<EMI ID=1.1>
à activité antivirale et un procédé de préparation pour de telles compositions. L'invention se rapporte plus particulièrement à la préparation de compositions qui, administrées à des hommes ou à des animaux, provoquent une résistance aux virus dans des organismes et des cellules vivante �t/ou induisent la formation de substances antivirales naturelles.
On prépare une composition antivirale selon l'invention à partir d'un ou de plusieurs composants inducteurs suscitant une
<EMI ID=2.1>
qui développent l'activité des inducteurs.
On sait que la résistance virale de tinsus et cellules vivants peut être induite par des virus, mais aussi par des composés d'ori gine naturelle ou synthétique. On peut ainsi provoquer une résistance aux virus à l'aide d'acides ribonucléiques naturels, cornue
<EMI ID=3.1>
tinine, des polysaccharides (N.B. Finter : Interferons, Philad�,'-..
1966, W.B. Saunders Co.).
On a constaté que des acides polyribonucléiques d'origine naturelle ou synthétique sont les inducteurs les plus actifs
(M.Harris : Science 170, 1068/1970/). Des mélanges simples (non
<EMI ID=4.1>
une chaîne du complexe est un acide désoxyribonucléique et l'
<EMI ID=5.1>
modifiés (comme des acides nucléiques renfermant des nucléotide%. contenant du soufre) ainsi que des composants analogues (produitr par introduction de nucléotides modifiés dans la molécule avant polymérisation) possèdent aussi un pouvoir inducteur de substance* antivirales.
<EMI ID=6.1>
<EMI ID=7.1>
<EMI ID=8.1>
<EMI ID=9.1>
<EMI ID=10.1>
<EMI ID=11.1>
<EMI ID=12.1>
On sait également que l'effet des inducteurs de type acide nucléique est plus impcrtant en présence de certains polycations. Par exemple, les inducteurs sont activés par la polylysine
<EMI ID=13.1>
Appl. Microbiol. 22, 380/1971), la polyornithine et la polyarginine. Le polycation le plus souvent étudié et le plus largement employé est le DEAE-dextrane (Dianzani, F. et coll.:Ann. N.Y. Acad. Sci.
<EMI ID=14.1>
Le brevet français n[deg.] 2 092 875 décrit la préparation de composés complexes induisant plus fortement la production d'ir.terféron que les seuls composants de caractère acide nucléique.
<EMI ID=15.1>
<EMI ID=16.1>
<EMI ID=17.1>
diluée, avec un polycation présentant des sites moléculaire* - tifs ou cationiques.
<EMI ID=18.1>
<EMI ID=19.1> b) les polymères de synthèse d'amino acides cationiques (poly polyornithine), <EMI ID=20.1> zime) ; et <EMI ID=21.1>
<EMI ID=22.1>
<EMI ID=23.1>
haut. Parmi les polycations énumérés ci-dessus, le DEAE-D exerce l'activation la plus importante pour un acide nucléique polymère
<EMI ID=24.1>
logiques de résistance au virus.
La présente invention se propose de fournir des polycations
<EMI ID=25.1>
duits déjà connus.
On a eu la surprise de constater que, par rapport à tous . composés connus pour leur effet d'activation, en particulier 1' polymères synthétiques d'amino acides cationiques naturels (par
<EMI ID=26.1>
peptides polycationiques de synthèse formés : <EMI ID=27.1>
<EMI ID=28.1>
tuants spécifiques basiques, ou <EMI ID=29.1>
au moins partiellement sur les groupes amino libres.
<EMI ID=30.1>
<EMI ID=31.1>
plus haut, on constate une activité avec des rapports inducteur:
activateur qui varient non seulement entre 2.10 -2 et 10 mais entre 10 et 10 . Le rapport utilisé de préférence maintenant,
<EMI ID=32.1>
aussi du mode d'administration de la composition.
<EMI ID=33.1>
<EMI ID=34.1>
l'invention pour former les complexes, peuvent être préparés selon des méthodes connues à partir de polypeptides contenant
<EMI ID=35.1>
ou carboxylique libres), par amidation d'au moins une partie des groupes carboxyliques libres avec des diamines ou des hydroxyalkylamines ou par alkylation d'au moins une partie de" groupes amino libres à l'aide d'agents d'alkylation.
<EMI ID=36.1>
en faisant réagir un dérivé réactif d'un polypeptide contenant des groupes carboxyliques libres, par exemple un ester d'acide poly-DL-amino-malonique, d'acide poly-L-aspartique ou poly-L-glutamique ou des copolym�res de ces amino-acides dicarboxyliques
<EMI ID=37.1>
méthodes pour les préparer : <EMI ID=38.1>
amino-2-éthylamine; b) Polypeptides polycationiques obtenus par réaction d'ester poly-aminomalonique ou a-ester méthylique d'acide 6-polyaspat tique ou des dérivés copolymêres de ces amino-acides, formés avec d'autres amino-acides ou leurs dérivés, avec des diamines primaires-tertiaires, ainsi que différents sels d'ammonium
<EMI ID=39.1>
stituants en position quaternaire sont des groupes hydrocarbonés
<EMI ID=40.1>
(groupes carboxy, acide sulfonique, etc.) et un ester carboxylique ou des cycles hétérocycliques (brevet de Grande-Bretagne
<EMI ID=41.1>
<EMI ID=42.1>
<EMI ID=43.1>
quaternaire peuvent être des groupes alkyles ou aralkyles, sub-
<EMI ID=44.1>
xyéthyle, benzyle ou p-chlorobenzyle (brevet hongrois n[deg.] 150 576).
d) . Amino-3-propylamides d'acide a-poly(L ou D)-aspartique,
<EMI ID=45.1>
<EMI ID=46.1>
e) Polypeptides polycationiques formés par réaction de y-esters <EMI ID=47.1>
cine, des diamines NI-mono ou dialkylées ou leurs mélanges;
<EMI ID=48.1>
et les divers dérivés quaternaires de ces polycations (brevet hongrois n[deg.] 150 756).
<EMI ID=49.1>
dérivés carboxamides par ces diamines; ainsi que des dérivés d'acide polyglutamique polycationiques modifiés par l'amino-2éthylamine et contenant aussi des "réticulations" composées
<EMI ID=50.1>
Hung. 54, 65/1967/).
h) Dérivés d'acide a-poly-L-glutamique modifiés par la diméthyl-
amino-2-éthylamine et contenant aussi des unités transformée?
<EMI ID=51.1>
<EMI ID=52.1>
<EMI ID=53.1>
k) Copolypeptides contenant la lysine et d'autres amino-acides
(comme l'alanine) et leurs dériver quaternaire? (brevet
<EMI ID=54.1>
La présente invention �urnit donc un procède de préparation de complexes ayant une activité antivirale accrue, qui consiste
<EMI ID=55.1>
aqueux, avec un polypeptide polycationique de synthèse construit totalement ou en partie à oartir d'unités d'n-aminoacide de formule générale :
<EMI ID=56.1>
dans laquelle :
A représente un groupe :
<EMI ID=57.1>
<EMI ID=58.1>
<EMI ID=59.1>
cyclique à 5 ou 6 éléments, contenant éventuellement un autrehétéroatome.
<EMI ID=60.1>
<EMI ID=61.1>
carbone;
<EMI ID=62.1>
<EMI ID=63.1>
, n peut être zéro,
<EMI ID=64.1>
<EMI ID=65.1> cationique synthétique (appelé par la suite : activateur) sont mises en contact dans des solutions aqueuses, de préférence dans des solutions préparées avec une solution de chlorure de sodium physiologique.
<EMI ID=66.1>
<EMI ID=67.1>
et/ou du chlorure de sodium, et éventuellement aussi d'autrer adjuvants pharmaceutiques connus en eux-mômes.
<EMI ID=68.1>
<EMI ID=69.1>
des compositions les renfermant sont décrits plus loin.
<EMI ID=70.1>
<EMI ID=71.1>
teur ou un mélange d'activateurs. Les compositions (solution'
<EMI ID=72.1>
<EMI ID=73.1>
lisants et autres adjuvants.
Par la suite, on désigne chaque type d'activateurs par lettre "A" suivie d'un indice caractéristique de la qualité. :
<EMI ID=74.1>
même catégorie. La première donnée numérique est la viscosité
<EMI ID=75.1>
dichloroacétique à 0,5%. La seconde donnée numérique représc ' le degré de substitution par les groupes cationiques caractér.r
<EMI ID=76.1>
rents types d'activateurs :
<EMI ID=77.1>
carboxyliques libres sont convertis en dérivés carboxamides
<EMI ID=78.1>
<EMI ID=79.1>
numériques entre parenthèses.
<EMI ID=80.1>
libres sont convertis en dérivés carboxamides avec de la diéthylamino-2-éthylamine , à des degrés divers, ainsi que l'indiquent les secondes valeurs numériques entre parenthèses.
<EMI ID=81.1>
carboxyliques libres sont convertis en dérivés carboxamides
<EMI ID=82.1>
dans le pourcentage indiqué.
<EMI ID=83.1>
libres sont convertis en dérivés carboxamides substitués par
<EMI ID=84.1>
et 8% d'imidazolyl-2-éthyle.
A6 Méthosulfate d'un dérivé de polylysine, dont les groupes
amino libres sont méthylés.
A7 Méthosulfate d'un dérivé de polyornithine dont !en groupes
amino libres sont méthylés.
<EMI ID=85.1>
liques libres sont convertis en dérivés carboxamides à l'a-'. de diéthylamino-2-éthylamine, dans le pourcentage indiqué.
<EMI ID=86.1>
liques libres sont convertis en dérivés carboxamides à l'a de diméthylamino-2-éthylamine dans le pourcentage indique.
<EMI ID=87.1>
carboxyliques libres sont convertis en dérivés carboxamides portant comme substituants des radicaux méthyldiéthylammonio2-éthyle, dans le pourcentage indiqué.
<EMI ID=88.1>
<EMI ID=89.1>
<EMI ID=90.1>
<EMI ID=91.1>
de l'alcool.
Les quantités absolue et relative de chaque composant des compositions selon l'invention peuvent varier dans de très larges mesures, en fonction des particularités de l'organisme traité
et du mode d'administration.
La préparation des compositions est illustrée par les exemple''suivants, qui ne sont pas limitatifs de la portée de l'invention.
<EMI ID=92.1>
<EMI ID=93.1>
NaCl physiologique. On neutralise le mélange et le soumet à une filtration stérile, puis on le mélange de façon stérile avec 100 ml de solution physiologique stérile qui renferme 1,0 microgramme d'inducteur par ml de solution. On peut répartir stérilement cette composition dans des ampoules et la conserver � l'état gel�.
<EMI ID=94.1>
I/f A2(0,90; 93%) - puly I:C (12,2; 6,3) I/g A4( - ; 92%) - poly I:C (12,2; 6,3)
<EMI ID=95.1>
<EMI ID=96.1>
<EMI ID=97.1>
si ce n'est que les solutions contiennent 10% de dextrane.
<EMI ID=98.1>
lidone.
<EMI ID=99.1>
<EMI ID=100.1>
\ <EMI ID=101.1>
On procède tel que décrit pour les compositions I/a à I/i,
si ce n'est que l'on répartit la solution stérile dans des ampoules de 10 ml et qu'on les soumet 1 une lyophilisation de façon stérile. Compositions VII/a à VII/e.
On procède tel que décrit pour les compositions I/a à I/e,
si ce n'est que l'on dissout les chlorhydrates neutres des activateurs et que l'on ne neutralise pas la solution.
Compositions VIII/a à VIII/h.
On dissout 100 mg d'activateur dans 100 ml de solution de chlorure de sodium physiologique. Après neutralisation et filtr�- tton stérile, on mélanqe la solution de façon stérile avec 100 ml de solution physiologique contenant 1,0 microgramme/ml d'inducteur. On peut répartir les compositions résultantes dans des ampoules
de 10 ml dans des conditions stériles ou les conserv..r à l'étai.
ou lyophilisé.
Des couples d'activateur-inducteur sont par exemple :
<EMI ID=102.1>
VIII/c A1(0,49; 96%) - poly I:C (12,2; 6,3)
<EMI ID=103.1>
VIII/h A5( - ) - poly I:C (12,2; 6,3) Compositions IX/a a IX/j.
<EMI ID=104.1>
<EMI ID=105.1>
<EMI ID=106.1>
<EMI ID=107.1>
<EMI ID=108.1>
IX/g A1(0,92; 94%) - statolon
<EMI ID=109.1>
IX/i A6( - ) - poly I:C (12,2; 6,3)
<EMI ID=110.1>
Compositions X/a à X/d.
On dissout 10C mg d'activateur dans 100 ml de solution physiologique. On neutralise la solution et on la soumet à une fil-
<EMI ID=111.1>
de solution physiologique stérile contenant 0,05 microgramme/ml d'inducteur. Les compositions obtenues peuvent être réparties en ampoules ou conservées à l'état gelé ou lyophilisé.
Des paires activateur-inducteur peuvent être par exemple composées de :
X/a A1(0,49; 96%) - statolon
X/b A1(0,52; 93%) - statolon
<EMI ID=112.1>
X/d A9(0,98; 91%) - poly I:C (12,2; 6,3)
<EMI ID=113.1>
On procède tel que décrit pour les compositions X/a à X/d,
<EMI ID=114.1>
gramme/ml d'inducteur au lieu de 0,05 microgramne.
<EMI ID=115.1> <EMI ID=116.1>
<EMI ID=117.1>
Compositions XII/a à XII/i.
On dissout 4,0 g d'activateur dans 100 ml de solution physio-
<EMI ID=118.1>
à 100 ml de solution physiologique contenant 100 microgrammes d'inducteur par ml. On lyophilise la solution obtenue, puis la mélange avec 1,0 kg de lactose et 1,0 kg d'amidon pour fabriquer des pilules. Chaque pilule doit contenir 2 mg d'activateur et 5,0 microgrammes d'inducteur.
<EMI ID=119.1>
décrits pour les compositions I.
<EMI ID=120.1>
On dissout 2,5 mg d'un sel d'activateur dans 50 ml d'eau distillée; on filtre la solution de façon stérile, puis on la mélange à 50 ml d'eau distillée stérile, contenant 125 mg d'indu teur. Il peut se former une légère opalescence. La composition
<EMI ID=121.1>
puis lyophilisée.
<EMI ID=122.1>
constitués de :
<EMI ID=123.1>
XIV/c A2(0,90: 93%) - poly I:C (12,2; 6,3)
<EMI ID=124.1>
si ce n'est que l'on dissout 5,0 mg d'activateur et non 2,5 mg, dans les 50 ml d'eau distillée.
Des couples activateur-inducteur peuvent être par exemple :
XV/a A2(0,90; 93%) - poly I:C (12,2: 6.3)
XV/b Al(0,90; 92%) - poly I:C ( 7,3; 3,4) Compositions XVl/a - XVI/b.
<EMI ID=125.1>
<EMI ID=126.1>
<EMI ID=127.1>
Composition XVII.
On procède tel que décrit pour les compositions XIV, si ce n'est que l'on dissout respectivement 5,0 mg d'activateur et
<EMI ID=128.1>
d'activateur et 125 mg d'inducteur.
Un couple activateur-inducteur peut être par exemple :
<EMI ID=129.1>
Composition XVIII.
On procède tel que décrit pour les compositions XIV, si ce n'est que l'on dissout respectivement 5,0 mg d'activateur et
<EMI ID=130.1>
dans 50 ml d'eau.
Un couple activateur -inducteur peut être par exemple :
<EMI ID=131.1>
<EMI ID=132.1>
<EMI ID=133.1>
n'est que l'on dissout respectivement 100 mg d'activateur et
<EMI ID=134.1>
<EMI ID=135.1>
qui est décrit dans la composition XVIII.
Les matériaux, méthodes et définitions utilisés dans le* expériences sont les suivants :
<EMI ID=136.1>
nate acide de sodium-acide carbonique.
La culture de tissu foetal humain est préparée de la façon
r
<EMI ID=137.1>
<EMI ID=138.1>
<EMI ID=139.1>
/ <EMI ID=140.1>
<EMI ID=141.1>
<EMI ID=142.1>
L'expression "activité biologique mesurée dans des cultures
<EMI ID=143.1>
<EMI ID=144.1>
<EMI ID=145.1>
concentration de l'activateur mise en oeuvre est à la limite de la non-toxicité.
<EMI ID=146.1>
d'activateur sous l'action de laquelle les cellules subissent des déformations morphologiques observables au microscope. En
<EMI ID=147.1>
<EMI ID=148.1>
<EMI ID=149.1>
<EMI ID=150.1>
<EMI ID=151.1>
d'embryon de poulet.
Pour les examans in vivo, dans des souris albinos CFLP, pesant
20 à 22 g, on procède de la façon suivante :
<EMI ID=152.1>
inoculation, afin d'éviter des infections bactériennes.
<EMI ID=153.1>
<EMI ID=154.1> mine la teneur en interféron du sérum dans des cultures de tissu, dans des tubes de fibroblaste L-929 de souris de 48 heures. Les cultures sont ensemencées avec les échantillons dilués, et l'en-
<EMI ID=155.1>
<EMI ID=156.1>
Ensuite, on réalise l'infection avec 5.10 p.f.u. de VSV, on fait incuber à 37[deg.]C pendant 48 heures et l'on détermine le titre en interféron (Ch. Buckler et coll.: Proc. Soc. Exp. Blol. Med. 136.
394-399, 1971).
Etude de la survie : on administre à des souris par voie intrapéritonéale, le virus Semliki Forent actif sur les souris
(C.J. Boradish et coll.: J. gen. Virol. 12, 141-160, 1971) à une concentration telle que la mortalité est de 100% en quelques jours. On détermine cette concentration au cours d'essais préliminaires.
<EMI ID=157.1>
la manière à tester. Les animaux survivent au moins 21 jours après l'infection.
Dans le cas du virus de la grippe, souche Hongkong 68/1,
la souche de virus a été complètement adaptée au poumon de souris
<EMI ID=158.1>
tuer une souris. L'infection est réalisée par voie trachéale,
<EMI ID=159.1>
<EMI ID=160.1>
sur le système nerveux, l'infection est faite par inoculations intracérébrales de 0,03 ml par souris avec des doses de 10 à
<EMI ID=161.1>
EXEMPLE
On fait incuber des cellules de fibroblaste L-929 de souris
<EMI ID=162.1> <EMI ID=163.1>
ou (à titre de comparaison) de DEAE-dextrane, et du poly I:C
<EMI ID=164.1>
<EMI ID=165.1>
à nouveau incuber à 37[deg.]C pendant 92heures. Ensuite, on détermine la dose efficace minimale de poly I:C en présence de différents activateurs. Les résultats sont rassembler dans le tableau 1.
TABLEAU 1
<EMI ID=166.1>
EXEMPLE 2
On fait incuL - des cellules de fibroblaste L-9?9
<EMI ID=167.1>
par un milieu de culture frais contenant : <EMI ID=168.1>
I/A - I/g VIII/a - VIII/h Il/a - Il/g IX/a - IX/j III/a - Ill/g X/a - X/d
<EMI ID=169.1>
<EMI ID=170.1> pour 100 ml de milieu.
On fait incuber les cultures de cellules à 37[deg.]C pendant
<EMI ID=171.1>
<EMI ID=172.1>
On ne constate aucun développement de virus sur l'une quelconque des cultures de cellules traitées et cela est vérifié par évaluation microscopique et/ou comptage de plaquer.
EXEMPLE 3
On fait incuber une culture de tissu dérivée de foetus humai:. primaire dans le milieu de culture de tjssu, puis on remplace
le milieu originel par un milieu frais qui renferme 10% de l'une des compositions suivantes :
I/h - I/i
<EMI ID=173.1>
<EMI ID=174.1>
IV/h - IV/i
V/h - V/i
VII/h - VII/i
XI/f, XI/c, Xl/g
<EMI ID=175.1>
<EMI ID=176.1>
une seule pilule de l'une des compositions XIII/h ou XIII/i pour
100 ml de milieu.
On fait incuber les cultures de cellules à 37"C pendant
12 heures, puis on les lave et les oppose au VSV et les fait incuber à nouveau à 37[deg.]C pendant 72 heures. On ne constate aucun développement de virus dans les cultures traitées, que ce soit par examens microscopiques et/ou comptage de plaques.
EXEMPLE 4
On dissout le contenu d'une seule ampoule de la composition XIV/a, b ou c, dans 1 ml de solution physiologique saline stérile.
<EMI ID=177.1>
le tableau '.' .
1 <EMI ID=178.1>
<EMI ID=179.1>
EXEMPLE 5
<EMI ID=180.1>
le virus Semliki Forcst (SFV), puis on administre par voie intr�péritonéale 0,1 ml d'une solution obtenue par mélange du contenu
<EMI ID=181.1>
<EMI ID=182.1>
après l'infection. Les données de survie des animaux sont rassem-
<EMI ID=183.1>
TABLEAU 3
<EMI ID=184.1>
<EMI ID=185.1>
<EMI ID=186.1>
TABLEAU 5
<EMI ID=187.1>
<EMI ID=188.1>
<EMI ID=189.1>
TABLEAU 7
<EMI ID=190.1>
<EMI ID=191.1>
<EMI ID=192.1>
EXEMPLE 6
<EMI ID=193.1>
HongKong 68/1 du virus de la grippe adapté aux souris.
On administre de plus, par voie intrapéritonéale juste après l'i:�fection, 0,1 ml d'une solution contenant le contenu d'une seule ampoule de composition XV/b dans 1 ml de solution physiologique; on répète cette opération une fois par jour pendant les deux jour, suivant le traitement. La moyenne de durée de survie réciproque
<EMI ID=194.1>
les groupes traités.
EXEMPLE 7
On procède tel que décrit dans 1'exemple 6, si ce n'est que
<EMI ID=195.1>
durée de survie réciproque est de 0,140 pour les témoins et de
<EMI ID=196.1>
tion.
EXEMPLE 8
<EMI ID=197.1>
<EMI ID=198.1>
<EMI ID=199.1>
1.- Procédé de préparation de complexes présentant une acti- vité antivirale supérieure, caractérisé en ce que l'on met en
<EMI ID=200.1>
dans des cellules vivantes, la production d'agents antiviraux naturels et/ou possédant intrinsèquement une activité antivirale, avec un polypeptide polycationique de synthèse, construit totale-
-ment ou en partie à l'aide d'unités d'a-aminoacide de formule générale :
<EMI ID=201.1>
dans laquelle :
A représente un grcupe :
<EMI ID=202.1>
ou
<EMI ID=203.1>
<EMI ID=204.1>
<EMI ID=205.1>
des groupes alkyles de 1 à 4 atomes de carbone, ou
<EMI ID=206.1>
<EMI ID=207.1>
atome;
R3 est un groupe alkyle de 1 à 4 atomes de carbone;
<EMI ID=208.1>
carbone;
<EMI ID=209.1>
<EMI ID=210.1>
, n peut être zéro;
ou avec un sel d'addition d'acide ou un dérive d'ammonium quaternaire d'un tel polypeptide polycationique de synthèse.
<EMI ID=211.1>
<EMI ID = 1.1>
with antiviral activity and a method of preparation for such compositions. The invention relates more particularly to the preparation of compositions which, when administered to humans or animals, induce resistance to viruses in living organisms and cells - or induce the formation of natural antiviral substances.
An antiviral composition according to the invention is prepared from one or more inducing components giving rise to a
<EMI ID = 2.1>
which develop the activity of the inducers.
It is known that the viral resistance of living cells and cells can be induced by viruses, but also by compounds of natural or synthetic origin. Resistance to viruses can thus be induced using natural ribonucleic acids, retort
<EMI ID = 3.1>
tinin, polysaccharides (N.B. Finter: Interferons, Philad �, '- ..
1966, W.B. Saunders Co.).
Polyribonucleic acids of natural or synthetic origin have been found to be the most active inducers
(M. Harris: Science 170, 1068/1970 /). Simple mixtures (no
<EMI ID = 4.1>
a chain of the complex is a deoxyribonucleic acid and the
<EMI ID = 5.1>
modified nucleic acids (such as nucleic acids containing% nucleotides containing sulfur) as well as analogous components (produced by the introduction of modified nucleotides into the molecule before polymerization) also possess an antiviral substance inducing power.
<EMI ID = 6.1>
<EMI ID = 7.1>
<EMI ID = 8.1>
<EMI ID = 9.1>
<EMI ID = 10.1>
<EMI ID = 11.1>
<EMI ID = 12.1>
It is also known that the effect of inducers of nucleic acid type is more important in the presence of certain polycations. For example, the inducers are activated by polylysine
<EMI ID = 13.1>
Appl. Microbiol. 22, 380/1971), polyornithine and polyarginine. The most frequently studied and widely used polycation is DEAE-dextran (Dianzani, F. et al.:Ann. N.Y. Acad. Sci.
<EMI ID = 14.1>
French patent n [deg.] 2 092 875 describes the preparation of complex compounds which induce the production of ir.terferon more strongly than the only components of a nucleic acid character.
<EMI ID = 15.1>
<EMI ID = 16.1>
<EMI ID = 17.1>
diluted, with a polycation having molecular sites * - tive or cationic.
<EMI ID = 18.1>
<EMI ID = 19.1> b) synthetic polymers of cationic amino acids (poly polyornithine), <EMI ID = 20.1> zime); and <EMI ID = 21.1>
<EMI ID = 22.1>
<EMI ID = 23.1>
high. Of the polycations listed above, DEAE-D exerts the most significant activation for a polymeric nucleic acid
<EMI ID = 24.1>
logics of resistance to the virus.
The present invention proposes to provide polycations
<EMI ID = 25.1>
already known products.
We were surprised to find that compared to all. compounds known for their activating effect, in particular synthetic polymers of natural cationic amino acids (e.g.
<EMI ID = 26.1>
Synthetic polycationic peptides formed: <EMI ID = 27.1>
<EMI ID = 28.1>
basic specific killers, or <EMI ID = 29.1>
at least partially on the free amino groups.
<EMI ID = 30.1>
<EMI ID = 31.1>
above, we see an activity with inducer ratios:
activator which vary not only between 2.10 -2 and 10 but between 10 and 10. The preferred ratio now,
<EMI ID = 32.1>
also the mode of administration of the composition.
<EMI ID = 33.1>
<EMI ID = 34.1>
the invention to form the complexes can be prepared according to known methods from polypeptides containing
<EMI ID = 35.1>
or free carboxylic), by amidation of at least part of the free carboxylic groups with diamines or hydroxyalkylamines or by alkylation of at least part of "free amino groups with the aid of alkylating agents.
<EMI ID = 36.1>
by reacting a reactive derivative of a polypeptide containing free carboxylic groups, for example an ester of poly-DL-amino-malonic acid, poly-L-aspartic or poly-L-glutamic acid or copolymers � res of these dicarboxylic amino acids
<EMI ID = 37.1>
methods to prepare them: <EMI ID = 38.1>
amino-2-ethylamine; b) Polycationic polypeptides obtained by reaction of poly-aminomalonic ester or a-methyl ester of 6-polyaspatic acid or copolymeric derivatives of these amino acids, formed with other amino acids or their derivatives, with diamines primary-tertiary, as well as various ammonium salts
<EMI ID = 39.1>
quaternary constituents are hydrocarbon groups
<EMI ID = 40.1>
(carboxy groups, sulfonic acid, etc.) and a carboxylic ester or heterocyclic rings (Great Britain patent
<EMI ID = 41.1>
<EMI ID = 42.1>
<EMI ID = 43.1>
quaternary can be alkyl or aralkyl groups, sub-
<EMI ID = 44.1>
xyethyl, benzyl or p-chlorobenzyl (Hungarian patent no [deg.] 150,576).
d). A-poly (L or D) -aspartic acid 3-amino-propylamides,
<EMI ID = 45.1>
<EMI ID = 46.1>
e) Polycationic polypeptides formed by reaction of γ-esters <EMI ID = 47.1>
cine, NI-mono or dialkylated diamines or mixtures thereof;
<EMI ID = 48.1>
and the various quaternary derivatives of these polycations (Hungarian patent no [deg.] 150,756).
<EMI ID = 49.1>
carboxamide derivatives by these diamines; as well as polycationic polyglutamic acid derivatives modified with 2-aminoethylamine and also containing compound "crosslinks"
<EMI ID = 50.1>
Hung. 54, 65/1967 /).
h) α-Poly-L-glutamic acid derivatives modified by dimethyl-
amino-2-ethylamine and also containing transformed units?
<EMI ID = 51.1>
<EMI ID = 52.1>
<EMI ID = 53.1>
k) Copolypeptides containing lysine and other amino acids
(like alanine) and their quaternary derivative? (patent
<EMI ID = 54.1>
The present invention therefore provides a process for the preparation of complexes having increased antiviral activity, which consists
<EMI ID = 55.1>
aqueous, with a synthetic polycationic polypeptide constructed wholly or in part from n-amino acid units of the general formula:
<EMI ID = 56.1>
in which :
A represents a group:
<EMI ID = 57.1>
<EMI ID = 58.1>
<EMI ID = 59.1>
5 or 6 membered cyclic, optionally containing another heteroatom.
<EMI ID = 60.1>
<EMI ID = 61.1>
carbon;
<EMI ID = 62.1>
<EMI ID = 63.1>
, n can be zero,
<EMI ID = 64.1>
Synthetic cationic <EMI ID = 65.1> (called hereafter: activator) are contacted in aqueous solutions, preferably in solutions prepared with physiological sodium chloride solution.
<EMI ID = 66.1>
<EMI ID = 67.1>
and / or sodium chloride, and possibly also other pharmaceutical adjuvants known per se.
<EMI ID = 68.1>
<EMI ID = 69.1>
compositions containing them are described below.
<EMI ID = 70.1>
<EMI ID = 71.1>
agent or a mixture of activators. The compositions (solution '
<EMI ID = 72.1>
<EMI ID = 73.1>
reading agents and other adjuvants.
In the following, each type of activator is designated by the letter "A" followed by a characteristic index of the quality. :
<EMI ID = 74.1>
same category. The first numerical data is the viscosity
<EMI ID = 75.1>
0.5% dichloroacetic. The second numerical data represents the degree of substitution by the characteristic cationic groups.
<EMI ID = 76.1>
Types of activators:
<EMI ID = 77.1>
free carboxylic acids are converted to carboxamide derivatives
<EMI ID = 78.1>
<EMI ID = 79.1>
numeric in parentheses.
<EMI ID = 80.1>
free are converted to carboxamide derivatives with 2-diethylamino-ethylamine, to varying degrees, as indicated by the second numerical values in parentheses.
<EMI ID = 81.1>
free carboxylic acids are converted to carboxamide derivatives
<EMI ID = 82.1>
in the percentage indicated.
<EMI ID = 83.1>
free are converted to carboxamide derivatives substituted by
<EMI ID = 84.1>
and 8% imidazolyl-2-ethyl.
A6 Methosulfate of a polylysine derivative, the groups of which
free amino are methylated.
A7 Methosulfate of a polyornithine derivative of which! In groups
free amino are methylated.
<EMI ID = 85.1>
Free liquids are converted to α-carboxamide derivatives. of diethylamino-2-ethylamine, in the percentage indicated.
<EMI ID = 86.1>
Free liquids are converted to α-carboxamide derivatives of 2-dimethylamino-ethylamine in the percentage indicated.
<EMI ID = 87.1>
Free carboxylic acids are converted into carboxamide derivatives bearing methyldiethylammonio2-ethyl radicals as substituents, in the percentage indicated.
<EMI ID = 88.1>
<EMI ID = 89.1>
<EMI ID = 90.1>
<EMI ID = 91.1>
alcohol.
The absolute and relative amounts of each component of the compositions according to the invention can vary over very wide measures, depending on the particularities of the organism treated.
and the method of administration.
The preparation of the compositions is illustrated by the following examples, which are not limiting on the scope of the invention.
<EMI ID = 92.1>
<EMI ID = 93.1>
Physiological NaCl. The mixture is neutralized and subjected to sterile filtration, then mixed in a sterile manner with 100 ml of sterile physiological solution which contains 1.0 microgram of inducer per ml of solution. This composition can be sterilized in ampoules and stored � frost state �.
<EMI ID = 94.1>
I / f A2 (0.90; 93%) - puly I: C (12.2; 6.3) I / g A4 (-; 92%) - poly I: C (12.2; 6.3)
<EMI ID = 95.1>
<EMI ID = 96.1>
<EMI ID = 97.1>
except that the solutions contain 10% dextran.
<EMI ID = 98.1>
lidone.
<EMI ID = 99.1>
<EMI ID = 100.1>
\ <EMI ID = 101.1>
The procedure is as described for the compositions I / a to I / i,
except that the sterile solution is divided into 10 ml ampoules and subjected to lyophilization in a sterile manner. Compositions VII / a to VII / e.
The procedure is as described for the compositions I / a to I / e,
except that the neutral hydrochlorides of the activators are dissolved and the solution is not neutralized.
Compositions VIII / a to VIII / h.
100 mg of activator are dissolved in 100 ml of physiological sodium chloride solution. After neutralization and sterile filtering, the solution is mixed sterile with 100 ml of physiological solution containing 1.0 microgram / ml of inducer. The resulting compositions can be distributed in ampoules.
10 ml under sterile conditions or stored in a prop.
or lyophilized.
Activator-inducer pairs are for example:
<EMI ID = 102.1>
VIII / c A1 (0.49; 96%) - poly I: C (12.2; 6.3)
<EMI ID = 103.1>
VIII / h A5 (-) - poly I: C (12.2; 6.3) Compositions IX / a to IX / j.
<EMI ID = 104.1>
<EMI ID = 105.1>
<EMI ID = 106.1>
<EMI ID = 107.1>
<EMI ID = 108.1>
IX / g A1 (0.92; 94%) - statolon
<EMI ID = 109.1>
IX / i A6 (-) - poly I: C (12.2; 6.3)
<EMI ID = 110.1>
Compositions X / a to X / d.
10C mg of activator is dissolved in 100 ml of physiological solution. The solution is neutralized and subjected to a wire.
<EMI ID = 111.1>
of sterile physiological solution containing 0.05 microgram / ml of inducer. The compositions obtained can be distributed in ampoules or stored in the frozen or lyophilized state.
Activator-inducer pairs can for example be composed of:
X / a A1 (0.49; 96%) - statolon
X / b A1 (0.52; 93%) - statolon
<EMI ID = 112.1>
X / d A9 (0.98; 91%) - poly I: C (12.2; 6.3)
<EMI ID = 113.1>
The procedure is as described for the compositions X / a to X / d,
<EMI ID = 114.1>
gram / ml of inducer instead of 0.05 microgram.
<EMI ID = 115.1> <EMI ID = 116.1>
<EMI ID = 117.1>
Compositions XII / a to XII / i.
4.0 g of activator are dissolved in 100 ml of physiological solution.
<EMI ID = 118.1>
to 100 ml of physiological solution containing 100 micrograms of inducer per ml. The resulting solution was freeze-dried, then mixed with 1.0 kg of lactose and 1.0 kg of starch to make pills. Each pill should contain 2 mg of activator and 5.0 micrograms of inducer.
<EMI ID = 119.1>
described for compositions I.
<EMI ID = 120.1>
2.5 mg of an activator salt are dissolved in 50 ml of distilled water; the solution is sterile filtered and then mixed with 50 ml of sterile distilled water, containing 125 mg of inducer. A slight opalescence may form. The composition
<EMI ID = 121.1>
then lyophilized.
<EMI ID = 122.1>
made up of:
<EMI ID = 123.1>
XIV / c A2 (0.90: 93%) - poly I: C (12.2; 6.3)
<EMI ID = 124.1>
except that 5.0 mg of activator and not 2.5 mg are dissolved in 50 ml of distilled water.
Activator-inducer pairs can be, for example:
XV / a A2 (0.90; 93%) - poly I: C (12.2: 6.3)
XV / b Al (0.90; 92%) - poly I: C (7.3; 3.4) Compositions XVl / a - XVI / b.
<EMI ID = 125.1>
<EMI ID = 126.1>
<EMI ID = 127.1>
Composition XVII.
The procedure is as described for compositions XIV, except that respectively 5.0 mg of activator and
<EMI ID = 128.1>
activator and 125 mg inducer.
An activator-inducer couple can be for example:
<EMI ID = 129.1>
Composition XVIII.
The procedure is as described for compositions XIV, except that respectively 5.0 mg of activator and
<EMI ID = 130.1>
in 50 ml of water.
An activator-inductor couple can be for example:
<EMI ID = 131.1>
<EMI ID = 132.1>
<EMI ID = 133.1>
is that one dissolves respectively 100 mg of activator and
<EMI ID = 134.1>
<EMI ID = 135.1>
which is described in composition XVIII.
The materials, methods and definitions used in the * experiments are as follows:
<EMI ID = 136.1>
sodium acid-carbonic acid nate.
The culture of human fetal tissue is prepared in the manner
r
<EMI ID = 137.1>
<EMI ID = 138.1>
<EMI ID = 139.1>
/ <EMI ID = 140.1>
<EMI ID = 141.1>
<EMI ID = 142.1>
The expression "biological activity measured in cultures
<EMI ID = 143.1>
<EMI ID = 144.1>
<EMI ID = 145.1>
concentration of the activator used is at the limit of non-toxicity.
<EMI ID = 146.1>
activator under the action of which the cells undergo morphological deformations observable under a microscope. In
<EMI ID = 147.1>
<EMI ID = 148.1>
<EMI ID = 149.1>
<EMI ID = 150.1>
<EMI ID = 151.1>
of chicken embryo.
For in vivo examinations, in CFLP albino mice weighing
20 to 22 g, the procedure is as follows:
<EMI ID = 152.1>
inoculation, in order to avoid bacterial infections.
<EMI ID = 153.1>
<EMI ID = 154.1> monitors serum interferon content in tissue cultures in 48 hour mouse L-929 fibroblast tubes. The cultures are inoculated with the diluted samples, and the en-
<EMI ID = 155.1>
<EMI ID = 156.1>
Then the infection is carried out with 5.10 p.f.u. of VSV, incubated at 37 [deg.] C for 48 hours and the interferon titer determined (Ch. Buckler et al .: Proc. Soc. Exp. Blol. Med. 136.
394-399, 1971).
Survival study: mice were administered intraperitoneally, the Semliki Forent virus active in mice
(C.J. Boradish et al .: J. gen. Virol. 12, 141-160, 1971) at a concentration such that the mortality is 100% within a few days. This concentration is determined during preliminary tests.
<EMI ID = 157.1>
the way to test. The animals survive at least 21 days after infection.
In the case of the influenza virus, Hongkong strain 68/1,
the virus strain has been completely adapted to the mouse lung
<EMI ID = 158.1>
kill a mouse. The infection is carried out through the tracheal route,
<EMI ID = 159.1>
<EMI ID = 160.1>
on the nervous system, the infection is made by intracerebral inoculations of 0.03 ml per mouse with doses of 10 to
<EMI ID = 161.1>
EXAMPLE
Mouse L-929 fibroblast cells are incubated
<EMI ID = 162.1> <EMI ID = 163.1>
or (for comparison) DEAE-dextran, and poly I: C
<EMI ID = 164.1>
<EMI ID = 165.1>
again incubate at 37 [deg.] C for 92 hours. Next, the minimum effective dose of poly I: C is determined in the presence of different activators. The results are collated in Table 1.
TABLE 1
<EMI ID = 166.1>
EXAMPLE 2
L-9 fibroblast cells are incubated? 9
<EMI ID = 167.1>
by fresh culture medium containing: <EMI ID = 168.1>
I / A - I / g VIII / a - VIII / h Il / a - Il / g IX / a - IX / j III / a - Ill / g X / a - X / d
<EMI ID = 169.1>
<EMI ID = 170.1> for 100 ml of medium.
Cell cultures are incubated at 37 [deg.] C for
<EMI ID = 171.1>
<EMI ID = 172.1>
No virus development was observed on any of the treated cell cultures and this was verified by microscopic evaluation and / or plate counting.
EXAMPLE 3
A tissue culture derived from human fetus is incubated. primary in the culture medium of tjssu, then one replaces
the original medium with a fresh medium which contains 10% of one of the following compositions:
I / h - I / i
<EMI ID = 173.1>
<EMI ID = 174.1>
IV / h - IV / i
V / h - V / i
VII / h - VII / i
XI / f, XI / c, Xl / g
<EMI ID = 175.1>
<EMI ID = 176.1>
a single pill of one of the compositions XIII / h or XIII / i for
100 ml of medium.
Cell cultures are incubated at 37 ° C for
12 hours, then washed and opposed to VSV and incubated again at 37 [deg.] C for 72 hours. No virus development was observed in the treated cultures, either by microscopic examination and / or plaque counting.
EXAMPLE 4
The contents of a single ampoule of composition XIV / a, b or c are dissolved in 1 ml of sterile physiological saline solution.
<EMI ID = 177.1>
table '.' .
1 <EMI ID = 178.1>
<EMI ID = 179.1>
EXAMPLE 5
<EMI ID = 180.1>
Semliki Forcst virus (SFV), then 0.1 ml of a solution obtained by mixing the contents is administered intr �
<EMI ID = 181.1>
<EMI ID = 182.1>
after infection. Animal survival data are collected
<EMI ID = 183.1>
TABLE 3
<EMI ID = 184.1>
<EMI ID = 185.1>
<EMI ID = 186.1>
TABLE 5
<EMI ID = 187.1>
<EMI ID = 188.1>
<EMI ID = 189.1>
TABLE 7
<EMI ID = 190.1>
<EMI ID = 191.1>
<EMI ID = 192.1>
EXAMPLE 6
<EMI ID = 193.1>
HongKong 68/1 influenza virus adapted to mice.
In addition, intraperitoneally, just after infection, 0.1 ml of a solution containing the content of a single ampoule of composition XV / b in 1 ml of physiological solution is administered; this operation is repeated once a day for the two days following the treatment. The mean reciprocal survival time
<EMI ID = 194.1>
the groups treated.
EXAMPLE 7
The procedure is as described in Example 6, except that
<EMI ID = 195.1>
reciprocal survival time is 0.140 for controls and
<EMI ID = 196.1>
tion.
EXAMPLE 8
<EMI ID = 197.1>
<EMI ID = 198.1>
<EMI ID = 199.1>
1.- Process for the preparation of complexes exhibiting superior antiviral activity, characterized in that it is used
<EMI ID = 200.1>
in living cells, the production of antiviral agents which are natural and / or intrinsically possessing antiviral activity, with a synthetic polycationic polypeptide, fully constructed
-ment or in part using α-amino acid units of general formula:
<EMI ID = 201.1>
in which :
A represents a group:
<EMI ID = 202.1>
or
<EMI ID = 203.1>
<EMI ID = 204.1>
<EMI ID = 205.1>
alkyl groups of 1 to 4 carbon atoms, or
<EMI ID = 206.1>
<EMI ID = 207.1>
atom;
R3 is an alkyl group of 1 to 4 carbon atoms;
<EMI ID = 208.1>
carbon;
<EMI ID = 209.1>
<EMI ID = 210.1>
, n can be zero;
or with an acid addition salt or a quaternary ammonium derivative of such a synthetic polycationic polypeptide.
<EMI ID = 211.1>