BE1029710A1 - Flüssigfermentationskulturverfahren und aktive Metaboliten von Inonotus hispidus - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung stellt ein Flüssigfermentationskulturverfahren und aktive Metaboliten von Inonotus hispidus zur Verfügung, wobei es sich bei dem Kulturmedium der Flüssigfermentation um Maltose, Hefepulver, Kaliumdihydrogenphosphat, Magnesiumsulfat und Wasser handelt; der Kulturstamm wird einer Aktivierung auf der Neigungsfläche, einer Plattenkultur, einer Myzeldispersion und einer Fermentationskultur im Schüttelkolben unterzogen, und die erhaltene Fermentationsbrühe von Inonotus hispidus wird einer Filtration, Ethanolfällung, Zentrifugation und Trocknung unterzogen, um Myzelien von Inonotus hispidus, Flavonoide mit der Aktivität zum Fangen von freien Radikalen in vitro und extrazelluläre Polysaccharide mit der Aktivität zum Hemmen der In-vitro-Proliferation von Tumorzellen zu erhalten. Die vorliegende Erfindung fügt Weizenkleie hinzu, um das dispergierte Myzel zu adsorbieren und zu stabilisieren sowie das Wachstum des Myzels an den Wänden zu verhindern und so die Morphologie, Größe und Anzahl der Myzelbällchen während des Fermentationsprozesses zu kontrollieren.
Description
Flüssigfermentationskulturverfahren und aktive Metaboliten von Inonotus hispidus
TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Fermentationstechnik, insbesondere ein
Flüssigfermentationskulturverfahren und aktive Metaboliten von Inonotus hispidus.
STAND DER TECHNIK
Inonotus hispidus ist ein großer Speise- und Heilpilz der Gattung Inonotus im Stamm der
Basidiomycota und die einzige Pilzart, die der Beschreibung der "Phellinus linteus" in den alten chinesischen Schriften entspricht. Der medizinische Wert von "Phellinus linteus" wird seit langem in chinesischen medizinischen Schriften erwähnt, vom "Sheng Nong's herbal classic" aus der östlichen Han-Dynastie bis zum "Compendium of Materia Medica" von Li Shizhen aus der Ming-Dynastie. Sie beseitigt nicht nur die Hitze und entgiftet den Körper, sondern aktiviert auch den Blutkreislauf und löst die Blutstauung auf. Sie ist auch wirksam dafür, Schwäche aufzufüllen und Qi zu beleben, und kann Amenorrhoe, Hämoptysen, Blutungen, Qi-Mangel und Blutmangel behandeln. In den letzten Jahren hat die in- und ausländische Forschung herausgefunden, dass das wild wachsende oder künstlich gezüchtete Inonotus hispidus ein breites Spektrum an biologischen Aktivitäten hat, wie z.B. Anti-Aging, Verbesserung der
Immunität, Anti-Virus, Senkung der Blutfette, Aktivierung des Blutkreislaufs und Lösung von
Blutstauungen, was eine extrem hohe Aussicht der medizinischen Anwendung hat. Das wild wachsende Inonotus hispidus nimmt jedoch mit dem Sammeln allmählich ab, was zu einer
Verknappung der Ressourcen von Inonotus hispidus und zu hohen Preisen führt; während bei der künstlichen Kultivierung von Inonotus hispidus die Gewinnung von Fruchtkörpern viel Zeit in Anspruch nimmt und mehr Ressourcen verbraucht, deshalb zieht die Technologie der
Flüssigfermentation mehr Aufmerksamkeit auf sich. Die derzeitigen flüssigen
Fermentationsstimme werden aus Wildstämmen identifiziert und isoliert, und die verschiedenen Stämme weisen große genetische Unterschiede auf und variieren in der Auswahl und Verwendung der Kulturmedien, was zu großen Unterschieden in der Art, dem Gehalt und der Aktivität der Fermentationsmetaboliten führt. Daher sind die Auswahl hochgradig lebensfähiger Stämme von Inonotus hispidus und die Optimierung der
Fermentationsbedingungen von entscheidender Bedeutung für die Technik der
Flüssigfermentation.
Inonotus hispidus ist ein Fadenpilz, und bei der Herstellung der Flüssigfermentation werden häufig Agarblöcke als Stammimpfung verwendet. In diesem Fall tritt das Myzel in dicht gepackten Massen auf und wächst kontinuierlich. Im Inneren der Massen ist der Nährstoff- und
Sauerstofftransfer blockiert, was zu einem Nährstoff- und Sauerstoffmangel führt, der das
Wachstum des Myzels und die Synthese von Produkten beeinträchtigt und manchmal die
Autolyse des Myzels im Inneren der Massen verursacht. Außerdem neigt das Myzel dazu, sich an den Glaswänden des Schüttelkolbens festzuhalten und nach oben zu wachsen, was dazu führt, dass die Nährstoffe nur begrenzt genutzt werden und nur eine geringe Menge des aktiven
Produkts ins flüssiges Kulturmedium abgesondert wird. Das Problem der Agglomeration der
Myzelbällchen und des Wachstums an der Wand tritt auch in der Fermentationsphase dieses
Stammes von Inonotus hispidus auf, was zu langen Fermentationszyklen, niedrigen
Stoffwechselerträgen des Produkts und geringer Aktivität führt, aufgrund dessen ist eine optimierte Kontrolle der Fermentationsbedingungen und Impfungsverfahren erforderlich.
INHALT DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Hinsichtlich der Mängel aus dem Stand der Technik zielt die vorliegende Erfindung darauf ab, ein Flüssigfermentationskulturverfahren und aktive Metaboliten von Inonotus hispidus zur
Verfügung zu stellen.
Ein Flüssigfermentationskulturverfahren von Inonotus hispidus, umfassend die folgenden
Schritte:
Plattenkultur: Beimpfen des aktivierten Inonotus hispidus-Stammes im
Agarplattenkulturmedium (PDA) zur Kultivierung;
Zubereitung des Kulturmediums: Rezeptur des Kohlenstoffquellen-Kulturmediums:
Kohlenstoffquelle 5-20 g/L, Hefeextraktpulver 5-20 g/L, Kaliumdihydrogenphosphat 0,5-5 g/L,
Magnesiumsulfat 0,1-2 g/L, Rezeptur des Stickstoffquellen-Kulturmediums: Maltose 5-20 g/L,
Stickstoffquelle 5-20 g/L, Kaliumdihydrogenphosphat 0,5-5 g/L, Magnesiumsulfat 0,1-3 g/L;
Myzeldispersion: Agarblöcke, die aus der Plattenkultur gewonnen wurden, werden als Stämme verwendet, in das oben genannte Kohlenstoffquellen-Kulturmedium und/oder
Stickstoffquellen-Kulturmedium beimpft, kultiviert, bis Myzelbällchen entstehen, und die flüssige Kultur, die die Myzelbällchen enthält, wird mit hoher Geschwindigkeit geschert und zerbrochen, um schließlich eine Pilzsuspension zu erhalten, die dispergiertes Myzel enthält;
Beimpfen des Myzels und Flüssigfermentationskultur: die Konzentration der zerkleinerten
Pilzsuspension wird entsprechend dem Lichtabsorptionswert eingestellt, dann wird die
Pilzsuspension in das oben genannte Kulturmedium beimpft, in dem die Weizenkleie hinzugefügt wird, um die beimpfte Kulturlösung für die Flüssigfermentationskultur zu erhalten.
Inonotus hispidus wird vom China General Microbiological Culture Collection Center ausgewählt, mit der Nummer CGMCC3.15188.
Bevorzugt wird der aktivierte Inonotus hispidus-Stamm erhalten, indem das
Malzsaft-Kulturmedium mit gefriergetrocknetem Pilzpulver gemischt wird, so dass sich das gefriergetrocknete Myzel zu einem Suspensionszustand aufgelöst wird, wobei dann die
Myzelsuspension in ein festes Kulturmedium verpflanzt wird, und wobei die Kolonien, die stark wachsen, ausgewählt und in ein neues festes Kulturmedium zur Kultivierung beimpft werden, wodurch ein gut gewachsener Stamm erhalten wird. Dabei enthält die
Zusammensetzung des festen Kulturmediums Glukose 5-15 g/L, Pepton 5-15 g/L,
Hefeextraktpulver 1-10 g/L und Agar 10-30 g/L.
Die Menge des Malzsaft-Kulturmediums ist ausreichend, wenn das gefriergetrocknete
Pilzpulver aufgelöst werden kann.
In dem Schritt der Plattenkultur umfassen die Kulturbedingungen bevorzugt die Kultivierung von 8 bis 10 Tagen bei 22-28°C unter Schutz vor Licht.
Bevorzugt ist die Kohlenstoffquelle im Schritt zur Zubereitung des Kulturmediums mindestens eines von Traubenzucker, Rohrzucker, Maltose, Lactose und löslicher Stärke ist, wobei die
Stickstoffquelle mindestens eines von Hefeextraktpulver, Pepton, Rinderpaste, Sojamehlkuchen und Harnstoff ist.
Bevorzugt enthält in dem Schritt der Zubereitung des Kulturmediums die Rezeptur des
Kohlenstoffquellen-Kulturmediums Kohlenstoffquelle 10-15 g/L, Hefeextraktpulver 10-15 g/L,
Kaliumdihydrogenphosphat 0,5-3 g/L, Magnesiumsulfat 0,1- 1 g/L, wobei die Rezeptur des
Stickstoffquellen-Kulturmediums Maltose 5-15 g/L, Stickstoffquelle 5-15 g/L,
Kaliumdihydrogenphosphat 0,5-3 g/L und Magnesiumsulfat 0,1-1 g/L enthält;
Bevorzugt wird nach der Zubereitung des Kulturmediums das Kulturmedium eine
Hochdrucks-Sterilisation unterzogen, auf Raumtemperatur abgekühlt und zur Verfügung gestellt.
Bevorzugt handelt es sich bei den Agarblöcken im Schritt der Myzeldispersion darum, dass es in der Nähe des Randes der Kolonien in der Plattenkultur gestanzt wird , um Agarblöcke mit
Myzel zu erhalten.
Bevorzugt beträgt die Kulturtemperatur im Schritt der Myzeldispersion 25-35°C.
Im Schritt der Myzeldispersion hat die beim Scheren hoher Geschwindigkeit verwendete
Hochgeschwindigkeitsschere eine Arbeitsintensität von 5 bis 6; wobei die
Hochgeschwindigkeitsschere eine Arbeitszeit von 60 bis 120 s hat.
Bevorzugt beträgt in dem Schritt des Beimpfens des Myzels und der Flüssigfermentationskultur der eingestellte Lichtabsorptionswert der Pilzsuspension 0,3 bis 0,5, weiter bevorzugt 0,35 bis 0,5; wenn der Lichtabsorptionswert zu groß ist, muss die ursprüngliche Pilzsuspension vor der
Impfung verdünnt werden.
Bevorzugt beträgt in dem Schritt des Beimpfens des Myzels und der Flüssigfermentationskultur die Menge der Pilzsuspensionsimpfung 0,5-1%.
Bevorzugt wird in dem Schritt des Beimpfens des Myzels und der Flüssigfermentationskultur die verwendete Weizenkleie zerkleinert und auf eine EndkorngröBe von 30 bis 50 Mesh gesiebt. Bevorzugt wird die verwendete Weizenkleie dreimal gewaschen und getrocknet, um lösliche Stoffe zu entfernen.
Bevorzugt beträgt in dem Schritt des Beimpfens des Myzels und der Flüssigfermentationskultur die Menge der zugegebenen Weizenkleie in der Kulturlösung 6-10 g/L, weiter bevorzugt 8-10 g/L.
Bevorzugt handelt es sich bei der Flüssigfermentationskultur in dem Schritt des Beimpfens des
Myzels und der Flüssigfermentationskultur darum, dass die erhaltene gebeimpfte Kulturlösung weiterhin für 8-15 Tage kultiviert wird.
Der Kohlenstoffgehalt mikrobieller Zellen ist recht hoch und erreicht im Allgemeinen etwa 50% des Trockengewichts des Myzels. Er ist einer der wichtigsten Rohstoffe für das Wachstum des Myzels und die Hauptenergiequelle für den mikrobiellen Stoffwechsel. Die Nutzung von
Kohlenstoff durch Mikroorganismen ist eng mit ihren eigenen enzymatischen Systemen und
Stoffwechselprozessen verbunden. Obwohl der Traubenzucker in der Fermentationsproduktion weit verbreitet ist, kann der Traubenzucker als schnell wirkende Kohlenstoffquelle die
Produktbildung hemmen, während langsam wirkende Kohlenstoffquellen wie Lactose,
Rohrzucker, Maltose und Stärke für die Produktbildung besser geeignet sind. Ähnlich wie
Kohlenstoffquellen spielen auch Stickstoffquellen eine Rolle für das Wachstum von
Mikroorganismen, dass sie die Zellstruktur bilden und die für das Zellwachstum benötigte
Energie bereitstellen. Es gibt hauptsächlich organische und anorganische Stickstoffquellen, wobei sich die Art der beiden im Fermentationsprozess stark unterscheidet. Anorganische
Stickstoffquellen sind schnell wirkende Stickstoffquellen mit einer einzigen Komponente und werden von dem Myzel leicht aufgenommen. Organische Stickstoffquellen sind komplex und nährstoffreich und enthalten Proteine, Peptide, freie Aminosäuren usw., übliche organische
Stickstoffquellen sind Rinderpulver, Pepton, Hefepulver usw. Organische Stickstoffquellen können erst dann aufgenommen werden, wenn sie durch die von Mikroorganismen abgesonderten Proteasen hydrolysiert werden und sich weiter zersetzen und metabolisieren. 5 Daher ist die Auswahl geeigneter Kohlenstoff- und Stickstoffquellen besonders wichtig für das
Wachstum des Myzels und die Akkumulation von Metaboliten.
Die flüssigen Stämme von Fadenpilzen werden in der Regel hergestellt, indem der Stamm zuerst aktiviert und dann auf eine Plattenkultur übertragen wird, wobei nach dem Wachstum der Kolonie es mit einer Stanze in der Nähe des Randes der Kolonie gestanzt wird und ein
Agarblock für die Flüssigkultur ausgewählt wird. Wenn der Agarblock als Beimpfungssamen verwendet wird, hat er sehr wenige Wachstumspunkte, was dazu führt, dass das Myzel um den
Agarblock herum nach außen wächst und große, dichte Myzelbällchen bildet. Im Inneren des
Bällchens ist der Nährstoff- und Sauerstofftransfer blockiert, was zu einem Nährstoff- und
Sauerstoffmangel führt, der das Wachstum des Myzels und die Synthese von Produkten beeinträchtigt und manchmal die Autolyse des Myzels im Inneren des Bällchen verursacht.
Darüber hinaus gibt es gewisse Wachstumsunterschiede zwischen den Agarblöcken, was eine genaue Kontrolle der Impfungsmenge und des Stammstatus erschwert. Um den
Wachstumspunkt des flüssigen Stammes zu verbessern, die Impfung zu erleichtern und die
Impfungsmenge genau zu kontrollieren, kann durch physikalische Zerkleinerung eine große
Anzahl an kleinen Myzelien für die Impfung gewonnen werden.
Die Weizenkleie ist reich an Rohprotein, Zuckern (Maltose, Stärke usw.) und Vitaminen, so dass der Weizenkleiensaft häufig als organische Stickstoffquelle zu mikrobiellen Kulturmedien hinzugefügt wird; z.B. wird die Kleie in einem selenreichen Myzelwachstumsmedium für
Inonotus hispidus als Stickstoffquelle verwendet. In Versuchen wurde es festgestellt, dass die
Weizenkleie während des Fermentationsprozesses eine dispergierende Wirkung auf das Myzel hat, die Agglomeration des Myzels verringern kann, die Bildung kleiner homogener
Myzelbällchen erleichtert und die Kontaktfläche zwischen dem Myzel und dem flüssigen
Kulturmedium vergrößert. Gleichzeitig kann das Myzel aufgrund der faserigen Struktur der
Weizenkleie auf den Kleieteilchen wachsen und die Nährstoffe des flüssigen Kulturmediums vollständig nutzen, anstatt in großen Mengen an den Wänden des Schüttelkolbens zu haften.
Die Weizenkleie selbst besteht aus groben Fasern und hat eine lockere Struktur mit zahlreichen
Falten und kleinen wabenförmigen Poren auf der Oberfläche. Deshalb fördert die Zugabe von
Weizenkleie das dispergierte Wachstum der Myzelbällchen und erhöht den Produktionsertrag von Metaboliten in der Fermentationsbrühe.
Die vorliegende Erfindung verwendet das Kulturmedium zur flüssigen Fermentation von
Inonotus hispidus. Unter den gleichen Kulturbedingungen wird der Produktionsertrag von extrazellulären Polysacchariden und Flavonoiden nach der Optimierung der Kohlenstoff- und
Stickstoffquellen um jeweils das 3,08- bzw. 1,24-fache erhöht; nach der Verbesserung des
Impfungsverfahrens wird der Produktionsertrag von Myzel, extrazellulären Polysacchariden und Flavonoiden jeweils um das 1,38-, 1,16- bzw. 1,52-fache erhöht. Nach der Zugabe von
Weizenkleie wird der Produktionsertrag von Myzel, extrazellulären Polysacchariden und
Flavonoiden jeweils um das 1,23-, 1,23- bzw. 1,13-fache erhöht. Das Kulturmedium ist einfach herzustellen, leicht zu handhaben, kostengünstig in der Produktion und Verarbeitung, liefert einen hohen Produktionsertrag an Biomasse und Polysacchariden und anderen aktiven
Produkten und lässt sich leicht in großem Maßstab und kommerziell kultivieren.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Figur 1 zeigt die Aktivität zum Fangen von freien Radikalen der aus den
Ausführungsbeispielen und den Vergleichsbeispielen gewonnenen Flavonoidkomponenten.
Figur 2 zeigt die Aktivität zum Hemmen der Proliferation von Tumorzellen (Hela) durch die aus den Ausführungsbeispielen und den Vergleichsbeispielen gewonnenen extrazellulären
Polysaccharidkomponenten.
Figur 3 zeigt die Aktivität zum Hemmen der Proliferation von Tumorzellen (HepG2) durch die aus den Ausführungsbeispielen und den Vergleichsbeispielen gewonnenen extrazellulären
Polysacchariden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren für die Kultur und Fermentation von Inonotus hispidus zur Verfügung, und das Verfahren zur Verwendung der vorliegenden Erfindung wird im Folgenden im Zusammenhang mit den Ausführungsbeispielen erläutert, aber diese
Ausführungsbeispiele sind nur normativ und stellen keine Einschränkung des Bereichs der vorliegenden Erfindung dar. Darüber hinaus können Änderungen oder Ersetzungen an den
Details und der Form der technischen Lösungen der vorliegenden Erfindung vorgenommen werden, ohne von Geist und Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen, aber diese
Änderungen und Ersetzungen sollten immer noch von dem Schutzumfang der vorliegenden
Erfindung gedeckt angesehen werden.
Die Stämme von Inonotus hispidus werden vom China General Microbiological Culture
Collection Center beschafft, mit der Nummer CGMCC3.15188;die Weizenkleie wird von der
Lvwan Agrarprodukte GmbH Shijiazhuang mit der Artikelnummer 202202250002 und einem körnigen Aussehen beschafft, und eine Vorbehandlung wird vor der Verwendung durchgeführt:
Nehmen einer angemessenen Menge an Weizenkleie, Einweichen für eine Zeitdauer in destilliertem Wasser, Filtrieren unter vermindertem Druck, um den Filterrückstand zu erhalten,
Wiederholen für 3 Male und Trocknen des Filterrückstandes in einem Ofen bei 60°C, die vollständig getrocknete Weizenkleie wird in einer Zerkleinerungsmaschine zerkleinert, durchgesiebt und gesammelt, das Modell des Hochgeschwindigkeitsscher-Emulgators ist IKA
T10 Basic.
Alle Rohstoffe der vorliegenden Erfindung sind, sofern nicht anders angegeben, im Handel erhältlich und werden nicht weiterverarbeitet, das Versuchsgerät ist ebenfalls im Handel erhältlich.
Die folgenden Ausführungsbeispiele und Vergleichsbeispiele werden auf ihre
Leistungsfähigkeit getestet: 1. die Myzelausbeute nach der Fermentation erfolgt das Filtrieren unter vermindertem Druck, um das Myzel zu gewinnen. Nach dem dreimaligen Waschen mit destilliertem Wasser werden 10 Myzelbällchen (wenn die Anzahl weniger als 10 ist, werden alle ausgewählt) zufällig ausgewählt, um den
Durchmesser zu messen, und dann in dem Ofen bei 60°C getrocknet und gewogen. 2. die Polysaccharid-Ausbeute 5 mL Fermentationsbrühe werden genommen, und wasserfreies Ethanol mit dem vierfachen
Volumen wird hinzugefügt, dann erfolgt ein Sedimentieren über Nacht. Zentrifugieren bei 6000
U/min für 30 Minuten und Entfernen von Überstand. Die Sedimentation wird mit 2 mL destilliertem Wasser aufgelöst. Der Gesamtzuckergehalt wird mit dem
Phenol-Schwefelsäure-Verfahren bestimmt. 2,0 mL der Lösung werden aufgenommen, dann wird 1 mL einer 5%igen Phenollösung hinzugefügt und bis zum gleichmäßigen Zustand geschüttelt, am Ende werden 5 mL konzentrierte Schwefelsäure hinzugefügt, bis zum gleichmäßigen Zustand geschüttelt und für 15 min im Wasserbad abgekühlt. Die
Lichtabsorption wird bei 490 nm gemessen, und der Gesamtpolysaccharidgehalt wird anhand der Regressionsgleichung der Standardkurve ermittelt (Y=13,726X+0,0116, R2=0,9941).
3. Gesamtgehalt an Flavonoiden 1 ml der Fermentationsbrühe von Inonotus hispidus wird genommen, 3 mL 95%iges Ethanol werden hinzugefügt, nach Sedimentieren bei 4°C für 24 Stunden erfolgt ein Zentrifugieren von 15 min bei 5000 U/min, die Sedimentation wird entfernt und der Überstand wird gesammelt, und 1 mL Überstand wird in ein Reagenzglas zugegeben, und in jedem Glas werden 0,3 mL einer 5%igen Natriumnitritlösung (zubereitet und gebrauchsfertig) und bis zum gleichmäßigen
Zustand geschüttelt, Stehenlassen für 6 min, danach werden 0,3 mL einer 10%igen
Aluminiumnitratlösung hinzugefügt und bis zum gleichmäßigen Zustand geschüttelt,
Stehenlassen für 6 min, dann werden 4,0 ml 4%iges Natriumhydroxid hinzugefügt, in jedem
Glas wird 42%iges Ethanol hinzugefügt, so dass das Gesamtvolumen 10 mL beträgt,
Stehenlassen für 30 min, danach wird die Lichtabsorption bei 510 nm gemessen. Unter
Verwendung von Gallussäure als Standardprodukt wird der Gesamtflavonoidgehalt der Probe gemäß der Regressionsgleichung der Standardkurve (Y=1,1321x, R°=0,9999) ermittelt, und die
Ergebnisse werden als Gallussäureäquivalent in mg/mL ausgedrückt. 4. Gesamtgehalt an Polyphenolen
Nehmen der Probe von 0,5 mL und Legen dieser ins Reagenzglas, Hinzugeben von destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 5,5 mL, Schütteln bis zum gleichmäßigen
Zustand, dann werden 0,5 mL Folin-Ciocalteu-Farbentwickler hinzugefügt, Reagieren in dunkler Umgebung für 10 min nach Schütteln bis zum gleichmäßigen Zustand, dann werden 40 mL einer 7,5%igen Natriumcarbonatlösung hinzugefügt, Reagieren in dunkler Umgebung für 1 h nach Schütteln bis zum gleichmäßigen Zustand, und die Lichtabsorption wird bei 765 nm gemessen. Unter Verwendung von Rutin als Standardprodukt wird der
Gesamtpolyphenolgehalt der Probe gemäß der Regressionsgleichung der Standardkurve (Y=10,674x, R2=0,9997) ermittelt, und die Ergebnisse werden als Rutinäquivalent in mg/mL ausgedrückt. 5. Aktivität zum Fangen von freien Radikalen
Eine 96-Well-Platte wird mit 20 uL verschiedener Probenlösungen und 180 ul einer 150 umol/L DPPH-Arbeitslösung versetzt. Die Leer- und Positivkontrollen sind destilliertes Wasser und 0,4 mg/mL VC. Vibrieren und gleichmäBiges Mischen, und der Lichtabsorptionswert wird bei 517 nm gemessen. VC-Gradientenkonzentrationen von 12,5, 25, 50, 100, 200 und 400 ug/ml werden verwendet, um das DPPH-Clearance mit der folgenden Formel zu berechnen:
DPPH-Clearance (%) = (A0-A1)/A0 x 100, AO - Lichtabsorptionswert der Leerkontrolle; A1 -
Lichtabsorptionswert der Probe.
6. Aktivität zum Hemmen der Proliferation von Tumorzellen
Die Zytotoxizitätsanalyse wird mit dem kolorimetrischen CCK8-Assay durchgeführt.
Menschliche Gebärmutterhalskrebszellen Hela und menschliche Leberkrebszellen HepG2 der logarithmischen Wachstumsphase werden für 1-2 min mit 0,25% Trypsin verdaut, nach
Beenden der Verdauung wird eine Zellsuspension mit einer Zelldichte von 5x104 Zellen/ml hergestellt. 100 ul zellhaltige Kulturlösung werden in 96-Well-Zellkulturplatten gegeben, und eine gleiche Menge an zellfreier Kulturlösung wird der leeren Kontrollgruppe zugesetzt. In jeder Gruppe werden 3 parallele Verbundlöcher hergestellt und in einem CO2-Inkubator kultiviert. Wenn die Zelldichte mehr als 80% beträgt, wird die ursprüngliche Kulturlösung vorsichtig verworfen, und 100 uL der Polysaccharidprobe mit einer Konzentration von 0,1 mg/mL wird zugegeben, und Kultivierung für weitere 12 h. AnschlieBend wird die Flüssigkeit langsam abgesaugt und 10 uL CCK-8 werden in jedes Loch Vertiefung gegeben und für 4 h kultiviert. Der OD-Wert jedes Lochs wird bei 450 nm mit einem Enzymmarker gemessen, und die Zellüberlebensrate wird mit der folgenden Formel berechnet: Zellhemmungsrate (%) = [OD(O Dosierung) - OD(Dosierung)/[OD(O Dosierung) - OD(Leere) x 100.
Ausführungsbeispiel 1 Fermentationskultur mit 20 g/L Maltose als Kohlenstoffquelle
Verwenden einer sterilen Pipette, um 0,3 mL eines geeigneten Malzsaft-Kulturmediums zu entnehmen und in eine Ampulle mit gefriergetrocknetem Pilzpulver zu tropfen, und vorsichtiges Vibrieren, um das gefriergetrocknete Myzel in eine Suspension aufzulösen.
Verpflanzen von 0,2 mL Myzelsuspension in ein festes Kulturmedium, dabei enthält die
Zusammensetzung des festen Kulturmediums Glukose 10 g/L, Pepton 10 g/l,
Hefeextraktpulver 5 g/L und Agar 20 g/L. Die Kolonien, die stark wachsen, werden ausgewählt, und ein Teil der Kolonien wird in ein neues festes Kulturmedium zur Kultivierung beimpft, dieser Schritt wird dreimal wiederholt, um Kolonien, die gut wachsen, zu erhalten, und diese in der Neigungsfläche zu behalten, dann wird der aktivierte Stamm aus der
Neigungsfläche mit einem Beimpfungsring in ein Agarplattenkulturmedium (PDA) beimpft,
Kultivieren für 8-10 Tage bei 27°C unter Schutz vor Licht; das
Kohlenstoffquellen-Basismedium wird im Verhältnis von Hefeextraktpulver 10 g/L,
Kaliumdihydrogenphosphat 1 g/L und Magnesiumsulfat 0,5 g/L hergestellt, und 20 g/L
Maltose werden als Kohlenstoffquelle hinzugefügt. Die zubereitete Kulturlösung wird in 250-mL-Erlenmeyerkolben gegossen, 150 ml Kulturmedium pro Kolben, Sterilisieren für 20 min bei 121°C im Autoklaven und Abkühlen auf Raumtemperatur. in einer ultrasauberen Bank wird es in der Nähe des Randes der Kolonien mit einer Stanze mit einem Durchmesser von 0,5 cm gestanzt, um Agarblöcke mit Myzel zu erhalten. Die Agarblöcke werden nach dem
Zufallsprinzip als Stämme ausgewählt und in 150 mL flüssiges Kulturmedium beimpft, für 14
Tage wird der beimpfte 250-mL-Schüttelkolben bei 30°C und 120 U/min im Schüttelherd kultiviert. Nach der Fermentation erfolgt die Prüfung mit dem des Leistungstestverfahren. Nach der Fermentation wird die erhaltene Fermentationsbrühe unter vermindertem Druck filtriert, um das Myzel und das Filtrat zu erhalten, dann wird dem Filtrat eine bestimmte Menge wasserfreies Ethanol zugesetzt, das Gemisch wird gründlich gerührt und für eine gewisse Zeit stehen gelassen, dann erfolgt eine Zentrifugation, die erhaltene Sedimentation ist der Metabolit - extrazelluläres Polysaccharid, und die erhaltene zentrifugale Lösung wird konzentriert und getrocknet, um den Metaboliten - Flavonoide - zu erhalten; die Aktivität zum Fangen von freien Radikalen von Flavonoiden und die Aktivität zum Hemmen der Proliferation von
Tumorzellen von extrazellulären Polysacchariden im getrennten Filtrat werden jeweils getestet.
Ausführungsbeispiel 2 Fermentationskultur mit 10 g/L Maltose als Kohlenstoffquelle
Im Kohlenstoffquellen-Basismedium werden 10 g/L Maltose als Kohlenstoffquelle hinzugefügt. Alle anderen Vorgänge sind gleich wie im Ausführungsbeispiel 1.
Ausführungsbeispiel 3 Fermentationskultur mit 20 g/L Hefeextraktpulver als Stickstoffquelle das Stickstoffquellen-Basismedium wird im Verhältnis von Maltose 10 g/L,
Kaliumdihydrogenphosphat 1 g/L und Magnesiumsulfat 0,5 g/L hergestellt, und 20 g/L
Hefeextraktpulver werden als Stickstoffquelle hinzugefügt. Alle anderen Vorgänge sind gleich wie im Ausführungsbeispiel 1.
Ausführungsbeispiel 4 Fermentationskultur mit 10 g/L Hefeextraktpulver als Stickstoffquelle
Im Stickstoffquellen-Basismedium werden 10 g/L Hefeextraktpulver als Stickstoffquelle hinzugefügt. Alle anderen Vorgänge sind gleich wie im Ausführungsbeispiel 3.
Ausführungsbeispiel 5
Der Schüttelkolben des Ausführungsbeispiels 4 wird bei 30°C und 120 U/min in einem
Schüttherd kultiviert, bis Myzelbällchen in groBer Zahl gebildet werden. Der Scherkopf der
Hochgeschwindigkeitsschere wird im Voraus in einem Autoklaven sterilisiert, dann in die
Hochgeschwindigkeitsschere eingebaut, mit Alkohol sterilisiert und zur UV-Sterilisation in eine ultrareine Bank gelegt. Die Flüssigkultur, die die oben genannten Myzelbällchen enthält, wird für 60 s bei einer hohen Geschwindigkeit der fünften Stufe geschert und zerkleinert, um eine Suspension zu erhalten, die eine große Anzahl an winzigen dispergierten Myzelien enthält.
Die Suspension wird zehnmal verdünnt und der Lichtabsorptionswert beträgt 0,480 bei 410 nm unter Verwendung einer Blindkulturlösung als Kontrolle. 0,5 mL der Suspension werden mit einer sterilen Pistole abgesaugt, in einen Schüttelkolben (250 mL) mit 150 mL flüssigem
Kulturmedium beimpft und für 10 Tage bei 30°C und 120 U/min in einem Schüttelherd kultiviert. Die Messungen nach Beenden der Fermentation stimmten mit dem
Ausführungsbeispiel 1 überein.
Ausführungsbeispiel 6
Gleich wie Ausführungsbeispiel 5, der Unterschied liegt darin, dass die Arbeitsintensität der
Hochgeschwindigkeitsschere auf 6 eingestellt wird, und alle anderen Vorgänge sind gleich wie im Ausführungsbeispiel 5.
Ausführungsbeispiel 7
Gleich wie Ausführungsbeispiel 5, der Unterschied liegt darin, dass die Arbeitszeit der
Hochgeschwindigkeitsschere auf 120 s verlängert wird, und alle anderen Vorgänge sind gleich wie im Ausführungsbeispiel 5.
Ausführungsbeispiel 8
Gleich wie Ausführungsbeispiel 5, der Unterschied liegt darin, dass der Lichtabsorptionswert der verdünnten Suspension auf 0.341 eingestellt wird, und alle anderen Vorgänge sind gleich wie im Ausführungsbeispiel 5.
Ausführungsform 9
Gleich wie Ausführungsbeispiel 5, der Unterschied liegt darin, dass 1,0 mL der Suspension mit einer sterilen Spitze abgesaugt wird, und alle anderen Vorgänge sind gleich wie im
Ausführungsbeispiel 5.
Ausführungsbeispiel 10 Fermentationskultur mit Weizenkleie (10 g/L, 30 Mesh) als Hilfsstoff
Wiegen und Nehmen einer angemessenen Menge an Weizenkleie, Einweichen für eine
Zeitdauer in destilliertem Wasser, Filtrieren unter vermindertem Druck, um den Filterrückstand zu erhalten, Wiederholen für 3 Male und Trocknen des Filterrückstandes in einem Ofen bei 60°C, die vollständig getrocknete Weizenkleie wird in einer Zerkleinerungsmaschine zerkleinert, auf 30 Mesh durchgesiebt und gesammelt. das Hilfsstoff-Basismedium wird aus
Maltosel0 g/L, Hefeextraktpulver 10 g/L, Kaliumdihydrogenphosphat 1 g/L und
Magnesiumsulfat 0,5 g/L hergestellt, und 10 g/L Weizenkleie (KorngrôBe: 30 Mesh) werden als Hilfsstoff hinzugefügt. Alle anderen Vorgänge sind gleich wie im Ausführungsbeispiel 1.
Ausführungsbeispiel 11 Fermentationskultur mit Weizenkleie ( 8 g/L, 50 Mesh) als Hilfsstoff
Im Hilfsstoff-Basismedium werden 8 g/L Weizenkleie (KorngröBe: 50 Mesh) als Hilfsstoff hinzugefügt. Alle anderen Vorgänge sind gleich wie im Ausführungsbeispiel 5.
Vergleichsbeispiel 1 Fermentationskultur mit Traubenzucker als Kohlenstoffquelle
Gleich wie Ausführungsbeispiel 1, der Unterschied liegt darin, dass die Maltose durch den
Traubenzucker ersetzt wird, und alle anderen Vorgänge sind gleich wie im Ausführungsbeispiel 1.
Vergleichsbeispiel 2 Fermentationskultur mit Rohrzucker als Kohlenstoffquelle
Gleich wie Ausführungsbeispiel 1, der Unterschied liegt darin, dass die Maltose durch den
Rohrzucker ersetzt wird, und alle anderen Vorgänge sind gleich wie im Ausführungsbeispiel 1.
Vergleichsbeispiel 3 Fermentationskultur mit Lactose als Kohlenstoffquelle
Gleich wie Ausführungsbeispiel 1, der Unterschied liegt darin, dass die Maltose durch die
Lactose ersetzt wird, und alle anderen Vorgänge sind gleich wie im Ausführungsbeispiel 1.
Vergleichsbeispiel 4 Fermentationskultur mit löslicher Stärke als Kohlenstoffquelle
Gleich wie Ausführungsbeispiel 1, der Unterschied liegt darin, dass die Maltose durch die lôsliche Stärke ersetzt wird, und alle anderen Vorgänge sind gleich wie im Ausführungsbeispiel 1.
Vergleichsbeispiel 5 Fermentationskultur mit Pepton als Stickstoffquelle
Gleich wie Ausführungsbeispiel 3, der Unterschied liegt darin, dass das Hefeextraktpulver durch das Pepton ersetzt wird, und alle anderen Vorgänge sind gleich wie im
Ausführungsbeispiel 3.
Vergleichsbeispiel 6 Fermentationskultur mit Rinderpaste als Stickstoffquelle
Gleich wie Ausführungsbeispiel 3, der Unterschied liegt darin, dass das Hefeextraktpulver durch die Rinderpaste ersetzt wird, und alle anderen Vorgänge sind gleich wie im
Ausführungsbeispiel 3.
Vergleichsbeispiel 7 Fermentationskultur mit Sojamehlkuchen als Stickstoffquelle
Gleich wie Ausführungsbeispiel 3, der Unterschied liegt darin, dass das Hefeextraktpulver durch den Sojamehlkuchen ersetzt wird, und alle anderen Vorgänge sind gleich wie im
Ausführungsbeispiel 3.
Vergleichsbeispiel 8 Fermentationskultur mit Harnstoff als Stickstoffquelle
Gleich wie Ausführungsbeispiel 3, der Unterschied liegt darin, dass das Hefeextraktpulver durch den Harnstoff ersetzt wird, und alle anderen Vorgänge sind gleich wie im
Ausführungsbeispiel 3.
Vergleichsbeispiel 9 Fermentationskultur unter Verwendung der optimalen Kohlenstoff- und
Stickstoffquellen ohne Zugabe von Weizenkleie
Gleich wie Ausführungsbeispiel 4, der Unterschied liegt darin, dass die Zeit der
Fermentationskultur auf 10 d verkürzt wird.
Tabelle 1 Durchschnittlicher Durchmesser und Masse des Myzels in der Fermentationsbrühe und Wirkstoffgehalt
Durchschnitt 0000 licher Extrazellulär
Bezeichnu Trockengewi Gesamtfla Gesamtpolyp ng der Durchmesse cht des © vonoide henole
Probe " der Myzels (g/L) Polysacchari (mg/mL) (mg/mL)
Myzelbällch de (mg/mL) en (cm) ‘Ausführun 1 4990 680 gsbeispiel 0.79 0.0406 0.1339 1
Ausführun 4.55 5.9 gsbeispiel 0.68 0.0318 0.1383 2
Ausführun 5.13 6.26 gsbeispiel 0.79 0.0394 0.1385 3
Ausführun 4.58 6.03 gsbeispiel 0.82 0.0468 0.1460 4
Ausführun 5.59 5.72 gsbeispiel 0.33 0.0645 0.1643
Ausführun 6.16 6.89 gsbeispiel 0.24 0.0711 0.1681 6
Ausführun 6.34 6.99 gsbeispiel 0.29 0.0709 0.1614 7
Ausführun 5.55 5.70 0.35 0.0678 0.1597 gsbeispiel
Ausführun 6.22 6.68 gsbeispiel 0.29 0.073 0.1694 9
Ausführun 6.03 6.35 gsbeispiel 0.31 0.0698 0.1660 10
Ausführun 6.86 7.04 gsbeispiel 0.21 0.0783 0.1745 11
Vergleich 4.7 1.96
I 0.91 0.0377 0.1250 sbeispiel1
Vergleich 4.83 0.99 oo 0.85 0.0418 0.1311 sbeispiel2
Vergleich 3.15 1.3
I 0.59 0.0306 0.1295 sbeispiel3
Vergleich 2.45 0.2 nn 0.61 0.0411 0.1239 sbeispiel4
Vergleich 4.26 4.67
I 0.92 0.0415 0.1315 sbeispiel5
Vergleich 3.97 5.02
I 0.84 0.0428 0.1244 sbeispiel6
Vergleich 1.44 3.18
I 0.34 0.0356 0.0598 sbeispiel7
Vergleich 0.28 0.4
I 0.13 0.0105 0.0445 sbeispiel8
Vergleich 3.69 3.54
I 0.76 0.0386 0.1477 sbeispiel9
Aus den Versuchsbeispielen 1-4 und den ersten acht Vergleichsbeispielen ist es ersichtlich, dass die optimalen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen zum Fördern von Inonotus hispidus zur
Fermentation und Erzeugung von extrazellulären Polysacchariden Maltose und Hefepulver sind. Der Grund liegt in den unterschiedlichen Stoffwechselwegen der verschiedenen
Nährstoffe innerhalb des Myzels und den verschiedenen extrazellulären aktiven Produkten, die gebildet werden können. Bei diesem Stamm fördern Maltose und Hefepulver im Vergleich zu anderen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen die intrazelluläre Synthese und extrazelluläre
Sekretion aktiver Produkte wie Biomoleküle stärker. Die bei der Fermentation verwendete
Stammform ist ebenfalls entscheidend für das Wachstum des Myzels und die Sekretion der
Produkte. Aus der Tabelle ist es ersichtlich, dass in den Ausführungsbeispielen 5-9 Myzel, das durch die Hochgeschwindigkeitsscherbrechung erhalten wird, als Stamm verwendet wird, was die Kontrolle der Impfungsmenge im Vergleich zu Agarblöcken erleichtert und die Anzahl der
Myzelwachstumsstellen erhöht, wodurch das Myzelwachstum und die Nutzung der
Kulturlösung beschleunigt werden und die Fermentationszeit stark verkürzt wird. Darüber hinaus kann die Zugabe einer bestimmten Menge an Weizenkleie die Ausbeute an extrazellulären Polysacchariden und die Produktion von Metaboliten erhöhen, was hauptsächlich auf die grobe Faserstruktur der Weizenkleie zurückzuführen ist, die es dem
Myzel ermöglicht, darauf zu wachsen, um die Verflechtungen zu verringern. Durch die
Verringerung des Durchmessers der Myzelaggregate vergrößert Weizenkleie die Kontaktfläche mit der Fermentationsbrühe, wodurch mehr aktive Produkte erzeugt werden können. Für
Inonotus hispidus können daher die Optimierung der Kohlenstoff- und Stickstoffquelle des flüssigen Kulturmediums, die Verbesserung des Impfungsverfahrens und die Zugabe von
Weizenkleie die Ausbeute an aktiven Metaboliten deutlich erhöhen, was die Kultivierung des
Stammes in großem Maßstab und die Extraktion der Produkte fördert sowie auf der Grundlage von Inonotus hispidus die weitere Entwicklung von Arzneimitteln ermöglicht, die antioxidativ wirken und die Proliferation von Tumorzellen hemmen.
Offensichtlich dienen die vorstehenden Ausführungsbeispiele nur zur klaren Erläuterung der
Beispiele der vorliegenden Erfindung, statt die Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zu beschränken. Der Durchschnittsfachmann auf dem betroffenen Gebiet können Änderungen oder Modifikationen anderer Formen auf der Grundlage der vorstehenden Erläuterung durchführen. Dabei ist es sowohl unnötig als auch unmöglich, alle Ausführungsformen aufzuführen. Alle unter Gedanken und Grundsätzen der vorliegenden Erfindung durchgeführten
Änderungen, äquivalenten Ersetzungen und Verbesserungen sollten als vom Schutzumfang der
Ansprüche der vorliegenden Erfindung gedeckt angesehen werden.
Claims (10)
1. Flüssigfermentationskulturverfahren von Inonotus hispidus, umfassend die folgenden Schritte: Plattenkultur: Beimpfen des aktivierten Inonotus hispidus-Stammes im Agarplattenkulturmedium zur Kultivierung; Zubereitung des Kulturmediums: Rezeptur des Kohlenstoffquellen-Kulturmediums: Kohlenstoffquelle 5-20 g/L, Hefeextraktpulver 5-20 g/L, Kaliumdihydrogenphosphat 0,5-5 g/L, Magnesiumsulfat 0,1-2 g/L, Rezeptur des Stickstoffquellen-Kulturmediums: Maltose 5-20 g/L, Stickstoffquelle 5-20 g/L, Kaliumdihydrogenphosphat 0,5-5 g/L, Magnesiumsulfat 0,1-3 g/L; Myzeldispersion: Agarblöcke, die aus der Plattenkultur gewonnen wurden, werden als Stämme verwendet, in das oben genannte Kohlenstoffquellen-Kulturmedium und/oder Stickstoffquellen-Kulturmedium beimpft, kultiviert, bis Myzelbällchen entstehen, und die flüssige Kultur, die die Myzelbällchen enthält, wird mit hoher Geschwindigkeit geschert und zerbrochen, um schließlich eine Pilzsuspension zu erhalten, die dispergiertes Myzel enthält; Beimpfen des Myzels und Flüssigfermentationskultur: die Konzentration der zerkleinerten Pilzsuspension wird entsprechend dem Lichtabsorptionswert eingestellt, dann wird die Pilzsuspension in das oben genannte Kulturmedium beimpft, in dem die Weizenkleie hinzugefügt wird, um die beimpfte Kulturlösung für die Flüssigfermentationskultur zu erhalten.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Inonotus hispidus vom China General Microbiological Culture Collection Center mit der Nummer CGMCC3.15188 ausgewählt; wobei in dem Schritt des Beimpfens des Myzels und der Flüssigfermentationskultur die Menge der zugegebenen Weizenkleie in der Kulturlösung 6-10 g/L beträgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kohlenstoffquelle im Schritt zur Zubereitung des Kulturmediums mindestens eines von Traubenzucker, Rohrzucker, Maltose, Lactose und löslicher Stärke ist, wobei die Stickstoffquelle mindestens eines von Hefeextraktpulver, Pepton, Rinderpaste, Sojamehlkuchen und Harnstoff ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Schritt der Zubereitung des Kulturmediums die Rezeptur des Kohlenstoffquellen-Kulturmediums Kohlenstoffquelle 10-15 g/L, Hefeextraktpulver 10-15 g/L, Kaliumdihydrogenphosphat 0,5-3 g/L, Magnesiumsulfat 0,1- 1 g/L enthält, wobei die Rezeptur des Stickstoffquellen-Kulturmediums Maltose 5-15 g/L, Stickstoffquelle 5-15 g/L, Kaliumdihydrogenphosphat 0,5-3 g/L und Magnesiumsulfat 0,1-1 g/L enthält.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kulturtemperatur im Schritt der Myzeldispersion 25-35°C beträgt; wobei im Schritt der Myzeldispersion die beim Scheren hoher Geschwindigkeit verwendete Hochgeschwindigkeitsschere eine Arbeitsintensität von 5 bis 6 hat; wobei die Hochgeschwindigkeitsschere eine Arbeitszeit von 60 bis 120 s hat.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Schritt des Beimpfens des Myzels und der Flüssigfermentationskultur der eingestellte Lichtabsorptionswert der Pilzsuspension 0,3 bis 0,5 beträgt.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Schritt des Beimpfens des Myzels und der Flüssigfermentationskultur die Menge der Pilzsuspensionsimpfung 0,5-1% beträgt.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Flüssigfermentationskultur in dem Schritt des Beimpfens des Myzels und der Flüssigfermentationskultur darum handelt, dass die erhaltene gebeimpfte Kulturlösung weiterhin für 8 bis 15 Tage kultiviert wird.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der aktivierte Inonotus hispidus-Stamm erhalten wird, indem das Malzsaft-Kulturmedium mit gefriergetrocknetem Pilzpulver gemischt wird, so dass sich das gefriergetrocknete Myzel zu einem Suspensionszustand aufgelöst wird, wobei dann die Myzelsuspension in ein festes Kulturmedium verpflanzt wird, und wobei die Kolonien, die stark wachsen, ausgewählt und in ein neues festes Kulturmedium zur Kultivierung beimpft werden, wodurch ein gut gewachsener Stamm erhalten wird.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Schritt der Plattenkultur die Kulturbedingungen die Kultivierung von 8 bis 10 Tagen bei 22-28°C unter Schutz vor Licht umfassen; wobei die Kulturtemperatur im Schritt der Myzeldispersion 25-35°C beträgt.
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Effective date: 20231215 |