | 6ЛА | GGC | GGA | GGA | GGC | ACC | AOC | ATC | ADG | 198 |
Thr | V*1 | Gly | Ser | Ser | Lys | He | Glu | Gly | Gly | Gly | Gly | Thr | Thr | lie | Thr | |
45 | 50 | 55 | ||||||||||||||
ACS | GAT | TOT | GTG | ATT | GTC | GGC | GGA | GCT | ATT | AST | GGT | CTT | TGC | ATC | GOT | 246 |
Thr | A3P | Cys | Vai | ZU | Vai | Gly | Gly | Gly | XU | Sec | Gly | Leu | CyS | He | AU | |
GO | «5 | 7D |
CAG GCG CTT ACT AC AAG CAT OCT SAT GCT GCT ODG AAT ΤΙΛ ATT GTG 294
Gin | Ale | Lau | AU | Thr | Lys | H13 | Pro | Asp | Ala | AU | Pro | Asn | leu | He | Val | |
75 | SO | 85 | ||||||||||||||
ACC | GAG | GCT | AAG | GAT | OCT | OTT | GGA | GGC | AAC | ATT | ATC | ACT | CGT | GM | GAG | 342 |
thr | Glu | Ale | Lys | Asp | Arg | Vai | Gly | Gly | Asn | He | lie | Thr | Arg | Glu | Glu | - |
90 | 95 | 100 | ||||||||||||||
AAT | GGT | TTT | CTC | TGG | GM | GM | GGT | ooc | MT | AGT | TTC | CM | COG | TOT | GAT | 390 |
Asn | Gly | Phe | leu | Trp | Glu | Glu | Gly | Pro | Asn | Ser | Phe | Gin | Pro | Ser | Asp | |
105 | 110 | 115 | 120 | |||||||||||||
CCT | ATC | CTC | ACT | ASG | GIG | CTA | GAT | ACT | GGT | TTG | AAG | GAT | GAT | TTG | GTG | 438 |
Pro | Met | Leu | Thr | Met | Vai | Vai | Asp | Ser | Gly | Leu | Itfs | AS₽ | Asp | leu | val | |
125 | 130 | 135 | ||||||||||||||
TTG | GGA | GAT | CCT | ACT | GOG | CCA | ASS | TTT | GTG | TIG | TGG | AAT | GHS | AAA | TTG | 485 |
leu | Gly | ASp | Pro | Thr | AU | Pro | Arg | Phe | val | leu | Tq> | АЗП | Gly | lys | Leu | |
140 | 145 | 150 | ||||||||||||||
AGS | COG | GTT | OCA | TCG | AAG | CTA | ACA | GAC | TTA | CCS | TTC | TTT | GAT | TIG | ATG | 534 |
Arg | Pro | val | Pm | Ser | Lys | leu | Thr | Asp | leu | Pro | Phe | phe | Asp | Leu | Met | |
155 | 160 | 165 |
ACT | AIT | GGT | GGG | MG | ATT | AGA | GCT | GGT | TTT | GGT | GCA | CTT | GGC | ATT | QGA |
Ser | Xie | Gly | Gly | LyS | lie | Arg | Ala | Gly | Phe | Gly | Ala | Leu | Gly | lie | Ar? |
170 | 175 | 180 | |||||||||||||
CCG | TCA | OCT | OCA | GGT | CGT | GAA | GAA | TCT | GIG | GAG | GAG | TTT | GTA | OGG | CGT |
Pro | Ser | Pro | Pro | Gly | Arg | Gin | Glu | Ser | va) | Glu | Glu | phe | Vai | Arg | Arg |
185 | 190 | 19S | 208 |
AAC CTC GGT | GAT GAG GTT TTT GAG CGC CIG ATT GM COG TTT TGT TCA | 67R | |||
Asn | Leu Gly | Asp Glu Vai Phe Glu Arg Leu lie Glu | Pro phe Cys Ser 215 | ||
205 | 210 | ||||
GCT | GTT TAT | GOT GGT GAT CCT | TCA. AAA CTG AGC ATG | AAA GCA GOG TIT | 726 |
Gly | Vai Tyr | Ala Gly Asp PrO | sor т.уз i«u Ser net | Lya Ala Ala Phe | |
220 | 225 | 230 | |||
GGG | AAG GIT | TGG AAA CTA GAG | CAA AAT GGT GGA A3C | ATA ATA GGT GCT | 774 |
Gly | Lys val | Trp Lys Leu Glu | Gin Aan Gly Gly Ser | lie lie Gly Gly | |
235 | 240 | 245 | |||
ACT | TTT AAG | GCA ATT CAG GAG | AGG AAA AAC GCT OOC | AAG QCA GAA OGA | 022 |
ihr | Vhe Lys | Ala lie Gin Glu | Arg Lys Asn Ala Pro | Lys Ala Glu 'Arg | |
250 | 255 | 260 | |||
GAC | COG CGC | CTG CCA AAA CCA | CAG GGC CM ACA GTT | GCT TCT TTC AGG | 070 |
А.ЯВ | Pro Arg | Leu Pro Lys Pro | Gin Gly Gin Thr Vai | Gly Ser Phe Arg | |
265 | 270 | 275 | 280 | ||
?AG | GGA CTT | CGA ATG TTG CCA | GAA GGA ATA TCT GCA | AGA TTA GCT ACC | 91B |
Gly Leu | Arg Met Leu Pro | Glu Ala lie Sex Mj | 'jpg Leu Gly Ser | ||
285 | 290 | 295 | |||
AAA | GTT AAG | TTG TCT TGG AAG | CTC TOA GGT ATC ACT | AAG CTG GAG AGO | 96$ |
Lys | Vai Lys | Leu Ser Trp Lys | Leu Ser Gly He Thr | lys Leu Gin Ser | |
300 | 305 | 31Ό | |||
GGA | GGA TAC | AAC TTA ACA TAT | GAG ACT OCA GAT GGT | TTA GTT TOC GTG | 1014 |
Gly Gly Tyr | Asn Leu Thr Tyr Glu Thr Pro Asp Gly | Leu Val Ser Val | |||
31S | 320 | 325 | |||
CAG | AGC AM | ACT GTT GTA ATG ACG GTG CCA TCT CAT GTT GCA ACT GGT | 1062 | ||
Gin | Ser lys | Ser val Val Met Thr val Pro Ser Bis val Ala Ser Gly | |||
330 | 335 | 340. | |||
CTC | TTG CGC | CCT CTT TCT GAA TCT OCT GCA AM GCA СТС TCA AAA CTA | 1110 | ||
Leu | Leu Arg | Pro Leu Ser Glu | Ser Ala Ala Aan Ala | Leu Ser lys leu | |
345 | 350 | 355 | 360 | ||
TAT | TAC CCA | CCA GTT GCA GCA | CTA TCT ATC TOG TAC | CCG AM GM GCA | 1158 |
Tyr | Tyr Pro | Pro Vai Ala Ala | Vai Ser He Ser Tyr | Pro Lys Glu Ala | |
365 | 37D | 37S | |||
ATC | OGA ACA | GAA TGT TTG ATA | GAT GGT GAA CTA AAG | GCT TTT GGG CM | 1206 |
He | Arg Thr | Glu Cys Leu lie Asp Gly Glu Leu lys | Gly Phe Gly Gift | ||
380 | 385 | 390 | |||
TTG | CAT OCA | CGC ACG CAA GGA | GTT GAA ACA TTA GGA | ACT ATC TAC AGC | 1254 |
Leu | His Pro | Axg Thr Gin Gly | val Glu Thr Leu Gly | Thr lie Tyr Ser | |
39b | 400 | 405 |
гсс тса сте ттт сс* *лт сте <зс* ав occ «за ма лтт ттб ехе тго1302
Sei Ser Leu Phe Pro Ann Arg Ala Pre Pro Gly Arg lie Leu Zen Leu <10 <15<20
АЙС TAD AIT GOT GQ3 TCT АСА AAC ADC GGA ATI CIG TOT AAG TCI GAA1350
Asn Tyr lie Gly Gly Ser Thr Asn Thr Gly Li· Leu Ser Lys SerGlu
425 430 435440
GET GAG TIL OTG GAA GCA GTT GAD АБА GAT ТИЗ MSG AAA ATG СТА ЯТТ1398
Gly Glu Leu Val Glu Ala Val Aap Arg Asp Leu Ang Lye Met leuHe
445 450455
MGCC7AATTOSJeCGATCCACTTA*ATTftGSAGTrAOGffTATGGCCT 144« lys Pro Анп. Ser Thr Asp Pro Leu Lys leu Gly V*1 Arg Val Trp Pro
4« - 465470
CAAGOCATTCCTCAGTITCTAGntSGTCACTTTaTATCCTTGACACG 1494 Gin Л1А lie Pro Gin Phe Leu Val Gly His Phe Asp lie Leo Asp Thr
475 440485
GCT АЛД ТСА ТСГ CFA ACS 7CT TOO GGC ТДС GAA GGG CTA TO TIG GOT1542
Aia LyS Ser sex LUU Thr Ser sex Gly Tyr Glu Gly Leu Phe leu Sly
490 495500
GOT АЛТ ТЛС OTC OCT GOT OTA GCC ТГА GOT COT TOT OTA GAA GOT Ga1S90
Gly А4П Tyr val Ala Gly val Ala Leu Gly Arg Сул Val Glu GlyAla
505 510 515520
TAT GAA ADC GOG АТГ SMS OTC AAC AAC TTC MEG TOA CTS ®C SOT TAG1638
Tyr Glu Thr Ala lie Glu Val Asn Aan Phe Met Ser Arg Tyr AlaTyr
535 530S35
AAG TAAAEOTAAA Л£ЖПАААТС TOCCllGCTTG OGIGROTTTT КПАААТЖГГ1891 hys
TKSAGATATC CAAAAAAAAA AAAAAAAA1719 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ Ю NQ1 (0 С2КВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА: 537 амино Киселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: дшмярм (и) МОЛЕКУЛЕН ТИП: дретеим (*ϋ ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:2:
wet Clu Leu Sfi-r »<*: r-ju Ar·.: Pro Thr Thr Gin se? Jeu Leu Pte Ser
6 lb
Phe | Ser | Lye | Pro | Asn | Leu | Arg | Leu | Asn | Vai | Tyr | Lys | Pro | Leu | Arg | Leu |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Arg | Cys | Ser | Vai | Ala | Gly | Gly | Pro | Thr | Vai | Gly | Ser | ser | I#3 | lie | Glu |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Gly | Gly | Gly | Gly | Thr | Thr | lie | Thr | Thr | Asp | Cys | Val | lie | Val | Gly | Gly |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Gly | lie | Ser | Gly | Leu | cys | He | Ala | Gin | Ala | Leu | Ala | Thr | Lys | His | Pro |
65 | 70 | 75 | 50 | ||||||||||||
Agp | Ala | Ale | Pro | АЗП | Leu | lie | Vai | Thr | Glu | Ala | Lys | Asp | Arg | Val | Gly |
05 | 90 | »5 | |||||||||||||
Gly | Mn | lie | lie | Thr | Arg | Glu | Glu | ASn | Gly | Phe | Leu | Trp | Glu | Glu | Gly |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Pro | Asn | Ser | Phe | Gin | Pro | Ser | Asp | Pro | Met | Leu | Thr | Met | v&l | Val | Asp |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Ser | Gly | leu | Lye | Asp | Asp | Leu | val | Leu | Gly | Asp | Pro | Thr | Ala | Pro | Arg |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Phe | val | Leu | Trp | Asn | Gly | Lye | leu | Arg | Pro | val | Pro | set | Lys | Leu | Thr |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
ASP | Leu | Pro | Phe | Phe | Asp | Leu | wee | Sex | lie | Gly | Gly | Lys | lie | Arg | Ala |
165 | l?0 | 175 | |||||||||||||
Gly | Phe | Gly | Ala | Leu | Gly | He | Arg | Pro | Ser | Pro | Pro | Gly | Arg | Glu | Glu |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Ser | Val | Glu | Glu | Phe | Vfcl | Arg | Arg | Asn | leu | Gly | ASp | Glu | val | Phe | Glu |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Arg | Leu | lie | G1U | Pro | Phe | Cys | Sex | Gly | Vai | Tyr | Ala | Gly | Asp | Pro | Ser |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
LyS | Leu | Ser | Met | Lys | Ala | Ala | PM | Gly | Lys | Val | Trp | Lys | Leu | Glu | Gin |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Asn | Gly | Gly | Ser | lie | lie | Gly | Gly | Thr | Phe | Lys | Ala | He | Gin | Glu | Arg |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Ly3 | Asn | Ala | Pro | Lys | Ala | Glu | Arg | Mp | Pro | Arg | Leu | Pro | Lys | Pro | Glh |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Gly | Gin | Thr | val | Gly | Ser | Phe | Arg | LyS | Gly | Leu | Arg | Met | Leiu | Pro | Glu |
275 | 280 | 285 |
Ala He Sex Ala Arq 1-jn Gly Sec Lys Vai I.ys Leu Ser lip Lye Leu 290 295 300
Ser Gly lie Tlir Lys Ιχϊυ Glu Ser Gly Gly Tyr Asn L@u Thr Tyr Glu 305 310 315 320
Thr | Pro | Asp | Gly | Leu | Val | Ser | Val | Gin | Ser | Lys | ser | vol | Val | Mat | Thr |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
VW | Pro | Ser | His | val | Ala | Ser | Gly | Leu | Leu | Arg | pro | Lev | Ser | Glu | Ser |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Ala | Ala | Asn | Ale | Leu | Ser | Lys | Leu | Tyr | Tyr | Pro | pro | val | Ala | Ala | Val |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Ser | lie | Ser | Tyr | Pro | Lys | Glu | Ala | He | Arg | Thr | Glu | Cye | teu | He | Asp |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Gly | Glu | LSU | LyS | Gly | Phe | Gly | Gin | Leu | His | Pro | Ax? | Thr | Gin | Gly | Val |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Glu | Thr | Lev | Gly | Thr | lie | Tyr | Sex | Ser | Ser | Lev | Phe | Pro | Asn | Ax? | Ala |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Pro | Pro | Gly | Arg | He | Leu | Leu | Leu | Asn | Tyr | He | Gly | Gly | Ser | Thr | Asn |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Thr | Gly | He | Leu | Ser | Lys | Ser | Glu | Gly | Glu | Leu | Val | Glu | Ala | Val | Asp |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Arg | Asp | Leu | Ax? | Lya | Met | LUu | He | lya | Pro | Asn | Ser | Thr | Asp | Pro | LSU |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Lys | leu | Gly | VW. | Ax? | %1 | Trp | Pro | Gin | Al* | lie | Pro | GlJl | Phe | Leu | val |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Gly | ΗΪ9 | Pte | Asp | lie | Leu | Aap | Thr | Ala | Lys | Ser | Ser | Leu | Thr | Ser | Ser |
455 | 490 | 495 | |||||||||||||
Gly | Tyr | Glu | Gly | Leu | Phe | Leu | Gly | Gly | Asn | Tyr | Val | Ala | Gly | Val | Ala |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
Leu | Gly | Arg | Cys | Val | Glu | Gly | Ala | Tyr | Glu | Thr | Ala | lie | Glu | Val | ASn |
515 | 520 | 52S | |||||||||||||
Asn | Phe | мес | Ser | Arg | Tyr | Ala | Tyr | LyS | |||||||
530 | 535 |
;2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 3:
(i)
ЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ (A) ДЪЛЖИНА: 1738 gBoflku бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСГ: едвоверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: ливеариа (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (iii) ХИПОТЕТИЧНОСГ: не (iv) БЕЗСМИСЛЕНОСТ: не (ix) ХАРАКТЕРИСТИКА:
(A) ИМЕ/КЛЮН: CDS (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: 70... 1596 (D) ДРУГА ИНФОРМАЦИЯ: / мбележка= *Arabidopsis porctox- 2 сДНК; посЛдовашелйасш cnijjWDC- 1* ix'i) Описание U-й, пос(\едрьс|Тсь^осТТа . ΐ© IUO?0 ? ТТТГГГАСТТ АТГГСССтСА CTGCTTTOGA CTCGTCAGAG ATTTTGACTC TGAATTOITG60
CAGATAGCA ATC QQG ТСГ GGA GCA GTA GCA GAT CAT CAA ATT GAA GOGIQS
Mat Ala Ser Gly Ala V&1 'Ala Asp itjs Uln He GLu Ala
I 51C
GIT | •iCA | GGA | AAA | AGA | GTC | GCA | gtc | GTA | GOT | GCA | GGT | GTA | AST | GSA | CTT | 156 |
vai | Sex | Gly | Lys | Axg | val | Ala | Val | Val | Gly | Ala | Gly | Val | Ser | Gly | leu | |
15 | 20 | 25 | ||||||||||||||
Gog | GOG | GCT | TAC | AAG | TTG | AAA | TCS | AGG | GCT | TTG | AAT | GTC | ACT | GTC | Ϊ7Τ | 204 |
Ala | Ala | Ala | Tyr | Lye | Leu | Lys | Ser | Arg' | Gly | Leu | Asn | Val | Thr | val | phe | |
30 | 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Gaa | GCT | GAT | GGA | AGA | GTA | GCT | GGG | AAG | TTG | AGA | AGT | GTT | ATC | CM | AAT | 25? |
Glu | Ala | Asp | Gly | Arg | Val | Gly | Gly | Lys | Leu | Arg | Sex | vai | Wat | Gin | Asn | |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
GGT | TTG | ATT | TOG | GAT | Gaa | GGA | GCA | AAC | ACC | ATG | ACT | GAG | GCT | GAG | CCA | 300 |
Gly | leu | Tie | Tzp | Asp | Glu | Gly | Ala | Asn | Thr | Met | Tbr | Glu | Ala | Glu | ExO | |
65 | TO | 75 | ||||||||||||||
GAA | Gn | G3G | ACT | ΊΤΑ | CTT | GAT | GAT | CTT | GGG | CTT | CGT | GAG | AAA | СЛЛ | <3A | 346 |
Glu | val | Gly | Ser | Leu | Leu | ASP | ASp | Leu | Gly | tea | Arg | Glu | LyS | Gin | Gin | |
BQ | S5 | 90 | ||||||||||||||
ΊΤΤ | CCA | ATT | TCA | CAli | AAA | AAG | COG | TAT | ATT | CTG | CGG | AAT | GGT | GTA | OCT | 396 |
Phe | F/Q | 71« | Ser | Lys | Lys | Arc | Ty* | He | Val | Arg | АЯЛ | Gly | val | Pxu | ||
IGO | J05 |
GTG | ATG | CTA CCT | ACC | AAT | CCC ATA GAG CTC CTC | ACA | act | AGT | GTC CTC | 444 | ||
va) | Met | Leu | Pro | Thr | AS:i | Pro lie Gly Usu val | Thr | Ser | Ser | Val | Leu | |
tic | 115 | 120 | 125 | |||||||||
TCT | ACC | QAA TCT | AAG | TTT | CAA ATC TTG TTG GAA | CCA | m | TTA | TGG | AAG | 492 | |
Ser | Thr | Gin | ser | Lyu | Phe | Gin He Leu Leu Glu | Pro | Phe | Leu | Trp | Lys | |
130 | 135 | 140 | ||||||||||
AAA AAG | TOC | TCA | AAA | GTC | тел gat era tct oct | GAA | GAA | AGT | GTA | AGC | 540 | |
Lys Lys | Sex | Ser | LyS | val | Ser ASp Ala Ser Ala | Glu | Glu | Ser | Val | Sex | ||
:45 | 150 | 155 | ||||||||||
GAG | TTC | TTT | CAA | CGC | CAT | TTT GGA CM GAG GTT GTT GaC | TAT | CTC | ATC | 588 | ||
Glu | Phe | Phe | Gin Arg | His | Phe Gly Gin Glu V&l | Val | Asp ТУГ | Leu | Tie | |||
160 | 165 | 170 | ||||||||||
GAC | OCT | TIT | GIT | GGT | GGA ACA AGT GCT GOG GAC | OCT | GAT | TCC | CTT | TCA | 636 | |
A3p | РГО | Phe | Vai | Gly | Gly Thr Ser Ala Ala Asp | Pro | ASp | ser | Leu | Ser | ||
175 | 180 | 185 | ||||||||||
ATG AAG | CAT | TCT | TTC | OCA GAT CTC TGG MT GTA | (ЗЙ | AM | AGT TTP | GGC | 684 | |||
Mat | LyS | Mi л | Ser | Phe | pro Asp Leu Trp Asn Vai | Glu | lys | Sex Phe | Gly | |||
190 | 195 | 200 | 205 | |||||||||
TCT | ATT | ΑΈΛ | GTC | GGT | GGA | ATC ASA ACA AAG TTT | OCT GCT | AAA GGT | GGT | 732 | ||
Ser | He | lie | Vai | Gly | Ala | lie Arg Thr Lys Phe | Ala AU | Lyg Gly Gly | ||||
210 | 215 | 220 | ||||||||||
AAA | AGT | AGA | GAC | ACA | aAG | AGT TCT OCT GGC ACA | AAA AAG | GGT | TOG | OGT | 780 | |
Lys | Ser | Arg Asp | Thr | Lys | Ser SOr Pro Gly Thr | Lys Lys | Gly | Ser | Arg | |||
225 | 230 | 235 | ||||||||||
GGG | TCA | TTC TCT | TTT | AAG | GGG 6® ATG CAG ATT | CTT OCT | GAT ACG | TTG | 828 | |||
Gly | Ser | Phe Ser | Phe | Lys | Gly Gly Met Gin lie | leu | Pro | Asp | Thr | Leu | ||
240 | 245 | 250 | ||||||||||
TGC | AAA AGT | CTC | TCA | CAT | GAT G№ ATC AAT TEA GAC | TCC | AAG GTA | CTC | 876 | |||
Cys | Dps | Ser | Leu | Ser | His | Asp Glu lie Asn Leu | Asp | Ser | I#S | val | Leu | |
255 | 260 | 265 | ||||||||||
TCT | TTG | TCT | TAC | AAT | TCT | GO TCA AGA CAG GAG | AAC | TGG | TCA | TTA TCT | 924 | |
ser | Leu | Ser Tyr | ASH | Ser | Gly Ser Arg Gin Glu | Asn | Trp | Ser | Leu | Sex | ||
2Щ | 275 | 280 | 285 | |||||||||
TCT | GTT | TOG CAT | AAT GAA ACG CAG AGA CAA AAC | OOC | CAT | TAT | GAT GCT | 972 | ||||
Cys | Vai | Ser | His | Азп | Glu | Thr Gin Arg Gin Asn | Pro | HiS | Tyr | Asp Ala | ||
290 | 295 | 300 | ||||||||||
GTA ATT | ATG | ACG | GCT | OCT | CTG TGC MT GTC AAG GAG | ATG | AAG 6П ATG | 1020 | ||||
Vai | lie | Met | Thr | Ala | Pro | Jeu Cys Asn Val Lys Glu | Met | Lys Val Met | ||||
305 | 310 | 315 |
АЛА GGA GGA CAA СОС TTT CAG СТЛ AAC Lye Gly Gly Gin Pro Phe Gin Leu Asn 320325 atg αχ стс tog етт тгл лтс лсс аса
Het Pro Leu Ser Val Leu lie Thr Thr
335340
AGA CCT CTT GM GGC TTT O3G GIA CTC Atg Pro Leu Glu Gly Phe Gly Val Leu 350355
CAT GGT TTC AAA ACT CTA GOT ЛСА CTT His Gly Phe l^s Thr T^t Gly Thr Ltu 370
GAT OCT TCC CXT ACT GAC GTT CAT CTA Asp Arg Ser Pro Ser Asp Val Hi 5 Lou 385390
AGT AGG AAC CAfi GAA OTA GCC AAA GCT SOr Arg Asn Gin Glu Leu Ala Lys Ala 400405
GTT GTG ACT TCT GAC CTT CAG OGA CTG Val Vai Thr Ser Asp Leu Gin Arg Leu 415420
GTG TCT GTC AAC CAT TAG TAT TGG AGG Val Ser Val Asn His Tyr Tyr Tip Arg 43043b
AGC AGC TAT GAC TCA GTC ATG GAA GCA Ser Ser Tyr Asp Ser val Mat Glu Ala 450
CTA OCT GGG TTC TTC TAT GCA GOT AAT Leu Pro Gly Phe Phe Tyr Ala Gly Asn 465470
GGG AAA TCA ATA GCA TCA GOT TGC AAA Gly Lys Ser lie Ala Ser Gly Cys Lye 480485
TAC CTG G№ TCT TGC TCA AAT GAC AAG 1603
Tyr Ix*u Glu Ser Cys Ser Адо Asp Lys 495500
TTT CTC CCC GAG ATT AAT TAC | 1060 |
Phe leu Pro Glu lie Asn Tyr | |
330 | |
TTC ACA AAG GAG AAA OTA AAG | 1116 |
Phe Thr Lys Glu Lys Val lys 343 | |
ATT CCA TCT AAG GAG CAA AAG | 1154 |
lie Pro Ser Lys Glu Gin Lyg 360 365 | |
TTT ТСЛ TCA ATG ATG TTT CCA | 1212 |
Phe Sor Ser Het Mat Phe Pro 375 380 | |
TAT >£A ACT TTT ATT GGT GGG | 1260 |
Tyr Thr Thr Phe He Gly Gly 395 | |
TCC ACT GAC GAA TTA AAA CAA | 1308 |
Ser Thr Лзр Glu Leu Lys Gin 410 | |
TTG GGG GTT GAA GGT GAA CCC | 1356 |
Leu Gly val Glu Gly Glu Pro 425 | |
AAA GCA TTC COG TTG TAT GAC | 1404 |
Lys Ala Phe Pro Leu Tyr Asp 440 445 | |
AIT GAC AAG ATG GAG AAT GAT | 1452 |
lie Asp Lys Met du Aan Asp 455 460 | |
ατ CGA GOG GOG CTC TCT GTT | 150Q |
his Arg Gly Gly Leu Ser val 475 | |
GCA GCT GAC CTT GTG ATC TCA | 1548 |
Ala Ala Asp Leu Val Xie Ser 490 | |
AAA CCA AAT GAC AQC ТГЛ TAACATIGTC Lya Pro Asti Asp Ser Leu 5D5 |
AAGGrrOSTC ССГПТТАТС ACTTACTTTG TAAACTTGrA AWGCMCA AGCCGCOGTG J 663
OGATTAQCCA ACAAGTCAGC AAAACCCAGA ТТСТСАТААЙ GCICaCTAAT ’ГСГАЙААТАА 1723
ACTATTTATG ТЛЛМ (2) ИНФОРМАЦ ИЯ ЗА SEQ Ю N04;
<ij СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАЕСШРИСГИЮк (A) ДЪЛЖИНА: 508 «мшю киселини (B) ТИП: Шшю киселина (D) ТОПОЛОГИЯ: шнмрш (и) МОЛЕКУЛЕН ТИП: npotmeuu (») ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ГО NO: 4:
Met | Ala | Ser | Gly | Ala | val | Ala | Asp | Я13 | Gin | He | Glu | Ala | val | Ser | Gly |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Ly«t | Atg | val | Ala | Val | Val | Gly | AU | Gly | Val | Ser | Gly | Leu | Ala | Ala | Ala |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Tyr | Lys | i-eu | LyS | Ser | Arg | Gly | Leu | МП | Val | Thr | Vol | Phe | Glu | Ala | Asp |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
C-ly | Arg | val | Gly | Gly | Lys | Leu | Arg | Ser | Val | Met | Gin | Asn | Gly | Leu | lie |
SO | 55 | 50 | |||||||||||||
Ttp | Glu | Gly | Ma | A30 | Tiir | ker. | -n-L | •:;1 u | Λ.:ζ.| | G& | Glu | Val | Gly | ||
G5 | 70 | 7 b | so | ||||||||||||
Ser | Leu | Leu | Asp | Asp | Leu | Gly | LCu | Arg | Glu | Lys | Gin | Gin | Phe | Pro | Xie |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
S6r | Gin | Lys | Lys | Arg | Tyr | lie | Vai | Arg | Asn | Gly | Val | Pro | Val | Met | Leu |
loo | 105 | 1W | |||||||||||||
Pro | Thr | Asn | Pro | Ila | Glu | Leu | val | Thr | Ser | sax | val | Leu | ser | Thr | Gin |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Ser | Lys | Phe | Gin | lie | Leu | Leu | Glu | Pro | Phe | Iau | Trp | lys | Lya | Lys | Ser |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Ser | Lys | val | ser | Asp | Ala | Ser | Ala | Glu | Glu | Ser | Val | Ser | GLu | Phe | Phe |
150 | 155 | 160 | |||||||||||||
Gl n | Arg | His | phe | Gly | Gin | Glu | Val | v$l | ASp | Tyr | Leu | lie | Asp | Pro | Phe |
165 | L?0 | 175 | |||||||||||||
val | Gly | Gly | Thr | Ser | Ala | Ala | Asp | Pro | Asp | Ser | i^eu | Ser | Net | LyS | His |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Ser | Phe | Pro | Asp | Leu | Trp | Mu | Val | Glu | Lys | Ser | Phe | Gly | Ser | He | I1C |
195 | 200 | 205 | |||||||||
val | Gly Ala lie Arg Thr | LyS | Pile | Ala Ala | LyS | Gly Gly Iya | Ser Arg | ||||
210 | 215 | 220 | |||||||||
Asp | Thr | Lys Ser | Ser Pro | Gly | Thr | lys Lys | Gly | Ser | Arg Gly | Ser Phe | |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||
Sex | Phe | Lys Gly Gly Met | Gin | lie | Leu Pro | Asp | Thr | Leu cys | Lys Ser | ||
245 | 250 | 255 | |||||||||
Leu | Ser | His | Asp | Glu lie | АЗП | Leu | Asp Ser | Lys | vw | Leu Ser | Leu Ser |
260 | 265 | 270 | |||||||||
Tyr | Aan | Ser | Gly | Ser Arg Gin Glu | Asn Trp | Ser | Leu | Sex Cys | val Ser | ||
275 | 280 | 285 | |||||||||
His | Asn | Glu | Thr | Gin Arg | Gin | Asn | Pro His | iyr | Asp | Ala Val | He Met |
290 | 295 | 300 | |||||||||
Thr | Ala | Pre | Leu | Cys Asn | Val | Lys | Glu Met | lya | VW- Met Lys | Gly Gly | |
3Q5 | 310 | 315 | 320 | ||||||||
Gin | Pro Phe | Gin | leu Asn | Phe | leu Pro Glu | lie | ASn | Tyr Met | Pro Leu | ||
325 | 330 | 335 | |||||||||
Ser | val | leu | He | Thr Thr | Phe | Thr | Lys Glu Lys | Val | lys Arg | Pro Leu | |
340 | 345 | 350 | |||||||||
Glu Gly Ph· Gly | Val Leu | He | Pro | Ser Lys Glu Gin | LyS HiA Gly Phe | ||||||
355 | 300 | 365 | |||||||||
Lys | Thr | Leu Gly | Thr Leu | Phe | Ser | Ser Net | Met | Phe Pro Asp | Arg Ser | ||
370 | 375 | 380 | |||||||||
Pro | Ser | Asp val | His Leu | Tyr | Thr | Thr Phe | lie Gly Gly Ser | Arg Asu | |||
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||
Gin | Glu | Leu Ala | Lys Ala | Ser | Thr | Asp Glu | Leu | Lys | Gin Val | Val Thr | |
405 | 410 | 415 | |||||||||
Ser | Asp | Leu Gin | Arg Leu | Leu | Gly | val Glu Gly | Glu | Pro Val | Ser Val | ||
420 | 425 | 430 | |||||||||
Asn | His | Tyr Tyr Trp Arg Lys | Ala | Phe Pro | Leu | Tyr | Asp Ser | Ser туг | |||
435 | 440 | 445 | |||||||||
ASp | Ser | val | Met | Glu Ala | He | ASp | Lys Met | Glu | Asn | Asp leu | Pro Gly |
450 | 455 | 460 | |||||||||
Phe | Phe | Tyr Ala Gly ЛЗП | His | Azq Gly Gly | LCu | ser | Val Gly | Lys Ser | |||
4€S | 470 | 475 | 4Θ0 |
Ϊ1« Ala Ser Gly Cys lys Ma Ala Asp Leu Vai Xie Ser Tyr Leu Glii 48$ 490 495
Sec Cya Ser Asn Asp lys Ly* Pro Asn Asp Ser Lee
500 505 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO 5:
(1) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА: 16№ gBcflku бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСГ. едновершкиа (D) ТОПОЛОГИЯ: линеярна (Й) МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК (ΐϋ) ХИПОТЕТИЧНОСЕ не (hr) БЕЗСМИСЛЕНОТО не (ix) ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ИМЕ/КЛЮЧ; CD5 (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: 2... 1453 (D) ДРУГА ИНФОРМАЦИЯ: /забелажка- “царевичен протокс-1 сДНК ( е непълна дължина); последователност от pWDC- 4 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ П> NO: 5:
G АКТ TOG GOG ОС TOC GTC GIG GIG GGC GGA GGC ATC W GGC CTO 46
Asn Ser Ala Asp Cys Vai val VS1 Gly Gly Gly lie Ser Gly leu 15 10 15
TGC | ADC | GOG | CAG | GOG | CTG | GCC | MX» | OGG | СЛС | GGC | GIC | GGG | GAC | GIG | CIT |
cys | Thr | Ala | Gin | Ala | Leu | Ala | The | AX9 | His | Gly | VW | Gly | Asp | Vai | Leu |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
GIC | AOG | GAG | GOO | CGC | GOC | OGC | CQC | GGC | GOC | AAC | ATT | ACC | MX | GTC | GAG |
Vai | Thr | Glu | Ala | A«G | Ala | Arg | Pro | Gly | Gly | АЗП | lie | Thr | Thr | Vai | Glu |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
CGC | ccc | GAG | GM | GGG | TAC | CTO | TOG | GAG | GAG | GGT | CCC | AAC | ADC | TTC | CAS |
Μς | Pro | G1U | Glu | Gly | Tyr | Leu | Trp | Glu | Glu | Gly | Pro | Asn | Ser | Phe | Gin |
SO | 55 | 60 | |||||||||||||
сос | TOC | GAC | CCC | GTT | СГС | ACC | ATO | QOC | GTO | GAC | AGO | QGA | CIC | AAG | GAT |
Pro | Ser | Mp | Pro | Vai | Leu | Thr | Met | Ma | v«l | Asp | Ser | Gly | Leu | LyS | Asp |
£5 | 70 | 75 |
GAC | TTG | GIT | ТТГ | GOG | GAC | CCA | AMT | GOG | CCG | OCT | TIC | GTG | CTG | TGG | GAS | 286 |
Asp | Leu | V&1 | Phe | Gly | Asp | Pro | Asn | Ala | РГО | Arg | Phe | Val | Leu | Tip | Glu | |
80 | 85 | 90 | 93 | |||||||||||||
GGG | AAG | CTG | MSG | CCC | GTG | CCA | TOC | AAG | CCC | GOC | GAC | CTC | COG | TTC | tic | 334 |
Gly | Lya | Leu | Arg | Pro | Val | Pro | Ser | tya | Pro | Ala | ASp | leu | Pro | Phe | Phe | |
Ida | 105 | 110 | ||||||||||||||
GAT | CIC | ATG | AfiC | ATC | CCA | GGG | AM! | crc | AfiG | GOC | Θ3Τ | CTA | GGC | GOG | CTT | 382 |
Asp | Leu | Met | Ser | Xie | Fro | Gly | Lpa | leu | Ala | Gly | Leu | Gly | Ala | leu | ||
115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
GGC | ATC | CGC | COG | OCT | oct | CCA | GGC | CGC | GM | GAG | ГСА | GTG | ras | GAG | TTC | 430 |
Gly | Xie | AX? | Pro | Pro | Pro | Pro | Gly | Arg | Glu | Glu | Ser | val | Glu | Glu | Phe | |
130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
GTG | CGC | CGC | AAC | arc | GGT | GCT | GAS | GTC | ГСТ | GMS | CGC | CTC | ATT | OCT | 478 | |
val | Arg | Ar? | A*n | Xeu | Gly | Ala | Glu | Val | Phe | Glu | Arg | Leu | lie | GLU | Pro | |
145 | 150 | 155 | ||||||||||||||
TIC | TGC | TEA | GOT | GTC | TAT | GCT | GOT | GAT | OCT | TCT | AAG | CTC | AGO | ATG | AMS | 526 |
Phe | Cys | Ser | Gly | Val | туг | Ala | Gly | Aap | Pro | Ser | Lye | Leu | Ser | Met | tya | |
160 | 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
GCT | OCA | TTT | GGS | A№ | GET | TCG | OGG | TIG | GM | GM | ACT | GGA | GOT | MOT | ACCT | 574 |
Ala | Ala | Ph· | Gly | LyS | vai | Tip | Arg | Lau | Glu | Glu | Thr | Gly | Gly | Ser | lie | |
180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
An- | GGT | GGA | ACC | ATC | AAG | ACA | ATT | CAG | GAG | MSG | AGC | AAG | AAT | CCA | AM | 622 |
ile | Gly | Gly | Thr | Ils | Lys | Thr | Ila | Gin | Glu | Arg | Sex | Lye | Aan | Pro | Lya | |
195 | 200 | 205 | ||||||||||||||
CCA | COS | AGS | GAT | GCC | OGC | CTT | COG | AAG | OCA | AM | GGG | CM3 | ACA | GTT | GCA | 670 |
PlO | Pro | Arg | *₽ | Ala | Arg | Leu | Pro | I*» | Pro | X#· | Gly | Gin | Thr | val | Ala | |
210 | 215 | 220 | ||||||||||||||
ICT | TIC | AGG | ме | GGT | CTT | GCC | ATG | CTT | CCA | MT | GOC | ATT | ACA | TOC | AGC | 718 |
Ser | Phe | Axg | t#s | Gly | leu | Ala | Mac | Lau | Pip | Asn | Ala | lie | Thr | Ser | Ser | |
225 | 230 | 235 | ||||||||||||||
TIG | GOT | ACT | AM | GTC | AM | CTA | ГСА | TGG | AM | GIC | ACG | AGC | ATT | ACA | AM | 766 |
Leu | Gly | Ser | Lye | Val | Lye | Leu | Set | Trp | 1^8 | leu | Thr | Sex | lie | Thr | Lye | |
240 | 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
TCA | GAT | <ac | MG | GGA | TAT | GIT | TTG | gag | TAT | GM | ЛС6 | Ora | GM | GGG | GTT | 814 |
Ser | ASp | Asp | Lys | Gly | Tyr | Val | leu | Glu | Tyr | Glu | Thr | Pro | Glu | Gly | val | |
260 | 265 | 270 | ||||||||||||||
t?rr | TCG | GTG | CAG | GCT | MA | AST | GTT | ATC | ATG | ACT | ATT | ora | tea | TAT | GTT | 862 |
val | ser | Val | Gin | Ala | Lys | Ser | Val | He | Met | Thr | lie | Pro | Ser | Tyr | val | |
275 | 280 | 285 |
GCT AGO AAC ATT TTG CGT ОСА CIT TCA ADC GAT GCT GCA GW GCT CTA910
Ala Ser Aan lie Leu Arg Pro Leu Ser Ser Азр Ala Ala Asp AlaLeu
290 295300
TCA AGA TTC TAT TAT CCA COG CTT GCT GCT CTA ACT Git TOG TAT CCA950
Set Arg ₽he Tyr Tyr Fro ЕГО Vai Ala Ala Vai Thr Vai Ser TyrPro
305 310315
AAG GAA GCA ATT AGA AAA GAA TOC TTA ATT GAT GGG GAA CTC CAG GGC1006
Lys Glu Ala lie Arg Lys Glu Cys Leu lie Asp Gly G1U Lev GiftGly
320 325 330335 m GGC CAG TIG CAT CCA OCT ACT CAA GQA GTT GftG АСА TTA GSA ACA1054
Phe Gly Gin Leu His pro Arg Ser Gin Gly Vai Glu Thr Leu GlyThr
340 345350
ATA TAC ACT TCC TCA СТС ТГГ OCA AAT OCT GCT OCT GAC GCT ASG CTG1102
Ila Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro A»n Arg Ala Pro Asp Gly Arg Vai
355 360365
TTA СТЕ CTA AAC TAC ATA GGA GCT GCT АСА ЛМС ACA GGA ATT GIT TCC1150
Leu Lau Leu Aan Tyr He Gly Gly Ala Thr Asn Thr Gly lie Vai Sex
370 375300
AAG ACT GAA ACT GAS CTG CTC GAA GCA GTT GAC OCT GAC CTC CGA AAA1190
Lys Thr Glu Ser Glu leu vai Glu Ala Vai Asp Arg Asp Leu Arg Lys
365 390395
MG СГТ АГА ААГ TOT ACA GCA CTG GAC OCT TTA CTC CTT GGT GTT CGA1246
Mat Leu lie Asn Ser Thr Ala Vai Asp Pro Leu vei Leu Gly Vbl Arg «00 405 410415
GTT TGG CCA CAA GOO ATA OCT CAG TTC CTO CTA GGA CAT CTT GAT CTT1294
Vai Trp Pro Gin Ala lie Pro Gin Phe Leu Vai Gly Hie Leu Asp Leu
420 425430
CTG GAA GCC GCA AAA GCT GCC CTG GAC CGA GCT GGC TAG GAT GGG CTG1342 laiu Glu Ala Ala Lys Ala Ala Leu Asp Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Leu
435 440445
TTC CTA GGA GQG AAC TAT CTT GCA GGA GIT GDC CTG GGC AGA TGC GTT1390
Phe Leu Gly Gly Asn Tyr Vai Ala Gly val Ala Leu Gly Arg Cys VA1
450 455460
GAG ИС GOG TAT GAA AST GCC TOG CAA ATA TCT GAC TTC TTG AQC AAG1430
Glu Gly Ala Tyr Glu Ser Ala Ser Gin lie Ser Asp Phe Leu Thr Lys
465 470475
TAT GOC TAC AAG TOATGAAAGA ACTOGAGOGC ТАСГЕСТТАА TCGTTTATGT1490
Tyr Ala Tyr Lys
SO
TGCAtWSATG ADGTGCCTCC GGGGMAANk МОМИИ ВДЯТОТТ АТТСГМТТТ теладгюс Атттстеггс ттттстлг аютмпйБ ттммтпа опстоеюс
AGATTSTTCT GTTCACIGCC СТТСАААЮА АЛТТПЛТГГ ТТСЖГГСТТТ TATGMSAGCr
GTGCTACTTA ААЛАААААЛЛ АШММ
1550
1610
1CT0
1698 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQID NO: 6:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(А) ДЪЛЖИНА 463 амшю кисцшш (B) ТИП: амино киселина (C) ТОПОЛОГИЯ: линеармк (И) МОЛЕКУЛЕН ТИП: пропеят (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ Ю NO: 6:
АЗП | Ser | Ala | ASp | Cys | val | Val | val | Gly | Gly | Gly | Xie | Ser | Gly | Leu | Cys |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Thr | Ma | Gin | Ma | Leu | Ala | Thr | Arg | Hi* | Gly | val | Gly | Asp | Val | leu | val |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Thr | Glu | Ala | Arg | Ala | Arg | Pro | GJy | Gly | Aen | lie | Thr | Thr | val | Glu | Arg |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Pro | Glu | Glu | Gly | Tyr | Leu | Tip | g: | . 4- | Gly | Pro | Asn | Ser | Phe | Gin | Pro |
SO 55 60 sar Asp Pro Vai Leu №t Met Ala Vai Asp Ser Gly Leu Lys Asp Asp 65 70 7580
Leu Vai Phe Gly Asp Pro Asn Ala Pro Arg Phe Vai leu Trp Glu Gly 85 9095
Lys Leu Arg Pro val Pro Ser Lys Pw Ala Asp Leu Pro Phe Phe Asp 100 105110
LHu Met Ser lie Pro Gly Lys Leu Arg Ala Gly Leu Gly Ala leu Gly
115 120125
He | Arg | Pro | Pro | Pro | Pro | Gly | Arg | Glu | Glu | Ser | val | Glu | Glu | Phe | Val |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Arg | Arg | Asn | Leu | Gly | Ala | Glu | Val | ?ne | Glu | Arg | Leu | He | Glu | Pro | Phe |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Cys | Ser | Gly | Val | Tyr | Ala | Gly | Asp | Pro | Ser | Lys | Leu | Ser | Met | Lys | Ala |
165 | 170 | 175 |
Ma Phe Gly Ly$ Val Tvp Arg Leu Glu Glu Thr Gly Gly Sei lie He IM 185190
Gly Gly Till He Lys Thr He Gin Glu Arg Ser Lys Asn Pro 1до Pro . 195 200205
Pro Arg Asp Ala Arg Leu Pro Lya Pro Lys Gly Gift Thr Vhl Ala Ser 210 215220
Phe Arg Lya Gly Leu Ala Met Leu Pro Asn Ala He Thr Ser SerLeu
225 230 235240
Gly Ser Lys Val lys Letl Ser Trp LyS Leu Thr Ser lie Thr LysSer
245 250255
Asp Asp Lye Gly Tyr Val Leu Glu Tyr Glu Thr Pro Glu Gily Val Vhl 260 265270
Ser Val Gin Ala Lys Ser Val He Met Thr He Pro Ser Tyr Val Ala 275 280285
Sex Asn He Leu Az? Pro Leu Ser Ser Asp Ala Ala Asp Ala Leu Sex 290 295300
Ar? Phe тух Tyr pro Pro Val Ala Ala Val Th! val Ser Tyr Pro Lys
305 31D 315320
Glu | Ala | He | Ax? | bys | Glu | CyS | Leu | He | Asp | Gly | Glu | leu | Gin | Gly | Fha |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Gly | Gin | Leu | HIS | Pro | Az? | Sex | Gin | Gly | val | Glu | Bur | leu | Gly | Thr | Xie |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
туг | Ser | Ser | Ser | leu | Pte | Fro | Asn | Az? | Ala | Pm | Aap | Gly | Ax? | val | Leu |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Leu | leu | ASn | Tyr | He | Gly | Gly | Ala | Thr | A*n | Thr | Gly | Xie | val | Ser | Lys |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Thr | Glu | Ser | Glu | leu | Val | Glu | Ala | Val | Asp | Ax? | Asp | leu | Arg | Lys | Met |
3B5 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Leu | He | Asn | Ser | Thr | Ala | Val | Asp | Pro | leu | val | Leu | Gly | val | Ar? | val |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Tip | Pro | (Un | Ala | He | Pio | Gin | she | Leu | val | Gly | Hxs | Leu | Asp | Leu | Leu |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Glu | Ala | Ala | lys | Ala | Ala | Leu | Asp | Arg | Gly | Gly | Tyr | Asp | Gly | Leu | Phe |
435 | 44Q | 445 |
Leu Gly Gly Asn Tyr Vai Ala Gly VW Al* Leu Gly Arg Cw VW Gin «0 <55 «0
Gly Ala Tyr Glu Ser Ala Ser Gin Xie Ser Asn Phe Leu Thr Lys Tyr
465 <70 <75 480
Ala Τγτ lys (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO 7:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА: 2061 цШи бази (B) ТИП: нуклеинов» киселина (C) ВЕРИЖНОСГ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: лшмрш (ц) МОЛЕКУЛЕН ТИП: <ДНК (ili) ХИПОТЕТИЧЯОСГ: не (к) БЕЗСМИСЛЕНОСГ: ме (к) ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ИМЕ/ КЛЮЧ: CDS (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: 64... 1698 (D) ДРУГАИНфОРМАЦИЯ: / забележка- “Царевична протокс- 2 сДНК: nocsegofiamcABOcxa от pWDC* 3“ (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА; SEQ И> N0:7:
СЮТОСТЛСС ТССАССТССЛ CGKCMCMG CWZCC0CA ТООЧИТОСЛ АЛСССТААСТ £0
I
CAA ATG СТС OCT TIG ACT GOC TCA GCC TCA TCC GQT TOG TOC CAT CCTIQS
Met Leu Ala Leu Thr Ala Ser Ala Ser Ser Ala Ser Ser HisPro 1 5 1015
TAT CGC CAC GCC TCC GCC CAC ACT CCT OGC CCC СОС CTA CCT GCG GlC156
Tyr Arg Kis Ala Sex Ala His Thr Arg Arg Pro Arg Axg al*val
2530
CTC GOG ATG GOG GGC ГСС GAC GAC CCC CGT GCA GOG OCC QCC AGA TOG204
Leu Ala Met Ala Gly Ser Asp Asp Pro Arg Ala Ala Pro Ala AtqSer
4045
GTC GCC GTC GTC GGC GCC GGG GTC AGC GGG CTC GDG GOG [3Q5 тдс ьгу:252
Val Ala Val Val Gly Ala Gly Val SCr Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Arg
55 ¢0
сте | AGA | C« | AGC | GGC | Gig | AAC | GTA | ACG | GIG | TTC | GAM | GOG | GCC | GHC | AGG | 300 |
Leu | Arg | Girt | sex | Gly | val | Азп | Val | Thr | Val | Phe | Glu | Ala | Ala | Asp | Arg | |
65 | 70 | 75 | ||||||||||||||
GCG | GGA | GGA | AAG | ATA | OGG | ACC | MT | TOC | GAG | GGC | GGG | TIT | GXC | TGG | GAT | 348 |
Ма | Gly | Gly | Lys | He | Arg | The | Asn | Ser | Glu | Gly | Gly | Phe | val | Trp | Asp | |
80 | 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
GAA | GGA | GOT | AAC | ACC | ATG | ACA | GAA | GOT | GM | TGG | GAG | GX | ACT | ASA | CTG | 395 |
Glu | Gly | Ala | Asn | rhr | MM | Thr | Glu | Gly | Glu | Tip | Glu | Ma | Ser | Arg | Leu | |
100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
АТГ | GAT | GKT | CTT | GGT | CTA | CM | GAC | AM | CAS | CAG | TAT | OCT | AAC | TCC | CM | 444 |
lie | ASp | MP | leu | Gly | Leu | Gia | MP | lye | Gin | Gin | tyr | Pre | Asn | Ser | Gin | |
115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
CAC | AMS | COT | TAC | ATT | GTC | AM | GAT | GSA | GCA | CCA | GCA | CIG | MT | CCT | TOG | 492 |
His | LyS | Arg | тук | Xie | val | ItfS | Asp | Gly | Ala | Pro | Ala | LOU | He | PxO | Ser | |
130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
GAT | CCC | AIT | TOG | CEA | ATG | AM | AGC | AST | OTT | CTT | TOG | ACA | MA | TCA | AAG | S40 |
A»p | Pro | He | Sax | Lau | Mec | lys | Ser | Ser | val | Leu | Ser | Thr | Lye | Sex | Lya | |
145 | L5C | 155 | ||||||||||||||
ЛТГ | GOG | TEA | TIT | TTT | GAA | CCA | TTT | CTC | TAC | AMS | AM | GCT | AAC | КЛ | AGA | 588 |
He | Ala | Leu | Phe | She | Glu | Pro | Phe | Leu | Tyr | lys | lys | Ala | Mn | Thx | Aro | |
160 | 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
MC | TCT | GGA | AAA | GIG | ICT | GMS | GAG | CAC | TTG | AST | GAG | AGT | GTT | GGG | AGC | 636 |
Asn | Ser | Gly | lya | val | Ser | Glu | Glu | Hie | Luu | Ser | Glu | Ser | vai | Gly | Ser | |
180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
TTC | TOT | GM | OGC | слс | TTT | GSA | AGA | GAA | GTT | GTT | GAC | TAT | TTT | GTT | GW | 664 |
Phe | Cys | G1U | Arg | H1S | Phe | Gly | Mg | Glu | Val | Val | Mp | Phe | vei | Asp | ||
195 | 200 | 205 | ||||||||||||||
CCA | TTT | GTA | OCT | GGA | ACA | ACT | GO | GGA | GAT | CCA | GAG | TCA | cm | TCT | ATT | 732 |
Pro | Phe | val | Ala | Gly | Thr | Sex | Ala | Gly | *4» | Pro | Glu | Ser | L8U | sar | He | |
210 | 215 | 220 | ||||||||||||||
GGT | CAT | GCA | TTC | CCA | GCA | TTG | TGG | AAT | TTG | GM | AGA | AAG | TAT | GGT | TCA | 780 |
Arg | His | Ala | Phe | Pro | Ala | Leu | Trp | Aen | Leu | Glu | Arg | Lys | Tyr | Gly | Ser | |
223 | 230 | 235 | ||||||||||||||
GTT | ATT | GTT | GGT | GOC | ATC | TTG | TCT | AAG | CTA | GCA | GCT | AAA | GOT | GAT | OCA | 828 |
Val | He | val | Gly | Ala | lie | Leu | Ser | Lys | Leu | Ala | Ala | iys | Gly | Asp | Pro | |
240 | 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
GTA | AAG | ACA | ACA | CAT | GAT | TCA | TCA | GGG | AAA | MSA | AGS | AAT | AGA | OGA | GIG | 876 |
Val | Liya | Thr | Arg | His | Asp | Ser | Ser | Gly | LyS | Arg | Arg | Asn | Arg | Arg | val | |
260 | 265 | 270 |
TOG TTT ТСЛ TIT CAT GGT QGA An; ОС TCA СТЛ МА АЛТ GO CTT САС921
Ser Phe Ser Phe His Gly Gly Met Gin sex Leu He Jurn Ala Leu His
275 280285
AAT QAA GTT GCA GAT GAT AM GIG AAG Ο'Γ GGT AGA GAA GTG TTG TCA972
Asn Glu V&1 Gly Asp Asp Asn Val Lys Leu Gly Thr Glu Val LeuSer
290 296300
TTG GCA TGT AO TTT GM GGA OTT OCT GCA CTA GGC ASG TOG TCA ΑΓΓ1020
Leu Ala Cya Thr Phe Asp Gly Pro Ala Leu Gly Arg Trp Serlie
305 310315
ICT GIT GAT TOG AAG GAT AGC GOT GAC AAG GAC CTT GOT AGT AAC СЛА1068 ser Val Asp Ser Цге Asp Ser Gly Asp Lys Asp leu Ala Sex AsnGin
320 325 330335
ACC TTT GAT GCT GTT MA MG ACA GET CCA TTG TOL AAT CTC CGG AQG1116
Thr Pte Asp Ala Val He Met Thr Ala Pro lasu Ser Asn Val ArgArg
340 345350
ATG AMS TTC ADC AAA GGT GGA GCT COG GTT GTT CTT GAC ™ CTT OCT1164
Met Lys ₽h« 5br Lys Gly Gly Ala Pro Val val Lev Asp Pte LeuPro
355 360365
AAG MG GM TM CTA ΟΆ CIA TCI CTC MG GXG ACT GCT TTO AAG JU»G1212
Lys Met Asp Tyr Leu Pro Leu Ser Leu Met Val Thr Ala Phe Lyslys
370 375380
GAT GM GTC AAG AAA OCT CTG GAA GGA TTT GGG GTC TXft ATA OCT TAG12&J
ASp Asp vai Lys Lys Pro Leu Glu Gly Phe Gly Vttl LBQ Xie ProTyr
385 390395
ARG <9A GAG CAA AAA CAT GOT OTG AAA ACC СГГ GGG ACT СТС ГГТ TOC1308
Lya Glu Gia Gia Lys His Gly Leu tys Thr Lau Gly Thr leu PheSer
400 405 410415
TCA ATG MG TIC ОСА (Й£Г OGA OCT OCT GAT G£ CAA TKT TIA TM ACA1356
Ser Met Met phe Pro Asp Arg Ala Fro Asp Asp Gin Tyr leu TyrThr
42Q 425430
ACA TTT GTT GGG GGT fiGC CAC AAT AGA GAT CTT GCT GGA GCT OCA ACG1404
Thr Phe Val Gly Gly Ser His Aan Arg Asp Leu Ala Gly Ala ProThr
435 440445
TCT ATT CTG AAA CAA CTT GIG ЛОС TCI GAC CTT AAA AAA CTC TTG GGC1452
Ser He Leu Lys Gin Leu Val Thr Ser Asp Leu Lys Lys Leu LeuGly
450 455460
OTA GAG GGG CAA CCA ACT TTT GTC AAG CAT GTA ТЛС TGG QGA AAT GCT1500 val Gly Gly Gin Pro Thr Phe Val Lys His Val Tyr Trp Gly А5ПAla
465 470475
1548
545
Lys Met | Glu | Lys | АЗП | Leu | Pro | Gly | Phe | Phe | Tyr | Ala Gly | Asn | Ser | Lyu |
500 | • | 505 | 510 | ||||||||||
GAT GGG | CTT | GCT | GTT | GCA | ЛОТ | GTT | ATA | GCT | TCA | AGC | AAG | GCT | GCT |
Asp Gly | Leu | Ala | Val | Gly | Ser | Val | He | Ala | Sex | Gly Ser | LyS | AL& | Ma |
515 | 520 | S2S | |||||||||||
GAC art | GCA ATC | TCA | TAT | CTT | G*A tct | CAC | ACC | AAG CAT | AAT | AAT | TCA | ||
Asp Leu | Ala | He | Sec | Tyr | LtU | Glu sar | His | Thr | Lya His Asn | Agn | ser |
1596
1644
1692
1745
CATCTACAGT ftSAAAOCGAT GCGTTGCWGT TTCAGAACAT CTTCACTTCT TCAGATATTA 1805
ЛСССГЮТГГ GMCATOCAC CAGAMQGTA GTCACATGTG TMGTGSSAA AATGAfiGTTA1865
AAAACEATTA TCGOGGCCGA AATGHCCTT TTTCTTTTCC 1VACAAGTGG CCWCGKAC1925
TTGAlGTTGG AAATATATTT AAATTTCTTG AMTGTTTGA GAACACATGC GTGAO7№IA19B5
ATATTTGCCT ATiyJWm TAGCW?afft CTTGGCCAGA TTAIGCTTTA ΟΟΟΟΙΤΓΑΑΑ2045
МММАМЛ MAMA (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NQ 8:
2061
0)
ЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ (А)ДЪЛЖИНА:544 аминокиселини (В) ТИП: шино киселина (Q ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: протеин (χί) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ П> NO 8:
Mee | Leu | Ala | Leu | Thr | Ala | Ser | Ala | Ser | Sex | Ala | Ser | Ser | His | Pro | Tyr |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Arg | His | Ala | Ser | Ala | His | Thr | Arg | Arg | Pro | Arg | Leu | Arg | Ala | val | Leu |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Ala | нес | Ala | Gly | Ser | Asp | Asp | Pro | Arg | Ala | Ala | ₽io | Ala | Arg | 50r | Val |
35 | 4(J | 45 |
Ala val Val Gly Ala Gly Val
SO55
Arg Gin Sex Gly Val asn Val 6570
Gly | Gly | Lya | He | Arg | Thr | Asn |
85 | ||||||
Gly | Ala | ASA | Thr | Het | Thr | Glu |
100 | ||||||
Ляр | Asp | Leu | Gly | Iau | Gin | Asp |
115 | ||||||
lye | Arg | Tyr | lie | val | Lys | Asp |
130 | 135 | |||||
Pro | He | Ser | Leu | Met | iys | Ser |
145 | 150 | |||||
Ala | Mu | Phe | Phe | Glu | Pro | Phe |
165 | ||||||
Ser | Gly | lys | Val | Ser | Glu | Glu |
180 | ||||||
Cys | Glu | Arg 195 | His | Phe | Gly | Arg |
Phe | val | Ala | Gly | Thr | Ser | Ala |
210 | 215 | |||||
His | Ala | Eha | Pro | Ala | Leu | Tip |
225 | 230 | |||||
He | Val | Gly | Ala | Xie | Leu | Sex |
245 | ||||||
LyS | Thr | Arg | His | Asp | Ser | Ser |
260
Phe Ser Phe His Gly Gly №t 27S
Glu Val Gly Хор Aap Asn val
290295
Ala Cys Thr Phe Asp Gly Val
30531Q
Gly leu Ala Ala Ala Tyr Arg Leu val Eh* Glu Ala Ala Aq> Arg Ala
7560
Glu Gly Gly Phe Val Trp Asp Glu 90 ,95
Glu | Tip | Glu | Ala | Ser | Axg | Leu | He |
105 | 110 | ||||||
Gin | flirt | Tyr | Pro | Asn | ser | GLn | Hie |
125 | |||||||
Ala | Pro | Ala | Lta | He | P»O | Ser | Asp |
140 | |||||||
val | Leu | ser | Thr | Lys | Ser | lys | He |
155 | 160 | ||||||
Tyr | LyB | lys | Ala | Asn | Thr | Arg | Asn |
170 | 175 | ||||||
Leu | Ser | Glu | Ser | val | Gly | ser | Phe |
185 | 190 | ||||||
val | Val | Asp | Tyr | Phe | Val | Asp | Pro |
205 | |||||||
M* | EXO | Glu | Ser | Leu | Ser | lie | Arg |
220 | |||||||
leu | Gin | Arg | lye | Tyr | Gly | Ser | Val |
235 | 240 | ||||||
Leu | Ala | Ala | Lys | Gly | Asp | Pro | val |
250 | 255 | ||||||
lys | Arg | Arg | ASS- | Arg | Arg | Val | Ser |
265 | 270 | ||||||
Ser | Leu | lie | AM | Ala | Leu | His | Asn |
285 | |||||||
Leo | Gly | Thr | Glu | Val | Leu | Ser | Leu |
300 | |||||||
Ala | Leu | Gly | Arg | Trp | Sex | He | Ser |
315 | 320 |
Val | Asp | Ser | tys | AS₽ | Ser | Gly | Asp | [ys | Asp | Uu | Ala | Ser | Asn | Gin | Thr |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Phe | Asp | Ala | val | Tie | Met | Thr | Ala | pro | Leu | Set- | ASS | Val | Arg | Arg | Met |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Lys | Phe | Thr | lys | Gly | Gly | Ala | Pro | Val | Val | Leu. | Asp | Ebe | Leu | Pro | I#s |
355 | 3« | 3S5 | |||||||||||||
Asp | Tyr | leu | Ped | Leu | Ser | leu | Mat | Vai | Thr | Ala | phe | Lys | Lys | Asp | |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Asp | Val | Lys | lys | FeO | leu | Glu | Gly | Phe | Gly | Val | Leu | lie | Pro | туг | Lys |
365 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Glu | Gin | Gin | LyS | H1S | Gly | Leu | Lys | Thr | Leu | Gly | Thr | Leu | Phe | Ser | Ser |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Met | Mat | Phe | Ped | Asp | Arg | Ala | Pro | M> | Asp | Gin | Tyr | Leu | ТУг | Thr | Thr |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Phe | Val | Gly | Gly | Ser | His | Asn | Arg | ASp | Leu | Ala | Gly | AU | Pro | Thr | Ser |
435 | 440 | - | 445 | ||||||||||||
xle | Lau | lys | Gin | Leu | val | Thr | Ser | Leu | LyS | lys | Leu | leu | Gly | val | |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
•Jly | Gin | Ped | Thr | vhe | Val | Lys | His | val | 'x . | -iy | Asn | Ala | Phe | ||
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Pro | leu | Tyr | Gly | Hi » | Asp | Tyr | sar | Ser | val | Leu | Glu | Ala | lie | Glu | Lys |
485 | 490 | 495 | |||||||||||||
Met | Glu | Ly« | Αβη | Leu | Pro | Gly | Phe | Phe | Tyr | Ala | Gly | Asn | Ser | X#S | ASp |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
Gly | Lea | Ala | Val | Gly | Ser | val | lie | AU | Ser | Gly | Ser | Igp | AU | Ala | ASP |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
Uu | Ala | He | Ser | Leu | Glu | Ser | HU | Thr | Lys | Hijt | Asn | Ann | Ser | EiS | |
530 | 535 | 540 |
(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 9:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА: 1697 двойки бази (B) ТИП: нуклешюва киселина (€) ВЕРИХНОСГ: едшВерижма
Р) ТОПОЛОГИЯ: лшаф*
ОД МОЛЕКУЛЕН ТИП: <ДНК (Ш) ХИПОТЕТИЧНОСП ис (к) ВЕЗСМИСЛЕНОСТ не (к) ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ИМЕ/ КЛИН: CDS (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: 29... 1501 (D) ДРУГА ИНФОРМАЦИЯ: / забележкв=* gpookgefi* протокс- 3 сДНК; йоследобатедносш. cmpWDC- 5* (») СПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА; SEQ П>9:
TTGQCATTTG ССТТСйЛОСА АОШПСТ ATG TCA ATI GCA MT TCT GGA GGA52
Met Ser lie Ala He Cys Gly Gly
GGT | ATA | GCT | GST | СП | ACT | ЛСА | GCA | TTT | ТЛТ | CTT | GCT | AGA | TTG | ATT | CCA | 100 |
Gly | lie | Ala | Gly | Leu | Ser | Thr | Ala | Phe | Tyr | Leu | Ala | Arg | Leu | lie | Pro | |
10 | 15 | 20 | ||||||||||||||
AAA | TCT | ACT | ATT | GAT | TTG | TAC | GAA | ΑΤΆ | CTT? | CCT | GGT | TTA | GGT | GGA | TCG | 148 |
Lys | Cys | Thr | lie | ASP | Leu | Tyr | Glu | Ly.·, | V.y | Pro | Arg | Leu | Gly | 61y | Tip | |
25 | 30 | 35 | 40 | |||||||||||||
CTT | CAG | TCG | GTC | AAa | ATC | COG | TGT | GCA | GAT | TCT | OCA | ACA- | oa | ACG | GTT | 19« |
Leu | Gin | Ser | val | ifrS | lie | Pro | Cys | Ala | Asp | Ser | Pro | Thr | Gly | Ttir | Vhl | |
45 | 50 | 55 | ||||||||||||||
TTG | TTT | GAG | CAA | GGT | OCT | AGA | ACT | err | OCT | CCT | GCT | GGG | CTT | GCT | GGC | 244 |
Leu | She | Glu | Gin | Gly | Pro | Arg | Thr | Leu | Arg | Pro | Ala | Gly | vu | Ala | Gly | |
¢0 | ¢5 | 70 | ||||||||||||||
TTA | GCA | AAC | тта | GAT | TTA | ATT | AGC | АВД | TIG | GGC | ATC | GAA | GAC | AM> | TTG | 292 |
Leu | Ala | ASH | Leu | ASp | Leu | He | Ser | Lys | Leu | Gly | He | Glu | Asp | lys | Leu | |
75 | 80 | 85 | ||||||||||||||
TTA | AGG | ATT | TOG | AGC | AAT | TCT | OOC | AGC | GCA | AAA | AAC | CGA | TAT | MT | TAT | 340 |
Leu | Arg | lie | Ser | Ser | Asn | Ser | Fro | Ser | Ala | Lys | Asn | Arg | Tyr | lie | Tyr | |
90 | 95 | 100 | ||||||||||||||
TAC | CCA | GAT | CGC | TTA | AM | GAA | ATT | oct | TCA | AGC | ATT | TTA | GGG | ACT | ATA | 380 |
Tyr | Fro | Дф | Aug | Leu | Asn | Glu | lie | Pro | Ser | Ser | lie | Leu | Gly | Ser | lie | |
105 | 110 | 115 | 120 | |||||||||||||
AAG | TCG | ATT | ATG | CAG | CCT | GCT | TTC | CCT | COG | ATC | OCT | TTG | GCT | ATG | ATC | 436 |
Lys | Sex | He | Met | Gin | Pro | Ala | Leu | Arg | Pro | Net | Pro | Leu | Ala | Met | Met |
12$ 130135 стг gag сос m сит мл юг mg cga Gat tcg aca gm gm мас gtg484
Leu Glu Pro the Arq Lys Ser Lys Arg Asp Ser Thr A»p Glu Ser Val
140 145150
GGT TCA TTT ATG ASA AGA ASA TTT &OT AAA AAC GTT ACS GAT MSA GTT532
Gly Ser the Met Arg Arg Arg Phe Gly Lys Asn Val Thr Asp Arg Val
155 160165
ATG | AST | GCA | ATO | ATA | AAT | GGT | ATT | TAT | OCT | GST | GAT | TTG | AAT | GAT | TTG | 580 |
Net | Ser | Ala | Mat | He | Asn | Gly | lie | Tyr | Ala | Gly | MP | Leu | Asn | A3₽ | Leu | |
170 | 175 | 180 | ||||||||||||||
TCT | ATG | CAT | TCT | AGC | ATG | TTT | GGA | TTT | TTA | GCG | AAG | ATT | GM | AAA | AAG | 528 |
Ser | Met | HAS | Ser | ser | Met | Phe | Gly | Phe | Leu | Ala | Lye | Ila | Glu | Lys | Ι«β | |
185 | 190 | 195 | 200 | |||||||||||||
TAT | GGA | AAC | ATT | ACT | TTG | GGA | TTA | KIT | ASA | GCT | СП | CTT | GCA | OST | GAA | 676 |
Tyr | Gly | ASH | lie | Thr | leu | Gly | Leu | Ila | Arg | Ala | Leu | Lau | Ala | Arg | Glu | |
205 | 210 | 213 | ||||||||||||||
АТЯ | TTA | TCT | OCT | GCT | as | AAA | GCT | TIG | GAA | AGC | AGC | ACT | ACT | CGC | AGA | 724 |
lie | Leu | Ser | Pro | Ala | Glu | tya | Ala | leu | Glu | Ser | Sec | Thr | Thr | Arg | Arg | |
220 | 225 | 230 | ||||||||||||||
GCC | AAA | AAC | AGC | AQA | GCT | GTC | AM | OS | TAT | GAA | ATC | GAC | AMS | tat | OTT | 1Ί2 |
Ala | iy* | Asn | Ser | Arg | Ala | val | lys | Gin | Tyr | Glu | He | ASp | Lye | туг | VUl | |
235 | 240 | 245 |
GCT | TTC | AAG | GM | GGG | ATT | GAG | ACT | АДТ | ACA | TIG | TCA | ATA | GCA | GAT | GM | 820 |
Ala | the | Lys | Glu | Gly | Ila | Glu | Thr | II* | Thr | Leu | Ser | lie | Ale | Mp | G1U | |
250 | 255 | 260 | ||||||||||||||
TTA | AAA | AAA | ATG | OCG | AM | GTC | AAfi | ATA | CAT | ca | AAC | AM | COB | GCC | CM | 868 |
lau | Iff· | Lys | Met | Pro | Am | iy« | He | His | leu | Asn | tye | Pro | Ala | GLn | ||
265 | 270 | 27S | 280 | |||||||||||||
ACT | TTG | OTT | CCA | CAT | AM | ACT | CM3 | TCT | CTT | GTA | GAC | GTC | AAT | GGT | CM | 916 |
Thr | Leu | Vai | Pro | His | 1УЗ | Thr | Gin | ser | Lau | vai | Mp | Val | Asn | Gly | Gin | |
285 | 290 | 295 | ||||||||||||||
GCT | TAC | GAG | TAT | GTT | GTG | TTT | GCA | AAC | TCT | TCT | osc | MT | TTA | GAG | AAT | 964 |
Ala | Tyr | Glu | туг | val | Val | Phe | Ala | Asn | Ser | Ser | Arg | Asn | Leu | Glu | АДП | |
300 | 305 | 310 | ||||||||||||||
CTA | ATA | TCT | TOT | CCT | AM | ATG | GAA | ACT | OCG | ACG | TCG | AGT | GTT | TAT | GlC | 1012 |
Leu | Ila | Ser | Cys | Pro | lys | Met | G1U | Thr | Pro | Thr | Ser | Ser | val | Tyr | Val | |
315 | 320 | 325 | ||||||||||||||
GTC | AAC | GTT | TAT | TAT | AAG | GAC | CCT | AAT | GTT | Ctt | OCA | ATC | OGT | GGT | TET | 1060 |
val | Asn | vai | Tyr | Tyr | Lys | Asp | Pro | Asn | Vai | Lev | Pro | He | Arg | Gly | Phe |
330 335340
QQG СТТ TIG MT CCA 1СЛ TGC ACT CCA MT MT COG MT CAT GTT СТГ1108
Gly Leu Leti lie Sic Cy? Thr Pro Asn Asn Pre Asn Kie Vat ]«et>
345 350 355360
GST ATC GTT TTT GAT ACT GAG CM AAC АЙС OCT GM MT GGA AX AAG1156
Gly lie val Phe Asp Ser Glu Gin Asn Asn fro Glu Asn Gly Ser Lys
365 370·375
OTC ACT GTC ATG MG GGA GGG TCT GCT TAT A£A AAA AAT ACT TCT TTG1204
Vai Thr Vai Het Met Gly Gly Ser Ala Tyr Thr Lys Asn Thr Ser Leu
380 385390
ATT OCA ACC AAC CCC GAA GM GCC GlT. AAC MT GCT CTC MA GCT TTG1252 lie Fro Ihr Asn Pro Glu Glu Ala Vai Asn Asn Ala Leu Lye Ala Leu
395 400405
CAO CAT ACT TTA AAA ATA TCC AST AM» OCA ACA CTC ACS AAT GCA ACA1300
Gin His Thr Leu Lys lie Ser Sex lys Pro Thr Xeu Thr Asn AlaThr
410 415420
TTA CM OCA AAT TGC ATC OCT CAA TAT CGI GTT GGG CAT CM GAT AAT1348
Leu Gin Pro Asn Cys lie Pro Gin Tyr Arg Vai Gly His Gin AspAsn
425 43D 435440
СГТ АЛТ TCT TIG AAA TCT TGG ATT GAG AAA MT ATG GGA С-Г-С, CGA ATT139 6
Leu As·· C-cr Leu Lya Ser Trp i ie Glu Lys Asn Met Gly Gja Arglie
445 450' 455
CTT CIA ACT GSA ACT TGG TAT AAT GST GIT ACT АЯТ GGG GAT TGT ATI1444
Leu Leu Thr Gly Ser Trp Tyr Ann Gly Vai Ser tie Gly Aap CysXia
460 465470
MS AAT GSA CAT TCA ACA GCT CGA AM CTA GCA TCA TTG ATG MT TCT1492
Mat A«n Gly His Ser Thr Ala Arg Lys Leu Ala Ser Leu Mat amSer
475 480485
TCT TCT TGAGOGTta TAAATGHGA TMAMATTA GTATATAQXT CCTTTGMTA1548
Ser Sec
490
TTTTATGAGT TGAAAATGCO ACTTG1GAM TMT7TTGCA CMQOOCTTT TAiraCAGAC 1608
GTATATQCGA GGACATTCGA CAAACCTTTG ΜΑΤΤΑΛΑΜ TCATATGOCT TTTAGCITM 1665
GACATCAAGG TCATQMTM ΤΑΛΑΑΤΤΤΤ 1697 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: lib (i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА: 490«ммно Иаоемли (B) 1МП: «аш&кммшм (D) ТОПОЛОГИЯ: мтмряв (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: црммш <м) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ Ю NO: 10:
Met | Ser | He Ala | lie Cys | Gly | Gly | Gly | He | Ala | Gly | leu | Ser | Thr | Ala |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||
Phe | Tyr | leu Ala | Axg Leu | He | Pie | Lys | Cis | Thi | lie | *4» | Тяп | Tyr | Glu |
20 | 25 | 30 | |||||||||||
LyS | Gly | Pro Arg | Leu Gly | Gly | Txp | £eu | Gin | Ser | Val | Lys | Ho | Pro | cys |
35 | 40 | 45 | |||||||||||
Ala | Asp | Ser Pro | Thr Gly | Thr | val | Lbu | Phe | G1U | Gin | Gly | Pro | Aug | Thr |
50 | 55 | 60 | |||||||||||
Leu | Arg | Pro Ala | Gly Val | Ala | Gly | Leu | Ala | Asn | Leu | M> | loti | He | Ser |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||
Lys | lev | Gly lie | Glu Asp | Lys | leu | Leu | Arg | He | Ser | Ser | Asn | Ser | Pro |
95 | 90 | 95 | |||||||||||
Ser | Ala | Lys Asn | Arg Tyr | rie | *r·..· 1 · . | τ-.· | * yr J | Arg | leu | Man | Glu | lie | |
100 | JVu | 110 | |||||||||||
Fra | Ser | Ser He | leu Gly | Ser | He | Lye | Ser | He | Nat | Gin | Pro | Ala | Leu |
115 | 120 | 125 | |||||||||||
Axg | Pro | Met Pro | Leu Ala | Met | Met | leu | Glu | Pro | Pbe | Axg | lye | Ser | lys |
130 | 135 | 140 | |||||||||||
Arg | Asp | s«r Thr | Asp Glu | Sax | val | Gly | Ser | Phe | Net | Acg | Axg | Axg | phe |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||
Gly | lys | Asn Val | Thr Aqp | Arg | Val | Het | Ser | Ala | »tet | lit | Asn | Gly | He |
165 | 170 | 175 | |||||||||||
Tyr | Ala | Gly Asp | Leu A»n | ASp | leu | Ser | Met | His | Ser | Ser | Net | Phe | Gly |
ISO | 165 | 190 | |||||||||||
Phe | Leu | Ala Lys | He Glu | tys | Lys | Tyr | Gly | ASn | Tie | Thr | leu | Gly | Leu |
195 | 200 | 205 | |||||||||||
lie | Arg | Ala Leu | Leu Ala | Arg | Glu | He | Leu | Ser | Pro | Ala | Glu | Lys | ALa |
210 | 215 | 220 | |||||||||||
Leu | Glu | Ser Ser | Thr Tht | Arg | Arg | Ala | Lye | A$n | Ser | Arg | Ala | vai | Lys |
225 | 230 | 235 | 240 |
151.Г1 | TYi | Glu He | Asp Lys 245 | Tyr val Ala | Phe LyS Glp Gly 250 | He Glu 255 | Thr |
Не | Thr | Leu Ser | He Ala | Asp GLv Leu | Lys lys Met Pro | Asn Val | Lys |
260 | 265 | 270 | |||||
J Je | ILL· | Leu Asn | Lys Pro | А1Д Gin Thr | Leu val Pro His | xys Thr | Gin |
275 | 28Q | 285 | |||||
Ser | Leu | Val Αφ | val Asn | Gly Gin Ala | туг Glu туг Val | val Phe | Ala |
290 | 295 | 300 | |||||
Asn | Ser | Ser Arg | Asn leu | Gltl ASn leu | Xie Ser Cys Pro | Lys Met | Glu |
305 | 310 | - | 315 | 320 | |||
Thr | Pro | Thr Ser | Ser Val | Tyr Val val | Asn Val Tyr Tyr | Lys Asp Psp | |
325 | 330 | 335 | |||||
Asn | Val | Leu Pru | He Arg Gly Phe Gly | Leu Leu lie Pro Sex Cys Thr | |||
340 | 345 | 350 | |||||
Pro | Asn | Asn Pro | Asn His | VM1 lau Gly | He Val Phe Asp Ser Glu Gin | ||
355 | 3« | 365 | |||||
Asn | Asn | Pro Glu | Asn Gly | Ser Lys Val | Thr val Mat Met. | Gly. Gly | S*r |
370 | 375 | 3BD | |||||
Ala | Tyr Thr Ly-S | Asn Ώιγ | Ser Leu He | Pro Thr Asn' Pro | Glu d-U | Ala | |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||
Val | Asn Asn Ala | Xeu Lys | Ala len Gin | His Thr Lyj | lie Ser | Ser | |
405 | 410 | 415 | |||||
Lys | Pep | Thr Leu | Thr Asn | Ala Thr Leu | Gift Pm Asn Cys | He Pro | Gin |
420 | 425 | 430 | |||||
Tyr Arg | Val Gly | His Gin | Asp Asn leu | Asn Sac Leu Lys | Ser Trp | He | |
435 | 440 | 445 | |||||
Glu | lys | Asn Met | Gly Gly | Arg lie Leu | Leu The Gly Ser | Τηρ туг | Asn |
450 | 455 | 460 | |||||
Gly | Val | Ser lie | Gly Asp | Cys He Met | Asn Gly His Ser Thr Ala | Arg | |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||
lys | Leu | Ala s«r | Leu Met | Asn Sec Ser | Ser | ||
48S | 490 |
(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ Ю NO; 11:
(1) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА: 41 двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D} ТОПОЛОГИЯ: лимеарна (и) МОЛЕКУЛЕН ТИП: друса нуклеинова киселина (А) ОПИСАНИЕ: олигоиуклеошид, използван за ковюпруираие на PCGN1761ENX (iii) ХИПОТЕТИЧНОСГ; не (iv) БЕЗСМИСЛЕНОСТ: не (Jd) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ Щ NO 11 AATTATGACG TAACGTAGGA ATTAGCGGCC CGCTCTCGAG Т (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 12 (i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА; 40 двойки бази (B) ТИП; нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП; друса нуклеинова киселина (А) ОПИСАНИЕ: олиаонуклеотид, използван за конструиране на
PCGN1761ENX (iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ: не (iv) БЕЗСМИСЛЕНОСТ: ме (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 12:
AATTACTCGA GAGCGGCCGC GAATTCCTAC GTTACGTCAT (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO 13:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА: 31 двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСГ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (Н) МОЛЕКУЛЕН ТИП: друга нуклеинова киселина (А) ОПИСАНИЕ: нраймер SONOOQ3 , използван за конструиране на pSOGlO (iii) ХИПОТЕТИЧНОСГ: не (iv) БЕЗСМИСЛЕНОСГ: НЕ (й) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ Ю NO 13: CTCGATCCAGCAGATTCGAAGAAGGTACAG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO 14:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА: 31 двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСГ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (и) МОЛЕКУЛЕН ТИП: друга амино киселина (А) ОПИСАНИЕ: нраймер SONOOD4 използвам за конструиране на pSOGlO (iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ: не (iv) БЕЗСМИСЛЕНОСГ: не (Й) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 14:
ACOGGATCCAACTTCCTAGCTGAAAAATOGG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ Ю NO: 15 :
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА: 26 двойки вози (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСГ, едвоверижна' (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: друга амино киселина (А) ОПИСАНИЕ: праймер SONOD31 използвам за конструиране на pSOG19 (iii) ХИПОТЕТИ.ЧНОСТ: ж (iv) БЕЗСМИСЛЕНОСГ: не (») ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:15:
CATGAGOGACTGACCACCCGCCGATC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА : SEQ П> NO: 16:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА: 24 двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСГ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (и) МОЛЕКУЛЕН ТИП: друга амино киселина (А) ОПИСАНИЕ: праймер SONOOIO, използван за конструиране на pSOG19 (iii) ХИПОТЕТИЧНОСГ: не (iv) БЕЗСМИСЛЕНОСГ: не (Xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ Ю NO: 16:
AGCGGATAACAATTTCACACAGGA (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 17:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА: 24 двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: друга амино киселина (А) ОПИСАНИЕ: праймер SON0016, използван за конструиране на pSOG19 (iii) ХИПСУГЕГИЧНОСТ: не (iv) БЕЗСМИСЛЕНОСТ: не (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO. 17: GCTACCATGGCCACATAGAACACC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO; 18:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА: 23 двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: друга амино киселина (А) ОПИСАНИЕ: праймер SON0017, използван за конструиране на PSOG19 (iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ: не (iv) БЕЗСМИСЛЕНОСТ: не (х!) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 18:
CGAGAGCTCGCACTTCAACCTTG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 19:
(ί) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА: 28 двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: сдиоверижна' (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (и) МОЛЕКУЛЕН ТИП: друга амино киселина (А) ОПИСАНИЕ: ираймер SONOG39, използван за коструираве на pSOG30 (Hi} ХИПОТВТИЧНОСТ: не (ή) БЕЗСМИСЛЕНОСГ: не (я) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА; SEQ Ш N0:19: CGACATGGTACGTCCTGTAGAAACCCACA (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ Ю NO: 20:
(i) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА: 24 двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едисверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (и) МОЛЕКУЛЕН ТИП: друеа амино киселина (А) ОПИСАНИЕ: ираймер SON0041, използван за коиспауиряме на pSOGJO (iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ; не (iv) БЕЗСМИСЛЕНОСТ: не (я) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 20:
ATCGCAAGACCGGCAACAGGATTC
Claims (13)
- Патентни претенции1. Изолирана ДНК молекула, кодираща протопорфириноген оксидаза, включваща аминокиселинна секвенция, избрана от групата, 5 съставена от SEQ ID No. 2, 4, 6, 8 и 10.
- 2. Изолирана ДНК молекула, кодираща протопорфириноген оксидаза, притежаваща секвенция, означена в SEQ ID No. 2, с изключение на това, че:а. аланинът в аминокиселина 220 е заместен с аминокиселина, избрана от групата, съставена от валин, треонин, левцин и цистеин; и/илиб. глицинът в аминокиселина 221 е заместен със серии; и/илив. тирозинът в аминокиселина 426 е заместен с аминокиселина, избрана от групата, съставена от цистеин, изолевцин, левцин, валин и треонин.
- 3. Изолирана ДНК молекула съгласно претенция 2, където аланинът в аминокиселина 220 от SEQ ID No. 2 е заместен с валин.
- 4. Изолирана ДНК молекула съгласно претенция 2, където тирозинът в аминокиселина 426 от SEQ ID No. 2 е заместен с цистеин.
- 5. Изолирана ДНК молекула, кодираща протопорфириноген оксидаза, притежаваща секвенция, означена в SEQ ID No. 6, с изключение на това, че:а. аланинът в аминокиселина 166 от SEQ ID No. 6 е заместен с валин; и/или
- 6. глицинът в аминокиселина 167 от SEQ ID No. 6 е заместен със серин; и/илив. тирозинът в аминокиселина 372 от SEQ ID No. 6 е заместен с цистеин.б. Експресионна касета, включваща промотор, свързан по оперативен път с изолираната ДНК молекула, съгласно която и да е претенция от 1 до 5.
- 7. Рекомбинантен вектор, включващ експресионната касета, съгласно претенция 6.
- 8. Клетка гостоприемник, трасформирана стабилно чрез използване на вектор, съгласно претенция 7, където споменатата клетка гостоприемник е способна да експресира споменатата ДНК молекула.
- 9. Растителна клетка, включваща ДНК молекула от която и да е претенция от 1 до 5, където споменатата ДНК молекула се експресира в споменатата растителна клетка и дава възможност на споменатата растителна клетка да бъде толерантна към хербицид, в количества, които инхибират естествено срещаната се protox активност.
- 10. Растение, включващо растителната клетка съгласно претенция 9.
- 11. Метод за осигуряване на растение, което е толерантно към протопорфириноген оксидаза, инхибираща хербицидите, характеризиращ се с това, че включва:а. осигуряване на експресионна касета, включваща растителен опериращ промотор, свързан по оперативен път с ДНК секвенция, кодираща протопорфириноген оксидаза;б. трансформиране на растителен материал със споменатата експресионна касета; ив. регенериране на растение от споменатия растителен материал.
- 12. Метод за контролиране на растежа на нежелано покълване, характеризиращ се с това, че включва прилагане към популацията от растения съгласно претенция 10 или на полученото чрез метода растение съгласно претенция 11, и на получените при нежелано покълване растения на ефективно количество от протопорфириноген оксидаза, инхибираща хербицида.
- 13. Използване на ДНК секвенция, кодираща протопорфириноген оксидаза, за осигуряване на растения, които са толерантни към протопорфириноген оксидаза, инхибираща хербицидите.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US26119894A | 1994-06-16 | 1994-06-16 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
BG101115A BG101115A (bg) | 1997-10-31 |
BG64394B1 true BG64394B1 (bg) | 2004-12-30 |
Family
ID=22992309
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
BG101115A BG64394B1 (bg) | 1994-06-16 | 1997-01-06 | Манипулиране на протопорфириноген оксидазната ензимна активност в еукариотични организми |
Country Status (24)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US5767373A (bg) |
EP (1) | EP0769059B1 (bg) |
JP (1) | JP3673925B2 (bg) |
CN (3) | CN100432229C (bg) |
AT (1) | ATE296888T1 (bg) |
AU (2) | AU706763B2 (bg) |
BG (1) | BG64394B1 (bg) |
BR (1) | BR9508030A (bg) |
CA (1) | CA2189349C (bg) |
CZ (2) | CZ295884B6 (bg) |
DE (1) | DE69534247T2 (bg) |
DK (1) | DK0769059T3 (bg) |
ES (1) | ES2239757T3 (bg) |
FI (1) | FI964958A (bg) |
HK (1) | HK1039794B (bg) |
HU (1) | HUT76353A (bg) |
MX (1) | MX237061B (bg) |
PL (3) | PL183091B1 (bg) |
PT (1) | PT769059E (bg) |
RO (3) | RO120003B1 (bg) |
RU (2) | RU2266332C2 (bg) |
SK (1) | SK284895B6 (bg) |
UA (1) | UA71536C2 (bg) |
WO (1) | WO1995034659A1 (bg) |
Families Citing this family (434)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6808904B2 (en) * | 1994-06-16 | 2004-10-26 | Syngenta Participations Ag | Herbicide-tolerant protox genes produced by DNA shuffling |
US5939602A (en) * | 1995-06-06 | 1999-08-17 | Novartis Finance Corporation | DNA molecules encoding plant protoporphyrinogen oxidase and inhibitor-resistant mutants thereof |
US6023012A (en) * | 1996-02-28 | 2000-02-08 | Novartis Finance Corporation | DNA molecules encoding plant protoporphyrinogen oxidase |
US5767373A (en) | 1994-06-16 | 1998-06-16 | Novartis Finance Corporation | Manipulation of protoporphyrinogen oxidase enzyme activity in eukaryotic organisms |
US6084155A (en) * | 1995-06-06 | 2000-07-04 | Novartis Ag | Herbicide-tolerant protoporphyrinogen oxidase ("protox") genes |
DE19524623A1 (de) * | 1995-07-06 | 1997-01-09 | Basf Ag | 5-Pyrazolylbenzoesäure-Derivate |
WO1997004088A1 (en) * | 1995-07-20 | 1997-02-06 | Sumitomo Chemical Company, Ltd. | Porphyrin-accumulating type herbicide resistance gene |
KR970021314A (ko) * | 1995-10-11 | 1997-05-28 | 김선중 | 제초제 지항성 식물체의 제조방법 |
DE19542520A1 (de) * | 1995-11-15 | 1997-05-22 | Basf Ag | Substituierte 1-Methyl-3-phenylpyrazole |
PL187094B1 (pl) * | 1996-02-28 | 2004-05-31 | Syngenta Participations Ag | Izolowana cząsteczka DNA kodująca enzym oksydazę protoporfirynogenu (protox) pszenicy, chimerowy gen, sposób wytwarzania roślin oraz sposób zwalczania chwastów |
EP0946737A2 (en) * | 1996-11-07 | 1999-10-06 | Zeneca Limited | Herbicide resistant plants |
DE19650216A1 (de) * | 1996-12-04 | 1998-06-10 | Inst Pflanzengenetik & Kultur | Verfahren zur Beeinflussung der Chlorophyllbiosynthese in Pflanzen |
WO1998029554A1 (en) * | 1996-12-27 | 1998-07-09 | Sumitomo Chemical Co., Ltd. | Methods of conferring ppo-inhibiting herbicide resistance to plants by gene manipulation |
ZA98371B (en) * | 1997-01-31 | 1999-07-16 | Du Pont | Genetically transformed plants demonstrating resistance to porphyrinogen biosynthesis-inhibiting herbicides. |
AU741013B2 (en) | 1997-09-11 | 2001-11-22 | Nihon Nohyaku Co., Ltd. | Novel protoporphyrinogen oxidase tolerant to light-requiring herbicides |
AU769868B2 (en) * | 1998-04-10 | 2004-02-05 | Sumitomo Chemical Company, Limited | A method for evaluating the ability of a compound to inhibit the protoporphyrinogen oxidase activity |
JP4788011B2 (ja) * | 1998-04-30 | 2011-10-05 | 住友化学株式会社 | 雑草防除剤耐性の付与方法 |
US6906245B1 (en) | 1998-04-30 | 2005-06-14 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Method for producing transgenic plants resistant to weed control compounds which disrupt the porphyrin pathways of plants |
AU753020B2 (en) * | 1998-04-30 | 2002-10-03 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Method for giving resistance to weed control compounds to plants |
DE19836684A1 (de) | 1998-08-13 | 2000-02-17 | Hoechst Schering Agrevo Gmbh | Herbizide Mittel für tolerante oder resistente Reiskulturen |
WO2000063356A2 (en) * | 1999-04-19 | 2000-10-26 | Syngenta Participations Ag | Herbicidal seed treatment |
EP1621614A3 (en) * | 1999-06-15 | 2006-02-08 | Syngenta Participations AG | Herbicide target genes and methods |
US6294345B1 (en) | 1999-07-27 | 2001-09-25 | Syngenta Participations Ag | Genes encoding proteins essential for plant growth and methods of use |
WO2001007590A2 (en) * | 1999-07-27 | 2001-02-01 | Syngenta Participations Ag | Chimeric genes for plastid expression |
EP1200611A1 (en) * | 1999-08-13 | 2002-05-02 | Syngenta Participations AG | Herbicide-tolerant protoporphyrinogen oxidase |
EP1222295A4 (en) * | 1999-10-11 | 2003-01-15 | Back Kyoung Whan | PROCESS FOR INCREASING YIELD OF A CROP OR BIOMASS USING THE PROTOPORPHYRINOGEN OXIDASE GENE |
JP4821038B2 (ja) * | 1999-10-29 | 2011-11-24 | 住友化学株式会社 | 除草剤耐性植物 |
JP4821036B2 (ja) * | 1999-10-29 | 2011-11-24 | 住友化学株式会社 | 除草剤耐性植物 |
EP1235906B8 (de) * | 1999-11-26 | 2008-01-23 | BASF Plant Science GmbH | Verfahren zur mutagenese von nukleotidsequenzen aus pflanzen, algen, oder pilzen |
EP1240185A2 (en) * | 1999-12-16 | 2002-09-18 | Syngenta Participations AG | Herbicide target genes and methods |
AU2001260114A1 (en) * | 2000-03-14 | 2001-09-24 | Syngenta Participations Ag | Protoporphyrinogen oxidase ("protox") genes |
DE10032633A1 (de) * | 2000-07-05 | 2002-01-17 | Bayer Ag | Verfahren zum Auffinden von Hemmstoffen der Protoporphyrinogen-Oxidase |
EP2290090A1 (en) | 2000-08-11 | 2011-03-02 | Syngenta Participations AG | Methods for stable transformation of plants |
DE10052454A1 (de) * | 2000-10-23 | 2002-05-02 | Angelika Weber | Verfahren und Vorrichtung zur automatischen Pflanzenauswahl und automatischen Zusammenstellung von Pflanzgruppen |
US6982169B2 (en) * | 2001-01-15 | 2006-01-03 | Morphotek, Inc. | Chemical inhibitors of mismatch repair |
EP1925672A1 (en) | 2001-06-22 | 2008-05-28 | Syngeta Participations AG | Abiotic stress responsive polynucleotides and polypeptides |
AU2002318437A1 (en) * | 2001-06-29 | 2003-03-03 | Clinomics Biosciences, Inc. | Evaluating neuropsychiatric diseases using a specimen-linked database |
AR037413A1 (es) * | 2001-11-27 | 2004-11-10 | Valent Biosciences Corp | Composicion herbicida intensificada |
US20050034188A1 (en) * | 2002-03-20 | 2005-02-10 | J. R. Simplot Company | Refined plant transformation |
AU2003230693B2 (en) * | 2002-03-20 | 2010-09-30 | J.R. Simplot Company | Refined plant transformation |
CA2662092C (en) | 2003-04-29 | 2012-07-17 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Novel glyphosate-n-acetyltransferase (gat) genes |
US6849579B2 (en) * | 2003-06-25 | 2005-02-01 | Pbi Gordon Corporation | Synergistic quinclorac herbicidal compositions |
US20070169227A1 (en) | 2003-12-16 | 2007-07-19 | Pioneer Hi-Bred International Inc. | Dominant Gene Suppression Transgenes and Methods of Using Same |
CN104293826A (zh) | 2003-12-16 | 2015-01-21 | 先锋高级育种国际公司 | 显性基因抑制性转基因及其使用方法 |
US7780793B2 (en) * | 2004-02-26 | 2010-08-24 | Applied Materials, Inc. | Passivation layer formation by plasma clean process to reduce native oxide growth |
US20060051966A1 (en) * | 2004-02-26 | 2006-03-09 | Applied Materials, Inc. | In-situ chamber clean process to remove by-product deposits from chemical vapor etch chamber |
US20050230350A1 (en) | 2004-02-26 | 2005-10-20 | Applied Materials, Inc. | In-situ dry clean chamber for front end of line fabrication |
JP4720223B2 (ja) * | 2004-05-18 | 2011-07-13 | 住友化学株式会社 | 除草活性化合物耐性植物 |
AR053563A1 (es) * | 2005-03-21 | 2007-05-09 | Basf Ag | Mezclas insecticidas |
AU2006242193A1 (en) | 2005-05-02 | 2006-11-09 | Purdue Research Foundation | Methods for increasing the yield of fermentable sugars from plant stover |
US7842856B2 (en) | 2005-08-25 | 2010-11-30 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Herbicide resistance gene, compositions and methods |
US7671254B2 (en) * | 2005-08-25 | 2010-03-02 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Herbicide resistance gene, compositions and methods |
BRPI0708480A2 (pt) * | 2006-03-02 | 2011-05-31 | Athenix Corp | processos e composições para aperfeiçoada atividade de enzima em plantas transgênicas |
US7951995B2 (en) | 2006-06-28 | 2011-05-31 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Soybean event 3560.4.3.5 and compositions and methods for the identification and detection thereof |
EP2171085A4 (en) | 2007-06-01 | 2010-07-14 | Sapphire Energy | SCREENING OF GENETICALLY MODIFIED PHOTOSYNTHETIC ORGANISMS WITH HIGH THROUGHPUT |
CA2698801A1 (en) | 2007-09-11 | 2009-03-19 | Sapphire Energy, Inc. | Molecule production by photosynthetic organisms |
US8314222B2 (en) | 2007-10-05 | 2012-11-20 | Sapphire Energy, Inc. | System for capturing and modifying large pieces of genomic DNA and constructing organisms with chloroplasts |
US8097712B2 (en) | 2007-11-07 | 2012-01-17 | Beelogics Inc. | Compositions for conferring tolerance to viral disease in social insects, and the use thereof |
AU2008321074A1 (en) * | 2007-11-13 | 2009-05-22 | Sapphire Energy, Inc. | Production of Fc-fusion polypeptides in eukaryotic algae |
US7947877B2 (en) * | 2008-05-14 | 2011-05-24 | Monosanto Technology LLC | Plants and seeds of spring canola variety SCV328921 |
US7935870B2 (en) * | 2008-05-14 | 2011-05-03 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of spring canola variety SCV354718 |
US7964774B2 (en) * | 2008-05-14 | 2011-06-21 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of spring canola variety SCV384196 |
US8829282B2 (en) * | 2008-05-14 | 2014-09-09 | Monsanto Technology, Llc | Plants and seeds of spring canola variety SCV425044 |
PT2294179E (pt) | 2008-06-27 | 2014-07-08 | Sapphire Energy Inc | Indução de floculação em organismos fotossintéticos |
US8748695B2 (en) * | 2008-07-23 | 2014-06-10 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Molecular markers linked to PPO inhibitor tolerance in soybeans |
US8697941B2 (en) * | 2008-07-23 | 2014-04-15 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Molecular markers linked to PPO inhibitor tolerance in soybeans |
CN102216453B (zh) | 2008-09-26 | 2014-02-05 | 巴斯夫农化产品有限公司 | 除草剂-抗性的ahas-突变体及使用方法 |
US8373025B2 (en) | 2009-02-09 | 2013-02-12 | Chromatin Germplasm, Llc | Herbicide resistant sorghum |
WO2010147825A1 (en) | 2009-06-09 | 2010-12-23 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Early endosperm promoter and methods of use |
US8071848B2 (en) * | 2009-06-17 | 2011-12-06 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of spring canola variety SCV218328 |
EP2638804A1 (en) | 2009-09-30 | 2013-09-18 | Basf Se | Low volatile amine salts of anionic pesticides |
US8962584B2 (en) | 2009-10-14 | 2015-02-24 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. | Compositions for controlling Varroa mites in bees |
WO2011056544A1 (en) | 2009-10-26 | 2011-05-12 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Somatic ovule specific promoter and methods of use |
GB0920891D0 (en) | 2009-11-27 | 2010-01-13 | Syngenta Participations Ag | Herbicidal compositions |
WO2011094199A1 (en) * | 2010-01-26 | 2011-08-04 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Polynucleotide and polypeptide sequences associated with herbicide tolerance |
US8148611B2 (en) * | 2010-02-26 | 2012-04-03 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of spring canola variety SCV453784 |
US8143488B2 (en) * | 2010-02-26 | 2012-03-27 | Monsanto Technoloy LLC | Plants and seeds of spring canola variety SCV470336 |
US8138394B2 (en) * | 2010-02-26 | 2012-03-20 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of spring canola variety SCV431158 |
CA2790211C (en) | 2010-03-08 | 2020-06-09 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for delivering polynucleotides into plants |
US8581048B2 (en) * | 2010-03-09 | 2013-11-12 | Monsanto Technology, Llc | Plants and seeds of spring canola variety SCV119103 |
US8153865B2 (en) * | 2010-03-11 | 2012-04-10 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of spring canola variety SCV152154 |
US9324576B2 (en) | 2010-05-27 | 2016-04-26 | Applied Materials, Inc. | Selective etch for silicon films |
AU2015271948A1 (en) * | 2010-08-03 | 2016-01-21 | Cibus Europe B.V. | Mutated protoporphyrinogen IX oxidase (PPX) genes |
UA112969C2 (uk) * | 2010-08-03 | 2016-11-25 | Сібас Юс Ллс | Рослина, стійка до одного або більше ррх-інгібуючих гербіцидів, яка містить мутантний ген протопорфіриноген ix оксидази (ррх) |
US20120122223A1 (en) | 2010-08-03 | 2012-05-17 | Cibus Us Llc | Mutated protoporphyrinogen ix oxidase (ppx) genes |
AU2011289283B2 (en) | 2010-08-13 | 2015-04-30 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Chimeric promoters and methods of use |
EP2460404A1 (en) | 2010-12-01 | 2012-06-06 | Basf Se | Compositions containing identical polyamine salts of mixed anionic pesticides |
UA122558C2 (uk) | 2010-11-24 | 2020-12-10 | Піонер Хай-Бред Інтернешнл, Інк. | Рослина brassica, яка є стійкою до гліфосату, та спосіб її одержання |
WO2012071039A1 (en) | 2010-11-24 | 2012-05-31 | Pioner Hi-Bred International, Inc. | Brassica gat event dp-061061-7 and compositions and methods for the identification and/or detection thereof |
CA2820706C (en) | 2010-12-03 | 2018-05-22 | Ms Technologies, Llc | Optimized expression of glyphosate resistance encoding nucleic acid molecules in plant cells |
TWI667347B (zh) | 2010-12-15 | 2019-08-01 | 瑞士商先正達合夥公司 | 大豆品種syht0h2及偵測其之組合物及方法 |
EP2652139B1 (en) | 2010-12-16 | 2021-10-20 | BASF Agro B.V. | Plants having increased tolerance to herbicides |
US10283321B2 (en) | 2011-01-18 | 2019-05-07 | Applied Materials, Inc. | Semiconductor processing system and methods using capacitively coupled plasma |
US8771539B2 (en) | 2011-02-22 | 2014-07-08 | Applied Materials, Inc. | Remotely-excited fluorine and water vapor etch |
US9064815B2 (en) | 2011-03-14 | 2015-06-23 | Applied Materials, Inc. | Methods for etch of metal and metal-oxide films |
US8999856B2 (en) | 2011-03-14 | 2015-04-07 | Applied Materials, Inc. | Methods for etch of sin films |
US8648230B2 (en) | 2011-03-18 | 2014-02-11 | Ms Technologies, Llc | Regulatory regions preferentially expressing in non-pollen plant tissue |
US8513487B2 (en) | 2011-04-07 | 2013-08-20 | Zenon LISIECZKO | Plants and seeds of spring canola variety ND-662c |
US8513494B2 (en) | 2011-04-08 | 2013-08-20 | Chunren Wu | Plants and seeds of spring canola variety SCV695971 |
US9198412B2 (en) | 2011-05-02 | 2015-12-01 | Basf Se | Method for enhancing the performance of a pesticide with guanidines |
US8507761B2 (en) | 2011-05-05 | 2013-08-13 | Teresa Huskowska | Plants and seeds of spring canola variety SCV372145 |
US8513495B2 (en) | 2011-05-10 | 2013-08-20 | Dale Burns | Plants and seeds of spring canola variety SCV291489 |
GB201109239D0 (en) | 2011-06-01 | 2011-07-13 | Syngenta Participations Ag | Herbicidal compositions |
BR112013029907A2 (pt) | 2011-06-01 | 2016-08-09 | Basf Se | método de controle de vegetação indesejada e uso de uma base |
CN105745320A (zh) | 2011-07-22 | 2016-07-06 | 赖斯泰克股份公司 | 产生 acc 酶抑制剂抗性水稻的方法和组合物 |
US9303270B2 (en) | 2011-07-22 | 2016-04-05 | Ricetec Aktiengesellschaft | Rice resistant to HPPD and accase inhibiting herbicides |
US8771536B2 (en) | 2011-08-01 | 2014-07-08 | Applied Materials, Inc. | Dry-etch for silicon-and-carbon-containing films |
CA2842346A1 (en) | 2011-08-02 | 2013-02-07 | Basf Se | Aqueous composition comprising a pesticide and a base selected from an alkali salt of hydrogencarbonate |
US8785729B2 (en) | 2011-08-09 | 2014-07-22 | Nunhems, B.V. | Lettuce variety redglace |
US8679982B2 (en) | 2011-08-26 | 2014-03-25 | Applied Materials, Inc. | Selective suppression of dry-etch rate of materials containing both silicon and oxygen |
US8679983B2 (en) | 2011-09-01 | 2014-03-25 | Applied Materials, Inc. | Selective suppression of dry-etch rate of materials containing both silicon and nitrogen |
US8754293B2 (en) | 2011-09-09 | 2014-06-17 | Nunhems B.V. | Lettuce variety intred |
BR112014005795A2 (pt) | 2011-09-13 | 2020-12-08 | Monsanto Technology Llc | métodos de controle de plantas, de redução da expressão de um gene de hppd de uma planta, de preparação de um nucleotídeo, e de identificação de polinucleotídeos úteis na modulação da expressão do gene de hppd no tratamento externo de uma planta, composições e cassete de expressão microbiana |
US10760086B2 (en) | 2011-09-13 | 2020-09-01 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
EP2755466A4 (en) | 2011-09-13 | 2015-04-15 | Monsanto Technology Llc | METHODS AND COMPOSITIONS FOR CONTROLLING WEEDS |
US10806146B2 (en) | 2011-09-13 | 2020-10-20 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
MX350774B (es) | 2011-09-13 | 2017-09-15 | Monsanto Technology Llc | Métodos y composiciones para el control de malezas. |
MX343072B (es) | 2011-09-13 | 2016-10-21 | Monsanto Technology Llc | Metodos y composiciones para controlar malezas. |
US10829828B2 (en) | 2011-09-13 | 2020-11-10 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
MX361938B (es) | 2011-09-13 | 2018-12-19 | Monsanto Technology Llc | Métodos y composiciones para el control de malezas. |
UA115534C2 (uk) | 2011-09-13 | 2017-11-27 | Монсанто Текнолоджи Ллс | Спосіб та композиція для боротьби з бур'янами (варіанти) |
US9840715B1 (en) | 2011-09-13 | 2017-12-12 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for delaying senescence and improving disease tolerance and yield in plants |
UY34328A (es) | 2011-09-13 | 2013-04-30 | Monsanto Technology Llc | ?composiciones y métodos para controlar malezas comprendiendo un polinucleótido y agente de transferencia, y que modulan protoporfirinógeno ix oxidasa?. |
EP2755987B1 (en) | 2011-09-13 | 2018-06-06 | Monsanto Technology LLC | Methods and compositions for weed control |
US9920326B1 (en) | 2011-09-14 | 2018-03-20 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for increasing invertase activity in plants |
US8927390B2 (en) | 2011-09-26 | 2015-01-06 | Applied Materials, Inc. | Intrench profile |
US8808563B2 (en) | 2011-10-07 | 2014-08-19 | Applied Materials, Inc. | Selective etch of silicon by way of metastable hydrogen termination |
WO2013070436A1 (en) | 2011-11-08 | 2013-05-16 | Applied Materials, Inc. | Methods of reducing substrate dislocation during gapfill processing |
US9204603B2 (en) | 2011-12-21 | 2015-12-08 | The Curators Of The University Of Missouri | Soybean variety S05-11482 |
US20130167262A1 (en) | 2011-12-21 | 2013-06-27 | The Curators Of The University Of Missouri | Soybean variety s05-11268 |
US9380756B2 (en) | 2012-01-04 | 2016-07-05 | Nunhems B.V. | Lettuce variety multigreen 50 |
WO2013103371A1 (en) | 2012-01-06 | 2013-07-11 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Ovule specific promoter and methods of use |
US9006515B2 (en) | 2012-01-06 | 2015-04-14 | Pioneer Hi Bred International Inc | Pollen preferred promoters and methods of use |
WO2013109754A1 (en) | 2012-01-17 | 2013-07-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Plant transcription factors, promoters and uses thereof |
AP2014007886A0 (en) | 2012-02-01 | 2014-08-31 | Dow Agrosciences Llc | Synthetic chloroplast transit peptides |
US9644213B2 (en) | 2012-03-09 | 2017-05-09 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Method of enhancing plant drought tolerance by expression of NDR1 |
WO2013138309A1 (en) | 2012-03-13 | 2013-09-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Genetic reduction of male fertility in plants |
EA201491670A1 (ru) | 2012-03-13 | 2015-07-30 | Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. | Генетическое снижение мужской репродуктивной функции у растений |
WO2013139779A1 (en) | 2012-03-21 | 2013-09-26 | Basf Se | Glyphosate tank mix adjuvant comprising a base selected from a carbonate and/or a phosphate |
AR090385A1 (es) | 2012-03-21 | 2014-11-05 | Basf Se | Adyuvante de mezcla en tanque liquido o particulado que comprende una base seleccionada de una mezcla de carbonato e hidrogenocarbonato |
EA201691456A1 (ru) | 2012-03-21 | 2016-11-30 | Басф Се | Адъювант баковой смеси, содержащий алкилполиглюкозид и основание |
CN104219955A (zh) | 2012-03-21 | 2014-12-17 | 巴斯夫欧洲公司 | 包含选自碳酸盐和/或磷酸盐的碱的固体颗粒状桶混物助剂 |
US8835720B2 (en) | 2012-04-26 | 2014-09-16 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of spring canola variety SCV967592 |
US8802935B2 (en) | 2012-04-26 | 2014-08-12 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of spring canola variety SCV942568 |
US8878009B2 (en) | 2012-04-26 | 2014-11-04 | Monsanto Technology, LLP | Plants and seeds of spring canola variety SCV318181 |
US8859857B2 (en) | 2012-04-26 | 2014-10-14 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of spring canola variety SCV259778 |
CN102747013B (zh) * | 2012-05-22 | 2014-10-15 | 中国农业科学院烟草研究所 | 一种兼抗烟草黑胫病和青枯病的生防菌株Trb3 |
CN104619843B (zh) | 2012-05-24 | 2020-03-06 | A.B.种子有限公司 | 用于使基因表达沉默的组合物和方法 |
WO2013188291A2 (en) | 2012-06-15 | 2013-12-19 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Methods and compositions involving als variants with native substrate preference |
AR091489A1 (es) | 2012-06-19 | 2015-02-11 | Basf Se | Plantas que tienen una mayor tolerancia a herbicidas inhibidores de la protoporfirinogeno oxidasa (ppo) |
US10041087B2 (en) | 2012-06-19 | 2018-08-07 | BASF Agro B.V. | Plants having increased tolerance to herbicides |
WO2013189773A1 (en) | 2012-06-21 | 2013-12-27 | Basf Se | An aqueous composition comprising dicamba and a drift control agent |
WO2014006047A1 (en) | 2012-07-03 | 2014-01-09 | Basf Se | Highly concentrated aqueous formulation comprising an anionic pesticide and a base |
US20150150249A1 (en) | 2012-07-09 | 2015-06-04 | Basf Se | Drift control agent comprising polypropylene glycol and a triblock polymer |
US9267739B2 (en) | 2012-07-18 | 2016-02-23 | Applied Materials, Inc. | Pedestal with multi-zone temperature control and multiple purge capabilities |
US9373517B2 (en) | 2012-08-02 | 2016-06-21 | Applied Materials, Inc. | Semiconductor processing with DC assisted RF power for improved control |
US9034770B2 (en) | 2012-09-17 | 2015-05-19 | Applied Materials, Inc. | Differential silicon oxide etch |
US9023734B2 (en) | 2012-09-18 | 2015-05-05 | Applied Materials, Inc. | Radical-component oxide etch |
US9390937B2 (en) | 2012-09-20 | 2016-07-12 | Applied Materials, Inc. | Silicon-carbon-nitride selective etch |
US9132436B2 (en) | 2012-09-21 | 2015-09-15 | Applied Materials, Inc. | Chemical control features in wafer process equipment |
US20140109259A1 (en) | 2012-10-11 | 2014-04-17 | Pioneer Hi Bred International Inc | Guard Cell Promoters and Uses Thereof |
US10077451B2 (en) | 2012-10-18 | 2018-09-18 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for plant pest control |
US8765574B2 (en) | 2012-11-09 | 2014-07-01 | Applied Materials, Inc. | Dry etch process |
US8969212B2 (en) | 2012-11-20 | 2015-03-03 | Applied Materials, Inc. | Dry-etch selectivity |
US9064816B2 (en) | 2012-11-30 | 2015-06-23 | Applied Materials, Inc. | Dry-etch for selective oxidation removal |
US8980763B2 (en) | 2012-11-30 | 2015-03-17 | Applied Materials, Inc. | Dry-etch for selective tungsten removal |
US20140173775A1 (en) | 2012-12-13 | 2014-06-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions for producing and selecting transgenic plants |
US9111877B2 (en) | 2012-12-18 | 2015-08-18 | Applied Materials, Inc. | Non-local plasma oxide etch |
WO2014100525A2 (en) | 2012-12-21 | 2014-06-26 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods for auxin-analog conjugation |
US8921234B2 (en) | 2012-12-21 | 2014-12-30 | Applied Materials, Inc. | Selective titanium nitride etching |
US10683505B2 (en) | 2013-01-01 | 2020-06-16 | Monsanto Technology Llc | Methods of introducing dsRNA to plant seeds for modulating gene expression |
UA118841C2 (uk) | 2013-01-01 | 2019-03-25 | Ей.Бі. СІДС ЛТД. | Спосіб формування рослини, яка має підвищену стійкість до комахи-шкідника |
US10000767B2 (en) | 2013-01-28 | 2018-06-19 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for plant pest control |
US10256079B2 (en) | 2013-02-08 | 2019-04-09 | Applied Materials, Inc. | Semiconductor processing systems having multiple plasma configurations |
US9362130B2 (en) | 2013-03-01 | 2016-06-07 | Applied Materials, Inc. | Enhanced etching processes using remote plasma sources |
US9040422B2 (en) | 2013-03-05 | 2015-05-26 | Applied Materials, Inc. | Selective titanium nitride removal |
US8801952B1 (en) | 2013-03-07 | 2014-08-12 | Applied Materials, Inc. | Conformal oxide dry etch |
US10170282B2 (en) | 2013-03-08 | 2019-01-01 | Applied Materials, Inc. | Insulated semiconductor faceplate designs |
AU2014248958A1 (en) | 2013-03-13 | 2015-10-01 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
EP2971185A4 (en) | 2013-03-13 | 2017-03-08 | Monsanto Technology LLC | Methods and compositions for weed control |
EA028528B1 (ru) | 2013-03-13 | 2017-11-30 | Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. | Внесение глифосата для борьбы с сорняками у brassica |
US20140289906A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions Having Dicamba Decarboxylase Activity and Methods of Use |
BR112015023304A2 (pt) | 2013-03-14 | 2017-07-18 | Pioneer Hi Bred Int | método para melhorar a tolerância ao estresse abiótico de uma planta, planta e semente |
CN115960896A (zh) | 2013-03-14 | 2023-04-14 | 先锋国际良种公司 | 用以防治昆虫害虫的组合物和方法 |
AU2014236162A1 (en) | 2013-03-14 | 2015-09-17 | Arzeda Corp. | Compositions having dicamba decarboxylase activity and methods of use |
US20140283211A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-18 | Monsanto Technology Llc | Methods and Compositions for Plant Pest Control |
WO2014150914A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Phi-4 polypeptides and methods for their use |
BR112015023700A2 (pt) | 2013-03-15 | 2017-07-18 | Pioneer Hi Bred Int | método de aprimoramento da tolerância ao estresse abiótico em uma planta de cultura agrícola , planta de milho transgênica, célula vegetal, semente, método de regulação negativa de um gene de acc oxidase endógeno em uma planta de milho. |
US20140271097A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Applied Materials, Inc. | Processing systems and methods for halide scavenging |
US10568328B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-02-25 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
US8895449B1 (en) | 2013-05-16 | 2014-11-25 | Applied Materials, Inc. | Delicate dry clean |
US9114438B2 (en) | 2013-05-21 | 2015-08-25 | Applied Materials, Inc. | Copper residue chamber clean |
US9493879B2 (en) | 2013-07-12 | 2016-11-15 | Applied Materials, Inc. | Selective sputtering for pattern transfer |
US9850496B2 (en) | 2013-07-19 | 2017-12-26 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for controlling Leptinotarsa |
EP3030663B1 (en) | 2013-07-19 | 2019-09-04 | Monsanto Technology LLC | Compositions and methods for controlling leptinotarsa |
US20160219812A1 (en) | 2013-07-25 | 2016-08-04 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Method for producing hybrid brassica seed |
EA201690374A1 (ru) * | 2013-08-12 | 2016-07-29 | Басф Агро Б.В. | Растения с повышенной устойчивостью к гербицидам |
CA2920591A1 (en) | 2013-08-12 | 2015-02-19 | BASF Agro B.V. | Plants having increased tolerance to herbicides |
EA030896B1 (ru) | 2013-08-16 | 2018-10-31 | Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. | Инсектицидные белки и способы их применения |
US9773648B2 (en) | 2013-08-30 | 2017-09-26 | Applied Materials, Inc. | Dual discharge modes operation for remote plasma |
BR122020001770B1 (pt) | 2013-09-13 | 2022-11-29 | Pioneer Hi-Bred International, Inc | Construto de dna, método de obtenção de planta transgênica, proteína de fusão, método para controlar uma população de praga de inseto, método para inibir o crescimento ou matar uma praga de inseto |
US8956980B1 (en) | 2013-09-16 | 2015-02-17 | Applied Materials, Inc. | Selective etch of silicon nitride |
US10329578B2 (en) | 2013-10-18 | 2019-06-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Glyphosate-N-acetyltransferase (GLYAT) sequences and methods of use |
US20150113681A1 (en) * | 2013-10-23 | 2015-04-23 | Syngenta Participations Ag | Composition and method for enhancing plant transformation |
BR112016008036A2 (pt) | 2013-10-25 | 2018-01-16 | Pioneer Hi Bred Int | método de identificação de uma primeira planta, kit, polinucleotídeo isolado, planta, germoplasma ou grão de soja |
US8951429B1 (en) | 2013-10-29 | 2015-02-10 | Applied Materials, Inc. | Tungsten oxide processing |
CN106232821A (zh) | 2013-11-04 | 2016-12-14 | 美国陶氏益农公司 | 最优大豆座位 |
US9236265B2 (en) | 2013-11-04 | 2016-01-12 | Applied Materials, Inc. | Silicon germanium processing |
US9576809B2 (en) | 2013-11-04 | 2017-02-21 | Applied Materials, Inc. | Etch suppression with germanium |
RU2019128647A (ru) | 2013-11-04 | 2019-11-05 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | Оптимальные локусы кукурузы |
CN105849266A (zh) | 2013-11-04 | 2016-08-10 | 孟山都技术公司 | 控制节肢动物寄生物和害虫侵染的组合物和方法 |
BR102014027438B1 (pt) | 2013-11-04 | 2022-09-27 | Dow Agrosciences Llc | Molécula de ácido nucleico recombinante e método de produção de uma célula vegetal transgênica |
US9520303B2 (en) | 2013-11-12 | 2016-12-13 | Applied Materials, Inc. | Aluminum selective etch |
US9245762B2 (en) | 2013-12-02 | 2016-01-26 | Applied Materials, Inc. | Procedure for etch rate consistency |
US9117855B2 (en) | 2013-12-04 | 2015-08-25 | Applied Materials, Inc. | Polarity control for remote plasma |
UA119253C2 (uk) | 2013-12-10 | 2019-05-27 | Біолоджикс, Інк. | Спосіб боротьби із вірусом у кліща varroa та у бджіл |
US9287095B2 (en) | 2013-12-17 | 2016-03-15 | Applied Materials, Inc. | Semiconductor system assemblies and methods of operation |
US9263278B2 (en) | 2013-12-17 | 2016-02-16 | Applied Materials, Inc. | Dopant etch selectivity control |
EP3083968A4 (en) * | 2013-12-18 | 2017-10-11 | BASF Agro B.V. | Plants having increased tolerance to herbicides |
US9190293B2 (en) | 2013-12-18 | 2015-11-17 | Applied Materials, Inc. | Even tungsten etch for high aspect ratio trenches |
TW201527312A (zh) | 2013-12-31 | 2015-07-16 | Dow Agrosciences Llc | 新穎玉米泛素啓動子(一) |
TW201527316A (zh) | 2013-12-31 | 2015-07-16 | Dow Agrosciences Llc | 新穎玉米泛素啓動子(五) |
TW201527314A (zh) | 2013-12-31 | 2015-07-16 | Dow Agrosciences Llc | 新穎玉米泛素啓動子(三) |
TW201527313A (zh) | 2013-12-31 | 2015-07-16 | Dow Agrosciences Llc | 新穎玉米泛素啓動子(二) |
BR112016016337A2 (pt) | 2014-01-15 | 2017-10-03 | Monsanto Technology Llc | Composição e métodos para controlar crescimento, desenvolvimento ou a capacidade de reprodução de uma planta, e para sensibilizar uma planta para um herbicida inibidor de epsps |
US9287134B2 (en) | 2014-01-17 | 2016-03-15 | Applied Materials, Inc. | Titanium oxide etch |
US9396989B2 (en) | 2014-01-27 | 2016-07-19 | Applied Materials, Inc. | Air gaps between copper lines |
US9293568B2 (en) | 2014-01-27 | 2016-03-22 | Applied Materials, Inc. | Method of fin patterning |
US9385028B2 (en) | 2014-02-03 | 2016-07-05 | Applied Materials, Inc. | Air gap process |
CN106232620B (zh) | 2014-02-07 | 2022-05-13 | 先锋国际良种公司 | 杀昆虫蛋白及其使用方法 |
US10227608B2 (en) | 2014-02-07 | 2019-03-12 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins from plants and methods for their use |
TW201538518A (zh) | 2014-02-28 | 2015-10-16 | Dow Agrosciences Llc | 藉由嵌合基因調控元件所賦予之根部特異性表現 |
US9499898B2 (en) | 2014-03-03 | 2016-11-22 | Applied Materials, Inc. | Layered thin film heater and method of fabrication |
US9299575B2 (en) | 2014-03-17 | 2016-03-29 | Applied Materials, Inc. | Gas-phase tungsten etch |
US9299537B2 (en) | 2014-03-20 | 2016-03-29 | Applied Materials, Inc. | Radial waveguide systems and methods for post-match control of microwaves |
US9299538B2 (en) | 2014-03-20 | 2016-03-29 | Applied Materials, Inc. | Radial waveguide systems and methods for post-match control of microwaves |
US9136273B1 (en) | 2014-03-21 | 2015-09-15 | Applied Materials, Inc. | Flash gate air gap |
US9903020B2 (en) | 2014-03-31 | 2018-02-27 | Applied Materials, Inc. | Generation of compact alumina passivation layers on aluminum plasma equipment components |
US11091770B2 (en) | 2014-04-01 | 2021-08-17 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for controlling insect pests |
US9269590B2 (en) | 2014-04-07 | 2016-02-23 | Applied Materials, Inc. | Spacer formation |
US9309598B2 (en) | 2014-05-28 | 2016-04-12 | Applied Materials, Inc. | Oxide and metal removal |
US9847289B2 (en) | 2014-05-30 | 2017-12-19 | Applied Materials, Inc. | Protective via cap for improved interconnect performance |
US9406523B2 (en) | 2014-06-19 | 2016-08-02 | Applied Materials, Inc. | Highly selective doped oxide removal method |
US9378969B2 (en) | 2014-06-19 | 2016-06-28 | Applied Materials, Inc. | Low temperature gas-phase carbon removal |
EP3158067B1 (en) | 2014-06-23 | 2020-08-12 | Monsanto Technology LLC | Compositions and methods for regulating gene expression via rna interference |
EP3161138A4 (en) | 2014-06-25 | 2017-12-06 | Monsanto Technology LLC | Methods and compositions for delivering nucleic acids to plant cells and regulating gene expression |
RS60016B1 (sr) | 2014-06-26 | 2020-04-30 | Basf Agrochemical Products Bv | Tretiranje semena inhibitorima acetolaktat sintaze (als) |
US9425058B2 (en) | 2014-07-24 | 2016-08-23 | Applied Materials, Inc. | Simplified litho-etch-litho-etch process |
US10378012B2 (en) | 2014-07-29 | 2019-08-13 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for controlling insect pests |
US9496167B2 (en) | 2014-07-31 | 2016-11-15 | Applied Materials, Inc. | Integrated bit-line airgap formation and gate stack post clean |
US9378978B2 (en) | 2014-07-31 | 2016-06-28 | Applied Materials, Inc. | Integrated oxide recess and floating gate fin trimming |
US9159606B1 (en) | 2014-07-31 | 2015-10-13 | Applied Materials, Inc. | Metal air gap |
US9165786B1 (en) | 2014-08-05 | 2015-10-20 | Applied Materials, Inc. | Integrated oxide and nitride recess for better channel contact in 3D architectures |
US9659753B2 (en) | 2014-08-07 | 2017-05-23 | Applied Materials, Inc. | Grooved insulator to reduce leakage current |
US20170218384A1 (en) | 2014-08-08 | 2017-08-03 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Ubiquitin promoters and introns and methods of use |
US9553102B2 (en) | 2014-08-19 | 2017-01-24 | Applied Materials, Inc. | Tungsten separation |
US9355856B2 (en) | 2014-09-12 | 2016-05-31 | Applied Materials, Inc. | V trench dry etch |
CA2961733A1 (en) | 2014-09-17 | 2016-03-24 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
US9368364B2 (en) | 2014-09-24 | 2016-06-14 | Applied Materials, Inc. | Silicon etch process with tunable selectivity to SiO2 and other materials |
US9478434B2 (en) | 2014-09-24 | 2016-10-25 | Applied Materials, Inc. | Chlorine-based hardmask removal |
US9613822B2 (en) | 2014-09-25 | 2017-04-04 | Applied Materials, Inc. | Oxide etch selectivity enhancement |
US9355922B2 (en) | 2014-10-14 | 2016-05-31 | Applied Materials, Inc. | Systems and methods for internal surface conditioning in plasma processing equipment |
US9966240B2 (en) | 2014-10-14 | 2018-05-08 | Applied Materials, Inc. | Systems and methods for internal surface conditioning assessment in plasma processing equipment |
US10435706B2 (en) | 2014-10-16 | 2019-10-08 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
US10219515B2 (en) | 2014-11-07 | 2019-03-05 | Basf Se | Agrochemical adjuvant containing 2-oxo-1,3-dioxolan-4 carboxylates |
US11637002B2 (en) | 2014-11-26 | 2023-04-25 | Applied Materials, Inc. | Methods and systems to enhance process uniformity |
US9299583B1 (en) | 2014-12-05 | 2016-03-29 | Applied Materials, Inc. | Aluminum oxide selective etch |
US10573496B2 (en) | 2014-12-09 | 2020-02-25 | Applied Materials, Inc. | Direct outlet toroidal plasma source |
US10224210B2 (en) | 2014-12-09 | 2019-03-05 | Applied Materials, Inc. | Plasma processing system with direct outlet toroidal plasma source |
WO2016099916A1 (en) | 2014-12-19 | 2016-06-23 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Polylactic acid compositions with accelerated degradation rate and increased heat stability |
US9502258B2 (en) | 2014-12-23 | 2016-11-22 | Applied Materials, Inc. | Anisotropic gap etch |
AU2015373893B2 (en) | 2014-12-31 | 2021-07-29 | Synthetic Genomics, Inc. | Compositions and methods for high efficiency in vivo genome editing |
US9343272B1 (en) | 2015-01-08 | 2016-05-17 | Applied Materials, Inc. | Self-aligned process |
US11257693B2 (en) | 2015-01-09 | 2022-02-22 | Applied Materials, Inc. | Methods and systems to improve pedestal temperature control |
EP3256589B1 (en) | 2015-01-22 | 2021-12-22 | Monsanto Technology LLC | Compositions and methods for controlling leptinotarsa |
US9373522B1 (en) | 2015-01-22 | 2016-06-21 | Applied Mateials, Inc. | Titanium nitride removal |
US9449846B2 (en) | 2015-01-28 | 2016-09-20 | Applied Materials, Inc. | Vertical gate separation |
US9728437B2 (en) | 2015-02-03 | 2017-08-08 | Applied Materials, Inc. | High temperature chuck for plasma processing systems |
US20160225652A1 (en) | 2015-02-03 | 2016-08-04 | Applied Materials, Inc. | Low temperature chuck for plasma processing systems |
US9881805B2 (en) | 2015-03-02 | 2018-01-30 | Applied Materials, Inc. | Silicon selective removal |
CN108064233B (zh) | 2015-05-19 | 2022-07-15 | 先锋国际良种公司 | 杀昆虫蛋白及其使用方法 |
CN107750125A (zh) | 2015-06-02 | 2018-03-02 | 孟山都技术有限公司 | 用于将多核苷酸递送至植物中的组合物和方法 |
AU2016270913A1 (en) | 2015-06-03 | 2018-01-04 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for introducing nucleic acids into plants |
CA2986265A1 (en) | 2015-06-16 | 2016-12-22 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
CA2993656A1 (en) * | 2015-08-03 | 2017-02-09 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for herbicide tolerance in plants |
CA2994676A1 (en) | 2015-08-06 | 2017-02-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Plant derived insecticidal proteins and methods for their use |
US9691645B2 (en) | 2015-08-06 | 2017-06-27 | Applied Materials, Inc. | Bolted wafer chuck thermal management systems and methods for wafer processing systems |
US9741593B2 (en) | 2015-08-06 | 2017-08-22 | Applied Materials, Inc. | Thermal management systems and methods for wafer processing systems |
US9349605B1 (en) | 2015-08-07 | 2016-05-24 | Applied Materials, Inc. | Oxide etch selectivity systems and methods |
US10504700B2 (en) | 2015-08-27 | 2019-12-10 | Applied Materials, Inc. | Plasma etching systems and methods with secondary plasma injection |
US10378023B2 (en) | 2015-09-01 | 2019-08-13 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for herbicide tolerance in plants |
CN108575091A (zh) | 2015-12-18 | 2018-09-25 | 先锋国际良种公司 | 杀昆虫蛋白及其使用方法 |
US11104911B2 (en) | 2015-12-22 | 2021-08-31 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Embryo-preferred Zea mays promoters and methods of use |
WO2017136204A1 (en) | 2016-02-05 | 2017-08-10 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Genetic loci associated with brown stem rot resistance in soybean and methods of use |
EA201892293A1 (ru) | 2016-05-04 | 2019-04-30 | Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. | Инсектицидные белки и способы их применения |
US10504754B2 (en) | 2016-05-19 | 2019-12-10 | Applied Materials, Inc. | Systems and methods for improved semiconductor etching and component protection |
US10522371B2 (en) | 2016-05-19 | 2019-12-31 | Applied Materials, Inc. | Systems and methods for improved semiconductor etching and component protection |
BR112018072473A2 (pt) | 2016-05-20 | 2019-02-19 | Basf Agro Bv | molécula de ácido nucleico, cassete de expressão, célula vegetal, planta, semente, métodos para expressar um ácido nucleico, produzir uma planta, controlar vegetação e cultivar a planta, combinação útil para o controle, processo para preparar uma combinação e uso de uma combinação |
CA3027736A1 (en) | 2016-06-16 | 2017-12-21 | Nuseed Pty Ltd. | Inbred transgenic canola line ns-b50027-4 and seeds thereof |
CN109312359A (zh) | 2016-06-16 | 2019-02-05 | 先锋国际良种公司 | 用以防治昆虫有害生物的组合物和方法 |
MX2023000286A (es) | 2016-06-16 | 2023-02-09 | Nuseed Nutritional Australia Pty Ltd | Canola evento elite ns-b50027-4. |
MX2018015900A (es) | 2016-06-24 | 2019-04-04 | Pioneer Hi Bred Int | Elementos reguladores de planta y metodos para usarlos. |
CA3029271A1 (en) | 2016-06-28 | 2018-01-04 | Cellectis | Altering expression of gene products in plants through targeted insertion of nucleic acid sequences |
US9865484B1 (en) | 2016-06-29 | 2018-01-09 | Applied Materials, Inc. | Selective etch using material modification and RF pulsing |
EP3954202A1 (en) | 2016-07-01 | 2022-02-16 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins from plants and methods for their use |
US20210292778A1 (en) | 2016-07-12 | 2021-09-23 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
CN109790153A (zh) | 2016-07-27 | 2019-05-21 | 巴斯夫农业公司 | 具有增加的除草剂耐受性的植物 |
CN109475099A (zh) * | 2016-07-29 | 2019-03-15 | 孟山都技术公司 | 用于在植物中进行基因表达的方法和组合物 |
EP3494224B1 (en) | 2016-08-05 | 2022-03-30 | Ricetec, Inc. | Methods and compositions for combinations of mutations associated with herbicide resistance/tolerance in rice |
US10629473B2 (en) | 2016-09-09 | 2020-04-21 | Applied Materials, Inc. | Footing removal for nitride spacer |
US10062575B2 (en) | 2016-09-09 | 2018-08-28 | Applied Materials, Inc. | Poly directional etch by oxidation |
US10062585B2 (en) | 2016-10-04 | 2018-08-28 | Applied Materials, Inc. | Oxygen compatible plasma source |
US9934942B1 (en) | 2016-10-04 | 2018-04-03 | Applied Materials, Inc. | Chamber with flow-through source |
US9721789B1 (en) | 2016-10-04 | 2017-08-01 | Applied Materials, Inc. | Saving ion-damaged spacers |
US10546729B2 (en) | 2016-10-04 | 2020-01-28 | Applied Materials, Inc. | Dual-channel showerhead with improved profile |
US10062579B2 (en) | 2016-10-07 | 2018-08-28 | Applied Materials, Inc. | Selective SiN lateral recess |
US9947549B1 (en) | 2016-10-10 | 2018-04-17 | Applied Materials, Inc. | Cobalt-containing material removal |
CN109863167B (zh) | 2016-11-01 | 2022-12-23 | 先锋国际良种公司 | 杀昆虫蛋白及其使用方法 |
US10163696B2 (en) | 2016-11-11 | 2018-12-25 | Applied Materials, Inc. | Selective cobalt removal for bottom up gapfill |
US9768034B1 (en) | 2016-11-11 | 2017-09-19 | Applied Materials, Inc. | Removal methods for high aspect ratio structures |
US10026621B2 (en) | 2016-11-14 | 2018-07-17 | Applied Materials, Inc. | SiN spacer profile patterning |
US10242908B2 (en) | 2016-11-14 | 2019-03-26 | Applied Materials, Inc. | Airgap formation with damage-free copper |
BR112019012763A2 (pt) | 2016-12-20 | 2019-12-10 | Basf Agro Bv | vegetais ou partes de vegetais, semente capaz de germinação em um vegetal, célula de vegetal ou capaz de regenerar um vegetal, célula de vegetal, produto de vegetal, progênie ou vegetal descendente, métodos para o controle de ervas daninhas e a produção de um vegetal, molécula de ácido nucléico, cassete de expressão, vetor, polipeptídeo de ppo mutada isolado, método para a produção de um produto de vegetal e produto de vegetal |
US10566206B2 (en) | 2016-12-27 | 2020-02-18 | Applied Materials, Inc. | Systems and methods for anisotropic material breakthrough |
US10403507B2 (en) | 2017-02-03 | 2019-09-03 | Applied Materials, Inc. | Shaped etch profile with oxidation |
US10431429B2 (en) | 2017-02-03 | 2019-10-01 | Applied Materials, Inc. | Systems and methods for radial and azimuthal control of plasma uniformity |
US10043684B1 (en) | 2017-02-06 | 2018-08-07 | Applied Materials, Inc. | Self-limiting atomic thermal etching systems and methods |
US10319739B2 (en) | 2017-02-08 | 2019-06-11 | Applied Materials, Inc. | Accommodating imperfectly aligned memory holes |
US10943834B2 (en) | 2017-03-13 | 2021-03-09 | Applied Materials, Inc. | Replacement contact process |
US10319649B2 (en) | 2017-04-11 | 2019-06-11 | Applied Materials, Inc. | Optical emission spectroscopy (OES) for remote plasma monitoring |
US11109591B2 (en) | 2017-04-24 | 2021-09-07 | Taminco Bvba | Single phase liquids of alkanolamine salts of dicamba |
US11276590B2 (en) | 2017-05-17 | 2022-03-15 | Applied Materials, Inc. | Multi-zone semiconductor substrate supports |
US11276559B2 (en) | 2017-05-17 | 2022-03-15 | Applied Materials, Inc. | Semiconductor processing chamber for multiple precursor flow |
US10049891B1 (en) | 2017-05-31 | 2018-08-14 | Applied Materials, Inc. | Selective in situ cobalt residue removal |
US10497579B2 (en) | 2017-05-31 | 2019-12-03 | Applied Materials, Inc. | Water-free etching methods |
US10920320B2 (en) | 2017-06-16 | 2021-02-16 | Applied Materials, Inc. | Plasma health determination in semiconductor substrate processing reactors |
US10541246B2 (en) | 2017-06-26 | 2020-01-21 | Applied Materials, Inc. | 3D flash memory cells which discourage cross-cell electrical tunneling |
US10727080B2 (en) | 2017-07-07 | 2020-07-28 | Applied Materials, Inc. | Tantalum-containing material removal |
US10541184B2 (en) | 2017-07-11 | 2020-01-21 | Applied Materials, Inc. | Optical emission spectroscopic techniques for monitoring etching |
US10354889B2 (en) | 2017-07-17 | 2019-07-16 | Applied Materials, Inc. | Non-halogen etching of silicon-containing materials |
US10170336B1 (en) | 2017-08-04 | 2019-01-01 | Applied Materials, Inc. | Methods for anisotropic control of selective silicon removal |
US10043674B1 (en) | 2017-08-04 | 2018-08-07 | Applied Materials, Inc. | Germanium etching systems and methods |
US10297458B2 (en) | 2017-08-07 | 2019-05-21 | Applied Materials, Inc. | Process window widening using coated parts in plasma etch processes |
CA3076831A1 (en) | 2017-09-25 | 2019-03-28 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Tissue-preferred promoters and methods of use |
US10128086B1 (en) | 2017-10-24 | 2018-11-13 | Applied Materials, Inc. | Silicon pretreatment for nitride removal |
US10283324B1 (en) | 2017-10-24 | 2019-05-07 | Applied Materials, Inc. | Oxygen treatment for nitride etching |
EP3716765A4 (en) | 2017-11-29 | 2021-08-25 | Basf Se | PLANTS WITH INCREASED TOLERANCE TO HERBICIDES |
US10256112B1 (en) | 2017-12-08 | 2019-04-09 | Applied Materials, Inc. | Selective tungsten removal |
CA3026528A1 (en) | 2017-12-15 | 2019-06-15 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for ppo herbicide tolerance |
US10903054B2 (en) | 2017-12-19 | 2021-01-26 | Applied Materials, Inc. | Multi-zone gas distribution systems and methods |
US11328909B2 (en) | 2017-12-22 | 2022-05-10 | Applied Materials, Inc. | Chamber conditioning and removal processes |
US10854426B2 (en) | 2018-01-08 | 2020-12-01 | Applied Materials, Inc. | Metal recess for semiconductor structures |
US10679870B2 (en) | 2018-02-15 | 2020-06-09 | Applied Materials, Inc. | Semiconductor processing chamber multistage mixing apparatus |
US10964512B2 (en) | 2018-02-15 | 2021-03-30 | Applied Materials, Inc. | Semiconductor processing chamber multistage mixing apparatus and methods |
TWI716818B (zh) | 2018-02-28 | 2021-01-21 | 美商應用材料股份有限公司 | 形成氣隙的系統及方法 |
US10593560B2 (en) | 2018-03-01 | 2020-03-17 | Applied Materials, Inc. | Magnetic induction plasma source for semiconductor processes and equipment |
US10319600B1 (en) | 2018-03-12 | 2019-06-11 | Applied Materials, Inc. | Thermal silicon etch |
US10497573B2 (en) | 2018-03-13 | 2019-12-03 | Applied Materials, Inc. | Selective atomic layer etching of semiconductor materials |
WO2019178042A1 (en) | 2018-03-14 | 2019-09-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins from plants and methods for their use |
CA3092075A1 (en) | 2018-03-14 | 2019-09-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins from plants and methods for their use |
US10573527B2 (en) | 2018-04-06 | 2020-02-25 | Applied Materials, Inc. | Gas-phase selective etching systems and methods |
US10490406B2 (en) | 2018-04-10 | 2019-11-26 | Appled Materials, Inc. | Systems and methods for material breakthrough |
US10699879B2 (en) | 2018-04-17 | 2020-06-30 | Applied Materials, Inc. | Two piece electrode assembly with gap for plasma control |
US10886137B2 (en) | 2018-04-30 | 2021-01-05 | Applied Materials, Inc. | Selective nitride removal |
US11702668B2 (en) | 2018-05-22 | 2023-07-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Plant regulatory elements and methods of use thereof |
EP3833747A1 (en) | 2018-06-28 | 2021-06-16 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods for selecting transformed plants |
US10755941B2 (en) | 2018-07-06 | 2020-08-25 | Applied Materials, Inc. | Self-limiting selective etching systems and methods |
US10872778B2 (en) | 2018-07-06 | 2020-12-22 | Applied Materials, Inc. | Systems and methods utilizing solid-phase etchants |
US10672642B2 (en) | 2018-07-24 | 2020-06-02 | Applied Materials, Inc. | Systems and methods for pedestal configuration |
US11049755B2 (en) | 2018-09-14 | 2021-06-29 | Applied Materials, Inc. | Semiconductor substrate supports with embedded RF shield |
US10892198B2 (en) | 2018-09-14 | 2021-01-12 | Applied Materials, Inc. | Systems and methods for improved performance in semiconductor processing |
US11062887B2 (en) | 2018-09-17 | 2021-07-13 | Applied Materials, Inc. | High temperature RF heater pedestals |
US11417534B2 (en) | 2018-09-21 | 2022-08-16 | Applied Materials, Inc. | Selective material removal |
US11682560B2 (en) | 2018-10-11 | 2023-06-20 | Applied Materials, Inc. | Systems and methods for hafnium-containing film removal |
US11121002B2 (en) | 2018-10-24 | 2021-09-14 | Applied Materials, Inc. | Systems and methods for etching metals and metal derivatives |
US11240961B2 (en) | 2018-10-26 | 2022-02-08 | Deere & Company | Controlling a harvesting machine based on a geo-spatial representation indicating where the harvesting machine is likely to reach capacity |
US11641800B2 (en) | 2020-02-06 | 2023-05-09 | Deere & Company | Agricultural harvesting machine with pre-emergence weed detection and mitigation system |
US11653588B2 (en) | 2018-10-26 | 2023-05-23 | Deere & Company | Yield map generation and control system |
US11079725B2 (en) | 2019-04-10 | 2021-08-03 | Deere & Company | Machine control using real-time model |
US11589509B2 (en) | 2018-10-26 | 2023-02-28 | Deere & Company | Predictive machine characteristic map generation and control system |
US11178818B2 (en) | 2018-10-26 | 2021-11-23 | Deere & Company | Harvesting machine control system with fill level processing based on yield data |
US11672203B2 (en) | 2018-10-26 | 2023-06-13 | Deere & Company | Predictive map generation and control |
US11957072B2 (en) | 2020-02-06 | 2024-04-16 | Deere & Company | Pre-emergence weed detection and mitigation system |
US11467605B2 (en) | 2019-04-10 | 2022-10-11 | Deere & Company | Zonal machine control |
AU2019369415A1 (en) | 2018-10-31 | 2021-03-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods for Ochrobactrum-mediated plant transformation |
US11437242B2 (en) | 2018-11-27 | 2022-09-06 | Applied Materials, Inc. | Selective removal of silicon-containing materials |
US11721527B2 (en) | 2019-01-07 | 2023-08-08 | Applied Materials, Inc. | Processing chamber mixing systems |
US10920319B2 (en) | 2019-01-11 | 2021-02-16 | Applied Materials, Inc. | Ceramic showerheads with conductive electrodes |
US11778945B2 (en) | 2019-04-10 | 2023-10-10 | Deere & Company | Machine control using real-time model |
US11234366B2 (en) | 2019-04-10 | 2022-02-01 | Deere & Company | Image selection for machine control |
CN114340391A (zh) | 2019-09-03 | 2022-04-12 | 巴斯夫欧洲公司 | 用于农药喷洒的喷洒漂移控制的聚合物 |
MX2022005893A (es) | 2019-11-15 | 2022-06-14 | Basf Corp | Metodos de uso de una composicion que comprende un plaguicida anionico y un amortiguador. |
US12035648B2 (en) | 2020-02-06 | 2024-07-16 | Deere & Company | Predictive weed map generation and control system |
US11477940B2 (en) | 2020-03-26 | 2022-10-25 | Deere & Company | Mobile work machine control based on zone parameter modification |
CN111423990B (zh) * | 2020-04-10 | 2021-08-27 | 科稷达隆(北京)生物技术有限公司 | 一种乙氧氟草醚敏感型酵母菌及其制备方法 |
WO2021254875A1 (en) | 2020-06-15 | 2021-12-23 | Basf Se | A stable, solvent-free, self-emulsifiable concentrate |
US20230235352A1 (en) | 2020-07-14 | 2023-07-27 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
CA3191142A1 (en) | 2020-08-26 | 2022-03-03 | Vindara, Inc. | Method and/or compositions for lettuce (lactuca sativa) breeding and/or varieties developed thereby |
US11711995B2 (en) | 2020-10-09 | 2023-08-01 | Deere & Company | Machine control using a predictive map |
US11635765B2 (en) | 2020-10-09 | 2023-04-25 | Deere & Company | Crop state map generation and control system |
US11675354B2 (en) | 2020-10-09 | 2023-06-13 | Deere & Company | Machine control using a predictive map |
US11592822B2 (en) | 2020-10-09 | 2023-02-28 | Deere & Company | Machine control using a predictive map |
US11727680B2 (en) | 2020-10-09 | 2023-08-15 | Deere & Company | Predictive map generation based on seeding characteristics and control |
US11983009B2 (en) | 2020-10-09 | 2024-05-14 | Deere & Company | Map generation and control system |
US11864483B2 (en) | 2020-10-09 | 2024-01-09 | Deere & Company | Predictive map generation and control system |
US11895948B2 (en) | 2020-10-09 | 2024-02-13 | Deere & Company | Predictive map generation and control based on soil properties |
US11871697B2 (en) | 2020-10-09 | 2024-01-16 | Deere & Company | Crop moisture map generation and control system |
US11946747B2 (en) | 2020-10-09 | 2024-04-02 | Deere & Company | Crop constituent map generation and control system |
US12013245B2 (en) | 2020-10-09 | 2024-06-18 | Deere & Company | Predictive map generation and control system |
US11650587B2 (en) | 2020-10-09 | 2023-05-16 | Deere & Company | Predictive power map generation and control system |
US11849671B2 (en) | 2020-10-09 | 2023-12-26 | Deere & Company | Crop state map generation and control system |
US11874669B2 (en) | 2020-10-09 | 2024-01-16 | Deere & Company | Map generation and control system |
US11845449B2 (en) | 2020-10-09 | 2023-12-19 | Deere & Company | Map generation and control system |
US11927459B2 (en) | 2020-10-09 | 2024-03-12 | Deere & Company | Machine control using a predictive map |
US11474523B2 (en) | 2020-10-09 | 2022-10-18 | Deere & Company | Machine control using a predictive speed map |
US11889788B2 (en) | 2020-10-09 | 2024-02-06 | Deere & Company | Predictive biomass map generation and control |
US11825768B2 (en) | 2020-10-09 | 2023-11-28 | Deere & Company | Machine control using a predictive map |
US11844311B2 (en) | 2020-10-09 | 2023-12-19 | Deere & Company | Machine control using a predictive map |
US11849672B2 (en) | 2020-10-09 | 2023-12-26 | Deere & Company | Machine control using a predictive map |
US11889787B2 (en) | 2020-10-09 | 2024-02-06 | Deere & Company | Predictive speed map generation and control system |
CA3197526A1 (en) | 2020-11-24 | 2022-06-02 | William Guy Whittingham | Herbicidal compounds |
EP4317425A1 (en) * | 2021-04-02 | 2024-02-07 | Qingdao KingAgroot Chemical Compound Co., Ltd. | Ppo polypeptide having tolerance to ppo inhibitor herbicide, and application |
WO2022214377A1 (en) | 2021-04-07 | 2022-10-13 | Syngenta Crop Protection Ag | Herbicidal compounds |
CA3221827A1 (en) | 2021-07-09 | 2023-01-12 | Philip Matthew JOYCE | Herbicidal compositions |
JP2024522912A (ja) | 2021-07-09 | 2024-06-21 | シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト | 除草剤組成物 |
CA3221821A1 (en) | 2021-07-09 | 2023-01-12 | Philip Matthew JOYCE | Herbicidal compositions |
EP4366529A1 (en) | 2021-07-09 | 2024-05-15 | Syngenta Crop Protection AG | Herbicidal compositions |
WO2023031161A1 (en) | 2021-09-03 | 2023-03-09 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Plants having increased tolerance to herbicides |
WO2023049906A1 (en) | 2021-09-27 | 2023-03-30 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Non-transgenic sunflower plants having increased tolerance to herbicides |
WO2023169984A1 (en) | 2022-03-11 | 2023-09-14 | Syngenta Crop Protection Ag | Herbicidal compounds |
WO2023222589A1 (en) | 2022-05-20 | 2023-11-23 | Syngenta Crop Protection Ag | Herbicidal compounds |
WO2024012968A1 (en) | 2022-07-13 | 2024-01-18 | Syngenta Crop Protection Ag | Herbicidal pyrimidinone derivatives |
WO2024020360A1 (en) | 2022-07-18 | 2024-01-25 | Pairwise Plants Services, Inc. | Mustard green plants named 'pwrg-1', 'pwrg-2,' and 'pwsgc' |
WO2024132649A1 (en) | 2022-12-20 | 2024-06-27 | Syngenta Crop Protection Ag | Herbicidal compositions |
Family Cites Families (29)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NZ228234A (en) | 1988-03-08 | 1992-09-25 | Ciba Geigy Ag | Non-coding chemically regulatable dna fragments, their use and preparation |
EP0360750A3 (en) * | 1988-09-22 | 1991-01-02 | Ciba-Geigy Ag | Novel herbicide tolerant plants |
US5693507A (en) | 1988-09-26 | 1997-12-02 | Auburn University | Genetic engineering of plant chloroplasts |
CN1039283C (zh) * | 1988-12-12 | 1998-07-29 | Fmc公司 | 卟啉的应用 |
NZ231658A (en) * | 1988-12-12 | 1992-05-26 | Fmc Corp | Inhibitors of protoporphyrinogen oxidase and compositions for killing tumour cells |
IL97645A (en) | 1990-03-23 | 1997-03-18 | Gist Brocades Nv | Production of enzymes in seeds and their use |
GB9009307D0 (en) | 1990-04-25 | 1990-06-20 | Ici Plc | Dna,constructs,cells and plant derived therefrom |
US5451513A (en) | 1990-05-01 | 1995-09-19 | The State University of New Jersey Rutgers | Method for stably transforming plastids of multicellular plants |
IL98405A0 (en) * | 1990-06-11 | 1992-07-15 | Fmc Corp | Pharmaceutical compositions containing enzyme inhibiting agents |
DK162790D0 (da) | 1990-07-06 | 1990-07-06 | Novo Nordisk As | Plantecelle |
IE913215A1 (en) | 1990-09-13 | 1992-02-25 | Gist Brocades Nv | Transgenic plants having a modified carbohydrate content |
US5290926A (en) * | 1990-09-14 | 1994-03-01 | Ciba-Geigy Corporation | Isolated DNA Encoding plant histidinol dehydrogenase |
ES2225817T3 (es) * | 1991-05-09 | 2005-03-16 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Plantas transgenicas con el contenido en polioles alterado. |
US5409823A (en) | 1992-09-24 | 1995-04-25 | Ciba-Geigy Corporation | Methods for the production of hybrid seed |
US5693506A (en) | 1993-11-16 | 1997-12-02 | The Regents Of The University Of California | Process for protein production in plants |
US5576198A (en) | 1993-12-14 | 1996-11-19 | Calgene, Inc. | Controlled expression of transgenic constructs in plant plastids |
GB9401780D0 (en) | 1994-01-31 | 1994-03-23 | Nickerson Biocem Ltd | Modified plants |
US5545817A (en) | 1994-03-11 | 1996-08-13 | Calgene, Inc. | Enhanced expression in a plant plastid |
US5530191A (en) | 1994-03-24 | 1996-06-25 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Method for producing cytoplasmic male sterility in plants and use thereof in production of hybrid seed |
US5767373A (en) * | 1994-06-16 | 1998-06-16 | Novartis Finance Corporation | Manipulation of protoporphyrinogen oxidase enzyme activity in eukaryotic organisms |
US6023012A (en) * | 1996-02-28 | 2000-02-08 | Novartis Finance Corporation | DNA molecules encoding plant protoporphyrinogen oxidase |
US5939602A (en) * | 1995-06-06 | 1999-08-17 | Novartis Finance Corporation | DNA molecules encoding plant protoporphyrinogen oxidase and inhibitor-resistant mutants thereof |
US5608144A (en) | 1994-08-12 | 1997-03-04 | Dna Plant Technology Corp. | Plant group 2 promoters and uses thereof |
US6020312A (en) * | 1994-09-13 | 2000-02-01 | Nce Pharmaceuticals, Inc. | Synthetic antibiotics |
US6084155A (en) * | 1995-06-06 | 2000-07-04 | Novartis Ag | Herbicide-tolerant protoporphyrinogen oxidase ("protox") genes |
WO1997004088A1 (en) | 1995-07-20 | 1997-02-06 | Sumitomo Chemical Company, Ltd. | Porphyrin-accumulating type herbicide resistance gene |
EP0846167B1 (en) | 1995-08-10 | 2004-05-06 | Rutgers University | Nuclear-encoded transcription system in plastids of higher plants |
PL187094B1 (pl) | 1996-02-28 | 2004-05-31 | Syngenta Participations Ag | Izolowana cząsteczka DNA kodująca enzym oksydazę protoporfirynogenu (protox) pszenicy, chimerowy gen, sposób wytwarzania roślin oraz sposób zwalczania chwastów |
ATE301187T1 (de) | 1996-03-06 | 2005-08-15 | Univ Rutgers | Plastidtransformation in arabidopsis thaliana |
-
1995
- 1995-06-06 US US08/472,028 patent/US5767373A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-08 DE DE69534247T patent/DE69534247T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-08 RO RO96-02348A patent/RO120003B1/ro unknown
- 1995-06-08 PL PL95344457A patent/PL183091B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1995-06-08 CZ CZ19963674A patent/CZ295884B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-06-08 RU RU2001130932/13A patent/RU2266332C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-06-08 PL PL95317759A patent/PL184242B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1995-06-08 EP EP95918724A patent/EP0769059B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-08 CA CA2189349A patent/CA2189349C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-06-08 JP JP50137096A patent/JP3673925B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1995-06-08 DK DK95918724T patent/DK0769059T3/da active
- 1995-06-08 HU HU9603175A patent/HUT76353A/hu not_active Application Discontinuation
- 1995-06-08 RO ROA200300143A patent/RO122046B1/ro unknown
- 1995-06-08 MX MX9606459A patent/MX237061B/es active IP Right Grant
- 1995-06-08 PT PT95918724T patent/PT769059E/pt unknown
- 1995-06-08 WO PCT/IB1995/000452 patent/WO1995034659A1/en active IP Right Grant
- 1995-06-08 CZ CZ2002620A patent/CZ296023B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-06-08 SK SK1610-96A patent/SK284895B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1995-06-08 AT AT95918724T patent/ATE296888T1/de active
- 1995-06-08 BR BR9508030A patent/BR9508030A/pt not_active IP Right Cessation
- 1995-06-08 PL PL95350720A patent/PL186842B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1995-06-08 AU AU24538/95A patent/AU706763B2/en not_active Ceased
- 1995-06-08 ES ES95918724T patent/ES2239757T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-08 RO ROA200300280A patent/RO121886B1/ro unknown
- 1995-06-08 CN CNB951936298A patent/CN100432229C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1995-06-08 RU RU97100774/13A patent/RU2192468C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-08-06 UA UA97010166A patent/UA71536C2/uk unknown
-
1996
- 1996-12-11 FI FI964958A patent/FI964958A/fi unknown
-
1997
- 1997-01-06 BG BG101115A patent/BG64394B1/bg unknown
-
1998
- 1998-01-29 US US09/015,683 patent/US6288306B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-01 US US09/071,296 patent/US6177245B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-12 US US09/191,998 patent/US6307129B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-11-19 US US09/196,268 patent/US6282837B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-09-23 AU AU50101/99A patent/AU750445B2/en not_active Ceased
-
2001
- 2001-03-21 CN CNB011118377A patent/CN1193096C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-03-29 CN CNB011121262A patent/CN1263856C/zh not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-02-22 HK HK02101331.4A patent/HK1039794B/zh not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
BG64394B1 (bg) | Манипулиране на протопорфириноген оксидазната ензимна активност в еукариотични организми | |
KR100493500B1 (ko) | 식물 프로토포르피리노겐 옥시다제 및 이의 억제제-내성 돌연변이체를 암호화하는 dna 분자 | |
JP2003507019A (ja) | 除草剤寛容性プロトポルフィリノーゲン・オキシダーゼ | |
KR20160145649A (ko) | 반수체 메이즈 형질전환 | |
AU744487B2 (en) | Riboflavin biosynthesis genes from plants and uses thereof | |
CA3063869A1 (en) | Glucosyl transferase polypeptides and methods of use | |
JP2002519035A (ja) | シロイヌナズナからのhmp−pキナーゼおよびtmp−ppアーゼならびに除草剤スクリーニングにおけるそれらの使用 | |
RU2235778C2 (ru) | Выделенный полинуклеотид, способный придавать растению устойчивость или толерантность к глифосатному гербициду, вектор, способ получения растений, толерантных или устойчивых к глифосатному гербициду, способ регенерации трансформированного растения и способ селективной борьбы с сорняками | |
US6271445B1 (en) | Nucleic acid molecules encoding 5′-phosphoribosyl-5-aminoimidazole (AIR) synthetase | |
JP5648822B2 (ja) | 相同組換えを利用したイネアントラニル酸合成酵素の改変 |