BE1025119A1

BE1025119A1 - Nouveaux procedes pour induire une reponse immunitaire

Info

Publication number: BE1025119A1
Application number: BE20175958A
Authority: BE
Inventors: Margherita Coccia; Arnauld Michel Didierlaurent
Original assignee: Glaxosmithkline Biologicals Sa
Priority date: 2016-12-20
Filing date: 2017-12-19
Publication date: 2018-10-30
Also published as: US20210100899A1; US11679153B2; GB201621686D0; CN110290806A; EP3558357A1; WO2018114892A1; BE1025119B1; US20200000912A1; US10881731B2

Abstract

La présente invention concerne des procédés pour induire une réponse immunitaire, en particulier des procédés pour adjuver la réponse immunitaire à un antigène comprenant l'administration séparée d'une saponine et d'un agoniste de TLR4.

Description

(30) Données de priorité :

20/12/2016 GB 1621686.3 (71) Demandeur(s) :

GLAXOSMITHKLINE BIOLOGICALS SA 1330, RIXENSART

Belgique (72) Inventeur(s) :

COCCIA Margherita

1330 RIXENSART

Belgique

DIDIERLAURENT Arnauld Michel

1330 RIXENSART

Belgique (54) NOUVEAUX PROCEDES POUR INDUIRE UNE REPONSE IMMUNITAIRE (57) La présente invention concerne des procédés pour induire une réponse immunitaire, en particulier des procédés pour adjuver la réponse immunitaire à un antigène comprenant l'administration séparée d'une saponine et d'un agoniste de TLR4.

BE2017/5958

NOUVEAUX PROCEDES POUR INDUIRE UNE REPONSE IMMUNITAIRE

DOMAINE TECHNIQUE

CONTEXTE DE L'INVENTION

Des adjuvants sont inclus dans les vaccins pour améliorer les réponses immunitaires humorales et cellulaires, particulièrement dans le cas de vaccins sous-unitaires faiblement immunogènes. De façon similaire aux infections naturelles par des pathogènes, les adjuvants reposent sur l'activation du système immunitaire inné afin de favoriser l'immunité adaptative durable. Du fait que l'activation simultanée de multiples voies immunitaires innées est une caractéristique des infections naturelles, les adjuvants peuvent combiner de multiples immunostimulants afin de favoriser les réponses immunitaires adaptatives à la vaccination.

Le système adjuvant 01 (AS01) est un adjuvant à base de liposomes qui contient deux immunostimulants, le 3-O-désacyl-4'-monophosphoryl-lipide A (3D-MPL) et le QS-21 (Garçon and Van Mechelen, 2011). L'agoniste de TLR4, le 3D-MPL, est un dérivé non toxique du lipopolysaccharide issu de Salmonella minnesota. Le QS21 est une molécule de saponine naturelle extraite de l'écorce de l'arbre d'Amérique du Sud Quillaja saponaria Molina (Kensil et al., 1991 ; Ragupathi et al., 2011) .

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L'ASOl est inclus dans le vaccin RTS,S développé récemment contre le paludisme (Mosquirix®) et le vaccin contre Herpes zoster HZ/su (Shingrix®), et dans de multiples vaccins candidats en développement contre des agents pathogènes tels que Herpes zoster (HZ/su), le virus de l'immunodéficience humaine et Mycobacterium tuberculosis. Durant l'évaluation préclinique et clinique de ces vaccins candidats, à la fois des anticorps spécifiques de l'antigène et une immunité due aux lymphocytes T CD4+ ont été constamment observés. La capacité de l'ASOl à produire constamment des réponses immunitaires cellulaires à la vaccination le distingue d'autres adjuvants qui généralement favorisent principalement les réponses humorales à la vaccination (Black et al., 2015 ; Garçon and Van Mechelen, 2011) . Simultanément, les vaccins adjuvés avec l'ASOl ont été efficaces pour favoriser

1'immunogénicité et l'efficacité de la vaccination dans les populations complexes, telles que les nourrissons (avec RTS,S) et les adultes plus âgés (avec HZ/su).

L'injection d'ASOl produit une activation rapide et transitoire de l'immunité innée dans des modèles animaux

Les neutrophiles et les recrutés vers le ganglion après l'immunisation. En monocytes sont rapidement lymphatique drainant (GLD) outre, l'ASOl induit le recrutement et l'activation des cellules dendritiques (CD) CMHII^hi9^h, qui sont nécessaires à l'activation des lymphocytes T (Didierlaurent A.M. et al., 2014). Certaines données sont également disponibles sur le mécanisme d'action des composants de l'ASOl. Le 3D-MPL envoie des signaux par l'intermédiaire du TLR4, en

BE2017/5958 stimulant l'activité transcriptionnelle du NF-κΒ et la production de cytokines et active directement les cellules présentatrices de l'antigène (CPA) à la fois chez les êtres humains et chez les souris (De Becker et al., 2000 ; Ismaili et al., 2002 ; Martin et al., 2003 ; Mata-Haro et al., 2007) . Le QS-21 favorise des réponses élevées en anticorps spécifiques de l'antigène et lymphocytes T CD8⁺ chez les souris (Kensil and Kammer, 1998 ; Newman et al., 1992 ; Soltysik et al., 1995) et des réponses en anticorps spécifiques de l'antigène chez les êtres humains (Livingston et al., 1994) . En raison de ses propriétés physiques, on pense que le QS-21 pourrait agir comme un signal de danger in vivo (Lambrecht et al., 2009 ; Li et al., 2008). Bien qu'il ait été montré que le QS-21 active 1'inflammasome ASCNLRP3 et la libération subséquente d'IL-lß/IL-18 (MartyRoix, R. et al., 2016), les voies moléculaires exactes impliquées dans l'effet adjuvant des saponines sont encore à définir clairement.

Il a été montré que le 3D-MPL et le QS21 agissent en synergie dans 1'induction des réponses immunitaires (Coccia et al. 2016). En outre, il a été montré que la façon selon laquelle les deux immunostimulants sont fournis est un facteur important qui influence la qualité des réponses induites, avec la présentation liposomale du 3D-MPL et du QS21 dans l'ASOl fournissant une puissance supérieure à l'AS02 à base d'émulsion huile dans l'eau (Dendouga et al. 2012) .

En dépit de l'écoulement de plus de 20 ans depuis que des combinaisons de l'agoniste de TLR4, le 3D-MPL, et de la saponine QS21 ont été décrites pour la première

BE2017/5958 fois (voir, par exemple, la demande de brevet international WO 96/33739), à ce jour, l'homme du métier n'a obtenu les bénéfices synergiques de la combinaison d'un agoniste de TLR4 et d'une saponine que par la coformulation de ces immunostimulants.

Il demeure un besoin de nouvelles approches d'immunisation qui sont des variantes ou qui fournissent des bénéfices par rapport aux approches actuelles, en étant hautement efficaces, sans risque, formulées de façon pratique, rentables, durables et qui induisent un large spectre de réponses immunitaires présentant une réactivité croisée.

RESUME DE L'INVENTION

Il a été découvert à présent, de façon surprenante, que la coformulation d'agoniste de TLR4 et de saponine n'est pas requise, un agoniste de TLR4 et une saponine peuvent être administrés séparément sans compromission sensible de l'effet adjuvant synergique qui a été observé avec la coformulation.

Par conséquent, il est fourni un agoniste de TLR4 pour une utilisation en tant qu'adjuvant avec une saponine, où l'agoniste de TLR4 est administré séparément de la saponine. Il est également fourni une saponine pour une utilisation en tant qu'adjuvant avec un agoniste de TLR4, où la saponine est administrée séparément de l'agoniste de TLR4.

La présente invention fournit en outre l'utilisation d'un agoniste de TLR4 dans la fabrication d'un adjuvant pour une utilisation avec une saponine, où l'agoniste de TLR4 est administré séparément de la saponine. En outre, il est fourni l'utilisation d'une

BE2017/5958 saponine dans la fabrication d'un adjuvant pour une utilisation avec un agoniste de TLR4, où la saponine est administrée séparément de l'agoniste de TLR4.

Il est également fourni un procédé pour induire une réponse immunitaire chez un sujet utilisant un agoniste de TLR4 et une saponine, caractérisé en ce que l'agoniste de TLR4 et la saponine sont administrés séparément au sujet. Il est fourni un procédé pour induire une réponse immunitaire chez un sujet utilisant un agoniste de TLR4 et une saponine, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :

(i) l'administration au sujet de l'agoniste de TLR4 ;

(ii) l'administration au sujet de la saponine ;

dans lequel les étapes peuvent être entreprises dans n'importe quel ordre et l'agoniste de TLR4 et la saponine sont administrés séparément.

Un procédé pour adjuver la réponse immunitaire d'un sujet à un antigène utilisant un agoniste de TLR4 et une saponine, caractérisé en ce que l'agoniste de TLR4 et la saponine sont administrés séparément au sujet forme également un aspect de l'invention. Il est fourni un procédé pour adjuver la réponse immunitaire d'un sujet à un antigène utilisant un agoniste de TLR4 et une saponine, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :

(i) l'administration au sujet de l'agoniste de TLR4 ;

(ii) l'administration au sujet de la saponine ;

(iii) l'administration au sujet de l'antigène ;

dans lequel les étapes peuvent être entreprises dans n'importe quel ordre, l'agoniste de TLR4 et la

BE2017/5958 saponine sont administrés séparément, et l'antigène peut être éventuellement coformulé avec l'agoniste de TLR4, la saponine ou coformulé avec chacun de l'agoniste de

TLR4 et la saponine.

La présente invention fournit également un kit comprenant : (i) une première composition comprenant un agoniste de TLR4 ; et (ii) une seconde composition comprenant une saponine. L'antigène peut être présent dans la première ou la seconde composition, ou à la fois dans les première et seconde compositions.

Il est fourni des kits comprenant : (i) une première composition comprenant un agoniste de TLR4 ; (ii) une seconde composition comprenant une saponine ; et (iii) des instructions indiquant que l'agoniste de TLR4 et la saponine doivent être administrés séparément. L'antigène peut être présent dans la première ou la seconde composition ou à la fois dans les première et seconde compositions.

La présente invention fournit également un kit comprenant : (i) une première composition comprenant un agoniste de TLR4 ; (ii) une seconde composition comprenant une saponine ; et (iii) une troisième composition comprenant un antigène.

Il est fourni des kits comprenant : (i) une première composition comprenant un agoniste de TLR4 ;

(ii) une seconde composition comprenant une saponine ;

(iii) une troisième composition comprenant un antigène ; et (iv) des instructions indiquant que l'agoniste de TLR4 et la saponine doivent être administrés séparément.

Il est fourni en outre une seringue multi-chambre comprenant un premier compartiment et un second

BE2017/5958 compartiment, ledit premier compartiment comprenant une première composition comprenant un agoniste de TLR4 et ledit second compartiment comprenant une seconde composition comprenant une saponine, lesdites première et seconde compositions étant administrables à un sujet soit séquentiellement soit simultanément (bien que séparément). L'antigène peut être présent dans la première ou la seconde composition, ou à la fois dans les première et seconde compositions. En variante, la seringue multi-chambre peut comprendre un troisième compartiment comprenant une troisième composition comprenant l'antigène.

Il est également fourni un kit comprenant : (i) une première seringue contenant une composition comprenant un agoniste de TLR4 ; et (ii) une seconde seringue contenant une comprenant une saponine. L'antigène peut être présent dans la première ou la seconde composition, ou à la fois dans les première et seconde compositions.

Il est fourni en outre un kit comprenant : (i) une première seringue contenant une composition comprenant un agoniste de TLR4 ; (ii) une seconde seringue contenant une composition comprenant une saponine ; et (iii) une troisième seringue contenant une composition comprenant un antigène.

Pour obtenir pleinement les bénéfices de la présente invention, l'agoniste de TLR4 devra être administré dans une composition qui est sensiblement dépourvue de saponine. En outre, la saponine devra être administrée dans une composition qui est sensiblement dépourvue d'agoniste de TLR4.

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BREVE DESCRIPTION DES FIGURES

Figure 1 : taux d'IFNgamma dans le GLD 6 heures après l'injection à la suite de l'administration de l'antigène gE seul ou de l'antigène gE avec le 3D-MPL et le QS21 séparés ou coformulés chez des souris.

Figure 2 : taux d'IFNgamma à la suite de l'administration de l'antigène gE avec le 3D-MPL et le QS21 séparés ou coformulés chez des souris.

Figure 3 : réponses des lymphocytes T CD4 à la suite de l'administration séparée de l'antigène gE et du 3D-MPL et du QS21 séparés ou coformulés chez des souris.

Figure 4 : rapport des réponses des lymphocytes T CD4 à la suite de l'administration de l'antigène gE et du 3D-MPL et du QS21 séparés ou coformulés chez des souris.

Figure 5 : réponses en anticorps à la suite de l'administration de l'antigène gE et du 3D-MPL et du QS21 séparés ou coformulés chez des souris.

Figure 6 : rapport des réponses en anticorps à la suite de l'administration de l'antigène gE et du 3D-MPL et du QS21 séparés ou coformulés chez des souris.

DESCRIPTION DES IDENTIFIANTS DES SEQUENCES de de

SEQ ID NO :

la souche Μ.

SEQ ID NO :

: séquence polypeptidique séquence polypeptidique tuberculosis H37Rv la souche de Μ.

SEQ ID NO : 4 de RTS de

Rvll96 séquence polypeptidique tuberculosis H37Rv de

Rv0125 séquence polypeptidique de la fusion de M72

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SEQ ID NO : 5 :	séquence	polypeptidique	de	la
fusion de M72-2his
SEQ ID NO : 6 :	séquence	polypeptidique	de	gE
tronqué du virus varicelle zona
SEQ ID NO : 7 :	séquence	polypeptidique		de

l'antigène PreF du RSV conformationnellement contraint

SEQ ID	NO : 8 : séquence	polypeptidique	de	gpl 2 0	du
VIH TV1
SEQ ID	NO : 9 : séquence	polypeptidique	de	gpl 2 0	du
VIH 1086.C.
	DESCRIPTION	DETAILLEE

Il a été découvert à présent, de façon surprenante, que la coformulation d'agoniste de TLR4 et de saponine n'est pas requise. L'agoniste de TLR4 et la saponine peuvent être administrés séparément sans compromission sensible de l'effet adjuvant. Par conséquent, la présente invention permet des variantes d'approches d'administration basées sur la formulation séparée des composants TLR4 et saponine, lesquelles approches sont avantageuses dans des circonstances comme lorsque des difficultés de coformulation existent pour un vaccin particulier (par exemple, la stabilité de la formulation ou pour surmonter d'autres incompatibilités antigène/adjuvant).

Par conséquent, il est fourni un agoniste de TLR4 pour une utilisation en tant qu'adjuvant avec une saponine, où l'agoniste de TLR4 est administré séparément de la saponine. Il est également fourni une saponine pour une utilisation en tant qu'adjuvant avec

BE2017/5958 un agoniste de TLR4, où la saponine est administrée séparément de l'agoniste de TLR4.

La présente invention fournit en outre l'utilisation d'un agoniste de TLR4 dans la fabrication d'un adjuvant pour une utilisation avec une saponine, où l'agoniste de TLR4 est administré séparément de la saponine. En outre, il est fourni l'utilisation d'une saponine dans la fabrication d'un adjuvant pour une utilisation avec un agoniste de TLR4, où la saponine est administrée séparément de l'agoniste de TLR4.

(i) l'administration au sujet de l'agoniste de TLR4 ;

(ii) l'administration au sujet de la saponine ;

Un procédé pour adjuver la réponse immunitaire d'un sujet à un antigène utilisant un agoniste de TLR4 et une saponine, caractérisé en ce que l'agoniste de TLR4 et la saponine sont administrés séparément au sujet forme également un aspect de l'invention. Il est fourni un procédé pour adjuver la réponse immunitaire d'un sujet

BE2017/5958 à un antigène utilisant un agoniste de TLR4 et une saponine, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :

(i) l'administration au sujet de l'agoniste de TLR4 ;

(ii) l'administration au sujet de la saponine ;

(iii) l'administration au sujet de l'antigène ;

dans lequel les étapes peuvent être entreprises dans n'importe quel ordre, l'agoniste de TLR4 et la saponine sont administrés séparément, et l'antigène peut être éventuellement coformulé avec l'agoniste de TLR4, la saponine ou coformulé avec chacun de l'agoniste de TLR4 et la saponine.

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(ii) une seconde composition comprenant une saponine ;

Il est fourni en outre une seringue multi-chambre comprenant un premier compartiment et un second compartiment, ledit premier compartiment comprenant une première composition comprenant un agoniste de TLR4 et ledit second compartiment comprenant une seconde composition comprenant une saponine, lesdites première et seconde compositions étant administrables à un sujet soit séquentiellement soit simultanément (bien que séparément). L'antigène peut être présent dans la première ou la seconde composition, ou à la fois dans les première et seconde compositions. En variante, la seringue multi-chambre peut comprendre un troisième compartiment comprenant une troisième composition comprenant l'antigène.

Il est également fourni un kit comprenant : (i) une première seringue contenant une composition comprenant un agoniste de TLR4 ; et (ii) une seconde seringue contenant une composition comprenant une saponine. L'antigène peut être présent dans la première ou la seconde composition, ou à la fois dans les première et seconde compositions.

Il est fourni en outre un kit comprenant : (i) une première seringue contenant une composition comprenant un agoniste de TLR4 ; (ii) une seconde seringue contenant une comprenant une saponine ; et (iii) une

BE2017/5958 troisième seringue contenant une composition comprenant un antigène.

Définitions

Su j et

Les procédés et les utilisations de la présente invention sont généralement prévus pour des sujets mammifères. Le sujet peut être un animal sauvage ou domestiqué. Les sujets mammifères comprennent, par exemple, des chats, des chiens, des porcs, des moutons, des chevaux ou des bovins. Dans un mode de réalisation de l'invention, le sujet est humain.

Le sujet à traiter en utilisant le procédé de l'invention peut être de tout âge.

Dans un mode de réalisation, le sujet est un nourrisson humain (d'un âge allant jusqu'à 12 mois). Dans un mode de réalisation, le sujet est un enfant humain (d'un âge inférieur à 18 ans) . Dans un mode de réalisation, le sujet est un être humain adulte (âgé de 18 à 59 ans). Dans un mode de réalisation, le sujet est un être humain plus âgé (âgé de 60 ans ou plus).

Administration séparée

Le terme « administrés séparément » exclut la coformulation de l'agoniste de TLR4 et de la saponine, mais comprend l'administration simultanée et l'administration séquentielle de l'agoniste de TLR4 et de la saponine formulés individuellement.

Emplacement de l'administration

L'agoniste de TLR4 et la saponine sont administrés de façon souhaitable à des emplacements d'une proximité

BE2017/5958 spatiale suffisante de telle façon que leur effet adjuvant synergique n'est pas sensiblement compromis.

L'agoniste de TLR4 et la saponine peuvent être administrés par diverses voies appropriées, y compris une administration parentérale, comme intramusculaire ou sous-cutanée. L'agoniste de TLR4 et la saponine peuvent être administrés par des voies différentes. De façon appropriée, l'agoniste de TLR4 et la saponine sont administrés par la même voie, en particulier, par voie intramusculaire.

Lorsque l'antigène est également fourni, l'antigène,

1'agoniste de TLR4 et la saponine peuvent être administrés par des voies différentes. De façon appropriée, l'agoniste de

TLR4, la saponine et

1'antigène sont administrés par la même voie, en particulier, par voie intramusculaire.

L'agoniste de TLR4 et la saponine sont administrés de façon souhaitable à un emplacement drainant vers le même ganglion lymphatique, comme au même membre, en particulier, au même muscle.

De façon appropriée, l'agoniste de TLR4 et la saponine sont administrés par voie intramusculaire même muscle.

Dans certains modes de réalisation, l'agoniste au de

TLR4 et la saponine sont administrés au même emplacement.

Si un antigène est également fourni, de façon appropriée, l'agoniste de TLR4, la saponine et l'antigène sont administrés à un emplacement drainant vers le même ganglion lymphatique, comme au même membre, en particulier, au même muscle et spécialement, au même emplacement.

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Lorsque l'antigène est également fourni, de façon appropriée, l'agoniste de TLR4, la saponine et l'antigène sont administrés par voie intramusculaire au même muscle.

La séparation spatiale des emplacements d'administration peut être au moins de 5 mm, comme au moins de 1 cm. La séparation spatiale des emplacements d'administration peut être inférieure à 10 cm, comme inférieure à 5 cm de distance.

Moment de l'administration

L'agoniste de TLR4 et la saponine sont administrés de façon souhaitable avec une proximité temporelle suffisante de telle façon que leur effet adjuvant synergique n'est pas sensiblement compromis. L'agoniste de TLR4 et la saponine peuvent être administrés à 6 heures l'un de l'autre. De façon appropriée, l'agoniste de TLR4 et la saponine sont administrés à 2 heures l'un de l'autre, en particulier à 1 heure l'un de l'autre, comme à 30 minutes et spécialement à 15 minutes (par exemple, à 5 minutes).

Si l'agoniste de TLR4 et la saponine sont administrés avec un délai, l'agoniste de TLR4 peut être administré en premier et la saponine administrée en second, en variante, de façon appropriée, la saponine est administrée en premier et l'agoniste de TLR4 administré en second.

Lorsqu'un antigène est également fourni, de façon appropriée, l'agoniste de TLR4, la saponine et l'antigène sont tous administrés à 6 heures les uns des autres. De façon appropriée, l'agoniste de TLR4, la saponine et l'antigène sont administrés à 2 heures les

BE2017/5958 uns des autres, en particulier, à 1 heure, comme à minutes et spécialement, à 15 minutes (par exemple, à 5 minutes).

De façon souhaitable, l'agoniste de TLR4 et la saponine sont administrés sans délai intentionnel (en tenant compte des modalités pratiques des un antigène est également l'agoniste de TLR4, la administrés sans délai des modalités pratiques administrations multiples) . Si fourni, de façon appropriée, saponine et l'antigène sont intentionnel (en tenant compte des administrations multiples) .

Le délai entre l'administration de l'agoniste de

TLR4 et de la saponine peut être d'au moins 5 secondes, comme 10 secondes, et en particulier, au moins secondes.

Régimes d'administration

Les approches pour établir une immunité forte et durable comprennent souvent l'addition d'une vaccination répétée, c'est-à-dire, la stimulation d'une réponse immunitaire par l'administration d'une ou de plusieurs autres doses de l'antigène. Ces autres administrations peuvent être effectuées avec le même vaccin (rappel homologue) ou avec un vaccin différent (rappel hétérologue) .

La présente invention peut être appliquée comme une partie d'un régime de sensibilisation/rappel homologue ou hétérologue, comme la vaccination soit de sensibilisation soit de rappel.

Résultat de l'administration

L'agoniste de TLR4 et la saponine peuvent être administrés séparément sans compromission sensible de

BE2017/5958 l'effet adjuvant synergique qui a été observé avec la coformulation. De façon appropriée, la réponse immunologique observée après un procédé de la présente invention est d'au moins 50 % de la réponse observée avec la coformulation, comme au moins 60 %, de façon appropriée au moins 70 %, spécialement au moins 80 % et en particulier au moins 90 %. De façon appropriée, la réponse immunologique observée après un procédé de la présente invention n'est pas inférieure à la réponse observée avec la coformulation.

Dans un mode de réalisation, la réponse immunitaire observée est la production innée d'IFNgamma (telle que décrite dans l'exemple 1). Dans un autre mode de réalisation, la réponse immunitaire observée est une réponse en anticorps (telle que décrite dans l'exemple 2). Dans un troisième mode de réalisation, la réponse immunitaire observée est une réponse des lymphocytes T CD4 (telle que décrite dans l'exemple 2).

Agonistes de TLR4

Un exemple approprié d'un agoniste de TLR4 est un lipopolysaccharide, de façon appropriée, un dérivé non toxique du lipide A, particulièrement un monophosphoryllipide A et de façon plus particulière le monophoshoryllipide A 3-dés-O-acylé (3D—MPL).

Le 3D-MPL est vendu sous le nom de « MPL » par GlaxoSmithKline Biologicals N.A. et il est appelé dans tout le document 3D-MPL. Voir, par exemple, les brevets US No. 4 436 727 ; 4 877 611 ; 4 866 034 et 4 912 094. Le 3D-MPL peut être produit selon les procédés décrits dans le document GB 2 220 211 A. D'un point de vue chimique, il s'agit d'un mélange de monophosphorylBE2017/5958 lipide A 3-désacylé avec 4, 5 ou 6 chaînes acylées. Dans le contexte de la présente invention, du 3D-MPL à petites particules peut être utilisé pour préparer la composition adjuvante aqueuse. Le 3D-MPL à petites particules a une taille de particule telle qu'il peut être stérilisé par filtration à travers un filtre de 0,22 μm. De telles préparations sont décrites dans le document WO 94/21292. De façon appropriée, du 3D-MPL en poudre est utilisé pour préparer des compositions adjuvantes aqueuses utilisées dans la présente invention

D'autres agonistes de TLR4 qui peuvent être utilisés sont des alkyl-glucosaminide phosphates (AGP) tels que ceux décrits dans le document WO 98/50399 ou le brevet US No. 6 303 347 (des procédés de préparation d'AGP sont également décrits) . D'autres AGP sont tels que décrits dans le brevet US No. 6 764 840. Certains AGP sont des agonistes de TLR4, et certains sont des antagonistes de TLR4.

D'autres agonistes de TLR4 qui peuvent être utilisés dans la présente invention comprennent

1'adjuvant glucopyranosyl-lipide (GLA) tel que décrit dans les documents

WO 2009/143457 ou les articles de la littérature Coler

RN et

Development and

Characterization of

Synthetic

Glucopyranosyl Lipid Adjuvant

System as a Vaccine

Adj uvant.

PLoS

ONE e!6333.

do i:10.1371/journal.pone.0016333 et Arias

MA et al.

(2012) Glucopyranosyl Lipid Adjuvant (GLA),

TLR4 Agonist, Promotes Potent Systemic a Synthetic and Mucosal

Responses to Intranasal Immunization with HIVgpl40. PLoS

ONE 7(7): e41144. doi: 10.1371/journal.pone .0041144. Les

BE2017/5958 documents WO 2008/153541 ou WO 2009/143457 sont incorporés ici en référence dans l'objectif de définir des agonistes de TLR4 qui peuvent être utilisés dans la présente invention.

Un agoniste de TLR4, tel qu'un lipopolysaccharide, tel que le 3D-MPL, peut être utilisé dans des quantités situées entre 1 et 100 pg par dose humaine. Le 3D-MPL peut être utilisé à un taux d'environ 50 pg. Les exemples de plages appropriées sont de 40 à 60 pg, de façon appropriée 45 à 55 pg ou 49 à 51 pg, comme 50 pg. Dans un autre mode de réalisation, la dose humaine comprend du 3D-MPL à un taux d'environ 25 pg. Les exemples de plages inférieures comprennent 20 à 30 pg, de façon appropriée 22 à 28 pg ou 24 à 26 pg, comme 25 pg. Les doses humaines prévues pour les enfants peuvent être réduites comparativement à celles prévues pour un adulte (par exemple, réduction de 50 %).

De façon appropriée, l'agoniste de TLR4 pour une utilisation dans l'invention est isolé. Un agoniste de TLR4 existant à l'état naturel « isolé » est un qui est retiré de son environnement d'origine. Par exemple, séparé de certains ou de la totalité des matériaux coexistants dans le système naturel (par exemple, étant fourni sous une forme pure à au moins 50 %, comme à au moins 80 %, en particulier à au moins 90 % et spécialement à au moins 95 % (comme à au moins 99 %) p/p.

Saponines

Une saponine appropriée pour une utilisation dans la présente invention est le Quil A et ses dérivés. Le Quil A est une préparation de saponine isolée de l'arbre d'Amérique du Sud Quillaj a saponaria Molina et décrite

BE2017/5958 pour la première fois comme dotée d'une activité d'adjuvant par Dalsgaard et al. en 1974 (Saponin adjuvants, Archiv, für die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p 243-254). Il a été isolé par CLHP des fractions purifiées de Quil A qui conservent l'activité d'adjuvant sans la toxicité associée au Quil A (voir, par exemple, le document EP 0 362 279) . Les fractions d'un intérêt général comprennent QS7, QS17, QS18 et QS21, par exemple, QS7 et QS21 (également connus en tant que QA7 et QA21). Le QS21 est une saponine d'un intérêt particulier.

Dans certains modes de réalisation de la présente invention, la saponine est un dérivé de quil A de Quillaj a saponaria Molina, de façon appropriée, une fraction immunologiquement active de Quil A, telle que QS7, QS17, QS18 ou QS21, en particulier QS21.

La saponine est fournie de façon optimale dans une composition moins réactogène où elle est neutralisée avec un stérol exogène, tel que le cholestérol, et elle est fournie dans une formulation liposomale telle que définie ici. Plusieurs formes particulières de compositions moins réactogènes dans lesquelles le QS21 est neutralisé avec un cholestérol exogène existent. La saponine/stérol est présentée dans une structure de formulation liposomale. Des procédés pour l'obtention de saponine/stérol dans une formulation liposomale sont décrits dans le document WO 96/33739, en particulier, 1'exemple 1.

Une saponine, telle que le QS21, peut être utilisée dans des quantités situées entre 1 et 100 pg par dose humaine. Le QS21 peut être utilisé à un taux d'environ

BE2017/5958 pg. Les exemples de plages appropriées sont de 40 à 60 pg, de façon appropriée 45 à 55 pg ou 49 à 51 pg, comme 50 pg. Dans un autre mode de réalisation, la dose humaine comprend du QS21 à un taux d'environ 25 pg. Les exemples de plages inférieures comprennent 20 à 30 pg, de façon appropriée 22 à 28 pg ou 24 à 26 pg, comme 25 pg Les doses humaines prévues pour les enfants peuvent être réduites comparativement à celles prévues pour un adulte (par exemple, réduction de 50 %) .

Le rapport pondéral de l'agoniste de TLR4 sur la saponine est de façon appropriée situé entre 1/5 et 5/1, de façon appropriée 1/1. Par exemple, lorsque du 3D-MPL est utilisé dans une quantité de 50 pg ou 25 pg par dose, alors, de façon appropriée, du QS21 peut être également utilisé dans une quantité de 50 pg ou 25 pg par dose (par exemple, dose humaine).

De façon appropriée, la saponine utilisée dans l'invention est isolée. Une saponine existant à l'état naturel « isolée » est une qui est retirée de son environnement d'origine. Par exemple, séparée de certains ou de la totalité des matériaux coexistants dans le système naturel (par exemple, étant fournie sous une forme pure à au moins 50 %, comme à au moins 80 %, en particulier à au moins 90 % et spécialement à au moins 95 % (comme à au moins 99 %) p/p.

Liposomes

La saponine et/ou l'agoniste de TLR4 peuvent être formulés avec tout support approprié. La saponine et l'agoniste de TLR4 peuvent être formulés avec des supports différents, ou l'un peut être formulé avec un support et l'autre non formulé avec un support.

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La saponine est formulée de façon appropriée avec des liposomes. Eventuellement, l'agoniste de TLR4 et la saponine sont formulés avec des liposomes.

La taille des liposomes peut varier de 30 nm à plusieurs μm selon la composition en phospholipides et le procédé utilisé pour leur préparation. Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, la taille des liposomes se situera dans la plage de 50 nm à 500 nm et dans d'autres modes de réalisation, de 50 nm à 200 nm.

De façon optimale, les liposomes devront être stables et avoir un diamètre de -100 nm pour permettre la stérilisation par filtration.

Le terme « liposome » est bien connu dans l'art et définit une catégorie générale de vésicules qui comprennent une ou plusieurs bicouches lipidiques entourant un espace aqueux. Les liposomes sont ainsi constitués d'une ou de plusieurs bicouches de lipides et/ou de phospholipides et peuvent contenir d'autres molécules, telles que des protéines ou des glucides, dans leur structure. Du fait que des phases à la fois lipidiques et aqueuses sont présentes, les liposomes peuvent encapsuler ou emprisonner un matériau soluble dans l'eau, un matériau soluble dans les lipides, ou des composés amphiphiles.

Tel qu'utilisé ici, un « adjuvant à base de liposomes neutres » signifie que l'adjuvant comprend des liposomes neutres pour la présentation des agents immunopotentialisateurs inclus.

L'intégrité structurale des liposomes peut être estimée par des procédés tels que la diffusion dynamique de la lumière (DDL) mesurant la taille et la

BE2017/5958 polydispersité des liposomes, ou, par microscopie électronique pour l'analyse de la structure des liposomes. Dans un mode de réalisation, la taille moyenne des particules (par spectroscopie par corrélation de photons) se situe entre 95 et 120 nm, et/ou, l'indice de polydispersité (par spectroscopie par corrélation de photons) n'est pas supérieur à 0,2. Dans un autre mode de réalisation, la taille moyenne des particules (par spectroscopie par corrélation de photons) se situe entre 95 et 120 nm, et/ou, l'indice de polydispersité (par spectroscopie par corrélation de photons) n'est pas supérieur à 0,3.

Les liposomes prévus pour la présente invention peuvent contenir un lipide neutre ou être constitués essentiellement de lipide neutre. Par « lipide neutre », il faut comprendre que la charge nette globale du lipide est (approximativement) de zéro. Par conséquent, le lipide peut être globalement non ionique ou il peut être zwittérionique. Dans un mode de réalisation, les liposomes comprennent un lipide zwittérionique. Les exemples de lipides appropriés sont des phospholipides tels que des espèces de phosphatidylcholine. Dans un mode de réalisation, les liposomes contiennent de la phosphatidylcholine en tant que lipide formant des liposomes qui est de façon appropriée température ambiante. Les exemples de cristallins de phosphatidylcholine non cristallin à tels lipides non comprennent la phosphatidylcholine de j aune d'œuf, la dioléoylphosphatidylcholine (DOPC) ou la dilaurylphosphatidylcholine (DLPC). Dans un mode de réalisation particulier, les liposomes de la présente invention

BE2017/5958 contiennent de la DOPC, ou, sont constitués essentiellement de DOPC. Les liposomes peuvent également contenir une quantité limitée d'un lipide chargé qui augmente la stabilité de la structure liposome-saponine pour les liposomes composés de lipides saturés. Dans ces cas, la quantité de lipide chargé est de façon appropriée de 1 à 20 % p/p, de préférence de 5 à 10 % p/p de la composition liposomale. Les exemples appropriés de ces lipides chargés comprennent le phosphatidylglycérol et la phosphatidylsérine. De façon appropriée, les liposomes neutres contiendront moins de 5 % p/p de lipide chargé, comme moins de 3 % p/p ou moins de 1 % p/p.

Les liposomes prévus pour la présente invention peuvent comprendre en outre un stérol. Les stérols appropriés comprennent le β-sitostérol, le stigmastérol, 1'ergostérol, 1'ergocalciférol et le cholestérol. Dans un mode de réalisation particulier, la formulation liposomale comprend du cholestérol en tant que stérol. Ces stérols sont bien connus dans l'art, par exemple, le cholestérol est divulgué dans l'index Merck, llème Edn., page 341, en tant que stérol existant à l'état naturel trouvé dans la graisse animale. Le rapport du stérol sur le phospholipide est de 1 à 50 % (mol/mol) , de façon appropriée de 20 à 25 %.

Le rapport de saponine/stérol sera généralement de l'ordre de 1/100 à 1/1 (p/p), de façon appropriée entre 1/10 et 1/1 (p/p), et de préférence de 1/5 à 1/1 (p/p). De façon appropriée, un excès de stérol est présent, le rapport de saponine/stérol étant au moins de 1/2 (p/p). Dans un mode de réalisation, le rapport de saponine/

BE2017/5958

stérol	est	de 1/5 (p/p). Dans un	mode	de réalisation,	le
stérol	est	le cholestérol.
La quantité de liposomes	(poids de lipide et	de
stérol	) se	situera généralement	dans	la plage de 0,1	mg
à 10	mg	par dose humaine	d ' une	composition,	en

particulier 0,5 mg à 2 mg par dose humaine d'une composition.

Dans un mode de réalisation particulièrement approprié, les liposomes utilisés dans l'invention comprennent (comme sont constitués essentiellement) de la DOPC et un stérol, en particulier le cholestérol. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, une composition utilisée dans l'invention comprend du QS21 sous la forme d'un liposome, où ledit liposome comprend de la DOPC et un stérol, en particulier le cholestérol.

Si l'agoniste de TLR4 est formulé avec des liposomes, ceux-ci peuvent être les mêmes que ou différents des liposomes utilisés avec la saponine. Par conséquent, l'agoniste de TLR4 (tel que le 3D-MPL) peut être formulé avec des liposomes comprenant de la DOPC et un stérol, en particulier le cholestérol.

Antigène

Les compositions, les kits et les procédés de la présente invention peuvent comprendre un immunogène ou un antigène. Dans certains modes de réalisation, les compositions, les kits et les procédés de la présente invention peuvent comprendre un polynucléotide codant pour l'immunogène ou l'antigène.

Par le terme « immunogène », il est signifié un polypeptide qui est capable de déclencher une réponse immunitaire. De façon appropriée, l'immunogène est un

BE2017/5958 antigène qui comprend au moins un épitope de lymphocyte B ou T. La réponse immunitaire déclenchée peut être une réponse des lymphocytes B spécifique de l'antigène, qui produit des anticorps neutralisants. La réponse immunitaire déclenchée peut être une réponse des lymphocytes T spécifique de l'antigène, qui peut être une réponse systémique et/ou une réponse locale. La réponse des lymphocytes T spécifique de l'antigène peut comprendre une réponse des lymphocytes T CD4+, telle qu'une réponse impliquant des lymphocytes T CD4+ exprimant une pluralité de cytokines, par exemple, l'IFNgamma, le TNFalpha et/ou 1'IL2. En variante, ou en outre, la réponse des lymphocytes T spécifique de l'antigène comprend une réponse des lymphocytes T CD8+, telle qu'une réponse impliquant des lymphocytes T CD8+ exprimant une pluralité de cytokines, par exemple, l'IFNgamma, le TNFalpha et/ou 1'IL2.

L'antigène peut être dérivé (comme obtenu à partir de) d'un pathogène humain ou non humain y compris, par exemple, des bactéries, des champignons, des microorganismes parasitaires ou des parasites multicellulaires qui infectent les vertébrés humains et non humains, ou à partir d'une cellule cancéreuse ou d'une cellule tumorale.

Dans un mode de réalisation, l'antigène est une protéine recombinante, telle qu'une protéine procaryote recombinante.

Dans un mode de réalisation, l'antigène est dérivé

de Plasmodium spp.	(tel que Plasmodium falciparum) , de
Mycobacterium spp.	(tel que Mycobacterium tuberculosis
(TB)), du virus	varicelle zona (VZV) , du virus

BE2017/5958 respiratoire syncytial, du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) , de Moraxella spp. (tel que Moraxella catarrhalis) ou de Haemophilus influenzae non typable (ntHi).

L'antigène peut comprendre ou être constitué de préparations dérivées de parasites qui provoquent le paludisme tels que Plasmodium falciparum ou Plasmodium vivax.

Dans un mode de réalisation, l'antigène peut être la protéine circumsporozoite (CS) de Plasmodium falciparum ou l'un de ses variants. Un variant approprié de la protéine CS peut être un variant dans lequel des parties de la protéine CS sont sous la forme d'une protéine hybride avec l'antigène de surface S issu de l'hépatite B (Ag HBs) . L'antigène variant de CS peut être, par exemple, sous la forme d'une protéine hybride comprenant sensiblement toute la partie C-terminale de la protéine CS, quatre répétitions en tandem ou plus de la région immunodominante de la protéine CS, et l'Ag HBs. La protéine hybride peut comprendre une séquence qui contient au moins 160 acides aminés et qui est sensiblement homologue à la partie C-terminale de la protéine CS, mais dépourvue de la séquence d'ancrage hydrophobe. La protéine CS peut être dépourvue d'au moins 12 des derniers acides aminés de la partie C-terminale. En outre, elle peut contenir 4 ou plus, par exemple, 10 ou plus motifs répétitifs du tétrapeptide Asn-Ala-AsnPro (NANP).

La protéine hybride pour une utilisation dans l'invention peut être une protéine qui comprend une partie de la protéine CS de P. falciparum correspondant

BE2017/5958 sensiblement aux acides aminés 207 à 395 du clone 3D7 de P. falciparum, dérivé de la souche NF54 fusionnés dans le cadre par l'intermédiaire d'un lieur linéaire à l'extrémité N-terminale de 1'Ag HBs. Le lieur peut comprendre une partie de preS2 provenant de l'Ag HBs. Des constructions de CS appropriées pour une utilisation dans la présente invention sont présentées dans le document WO 93/10152, qui a été délivré aux Etats-Unis en tant que brevets US No. 5 928 902 et 6 169 171, les deux étant incorporés en référence dans l'objectif de décrire des protéines appropriées pour une utilisation dans la présente invention.

Une protéine hybride particulière pour une utilisation dans l'invention est la protéine hybride connue en tant que RTS (SEQ ID NO : 1, également divulguée dans les documents WO 2015/150568, WO 93/10152 (dans lequel elle est indiquée par RTS*) et dans le document WO 98/05355, qui est constituée de :

- un résidu de méthionine

- trois résidus d'acides aminés, Met Ala Pro

- une suite de 189 acides aminés représentant les acides aminés 207 à 395 de la protéine CS de la souche 3D7 de P. falciparum

- un résidu de glycine

- quatre résidus d'acides aminés, Pro Val Thr Asn, représentant les quatre résidus carboxy-terminaux de la protéine preS2 du virus de l'hépatite B (sérotype adw), et

- une suite de 226 acides aminés, codés par les nucléotides 1653 à 2330, et spécifiant la protéine S du virus de l'hépatite B (sérotype adw).

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RTS peut être sous la forme de particules mixtes de

RTS,S. Les particules de RTS,S comprennent deux polypeptides, RTS et S, qui peuvent être synthétisés simultanément et former spontanément les structures particulaires composites (RTS,S).

L'antigène peut comprendre ou être constitué de préparations dérivées de Mycobacterium spp., tel que Mycobacterium bovis ou Mycobacterium tuberculosis, en particulier Mycobacterium tuberculosis.

Les antigènes d'intérêt dans le domaine de la tuberculose comprennent Rvll96 et Rv0125. Rvll96 (décrit, par exemple, par le nom de Mtb39a dans Dillon et al. Infection and Immunity 1999 67(6): 2941-2950) est hautement conservé, avec 100 % d'identité de séquence parmi les souches H37Rv, C, Haarlem, CDC1551, 94-M4241A, 98-R604INH-RIF-EM, KZN605, KZN1435, KZN4207, KZNR506, la souche Fil comportant une mutation ponctuelle unique Q30K (la plupart des autres isolats cliniques présentent un excès de 90 % d'identité avec H37Rv). Rv0125 (décrit, par exemple, par le nom de Mtb32a dans Skeiky et al. Infection and Immunity 1999 67(8): 3998-4007) est aussi hautement conservé, avec 100 % d'identité de séquence parmi de nombreuses espèces. Rv0125 pleine longueur comprend une séquence signal N-terminale qui est clivée pour fournir la protéine mature.

Dans un mode de réalisation, l'antigène est dérivé de Rvll96, comme comprend, comme est constitué de, une séquence présentant au moins 70 % d'identité avec SEQ ID NO : 2, comme au moins 80 %, en particulier au moins 90 %, spécialement au moins 95 %, par exemple au moins 98 %, comme au moins 99 %. En général, les

BE2017/5958 antigènes associés à Rvll96 comprendront (comme seront constitués de) un dérivé de SEQ ID NO : 2 comportant un petit nombre de délétions, d'insertions et/ou de substitutions.

Les exemples sont ceux comportant des délétions de jusqu'à 5 résidus au niveau de emplacements, des insertions de jusqu'à 5 résidus au niveau de 0 à 5 cinq emplacements et des substitutions de jusqu'à 20 résidus. D'autres dérivés de Rvll96 sont ceux comprenant (comme constitués de) un fragment de

SEQ ID NO : 2 qui a une longueur d'au moins 200 acides aminés, comme une longueur d'au moins 250 acides aminés, en particulier une longueur d'au moins 300 acides aminés, spécialement une longueur d'au moins 350 acides aminés.

Dans un mode de réalisation, l'antigène est dérivé de Rv0125, comme comprend, comme est constitué de, une moins séquence présentant au d'identité avec

SEQ ID	NO :	3, comme au	moins	80	o O r	en	particulier	au
moins	90 %,	spécialement	au moins	95	o θ r	par exemple	au
moins	98 %,	comme au	moins	99	o 0 ·	En	général,	les

(comme seront antigènes associés à Rv0125 comprendront constitués de) un dérivé de SEQ ID NO : 3 comportant un petit nombre de délétions, d'insertions et/ou de substitutions.

Les exemples sont ceux comportant des délétions de jusqu'à 5 résidus au niveau de emplacements, des insertions de jusqu'à 5 résidus au niveau de 0 à 5 cinq emplacements et des substitutions de jusqu'à 20 résidus. D'autres dérivés de Rv0125 sont ceux comprenant (comme constitués de) un fragment de

SEQ ID NO : 3 qui a une longueur d'au moins 150 acides aminés, comme une longueur d'au moins 200 acides aminés, en particulier une longueur d'au moins 250 acides aminés,

BE2017/5958 spécialement une longueur d'au moins 300 acides aminés. Des dérivés particuliers de Rv0125 sont ceux comprenant (comme constitués de) le fragment de SEQ ID NO : 3 correspondant aux résidus 1 à 195 de SEQ ID NO : 3. D'autres dérivés immunogènes de Rv0125 sont ceux comprenant (comme constitués de) le fragment de SEQ ID NO : 3 correspondant aux résidus 192 à 323 de SEQ ID NO : 3. Des antigènes associés à Rv0125 particulièrement préférés sont des dérivés de SEQ ID NO : 3 dans lesquels au moins l'un (par exemple, un, deux, voire même les trois) de la triade catalytique ont été substituée ou délétés, de telle façon que l'activité protéase a été réduite et la protéine plus facilement produite - le résidu catalytique de sérine peut être délété ou substitué (par exemple, substitué par l'alanine) et/ou le résidu catalytique d'histidine peut être délété ou substitué et/ou le résidu catalytique d'acide aspartique peut être délété ou substitué. Sont spécialement d'intérêt, des dérivés de SEQ ID NO : 3 dans lesquels le résidu catalytique de sérine a été substitué (par exemple, substitué par l'alanine). Sont également d'intérêt, des antigènes associés à Rv0125 qui comprennent, comme sont constitués de, une séquence présentant au moins 70 % d'identité avec SEQ ID NO : 3, comme au moins 80 %, en particulier au moins 90 %, spécialement au moins 95 %, par exemple au moins 98 %, comme au moins 99 % et dans lesquels au moins l'un de la triade catalytique a été substitué ou délété ou ceux comprenant, comme constitués de, un fragment de SEQ ID NO : 3 qui a une longueur d'au moins 150 acides aminés, comme une longueur d'au moins 200 acides aminés,

BE2017/5958 en particulier une longueur d'au moins 250 acides aminés, spécialement une longueur d'au moins 300 acides aminés et dans lesquels au moins l'un de la triade catalytique a été substitué ou délété. D'autres dérivés immunogènes de Rv0125 sont ceux comprenant (comme constitués de) le fragment de SEQ ID NO : 3 correspondant aux résidus 192 à 323 de SEQ ID NO : 3 dans lesquels au moins l'un (par exemple, un, deux, voire même les trois) de la triade catalytique a été substitué ou délété. Des dérivés immunogènes particuliers de Rv0125 sont ceux comprenant (comme constitués de) le fragment de SEQ ID NO : 3 correspondant aux résidus 1 à 195 de SEQ ID NO : 3 dans lesquels le résidu catalytique de sérine (position 176 de SEQ ID NO : 3) a été substitué (par exemple, substitué par l'alanine).

De façon appropriée, l'antigène comprendra, comme sera constitué de, une séquence présentant au moins 70 % d'identité avec SEQ ID NO : 4, comme au moins 80 %, en particulier au moins 90 %, spécialement au moins 95 %, comme au moins 98 %, par exemple au moins 99 %. En général, les antigènes associés à M72 comprendront, comme seront constitués de, un dérivé de SEQ ID NO : 4 comportant un petit nombre de délétions, d'insertions et/ou de substitutions. Les exemples sont ceux comportant des délétions de jusqu'à 5 résidus au niveau de 0 à 5 emplacements, des insertions de jusqu'à 5 résidus au niveau de 0 à 5 cinq emplacements et des substitutions de jusqu'à 20 résidus. D'autres dérivés de M72 sont ceux comprenant, comme constitués de, un fragment de SEQ ID NO : 4 qui a une longueur d'au moins 450 acides aminés, comme une longueur d'au moins

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500	acides	aminés,	comme	une	longueur d'au	moins
550	acides	aminés,	comme	une	longueur d'au	moins
600	acides	aminés,	comme	une	longueur d'au	moins
650	acides	aminés ou	une longueur	d'au moins 700	acides
aminés. Du	fait que	M72	est une protéine de	fusion

dérivée des deux antigènes individuels Rv0125 et Rvll96, tout fragment d'au moins 450 résidus comprendra une pluralité d'épitopes issus de la séquence pleine longueur (Skeiky et al. J. Immunol. 2004 172: 7618-7628 ; Skeiky Infect. Immun. 1999 67(8): 39984007 ; Dillon Infect. Immun. 1999 67(6): 2941-2950).

Un antigène associé à M72 comprendra, comme sera constitué de, une séquence présentant au moins 70 % d'identité avec SEQ ID NO : 4, comme au moins 80 %, en particulier au moins 90 %, spécialement au moins 95 %, comme au moins 98 %, par exemple au moins 99 %.

En général, les antigènes associés à M72 comprendront, comme seront constitués de, un dérivé de SEQ ID NO : 4 comportant un petit nombre de délétions, d'insertions et/ou de substitutions. Les exemples sont ceux comportant des délétions de jusqu'à 5 résidus au niveau de 0 à 5 emplacements, des insertions de jusqu'à 5 résidus au niveau de 0 à 5 cinq emplacements et des substitutions de jusqu'à 20 résidus.

Dans des modes de réalisation particuliers, un antigène associé à M72 comprendra les résidus 2 à 723 de SEQ ID NO : 4, par exemple, comprendra (ou sera constitué de) SEQ ID NO : 4 ou comprendra (ou sera constitué de) SEQ ID NO : 5.

Un autre antigène qui peut être employé conformément à la présente invention est l'antigène de

BE2017/5958 la tuberculose Rvl753 et ses variants, tels que décrits dans le document WO 2010010180, par exemple, une séquence de Rvl753 choisie parmi SEQ ID NO : 1 et 2 à 7 du document WO 2010010180, en particulier SEQ ID NO : 1. Un autre antigène d'intérêt dans le domaine de la tuberculose est Rv2386 et ses variants, tels que décrits dans le document WO 2010010179, par exemple, une séquence de Rv2386 choisie parmi SEQ ID NO : 1 et 2 à 7 du document WO 2010010179, en particulier SEQ ID NO : 1. D'autres antigènes d'intérêt dans le domaine de la tuberculose comprennent Rv3616 et ses variants, tels que décrits dans le document WO 2011092253, par exemple, une séquence naturelle de Rv3616 choisie parmi SEQ ID NO : 1 et 2 à 7 du document WO 2011092253 ou une séquence modifiée de Rv3616 telle que celles choisies parmi SEQ ID NO : 161 à 169, 179 et 180 du document WO 2011092253, en particulier SEQ ID NO : 167. Un autre antigène d'intérêt est HBHA, tel que décrit dans les documents WO 97044463, WO 03044048 et WO 2010149657. Les demandes de brevet susmentionnées WO 2010010180, WO 2010010179, WO 2011092253, WO 97044463, WO 03044048 et WO 2010149657 sont incorporées ici en référence dans leur intégralité dans l'objectif de définir des antigènes qui peuvent être utilisés dans la présente invention.

D'autres antigènes d'intérêt sont ceux comprenant (ou constitués de) : Rvll74, également connu sous le nom de DPV, tel que décrit par SEQ ID NO : 8 du document WO 2010010177 ; Rvl793, également connu sous le nom de MTI ou Mtb9.9, tel que décrit par SEQ ID NO : 10 du document WO 2010010177 ; Rv2087, également connu sous le

BE2017/5958 nom de MSL ou Mtb9.8, tel que décrit par SEQ ID NO : 9 du document WO 2010010177 ; Rv3616, également connu sous le nom de HTCC1 ou Mtb40, tel que décrit par SEQ ID NO : 1 et 2 à 7 du document WO 2010010177 ou SEQ ID NO : 161 à 169, 179 ou 180 du document WO 2011092253 ; et/ou Rv3874, également connu sous le nom de CFP10 ou Tb38.1, tel que décrit par SEQ ID NO : 9 du document WO 2010010177 ; ou l'une de leurs parties immunogènes (comme au moins 20, 50, 75 ou 100 résidus issus de ceux-ci) ou l'un de leurs variants (comme présentant au moins 70 %, 80 %, 90 % ou 95 % d'identité avec ceux-ci). (Les documents WO 2010010177 et WO 2011092253 sont incorporés ici en référence dans leur intégralité dans l'objectif de définir des antigènes qui peuvent être utilisés dans la présente invention) .

Les antigènes de la tuberculose sont de la façon la plus appropriée utilisés sous la forme d'un polypeptide, mais en variante, ils peuvent être fournis sous la forme d'un polynucléotide codant pour ledit polypeptide.

Un autre antigène qui peut être employé conformément à la présente invention est dérivé du virus varicelle zona (VZV). L'antigène du VZV pour une utilisation dans l'invention peut être tout antigène approprié du VZV ou l'un de ses dérivés immunogènes, étant de façon appropriée un antigène purifié du VZV.

Dans un mode de réalisation, l'antigène du VZV est la glycoprotéine gE du VZV (également connue sous le nom de gpl) ou l'un de ses dérivés immunogènes. La protéine gE de type sauvage ou pleine longueur est constituée de 623 acides aminés comprenant un peptide signal, la partie principale de la protéine, une région d'ancrage

BE2017/5958 hydrophobe (résidus 546 à 558) et une queue C-terminale. Dans un aspect, une forme tronquée C-terminale de la gE (également appelée gE tronquée ou forme tronquée de gE) est utilisée, selon laquelle la troncature élimine 4 à 20 pour cent des résidus d'acides aminés totaux à l'extrémité carboxy-terminale. Dans un autre aspect, à la gE tronquée, il manque la région d'ancrage carboxyterminale (de façon appropriée, approximativement les acides aminés 547 à 623 de la séquence de type sauvage). Dans un autre aspect, la gE est une gE tronquée ayant la séquence de SEQ ID NO : 6.

L'antigène gE, ses dérivés sans ancre (qui sont également des dérivés immunogènes) et leur production sont décrits dans le document EP 0 405 867 et les références à l'intérieur [voir également, Vafai A., Antibody binding sites on truncated forms of varicellazoster virus gpl(gE) glycoprotein, Vaccine 1994 12: 12659]. Le document EP 192 902 décrit également la gE et sa production. La gE tronquée est également décrite par Haumont et al. Virus Research (1996) vol 40, p 199-204, incorporé ici dans son intégralité. Une composition de gE du VZV adjuvée appropriée pour une utilisation conformément à la présente invention est décrite dans le document WO 2006/094756, c'est-à-dire, une gE du VZV tronquée en carboxy-terminal en combinaison avec un adjuvant comprenant du QS21, du 3D-MPL et des liposomes contenant en outre du cholestérol. Leroux-Roels I. et al. (J. Infect. Dis. 2012, 206: 1280-1290) ont rapporté lors d'un essai clinique en phase I/II l'évaluation du vaccin sous-unitaire à base de gE tronquée du VZV.

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L'antigène peut comprendre ou être constitué de préparations dérivées du virus respiratoire syncytial humain (RSV). Dans certains modes de réalisation favorables, un antigène polypeptidique est un antigène polypeptidique de la protéine F provenant du RSV. Sont particulièrement appropriés en tant que composant antigène polypeptidique dans le contexte, les antigènes du polypeptide F conformationnellement contraints.

Des protéines

F conformationnellement contraintes ont été décrites auparavant dans les conformations à la fois préfusion (PreF) et postfusion (PostF).

De telles protéines conformationnellement contraintes comprennent généralement un ectodomaine modifié de protéine du

RSV. Un polypeptide d'ectodomaine de protéine est une partie de la protéine

F du RSV qur comprend la totalité ou une partie du domaine extracellulaire de la protéine F du RSV et à laquelle il manque un domaine transmembranaire fonctionnel (par exemple, par délétion ou substitution), qui peut être exprimée, par exemple, sous forme soluble (non fixée à une membrane) en culture cellulaire.

Des exemples d'antigènes de protéine F conformationnellement contraints dans la conformation préfusion ont été décrits dans l'art et sont divulgués en détail, par exemple, dans le brevet US No. 8 563 002 (WO 2009079796) ; la demande publiée de brevet US No. US 2012/0093847 (WO 2010/149745) ; US 2011/0305727 (WO 2011/008974) ; US 2014/0141037, WO 2012/158613 et WO 2014/160463, chacun étant incorporé ici en référence dans l'objectif d'illustrer des polypeptides F de préfusion (et des acides nucléiques), et des procédés

BE2017/5958 pour leur production. Typiquement, l'antigène est sous la forme d'un trimère de polypeptides. D'autres publications fournissant des exemples de protéines F dans la conformation préfusion comprennent : McLellan et al., Science, Vol. 340: 1113-1117 ; McLellan et al., Science, Vol 342: 592-598, et Rigter et al., PLOS One, Vol. 8: e71072, chacun d'entre eux peut être également utilisé dans le contexte des combinaisons immunogènes divulguées ici.

Par exemple, un polypeptide de protéine F stabilisé dans la conformation préfusion comprend généralement un ectodomaine d'une protéine F (par exemple, un polypeptide de protéine F soluble) comprenant au moins une modification qui a stabilisé la conformation préfusion de la protéine F. Par exemple, la modification peut être choisie parmi une addition d'un domaine de trimérisation (généralement à l'extrémité C-terminale), la délétion d'un ou de plusieurs des sites de clivage de la furine (au niveau des acides aminés -105 à 109 et -133 à 136), une délétion du domaine pep27, la substitution ou l'addition d'un acide aminé hydrophile dans un domaine hydrophobe (par exemple, HRA et/ou HRB). Dans un mode de réalisation, l'antigène preF conformationnellement contraint comprend un domaine F2 (par exemple, les acides aminés 1 à 105) et un domaine Fl (par exemple, les acides aminés 137 à 516) d'un polypeptide de protéine F du RSV sans aucun site de clivage de la furine intervenant, où le polypeptide comprend en outre un domaine de trimérisation hétérologue en position C-terminale par rapport au domaine Fl. Eventuellement, l'antigène PreF comprend

BE2017/5958 également une modification qui change la glycosylation (par exemple, augmente la glycosylation), comme une substitution d'un ou de plusieurs acides aminés au niveau des positions correspondant aux acides aminés -500 à 502 d'une protéine F du RSV. Lorsqu'une séquence d'oligomérisation est présente, il s'agit de préférence d'une séquence de trimérisation. Des séquences d'oligomérisation appropriées sont bien connues dans l'art et comprennent, par exemple, la superhélice de la protéine à leucine zipper GCN4 des levures, la séquence de trimérisation provenant de la fibritine du bactériophage T4 (« foldon »), et le domaine trimère de la HA de la grippe. En outre ou en variante, le polypeptide F conformationnellement contraint dans la conformation préfusion peut comprendre au moins deux résidus introduits de cystéine, qui sont en étroite proximité l'un de l'autre et forment un pont disulfure qui stabilise le polypeptide F en pré-fusion du RSV. Par exemple, les deux cystéines peuvent être à environ 10 Ä l'une de l'autre. Par exemple, les cystéines peuvent être introduites au niveau des positions 165 et 296 ou au niveau des positions 155 et 290. Un exemple d'antigène PreF est représenté par SEQ ID NO : 7.

L'antigène peut comprendre ou être constitué de préparations dérivées du VIH. L'antigène peut être une protéine du VIH telle que la protéine d'enveloppe du VIH. Par exemple, l'antigène peut être un polypeptide de la gpl20 d'enveloppe du VIH ou l'un de ses fragments immunogènes.

Un antigène approprié est le polypeptide de la gpl20 du clade B du VIH de SEQ ID NO : 8 de la demande publiée

BE2017/5958

WO 2008/107370 (ou un fragment immunogène de ce polypeptide). SEQ ID NO : 8 du document WO 2008/107370 est incorporée en référence dans cette demande.

Les antigènes appropriés comprennent également un polypeptide comprenant la région V1V2 de SEQ ID NO : 1 de la demande publiée WO 2015/036061, ou un dérivé ou fragment immunogène de la région V1V2 de SEQ ID NO : 1. En outre, un polypeptide comprenant la région V1V2 de SEQ ID NO : 5 du document WO 2015/036061 ou un dérivé ou fragment immunogène de la région V1V2 de SEQ ID NO : 5 peut être utilisé en tant qu'antigène approprié. SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 5 du document WO 2015/036061 sont incorporées en référence.

Dans un autre mode de réalisation, l'antigène peut comprendre deux antigènes polypeptidiques différents ou plus de la gpl20 d'enveloppe du VIH (ou des fragments immunogènes de ces polypeptides). Les antigènes appropriés comprennent les et antigènes polypeptidiques de la gpl20 du clade C du VIH y compris la gpl20 de TV1 (SEQ ID NO : 8) et la gpl20 de 1086.C (SEQ ID NO : 9).

D'autres antigènes appropriés du VIH comprennent les protéines du VIH Nef, Gag et Pol et leurs fragments immunogènes.

La composition peut comprendre un ou plusieurs antigènes de Haemophilus influenzae non typable, par exemple, choisis parmi : la protéine fimbrine [(US 5766608 - Ohio State Research Foundation)] et des fusions comprenant des peptides qui en sont issus [par exemple, des fusions de peptide LB1(f) ; US 5 843 464 (OSU) ou WO 99/64067] ; OMP26 [WO 97/01638 (Cortecs)] ; P6 [EP 281 673 (State University of New York)] ; TbpA et/ou

BE2017/5958

TbpB ; Hia ; Hsf ; Hin47 ; Hif ; Hmwl ; Hmw2 ; Hmw3 ; Hmw4 ; Hap ; D15 (WO 94/12641) ; la protéine D (EP 594 610) ; P2 ; et P5 (WO 94/26304) ; la protéine E (WO 07/084053) et/ou PilA (WO 05/063802). La composition peut comprendre un ou plusieurs antigènes protéiniques de Moraxella catarrhalis, par exemple, choisis parmi : OMP106 [WO 97/41731 (Antex) et WO 96/34960 (PMC)] ; OMP21 ; LbpA et/ou LbpB [WO 98/55606 (PMC)] ; TbpA et/ou TbpB [WO 97/13785 et WO 97/32980 (PMC)] ; CopB [Helminen

ME, et al. (1993) Infect. Immun. 61: 2003-2010] ; UspAl et/ou UspA2 [WO 93/03761 (University of Texas)] ; OmpCD ; HasR (PCT/EP 99/03824) ; PilQ (PCT/EP 99/03823) ; OMP85 (PCT/EP 00/01468) ; lipo06 (GB 9 918 208.1) ; lipoil (GB 9 918 038.2) ; P6 (PCT/EP 99/03822) ; OmplAl (PCT/EP 99/03257) ; et OmpE.

(GB 9 917 977.2) ; lipolO (GB 9 918 302.2) ; lipol8 (PCT/EP 99/03038) ; D15 (PCT/EP 99/06781) ; Hly3

Dans un mode de réalisation, la composition peut comprendre un ou plusieurs antigènes de protéine(s) de H. influenzae non typable (NTHi) et/ou un ou plusieurs antigènes de protéine(s) de M. catarrhalis. La composition peut comprendre la protéine D (PD) de H. influenzae. La protéine D peut être telle que décrite dans le document WO 91/18926. La composition peut comprendre en outre la protéine E (PE) et/ou la piline A (PilA) de H. Influenzae. La protéine E et la piline A peuvent être telles que décrites dans le document WO 2012/139225. La protéine E et la piline A peuvent se présenter sous la forme d'une protéine de fusion ; par exemple, LVL735 tel que décrit dans le document WO 2012/139225. Par exemple, la composition peut

BE2017/5958 comprendre trois antigènes de NTHi (PD, PE et PilA, avec les deux derniers combinés sous la forme d'une protéine de fusion PEPilA). La composition peut comprendre en outre UspA2 de M. catarrhalis. UspA2 peut être tel que décrit dans le document WO 2015125118, par exemple, MC009 ((M)(UspA2 31-564)(HH)) décrit dans le document WO 2015125118. Par exemple, la composition peut comprendre trois antigènes de NTHi (PD, PE et PilA, avec les deux derniers combinés sous la forme d'une protéine de fusion PEPilA) et un antigène de M. catarrhalis (UspA2).

Il peut être fourni une pluralité d'antigènes. Par exemple, il peut être fourni une pluralité d'antigènes pour renforcer la réponse immunitaire déclenchée (par exemple, pour assurer une protection forte), il peut être fourni une pluralité d'antigènes pour élargir la réponse immunitaire (par exemple, pour assurer une protection contre tout un éventail de souches pathogènes ou dans une grande proportion d'une population de sujets) ou il peut être fourni une pluralité d'antigènes pour déclencher actuellement des réponses immunitaires par rapport à un certain nombre de troubles (simplifiant de cette façon les protocoles d'administration). Lorsqu'il est fourni une pluralité d'antigènes, ceux-ci peuvent être sous la forme de protéines distinctes, ou ils peuvent être sous la forme d'une ou de plusieurs protéines de fusion.

Les antigènes peuvent être fournis séparément de l'agoniste de TLR4 et de la saponine ou les antigènes peuvent être fournis en coformulation avec l'agoniste de TLR4, la saponine ou avec l'agoniste de TLR4 et également

BE2017/5958 avec la saponine. Lorsqu'il est fourni une pluralité d'antigènes, certains ou la totalité de ceux-ci peuvent être fournis séparément de l'agoniste de TLR4 et de la saponine ou certains ou la totalité peuvent être fournis dans une coformulation avec l'agoniste de TLR4, la saponine ou avec l'agoniste de TLR4 et également avec la saponine. Eventuellement, un ou des antigènes différents de l'antigène ou des antigènes coformulés avec la saponine peuvent être coformulés avec l'agoniste de TLR4 .

L'antigène peut être fourni dans une quantité de 0,1 à 100 pg par dose humaine.

Autres excipients

L'agoniste de TLR4, la saponine et (selon le cas) l'antigène sont fournis de façon appropriée sous la forme de préparations liquides qui sont sensiblement aqueuses.

De façon appropriée, les compositions utilisées dans la présente invention ont un volume de dose humaine situé entre 0,05 ml et 1 ml, comme entre 0,1 et 0,5 ml, en particulier un volume de dose d'environ 0,5 ml, ou 0,7 ml. Les volumes des compositions utilisées peuvent dépendre de la voie et de l'emplacement de l'administration, avec des doses plus petites étant données par la voie intradermique ou si, à la fois, l'agoniste de TLR4 et la saponine sont administrés au même emplacement.

Dans un autre mode de réalisation, un tampon est ajouté à la composition. Le pH d'une préparation liquide est ajusté au vu des composants de la composition et d'une adéquation nécessaire pour l'administration au sujet. De façon appropriée, le pH d'un mélange liquide est au moins de 4, au moins de 5, au moins de 5,5, au

BE2017/5958 du mélange liquide peut être inférieur à

9, inférieur à inférieur à 7,5 ou inférieur à 7. Dans d' autres modes de réalisation,

Ie pH du mélange liquide se situe entre et 9, entre et comme entre 5,5 et

Un tampon approprié peut tampons acétate, citrate, succinate, le tampon

Na/K2PC>4 ou dans être choisi parmi les tartrate est un

K/K2PO4.

Le tampon peut histidine, maléate, phosphate, et TRIS. Dans un mode de réalisation tampon phosphate être présent dans une quantité d'au moins 6 mM, moins 4 0 mM. Le tampon peut tel le que Na/Na2PC>4, mélange liquide moins 10 mM ou être présent dans le mélange liquide dans une quantité inférieure à 100 mM, inférieure à

Il est parentérale, mM bien les ou inférieure à connu que solutions osmolalité pharmaceutiquement distorsion ou la pharmaceutiquement que les solutions

0 mM.

pour une devront acceptable administration présenter une pour éviter la lyse des cellules.

acceptable présenteront approximativement isotonique ou

Une osmolalité signifiera généralement une osmolalité qui est légèrement hypertonique.

De façon appropriée, les compositions de la présente invention, une fois reconstituées, présenteront une osmolalité située dans la plage de 250 à 750 mOsm/kg, par de

500 exemple, l'osmolalité peut se situer dans la plage

250 à 550 mOsm/kg, comme dans la plage mOsm/kg.

L'osmolalité peut connues dans l'art, osmomètre disponible être mesurée comme par selon des techniques l'utilisation d'un dans le commerce, par exemple,

BE2017/5958 l'instrument Advanced® Model 2020 disponible chez

Advanced Instruments Inc. (Etats-Unis).

Un « agent d' isotonicité » est un composé qui est physiologiquement toléré et confère une tonicité appropriée à une formulation pour empêcher le flux net d'eau à travers les membranes cellulaires qui sont en contact avec la formulation. Dans certains modes de réalisation, l'agent d'isotonicité utilisé pour la composition est un sel (ou des mélanges de sels) . Toutefois, dans d'autres modes de réalisation, la composition comprend un agent d'isotonicité non ionique et la concentration de chlorure de sodium dans la composition est inférieure à 100 mM, comme inférieure à 80 mM, par exemple, inférieure à 50 mM, comme inférieure à 40 mM, inférieure à 30 mM et spécialement inférieure à 20 mM. La force ionique dans la composition peut être inférieure à 100 mM, comme inférieure à 80 mM, par exemple, inférieure à 50 mM, comme inférieure à 40 mM ou inférieure à 30 mM.

Dans un mode de réalisation particulier, l'agent d'isotonicité non ionique est un polyol, tel que le sorbitol. La concentration de sorbitol peut se situer, par exemple, entre environ 3 % et environ 15 % (p/v), comme entre environ 4 % et environ 10 % (p/v) . Des adjuvants comprenant une fraction de saponine immunologiquement active et un agoniste de TLR4 dans lesquels l'agent d'isotonicité est un sel ou un polyol ont été décrits dans le document WO 2012/080369.

La présente invention peut être appliquée pour une utilisation dans le traitement ou la prophylaxie d'une maladie ou d'un trouble associé à un ou plusieurs

BE2017/5958 antigènes décrits ci-dessus. Dans un mode de réalisation, la maladie ou le trouble est choisi parmi le paludisme, la tuberculose, la BPCO, le VIH et l'herpès.

Afin d'obtenir pleinement les bénéfices de la présente invention,

1'agoniste de

TLR4 devra être administré dans une composition qui est sensiblement dépourvue de saponine. De façon appropriée, la composition comprenant l'agoniste de

TLR4 contiendra moins de 1 pg de saponine par dose humaine en particulier moins de 0,5 pg de saponine, spécialement moins de 0,1 pg de saponine (par exemple, dépourvue de saponine). Dans certains modes de réalisation, le 3D-MPL est fourni dans une composition qui contient moins de 1 pg de saponine par dose humaine, en particulier moins de 1 pg de saponine, spécialement moins de 0,1 pg de saponine (par exemple, dépourvue de saponine) . Dans certains modes de réalisation, le 3D-MPL est fourni dans une composition qui contient moins de 1 pg de QS21 par dose humaine, en particulier moins de 0,5 pg de QS21, spécialement moins de 0,1 pg de QS21

En outre, la saponine devra être administrée dans une composition qui est sensiblement dépourvue d'agoniste de TLR4. De façon appropriée, la composition comprenant la saponine contiendra moins de 1 pg d'agoniste de TLR4 par dose humaine, en particulier moins de 0,5 pg d'agoniste de TLR4, spécialement moins de

0,1 pg d'agoniste de TLR4 (par exemple, dépourvue d'agoniste de TLR4). Dans certains modes de réalisation, le QS21 est fourni dans une composition qui contient moins de 1 pg d'agoniste de TLR4 par dose humaine, en particulier moins de 0,5 pg d'agoniste de TLR4,

BE2017/5958 spécialement moins de 0,1 pg d'agoniste de TLR4 (par exemple, dépourvue d'agoniste de TLR4). Dans certains modes de réalisation, le QS21 est fourni dans une composition qui contient moins de 1 pg de 3D-MPL par dose humaine, en particulier moins de 0,5 pg de 3D-MPL, spécialement moins de 0,1 pg de 3D-MPL (par exemple, dépourvue de 3D-MPL).

De façon appropriée, les compositions utilisées dans la présente invention ne comprennent pas de particules de sel d'aluminium.

Seringues multi-chambres

L'utilisation de seringues multi-chambres fournit un procédé pratique pour l'administration séparée de l'agoniste de TLR4 et de la saponine. Les seringues multi-chambres peuvent être configurées pour fournir une administration simultanée mais séparée de l'agoniste de TLR4 et de la saponine, ou elles peuvent être configurées pour fournir une administration séquentielle (dans un ordre ou dans l'autre).

Dans d'autres configurations, un élément peut être fourni sous forme sèche (par exemple, lyophilisée) dans une chambre et reconstitué par le diluant contenu dans l'autre avant l'administration.

Des exemples de seringues multi-chambres peuvent être trouvés dans des divulgations telles que

WO 2016172396, bien que tout un éventail d'autres configurations soit possible.

Les enseignements de toutes présente demande, y compris les les références dans la demandes de brevet et les brevets délivrés, sont incorporés ici en référence dans leur intégralité. Une composition ou une méthode ou

BE2017/5958 un procédé défini(e) comme « comprenant » certains éléments est compris(e) comme englobant une composition, une méthode ou un procédé (respectivement) constitué(e) de ces éléments. Tel qu'utilisé ici, « constitué essentiellement de » signifie que des composants supplémentaires peuvent être présents à condition qu'ils ne modifient pas les propriétés globales ou la fonction.

L'invention va être décrite en outre en référence aux exemples non limitatifs suivants.

Exemple 1 - Etude de 1'impact de la formulation séparée de l'agoniste de TLR4 et de la saponine sur les réponses immunitaires innées chez les souris

Objectif (s)

Le système adjuvant liposomal AS01 induit une signature spécifique des ganglions lymphatiques drainants très précocement après l'injection. L'IFNg inné (i-IFNg) est l'IFNg produit par les cellules innées des ganglions lymphatiques drainants qui, chez les souris, atteint un pic environ 6 heures après l'injection avec l'ASOl et résulte de la synergie entre le 3D-MPL et le QS21 lorsqu'ils sont coformulés dans des liposomes. Par conséquent, l'IFNg détecté 6 h après l'injection chez des souris pourra être un paramètre clé pour distinguer l'intégrité du système adjuvant AS01. On pense que la signature innée est essentielle pour l'effet de l'adjuvant AS01. Dans les sérums humains, la signature de l'IFNg inné est présente chez les patients immunisés avec un vaccin adjuvé avec I'ASOIb et elle est la marque de la protection (MAL-027).

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L'objectif de cette étude a été d'estimer si la coformulation de l'agoniste de TLR4, le 3D-MPL, et de la saponrne, le QS21, est nécessaire pour maintenir la signature observée de

1'i-IFNg.

Pour ceci, des sourrs ont été immunisées par vore intramusculaire avec

1'antigène gE du virus varicelle zona adjuvé avec du 3DMPL et du

QS21 coformulés ou avec du 3D-MPL et du QS21 séparés formulés dans des liposomes. Les ganglions lymphatiques iliaques ont été prélevés 6 heures après l'injection, la teneur en IFNg a été évaluée par un test

ELISA.

Matériaux et procédés

Aperçu de la conception de l'étude

Les souris ont été logées dans un établissement dépourvu de pathogènes et les études animales ont été conduites selon des protocoles approuvés par le Committee on Use and Care of Animals de GSK.

Les souris utilisées dans cette étude étaient des femelles âgées de 6 à 8 semaines de la souche C57BL/6, elles ont été séparées en 3 groupes. Les souris ont toutes reçu les injections intramusculaires dans les muscles gastrocnémiens à droite et à gauche. Pour le groupe 1 (formulation liposomale « combinée ») , chaque souris (n = 20) a reçu 5 pg de gE recombinante (Haumont et al. 1996 ; Dendouga et al. 2012 ; Fochesato et al. 2016) formulée avec 1/125 de la dose humaine d'ASOlß, correspondant à 0,4 pg de 3D-MPL et 0,4 pg de QS21 dans un volume total de 40 pi (volume injecté par muscle = 20 pi, administré en utilisant de seringues chacune avec 10 pl) . Dans le groupe évaluant les formulations liposomales « séparées » (groupe 2), chaque souris (n =

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20) a reçu dans chaque muscle (à droite et à gauche), seringue de 10 μΐ contenant du 3D-MPL (0,4 μg de 3DMPL) et de la gE (1,25 gg) et 1 seringue de 10 μΐ contenant le QS21 (0,4 gg) et la gE (1,25 gg). Dans le groupe 3 (formulation « antigène »), chaque souris (n =

5) a reçu l'antigène gE dans du tampon seul (5 gg/ animal) dans un volume total de 40 gl/animal, administré en utilisant quatre seringues chacune avec 10 gl.

Afin d'injecter avec les deux seringues au niveau du même site, les souris ont été colorées au niveau du site d'injection. Le temps entre chaque injection a été maintenu à un minimum, généralement moins de 30 secondes.

Voir le tableau 1 pour un résumé de la conception de l'étude.

Tableau 1

Résumé de la conception de l'étude

Groupe	Volume inj ecté (gl)	Antigène (pg)	MPL (pg)	QS (pg)
1	Par animal	40	5	0,4	0,4
	Par mu scie	20	2,5	0,2	0,2
	Par	10	1,25	0,1	0,1	Seringue 1
	INJ	10	1,25	0,1	0,1	Seringue 2
2	Par animal	40	5	0,4	0,4

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	Par	20	2,5	0,2	0,2
	mu scie
	Par	10	1,25	0,2	0,2	Seringue 1
	INJ	10	1,25			Seringue 2
3	Par	40	5
	animal
	Par	20	2,5
	mu scie
	Par	10	1,25			Seringue 1
	INJ	10	1,25			Seringue 2

Lectures immunologiques

- Prélèvement de GLD et traitement des échantillons congelés instantanément

Pour l'estimation de la production d'IFNg proinflammatoire, les ganglions lymphatiques iliaques à gauche et à droite ont été prélevés 6 h après 1'immunisation.

Les échantillons tissulaires disséqués à partir de la lymphe drainante ont été homogénéisés individuellement dans 1 ml (0,5 ml/GLD) de PBS contenant un cocktail d'inhibiteurs anti-protéases (Sigma-Aldrich) Les homogénats ont été clarifiés par centrifugation et stockés à -70 °C jusqu'à l'analyse.

- IFNg de souris par test ELISA

Le dosage immunologique Quantikine Mouse IFN-gamma (R&D systems MIF00) est conçu pour mesurer l'IFNg de souris dans le sérum et l'homogénat tissulaire de souris.

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Les résultats obtenus en utilisant de l'IFNg naturel de souris ont montré des courbes dose-réponse qui étaient parallèles aux courbes d'étalonnage obtenues en utilisant les étalons recombinantes du kit. La procédure complète du dosage a été suivie soigneusement et peut être résumée comme il est décrit ci-dessous.

Il a été fourni une microplaque présensibilisée avec l'anticorps de capture. Les échantillons de sérum ou d'homogénat tissulaire (ou les étalons) ont été ajoutés. L'IFNg présent dans l'échantillon est lié par l'anticorps immobilisé après incubation à température ambiante pendant 2 heures. Les matériaux non liés ont été éliminés par lavage (5 lavages, avec le tampon de lavage fourni) . Un second anticorps marqué avec de la HRP (anticorps de détection) a été ajouté et incubé à température ambiante pendant 2 heures pour se lier à l'IFNg capturé. L'anticorps de détection non lié a été éliminé par lavage avec 5 autres lavages. La solution de substrat de tétraméthylbenzidine (TMB) a été ensuite ajoutée aux puits et incubée à température ambiante pendant 30 minutes (protégée contre la lumière) . Le développement de la couleur a été stoppé et l'absorbance de la couleur à 450 nm a été mesurée (E-Max Reader). Les résultats ont été calculés en utilisant le logiciel softmax-pro.

Pour l'analyse statistique, une analyse de modèle de variance comprenant le facteur de groupe a été adaptée sur les mesures d'IFNg des groupes 1 et 2 transformées en log. Les moyennes des moindres carrés et la différence des groupes ont été dérivées du modèle. Après rétrotransformation, les moyennes géométriques avec des

BE2017/5958 intervalles de confiance à 95 % ainsi que le rapport des moyennes géométriques ont été rapportés.

Résultats

Les données sont représentées graphiquement sur les figures 1 et 2. Les valeurs du groupe non adjuvé étaient toutes au-dessous de la limite de détection. Les moyennes géométriques estimées pour chaque groupe sont résumées dans le tableau 2. La comparaison entre la coformulation et l'administration séparée de 3D-MPL et de QS21 est 10 résumée dans le tableau 3.

Tableau 2

Moyennes géométriques (avec intervalles de confiance à

%) de l'IFNg estimé par le modèle ANOVA

	Moyenne	IC à 95 %
Group Descriptio	géométriqu	Limite	Limite
e n	e	inférieur	supérieur
	(pg/ml)	e	e
1 Coformulés	155, 0	119, 8	200,4
2 Séparés	149, 2	115,4	192, 9
	Tableau 3
Comparaison entre les réponse	s en IFNg	obtenues
Rapport des	Intervalles de confiance à 90 %
Comparaison moyennes	Limite	Limite
géométriques* inférieure	supérieure
Administration
séparée contre	0, 96	0,71	1,30
coformulation
*Le dénominateur des	rapports des	moyennes	géométriques
est toujours associé	à la coformu	lation.

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Conclusion

Il a été démontré que la formulation séparée n'est pas inférieure à la coformulation dans les conditions du test.

Exemple 2 - Etude de 1'impact de la formulation séparée de l'agoniste de TLR4 et de la saponine sur les réponses immunitaires adaptatives chez des souris

Objectif (s)

A la lumière de la découverte positive dans l'exemple 1 que les réponses immunitaires innées observées à la suite de l'administration des composants formulés séparément n'ont pas été inférieures aux composants coformulés, les travaux ont été étendus pour étudier tout impact sur les réponses immunitaires adaptatives. Pour ceci, des souris ont été immunisées par voie intramusculaire avec l'antigène gE du virus varicelle zona adjuvé avec du 3D-MPL et du QS21 coformulés ou avec du 3D-MPL et du QS21 séparés dans une plage de doses. Les réponses déclenchées des lymphocytes T et en anticorps ont été ensuite quantifiées.

Matériaux et procédés

Aperçu de la conception de l'étude

Les souris utilisées dans cette étude étaient des femelles âgées de 6 à 8 semaines de la souche C57BL/6, elles ont été séparées en 11 groupes de 5 souris. Les

BE2017/5958 souris ont toutes reçu les injections intramusculaires dans les muscles gastrocnémiens à droite et à gauche au jour 0 et au jour 14. Des échantillons de sérum et de tissu splénique ont été prélevés au jour 21, pour la 5 mesure des réponses spécifiques de gE humorales et des lymphocytes T (CD4 et CD8 Thl) respectivement.

Tableau 4

Résumé de la conception de l'étude

Groupe	Matériau testé	Approche de formulation	Dose de 1'antigène	Dose de chaque immunostimulant
1	gE/3D- MPL +QS21	Coformulation	5 pg	1 pg
2	Séparés
3	Coformulation	0,4 pg
4	Séparés
5	Coformulation	0,2 pg
6	Séparés
7	Coformulation	0,1 pg
8	Séparés
9	Coformulation	0,05 pg
10	Séparés
11	gE/PBS	-	-

Pour chaque groupe, un volume total de 20 μΐ a été administré à chaque occasion. Ceci consistait en 2 injections dans le muscle à gauche de l'une ou l'autre des formulations séparées (pour le 3D-MPL et le QS21 15 séparés) ou des formulations identiques (coformulés et témoin PBS). Afin d'injecter avec les deux seringues au

BE2017/5958 même site, les souris ont été colorées au niveau du site d'injection. Le temps entre les deux injections a été maintenu à un minimum, moins de 30 secondes.

Lectures immunologiques

- Prélèvement des rates et traitement des échantillons pour la suspension cellulaire et la coloration intracellulaire des cytokines (ICS) au jour 7PII

Les rates ont été prélevées dans du milieu RPMI et dissociées en utilisant un broyeur de tissus de type Potter (homogénéiseur) en utilisant deux coups vers le haut et vers le bas. Les échantillons homogénéisés ont été transférés dans des tubes en polypropylène à fond arrondi de 15 ml. Le matériau fibreux a été éliminé par filtration à travers un tamis cellulaire en nylon de 100 μm. Les cellules ont été ensuite lavées, comptées et remises en suspension à 10*7 cellules par ml.

L'ICS (coloration intracellulaire des cytokines) est la technologie qui permet la quantification des lymphocytes T spécifiques de l'antigène sur la base de la production de cytokines.

Des cellules lymphoïdes sont restimulées pendant une nuit in vitro avec des peptides gE en présence d'un inhibiteur de sécrétion (bréfeldine A) . Ces cellules sont ensuite traitées par une procédure immunofluorescence classique utilisant des anticorps fluorescents (coloration extracellulaire : CD4, CD8, coloration intracellulaire : TNFa, IFNg et IL2) .

Les résultats sont exprimés en fréquence de cellules positives pour une cytokine au sein d'une population de lymphocytes T CD4 et CD8. L'analyse s'est

BE2017/5958 concentrée sur les cellules exprimant au moins deux cytokines.

- Dosage de gE par un test ELISA au jour 7PII sur des sérums

Les IgG totales anti-gE (VZV) ont été mesurées par un test ELISA. Des plaques de 96 puits ont été sensibilisées avec l'antigène pendant une nuit à 4 °C. Les plaques ont été ensuite lavées et saturées avec du tampon de saturation pendant 1 heure à 37 °C. Ensuite, 100 μΐ de sérum de souris ou d'étalon ou de témoin dilué ont été ajoutés et incubés pendant 1 heure à 37 °C. Après lavage, les plaques ont été incubées pendant 1 heure à 37 °C avec 100 μΐ d'anticorps anti-IgG de souris-HRP. Après lavage, 100 μΐ de TMB par puits ont été ajoutés et les plaques ont été maintenues dans l'obscurité à température ambiante pendant 15 minutes. Pour stopper la réaction, 100 μΐ de H2SO4 0,4 N ont été ajoutés par puits. L'absorbance a été lue à une longueur d'onde de 450/630 nm par un lecteur de plaques Elisa. Les résultats ont été calculés en utilisant le logiciel Softmax-pro.

Résultats

1. Réponse des lymphocytes T : réponses des lymphocytes T CD4+ spécifiques de gE

Les données sont représentées graphiquement sur les figures 3 et 4. Les moyennes géométriques de chaque groupe sont résumées dans le tableau 5. Les comparaisons de coformulation contre formulation séparée sont résumées dans le tableau 6.

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Tableau 5

CD4+ exprimant au moins 2 cytokines : moyennes géométriques et leurs IC à 95 % par groupe

Procédé	Dose	N	Moyenne géométrique	IC à 95 % - Limite inférieure	IC à 95 % - Limite supérieure
Coformulés	0,05	5	0,33	0,21	0,54
Coformulés	0,1	5	0,40	0,29	0,56
Coformulés	0,2	5	0,52	0,42	0, 64
Coformulés	0,4	5	0,44	0,32	0, 60
Coformulés	1	5	0,48	0,31	0,75
Séparés	0,05	5	0,23	0,12	0,42
Séparés	0,1	5	0,29	0,16	0,53
Séparés	0,2	5	0,43	0,36	0,52
Séparés	0,4	5	0,45	0,36	0,57
Séparés	1	5	0,45	0,34	0, 61

Tableau 6

CD4+ exprimant au moins 2 cytokines : rapports des moyennes géométriques et leurs IC à 95 % (comparaison de formulation dose par dose)

Comparaison	Rapport des moyennes géométrique s	IC à 95 % - Limite inférieur e	IC à 95 % - Limite supérieur e
Séparés/Coformulé s à la dose de 0,05	0, 68	0,35	1,31

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Séparés/Coformulé s à la dose de 0,1	0,72	0,40	1,31
Séparés/Coformulé s à la dose de 0,2	0,83	0, 66	1,05
Séparés/Coformulé s à la dose de 0,4	1,03	0,74	1,42
Séparés/Coformulé s à la dose de 1	0, 94	0, 60	1,48

Dans cette expérience, les fréquences des lymphocytes T CD4+ spécifiques de gE augmentent avec la dose d' immunostimulant jusqu'à la dose de 0,2 pg (1/250HD par animal) atteignant ensuite un plateau. Ceci a été observé pour les formulations séparées et les coformulations (voir le tableau 6). En outre, lorsque l'on regarde le rapport des moyennes géométriques des fréquences des lymphocytes T CD4+ pour les composants séparés/coformulés, les deux approches de formulation induisent des réponses comparables à la dose de 1, 0,4, et 0,2 pg. Une légère différence apparaît avec les doses les plus basses (0,1 et 0,05 pg) (voir le tableau 6).

2. Réponse en anticorps : taux d'IgG anti-gE

Les données sont représentées graphiquement sur les figures 5 et 6. Les moyennes géométriques de chaque groupe sont résumées dans le tableau 7. Les comparaisons de coformulation contre formulation séparée sont résumées dans le tableau 8.

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Tableau 7

Réponse en anticorps : moyennes géométriques et leurs

IC à 95 % par groupe

Procédé	Dose	N	Moyenne géométrique	IC à 95 % - Limite inférieure	IC à 95 % - Limite supérieure
Coformulés	0,05	5	5642,86	3223,63	9877,64
Coformulés	0,1	5	9824,45	4768,72	20 240,18
Coformulés	0,2	5	8708,63	5712,27	13 276,73
Coformulés	0,4	5	13 041,60	10 126,89	16 795,23
Coformulés	1	5	17 620,54	15 231,37	20 384,46
Séparés	0,05	5	3514,16	2200,79	5611,32
Séparés	0,1	5	5920,71	3603,14	9728,96
Séparés	0,2	5	7436,33	5600,54	9873,86
Séparés	0,4	5	13 624,91	8850,08	20 975,86
Séparés	1	5	17 129,23	11 845,40	24 770,00

Tableau 8

Réponse en anticorps : rapports des moyennes géométriques et leurs IC à 95 % (comparaison de formulation dose par dose)

Comparaison	Rapport des moyennes géométrique s	IC à 95 % - Limite inférieur e	IC à 95 % - Limite supérieur e
Séparés/Coformulé s à la dose de 0,05	0, 62	0,34	1,15

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Séparés/Coformulé s à la dose de 0,1	0, 60	0,29	1,27
Séparés/Coformulé s à la dose de 0,2	0,85	0,55	1,32
Séparés/Coformulé s à la dose de 0,4	1,04	0, 68	1, 61
Séparés/Coformulé s à la dose de 1	0, 97	0, 68	1,40

Les résultats suggèrent que les taux d'IgG spécifiques de gE augmentent avec la dose des immunostimulants. Ceci a été observé pour les 5 administrations à la fois séparées et coformulées (voir le tableau 8). En outre, lorsque l'on regarde les rapports des moyennes géométriques des taux d'IgG pour les composants séparés/coformulés, il semble que les deux formulations induisent une réponse similaire en 10 anticorps à la dose de 1, 0,4 et 0,2 pg. Une légère différence apparaît avec les doses les plus basses (0,1 et 0,05 pg) (voir le tableau 9).

Conclusion

Globalement, l'administration séparée de l'agoniste de TLR4 et de la saponine n'a pas produit de changement sensible des réponses cellulaires et en anticorps observées.

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Claims

REVENDICATIONS

1. Agoniste de TLR4 pour une utilisation en tant qu'adjuvant avec une saponine, où l'agoniste de TLR4 est administré séparément de la saponine.
2. Saponine pour une utilisation en tant qu'adjuvant avec un agoniste de TLR4, où la saponine est administrée séparément de l'agoniste de TLR4.
3. Utilisation d'un agoniste de TLR4 dans la fabrication d'un adjuvant pour une utilisation avec une saponine, où l'agoniste de TLR4 est administré séparément de la saponine.
4. Utilisation d'une saponine dans la fabrication d'un adjuvant pour une utilisation avec un agoniste de TLR4, où la saponine est administrée séparément de l'agoniste de TLR4.
5. Procédé pour adjuver la réponse immunitaire à un antigène utilisant un agoniste de TLR4 et une saponine, caractérisé en ce que l'agoniste de TLR4 et la saponine sont administrés séparément.
6. Procédé pour adjuver la réponse immunitaire d'un sujet à un antigène utilisant un agoniste de TLR4 et une saponine, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :

(i) l'administration au sujet de l'agoniste de TLR4 ;

(ii) l'administration au sujet de la saponine ;

(iii) l'administration au sujet de l'antigène ;

dans lequel les étapes peuvent être entreprises dans n'importe quel ordre, l'agoniste de TLR4 et la saponine sont administrés séparément, et l'antigène peut être éventuellement coformulé avec l'agoniste de TLR4,

BE2017/5958 la saponine ou coformulé avec chacun de l'agoniste de

TLR4 et de la saponine.
7. Procédé pour induire une réponse immunitaire chez un sujet utilisant un agoniste de TLR4 et une saponine, caractérisé en ce que l'agoniste de TLR4 et la saponine sont administrés séparément au sujet.
8. Procédé pour induire une réponse immunitaire chez un sujet utilisant un agoniste de TLR4 et une saponine, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :

(i) l'administration au sujet de l'agoniste de TLR4 ;

(ii) l'administration au sujet de la saponine ;

dans lequel les étapes peuvent être entreprises dans n'importe quel ordre, l'agoniste de TLR4 et la saponine sont administrés séparément.
9. Kit comprenant :

(i) une première composition comprenant un agoniste de TLR4 ; et

(ii: ) une seconde composition comprenant une saponine • 10 . Kit selon la revendication 7, comprenant en outre un antigène. 11. Kit selon la revendication 10, dans lequel

l'antigène est présent au sein des première et/ou seconde compositions.
12. Kit comprenant :

(i) une première composition comprenant un agoniste de TLR4 ;

(ii) une seconde composition comprenant une saponine ; et

BE2017/5958 (iii) une troisième composition comprenant un antigène .
13. Seringue multi-chambre comprenant un premier compartiment et un second compartiment, ledit premier compartiment comprenant une première composition comprenant un agoniste de TLR4 et ledit second compartiment comprenant une seconde composition comprenant une saponrne, lesdites première et seconde compositions étant administrables à un su j et soit séguentiellement soit simultanément.
14 . Seringue multi-chambre selon la revendication 13, comprenant en outre au morns un antigène.
15. Seringue multi-chambre selon la revendication 14, comprenant un troisième compartiment, ledit troisième compartiment comprenant une troisième composition comprenant l'au moins un antigène.
16. Seringue multi-chambre selon la revendication 14, dans laguelle au moins un antigène est présent au sein des première et/ou seconde compositions.
17. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon l'une guelcongue des revendications 1 à 16 pour une administration à un sujet humain.
18. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon l'une guelcongue des revendications 1 à 17 où l'agoniste de TLR4 est un lipopolysaccharide.
19. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon l'une guelcongue des

BE2017/5958 revendications 1 à 17 où l'agoniste de TLR4 est un dérivé non toxique du lipide A.
20. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon la revendication 19 où l'agoniste de TLR4 est le monophosphoryl-lipide A.
21. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon la revendication 20 où l'agoniste de TLR4 est un monophosphoryl-lipide A 3-désO-acylé.
22. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon la revendication 18 où l'agoniste de TLR4 est un adjuvant glucopyranosyl-lipide
23. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon l'une quelconque des revendications 1 à 22, où la quantité d'agoniste de TLR4 dans une seule dose pour adulte humain est de 1 à 100 pg, comme 40 à 60 pg ou 20 à 30 pg.
24. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon l'une quelconque des revendications 1 à 23 où la saponine peut être obtenue à partir de Quillaja saponaria.
25. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon la revendication 24 où la saponine comprend un ou plusieurs de QS7, QS17, QS18 et QS21.
26. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon la revendication 25 où la saponine comprend du QS21.
27. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon la revendication 25 où la saponine est constituée de QS21.

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28. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon l'une quelconque des revendications 1 à 27, où la quantité de saponine dans une seule dose pour adulte humain est de 1 à 100 pg, comme 40 à 60 pg ou 20 à 30 pg.
29. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon la revendication 28, où la quantité d'agoniste de TLR4 dans une seule dose pour adulte humain est de 40 à 60 pg, comme environ 50 pg, et la quantité de saponine est de 40 à 60 pg, comme environ 50 pg.
30. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon la revendication 28, où la quantité d'agoniste de TLR4 dans une seule dose pour adulte humain est de 20 à 30 pg, comme environ 25 pg, et la quantité de saponine est de 20 à 30 pg, comme environ 25 pg.
31. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon l'une quelconque des revendications 1 à 30, où l'agoniste de TLR4 et la saponine sont administrés par voie intramusculaire.
32. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon l'une quelconque des revendications 1 à 31, où l'agoniste de TLR4 et la saponine sont administrés à des emplacements espacés d'au moins 5 mm, comme espacés d'au moins 1 cm.
33. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon l'une quelconque des revendications 1 à 32, où l'agoniste de TLR4 et la saponine sont administrés à des emplacements espacés de moins de 10 cm, comme espacés de moins de 5 cm.

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34. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon l'une guelcongue des revendications 1 à 33, où l'agoniste de TLR4 et la saponine sont administrés à un emplacement drainant vers le même ganglion lymphatigue.

35. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon 1 ' une des revendications 1 à 34, où l'agoniste de TLR4 et la

saponine sont administrés par voie intramusculaire au même muscle.
36. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon l'une guelcongue des revendications 1 à 35, où l'agoniste de TLR4 et la saponine sont administrés au même emplacement.
37. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon l'une guelcongue des revendications 1 à 36, où l'agoniste de TLR4 et la saponine sont administrés à 6 heures l'un de l'autre, comme à 2 heures l'un de l'autre, en particulier à 1 heure l'un de l'autre, comme à 30 minutes et spécialement à 15 minutes (par exemple, à 5 minutes).
38. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon l'une guelcongue des revendications 1 à 37, où l'agoniste de TLR4 et la saponine sont administrés espacés d'au moins 5 secondes, comme 10 secondes, et en particulier d'au moins 30 secondes.
39. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon l'une guelcongue des revendications 1 à 38, où l'agoniste de TLR4 est administré avant la saponine.

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40. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon l'une quelconque des revendications 1 à 39, où la saponine est administrée avant l'agoniste de TLR4.
41. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon la revendication 37, où l'agoniste de TLR4 et la saponine sont administrés sans délai.
42. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon l'une quelconque des revendications 1 à 41, où un antigène est fourni et l'agoniste de TLR4, la saponine et l'antigène sont tous administrés en 6 heures, comme en 2 heures, en particulier en 1 heure, comme en 30 minutes et spécialement en 15 minutes (par exemple, en 5 minutes).
43. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon la revendication 42, où un antigène est fourni et l'agoniste de TLR4, la saponine et l'antigène sont tous administrés sans délai.
44. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon l'une quelconque des revendications 1 à 43, pour une utilisation en tant que primo-vaccinâtion.
45. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon l'une quelconque des revendications 1 à 43, pour une utilisation en tant que vaccination de rappel.
46. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon l'une quelconque des revendications 1 à 45, où l'agoniste de TLR4 n'est pas formulé avec des liposomes.

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47. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon l'une guelcongue des revendications 1 à 45, où l'agoniste de TLR4 est formulé avec des liposomes.
48. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon l'une guelcongue des revendications 1 à 47, où la saponine est formulée avec des liposomes.
49. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon la revendication 47 ou 48, où chague dose contient 0,1 à 10 mg, comme 0,5 à 2 mg de liposomes.
50. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon la revendication 47 ou 48, où chague dose contient 0,1 à 10 mg, comme 0,5 à 2 mg de liposomes.
51. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon l'une guelcongue des revendications 1 à 50, où un ou plusieurs antigènes sont également fournis.
52. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon la revendication 51, où un ou plusieurs antigènes sont coformulés avec l'agoniste de TLR4.
53. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon la revendication soit 51 soit 52, où un ou plusieurs antigènes sont coformulés avec la saponine.
54. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon l'une guelcongue des revendications 1 à 53, où l'agoniste de TLR est fourni

BE2017/5958 dans une composition sensiblement dépourvue de saponine, comme comprenant moins de 1 gg de saponine par dose humaine.
55. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon l'une quelconque des revendications 1 à 54, où la saponine est fournie dans une composition sensiblement dépourvue d'agoniste de TLR4, comme comprenant moins de 1 gg d'agoniste de TLR4 par dose humaine.
56. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon l'une quelconque des revendications 1 à 55, où le 3D-MPL est fourni dans une composition sensiblement dépourvue de saponine, comme comprenant moins de 1 gg de saponine par dose humaine.
57. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon l'une quelconque des revendications 1 à 56, où le QS21 est fourni dans une composition sensiblement dépourvue d'agoniste de TLR4, comme comprenant moins de 1 gg d'agoniste de TLR4 par dose humaine.
58. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon l'une quelconque des revendications 1 à 57, où l'agoniste de TLR4 est fourni dans une composition sensiblement dépourvue de QS21, comme comprenant moins de 1 gg de saponine par dose humaine.
59. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon l'une quelconque des revendications 1 à 58, où la saponine est fournie dans une composition sensiblement dépourvue de 3D-MPL, comme comprenant moins de 1 gg de 3D-MPL par dose humaine.

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60. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon l'une quelconque des revendications 1 à 59, où le 3D-MPL est fourni dans une composition sensiblement dépourvue de QS21, comme comprenant moins de 1 pg de saponine par dose humaine.
61. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon l'une quelconque des revendications 1 à 60, où le QS21 est fourni dans une composition sensiblement dépourvue de 3D-MPL, comme comprenant moins de 1 pg de 3D-MPL par dose humaine.
62. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon l'une quelconque des revendications 1 à 61, où la réponse immunologique observée est d'au moins 50 % de la réponse observée avec la coformulation, comme d'au moins 60 %, de façon appropriée d'au moins 70 %, spécialement d'au moins 80 % et en particulier d'au moins 90 %.
63. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon l'une quelconque des revendications 1 à 62, où la réponse immunologique observée n'est pas inférieure à la réponse observée avec la coformulation.
64. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon l'une quelconque des revendications 1 à 63, où l'antigène est dérivé d'un pathogène humain ou non humain y compris, par exemple, des bactéries, des champignons, des micro-organismes parasitaires ou des parasites multicellulaires qui infectent les vertébrés humains et non humains, ou à partir d'une cellule cancéreuse ou d'une cellule tumorale.

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65. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon la revendication 64, où l'antigène est dérivé de Plasmodium falciparum ou Plasmodium vivax, comme l'antigène de SEQ ID NO : 1.
66. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon la revendication 64, où l'antigène dérivé de Mycobacterium spp., comme dérivé de l'une quelconque des SEQ ID NO : 2 à 5.
67. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon la revendication 64, où l'antigène est dérivé du virus varicelle zona, comme l'antigène de SEQ ID NO : 6.
68. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon la revendication 64, où l'antigène est dérivé du virus respiratoire syncytial humain, comme l'antigène de SEQ ID NO : 7.
69. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon la revendication 64, où l'antigène est dérivé du VIH, comme l'antigène de SEQ ID NO : 8 ou 9.
70. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon la revendication 64, où l'antigène est dérivé de H. influenzae non typable (NTHi) et/ou de M. catarrhalis.
71. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon l'une quelconque des revendications 64 à 70, où l'antigène est fourni sous la forme d'un polypeptide.
72. Agoniste de TLR4, saponine, utilisation, procédé, kit ou seringue selon l'une quelconque des

BE2017/5958 revendications 64 à 70, où il est fourni un polynucléotide qui code pour l'antigène polypeptidique.

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