AT510991A2

AT510991A2 - Peptide für die Inhibition MyD88-abhängiger Signalwege

Info

Publication number: AT510991A2
Application number: ATA9494/2009A
Authority: AT
Original assignee: Kemijski Inst
Priority date: 2009-10-09
Filing date: 2009-10-09
Publication date: 2012-08-15
Also published as: AT510991A5; WO2011043740A1

Abstract

Hemmpeptide (inhibitorische Peptide) für die Inhibition MyD88-abhängiger Signalwege. Der Bereich der Erfindung ist ein neues Hemmpeptid mit einem Segment zur Inhibition der MyD88-Aktivierung. Die Erfindung umfasst das Hemmpeptid und seine Verwendung zur Heilung von Krankheitszuständen, die mit einer übermäßigen angeborenen Immunsystemreaktion verbunden sind.

Description

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Peptide für die Inhibition der MyD88-abhängiger Signalwege Bereich der Erfindung

Der Bereich der Erfindung ist das neue Peptid für die Inhibition, die die Aktivierung der angeborenen Immunreaktion über das Adapterprotein MyD88 verhindert. Die Erfindung sind die Peptide und ihre Verwendung bei Heilung von Krankheitszuständen, die mit einer übermäßigen angeborenen Immunsystemreaktion verbunden sind.

Stand der Technik

Vielzellige Organismen brauchen für das Überleben in der Umgebung ein Immunsystem, mit dem sie in der Lage sind, die Anwesenheit der für pathogene Mikroorganismen und pathologisch veränderte Eigenzellen typischen Moleküle zu erkennen. Ein wichtiger Bestandteil der angeborenen Immunsystemreaktion sind Rezeptoren, die dazu fähig sind, die typischen Moleküle der pathogenen Organismen erkennen zu können. Unter den Rezeptoren sind für eine effektive Immunsystemreaktion vor allem Toll-like Rezeptoren bzw. TLR-Rezeptoren.

NACHGEREICHT

Zur Aktivierung der TLR-Rezeptoren kommt es beim Binden der Moleküle, die die Ektodomäne der TLR (Agonisten) aktivieren. Die Bindung des Agonisten (mit Pathogenen verbundene molekulare Muster bzw. PAMPs) bewirkt bei den meisten TLR-Rezeptoren eine Dimerisation der Ektodomänen und folglich das Verbinden der zyto-solischen TIR-Domänen (eng. Rezeptor Toll/lnterleukin-1) des TLR-Rezeptoren. Bei der Dimerisation der TIR-Domänen der Rezeptoren kommt es im Zytosol zur Bindung dieser an die Adapterproteine, z.B. die Proteine MyD88, Mal/TiRAP, TRAM oder TRIF. Adapterproteine lösen durch die Aktivierung der Proteinkinasen die Signalkaskade aus, die zur Aktivierung der Transkriptionsfaktoren und zur Überschreibung der Gene, die bei der Reaktion des Immunsystems mitwirken, führt - die Aktivierung der TLR-Rezeptoren löst die Produktion der Zytokine wie IL-12, IL-6, IL-8, IL-1 sowie der Interferone Typ I und II aus. 2

Die Eigenschaft sämtlicher Adapterproteine (Adapter) TLR der Signalwege ist die enthaltene TIR-Domäne. Der Adapter MyD88 wird für die Aktivierung der von MyD88 abhängigen und für die Rezeptoren TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 und TLR9 typischen Signalwege sowie bei der Stimulation der Interleukin-Rezeptoren mit IL-1, IL-18 und IL-33 gebraucht. Mal/TIRAP wirkt beim von MyD88 abhängigen Signalweg im Fall der Verwendung der Rezeptoren TLR4 und TLR2 mit. Der von MyD88 unabhängige Signalweg ist typisch für die Rezeptoren TLR4 und TLR3, wobei die Hauptrolle das Protein TRIF spielt. Typisch ist das Protein TRAM für den von MyD88 unabhängigen Signalweg lediglich im Fall der Verwendung des Rezeptors TLR4 (A-kira S., Takeda K. 2004. Toll-tike receptor signalling. Nature Reviews: Immunology, 4: 499-511).

MyD88 und TRIF spielen eine wichtige Rolle beim weiteren Signalisieren und führen zur Synthese der Entzündungs-Zytokine, während Mal/TIRAP und TRAM lediglich als eine Verbindung zwischen MyD88 oder TRIF und den entsprechenden TLR-Rezeptoren dienen sollen, obwohl auch ihre verstärkte Äußerung zur Zellenaktivierung führt (Nishiya T., Kajita E., Horinouchi T., Nishimoto A., Miwa S. 2007. Distinct roles of TIR and non-TIR regions in the subcellular localization and signaling proper-ties of MyD88. FEBS Letters, 581: 3223-3229).

MyD88 ist ein aus der DD-Domäne (Eng. death domain) und TIR-Domäne gebildetes Adapter, zwischen denen befindet sich die intermediäre Domäne INT (Eng. intermedi-ate domain). Die MyD88-Moleküle bei Wirbeltieren sind homolog und können sich gegenseitig funktional ersetzen. MyD88 ist das Hauptmolekül für die Signalisierung bei TLR-Rezeptoren (außer Rezeptor TLR3) sowie beim Interleukin-Rezeptor 1 (IL-1 R). Die Domäne TIR MyD88 auf dem C-Terminus ist verantwortlich für die Bindung mit der TIR-Domäne der TLR-Rezeptoren und die DD-Domäne auf dem N-Terminus ist verantwortlich für die Bindung mit 1RAS4-Kinase (Eng. IL-1 R-associated kinase 4) sowie für den weiteren Signaltransport auf dem Signalweg. Die Rolle der INT-Domäne wurde noch nicht genau erforscht, die Abwesenheit der INT-Domäne ist jedoch mit der Unfähigkeit der MyD88-Signalisierung verbunden. Janssens und Kollegen berichteten

NACHGEREICHT • · Λ · über die Form MyD88 ohne die INT-Domäne, genannt MyD88s (Eng. MyD88 short), die als Inhibitor wirkt (Janssens S., Burns K., Tschopp J., Beyaert R. 2002. Regulation of lnterIeukin-1- and lipopolysaccharide-induced NF-κΒ activation by alternative splic-ing of MyD88. Current Biology, 12: 467-471). MyD88s kann sich auf die TIR-Domäne des Rezeptoren binden, nicht jedoch auf die DD-Domäne der IRAS4-Kinase, denn für die Bindung auf IRAS4 werden die DD-Domäne sowie auch die INT-Domäne benötigt. Der genaue Mechanismus der MyD88-Aktivierung und der weiteren Kinasen ist noch nicht bekannt, weil sich die meisten auf MyD88 bezogenen Forschungen auf die TIR-Domäne konzentriert haben.

Eine falsche Regulierung des Immunsystems kann ernsthafte Krankheitszustände auslösen, z.B. die Sepsis. Bei der Sepsis handelt es sich um einen pathologischen Zustand mit starken Anzeichen einer Infektion und der entsprechenden Systemreaktion, entstanden durch die übermäßige Verstärkung der eigentlich entsprechenden Anfangsreaktion des Wirtes auf die Infektion durch Mikroorganismen. Die Sepsis kann zu einem septischen Schock übergehen, für den neben der Entzündungsreaktion des Systems auch eine starke Betroffenheit des Kreislaufsystems, Bluttiefdruck und Organversagen typisch sind. Bei einer chronischen Entzündung kommt es oft zur Aktivierung des angeborenen Immunsystems über mehrere TLR-Rezeptoren, deshalb wird die Inhibition mehrerer TLR-Rezeptoren gleichzeitig angestrebt, z.B. durch den gemeinsamen Adapter MyD88 (Patent US 7122656 B2).

Eine falsche Regulierung des Immunsystems trägt auch zur Entstehung chronischer Entzündungskrankheiten bei, wie z.B. rheumatoide Arthritis, Gicht, systematisches Lupus Erythematodes und Colitis, zur Krebsentwicklung sowie zur Entstehung bestimmter autoimmuner Krankheiten. Bei diesen Krankheiten kann die Inhibition der Signalisierung eine nützliche Therapie darstellen.

Die Inhibitoren der Signalwege des angeborenen Immunsystems können in mehrere Gruppen aufgeteilt werden:

MACHGEREICHT 4 - DNA-Konstrukte, die die Informationen von dem Teil des Proteins enthalten, das dazu fähig ist, den Signalweg zu inhibieren. Ein solches stellt bei der TLR-abhängigen Signalisierung das dominant-negative MyD88 dar. Das ist eine Form von MyD88, die lediglich die TIR-Domäne enthält und sich auf die TIR-Domäne des TLR-Rezeptoren bindet, sie hat jedoch keine DD-Domäne und kann die Signalkaskade nicht auslösen. Die Inhibitoren in Form von DNA-Konstrukten treffen auf für die Gentherapie typischen Schwierigkeiten, z.B. Probleme bez. der gezielten Zufuhr in den Organismus, Kontrolle der Äußerungsstufe des zugeführten Gens, das Problem der Sicherheit und der Effektivität der Vektoren - deshalb stellen sie eine weniger erwünschte Behandlungsform dar {Traister R.S., Hirsch R. 2008. Gene therapy for arthritis. Mod Rheumatol (2008) 18:2-14); - rekombinante Proteine stellen einen therapeutisch interessanteren Inhibitoren-Typ dar. Dazu gehören einzelne Protein-Domänen, die die Fähigkeit haben, die Signalwege zu inhibieren. Ein solches Beispiel sind das rekombinant gewonnenes dominantnegatives MyD88 und der Hemmstoff IL-1R, der kaufmännisch unter dem Namen Anakinra bekannt ist und für die Behandlung von rheumatoidem Arthritis verwendet wird. Bei der therapeutischen Verwendung stoßen jedoch auf Grund der geringen Stabilität, der Anwendungsweise, pharmakologischen Eigenschaften und Produktionskosten auch die rekombinanten Proteine an ihre Grenzen.

Die Inhibitoren-Peptide und Peptidomimetika stellen einen therapeutisch entsprechenden Hemmstoff-Typ dar, da sie durch die chemische Synthese gewonnen werden können. Dadurch erhalten sie nicht nur die entsprechende Qualität und Reinheitsgrad, sonder können auch industriell in großen Mengen produziert werden. Für die Inhibition des vom TLR4-Rezeptor abhängigen Signalwegs sind zurzeit Inhibitoren-Peptide bekannt, dessen Sequenz der Sequenz der BB-Schleifen der Adapter MyD88, Mal/TIRAP, TRIF und TRAM (Patent Nr. W02006113530 (A2)) entspricht. Die Peptide der BB-Schleifen der Adapter sind nicht spezifisch auf ein bestimmtes Ziel gerichtet, sie können sich nämlich auch auf andere Proteine mit der TIR-Domäne binden.

NACHGEREICHT 5

Die Inhibition des interzellulären Signalwegs ist jedoch nur mit der Zufuhr des Hemmpeptids in die Zelle möglich. Für die Translokation der Peptide in die Zelle werden üblicherweise kurze Sequenzen verwendet, die aus Proteinseg menten mit der Fähigkeit des Eintretens in die Zelle hervorgehen, z.B. die Sequenz des TAT-Proteins des HIV-1-Virus und die Sequenz der Homeodomäne des Transkriptionsfaktors Antennapedia bei der Essigfliege (Sebbage V. Cell-penetrating peptides and their therapeutic appli-cations. 2009. Bioscience Horizons. Vol 2 (1): 64-72). Eine solche Sequenz wurde auch im Fall der Peptide der BB-Schleifen verwendet. Ein noch weniger bekanntes und zur Signalinhibition der TLR-Rezeptoren noch nicht verwendetes Verfahren für den Transport der Peptide in die Zelle umfasst auch die Zugabe der Azylkette (Nelson A.R., Borland L., Allbritton N.L., Sims C.E. 2007. Myristoyl-based transport of peptides into living cells. Biochemistry 46: 14771-14781)

Die Erfinder entdeckten einen neuen Typ der Peptid-Inhibitoren, die die Aktivierung des angeborenen Immunsystems hemmen, d.h. die MyD88-abhängige Signalisierung. Diese Peptide (mit SEQ ID NO gekennzeichnete Peptide: 4 bis einschließlich 11) umfassen die Sequenz, die der Sequenz der INT-Domäne des MyD88-Proteins entspricht und wirken durch die Inhibition des Signalwegs.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf die Hemmpeptide mit der Sequenz aus SEQ ID NR: 4 bis einschließlich SEQ ID NR: 11 oder die Peptide mit der Sequenz aus SEQ ID NR: 4 bis einschließlich SEQ ID NR: 11, mit der Option einer solchen Verbindung mit anderen Aminosäure-Sequenzen, außer mit den Sequenzen der TIR-Domäne oder der DD-Domäne des MyD88-Proteins, bei der das Fusions-Protein seine Hemmeigenschaften der Hemmpeptide behält.

Die Erfindung bezieht sich auf Hemmpeptide, die mindestens zu 75 % mit den oben beschriebenen Hemmpeptiden übereinstimmen, und die Hemmpeptide mit punktuell veränderten Aminosäuren sowie Peptide mit der Aminosäure-Sequenz der Domäne INT MyD88 der Wirbeltiere umfassen.

NACHGEREICHT 6

Die Erfindung bezieht sich auf Hemmpeptide, die das hemmende Polypeptid und das Segment für die Übertragung des Peptids in die Zelle enthalten, das Transportsegment stellen jedoch die Translokationssequenzen von Antennapedia aus SEQ ID: 13 oder von TAT-Peptid aus SEQ ID NR: 12 dar. Im zweiten Teil der Erfindung stellen jedoch das Segment für die Übertragung des Peptids in die Zelle Azylketten dar, die 8-22 Kohlenstoffatome enthalten, meistens Lauryl- oder Myristoyl-Ketten.

Die Erfindung bezieht sich auf die DNA-Konstrukte, die die Informationen der Hemmpeptide enthalten und mit den Regulierungselementen verbunden sind, z.B. Promotor und Terminator, die die Äußerung des Hemmpeptids im Organismus des Wirts ermöglichen.

Die Erfindung bezieht sich auf kleine organische Moleküle, Peptidomimetika, die die Eigenschaften und die Funktion der Hemmpeptide imitieren.

Die Erfindung bezieht sich auf die Zubereitung der Hemmpeptide für die Therapie und die Behandlung oder Vorbeugung von Krankheiten bei Menschen und Tieren, wenn die typische Eigenschaft der Erkrankung die Aktivierung der angeborenen Immunreaktion ist und wenn die pharmazeutische Zubereitung Folgendes enthält: (a) Hemmpeptide gemäß Erfindung und (b) pharmazeutisch akzeptable Trägerstoffe.

Die Erfindung bezieht sich auf die Methode der selektiven Inhibition der MyD88-anhängigen Signalwege, entstanden durch die Einfuhr einer beliebigen Hemmpepti-den-Kombination in einer für die Inhibition ausreichenden Menge.

Die Erfindung bezieht sich auf die Methoden zur Vorbeugung der Entzündungsreaktion, die die MyD88-abhängige Aktivierung im Wirt einschließt, und zwar mit Hemmpeptiden, wenn die Entzündungsreaktion mit mindestens einem der folgenden Zustände verbunden ist: Asthma, Kontaktdermatitis, verzögerte Überempfindlichkeit, Wundheilung, allergische Rhinitis, Nahrungsmittel-Überempfindlichkeit, atopische Dermatitis, chronische Darmentzündung, immunologische Lungenerkrankung, Autoimmun- sowie immunvermittelte Hauterkrankungen, Schuppenflechte, mit Glutenempfindlichkeit ver- NACHGEREICi . Γ j bundene Enteropathie, rheumatoide Arthritis, Transplantat-Ablehnung, Sepsis, septischer Schock, Krebs, Gicht, systematisches Lupus Erythematodes, Colitis, neuropa-thischer Schmerz, neurodegenerative Erkrankung, Ischämie, Hypoxie, Transplantationen,

Gemäß der Erfindung umfassen die Methoden die prophylaktische oder therapeutische Zufuhr der Hemmpeptide, das Hemmpeptid wird jedoch auf eine oder mehrere Weisen zugeführt: intravenös, intradermal, unter die Haut, oral, durch Einatmung, durch tiefe Lungeneinatmung, nasal, transdermal, transmukös, vaginal, rektal, in-trathekal, intraartikulär, intraperitoneal oder durch die Methoden der Genbehandlung; das Hemmpeptid kann in Kombination mit Verbindungen, die zur Behandlung oder Vorbeugung von Entzündungen sowie der mit Entzündungen verbundenen Zuständen verwendet werden, zugeführt werden.

Die Erfindung bezieht sich auch auf einen Satz, das mindestens eins der Hemmpeptide und das Kontroll-Peptid ohne Hemmeigenschaften enthält.

Beschreibung der Bilder

Bild 1: Die Peptide der INT-Domäne des MyD88-Adapters hemmen die Signalisierung über TLR4/MD-2. Die Zellen HEK293 ohne die Ausbildung der TLR-Rezeptoren wurden mit Plasmiden für TLR4, seinem Korezeptor MD-2 und Reporterplasmiden transferiert. 24 Stunden nach derTransfektion wurden Peptide zugeführt und 6 Stunden später wurden die Zellen HEK293 mit sLPS stimuliert (Endkonzentration 25 ng/ml). Nach 16 Stunden wurden die Zellen lysiert und die Luciferase-Aktivität wurde ermittelt. p71, p72, p73, p74, p92, p93 sind verschiedene Hemmpeptiden, p75 ist das Kontroll-peptid.

Bild 2: Die Peptide der INT-Domäne des MyD88-Adapters hemmen die Signalisierung über den Interleukin-Rezeptor 1. Die Zellen HEK293 mit dem Interleukin-Rezeptor 1 wurden mit Reporterplasmiden transferiert. 24 Stunden nach derTransfektion wurden Peptide zugeführt und 6 Stunden später wurden die Zellen HEK293 mit IL-1 beta stimuliert (Endkonzentration 5 ng/ml). Nach 16 Stunden wurden die Zellen lysiert und

NACHGEREICHT »· · * ·*·1 8 die Luciferase-Aktivität wurde ermittelt. p71, p72, p73, p74, p92 sind verschiedene Hemmpeptiden, p75 ist das Kontrollpeptid.

Bild 3: Die Peptide der INT-Domäne des MyD88-Adapters hemmen die Signalisierung nicht über den von MyD88-abhängigen Rezeptor TLR3. Die Zellen HEK293 ohne ausgebildete TLR-Rezeptoren wurden mit Plasmiden für TLR3 und den Reporterplasmiden transfektiert. 24 Stunden nach der Transfektion wurden Peptide zugeführt und 6 Stunden später wurden die Zellen HEK293 mit poly l:C stimuliert (Endkonzentration 10 ng/ml). Nach 16 Stunden wurden die Zellen lysiert und die Luciferase-Aktivität wurde ermittelt. p71, p72, p73, p74, p92, p93 sind verschiedene Hemmpeptiden, p75 ist das Kontrollpeptid.

Bild 4: Die Peptide der INT-Domäne des MyD88-Adapters hemmen die Synthese von mRNA für TNF-alfa bei durch sLPS stimulierten MM6-Zellen. Der menschlichen Mo-nozyten-Zelllinie MM6 wurden Peptide {Endkonzentration 50 uM) zugegeben und sie wurde 2 Stunden später mit sLPS {Endkonzentration 0,5 ug/ml) stimuliert. 1,5 Stunden später wurde die RNA isoliert, RT-PCR sowie qPCR wurden durchgeführt. p71, p74, p93 sind die verschiedenen Hemmpeptide, p75 ist das Kontrollpeptid. ***p<0.005.

Bild 5: Die Peptide der INT-Domäne des MyD88-Adapters hemmen die Synthese von mRNA für TNF-alfa bei durch Flagellin stimulierten MM6-Zellen. Der menschlichen Monozyten-Zelllinie MM6 wurden Peptide (EndKonzentration 50 uM) zugegeben und sie wurde 2 Stunden später mit Flagellin (Endkonzentration 50 ug/ml) stimuliert. 1,5 Stunden später wurde die RNA isoliert, RT-PCR sowie qPCR wurden durchgeführt. p71, p74 sind die verschiedenen Hemmpeptide, p52 ist das Kontrollpeptid. ***p<0.005.

Bild 6: Die Peptide der INT-Domäne des MyD88-Adapters hemmen die Synthese von mRNA für TNF-alfa bei durch R848 stimulierten MM6-Zellen. Der menschlichen Monozyten-Zelllinie MM6 wurden Peptide (Endkonzentration 50 uM) zugegeben und sie wurde 2 Stunden später mit R848 (Endkonzentration 10 ug/ml) stimuliert. 1,5 Stunden später wurde die RNA isoliert, RT-PCR sowie qPCR wurden durchgeführt. p71, p74 sind die verschiedenen Hemmpeptide, p52 ist das Kontrollpeptid. *p<0.05, **p<0.01.

nachgereicht I

Bild 7: Die Peptide der INT-Domäne des MyD88-Adapters hemmen die ERK-Kinase-Phosphorylierung bei RAW264.7-Zellen. Der Makrophagen-Zelllinie von Mäusen RAW264.7 wurden Peptide (Endkonzentration 50 uM) zugegeben und sie wurde 2 Stunden später mit sLPS (Endkonzentration 0,5 ug/ml) stimuliert. 15 Minuten später wurden die Zellen lysiert und die Stufe der Phosphorylierung von Kinasen p42/p44 wurde mit Hilfe von Antikörpern ermittelt. Ein gleichmäßiges Aufträgen von Proteinen wurde durch die Detektion von a/b-Tubulin gezeigt. p71, p73, p92, p93 sind verschiedene Hemmpeptiden, p75 ist das Kontrollpeptid.

Bild 8: Die Peptid-Internalisierung mit dem Translokations-Element Antennapedia (p93), gekennzeichnet mit Alexa Flour 555. Das mit Alexa Flour 555 gekennzeichnete Peptid wurde für 20 Minuten zur Zelllinie HeLa gegeben, danach wurden die Zellen ausgespült und mit einem Membranenfarbstoff Dio und dem Kernfarbstoff Hoechst gefärbt Das linke Bild zeigt die Zellkerne, das mittlere die Membrane und rechts ist das internalisierte Peptid mit fluoreszierender Kennzeichnung dargestellt.

Bild 9: Die Peptid-Internalisierung mit dazugegebenem Myristat als Translokations-Signal (p71), gekennzeichnet mit Alexa Flour 555. Das mit Alexa Flour 555 gekennzeichnete Peptid wurde für 20 Minuten zur Zelllinie HeLa gegeben, danach wurden die Zellen ausgespült und mit einem Membranenfarbstoff Dio und dem Kernfarbstoff Hoechst gefärbt. Das linke Bild zeigt die Zellkerne, das mittlere die Membrane und rechts ist das internalisierte Peptid mit fluoreszierender Kennzeichnung dargestellt.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Sofern nicht anders festgelegt, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung wie sie allgemein den Fachexperten aus dem Bereich der Erfindung bekannt ist. Der Zweck der Terminologie, die bei der Beschreibung der Erfindung verwendet wird, ist die Erläuterung eines bestimmten Segments der Erfindung und nicht die Einschränkung der Erfindung. Sämtliche in der Beschreibung genannten Veröffentlichungen sind als Referenzen angeführt. Die Beschreibung der Erfindung und die Patentansprüche sind in der Einzahl geschrieben, NACHGEREIC! ;T ! _ _ » sie inkludieren jedoch auch die Mehrzahl, was aber in der Beschreibung zwecks der Einfachheit nicht speziell betont wird.

Die Grundlage für die Erfindung ist die überraschende Entdeckung, dass die MyD88-abhängige Signalisierung des angeborenen Immunsystems durch Peptide mit der Sequenz der INT MyD88-Domäne, die sich zwischen der DD-Domäne und TIR-Domäne im MyD88 befindet sowie die Aminosäure-Sequenz 110 bis 158 im SEQ ID:1 enthält, unterbrochen werden kann. Die präsentierte Erfindung beschreibt einen neuen Typ der Hemmpeptide, deren Zusammensetzung basiert auf den jüngsten Erkenntnissen der Erfinder im Bereich der angeborenen Immunität. Die Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass die Peptide mit der Sequenz der Domäne INT MyD88 dazu fähig sind, die Aktivierung des angeborenen Immunsystems zu hemmen und somit stellen sie ein neues Werkzeug für die Behandlung der mit der übermäßigen Aktivierung des angeborenen Immunsystems verbundenen Krankheitszuständen.

Der Begriff »Peptid« bezieht sich in der Beschreibung der Erfindung auf die Peptide bzw. Proteine, die mindestens zwei mit einer Peptidbindung miteinander verbundene Aminosäuren enthalten. Der Begriff »Peptid« bezeichnet kurze Ketten sowie auch auf längere Aminosäure-Ketten, die gewöhnlich Proteine genannt werden. Das Peptid kann auch Aminosäuren enthalten, die nicht im Genom kodiert sind. Diese Aminosäuren können durch natürliche Prozesse (wie Posttranslations-Modifikationen) oder chemisch modifiziert sein. Die Modifikationen können überall auf dem Peptid auftre-ten, auf Nebenketten der Aminosäuren, auf N-Terminus oder C-Terminus. Das einzelne Peptid kann mehrere verschiedene Modifikationen an verschiedenen Stellen enthalten. Peptide können linear, verzweigt oder zyklisch sein, Zu den Peptid-Modifikationen gehören: Acetylierung, Azylierung, ADP-Ribosylierung, Amidierung, kovalente Bindung von Lipiden oder Lipidderivaten, kovalente Bindungen von Phosphatidyli-nositolen, Zyklisierung, Bildung von Disulfid-Brücken, kovalente Verbindungen, Glyko-lisierung, Hydroxylierung, Phosphorierung, Prenylierung, Ubiquitinierung und Ähnliches.

NACHGEREICf !T I

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Der Begriff »Hemmpeptid« bezieht sich in der Beschreibung der Erfindung auf die Peptide mit der Sequenz, die dazu fähig ist, den Signalweg in der Zelle zu inhibieren bzw. zu stoppen. Der Begriff "Inhibition" bedeutet jede messbare Reduktion der Äußerung der Produkte der Aktivierung von TLR-Rezeptoren, der Signalisierung der TLR-Rezeptoren oder der von TLR vermittelten Genäußerung, z.B. die Äußerung der Zytokine.

Der Begriff »angeborene Immunreaktion bzw. angeborene Immunität« bezeichnet die Zellenreaktion bei der Aktivierung der Toll-like- sowie anderer Zellrezeptoren, wobei die Rezeptorsequenz in den Reproduktionszellen definiert ist und sich im Organismus nicht verändert.

Der Begriff »Adapterprotein« oder »Adapter« bezeichnet Zytosol-Proteine, die bei der Übertragung des Dimerisierungssignals der Domänen TIR TLR vermitteln. Diese Adapter-Proteine enthalten TIR-Domänen, die sich auf die Domänen TIR TLR und der Interleukin-Rezeptoren sowie anderer Proteine, die die TIR-Domäne enthalten, binden können. Zu den Adaptern gehören MyD88, TRIF, Mal/TIRAP, TRAM und SARM.

Der Begriff »Zellaktivierung« bezeichnet die Aktivierung der Immunreaktion über Toll-like-Rezeptoren, die Aktivierung der angeborenen Immunität oder Freisetzung von Zytokinen.

Der Begriff »Toll-like-Rezeptoren« bzw. »TLR« bezeichnet die TLR-Rezeptoren von Menschen oder Tieren. TLR bezeichnet die Mitglieder der Gruppe der Transmembran-Rezeptoren Typ I, die aus Leuzin-reichen Wiederholungen auf der aminoterminalen Seite, transmembranem Teil sowie Zytosol-Domäne bestehen, die die strukturell erhaltene TIR-Domäne enthält. Der Begriff bezeichnet native Rezeptoren mit der Fähigkeit der Zellaktivierung bzw. die Immunreaktion zusammen mit entsprechenden Liganden (Agonisten). Die TLR-Rezeptoren erkennen verschiedene Moleküle, deren Struktur und Lokalisierung typisch für die Infektion durch Mikroben oder für pathologische Bedingungen sind, zum Beispiel chronische Erkrankungen wie Krebs, Arterienverkalkung oder autoimmune Erkrankungen. Die Toll-like-Rezeptoren befinden sich entweder an der Zelloberfläche (TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6, TLR10, TLR11) o- NACHGEREICHT | 12 • ft der in den intrazellulären Vesikeln (TLR3, TLR7, TLR8, TLR9). Zur Aktivierung der TLR kommt es bei der Bindung des Moleküls, das die Ektodomäne TLR, die aus Leuzin-Wiederholungen besteht (LRR), aktiviert (Agonist). Die Bindung des Agonisten bewirkt die Dimerisation der Ektodomänen und dadurch die Dimerisation der TIR-Zytosol-Domänen. Bei der Dimerisation von TIR-Domänen binden sich im Zytosol auf sie die Zytosol-Adapter wie MyD88 oder TRIF und durch die Aktivierung der Protein-Kinasen wird die Signalkaskade ausgelöst, die zur Aktivierung der Transkriptionsfaktoren und zum Überschreiben der Gene, die bei der Immunreaktion mitwirken, führt.

Verschiedene TLR lösen verschiedene Reaktionen aus, entweder über MyD88-abhängige oder TRIF-abhängige Wege, und im Organismus die Produktion entzündungshemmender Zytokine wie IL-1, IL-6, TNF-alfa oder anderer Interferone.

Die Erfinder konnten zeigen, dass es möglich ist, mit den Hemmpeptiden mit der Sequenz der INT-Domäne MyD88 die Aktivierung der MyD88-abhängigen Signalwege spezifisch zu inhibieren.

Sofern nicht anders festgelegt, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung wie sie allgemein den Fachexperten aus dem Bereich der Erfindung bekannt ist. Der Zweck der Terminologie, die bei der Beschreibung der Erfindung verwendet wird, ist die Erläuterung eines bestimmten Segments der Erfindung und nicht die Einschränkung der Erfindung. Sämtliche in der Beschreibung genannten Veröffentlichungen sind als Referenzen angeführt. Die Beschreibung der Erfindung und die Patentansprüche sind in der Einzahl geschrieben, sie inkludieren jedoch auch die Mehrzahl, was aber in der Beschreibung zwecks der Einfachheit nicht speziell betont wird.

Hemm peptide

Die präsentierte Erfindung basiert auf der unerwarteten Entdeckung, dass Peptide mit der Sequenz der INT-Domäne des Adapterproteins MyD88 die MyD88-anhängigen Signalwege der angeborenen Immunität inhibieren.

NACHGEREICHT • « I · » « · • > · * »·»« · « *· *· ·♦ » ** k 13

Die Erfindung bezieht sich auf Hemmpeptide (SEQ ID: 4 bis einschließlich SEQ ID NR: 11), die die Hemmsequenz enthalten: diese Sequenz der INT-Domäne MyD88 (Sequenz von der 110. bis 130. Aminosäure von MyD88 unter SEQ ID: 1 und kürzere Sequenzen, die lange sind als 10 Aminosäuren) oder die verkürzte Sequenz, solange diese noch die Hemmfunktion beibehält, und auch punktuelle Veränderungen (Änderungen einzelner Aminosäuren) in der Sequenz, die ihre Hemmfunktion nicht aufhe-ben.

Die Hemmaktivität des Peptids der INT-Domäne, die 9 Aminosäure-Reste enthält (SEQ ID: 11), war wesentlich geringer als die Hemmaktivität des Peptids mit 13 (SEQ ID: 5) oder 21 (SEQ ID: 4) Aminosäure-Resten. Peptide, deren Sequenz-Länge zwischen diesen zwei Grenzwerten liegt, zum Beispiel SEQ ID: 6, mit 17 Resten, sind auch hemmaktiv. Aus der Erfindung geht auch hervor, dass sich das Hemmpeptid auch als Fusionspeptid mit anderen Proteinen oder anderen Molekülen verbinden kann (ausgenommen die Sequenz der TIR-Domäne oder der DD-Domäne von MyD88), solange er die Hemmfunktion hat. Natürlich umfasst die Erfindung auch Mul-timere der Hemmpeptide, und zwar mit der gleichen oder mit verschiedener Länge.

Ein zusätzlicher Aspekt der Erfindung ist, dass die Hemmpeptide neben dem Hemmsegment, das die Aktivierung über MyD88 verhindert, auch eine zusätzliche "Translokationssequenz" enthalten können, die bei der Einführung in die Zelle mitwirkt, jedoch nicht auf Azylketten bzw. auf die bekannten Peptidsequenzen für die Zufuhr in die Zelle reduziert ist und sich entweder auf dem N-Terminus oder C-Terminus der Hemmsequenz befindet. Der Begriff »Translokationssequenz« bezeichnet kurze, aus Proteinsegmenten entstandene Polypeptid-Sequenzen mit der Fähigkeit zum Eintritt in die Zelle, zum Beispiel die Sequenz des TAT-Protein des Virus HIV-1 und die Sequenz der Homeodomäne des Transkriptionsfaktors von Antennapedia bei der Essigfliege. Jede Translokationssequenz, die zur Einfuhr der Hemmsequenz in die Zelle verwendet werden kann, kann gemäß dieser Erfindung verwendet werden.

Auch manche andere Methoden können für die Einfuhr des Hemmpeptids in die Zelle verwendet werden, einschließlich nichtkovalente oder kovalente Verbindungen mit

NACHGEFtEICHT 14 * «·

Translokationssequenzen, Virusproteinen, Proteinen, die die Endozytose ermöglichen bzw. der Eintritt über Rezeptoren, Translokation über die Membrane und auch physikalischen Eintrittsmethoden, z.B. Mikroinjektion, Elektroporation, über Porenbildung oder andere Methoden.

Eine weniger bekannte und zur Signalhemmung der TLR-Rezeptoren bisher noch nie verwendete Methode für den Peptidtransport in die Zelle verwendet den Zusatz von hydrophoben Gruppen wie Fettsäureketten, vor allem die Azylkette mit einer Länge zwischen 6 und 28 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise zwischen 8 und 22 Kohlenstoffatomen. Die Azyiketten können gerade, verzweigt, zyklisch, gesättigt oder ungesättigt sein, sie können Heteroatome wie Sauerstoff, Schwefel, Stickstoff, Phosphor und andere enthalten.

Als Hemmstoffe der TLR- und IL-1R-Aktivierung können auch organische Verbindungen mit entsprechenden Struktureigenschaften mit den oben beschriebenen Hemmpeptiden verwendet werden, meistens mit einer Molekülmasse unter 2 kDa. Oft werden zum Beispiel kleine Moleküle wie Peptidomimetika verwendet. Peptidomimetika, wie es den Fachexperten aus dem Bereich der Erfindung auch bekannt ist, sind chemisch synthetisierte Verbindungen, die die erforderliche räumliche Struktur für die richtige Interaktion mit dem entsprechenden Protein gewährleisten, also können sie eine Reaktion auslösen oder hemmen. Deshalb umfasst die Erfindung auch die Verwendung kleiner Peptidomimetika, die die Wirkung der Peptide aus der INT-Domäne von MyD88 zur Hemmung der MyD88-abhängigen Signale nachahmen.

Die Hemmpeptide dieser Erfindung können mit den im Bereich der Erfindung bekannten Methoden zubereitet werden, z.B. mit einer chemischen Synthese. Die Hemmpeptide können auch in Wirtsorganismen zubereitet werden, z.B. Viren, Bakterien, Kulturhefe, Saugetiere und ähnlichem, und zwar mit Hilfe der Technologie der rekombinan-ten DNA über den rekombinanten Expressionsvektor, der die Informationen für die oben genannten Peptide enthält oder aber endogen im Wirt durch die Methoden der Gentherapie. Es ist möglich, ein DNA-Konstrukt zuzubereiten, das aus einem entsprechenden Vektor und der entsprechenden Sequenz besteht, die die Hemmsequenz der

NACHGEREICHT INT-Domäne von MyD88 kodiert (Beschreibung oben). Diese DNA-Konstrukte können mit den Methoden der Gentherapie in die Zellen einführt werden und somit haben sie den Vorteil der interzellulären Lokalisation, daher brauchen sie keine zusätzlichen T ranslokationssegmente.

Weiters bietet die Erfindung auch die Methoden für die Behandlung der Zustände, die mit einer übermäßigen Aktivierung der TLR-Rezeptoren verbunden sind. Eine dieser Methoden stellt die Einfuhr eines oder mehrerer Hemmpeptide oder der oben beschriebenen Peptidomimetika in den Organismus, der eine Behandlung benötigt, dar, als Option in Kombination mit dem pharmazeutisch akzeptablem Trägerstoff und in einer Menge, die die Signale über MyD88 reduziert oder vollständig hemmt.

Die biologisch aktiven Moleküle dieser Erfindung können auf eine beliebige ausgewählte Zelle gerichtet sein, solange die Möglichkeit besteht, dass diese Moleküle (Hemmpeptide, Peptidomimetika) in Kontakt mit der gewählten Zelle kommen. Die Zellen können sich im Inneren der Gewebes oder des Organs befinden, sie sind jedoch mit den Blutgefäßen, in die das Peptid eingeführt wird, verbunden. Weiters können Peptide auf bestimmte Zelle gerichtet sein, und zwar über zusätzliche Moleküle, die sich an den spezifischen Rezeptor binden, z.B. an den Integrinrezeptor. Zusätzlich können Peptide direkt in das Gewebe eingeführt werden.

Die Einfuhr des Peptids kann ex vivo oder in vivo durchgeführt werden. Die Einfuhr ex vivo umfasst das Sammeln der Proben von Immunzellen, endothelialen Zellen, von Zellen des Schleimhautepithels in der Lunge oder im Darm, odereinen anderen Zelltyp, bei denen die Behandlung für den Organismus nützlich ist. Die gesammelten Zellen werden dann in vitro bebrütet, es werden ausgewählte Hemmpeptide zugegeben und bei der Exposition der Zellen gegen Hemmpeptide können die Zellen wieder in den Organismus zurückkehren, wodurch die therapeutische oder prophylaktische Behandlung gesichert wird. Die Einfuhr in vivo bezieht sich auf die Einfuhr eines oder mehrerer gewählten Hemmpeptide direkt in den Organismus. Die gewählten Peptide können auf jede entsprechende Art eingeführt werden, jedoch nicht beschränkt auf die Injektion (z.B. intravenös, subkutan, intraperitoneal, intradermal, intraartikulär, in-

NACHGEREICHT trathekal), Einatmung, Einnahme ... Wenn die Peptide gemäß der Erfindung in einer enkapsulierter oder enterischer Form zubereitet werden, ist auch die orale Einnahme möglich. Die Hemmpeptide gemäß der Erfindung in Form von DNA-Konstrukten können unter Verwendung von Virusträgern, Lipid-Komplexen, Nanoteilchen, physikalischen Methoden wie Elektroporation, biolistische Methode, Mikroinjektion und ähnlichen Methoden der Genbehandlung eingeführt werden. Zusätzlich können die Moleküle gemäß der Erfindung in Kombination mit anderen Verbindungen oder aktiven Stoffen eingeführt werden, einschließlich immunogener Zusätze, Adjuvanten, Antivirusmedikamente, Antibiotika, entzündungshemmender Medikamente sowie pharmazeutisch akzeptabler Medikamenten oder deren Derivate.

Die Erfindung wird zur Vorbeugung und Behandlung von Krankheiten, die durch Infektionen mit Mikroorganismen entstehen, einschließlich Bakterien, Viren, Pilzen, Urtierchen und anderen Mikroorganismen, zur Vorbeugung und Behandlung von Allergien, Krebsentwicklung, neurodegenerativen Erkrankungen, neuropathischen Schmerzen, rheumatoide Arthritis, Gicht, systemischer Lupus erythematodes und andere Autoimmunkrankheiten sowie Erkrankungen, bei denen die Aktivierung der Immunreaktion die Signalisierung über MyD88 fordert, verwendet.

Der Begriff »Behandlung« bezeichnet den Krankheitszustand des Subjekts, der mindestens in einem der klinischen Indikatoren verbessert oder teilweise verbessert ist, der Begriff bezieht sich auch auf ein verlangsamtes Fortschreiten der Erkrankung oder der Störung. Der Begriff inkludiert auch die Vorbeugung der Infektion und des Krankheitszustandes, er stellt jedoch keine vollkommene Unterbindung des Krankheitszustandes dar, sondern das verlangsamte Fortschreiten des Erkrankungszustands des Subjekts. Die Methode der »Behandlung des Krankheitszustandes« inkludiert therapeutische Behandlungsmethoden und die Vorbeugung des Krankheitszustandes. Die Behandlung des Krankheitszustandes kann sowohl die vorbeugende (prophylaktische) wie auch die therapeutische Behandlung umfassen. Unter vorbeugender Behandlung versteht man eine Behandlung, die vor der Erscheinung der Symptome oder der Anzeichen des Erkrankungszustandes beginnt, Eine solche vorbeugende Behandlung verkleinert allgemein das Risiko der Entwicklung eines Krankheitszustandes im Orga-

NACHGEREICHT nismus und reduziert die Folgen des bereits vorhandenen Krankheitszustandes oder beides. Die therapeutische Behandlung bezieht sich auf die Behandlung, die bei Auftreten der Symptome oder der Anzeichen eines Krankheitszustandes beginnt. Der Zweck einer solchen therapeutischen Behandlung ist die Einschränkung und Reduktion des fortgeschrittenen Krankheitszustandes. Zustände, die durch die Verwendung der Methoden gemäß der Erfindung behandelt werden können, umfassen Virus-, Bakterien-, Pilz-, Parasit-, neoplastische, neurodegenerative Erkrankungen, neuropathi-sche Schmerzen, Herz- und Kreislauferkrankungen, autoimmune Krankheiten, Krebs, Sepsis, septischen Schock ..., sie sind jedoch nicht auf diese beschränkt

Es hat sich gezeigt, dass eine selektive Stimulation von TLR4 über den MyD88-unabhängigen Weg, zum Beispiel mit Hilfe des monophosphorilierten Lipids A (MPLA), einen potentiellen Vorteil für die Impfung darstellt, denn sie verhindert die durch MyD88-Aktivierung verursachten Entzündungsreaktionen. Peptide und Pep-tidomimetika gemäß der Erfindung können in Kombination mit Adjuvanten verwendet werden, die die TLR-Rezeptoren und andere Rezeptoren der angeborenen Immunreaktion stimulieren, und zwar so, dass die ungewollte Entzündung vermieden wird, die nützlichen Eigenschaften des Impfstoffs jedoch erhalten bleiben. Die kann durch Zusatz von Peptiden oder Peptidomimetika gemäß der Erfindung zu jeder beliebigen Kombination von Immunogenen, Adjuvanten oder deren Mischungen bei beliebiger Zufuhrart, wie zum Beispiel subkutal, intramuskulär, nasal oder durch orale Applikation, erreicht werden, jedoch nicht auf diese beschränkt.

Pharmazeutische Zusammensetzung

Die Erfindung bietet eine pharmazeutische Zubereitung mit Hemmpeptiden gemäß der Erfindung und mit pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoffen. Der Begriff »pharmazeutisch akzeptabel« bezeichnet das Material, das für den Organismus des Wirten nicht toxisch ist, dass heißt für Menschen und Tiere, jedoch nicht auf diese beschränkt.

Im Rahmen der Erfindung sind Hemmpeptide und Peptidomimetika gemäß der Erfindung in der pharmazeutischen Zubereitung in einer »inhibitorisch wirksamen« Menge nachgereicht enthalten. Der Begriff »inhibitorisch wirksame« Menge bezeichnet die Menge, die effektiv die Immunreaktion (zellulär oder humoral) im Organismus, dessen pharmazeutische Zubereitung eingeführt wurde, hemmt. Als Option ist eine Dosiermenge, bei der die Aktivierung der Immunreaktion gehemmt wird, ausreichend. Der gewonnene Schutz ist nicht unbedingt vollkommen, es reicht schon, dass der Nutzen der eingeführten pharmazeutischen Zubereitung größer ist als die unerwünschten Wirkungen. Die inhibitorisch wirksame Menge hängt von der Zufuhrart, den Hemmpeptiden und vom Organismus ab. Wirksame Mengen, Dosen, sind auf eine aus dem Stand der Technik bekannte Weise festgelegt und befinden sich vorzugsweise im Bereich zwischen 1 und 1000 Mikrogramm/Kg Körpergewicht entsprechend dem Krankheitstyp, dem Gewebe, der Zufuhrart und anderen Faktoren.

Die pharmazeutische Zubereitung gemäß der Erfindung inkludiert andere medizinischen Agens, pharmazeutische Agens, Stabilisierungsverbindungen, Puffer, Trägerstoffe, Verdünnungsstoffe, Salze, Netzmittel, Osmostabilisatoren.

Die Erfindung ermöglicht auch die Erstellung des Satzes, der im Bereich der Immunsystemforschung für die Durchführung der Erfindung verwendet werden kann. Der Satz enthält die Verpackung, die mindestens eins der oben beschriebenen Hemmpeptide und ein aus Aminosäure-Resten der oben genannten Hemmpeptide bestehenden Kontrollpeptid ohne Hemmeigenschaften enthält, jedoch in einer veränderten Sequenz. Der Satz enthält auch entsprechende Lösungen für die Erstellung der Erfindung sowie die schriftlichen Unterlagen mit der Gebrauchsanleitung für die Erstellung der Erfindung und analytischen Informationen wie Reagentmenge in der Verpackung und Ähnliches.

Im Weiteren sind Erstellungsbeispiele angeführt, deren Zweck es ist, die Erfindung zu verbildlichen. Die Beschreibung einzelner Erstellungsbeispiele dient nicht der Einschränkung der Erfindung, sondern wird als Demonstration der Wirkungsweise der Erfindung dargestellt. NACHGERHICirrj

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Erstellungsbeispiele

Beispiel 1. Schematische Darstellung der Peptide der INT-Domäne des MyD88-Adapters.

Das Beispiel 1 zeigt Hemm- und Kontrollpeptide (Tabelle 1), die für die Präsentation der Wirkungsweise der Erfindung vorbereitet wurden.

Tabelle 1: Schematische Darstellung der Peptide der INT-Domäne des MyD88, die bei den Erstellungsbeispielen mit dem Zweck der Präsentation der Wirkungsweise der Erfindung verwendet wurden.

Peptid Translokationsmotiv Bezeichnung | Peptidsequenz Hemmpeptide P?1 Myristat Sequenz der Domäne INT MyD88 - 21 AS (EEDCQKYILKQQQEEAEKPLQ) p72 Myristat Sequenz der Domäne INT MyD88 - 13 AA (LKQQQEEAEKPLQ) p73 Myristat Sequenz der Domäne INT MyD88 - 17 AA (EEDCQKYILKQQQEEAE) p74 Laurat Sequenz der kationischen AS GRVRRLS und Sequenz der Domäne INT MyD88 - 21 AA (EEDCQKYILKQQQEEAEKPLQ) p51 Myristat Sequenz der Domäne INT MyD88 - 9 AA (LKQQQEEAE) p92 Myristat Sequenz der kationischen AS GRVRRLS und Sequenz der Domäne INT MyD88 - 21 AA (EEDCQKYILKQQEEAEKPLQ) p93 Sequenz Antennapedia (RQIKIWFQNRRM-KWKK) Sequenz der Domäne INT MyD88 -21 AA (EEDCQKYILKQQEEAEKPLQ) Kontrollpeptid P75 - Sequenz der kationischen AS GRVRRLS und Sequenz der Domäne INT MyD88 - 21 AA (EEDCQKYILKQQQEEAEKPLQ) p52 Myristat veränderte Sequenz 21 AS der Domäne INT MyD88

Beispiel 2. Inhibition der angeborenen Immunität in der Zelllinie HEK293 auf dem Niveau der Inhibition des Aktivierungsreporters NF-kB.

Mit diesem Beispiel wurde gezeigt, dass die Hemmpeptide die Aktivierung der natürlichen Immunität überden Rezeptor-Komplex TLR4/MD-2 und IL-1R (MyD88-abhäng-iger Signalweg) hemmen, und nicht auch über den Rezeptor TLR3 (MyD88-unab-hängiger Signalweg). Dies zeigten wir mit der Inhibition Reporteraktivierung mit dem für MyD88-abhängigen Signalweg typischen NF-KB-Promotor, während die Aktivie-

NACHGEREICHT rung im Beispiel des Reporters mit dem für MyD88-unabhängigen Signalweg typischen IFN-beta-Promotor nicht inhibiert wurde.

Die Methoden und Techniken der Bebrütung von Zelllinien sind den Fachexperten aus dem einschlägigen Bereich gut bekannt und werden hier nur grob beschrieben, und zwar zur Erläuterung des Ausführungsbeispiels. Die Zelllinie HEK293 wurde bei 37 °C und 5 % CO2 gebrütet. Zur Bebrütung haben wir das Nährmedium DMEM mit 10 % FBS verwendet, das sämtliche erforderlichen Nährstoffe und Wachstumsfaktoren beinhaltet. Bei entsprechender Dichte wurden sie umgesetzt oder ausgedünnt. Wenn wir sie für Versuche verwenden wollten, wurden die Zellen zuerst mit dem Hemacytome-ter durchgezählt und entsprechend auf die Mikrotiterplatte mit 96 Näpfchen, geeignet für die Bebrütung von Zellkulturen, aufgetragen. Die gefüllten Platten wurden im Brutkasten bei 37 °C und 5 % CO2 gebrütet, bis die Zellen entsprechend durchgewachsen für die Transfektion waren. Für die Zellentransfektion wurden Transfektionsreagenzien GeneJuice, JetPei oder Lipofectamine verwendet. Die Transfektion wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers mit einem angepassten Verfahren für die Transfektion in Mikrotiterplatten mit 96 Näpfchen durchgeführt. Für die Transfektion der Zelllinie HEK293 wurde die folgende DNA in den angeführten Mengen verwendet: pNF-KB-Fluc 50 ng, pRIuc 10 ng, pTLR4 2,5 ng, pMD-2 2,5 ng beim Versuch der Aktivierung des Rezeptor-Komplexes TLR4/MD-2 (Bild 1), pNF-κΒ-Fluc 50 ng, pRIuc 10 ng beim Versuch der Aktivierung IL1-R (Bild 2) bzw. pIFN-beta-Fluc 50 ng, pRIuc 10 ng, pTLR3 20 ng beim Versuch der Aktivierung des Rezeptors TLR3 (Bild 3). 24 Stunden nach der Transfektion wurden den Zellen Hemmpeptide in der neben den Bildern angeführten Menge zugegeben und 6 Stunden später wurden sie mit dem entsprechenden Agonist stimuliert - sLPS für TLR4/MD-2, IL-1 beta für IL1-R sowie poly l:C für TLR3, 16 Stunden später wurden die Zellen lysiert und die Luciferase-Aktivität wurde ermittelt. Für die Luciferase-Aktivität wurde ein Test mit zwei Reporter-Proteinen eingesetzt: (a) Glühwürmchen-Luciferase (Fluc) und (b) Renilla Luciferase (Rluc). Die Glühwürmchen-Luciferase (Fluc) mit CoA, ATP und Luciferin als Substrat, ist funk-

NACHGEREICHT 21 • * • · tional mit dem Promotor verbunden, der die Aktivierung von NFkB bzw. IRF-3 der Transkriptionsfaktoren erkennt Bei der Aktivierung der angeborenen Immunität über TLR-Rezeptoren kommt es zur Aktivierung von NFkB (bei MyD88-abhängigen Signalisierung) bzw. zur Aktivierung von IRF-3 (bei MyD88-unabhängigen Signalisierung). Dies kann man mit der Messung der Aktivität der Glühwürmchen-Luciferase ermitteln. Der zweite Reporter, der gleichzeitig mit dem Plasmid pNF-KB-Fluc bzw. pIFN-beta-Fluc und den Plasmiden für TLR-Rezeptoren in die Zelle transfiziert wird, dient als Reporter für die Wirksamkeit der Transfektion. Das Reporterplasmid trägt die DNA-Information für die Renilla-Luciferase (Rluc) mit dem entsprechenden Substrat Co-elenterazin. Rluc äußert sich in den Zellen unabhängig von den Bedingungen. Für die Analyse der der Expression der Reporterproteine wurden die Zellen mit Puffer gemäß den Herstellerhinweisen (Promega) lysiert. Zuerst wurde die Aktivität der Glühwürmchen-Luciferase gemessen (NF-kB-FIuc bzw. IFN-beta-Fluc) und danach auch die Aktivität der Renilla -Luciferase (Rluc; phRL-TK http://www.promeqa.com/-vectors/prltk.txt). Wir verwendeten die Methode der doppelten Luciferase gemäß den Herstellerhinweisen (Promega). Die Aktivität von Rluc zeigt also den Anteil der trans-fizierter Zellen, während die Aktivität von Fluc die Aktivierung der angeborenen Immunität zeigt. Das Verhältnis Fluc/Rluc (RLU - Eng. relative luciferase units) gibt also den normalisierten Wert der stimulierten Zellen im Vergleich zu den transfizierten Zellen wider.

Die Ergebnisse aus den Bildern 1,2 und 3 zeigen, dass die Hemmpeptide die MyD88-abhängige Signalisierung bei Aktivierung des Rezeptor-Komplexes TLR4/MD-2 und IL-1R hemmen, nicht jedoch die MyD88-unabhängige Signalisierung bei Aktivierung des TLR3-Rezeptors, was auch die Überlegungen des Erfinders bestätigen, dass die Peptide der Domäne INT MyD88 die Aktivierung der angeborenen Immunität hemmen.

Beispiel 3. Die Peptide der INT-Domäne des MyD88-Adapters hemmen die Synthese von mRNA für TNF-alfa bei stimulierter Linie der menschlichen Monozyten MM6.

[nachgereioht j

Das Beispiel 3 zeigt die Wirkungsweise der Peptide der INT-Domäne des MyD88-Adapters an der Modelliinie der menschlichen Monozyten MM6. Die Linie MM6 wurde bei 37 °C und 5 % CO2 gebrütet. Für die Bebrütung wurde das Nährmedium RPMI mit 5 % FBS und dem Zusatz von inessentiellen Aminosäuren verwendet. Für den Versucht entnahmen wir 106 Zellen und fügten ihnen Peptide zu, 2 Stunden später wurden sie mit Agonisten für verschiedene TLR-Rezeptoren stimuliert. Die MM6-Linie ist die menschliche Monozyten-Linie und äußert bereits selbst verschiedene TLR-Rezeptoren. Dies bedeutet, dass sie nicht durch die Transfektion in die Zelle eingeführt werden müssen. 1,5 Stunden nach der Stimulation wurden die Zellen mit dem Reagent TRIzol lysiert und aus ihnen wurde dann die gesamte RNA mit dem kommerziell verfügbaren Satz für die Isolierung von RNA isoliert. Um die Reste der DNA aus den RNA-Isolaten entfernen zu können, wurde auch die Reinigung mit DNase durchgeführt. Es folgte die Reverstranskription von RNA in die cDNA mit entsprechenden anfänglichen Reverse-Oiigonukleotiden (für Zytokine sowie für HPRT als entsprechende Innenkontrolle). Die gewonnene cDNA wurde danach mit qPCR mit entsprechenden Anfangsnukleotiden vermehrt. Das Ergebnis qPCR zeigt die Menge an mRNA für ein bestimmtes Zytokin, normalisiert gemäß der Menge an mRNA für die entsprechende Innenkontrolle. Im Beispiel 3 wird die Wirksamkeit der Hemmpeptide gemäß der Erfindung am Beispiel der Inhibition der mRNA-Synthese für das Zytokin TNF-alfa, dessen Produktion bei der Aktivierung der angeborenen Immunität ausgelöst wird, dargestellt. Die Ergebnisse der Bilder 4, 5 und 6 zeigen, dass die Hemmpeptide die Synthese von mRNA für TNF-alfa bei Stimulierung der MM6-Zellen mit Agonisten für TLR4/MD-2 (Bild 4), TLR5 (Bild 5) sowie TLR8 (Bild 6) inhibieren, die die MyD88-abhängige Signalisierung auslösen, was auch die Überlegungen des Erfinders bestätigen, dass die Peptide der Domäne INT MyD88 die Aktivierung der angeborenen Immunität hemmen.

Beispiel 4. Peptide der INT-Domäne des MyD88-Adapters hemmen die ERK-Kinase-Phosphorylierung bei Mausmakrofagen RAW264.7.

Das Beispiel 4 zeigt die Wirkungsweise der Peptide der INT-Domäne des MyD88-Adapters an der Modelllinie der Mausmakrofage RAW264.7. Die Linie RAW264.7 wurde bei 37 °C und 5 % CO2 bebrütet. Für die Bebrütung wurde das Nährmedium

NACHGEREICI 23 DMEM mit 10 % FBS verwendet. Für den Versucht entnahmen wir 106 Zellen und fügten ihnen Peptide zu. 2 Stunden später wurden sie mit sLPS stimuliert und nach 15 Minuten mit Lysepuffer lysiert, es wurden auch Phosphatase-Inhibitoren zugegeben. Bei Aktivierung der TLR-Rezeptoren an der Oberfläche der Mausmakrofage kommt es sehr schnell zu Phosphorylierung von MAP-Kinasen, dazu gehören auch ERK-Kina-sen (p44/p44), So kann die Aktivierung der angeborenen Immunität auch über die Phosphorylierung der ERK-Kinasen verfolgt werden. Bei der löslichen Fraktion der Zell-Lysaten wurde die Protein-Konzentration ermittelt und auf das SDS-Gel wurden 40 ug Proteine aufgetragen. Nach der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurden die nach Größe getrennten Proteine auf die Nitrocellulose-Membrane mit der Übertragung nach Western übertragen. Die phosphorylierten Kinasen werden mit Hilfe spezifischer Antikörper detektiert. Die Ergebnisse aus Bild 7 zeigen, dass die Hemmpeptide die ERK-Kinase-Phosphorylierung hemmen, was auch die Überlegungen des Erfinders bestätigen, dass die Peptide der Domäne INT MyD88 die Aktivierung der angeborenen Immunität hemmen.

Beispiel 5. Internalisierung der Peptide der INT*Domäne des MyD88-Adapters.

Das Beispiel 5 stellt die Lokalisierung der fluoreszierend gekennzeichneten Peptide in der Zelllinie HeLa dar. Die Lokalisierung der fluoreszierend gekennzeichneten Hemmpeptide in der Zelllinie ermittelten die Erfinder durch das Mikroskopieren mit dem Kon-fokalmikroskop. Die Techniken und Methoden der Arbeit mit dem Konfokalmikroskop und die Färbung der Zellelemente sind den Fachexperten allgemein bekannt. Die fluoreszierend gekennzeichneten Peptide wurden den Zellen HeLa zugegeben, die 24 Stunden davor in entsprechende Näpfchen für die Mikroskopierung gefüllt wurden. 30 Minuten später wurden die Zellen mit PBS-Puffer gespült und ein neues Nährmedium wurde zugefügt. Die Zellkerne wurden mit dem Farbstoff Hoechst gefärbt und die Zellmembranen mit dem Farbstoff Dio. Die gekennzeichneten lebenden Zellen wurden durch das Konfokalmikroskop Leica TCS SPS kontrolliert. Dieses Mikroskop dient zum Laserscannen der fluoreszierend gekennzeichneten lebenden oder fixierten Zellen.

Wir verwendeten das 63* Ölimmersionsobjektiv. Die Bilder wurden mit dem Programm LAS AF 1.8.0. Leica Microsystems erstellt. Die Laserbenutzung war von den

NACHGEREICHT 24 • * * *

Wellenlängen abhängig, bei denen wir die einzelnen Fluorophore (Farbstoffe) stimulieren wollten.

Die Bilder 8 und 9 zeigen, dass die Hemmpeptide im Zellinneren lokalisiert werden, was auch die Bedingung für ihre erfolgreiche Wirkung darstellt. SEQUENZEN-LISTE <160 > 13 <170> Patentin Version 3.4 <210> 1 <211> 296

<212> PRT <213> Homo sapiens <22Q> <221> reifes Peptid <222> (1)..(296) <223> MyD88

NACHGEREICHT <4 0 0 > 1

Met Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser 1 5 10 15 Thr Ser Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg 20 25 30 Leu Ser Leu Phe Leu Asn Val Arg Thr Gin Val Ala Ala Asp Trp Thr 35 40 45 Ala Leu Ala Glu Glu Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gin Leu 50 55 60 Glu Thr Gin Ala Asp Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gin Gly 65 70 75 80 Arg Pro Gly Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu 85 90 95 Gly Cys Asp Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp 100 105 110 Cys Gin Lys Tyr Ile Leu Lys Gin Gin Gin Glu Glu Ala Glu Lys Pro 115 120 125 Leu Gin Val Ala Ala Val Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu 130 135 140 · • · • · * • « ♦ · • • · • 1 • * · • · * · • • · • 25 Ala Gly Ile Thr Thr Leu Asp Asp Pro Leu Gly His Met Pro Glu Arg 145 150 155 160 Phe Asp Ala Phe Ile Cys Tyr Cys Pro Ser Asp Ile Gin Phe Val Gin 165 170 175 Glu Met Ile Arg Gin Leu Glu Gin Thr Asn Tyr Arg Leu Lys Leu Cys 180 185 190 Val Ser Asp Arg Asp Val Leu Pro Gly Thr Cys Val Trp Ser Ile Ala 195 200 205 Ser Glu Leu Ile Glu Lys Arg Cys Arg Arg Met Val Val Val Val Ser 210 215 220 Asp Asp Tyr Leu Gin Ser Lys Glu Cys Asp Phe Gin Thr Lys Phe Ala 225 230 235 240 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala His Gin Lys Arg Leu Ile Pro Ile Lys 245 250 255 Tyr Lys Ala Met LyS Lys Glu Phe Pro Ser Ile Leu Arg Phe Ile Thr 260 265 270 Val Cys Asp Tyr Thr Asn Pro Cys Thr Lys Ser Trp Phe Trp Thr Arg 275 280 285 Leu Ala Lys Ala Leu Ser Leu Pro 290 295 <210 > 2 <211> 49

<212> PRT <213> Homo sapiens <220 > <221> reifes Peptid <222 > (1) . . (49) <223> Domäne INT MyD88 <400> 2

Glu Glu Asp Cys Gin Lys Tyr Ile Leu Lys Gin Gin Gin Glu Glu Ala 15 10 15

Glu Lys Pro Leu Gin Val Ala Ala Val Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr 20 25 30

Ala Glu Leu Ala Gly Ile Thr Thr Leu Asp Asp Pro Leu Gly His Met 35 40 45

Pro <210> 3 nachgereicht * · * · • * * * » • • » • » • * • · • * • · f 26 <211? 49 <212? PRT <213? Mus musculus <220? <221? reifes Peptid <222? <1> ..(49) <223? Domäne INT MyD88 Mus Musculus <400? 3 Glu Glu Asp Cys Gin Lys Tyr Leu Gly Lys 1 5 10 Glu Lys i Pro Leu Gin Val Ala Arg Val Glu 20 25 Lys Glu . Leu Gly Gly Ile Thr Thr Leu Asp 35 40 Pro <210? 4 <211? 21 <212? PRT <213? künstliche Sequenz <220? <221? reifes Peptid <222? (1)..(21) <223? P?1 <400? 4 Glu Glu l Asp Cys Gin Lys Tyr Ile Leu Lys 1 5 10 Glu Lys ! Pro Leu Gin 20 <210? 5 <211? 13 <212? PRT <213? künstliche Sequenz <220? <221? reifes Peptid <222? (1)..(13) <223? p72 <400? 5 Leu Lys i Gin Gin Gin Glu Glu Ala Glu Lys 1 5 10 15 30 45 15 I nachgereicht i

* * ·*·····* ** , * * * | · * * · « ·** « 1 » * # <9 · % ' · * * · »«» ·* ** * ·· I 27 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> künstliche Sequenz <220> <221> reifes Peptid <222> (1) . . (17) <223> p73 <400> 6

Glu Glu Asp Cys Gin Lys Tyr Ile Leu Lys Gin Gin Gin Glu Glu Ala 15 10 15

Glu <210> 7

<211> 28 <212 > PRT <213> künstliche Sequenz <220> <221> reifes Peptid <222> (1)..(28) <223 > p74 <400> 7

Gly Arg Val Arg Arg Leu Ser Glu Glu Asp Cys Gin Lys Tyr Ile Leu 15 10 15

Lys Gin Gin Gin Glu Glu Ala Glu Lys Pro Leu Gin 20 25

<210> 8 <211> 28 <212> PRT <213> künstliche Sequenz <220> <221> reifes Peptid <222> (1)..(28) <223> p75 <400> 8

Gly Arg Val Arg Arg Leu Ser Glu Glu Asp Cys Gin Lys Tyr Ile Leu 15 10 15

Lys Gin Gin Gin Glu Glu Ala Glu Lys Pro Leu Gin 20 25 <210> 9 machgereicht

<212> PRT <213> künstliche Sequenz <220> <221> reifes Peptid <222> (1)..(27) <223 > p92 <400> 9 Gly Arg Val Arg Arg Leu Ser Glu Glu Asp 1 5 10 Lys Gin Gin Glu Glu Ala Glu Lys Pro Leu 20 25 <210 > 10 <211> 36 <212> PRT <213 > künstliche Sequenz <22 0 > <221> reifes Peptid <222 > (1)..(36) <223> p93 <400> 10 Arg Gin Ile Lys Ile Trp Phe Gin Asn Arg 1 5 10

IS 15

Glu Glu Asp Cys Gin Lys Tyr Ile Leu Lys Gin Gin Glu Glu Ala Glu 20 25 30

Lys Pro Leu Gin 35 <210> 11 <211> 9

<212 > PRT <213> künstliche Sequenz <22 0> <221> reifes Peptid <222> (1)..(9) <223> p51 <4 0 0 > 11

Leu Lys Gin Gin Gin Glu Glu Ala Glu 1 5

NACHGEREICHT <210> 12 <211> 14 • · * 29

< 212 > PRT <213 > VIRUS HIV- 1 <220> <221> reifes Peptid <222> (1) . . (14)

<223> Protein TAT <400> 12

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro Gin Gin 15 10 <210> 13

<211> 16 <212 > PRT <213> Drosophila melanogaster <220> <221> reifes Peptid <222> (1)..(16) <223> Antennapedia <4 00 > 13

Arg Gin Ile Lys Ile Trp Phe Gin Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 15 10 15

Claims

Patentanwälte Dipl.-Ing. Helmut Hübscher Dipl.-Ing. Karl Winfried Hellmich Spittelwiese 7, A 4020 Linz (38585) HEL Patentansprüche: 1. Hemmpeptid mit der Sequenz unter SEQ ID NR: 4 bis SEQ ID NR: 11.
2. Das Hemmpeptid gemäß Anspruch 1 ist optionsmäßig mit anderen Aminosäuresequenzen verbunden, außer mit den Sequenzen der Domänen TIR oder DD MyD88, so behält das Fusionsprotein die Hemmeigenschaften des Hemmpeptids gemäß Anspruch 1.
3. Die Hemmpeptide gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Hemmpeptid zu 75 % mit dem Hemmpeptid gemäß Anspruch 1 übereinstimmt und die Hemmpeptide mit punktuellen Aminosäure-Veränderungen oder das Hemmpeptid der INT-Domäne MyD88 der Wirbeltiere inkludiert.
4. Das Hemmpeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, das optionsmäßig das Translokationssegment enthält, das den Eintritt des Hemmpeptids in die Zelle ermöglicht und bei dem das Translokationssegment aus Translokationssequenzen, die das Hemmpeptid in die Zelle übertragen, besteht.
5. Das Hemmpeptid gemäß Anspruch 4 mit dem Translokationssegment aus dem Peptid Antennapedia SEQ ID: 13 oder TAT-Peptid SEQ ID NR: 12.
6. Das Hemmpeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, das optionsmäßig das Translokationssegment enthält, wobei das Translokationssegment eine Azylkette ist, die 8 bis 22 Kohlenstoffatome enthält, vorzugsweise eine Lauryl- oder Myristoylkette. NACHCE'_Lw. IT
7. Das Hemmpeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 für die Zubereitung von Therapeutika für die Behandlung oder Vorbeugung von Krankheiten bei Menschen und Tieren, wenn für die Krankheit die Aktivierung der angeborenen Immunreaktion oder Entzündung typisch sind.
8. DNA, die die Peptide gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 kodiert, wobei die DNA operativ mit den Regulationselementen verbunden ist, zum Beispiel mit dem Promotor und dem Terminator, die die Äußerung des Hemmpeptiden im Organismus der Wirten ermöglichen.
9. Kleines organisches Molekül (Peptidomimetikum), das die Eigenschaften und die Wirkung der Peptide gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 nachahmt.
10. Die pharmazeutische Zusammensetzung, die: (a) das Hemmpeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 und (b) den pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff umfasst.
11. Die Methode für die selektive Hemmung MyD88-abhängiger Wege, die eine beliebige Kombination von Hemmpeptiden gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 in einer solchen Menge in die Zelle einführt, die für die Entstehung der Hemmung ausreichend ist.
12. Die Methode zur Vorbeugung der Entzündungsreaktion, die die Aktivierung von MyD88 im Organismus umfasst, für die Zufuhr des Hemmpeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7.
13. Die Methode gemäß Anspruch 12, bei der die Entzündungsreaktion mit mindestens einem der folgenden Zustände verbunden ist - Allergien, Asthma, Kontaktderma-titis, verzögerte Überempfindlichkeit, Wundheilung, allergische Rhinitis, Nahrungsmit-tel-Überempfindlichkeit, atopische Dermatitis, chronische Darmentzündung, immunologische Lungenerkrankung, Autoimmun- sowie immunvermittelte Hauterkrankungen, Schuppenflechte, mit Glutenempfindlichkeit verbundene Enteropathie, rheumatoide NACHGERBC; jT 3 Arthritis, Transplantat-Ablehnung, Sepsis, septischer Schock, Krebs, Gicht, systematisches Lupus Erythematodes, Colitis, neuropathischer Schmerz, neurodegenerative Erkrankung, Ischämie, Hypoxie, Transplantation.
14. Die Methode gemäß Anspruch 12 oder 13, bei der das Hemmpeptid prophylaktisch oder therapeutisch eingeführt wird.
15. Die Methode gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14, bei der das Hemmpeptid oder der DNA-Kode für das Hemmpeptid gemäß Anspruch 8 durch eine oder mehrere folgender Methoden zugeführt wird - intravenös, intradermal, unter die Haut, oral, durch Einatmung, durch tiefe Lungeneinatmung, nasal, transdermal, transmukös, vaginal, rektal, intrathekal, intraartikulär, intraperitoneal oder durch die Methoden der Gentherapie.
16. Die Methode gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15, bei der das Hemmpeptid in Kombination mit der Verbindung, die zur Behandlung und Vorbeugung der mit Entzündungen verbundenen Zustände verwendet werden, eingeführt wird.
17. Der Satz, der mindestens ein Hemmpeptid gemäß einem beliebigen Anspruch von Nr. 1 bis 6 und ein Kontrollpeptid enthält.

Linz, am 10. April 2012