BE1030204B1 - Méthodes et systèmes de coiffage de molécules d’acide nucléique - Google Patents

Méthodes et systèmes de coiffage de molécules d’acide nucléique Download PDF

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BE1030204B1 BE20225036A BE202205036A BE1030204B1 BE 1030204 B1 BE1030204 B1 BE 1030204B1 BE 20225036 A BE20225036 A BE 20225036A BE 202205036 A BE202205036 A BE 202205036A BE 1030204 B1 BE1030204 B1 BE 1030204B1
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Abstract

Sont décrits ici des systèmes de coiffage d’acide nucléique. Sont également décrites ici des méthodes de coiffage d’acide nucléique avec les systèmes décrits ici.

Description

1 BE2022/5036
MÉTHODES ET SYSTÈMES DE COI FFAGE DE MOLÉCULES D’ACIDE
NUCLÉI QUE
CONTEXTE
Le traitement d'acide nucléique in vitro est largement utilisé dans les domaines du biomédical ou des biosciences. L'une des méthodes de traitement ou de fabrication d'acides nucléiques in vitro implique le coiffage d’ARN messager (ARNm) pour la fabrication d'ARNm ou d’un peptide codé par l’'ARNm en quantités industrielles. Deux strategies principales sont actuellement utilisées pour la production d'ARNm coiffé en 5’ : le coiffage co-transcriptionnel, moyennant quoi un oligonucléotide synthétique intégrant la structure de coiffe est incorporé durant la transcription du brin d’ADN matrice ; et le coiffage post-transcriptionnel, moyennant quoi la biosynthèse de la structure de coiffe et les réactions associées sont catalysées enzymatiquement.
RÉSUMÉ
Le coiffage post-transcriptionnel efficace de l’'ARNm requiert un traitement antérieur de la récolte de la réaction obtenue après transcription in vitro (TIV). La méthode traditionnelle de prétraitement implique au moins une opération de purification entre l'étape de TIV et l’étape de coiffage enzymatique afin d'assurer une efficacité de coiffage suffisante. De telles étapes augmentent la durée et la complexité du procédé et diminuent le rendement global de molécules d’ARN coiffées. En conséquence, des systèmes et des méthodes pour un traitement simple, peu coûteux et rapide de récolte de réaction d’ARNm pour assurer un coiffage enzymatique efficace en aval sont intéressants.
Est décrite ici, dans certains aspects, une méthode de production d'au moins une molécule d'acide ribonucléique (ARN) coiffée, comprenant : la fourniture d’une — pluralité de molécules d’ARN non coiffées dans une première solution ; l’élimination d’une pluralité de molécules qui a un poids moléculaire d’au plus environ 1 000 kDa dans la première solution pour former une deuxième solution, de sorte qu’une efficacité de coiffage post-transcriptionnel d'au moins 75 % est atteinte ; la mise en contact de la deuxième solution avec une pluralité de molécules d’enzyme de coiffage ; et l’ajout d’une structure de coiffe à une extrémité 5’ d’une molécule d'ARN non coiffée pour former l’au moins une molécule d’ARN coiffée. Dans certains modes de réalisation, la pluralité de molécules a un poids moléculaire d’au plus environ
2 BE2022/5036
800 kDa.
Dans certains modes de réalisation, la pluralité de molécules a un poids moléculaire d’au plus environ 600 kDa.
Dans certains modes de réalisation, la pluralité de molécules a un poids moléculaire d’au plus environ 500 kDa.
Dans certains modes de réalisation, la pluralité de molécules a un poids moléculaire d'au plus environ 400 kDa.
Dans certains modes de réalisation, la pluralité de molécules a un poids moléculaire d’au plus environ 200 kDa.
Dans certains modes de réalisation, la pluralité de molécules a un poids moléculaire d'au plus environ
100 kDa.
Dans certains modes de réalisation, la pluralité de molécules a un poids moléculaire d’au plus environ 30 kDa.
Dans certains modes de réalisation, la pluralité de molécules a un poids moléculaire d’au plus environ 10 kDa.
Dans certains modes de réalisation, la pluralité de molécules a un poids moléculaire d’au plus environ
5 kDa.
Dans certains modes de réalisation, la pluralité de molécules a un poids moléculaire d'au plus environ 3 kDa.
Dans certains modes de réalisation l'élimination de la pluralité de molécules comprend la filtration de la première solution contre un filtre, dans laquelle le filtre comprend une taille de pore nominale mesurée en un seuil de coupure de poids moléculaire (PMCO) d'environ 800 kDa, 600 kDa, 500 kDa,
400 kDa, 200 kDa, 100 kDa, 50 kDa 30 kDa, 10 kDa, 5 kDa, 3 kDa ou 1 kDa.
Dans certains modes de réalisation, la filtration se fait par diafiltration continue ou discontinue.
Dans certains modes de réalisation, la filtration comprend une filtration à écoulement tangentiel.
Dans certains modes de réalisation, l'élimination de la pluralité de molécules comprend la réalisation d’une dialyse de la première solution dans un milieu adéquat.
Dans certains modes de réalisation, l'élimination de la pluralité de molécules ne comprend pas d'étape de purification additionnelle.
Dans certains modes de réalisation, l'étape de purification additionnelle est effectuée par une chromatographie.
Dans certains modes de réalisation, la pluralité de molécules d’ARN non coiffées est générée par l'intermédiaire d’une réaction de transcription in vitro (TIV). Dans certains modes de réalisation, la pluralité d'enzymes de coiffage est sélectionnée dans le groupe constitué d'ARNm (nucléoside-2’-O-)-méthyltransférase spécifique de coiffe, d’enzyme de coiffage de Vaccinia (VCE), d’enzyme de coiffage du virus de la maladie de la langue bleue, d’enzyme de coiffage du virus de la chlorelle, d’enzyme de coiffage de S. cerevisiae, d'enzyme de coiffage de mimivirus, d’enzyme de coiffage du virus de la peste porcine africaine, et d'enzyme de coiffage de réovirus aviaire.
Dans certains modes de réalisation, l’ajout de la structure de coiffe à l'extrémité 5’ de la molécule d’ARN non coiffée se produit à une efficacité d'au moins 70 %. Dans certains modes de réalisation, l’ajout de la structure de coiffe à l'extrémité 5’ de la molécule d’ARN non coiffée se produit à une efficacité d’au moins 75%. Dans certains modes de réalisation, l'ajout de la structure de coiffe à
3 BE2022/5036 l'extrémité 5’ de la molécule d’ARN non coiffée se produit à une efficacité d’au moins 77 %. Dans certains modes de réalisation, l'ajout de la structure de coiffe à l'extrémité 5’ de la molécule d’ARN non coiffée se produit à une efficacité d’au moins 80%. Dans certains modes de réalisation, l'ajout de la structure de coiffe à l'extrémité 5’ de la molécule d’ARN non coiffée se produit à une efficacité d’au moins 85%. Dans certains modes de réalisation, l'ajout de la structure de coiffe à l'extrémité 5’ de la molécule d’ARN non coiffée se produit à une efficacité d’au moins 90 %. Dans certains modes de réalisation, l'ajout de la structure de coiffe à l'extrémité 5’ de la molécule d’ARN non coiffée se produit à une efficacité d’au moins 95 %. Dans certains modes de réalisation, l'ajout de la structure de coiffe à l'extrémité 5’ de la molécule d’ARN non coiffée se produit à une efficacité d’au moins 97%. Dans certains modes de réalisation, l'ajout de la structure de coiffe à l'extrémité 5’ de la molécule d’ARN non coiffée se produit à une efficacité d’au moins 98 %. Dans certains modes de réalisation, l'ajout de la structure de coiffe à — l'extrémité 5’ de la molécule d’ARN non coiffée se produit à une efficacité d’au moins 99 %. Dans certains modes de réalisation, l'ajout de la structure de coiffe à l'extrémité 5’ de la molécule d’ARN non coiffée se produit à une efficacité de 100 %.
Dans certains modes de réalisation, une concentration de la pluralité de molécules est réduite d'au moins 50 %, 60 %, 70 %, ou 80 %, ou 85 %, ou 90 %, ou 95 %, ou 96%, ou 97%, ou 98 %, 99 %, ou près de 100 % dans la deuxième solution comparativement à une concentration de la pluralité de molécules dans la première solution. Dans certains modes de réalisation, une concentration de la pluralité de molécules est réduite d'au moins 99,9975 % dans la deuxième solution comparativement à une concentration de la pluralité de molécules dans la première solution. Dans certains modes de réalisation, la concentration de la pluralité de molécules dans la deuxième solution est inférieure ou égale à 50 %, ou 40 %, ou %, ou 20 %, ou 15 %, ou 10 %, ou 5 %, ou 4 %, ou 3 %, ou 2 %, ou 1 % de la concentration de la pluralité de molécules dans la première solution. Dans certains modes de réalisation, la méthode comprend en outre la synthèse d’un peptide ou 30 d'une protéine en utilisant lau moins une molécule d’ARN coiffée.
Est décrite ici, dans certains aspects, une composition pharmaceutique obtenue en utilisant une méthode décrite ici. Dans certains modes de réalisation, la composition pharmaceutique est un vaccin.
Est décrit(e) ici, dans certains aspects, un peptide ou une protéine obtenu(e) en utilisant une méthode décrite ici. Dans certains modes de réalisation, le peptide ou
4 BE2022/5036 la protéine est produit(e) in vivo. Dans certains modes de réalisation, le peptide ou la protéine est produit(e) in vitro. Dans certains modes de réalisation, le peptide ou la protéine est un peptide ou une protéine prophylactique ou thérapeutique.
Est décrite ici, dans certains aspects, une composition comprenant une pluralité de molécules d’ARN coiffées en 5’, dans laquelle lesdites molécules d’ARN sont obtenues au moyen d’une réaction de transcription in vitro et dans laquelle ledit coiffage s’est produit de manière post-transcriptionnelle, ladite composition comprend des réactifs pour une transcription in vitro, et dans laquelle la concentration d’ARN dans ladite composition est inférieure à 20 mg/ml.
Est décrite ici, dans certains aspects, une composition comprenant une pluralité de molécules d’ARN coiffées en 5’, lesdites molécules d’ARN sont obtenues au moyen d’une réaction de transcription in vitro et dans laquelle ledit coiffage s'est produit de manière post-transcriptionnelle, dans laquelle l'efficacité de la réaction de coiffage est d’au moins 75 % sans utiliser de chromatographie.
Est décrite ici, dans certains aspects, une composition comprenant une pluralité de molécules d’ARN coiffées en 5’ et non coiffées, lesdites molécules d’ARN sont obtenues au moyen d’une réaction de transcription in vitro et dans laquelle ledit coiffage s’est produit de manière post-transcriptionnelle, dans laquelle un rapport entre la pluralité de molécules d’ARN non coiffées et la pluralité de molécules d'ARN coiffées est entre 0,0001 à 0,3.
Est décrit ici, dans certains aspects, un système comprenant : au moins un récipient contenant la première solution ou la deuxième solution selon l’une quelconque des revendications précédentes ; et au moins un filtre pour séparer la pluralité de molécules selon l’une quelconque des revendications précédentes.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSI NS
La présente demande de brevet contient au moins un dessin exécuté en couleur. Des copies du présent brevet ou de la présente demande de brevet comportant un (des) dessin(s) en couleur seront fournies par Office sur demande et après règlement des frais nécessaires.
La Fig. 1 illustre un exemple non limitant d’un protocole expérimental comprenant un échange de tampon (par ex., diafiltration) pour éliminer la pluralité de molécules qui inhibe la réaction de coiffage de la première solution contenant les molécules d’ARN non coiffées.
La Fig. 2 illustre un autre exemple non limitant d’un protocole expérimental 5 comprenant une dialyse pour éliminer la pluralité de molécules qui inhibe la réaction de coiffage de la première solution contenant les molécules d’ARN non coiffées.
La Fig. 3 illustre un exemple non limitant d’un système décrit ici, où le système comprend au moins un récipient (301) comprenant une première solution (302) comprenant au moins un acide nucléique non coiffé. La première solution (302) peut être mise en contact avec une membrane filtrante (303). La mise en contact avec la membrane filtrante (303) élimine une pluralité de molécules capables de s’infiltrer dans la membrane qui inhibe la réaction de coiffage, permettant ainsi à la réaction de coiffage de se produire pour générer des molécules d’ARN coiffées (304). L'acide nucléique coiffé (304) peut être davantage purifié ou filtré pour augmenter la concentration (305) des molécules d’ARN coiffées (304) et pour éliminer davantage les substances indésirables contenues dans la solution.
Les nouveaux points caractéristiques de la divulgation sont exposés de manière — détaillée dans les revendications jointes. Une meilleure compréhension des points caractéristiques et avantages de la présente divulgation sera obtenue en référence à la description détaillée suivante qui expose les modes de réalisation illustratifs.
DESCRI PTI ON DÉTAILLÉE
Vue d'ensemble
Un coiffage post-transcriptionnel efficace de l'ARN messager produit par transcription in vitro (TIV) n'est possible qu’après un traitement intermédiaire du produit de la réaction de TIV. Ce traitement intermédiaire implique typiquement une opération de purification (telle qu’une chromatographie), habituellement en combinaison avec une étape de filtration à écoulement tangentiel. Cela donne à penser que le produit de la réaction de transcription in vitro contient des substances qui interfèrent avec les réactifs de coiffage. Le coiffage enzymatique immédiatement après la TIV, sans traitement intermédiaire du produit réactionnel, produit une petite quantité ou une quantité proche de 0% de molécules d’ARNm coiffées. Lorsque les réactifs de coiffage sont ajoutés à la TIV pour «transcription et coiffage concomitants » (réaction monotope), un coiffage marginal peut être atteint (moins de 10 %). Cela
6 BE2022/5036 confirme qu'un coiffage réussi requiert un certain traitement intermédiaire du produit de la TIV. Un traitement intermédiaire conventionnel, tel que mentionné ci-dessus, implique une ou plusieurs étapes de purification, ce qui s'accompagne de plusieurs désavantages : perte inévitable de produit (rendement diminué du procédé) ; complexité accrue du procédé requérant le développement d'étapes supplémentaires ; nécessité d'un équipement additionnel ; et coûts accrus en raison de la perte de produit et du coût des étapes opérationnelles supplémentaires. La nécessité d'un équipement additionnel conduit également à un coût opérationnel accru, à un encombrement accru du système, et à une durée étendue du procédé.
Sont décrits ici des systèmes et des méthodes d'élimination (par filtration ou dialyse) de la pluralité de molécules qui inhibe la réaction de coiffage sur la base de la taille, où la pluralité de molécules est plus petite et peut être filtrée à une taille de pore nominale inférieure à la taille moléculaire de l'ARN. Dans certains modes de — réalisation, les systèmes et méthodes comprennent une filtration directe à travers un filtre (par ex., une membrane filtrante) suivie d’une resolubilisation du rétentat dans un solvant adéquat (par ex. de l’eau) ; diafiltration contre un nombre adéquat de diavolumes d’un solvant adéquat ; ou dialyse de la récolte de la TIV dans un milieu adéquat pour éliminer les substances qui inhibent la réaction de coiffage consistant à ajouter des structures de coiffe à des molécules d'ARN non coiffées. Dans certains cas, les systèmes et méthodes peuvent comprendre une dilution des molécules d'ARN de TIV suivie d’une ultrafiltration pour éliminer une portion du solvant. Dans certains modes de réalisation, les systèmes et méthodes conduisent à une élimination incomplète des solutés, en fonction du facteur de dilution choisi. Par exemple : une dilution 50x suivie d’une reconcentration dans le volume de solvant d’origine élimine 98 % des solutés.
Dans certains modes de réalisation, les systèmes et méthodes décrits ici permettent à une réaction de coiffage de se produire sans qu'il soit nécessaire de tout d’abord isoler ou purifier l'ARN non coiffé en utilisant des méthodes conventionnelles, telles qu’une chromatographie. Dans certains modes de réalisation, les systèmes et méthodes décrits ici atteignent une efficacité de coiffage en 5’ de VARNm in vitro qui est sensiblement similaire à l’efficacité de coiffage atteinte en utilisant des méthodes conventionnelles de purification de molécules d’ARN non coiffées. Dans certains modes de réalisation, les systèmes et méthodes décrits ici comprennent la mise en contact d’une solution comprenant des molécules d’ARN non coiffées avec un filtre.
Dans certains cas, le matériau filtrant comprend une céramique. Dans certains cas,
7 BE2022/5036 le matériau filtrant comprend un ou plusieurs minéraux. Dans certains cas, le matériau filtrant comprend un ou plusieurs métaux. Dans certains cas, le matériau filtrant comprend un polymère. Le filtre comprend des pores ayant une taille de pore qui : permet à la pluralité de molécules qui inhibe la réaction de coiffage de traverser, mais retient les molécules d’ARN non coiffées. En effectuant un tel échange de milieu, la pluralité de molécules qui inhibent la réaction de coiffage consistant à ajouter des structures de coiffe à des molécules d’ARN non coiffées est éliminée de la solution comprenant les molécules d'ARN non coiffées jusqu'à ce que la concentration de la pluralité de molécules qui inhibent la réaction de coiffage soit réduite jusqu’à un niveau où elle n’inhibe plus la réaction de coiffage. Dans certains modes de réalisation, la solution après échange de tampon est mise en contact avec une pluralité d’enzymes de coiffage et autres réactifs pour former des molécules d’ARN coiffées. Dans certains modes de réalisation, les molécules d’ARN coiffées obtenues à partir des systèmes et méthodes décrits ici peuvent être utilisées à des fins telles que la fabrication de compositions pharmaceutiques ou de diagnostic.
Systèmes
Sont décrits ici des systèmes de traitement d'acides nucléiques avec les méthodes décrites ci-dessous, tels que le traitement de solutions contenant des molécules — d’ARN non coiffées dérivées de réactions de transcription in vitro (TIV) pour éviter l’inhibition de réactions de coiffage relatives à l’ajout d’une structure de coiffe à une molécule d’ARN non coiffée. Le système peut comprendre une portion en amont ayant pour but de fournir des mélanges réactionnels de TIV contenant les molécules d’ARN non coiffées. Dans certains cas, le système peut comprendre une portion en aval pour un traitement supplémentaire des molécules d'ARN coiffées, tel qu’une purification pour éliminer les substances indésirables et une filtration à écoulement tangentiel pour changer la composition et la concentration de la solution de molécules d’ARN coiffées. Dans certains modes de réalisation, le système peut en outre être configuré pour fabriquer des composés, des biomolécules ou des compositions — pharmaceutiques en utilisant l'ARN coiffé en tant qu’entrée. Par exemple, le système décrit ici peut synthétiser ou augmenter le rendement de synthèse d’un antigène codé par l’ARN coiffé ou l'ARNm coiffé, où l’antigène peut en outre être formulé dans un vaccin. Dans certains modes de réalisation, le système comprend des composants ou des dispositifs pour initier ou maintenir des réactions biologiques. Dans certains modes de réalisation, le système peut être configuré pour effectuer toute sorte de procédé approprié. Les exemples non limitants de procédés auxquels le système divulgué ici peut être adapté incluent la production d'un composé biologique ; la
8 BE2022/5036 production d’un composé pharmaceutique ou biopharmaceutique ; la synthèse d’ARN, incluant les procédés de TIV et post-transcriptionnels et la purification d’ARN ; la synthèse protéique, incluant la synthèse protéique à dépendance cellulaire et la synthèse protéique acellulaire (CFPS) ; ou une combinaison de ceux-ci.
Dans certains modes de réalisation, le système décrit ici est modulaire, où chaque composant du système peut être indépendamment assemblé ou désassemblé sur la base de la fonctionnalité nécessaire. Dans certains modes de réalisation, le système comprend un réacteur continu ou un réacteur discontinu. Dans certains cas, le système peut comprendre un réacteur continu. Le système peut être employé dans un mode continu. Dans d'autres cas, le système peut comprendre un réacteur discontinu. Le système peut être employé dans un mode non continu ou un mode de réaction discontinu. Dans d'autres cas, le système peut comprendre une combinaison d’un réacteur continu et d’un réacteur discontinu et le système peut être employé dans un mode semi-continu.
Dans certains cas, un système tel que divulgué ici peut comprendre plus d’un récipient. Les plus d’un récipient peuvent être en communication fluidique les uns avec les autres, un certain sous-ensemble des plus d’un récipient peut être en communication fluidique avec le même ou un autre sous-ensemble des plus d’un récipient, ou les plus d’un récipient peuvent ne pas être en communication fluidique.
Le système peut être programmable pour transporter le milieu d’un récipient à un autre après une certaine période de temps. Dans certains cas, la période de temps peut être déterminée par un temps d'incubation ou de réaction d’un réactif ou d’un — composant du milieu, la longueur du récipient, le volume du récipient, le débit du milieu à travers le récipient, ou une certaine combinaison de ceux-ci. Dans certains modes de réalisation, le système décrit ici comprend au moins un filtre décrit ici.
Dans certains modes de réalisation, le filtre (par ex., une membrane filtrante) peut être positionné entre deux réacteurs pour générer la deuxième solution à partir de la première solution.
Dans certains modes de réalisation, le système décrit ici comprend au moins un récipient. Un premier récipient contient une première solution comprenant les molécules d’ARN non coiffées. Dans certains modes de réalisation, la première solution peut être filtrée pour obtenir une deuxième solution. Les unités de filtration peuvent comprendre une unité de filtration frontale, une unité de filtration rotative, une unité de filtration à écoulement tangentiel (TFF), une unité de filtration à écoulement tangentiel alterné (ATF), ou toute autre unité de filtration adéquate
9 BE2022/5036 connue dans l’art. Dans certains modes de réalisation, l’unité de filtration est en communication fluidique avec le premier récipient. Dans certains modes de réalisation, l’unité de filtration n'est pas en communication fluidique avec le premier récipient. Après le procédé de filtration, dans certains cas, les systèmes peuvent en outre comprendre une unité de mélange. La deuxième solution filtrée peut passer à travers le dispositif de mélange. Dans certains modes de réalisation, la deuxième solution filtrée peut ne pas passer à travers le dispositif de mélange. Dans certains modes de réalisation, le dispositif de mélange est contenu à l’intérieur de l’unité de filtration.
Dans certains modes de réalisation, la deuxième solution filtrée peut être transférée dans un second récipient pour que la réaction le coiffage se produise. Dans certains cas, la réaction de coiffage consistant à ajouter une structure de coiffe à une molécule d’ARN non coiffée est réalisée dans le second récipient. Dans certains modes de réalisation, unité de filtration est en communication fluidique avec le second récipient. Dans certains modes de réalisation, l’unité de filtration n’est pas en communication fluidique avec le second récipient. Tout réactif nécessaire, tel que des enzymes de coiffage telles que décrites ici, des substrats d’enzyme de coiffage, des tampons et des sels, un donneur de méthyle, et autres réactifs, peut être ajouté au second récipient par l'intermédiaire d’une valve ou d’une ouverture. Dans certains modes de réalisation, la deuxième solution filtrée peut être renvoyée vers le premier récipient pour que la réaction le coiffage se produise. Dans certains cas, la réaction de coiffage consistant à ajouter une structure de coiffe à une molécule d’ARN non coiffée est réalisée dans le premier récipient. Tout réactif nécessaire, tel que des enzymes de coiffage telles que décrites ici, des substrats d’enzyme de coiffage, des tampons et des sels, un donneur de méthyle, et autres réactifs, peut être ajouté au premier récipient par l’intermédiaire d’une valve ou d’une ouverture.
Dans certains modes de réalisation, le système décrit ici comprend au moins un récipient. Un premier récipient contient une première solution comprenant les molécules d’ARN non coiffées. Dans certains modes de réalisation, la première solution peut subir un procédé de dialyse pour obtenir une deuxième solution. Dans certains modes de réalisation, le système comprend un dispositif de dialyse, qui comprend un filtre adéquat pour effectuer un procédé de dialyse. Dans certains modes de réalisation, le dispositif de dialyse est en communication fluidique avec le premier récipient. Dans certains modes de réalisation, le dispositif de dialyse n’est pas en communication fluidique avec le premier récipient. Après le procédé de
10 BE2022/5036 dialyse, dans certains cas, les systèmes peuvent en outre comprendre une unité de mélange. La deuxième solution traitée peut passer à travers le dispositif de mélange.
Dans certains modes de réalisation, la deuxième solution traitée peut ne pas passer à travers le dispositif de mélange. Dans certains modes de réalisation, le dispositif de mélange est contenu à l’intérieur de l’unité de dialyse.
Après dialyse ou dialyse plus mélange, la deuxième solution traitée est transférée dans un second récipient pour réaliser une réaction de coiffage. Dans certains cas, la réaction de coiffage consistant à ajouter une structure de coiffe à une molécule d’ARN non coiffée est réalisée dans le second récipient. Dans certains modes de réalisation, l'unité de dialyse est en communication fluidique avec le second récipient. Dans certains modes de réalisation, l'unité de dialyse n’est pas en communication fluidique avec le second récipient. Tout réactif nécessaire, tel que des enzymes de coiffage telles que décrites ici, des substrats d'enzyme de coiffage, des tampons et des sels, un donneur de méthyle, et autres réactifs, peut être ajouté au second récipient par l'intermédiaire d’une valve ou d’une ouverture. Dans certains modes de réalisation, la deuxième solution filtrée peut être renvoyée vers le premier récipient pour que la réaction le coiffage se produise. Dans certains cas, la réaction de coiffage consistant à ajouter une structure de coiffe à une molécule d’ARN non coiffée est réalisée dans le premier récipient. Tout réactif nécessaire, tel que des enzymes de coiffage telles que décrites ici, des substrats d’enzyme de coiffage, des tampons et des sels, un donneur de méthyle, et autres réactifs, peut être ajouté au premier récipient par l'intermédiaire d’une valve ou d’une ouverture.
La solution peut être transportée d’une partie du système à une autre (par ex., d’un segment à un autre) ou dans ou hors du système par l’ouverture ou la fermeture de valves. Les valves peuvent être amenées à s'ouvrir ou à se fermer à certains moments par le système. Le système peut en outre comprendre des pompes ou un autre moyen, qui sont en outre amenés par le système à transporter la solution. Dans certains modes de réalisation, le système comprend un composant ou un dispositif de purification pour capturer le composé ou la biomolécule synthétisé(e) ou présent(e) dans la solution (par ex., la molécule d’ARN coiffée ou le polypeptide codé à partir de la molécule d’ARN coiffée) pour éliminer les substances indésirables. Un exemple non limitant du composant ou du dispositif de purification inclut une — chromatographie ou une filtration.
Méthodes
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Sont décrites ici des méthodes de coiffage de molécules d’ARN synthétisées à partir d’une réaction de TIV. Dans certains modes de réalisation, la méthode utilise les systèmes décrits ici pour éliminer et séparer la pluralité de molécules qui inhibe la réaction de coiffage des molécules d'ARN non coiffées ou des molécules d'ARNm non coiffées. Dans certains modes de réalisation, la méthode comprend l’obtention d’une première solution comprenant les molécules d’ARN non coiffées. Dans certains modes de réalisation, tel qu'illustré sur la FIG. 1, la première solution est mise en contact avec au moins un filtre (par ex., une membrane filtrante) pour former une deuxième solution, où la pluralité de molécules qui inhibe la réaction de coiffage est passée à travers le pore du filtre et séparée des molécules d’ARN non coiffées ou des molécules d’ARNm non coiffées. Dans certains modes de réalisation, la filtration de la première solution par mise en contact avec le filtre diminue une concentration de la pluralité de molécules qui inhibe la réaction de coiffage dans la deuxième solution. Dans certains modes de réalisation, tel qu'illustré sur la FIG,2, la première solution subit une dialyse pour échange de tampon, où la pluralité de molécules peuvent passer à travers les pores du filtre de dialyse (par ex., membrane filtrante de dialyse). Dans certains modes de réalisation, le filtre de dialyse comprend le même matériau ou la même taille de pore que l’au moins une membrane filtrante décrite ici. Dans certains modes de réalisation, la pluralité de molécules dans la deuxième solution est éliminée ou diminuée d'au moins 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou tout pourcentage entre les pourcentages mentionnés ci-dessus par la filtration ou la dialyse du filtre. Dans certains modes de réalisation, la pluralité de molécules dans la deuxième solution est inférieure ou égale à 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ou Moins de la concentration de la — pluralité de molécules dans la première solution.
Dans certains modes de réalisation, le filtre élimine et sépare une pluralité de molécules qui inhibe ou interfère avec une réaction de coiffage consistant à ajouter des structures de coiffe à des molécules d’ARN non coiffées dans la première solution pour obtenir la deuxième solution, où le filtre sépare la pluralité de molécules comprenant un seuil de coupure de poids moléculaire (PMCO) d’au plus environ 1 kDa, 3 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 30 kDa, 50 kDa, 100 kDa, 150 kDa, 200 kDa, 250 kDa, 300 kDa, 350 kDa, 400 kDa, 450 kDa, 500 kDa, 550 kDa, 600 kDa, 650 kDa, 700 kDa, 750 kDa, 800 kDa, 850 kDa, 900 kDa, 950 kDa 1 000 kDa, ou tout poids — moléculaire entre les valeurs de poids moléculaire mentionnées ci-dessus.
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En ce qui concerne le procédé de filtration/diafiltration/ultrafiltration, dans certains modes de réalisation, une étape optionnelle de dilution du mélange réactionnel de
TIV, à savoir, la première solution contenant une pluralité de molécules d’ARN non coiffées est effectuée avant le procédé de filtration. Le diluant peut être de l’eau purifiée ou toute autre solution adéquate qui n’interfère pas avec de quelconques réactions en aval. Dans certains modes de réalisation, le mélange réactionnel de TIV est dilué par un facteur d’au moins 1, d’au moins 2, d’au moins 3, d'au moins 4, d'au moins 5, d’au moins 6, d'au moins 7, d'au moins 8, d’au moins 9, d'au moins 10, d'au moins 12, d'au moins 12, d'au moins 14, d'au moins 16, d'au moins 18, d’au moins 20, d'au moins 30, d'au moins 40, d'au moins 50, d'au moins 60, d'au moins 70, d'au moins 80, d’au moins 90, d'au moins 100, d'au moins 1 000, d’au moins 10 000, d'au moins 20 000, d'au moins 30 000, d'au moins 40 000 ou tout nombre numérique entre les facteurs de dilution mentionnés ci-dessus pour former une deuxième solution, où l'efficacité de coiffage dans la deuxième solution est augmentée comparativement à l'efficacité de coiffage de la solution non diluée. Dans certains modes de réalisation, la première dilution est diluée par un facteur d'environ 1 à environ 100. Dans certains modes de réalisation, la première dilution est diluée par un facteur d'environ 1 à environ 2, d'environ 1 à environ 5, d'environ 1 à environ 10, d’environ 1 à environ 20, d'environ 1 à environ 30, d'environ 1 à environ 40, d'environ 1 à environ 50, d'environ 1 à environ 60, d’environ 1 à environ 70, d'environ 1 à environ 80, d'environ 1 à environ 100, d'environ 2 à environ 5, d'environ 2 à environ 10, d'environ 2 à environ 20, d’environ 2 à environ 30, d'environ 2 à environ 40, d’environ 2 à environ 50, d'environ 2 à environ 60, d'environ 2 à environ 70, d'environ 2 à environ 80, d’environ 2 à environ 100, d'environ 5 à environ 10, d'environ 5 à environ 20, d'environ 5 à environ 30, d'environ 5 à environ 40, d'environ 5 à environ 50, d’environ 5 à environ 60, d’environ 5 à environ 70, d'environ 5 à environ 80, d'environ 5 à environ 100, d'environ 10 à environ 20, d’environ 10 à environ 30, d'environ 10 à environ 40, d’environ 10 à environ 50, d’environ 10 à environ 60, d'environ 10 à environ 70, d’environ 10 à environ 80, d’environ 10 à — environ 100, d’environ 20 à environ 30, d’environ 20 à environ 40, d'environ 20 à environ 50, d'environ 20 à environ 60, d’environ 20 à environ 70, d’environ 20 à environ 80, d’environ 20 à environ 100, d’environ 30 à environ 40, d’environ 30 à environ 50, d'environ 30 à environ 60, d’environ 30 à environ 70, d’environ 30 à environ 80, d'environ 30 à environ 100, d’environ 40 à environ 50, d’environ 40 à — environ 60, d’environ 40 à environ 70, d'environ 40 à environ 80, d'environ 40 à environ 100, d'environ 50 à environ 60, d’environ 50 à environ 70, d’environ 50 à environ 80, d’environ 50 à environ 100, d’environ 60 à environ 70, d’environ 60 à
13 BE2022/5036 environ 80, d'environ 60 à environ 100, d'environ 70 à environ 80, d’environ 70 à environ 100, ou d'environ 80 à environ 100. Dans certains modes de réalisation, la première dilution est diluée par un facteur d'environ 1, d'environ 2, d’environ 5, d'environ 10, d'environ 20, d'environ 30, d'environ 40, d'environ 50, d’environ 60, d'environ 70, d’environ 80, ou d'environ 100. Dans certains modes de réalisation, la première dilution est diluée par un facteur d’au moins environ 1, environ 2, environ 5, environ 10, environ 20, environ 30, environ 40, environ 50, environ 60, environ 70 ou environ 80. Dans certains modes de réalisation, la première dilution est diluée par un facteur d'au plus environ 2, environ 5, environ 10, environ 20, environ 30, environ 40, environ 50, environ 60, environ 70, environ 80, environ 100, ou tout nombre numérique entre les facteurs de dilution mentionnés ci-dessus.
En outre, tel que représenté sur la FIG. 2, après le procédé de filtration/diafiltration/ultrafiltration pour éliminer au moins une portion de la pluralité de molécules qui inhibe la réaction de coiffage consistant à ajouter des structures de coiffe à des molécules d’ARN non coiffées, une étape optionnelle de lavage de la pluralité de molécules d’ARN non coiffées retenue par le filtre. Dans certains modes de réalisation, de l’eau purifiée sans RNAase ou un autre agent de lavage adéquat peut être utilisé pour effectuer cette étape optionnelle. Dans certains modes de réalisation, cet étape optionnelle de lavage peut reconcentrer la pluralité de — molécules d’ARN non coiffées.
Dans certains modes de réalisation, l'élimination de la pluralité de molécules qui inhibe ou interfère avec une réaction de coiffage augmente l'efficacité de coiffage dans la deuxième solution ou permet à la réaction de coiffage d'atteindre une efficacité de coiffage sensiblement similaire comparativement à l’utilisation de méthodes de purification d’ADN conventionnelles. Dans certains modes de réalisation, la réaction de coiffage est initiée par mise en contact de la deuxième solution avec une pluralité d’enzymes de coiffage et autres réactifs pour former au moins une molécule d’ARN coiffée ou au moins une molécule d’ARNm coiffée. Dans certains modes de réalisation, la filtration ou la dialyse de la première solution augmente l'efficacité de coiffage de la deuxième solution à au moins 50 %, au moins 55 %, au moins 60 %, au moins 65 %, au moins 70 %, d'au moins 75 %, au moins 77 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 87 %, au moins 90 %, au moins 95 %, au moins 96 %, au moins 97 %, au moins 98 %, au moins 99 %, au moins 99,5 %, au moins 99,9 %, ou tout pourcentage entre les pourcentages mentionnés ci-dessus. Dans certains modes de réalisation, la filtration ou la dialyse de la première solution permet à la réaction de coiffage de se produire à une efficacité d’au moins
14 BE2022/5036 environ 85 %, 87 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 %, ou tout pourcentage entre les pourcentages mentionnés ci-dessus.
Dans certains modes de réalisation, l'efficacité de coiffage peut être déterminée en divisant la quantité de molécules d’ARN non coiffées par la quantité de molécules d’ARN coiffées pour obtenir un rapport d'ARN non coiffé/ARN coiffé. Par exemple, mais sans s’y limiter, une chromatographie liquide couplée à une mesure d’absorbance UV et à une spectrométrie de masse (CL-UV-SM) peut être utilisée pour évaluer les concentrations de molécules d’ARN coiffées ou non coiffées. Dans certains modes de réalisation, les concentrations des molécules d’ARN non coiffées et des molécules d’ARN coiffées sont calculées sur la base des mesures lues d’absorbance des molécules éluées telles qu’identifiées par spectrométrie de masse en ligne.
L'efficacité de coiffage est calculée sur la base des concentrations calculées. Dans certains modes de réalisation, l'efficacité de coiffage est calculée directement sur la base des mesures lues d’absorbance des molécules d’ARN coiffées et des molécules d’ARN non coiffées.
Dans certains modes de réalisation, la filtration ou la dialyse de la première solution pour obtenir une deuxième solution contenant une pluralité de molécules d’ARN non coiffées et un niveau réduit de molécules qui inhibe la réaction de coiffage permet au coiffage des molécules d’ARN non coiffées de commencer et de se poursuivre. Après la réaction de coiffage, le rapport d’ARN non coiffé/ARN coiffé est d’au plus 1,0, d'au plus 0,8, d'au plus 0,6, d’au plus 0,4, d'au plus 0,2, d'au plus 0,1, d'au plus 0,09, d’au plus 0,08, d’au plus 0,07, d'au plus 0,06, d'au plus 0,05, d'au plus 0,04, d'au plus 0,03, d'au plus 0,02, d'au plus 0,01, d'au plus 0,001 ou d’au plus 0,0001. Dans certains modes de réalisation, le rapport entre une pluralité de molécules d’ARN non coiffées et la pluralité de molécules d’ARN coiffées est entre environ 0,001 à environ 10. Dans certains modes de réalisation, le rapport entre une pluralité de molécules d’ARN non coiffées et la pluralité de molécules d'ARN coiffées est entre environ 0,001 ä environ 0,002, environ 0,001 à environ 0,005, environ 0,001 à environ 0,01, environ 0,001 à environ 0,02, environ 0,001 à environ 0,05, environ 0,001 à environ 0,1, environ 0,001 à environ 0,2, environ 0,001 à environ 0,5, environ 0,001 à environ 1, environ 0,001 à environ 5, environ 0,001 à environ 10, environ 0,002 à environ 0,005, environ 0,002 à environ 0,01, environ 0,002 à environ 0,02, environ 0,002 à environ 0,05, environ 0,002 à environ 0,1, environ 0,002 à environ 0,2, environ 0,002 à environ 0,5, environ 0,002 à environ 1, environ 0,002 à environ 5, environ 0,002 à environ 10, environ 0,005 à environ 0,01, environ 0,005 à environ
15 BE2022/5036 0,02, environ 0,005 à environ 0,05, environ 0,005 à environ 0,1, environ 0,005 à environ 0,2, environ 0,005 à environ 0,5, environ 0,005 à environ 1, environ 0,005 à environ 5, environ 0,005 à environ 10, environ 0,01 à environ 0,02, environ 0,01 à environ 0,05, environ 0,01 à environ 0,1, environ 0,01 à environ 0,2, environ 0,01 à environ 0,5, environ 0,01 à environ 1, environ 0,01 à environ 5, environ 0,01 à environ 10, environ 0,02 à environ 0,05, environ 0,02 à environ 0,1, environ 0,02 à environ 0,2, environ 0,02 à environ 0,5, environ 0,02 à environ 1, environ 0,02 à environ 5, environ 0,02 à environ 10, environ 0,05 à environ 0,1, environ 0,05 à environ 0,2, environ 0,05 à environ 0,5, environ 0,05 à environ 1, environ 0,05 à environ 5, environ 0,05 à environ 10, environ 0,1 à environ 0,2, environ 0,1 à environ 0,5, environ 0,1 à environ 1, environ 0,1 à environ 5, environ 0,1 à environ 10, environ 0,2 à environ 0,5, environ 0,2 à environ 1, environ 0,2 à environ 5, environ 0,2 à environ 10, environ 0,5 à environ 1, environ 0,5 à environ 5, environ 0,5 à environ 10, environ 1 à environ 5, environ 1 à environ 10, ou environ 5 à environ 10.
Dans certains modes de réalisation, le rapport entre une pluralité de molécules d’ARN non coiffées et la pluralité de molécules d’ARN coiffées est d'environ 0,001, d'environ 0,002, d'environ 0,005, d'environ 0,01, d'environ 0,02, d'environ 0,05, d'environ 0,1, d'environ 0,2, d'environ 0,5, d'environ 1, d'environ 5 ou d'environ 10. Dans certains modes de réalisation, le rapport entre une pluralité de molécules d'ARN non coiffées et la pluralité de molécules d’ARN coiffées est d'au moins environ 0,001, environ 0,002, environ 0,005, environ 0,01, environ 0,02, environ 0,05, environ 0,1, environ 0,2, environ 0,5, environ 1, ou environ 5. Dans certains modes de réalisation, le rapport entre une pluralité de molécules d'ARN non coiffées et la pluralité de molécules d’ARN coiffées est d'au plus environ 0,002, environ 0,005, environ 0,01, environ 0,02, environ 0,05, environ 0,1, environ 0,2, environ 0,5, environ 1, environ 5, ou environ 10.
Dans certains modes de réalisation, durant l’étape de filtration ou de dialyse de la première solution pour former la deuxième solution, aucune purification additionnelle des molécules d’ARN non coiffées n’est nécessaire. Par exemple, la réaction de coiffage peut se produire sans inhibition par la méthode décrite ici sans avoir besoin d'utiliser une chromatographie ou toute autre méthode de purification utilisée pour augmenter l’efficacité des réactions de coiffage d'ADN par les normes industrielles actuelles.
Pour le procédé de filtration/diafiltration/ultrafiltration, dans certains modes de réalisation, la première solution est soumise au procédé dans le même récipient que
16 BE2022/5036 la réaction de synthèse d’ARN par TIV. Dans certains modes de réalisation, la première solution est transférée dans un récipient différent pour réaliser le procédé de filtration après l’achèvement de la réaction de synthèse d’ARN par TIV. Dans certains modes de réalisation, des filtres (par ex., membranes filtrantes) ayant certaines tailles de pore telles que décrites ici sont utilisés pour séparer les molécules sur la base de leurs tailles. Les tailles de pore des filtres sont sélectionnées pour éliminer la pluralité des molécules qui inhibe la réaction de coiffage des molécules d’ARN non coiffées. Par ailleurs, les tailles de pore des filtres sont sélectionnées pour retenir les molécules d’ARN non coiffées. Dans certains cas, les filtres sont des filtres polymères (par ex., membranes polymères). Les matériaux des filtres (par ex, membranes) peuvent être tout matériau adéquat qui peut être utilisé dans le procédé de filtration. Dans certains modes de réalisation, une pression positive est appliquée sur la première solution contre le filtre durant le procédé de filtration pour éliminer la pluralité de molécules qui inhibe la réaction de coiffage des molécules d’ARN non coiffées. Dans certains modes de réalisation, au moins environ 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % ou près de 100 % de la pluralité des molécules qui inhibe la réaction de coiffage est éliminée. Dans certains modes de réalisation, un procédé de filtration à écoulement direct (DFF) utilisant au moins un dispositif de pompage ou centrifuge est utilisé pour collecter le rétentat, à savoir, la deuxième solution qui comprend une pluralité de molécules d’ARN non coiffées et comprend un niveau suffisamment réduit d’une pluralité de molécules qui inhibe la réaction de coiffage. Dans d'autres modes de réalisation, un procédé de filtration à écoulement tangentiel (TFF) est utilisé pour collecter le rétentat tel que décrit ici. Durant le procédé de TFF, la première solution est passée — parallèlement à une membrane filtrante plutôt que d’être poussée à travers le filtre perpendiculairement.
Dans certains modes de réalisation, un procédé de diafiltration est utilisé pour collecter le rétentat tel que décrit ci-dessus. Dans certains modes de réalisation, le procédé de diafiltration est un procédé de diafiltration continu. La solution de — diafiltration (eau ou tout autre tampon adéquat) est ajoutée à un récipient contenant la première solution au même débit que le filtrat (par ex., la solution contenant une pluralité de molécules qui inhibe la réaction de coiffage) est généré. De cette manière, le volume dans le récipient reste constant, mais les molécules plus petites (par ex., la pluralité de molécules qui inhibe la réaction de coiffage et autres sels ; ayant un poids moléculaire et une taille inférieurs aux molécules d’ARN non coiffées) qui peut s'infiltrer librement dans le filtre sont évacuées. Dans certains modes de réalisation, le procédé de diafiltration est une diafiltration discontinue. Dans certains cas, au
17 BE2022/5036 moins environ 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 %, ou près de 100 % en poids de la pluralité des molécules qui inhibe la réaction de coiffage est éliminée.
Pour le procédé de dialyse, dans certains modes de réalisation, un dispositif de dialyse est fourni pour contenir le mélange réactionnel de TIV, à savoir, la première solution.
Le dispositif de dialyse peut être fait d’un filtre capable de retenir les molécules d'ARN non coiffées à l’intérieur du dispositif de dialyse et de laisser la pluralité de molécules qui inhibe la réaction de coiffage migrer par diffusion hors du dispositif de dialyse.
Dans certains modes de réalisation, le filtre comprend un seuil de coupure de poids moléculaire d’au plus environ 1 kDa à environ 1 000 kDa. Dans certains modes de réalisation, le filtre comprend un seuil de coupure de poids moléculaire d'au plus environ 3 kDa à environ 200 kDa. Dans certains modes de réalisation, le filtre comprend un seuil de coupure de poids moléculaire d’au plus environ 5 kDa à environ 400 kDa. Dans certains modes de réalisation, le filtre comprend un PMCO d'au plus environ 10 kDa à environ 750 kDa. Dans certains modes de réalisation, le filtre comprend un PMCO d'au moins environ 3 kDa, 5 kDa, 10 kDa ou 30 kDa. Dans certains modes de réalisation, le filtre comprend un PMCO d'au plus environ 200 kDa, 400 kDa, 500 kDa, 600 kDa, 750 kDa ou 800 kDa.
L'étape de dialyse sert à éliminer au moins une portion de la pluralité de molécules qui inhibe la réaction de coiffage. Le procédé de dialyse peut comprendre le changement du tampon de dialyse et l’ajout d’un tampon de dialyse extemporané au mélange réactionnel de TIV. Ce cycle de changement et d'ajout peut être répété plusieurs fois jusqu'à ce que la pluralité de molécules qui inhibe la réaction de coiffage soit éliminée jusqu'à un niveau où elle n’inhibe plus la réaction de coiffage. Dans certains modes de réalisation, le procédé de dialyse ne requiert pas la répétition du cycle de changement et d'ajout puisque l’ajout d’un tampon de dialyse au mélange réactionnel de TIV une fois est suffisant pour éliminer la pluralité de molécules qui — inhibe la réaction de coiffage jusqu'au niveau où elle n’inhibe plus la réaction de coiffage.
Dans certains modes de réalisation, la première solution (à savoir, le mélange réactionnel issu du procédé de synthèse d’ARN par TIV) n’est pas diluée avant de passer au procédé de filtration pour éliminer au moins une portion de la pluralité des =— molécules qui inhibe la réaction de coiffage. Dans certains autres modes de réalisation, la première solution n’est pas diluée avant de passer à un procédé de dialyse pour réduire la concentration de la pluralité des molécules qui inhibe la
18 BE2022/5036 réaction de coiffage. Dans certains modes de réalisation, le dispositif de dialyse peut être de toute forme, telle qu’une forme tubulaire. Le dispositif de dialyse contenant la première solution est immergé dans un tampon de dialyse adéquat (par ex., de l’eau) pour permettre à la pluralité de molécules qui inhibe la réaction de coiffage de migrer par diffusion hors du tampon de dialyse. Le tampon de dialyse peut être agité par un dispositif d’agitation pour faciliter la diffusion de la pluralité de molécules qui inhibe la réaction de coiffage. Dans certains modes de réalisation, le tampon de dialyse peut être éliminé et remplacé par un tampon de dialyse extemporané lorsqu’un équilibre des concentrations de la pluralité des molécules entre le mélange réactionnel de TIV contenu dans le dispositif de dialyse et le tampon de dialyse est atteint. Le tampon de dialyse peut être remplacé plusieurs fois jusqu'à ce qu’une concentration de la pluralité des molécules qui inhibe la réaction de coiffage soit réduite à un niveau adéquat tel que l'efficacité de la réaction de coiffage est augmentée d’au moins 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95%, 99%, près de 100 % ou tout pourcentage entre les pourcentages mentionnés ci-dessus. Dans certains modes de réalisation, de l'électricité peut être utilisée pour faciliter le procédé de dialyse.
Dans certains modes de réalisation, la première solution peut être diluée dans le même récipient que celui où la TIV et la réaction de coiffage se produisent. Par exemple, une solution additionnelle peut être ajoutée à la première solution dans le même récipient pour former une seconde solution (diluée). Dans certains modes de réalisation, la première solution peut être diluée en mélangeant une portion de la première solution avec une solution additionnelle dans un second récipient pour former la seconde solution (diluée). Dans certains modes de réalisation, toute solution qui est inerte et n’interfère pas avec la réaction de coiffage des molécules d’ARN ou d’ARNm non coiffées peut être utilisée. Dans certains modes de réalisation, la solution de dilution est de l’eau. Dans certains modes de réalisation, la deuxième solution peut être davantage purifiée (par ex., par chromatographie) ou concentrée (par ex., par filtration ou ultrafiltration) avant la réaction de coiffage. Dans certains modes de réalisation, le volume de la deuxième solution peut être diminué avant la réaction de coiffage (par ex., par filtration ou ultrafiltration). Dans certains modes de réalisation, la dilution de la première solution pour former la deuxième solution ne crée pas de volume en excès et la réaction de coiffage peut être initiée directement dans la deuxième solution. Dans certains modes de réalisation, les molécules d’ARN coiffées ou les molécules d'ARNm coiffées peuvent alors être purifiées à partir de la deuxième solution et en outre formulées (par ex., dans une composition
19 BE2022/5036 pharmaceutique décrite ici). Dans certains modes de réalisation, une réaction additionnelle peut être réalisée dans le récipient après la réaction de coiffage, où les molécules d’ARN coiffées fonctionnent en tant que matrice pour synthétiser les composés ou les biomolécules décrits ici.
Dans certains modes de réalisation, la méthode comprend en outre la purification ou la filtration d’une solution après que la deuxième solution a subi une réaction de coiffage tel que montré sur les FIGS. 1 et 2. La solution contient une pluralité de molécules d’ARN coiffées. La pluralité de molécules d’ARN coiffées est purifiée ou filtrée pour éliminer les substances indésirables et préparée pour toute autre réaction adéquate en aval décrite ici pour produire des compositions pharmaceutiques. Dans certains modes de réalisation, la pluralité de molécules d’ARN coiffées n’est pas davantage purifiée ou filtrée.
Dans certains modes de réalisation, la méthode comprend tout d’abord la synthèse des molécules d’ARN non coiffées. Par exemple, les molécules d’ARN non coiffées peuvent être synthétisées à partir d’une transcription in vitro (TIV). Dans certains modes de réalisation, la réaction de TIV peut être réalisée dans l’un quelconque des récipients du système décrit ici. Dans certains modes de réalisation, la réaction de
TIV se produit dans un réacteur continu. Dans certains modes de réalisation, la réaction de TIV se produit dans un réacteur discontinu. Dans certains modes de réalisation, la réaction de TIV se produit dans un mode semi-continu/continu simulé, dans laquelle les systèmes décrits ici comprennent au moins un réacteur discontinu et au moins un réacteur continu. Dans certains modes de réalisation, la réaction de
TIV peut être terminée par inactivation d'ARN polymérase dans la solution. L’ARN polymérase peut être inactivée par chauffage, refroidissement, ajout d’un chélateur (par ex., 8-hydroxyquinoline, carboplatine, EDTA, EGTA, bromure d’hexadécylpyridinum ou tartrate de sodium), ou une combinaison de ceux-ci. Les exemples non limitants d’ARN polymérase qui peuvent être utilisés pour synthétiser les molécules d’ARN non coiffées par l'intermédiaire d’une TIV peuvent inclure une
T7 ARN polymérase, une T3 ARN polymérase, une SP6 ARN polymérase, une ARN polymérase I, une ARN polymérase II, une ARN polymérase III, une ARN polymérase
IV, une ARN polymérase V et une ARN polymérase à une seule sous-unité. Dans certains modes de réalisation, la polymérases est une T3 ARN polymérase, une T7
ARN polymérase ou une SP6 ARN polymérase.
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Dans certains modes de réalisation, la méthode comprend la mise en contact de la deuxième solution (avec la pluralité de molécules qui inhibe la réaction de coiffage éliminée par la membrane filtrante), avec au moins un enzyme de coiffage et autres réactifs (par ex., substrats d'’enzyme, agents de tamponnement, sels de magnésium) pour initier la réaction de coiffage dans la deuxième solution. Les exemples non limitants d’enzyme de coiffage incluent VARNm (nucléoside-2'-O-)-méthyltransférase spécifique de coiffe, l’enzyme de coiffage de Vaccinia (VCE), l’enzyme de coiffage du virus de la maladie de la langue bleue, l’enzyme de coiffage du virus de la chlorelle,
Venzyme de coiffage de S. cerevisiae, l'enzyme de coiffage de mimivirus, l’'enzyme de coiffage du virus de la peste porcine africaine, ou l’enzyme de coiffage de réovirus aviaire. Les exemples non limitants d’autres réactifs peuvent inclure l'ARNm (nucléoside-2'-O-)-méthyltransférase spécifique de coiffe, la 2”-O-méthyltransférase, un sel de magnésium, le guanosine-5'-triphosphate, la S-adénosylméthionine, les agents de tamponnement, un inhibiteur de RNase. Les exemples non limitants de structure de coiffage incluent GpppN, m7GpppN (Cap 0), m7Gpppm6A, m7Gpppm1A, m7GpppNm (Cap 1), m2,7GpppNm, m2,2,7GpppNm, m7Gpppm6Am, m7GpppmlAm, m7GpppNmpNm (Cap 2), m7GpppNmpNmpNm (Cap 3), m7GpppNmpNmpNmpNm (Cap 4), où N représente tout nucléotide, A l’adénosine, G la guanosine, m un groupe méthyle et p un groupe phosphate. Dans certains modes de réalisation, la structure de coiffage comprend un nucléotide modifié chimiquement. Dans certains modes de réalisation, la réaction de coiffage décrite ici donne une majorité d’une espèce de structure coiffée (par ex., Cap 1). Dans certains modes de réalisation, la réaction de coiffage décrite ici donne d’autres structures de coiffe mineures telles que Cap 0, Cap 2, ou autre.
Dans certains modes de réalisation, la première solution comprend des molécules d’ARN non coiffées. Dans certains modes de réalisation, les molécules d’ARN non coiffées peuvent inclure un ARN à chaîne longue, un ARN codant, un ARN non codant, un ARN long non codant, un ARN à simple brin (ARNsb), un ARN à double brin (ARNdb), un ARN linéaire (ARNIin), un ARN circulaire (ARNcirc), un ARN messager (ARNm), un ARNm auto-amplificateur (SAM), un ARNm trans-amplificateur, des oligonucléotides d’ARN, des oligonucléotides antisens, des petits ARN interférents (petits ARNi), un petit ARN en épingle à cheveux (ARNsh), un ARN antisens (ARNas), des ARN guides CRISPR/Cas9, des riborégulateurs, un ARN immunostimulateur (ARNis), des ribozymes, des aptamères, un ARN ribosomique (ARNr), un ARN de transfert (ARNt), un ARN viral (ARNv), un ARN rétroviral ou un ARN réplicon, un petit
ARN nucléaire (petit ARNn), un petit ARN nucléolaire (petit ARNno), un microARN
21 BE2022/5036 (MIARN), des ARN associés au site de départ de la transcription (TSSa), des ARN antisens en amont (ua) et des produits de transcription en amont du promoteur (PROMPT). Dans certains modes de réalisation, les molécules d’ARN non coiffées comprennent au moins une modification chimique comprenant une modification du squelette, une modification de sucre, ou une modification de base. Dans ce contexte, une molécule d’ARN modifiée comprend des modifications de nucléotide, par ex. des modifications de squelette, des modifications de sucre ou des modifications de base.
Une modification de sucre en lien avec la présente divulgation est une modification chimique du sucre des nucléotides de la molécule d’ARN. En outre, une modification de base en lien avec la présente divulgation est une modification chimique du groupement de base des nucléotides de la molécule d'ARN. Dans ce contexte, les modifications de nucléotide sont sélectionnées parmi les modifications de nucléotide qui sont applicables à une transcription et/ou à une traduction. Dans des modes de réalisation supplémentaires, ARN modifié comprend des modifications de nucléoside — sélectionnées parmi la 6-aza-cytidine, la 2-thio-cytidine, l’a-thio-cytidine, la pseudo- iso-cytidine, la 5-aminoallyl-uridine, la 5-iodo-uridine, la N1-méthyl-pseudouridine, la 5,6-dihydrouridine, l’a-thio-uridine, la 4-thio-uridine, la 6-aza-uridine, la 5- hydroxy-uridine, la désoxy-thymidine, la 5-méthyl-uridine, la pyrrolo-cytidine,
Vinosine, l’a-thio-guanosine, la 6-méthyl-guanosine, la 5-méthyl-cytidine, la 8-oxo- guanosine, la 7-déaza-guanosine, la N1-méthyl-adénosine, la 2-amino-6-chloro- purine, la N6-méthyl-2-amino-purine, la pseudo-iso-cytidine, la 6-chloro-purine, la
N6-méthyl-adénosine, l’a-thio-adénosine, la 8-azido-adénosine, la 7-déaza- adénosine.
Production de biomolécules
Dans certains cas de la présente divulgation, les systèmes et méthodes décrits ici sont conçus pour accueillir un(e) réaction/procédé ou une partie d’un(e) réaction/procédé ayant lieu dans le système. Dans certains cas, la réaction porte sur le traitement d’une pluralité de molécules d’ARN non coiffées de sorte qu’une réaction de coiffage consistant à ajouter une structure de coiffe à une molécule d’ARN non coiffée peut se dérouler sans inhibition. Dans certains cas, la réaction porte sur une transcription in vitro (TIV) d’ARN à partir d’une matrice d'ADN avec des réactions post-transcriptionnelles s'ensuivant, telles qu’un coiffage enzymatique et/ou un ajout de queue poly(A). Dans certains cas, la réaction est afférente à la traduction in vitro (acellulaire) d’ARN en protéine. Dans certains cas, la réaction est afférente à une combinaison des deux procédés, à savoir, d'ADN en ARN par le biais d’une transcription et d’ARN en une protéine par le biais d’une traduction.
22 BE2022/5036
Dans certains cas, la transcription in vitro porte sur un procédé dans lequel de l'ARN est synthétisé dans un système acellulaire (in vitro). Dans certains cas, des vecteurs de clonage d'ADN, en particulier des vecteurs d'ADN plasmidique, sont appliqués en tant que matrice pour la génération de produits de transcription d’ARN suivant la linéarisation de la molécule d'ADN plasmidique circulaire. Ces vecteurs de clonage sont généralement conçus sous la forme d’un vecteur de transcription. L'ARN peut être obtenu par transcription in vitro dépendante de l'ADN d'une matrice d’ADN appropriée. Un promoteur pour contrôler la transcription d’ARN in vitro peut être tout promoteur pour toute ARN polymérase dépendante de l'ADN. Dans certains modes de réalisation, une ARN polymérase virale se lie à un promoteur viral et est au moins un promoteur sélectionné dans la liste constituée de T7, T3, T7lac, SP6, pL, pR, CMV,
SV40 et CaMV35S. En variante ou en combinaison, le fragment d'acide nucléique comprenant la séquence de promoteur comprend un promoteur bactérien. Dans certains cas, une ARN polymérase bactérienne se lie à un promoteur bactérien et est au moins un promoteur sélectionné dans la liste constituée d’araBAD, trp, lac et Ptac.
Dans certains cas, le fragment d'acide nucléique comprenant la séquence de promoteur comprend un promoteur eucaryote. Dans certains cas, l'ARN polymérase eucaryote se lie à un promoteur eucaryote et est au moins un promoteur sélectionné dans la liste constituée d'EFla, PGK1, Ubc, bêta actine, CAG, TRE, UAS, Ac5,
Polyhédrine, CaMKIIa, ALB, GAL1, GAL10, TEF1, GDS, ADH1, Ubi, H1 et U6. Dans certains cas, le promoteur eucaryote est au moins un promoteur sélectionné dans la liste constituée d’un promoteur d’ARN pol I, d’un promoteur d’ARN pol II et d’un promoteur d’ARN pol III.
Dans certains cas, les ARN polymérases dépendantes de l'ADN comprennent au moins l’une d’une T7 ARN polymérase, d’une T3 ARN polymérase, d’une SP6 ARN polymérase, d’une ARN polymérase I, d’une ARN polymérase II, d'une ARN polymérase III, d'une ARN polymérase IV, d'une ARN polymérase V et d’une ARN — polymérase à une seule sous-unité. La matrice d’ADN pour transcription d’ARN in vitro peut être obtenue par clonage d’un acide nucléique, en particulier d'un ADNc correspondant à ARN respectif devant être transcrit in vitro, et introduction de celui- ci dans un vecteur approprié pour la transcription d’ARN in vitro, par exemple dans un ADN plasmidique circulaire qui est introduit dans un hôte tel qu’une bactérie.
L’ADNc peut être obtenu par transcription inverse d'ARNm, synthèse chimique ou par amplification (par exemple, réaction en chaîne par polymérase). De plus, la matrice
23 BE2022/5036 d’ADN pour synthèse d’ARN in vitro peut également être obtenue par synthèse de gènes.
Dans certains cas, la matrice d’ADN porte sur une molécule d'ADN comprenant une sequence d'acide nucléique codant pour la séquence d’ARN. L'ADN matrice est utilisé en tant que matrice pour la transcription d’ARN in vitro afin de produire ARN codé par l'ADN matrice. Par conséquent, l'ADN matrice comprend tous les éléments nécessaires à la transcription d’ARN in vitro, en particulier un élément de promoteur pour la liaison d’une ARN polymérase dépendante de l'ADN comme par ex. les ARN polymérases T3, T7 et SP6 en 5’ de la séquence d'ADN codant pour la séquence d’ARN cible. La queue poly(A) peut être soit codée dans la matrice d’ADN soit ajoutée enzymatiquement à ARN dans une étape séparée après transcription in vitro. Dans certains cas, l'ADN matrice comprend des sites de liaison d'amorce en 5’ et/ou 3’ de la séquence d’ADN codant pour la séquence d’ARN cible pour déterminer l'identité de la séquence d’ADN codant pour la séquence d'ARN cible par ex. par PCR ou séquençage d'ADN. Dans certains cas, la matrice d’ADN comprend une UTR en 5’ ou une UTR en 3’. Dans certains cas, la matrice d'ADN comprend un vecteur d’ADN, tel qu’un ADN plasmidique, qui comprend une séquence d'acide nucléique codant pour la séquence d’ARN. Dans certains cas, la matrice d'ADN comprend une molécule — d'ADN linéaire ou circulaire.
Dans certains cas de la présente divulgation, une matrice d'ADN code pour une espèce moléculaire d’ARN différente. Dans certains cas la matrice d’ADN contient un promoteur sub-génomique et un grand cadre ouvert de lecture codant pour des protéines non structurelles qui, suivant l’administration du composé biopharmaceutique dans le cytosol, sont transcrites dans quatre composants fonctionnels (nsP1, nsP2, nsP3 et nsp4) par ARN polymérase dépendante de ARN codée (RDRP). La RDRP produit alors une copie en sens négatif du génome qui sert de matrice pour deux molécules d’ARN à brin positif : l'ARNm génomique et un ARNm — sub-génomique plus court. Cet ARNm sub-génomique est transcrit à des niveaux très élevés, permettant l’amplification d'un ARNm codant pour l’antigène de choix. Une espèce moléculaire d’ARN différente peut coder pour un antigène de différents sérotypes ou souches d’un pathogène, un allergène différent, un antigène auto- immun différent, un antigène différent d’un pathogène, des protéines adjuvantes différentes, une isoforme ou un variant différent(e) d’un antigène de cancer ou de tumeur, un antigène de tumeur différent d’un patient, un anticorps parmi un groupe d'anticorps qui ciblent différents épitopes d’une protéine ou d’un groupe de protéines,
24 BE2022/5036 différentes protéines d’une voie métabolique, une seule protéine parmi un groupe de protéines qui font défaut chez un sujet, ou une isoforme différente d’une protéine pour une thérapie moléculaire.
Dans certains modes de réalisation, les molécules d’ARN coiffées par la méthode décrite ici comprennent une région non codante d'un peptide ou d’une protéine. Dans certains modes de réalisation, les molécules d’ARN coiffées par la méthode décrite ici comprennent une région codante d’un peptide ou d’une protéine. Dans un tel cas, les molécules d'ARN coiffées servent de matrice pour la synthèse de peptides ou de protéines. Par exemple, les molécules d’ARN coiffées peuvent en outre être formulées dans une composition ou une composition pharmaceutique pour être administrées à un sujet, où la synthèse du peptide ou de la protéine se produit dans vivo. Dans certains modes de réalisation, le peptide ou la protéine peuvent être synthétisés directement à partir des molécules d’ARN coiffées dans un récipient du système soit — identique soit différent. Le peptide ou la protéine synthétisé(e) in vitro peut alors être formulé(e) dans une composition ou une composition pharmaceutique. Dans certains modes de réalisation, le peptide ou la protéine codé(e) par les molécules d’ARN coiffées peut être prophylactique. Dans certains modes de réalisation, le peptide ou la protéine codé(e) par les molécules d’ARN coiffées peut être thérapeutique. Dans certains modes de réalisation, le peptide ou la protéine codé(e) par les molécules d’ARN coiffées comprend un poids moléculaire (PM) d'environ 1 kDa à environ 1 000 kDa. Dans certains modes de réalisation, le peptide ou la protéine codé(e) par les molécules d’ARN coiffées comprend un poids moléculaire (PM) d’environ 10 kDa à environ 20 kDa, d'environ 10 kDa à environ 50 kDa, d’environ 10 kDa à environ 100 kDa, d'environ 10 kDa à environ 200 kDa, d'environ 10 kDa à environ 300 kDa, d'environ 10 kDa à environ 400 kDa, d'environ 10 kDa à environ 500 kDa, d'environ 10 kDa à environ 600 kDa, d'environ 10 kDa à environ 700 kDa, d’environ 10 kDa à environ 800 kDa, d’environ 10 kDa à environ 1 000 kDa, d’environ 20 kDa à environ 50 kDa, d’environ 20 kDa à environ 100 kDa, d'environ 20 kDa à environ 200 kDa, — d'environ 20 kDa à environ 300 kDa, d'environ 20 kDa à environ 400 kDa, d’environ 20 kDa à environ 500 kDa, d'environ 20 kDa à environ 600 kDa, d’environ 20 kDa à environ 700 kDa, d'environ 20 kDa à environ 800 kDa, d’environ 20 kDa à environ 1 000 kDa, d’environ 50 kDBa à environ 100 kDa, d’environ 50 kDa à environ 200 kDa, d’environ 50 kDa à environ 300 kDa, d'environ 50 kDa à environ 400 kDa, d'environ 50 kDa à environ 500 kDa, d’environ 50 kDa à environ 600 kDa, d'environ kDa à environ 700 kDa, d'environ 50 kDa à environ 800 kDa, d’environ 50 kDa à environ 1 000 kDa, d’environ 100 kDa à environ 200 kDa, d'environ 100 kDa à
25 BE2022/5036 environ 300 kDa, d'environ 100 kDa à environ 400 kDa, d’environ 100 kDa à environ 500 kDa, d'environ 100 kDa à environ 600 kDa, d’environ 100 kDa à environ 700 kDa, d’environ 100 kDa à environ 800 kDa, d’environ 100 kDa à environ 1 000 kDa, d'environ 200 kDa à environ 300 kDa, d'environ 200 kDa à environ 400 kDa, d’environ 200 kDa à environ 500 kDa, d’environ 200 kDa à environ 600 kDa, d’environ 200 kDa à environ 700 kDa, d’environ 200 kDa à environ 800 kDa, d’environ 200 kDa à environ 1 000 kDa, d'environ 300 kDa à environ 400 kDa, d’environ 300 kDa à environ 500 kDa, d'environ 300 kDa à environ 600 kDa, d’environ 300 kDa à environ 700 kDa, d’environ 300 kDa à environ 800 kDa, d’environ 300 kDa à environ 1 000 kDa, d'environ 400 kDa à environ 500 kDa, d'environ 400 kDa à environ 600 kDa, d’environ 400 kDBa à environ 700 kDa, d’environ 400 kDa à environ 800 kDa, d’environ 400 kDa à environ 1 000 kDa, d'environ 500 kDa à environ 600 kDa, d'environ 500 kDa à environ 700 kDa, d’environ 500 kDa à environ 800 kDa, d’environ 500 kDa à environ 1 000 kDa, d'environ 600 kDa à environ 700 kDa, d'environ 600 kDa à environ 800 kDa, d’environ 600 kDa à environ 1 000 kDa, d'environ 700 kDa à environ 800 kDa, d'environ 700 kDa à environ 1 000 kDa, ou d’environ 800 kDa à environ 1 000 kDa. Dans certains modes de réalisation, le peptide ou la protéine codé(e) par les molécules d’ARN coiffées comprend un poids moléculaire (PM) d'environ 10 kDa, d'environ 20 kDa, d'environ 50 kDa, d’environ 100 kDa, d’environ 200 kDa, d'environ 300 kDa, d'environ 400 kDa, d'environ 500 kDa, d'environ 600 kDa, d'environ 700 kDa, d'environ 800 kDa ou d'environ 1 000 kDa. Dans certains modes de réalisation, le peptide ou la protéine codé(e) par les molécules d’ARN coiffées comprend un poids moléculaire (PM) d'au moins environ 10 kDa, environ 20 kDa, environ 50 kDa, environ 100 kDa, environ 200 kDa, environ 300 kDa, environ 400 kDa, environ 500 kDa, environ 600 kDa, environ 700 kDa ou environ 800 kDa.
Dans certains modes de réalisation, le peptide ou la protéine codé(e) par les molécules d’ARN coiffées comprend un poids moléculaire (PM) d’au plus environ 20 kDa, environ 50 kDa, environ 100 kDa, environ 200 kDa, environ 300 kDa, — environ 400 kDa, environ 500 kDa, environ 600 kDa, environ 700 kDa, environ 800 kDa ou environ 1 000 kDa.
Dans certains modes de réalisation, le peptide ou la protéine codé(e) par les molécules d’ARN coiffées comprend un poids moléculaire (PM) d’au plus environ 10 kDa à environ 1 000 kDa. Dans certains modes de réalisation, le peptide ou la protéine codé(e) par les molécules d’ARN coiffées comprend un poids moléculaire (PM) d'au plus environ 10 kDa à environ 20 kDa, environ 10 kDa à environ 50 kDa,
26 BE2022/5036 environ 10 kDa à environ 100 kDa, environ 10 kDa à environ 200 kDa, environ
10 kDa à environ 300 kDa, environ 10 kDa à environ 400 kDa, environ 10 kDa à environ 500 kDa, environ 10 kDa à environ 600 kDa, environ 10 kDa à environ
700 kDa, environ 10 kDa à environ 800 kDa, environ 10 kDa à environ 1 000 kDa,
— environ 20 kDa à environ 50 kDa, environ 20 kDa à environ 100 kDa, environ 20 kDa à environ 200 kDa, environ 20 kDa à environ 300 kDa, environ 20 kDa à environ
400 kDa, environ 20 kDa à environ 500 kDa, environ 20 kDa à environ 600 kDa, environ 20 kDa à environ 700 kDa, environ 20 kDa à environ 800 kDa, environ
20 kDa à environ 1 000 kDa, environ 50 kDa à environ 100 kDa, environ 50 kDa à environ 200 kDa, environ 50 kDa à environ 300 kDa, environ 50 kDa à environ 400 kDa, environ 50 kDa à environ 500 kDa, environ 50 kDa à environ 600 kDa, environ 50 kDa à environ 700 kDa, environ 50 kDa à environ 800 kDa, environ
50 kDa à environ 1 000 kDa, environ 100 kDa à environ 200 kDa, environ 100 kDa à environ 300 kDa, environ 100 kDa à environ 400 kDa, environ 100 kDa à environ
500 kDa, environ 100 kDa à environ 600 kDa, environ 100 kDa à environ 700 kDa, environ 100 kDa à environ 800 kDa, environ 100 kDa à environ 1 000 kDa, environ
200 kDa à environ 300 kDa, environ 200 kDa à environ 400 kDa, environ 200 kDa à environ 500 kDa, environ 200 kDa à environ 600 kDa, environ 200 kDa à environ
700 kDa, environ 200 kDa à environ 800 kDa, environ 200 kDa à environ 1 000 kDa,
environ 300 kDa à environ 400 kDa, environ 300 kDa à environ 500 kDa, environ 300 kDa à environ 600 kDa, environ 300 kDa à environ 700 kDa, environ 300 kDa à environ 800 kDa, environ 300 kDa à environ 1 000 kDa, environ 400 kDa à environ
500 kDa, environ 400 kDa à environ 600 kDa, environ 400 kDa à environ 700 kDa, environ 400 kDa à environ 800 kDa, environ 400 kDa à environ 1 000 kDa, environ
500 kDa à environ 600 kDa, environ 500 kDa à environ 700 kDa, environ 500 kDa à environ 800 kDa, environ 500 kDa à environ 1 000 kDa, environ 600 kDa à environ
700 kDa, environ 600 kDa à environ 800 kDa, environ 600 kDa à environ 1 000 kDa, environ 700 kDa à environ 800 kDa, environ 700 kDa à environ 1 000 kDa, ou environ 800 kDa à environ 1 000 kDa.
Dans certains modes de réalisation, le peptide ou la protéine codé(e) par les molécules d'ARN coiffées comprend un poids moléculaire (PM) d'au plus environ 10 kDa, environ 20 kDa, environ 50 kDa, environ
100 kDa, environ 200 kDa, environ 300 kDa, environ 400 kDa, environ 500 kDa, environ 600 kDa, environ 700 kDa, environ 800 kDa ou environ 1 000 kDa.
Dans certains modes de réalisation, le peptide ou la protéine codé(e) par les molécules d'ARN coiffées comprend un poids moléculaire (PM) d'au plus au moins environ 10 kDa, environ 20 kDa, environ 50 kDa, environ 100 kDa, environ 200 kDa, environ
300 kDa, environ 400 kDa, environ 500 kDa, environ 600 kDa, environ 700 kDa ou
27 BE2022/5036 environ 800 kDa. Dans certains modes de réalisation, le peptide ou la protéine codé(e) par les molécules d’ARN coiffées comprend un poids moléculaire (PM) d'au plus au plus environ 20 kDa, environ 50 kDa, environ 100 kDa, environ 200 kDa, environ 300 kDa, environ 400 kDa, environ 500 kDa, environ 600 kDa, environ 700 kDa, environ 800 kDa ou environ 1 000 kDa.
Compositions
Est décrite ici une composition comprenant un agent ou une composition décrit(e) ici (par ex., les molécules d’ARN non coiffées après traitement telles que décrites ici).
Dans certains modes de réalisation, la composition comprend des substances ayant un PM de 400 kDa ou moins à une concentration de moins de 15 % v/v. Dans certains modes de réalisation, Ies substances comprennent un PM d'environ 20 kDa, d'environ 50 kDa, d'environ 100 kDa, d'environ 200 kDa, d'environ 300 kDa, d'environ 400 kDa, d'environ 500 kDa, d'environ 600 kDa, d'environ 700 kDa, d'environ 800 kDa ou d'environ 1 000 kDa. Dans certains modes de réalisation, les substances comprennent une concentration de moins de 30 % v/v, de moins de 25 % v/v, de moins de 20 % v/v, de moins de 19 % v/v, de moins de 18 % v/v, de moins de 17 % v/v, de moins de 16 % v/v, de moins de 15 % v/v, de moins de 14 % v/v, de moins de 13 % v/v, de moins de 12 % v/v, de moins de 11 % v/v, de moins de 10 % v/v, de moins de 9 % v/v, de moins de 8 % v/v, de moins de 7 % v/v, de moins de 6 % v/v, de moins de 5 % v/v, de moins de 4 % v/v, de moins de 3 % v/v, de moins de 2 % v/v ou de moins de 1 % v/v.
Dans certains modes de réalisation, la composition comprend une pluralité de — molécules d’ARN non coiffées en 5’, dans laquelle lesdites molécules d’ARN non coiffées sont obtenues au moyen d’une réaction de transcription in vitro, ladite composition comprend des réactifs pour une transcription in vitro, et dans laquelle la concentration d’ARN non coiffé dans ladite composition est inférieure à 20 mg/ml.
Dans certains modes de réalisation, la concentration de l’ARN non coiffé dans ladite composition comprend une plage entre environ 0,01 mg/ml à environ 20 mg/ml.
Dans certains modes de réalisation, la concentration de l’ARN non coiffé dans ladite composition comprend une plage entre environ 0,01 mg/ml à environ 0,02 mg/ml, environ 0,01 mg/ml à environ 0,05 mg/ml, environ 0,01 mg/ml à environ 0,1 mg/ml, environ 0,01 mg/ml à environ 0,2 mg/ml, environ 0,01 mg/ml à environ 0,5 mg/ml, environ 0,01 mg/ml à environ 1 mg/ml, environ 0,01 mg/ml à environ 2 mg/ml, environ 0,01 mg/ml à environ 5 mg/ml, environ 0,01 mg/ml à environ 10 mg/ml, environ 0,01 mg/ml à environ 20 mg/ml, environ 0,02 mg/ml à environ 0,05 mg/ml,
28 BE2022/5036 environ 0,02 mg/ml à environ 0,1 mg/ml, environ 0,02 mg/ml à environ 0,2 mg/ml, environ 0,02 mg/ml à environ 0,5 mg/ml, environ 0,02 mg/ml à environ 1 mg/ml, environ 0,02 mg/ml à environ 2 mg/ml, environ 0,02 mg/ml à environ 5 mg/ml, environ 0,02 mg/ml à environ 10 mg/ml, environ 0,02 mg/ml à environ 20 mg/ml,
environ 0,05 mg/ml à environ 0,1 mg/ml, environ 0,05 mg/ml à environ 0,2 mg/ml, environ 0,05 mg/ml à environ 0,5 mg/ml, environ 0,05 mg/ml à environ 1 mg/ml, environ 0,05 mg/ml à environ 2 mg/ml, environ 0,05 mg/ml à environ 5 mg/ml, environ 0,05 mg/ml à environ 10 mg/ml, environ 0,05 mg/ml à environ 20 mg/ml, environ 0,1 mg/ml à environ 0,2 mg/ml, environ 0,1 mg/ml à environ 0,5 mg/ml,
environ 0,1 mg/ml à environ 1 mg/ml, environ 0,1 mg/ml à environ 2 mg/ml, environ 0,1 mg/ml à environ 5 mg/ml, environ 0,1 mg/ml à environ 10 mg/ml, environ 0,1 mg/ml à environ 20 mg/ml, environ 0,2 mg/ml à environ 0,5 mg/ml, environ 0,2 mg/ml à environ 1 mg/ml, environ 0,2 mg/ml à environ 2 mg/ml, environ 0,2 mg/mI à environ 5 mg/ml, environ 0,2 mg/ml à environ 10 mg/ml, environ 0,2 mg/ml à environ 20 mg/ml, environ 0,5 mg/ml à environ 1 mg/ml, environ 0,5 mg/mI à environ 2 mg/ml, environ 0,5 mg/ml à environ 5 mg/ml, environ 0,5 mg/ml à environ 10 mg/ml, environ 0,5 mg/ml à environ 20 mg/ml, environ 1 mg/ml à environ 2 mg/ml, environ 1 mg/ml à environ 5 mg/ml, environ 1 mg/ml à environ 10 mg/ml, environ 1 mg/ml à environ 20 mg/ml, environ 2 mg/ml à environ 5 mg/ml, environ 2 mg/ml à environ 10 mg/ml, environ 2 mg/ml à environ 20 mg/MI, environ 5mg/ml à environ 10 mg/ml, environ 5 mg/mI à environ 20 mg/ml, ou environ 10 mg/ml à environ 20 mg/ml.
Dans certains modes de réalisation, la concentration de l’ARN non coiffé dans ladite composition comprend une plage entre environ 0,01 mg/ml, environ 0,02 mg/ml, environ 0,05 mg/ml, environ 0,1 mg/ml, environ 0,2 mg/ml, environ 0,5 mg/ml, environ 1 mg/ml, environ 2 mg/ml, environ 5 mg/ml, environ 10 mg/ml ou environ 20 mg/ml.
Dans certains modes de réalisation, la concentration de ARN non coiffé dans ladite composition comprend une plage entre au moins environ 0,01 mg/ml, environ 0,02 mg/ml, environ 0,05 mg/ml, environ 0,1 mg/ml, environ 0,2 mg/ml, environ 0,5 mg/ml, environ 1 mg/ml, environ 2 mg/ml, environ 5 mg/ml ou environ 10 mg/ml.
Dans certains modes de réalisation, la concentration de VARN non coiffé dans ladite composition comprend une plage entre au plus environ 0,02 mg/ml, environ 0,05 mg/ml, environ 0,1 mg/ml, environ 0,2 mg/ml, environ 0,5 mg/ml, environ 1mg/ml, environ 2 mg/ml, environ 5mg/ml, environ 10 mg/ml ou environ 20 mg/ml.
29 BE2022/5036
Dans certains modes de réalisation, la composition comprend une pluralité de molécules d’ARN coiffées en 5’, dans laquelle une réaction de coiffage se produit de manière post-transcriptionnelle et dans laquelle un rapport entre une pluralité de molécules d'ARN non coiffées et la pluralité de molécules d’ARN coiffées est entre 0,0001 et 1. Dans certains modes de réalisation, la composition comprend une pluralité de molécules d’ARN coiffées en 5’, dans laquelle une réaction de coiffage se produit de manière post-transcriptionnelle et dans laquelle un rapport entre une pluralité de molécules d’ARN non coiffées et la pluralité de molécules d’ARN coiffées est entre 0,01 et 0,5. Dans certains modes de réalisation, la composition comprend les molécules d’ARN coiffées ou un peptide codé par les molécules d’ARN coiffées.
Dans certains modes de réalisation, les molécules d’ARN coiffées ou un peptide codé par les molécules d'ARN coiffées peuvent coder pour un antigène pour une formulation de vaccin. Dans certains modes de réalisation, les molécules d’ARN coiffées sont traitées davantage pour une formulation dans une composition de vaccin.
Dans certains modes de réalisation, la composition de vaccin comprend au moins une molécule d’ARN coiffée en 5’, où la molécule d’ARN coiffée en 5’ est une molécule d’ARNm coiffée en 5’. Dans certains modes de réalisation, l’au moins une molécule d'ARNm coiffée en 5’ peut être encapsulée dans une nanoparticule pour former une composition pharmaceutique. La nanoparticule peut comprendre des lipides, des glucides, des polypeptides, des polymères formés à partir d’un ou plusieurs monomères, ou toute combinaison de ceux-ci (incluant des combinaisons moléculaires de ces substances). Dans certains modes de réalisation, lau moins une — molécule d’ARN coiffée en 5’ est complexée avec un polymère chargé, par ex. par interaction électrostatique.
Dans certains modes de réalisation, la composition pharmaceutique comprenant l’au moins une molécule d'ARNm coiffée en 5’ peut être formulée avec un lipide chargé ou un lipide aminé. Dans certains modes de réalisation, la composition pharmaceutique comprenant l’au moins une molécule d’ARNm coiffée en 5’ peut être formulée par complexation avec des lipides, des liposomes ou des lipoplexes. Par exemple, la complexation peut inclure la mise en contact de l’au moins une molécule d’ARNm coiffée en 5’ avec un PEG-lipide ou un lipide zwitterionique comprenant un groupe de tête, où la charge positive est située près de la région de la chaîne acyle et la charge négative est située au niveau de l'extrémité distale du groupe de tête.
Dans certains modes de réalisation, la composition pharmaceutique comprenant l’au
30 BE2022/5036 moins une molécule d'ARNm coiffée en 5’ peut être formulée avec un vecteur de bicouche lipidique.
Dans certains modes de réalisation, la composition pharmaceutique comprenant l’au moins une molécule d'ARNm coiffée en 5’ comprend peut être formulée avec un polymère naturel ou synthétique. Les exemples non limitants de tels polymères peuvent inclure le chitosan ou la cyclodextrine. Dans certains modes de réalisation, la composition pharmaceutique comprenant l’au moins une molécule d’ARNm coiffée en 5’ comprend peut être formulée dans une formulation de polymère comprenant un polymère tel que des polyéthènes, un polyéthylène glycol (PEG), une poly(l-lysine) (PLL), un lipopolymère cationique, un lipopolymère cationique biodégradable, une polyéthylèneimine (PEI), des poly(alkylène imines) ramifiées réticulées, un dérivé de polyamine, un poloxamère modifié, un polymère biodégradable, un polymère biodégradable élastique, des polymères acryliques, un polymère contenant une amine, un polymère de dextrane, un dérivé de polymère de dextrane, ou une combinaison ceux-ci. Dans certains modes de réalisation, la composition pharmaceutique comprenant l’au moins une molécule d'ARNm coiffée en 5’ comprend peut être formulée dans un polyplexe avec un ou plusieurs polymères communément utilisés en formulation pharmaceutique. Dans certains modes de réalisation, le — polyplexe comprend deux polymères cationiques ou plus tels qu’une poly(éthylène imine) (PEI). Dans certains modes de réalisation, la composition pharmaceutique comprenant l’au moins une molécule d'ARNm coiffée en 5’ comprend peut être formulée sous la forme d'une nanoparticule en utilisant une combinaison de polymères, de lipides, ou d’autres agents biodégradables. Dans certains modes de réalisation, les nanoparticules de lipides peuvent comprendre un cœur de l’'ARNm coiffé en 5’ décrit ici et une enveloppe de polymère. L'enveloppe de polymère peut être l’un quelconque des polymères connus en formulation pharmaceutique.
Dans certains modes de réalisation, la composition pharmaceutique comprend un — vecteur, excipient ou diluant pharmaceutiquement acceptable. Dans certains modes de réalisation, la composition pharmaceutique décrite ici inclut au moins un agent actif additionnel décrit ici. Dans certains modes de réalisation, lau moins un agent actif additionnel est un agent chimiothérapeutique, un agent cytotoxique, une cytokine, un agent inhibiteur de croissance, un agent anti-hormonal, un agent anti- angiogénigue ou un inhibiteur de point de contrôle. Dans certains modes de réalisation, l’au moins un agent actif additionnel est un adjuvant pour augmenter l’efficacité de la vaccination.
31 BE2022/5036
Dans la mise en pratique des méthodes de traitement ou d'utilisation fournies ici, une quantité thérapeutiquement efficace de composition pharmaceutique décrite ici est administrée à un mammifère ayant une maladie, un trouble ou une affection à traiter.
Dans certains modes de réalisation, le mammifère est un humain. Une quantité thérapeutiquement efficace peut varier largement en fonction de la sévérité de la maladie, de l’âge et de la santé relative du sujet, de la puissance de l’agent thérapeutique utilisé et d'autres facteurs. Les agents thérapeutiques, et dans certains cas, les compositions décrites ici, peuvent être utilisés seuls ou en combinaison avec un ou plusieurs agents thérapeutiques en tant que composants de mélanges.
La composition pharmaceutique décrite ici peut être administrée à un sujet par des voies d'administration appropriées, incluant, mais sans s'y limiter, les voies d'administration intraveineuse, intra-artérielle, orale, parentérale, buccale, topique, — transdermique, rectale, intramusculaire, sous-cutanée, intra-osseuse, transmuqueuse, par inhalation ou intrapéritonéale. La composition décrite ici peut inclure, mais sans s'y limiter, des dispersions liquides aqueuses, des dispersions auto-émulsifiantes, des solutions solides, des dispersions liposomales, des aérosols, des formes galéniques solides, des poudres, des formulations à libération immédiate, des formulations à libération contrôlée, des formulations fondant rapidement, des comprimés, des capsules, des pilules, des formulations à libération retardée, des formulations à libération prolongée, des formulations à libération pulsatile, des formulations multi-particulaires, et des formulations mixtes à libération immédiate et contrôlée.
La composition pharmaceutique incluant un agent thérapeutique peut être fabriquée d’une manière conventionnelle, telle que, à titre d'exemple uniquement, au moyen d’un mélange conventionnel, d’un mélange chaotique, d’un mélange laminaire, d’une dissolution, d’une encapsulation ou d’autres procédés.
La composition pharmaceutique peut inclure au moins un agent thérapeutique exogène en tant que principe actif sous une forme exempte d'acide ou exempte de base, ou sous une forme de sel pharmaceutiquement acceptable. De plus, les méthodes et compositions décrites ici incluent l’utilisation de N-oxydes (le cas échéant), de formes cristallines, de phases amorphes, ainsi que de métabolites actifs de ces biomolécules ayant le même type d'activité. Dans certains modes de réalisation, les agents thérapeutiques existent sous forme non solvatée ou sous des formes solvatées avec des solvants pharmaceutiquement acceptables tels que de
32 BE2022/5036 l’eau, de l’éthanol, et autres. Les formes solvatées des agents thérapeutiques sont également considérées comme étant divulguées ici.
Dans certains modes de réalisation, la composition pharmaceutique fournie ici inclut un ou plusieurs agents de conservation pour inhiber l’activité microbienne. Les agents de conservation adéquats incluent les substances contenant du mercure telles que le merfen et le thiomersal ; le dioxyde de chlore stabilisé ; et les composés d’ammonium quaternaire tels que le chlorure de benzalkonium, le bromure de cétyltriméthylammonium et le chlorure de cétylpyridinium.
L'utilisation de termes absolus ou séquentiels, par exemple, « sera », « ne sera pas », « devrait », «ne devrait pas », « doit », «ne doit pas », « premier », « initialement », « suivant », « ensuite », « avant », « après », « en dernier » et « enfin », ne sont pas destinés à limiter la portée des présents modes de réalisation divulgués ici mais à titre d'exemples.
Telles qu’utilisées ici, les formes singulières « un », « une », «le » et « la » sont destinées à inclure les formes plurielles également, sauf si le contexte indique clairement le contraire. En outre, dans la mesure où les termes « incluant », « inclut », « ayant », « a », « comportant », ou des variantes de ceux-ci, sont utilisés dans la description détaillée et/ou les revendications, de tels termes sont destinés à être inclusifs d’une manière similaire au terme « comprenant ».
Telles qu'’utilisées ici, les expressions «au moins un », «un ou plusieurs » et « et/ou » sont des expressions ouvertes qui sont toutes deux des formes conjonctives et disjonctives. Par exemple, chacune des expressions « au moins l’un de A, Bet C », « au moins l’un de A, B ou C », « un ou plusieurs de A, B et C », « un ou plusieurs de A, B ou C » et « A, B et/ou C » signifie A seul, B seul, C seul, À et B ensemble, A et C ensemble, B et C ensemble, ou A, B et C ensemble.
Tel qu'utilisé ici, « ou » peut faire référence à « et», « ou », ou « et/ou » et peut être utilisé à la fois de manière exclusive et inclusive. Par exemple, le terme « A ou
B » peut faire référence à « A ou B », « A mais pas B », « B mais pas A », et «A et
B”. Dans certains cas, le contexte peut imposer une signification particulière.
Tous les systèmes, méthodes, logiciels et plateformes décrits ici sont modulaires. En conséquence, les termes tels que « premier » et « second » n’impliquent pas nécessairement une priorité, un ordre d'importance, ou un ordre d'actions.
33 BE2022/5036
Le terme « environ » lorsqu'il fait référence à un nombre ou à une plage numérique signifie que le nombre ou la plage numérique auquel (à laquelle) il est fait référence est une approximation à l’intérieur d’une variabilité expérimentale (ou à l'intérieur d'une l'erreur expérimentale statistique), et le nombre ou la plage numérique peut varier, par exemple, de 1 % à 15 % du nombre ou de la plage numérique indiqué(e).
Dans les exemples, le terme « environ » fait référence à + 10 % d’un nombre ou d’une valeur indiqué(e).
Les termes « augmenté », « augmentant », ou « augmentation » sont utilisés ici pour désigner généralement une augmentation par une quantité statiquement significative. Dans certains modes de réalisation, les termes « augmenté » ou « augmentation » désignent une augmentation d'au moins 10 % comparativement à un niveau de référence, par exemple une augmentation d’au moins environ 10 %, d’au moins environ 20 %, ou d'au moins environ 30 %, ou d'au moins environ 40 %, ou d'au moins environ 50 %, ou d'au moins environ 60 %, ou d'au moins environ 70 %, ou d'au moins environ 80 %, ou d’au moins environ 90 % ou jusqu'à 100 % inclus ou toute autre augmentation entre 10 et 100 % comparativement à un niveau de référence, un étalon ou un témoin. Les autres exemples d’« augmentation » incluent une augmentation d’un facteur d’au moins 2, d’au moins 5, d’au moins 10, d'au moins 20, d’au moins 50, d'au moins 100, d’au moins 1 000 ou tout nombre numérique entre les facteurs de dilution mentionnés ci-dessus comparativement à un niveau de référence.
Les termes « diminué », « diminuant » ou « diminution » sont utilisés ici pour signifier généralement une diminution d’une quantité statistiquement significative.
Dans certains modes de réalisation, « diminué » ou « diminution » signifie une réduction d’au moins 10 % comparativement à un niveau de référence, par exemple une diminution d'au moins environ 20 %, ou d'au moins environ 30 %, ou d'au moins environ 40 %, ou d'au moins environ 50 %, ou d'au moins environ 60 %, ou d'au moins environ 70 %, ou d'au moins environ 80 %, ou d'au moins environ 90 % ou jusqu’à 100% inclus (par ex., niveau absent ou niveau non détectable comparativement à un niveau de référence), ou toute diminution entre 10 et 100 % comparativement à un niveau de référence. Dans le contexte d’un marqueur ou d’un — symptôme, par ces termes on désigne une diminution statistiquement significative d’un tel niveau. La diminution peut être, par exemple, d'au moins 10 %, d’au moins 20 %, d'au moins 30 %,d’au moins 40 % ou plus, et est de préférence jusqu'à un
34 BE2022/5036 niveau accepté comme étant dans la plage de la normale pour un individu sans maladie donnée.
Les termes « ARN » ou « molécule d’ARN » sont utilisés ici pour faire généralement reference à tout type d’ARN. Un exemple non limitant d’ARN inclut un ARN à chaîne longue, un ARN codant, un ARN non codant, un ARN long non codant, un ARN à simple brin (ARNsb), un ARN à double brin (ARNdb), un ARN linéaire (ARNIin), un
ARN circulaire (ARNcirc), un ARN messager (ARNm), un ARNm auto-amplificateur (SAM), un ARNm trans-amplificateur, des oligonucléotides d’'ARN, des oligonucléotides antisens, des petits ARN interférents (petits ARNi), un petit ARN en épingle à cheveux (ARNsh), un ARN antisens (ARNas), des ARN guides CRISPR/Cas9, des riborégulateurs, un ARN immunostimulateur (ARNis), des ribozymes, des aptamères, un ARN ribosomique (ARNr), un ARN de transfert (ARNt), un ARN viral (ARNv), un ARN rétroviral ou un ARN réplicon, un petit ARN nucléaire (petit ARNn), un petit ARN nucléolaire (petit ARNno), un microARN (miARN), des ARN associés au site de départ de la transcription (TSSa), des ARN antisens en amont (ua), des produits de transcription en amont du promoteur (PROMPT), ou une combinaison de ceux-ci. — Tandis que les modes de réalisation préférés de la présente invention ont été montrés et décrits ici, il sera évident pour l'homme du métier que de tels modes de réalisation sont fournis à titre d'exemple uniquement. L'invention n’est pas destinée à être limitée par les exemples spécifiques fournis à l’intérieur du mémoire descriptif. Tandis que l'invention a été décrite en référence au mémoire descriptif mentionné ci-dessus, les descriptions et les illustrations des modes de réalisation ici ne sont pas destinées à être interprétées dans un sens limitant. De nombreux (nombreuses) variations, changements et substitutions apparaîtront à présent à l'homme du métier sans s'éloigner de l'invention. En outre, il est entendu que tous les aspects de l’invention ne sont pas limités aux représentations, configurations ou proportions relatives spécifiques exposées ici qui dépendent d’une variété de conditions et de variables. Il est entendu que diverses variantes aux modes de réalisation de l'invention décrite ici peuvent être employées dans la mise en pratique de l'invention. Il est par conséquent envisagé que l'invention devrait également couvrir de tel(le)s Variantes, modifications, variations ou équivalents. Il est prévu que les revendications suivantes — définissent la portée de l'invention et que les méthodes et structures à l’intérieur de la portée de ces revendications et leurs équivalents soient couvertes par celles-ci.
35 BE2022/5036
EXEMPLES
Les exemples illustratifs suivants sont représentatifs des modes de réalisation des systèmes et des méthodes décrits ici et ne sont pas destinés à être limitants de quelque manière que ce soit.
Exemple 1. Coiffage d'acide nucléique suivant un échange de tampon
L'efficacité de coiffage d’un ARN transcrit in vitro a été augmentée par dilution de la solution contenant les molécules d’ARN non coiffées avant la réaction de coiffage. Les
Fig. 1 et Fig. 2 illustrent des exemples non limitants des expériences pour effectuer un échange de tampon et une dialyse pour le coiffage de l'ARN transcrit in vitro (TIV).
La solution contenant les molécules d'ARN non coiffées peut être mise en contact avec un filtre comprenant un seuil de coupure de poids moléculaire de 10 kDa (PMCO de 10 kDa). Après élimination de la solution par centrifugation, le rétentat peut être re-dilué dans de l’eau exempte de RNase et la solution résultante à nouveau filtrée à travers le filtre à PMCO de 10 kDa. Ce procédé peut être répété une nouvelle fois.
Puis le rétentat peut être dissous dans de l’eau exempte de RNase, et les molécules d’ARN non coiffées peuvent être mises en contact avec des enzymes de coiffage et autres réactifs de coiffage (GTP, concentré de tampon de coiffage, S- adénosylméthionine, MgCl2) pour initier la réaction de coiffage.
Tandis que la divulgation précédente a été décrite de manière quelque peu détaillée à des fins de clarté et de compréhension, il sera évident pour l’homme du métier d’après une lecture de cette divulgation que divers changements de forme et de détail peuvent être apportés sans s'éloigner de la véritable portée de la divulgation. Par exemple, toutes les techniques et tous les appareils décrits ci-dessus peuvent être utilisés dans diverses combinaisons. Tou(te)s les publications, brevets, demandes de brevet et/ou autres documents cités dans la présente demande sont incorporés à titre de référence dans leur intégralité à tous fins utiles dans la même mesure que si chaque publication, brevet, demande de brevet et/ou autre document individuel était individuellement et séparément indiqué comme étant incorporé à titre de référence à tous fins utiles.
Tou(te)s les publications, brevets et demandes de brevet mentionné(e)s dans le présent mémoire descriptif sont ici incorporé(e)s à titre de référence dans la même mesure que si chaque publication, brevet ou demande de brevet individuel était spécifiquement et individuellement indiqué(e) comme étant incorporé(e) à titre de
36 BE2022/5036 référence.
Dans la mesure où les publications et brevets ou demandes de brevet incorporés à titre de référence contredisent la divulgation contenue dans le mémoire descriptif, le mémoire descriptif est destiné à primer et/ou l'emporter sur tout matériau contradictoire de ce type.

Claims (45)

37 BE2022/5036 REVENDICATIONS
1. Méthode de production d'au moins une molécule d’acide ribonucléique (ARN) coiffée, comprenant :
a. la fourniture d’une pluralité de molécules d'ARN non coiffées dans une première solution ;
b. l'élimination d’une pluralité de molécules qui a un poids moléculaire d’au plus environ 1 000 kDa dans la première solution pour former une deuxième solution, de sorte qu’une efficacité de coiffage post-transcriptionnel d'au moins 75 % est atteinte ;
C. la mise en contact de la deuxième solution avec une pluralité de molécules d’enzyme de coiffage ; et d. l'ajout d’une structure de coiffe à une extrémité 5’ d’une molécule d’ARN non coiffée pour former l’au moins une molécule d’ARN coiffée.
2. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle la pluralité de molécules a un poids moléculaire d’au plus environ 800 kDa.
3. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle la pluralité de molécules a un poids moléculaire d’au plus environ 600 kDa.
4. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle la pluralité de molécules a un poids moléculaire d’au plus environ 500 kDa.
5, Méthode selon la revendication 1, dans laquelle la pluralité de molécules a un poids moléculaire d’au plus environ 400 kDa.
6. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle la pluralité de molécules a un poids moléculaire d’au plus environ 200 kDa.
7. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle la pluralité de molécules a un poids moléculaire d’au plus environ 100 kDa.
8. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle la pluralité de molécules a un poids moléculaire d’au plus environ 30 kDa.
9, Méthode selon la revendication 1, dans laquelle la pluralité de molécules a un poids moléculaire d'au plus environ 10 kDa.
10. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle la pluralité de molécules a un poids moléculaire d’au plus environ 5 kDa.
11. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle la pluralité de molécules a un poids moléculaire d’au plus environ 3 kDa.
12. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle l'élimination de la pluralité de molécules comprend la filtration de la première solution contre un filtre, dans laquelle le filtre comprend une taille de pore nominale mesurée en un seuil de coupure de
38 BE2022/5036 poids moléculaire (PMCO) d'environ 800 kDa, 600 kDa, 500 kDa, 400 kDa, 200 kDa, ou 100 kDa.
13. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle l'élimination de la pluralité de molécules comprend la diafiltration de la première solution contre un filtre, dans laquelle le filtre comprend une taille de pore nominale mesurée en PMCO d'environ 50 kDa, 30 kDa, 10 kDa, 5 kDa, 3 kDa, ou 1 kDa.
14. Méthode selon la revendication 13, dans laquelle la filtration se fait par diafiltration continue ou discontinue.
15. Méthode selon la revendication 13, dans laquelle la filtration comprend une — filtration à écoulement tangentiel.
16. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle l'élimination de la pluralité de molécules comprend la réalisation d’une dialyse de la première solution dans un milieu adéquat.
17. Méthode selon l’une quelconque des revendications 15 ou 16, dans laquelle l'élimination de la pluralité de molécules ne comprend pas d'étape de purification additionnelle.
18. Méthode selon la revendication 17, dans laquelle l'étape de purification additionnelle est effectuée par une chromatographie.
19. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle la pluralité de molécules — d’ARN non coiffées est générée par l'intermédiaire d’une réaction de transcription in vitro (TIV).
20. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 19, dans laquelle la pluralité d’enzymes de coiffage est sélectionnée dans le groupe constitué d’'ARNm (nucléoside-2’-O-)-méthyltransférase spécifique de coiffe, d’enzyme de coiffage de — Vaccinia (VCE), d’enzyme de coiffage du virus de la maladie de la langue bleue, d’enzyme de coiffage du virus de la chlorelle, d’enzyme de coiffage de S. cerevisiae, d’enzyme de coiffage de mimivirus, d’enzyme de coiffage du virus de la peste porcine africaine, et d’enzyme de coiffage de réovirus aviaire.
21. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 20, dans laquelle — l'ajout de la structure de coiffe à l'extrémité 5’ de la molécule d’ARN non coiffée se produit à une efficacité d’au moins 70 %.
22. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 20, dans laquelle l’ajout de la structure de coiffe à l'extrémité 5’ de la molécule d’ARN non coiffée se produit à une efficacité d’au moins 75 %.
23. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 20, dans laquelle l’ajout de la structure de coiffe à l'extrémité 5’ de la molécule d’ARN non coiffée se produit à une efficacité d’au moins 77 %.
39 BE2022/5036
24. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 20, dans laquelle l’ajout de la structure de coiffe à l'extrémité 5’ de la molécule d’ARN non coiffée se produit à une efficacité d’au moins 80 %.
25. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 20, dans laquelle l’ajout de la structure de coiffe à l'extrémité 5’ de la molécule d’ARN non coiffée se produit à une efficacité d’au moins 85 %.
26. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 20, dans laquelle l’ajout de la structure de coiffe à l'extrémité 5’ de la molécule d’ARN non coiffée se produit à une efficacité d’au moins 90 %.
27. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 20, dans laquelle l’ajout de la structure de coiffe à l'extrémité 5’ de la molécule d’ARN non coiffée se produit à une efficacité d’au moins 95 %.
28. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 20, dans laquelle l’ajout de la structure de coiffe à l'extrémité 5’ de la molécule d’ARN non coiffée se produit à une efficacité d’au moins 97 %.
29. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 20, dans laquelle l’ajout de la structure de coiffe à l'extrémité 5’ de la molécule d’ARN non coiffée se produit à une efficacité d’au moins 98 %.
30. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 20, dans laquelle l’ajout de la structure de coiffe à l'extrémité 5’ de la molécule d’ARN non coiffée se produit à une efficacité d’au moins 99 %.
31. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 20, dans laquelle l’ajout de la structure de coiffe à l'extrémité 5’ de la molécule d’ARN non coiffée se produit à une efficacité d'environ 100 %.
32. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 31, dans laquelle une concentration de la pluralité de molécules est réduite d’au moins 50 %, 60 %, 70 %, ou 80 %, ou 85 %, ou 90 %, ou 95 %, ou 96 %, ou 97 %, ou 98 %, ou 99 % dans la deuxième solution comparativement à une concentration de la pluralité de molécules dans la première solution.
33. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 31, dans laquelle une concentration de la pluralité de molécules est réduite d’au moins 99,9975 % dans la deuxième solution comparativement à une concentration de la pluralité de molécules dans la première solution. 34, Méthode selon la revendication 33, dans laquelle la concentration de la — pluralité de molécules dans la deuxième solution est inférieure ou égale à 50 %, ou %, ou 30 %, ou 20 %, ou 15 %, ou 10 %, ou 5 %, ou 4 %, ou 3 %, ou 2 %, ou 1 % de la concentration de la pluralité de molécules dans la première solution.
40 BE2022/5036
35. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 34, comprenant en outre la synthèse d’un peptide ou d’une protéine en utilisant l’au moins une molécule d’ARN coiffée.
36. Composition pharmaceutique obtenue en utilisant la méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 35.
37. Composition pharmaceutique selon la revendication 36, dans laquelle la composition pharmaceutique est un vaccin.
38. Peptide ou protéine obtenu(e) en utilisant la méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 35.
39. Peptide ou protéine selon la revendication 38, dans lequel (laquelle) le peptide ou la protéine est produit(e) in vivo.
40. Peptide ou protéine selon la revendication 38, dans lequel (laquelle) le peptide ou la protéine est produit(e) in vitro.
41. Peptide ou protéine selon l’une quelconque des revendications 39 à 41, dans lequel (laquelle) le peptide ou la protéine est un peptide ou une protéine prophylactique ou thérapeutique.
42. Composition comprenant une pluralité de molécules d’ARN coiffées en 5’, dans laquelle lesdites molécules d'ARN sont obtenues au moyen d'une réaction de transcription in vitro et dans laquelle ledit coiffage s’est produit de manière post- transcriptionnelle, ladite composition comprend des réactifs pour une transcription in vitro, et dans laquelle la concentration d’ARN dans ladite composition est inférieure à 20 mg/ml.
43. Composition comprenant une pluralité de molécules d’ARN coiffées en 5’, lesdites molécules d’ARN sont obtenues au moyen d’une réaction de transcription in vitro et dans laquelle ledit coiffage s’est produit de manière post-transcriptionnelle, dans laquelle l’efficacité de la réaction de coiffage est d'au moins 75 % sans utiliser de chromatographie.
44. Composition comprenant une pluralité de molécules d’ARN coiffées en 5’ et non coiffées, lesdites molécules d’ARN sont obtenues au moyen d’une réaction de — transcription in vitro et dans laquelle ledit coiffage s'est produit de manière post- transcriptionnelle, dans laquelle un rapport entre la pluralité de molécules d'ARN non coiffées et la pluralité de molécules d’ARN coiffées est entre 0,0001 à 0,3.
45, Système comprenant :
a. au moins un récipient contenant la première solution ou la deuxième solution selon l’une quelconque des revendications précédentes ; et b. au moins un filtre pour séparer la pluralité de molécules selon l’une quelconque des revendications précédentes.
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