BG62053B1

BG62053B1 - (-)-бета-l-2-хидроксиметил-5-(5-флуороцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолан, методиза получаването му, фармацевтичен състав на негова база иприложението му като антивирусно средство

Info

Publication number: BG62053B1
Application number: BG98062A
Authority: BG
Inventors: Dennis C. Liotta; Raymond F. Schinazi; Woo-Baeg Choi
Original assignee: Emory University
Priority date: 1991-02-22
Filing date: 1993-08-20
Publication date: 1999-01-29
Also published as: ATE469147T1; MY114350A; RO119365B1; CZ295074B6; CA2104399A1; PT100151B; DK1439177T3; IE920545A1; CN1127301A; NO2005015I1; NZ241625A; CN100396785C; WO1992014743A3; MX9200747A; CN1065065A; HU9302377D0; HU227823B1; NO312399B1; AU1561792A; AU679649B2

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася до (-)-р-1_-2-хидроксиметил-5-(5флуорцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолан [(-)-FTCJ, до методи за получаването му, до фармацевтичен състав на негова база и приложението му като антивирусно средство.

Предшестващо състояние на техниката

През 1981 г. синдромът на придобитата имунна недостатъчност (СПИН) е идентифициран като болест, която засяга тежко човешката имунна система и която почти без изключение води до смърт. През 1983 г. е установена етиологичната причина за СПИН като вирус на човешката имунна недостатъчност (HIV). През декември 1990 год. Световната здравна организация изчислява, че между 8 и 10 милиона души в света са заразени с HIV и че между 1 000 000 и 1 400 000 от тях са в САЩ.

През 1985 г. се съобщава, че синтетичният нуклеозид 3’-азидо-3’деокситимидин (ATZ) инхибира репликацията на вируса на човешката имунна недостатъчност. От тогава редица други синтетични нуклиозиди, вкл. 2’,3'-дидеоксиинозин (DDI), 2’,3’-дидеоксицитидин (DDC), 3'-флуоро3’-деокситимидин (FLT) и 2’,3'-дидеокси- 2’,3’- дидехидротимидин (D4T) са доказани като ефективни срещу HIV. Редица други 2’,3’-дидеокси нуклеозиди показват инхибиране растежа на различни вируси in vitro. Изглежда, че след клетъчното фосфорилиране до 5’-трифосфат чрез клетъчни кинази, тези синтетични нуклеозиди се включват в растежната 0 нишка на вирусната ДНК, причинявайки прекъсване на веригата дължащо се на отсъствието на 3’-хидроксилната група.

Постижението в инхибиране репликацията на HIV in vivo или in vitro на различни 2’,3’-дидеокси нуклеозиди подтиква редица изследователи да създадат и изпитат нуклеозиди, при които въглеродния атом на 3’-място в нуклеозида се замества с хетероатом. Norbeck, et al., показват че (±)-1-[2β, 4р,)-2-(хидроксиметил)-4-диоксоланил] тимин, (означаван като (±)-диоксалан-Т), проявява умерена активност срещу HIV (ЕСвд 20 мкм в АТН8 клетки) и е нетоксичен към незаразени контролни клетки при концентрация 200 мкМ. Tetrahedron Letters 30 (46), 6246, (1989). В Европейска патентна заявка No 0337713 и САЩ патент 5 041 449, прехвърлени на IAF Biochem International, Inc., са описани 2заместени-4-заместени-1,3-диоксолани, които проявяват антивирусна активност.

В САЩ патент 5 047 407 и публикувана Европейска патентна заявка No 0 382 526, преостъпени на IAF Biochem International, Inc., се . описват голям клас 2-заместени-5-заместени-1,3-диоксолан нуклеозиди с антивирусна активност и по-специално се съобщава за рацемичната смес (при С4’-място) на Cl’-β изомера на 2-хидроксиметил-5-(цитозин-1ил-1,3-оксатиолан (означен по-долу като (±)-ВСН-189), която има приблизително същата активност срещу HIV както ATZ и никаква клетъчна токсичност при изпитваната концентрация. Установено е също така, че (±)-ВСН-189 инхибира репликацията на резистентни на ATZ HIV изолати in vitro от пациенти, които са лекувани с ATZ повече от 36 седмици.

Малко изменение в химическата структура на синтетичния нуклеозид може да повлияе значително върху биологичната активност на съединението. В подкрепа на това са публикациите на Lack S. Jeong, et al., „Asymmetric Synthesis and Biological Evaluation of p-L-(2R, 5S)- and γL-(2R, 5S)-1,3-Oxathiolane-Pyrimidine and -Purine Nucleosides as Potential Anti-HIV Agents“ Journal of Medicindl Chemistry, 1993, Vol. 36, No. 2, pp 181 -195 и Shin-Lian Doong et al., „Inhibition of the Replication of Hepatitis B Virus in vitro by 2’,2’-Dideoxy-3’-Thiacytidine and Related Analogues, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991), pp. 8495 - 8499. Както е показано в тези статии, активността на анти-HIV и анти-HBV варира значително в зависимост от избора на заместителя в 5-та позиция в 1,3-оксатиолан нуклеозида. Докато заявката '526 разкрива както рацемично така и енантиомерно обогатени FTC с обща формула, тя не разкрива или не посочва важността от избор на 5-флуороцитозиновата база в 1,3оксатиолан нуклеозида.

Друг вирус, който причинява сериозен човешки здравен проблем е хепатитния В вирус (означен по-долу като HBV). HBV е вторична причина за рак у хората само при тютюнопушачите. Механизъмът, по който HBV предизвиква рак е непознат, макар че се предполага, че той може директно или индирактно да активира туморно развитие чрез хронично възпаление, цироза и клетъчна регенерация свързана с инфекцията.

След два до шест месеца инкубационен период, през време на който организмът е нечувствителен към инфекцията, HBV заразата може да доведе до остър хепатит и увреждане на черния дроб, което причинява болки в стомаха, жлъчката и повишаване на нивото на някой ензими в кръвта. HBV може да причини скоротечен хепатит, бързо прогресиращ, често с фатална форма на болестта, при което голями части от черния дроб се унищожават.

Пациентите обикновено се възстановяват след остър хепатит, при някой пациенти обаче, в кръвта се запазва висока концентрация на вирусен антиген за продължителен или неопределен период от време, като причинява хронична инфекция. Хроничните инфекции могат да даведат до хроничен устойчив хепатит. Заразените с хроничен устойчив HBV пациенти се срещат по-често в развиващите се страни. Около средата на 1991 г. е имало приблизително 225 млн. носители на хроничен HBV само в Азия. По целия свят общо 300 млн. са носителите. Хроничният устойчив хепатит може да предизвика умора, цироза на черния дроб и хепатоцелуларна карцинома, първичен рак на черния дроб.

В западните индустриализирани страни рисковите групите за HBV инфекция включват тези в контакт с HBV носители или тяхни кръвни проби. Епидемиологията на HBV е много подобна на синдрома на прибодитата имунна недостатъчност, което обяснява защо HBV инфекцията е обичайна между пациентите със СПИН или свързана със СПИН комплекси. Все пак, HBV е по-заразителен от HIV.

Получена е човешка серумна ваксина за имунизиране на пациенти срещу HBV. Въпреки че е установено, че тя е ефективна, производството на ваксина е трудно, защото е ограничена доставката на човешки серум от хронични носители и начина на пречистване е продължителен и скъп. Освен това всяка партида от ваксина, приготвена от различни серуми, трябва да се изпитва върху шимпанзета, за да се осигури безопасност. Ваксини са получени също чрез генно инженерство. Ежедневно третиране с α-интерферон, протеин получен чрез генно инженерство, също се оказва обещаващо. Все пак до сега няма известно фармацевтично средство, което ефективно да подтиска репликацията на вируса.

За да бъде нуклеозида търговски продукт за фармацевтични цели, той трябва да бъде не само ефикасен и с ниска токсичност, но за да се произвежда трябва също да е икономически изгоден. Голям брой изследвания са проведени за търсене на нови, малкоструващи методи за промишлено производство на нуклеозидни препарати. 2’,3'-дидеокси нуклеозидите се получават понастоящем по един от двата начина: получаване производно на интактния нуклеозид или кондензация на производно на захарната част с хетероциклична база. Въпреки че има редица недостатъци свързани с получаването на нови нуклеозидни аналози чрез модифициране на интактни нукпеозиди, главно предимство на този начин е това, че подходящата абсолютна стереохимия вече е създадена от природата. Все пак, този подход не може да се използва в производството на нуклеозиди, които съдържат несрещащи се в природата бази или въглехидратни части (и които поради това не са получени от интактни нуклеозиди), като 1,3- оксатиолан нуклеозиди и

1,3-диоксалан нуклеозиди.

Когато се кондензира въглехидрат или въглехидратно-подобна част с хетероциклична база до синтетичен нуклеозид, се получава нуклеозид, който има два хирални центъра (при СГ и С4’ -позиции) и поради това съществува като диастереомерна двойка. Всеки диастереомер съществува като група енантиомери. Така продуктът е смес от четири енантиомера.

Често се срещат нуклеозиди с неприродно срещаща се стереохимия в С1 ’ или в С4’ -позиция да са по-малко активни, отколкото нуклеозид със запазена природна стереохимия. Например Carter et al., съобщават, че концентрацията на (-)-енантиомер на карбовир (2',3'дидехидро- 2’,3’- дидеоксигуанозин) в клетъчна култура необходима за намаляване на реверсивната транскриптазна активност с 50 % (ЕС₅₀) е

0.8 мкМ, докато ЕС50 за (+)-енантиомера на карбовир е по-голяма от 60 мкМ Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 34, 6, 1297 - 1300 (юни 1990).

WO 91/11186 на Emory University разкрива между другото група от енантиомерно обогатени 1,3-оксатиолан нуклеозиди. Докато заявката разкрива както рацемично, така и енантиомерно обогатен FTC, тя обаче на разкрива, че (-)-FTC неочаквано превъзхожда другите 1,3-оксатиолан нуклеозиди. В същия патент се описва получаването на 1,3- оксатиолан нуклеозиди с висока диастереоселективност (висок процент на нуклеозид с β- конфигурация на връзката от С1’-въглерода към © хетероцикличната база) чрез грижлива селекция на Люисовата киселина използвана в процеса на кондензация. Намерено е, че кондензацията на 1,3-оксатиолан нуклеозид с база се извършва с почти пълна β-стереоспецифичност, когато се използват калаен хлорид като кондензационен катализатор. Други Люисови киселини осигуряват ниска (или никаква) С1’-р-селективност или просто не успяват да катализират реакцията.

Поради факта, че синдромът на придобитата имунна недостатъчност, свързан със СПИН комплекс и и хепатитния В вирус достигат епидемично ниво на разпространение в света и имат трагични ефекти върху заразения пациент, остава остра нуждата от осигуряване на нови, ефективни фармацевтични средства за лечение на тези болести, които да имат ниска токсичност върху организма.

Също така има нужда от осигуряване на икономически ефективен, търговско изгоден метод за производство на фармацевтични значими нуклеозиди и да се постигне β-стереоспецифичност на С4’позиция в синтетичния нуклеозид, получен при кондензация на подобна на въглехидрат част с база.

Техническа същност на изобретението

Изобретението се отнася до (-)-р-1_-2-хидроксиметил-5-(5флуорцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолан [(-)-FTC] като изолиран енантиомер или негово физиологично приемливо производно или физиологично приемлива сол.

Намерено бе, че (-)-FTC изненадващо проявява висока активност срещу вируса на имунна недостатъчност у хора, при много ниска клетъчна токсичност за организма. Също така е установено, че (-)-FTC проявява изненадващо голяма активност срещу HBV и поради това може да се използва за лечение на пациенти, които имат различни заболявания свързани с HBV зараза.

Токсикологичните и фармацевтични изследвания потвърждават полезността на (-)-FTC като антивирусно средство за фармацевтично приложение. (-)-FTC не е токсичен за периферните клетки и костния мозак у хора при концентрация до 50 мкМ и при други клетъчни линии при концентрация до 200 мкМ.

Продължително лечение с FTC не е токсично за гризачи, дори при орални дози от 85 мг/кг дневно в продължение на най-малко два месеца, фармакокинетиката на FTC при резус маймуни показва висока орална биодостъпност (приблизително 73 ± 6 %) и краен полуживот в плазмата приблизително 1.34 + 0.18 (средно между орално и интравенозно приложение).

Описан е също метод за разделяне на рацемична смес от нуклеозидни енантиомери, по-специално на рацемична смес на FTC, който се състои в подлагане на рацемичната смес на въздействието на ензим, който избирателно катализира реакцията към единия от енантиомерите. Методите могат да се използват и в голямомащабно изпълнение и при изгодни икономически условия.

Чрез описаните тук методи FTC се разделя на неговите (+)-β-ϋ и (-)-p-L енантиомери. (-)-β-ί енантиомерът е по-активен срещу HIV, HBV и SIV.

Кратко описание на фигурите

Фигура 1 е илюстрация на химическата структура на 2хидроксиметил-5-(5-флуороцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолан („FTC“).

Фигура 2 е илюстрация на метода за получаване на 2хидроксиметил-5-(5-флуороцитозин-1 -ил)-1,3-оксатиолан.

Фигура 3 е диаграма, показваща последователността на спецификата на алкалната фосфатаза и змийска отрова за (+) и (-) енантиомерите на FTC.

фигура 4 е графика показваща напредването на катализираната с липаза хидролиза на 5’- бутириловия естер на FTC в течение на времето, като се използват ензимите Amano PS-800® (незатъмнено квадратче) и PLE (светло кръгче с пунктир).

Фигура 5 е графика на ефекта на концентрацията (мкМ) от рацемичен и обогатен на енантиомери FTC (получен по метода от пример 4) спрямо процента инхибиране на човешки РВМ клетки, заразени с HIV-1 (затъмнено кръгче, (±)-FTC), (незатъмнено кръгче (-)FTC), (затъмнено квадратче (+)-FTC).

фигура 6 е графика на ефекта на концентрацията (мкМ) на рацемичен и обогатен на енантиомери FTC (получен по метода от пример 3) спрямо процента инхибиране на човешки РВМ клетки, заразени с HIV-1 (затъмнено кръгче, (±)-FTC), (незатъмнено кръгче (-)FTC), (затъмнено квадратче (+)-FTC).

фигура 7 е графика на усвояването на (±)-FTC в човешки РВМ клетки (средно от две измерения) във времето (часове) по отношение pmol/10⁶ клетки.

фигура 8 е графика на отделянето на белязан с радиоактивен изотоп (±)-FTC от човешки РВМ клетки, измерено в часове по отношение pmol/10⁶ клетки.

Фигура 9 илюстрира присъствието на [³Н]- (±)-FTC и неговите фосфорилирани производни в човешки HepG-2 клетки (средно от две измервания) инкубирани в среда съдържаща 10 мкМ [³Н]- (±)-FTC, измерено в часове по отношение pmol/10⁶ клетки.

фигура 10 илюстрира отделянето на [³Н]~ (±)-FTC и неговите фосфорилирани производни в човешки HepG-2 клетки в pmol/10⁶ клетки по отношение на времето след пулсиране на клетките с 10 мкМ [³Н]- (±)FTC (700 DPM/pmol) за 24 часа и количествено определяне на концентрацията на съединението 24 часа след отстраняването.

фигура 11 илюстрира намаляването на общата концентрация на [³Н]- (±)-FTC и неговите фосфорилирани производни в човешки HepG-2 клетки след инкубиране с 10 мкМ [³Н]- (±)-FTC (700 DPM/pmol) за 24 часа в pmol/10⁶ клетки по отношение на времето.

Фигура 12 е графика на ефекта на енатиомерите на FTC върху образуването на колонии от гранулоцит-макрофагни изходни клетки, както е изчислено в процент преживели спрямо концентрацията в мкМ (незатъмнено кръгче (-)-FTC), (затъмнено кръгче (+)-FTC), (AZT затъмнено квадратче).

Използваните тук термини се отнасят до следното:

„енантиомерно обогатен нукпеозид означава нуклеозиден състав, който включва най-малко 95 % от единия енантиомер на този нуклеозид;

FTC означава 2-хидроксиметил-5-(5-флуороцитозин-1-ил)-1,3оксатиолан (рацемична форма или енантиомери), също споменаван като 2’-деокси-5-флуоро-3’-тиацитидин;

(±)-FTC e (±)-D, L-2- хидроксиметил-5-(5-флуороцитозин-1-ил)-1,3оксатиолан;

(-)-FTC e (-)-β-Ι_-2- хидроксиметил-5-(5-флуороцитозин-1-ил)-1,3оксатиолан;

(+)-FTC е(+)-р-О-2-хидроксиметил-5-(5-флуороцитозин-1-ил)-1,3оксатиолан;

FTC-MP, FTC-DP и FTC-TP се отнасят до монофосфат, дифосфат и съответно трифосфат на FTC;

ВСН-189 означава 2-хидроксиметил-5-(цитозин-1-ил)-1,3оксатиолан;

„предпочитана ензимна катализа“ означава катализа с ензим, който показва предпочитание към един субстрат пред друг;

„отцепваща се група“ означава функционална група, която осигурява начално карбонизиране, когато се отделя от молекулата, към която е свързана.

Изобретението се отнася също така и до метод и състав за лечение на HIV и HBV инфекции и други вируси, отнасящи се по подобен начин в човека и други животински организми, който включва прилагане на ефективно количество от (-)-β-1_-2- хидроксиметил-5-(5флуороцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолан, на негово фармацевтично (физиологично) приемливо производно или негово фармацевтично (физиологично) приемлива сол, във фармацевтичноприемлив носител. Както е показано по-долу, съединението съгласно изобретението притежава антиретровирусна активност, като анти-HIV-l, анти-Н1\/-2 и активност срещу вируса на имунната недостатъчност у маймуни (антиSIV), сами по себе си или се метаболизират до съединение, което проявява антиретровирусна активност.

(-)-FTC и неговите фармацевтичноприемливи производни или фармацевтичноприемливи формулировки са полезни за предпазване и лечение на HIV- зарази и други свързани с тях състояния като свързан със СПИН комплекс (ARC), устойчива генерализирана лимфаденопатия (PGL), свързани със СПИН неврологични състояния, анти-Н ^антитело положителни и HIV-положителни състояния, Kaposi’s sarcoma, thrombocytopenia purpurea и случайни инфекции, В допълнение, това съединение или формулировки на негова база, могат да се използват профилактично за предпазване или забавяне прогресирането на клиничното заболяване у индивиди, които са анти-HIV антитяло или HIVантиген позитивни или са били изложени на HIV.

(-)-FTC и неговите фармацевтичноприемливи производни или соли или фармацевтичноприемливи формулировки съдържащи го, са полезни за предпазване и лечение на HIV- зарази и други свързани с тях състояния като анти-HIV антитело позитивни и HBV-позитивни състояния, хронично чернодробно възпаление причинено от HBV, цироза, остри хепатити, скоротечни хепатити, хронични устойчиви хепатити и умора. Тези съединения или формулировки на тяхна база могат да се прилагат също така профилактично за предпазване или забавяне на клинично заболяване при индивиди, които са анти-HIV антитело или HBV-антиген позитивни или такива които са били изложени на HBV.

Методът за получаване на 2-хидроксиметил-5-(5-флуороцитозин1 -ил)-1,3-оксатиолан включва:

1) взаимодействие на евентуално защитен 5-флуороцитозин с 1,3оксатиолан с формула А

в която R_1a означава водород или хидроксилзащитна група, включително ацилна група, и L е отцепваща се група, и евентуално отстраняване на хидроксилзащитната група.

2) взаимодействие на съединение с формула В

в която R_1a има посоченото по-горе значение, a R_1b означава аминозащитна група) с флуориращо средство за вкарване на флуорен атом в 5-та позиция на цитозиновия пръстен и евентуално отстраняване на защитните групи или

3) взаимодействие на съединение с формула С

в която R_1a има посоченото по-горе значение, със средство осигуряващо превръщането на оксо групата на 4-то място в урациловия пръстен в аминогрупа и отстраняване на оставащите защитни групи за да се получи желаното съединение.

Получаването на (-)-FTC енантиомера на 2-хидроксиметил-5-(5флуороцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолан може да се осъществи в подлагане на съединението или на негово производно (например 5’-естера) под формата на смес от (-) и (+) енантиомери на условия, или на взаимодействие с реактиви служещи за разделяне на енантиомерите, и

при необходимост, превръщане на получените производни в основното съединение.

Що се отнася до метод 1) по-горе, хидроксилните защитни групи включват защитни групи, описани подробно по-долу, включително ацил (например ацетил), арилацетил (например бензоил или заместен бензоил) тритил или монометокситритил, бензил или заместен бензил, тризаместен силил, включително триалкилсилил (например диметилтрет.-бутилсилил) или дифенилметилсилил. Съединението 5флуороцитозин може да бъде евентуално защитено с трисубституирани силилови групи. Защитните групи могат да се отстранят по обичайния начин. Отцепващата се група L е типичната, използвана в областта на нуклеозидната химия, например халоген като хлор или бром, алкокси като метокси или етокси или ацил като ацетил или бензоил.

Взаимодействието при метод 1) може да се извърши в органичен разтворител (например 1,2-дихлороетан или ацетонитрил) в присъствие на Люисова киселина, за предпочитане калаен хлорид или триметилсилил трифлат.

Съединенията с формула А (в която L означава ацилна група, напр. ацетилна група) могат да се получат чрез взаимодействие на съединение с формула D

R.aO в която R_1a има посоченото по-горе значение, с редуциращо средство, напр. литиевоалуминиев хидрид, последвано от обработване с подходящ общоприет реактив до получаване на желаното междинно съединение, например анхидрид на карбоксилна киселина, напр. оцетен анхидрид за ацетилиране, хлориращи или бромиращи реактиви за халогениране или алкилиращи средства,

Съединението с формула D може да се получи чрез взаимодействие на съединение с формула Е

с HSCH₂CO₂H при повишена температура.

Съеднението с формула Е може да се получи чрез озонолиза на алилов етер или естер с формула CH₂=CH-CH₂-OR или диетер или диестер на 2-бутен-1,3-диол с формула ROCH₂-CH = CH-CH₂OR, в която R е защитна група като алкил, силил или ацилна група.

Що се отнася до метод 2) по-горе, 5-флуоро заместителя може да се вкара по известни в областта методи (М. J. Robins, et al., в Nucleic Acid Chemistry, Part 2, L. B. Townsend and R. S. Tipson, editors, J. Wiley and Sons, New York, 895 - 900 (19/8) и цитатите там; R. Duschinsky в Nucleic Acid Chemistry, Part 1, L. B. Townsend and R. S. Tipson, editors, J. Wiley and Sons, New York, 43 - 46 (1978) и цитатите там), флуориращото средство може да бъде например триметилхипофлуорит във флуоротрихлоро метан.

Относно метода 3), съединението с формула С може да се третира с 1,2,4-триазол, заедно с 4-флуорофенил дихлорофосфат, за да се образува съответното 4-(1,2,4-триазолил) съединение, което след това се превръща в желаното 4-амино (цитидин) съединение чрез въздействие с например метанол.

Изходните съединения с формула В и С могат да се получат например чрез взаимодействие на подходяща (евентуално защитена) база със съединение с формула А по аналогичен начин на описания в метод 1). 5-флуороурацил и 5-флуороцитозин са търговски достъпни продукти от Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wl 53233, USA.

Разделянето на (±)-енантиомерите може да се осъществи както подробно е описано в раздел III по-долу.

FTC може да се превърне във фармацевтично приемлив естер чрез взаимодействие с подходящо естерифициращо средство, например с киселинен халогенид или анхидрид. FTC или негово фармацевтично приемливо производно може да се превърне в негова фармацевтично приемлива сол по обичайния начин, например чрез третиране с подходяща база. Естерът или солта на FTC може да се превърне в FTC, например чрез хидролиза.

I. Активно съединение и негови фармацевтично приемливи производни и соли

Описаното тук антивирусно съединение е 2- хидроксиметил-5-(5флуороцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолан (виж. фигура 1) в рацемична форма или като изолиран енантиомер.

Активното съединение може да се прилага като някое от производните му, което при прилагане върху приемащия може да осигури директно или недиректно основното съединение FTC, или което само по себи си притежава активност.

II. Получаване на активното съединение

Рацемичната смес на FTC може за де получи съгласно метода описан в РСТ патент No WO 91/11186 на Emory University, публикуван на 8 август 1991 г. или по метода описан в пример 1. Най-общо методите включват озониране на алилов етер или естер с формула СН₂=СН-СН₂OR или диетер или диестер на 2-бутен-1,3-диол с формула ROCH₂CH = CH-CH₂OR, в която R е защитна група като алкил, силил или ацилна група за да се образува гликоалдехид с формула OCH-CH₂-OR; прибавяне на тиогликолова киселина към гликоалдехида за получаване на лактон с формула 2-( Р-окси)-метил-5-оксо-1,3-оксатиолан, редуциране на лактона до съединения съдържащи отцепваща се група на 5-то място на оксатиолановия пръстен, свързване на тези съединения с силилиран 5-флуороцитозин в присъствието на SnCI₄ и евентуално отстраняване на защитните групи.

Пример 1 Получаване на (±)-D, L-2- хидроксиметил-5-(5флуороцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолан

Метод за получаване на рацемична смес на FTC е илюстриран на фигура 2 и описан подробно по-долу.

Защита на 2-бутен-1,4-диол

В суха двулитрова тригърлена колба в инертна атмосфера в 800 мл сух пиридин се разтварят 100 г (93.5 мл = 1.135 мола = 1.00 екв.) 2бутен-1,4-диол и 15 г (приблизително 0.1 екв.) DMAP (4диметиламинопиридин) и се бърка при охлаждане до 0° С. След това бавно се прибавя бутилхлорид (260 мл = 2.2 екв.), за да се предотврати прегряване и се бърка един час. Реакцията се прекъсва с малко ледена вода. Течността се отдекантира от солта и се изпарява под вакуум. Останалата сол се разтваря във вода и водния разтвор се екстрахира двукратно с етилов етер. Обединените други слоеве се промиват един път с наситен разтвор на CuSO₄, два пъти с наситен разтвор на натриев бикарбонат съдържащ Norit® и селд това се филтрува под вакуум през целит.

Концентрираната реакционна смес се разтваря в етер и промива като се следва същия начин на работа както по-горе за разтвора на солта. Събраните органични слоеве се концентрират в ротационен изпарител, след това се поставят под вакуум. Тази реакция обикновено протича почти количествено. Ако е необходимо мащабът може лесно да се увеличи. Съединението 1,4-дибутирил-2-бутен-1,4-диол е безцветна до леко жълта бистра течност.

Озонолиза на защитения диол

1,4-дибутирил-2-бутен-1,4-диол (1.365 мола) се разтваря в 4 л сух метиленхлорид в суха, 5 литрова тригърлена колба снабдена с изсушаваща тръба и отворена тръба за пропускане на газ. За предпочитане тръбата да не е обикновена тръба за барботиране на газ, която може да се запуши в концентрирания разтвор. Разтворът се бърка и охлажда до -78° С като през това време през разтвора барботира инертен газ. Входът за газ се запушва веднага щом разтворът се охлади достатъчно, а колбата и апаратът за бъркане се преместват до озоновия генератор. През бъркания разтвор барботира кислород най-малко 20 минути през което време се поддържа ледена баня. Криовъглен е идеален за поддържане на ниската температура при тази продължителна реакция. След това се пропуска озон при 8 до 8.5 psi. След приключване, притокът на озон се спира и през разтвора се барботира кислород около половин час преди да се прибавят 3 еквивалента Me₂S. Колбата се отстранява от охлаждащата баня и се премества под камина, където се бърка около два дни до напълно ® завършване на редукцията. Разтворът се изпарява и се оставя под вакуум за няколко часа.

Тази реакция обикновено се извършва с добив приблизително 95 % на защитен алдехид (2-бутирилоксиацеталдехид), безцветна до жълта бистра течност.

Циклизация на алдехида с меркаптооцетна киселина

Алдехидът (1.0 екв.) се разтваря в толуен до получаване на 0.80 до 0.85 М разтвор в колба, снабдена с уловител от типа Dean Stark. Прибавя се тиогликолова киселина (1.1 екв.) и сместа се нагрява при кипене. Водата се отстранява ацеотропно чрез уловителя. Реакцията *** приключва за три часа и се оставя да се охлади до стайна температура.

Органичният разтвор се промива двукратно с равни обеми наситен воден разтвор на натриев бикарбонат и веднаж с вода, суши се над магнезиев сулфат и Norit и се филтрува под вакуум през целит преди да се изпари под вакуум. Първата натриев бикарбонатна промивка се екстрахира повторно един път с етер, етерът се промива един път с вода, суши се над магнезиев сулфат и Norit, филтрува се под вакуум през целит и се изпарява заедно с другия органичен продукт от толуеновия разтвор. Обединеният продукт се поставя под вакуум за една нощ.

Реакцията протича обикновено с добив 90 % от 2-(бутирилокси)метил-5-оксо-1,3-оксатиолан.

Редукция на лактона и превръщане в ацетат

2-бутирилокси-метил-5-оксо-1,3-оксатиолав (1.00 екв.) се разтваря в сух тетрахидрофуран до получаване на 0.23 М разтвор в суха тригърлена колба снабдена с механична бъркалка и поддържана под инертна атмосфера. Разтворът се бърка и охлажда до 0° С преди да се прибавят през канюла 1.1 екв. от 1.0 М Li(t-BuO)₃AIH в тетрахидрофуран. Редукцията завършва за приблизително три часа както показва тънкослойната хроматография при използване на система от разтворители 2:1 етер/хексан и анисалдехид за проявяване на петната.

След това се прибавян приблизително 10 екв. прясно дестилиран оцетен анхидрид и се бърка два дни за да се получи ацетилирания продукт. Реакцията се прекъсва чрез прибавяне на наситен разтвор на натриев бикарбонат и се бърка една нощ След това разтворът се изпарява и бърка с още разтвор на натриев бикарбонат една нощ. Следва екстрахиране с етер, който се промива (внимателно) двукратно с наситен разтвор на натриев бикарбонат и веднаж с вода, суши се над магнезиев сулфат и Norit, филтрува се под вакуум през целит и се изпарява. Продуктът е тъмножълта бистра течност. Газова хроматография (начална температура 80°, начално време=5 мин., програмирана скорост = 10°/мин; крайна температура 240° С) показва чистота приблизително 70 %.

Силилиране на 5-флуороцитозин

5-флуороцитозин (1.05 екв. на база количеството лактон получен в предишния етап като се използва газова хроматография за определяне на чистотата) се силилира при кипене в най-малко 10 екв.

хексаметилдисилазин, съдържащ каталитично количество чист амониев сулфат (0.05 до 0.10 екв.) за два часа след избистрянето на разтвора. След това колбата се запушва плътно и разтворителят се отстранява като се използва вакуум помпа с допълнителен уловител. Продуктът, бяло твърдо вещество, се оставя под вакуум през нощта, докато се използва за следващата реакция на свързване.

Свързване на силилиран 5-флуороцитозин с ацетилиран лактол

Към силилиран 5-флуороцитозин (33.86 г, 0.124 мола) в сух дихлорометан (350 мл) се прибавя SnCI₄ разтвор (135.6 мл, 1 моларен разтвор в дихлорометан) в атмосфера на азот. Разтворът се бърка 15 мин. при стайна температура. Този разтвор се прехвърля през канюла към разтвора на лактол ацетата (38 г, 0.113 мола) в дихлорометан (400 мл) под азотна атмосфера в продължение на 30 минути.

Разтворът се бърка 2 часа като края на реакцията се проследява чрез тънкослойна хроматография. Разтворът се разрежда с дихлорометан (500 мл) и се изсолва с разтвор на амониев хидроксид. Разтворът на амониев хидроксид (100 мл) се прибавя бавно, като температурата на реакционната смес се поддържа под 30° С, като се получава бяла утайка.

Сместа се бърка още 30 мин. и след това се пропуска през колона със силикагел (7 инча диаметър, 5 инча височина). Елуира се последователно с дихлорометан (2 л), етилацетат (2 л) и етилацетат : етанол (9:1) {4 л). Етилацетатьт и етилацетат : етаноловите елуенти съдържат желания продукт. Тези разтвори се обединяват и изпаряват под вакуум. Полученото лепкаво твърдо вещество се промива със сух етер (200 мл) като се получава бяло твърдо вещество (25.35 г, 71 %) FTC5’-бутират.

РТС-5’-бутират (8.74 г, 0.026 мола) се разтваря в 250 мл метанол. Прибавя се натриев метоксид (2.85 г, 0.052 мола). при стайна температура). Реакционната смес се бърка 1 час, като края на реакцията се установява чрез тънкослойна хроматография. За изсолване на реакцията се прибавя разтвор на амониев хлорид (10 мл) и след това разтворителя се отстранява под намалено налягане. Остатъкът се абсорбира върху силикагел (5 г) и се пропуска през малка колонка, като се използват етиацетат:етанол (9:1) като елуент. Съдържащите продукта фракции се обединяват и изпаряват за да се получи лепкаво твърдо вещество, което се промива със сух етер за да се получи бял твърд FTC (6.00 г, 88 %).

¹Н ЯМР (DMSO-d⁶) 8.18 (1Н, d, Н₆, J = 8.4 Hz), 7.81 & 7.57 (2Н, широк, ИНг), 6.12 (1Н, dd, Н,., J=5.7 & 4.2 Hz), 5.40 (1Н, t, OH, J = 5.7 Hz), C 5.17 (1H, t, 1H₄„ J = 3-6 Hz), 3.74 (2H, m, 2H₅), 3.41 (1H, dd, 1H₂., J = 5.7 & 11.7 Hz), 3.11 (1H, dd, 1H₂., J=4.2 & 11.7 Hz; ¹³C ЯМР (DMSO-d⁶) 157.85 (d, J = 13.4 Hz), 153.28, 136.12 (d, J = 241 Hz), 126.01 (d, J=32.6 Hz), 86.90, 86.84, 62.48, 37.07; т.т. 195 - 196° C.

III. Разделяне на нуклеозидните енантиомери

Методът осигурява разделяне на рацемични смеси на нуклеозидни енантиомери, включително, но не само(+) и (-) енантиомерите на FTC. Методът може също така да се използва за разделяне на въглехидрати или въглехидрат подобни части като производни на 1,3-оксатиолан и 1,3-диоксолан. Методът включва използването на ензим, който избирателно катализира реакция на единия от енатиомерите на рацемичната смес. Реагиралият енантиомер се отделя от нереагирания енантиомер на базата на разликата във физическата структура. Като се има предвид описаното тук, всеки специалист в областта може да избере ензима, който е селективен за нуклеозидния енантиомер по избор (или селективен за нежелания енантиомер, като метод за отстраняването му), чрез подбиране на ензимите описани по.долу или чрез систематично оценяване на друг известен ензим. Като се има предвид описаното тук, всеки специалист от областта също така ще може да модифицира субстрата, ако е необходимо, за да се постигне желаното разделяне. Като се използват реактивите за хирално ЯМР отместване, поляриметрия или хирална ВЕТХ, може да се определи оптическото обогатяване на извлечения естер.

Следващите примери илюстрират използването на ензими за разделяне на рацемични смеси на енантиомери. Могат да се използват други методи за разделяне на рацемични смеси, в комбинация с описания тук метод за разделяне. Всички тези модификации са взети предвид в обхвата на изобретението.

Разделяне основаващо се на хидролиза на С5’-нуклеозидни естери

Съгласно едно изпълнение методът включва взаимодействие на С5’-хидроксилната група на смес от нуклеозидни рацемати с ацилно съединение до получаване на С5’-естери, в които нуклеозидът е в „карбинолния“ край на естера. Рацемичната смес от С5’-естери след това се обработва с ензим, който избирателно разцепва или хидролизира единия от енатиомерите, но не и другия, за даден период от време.

Предимството на този метод е, че той може да се използва за разделяне на голямо разнообразие от нуклеозиди, включително пиримидин и пурин нуклеозиди, които евентуално са субституирани във въглехидратната част или базовата част. Методът може да се използва също така и за разделяне на нуклеозидни производни, които съдържат и хетероатоми във въглехидратната част, например FTC и ВСН-189. Широкото приложение на този метод се основава на факта, че въпреки че карбинолната част на естера играе роля върху способността на ензима да диференцира енантиомерите, главният разпознавателен участък за тези ензими е в частта карбоксилна киселина на естера. Освен това могат успешно да се екстраполират резултатите от изследване на една ензим/субстрат система към друга, привидно различна, при условие, че частите на карбоксилната киселина на двата субстрата са еднакви или по същество подобни.

Друго предимство на този метод е че той е региоселективен. Ензимите, които катализират естерите, обикновено не катализират странични реакции в други части на молекулата. Например ензимът липаза катализира хидролизата на естера на 2-хидроксиметил-5-оксо-

1,3-оксатиолан, без да хидролизира вътрешния лактон. Това контрастира подчертано с „химическия“ подход към естерната хидролиза.

Друго предимство на този метод е, че отделянето на нехидролизирания енантиомер и на хидролизирания енантиомер от реакционната смес е съвсем просто. Нехидролизирания енантиомер е по-липофилен от хидролизирания енантиомер и може ефективно да се извлече чрез проста екстракция с някой от многобройните неполярни органични разтворители или смеси от разтворители, като хексан и хексан/етер. По-малко липофилният, повече полярен хидролизиран енантиомер може след това да се получи чрез екстракция с полярен органичен разтворител., напр. етилацетат или чрез лиофилизиране, последвано от екстрахиране с етанол или метанол. По време на хидролизата трябва да се избегва алкохол, тъй като той може да денатурира ензима при определени условия.

Ензими и субстрати

При подходящо подбрани ензим и субстрат, могат да се установят условията на единия от нуклеозидните енантиомери. Желаният енантиомер може да се изолира чрез обработване на рацемичната смес с ензим, който хидролизира желания енантиомер (последвано от екстрахиране на полярния хидролизат с полярен разтворител) или чрез обработване с ензим, който хидролизира нежелания енантиомер с неполярен разтворител).

Ензими, които катализират хидролизата на естери, са естерази, например свинска чернодробна естераза, липаза включително свинска панкреатична липаза, и Amano PS-800 липаза, субтилизин и ахимотрипсин.

Фигура 3 е диаграма, показваща последователността на спецификата на алкалната фосфатаза и змийска отрова за (+) и (-) енантиомерите на FTC. Както се показва, алкалната фосфатаза хидролизира трифосфата и на двата енантиомера на FTC и поради това не е ефективна като разделящо средство. Фосфодиестераза I с предпочитание хидролизира (ч-)-изомера на FTC до неговия моноестер, който след това се подлага на 5’-нуклееотидаза до получаване на (+)FTC.

Най-ефективната ацилна група, която да се използва за естерифициране на 5’-място на нуклеозида, може да се определи без излишно експериментиране, чрез оценяване на редица хомолози като се използва избраната ензимна система. Например, когато се естерифицират 1,3-оксатиолан нуклеозидите с маслена киселина, разделянето със свинска чернодробна естераза и Amano PS-800 се извършва с висока енантиоселективност (94 - 100 % енантиомерен излишък) и противоположна селективност. Свинска чернодробна естераза с предпочитание хидролизира (-)-енантиомера на FTC, а Amano PS-800 с предпочитание хидролизира (-)-енантиомера на FTC. Процентът енантиомерен излишък, даден в таблица 1, е количеството на пречистен маслен естер останал в сместа обработена с ензим (напр. масления естер на (-)-FTC в случай на PLE и масления естер на (+)-FTC в случай на Amano PS-800).

Примери за ацилни групи (без те да ограничават изобретението), които могат да се използват със специфична нуклеозидна енантиомерна смес и специфичен ензим включват алкилкарбоксилни киселини с субституирани киселини, като оцетна киселина, пропионова киселина, маслена киселина и пентанова киселина. С определени ензими може да се предпочете използването на ацилно съединение, което е значително електрон-изтеглящо и улеснява хидролизата чрез отслабване на естерната връзка. Примери на електрон-изтеглящи ацилни групи са ахалогенираните естери като 2-хлоропропионова киселина, 2хлоромаслена киселина и 2-хлоропентанова киселина. ахалогенираните естери са отлични субстрати за липази.

Условия за разделяне

Ензимната хидролиза обикновено се провежда с каталитично количество ензим във воден буфер, който има pH близко до оптималното pH за въпросния ензим. С напредването на реакцията pH спада в резултат на освобождаване на карбоксилна киселина. Трябва да се прибави водна база, за да се поддържа pH близко до оптималната стойност за ензима. Напредването на реакцията може лесно да се определи чрез проследяване промяната на pH и количеството база необходимо за поддържане на pH. Хидрофобният естер (нехидролизирания енантиомер) и по-полярният алкохол (хидролизиран енантиомер) могат да бъдат последователно и селективно екстрахирани от разтвора чрез разумен подбор на органични разтворители. Алтернативно продуктът, който ще се разделя, може да се пропусне през колона, която съдържа ензима имобилизиран върху твърд носител.

Ензимната хидролиза извършена при хетерогенни условия може да има лоша възпроизводимост. Поради тове се предпочита хидролизата да се провежда при хомогенни условия. Алкохолните разтвортели не се предпочитат, защото те могат да денатурират ензимите. Хомогенност може да се постигне чрез използването на нейонни повърхностноактивни вещества като Тритон Х-100. Прибавянето на тези повърхностноактивни вещества не само подпомата разтварянето на изходния продукт, но също повишава разтворимостта във вода на продукта. Поради това, макар че ензимната реакция може да се проведе по-ефективно с прибавянето на нейонно повърхностноактивно вещество отколкото при хетерогенни условия, извличането както на оползотворения изходен продукт, така и на продукта, може да стане по-трудно. Продуктът може да се изолира с подходящи хроматографски и химически (например селективно образуване на сол) техники. Диацилираните нуклеозиди също могат да се използват, но често са твърде липофилни и трудно разтворими във използваната среда.

Пример 2 Енантиоселекгивна липаза-катализирана хидролиза на FTC естери.

Редица 5’-О-ацилни производни на FTC се получават чрез селективно О-ацилиране на N-хлороводород на сол (виж таблица 1 и фигура 4) на (+)-FTC. Проучена е ефективността на хидролизата на производните с липаза. Както е показано на таблица 1, свинската чернодробна естераза (PLE) показва висока степен на селективност при хидролизата на естера на (+)-енантиомера на FTC, оставайки предимно бутирата на (-)-FTC според анализираната с ВЕТХ смес. Обратно, PS-800 хидролизира с предпочитание естера на (-)енантиомера на FTC, оставайки предимно бутирата на (+)-FTC в сместа според атализа с ВЕТХ. Намерено е, че скоростта зависи от природата на ацилната група; ацетиловото производно е значително по-бавно от бутиратното производно. Сега е намерено, че скоростта на хидролиза на пропионовия естер на FTC е дори по-голяма от тази наблюдавана при бутиратното производно. Процентът на извличане и процена енантиомерен излишък се определят като се използва ВЕТХ. Въпреки че енантиоселективността е отлична когато се прилага PLE (обикновено 97 % или повече), допълнително обогатяване може да се постигне с помощта на последващи ензимни хидролизни реакции, в които енантиомерно обогатения бутират от PLE се подлага на ензимна хидролиза с PS-800.

Таблица 1

Сравняване на ефекта от ензимна хидролиза при естер
Субстрат	% извличане	% Е.Е. (s.m.)
FTC естери с PLE:		(-)-FTC (бутират)
ацетат	32.68	N.D.
пропионат	39.87	N.D.
бутират	48.00	98
бутират	45.71	98.6
FTC естери с PS-800:		(+)-FTC (бутират)
ацетат	73.17	N.D.
пропионат	52.67	N.D.
бутират	58.34	N.D.
валерат	41.50	94

Пример 3: Метод за получаване на (+) и (-)-FTC чрез енантиоселективна, липаза-катализирана хидролиза на FTC бугират

5-О-бутират на FTC (0.47 ммола, 149 мг) се разтваря в 16 мл разтвор на 4:1 pH 8 буфер:метилцианид. Бистрият разтвор се бърка и се третира с 26 мг свинска чернодробна естераза (PLE-A). Напредването на реакцията се наблюдава с ВЕТХ (фиг. 4). След 20 часа (52 % превръщане) реакционната смес се екстрахира с 2 х 80 мл хлороформ и с 80 мл етилацетат. Органичните екстракти се обединяват, сушат се над . , . безводен магнезиев сулфат, филтруват се и се концентрират на ротационен изпарител. Полученият остатък се елуира върху 2 х 1000 m pTLC плочки, като за елуент се използва етилацетат (двойно елуиране) и след изолиране се получават 53 мг (36 % на база на изходното вещество) FTC бутират, който има 98 % енантиомерен излишък (е.е.) определен чрез ВЕТХ анализ. Енантиомерно-обогатеният бутират след това се обработва с 1.6 мл метанол последван от 0.38 ммола (20 мг) натриев метоксид. Получената смес се бърка при стайна температура, а напредването на реакцията се наблюдава чрез ВЕТХ. Реакцията приключва след 30 минути. Разтворителят се отстранява чрез ротационно изпаряване като се получава сурово бяло твърдо вещество (76 мг), което се елуира върху 1000 m pTLC като се използва 5:1 етилацетат:етанол. (-)-FTC се изолира като бяло твърдо вещество (33 мг; 82 % добив). ВЕТХ анализ на FTC като негово 5’-О-ацетатно производно показва 97 % е.е.; [a]²⁰ _D-120.5° (С = 0.88; абсол. етанол).

Образуването на емулсии при етапа на доработване могат да се избегнат чрез прибавяне в края на хлороформ към реакционната смес (това също служи за денатуриране на ензима), отстраняване на разтворителя под вакуум и след това екстрахиране с хлороформ.

Аналогично 1.2 ммола (375 мг) от 5’-О-бутират на FTC на (±)-FTC се разтваря в 40 мл 4:1 pH 8 буфер:метилцианид. Бистрият разтвор се бърка и се третира с 58 мг свинска чернодробна естераза (PLE-A). Напредването на реакцията се наблюдава с ВЕТХ. След 90 минути (38 % превръщане) реакционната смес се прибавя към 150 мл хлороформ. Слоевете се разделят и водния слой се лиофилизира за да се отстрани разтворителя. Белият остатък от лиофилизирането се екстрахира с 3 х 10 мл абсолютен етанол. Екстрактите се филтруват, обединяват се и се концентрират под вакуум за да дадат 179 мг сурово масло. Суровият продукт се елуира върху 45 х 30 мм колона със силикагел като се използва 3 х 75 мл етилацетат, последвано от 5 : 1 етилацетат - етанол. (+)-FTC се изолира като бяло твърдо вещество (109 мг; 37 % на база изходния бутират). ВЕТХ анализ на (+)-FTC като негово 5’-О-ацетатно производно показва 97.4 % е.е.; [01]²%-113.4° (С = 2.53; абсол. етанол).

Подобна реакция може да се проведе при използване на 0.12 ммола (37 мг) от 5’-О-бутират на FTC и 7 мг PS-800 в 4.0 мл 4:1 pH 8 буфер:метилцианид. Реакцията е значително по-бавна от тази с PLE-A и изисква 74 часа за 59 % превръщане. Изобираният бутират (11.4 мг; 31 % от първоначалното количество) показва 94 % е.е доказано чрез ВЕТХ.

Разделяне на нуклеозидни енантиомери с цитидин-деоксицитидин деаминаза

Съгласно алтернативно изпълнение, цитидин-деоксицитидин деаминаза се използва за разделяне на рацемични смеси на 2хидроксиметил-5-(цитозин-1-ил)-1,3-оксатиолан и негови производни, включително 2-хидроксиметил-5-(5-флуоро-цитозин-1 -ил)-1,3оксатиолан. Ензимът катализира деаминирането на цитозиновата част до урацил. Намерено е, че един от енантиомерите на 1,3оксатиолановите нукпеозиди е предпочитан субстрат за цитидинС деоксицитидин деаминаза. Енантиомерът, който не се превръща в урацилово производно (и поради това е все още базичен), се екстрахира от разтвора с кисел разтвор. Трябва да се внимава да се избягват силно кисели разтвори (pH под 3.0), тъй като те могат да отцепят оксатиолановия пръстен.

Цитидин-деоксицитидин деаминазата може да се изолира от черен дроб на плъх или от човешки черен дроб или да се извлече от рекомбинантна последователност в прокариотна система като в Е. coli.

Методът за разделяне на цитидин-нуклеозидни енантиомери при използване на цитидин-деоксицитидин деаминаза може да се използва J като самостоятелен метод за разделяне или да се използва в комбинация с други методи за разделяне, включително разделяне чрез ензимна хидролиза на 5’-О-нуклеозидни естери, както е описано погоре.

Комбинация на ензимно разделяне с класически методи на разделяне

Методът описан по-горе за разделяне на рацемични смеси на нуклеозидни енантиомери може да се комбинира с други класически методи на енантиомерно разделяне за да се увеличи оптичната чистота на крайния продукт.

Класическите методи на разделяне включват различни физични и химични техники. Често най-простата и най-ефективна техника е прекристализацията, основаваща се на принципа, че рацематите често са по-разтворими от съответните отделни енантиомери. Прекристализацията може да се извърши във всеки етап, включително на ацетилирани съединения или на крайния енантиомерен продукт. Ако е успешен, този метод се предпочита.

Когато прекристаризирането не успява да осигури продукт с приемлива оптична чистота, могат да се изпитат други методи. Ако нукпеозидът е базичен (например цитидин) могат да се използват хирални киселини, които образуват диастереомерни смеси, които могат да притежават съществено различаваща се разтворимост. Примери, без те да са ограничиващи, за хирални киселини са ябълчена киселина, бадемова киселина, дибензоилвинена киселина, З-бромкамфор-8сулфонова киселина, 10-камфорсулфонова киселина и ди-ртолуолвинена киселина. Подобно, ацелирането на свободната хидроксилна група с производно на хирална киселина води до образуване на диастереомерни смеси, чиито физични свойства могат значително да се различават и това да позволява разделянето им.

Малки количества от енантиомерно обогатени нуклеозиди могат да се получат или да се пречистят чрез пропускане на рацемичната смес през ВЕТХ колона, която е предназначена за хирално разделяне, включително циклодекстрин свързани колони, продавани от Rainin Corporation.

Пример 4: Разделяне на рацемични смеси от нуклеозиди чрез ВЕТХ

Разделянето на С 4'-енантиомерите на (±)-FTC се извършва като се използва циклодекстрин свързана (cyclobond АС-I) колона получена от Rainin Corporation (Woburn, WA). Условията са следните: изократен 0.5 % метанол във вода; скорост на протичане 1 мл/мин, UV детектиране при 262 нм. ВЕТХ марка метанол се получава от J.T. Baker (Phillipsburg, NJ). Рацемичните смеси се инжектират и се събират фракции, Съдържащите отделните енантиомери фракциите се обединяват, охлаждат се и след това се лиофилизират. Съединенията се охарактеризират чрез UV спектроскопия и по времето им на задържане при ВЕТХ. Най-общо (-)-енантиомерите имат по-кратко време на задържане от (+)-енантиомерите (виж J. Liquid Chromatography 7: 353 376, 1984), Концентрацията на съединенията се установява чрез UV спектроскопия, като се използва еталонен разтвор с позната концентрация (15 мкМ) получен във вода за биологично количествено определение. Времената на задържане за разделените енатиомери са дадени в таблица 2.

Таблица 2

Време на задържане на енантиомерите на FTC

Съединение R_f (минути) (-)-FTC 8.3 (+)-FTC 8.7

Пример 5: Алтернативни методи за разделяне на

FTC енантиомери при използване на хирална колона

Като се използва Cyclobond АС-I колона (5 мкм, 25 см х 4.6 мм, Rainin Corporation, Woburn, WA, каталожен No AST-41-41049), със скорост на протичане 0.6 мл/мин на 0.5 % изократен метанол (Fisher Scientific, Inc. качество за ВЕТХ, каталожен No А-452-4 във вода) и UV детектиране при 262 нм. FTC енантиомерите проявяват време на задържане 12.68 мин (-)-FTC и 13.20 минути (+)- FTC.

Като се използва Chiralpak AS колона (10 мкм, 25 см х 4.6 мм, J. Т. Baker Inc., Phillisburg, NJ, каталожен No 7406-00p сериен No 09-2910320), със скорост на протичане 0.8 мл/мин на изопропилов алкохол (качество за ВЕТХ, Fisher Scientific, Inc. качество за ВЕТХ, каталожен No А-451-4 във вода) и UV детектиране при 262 нм. FTC енантиомерите проявяват време на задържане 5.9 мин (-)-FTC и 9.8 минути (+)- FTC.

Пример 6: Анти-HIV активност на енантиомерите на FTC разделени чрез ВЕТХ.

β

A. Тридневни фитохемаглутинин-стимулирани РВМ клетки (10 клетки/мл) от хепатит В и HIV-1 серонегативни здрави донори се заразяват с HIV-1 (щам LAV) при концентрация около 100 пъти 50 % от заразната доза за тьканна култура (TICD 50) за мл и се култивира в присъствие или отсъствие на антивирусни съединения с различни концентрации.

B. Приблизително един час след заразяването, средата, заедно със изпитваното съединение (2 пъти крайната концентрация в средата), или без съединението, се прибавя към колбите (5 мл; краен обем 10 мл). Като положителна контрола се използва ATZ.

C. Клетките се излагат на вируса (около 2 х 10⁵ dpm/мл, както е определено чрез реверсивен транскриптазен анализ) и след това се поставят в СО₂ инкубатор. HIV-1 (щам LAV) се получава от Center for Desease Control, Atlanta, Georgia. Използваните за култивиране на РВМ клетки методи, събирането на вируса и определянето на реверсивната транскриптазна активност са описани от McDougal et al., (J. Immun. Meth. 76, 171 - 183, 1985) и от Spira et al., (J. Clin. Meth. 25, 97 - 99, 1987), c изключение на това, че фунгизоната не се включва в средата (виж Schinazi, et al., Antimicrob. Agents Chemother. 32, 1784 - 1787 (1988); Id., 34:1061 - 1067 (1990)).

D. Ha шестия ден клетките и супернатантата се преместват в 15 мл епруветка и се центрофугират при около 900 г за 10 минути. Отделят се 5 мл от супернатантата и вирусът се концентрира при центрофугиране при 40 000 оборота в минута за 30 минути (Beckman

70.1 Ti rotor). Солюбилизираните вирусни пелети се обработват за определяне нивото на ревесивната транскриптаза. Резултатите са изразяват в dpm/мл анализирана супернатанта. Вируси от по-малки обеми супернатанта (1 мл) могат също да се концентрират чрез центрофугиране преди солюбилизиране и определяне на реверсивното транскриптазно ниво.

Средната ефективна концентрация (ЕС₅₀) се определя чрез средно ефективен метод (Antimicrob. Agents Chemother. 30, 491 - 498 (1986)). Накратко процентът инхибиране на вируса, както е определен f от измерванията на реверсивната кренскриптаза, се представя спрямо микромоларната концентрация на съединението. ЕС₅₀ е концентрацията на съединението, при която има 50 % инхибиране на вирусния растеж.

Е. Митоген стимулираните незаразени човешки РВМ клетки (3.8 х 10⁵ слетки/мл) се култивират в присъствие или отсътвие на лекарство при условия подобни на използваните при антивирусните изпитания описани по-горе. Клетките се преброяват след шест дни като се използва хемацитометър и метод на изключване с трипаново синьо, както е описано от Schinazi, et al., Antimicrob. Agents and Chemotherapy, 22(3), 499 (1982). IC₅₀ е концентрацията от съединението, която инхибира 50 % от нормалния клетъчен растеж.

Енантиомерите на FTC се изолират по метода описан в пример 4, а антивирусната активност се определя по метода описан погоре. Резултатите са представени в таблица 4 и илюстрирани на фиг. 5.

Таблица 4

Антивирусна активност на (+) и (-) енантиомерите на FTC

съединение	концентр. мкМ	DMP/мл	% инхибиране (корегиран	EC5Q . мкМ
FTC (±)	0.0001	73.755	26.6	0.018
	0.005	83.005	16.3
	0.01	60.465	41.3
	0.05	34.120	70.4
	0.1	14.160	92.4
	0.5	18.095	88.1
	1	7.555	99.7
	5	7.940	99.3
	10	5.810	101.7
FTC (-)	0.001	76.275	23.8	0.02
	0.005	58.590	43.3
	0.01	75.350	24.8
	0.05	28.890	76.2
	0.1	13.175	93.5
	0.5	9.485	97.6
FTC (+)	0.001	94.340	3.8	0.28
	0.005	107.430	-10.6
	0.01	99.465	-1.8
	0.05	87.120	11.8
	0.1	86.340	12.7
	0.5	33.225	71.4
Както	се вижда от	таблица 4,	при този експеримент (-)-

енантиомерът на FTC се явява приблизително с един порядък на величината по-силен от (+)-FTC енантиомера и има приблизително същата анти-HIV активност както рацемичната смес. Нито енантиомерите, нито рацемичната смес са токсични до 100 мкМ, както е измерено по метода на изключване с трипаново синьо при човешки РВМ клетки.

Пример 7: Антивирусна активност на FTC енантиомерите разделени по метода описан в пример 3

Енантиомерите на (±)-FTC също могат да се разделят по метода описан в пример 6. Резултатите са дадени на фиг. 6. Както е показано на фигура 6, ЕС^ на рацемичната смес на FTC е0.017 мкМ, ЕС^ на (-)FTC е 0.0077 мкМ, а ЕС₅₀ на (+)-FTC е 0.84 мкМ.

Пример 8: Усвояване на (±)-FTC в човешки РВМ клетки

Изследването се провежда като се използва радиобелязан FTC, който следва вътрешноклетъчния профил на основното лекарство и проследява метаболитите в клетките. Всички изследвания се правят с повторение. Човешки мононукпеоарни клетки от периферна кръв (РВМ клетки) се суспендират в RPMI 1640 среда съдържаща 10 % телешки ембрионален серум и антибиотици (2 х 10⁶ клетки/мл), 10 мл за определено време) и се инкубира с прибавяне на 10 мкМ FTC (специфична активност около 700 dmp/pmol). Клетките се поставят на въздействието на лекарството за 2, 6, 12 и 24 часа. В така определените моменти, средата се отстрнява и клетките се промиват два пъти със студен балансиран солев разтвор на Hank. Екстрахирането се извършва с прибавяне на 0.2 мл 60 % студен метанол/вода и се държи една нощ при -70° С. На следващата сутрин суспензията се центрофугира и екстракцията се повтаря два пъти по 0.5 часа при -70° С. Общата супернатанта (0.6 мл) се лиофилизира до сухо. Остатъкът се суспендира повторно в 250 мкл вода и аликвотни части между 50 и 100 мкл се анализират чрез ВЕТХ. Количественото определение на междуклетъчното изходно лекарство и метаболитните му производни се извършва чрез ВЕТХ. Поради нестабилност на някой съединения в кисела среда, използва се буферна система близка до физиологичното pH за разделяне на метаболитите.

Фиг. 7 е графика на усвояването на (±)-FTC в човешки РВМ клетки (средна стойност от две измервания) във времето (часове) по отношение pmol/10⁶ клетки. Изследванията за усвояване показват, че радиобелязаният FTC лесно се усвоява от човешките лимфоцити, което води до получаване на много голями количества 5’-трифосфатно производно на FTC.

Пример 9:

Антиретровирусна активност на FTC в различни клетъчни линии

Антиретровирусната активност на FTC се измерва в редица клетъчни линии като се използват подобни, но не идентични методи на описаните в пример 6. Клетъчните линии се получават или от човешки донори, AIDS Research and Reference Reagent Program, NIH, Rockville, Maryland, ATCC или от Червения кръст. Клетки със СЕМ тримидин недостатъчност се получават чрез последователно пренасяне на СЕМ клетки в присъствието на 5-бром-2’-деоксиуридин. Резултатите са дадени в таблица 5.

Таблица 5

Антиретровирусна активност на FTC в различни клетъчни системи

клетъчна система (вирусен щам)	ECgo .’ мк
	(±)-FTC
HIV-1
РВМС (LAV-1)	0.027
МТ2 (HTLV_1I1B)	0.89
СЕМ (LAV-1)	0.08
СЕМ-ТК⁰ (LAV-1)	0.026
СЕМ (HTLVuib) NIH	0.09

HIV-2

РВМС (ROD2)

0.0038 (±)-FTC

0.0007 (-)-FTC

SIV

AA-2 (SIV251)

C-8166 (SIV251)

FIV

CrFK (61E)

0.026 (+)-FTC

4.6 <8.0 <1

V. Способност на FTC да инхибира репликацията на HBV

Пример 10: Оценяване активността на (+) и (-)енантиомерите на FTC в 2.2.15 клетъчни култури

Способността на енантиомерите на FTC да инхибират растежа на вируси в 2.2.15 клетъчни култури (HepG2 клетки трансформирани с хепатитен вирус) е описано подробно по-долу.

Резюме и описание на опитите за антивирусни ефекти в тази културална система и анализите на HBV ДНК са описани (Kobra and Milman, 1991, Antiviral Res., 15:217). Антивирусната оценка се извършва върху два отделни пасажа клетки. Всички кладенчета, във всички панички се посяват с една и съща плътност в едно и също време.

Параметри на опита

Поради присъщите вариации в нивата на вътрешноклетъчните и извънклетъчни HBV ДНК, само потискане по-голямо от 3.5 пъти (за HBV вирусна ДНК) или 3-0 пъти (за посредниците на HBV ДНК репликацията) от средното ниво на тези HBV ДНК форми в нетретирани клетки, се считат статистически значими (Р < 0.05). Нивата на интегрираната HBV ДНК във всеки клетъчен ДНК препарат (които остават постоянни на база клетка в тези експерименти) се използват за да се изчислят нивата на вътрешноклетъчните HBV ДНК форми, като по такъв начин се осигурява сравняване на еднакво количество клетъчна ДНК в отделните проби.

Типични стойности за извънклетъчни HBV вирусни ДНК в нетретирани клетки са от 50 до 150 pg/мл културална среда (средно приблизително 76 pg/мл). Вътрешноклетъчните посредници на HBV ДНК репликацията в нетретирани клетки са от 50 до 100 pg/мл клетъчна ДНК (средно приблизително 74 pg/мл клетъчна ДНК). Въобще, потискането на нивата на вътрешноклетъчната HBV ДНК, дължащо се на третирането с противовирусни съединения, е по-слабо изразено и настъпва по-бавно отколкото потискане на нивата на HBV вирусна ДНК (Kobra and Milan, 1991, Antiviral Res., 15:217).

Начинът на извършване на хибридизационните анали за тези експерименти имат за резултат еквивалентност приблизително 1.0 pg вътрешноклетъчна HBV ДНК до 2 - 3 геномни копия за клетка и 1.0 рд/мл извънклетъчна HBV ДНК до 3 χ 10⁵ вирусни частички/мл.

Токсикологични анализи

Токсикологични анализи се извършват за да се прецени дали наблюдаваните антивирусни ефекти се дължат на общо действие върху жизнеспособността на клетките. Използваният тук метод е измерване на поглъщането на червено неутрално багрило, стандартен и широко използван тест за жизнеспособността на клетките в различни системи приемници на вируси, включително HSV и HIV. Токсикологичните анализи се провеждат в 96 кладенчеви плоскодънни тъканнокултурални панички. Клетките за токсикологичните анализи се култивират и третират с изпитваните съединения по същата схема, както е описана за антивирусно оценяване по-долу. Всяко съединение се изпитва в 4 концентрации в три повторения (кладенчета „А“, „В и „С“). Поглъщането на червено неутрално багрило се използва за да се определи относителното ниво на токсичност. Абсорбирането на интернализираното багрило при 510 нм (А^) се използва за количествен анализ. Стойностите са представени като процент на средни стойности за 9 различни култури от нетретирани клетки, поддържани в същите 96-кпаденчеви панички както изпитваните съединения. Поглъщането на багрилото в 9-те контролни култури на паничка 5 е в границите 91.6 % до 110.4 %, а в паничка 6 от 96.6 % до 109 %.

Резултатите са дадени в таблица 6.

Таблица 6

Анализ за токсичност на изпитваните съединения при 2.2.15

клетки

паничка	съединение	конц. (мкМ)	поглъщане на багрилото (% от контролата)
клад. А	клад. В	клад. С
5	DMSO	10.0*	0.7	1.6	0.9
		3.3	55.9	68.7	61.7
		1.0	91.2	96.4	106.8
		0.3	98.7	102.9	93.6
6	(-)-FTC	300	53.0	51.1	51.5
		100	64.1	66.6	77.6
		30	98.7	94.3	96.4
		10	94.3	94.9	92.2
6	(-h)-FTC	300	43.4	56.7	58.5
		100	77.7	66.3	72.1
		30	81.1	88.3	88.1
		10	90.9	99.4	90.5

* За DMSO, концентрациите са дадени като процент от първоначалния разтвор.

Оценяване на токсичността

Както се вижда от таблица 6, няма значителна токсичност (поголямо от 50 % намаление в нивото на поглъщане на багрилото наблюдавано в нетретираните клетки) при изпитваните съединения при концентрациите използвани за антивирусно оценяване. Двете изпитвани съединения (-)-FTC и (+)-FTC изглежда да са токсични при по-високи концентрации, използвани при тестовете за токсичност (330 мкМ).

Антивирусна оценка

Контроли

В рамките на нормалните изменения, нивата на HBV вирусна ДНК и посредниците на вътрешноклетьчна HBV репликация [HBV RI] остават постоянни в нетретираните клетки през време на критичния период. DMSO, в концентрация 1 %, не повлиява нивата на HBV репликацията при 2.2.15 клетъчни култури.

Изпитвани съединения

Както е показано в таблица 7, двете съединения (-)-FTC и (+)FTC значително инхибират репликацията на HBV в изпитваните концентрации. Както се вижда от таблица 8, (-)-FTC все още значително инхибира синтезата на HBV вирусна ДНК и вътрешноклетьчна HBV ДНК при концентрации 4, 1 и 0.25 мкМ.

Таблица 7

Ефект на изпитваните съединения върху образуването на HBV в

2.2.15 клетъчни култури.

кпа-	третиране	HBV вирусна ДНК*	вътрешноклетьчна
денче			(рд/мл		HBV ДНК	(pg/мл
		културална среда)	клетъчна	ДНК)
		ден 0	ден 4	ден 9	MONO	RI
7А	нетретирани	59	75	94	2.7	93
	клетки
7В	нетретирани	47	64	88	2.5	93
	клетки
8А	нетретирани	65	100	71	2.2	97
	клетки
8В	нетретирани	77	65	110	2.4	62

клетки

кпа-	третиране	HBV вирусна ДНК*	вътрешноклетъчна
денче				(рд/мл		HBV ДНК	(рд/мл
			културална среда)	клетъчна	ДНК)
			ден 0	ден 4	ден 9	MONO	RI
7К	DMSO @	1.00 %	100	50	48	1.9	95
71_	DMSO @	1.00 %	48	96	54	2.8	98
8К	DMSO @	1.00 %	93	63	68	2.2	86
8L	DMSO @	1.00 %	66	57	59	1.6	97
9U	(-)-FTC @	10 мкМ	120	36	1	1.1	14
9V	(-)-FTC @	10 мкМ	89	48	1	1.5	19
10U	В-FTC @	10 мкМ	58	41	0.1	1.9	13
10V	(-)-FTC @	10 мкМ	110	32	0.1	1.2	16
9W	(+)-FTC ©	10 мкМ	88	42	0.1	0.8	14
9Х	(+)-FTC ©	10 мкМ	58	57	0.2	0.4	19
10W	(+)-FTC ©	10 мкМ	69	55	0.1	0.7	17
10Х	(+)-FTC ©	10 мкМ	45	39	0.1	0.4	15
	* Прекъсване чувствителността	за HBV	вирусна	ДНК е 0.1	рд/мл.

@ Вътрешноклетъчна HBV ДНК се анализира 24 часа като се следва 9-ия ден от третирането. Нивата на интегрираната HBV ДНК във всеки клетъчен ДНК препарат се използват за изчисляване нивата на епизомалните 3.2 Kb HBV геноми (MONO.) и посредници на HBV ДНК репликация (RI).

Таблица 8

Ефект на изпитваните съединения върху HBV образуването

		в 2.2.15 клетъчна култура
кла-	третиране	HBV вирусна ДНК*	вътрешноклетъчна
денче		(рд/мл	HBV ДНК* (рд/мл
		културална среда)	клетъчна ДНК)
		ден 0 ден 4 ден 9	MONO RI

кла-	третиране	HBV вирусна ДНК*	вътрешноклетъчна
денче 31А	нетретирани	(рд/мл културална среда) ден 0 ден 4 ден 9 64 54 65	HBV ДНК* клетъчна MONO 2.8	(рд/мл ДНК) RI 65
31В	клетки нетретирани	51	54	77	2.0	53
32А	клетки нетретирани	100	76	56	3.5	81
32В	клетки нетретирани	53	97	83	1.1	68
35А	клетки (-)-FTC @ 4мкМ	74	27	>0.1	1.4	1
35В	(-)-FTC @ 4мкМ	87	28	>0.1	0.5	1
36А	(-)-FTC @ 4мкМ	120	20	1	0.9	1
36В	(-)-FTC @ 4мкМ	59	16	0.2	0.2	2
35С	(-)-FTC @ 1 мкМ	70	13	>0.1	1.7	2
35D	(-)-FTC @ 1 мкМ	62	15	>0.1	1.2	3
ЗбС	(-)-FTC @ 1 мкМ	60	22	1	1.4	2
36D	(-)-FTC @ 1 мкМ	89	28	0.3	1.5	4
35Е	(-)-FTC @0.25 мкМ	84	15	>0.1	1.5	4
35F	(-)-FTC @0.25 мкМ	89	16	4	2.2	4
36Е	(-)-FTC @0.25 мкМ	66	13	1	1.8	8
36F	(-)-FTC @0.25 мкМ	49	19	0.1	0.3	9
	* Прекъсване чувствителността	за HBV	вирусна	ДНК е 0.1	рд/мл.

Пример 11: Усвояване на (±)-FTC в човешки чернодробни клетки; HBV активност на FTC

Повтаря се методиката от пример 8 с човешки чернодробни клетки (HepG2 клетки, получени от АТСС), за да се определи усвояването и метаболизма на FTC в тези клетки. Както е показано на фиг. 9, (±)-FTC се усвоява в колямо количество от HepG2 клетките. Тези човешки чернодробни клетки метаболизират в голяма степен (±)-FTC до (+)-РТС-трифосфат.

Тези данни, заедно с други данни посочени тук, показват, че (±)FTC, както и неговите (-) и (+) енантиомери се фосфорилират в чернодробните клетки. Тези клетки могат да се трансформират с хепатит В вирус.

Пример 12: Отделяне на FTC от човешки HepG2 клетки

Фигура 10 илюстрира отделянето на [³Н]- (±)-FTC и неговите фосфорилирани производни в човешки HepG2 клетките в pmol/10 клетки във времето, след пулсиране на клетките с 10 мкМ [³Н]- (±)-FTC (700 DPM/pmol) за 24 часа след отстраняването.

На фиг. 11 е илюстрирано намаляването на общата концентрация на [³Н]- (±)-FTC и на неговите фосфорилирани производни в човешки HepG2 клетки след инкубиране в 10 мкМ [³Н]- (±)-FTC (700 DPM/pmol) за 24 часа, в pmol/10⁶ клетки във времето.

Както е показано, дори след 48 часа в клетките присъства над 1мкМ от активното съединение (което е значително по-високо от ЕС₅₀ за съединението).

V. Токсичност в изходни клетки на гранулоцит-микрофаги

Пример 13: Ефект на FTC върху образуването на колонии от изходни клетки на гранулоцит-микрофаги фигура 12 е графика на ефекта на (-) и (-) енантиомерите на FTC върху образуването на колонии от изходните клетки на гранулоцитмикрофаги, измерено в процент преживяли по отношение на концентрацията в мкМ; [ (-)-FTC незатъмнено кръгче, (+)-FTC затъмнено кръгче, AZT затъмнено квадратче]. Както се вижда, (-)-енантиомерът на FTC е по-малко токсичен, т.е. има по-висока IC^ от (+)-енантиомера или AZT в тази клетъчна линия.

III. Получаване на фармацевтични състави

Хора, страдащи от заболявания причинени от ΗIV и HBV, могат да се лекуват чрез прилагане на ефективно количество от (-)-FTC или негово фармацевтично приемливо производно или сол, заедно с фармацевтично приемлив носител или разредител. Активното вещество може да се приложи по всеки подходящ начин, например орално, парентерално, интравенозно, интрадермално, подкожно или външно, в течна или твърда форма.

Активното съединение се включва във фармацевтично приемлив носител или разредител в количество достатъчно за да освободи в пациента терапевтично количество от съединението, което да инхибира вирусната репликация in vivo, по-специално HIV и HBV репликацията, без да причини сериозни токсични ефекти в лекувания пациент. Под „инхибиращо количество се разбира количеството активно вещество, достатъчно да прояви инхибиращ ефект, както се измерва например чрез опитите описани тук.

Предпочитаната доза от (-)-FTC при гореописаните условия е в границите от около 1 до 50 мг/кг, за предпочитане 1 до 20 мг/кг телесно тегло на ден, най-общо 0.1 до около 100 мг за килограм телесно тегло на приемника дневно. Ефективната доза на фармацевтично приемливото производно може да се изчисли по отношение на теглото на изходния нуклеозид, който ще се освободи. Ако самото производно притежава активност, ефективната доза може да се пресметне както по-горе, като се използва теглото на производното или по друг известен на специалистите начин.

Съединението се прилага удобно в подходящи дозиращи единици форма, включително, без да са ограничаващи, съдържащи 7 до 3000 мг, за предпочитане 70 до 1400 мг активна съставка за единична дозираща форма. При оралните дози се прилагат обикновено 50 - 1000 мг.

Идеалното е, активната съставка да се прилага така, че да осигури върхова концентрация от активно вещество в плазмата от 0.2 до 70 мкМ, за предпочитане от 1.0 до 10 мкМ. Това може да се постигне, например чрез интравенозно инжектиране на 0.1 до 5 % разтвор от активната съставка, евентуално в солев разтвор, или да се приложи под формата на болус от активната съставка.

Концентрацията от активното съединение в състава на лекарството ще зависи от абсорбирането, дезактивирането и скоростта на изхвърляне на лекарството, както и от други фактори известни на специалистите. Трябва да се отбележи, че дозировката ще зависи и от сериозността на състоянието, което ще се лекува. Освен това за всеки отделен случай могат да се предпишат специфични дози за определен период от време в зависимост от нуждаещия се индивид и от професионалната преценка на лекуващия, като тук посочените дозировки са само примерни, без да ограничават обхвата или приложението на състава за който се претендира. Активната съставка може да се приложи наведнаж или да се раздели на няколко по-малки дози, които да се приложат в различни интервали от време.

Предпочитан начин на приложение на активното съединение е оралния. Оралните състави обикновено включват инертен разредител или ядлив носител. Те могат да се затварят в желатинови капсули или да се компримират в таблетки. За целта на орално лечебно приложение, активното съединение може да се използва заедно с пълнители и да се използва под формата на таблетки, пастили или капсули. Фармацевтично съвместими свързващи средства и/или помощни вещества могат да се включат като част от състава.

Таблетките, пилюлите, капсулите, пастилите и подобни могат да съдържат някоя от следните съставки или съединения от подобен характер: свързващи вещества като микрокристална целулоза, гума трагаканта или желатин; пълнители като нишесте или лактоза, дезинтегриращи вещества като алгинова киселина, примогел или царевично нишесте; смазващо вещество като магнезиев стеарат или стеротес; хлъзгащи вещества като колоидален силиконов диоксид; подслаждащо средство като захар или захарин, ароматизиращо вещество като мента, метил салицилат или портокалова есенция. Когато единичната доза е под форма на капсула в допълнение към горните вещества тя може да съдържа течен носител като мазнина. В допълнение, единичните дозиращи форми могат да съдържат различни други вещества, които модифицират физическата форма на дозиращата единица, например покритие от захар, шеллак или други свързани с червата средства.

(-)-FTC или неговите фармацевтично приемливи производни или соли могат да се прилагат като съставка на елексир, суспензия, сироп, нишестена капсула, дъвка или подобни. Сиропът може да съдържа допълнително към активното съединение и захар като подсладител и някой консерванти, багрила, оцветители и ароматизиращи средства.

(-)-FTC или неговите фармацевтично приемливи производни или соли могат да се прилагат също така като се смесят с други активни вещества, които не намаляват желаното действие или с вещества, които допълват желаното действие като антибиотици, противогъбични средства, противовъзпалителни или други противовирусни средства, включително други нуклеозидни анти-HIV съединения.

Разтворите или суспензиите използвани за парентерално, подкожно или външно приложение могат да включват следните съставки: стерилен разредител като вода за инжекции, физиологичен разтвор, фиксирани масла, полиетиленгликоли, глицерин, пропиленгликол или други синтетични разтворители; антибактериални средства като бензилов алкохол или метил парабени; антиоксиданти като аскорбинова киселина или натриев бисулфит; хелати като етилендиаминтетраоцетна киселина; буфери като ацетати, цитрати или фосфати и изотонизиращи добавки като натриев хлорид или декстроза. Парентералните препарати могат да се затварят в ампули, спринцовки за еднократна употреба или флакони от стъкло или пластмаса съдържащи многократни дози.

Ако се прилагат интравенозно, предпочитаните носители са физиологичен разтвор или фосфатно буфериран солев разтвор (PBS).

В предпочитано изпълнение активното съединение се формулира с носители, които защитават съединението срещу бързо елиминиране от организма, като лекарствени форми с контролирано освобождаване, включително импланти и системи за микрокапсулирано освобождаване. Могат да се използват биоразграждащи се, биосъвместими полимери като етиленвинилацетат, полианхидриди, полигликолова киселина, колаген, полиортоестери и полимлечна киселина. Методите за получаване на такива лекарствени форми са известни на специалистите от обастта. Веществата могат да се получат от търговията от Alza Corporation и Nova Pharmaceuticals, Inc.

Липозомни суспензии (включително липозоми насочени към заразените клетки с моноклинални антитела спрямо вирусни антигени) също се предпочитат като фармацевтичноприемливи носители. Те могат да се получат по известни на специалистите методи, например както е описано в САЩ патент No 4 522 811 (който е включен тук). Например липозомни лекарствени форми могат да се получат чрез разтваряне на подходящ липид(и) (като стеарил фосфатидил етаноламин, стероил фосфатидил холин, арахадоил фосфатидил холин и холестерол) в неорганичен разтворител, който след това се изпарява, като остава тънък филм от изсушен липид върху повърхността на контейнера. В контейнера след това се поставя воден разтвор на активното съединение. След това контейнерът се разклаща на ръка за да се отдели липидния материал от стените на контейнера и да се диспергират липидните агрегати, като по този начин се образува липозомна суспензия.

Claims

Патентни претенции

1. (-)-0-1_-2-хидроксиметил-5-(5-флуорцитозин-1 -ил)-1,3-оксатиолан като изолиран енантиомер или негово физиологично приемливо производно или физиологично приемлива сол.
2. фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че съдържа ефективно количество (-)-р-1_-2-хидроксиметил-5-(5-флуорцитозин-1-ил)-

1,3-оксатиолан или негова физиологично приемлива сол във фармацевтично приемлив носител за лечение на HIV инфекции при хора.
3. Метод за получаване на 2-хидроксиметил-5-(5-флуорцитозин-1ил)-1,3-оксатиолан, характеризиращ се с това, че включва взаимодействие на евентуално защитен 5-флуороцитозин с 1,3оксатиолан с формула А в която R_la означава водород или хидроксилзащитна група, включително ацилна група, и L е отцепваща се група, и евентуално отстраняване на хидроксилзащитната група.
4. Метод за получаване на 2-хидроксиметил-5-(5-флуорцитозин-1ил)-1,3-оксатиолан, характеризиращ се с това, че включва взаимодействие на съединение с формула В

S в която R_1a е хидроксилзащитна група, a R_1b означава аминозащитна група с флуориращо средство за вкарване на флуорен атом в 5-та позиция на цитозиновия пръстен и евентуално отстраняване на защитните групи.
5. Метод за получаване на 2-хидроксиметил-5-(5-флуорцитозин-1ил)-1,3-оксатиолан, характеризиращ се с това, че включва взаимодействие на съединение с формула С в която R_1a е хидроксилзащитна група, със средство за превръщане на оксогрупата в 4-та позиция в урациловия пръстен в аминогрупа и отстраняване на защитните групи.
6. Метод съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че 1,3- оксатиоланът се получава чрез:

(I) озониране на съединение с формула CH₂=CH-CH₂-OR или ROCH₂-CH = CH-CH₂OR, в която R е защитна група, за да се получи съединение с формула Е (II) взаимодействие на съединение Е от етап (-) с меркаптооцетна киселина за получаване на съединение с формула D (III) и редуциране на съединение D от етап (II) и след това взаимодействието му с анхидрид на карбоксилна киселина, алкилиращо средство или халогениращо средство за получаване на 1,3-оксатиолан с формула А

Rt аО—

L в която L е отцепваща се група.
7. Метод съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че анхидридът на карбоксилната киселина е оцетен анхидрид.
8. (-)-р-1_-2-хидроксиметил-5-(5-флуорцитозин-1 -ил)-1,3-оксатиолан в енантиомерно обогатена форма.
9. Състав съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че е подходящ за орално приложение.
10. Състав съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че е под формата на капсули.
11. Състав съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че е под форма на таблетки.
12. Използване на (-)-р-1_-2-хидроксиметил-5-(5-флуорцитозин-1ил)-1,3-оксатиолан като изолиран енантиомер, съгласно претенция 1, за получаване на лекарство за лечение на HIV.
13. Използване на (-)-р-1_-2-хидроксиметил-5-(5-флуорцитозин-1ил)-1,3-оксатиолан в енантиомерно обогатена форма, съгласно претенция 8, за получаване на лекарство за лечение на HIV.