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ANTICORPS MONOCLONAL HUMAIN CONTRE PSEUDOMONAS AERUGINOSA, SA PRODUCTION ET SON APPLICATION
La présente invention concerne un anticorps monoclonal humain contre Pseudomonas aeruginosa (appelé ci-dessous"P. aeruginosa" ou"PA"), et sa production et son utilisation. Plus particulièrement, elle concerne un anticorps monoclonal humain, qui peut reconnaitre une structure commune aux lipopolysaccharides dans P. aeruqinosa de différents sérotypes, et présente une propriété de liaison à P. aeruginosa de deux ou plusieurs serotypes, sa production et utilisation.
L'anticorps monoclonal humain présente, comme il est dit ci-dessus, une propriété de liaison à P. aeruqinosa de deux ou plusieurs sérotypes et également au lipide A des bacteries Gram-négatives, en particulier aux bactéries appartenant aux genres Escherichia, Salmonella et Pseudomonas, si bien qu'il est utile pour la prévention ou le traitement des maladies infectieuses provoquées par P. aeruginosa et également pour les chocs d'endotoxine provoqués par les bactéries Gram négatives.
Les bactéries provoquant des maladies infectieuses, c'est-à-dire les bactéries prophlogistiques, varient avec le développement et les modifications des
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antibiotiques utilisés en clinique. 11 s'ensuit que des maladies infectieuses ä bactéries n'ayant originellement qu'une faible pathogenicite ou virulence peuvent augmenter. Ainsi, P. aeruginosa est actuellement l'une des principales bactéries pathogènes provoquant des maladies infectieuses, dont les graves symptômes mènent souvent ä la mort des malades, en particulier lorsque leurs défenses immunologiques sont fiables à la suite d'une administration continue d'immunosuppresseurs, lorsqu'ils souffrent de cancer ou de
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brulure, etc.
Parmi les divers procédés préventifs ou thérapeutiques pour les infections bactériennes, le plus courant est la chimiothérapie par utilisation d'antibiotiques ou d'agents antimicrobiens. En fait, on a mis au point divers antibiotiques, y compris la streptomycine, la kanamycine, la pénicilline, la céphalo- sporine, etc, qui sont actifs a l'egard de presque toutes les bactéries Gram-positives (p. ex. les staphylocoques) et les bactéries Gram-négatives (p. ex. E. coli) et produisent un effet clinique important. Cependant, on ne connait que peu de medicaments auxquels est sensible P. aeruginosa. Même les médicaments agissent sur P. aeruginosa seulement de façon bactériostatique et non bactéricide.
Ainsi, ils peuvent prévenir la croissance de P. aeruginosa mais ne présentent cliniquement aucun effet thérapeutique remarquable..
L'autre procédé préventif ou thérapeutique est le traitement aux anticorps comprenant l'administration d'immunoglobuline. Ce procédé est souvent réa-
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lisé en association avec la chimiothérapie et attire aujourd'hui de plus en plus l'attention comme substitut de la chimiothérapie. On peut obtenir un sérum à haut titre d'anticorps par immunisation active d'animaux comme les chevaux ou les lapins, et l'on peut effectuer le traitement aux anticorps par administration d'un tel sérum. En fait son remarquable effet thérapeutique a été mis en évidence sur des infections expérimentales en utilisant divers animaux.
On sait, d'après les cas de la toxine de la diphtérie et de la toxine de la vipère que le traitement aux anticorps utilisant des sera provenant d'animaux est tout ä fait efficace même sur les êtres humains. Cependant, l'introduction d'une protéine étrangère, d'origine animale, dans un corps humain provoque de graves effets secondaires comme une anaphylaxie ou d'autres réaction allergiques. 11 est ainsi tres souhaitable de mettre au point une immunoglobuline humaine ayant un haut titre d'anticorps contre les bactéries et présentant un effet thérapeutique marqué sur les infections bactériennes.
On prépare les préparations d'immunoglobuline humaine classiques en recueillant du sang auprès de personnes en bonne santé ou de malades infectés par des bactéries, en soumettant le sang à un fractionnement pour obtenir une fraction d'immunoglobuline, en purifiant la fraction d'immunoglobuline et en
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en éliminant les matières agglutinantes par addition d'éthylèneglycol, traitement avec des proteases, sulfonisation, chromatographie sur des colonnes du type DEAE, etc, suivie par une formulation du produit résultant en
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préparations injectables par voie intramusculaire ou re p intraveineuse.
Ces préparations sont intéressantes en ce qu'elles ne provoquent pas d'anaphylaxie ni d'autres effets secondaires que ceux qui sont observés avec l'administration d'immunoglobuline provenant d'animaux, mais elles ont certains inconvénients. L'un de ces inconvénients est que leur titre d'anticorps contre les bacteries est si faible qu'on peut ne pas nécessairement produire un effet thérapeutique suffisant. Un autre inconvénient est qu'il est difficile de les fournir de manière reproductible avec un haut titre d'anticorps en grande quantité, car on les prépare en utilisant le sang recueilli auprès des personnes en bonne santé ou des malades infectés par des bactéries, et l'obtention de sera ayant de façon constante et uniforme un haut titre en anticorps est très difficile.
Un autre inconvénient est qu'elles peuvent être contaminées par les virus de l'hépatite (p. ex. le virus HB), le virus de la leucémie des cellules T Adultes (ATLV, HTLV), etc, car le sang utilisé comme produit de départ est obtenu chez de nombreuses personnes inconnues. Pour surmonter ces inconvénients, la production d'un anticorps monoclonal humain ayant un fort effet d'inhibition sur les infections ä P. aeruginosa est très souhaitable.
Lorsqu'un anticorps est lié ä la couche superficielle d'un corps bactérien, la phagocytose d'un macrophage sur le corps bactérien est accélérée (c'est l'accélération de la phagocytose due à l'opsonisation), ou bien il se produit une lyse de corps bactérien par le complement. Comme antigène
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cible à la surface du corps bactérien de P. aeruginosa, on connaît les lipopolysaccharides (LPS), les protéines d'enveloppe, les flagelles, les pili, etc. Parmi eux, le 0-polysaccharide qui est un constituant des LPS situé ä la partie la plus extérieure de la cou-
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che superficielle et appelé "antigene 0"a une forte antigénicité, et l'anticorps correspondant ä l'antigene 0 présente généralement un effet preventief ou thérapeutique élevé.
L'antigène 0 est diversifié dans sa structure chimique si bien que les souches appartenant ä P. aeruqinosa sont classées d'après la différence de réactivité immunologique avec un antisérum ou un anticorps monoclonal de souris préparé contre l'antigene 0 de la souche de référence de P. aeruginosa. Cette classification est connue comme sérotypique, et on peut citer comme exemples de cette classification sérotypique : les types 1 ä 17 selon la classification de Homma et coll. (Japan. J. Exp. Med., ! !, 1 (1974) ; les types 1 à 7 selon la classification de Fisher et coll. J.
Bacteriol. 98, 835 (1969) ; les types A à M selon la classification de Nippon Ryokunohkin Kenkyukai Kesseigata-bets Kento lnkai Cömmission d'étude sur la classification des sérotypes, groupe d'étude japonais sur Pseudomonas aeruqinosa (appelee ci-dessous "Commission japonaise") (Japan. J. Exp. Med., 329 (1976)); les types 1 ä 17 selon la classification de l'International Antigenic Typing System (IATS), etc.
Ces classifications et leur correspondance sont
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rappelées dans le tableau l (Japan. J. Exp. Med., 46, 29 (1976) ).
TABLEAU 1 : Classification sérotypique de P. aeruginosa
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<tb>
<tb> commission <SEP> Homma <SEP> et <SEP> coll. <SEP> ITATS <SEP> Fisher <SEP> et <SEP> coll
<tb> Japonaise <SEP> 1983 <SEP> 1969
<tb> 1976
<tb> A <SEP> 1 <SEP> 3 <SEP> B <SEP> 2, <SEP> 7, <SEP> 13, <SEP> 16 <SEP> 2, <SEP> 5, <SEP> 16 <SEP> 3, <SEP> 7
<tb> C <SEP> 3 <SEP> 8 <SEP> 6
<tb> D <SEP> 4 <SEP> 9 <SEP> E <SEP> 5 <SEP> 11 <SEP> 2 <SEP> I
<tb> F <SEP> 6 <SEP> 4 <SEP> G <SEP> 8 <SEP> 6 <SEP> 1
<tb> H <SEP> 9 <SEP> 10 <SEP> 5
<tb> I <SEP> 10 <SEP> 1 <SEP> 4
<tb> J <SEP> 11 <SEP> 15 <SEP> K <SEP> 12 <SEP> 13 <SEP> L <SEP> 14
<tb> M <SEP> 15, <SEP> 17 <SEP> - <SEP> -
<tb> 7, <SEP> 12,14, <SEP> 17 <SEP> -
<tb>
L'antigène 0 de P. aeruqinosa a une structure
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poJ. ymeriquc comprenant d < js mot-ii's rupctitifs de a 5 saccharides, et la séquence de ces motifs varie avec chaque sérotype.
On sait que l'anti- corps spécifique d'un certain antigène 0 présente un fort effet préventif ou thérapeutique pour les infections contre P. aeruginosa du sérotype auquel ledit antigène 0 appartient mais ne présente aucun effet contre P. aeruginosa de n'importe quel autre sérotype.
11 est également connu que 1'on peut produire un anti-
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corps monoclonal humain de façon continue ä l'aide d'une liqnée cellulaire établie capable de produire un anticorps spécifique.
L'etablissement d'une lignée cellulaire capable de produire un anticorps monoclonal spécifique
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de l'antigene 0 du lipopolysaccharide de P. aeruginosa peut être fait par application d'un procédé de transformation à l'aide du virus EB (Epstein,-Barr) ou d'un procédé de fusion cellulaire, etc. Ainsi, la demande de brevet JP-A1-61-69796 indique que la transformation des splénocytes obtenus chez des malades ayant été infectés avec P. aeruqinua dans le passé, avec le virus EB, donne des cellules transformées par le virus EB capables de produire un anticorps monoclonal humain spécifique de l'antigè- ne 0 de P. aeruginosa.
La demande de, brevet JP-Al, 61- 152281 indique également que la stimulation des cellules d'amygdale obtenues ches des malades atteints d'amygdalite avec du phytolaque ou poleweed (PWM) et la fusion des cellules d'amygdale stimulées avec des cellules de myelome de souris (souche P3-X63-Ag8-UI) donne des hybridomes souris-homme capables de produire un anticorps monoclonal humain spécifique de l'antigene 0 de P. aeruqinosa. Cependant, les anticorps monoclonaux humains tels que décrits ci-dessus sont restreints aux anticorps monoclonaux humains spécifiques des serotypes, c'est-à-dire ayant une propriété de liai-
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son avec P. aeruqinosa d'un certain sérotype et n'ayant pas de propriétés de liaison avec P. aeruginosa d'autres sérotypes.
Par ailleurs, la demande de brevet JP-Al-62-187417 décrit l'obtention d'un anticorps monoclonal à réactivité croisée et effet preventif croisé
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à l'égard de P. aeruginosa de deux ou plu- sieurs serotypes, basée sur l'obtention d'une cellule capable de produire un anticorps monoclonal ayant une réactivité croisée vis ä vis des souches de types 2, 5 et 16 de la classification de l'IATS ainsi que des souches des types 3 et 7 dans la classification de Fisher.
Comme on le voit d'après le tableau 1 ci-dessus, cependant, toutes ces souches tombent dans le type B de la classification de la Commission japonaise, et donc, ledit anticorps monoclonal reste toujours spécifique des souches d'un seul sérotype. Ainsi, ledit anticorps monoclonal présente seulement une propriété de liaison avec seulement moins de 20% des souches d'isolats cliniques, et ainsi plusieurs anticorps monoclonaux spécifiques des sérotypes sont nécessaires pour l'utilisation pratique.
L'évolution des maladies infectieuses provoquées par les bactéries Gram-négatives aboutit à une septicémie, qui fait que la vie des malades est souvent mise en danger. Les symptômes typiques de la septicémie sont la pyrexie, le rigor, l'insuffisance organique, le choc, etc. Le choc septique est appe- 16 "choc endotoxinique" et est provoqué par le LPS (lipopolysaccharide, qui est connu comme endotoxine et sécrété par le corps bactérie dans le corps humain à la suite de la prolifération et de la mort d'un grand nombre de bactéries Gram-ndgatives et/ou de la rupture desdites bactéries sous l'action des antibiotiques administrés. On sait que le site actif provoquant le choc endotoxinique est le lipide A du PLS.
Cependant, on ne dispose actuellement d'aucun procédé préventif
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ou thérapeutique efficace contre le choc endotoxinique, et la mortalité due au choc endotoxinique atteint 50%.
C'est pourquoi il existe une forte demande pour le développement d'un procédé préventif ou thérapeutique efficace.
Ziegler et coll. ont administre un E. coli J5 stérilisé à la chaleur (mutant rugueux type Rc) comme vaccin ä des personnes en bonne santé pour obtenir un antisérum, dont il a été démontré qu'il est efficace pour la prévention du choc fatal dû à une bac- térémie (New England J. Med., 307, 1552-1230, (1982).
Ultérieurement, on a procédé ä diverses études animales et cliniques et il s'est révélé que divers anti- sera et anticorps monoclonaux spécifiques d'E. coli J5 ou du core glycolipidique de bactéries Gram-négatives sont efficaces dans la prévention du choc endotoxinique (WO 8404458 i W0850l659 ; EP-A-0174204 ; JA-A-61-130300 ; Mutharia et coll. : Inf. Immun., 45, 631 - 636 (1984) ; Teng et coll. : Proc. Natl. Acad.
Sei., USA, 82, 1790-1794 (1985) ; Gigliotti & Shenep : J. Inf. Dis., 151, 1005 - 1011 (1985) ; Braude et coll. : J. Inf. Dis., 136 (Suppl), S167 - 173 (1977) ; Nellesand Niswander : Inf. Immun., 46, 677-681 (1984) ; Pollack et coll. : J. Clin. Invest., 72, 1874 - 1881 (1983) ; Young et coll. : Clin. Res., 30, 522A (1982) ; Young et coll. : Clin. Res., 32, 518A (1984).
Comme on l'a expliqué ci-dessus, l'anticorps connu spécifique de l'antigene 0 du lipopolysaccharlde de P. aeruginosa n'est efficace que dans la prévention et le traitement des infections provoquées par
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P. aeruginosa du sérotype auquel ledit antigene 0 appartient et ne produit aucun effet préventif ou thérapeutique pour les infections provoquees par
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P. aeruginosa de tout autre sérotype. 11 est donc nécessaire pour la prévention ou le traitement des infections à P. aeruginosa de n'importe quel sérotype de fournir au moins 13 ä 17 types d'anticorps monoclonaux spécifiques de tous les sérotypes de P. aeruginosa.
A cet effet, il faut établit des lignées cellulaires
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produisant des anticorps monoclonaux humains spécifiques d'au moins 13 ä 17 types de sérotypes. En outre, il faut cultiver chacune des lignées cellulaires ä grande échelle ainsi que purifier l'anticorps produit, et cela pose un problème difficile du point de vue industriel. 11 est hautement souhaitable de mettre au point un anticorps monoclonal humain qui peut etre
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lie non seulement à une souche sérotypique de P. aeruginosa mais à plusieurs ou à toutes les souches sérotypiques de manière à produire un effet préventif ou thérapeutique sur les infections dues ä P. aeruginosa de divers sérotypes.
A la suite d'études poussées pour obtenir à l'échelle industrielle un anticorps monoclonal humain efficace dans la prophylaxie et le traitement des maladies infectieuses provoquées par P. aeruginosa et une immunoglobuline humaine de titre élevé contenant un tel anticorps, on a maintenent réussi à établir une lignée cellulare en utilisant un anticorps monoclonal humain venant de lymphocytes B humains qui se lie de façon spécifique ä la structure chimique commune au LPS de P.
aeruginosa de divers sérotypes. En cultivant une tel-
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le lignée cellulaire, on peut obtenir un anticorps monozonal humain réactif vis à vis de 2 ou plusieurs catégo- ries de LPS de différents sérotypes et ayant un effet oreventif ou thérapeutique ä l'égard des infections a P. aeruginosa de deux ou plusieurs sérotypes. Plus specfiquement, l'anticorps monoclonal selon l'invention est caractéristique en ce qu'il présente une propriété de liaison spécifique avec presque toutes les souches de P.
aeruqinosa appartenant aux types A, F, G et M de la classification de la Commission Japonaise et on peut donc le distinguer clairement des anticorps monoclonaux classiques spécifiques d'une seule souche sérotypique ainsi que de l'anticorps monoclonal connu se liant de façon croisée à des souches de sérotypes d'un sousgroupes de ladite classification tel que décrit dans JP-Al-62-187417.
L'invention a donc pour objet de fournir un anticorps humain qui peut reconnaitre un site antigénique commun au LPS de.
P. aeruginosa, en particulier un anticorps monoclonal humain ayant une seule spécificité antigénique (anticorps monospecifique). Un autre objet de l'invention est de fournir une lignée cellulaire humaine qui est capable de produire de façon continue ledit anticorps humain. Un autre objet de l'invention consiste a fournir une préparation d'immunoglobuline humaine pour la prevention ou le traitement des infections bactériennes, et notament des infections à P. aeruginosa et/ou des infections d bactéries Gram-négatives, comprenant une quantité efficace dudit anticorps humain comme ingrédient actif. Un autre objet de l'invention est encore de fournir un procédé de production dudit anticorps humain par culture in vitro ou in vivo de ladite lignée cellu-
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laire humaine.
L' invention a encore pour objet de fournir un procédé pour obtenir ladite lignée cellulaire humaine. Un objet de l'invention est aussi de fournir un nouvel anticorps qui peut reconnaltre la structure chimique commune au LPS des P. aeruginosa et qui réagit de façon croisde au lipide A provenant de bactéries Gram-négatives comme P. aeruginosa, E. coli et S. thyphimurium. Ces objets de l'invention, ainsi que d'autres, apparaîtront aux spécialistes d'après les indications précédentes et la description qui va suivre.
L'anticorps monoclonal humain selon l'invention, qui est spécifique du site antigénique commun au LPS des P. aeruqinosa designe un seul anticorps monoclonal humain qui peut reconnaître le site antigénique commun au LPS des P. aeruginosa de deux ou plusieurs sérotypes, p. ex. des types A, G, F et M, et réagit de façon croisee avec le lipide A du LPS provenant de bactéries Gram- negatives. 11 peut être produit à partir d'un seul clone producteur d'anticorps.
Ledit anticorps monoclonal humain a une proprié- Jté de de liaison avec les souches de P. aeruginosa de '2 ou plusieurs sérotypes ou du LPS qui en dérive, c'est- à-dire une aptitude à accélérer une propriété bactéricide en présence de complément ainsi qu'une phagocytose par un neutrophile et un macrophage (opsonisation), et peut prévenir ou traiter des maladies infectieuses à P. aeruginosa. Les déterminants antigéniques dudit
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anticorps monoclonal humain sont presents dans le LPS des souches des types A, G, F et M, en particulier au site lipidique A et ä la partie polysaccharidique du LPS.
Le serotype utilisé ici est donné selon la classification de la Commission Japonaise, qui est determinée sur la différence de reaction immunochimique en utilisant un antisérum ou un anticorps monoclonal de
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souris spécifiquement réactif avec la souche de référence de P. aeruginosa de chaque sérotype.
Le LPS représente un lipopolysaccharide qui est un constituant de la couche de surface d'un corps bactérien Gram-négatif et comprend un lipide (lipide A) et une partie de core qui y est reliée, ladite partie de core comprenant l'acide 2-céto-3-desoxyoctoni- que, un heptose, l'acide phosphorique, etc, comme constituants et protant une chaine latérale polysaccharidique appelée "antigène O" à son extrémité. L'antigène 0 a une structure polymérique comprenant une chaine droite consti- tue de 2 5 monosaccharides comme motif répétitif.
La composition, la disposition et la configuration de la chaine saccharidique diffèrent selon les sérotypes, et cette différence est la base de la classification en sérotypes.
Telle que décrite ci-dessus, l'invention fournit un anticorps monoclonal humain, qui peut reconnaltre le site du déterminant antigenique commun au LPS des P. aeruginoas et qui réagit également de façon croisée avec le lipide A provenant de bactéries Gram-negatives.
L'anticorps monoclonal humain reagissankde
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facon croisée au lipide A provenant de bactéries Gramnégatives est un anticorps unique de type humain qui peut reconnaitre spécifiquement le lipide A isolé et purifié à partir de bactéries Gram-négatives comme E. coli, S. typhimurium et P. aeruginosa.
Comme l'anticorps monoclonal humain a une propriété de liaison spécifique avec le lipide A des bactéries Gram-négatives y compris P. aeurqinosa et une propriété de neutralisation des activités biologiques comme l'activiste mitogène, la toxicité fatale et la reaction de Schwarzman provoquées par le lipide A en plus de ladite réactivité envers les sites antigeniques communs au LPS des P. aeruginosa, il est utile comme agent préventif ou thérapeutique dans le, choc : endotoxinique provoqué par les bactéries Gram-négatives.
L'anticorps monoclonal humain peut également présenter une propriété de liaison avec le LPS obtenu de E. coli ou S. typhimurium ou avec la partie LPS dans le cas du site lipidique A exposé comme dans une souche déficiente en antigène 0 et en polysaccharides de core : p. ex. souche de type rugueuse profonde).
Le lipide A constitue une partie glycolipidique du LPS ! et peut être préparé à partir du LPS par clivage de la liaison cétoside dans l'acide cetodesoxyoctonique (KDO) avec un acide. 11 comprend un squelette d'ester bêta (l-isaccharide, 1, 4'-di- phosphorique et d'acides gras qui y sont attachés, la quantité d'acides gras étant de 4 moles pour
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1 mole de lipide A. Les types, le nombre et la position de liaison des acides gras varient avec chaque souche.
La lignée cellulaire humaine qui peut produire de façon continue l'anticorps monoclonal humain de l'invention specifiquement réactif envers le déterminant antigénique commun au LPS des P. aeruginosa et en particulier ayant une réactivité croisée avec le lipide A des bactéries Gram-negatives peut être produite par divers procédés, dont certains exemples sont donnés cidessous.
Dans le premier procédé, on infecte des lymphocytes B humains, sensibilises (immunisés) avec P. aeruginosa (bactéries vivantes ou bactéries tuées au formol ou par chauffage), du LPS provenant de P. aeruginosa ou une bactérie Gram-négative, ayant une structure lipidique A à sa surface (bactéries vivantes ou bactéries tuées avec du formol ou par chauffage) de preference E. coli J5 ou S. typhimurium mutants, Rc, Rd ou Re, ou du LPS ou lipide A provenant de ces souches, in vivo ou in vitro, avec le virus d'EB (Epstein-Barr) par melange, de façon que lesdits lymphocytes B soient transformés en lymphocytes qui peuvent proliférer de façon, continue.
A partir des cellules ainsi transformées (avant ou après clonage), on choisit les cellules produisant un anticorps ayant une réactivité spécifique et on les fait proliférer de façon continue in vitro de manière a établir des li-
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res gnees cellulaires qui peuvent produire ledit anticorps de façon continue. Pour la sélection, on peut utiliser un test ELISA (enzyme, linked immunosorbent assay) avec une série de crops bactériens comprenant des souches de P. aeruginosa de 17 sortes différentes de sérotypes
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et E. coli 0-111 : B4 et J5. La sélection peut également se faire par ELISA en utilisant le LPS et le lipide A provenant de P. aeruginosa, E. coli 0-111 : B4 et J5 et une souche sauvage de S. typhimurium et des mutants Ra ä Re comme antigènes.
Dans le second procédé, on soumet des lymphocytes B humains sensibilisés avec P. aeruginosa (bactéries vivantes ou bactéries tuées au formol ou par chauffage), du LPS provenant de aeruginosa, ou d'une bactérie Gram-négative ayant une structure de lipide A ä sa surface (bactéries vivantes ou bactéries tuées au formol ou par chauffage), de préférence E. coli J5 ou S. typhimurium Rc, Rd ou Re mutants
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ou le LPS ou le lipide A provenant de ces souches, à une fusion cellulaire avec des cellules de myélome ou des cellules de lymphoblastolde B pour établir des lignées cellulaires qui peuvent proliférer in vitro de façon continue et produire de façon continue un anticorps
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spécifique de LPS.
Dans le troisième procédé, on soumet les cellules transformées par le virus EB telles qu'établies dans le premier procédé à une fusion cellulaire avec des cellules de myélome ou des cellules de lymphoblastolde B afin d'établir une lignée cellulaire qui peut proliférer in vitro de façon continue et produire un anticorps spécifique de LPS de façon continue.
Les lignées cellulaires ainsi établies peuvent être cultivées in vivo (p. ex. souris nue) ou
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in vitro cette culture suivie par une Operation de collece collec- de et de purification de l'anticorps libéré dans le milieu de culture ou dans le fluide d'ascites pour obtenir
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l'anticorps en grande quantité.
La production de l'anticorps monoclonal de l'invention comprend les étapes suivantes : (1), préparation de lymphocytes B humains sensibilisés avec un antigène ; (2) établissement de lignées cellulaires productrices d'anticorps spécifiques monoclonaux en immortalsant les cellules préparées en (1) ; (3) culture des 1ignées cellulaires telles qu'établies en (2) ; (4) purification de l'anticorps spécifique monoclonal provenant de la culture telle qu'obtenue en (3) ; et (5) production d'une préparation d'immunoglobin de titre élevé comprenant l'anticorps spécifique monoclonal tel que purifié en (4). Chacune de ces étapes sera ex-
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pliquée en détail ci-dessous.
Etape (1) : Comme lymphocytes B humains, on peut utiliser des cellules de lymphocytes humains produisant un anticorps contre le LPS de P. aeruginosa et le lipide A des bactéries Gram-négatives, qui peut etre séparé du sang périphérique par centrifugation en utilisant un liquide de séparation lymphocytaire comme Lymphoprepe ou Mono-Poly Resolving MediumS (Flow Lab. ). On peut également utiliser des lymphocytes B provenant de tissus ou d'organes (p. ex. ganglions lymphatiques, rate) extraits dans un but de diagnostic ou de traitement des maladies, de sang de cordon ombilical, etc.
11 est souhaitable d. obtenir ces cellules auprès de personnes qui ont été autrefois infectées avec P. aeruginosa et dont les cellules sont ainsi sensibilisées. Les personnes en question, dont on peut obtenir les cellules, peuvent être choisies par une mesure préalable du titre d'an-
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ticorps dans leurs sera. On peut également obtenir des lymphocytes B humains auprès de toute personne, quels que soient ses antécédents médicaux et les mélanger avec P. aeruginosa inactivée, du lPS provenant de P. aeruginosa ou de- bactéries Gram-négatives ayant une structure lipidique A à leur surface, de préférence E. coli JS inactivee ou mutant S. thyphimurium Rc, Rd ou Re ou du LPS ou lipide A provenant de bactéries Gram-négatives in vitro dans un but de sensibilisation.
Autrement dit, on peut ajouter n'importe lequel de ces antigènes inactivés aux lymphocytes B. En outre, on peut ajouter des solutions contenant des lymphokines comme des facteurs de prolifération des cellules B ou des facteurs de différenciation des cellules B (p. ex. des lectines végétales comme le mitogène de pokeweek (PWM), des composants de corps bactériens comme le Cowan I, une culture mixte de lymphocytes humains, une culture de rate, de thymus ou de cordon ombilical) à des lymphocytes B humains aux fins de sensibilisation in vitro, ce traitement étant suivi par une prolifération et une différenciation donnant des cellules productrices d'anticorps.
Les lymphocytes humains B ainsi obtenus ont une molécule d'anticorps à la surface cellulaire et peuvent sécréter une faible quantité d'anticorps pendant une certaine periode limitée, mais ils ne sont pas immortels.
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Etape
Pour transformer leslymphocytes B humains sensibilisés ci-dessus en lignées cellulaires immortelles proliférant de façon continue, il existe
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fondamentalement deux procédés, dont le premier comprend l'infection de lymphocytes B avec le virus EB par culture mixte des lymphocytes B humains sensibilises avec le virus EB préparé à partir de cellules B95-8 de Marmouset, de préférence en utilisant de 2 ä 10 TDso de virus par cellule. On inocule des microplaques ä 96 puits avec les cellules ä raison de 0, 5 à 3 x 104 par réservoir, et on effectue la culture en vue de la transformation en utilisant un milieu habituel (p. ex.
RPMI1640, MEM d'Eagle) contenant du sérum de foetus de bovin, du sérum de bovin, du sérum de cheval ou du serum humain en proportion de 2 ä 20% (v/v) en présence de 5 à 10% de C02, ä température de 32 ä 37 C pendant 2 à 5 semaines, temps pendant lequel on échange la moitié du milieu tous les 2 à 4 jours. Si néces- saire, on peut y ajouter de 1 ä 2 vg/ml de cyclosporine A et un agent antibiotique ou antimicrobien pour la prévention de la contamination du mycoplasme. On peut observer les cellules ainsi transformées sous forme de colonies de 20 à 200 cellules au microscope optique 10 jours ou plus après 1'infection et les distinguer facilement des cellules non transformées.
On soumet la culture contenant les cellules transformées ayant suffisamment proliféré dans les puits à un tri pour évaluer le titre d'anticorps par ELISA, on
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s sélectionne les puits sur lesquels on reconnalt e la production d'anticorps et on confirme la spécificité envers le LPS selon la technique du Western blot.
Ensuite, on soumet la culture contenant les amas de cellules transformées ä une aspiration et rejet re- pétés avec une pipette pour briser les amas, on dilue avec la solution de culture pour obtenir une concen-
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tration cellulaire appropriée et on inocule dans une microplaque à 96 puits pour avoir de 0, 5 à 100 cellules par réservoir pour le clonage (procédé de dilution limitante). On peut également effectuer le clonage en utilisant de l'agarose (p. ex. sea plaque agarose). Ainsi, on inocule les cellules transformées (environ 7 x 104 à 7 x 105) dans une plaque de culture
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(diamètre 30 mm) avec 0, 36 à 0, 4% (p/v) d'agarose et on cultive à 37 C sous C02 à 5% pour obtenir une colonie ayant proliféré à partir d'une seule cellule.
Lors du clonage, il est $ouhaitable d'utiliser des cellules péritonéales de souris, des lymphocytes de sang de cordon ombilical humain ou des cellulesspléniques de souris irradiées aux rayons X comme couche d'alimentation.
A partir des lignées cellulaires clonées on choisit celles qui ont une haute productivité en anticorps spécifiques par mesure des titres d'anticorps des surnageants de cultures desdites lignées cellulaires clonées, se10n 1a technique ELISA en utilisant des corps bactériens de P. aeruqinosa de 17 sérotypes différents et d'E. coli 0-11 : B4 et JS comme antigène en phase solide et en outre en utilisant du LPS et du lipide A provenant de P. aeruginosa de 17 sérotypes différents, E. coli 0-111 : B4 et J5, S. typhimurium souche sauvage et mutants Ra à Re comme antigène en phase solide.
On procède au clonage et à la sélection comme ci-dessus de façon répétée deux ou trois fois de manière ä établir une lignée cellulaire transformée ayant un taux de prolifération élevé et produisant l'anticorps spécifique de façon stable en grande quantité.
Le second procédé comprend 1'étape consistant ä soumettre les
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lymphocytes B humains sensibilisés et les cellules de myélome à une fusion cellulaire en présence de polym ye a éthylèneglycol. Les cellules de myélome utilisées sont des mutants déficients en hypoxanthine-guanine phos- phoribosyl transférase (HGPRT) (p. ex. P3X63-Ag 8 (P3),
P3X63-Ag 8. 653) provenant de cellules de myélome de souris, des mutants déficients en HGPRT provenant de jellules de myélome humain U -266, d'hétéromyélome sou- ris-homme SHM-D33 déficient en HGPRT, etc. On peut également employer des mutants déficients en HGPRT provenant de cellules lymphoblastoldes B humaines.
Comme polyéthy1èneglycol (PEG), on peut utili- ser, par exemple, du PEG 1000 à 6000 à une concentra- tion de 30 à 50% (p/w). On peut accroire l'efficacité de la fusion en y incorporant de la lectine, de la po- ly-L-lysine, du diméthylsulfoxyde, etc.
On peut procéder à la fusion, par exemple, de la même manière qu'il est dit dans l'article de Kohler et coll. (Nature, 256,495 (1975) dans lequel on fusion- ne des cellules de souris pour obtenir un hybridome produisant un anticorps monoclonal de souris. Par exemple, on Melange les lymphocytes B humains sensibilisés et les cellules de myélome déficientes en HGPRT dans une proportion de 10-1 : 1, on y ajoute en plusieurs fois du PEG 3000ä raison de 30 ä 50% (p/v) en 0, 5 ä 1 miigute, et on laisse reposer le mélange resultant pendant 1 à
10 minutes.
Au mélange résultant, on ajoute en 5 à 10 minutes50ml d'un milieu de culture ne contenant pas de sérum, et on ajoute encore du milieu de culture pour obtenir une concentration cellulaire de 105 à 106/mil. On inocule la suspension cellulaire ainsi obtenue dans
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une microplaque ä 96 puits ä raison de 2 x 104 à 2 x 105 cellules par puits.
Le jour suivant, on en remplace la moitié par un milieu contenant de
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l'hypoxanthine, aminoptérine-thymidine (milieu HAT) ou un milieu contenant de l'hypoxanthine-azasérine (mi- lieu HAz). et on effectue la culture à une température de 32 à 370C sous CO2 ä 5% pendant environ 2 ä 3 semaines pendant les- quelles on remplace le milieu de culture par un mi- lieu HAT pendant environ 10 ä 20 jours puis par un mi- lieu contenant de l'hypoxanthine-thymidine (milieu HT) pendant environ 3 à 5 jours.
ä raison de la moitié à des intervalles de 3jours pour obtenir une colonie pro- liférative, c'est-à dire des hybridomes.Il est également possible de choisir un hybridome par l'utilisation combi- née d'inhibiteurs du metabolisme sans utiliser un mu- tant déficient en HGPRT. On mesure le titre d'anticorps du milieu de culture de l'hybridome parla technique
ELISA comme mentionné ci-dessus, on choisit la lignée cellulaire produisant l'anticorps spécifique ayant la spécificité de réaction ci-dessus, et on confirme la spécificité envers le polysaccharide par la technique du Western blot.
On répète le clonage deux ou trois fois par le procédé de dilution limitante ou le procédé à l'agarose pour obtenir une lignée cel- lulaire stable ayant une grand vitesse de de prolifération et une productivité d'anticorps spé-
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cifique élevée.
Dans le premier procédé tel qu'expliqué cidessus, on peut utiliser des cellules transformées par le virus EB au lieu de lymphocytes B humains sen- sibilises.
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On peut faire proliférer de façon continue les lignées cellulaires telles qu'établies à partir de lymphocytes B humains sensibilisés selon le procédé de transformation au virus EB ou le procédé de fusion cellulaire (hybridomes) et leur faire produire en grande quantité et de façon stable l'anticorps spécifique.
Etape (3) : -
On fait incuber les cellules transformées ainsi éta- blies ou les hybridomes (0, 5 - 5 x 105 cellules/ml) ä l'état stationnaire ou avec rotation dans un milieu de culture habituel pour cellules animales dans un ré-
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cipient tel qu'un ballonou une plaque d'incubation par utilisation d'un incubateur ä C02 à 32 - 370C sous C02 à 2 - 10%. En particulier lorsqu'on fait l'incubation à grande échelle, on, peut utiliser une cuve de fermentation, un système de f ibres creuses, ou similaire, conçu pour les cellules animales. Le milieu de culture habituel peut entre, par exemple, un milieu contenant de 2 ä 20% de sérum de fcetus de bovin, de veau, de vache, de cheval humainousimilairep. ex.
RPMI1640, d'Eagle), un milieu dépourvu de sérum contenant les composants sous forme de traces nécessaires pour la prolifération des cellules (p. ex. l'insuline, la tranferrine, l'éthanolamine, la sélénite, l'albumine bovine des lipides), etc.
Etape (4) :-
La purification de l'anticorps peut s'effec- tuer par des procédés biochimiques classiques (p. ex. fractionnement par précipitation au sulfate d'ammonium, fractionnement par précipitation à l'éthanol, fractionnement par PEG, chromatographie d'échange d'ions, filtration sur gel, chromatographie d'affini-
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té, chromatographie en phase liquide ä grande vitesse, électrophorèse). Dans le procédé de purification, il faut prendre garde d'empêcher la production d'agglutination ou la dépression de l'activité d'anticorps. A cet effet, on peut ajouter de la sérum albumine humaine (HSA) en une quantité de 0, 05 à 2%.
On peut quelquefois préférer l'addition d'acides aminés comme la glycine ou l'alpha-alanine, en particulier d'acides aminés basiques comme la lysine, l'arginine ou l'histidine, les saccharides comme le glucose ou le mannitol, les sels, comme le chlorure de sodium, etc. Une agglutination tend ä se produire, en particulier dans le cas d'un anti corps 19M, et le traitement avec la beta- propiolactone, l'anhydride acétique, ou similaire est effi- cace dans la prevention d'une telle agglutination.
Dans ce cas, une administration intraveineuse est rendue possible.
Etape (5) : -
On peut formuler. l'anticorps monoclonal purifié en une préparation biologique parun procédéconnuensoi dans lequel, par exemple, on filtre à travers un filtre à membrane pour enlever les bactéries, on verse dans des flacons stérilisés avec un stabilisateur et on lyophilise.
La preparation d'anticorps monoclonal humain peut ne comprendre qu'un seul type d'anticorps monoclonal humain contre le LPS de P. aeruginosa pour son utilisation comme agent préventif ou thérapeutique contre les infections à P. aeruqinosa. De préférence, la preparation comprend en outre au moins un type d'anti-
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corps monoclonal humain qui peut reconnaître un déterminant antigénique différent dans la structure moleculaire LPS de P. aeruginosa et/ou au moins un type d'antic. prs humain classique qui peut reconnaitre les exotoxines, les exoenzymes (p. ex. diastase, protease), les protéines d'enveloppe 10U les endotoxines.
La préparation peut egalement comprendre n'importe quel anticorps humain contre les bactéries autres que P. aeruginosa, les virus, les champignons, les protozoaires, les cellules cancéreuses, etc. En outre, l'anticorps monoclonal humain de l'invention peut être incorporé dans une préparation d'immunoglobuline humaine
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classique pour constituer une preparation d'immunoglobuline à titre é1evé contre le LPS.
L'anticorps monoclonal humain de l'invention appartient surtout à la classe IgG ou IgM, mais n'y est pas limite. L'anticorps monoclonal humain a une propriété de liaison avec P. aeruginosa de deux ou plusieurs catégories de sérotypes, présente une activité bactéricide en présence d'un complément et a une activité d'accélération de la phagocytose de P. aeruginosa par les neutrophiles et les macrophages (opsonisation). On peut traiter les infections expérimentales de la souris avec des P. aeruginosa de deux ou plusieurs catégories de sérotypes par administration d'un seul anticorps monoclonal humain de l'invention.
L'anticorps monoclonal humain de l'invention a une propriété de liaison spécifique avec les corps bacteriens de P. aeruginosa IID1001 (ATCC 27577), IID 1006 (ATCC 27582), IID1020 et IID 1015 parmi les souches
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de réfeence pouria classification des sérotypes de P. aeruginosa. En outre, il a une propriété de liaie son au lipide A des bactéries Gram-négatives et il permet de neutraliser une activité biologique comme l'activité léthale ou la réaction de Schwartzman.
L'anticorps monoclonal humain peut aussi se lier avec les liposaccharides provenant de E. coli mutant Rc J5 (ATCC 39355) S. minnesota type rugueux mutantsrc, Rd et Re et P. aeruginosa IID1001 (ATCC 27577) mais non à ceux qui proviennent d'E. coli souche de type lisse 0-11 : 84, S. minnesota souche type sauvage lisse, mutant type rugueux Ra et Rb et P. aeruginosa IID1002 (ATCC 27578) et PA 103.
Tel que compris d'après ce qui precede, l'anticorps monoclonal humain de l'invention diffère de
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l'anticorps monoclonal connu spécif ique de sérotype et de l'anticorps monoclonal 1 connu à réaction croisée de sousgroupe serotypique. Comme il peut etre lié à P. aeruginosa de deux ou plusieurs sérotypes différents, on peut couvrir P. aeruginosa de tous les sérotypes ou presque tous les sérotypes par un plus petit nombre d'anticorps monoclonaux y compris celuici. L'anticorps monoclonal humain de l'invention est donc très intéressant du point de vue de la prévention et du traitement des infections à P. aeruginosa. En outre, il est utile pour la prévention et le traitement du choc endotoxinique, pour lequel on ne dispose pas actuellement d'agents efficaces.
Les déterminants antigéniques reconnus par l'anticorps monoclonal humain de l'invention sont le site du lipide A et le site polysaccharidique du LPS.
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Le site polysaccharidlque à reconnaitre est limite à celui que l'on trouve dans certaines souches sérotypiques, à savoir les types A, F, G et M. On suppose donc que la structure commune au site du lipide A et au site polysaccharidique peut etre presente.
Pour la prévention et le traitement, notamment chez l'hommcdesmaladics infecticuscsä P. aeruginosa, des infections mixtes avec des bactéries contenant P. aeruginosa et du choc endotoxinique dû ä des bactéries Gram-négatives, on peutadminiscrcrune préparation d'immunoglobu- line humaine contenant l'anticorps monoclonal humain à un malade adulte ä raison : d'environ 1 à 10 g à chaque fois en cas oe symptome grave ou
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à raison d'environ 0, 2 à 5 g à chaque fois dans en cas de symptome bénin ou dans un but de prévention.
La teneur en anticorps monoclonal humain de l'invention dans la préparation d'immunoglobuline humaine est généralement d'environ 0, 5 à à 500 mg, de préférence environ 5 ä 50 mg.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un anticorps monoclonal humain tel que défini ci-dessus comme ingrédient actif dans la preparation d'un médicament destiné à prévenir ou ä traiter les infections bactériennes provoquées par P. aeruqinosa et de façon générale par des bactéries Gram-négatives, y compris le choc endotoxinique.
Comme il est dit ci-dessus, l'anticorps monoclonal humain de l'invention a un titre d'anticorps élevé contre son antigène et présente un excellent effet thérapeutique dans le Systeme des infections expérimentales de la souris. Comme il s'agit d'une protéine d'origine humaine, aucun effet secondaire (p. ex. anaphylaxie) tel qu'on en observe après administration d'une protéine hétérologue n'est produit. Comme l'anti-
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corps est produit ä partir d'une 1ignée cellulaire spécifique, la possibilité de contamination par des corps biologiquement dangereux inconnus est bien moindre par comparaison avec les immunoglobulines classiques produits à partir de sang humain prove- nant de nombreuses personnes inconnues.
L'anticorps monoclonal humain de l'invention est produit avec un haut titre d'anticorps in vitro de façon stable en grande quantité, et son procédé de production est plus interessant que les procédés de production classiques utilisant le sang humain avec un contrôle de qualité facile.
L'invention sera expliquée en détail ci-dessous ä l'aide d'exemples, mais il faut comprendre que l'in- vention ne se limite pas à ces exemples.
Exemple 1 Etablissement de 1ignées cellulaires productrices d'anticorps monoclonal humain par le procédé de transformation du virus EB : (1) Préparation de la solution de virus EB et mesure de son titre viral
On met en suspension des cellules B95-8 de mar- mouset produisant et libérant le virus EB dans un milieu RPM11640 contenant 10 % de sérum de foetus de
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veau (FCS) à raison de 6, 5 x 105 ce1lules/ml et on fait incuber à tat stationnaire dans un ballon de culture T-75 (Corning25110) à 37"C sous atmosphere
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de CO a de > o pendant 4 jours. On recueille le sur- nageant de culture et on le soumet à une centrifugation à l'aide d'une centrifugeuse basse vitesse (RS- 20HB ; Tommy Precision Ind. Co. Ltd.) à 2000 tpm pendant 10 minutes.
On filtre le surnageant ä travers un filtre a membrane de 0,45 #(Millex SLHA 0250S).
On met le filtrat dans des tubes ä sérum (MS- 4505 ; Sumitomo Bakelite Co.,--------
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Ltd. ) et on le conserve à -80 C. Lors de l'utilisation, on dilue le contenu de façon appropriée et on l'utilise pour l'expérience de transformation des lymphocytes humains avec le virus EB.
On détermine le titre viral de la solution de virus EB selon le procédé de Moss et coll. (J. General Virology, 17, 233 (1972)) en utilisant des lymphocytes de sang périphérique humain. (PBL) comme cellules inducatrices. Autrement dit, on met une suspension de lymphocytes du sang périphérique'humain (106 cellules/ml) dans du milieu RPMI 1640 contenant 15% de FCS dans une microplaque à 96 puits. (Sumitomo Bakelite) à raison de 100 pl par puits. A chaque puits, on ajoute la solution de virus EB (20 tjl) dans des dilutions en série au dixième (dans un intervalle de 100 ä 107) avec le milieu ci-dessus, et on conduit l'incubation ä 370C sous une atmosphère ä 5% de C02.
On renouvelle le tiers du volume du milieu tous les 3 jours, et au bout de 3 semaines, on examine la présence des cellules transformées au microscope optique. On procède ä l'examen sur 6 puits par dilution, et on détermine la vitesse de transformation. On détermine de façon stochastique la dilution la plus élevée requise pour la transformation de 50% des cellules à partir de 1avitesse de transformation à chaque dilution selon la méthode de Reed et Muench; on calcule la quantité de virus et on la prend comme lTD50, d'après quoi on recalcule la quantité de virus dans l'échantillon d'origine et on la désigne par le nombre de TDo. On obtient ainsi la solution de virus EB ayant une quantité de virus de 105 à 107 TD50/ml.
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(2) mesure du titre d'anticorps anti-P. aeruginosa selon le procédé ELISA
On mesure le titre d'anticorps contre l'antigène
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de surface de P. aeruginosa comme suit. On met en suspension ijj dans une solution de tampon phosphaté (pH 7, 2) comprenant NaCl (8 9/1), KCI (0, 2 9/1), NaHPO4. 12 H2O (2, 99 g/l et KH2P04 (0, 2 9/1) (PBS) pourobte- nir une absorbance de 0,2 à une longueur d'onde de 600 nm. On met la suspension dans des microplaques ä 96 puits (Falcon =3912) à raison de 50 pl par puits, puis on centrifuge à 200 tpm pendant 15 minutes. On ajoute du glutaraldehyd ä 2% ä chaque puits. raison de 50 #l par - puits pour fixer le corps bactérien aux microplaques.
Après enlèvement de la solution bactérienne des microplaques, on introduit dans la microplaque une solution de PBS ä 3% contenant de la sérum albumine bovine (BSA) a raison de 120 pl par-puits et on fait incuber à 370C pendant 30 minutes pour bloquer les parties non liées de la plaque d'essai.. On utilise la microplaque résultante comme plaque revetue d'antigènes dans l'opération ultérieure. Si on le désire, on peut effectuer le stockage de cette microplaque à -20oC.
Avant le dosage, on lave la microplaque trois fois avec une solution de PBS contenant 0, 05% de Tween 20 (PBST). On introduit du PBST contenant 1% de BSA dans les-puits a raison de 50 ul par puits, et on y ajoute un échantillon (sérum, fluide ascitique
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ou surnageant de culture) éventuellement dilué avec PBST contenant 1% de BSA, à raison de 50 nl par puits, puis on fait incuber ä 370C pendant 2 heures. On enlève l'échantillon de la plaque, que l'on
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lave3 fois avec du PBST.
On ajoute ä la microplaque un anticorps anti-immunoglobine humaine marqué à la phosphatase, purifiée par chromatographie d'affinité (Kirkegaard & Perry Lab. Inc.) (second anticorps) diluée 500à 1000 fois avec une solution de PBS contenant 1% de BSA à raison de 100 #l par puits pour incubation à 370C pendant 2 heures. Pour mesurer le titre d'anticorps IgG et le titre d'anticorps 19M, on emploie respectivement un anticorps anti-IgG humaine marqué à la phosphatase et un anticorps marqué ä la phosphatase.
Apres enlèvement du second anticorps, on lave 3 fois la microplaque avec du PBST, et on ajoute une solution de substrat, c'est-àdire une solution aqueuse contenant du sel disodique de l'acide p-nitrophénylphosphorique (3 mg) dans du tampon de diéthanolamine ä 10% (pH 9, 1 ; 1 ml) contenant NaN3 (0,2 mg/l ml) et MgCl2. 6H20 (0, 1 mg/mI)
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à la microplaque, ä raison de 100 pl par puits, puis on effectue la réaction à 37 C. Au bout de 45 minutes, on ajoute NaOH 3N à raison de 20 nl par puits pour arrêter la réaction. On mesure l'activité de liaison de l'anticorps (OD405) sur Multiskan (Titertek).
(3) Préparation de lymphocytes ä partir de sang périphérique humain
On recueille du sang périphérique humain (100 ml) présentant un titre élevé d'anticorps contre P. aeruginosa de plusieurs sérotypes. On met du mi- lieu Mono-Poly Resolving Mediums (15 ml ; Flow Lab. ) dans un tube de centrifugation (volume 50 ml ; Sumitomo Bakelite), et on y verse lentement le sang
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périphérique humain ci-dessus (20 ml), puis on procède à une centrifugation avec une centrifugeuse basse vi- tesse (Bs-20HB, Tommy Precision Ind. ) a 2500 tpm (Roter-TS-7) et à la température ambiante pendant 15 minutes, ce qui sépare les hématies et les lymphocytes.
On recueille la fraction contenant les lymphocytes et on la lave avec du milieu RPMI 1640 contenant 10% de FCS (appelé ci-dessous "milieu") deux fois, puis on calcule le nombre de cellules pour obtenir 1, 2 x 108 lymphocytes.
(4) Etablissement de lignées cellulaires productrices d'anticorps anti-LPS de P. aeruginosa selon la méthode de transformation du virus EB
On met en suspension des lymphocytes du sang périphérique humain (2 x 107) dans le milieu (2 ml), et on y ajoute la solution de virus EB (10 ml ; quanti-
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té de virus, 107 TDSo/m1), puis on effectue une in- cubation à 37 C en atmosphère à 5% de C02 pendant 2 heures.
On met en suspension les lymphocytes humains infectes par le virus EB dans du milieu essentiel minimum d'Eagle modifié par Dulbecco (appelé ci-dessous "milieu d'établissement de la lignée cellulaire") comprenant 15% de FCS, 10% de milieu de culture tissulaire NCTC 109, de la pénicilline (100 UI/ml) de la streptomycine (100 ng/ml), de l'arginine (0, 2 mg/mI), de l'aci-
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de oxaloacétique (0, 15 mg/ml), du pyruvate de sodium (0, 05 mg/ml) et de l'insuline bovine (0, 2 U/ml) pour obtenir une concentration d'environ 2 x 105 cellules/ml, etonjrepartitlasuspensiondans une plaque de culture à 24 puits préalablement chargée de cel-
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lules péritonéales de souris en suspension (environ 1 x 105 ce11u1es/puits,
ä raison de 0, 5 ml/ puits. On cultive les lymphocytes ä 370C en atmosphère à 100% d'humidité et 5% de C02 et on remplace la moitié du milieu par du milieu d'établissement de la lignee cellulaire frais tous les 3 jours en commençant une semaine après le début de l'incubation. Au bout d'un mois environ, on recueille les cellules et on les utilise pour la fusion cellulaire.
(5) Fusion cellulaire avec les cellules transformées par le virus EB
On effectue une sous-culture de cellules de
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myélome de souris BALB/C provenant d'une 1ignée m ye ee MOPC-21 et déficientes en HGPRT (P3X63-Ag8. 653 ; ATCC CRL 1580) dans le milieu d'etablissement de ld 1ignée cellulaire, on prélève et on lave 1 x 107 cellules 3 fois avec du milieu essentiel minimum d'Eagle. On lave les cellules transformées par le virus EB (2 x 107 cellules) obtenues en (4) 3 fois avec du milieu essentiel minimum d'Eagle, on mélange avec des cellules de myélome (1 x 107) dans un tube à centrifugation (Corning =25330) et on les soumet à une centrifuga-
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tion à 400 g pendant 7 minutes.
Au prédpicé résultant-on ajoute du PEG 4000 (1 ml ; solution de PBS a 45%, Merck) en 1 minute tout en faisant tourner le tube à centrifugation et en agitant avec une pipette, puis on laisse reposer ä la température ambiante pendant 1 minute. On ajoute du milieu essentiel minimum d'Eagle (9 ml) en 5 minutes aux fins de dilution et on maintient la dilution résultante à 370C pendant 1 heure. On met en suspension le précipité après
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centrifugation dans le milieu d'établissement d9 la lignée cellulaire (100 ml) et on verse dans des plaques à 96 puits (Falcon =3040) a raison de 1 x 104 cellules de myélome par puits .
Simultanément, on ajoute des cellulesspléniques de souris3ALB/C comme couche d'alimentation à raison de 3 x 104 cellules par réservoir puis on effectue une incubation ä 370C en atmosphère à 5% de C02. Ensuite, tous les deux ou trois jours, on remplace la moitié du volume du milieu par un milieu de sélection. Après la fusion cellulaire pendant environ 2 semaines, on soumet les surnageants des puits dans lesquels on a observé une prolifération ä un examen de la production des anticorps contre P. aeruginosa de différents serotypes parla metho- de ELISA. On sélectionne les cellules fusionnées (hybridomes) dans les puits présentant un titre relativement élevé d'anticorps et on les soumet à une culture plus poussée tout en clonant par le procédé de dilution limitante.
Au bout d'environ 2 semaines, la présence d'anticorps contre le déterminant antigénique commun se liant à P. aeruginosa de plusieurs sérotypes est confirmée par méthode'ELISA sur le surnageant de culture du clone. On soumet le clone à une culture ä plus grande échelle en uti- lisant. une plaque de culture à 24 puits (MS- 30240 ; Sumitomo Bakelite), un ballon de culture T-25 (=25100 ; Corning) et un ballon de culture T-75 (=25110 ; Corning). Ce clone est appelé'Hybridome FKF- 1F3"et est déposé sous le numéro FERM P-9784 au Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology situe ä Tsukuba, Ibaraki-ken,
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Japon. L'anticorps monoclonal humain FKF-1F3 est une IgM (p, k).
Exemple 2 :
Analyse de l'antigène reconnu par l'anticorps FKF-1F3 : (1) Préparation de LPS de P. aeruginosa
On prépare le LPS P. aeruginosa de la même manière que dans le procédé de Westphal et coll. ("Methods in Carbohydrate Chemistry", Academic Press, N. Y., Vol. 5, pages 83 à 91 (1965) ). Autrement dit, on traite le corps bactérien humide (4 g) avec du phénol à 45% chauffé à 65 - 68OC, on refroidit en-dessous de 100C et on soumet à une centrifugation à 3000 tpm pendant 15 minutes, ce qui extrait le LPS vers la couche aqueuse. On dialyse la couche aqueuse contre de l'eau pour éliminer le phénol et on concentre à pression réduite pour former des micelles de LPS que l'on soumet à une ultra-centrifugation pour récupérer le LPS.
On obtient ä chaque fois 2 mg de LPS de souche standard Type A IID1001, desouchetypeE PA103 et de souche standard type G IID1020. Le corps bactérien de P. aeruqinosa utilisé provenait de la Collection 11 Institut de Recherche en Sciences Médicales de l'Université de Tokyo, au Japon. On le trouve également ä l'American Type Culture Collection (ATCC) aux Etats Unis.
(2) Analyse de l'antigène par la méthode Western blot.
On soumet le LPS de types A et E de P. aeruginosa à une électrophorèse sur gel d'acide désoxycholique (DOC)/polyacrylamide selon le procédé
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de Komuro et colt. (présumé des rapports du 33 colloque sur les toxines ä Osaka, pages 94 à 99 (1986)), et on plonge le gel dans un tampon de transfert (tris 25 mM-glycine 192 mM, pH 8, 3, méthanol à 20% (v/v)) ä 4OC'pendant la nuit et on transfère sur une membrane Durapore (Millipore) à la température ambiante, puis on fait incuber avec un tampon PBS contenant 2% de cascinu a la température ambiante pendant 1 heure pour obteni un blocage.
En outre, on effectue une incubation avec une solution à 0, 1% de BSA et une solution de TBS contenant du FCS ä 10% à la température ambiante pendant 1 heure.
Sur la membrane Durapore bloquante résultante, on fait incuber des solutions aqueuses du surnageant de culture FKF-1F3 et de l'anticorps monoclonal humain HI-006 (IgM) reconnaissant spécifiquement l'antigène0 d type E comme témoin à 37 C pendant 1 heure puis ä 4 C pendant la nuit. On lave la membrane de Durapore avec une solution de TBS contenant 0, 05% de Tween 20 (pH 8, 0) 5 fois et on fait incuber avec le second anticorps (anticorpsanti-immunoglobine humai- : ne marqué à la peroxydase, dilue avec 1% de BSA et du PBS contenant 0, 05% de Tween 20 au 30000) à 37 C pendant 1 heure.
De meme, on procède à un lavage avec du PBS contenant 0, 05% de Tween 20 (pH 8, 0) cinq fois, et on effectue une coloration avec un agent colorant (PBS contenant 0, 5 mg/ml de chloronaphtol, 20% de méthanol et 0,08% d'H2O2 ; pH 7, 5). A la suite de cela, on reconnait un groupe de bandes colorées en échelle du. à la réaction avec l'anticorps FKF-1F3 sur le parcours d.'electrophorèse de P. aeruqinosa type LPS, tandis qu'il ne se produit pas de réac-
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tion sur le parcours'd'électrophorèse de P. aeruqinosa type E LPS. Dans le cas de HI-006, comme témoin, les bandes en échelle sont reconnues sur le parcours d'électrophorèse de type E LPS, mais on n'observe pas de coloration sur un quelconque autre parcours.
Exemple 3
Etude du spectre de liaison de l'anticorps FKF-1F3 par la méthode ELISA : (1) ProRriété de liaison de l'anticorps FKF- 1F3 aux souches sérotypiqucscte référence de P. aeruginosa
De la même manière que dans l'exemple 1 (2), on examine la propriété de liaison de l'anticorps FKF-1F3 aux souches sérotypiques de P. aeruqinosa selon la méthode ELISA, dont les résultats sont présentés au tableau 2. Les souches utilisées proviennent de la Collection de l'Institut de Recherche en Sciences Médicales de l'Université de Tokyo, au Japon, et cultivées dans un milieu gélose d'infusion coeur ou un milieu de bouillon d'infusion de cceur.
<Desc/Clms Page number 38>
Tableau 2 : Activité de liaison de l'anticorps
FKF-1F3 aux souches sérotypiques de réfé-
EMI38.1
rence de P. aeruginosa selon la classification de la Commission Japonaise
EMI38.2
<tb>
<tb> Sérotype <SEP> Souche <SEP> Activité <SEP> de <SEP> liaison <SEP> (OD405)*
<tb> A <SEP> IID <SEP> 1001 <SEP> 0, <SEP> 6
<tb> B <SEP> IID <SEP> 1002 <SEP> 0
<tb> B <SEP> IID <SEP> 1007 <SEP> 0
<tb> B <SEP> IID <SEP> 1013 <SEP> 0
<tb> B <SEP> IID <SEP> 5004 <SEP> 0
<tb> c <SEP> IID <SEP> 1021 <SEP> 0
<tb> D <SEP> IID <SEP> 1004 <SEP> 0
<tb> E <SEP> IID <SEP> 1130 <SEP> 0
<tb> F <SEP> IID <SEP> 1006 <SEP> 0, <SEP> 4
<tb> G <SEP> IID <SEP> 1020 <SEP> 0, <SEP> 4
<tb> H <SEP> IID <SEP> 1009 <SEP> 0
<tb> I <SEP> 110 <SEP> 1010 <SEP> 0
<tb> J <SEP> IID <SEP> 1011 <SEP> 0
<tb> K <SEP> IID <SEP> 1012 <SEP> 0
<tb> L <SEP> IID <SEP> 5141 <SEP> 0
<tb> M <SEP> IID <SEP> 5018 <SEP> 0,
<SEP> 1
<tb> M <SEP> IID <SEP> 1015 <SEP> 0, <SEP> 3
<tb>
EMI38.3
Note : *) Absorption après coloration selonlamétho- de ELISA (45 minutes).
On révèle ainsi que l'anticorps FKF-1F3 a une propriété de liaison spécifique, avec les types A, F, Get M.
(2) Propriété de liaison de l'anticorps FKF- 1F3 aux souches cliniquement isolées
On examine la propriété de liaison de l'anticorps FKF-1F3 sur les types A et G qui sont cliniquement isolés avec une fréquence élevée. Pour l'examen on utilise 19 isolats cliniques de type A et 19 iso-
<Desc/Clms Page number 39>
lats cliniques de type G. Comme résultat, l'anticorps se lie ä 14 isolats cliniques de type A (74%) et ä 10 isolats cliniques de type G (53%) comme on le voit dans les tableaux 3 et 4.
Tableau 3 : Activité de liaison de l'anticorps
FKF-1F3 à 19 isolats cliniques de serotype A
EMI39.1
<tb>
<tb> Souche <SEP> Activité <SEP> de <SEP> liainson <SEP> (OD405)
<tb> SP6745 <SEP> 0, <SEP> 8
<tb> SP6746 <SEP> 1, <SEP> 6
<tb> SP6783 <SEP> 1,2
<tb> SP6818 <SEP> 2, <SEP> 5
<tb> SP6830 <SEP> 0, <SEP> 6
<tb> SP6840 <SEP> 2, <SEP> 4
<tb> SP6708a <SEP> 1,. <SEP> 2
<tb> SP9710 <SEP> 2, <SEP> 0
<tb> SP9711 <SEP> 1, <SEP> 6
<tb> SP9731 <SEP> 0, <SEP> 1
<tb> SP9762 <SEP> 0,1
<tb> SP9763 <SEP> 0, <SEP> 1
<tb> SP9768 <SEP> 1, <SEP> 6
<tb> SP9780 <SEP> 2,1
<tb> SP10029 <SEP> 1. <SEP> 4
<tb> SP10040 <SEP> 0,2
<tb> SP10060 <SEP> 0, <SEP> 6
<tb> SP10618 <SEP> lys <SEP> 7
<tb> SP10676 <SEP> 0,2
<tb>
Note : *) Absorption après coloration selon la méthode
ELISA (au bout de 45 minutes).
<Desc/Clms Page number 40>
Tableau 4 :
Activité de liaison de l'anticorps
FKF-1F3 à 19 isolats cliniques de sérotype G
EMI40.1
<tb>
<tb> Souche <SEP> Activité <SEP> de <SEP> liaison <SEP> (OD405)
<tb> SP9704 <SEP> 1,7
<tb> SP9709 <SEP> 1.. <SEP> 6
<tb> SP9712 <SEP> 0, <SEP> 1
<tb> SP9714 <SEP> 1, <SEP> 4
<tb> SP9717 <SEP> 0
<tb> SP9718 <SEP> 0, <SEP> 8
<tb> SP9738 <SEP> 0,7
<tb> $P9785 <SEP> 1.. <SEP> 1
<tb> SP9743 <SEP> 1,8
<tb> SP9792 <SEP> 0, <SEP> 1
<tb> SP9755 <SEP> 0,1
<tb> SP9761 <SEP> 0
<tb> SP9767 <SEP> 1, <SEP> 3
<tb> SP9772 <SEP> 0
<tb> GN11187 <SEP> 0
<tb> TL2378 <SEP> 1, <SEP> 7
<tb> TL2424 <SEP> 0
<tb> SP6788 <SEP> 1, <SEP> 3
<tb> spa <SEP> 0,3
<tb>
EMI40.2
Note *) :
Absorption après coloration selon ia méthode ELISA (au bout de 45 minutes) On examine également l'activité de liaison de l'anticorps FKF-1F3 avec les isolats de P. aeruginosa sérotype M provoquant des infections broncho-oesophagien- nes chroniques fréquentes. Les résultats sont présentés au tableau 5, d'après lequel on voit que l'activité de liaison dépend largement de l'origine des souches et que ledit anticorps est lie aux souches testées à raison de 10 ä 99%.
<Desc/Clms Page number 41>
Tableau 5 : Activité de liaison de l'anticorps
FKF-1F3 aux isolats cliniques de sérotype M.
EMI41.1
<tb>
<tb>
Souche <SEP> Lieu <SEP> et/ou <SEP> année <SEP> Activité <SEP> de <SEP> liaison
<tb> d'isolement <SEP> (OD405)
<tb> SP9716 <SEP> 0, <SEP> 1
<tb> SP9730 <SEP> 0,1
<tb> SP9744 <SEP> 0,1
<tb> SP9748 <SEP> Tokyo <SEP> 0,4
<tb> SP9749 <SEP> 0,1
<tb> SP9752 <SEP> 1984 <SEP> 0, <SEP> 1
<tb> SP9775 <SEP> 0
<tb> SP10067 <SEP> 1,1
<tb> SP10675 <SEP> 0,1
<tb> SP6763 <SEP> 1,0
<tb> SP6764 <SEP> 0,9
<tb> SP6765 <SEP> 0, <SEP> 9
<tb> SP6782 <SEP> 1t2
<tb> SP6794 <SEP> Kyoto <SEP> 1,0
<tb> GN6833 <SEP> 0,6
<tb> TL68S2 <SEP> 1984 <SEP> 1,1
<tb> TL6890 <SEP> 0,1
<tb> SP6892 <SEP> 1,1
<tb> SP6895 <SEP> 0, <SEP> 8
<tb> SP6908 <SEP> 0,8
<tb>
Note *) Absorption après coloration selon la méthode
ELISA (au bout de 15 minutes)
Exemple 4
Propriété de liaison de l'anticorps FKF-IF3 avec
EMI41.2
E. coli J5 :
DE la même manière que dans l'exemple 1 (2), on examine l'activité de liaison de l'anticorps FKF-
EMI41.3
lF3avec E. coli type Rc mutant J5 (ATCC 39355) selon la méthode ELISA. On fait incuber la souche J5 dans
<Desc/Clms Page number 42>
un milieu gélosé d'infusion de c#ur. Les résultats sont présentés au tableau 6, d'après lequel on comprend que l'anticorps FKF-lF3se lie avec P.aeruginosa IID 1001 (sérotype A) comme témoin positif et faiblement avec
E. coli J5.
Tableau 6
EMI42.1
<tb>
<tb> Souche <SEP> Activité <SEP> de <SEP> liaison
<tb> (OD405)
<tb> E. <SEP> coli <SEP> J5 <SEP> 0,3
<tb> P. <SEP> aeruginosa <SEP> IID <SEP> 1001 <SEP> 0, <SEP> 6
<tb> (-) <SEP> 0
<tb>
Exemple 5
Etude de la spécificité de liaison par un système compétitif :
Comme il se confirme que l'anticorps FKF-1F3 est lié aux corps bactériens : P. aeruginosa 110
EMI42.2
1001 (sérotype A) et P. aeruginosa IID 1002 (sérotype B) on examine la spécificité de liaison par un système compétitif, c'est à dire de la même manière que dans l'exemple 1 (2) par la méthode ELISA en utilisant une plaque bactérienne.
Comme substance compéti-
EMI42.3
tive, on utilise du LPS (à chaque fois 50 g/m1) de P. aeruqinosa IID 1001 (sérotype A), P. aeruginosa IID 1002 (sérotype B), P. aeruginosa 103 (sérotypeE), P. aeruginosa IID 1020 (sérotype G), E. coli 0-111 B4 et J5. Les résultats sont présentés au tableau 7.
<Desc/Clms Page number 43>
EMI43.1
Tableau 7 . -----. -.
EMI43.2
<tb>
<tb>
Planque <SEP> antigénique <SEP> Origine <SEP> de <SEP> la <SEP> substance <SEP> Activité <SEP> de
<tb> liaison
<tb> compétitive <SEP> (LPS)
<tb> (OD405)
<tb> Souche <SEP> PA <SEP> IID1001 <SEP> PA <SEP> IID <SEP> 1001 <SEP> 0, <SEP> 6
<tb> PA <SEP> IID <SEP> 1002 <SEP> 2,4
<tb> PA <SEP> PA <SEP> 103 <SEP> 2, <SEP> 4
<tb> PA <SEP> IID <SEP> 1020 <SEP> 1, <SEP> 9
<tb> EC <SEP> 0-1ltB4 <SEP> 2, <SEP> 5
<tb> EC <SEP> J5 <SEP> 2, <SEP> 1
<tb> (-) <SEP> 2, <SEP> 3
<tb> Souche <SEP> PA <SEP> IID1020 <SEP> PA <SEP> IID <SEP> 1001 <SEP> 0, <SEP> 2
<tb> PA <SEP> IID <SEP> 1002 <SEP> 1,0
<tb> PA <SEP> PA <SEP> 103 <SEP> 0, <SEP> 9
<tb> PA <SEP> IID <SEP> 1020 <SEP> 0,7
<tb> EC <SEP> 0-111 <SEP> :
B4 <SEP> 1, <SEP> 0
<tb> EC <SEP> J5 <SEP> 0,8
<tb> (-) <SEP> 0,9
<tb>
EMI43.3
- ----- -
Dans les plaques de corps bactérien de P. aeruginosa IID 1001 et IID 1020, le LPS provenant de IID 1001 inhibe fortement la liaison de l'anticorps FKF-1F3, et le LPS provenant de IID 1020 présente une faible activité d'inhibition. D'autres LPS ne présentent pas d'activité, ou seulement une activité très faible.
Exemple 6 :
Propriété de liaison de l'anticorps FKF-1F3 au LPS provenant de P. aeruginosa :
On dissout du LPS provenant de P. aeruginosa (1 pg/ml, de la phosphatidylcholine (5 #g/ml), du cholestérol (2, 5 ng/ml) dans l'éthanol et on répartit solution résultante dans une plaque à 96 puits
<Desc/Clms Page number 44>
a raison de 10 #l par puits, puis on laisse reposer à 37 C pendant 2 heures pour séchage.
On ajoute une solution de BSA-PBS à 3% (100 #l), suivi par une réaction ä la température ambiante pendant 2 heures aux fins de saturation pour obtenir une plaque d'antigène utilisant le LPS comme antigène (Kannagi et coll. : "Application of Immunological Methods in Biomedical Science", Blackwell Scientific, Oxford, pages 117. 1-117. 20 (1986)).
On effectue le fest ELISA de la mime manière que dans l'exemple 1(2) en utilisant du. PBS ä 0, 5% de BSA au lieu de PBST. Les résultats sont présentés au tableau 8.
Tableau 8
EMI44.1
<tb>
<tb> 1 <SEP> Activité <SEP> de <SEP> liaison
<tb> Origine <SEP> du <SEP> LPS <SEP> Sérotype <SEP> (OD405)
<tb> p. <SEP> aeruginosa <SEP> A <SEP> IID <SEP> 1001 <SEP> A <SEP> 0, <SEP> 7
<tb> P. <SEP> aeruginosa <SEP> A <SEP> IID <SEP> 1002 <SEP> B <SEP> 1
<tb> p. <SEP> aeruginosa <SEP> PAO <SEP> 1822 <SEP> B <SEP> 0, <SEP> 1
<tb> P. <SEP> aeruginosa <SEP> PA <SEP> 103 <SEP> E <SEP> 0, <SEP> 2
<tb> p. <SEP> aeruginosa <SEP> IID <SEP> 1020 <SEP> G <SEP> 0, <SEP> 3
<tb>
L'anticorps FKF-1F3 est lié fortement à LPS
EMI44.2
provenant de P. aeruginosa IID 1001 (sérotype A) et faiblement à LPS provenent de P. aeruqinosa IID
1020 (sérotype G).
Exemple 7
Propriété de liaison de l'anticorps FKF-1F3 avec le LPS et avec le lipide A provenant d'une Salmonella :
On examine la propriété de liaison de l'anti- corps. FKF-1F3 avec une série de LPS provenant de
<Desc/Clms Page number 45>
Salmonella minnesota par la réaction compétitive selon la méthode ELISA. On mélange l'anticorps FKF-1F3 avec du LPS provenant de S. minnesota et du lipide A (nécessaire de LPS très purifié : List Biological Laboratories, Inc.) comme substances compétitives à des concentrations de 2,5 #M et 25 UM, suvi par une incubation à 370C pendant 1 heure. On effectue le test ELISA en utilisant une plaque ä 96 puits fixant les bactéries P. aeruginosa IID 1001 aux fins de mesure du taux d'inhibition.
Les résultats sont présentés au tableau 9, d'oü l'on comprend que l'anticorps FKF-1F3 a une forte propriété de liaison avec le lipide A et le LPS (Rc, Rd, et Re type rugueux).
Tableau 9
EMI45.1
<tb>
<tb> Chémotype <SEP> de <SEP> LPS <SEP> Activité <SEP> de <SEP> liaison <SEP> (OD405)
<tb> 0, <SEP> 25 <SEP> uM <SEP> 25 <SEP> pM
<tb> LPS <SEP> type <SEP> sauvage <SEP> 0, <SEP> 24 <SEP> 0, <SEP> 29
<tb> Ra <SEP> 0,27 <SEP> 0, <SEP> 25
<tb> Rb <SEP> 0, <SEP> 24 <SEP> 0, <SEP> 22
<tb> Rc <SEP> 0. <SEP> 22 <SEP> 0,07
<tb> Rd <SEP> 0,17 <SEP> 0,04
<tb> Re <SEP> 0,03 <SEP> 0
<tb> Lipide <SEP> A <SEP> 0, <SEP> 12 <SEP> 0,02
<tb> (-) <SEP> 0,26 <SEP> 0,26
<tb>
Note : l'activité de liaison indique 1'activité après déduction de la valeur pour l'essai à blanc (0, 14).
Exemple 8 propriété de liaison du FKF-1F3 au lipide A des bacteries Gram-negatives :
On effectue des recherches en utilisant du li-
<Desc/Clms Page number 46>
EMI46.1
pide A provenant d'E. coli, du lipide A provenant de S* typhimurium re-mutant (Ribi Immunochem. Research Inc., Hamilton, MT) et du lipide A provenant de S. minnesota R595 (List Biological Laboratories Inc.) de la même manière que dans l'exemple 7 selon la méthode ELISA. On prépare le LPS et le lipide A provenant de P. aeruqinosa IID 1001 comme suit : selon le procédé de westphal et coll., on traite la fraction soluble dans l'eau obtenue par extraction avec du phénol chaud à 45% avec du bromure de cétylméthylammo- nium ("Cetavlon" ;
Nakarai Chemical ) aux fins d'élimination des acides nucléiques, er on utilise le précipité ä l'ethanol comme specimen de LPS (Methods Carbohydr. Chem., 1, 83-91 (1965)) ; on hydrolyse le LPS avec de l'acide acétique à 1% ä 100"C pendant 90 minutes, et on utilise l'extrait au chloroforme comme specimen de lipide A (Eur. J. Biochem. 52, 331 - 343 (197S)).
De la même manière que dans l'exemple 7, on effectue le test ELISA enutilisant une plaque revêtue de lipide A provenant de S. minnesota R595 et en utili- sant le lipide A comme substance competitive (50 #g/ ml). Les résultats sont présentés au tableau 10, d'où on comprend que l'anticorps FKF-1F3 ä une propriété de liaison avec le lipide A provenant de diverses bactéries Gram-négatives.
Tableau 10
EMI46.2
<tb>
<tb> Lipide <SEP> A <SEP> Activité <SEP> de <SEP> liaison(OD405)
<tb> P. <SEP> aeruginosa <SEP> IID <SEP> 1001 <SEP> 0,25
<tb> E <SEP> coli <SEP> J5 <SEP> 0, <SEP> 18
<tb> S. <SEP> typhimurium <SEP> Re <SEP> mutant <SEP> 0.16
<tb> S. <SEP> minnesota <SEP> R595 <SEP> 0, <SEP> 18
<tb> (-) <SEP> 1, <SEP> 07
<tb>
<Desc/Clms Page number 47>
Exemple 9
Activité de liaison de l'anticorps FKF-1F3 avec le LPS provenant de P. aeruginosa :
On compare la propriété de liaison avec le LPS pro-
EMI47.1
venant de P. aeruginosa 110 101 celle avec le LPS d'E. coli et de S. minnesota. On effectuele testELISAde 2 L-1 la meme manière que dans l'exemple 8 en utilisant une plaque revetue du lipide A de S. minnesota R595 et en utilisant du LPS intact et du lipide A provenant de P. aeruginosa IID 1001.
(Cf exemple 8) et de LPS type lisse et de lipide A provenant d'E. coli et de S. minnesota comme substances compétitives (50 pg/ml). Les résultats sont présentés au tableau 11, d'où l'on comprend que l'anticorps peut être lié au lipide A provenant de n'importe quel microorganisme et au LPS de type lisse provenant seulement de P. aeruginosa. La raison pour laquelle on n'observe pas de propriété de liaison avec le LPS de type lisse est probablement due à la formation de micelles avec le LPS en solution aqueuse, ce qui fait que la fraction lipide A n'est pas exposée à l'empêchement stérique de la fraction polysaccharidique. Dans le cas de P. aeruginosa, n'importe quel site de liaison d'anticorps peut être présent outre le lipide A.
Tableau 11
EMI47.2
<tb>
<tb> Substance <SEP> compétitive <SEP> Activité <SEP> de <SEP> liaison(OD405)
<tb> P. <SEP> aeruginosa <SEP> IID <SEP> 1001 <SEP> LPS <SEP> 0,16
<tb> P. <SEP> aeruginosa <SEP> IID <SEP> 1001 <SEP> Lipide <SEP> A <SEP> 0, <SEP> 24
<tb> E. <SEP> coli <SEP> 0111 <SEP> : <SEP> 134 <SEP> LPS <SEP> 1, <SEP> 02
<tb> E. <SEP> coli <SEP> J5 <SEP> LPS <SEP> olie
<tb> S <SEP> mi <SEP> nnesotatype <SEP> sauvage <SEP> LPS <SEP> 1; <SEP> 07
<tb> S. <SEP> minnesota <SEP> RS95 <SEP> Lipide. <SEP> A <SEP> 0, <SEP> 20
<tb> (-) <SEP> 1,12
<tb>
<Desc/Clms Page number 48>
Exemple 10 propriété de liaison de l'anticorps FKF-1F3
EMI48.1
à la chitine :
Antérieurement, Teng et coll. ont réussi à préparer un anticorps monoclonal humain (IgM) contre le LPS d'E. coli J5 (Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A., 82, 1790 - 1794 (1985)).
Dans leur article, il est indiqué que l'anticorps a une propriété de liaison à la chitine (homopolymere de N-acétylglucosamine).
Dans cet exemple, on effectue les recherches sur la propriété de liaison de l'anticorps FKF-1F3 chitine selonla méthode ELISA en utilisant une plaque revetue de lipide A provenant de S. minnesota R595 et en utilisant de la poudre de chitine provenant de carapace de crabe (Nakarai Chemical) comme substance compétitive de la même manière que dans l'exemple 8. Les résultats sont présentés au ta-
EMI48.2
bleau 12, d'où l'on comprend que l'on n'observe pas de réaction croisée entre l'anticorps FKF-IF3 et la chitine. Ainsi, l'anticorps FKF-1F3 diffère da l'anticorpshumain anti-LPS de E. coli J5 par l'epitop reconnu.
Tableau 12
EMI48.3
<tb>
<tb> Dose <SEP> Activité <SEP> de <SEP> liaison
<tb> Substance <SEP> compétitive <SEP> (#g) <SEP> (OD405)
<tb> Chitine <SEP> 5 <SEP> 1,05
<tb> 10 <SEP> 1, <SEP> 01
<tb> Lipide <SEP> A <SEP> provenant <SEP> de <SEP> 5 <SEP> 0,33
<tb> S. <SEP> minnesota <SEP> R595 <SEP> 10 <SEP> 0, <SEP> 18
<tb> (-) <SEP> - <SEP> 1... <SEP> 07
<tb>
<Desc/Clms Page number 49>
Exemple 11 'Separation de la fraction polysaccharidique de LPS et analyse de l'antigène : ze Séparation de la fraction polysaccharidique du LPS provenant de P. aeruginosa IID 1001
Selon le procédé de Wilkinson et coll. (Eur.
J. Biochem, 52, 331 (1975), on sépare la fraction polysaccharidique du LPS provenant de P. aeruginosa IID 1001.
Autrement dit, on dissout du LPS (10 mg) dans de l'acide acétique à 1% et on hydrolyse ä 100 C pendant 90 minutes.
On élimine le lipide A libéré par fractionnement avec du chloroforme. On soumet la fraction soluble dans l'eau obtenue à une chromatographie sur colonne (taille de la colonne 1 x 70 cm) en utilisant du dextran ("Sephadex G50" ; Pharmacia, Uppsala) équilibré avec un tampon pyridine-
EMI49.1
a acétate 50 mM (pH 5, 5) pour le fractionnement. On disce tingue par spectophotométrie les fractions auxquelles le polysaccharide, l'oligosaccharide du noyau de type semirugueux et l'oligosaccharide du noyau du type rugueux sont dilués. On détecte le saccharide neutre par le procédé de l'acide phénol-sulfurique (Dubois et coll. : Anal. Chem.
28, 350 (1956)), et on hydrolyse l'aminosaccharide avec de l'acide sulfurique 2N à 100 C pendant 2 heures puis on détecte par le procédé MBTH chlorhydrate de (3-méthyl- 2-benzothiazolinone hydrazone (Tsuji et coll. : Chem.
Pharm. Bull. 17, 217 (1969)). On recueille après lyophilisation les fractions de polysaccharide, les fractions d'oligosaccharide de core du type semi-rugueux et d'oligosaccharide de core du type rugueux.
<Desc/Clms Page number 50>
(2) Propriété de liaison de l'anticorps FKF- 1F3 à la fraction polysaccharidique
On étudie la compétition de l'anticorps FKF-1F3 avec le polysaccharide, l'oligosaccharide de core du type semi-rugueux et l'oligosaccharide du ty- pe rugueux provenant de P. aeruqinosa IID 1001 tel qu'obtenu dans l'exemple 12 (1) selon la méthode ELISA de la même manière que dans l'exemple 7. La quantité de substance compétitive utilisée est la quantité correspondant à 20 nmoles du saccharide neutre selon le procédé au phénol-acide sulfurique tel que mentionne dans l'exemple 12 (1). Les résultats sont présentés au tableau 13.
Tableau 13
EMI50.1
<tb>
<tb> Substance <SEP> competitive <SEP> Activit4 <SEP> de <SEP> liaison
<tb> (OD <SEP> 4 <SEP> 05)
<tb> Polysaccharide <SEP> 0, <SEP> 04
<tb> Oligosaccharide <SEP> du <SEP> core <SEP> 0, <SEP> 42
<tb> de. <SEP> type <SEP> semi-rugueux
<tb> Oligosaccharide <SEP> du <SEP> core <SEP> o, <SEP> 39
<tb> de <SEP> type <SEP> rugueux
<tb> (-) <SEP> 0,39
<tb>
D'après les résultats ci-dessus et l'essai de Western blot dans l'exemple 2 (1), on peut dire que l'épitope tel que reconnu par l'anticorps FKF-1F3 est présent dans la fraction polysaccharidiqueen plus du lipide A, dans le cas de certaines souches de P. aeruginosa.
<Desc/Clms Page number 51>
Exemple 12
Effet thérapeutique de l'anticorps FKF-1F3 sur les infections expérimentales à P. aeruginosa chez les souris : (1) Effet thérapeutique sur les infections ä P. aeruginosa (sérotype G)
On inocule par voie intraperitoneale ä des souris ICR-slc (âgées de 4 semaines ; mâles ; 10 animaux par groupe) 1, 2 x 104 ou 6, 2 x 104 cellules d'isolat clinique de P. aeruginosa SP 6788 (serotype G). Au bout d'une heure, on administre par voie intraperitoneale l'anticorps FKF-1F3 (0, 1 pg). Le jugement de l'effet thérapeutique se fait sur le taux de survie au bout d'une semaine.
Les résultats sont présentés au tableau 14, d'où 1'on comprend que tous les animaux survivent dans les groupes traités et que l'anticorps FKF-1F3 est efficace dans le traitement des infections ä P. aeruginosa (sérotype G).
Tableau 14
EMI51.1
<tb>
<tb> Anticorps <SEP> Dose <SEP> Taux <SEP> de <SEP> survie <SEP> (%)
<tb> (quantité <SEP> inoculée <SEP> CFUitête)
<tb> 1,, <SEP> 2 <SEP> x <SEP> 104 <SEP> 6, <SEP> 2 <SEP> x <SEP> 104
<tb> FKF-IF3 <SEP> 01 <SEP> ug/tete <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Aucun <SEP> - <SEP> 20 <SEP> 30
<tb>
EMI51.2
(2) Effet thérapeutique sur les infections à P. aeruginosa (serotypes A) On inocule par voie intraperitoneale ä des souris 5% mutin ICR-slc (âgées de 4 semaines ; mâles ; 10 animaux par groupe) 3, 7 x 104, 1, 5 x 105 ou 7, 3 x 105
<Desc/Clms Page number 52>
cellules d'isolat clinique de P. aeruginosa SP6788 (serotype A). Au bout d'une heure, on administre par voie intraperitoneale l'anticorps FKF-1F3 (0, 1 pg).
Le juge-
EMI52.1
ment de l'effet thérapeutique se fait sur le taux de survie au bout d'une semaine. Les résultats sont présentés au tableau 15, d'où l'on comprend qu'un taux de survie significatif est produit dans les groupes traités meme lorsque la quantité inoculée atteint 1, 5 x 105 cellules et que l'anticorps FKF-1F3 est efficace dans le traitement des infections à P. aeruginosa (serotype A).
Tableau 15
EMI52.2
<tb>
<tb> Anticorps <SEP> Dose <SEP> Taux <SEP> de <SEP> survie <SEP> (%)
<tb> (quantité <SEP> inoculée <SEP> CFU/. <SEP> tête)
<tb> 3,7 <SEP> x <SEP> 104 <SEP> 1,5 <SEP> x <SEP> 105 <SEP> 7,3 <SEP> x <SEP> 105
<tb> FKF-1F3 <SEP> 01 <SEP> pg/'tête <SEP> 100 <SEP> 80 <SEP> 0
<tb> BSA <SEP> 2 <SEP> #g/tête <SEP> 80 <SEP> 20 <SEP> 10
<tb> Sel <SEP> phys. <SEP> - <SEP> 50 <SEP> 10 <SEP> 0
<tb>