BE1030203B1

BE1030203B1 - Méthodes et systèmes de coiffage de molécules d’acide nucléique

Info

Publication number: BE1030203B1
Application number: BE20225035A
Authority: BE
Inventors: Grégory Godefroi; Kristof Vandekerckhove; Blandine David
Original assignee: Quantoom Biosciences S A
Priority date: 2022-01-20
Filing date: 2022-01-20
Publication date: 2023-08-21
Also published as: BE1030203A1

Abstract

Sont décrits ici des systèmes de coiffage d’acide nucléique. Sont également décrites ici des méthodes de coiffage d’acide nucléique avec les systèmes décrits ici.

Description

1 BE2022/5035

MÉTHODES ET SYSTÈMES DE COI FFAGE DE MOLÉCULES D’ACIDE

NUCLÉI QUE

CONTEXTE

Le traitement d'acide nucléique in vitro est largement utilisé dans les domaines du biomédical ou des biosciences. L'une des méthodes de traitement ou de fabrication d'acides nucléiques in vitro implique le coiffage d’ARN messager (ARNm) pour la fabrication d'ARNm ou d’un peptide codé par l'ARNm en quantités industrielles. Deux stratégies principales sont actuellement utilisées pour la production d'ARNm coiffé en 5’ : le coiffage co-transcriptionnel, moyennant quoi un oligonucléotide synthétique intégrant la structure de coiffe est incorporé durant la transcription du brin d’ADN matrice ; et le coiffage post-transcriptionnel, moyennant quoi la biosynthèse de la structure de coiffe et les réactions associées sont catalysées enzymatiquement.

RÉSUMÉ

Le coiffage post-transcriptionnel efficace de l’'ARNm requiert un traitement antérieur de la récolte de la réaction obtenue après transcription in vitro (TIV). La méthode traditionnelle de prétraitement implique au moins une opération de purification entre l'étape de TIV et l’étape de coiffage enzymatique afin d'assurer une efficacité de coiffage suffisante. De telles étapes augmentent la durée et la complexité du procédé et diminuent le rendement global de molécules d’ARN coiffées. En conséquence, des systèmes et des méthodes pour un traitement simple, peu coûteux et rapide de récolte de réaction d’ARNm pour assurer un coiffage enzymatique efficace en aval sont intéressants. Est décrite ici, dans certains aspects, une méthode de production d'au moins une molécule d'acide ribonucléique (ARN) coiffée, comprenant : la fourniture d’une pluralité de molécules d’ARN non coiffées dans une première solution ; la dilution de la première solution par un facteur d'au moins 4 pour former une deuxième solution contenant la pluralité de molécules d’ARN non coiffées ; la mise en contact de la deuxième solution avec une pluralité de molécules d’enzyme de coiffage ; et l'ajout d’une structure de coiffe à une extrémité 5’ d’une molécule d’ARN non coiffée pour former au moins une molécule d’ARN coiffée. Dans certains modes de réalisation, la dilution de la première solution comprend l’ajout d’un volume d'un diluant à ladite première solution. Dans certains modes de réalisation, la première solution est diluée par un facteur entre environ 4 et 1 000. Dans certains modes de réalisation, la première solution est diluée par un facteur d’au moins

2 BE2022/5035 environ 200. Dans certains modes de réalisation, la première solution est diluée par un facteur d’au moins environ 50. Dans certains modes de réalisation, la première solution est diluée par un facteur d’au moins environ 10. Dans certains modes de réalisation, la méthode comprend en outre l'élimination d’un volume en excès de la deuxième solution. Dans certains modes de réalisation, l'élimination du volume en excès comprend une ultrafiltration, une microfiltration, une filtration à écoulement tangentiel, ou une combinaison de celles-ci. Dans certains modes de réalisation, la dilution de la première solution ne comprend pas d'étape de purification additionnelle.

Dans certains modes de réalisation, l'étape de purification additionnelle comprend une chromatographie. Dans certains modes de réalisation, la dilution de la première solution se produit dans un(e) même cuve ou réacteur que la pluralité de molécules d’ARN non coiffées générées par l'intermédiaire d’une réaction de transcription in vitro (TIV). Dans certains modes de réalisation, la dilution de la première solution se produit dans un(e) cuve ou un réacteur différent(e) de la pluralité de molécules d'ARN non coiffées générées par l'intermédiaire d’une réaction de TIV. Dans certains modes de réalisation, la réaction de TIV se produit dans un réacteur continu ou un réacteur discontinu. Dans certains modes de réalisation, la pluralité d’enzymes de coiffage est sélectionnée dans le groupe constitué d'ARNm (nucléoside-2’-O-)-méthyltransférase spécifique de coiffe, d’enzyme de coiffage de Vaccinia (VCE), d’enzyme de coiffage du virus de la maladie de la langue bleue, d’enzyme de coiffage du virus de la chlorelle, d’enzyme de coiffage de S. cerevisiae, d'enzyme de coiffage de mimivirus, d’enzyme de coiffage du virus de la peste porcine africaine, et d'enzyme de coiffage de réovirus aviaire. Dans certains modes de réalisation, l’ajout de la structure de coiffe à l'extrémité 5’ de la molécule d’ARN non coiffée se produit à une efficacité d'au moins 70 %, d'au moins 75 %, d'au moins 77 %, d'au moins 80 %, d'au moins 85 %, d'au moins 87 %, d'au moins 90 %, d'au moins 95 %, d'au moins 97 %, d'au moins 98 % ou d'au moins 99 %. Dans certains modes de réalisation, l’ajout de la structure de coiffe à l'extrémité 5’ de la molécule d’ARN non coiffée se produit à une efficacité d'environ 100 %.

Dans certains modes de réalisation, l'ARN comprend une séquence d'acide nucléique codant pour un peptide ou une protéine. Dans certains modes de réalisation, l’ARN polymérase est sélectionnée dans le groupe constitué d’une T7 ARN polymérase, d’une T3 ARN polymérase, d’une SP6 ARN polymérase, d’une ARN polymérase I, d'une ARN polymérase II, d’une ARN polymérase III, d'une ARN polymérase IV, d'une

ARN polymérase V, et d’une ARN polymérase à une seule sous-unité. Dans certains modes de réalisation, la méthode comprend en outre la synthèse d’un peptide ou

3 BE2022/5035 d’une protéine en utilisant lau moins une molécule d’ARNm coiffée. Dans certains modes de réalisation, la dilution de la première solution comprend la diminution d’une concentration d’une pluralité de molécules qui inhibe une réaction de coiffage consistant à ajouter une structure de coiffage à une extrémité 5’ d’une molécule d’ARN non coiffée. Dans certains modes de réalisation, la concentration de la pluralité de molécules est diminuée jusqu'à un niveau où la réaction de coiffage n’est plus inhibée. Dans certains modes de réalisation, la dilution de la première solution comprend la diminution d’une concentration de la pluralité de molécules d’ARN non coiffées. Dans certains modes de réalisation, la concentration de la pluralité de molécules d’ARN non coiffées est diminuée jusqu'à un niveau où la réaction de coiffage n’est plus inhibée.

Est décrite ici, dans certains aspects, une composition pharmaceutique obtenue en utilisant une méthode décrite ici. Dans certains modes de réalisation, la composition pharmaceutique est un vaccin et un vecteur pharmaceutique acceptable.

Est décrit(e) ici, dans certains aspects, un peptide ou une protéine obtenu(e) en utilisant une méthode décrite ici. Dans certains modes de réalisation, le peptide ou la protéine est produit(e) in vivo. Dans certains modes de réalisation, le peptide ou la protéine est produit(e) in vitro. Dans certains modes de réalisation, le peptide ou la protéine est un peptide ou une protéine prophylactique ou thérapeutique.

Est décrite ici, dans certains aspects, une composition comprenant une pluralité de molécules d’ARN coiffées en 5’, dans laquelle lesdites molécules d’ARN sont obtenues au moyen d’une réaction de transcription in vitro et dans laquelle ledit coiffage s’est produit de manière post-transcriptionnelle, ladite composition comprend des réactifs pour une transcription in vitro, et dans laquelle la concentration d’ARN dans ladite composition est inférieure à 20 mg/ml.

Est décrite ici, dans certains aspects, une composition comprenant une pluralité de — molécules d’ARN coiffées en 5’, lesdites molécules d'ARN sont obtenues au moyen d’une réaction de transcription in vitro et dans laquelle ladite réaction de coiffage s’est produite de manière post-transcriptionnelle, dans laquelle l'efficacité de la réaction de coiffage est d'au moins 75 % sans utiliser de chromatographie.

Est décrite ici, dans certains aspects, une composition comprenant une pluralité de molécules d’ARN coiffées en 5’ et non coiffées, lesdites molécules d’ARN sont obtenues au moyen d’une réaction de transcription in vitro et dans laquelle ledit

4 BE2022/5035 coiffage s’est produit de manière post-transcriptionnelle, ladite composition comprend des réactifs pour une transcription in vitro dans laquelle un rapport entre la pluralité de molécules d’ARN non coiffées et la pluralité de molécules d’ARN coiffées est entre 0,0001 à 1.

Est décrit ici, dans certains aspects, un système de production d'au moins une molécule d’ARN coiffée. Le système comprend un bioréacteur configuré pour contenir une première solution contenant une pluralité de molécules d’ARN non coiffées, dans laquelle la première solution est diluée par un facteur d’au moins 4 pour former une deuxième solution, dans laquelle la deuxième solution comprend la pluralité de molécules d’ARN non coiffées ; et le bioréacteur ou un second bioréacteur configuré pour ajouter une structure de coiffe à une extrémité 5’ d’une molécule d’ARN non coiffée pour former au moins une molécule d’ARN coiffée par mise en contact de la deuxième solution avec une pluralité de molécules d’enzyme de coiffage.

BRÈVE DESCRIPTION DES DESSI NS

La présente demande de brevet contient au moins un dessin exécuté en couleur. Des copies du présent brevet ou de la présente demande de brevet comportant un (des) — dessin(s) en couleur seront fournies par l'Office sur demande et après règlement des frais nécessaires.

La Fig. 1 illustre un exemple non limitant du système décrit ici pour le coiffage d'acide nucléique. Le système comprend un premier réacteur discontinu (101) comprenant une première solution contenant de l’acide nucléique non coiffé tel que des molécules d’ARN non coiffées. La première solution peut être passée à travers un réacteur à écoulement continu (ligne marquée d’une flèche ; 104) où elle est mélangée avec un diluant adéquat à travers une entrée à un débit défini (q_dilution) pour atteindre la dilution cible. La solution diluée peut également être passée à travers un dispositif de filtration (103) avant d'arriver à un second réacteur discontinu (102), à partir duquel elle est passée sur le réacteur de coiffage enzymatique. Puisque la concentration d’une pluralité de molécules qui influencent négativement la réaction de coiffage est diminuée par dilution de la première solution (pour obtenir une deuxième solution), une telle dilution peut accroître le coiffage en 5’ des molécules d’ARN transcrites in vitro (TIV). La première solution diluée, à savoir, la deuxième solution contenant l’acide nucléique, peut être suivie d’une ultrafiltration ou de toute autre méthode adéquate pour former une troisième solution. L'utrafiltration ou toute autre méthode adéquate diminue le volume total de solution à traiter en aval et permet un ajustement de la concentration d'ARNm non coiffé à une concentration qui est optimale pour l’opération suivante en aval (par ex. la réaction de coiffage enzymatique). L'acide nucléique coiffé peut être traité davantage en aval, tel que par 5 chromatographie, filtration à écoulement tangentiel ou d'autres méthodes de purification adéquates.

La Fig. 2 illustre un exemple non limitant de protocoles expérimentaux, où une concentration de ARN non coiffé peut être diluée 10 fois (10x) dans certains modes de réalisation.

La Fig. 3 illustre un exemple non limitant d’un mode de réalisation du système, qui comprend au moins un ou un premier récipient (301) comprenant une première solution (302) comprenant au moins un acide nucléique non coiffé. La première solution (302) peut être diluée directement dans le premier récipient (301) pour obtenir une deuxième solution (304). Le système peut en outre comprendre au moins un récipient additionnel (par ex., un second récipient, 303) pour diluer la première solution (302) pour obtenir une deuxième solution (304) dans le second récipient (303). En raison de la pluralité diminuée de molécules qui influencent — négativement la réaction de coiffage dans la deuxième solution (304), les agents de coiffage, (par ex., enzyme(s) de coiffage) coiffent alors l’acide nucléique (acide nucléique coiffé, 305). L'acide nucléique coiffé (305 ) peut être traité davantage, par exemple, pour changer la concentration (306) de l'acide nucléique coiffé (305) ou les systèmes de tampon d'échange, avant traitement supplémentaire en aval.

Les nouveaux points caractéristiques de la divulgation sont exposés de manière détaillée dans les revendications jointes. Une meilleure compréhension des points caractéristiques et avantages de la présente divulgation sera obtenue en référence à la description détaillée suivante qui expose les modes de réalisation illustratifs.

DESCRI PTI ON DÉTAILLÉE

Vue d'ensemble

Un coiffage post-transcriptionnel efficace de l'ARN messager produit par transcription in vitro (TIV) n’est possible qu'après un traitement intermédiaire du produit de la réaction de TIV. Ce traitement intermédiaire implique typiquement une opération de purification (telle qu’une chromatographie), habituellement en combinaison avec une

6 BE2022/5035 étape de filtration à écoulement tangentiel. Cela donne à penser que le produit de la réaction de transcription in vitro contient des substances qui interfèrent avec les réactifs de coiffage. Le coiffage enzymatique immédiatement après la TIV, sans traitement intermédiaire du produit réactionnel, produit des quantités réduites ou approchant 0 % de molécules d'ARNm coiffées. Lorsque les réactifs de coiffage sont ajoutés à la TIV pour « transcription et coiffage concomitants » (réaction monotope), un coiffage marginal peut être atteint (moins de 10 %). Cela confirme qu’un coiffage réussi requiert un certain traitement intermédiaire du produit de la TIV. Un traitement intermédiaire conventionnel, tel que mentionné ci-dessus, implique une ou plusieurs étapes de purification, ce qui s'accompagne de plusieurs désavantages : perte inévitable de produit (rendement diminué du procédé) ; complexité accrue du procédé requérant le développement d'étapes supplémentaires ; nécessité d’un équipement additionnel ; et coûts accrus en raison de la perte de produit et du coût des étapes opérationnelles supplémentaires. La nécessité d'un équipement — additionnel conduit également à un coût opérationnel accru, à un encombrement accru du système, et à une durée étendue du procédé.

Sont décrits ici des systèmes et des méthodes de dilution du produit de la TIV pour diminuer la concentration d'agents d'interférence jusqu'à un niveau où ils n’interfèrent plus avec la réaction de coiffage enzymatique consistant à ajouter des structures de coiffe aux molécules d’ARN non coiffées. La concentration diminuée de molécules d'ARN non coiffées avant la réalisation de la réaction de coiffage peut également contribuer à atteindre une réaction de coiffage efficace pour ajouter une structure de coiffe à une molécule d'ARN non coiffée. Tel que démontré ici, une — dilution du produit de la réaction de TIV peut donner une efficacité de coiffage d'au moins environ 90 % à 99,9 %. Ceci est comparable ou sensiblement similaire à l'efficacité de coiffage qui a été atteinte dans une condition témoin, moyennant quoi la TIV a été purifiée en utilisant un kit de purification d'acide nucléique. En atteignant une efficacité de coiffage d’ARNm élevée sensiblement similaire comparativement à l’utilisation des méthodes actuellement conventionnelles dans l'industrie, les systèmes et méthodes actuels permettent également d’obtenir un coût opérationnel réduit de manière significative et un rendement de procédé amélioré. En outre, en utilisant les systèmes et méthodes actuels, il est bien plus simple d'augmenter l'échelle de la production de molécules d’ARNm coiffées.

Dans certains modes de réalisation, les systèmes et méthodes décrits ici fournissent une dilution d’une première solution comprenant des molécules d’ARN non coiffées pour former une deuxième solution, qui comprend une concentration diminuée d’une

7 BE2022/5035 pluralité de molécules qui influencent négativement ou inhibent la réaction de coiffage enzymatique et l'efficacité de coiffage résultante. Dans certains modes de réalisation, la deuxième solution est mise en contact avec une pluralité d’enzymes de coiffage et autres réactifs (par ex., —guanosine-5”-triphosphate, S- adénosylméthionine) pour produire des molécules d’ARN coiffées. Dans certains cas, au moins un type d’enzyme de coiffage est utilisé. Dans certains cas, plus d’un type d’enzymes de coiffage sont utilisés. Dans certains modes de réalisation, le facteur de dilution utilisé pour diluer la première solution pour obtenir la deuxième solution est suffisant pour diminuer l’inhibition de la réaction de coiffage exercée par la pluralité des molécules dans la deuxième solution. La Fig. 1 fournit un exemple non limitant d’un système décrit ici. Dans cet exemple non limitant, la réaction de coiffage en 5’ d’une molécule d’ARNm peut être inhibée par la présence d'une pluralité de molécules dans une première solution. Par dilution de la première solution, une deuxième solution est obtenue, où la concentration de la pluralité des molécules qui influence … négativement ou inhibe la réaction de coiffage est diminuée. Dans certains modes de réalisation, la deuxième solution passe en outre par une étape de filtration pour éliminer un volume et reconcentrer la pluralité des molécules d'ARN non coiffées. Une telle diminution de concentration ou élimination de la pluralité des molécules permet à la réaction de coiffage de se produire efficacement. Dans certains modes de réalisation, la deuxième solution peut subir un échange de tampon par dialyse ou autre moyen d'échange du tampon de l’ARNm non coiffé avant de passer à la réaction de coiffage. Dans certains modes de réalisation, la solution contenant les molécules d’ARNm coiffées peut être davantage purifiée. Dans certains modes de réalisation, les molécules d'ARNm coiffées obtenues à partir des systèmes et méthodes décrits ici peuvent être utilisées à des fins telles que la fabrication de compositions pharmaceutiques ou de diagnostic.

Systèmes

Sont décrits ici des systèmes de traitement d'acides nucléiques avec les méthodes décrites ci-dessous, tels que le traitement de solutions contenant des molécules d’ARN non coiffées dérivées de réactions de transcription in vitro (TIV) pour éviter l’inhibition de réactions de coiffage relatives à l’ajout d’une structure de coiffe à une molécule d’ARN non coiffée. Le système peut comprendre une portion en amont ayant pour but de fournir des mélanges réactionnels de TIV contenant les molécules d’ARN non coiffées. Dans certains cas, le système peut comprendre une portion en aval pour un traitement supplémentaire des molécules d'ARN coiffées, tel qu’une purification pour éliminer les substances indésirables et une filtration à écoulement

8 BE2022/5035 tangentiel pour modifier la composition et la concentration de la solution de molécules d’ARN coiffées. Dans certains modes de réalisation, le système peut en outre être configuré pour fabriquer des composés, des biomolécules ou des compositions pharmaceutiques en utilisant ARN coiffé en tant qu’entrée. Par exemple, le système décrit ici peut synthétiser ou augmenter le rendement de synthèse d’un antigène codé par l’ARN coiffé ou l'ARNm coiffé, où l’antigène peut en outre être formulé dans un vaccin. Dans certains modes de réalisation, le système comprend des composants ou des dispositifs pour initier ou maintenir des réactions biologiques. Dans certains modes de réalisation, le système peut être configuré pour effectuer toute sorte de procédé approprié. Les exemples non limitants de procédés auxquels les systèmes divulgués ici peuvent être adaptés incluent la production d’un composé biologique ; la production d’un composé pharmaceutique ou biopharmaceutique ; la synthèse d’ARN, incluant la TIV, les procédés post-transcriptionnels et la purification d’ARN ; la synthèse protéique, incluant la synthèse protéique à dépendance cellulaire et la — synthèse protéique acellulaire (CFPS) ; ou une combinaison de ceux-ci.

Dans certains modes de réalisation, le système décrit ici est modulaire, où chaque composant du système peut être indépendamment assemblé ou désassemblé sur la base de la fonctionnalité nécessaire. Dans certains modes de réalisation, le système peut être un système ouvert ou un système fermé de telle manière que le système comprend un réacteur continu ou un réacteur discontinu. Dans certains cas, le système peut comprendre un réacteur continu. Le système peut être employé dans un mode continu. Dans d'autres cas, le système peut comprendre un réacteur discontinu. Le système peut être employé dans un mode non continu ou un mode de réaction discontinu. Dans d'autres cas, le système peut comprendre une combinaison d’un réacteur continu et d’un réacteur discontinu et le système peut être employé dans un mode semi-continu.

Dans certains modes de réalisation, le système tel qu'illustré sur la FIG. 1 comprend au moins deux récipients, où un premier récipient 101 contient une première solution comprenant les molécules d’ARN non coiffées. Dans certains modes de réalisation, la première solution peut être diluée pour obtenir une deuxième solution. Par exemple, une fraction de la première solution peut être transférée dans un second récipient pour diluer la première solution dans la deuxième solution. Dans certains cas, ce procédé de transfert et de dilution est un procédé continu. Le débit de transfert de la première solution vers une deuxième solution est régulé et contrôlé en fonction d’une vitesse du procédé de dilution. Dans certains cas, après dilution d’au moins une

9 BE2022/5035 portion de la première solution contenant les molécules d'ARN non coiffées, le procédé comprend en outre le mélange de la première solution diluée avant le transfert de la première solution diluée vers une étape suivante. Dans certains cas, le procédé de transfert et de dilution est un procédé non continu ou un procédé discontinu. Dans certains cas, le procédé de transfert et de dilution est une combinaison d’un procédé non continu et/ou d'un procédé continu.

Dans certains cas, l'étape de mélange est réalisée par un système de mélange, qui peut comprendre un objet magnétique, un agitateur, un déflecteur, une bille, ou tout autre objet adéquat qui peut être utilisé pour mélanger une solution.

Après dilution ou mélange additionnel, la concentration de la pluralité de molécules qui inhibe la réaction de coiffage est diminuée, ce qui conduit au coiffage des molécules d’ARN non coiffées dans la deuxième solution. Dans certains modes de réalisation, le facteur de dilution pour diluer la première solution pour former la deuxième solution est d'au moins 4, d'au moins 5, d’au moins 6, d’au moins 7, d'au moins 8, d'au moins 9, d'au moins 10, d'au moins 12, d'au moins 14, d’au moins 16, d'au moins 18, d'au moins 20, d'au moins 30, d'au moins 40, d'au moins 50, d’au moins 60, d'au moins 70, d'au moins 80, d'au moins 90, d’au moins 100, d’au moins 1 000, ou tout nombre numérique entre les facteurs de dilution mentionnés ci- dessus.

Tel qu'illustré sur la FIG. 1, le système peut comprendre un dispositif de filtration 103 qui est configuré pour filtrer la première solution diluée pour reconcentrer la pluralité des molécules d’ARN non coiffées avant l'entrée dans le réacteur discontinu 102. Dans certains modes de réalisation, le système ne comprend pas de dispositif de filtration 103 ou la première solution diluée ne passe pas à travers le dispositif de filtration 103 avant l'entrée dans le réacteur discontinu 102. Le réacteur discontinu 101, le récipient pour diluer la première réaction pour obtenir la deuxième solution, le dispositif de mélange, le dispositif de filtration 103, et le réacteur discontinu 102 sont en communication fluidique les uns avec les autres. Dans certains modes de réalisation, la réaction de coiffage consistant à ajouter une structure de coiffe à une molécule d’ARN non coiffée est réalisée dans un réacteur discontinu 102. Tout réactif nécessaire, tel que des enzymes de coiffage telles que décrites ici, du guanosine-5'- triphosphate, des tampons et des sels, un donneur de méthyle (par ex. S- — adénosylméthionine), et autres réactifs nécessaires peuvent être ajoutés au réacteur discontinu 102 par l'intermédiaire d’une valve ou d’une ouverture.

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Dans certains modes de réalisation, le système peut comprendre une unité de filtration. Les unités de filtration peuvent comprendre une unité de filtration frontale, une unité de filtration rotative, une unité de filtration à écoulement tangentiel (TFF), une unité de filtration à écoulement tangentiel alterné (ATF), une unité de microfiltration, une unité d'ultrafiltration ou toute autre unité de filtration adéquate connue dans l’art.

La solution peut être transportée d'une partie du système à une autre (par ex., d’un segment à un autre) ou dans ou hors du système par l’ouverture ou la fermeture de valves. Les valves peuvent être amenées à s’ouvrir ou à se fermer à certains moments par le système. Le système peut en outre comprendre des pompes ou un autre moyen, qui sont en outre amenés par le système à transporter la solution.

Dans certains modes de réalisation, le système peut comprendre un composant ou un dispositif de purification pour purifier la biomolécule synthétisée ou présente dans la solution (par ex., la molécule d’ARN coiffée ou le polypeptide codé à partir de la molécule d’ARN coiffée) et la préparer pour toute réaction adéquate en aval. Un exemple non limitant du composant ou du dispositif de purification peut inclure une chromatographie ou une filtration.

Méthodes

Sont décrites ici des méthodes de coiffage de molécules d’ARN (incluant des molécules d’ARNm, par exemple) synthétisées à partir d’une réaction de TIV. Dans certains modes de réalisation, la méthode augmente l'efficacité de coiffage des molécules d’ARN synthétisées à partir d’une réaction de TIV. Dans certains modes de — réalisation, la méthode élimine une inhibition d’une réaction de coiffage consistant à ajouter une structure de coiffe à une molécule d'ARN non coiffée. Dans certains modes de réalisation, la méthode utilise les systèmes décrits ici pour diluer la pluralité de molécules qui inhibe la réaction de coiffage. Dans certains modes de réalisation, la méthode comprend la dilution d’une première solution contenant les molécules — d’ARN non coiffées ou les molécules d’'ARNm non coiffées pour former une deuxième solution, où la dilution de la pluralité de molécules qui inhibe la réaction de coiffage permet un coiffage post-transcriptionnel des molécules d’ARN ou ARNm non coiffées dans la deuxième solution. Dans certains modes de réalisation, la réaction de coiffage est initiée par mise en contact de la deuxième solution avec une pluralité d'enzymes de coiffage et autres réactifs pour former au moins une molécule d’ARN coiffée. Dans certains modes de réalisation, la dilution de la première solution permet à l'efficacité de coiffage post-transcriptionnel pour produire des molécules d’ARN coiffées

11 BE2022/5035 d'atteindre au moins 50 %, au moins 55 %, au moins 60 %, au moins 65 %, au moins 70 %, d'au moins 75 %, au moins 77 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 87 %, au moins 90 %, au moins 95 %, au moins 97 %, au moins 98 %, au moins 99 %, au moins 99,5 %, au moins 99,9 % ou 100 % de molécules d’ARN — coiffées, ou tout pourcentage entre les pourcentages mentionnés ci-dessus.

Dans certains modes de réalisation, après réaction de transcription in vitro (TIV) pour obtenir une pluralité de molécules d’ARN non coiffées, la matrice d’ADN utilisée dans la réaction de TIV peut être éliminée. Par exemple, la matrice d'ADN peut être éliminée par traitement par DNase. Après traitement par DNase, la réaction de TIV peut être terminée par chauffage, refroidissement ou mise en contact de la solution contenant les molécules d'ARN avec un agent chélatant. Un exemple non limitant de agent chélatant peut inclure la 8-hydroxyquinoline, le carboplatine, VEDTA, l’EGTA, le bromure d’hexadécylpyridinum ou le tartrate de sodium. Avant le coiffage, les molécules d’ARN non coiffées peuvent être dénaturées (par ex., par chauffage à 65 °C pendant 5 minutes). La température de la dénaturation et la durée de la dénaturation peuvent varier. Dans certains modes de réalisation, la dénaturation des molécules d’ARN non coiffées n’est pas réalisée avant la réaction de coiffage.

Dans certains modes de réalisation, l'efficacité de coiffage peut être déterminée en divisant la quantité de molécules d’ARN non coiffées par la quantité de molécules d’ARN coiffées pour obtenir un rapport d'ARN non coiffé/ARN coiffé. Par exemple, mais sans s’y limiter, une chromatographie liquide couplée à une mesure d’absorbance UV et à une spectrométrie de masse (CL-UV-SM) peut être utilisée pour évaluer les concentrations de molécules d’ARN coiffées ou non coiffées. Dans certains modes de réalisation, les concentrations des molécules d’ARN non coiffées et des molécules d’ARN coiffées sont calculées sur la base des mesures lues d’absorbance des molécules éluées telles qu’identifiées par spectrométrie de masse en ligne.

L'efficacité de coiffage est calculée sur la base des concentrations calculées. Dans certains modes de réalisation, l'efficacité de coiffage est calculée directement sur la base des mesures lues d’absorbance des molécules d’ARN coiffées et des molécules d’ARN non coiffées.

Dans certains modes de réalisation, la dilution de la première solution permet un coiffage de l'ARN non coiffé, où après la réaction de coiffage le rapport d’ARN non coiffé/ARN coiffé est d’au plus 1,0, d'au plus 0,8, d’au plus 0,6, d'au plus 0,4, d'au plus 0,2, d’au plus 0,1, d'au plus 0,09, d’au plus 0,08, d’au plus 0,07, d’au plus 0,06, d’au plus 0,05, d’au plus 0,04, d'au plus 0,03, d'au plus 0,02, d'au plus 0,01, d'au

12 BE2022/5035 plus 0,001 ou d'au plus 0,0001. Dans certains modes de réalisation, le rapport entre une pluralité de molécules d’ARN non coiffées et la pluralité de molécules d'ARN coiffées est entre environ 0,001 à environ 10. Dans certains modes de réalisation, le rapport entre une pluralité de molécules d'ARN non coiffées et la pluralité de molécules d’ARN coiffées est entre environ 0,001 à environ 0,002, environ 0,001 à environ 0,005, environ 0,001 à environ 0,01, environ 0,001 à environ 0,02, environ 0,001 à environ 0,05, environ 0,001 à environ 0,1, environ 0,001 à environ 0,2, environ 0,001 à environ 0,5, environ 0,001 à environ 1, environ 0,001 à environ 5, environ 0,001 à environ 10, environ 0,002 à environ 0,005, environ 0,002 à environ

0,01, environ 0,002 à environ 0,02, environ 0,002 à environ 0,05, environ 0,002 à environ 0,1, environ 0,002 à environ 0,2, environ 0,002 à environ 0,5, environ 0,002 à environ 1, environ 0,002 à environ 5, environ 0,002 à environ 10, environ 0,005 à environ 0,01, environ 0,005 à environ 0,02, environ 0,005 à environ 0,05, environ 0,005 à environ 0,1, environ 0,005 à environ 0,2, environ 0,005 à environ 0,5, environ 0,005 à environ 1, environ 0,005 à environ 5, environ 0,005 à environ 10, environ 0,01 à environ 0,02, environ 0,01 à environ 0,05, environ 0,01 à environ 0,1, environ 0,01 à environ 0,2, environ 0,01 à environ 0,5, environ 0,01 à environ 1, environ 0,01 à environ 5, environ 0,01 à environ 10, environ 0,02 à environ 0,05, environ 0,02 à environ 0,1, environ 0,02 à environ 0,2, environ 0,02 à environ 0,5, environ 0,02 à environ 1, environ 0,02 à environ 5, environ 0,02 à environ 10, environ 0,05 à environ 0,1, environ 0,05 à environ 0,2, environ 0,05 à environ 0,5, environ 0,05 à environ 1, environ 0,05 à environ 5, environ 0,05 à environ 10, environ 0,1 à environ 0,2, environ 0,1 à environ 0,5, environ 0,1 à environ 1, environ 0,1 à environ 5, environ 0,1 à environ 10, environ 0,2 à environ 0,5, environ 0,2 à environ 1, environ 0,2 à environ 5, environ 0,2 à environ 10, environ 0,5 à environ 1, environ 0,5 à environ 5, environ 0,5 à environ 10, environ 1 à environ 5, environ 1 à environ 10, ou environ 5 à environ 10. Dans certains modes de réalisation, le rapport entre une pluralité de molécules d'ARN non coiffées et la pluralité de molécules d’ARN coiffées est d'environ 0,001, d’environ 0,002, d’environ 0,005, d'environ 0,01, d'environ 0,02, d’environ 0,05, d'environ 0,1, d'environ 0,2, d'environ 0,5, d'environ 1, d’environ 5, ou d'environ 10. Dans certains modes de réalisation, le rapport entre une pluralité de molécules d'ARN non coiffées et la pluralité de molécules d’ARN coiffées est d'au moins environ 0,001, environ 0,002, environ 0,005, environ 0,01, environ 0,02, environ 0,05, environ 0,1, environ 0,2, environ 0,5, — environ 1, ou environ 5. Dans certains modes de réalisation, le rapport entre une pluralité de molécules d’ARN non coiffées et la pluralité de molécules d’ARN coiffées

13 BE2022/5035 est d’au plus environ 0,002, environ 0,005, environ 0,01, environ 0,02, environ 0,05, environ 0,1, environ 0,2, environ 0,5, environ 1, environ 5, ou environ 10.

Dans certains modes de réalisation, la réaction de coiffage peut être réalisée à une inhibition réduite ou absente par la dilution de la première solution pour former la deuxième solution, où aucune purification ou filtration additionnelle n’est nécessaire.

Par exemple, la réaction de coiffage est effectuée par la méthode décrite ici sans avoir besoin d'utiliser une chromatographie pour tout d'abord purifier l'ARN non coiffé. Dans certains modes de réalisation, le mélange réactionnel de TIV (par ex., la première solution avant dilution) n’est pas purifié ou filtré (par ex., par chromatographie ou filtration conventionnelle) avant la réaction de coiffage. Dans certains modes de réalisation, la deuxième solution avant d’être mise en contact avec l’'enzyme de coiffage et les réactifs pour la réaction de coiffage est filtrée pour reconcentrer la pluralité de molécules d’ARN non coiffées. Dans certains modes de — réalisation, la deuxième solution avant la réalisation de la réaction de coiffage n’est pas filtrée ou purifiée. Dans certains modes de réalisation, la solution après la réaction de coiffage contenant une pluralité de molécules d’ARN coiffées n’est pas purifiée ou filtrée (par ex., par chromatographie ou filtration conventionnelle) avant d’être formulée dans une composition ou une composition pharmaceutique décrite ici ou d'être utilisée pour toute autre application où un acide nucléique coiffé peut être utilisé. Dans certains modes de réalisation, la solution contenant une pluralité de molécules d’ARN coiffées après la réaction de coiffage est purifiée ou filtrée.

Dans certains modes de réalisation, la première solution peut être diluée par un facteur d'au moins 2, d'au moins 3, d'au moins 4, d'au moins 5, d’au moins 6, d'au moins 7, d'au moins 8, d'au moins 9, d'au moins 10, d'au moins 12, d'au moins 12, d'au moins 14, d'au moins 16, d'au moins 18, d'au moins 20, d'au moins 30, d’au moins 40, d'au moins 50, d'au moins 60, d'au moins 70, d'au moins 80, d'au moins 90, d’au moins 100 ou d’au moins 1 000 pour former une deuxième solution, où la réaction de coiffage peut se produire dans la deuxième solution après mise en contact des molécules d’ARN non coiffées avec des agents de coiffage, par exemple des enzymes de coiffage, en présence de, par exemple, des substrats d’enzyme, des tampons de réaction de coiffage, des sels, et autres réactifs. Dans certains modes de réalisation, la première solution est diluée par un facteur d'environ 1 à environ 100.

Dans certains modes de réalisation, la première solution est diluée par un facteur d'environ 1 à environ 5, d’environ 1 à environ 10, d'environ 1 à environ 20, d'environ 1 à environ 30, d'environ 1 à environ 40, d’environ 1 à environ 50, d’environ 1 à

14 BE2022/5035 environ 60, d'environ 1 à environ 70, d’environ 1 à environ 80, d’environ 1 à environ 100, d’environ 2 à environ 5, d'environ 2 à environ 10, d'environ 2 à environ 20, d'environ 2 à environ 30, d’environ 2 à environ 40, d'environ 2 à environ 50, d'environ 2 à environ 60, d’environ 2 à environ 70, d'environ 2 à environ 80, d’environ 2 à environ 100, d'environ 5 à environ 10, d'environ 5 à environ 20, d'environ 5 à environ 30, d'environ 5 à environ 40, d'environ 5 à environ 50, d'environ 5 à environ 60, d'environ 5 à environ 70, d’environ 5 à environ 80, d’environ 5 à environ 100, d'environ 10 à environ 20, d’environ 10 à environ 30, d'environ 10 à environ 40, d'environ 10 à environ 50, d’environ 10 à environ 60, d'environ 10 à environ 70, d'environ 10 à environ 80, d’environ 10 à environ 100, d’environ 20 à environ 30, d'environ 20 à environ 40, d’environ 20 à environ 50, d’environ 20 à environ 60, d’environ 20 à environ 70, d'environ 20 à environ 80, d'environ 20 à environ 100, d'environ 30 à environ 40, d’environ 30 à environ 50, d’environ 30 à environ 60, d'environ 30 à environ 70, d’environ 30 à environ 80, d'environ 30 à environ 100, d’environ 40 à environ 50, d’environ 40 à environ 60, d’environ 40 à environ 70, d'environ 40 à environ 80, d'environ 40 à environ 100, d'environ 50 à environ 60, d'environ 50 à environ 70, d’environ 50 à environ 80, d'environ 50 à environ 100, d'environ 60 à environ 70, d'environ 60 à environ 80, d'environ 60 à environ 100, d'environ 70 à environ 80, d’environ 70 à environ 100, ou d’environ 80 à environ 100. Dans certains modes de réalisation, la première solution est diluée par un facteur d'environ 1, d'environ 2, d'environ 5, d'environ 10, d'environ 20, d'environ 30, d'environ 40, d'environ 50, d’environ 60, d'environ 70, d'environ 80, ou d'environ 100. Dans certains modes de réalisation, la première solution est diluée par un facteur d’au moins environ 1, environ 2, environ 5, environ 10, environ 20, environ 30, environ 40, environ 50, environ 60, environ 70 ou environ 80. Dans certains modes de réalisation, la première solution est diluée par un facteur d’au plus environ 2, environ 5, environ 10, environ 20, environ 30, environ 40, environ 50, environ 60, environ 70, environ 80 ou environ 100.

Dans certains modes de réalisation, la première solution peut être diluée dans le même récipient que celui où la TIV et la réaction de coiffage se produisent. Par exemple, un volume de diluant peut être ajouté à la première solution dans le même récipient pour former une seconde solution (diluée). Dans certains modes de réalisation, tout diluant qui est inerte et n’interfère pas avec la réaction de coiffage des molécules d’ARN ou d'ARNm non coiffées peut être utilisé. Dans certains modes de réalisation, le diluant est de l’eau.

15 BE2022/5035

Dans certains modes de réalisation, la première solution peut être diluée en mélangeant une portion de la première solution avec un diluant dans un second récipient pour former la seconde solution (diluée). Dans certains cas, la deuxième solution peut subir un échange de tampon pour un tampon adéquat ou des conditions de solution pour qu’un traitement supplémentaire se produise. Dans certains modes de réalisation, la deuxième solution peut être davantage purifiée (par ex., par chromatographie) ou concentrée (par ex., par filtration ou ultrafiltration) avant la réaction de coiffage. Dans certains modes de réalisation, le volume de la deuxième solution peut être diminué avant la réaction de coiffage (par ex., par filtration ou ultrafiltration). Par exemple, la deuxième solution peut être reconcentrée par mise en contact avec une membrane filtrante (par ex., une membrane filtrante ayant un seuil de coupure à 10 kDa) pour éliminer le fluide en excès. Dans certains modes de réalisation, la membrane peut avoir un seuil de coupure de poids moléculaire (PMCO) d’au moins 1 kDa, 3 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 25 kDa, 30 kDa, 35 kDa, 40 kDa, 45 kDa, 50 kDa, 55 kDa, 60 kDa, 65 kDa, 70 kDa, 75 kDa, 80 kDa, 85 kDa, 90 kDa, 95 kDa, 100 kDa, 200 kDa, 300 kDa, 400 kDa, 500 kDa, 600 kDa, 700 kDa, 750 kDa, 800 kDa, 900 kDa, 1000 kDa, 2000 kDa, 3000 kDa, 4 000 kDa, 5 000 kDa, ou tout PMCO entre deux quelconques des plages décrites ici. Dans certains modes de réalisation, le PMCO est d'au moins environ 30 kDa à au moins environ 100 kDa. Dans certains modes de réalisation, le PMCO est d’au moins environ 30 kDa à au moins environ 500 kDa. Dans certains modes de réalisation, le PMCO est d'au moins environ 30 kDa à au moins environ 1 000 kDa. Dans certains modes de réalisation, la deuxième solution peut être purifiée ou reconcentrée avant la réaction de coiffage. Dans certains modes de réalisation, la deuxième solution peut être purifiée ou reconcentrée avant la réaction de coiffage. Dans certains modes de réalisation, la deuxième solution ne peut être purifiée qu'avant la réaction de coiffage.

Dans certains modes de réalisation, la deuxième solution ne peut être concentrée qu'avant la réaction de coiffage.

Dans certains modes de réalisation, la dilution de la première solution pour former la deuxième solution crée une augmentation de volume, où la deuxième solution peut être concentrée (par ex., par filtration ou ultrafiltration) pour éliminer un volume en excès avant la réaction de coiffage. Dans certains modes de réalisation, la dilution de la première solution pour former la deuxième solution ne crée pas de volume en — excès selon les besoins des réactions en aval et la réaction de coiffage peut être initiée directement dans la deuxième solution. Dans certains modes de réalisation, les molécules d’ARN coiffées peuvent alors être purifiées à partir de la deuxième

16 BE2022/5035 solution et formulées davantage (par ex., dans une composition pharmaceutique décrite ici) par l'intermédiaire de divers procédés en aval. Dans certains modes de réalisation, des procédés additionnels peuvent être réalisés après la réaction de coiffage pour produire une composition pharmaceutique finale. Par exemple, les molécules d'ARN ou d'ARNm coiffées fonctionnent comme des matrices pour la synthèse de peptides ou de protéines. Les molécules d’ARN coiffées peuvent également être encapsulées dans ou adsorbées sur des nanoparticules lipidiques (LNP) ou d’autres systèmes d'administration d’ARN pour la production de vaccins à

ARNm.

Dans certains modes de réalisation, la méthode comprend tout d’abord la synthèse des molécules d’ARN ou ARNm non coiffées. Par exemple, les molécules d’ARN non coiffées peuvent être synthétisées à partir d’une transcription in vitro (TIV). Dans certains modes de réalisation, la réaction de TIV peut être réalisée dans l’un quelconque des récipients du système décrit ici. Dans certains modes de réalisation, la réaction de TIV se produit dans un réacteur continu. Dans certains modes de réalisation, la réaction de TIV se produit dans un réacteur discontinu. Dans certains modes de réalisation, la réaction de TIV peut être terminée par inactivation d’ARN polymérase dans la solution. L'ARN polymérase peut être inactivée par chauffage, refroidissement, ajout d’un chélateur (par ex., EDTA), ou une combinaison de ceux- ci. Les exemples non limitants d’ARN polymérase qui peuvent être utilisés pour synthétiser les molécules d’ARN non coiffées par l'intermédiaire d’une TIV peuvent inclure la T3 ARN polymérase, la T7 ARN polymérase, la SP6 ARN polymérase. Dans certains modes de réalisation, la méthode comprend la dégradation de la matrice — d’ADN après TIV.

Dans certains modes de réalisation, la méthode comprend la mise en contact de la deuxième solution (comprenant la pluralité diluée de molécules qui inhibe la réaction de coiffage), avec une enzyme de coiffage et autres réactifs pour initier la réaction de coiffage dans la deuxième solution. Les exemples non limitants d’enzyme de coiffage incluent VARNm (nucléoside-2’-O-)-méthyltransférase spécifique de coiffe,

Venzyme de coiffage de Vaccinia (VCE), l’enzyme de coiffage du virus de la maladie de la langue bleue, l’enzyme de coiffage du virus de la chlorelle, l'enzyme de coiffage de S. cerevisiae, l’enzyme de coiffage de mimivirus, l’enzyme de coiffage du virus de la peste porcine africaine, ou l’enzyme de coiffage de réovirus aviaire. Les exemples non limitants d'autres réactifs peuvent inclure VARNm (nucléoside-2"-O-)- méthyltransférase spécifique de coiffe, la 2'-O-méthyltransférase, un sel de

17 BE2022/5035 magnésium, le guanosine-5'-triphosphate, la S-adénosyIméthionine, les agents de tamponnement, un inhibiteur de RNase. Les exemples non limitants de structures de coiffage formées durant la réaction de coiffage incluent GpppN, m7GpppN (Cap 0), m7GpppméA, m7GpppmlA, m7GpppNm (Cap 1), m2,7GpppNm, m2,2,7GpppNm, m7Gpppm6Am, m7GpppmiAm, m7GpppNmpNm (Cap 2), m7GpppNmpNmpNm (Cap 3), m7GpppNmpNmpNmpNm (Cap 4), où N représente tout nucléotide, A l’adénosine, G la guanosine, m un groupe méthyle et p un groupe phosphate. Dans certains modes de réalisation, la structure de coiffage comprend un nucléotide modifié chimiquement. Dans certains modes de réalisation, la réaction de coiffage décrite ici donne une majorité d'une espèce de structure coiffée (par ex., Cap 1).

Dans certains modes de réalisation, la réaction de coiffage décrite ici donne d’autres structures de coiffe mineures telles qu’une coiffe non méthylée, Cap 0, Cap 2, ou autre.

Dans certains modes de réalisation, la première solution comprend des molécules d’ARN non coiffées. Dans certains modes de réalisation, les molécules d’ARN non coiffées peuvent inclure un ARN à chaîne longue, un ARN codant, un ARN non codant, un ARN long non codant, un ARN à simple brin (ARNsb), un ARN à double brin (ARNdb), un ARN linéaire (ARNIin), un ARN circulaire (ARNcirc), un ARN messager (ARNm), un ARNm auto-amplificateur (SAM), un ARNm trans-amplificateur, des oligonucléotides d’ARN, des oligonucléotides antisens, des petits ARN interférents (petits ARNi), un petit ARN en épingle à cheveux (ARNsh), un ARN antisens (ARNas), des ARN guides CRISPR/Cas9, des riborégulateurs, un ARN immunostimulateur (ARNis), des ribozymes, des aptamères, un ARN ribosomique (ARNr), un ARN de transfert (ARNt), un ARN viral (ARNv), un ARN rétroviral ou un ARN réplicon, un petit

ARN nucléaire (petit ARNn), un petit ARN nucléolaire (petit ARNno), un microARN (MIARN), des ARN associés au site de départ de la transcription (TSSa), des ARN antisens en amont (ua), des produits de transcription en amont du promoteur (PROMPT), ou une combinaison de ceux-ci. Dans certains modes de réalisation, les molécules d’ARN non coiffées comprennent au moins une modification chimique comprenant une modification du squelette, une modification de sucre, ou une modification de base. Dans ce contexte, une molécule d’ARN modifiée comprend des modifications de nucléotide, par ex. des modifications de squelette, des modifications de sucre ou des modifications de base. Une modification de sucre en lien avec la présente divulgation est une modification chimique du sucre des nucléotides de la molécule d’ARN. En outre, une modification de base en lien avec la présente divulgation est une modification chimique du groupement de base des nucléotides de la molécule d’ARN. Dans ce contexte, les modifications de nucléotide sont

18 BE2022/5035 sélectionnées parmi les modifications de nucléotide qui sont applicables à une transcription et/ou à une traduction. Dans des modes de réalisation supplémentaires, l'ARN modifié comprend des modifications de nucléoside sélectionnées parmi la 6- aza-cytidine, la 2-thio-cytidine, l’a-thio-cytidine, la pseudo-iso-cytidine, la 5- aminoallyl-uridine, la 5-iodo-uridine, la N1-méthyl-pseudouridine, la 5,6- dihydrouridine, l’a-thio-uridine, la 4-thio-uridine, la 6-aza-uridine, la 5-hydroxy- uridine, la désoxy-thymidine, la 5-méthyl-uridine, la pyrrolo-cytidine, l’inosine, l’a- thio-guanosine, la 6-méthyl-guanosine, la 5-méthyl-cytidine, la 8-oxo-guanosine, la 7-déaza-guanosine, la N1-méthyl-adénosine, la 2-amino-6-chloro-purine, la N6- méthyl-2-amino-purine, la pseudo-iso-cytidine, la 6-chloro-purine, la N6-méthyl- adénosine, l’a-thio-adénosine, la 8-azido-adénosine, la 7-déaza-adénosine, et une combinaison de celles-ci.

Dans certains modes de réalisation, la méthode comprend la dilution d’un mélange réactionnel de TIV pour réaliser une réaction de coiffage sans inhibition. Dans certains modes de réalisation, le mélange réactionnel de TIV (par ex., la première solution comprenant une pluralité de molécules d’ARN non coiffées avant dilution) n’est pas purifié (par ex., par chromatographie conventionnelle ou autres méthodes de purification adéquates) avant la réaction de coiffage. Dans certains modes de réalisation, la solution avant ou après réaction de coiffage (par ex., la deuxième solution avant ou après avoir été mise en contact avec l’enzyme de coiffage et autres réactifs pour la réaction de coiffage) n’est pas purifiée (par ex., par chromatographie conventionnelle ou autres méthodes de purification). Dans certains modes de réalisation, la deuxième solution diluée ne passe pas par une étape de filtration ou toute autre étape adéquate pour éliminer l’augmentation de volume. Dans certains modes de réalisation, l'efficacité de la réaction de coiffage de la deuxième solution est augmentée en raison de la dilution du mélange réactionnel de TIV et non en raison de la purification additionnelle de la deuxième solution. Dans certains modes de réalisation, la dilution du mélange réactionnel de TIV diminue la concentration de la pluralité de molécules qui inhibe la réaction de coiffage, augmentant ainsi l'efficacité de la réaction de coiffage dans le mélange réactionnel de TIV dilué. Dans certains modes de réalisation, la solution diluée, après réaction de coiffage, peut être reconcentrée ou purifiée avant d’être formulée dans une composition ou une composition pharmaceutique décrite ici ou d’être utilisée pour toute autre application où un ARN coiffé peut être utilisé.

19 BE2022/5035

Dans certains modes de réalisation, la méthode comprend la dilution du mélange réactionnel de TIV suivie de l'élimination du volume de fluide en excès par filtration ou autres méthodes adéquates pour concentrer la molécule d'ARN non coiffée pour un traitement en aval. Dans certains modes de réalisation, la dilution ou l’élimination du volume de fluide en excès (par l'intermédiaire d’une filtration ou d’autres méthodes adéquates) diminue la concentration ou élimine la majorité de la pluralité de molécules qui inhibe la réaction de coiffage, augmentant ainsi l’efficacité de la réaction de coiffage. Dans certains modes de réalisation, la deuxième solution diluée puis reconcentrée (par ex., par l'intermédiaire d’une filtration), après réaction de coiffage, peut être davantage purifiée, concentrée et/ou filtrée avant de passer par une série d'étapes de procédé en aval pour être formulée dans une composition ou une composition pharmaceutique décrite ici ou d'être utilisée pour toute autre application où un acide nucléique coiffé peut être utilisé.

Dans certains modes de réalisation, la méthode comprend la dilution du mélange réactionnel de TIV suivie de l’élimination du volume de fluide augmenté par ultrafiltration ou microfiltration pour concentrer la molécule d'acide nucléique non coiffée (par ex., molécule d’ARN non coiffée) pour un traitement en aval. Dans certains modes de réalisation, la méthode comprend la dilution du mélange réactionnel de TIV suivie de l’élimination du volume de fluide augmenté par filtration à écoulement tangentiel pour concentrer les molécules d’ARN non coiffées. Dans certains modes de réalisation, la dilution ou l’élimination du volume de fluide en excès (par l'intermédiaire d’une ultrafiltration utilisant une membrane capable de retenir les molécules d'ARN non coiffées) diminue la concentration de la pluralité de — molécules qui inhibe la réaction de coiffage, augmentant ainsi l'efficacité de la réaction de coiffage dans le mélange réactionnel de TIV. Dans certains modes de réalisation, le mélange réactionnel de TIV dilué puis reconcentré (par ex., par l'intermédiaire d’une ultrafiltration), après réaction de coiffage, peut être davantage purifié, concentré et/ou filtré avant d’être formulé dans une composition ou une composition pharmaceutique décrite ici ou d'être utilisé pour toute autre application où un ARN coiffé peut être utilisé.

Production de biomolécules

Dans certains cas de la présente divulgation, les systèmes et méthodes décrits ici sont conçus pour accueillir un(e) réaction/procédé ou une partie d’un(e) réaction/procédé ayant lieu dans le système. Dans certains cas, la réaction porte sur le traitement d’une pluralité de molécules d’ARN non coiffées de sorte qu’une réaction

20 BE2022/5035 de coiffage consistant à ajouter une structure de coiffe à une molécule d’ARN non coiffée peut se dérouler sans interférence ou inhibition. Dans certains cas, le procédé comprend également des étapes afférentes à la traduction in vitro (acellulaire) d'ARN en protéine. Dans certains cas, la réaction est afférente à une combinaison des deux procédés, à savoir, d'ADN en ARN par le biais d’une transcription et d'ARN en une protéine par le biais d’une traduction.

Dans certains cas, la transcription in vitro porte sur un procédé dans lequel de l'ARN est synthétisé dans un système acellulaire (in vitro). Dans certains cas, des vecteurs de clonage d’ADN, en particulier des vecteurs d’ADN plasmidique, sont appliqués en tant que matrice pour la génération de produits de transcription d’ARN suivant la linéarisation d'ADN plasmidique circulaire. Ces vecteurs de clonage sont généralement conçus sous la forme d’un vecteur de transcription. L'ARN peut être obtenu par transcription in vitro dépendante de VADN d’une matrice d’ADN … appropriée. Un promoteur pour contrôler la transcription d’ARN in vitro peut être tout promoteur pour toute ARN polymérase dépendante de l'ADN. Dans certains modes de réalisation, une ARN polymérase virale se lie à un promoteur viral qui est au moins un promoteur sélectionné dans la liste constituée de T7, T3, T7lac, SP6, pL, pR, CMV,

SV40 et CaMV35S. En variante ou en combinaison, le fragment d'acide nucléique comprenant la séquence de promoteur comprend un promoteur bactérien. Dans certains cas, une ARN polymérase bactérienne se lie à un promoteur bactérien qui est au moins un promoteur sélectionné dans la liste constituée d’araBAD, trp, lac et

Ptac. Dans certains cas, le fragment d'acide nucléique comprenant la séquence de promoteur comprend un promoteur eucaryote. Dans certains cas, l'ARN polymérase — eucaryote se lie à un promoteur eucaryote qui est au moins un promoteur sélectionné dans la liste constituée d’EFla, PGK1, Ubc, bêta actine, CAG, TRE, UAS, Ac5,

Polyhédrine, CaMKIIa, ALB, GAL1, GAL10, TEF1, GDS, ADH1, Ubi, H1 et U6. Dans certains cas, le promoteur eucaryote est au moins un promoteur sélectionné dans la liste constituée d’un promoteur d’ARN pol I, d’un promoteur d’ARN pol II et d’un — promoteur d’ARN pol III.

Dans certains cas, les ARN polymérases dépendantes de l'ADN comprennent au moins l’une d’une T7 ARN polymérase, d’une T3 ARN polymérase, d’une SP6 ARN polymérase, d’une ARN polymérase I, d’une ARN polymérase II, d'une ARN — polymérase III, d'une ARN polymérase IV, d'une ARN polymérase V, et d’une ARN polymérase à une seule sous-unité. La matrice d’ADN pour transcription d’ARN in vitro peut être obtenue par clonage d’un acide nucléique, en particulier d'un ADNc

21 BE2022/5035 correspondant à ARN respectif devant être transcrit in vitro, et introduction de celui- ci dans un vecteur approprié pour la transcription d’ARN in vitro, par exemple dans un ADN plasmidique circulaire qui est introduit dans un hôte tel qu’une bactérie.

L'ADNc peut être obtenu par transcription inverse d’ARNm ou synthèse chimique. De plus, la matrice d'ADN pour synthèse d’ARN in vitro peut également être obtenue par synthèse de gènes ou par des réactions d'amplification, incluant une réaction en chaîne par polymérase (PCR).

Dans certains cas, la matrice d’ADN porte sur une molécule d'ADN comprenant une sequence d'acide nucléique codant pour la séquence d’ARN. L'ADN matrice est utilisé en tant que matrice pour la transcription d’ARN in vitro afin de produire ARN codé par l'ADN matrice. Par conséquent, l'ADN matrice comprend tous les éléments nécessaires à la transcription d’ARN in vitro, en particulier un élément de promoteur pour la liaison d’une ARN polymérase dépendante de l'ADN comme par ex. les ARN polymérases T3, T7 et SP6 en 5’ de la séquence d'ADN codant pour la séquence d’ARN cible. La queue poly(A) peut être soit codée dans la matrice d’ADN soit ajoutée enzymatiquement à ARN dans une étape séparée après transcription in vitro. Dans certains cas, l'ADN matrice comprend des sites de liaison d'amorce en 5’ et/ou 3’ de la séquence d’ADN codant pour la séquence d’ARN cible pour déterminer l'identité de la séquence d’ADN codant pour la séquence d'ARN cible par ex. par PCR ou séquençage d'ADN. Dans certains cas, la matrice d’ADN comprend une UTR en 5’ ou une UTR en 3’. Dans certains cas, la matrice d'ADN comprend un vecteur d’ADN, tel qu’un ADN plasmidique, qui comprend une séquence d'acide nucléique codant pour la séquence d’ARN. Dans certains cas, la matrice d'ADN comprend une molécule — d'ADN linéaire ou circulaire.

Dans certains cas de la présente divulgation, une matrice d'ADN code pour une espèce moléculaire d’ARN différente. Dans certains cas la matrice d’ADN contient un promoteur sub-génomique et un grand cadre ouvert de lecture codant pour des protéines non structurelles qui, suivant l’administration du composé biopharmaceutique dans le cytosol, sont transcrites dans quatre composants fonctionnels (nsP1, nsP2, nsP3 et nsp4) par ARN polymérase dépendante de ARN codée (RDRP). La RDRP produit alors une copie en sens négatif du génome qui sert de matrice pour deux molécules d’ARN à brin positif : VARNm génomique et un ARNm — sub-génomique plus court. Cet ARNm sub-génomique est transcrit à des niveaux très élevés, permettant l’amplification d'un ARNm codant pour l’antigène de choix. Une espèce moléculaire d’ARN différente peut coder pour un antigène de différents

22 BE2022/5035 sérotypes ou souches d’un pathogène, un allergène différent, un antigène auto- immun différent, un antigène différent d’un pathogène, des protéines adjuvantes différentes, une isoforme ou un variant différent(e) d’un antigène de cancer ou de tumeur, un antigène de tumeur différent d’un patient, un anticorps parmi un groupe d'anticorps qui ciblent différents épitopes d’une protéine ou d’un groupe de protéines, différentes protéines d’une voie métabolique, une seule protéine parmi un groupe de protéines qui font défaut chez un sujet, ou une isoforme différente d’une protéine pour une thérapie moléculaire.

Dans certains modes de réalisation, les molécules d'ARN coiffées par la méthode décrite ici comprennent une région codante d’un peptide ou d’une protéine. Dans un tel cas, les molécules d’ARN coiffées servent de matrice pour la synthèse de peptides ou de protéines. Par exemple, les molécules d’ARN coiffées peuvent en outre être formulées dans une composition ou une composition pharmaceutique pour être administrées à un sujet, où la synthèse du peptide ou de la protéine se produit dans vivo. Dans certains modes de réalisation, le peptide ou la protéine peuvent être synthétisés directement à partir des molécules d'ARN coiffées dans un récipient du système soit identique soit différent. Le peptide ou la protéine synthétisé(e) in vitro peut alors être formulé(e) dans une composition ou une composition pharmaceutique. Dans certains modes de réalisation, le peptide ou la protéine codé(e) par les molécules d’ARN coiffées peut être prophylactique. Dans certains modes de réalisation, le peptide ou la protéine codé(e) par les molécules d’ARN coiffées peut être thérapeutique. Dans certains modes de réalisation, le peptide ou la protéine codé(e) par les molécules d’ARN coiffées comprend un poids moléculaire (PM) d’environ 1 kDa à environ 1 000 kDa. Dans certains modes de réalisation, le peptide ou la protéine codé(e) par les molécules d’ARN coiffées comprend un poids moléculaire (PM) d'environ 10 kDa à environ 20 kDa, d’environ 10 kDa à environ 50 kDa, d’environ 10 kDa à environ 100 kDa, d'environ 10 kDa à environ 200 kDa, d'environ 10 kDa à environ 300 kDa, d’environ 10 kDa à environ 400 kDa, d'environ 10 kDa à environ 500 kDa, d'environ 10 kDa à environ 600 kDa, d’environ 10 kDa à environ 700 kDa, d’environ 10 kDa à environ 800 kDa, environ 10 kDa à environ 1 000 kDa, d'environ 20 kDa à environ 50 kDa, d’environ 20 kDa à environ 100 kDa, d'environ 20 kDa à environ 200 kDa, d’environ 20 kDa à environ 300 kDa, d'environ 20 kDa à environ 400 kDa, d'environ 20 kDa à environ 500 kDa, d’environ 20 kDa à — environ 600 kDa, d’environ 20 kDa à environ 700 kDa, d’environ 20 kDa à environ 800 kDa, d'environ 20 kDa à environ 1 000 kDa, d’environ 50 kDa à environ 100 kDa, d'environ 50 kDa à environ 200 kDa, d’environ 50 kDa à environ 300 kDa,

23 BE2022/5035 d'environ 50 kDa à environ 400 kDa, d’environ 50 kDa à environ 500 kDa, d'environ 50 kDa à environ 600 kDa, d'environ 50 kDa à environ 700 kDa, d’environ 50 kDa à environ 800 kDa, d'environ 50 kDa à environ 1 000 kDa, d’environ 100 kDa à environ 200 kDa, d’environ 100 kDa à environ 300 kDa, d’environ 100 kDa à environ 400 kDa, d’environ 100 kDa à environ 500 kDa, d’environ 100 kDa à environ 600 kDa, d’environ 100 kDa à environ 700 kDa, d’environ 100 kDa à environ 800 kDa, d’environ 100 kDa à environ 1 000 kDa, d'environ 200 kDa à environ 300 kDa, d’environ 200 kDa à environ 400 kDa, d’environ 200 kDa à environ 500 kDa, d'environ 200 kDa à environ 600 kDa, d’environ 200 kDBa à environ 700 kDa, d’environ 200 kDa à environ 800 kDa, d’environ 200 kDa à environ 1 000 kDa, d'environ 300 kDa à environ 400 kDa, d'environ 300 kDa à environ 500 kDa, d'environ 300 kDa à environ 600 kDa, d’environ 300 kDa à environ 700 kDa, d’environ 300 kDa à environ 800 kDa, d’environ 300 kDa à environ 1 000 kDa, d'environ 400 kDa à environ 500 kDa, d'environ 400 kDa à environ 600 kDa, d'environ 400 kDa à environ 700 kDa, d’environ 400 kDa à environ 800 kDa, d’environ 400 kDa à environ 1 000 kDa, d'environ 500 kDa à environ 600 kDa, d’environ 500 kDa à environ 700 kDa, d’environ 500 kDa à environ 800 kDa, d’environ 500 kDa à environ 1 000 kDa, d'environ 600 kDa à environ 700 kDa, d’environ 600 kDa à environ 800 kDa, d’environ 600 kDa à environ 1 000 kDa, d'environ 700 kDa à environ 800 kDa, d'environ 700 kDa à environ 1 000 kDa, ou d'environ 800 kDa à environ 1 000 kDa. Dans certains modes de réalisation, le peptide ou la protéine codé(e) par les molécules d’ARN coiffées comprend un poids moléculaire (PM) d’environ 10 kDa, d'environ 20 kDa, d'environ 50 kDa, d'environ 100 kDa, d'environ 200 kDa, d'environ 300 kDa, d'environ 400 kDa, d'environ 500 kDa, d'environ 600 kDa, d'environ 700 kDa, d'environ 800 kDa ou d’environ 1 000 kDa. Dans certains modes de réalisation, le peptide ou la protéine codé(e) par les molécules d’ARN coiffées comprend un poids moléculaire (PM) d'au moins environ 10 kDa, environ 20 kDa, environ 50 kDa, environ 100 kDa, environ 200 kDa, environ 300 kDa, environ 400 kDa, environ 500 kDa, environ 600 kDa, environ 700 kDa ou environ 800 kDa. Dans certains modes de réalisation, le peptide ou la protéine codé(e) par les molécules d’ARN coiffées comprend un poids moléculaire (PM) d’au plus environ 20 kDa, environ 50 kDa, environ 100 kDa, environ 200 kDa, environ 300 kDa, environ 400 kDa, environ 500 kDa, environ 600 kDa, environ 700 kDa, environ 800 kDa ou environ 1 000 kDa.

Dans certains modes de réalisation, le peptide ou la protéine codé(e) par les molécules d’ARN coiffées comprend un poids moléculaire (PM) d’au plus environ

24 BE2022/5035

10 kDa à environ 1 000 kDa.

Dans certains modes de réalisation, le peptide ou la protéine codé(e) par les molécules d’ARN coiffées comprend un poids moléculaire

(PM) d'au plus environ 10 kDa à environ 20 kDa, environ 10 kDa à environ 50 kDa, environ 10 kDa à environ 100 kDa, environ 10 kDa à environ 200 kDa, environ kDa à environ 300 kDa, environ 10 kDa à environ 400 kDa, environ 10 kDa à environ 500 kDa, environ 10 kDa à environ 600 kDa, environ 10 kDa à environ

700 kDa, environ 10 kDa à environ 800 kDa, environ 10 kDa à environ 1 000 kDa, environ 20 kDa à environ 50 kDa, environ 20 kDa à environ 100 kDa, environ 20 kDa à environ 200 kDa, environ 20 kDa à environ 300 kDa, environ 20 kDa à environ

10 400 kDa, environ 20 kDa à environ 500 kDa, environ 20 kDa à environ 600 kDa, environ 20 kDa à environ 700 kDa, environ 20 kDa à environ 800 kDa, environ

20 kDa à environ 1 000 kDa, environ 50 kDa à environ 100 kDa, environ 50 kDa à environ 200 kDa, environ 50 kDa à environ 300 kDa, environ 50 kDa à environ

400 kDa, environ 50 kDa à environ 500 kDa, environ 50 kDa à environ 600 kDa,

environ 50 kDa à environ 700 kDa, environ 50 kDa à environ 800 kDa, environ 50 kDa à environ 1 000 kDa, environ 100 kDa à environ 200 kDa, environ 100 kDa à environ 300 kDa, environ 100 kDa à environ 400 kDa, environ 100 kDa à environ

500 kDa, environ 100 kDa à environ 600 kDa, environ 100 kDa à environ 700 kDa, environ 100 kDa à environ 800 kDa, environ 100 kDa à environ 1 000 kDa, environ

200 kDa à environ 300 kDa, environ 200 kDa à environ 400 kDa, environ 200 kDa à environ 500 kDa, environ 200 kDa à environ 600 kDa, environ 200 kDa à environ

700 kDa, environ 200 kDa à environ 800 kDa, environ 200 kDa à environ 1 000 kDa, environ 300 kDa à environ 400 kDa, environ 300 kDa à environ 500 kDa, environ

300 kDa à environ 600 kDa, environ 300 kDa à environ 700 kDa, environ 300 kDa à

— environ 800 kDa, environ 300 kDa à environ 1 000 kDa, environ 400 kDa à environ 500 kDa, environ 400 kDa à environ 600 kDa, environ 400 kDa à environ 700 kDa, environ 400 kDa à environ 800 kDa, environ 400 kDa à environ 1 000 kDa, environ

500 kDa à environ 600 kDa, environ 500 kDa à environ 700 kDa, environ 500 kDa à environ 800 kDa, environ 500 kDa à environ 1 000 kDa, environ 600 kDa à environ

700 kDa, environ 600 kDa à environ 800 kDa, environ 600 kDa à environ 1 000 kDa, environ 700 kDa à environ 800 kDa, environ 700 kDa à environ 1 000 kDa, ou environ 800 kDa à environ 1 000 kDa.

Dans certains modes de réalisation, le peptide ou la protéine codé(e) par les molécules d’ARN coiffées comprend un poids moléculaire (PM) d'au plus environ 10 kDa, environ 20 kDa, environ 50 kDa, environ

100 kDa, environ 200 kDa, environ 300 kDa, environ 400 kDa, environ 500 kDa, environ 600 kDa, environ 700 kDa, environ 800 kDa ou environ 1 000 kDa.

Dans certains modes de réalisation, le peptide ou la protéine codé(e) par les molécules

25 BE2022/5035 d’ARN coiffées comprend un poids moléculaire (PM) d'au plus au moins environ 10 kDa, environ 20 kDa, environ 50 kDa, environ 100 kDa, environ 200 kDa, environ 300 kDa, environ 400 kDa, environ 500 kDa, environ 600 kDa, environ 700 kDa ou environ 800 kDa. Dans certains modes de réalisation, le peptide ou la protéine codé(e) par les molécules d’ARN coiffées comprend un poids moléculaire (PM) d'au plus au plus environ 20 kDa, environ 50 kDa, environ 100 kDa, environ 200 kDa, environ 300 kDa, environ 400 kDa, environ 500 kDa, environ 600 kDa, environ 700 kDa, environ 800 kDa ou environ 1 000 kDa.

Compositions

Est décrite ici une composition comprenant un agent ou une composition décrit(e) ici (par ex., les molécules d’ARN non coiffées après traitement telles que décrites ici).

Dans certains modes de réalisation, la composition comprend des substances ayant un PM de 400 kDa ou moins à une concentration de moins de 15 % v/v. Dans certains modes de réalisation, Ies substances comprennent un PM d'environ 20 kDa, d'environ 50 kDa, d'environ 100 kDa, d'environ 200 kDa, d'environ 300 kDa, d'environ 400 kDa, d'environ 500 kDa, d'environ 600 kDa, d'environ 700 kDa, d'environ 800 kDa ou d'environ 1 000 kDa. Dans certains modes de réalisation, les substances comprennent une concentration de moins de 30 % v/v, de moins de 25 % v/v, de moins de 20 % v/v, de moins de 19 % v/v, de moins de 18 % v/v, de moins de 17 % v/v, de moins de 16 % v/v, de moins de 15 % v/v, de moins de 14 % v/v, de moins de 13 % v/v, de moins de 12 % v/v, de moins de 11 % v/v, de moins de 10 % v/v, de moins de 9 % v/v, de moins de 8 % v/v, de moins de 7 % v/v, de moins de 6 % v/v, de moins de 5 % v/v, de moins de 4 % v/v, de moins de 3 % v/v, de moins de 2% v/v ou de moins de 1 % v/v.

Dans certains modes de réalisation, la composition comprend une pluralité de molécules d’ARN non coiffées en 5’, dans laquelle lesdites molécules d'ARN non coiffées sont obtenues au moyen d’une réaction de transcription in vitro, ladite composition comprend des réactifs pour une transcription in vitro, et dans laquelle la concentration d’ARN non coiffé dans ladite composition est inférieure à 20 mg/ml.

Dans certains modes de réalisation, la concentration de l’ARN non coiffé dans ladite composition comprend une plage entre environ 0,01 mg/ml à environ 20 mg/ml.

Dans certains modes de réalisation, la concentration de l’ARN non coiffé dans ladite composition comprend une plage entre environ 0,01 mg/ml à environ 0,02 mg/ml, environ 0,01 mg/ml à environ 0,05 mg/ml, environ 0,01 mg/ml à environ 0,1 mg/ml, environ 0,01 mg/ml à environ 0,2 mg/ml, environ 0,01 mg/ml à environ 0,5 mg/ml, environ 0,01 mg/ml à environ 1 mg/ml, environ 0,01 mg/ml à environ 2 mg/ml,

26 BE2022/5035 environ 0,01 mg/ml à environ 5 mg/ml, environ 0,01 mg/ml à environ 10 mg/ml, environ 0,01 mg/ml à environ 20 mg/ml, environ 0,02 mg/ml à environ 0,05 mg/ml, environ 0,02 mg/ml à environ 0,1 mg/ml, environ 0,02 mg/ml à environ 0,2 mg/ml, environ 0,02 mg/ml à environ 0,5 mg/ml, environ 0,02 mg/ml à environ 1 mg/ml,

environ 0,02 mg/ml à environ 2 mg/ml, environ 0,02 mg/ml à environ 5 mg/ml, environ 0,02 mg/ml à environ 10 mg/ml, environ 0,02 mg/ml à environ 20 mg/ml, environ 0,05 mg/ml à environ 0,1 mg/ml, environ 0,05 mg/ml à environ 0,2 mg/ml, environ 0,05 mg/ml à environ 0,5 mg/ml, environ 0,05 mg/ml à environ 1 mg/ml, environ 0,05 mg/ml à environ 2 mg/ml, environ 0,05 mg/ml à environ 5 mg/ml,

environ 0,05 mg/ml à environ 10 mg/ml, environ 0,05 mg/ml à environ 20 mg/ml, environ 0,1 mg/ml à environ 0,2 mg/ml, environ 0,1 mg/ml à environ 0,5 mg/ml, environ 0,1 mg/ml à environ 1 mg/ml, environ 0,1 mg/ml à environ 2 mg/ml, environ 0,1 mg/ml à environ 5 mg/ml, environ 0,1 mg/ml à environ 10 mg/ml, environ 0,1 mg/ml à environ 20 mg/ml, environ 0,2 mg/ml à environ 0,5 mg/ml, environ

0,2 mg/ml à environ 1 mg/ml, environ 0,2 mg/ml à environ 2 mg/ml, environ 0,2 mg/mI à environ 5 mg/ml, environ 0,2 mg/ml à environ 10 mg/ml, environ 0,2 mg/ml à environ 20 mg/ml, environ 0,5 mg/ml à environ 1 mg/ml, environ 0,5 mg/mI à environ 2 mg/ml, environ 0,5 mg/ml à environ 5 mg/ml, environ 0,5 mg/ml à environ 10 mg/ml, environ 0,5 mg/ml à environ 20 mg/ml, environ

1 mg/ml à environ 2 mg/ml, environ 1 mg/ml à environ 5 mg/ml, environ 1 mg/ml à environ 10 mg/ml, environ 1 mg/ml à environ 20 mg/ml, environ 2 mg/ml à environ 5 mg/ml, environ 2 mg/ml à environ 10 mg/ml, environ 2 mg/ml à environ 20 mg/MI, environ 5mg/ml à environ 10 mg/ml, environ 5 mg/mI à environ 20 mg/ml, ou environ 10 mg/ml à environ 20 mg/ml.

Dans certains modes de réalisation, la concentration de l’ARN non coiffé dans ladite composition comprend une plage entre environ 0,01 mg/ml, environ 0,02 mg/ml, environ 0,05 mg/ml, environ 0,1 mg/ml, environ 0,2 mg/ml, environ 0,5 mg/ml, environ 1 mg/ml, environ 2 mg/ml, environ 5 mg/ml, environ 10 mg/ml ou environ 20 mg/ml.

Dans certains modes de réalisation, la concentration de ARN non coiffé dans ladite composition comprend une plage entre au moins environ 0,01 mg/ml, environ 0,02 mg/ml, environ 0,05 mg/ml, environ 0,1 mg/ml, environ 0,2 mg/ml, environ 0,5 mg/ml, environ 1 mg/ml, environ 2 mg/ml, environ 5 mg/ml ou environ 10 mg/ml.

Dans certains modes de réalisation, la concentration de VARN non coiffé dans ladite composition comprend une plage entre au plus environ 0,02 mg/ml, environ

0,05 mg/ml, environ 0,1 mg/ml, environ 0,2 mg/ml, environ 0,5 mg/ml, environ 1mg/ml, environ 2 mg/ml, environ 5mg/ml, environ 10 mg/ml ou environ 20 mg/ml.

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Dans certains modes de réalisation, la composition comprend une pluralité de molécules d’ARN coiffées en 5’, dans laquelle une réaction de coiffage se produit de manière post-transcriptionnelle et dans laquelle un rapport entre une pluralité de molécules d'ARN non coiffées et la pluralité de molécules d’ARN coiffées est entre 0,0001 et 1. Dans certains modes de réalisation, la composition comprend une pluralité de molécules d’ARN coiffées en 5’, dans laquelle une réaction de coiffage se produit de manière post-transcriptionnelle et dans laquelle un rapport entre une pluralité de molécules d’ARN non coiffées et la pluralité de molécules d’ARN coiffées est entre 0,01 et 0,5. Dans certains modes de réalisation, la composition comprend les molécules d’ARN coiffées ou un peptide codé par les molécules d’ARN coiffées.

Dans certains modes de réalisation, les molécules d’ARN coiffées ou un peptide codé par les molécules d'ARN coiffées peuvent coder pour un antigène pour une formulation de vaccin. Dans certains modes de réalisation, les molécules d’ARN coiffées sont traitées davantage pour une formulation dans une composition de vaccin.

Dans certains modes de réalisation, la composition de vaccin comprend au moins une molécule d’ARN coiffée en 5’, où la molécule d’ARN coiffée en 5’ est une molécule d’ARNm coiffée en 5’. Dans certains modes de réalisation, au moins une molécule d’ARNm coiffée en 5’ peut être encapsulée dans une nanoparticule pour former une composition pharmaceutique. La nanoparticule peut comprendre des lipides, des glucides, des polypeptides, des polymères formés à partir d’un ou plusieurs monomères, ou toute combinaison de ceux-ci (incluant des combinaisons moléculaires de ces substances). Dans certains modes de réalisation, lau moins une molécule d’ARN coiffée en 5’ est complexée avec un polymère chargé, par ex. par interaction électrostatique.

Dans certains modes de réalisation, la composition pharmaceutique comprenant l’au moins une molécule d'ARNm coiffée en 5’ peut être formulée avec un lipide chargé ou un lipide aminé. Dans certains modes de réalisation, la composition pharmaceutique comprenant l’au moins une molécule d’ARNm coiffée en 5’ peut être formulée par complexation avec des lipides, des liposomes ou des lipoplexes. Par exemple, la complexation peut inclure la mise en contact de l’au moins une molécule — d’ARNm coiffée en 5’ avec un PEG-lipide ou un lipide zwitterionique comprenant un groupe de tête, où la charge positive est située près de la région de la chaîne acyle et la charge négative est située au niveau de l'extrémité distale du groupe de tête.

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Dans certains modes de réalisation, la composition pharmaceutique comprenant l’au moins une molécule d'ARNm coiffée en 5’ peut être formulée avec un vecteur de bicouche lipidique.

Dans certains modes de réalisation, la composition pharmaceutique comprenant l’au moins une molécule d'ARNm coiffée en 5’ comprend peut être formulée avec un polymère naturel ou synthétique. Les exemples non limitants de tels polymères peuvent inclure le chitosan ou la cyclodextrine. Dans certains modes de réalisation, la composition pharmaceutique comprenant l’au moins une molécule d’ARNm coiffée en 5’ comprend peut être formulée dans une formulation de polymère comprenant un polymère tel que des polyéthènes, un polyéthylène glycol (PEG), une poly(l-lysine) (PLL), un lipopolymère cationique, un lipopolymère cationique biodégradable, une polyéthylèneimine (PEI), des poly(alkylène imines) ramifiées réticulées, un dérivé de polyamine, un poloxamère modifié, un polymère biodégradable, un polymère biodégradable élastique, des polymères acryliques, un polymère contenant une amine, un polymère de dextrane, un dérivé de polymère de dextrane, ou une combinaison ceux-ci. Dans certains modes de réalisation, la composition pharmaceutique comprenant l’au moins une molécule d'ARNm coiffée en 5’ comprend peut être formulée dans un polyplexe avec un ou plusieurs polymères communément utilisés en formulation pharmaceutique. Dans certains modes de réalisation, le — polyplexe comprend deux polymères cationiques ou plus tels qu’une poly(éthylène imine) (PEI). Dans certains modes de réalisation, la composition pharmaceutique comprenant l’au moins une molécule d'ARNm coiffée en 5’ comprend peut être formulée sous la forme d'une nanoparticule en utilisant une combinaison de polymères, de lipides, ou d’autres agents biodégradables. Dans certains modes de réalisation, les nanoparticules de lipides peuvent comprendre un cœur de l’'ARNm coiffé en 5’ décrit ici et une enveloppe de polymère. L'enveloppe de polymère peut être l’un quelconque des polymères connus en formulation pharmaceutique.

Dans certains modes de réalisation, la composition pharmaceutique comprend un — vecteur, excipient ou diluant pharmaceutiquement acceptable. Dans certains modes de réalisation, la composition pharmaceutique décrite ici inclut au moins un agent actif additionnel décrit ici. Dans certains modes de réalisation, lau moins un agent actif additionnel est un agent chimiothérapeutique, un agent cytotoxique, une cytokine, un agent inhibiteur de croissance, un agent anti-hormonal, un agent anti- angiogénigue ou un inhibiteur de point de contrôle. Dans certains modes de réalisation, l’au moins un agent actif additionnel est un adjuvant pour augmenter l’efficacité de la vaccination.

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Dans la mise en pratique des méthodes de traitement ou d'utilisation fournies ici, une quantité thérapeutiquement efficace de composition pharmaceutique décrite ici est administrée à un mammifère ayant une maladie, un trouble ou une affection à traiter.

Dans certains modes de réalisation, le mammifère est un humain. Une quantité thérapeutiquement efficace peut varier largement en fonction de la sévérité de la maladie, de l’âge et de la santé relative du sujet, de la puissance de l’agent thérapeutique utilisé et d'autres facteurs. Les agents thérapeutiques, et dans certains cas, les compositions décrites ici, peuvent être utilisés seuls ou en combinaison avec un ou plusieurs agents thérapeutiques en tant que composants de mélanges.

La composition pharmaceutique décrite ici peut être administrée à un sujet par des voies d'administration appropriées, incluant, mais sans s'y limiter, les voies d'administration intraveineuse, intra-artérielle, orale, parentérale, buccale, topique, transdermique, rectale, intramusculaire, sous-cutanée, intra-osseuse, transmuqueuse, par inhalation ou intrapéritonéale. La composition décrite ici peut inclure, mais sans s'y limiter, des dispersions liquides aqueuses, des dispersions auto-émulsifiantes, des solutions solides, des dispersions liposomales, des aérosols, des formes galéniques solides, des poudres, des formulations à libération immédiate, des formulations à libération contrôlée, des formulations fondant rapidement, des comprimés, des capsules, des pilules, des formulations à libération retardée, des formulations à libération prolongée, des formulations à libération pulsatile, des formulations multi-particulaires, et des formulations mixtes à libération immédiate et contrôlée.

La composition pharmaceutique incluant un agent thérapeutique peut être fabriquée d’une manière conventionnelle, telle que, à titre d'exemple uniquement, au moyen d’un mélange conventionnel, d’un mélange chaotique, d’un mélange laminaire, d’une dissolution, d’une encapsulation ou d’autres procédés.

La composition pharmaceutique peut inclure au moins un agent thérapeutique exogène en tant que principe actif sous une forme exempte d'acide ou exempte de base, ou sous une forme de sel pharmaceutiquement acceptable. De plus, les méthodes et compositions décrites ici incluent l’utilisation de N-oxydes (le cas — échéant), de formes cristallines, de phases amorphes, ainsi que de métabolites actifs de ces biomolécules ayant le même type d'activité. Dans certains modes de réalisation, les agents thérapeutiques existent sous forme non solvatée ou sous des

30 BE2022/5035 formes solvatées avec des solvants pharmaceutiquement acceptables tels que de l’eau, de l’éthanol, et autres. Les formes solvatées des agents thérapeutiques sont également considérées comme étant divulguées ici.

Dans certains modes de réalisation, la composition pharmaceutique fournie ici inclut un ou plusieurs agents de conservation pour inhiber l’activité microbienne. Les agents de conservation adéquats incluent les substances contenant du mercure telles que le merfen et le thiomersal ; le dioxyde de chlore stabilisé ; et les composés dammonium quaternaire tels que le chlorure de benzalkonium, le bromure de cétyltriméthylammonium et le chlorure de cétylpyridinium.

L'utilisation de termes absolus ou séquentiels, par exemple, « sera », « ne sera pas », « devrait», «ne devrait pas», «doit», «ne doit pas», «premier », « initialement », « suivant », « ensuite », « avant », « après », « en dernier » et «enfin », ne sont pas destinés à limiter la portée des présents modes de réalisation divulgués ici mais à titre d'exemples.

Telles qu'utilisées ici, les formes singulières « un », « une », «le » et « la » sont destinées à inclure les formes plurielles également, sauf si le contexte indique clairement le contraire. En outre, dans la mesure où les termes « incluant », « inclut », « ayant », « a », « comportant », ou des variantes de ceux-ci, sont utilisés dans la description détaillée et/ou les revendications, de tels termes sont destinés à être inclusifs d’une manière similaire au terme « comprenant ».

Telles qu'utilisées ici, les expressions « au moins un », «un ou plusieurs » et « et/ou » sont des expressions ouvertes qui sont toutes deux des formes conjonctives et disjonctives. Par exemple, chacune des expressions « au moins l’un de A, Bet C », « au moins l’un de A, B ou C », « un ou plusieurs de A, B et C », « un ou plusieurs de A, B ou C » et «A, B et/ou C » signifie A seul, B seul, C seul, À et B ensemble, A et C ensemble, B et C ensemble, ou A, B et C ensemble.

Tel qu'utilisé ici, « ou » peut faire référence à « et», « ou », ou « et/ou » et peut être utilisé à la fois de manière exclusive et inclusive. Par exemple, le terme « A ou

B » peut faire référence à « À ou B », « A mais pas B », « B mais pas A », et «A et

B”. Dans certains cas, le contexte peut imposer une signification particulière.

31 BE2022/5035

Tous les systèmes, méthodes, logiciels et plateformes décrits ici sont modulaires. En conséquence, les termes tels que « premier » et « second » n’impliquent pas nécessairement une priorité, un ordre d'importance, ou un ordre d'actions.

Le terme « environ » lorsqu'il fait référence à un nombre ou à une plage numérique signifie que le nombre ou la plage numérique auquel (à laquelle) il est fait référence est une approximation à l’intérieur d’une variabilité expérimentale (ou à l'intérieur d’une l'erreur expérimentale statistique), et le nombre ou la plage numérique peut varier, par exemple, de 1 % à 15 % du nombre ou de la plage numérique indiqué(e).

Dans les exemples, le terme « environ » fait référence à + 10 % d’un nombre ou d’une valeur indiqué(e).

Les termes « augmenté », « augmentant », ou « augmentation » sont utilisés ici pour désigner généralement une augmentation par une quantité statiquement significative. Dans certains modes de réalisation, les termes « augmenté » ou « augmentation » désignent une augmentation d'au moins 10 % comparativement à un niveau de référence, par exemple une augmentation d’au moins environ 10 %, d’au moins environ 20 %, ou d'au moins environ 30 %, ou d'au moins environ 40 %, ou d'au moins environ 50 %, ou d'au moins environ 60 %, ou d'au moins environ 70%, ou d’au moins environ 80 %, ou d'au moins environ 90 % ou jusqu'à 100 % inclus ou toute autre augmentation entre 10 et 100 % comparativement à un niveau de référence, un étalon ou un témoin. Les autres exemples d’« augmentation » incluent une augmentation d’un facteur d’au moins 2, d’au moins 5, d’au moins 10, d’au moins 20, d'au moins 50, d'au moins 100, d'au moins 1 000 ou plus …— comparativement à un niveau de référence.

Les termes « diminué », « diminuant » ou « diminution » sont utilisés ici pour signifier généralement une diminution d’une quantité statistiquement significative.

Dans certains modes de réalisation, « diminué » ou « diminution » signifie une reduction d’au moins 10 % comparativement à un niveau de référence, par exemple une diminution d'au moins environ 20 %, ou d'au moins environ 30 %, ou d'au moins environ 40 %, ou d'au moins environ 50 %, ou d'au moins environ 60 %, ou d'au moins environ 70 %, ou d'au moins environ 80 %, ou d'au moins environ 90 % ou jusqu’à 100% inclus (par ex., niveau absent ou niveau non détectable — comparativement à un niveau de référence), ou toute diminution entre 10 et 100 % comparativement à un niveau de référence. Dans le contexte d’un marqueur ou d’un symptôme, par ces termes on désigne une diminution statistiquement significative

32 BE2022/5035 d’un tel niveau. La diminution peut être, par exemple, d'au moins 10 %, d’au moins 20 %, d'au moins 30 %, d'au moins 40 % ou plus, et est de préférence jusqu'à un niveau accepté comme étant dans la plage de la normale pour un individu sans maladie donnée.

Les termes « ARN » ou « molécule d’ARN » sont utilisés ici pour faire généralement référence à tout type d'ARN. Un exemple non limitant d’ARN inclut un ARN à chaîne longue, un ARN codant, un ARN non codant, un ARN long non codant, un ARN à simple brin (ARNsb), un ARN à double brin (ARNdb), un ARN linéaire (ARNIin), un

ARN circulaire (ARNcirc), un ARN messager (ARNm), un ARNm auto-amplificateur (SAM), un ARNm trans-amplificateur, des oligonucléotides d’'ARN, des oligonucléotides antisens, des petits ARN interférents (petits ARN), un petit ARN en épingle à cheveux (ARNsh), un ARN antisens (ARNas), des ARN guides CRISPR/Cas9, des riborégulateurs, un ARN immunostimulateur (ARNis), des ribozymes, des aptamères, un ARN ribosomique (ARNr), un ARN de transfert (ARNt), un ARN viral (ARNv), un ARN rétroviral ou un ARN réplicon, un petit ARN nucléaire (petit ARNn), un petit ARN nucléolaire (petit ARNno), un microARN (miARN), des ARN associés au site de départ de la transcription (TSSa), des ARN antisens en amont (ua), des produits de transcription en amont du promoteur (PROMPT), ou une combinaison de ceux-ci.

Tandis que les modes de réalisation préférés de la présente invention ont été montrés et décrits ici, il sera évident pour l'homme du métier que de tels modes de réalisation sont fournis à titre d'exemple uniquement. L'invention n’est pas destinée à être limitée par les exemples spécifiques fournis à l’intérieur du mémoire descriptif. Tandis que l'invention a été décrite en référence au mémoire descriptif mentionné ci-dessus, les descriptions et les illustrations des modes de réalisation ici ne sont pas destinées à être interprétées dans un sens limitant. De nombreux (nombreuses) variations, changements et substitutions apparaîtront à présent à l'homme du métier sans — s'éloigner de l'invention. En outre, il est entendu que tous les aspects de l’invention ne sont pas limités aux représentations, configurations ou proportions relatives spécifiques exposées ici qui dépendent d’une variété de conditions et de variables. Il est entendu que diverses variantes aux modes de réalisation de l'invention décrite ici peuvent être employées dans la mise en pratique de l'invention. Il est par conséquent envisagé que l'invention devrait également couvrir de tel(le)s Variantes, modifications, variations ou équivalents. Il est prévu que les revendications suivantes

33 BE2022/5035 définissent la portée de l’invention et que les méthodes et structures à l’intérieur de la portée de ces revendications et leurs équivalents soient couvertes par celles-ci.

EXEMPLES

Les exemples illustratifs suivants sont représentatifs des modes de réalisation des systèmes et des méthodes décrits ici et ne sont pas destinés à être limitants de quelque manière que ce soit.

Exemple 1. Coiffage d’acide nucléique dilué

De ARN non coiffé transcrit in vitro peut être dilué avant la réaction de coiffage. Une telle dilution diminue la concentration d’une pluralité de molécules qui inhibe la réaction de coiffage. L'ARN non coiffé dilué peut alors être mis en contact avec des réactifs de coiffage pour initier la réaction de coiffage. La Fig. 2 illustre un exemple non limitant pour la dilution et le coiffage de l'ARN transcrit in vitro (TIV). La solution contenant les molécules d’ARN non coiffées peut être diluée. Des réactifs et des réactions de TIV peuvent être utilisés pour synthétiser ARN de TIV non coiffé. La solution contenant l’ARN de TIV non coiffé peut être diluée avant l’ajout de réactifs de coiffage pour des réactions de coiffage. L'efficacité de coiffage est alors calculée comme étant la proportion d’ARN coiffé par rapport à la somme d'ARN non coiffé et coiffé. L'ARN coiffé peut également être purifié pour un traitement additionnel en aval.

Tandis que la divulgation précédente a été décrite de manière quelque peu détaillée à des fins de clarté et de compréhension, il sera évident pour l’homme du métier d'après une lecture de cette divulgation que divers changements de forme et de détail peuvent être apportés sans s'éloigner de la véritable portée de la divulgation. Par exemple, toutes les techniques et tous les appareils décrits ci-dessus peuvent être utilisés dans diverses combinaisons. Tou(te)s les publications, brevets, demandes de brevet et/ou autres documents cités dans la présente demande sont incorporés à — titre de référence dans leur intégralité à tous fins utiles dans la même mesure que si chaque publication, brevet, demande de brevet et/ou autre document individuel était individuellement et séparément indiqué comme étant incorporé à titre de référence à tous fins utiles.

Tou(te)s les publications, brevets et demandes de brevet mentionné(e)s dans le présent mémoire descriptif sont ici incorporé(e)s à titre de référence dans la même mesure que si chaque publication, brevet ou demande de brevet individuel était

34 BE2022/5035 spécifiquement et individuellement indiqué(e) comme étant incorporé(e) à titre de référence.

Dans la mesure où les publications et brevets ou demandes de brevet incorporés à titre de référence contredisent la divulgation contenue dans le mémoire descriptif, le mémoire descriptif est destiné à primer et/ou l'emporter sur tout matériau contradictoire de ce type.

Claims

35 BE2022/5035 REVENDICATIONS

1. Méthode de production d’au moins une molécule d'acide ribonucléique (ARN) coiffée, comprenant :

a. la fourniture d’une pluralité de molécules d’ARN non coiffées dans une première solution ;

b. la dilution de la première solution par un facteur d'au moins 4 pour former une deuxième solution contenant la pluralité de molécules d'ARN non coiffées ;

c. la mise en contact de la deuxième solution avec une pluralité de molécules d’enzyme de coiffage ; et d. l'ajout d’une structure de coiffe à une extrémité 5’ d’une molécule d’ARN non coiffée pour former au moins une molécule d’ARN coiffée.

2. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle la dilution de la première solution comprend l’ajout d’un volume d’un diluant à ladite première solution.

3. Méthode selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans laquelle la première solution est diluée par un facteur entre environ 5 et 1 000.

4. Méthode selon la revendication 3, dans laquelle la première solution est diluée par un facteur d'au moins environ 200.

5. Méthode selon la revendication 3, dans laquelle la première solution est diluée par un facteur d'au moins environ 50.

6. Méthode selon la revendication 3, dans laquelle la première solution est diluée par un facteur d'au moins environ 10.

7. Méthode selon les revendications 1 à 6, comprenant en outre l’élimination d’un volume en excès de la deuxième solution.

8. Méthode selon la revendication 7, dans laquelle l'élimination du volume en excès comprend une ultrafiltration, une microfiltration, une filtration à écoulement tangentiel, ou une combinaison de celles-ci.

9. Méthode selon la revendication 7 ou 8, dans laquelle la dilution de la première solution ne comprend pas d'étape de purification additionnelle.

10. Méthode selon la revendication 9, dans laquelle l’étape de purification additionnelle comprend une chromatographie.

11. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, dans laquelle la dilution de la première solution se produit dans un(e) même cuve ou réacteur que la pluralité de molécules d’ARN non coiffées générées par l'intermédiaire d’une réaction de transcription in vitro (TIV).

12. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, dans laquelle la dilution de la première solution se produit dans un(e) cuve ou un réacteur différent(e)

36 BE2022/5035 de la pluralité de molécules d’ARN non coiffées générées par l'intermédiaire d’une réaction de TIV.

13. Méthode selon la revendication 11, dans laquelle la réaction de TIV se produit dans un réacteur continu ou un réacteur discontinu.

14. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 13, dans laquelle la pluralité d’enzymes de coiffage est sélectionnée dans le groupe constitué d’'ARNm (nucléoside-2’-O-)-méthyltransférase spécifique de coiffe, d’enzyme de coiffage de Vaccinia (VCE), d’enzyme de coiffage du virus de la maladie de la langue bleue, d’enzyme de coiffage du virus de la chlorelle, d’enzyme de coiffage de S. cerevisiae, d’enzyme de coiffage de mimivirus, d’enzyme de coiffage du virus de la peste porcine africaine, et d’enzyme de coiffage de réovirus aviaire.

15. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 14, dans laquelle l’ajout de la structure de coiffe à l'extrémité 5’ de la molécule d’ARN non coiffée se produit à une efficacité d'au moins 70 %, d’au moins 75 %, d'au moins 77 %, d'au moins 80 %, d'au moins 85 %, d'au moins 87 %, d'au moins 90 %, d'au moins 95 %, d'au moins 97 %, d'au moins 98 %, d'au moins 99 % ou de 100 %.

16. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 15, dans laquelle l’ARN comprend une séquence d'acide nucléique codant pour un peptide ou une protéine.

17. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 15, dans laquelle l’ARN polymérase est sélectionnée dans le groupe constitué d’une T7 ARN polymérase, d’une T3 ARN polymérase, d’une SP6 ARN polymérase, d’une ARN polymérase I, d’une ARN polymérase II, d’une ARN polymérase III, d’une ARN polymérase IV, d’une ARN polymérase V, et d’une ARN polymérase à une seule sous-unité.

18. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 17, comprenant en outre la synthèse d’un peptide ou d’une protéine en utilisant lau moins une molécule d’ARNm coiffée.

19. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 18, dans laquelle la dilution de la première solution comprend la diminution d’une concentration d’une pluralité de molécules qui inhibe une réaction de coiffage consistant à ajouter une structure de coiffage à une extrémité 5’ d’une molécule d’ARN non coiffée.

20. Méthode selon la revendication 19, dans laquelle la concentration de la pluralité de molécules est diminuée jusqu’à un niveau où la réaction de coiffage n’est plus inhibée.

21. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 20, dans laquelle la dilution de la première solution comprend la diminution d’une concentration de la pluralité de molécules d’ARN non coiffées.

37 BE2022/5035

22. Méthode selon la revendication 21, dans laquelle la concentration de la pluralité de molécules d'ARN non coiffées est diminuée jusqu'à un niveau où la réaction de coiffage n’est plus inhibée.

23. Composition pharmaceutique obtenue en utilisant la méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 22.

24. Composition pharmaceutique selon la revendication 23, dans laquelle la composition pharmaceutique est un vaccin et un vecteur pharmaceutique acceptable.

25. Peptide ou protéine obtenu(e) en utilisant la méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 24.

26. Peptide ou protéine selon la revendication 25, dans lequel (laquelle) le peptide ou la protéine est produit(e) in vivo.

27. Peptide ou protéine selon la revendication 25, dans lequel (laquelle) le peptide ou la protéine est produit(e) in vitro.

28. Peptide ou protéine selon la revendication 25, dans lequel (laquelle) le peptide ou la protéine est un peptide ou une protéine prophylactique ou thérapeutique.

29. Composition comprenant une pluralité de molécules d'ARN coiffées en 5’, dans laquelle lesdites molécules d'ARN sont obtenues au moyen d'une réaction de transcription in vitro et dans laquelle ledit coiffage s’est produit de manière post- transcriptionnelle, ladite composition comprend des réactifs pour une transcription in vitro, et dans laquelle la concentration d’ARN dans ladite composition est inférieure à 20 mg/ml.

30. Composition comprenant une pluralité de molécules d’ARN coiffées en 5’, lesdites molécules d'ARN sont obtenues au moyen d’une réaction de transcription in vitro et dans laquelle ladite réaction de coiffage s’est produite de manière post- — transcriptionnelle, dans laquelle l'efficacité de la réaction de coiffage est d'au moins 75 % sans utiliser de chromatographie.

31. Composition comprenant une pluralité de molécules d’ARN coiffées en 5’ et non coiffées, lesdites molécules d’ARN sont obtenues au moyen d’une réaction de transcription in vitro et dans laquelle ledit coiffage s’est produit de manière post- — transcriptionnelle, ladite composition comprend des réactifs pour une transcription in vitro dans laquelle un rapport entre la pluralité de molécules d’ARN non coiffées et la pluralité de molécules d’ARN coiffées est entre 0,0001 à 1.

32. Système de production d'au moins une molécule d'acide ribonucléique (ARN) coiffée, comprenant : un bioréacteur configuré pour contenir une première solution contenant une pluralité de molécules d’ARN non coiffées, dans lequel :

38 BE2022/5035 la première solution est diluée par un facteur d’au moins 4 pour former une deuxième solution, dans lequel la deuxième solution comprend la pluralité de molécules d’ARN non coiffées ; et le bioréacteur ou un second bioréacteur configuré pour ajouter une structure de coiffe à une extrémité 5’ d’une molécule d’ARN non coiffée pour former au moins une molécule d’ARN coiffée par mise en contact de la deuxième solution avec une pluralité de molécules d’enzyme de coiffage.