AT501928A1 - Verfahren zur herstellung von chiralen alkoholen - Google Patents

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Description

Verfahren zur Herstellung von chiralen Alkoholen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung enantiomerenreiner Alkohole der allgemeinen Formel Ia bzw. Ib
OH (Ia)
OH
Ri R2
R4 R2'
Rs wobei Ri, R2, R3, R4, R5 und Rö jeweils Wasserstoff, Halogen, eine Ci-Cö-Alkyl- oder C|-C6-Alkoxygruppe repräsentieren, mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Reste Ri, R2, R3, R4, R5 und Rg von den übrigen fünf verschieden ist, sowie der Maßgabe, dass mindestens einer der Reste Rj, R2, R3, R4, R5 und Re ein Halogen ist.
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung enantiomerenreiner Alkohole der allgemeinen Formel lila bzw. Illb
wobei R7, Rg und R9 eine C1 -Cö-Alkylgruppe repräsentieren.
Enantiomerenreine Alkohole der allgemeinen Formeln Ia bzw. Ib und lila bzw. Illb stellen wertvolle chirale Bausteine für die Synthese einer Vielzahl von chiralen Verbindungen dar, welche für die Herstellung von pharmazeutisch wirksamen Substanzen von Interesse sind. Viele dieser enantiomerenreinen Alkohole sind jedoch auf chemischem Weg nicht oder nur sehr aufwendig darstellbar und stehen daher auch nicht in größeren Mengen zur Verfügung.
Die Erfindung stellt sich daher die Aufgabe, ein Verfahren bereitzustellen, das die wirtschaftliche Herstellung enantiomerenreiner Alkohole der allgemeinen Formel Ia bzw. Ib und lila bzw. Illb in hoher Ausbeute und hoher Enantiomerenreinheit ermöglicht. » ·
• · · · ♦ • · · ·· ·· 2
Diese Aufgabe wird in bezug auf die Alkohole der allgemeinen Formel Ia bzw. Ib erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass ein Keton der allgemeinen Formel II
Ri
r4 (II) R2'
wobei Ri, R2, R3, R4, Rs und Re jeweils Wasserstoff, Halogen, eine Ci-Cö-Alkyl- oder Ci-Ce-Alkoxygruppe repräsentieren, mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Reste Ri, R2, R3, R4, R5 und Rö von den übrigen fünf verschieden ist, sowie der Maßgabe, dass mindestens einer der Reste Ri, R2, R3, R4, R5 und Re ein Halogen ist, in Gegenwart einer S- bzw. R-spezifischen Dehydrogenase/Oxidoreduktase unter Verwendung von NADH oder NADPH als Cofaktor enzymatisch reduziert wird.
Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass Ri=R2= CI und R3=R4=R5=R6= H.
Eine andere bevorzugte Ausführungsform ist dadurch gekennzeichnet, dass Ri=R2=R4~ CI und R3= R5=R*= H.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform ist dadurch gekennzeichnet, dass Ri= CH3, R2= CI und R3=R4=R5=R6= H.
Noch eine weitere bevorzugte Ausführungsform ist dadurch gekennzeichnet, dass Ri= CI Und R2=R3=R4=R5=R6= H.
Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe in bezug auf die Alkohole der allgemeinen Formel lila bzw. Illb wird dadurch gelöst, dass ein Keton der allgemeinen Formel IV
• · · • · · ·· · ·· ·· • · ··· ··· ···· • · · ···· · · ··· · · • · t ··· · « · ·· Μ·· · «· ·« ·· 3 wobei R.7, R-b und R9 eine C1 -Cö-Alkylgruppe repräsentieren, in Gegenwart einer S- bzw. R-spezifischen Dehydrogenase/Oxidoreduktase unter Verwendung von NADH oder NADPH als Cofaktor enzymatisch reduziert wird.
Unter dem Begriff „NADH“ wird reduziertes Nicotinamid-adenin-dinucleotid und unter dem Begriff „NAD“ Nicotinamid-adenin-dinucleotid verstanden. Unter dem Begriff „NADPH“ wird reduziertes Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat und unter dem Begriff „NADP“ N icotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat verstanden.
Eine bevorzugte Ausführungsform dieses Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass R7=R8=R9= CH3.
Eine andere bevorzugte Ausführungsform ist dadurch gekennzeichnet, dass R7= CH3 und Rg=R9= C2H5.
Die erfindungsgemäß als Ausgangsmaterial dienenden Ketone der allgemeinen Formel Π bzw. IV sind im Allgemeinen leicht und preiswert erhältlich.
Die für die enzymatische Reduktion eingesetzte Dehydrogenase wird nach einer bevorzugten Ausführungsform aus mikrobiellem Ausgangsmaterial gewonnen. Welche Konfiguration der Produkte überwiegend oder ausschließlich gebildet wird, hängt von der Art der Dehydrogenase/Oxidoreduktase wie auch von der Art des Cofaktors ab.
Vorzugsweise wird bei den Verfahren zur Herstellung von enantiomerenreinen Alkoholen der allgemeinen Formeln Ia bzw. Ib und nia bzw. Illb als R-spezifische Dehydrogenase eine sekundäre Alkoholdehydrogenase aus Lactobazillen der Gattung Lactobacilliales, insbesondere Lactobacillus kefir, Lactobacillus brevis oder Lactobacillus minor, oder aus Pseudomonas eingesetzt.
Unter R-spezifischen sekundären Alkoholdehydrogenasen werden dabei solche verstanden, die die Ketogruppe in einer Gruppierung H3C-C(C=0)-CH2-C zu dem entsprechenden (R)-konfigurierten Alkohol reduzieren. Derartige R-spezifische sekundäre Alkoholdehydrogenasen sind z.B. in der US 5,200,335, der DE 196 10 984 Al, der DE 101 19 274 oder der US 5,385,833 beschrieben.
Als S-spezifische Dehydrogenase wird bevorzugt eine sekundäre Alkoholdehydrogenase aus der Gattung Pichia oder Candida, insbesondere Candida boidinii ADH, Candida parapsilosis
4 oder Pichia capsulata, eingesetzt. Derartige S-spezifische Dehydrogenasen sind z.B. in der US 5,523,223 oder der DE 103 27 454 beschrieben.
Das Enzym muss nicht in reiner Form eingesetzt werden. Ebenso gut können auch enzymhaltige Mikroorganismen oder mehr oder weniger gereinigte Lysate davon verwendet werden. Soll die Reaktion kontinuierlich durchgeführt werden, so können auch immobilisierte Enzyme verwendet werden. Die Immobilisierung kann beispielsweise durch Einschließen der Enzyme - insbesondere in polymere Netzwerke oder in semipermeable Membranen- oder durch Binden an einen Träger, beispielsweise durch Absorption oder durch ionische oder kovalente Bindungen, erfolgen. Bevorzugt werden die Dehydrogenasen aber in freier Form eingesetzt.
Die enzymatische Reduktion selbst läuft unter milden Bedingungen ab, so dass die erzeugten Alkohole nicht weiterreagieren. Die erfindungsgemäßen Verfahren weisen eine hohe Standzeit, eine Enantiomerenreinheit von mehr als 95 % der hergestellten chiralen Alkohole der Formeln Ia bzw. Ib und lila bzw. mb und eine hohe Ausbeute bezogen auf die eingesetzte Menge an Ketoverbindungen der Formel Π bzw. IV auf.
Die Oxidoreduktasen können in den erfindungsgemäßen Verfahren entweder vollständig gereinigt oder teilweise gereinigt, in Form von Zelllysaten oder in Form ganzer Zellen eingesetzt werden. Die eingesetzten Zellen können dabei nativ oder permeabilisiert vorliegen. Bevorzugt werden klonierte und überexprimierte Oxidoreduktasen (beispielsweise bekannt aus der US 5,523,223, der DE 103 27 454 oder der DE 101 19 274) eingesetzt.
Gemäß einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Verfahren beträgt die Volumenaktivität der eingesetzten Oxidoreduktase 10 U/ml bis 5000 U/ml, vorzugsweise 100 U/ml bis 1000 U/ml.
Je kg zu reduzierendem Keton werden im Verfahren 5000 bis 10.000.000 U, vorzugsweise 10.000 bis 1.000.000 U, Oxidoreduktase eingesetzt. Der Enzymeinheit 1 U entspricht dabei der Enzymmenge, die benötigt wird um 1 pmol der Ketoverbindung der Formel Π bzw. IV pro Minute umzusetzen.
Eine bevorzugte Ausfuhrungsform der Erfindung ist weiters dadurch gekennzeichnet, dass das bei der Reduktion gebildete NAD oder NADP kontinuierlich mit einem Cosubstrat zu NADH bzw. NADPH reduziert wird. 99 99 ·· · »· 99 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 9 9 999 9 9 9 9999 9 9 999 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 9999 9 99 99 99 5
Als Cosubstrat werden dabei bevorzugt primäre und sekundäre Alkohole, wie Ethanol, 2-Propanol, 2-Butanol, 2-Pentanol, 4-Methyl-2-pentanol, 2-Octanol oder Cyclohexanol, eingesetzt.
Diese Cosubstrate werden mit Hilfe einer Oxidoreduktase und NAD bzw. NADP zu den entsprechenden Aldehyden oder Ketonen und NADH bzw. NADPH umgesetzt. Dadurch kommt es zur Regenerierung des NADH bzw. NADPH. Der Anteil des Cosubstrates für die Regenerierung beträgt dabei von 5 bis 95 Vol %, bezogen auf das Gesamtvolumen.
Zur Regenerierung des Cofactors kann zusätzlich eine Alkoholdehydrogenase zugesetzt werden. Geeignete NADH-abhängige Alkoholdehydrogenasen sind beispielsweise erhältlich aus Bäckerhefe, aus Candida boidinii, Candida parapsilosis oder Pichia capsulata. Geeignete NADPH-abhängige Alkoholdehydrogenasen kommen ferner vor in Lactobacillus brevis (DE 196 10 984 Al), Lactobacillus minor (DE 101 19 274), Pseudomonas (US 5,385,833) oder in Thermoanaerobium brockii. Geeignete Cosubstrate für diese Alkoholdehydrogenasen sind die bereits genannten sekundären Alkohole wie Ethanol, 2-Propanol (Isopropanol), 2-Butanol, 2-Pentanol, 4-Methyl-2-pentanol, 2-Octanol oder Cyclohexanol.
Ferner kann die Cofactorregenerierung beispielsweise auch mit mittels NAD- oder NADP-abhängiger Formiat-Dehydrogenase (Tishkov et al., J. Biotechnol. Bioeng. [1999] 64, 187-193, Pilot-scale production and isolation of recombinant NAD and NADP specific Formate dehydrogenase) durchgeführt werden. Geeignete Cosubstrate der Formiat-Dehydrogenase sind beispielsweise Salze der Ameisensäure wie Ammoniumformiat, Natriumformiat oder Calciumformiat. Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Verfahren jedoch ohne eine solche zusätzliche Dehydrogenase durchgeführt, d.h. es findet eine substratgekoppelte Coenzymregenerierung statt.
Der wässrige Anteil des Reaktionsgemisches, in dem die enzymatische Reduktion abläuft enthält bevorzugt einen Puffer, beispielsweise Kaliumphosphat-, Tris/HCl- oder Triethanolamin-Puffer, mit einem pH-Wert von 5 bis 10, vorzugsweise ein pH-Wert von 6 bis 9. Der Puffer kann zusätzlich noch Ionen zur Stabilisierung oder Aktivierung der Enzyme enthalten, beispielsweise Zinkionen oder Magnesiumionen.
Die Temperatur beträgt während der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zweckmäßig von etwa 10°C bis 70°C, bevorzugt von 20°C bis 40°C. ·· ·· · ·· ·· ·· ♦ · · · · · ·· « · ♦ · · · · ·· · · ♦ ·« • · ♦ ··♦♦ ♦ · #·· · » • · t · · · ♦ · ♦ ·· ·♦·· · ·· ·· ·· 6
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren wird die enzymatische Umsetzung in Anwesenheit eines mit Wasser nicht oder nur beschränkt mischbaren organischen Lösungsmittels durchgeführt. Dieses Lösungsmittel ist beispielsweise ein symmetrischer oder unsymmetrischer Di(Ci-C6)alkylether, ein geradkettiges oder verzweigtes Alkan oder Cycloalkan oder ein wasserunlöslicher sekundärer Alkohol, der zugleich das Cosubstrat darstellt. Die bevorzugten organischen Lösungsmittel sind beispielsweise Diethylether, tertiär-Butylmethylether, Diisopropylether, Dibutylether, Butylacetat, Heptan, Hexan, 2-Oktanol, 2-Heptanol, 4-Methyl-2-pentanol oder Cyclohexan.
Der Reaktionsansatz besteht beim Einsatz wasserunlöslicher Lösungsmittel bzw. Cosubstrate aus einer wässrigen und einer organischen Phase. Das Substrat verteilt sich entsprechend seiner Löslichkeit zwischen organischer und wässriger Phase. Die organische Phase hat allgemein einen Anteil von 5 bis 95 %, bevorzugt von 20 bis90 % bezogen auf das gesamte Reaktionsvolumen. Die zwei flüssigen Phasen werden bevorzugt mechanisch gemischt, so dass eine große Oberfläche zwischen ihnen erzeugt wird. Auch in dieser Ausführungsform kann das bei der enzymatischen Reduktion gebildete NAD bzw. NADP mit einem Cosubstrat, wie beschrieben, wieder zu NADH bzw. NADPH reduziert werden.
Die Konzentration des Cofaktors NADH bzw. NADPH in der wässrigen Phase beträgt allgemein 0,001 mM bis ImM, insbesondere 0,01 mM bis 0,1 mM.
In den erfindungsgemäßen Verfahren kann noch ein Stabilisator der Oxidoreduktase/Dehydrogenase eingesetzt werden. Geeignete Stabilisatoren sind beispielsweise Glycerin, Sorbitol, 1,4 -DL-Dithiothreit (DTT) oder Dimethylsulfoxid (DMSO).
Das erfmdungsgemäße Verfahren wird beispielsweise in einem geschlossen Reaktionsgefäß aus Glas oder Metall durchgeführt. Dazu werden die Komponenten einzeln in das Reaktionsgefäß überführt und unter einer Atmosphäre von beispielsweise Stickstoff oder Luft gerührt. Die Reaktionszeit beträgt von 1 Stunde bis 48 Stunden, insbesondere von 2 Stunden bis 24 Stunden.
Anschließend wird das Reaktionsgemisch aufgearbeitet. Dazu wird die wässrige Phase abgetrennt, die organische Phase wird filtriert. Die wässrige Phase kann gegebenenfalls noch einmal extrahiert werden und wie die organische Phase weiter aufgearbeitet werden. Danach wird gegebenenfalls das Lösungsmittel aus der filtrierten organischen Phase verdampft. 7 ····
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen näher erläutert.
Beispiele:
Analytik: a) Amide:
Die Bestimmung des ee (enantiomeric excess) erfolgte mittels chiraler Gaschromatographie. Dazu wurde ein Gaschromatograph GC-17A von Shimadzu mit einer chiralen Trennsäule CP-Chirasil-DEX CB (Varian Chrompack, Darmstadt, Deutschland), Flammen-Ionisations-Detektor und Helium als Trägergas benutzt.
Die Trennung von N,N-Dimethyl-3-hydroxybutanamid erfolgte bei 0,86 bar und 10 min bei 120°C, 2°C/min-> 125°C.
Die Retentionszeiten waren: (3R) 10,42 min und (3S) 10,09 min.
Die Trennung von N,N-Diethyl-3-hydroxybutanamid erfolgte bei 0,75 bar und 10 min bei 130°C, 2°C/min-> 135°C.
Die Retentionszeiten waren: (3R) 11,6 min und (3S) 11,3 min. b) Chlor-Verbindungen:
Die Bestimmung des ee (enantiomeric excess) erfolgte mittels chiraler Gaschromatographie. Dazu wurde ein Gaschromatograph GC-17A von Shimadzu mit einer chiralen Trennsäule FS-Hydrodex ß-6-TBDM (Machery-Nagel, Düren, Deutschland), Flammen-Ionisations-Detektor und Helium als Trägergas benutzt.
Die Trennung von l-Chloropropan-2-ol erfolgte bei 0,94 bar und 15 min bei 40°C, l°C/min-> 50°C.
Die Retentionszeiten waren: (2R) 20,3 min und (2S) 20,9 min.
Die Trennung von l,l-Dichloropropan-2-ol erfolgte bei 0,69 bar und 15 min bei 80°C, 2°C/min-> 95°C.
Die Retentionszeiten waren: (2R) 20,8 min und (2S) 21,4 min.
Die Trennung von l,l,3-Trichloropropan-2-ol erfolgte bei 0,69 bar und 30 min bei 120°C isotherm.
Die Retentionszeiten waren: (2R) 25,0 min und (2S) 24,5 min.
Die Trennung von 3-Chlorobutan-2-ol erfolgte bei 0,98 bar und 25 min bei 50°C isotherm. Die Retentionszeiten waren: (3R)-3-Chlorobutan-2-on: 6,0 min (3S)-3-Chlorobutan-2-on: 6,2 min (3R,2R)-3-Chlorobutan-2-ol: 17,5 min ·· · · · ·· «· V« • · · ·· · ·· · · • · · · · »t · ···· • · · ···· · · ··· · · • · · #·· « » « ·· ···· · ·· ·· ·· δ (3R,2S)-3-Chlorobutan-2-ol: 18,1 min (3S,2R)-3-Chlorobutan-2-ol: 20,7 min (3S,2S)-3-Chlorobutan-2-ol: 22,1 min 1. Synthese von (S)-3-Hydroxy-N,N-diethylbutanamid aus N,N-Diethylacetoacetamid
Zur Synthese von (R)-3-Hydroxy-N,N-diethylbutanamid wurde ein Gemisch aus 172 ml Puffer (100 mM Triethanolamin, pH = 7, 0,5 mM DTT, 20% Glycerin), 18 ml 2-Propanol (0,23 mol), 10 ml N,N-Diethylecetoacetamid (63 mmol), 200 mg NAD und 30000 Units rekombinante Alkoholdehydrogenase aus Candida parapsilosis für 24 h bei Raumtemperatur unter ständiger Durchmischung inkubiert. Nach 24 h waren 97 % des eingesetzten N,N-Diethylacetoacetamid zu (S)-3-Hydroxy-N,N-diethylbutanamid reduziert. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend mit Ethylacetat extrahiert und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt. Das so gewonnene Rohprodukt wurde mittels Vakuumdestillation aufgereinigt. Es konnten 2,5 g (S)-3-Hydroxy-N,N-diethylbutanamid mit einer Reinheit >98% und einem Enantiomerenüberschuss von >99,9% gewonnen werden.
Analysenergebnisse:
Elementaranalyse % gef.(ber): C8H17NO2 C: 59,8 (60,4) H: 10,7(10,8) N: 8,9 (8,8) 'H-NMR in CDC13:
Signal Integral Zuordnung 1,13 (T)+ l,19ppm(T) 6 2x CH3 (Ethyl) 1,22 ppm 3 CH3 (neben chiralem Zentrum) 2,3 (DvD)+ 2,5 (DvD) 2 CH2 (neben chiralem Zentrum) 3,2 (DvD)+ 3,5 (DvD) 4,2 2 x CH2 4,2(M) 1 CH (chirales Zentrum) izZiS}_ 0,9 OH ·· · ·· ·· • · · · · • · · ···# • · · · ·· ···· · ·· · · ··· • ··· · · • ♦ · ♦ ·· ·· ·· 9 ,3C-NMR in CDC13:
Signal Zuordnung 12 ppm CH3 (Ethyl) 14 ppm CH3 (Ethyl 22ppm CH3 (neben chiralem Zentrum) 39 ppm ch2 40 ppm ch2 41 ppm ch2 64 ppm CH (chirales Zentrum) 171 ppm C=0 (78 ppm) Lösungsmittel (CDC13)
Spezifische Drehwerte:
Der spezifische Drehwert [<x]d20 der Enantiomere wurde mit einem Präzisionspolarimeter POL-S2 bei einer Schichtdicke von 1 dm gemessen. Für die Untersuchung wurden 0,5 g Probe in 25 ml EtOH gelöst. (S)-3-Hydroxy-N,N-diethylbutanamid (100%) [oc]d20 = +19,92 ±1 0 x l/g»dm 2. Synthese von (R)-3-Hydroxy-N,N-diethylbutanamid aus N,N-Diethylacetoacetamid
Zur Synthese von (R)-3-Hydroxy-N,N-diethylbutanamid wurde ein Gemisch aus 290 ml Puffer (100 mM Triethanolamin, pH = 7,1 mM MgCl2, 10% Glycerin), 100 ml 2-Propanol (1,3 mol), 10 ml N,N-Diethylecetoacetamid (63 mmol), 20 mg NADP und 60000 Units rekombinante Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus minor (DE-A 101 19 274) für 24 h bei Raumtemperatur unter ständiger Durchmischung inkubiert. Nach 24 h waren 60 % des eingesetzten Ν,Ν-Diethylacetoacetamid zu (R)-3-Hydroxy-N,N-diethylbutanamid reduziert. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend mit Ethylacetat extrahiert und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt. Das so gewonnene Rohprodukt wurde mittels Vakuumdestillation aufgereinigt. Es konnten 2,5 g (R)-3-Hydroxy-N,N-diethylbutanamid mit einer Reinheit >98% und einem Enantiomerenüberschuss von >99% gewonnen werden.
Analysenergebnisse:
Elementaranalyse % gef.(ber): CeHnNCh C: 59,8 (60,4) • ♦ · · · ·· · · ··· • · ♦ ···· · · ··· · · • · · ··· · · · •f ···· · ·· ·· ·« 10 Η: 10,7 (10,8) N: 8,9 (8,8) 'H-NMR in CDCI3: Ergebnisse analog zu Beispiel 1 i3C-NMR in CDCI3: Ergebnisse analog zu Beispiel 1
Spezifische Drehwerte: (R)-3-Hydroxy-N,N-diethylbutanamid (100%) [a]D20 = -19,7 ±1 0 x l/g«dm
Mittels 'Η- NMR,13 C-NMR und Elementaranalyse konnte die Struktur der Alkohole (S)-und (R)-3-Hydroxy-N,N-diethylbutanamid bestätigt werden. Die genaue Bestimmung des Enantiomerenüberschusses erfolgte mittels chiraler GC und über Bestimmung des Drehwertes [cc]d20 3. Synthese von (R)-3-Hydroxy-N,N-dimethylbutanamid aus N,N-Dimethylaceto-acetamid
Zur Synthese von (R)-3-Hydroxy-N,N-dimethylbutanamid wurde ein Gemisch aus 525 ml Puffer (100 mM Triethanolamin, pH = 7,1 mM MgCl2,10% Glycerin), 90 ml 2-Propanol (1,18 mol), 15 ml N,N-Dimethylacetoacetamid (120 mmol), 30 mg NADP und 50000 Units rekombinante Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus minor (DE-A 101 19 274) für 24 h bei Raumtemperatur unter ständiger Durchmischung inkubiert. Nach 24 h waren 95 % des eingesetzten Ν,Ν-Dimethylacetoacetamid zu (R)-3-Hydroxy-N,N-diethylbutanamid reduziert. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend mit Ethylacetat extrahiert und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt. Das so gewonnene Rohprodukt wurde mittels Vakuumdestillation aufgereinigt. Es konnten o 2,3 g (R)-3-Hydroxy-N,N-dimethylbutanamid mit einer Reinheit >98% und einem Enantiomerenüberschuss von >99,0% gewonnen werden.
Analysenergebnisse:
Elementaranalyse % gef.(ber): C6H13NO2 C: 54,2 (54,9) H: 9,7 (10,0) N: 10,4 (10,7) ·· φφ · φφ ·· ·· • φ φ φ φ φ φ φ φ φ • · · · · φφ φ φ φφφ φφφ φφφφ φ φ φφφ · φ φφφ φφφ φφφ φφ φφφφ φ φφ φφ φφ 11 'H-NMR in CDC13:
Signal Integral Zuordnung 1,2 ppm (D) 3 CH3 (neben chiralem Zentrum) 2,3 (DvD)+ 2,5 (DvD)ppm 2 CH2 (neben chiralem Zentrum) 2,9 (S)+ 3,0 (S)ppm 6 2 x CH3 4,2 ppm (M) 1 CH (chirales Zentrum) 4,6 ppm(S) 1,0 OH 13C-NMR in CDC13:
Signal Zuordnung 22ppm CH3 (neben chiralem Zentrum) 34 ppm CH3 36 ppm ch3 41 ppm ch2 64 ppm CH (chirales Zentrum) 171 ppm C=0 (78 ppm) Lösungsmittel (CDC13)
Spezifische Drehwerte: (R)-3-Hydroxy-N,N-dimethylbutanamid (100%) [cc]d20 = - 29,1 ±1 0 x l/g*dm 4. Synthese von (S)-3-Hydroxy-N,N-dimethylbutanamid aus N,N-Dimethylaceto-acetamid
Zur Synthese von (S)-3-Hydroxy-N,N-dimethylbutanamid wurde ein Gemisch aus 89 ml Puffer (100 mM Triethanolamin, pH = 7,1 mM ZnCL, 10% Glycerin), 9 ml 2-Propanol (0,12 mol), 2,5 ml N,N-Dimethylacetoacetamid (19 mmol), 10 mgNAD und 16000 Units rekombinante Alkoholdehydrogenase aus Candida parapsilosis für 24 h bei Raumtemperatur unter ständiger Durchmischung inkubiert. Nach 24 h waren 95 % des eingesetzten N,N-Dimethylacetoacetamid zu (S)-3-Hydroxy-N,N-diethylbutanamid reduziert. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend mit Ethylacetat extrahiert und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt. Das so gewonnene Rohprodukt wurde mittels Vakuumdestillation aufgereinigt. Es konnten so (S)-3-Hydroxy-N,N-dimethylbutanamid mit einer Reinheit >98% und einem Enantiomerenüberschuss von >99,0% gewonnen werden. ·· ·· · ·· ft tt • t t t t t t · t t • · t t t tt t t ttt t · t tttt · · ttt t · ttt « t t t t · tt tttt t «· tt tt 12
Spezifische Drehwerte: (S)-3-Hydroxy-N,N-dimethylbutanamid (100%) [a]D20 = + 29,1 ±1 ° x l/g«dm 5. Synthese von (S)-l,l-Dichlor-2-propanol aus 1,1-Dichloraceton
Zur Synthese von (S)-l,l-Dichlor-2-propanol wurde ein Gemisch aus 640 ml Puffer (100 mM Triethanolamin, pH = 7, 1 mM ZnCl2, 20% Glycerin), 80 ml 2-Propanol (1,05 mol), 20 ml 1,1-Dichloraceton (0,2 mol), 40 mg NAD und 13000 Units rekombinante Alkoholdehydrogenase aus Pichia capsulata (DE-A 103 27 454) für 24 h bei Raumtemperatur unter ständiger Durchmischung inkubiert. Nach 24 h waren 100 % des eingesetzten 1,1-Dichloraceton zu (S)-l,l-Dichlor-2-propanol reduziert. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend mit Ethylacetat extrahiert und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt. Das so gewonnene Rohprodukt wurde mittels Vakuumdestillation aufgereinigt. Es konnten 6,5 g (S)-l,l-Dichlor-2-propanol mit einer Reinheit >99% und einem Enantiomerenüberschuss von >99,9% gewonnen werden.
Analysenergebnisse:
Elementaranalyse und Chlorbestimmung % gef.(ber): C3H6CI2O C: 26,7 (27,9) H: 4,7 (4,7) O: 14,8 (12,4) CI: 53,4 (55) 'H-NMR in CDC13:
Signal Integral Zuordnung 1,3 ppm (D) 3,1 ch3 3,2 ppm (D) 1 OH 4,1 ppm (DvQ) 1 CH (chirales Zentrum) 5,7 ppm(S) 1,0 CH l3C-NMR in CDCI3:
Signal Zuordnung 18 nnm ch3 72 ppm CH ·· ·· ·· # • · · · · • · · · · I · · ···· • · 9 · •9 9999 9 • 9 9 9 9 ·· · 9 999 • 9 999 « · 9 9 · · · 99 99 ·· 13 77 ppm
CH
Spezifische Drehwerte: (S)-1,1 -Dichlor-2-propanol(100%) [a]d20 = -19,1 ±1 °x l/g»dm 6. Synthese von (R)-l,l-DichIor-2-propanol aus 1,1-Dichloraceton
Zur Synthese von (R)-l,l-Dichlor-2-propanol wurde ein Gemisch aus 320 ml Puffer (100 mM Triethanolamin, pH = 7,1 mM MgCb, 10% Glycerin), 60 ml 2-Propanol (0,78 mol), 20 ml 1,1-Dichloraceton (0,2 mol) gelöst in 40 ml Ethylacetat, 40 mg NADP und 8000 Units rekombinante Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus minor (DE-A 101 19 274) für 24 h bei Raumtemperatur unter ständiger Durchmischung inkubiert. Nach 24 h waren 100 % des eingesetzten 1,1-Dichloraceton zu (R)-l,l-Dichlor-2-propanol reduziert. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend mit Ethylacetat extrahiert und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt. Das so gewonnene Rohprodukt wurde mittels Vakuumdestillation aufgereinigt. Es konnten 4,8 g (R)-l,l-Dichlor-2-propanol mit einer Reinheit >98% und einem Enantiomerenüberschuss von >95% gewonnen werden.
Analysenergebnisse:
Elementaranalyse und Chlorbestimmung % gef.(ber): C3H6Cl20 C: 26,7 (27,9) H: 4,7 (4,7) O: 14,8 (12,4) CI: 53,4 (55) 'H-NMR in CDCI3: analog Beispiel 5 13C-NMR in CDCI3: analog Beispiel 5 Spezifische Drehwerte: (R)-l,l-Dichlor-2-propanol (100%) [oc]d20 = + 19,56 ±1 0 x l/g*dm 7. Synthese von (R)-l ,1,3-Trichlor-2-propanol aus 1,1,3-Trichloraceton
Zur Synthese von (R)-l,l,3-Trichlor-2-propanol wurde ein Gemisch aus 110 ml Puffer (100 mM Triethanolamin, pH = 7,1 mM MgCh, 10% Glycerin), 40 ml 2-Propanol (0,52 mol), 10 ·· · • · ·· ·· • · · · · ·· · · ·Μ • · · +··· · « ··· · | • · · #·· · · ♦ ·· ···· · ·· ·· ·« 14 ml 1,1,3-Trichloraceton (93 mmol) gelöst in 40 ml Ethylacetat, 20 mg NADP und 12000 Units rekombinante Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus minor (DE-A 101 19 274) für 24 h bei Raumtemperatur unter ständiger Durchmischung inkubiert. Nach 24 h waren 100 % des eingesetzten 1,1,3-Trichloraceton zu (R)-l,l,3-Trichlor-2-propanol reduziert. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend mit Ethylacetat extrahiert und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt. Das so gewonnene Rohprodukt wurde mittels Vakuumdestillation aufgereinigt. Es konnten 8,9 g (R)-l,l,3-Trichlor-2-propanol mit einer Reinheit >99% und einem Enantiomerenüberschuss von >97% gewonnen werden.
Analysenergebni sse:
Elementaranalyse und Chlorbestimmung % gef.(ber): C3H5CI3O C: 22,1 (22,1) H: 2,8 (3,1) 0:11,1 (9,8) CI: 63,9 (65,1) 'H-NMR in CDCI3:
Signal Integral Zuordnung 3,3 ppm (S) 1 OH 3,8 ppm (D) 2 ch2 4,2 ppm (M) 1 CH (chirales Zentrum) 5,9 ppm(D) 1,0 CH 13C-NMR in CDCI3:
Signal Zuordnung 45 ppm ch2 73 ppm CH 77 ppm CH
Spezifische Drehwerte: (R)-l,l,3-Trichlor-2-propanol (100%) [cc]d20 = + 10,1 ±1 0 x l/g»dm 8. Synthese von (S)-l,l>3-Trichlor-2-propanol aus 1,1,3-Trichloraceton ·· · • · ·· ·· • · · · • · · • · · • · · • · · · • · · ·· • · ·· ·· ·· ···· ···· · · • · · • · ··· ··· · ·· ··· · · • · · • · ·· 15
Zur Synthese von (S)- l,l,3-Trichlor-2-propanol wurde ein Gemisch aus 9 ml Puffer (100 mM Triethanolamin, pH = 7, 1 mM ZnCl2, 20% Glycerin), 0,8 ml 2-Propanol (10 mmol), 0,25 ml 1,1,3-Trichloraceton (0,2 mol), 10 mg NAD und 2000 Units rekombinante Alkoholdehydrogenase aus Pichia capsulata (DE-A 103 27 454) für 24 h bei Raumtemperatur unter ständiger Durchmischung inkubiert. Nach 24 h waren 97 % des eingesetzten 1,1,3-Trichloraceton zu (S)-l,l,3-Trichlor-2-propanol mit einem Enantiomerenüberschuss von >60% reduziert.
Spezifische Drehwerte: (S)-l,l,3-Trichlor-2-propanol (100%) [cx]d2° = -10,1 ±1 ° x l/g»dm 9. Synthese von S-Chlor-2-propanol aus Chloraceton
Zur Synthese von S-Chlor-2-propanol wurde ein Gemisch aus 0,6 ml Puffer (100 mM Triethanolamin, pH = 7,10% Glycerin, 1 mM ZnCL), 400 μΐ 4-Methyl-2-propanol, 100 μΐ Chloraceton, 1mg NAD und 60 Units rekombinante Alkoholdehydrogenase aus Pichia capsulata (DE-A 103 27 454) bzw. Candida parapsilosis für 24 h bei Raumtemperatur unter ständiger Durchmischung inkubiert. Nach 24 h waren 100% des eingesetzten Chloraceton zu S-Chlor-2-propanol mit einem Enantiomerenüberschuss von >97% reduziert. 10. Synthese von R-Chlor-2-propanol aus Chloraceton
Zur Synthese von R-Chlor-2-propanol wurde ein Gemisch aus 0,4 ml Puffer (100 mM Triethanolamin, pH = 7, 10% Glycerin), 300 μΐ 2-Propanol, 100 μΐ Chloraceton gelöst in 200 μΐ Ethylacetat, 1 mg NADP und 30 Units rekombinante Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus minor (DE-A 101 19 274) für 24 h bei Raumtemperatur unter ständiger Durchmischung inkubiert. Nach 24 h waren 100% des eingesetzten Chloraceton zu R-Chlor- 2- propanol mit einem Enantiomerenüberschuss von >95% reduziert. 11. Synthese von (2S)-3-chlor-2-butanol aus 3-Chlor-2-butanon
Zur Synthese von (2S)-3-chlor-2-butanol wurde ein Gemisch aus 0,45 ml Puffer (100 mM Triethanolamin, pH = 7, 10% Glycerin, 1 mM ZnCl2), 450 μΐ 4-Methyl-2-propanol, 100 μΐ 3- Chlor-2-butanon (1 mmol), 0,1mg NAD (0,15 pmol) und 60 Units rekombinante Alkoholdehydrogenase aus Pichia capsulata (DE-A 103 27 454) bzw. Candida parapsilosis für 24 h bei Raumtemperatur unter ständiger Durchmischung inkubiert. Nach 24 h waren ·· ·· • · · t · • ·· · • · · · • · · ·
···· t • · ♦ · · ♦ ft· ♦ · ··· · · • · · · · ·· ·· ·· 16 100% des eingesetzten 3-Chlor-2-butanon zu (2S)-3-chlor-2-butanol mit einem Enantiomerenüberschuss von >98% reduziert. 12. Synthese von (2R)-3-chlor-2-butanol aus 3-Chlor-2-butanon
Zur Synthese von (2R)-3-chlor-2-butanol wurde ein Gemisch aus 0,45 ml Puffer (100 mM Triethanolamin, pH = 7, 10% Glycerin, 1 mM MgCh), 450 μΐ 4-Methyl-2-propanol, 100 μΐ 3-Chlor-2-butanon (1 mmol), 0,1mg NADP (0,13 μιηοΐ) und 60 Units rekombinante Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus minor (DE-A 101 19 274) für 24 h bei Raumtemperatur unter ständiger Durchmischung inkubiert. Nach 24 h waren 100% des eingesetzten 3-Chlor-2-butanon zu (2R)-3-chlor-2-butanol mit einem Enantiomerenüberschuss von >98% reduziert.

Claims (14)

  1. • · • · • · · ·· ·· ·♦ • · · · · ··«· ♦ ··· · • · ·· · · ··· • · ··♦ · · • · · · · ·· ·· ·· 17 Patentansprüche: 1. Verfahren zur Herstellung eines enantiomerenreinen Alkohols der allgemeinen Formel Ia bzw. Ib OH (Ia) OH (Ib)
    R£ I I R5 R3 Re
    wobei Ri, R2, R3, R4, R5 und Rö jeweils Wasserstoff, Halogen, eine Ci-Cö-Alkyl- oder Ci-Cö-Alkoxygruppe repräsentieren, mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Reste Ri, R2, R3, R4, R5 und R$ von den übrigen fünf verschieden ist, sowie der Maßgabe, dass mindestens einer der Reste Ri, R2, R3, R4, R$ und R$ ein Halogen ist, dadurch gekennzeichnet, dass ein Keton der allgemeinen Formel II o (II)
    wobei Ri, R2, R3, R4, R5 und R6 die oben angegebene Bedeutung besitzen, in Gegenwart einer S- bzw. R-spezifischen Dehydrogenase/Oxidoreduktase unter Verwendung vonNADH oder NADPH als Cofaktor enzymatisch reduziert wird.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Ri=R2= CI und R3=R4=R5=R6= H.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Ri=R2=R4= CI und R3= r5=r*= h.
  4. ··· · · « · 4 ♦ · ft 18
    4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Ri= CH3, R2= CI und R3=R4=R5=Rö=: H. «· ·· • · · • · · • · · 4 « t 4» ···· • · · ·· • ····· f
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R|= CI und R2=R3~R4“R5=R6= H.
  6. 6. Verfahren zur Herstellung eines enantiomerenreinen Alkohols der allgemeinen Formel lila bzw. Illb OH O (lila) OH O (Illb)
    Ry
    N R9 r9 wobei R7, Rg und R9 eine C1 -Cö-Alkylgruppe repräsentieren, dadurch gekennzeichnet, dass ein Keton der allgemeinen Formel IV o o (IV)
    r9 wobei R7, Re und R9 die oben angegebene Bedeutung besitzen, in Gegenwart einer S- bzw. R-spezifischen Dehydrogenase/Oxidoreduktase unter Verwendung von NADH oder NADPH als Cofaktor enzymatisch reduziert wird.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass R7=Rg=R9= CH3.
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass R?= CH3 und Rg=R9= C2H5.
  9. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass als R-spezifische Dehydrogenase eine sekundäre Alkoholdehydrogenase aus Lactobazillen der Gattung Lactobacilliales, insbesondere Lactobacillus kefir, Lactobacillus brevis oder Lactobacillus minor, oder aus Pseudomonas eingesetzt wird.
  10. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass als S-spezifische Dehydrogenase eine sekundäre Alkoholdehydrogenase aus der Gattung Pichia • Φ φφ * • · φ φ φ φ φ φ φ φ • · · φφφφ φ φ φ · ·» φφφφ φ φφ φφ φφ φ · · · · ·· · · φφφ • · ··· φ · • · φ φ φ 19 oder Candida, insbesondere Candida boidinii ADH, Candida parapsilosis oder Pichia capsulata, eingesetzt wird.
  11. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Volumenaktivität der eingesetzten Oxidoreduktase 10 U/ml bis 5000 U/ml, vorzugsweise 100 U/ml bis 1000 U/ml, beträgt.
  12. 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass je kg zu reduzierendem Keton 5000 bis 10.000.000 U, vorzugsweise 10.000 bis 1.000.000 U, Oxidoreduktase eingesetzt werden.
  13. 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das bei der Reduktion gebildete NAD oder NADP kontinuierlich mit einem Cosubstrat zu NADH bzw. NADPH reduziert wird.
    14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass als Cosubstrat primäre und sekundäre Alkohole, wie Ethanol, 2-Propanol, 2-Butanol, 2-Pentanol, 4-Methyl-2-pentanol, 2-Octanol oder Cyclohexanol, eingesetzt werden. J 7468 17 A 1808/2004 Patentansprüche: 1. Verfahren zur Herstellung eines Alkohols der allgemeinen Formel Ia bzw. Ib mit einer Enantiomerenreinheit (ee) von >95%, OH (Ia) OH (Ib)
    R4 Ri
    Rs wobei Ri, R2, R3, R4, R5 und Rö jeweils Wasserstoff, Halogen, eine Ci-Cö-Alkyl- oder Ci-C6-Alkoxygruppe repräsentieren, mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Reste Ri, R2, R3, R4, R5 und R$ von den übrigen fünf verschieden ist, sowie der Maßgabe, dass mindestens einer der Reste Ri, R2, R3, R4, R5 und Re ein Halogen ist, dadurch gekennzeichnet, dass ein Keton der allgemeinen Formel II Ri
    (II) Ri
    wobei Ri, R2, R3, R4, R5 und Re die oben angegebene Bedeutung besitzen, in Gegenwart einer S- bzw. R-spezifischen Dehydrogenase/Oxidoreduktase unter Verwendung von NADH oder NADPH als Cofaktor enzymatisch reduziert wird und das bei der Reduktion gebildete NAD oder NADP kontinuierlich mit einem Cosubstrat zu NADH bzw. NADPH reduziert wird. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Ri=R2= CI und R3=R4=R5=R6= H. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Ri=R2=R4= CI und R3= R5=R6=H. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Ri= CH3, R2= CI und R3=R4=R5—Rö= H. NACHGEREICHT 4 • · • ··· • · · • · · • ·· • · · · · · · • · · · · · ··· « · · · ··· · • · · · · · • f 9t ·· ··· 18 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Rj= CI und R2=R3=R4=:R5=:R6:= H. 6. Verfahren zur Herstellung eines enantiomerenreinen Alkohols der allgemeinen Formel lila bzw. Illb
    wobei R7, Re und R9 eine C1 -Cö-Alkylgruppe repräsentieren, dadurch gekennzeichnet, dass ein Keton der allgemeinen Formel IV
    wobei R7, Rs und R9 die oben angegebene Bedeutung besitzen, in Gegenwart einer S- bzw. R-spezifischen Dehydrogenase/Oxidoreduktase unter Verwendung von NADH oder NADPH als Cofaktor enzymatisch reduziert wird. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass R7=Rg=R9= CH3. 8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass R7= CH3 und Rg=R9= C2H5. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass als R-spezifische Dehydrogenase eine sekundäre Alkoholdehydrogenase aus Lactobazillen der Gattung Lactobacilliales, insbesondere Lactobacillus kefir, Lactobacillus brevis oder Lactobacillus minor, oder aus Pseudomonas eingesetzt wird. NACHGEREICHT 9 9 • · • ··· • · · • · · • ·· • · · · · · · • · · · · t ··· • · · · ··· · • · · · · · ·· ·· ·· ··· 19 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass als S-spezifische Dehydrogenase eine sekundäre Alkoholdehydrogenase aus der Gattung Pichia oder Candida, insbesondere Candida boidinii ADH, Candida parapsilosis oder Pichia capsulata, eingesetzt wird. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Volumenaktivität der eingesetzten Oxidoreduktase 10 U/ml bis 5000 U/ml, vorzugsweise 100 U/ml bis 1000 U/ml, beträgt. 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass je kg zu reduzierendem Keton 5000 bis 10.000.000 U, vorzugsweise 10.000 bis 1.000.000 U, Oxidoreduktase eingesetzt werden. 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das bei der Reduktion gebildete NAD oder NADP kontinuierlich mit einem Cosubstrat zu NADH bzw. NADPH reduziert wird.
  14. 14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass als Cosubstrat primäre und sekundäre Alkohole, wie Ethanol, 2-Propanol, 2-Butanol, 2-Pentanol, 4-Methyl-2-pentanol, 2-Octanol oder Cyclohexanol, eingesetzt werden. NACHGEREICHT
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