AT4923U1 - Pharmazeutisches präparat zur behandlung von blutgerinnungsstörungen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein pharmazeutisches Präparat zur Behandlung von Blutgerinnungsstörungen das einen Rezeptorbindungskonkurrenten als einzige aktive Komponente enthält, sowie auf medizinische Verwendungen solcher Präparate.

Description

AT 004 923 Ul

Die Erfindung bezieht sich auf ein pharmazeutisches Präparat zur Behandlung von Blutgerinnungsstörungen, das zu einer Verlängerung der Halbwertszeit von Blutproteinen führt.

Faktor VIII und von-Willebrand-Faktor (vWF) sind funktionell verbundene Plasmaglykoproteine, die bei der Blutstillung eine entscheidende Rolle spielen. Mängel an diesen Proteinen führen zu den üblichsten Blutungsstörungen bei Menschen. Ein Mangel an Faktor VIII, ein Genprodukt des X-Chromosoms und des notwendigen Cofaktors für die von Faktor IX mediierte Aktivierung von Faktor X, führt zu Hämophilie A, während ein Mangel an vWF, der die Adhäsion der Plättchen am Subendothel mediiert und Faktor VIII stabilisiert, zum Willebrand-Jürgens-Syndrom (von Willebrand disease, vWD) führt (Montgomery R.R., Coller B.S.: Von Willebrand disease, in Colman R.W., Hirsh J., Marder V.J., Salzman E.W. (Hg): Hemostasis and Thrombosis: Basic Principles and Clinical Practice (3. Auflage). Philadelphia, PA, Lippincott, 1994, S. 134; Sadler J.E., Davie E.W.: Hemophilia A, hemophilia B, and von Willebrand disease, in Stamatoyannopoulos G., Nien-huis A.W., Majerus P.W., Varmus H. (Hg): The Molecular Basis of Blood Diseases, Philadelphia, PA, W.B. Saunders, 1994, S. 657).

Jede Untereinheit eines vWF-Multimers enthält eine Faktor VIII-Bindungsstelle an ihrem aminoterminalen Ende (Foster P.A. et al., J. Biol. Chem. 262:8443, 1987). Das Binden des Faktor VIII-Heterodimers an vWF über die amino- und carboxyterminalen Regionen in der leichten Kette von Faktor VIII ist für das Überleben von Faktor VIII in vivo entscheidend (Lenting P.J. et al., Blood 92: 3983, 1998, Weiss H.J. et al., J. Clin. Invest. 60:390, 1977). Obwohl Studien in vitro widersprüchliche Daten für das Verhältnis von Faktor VIII:vWF-Untereinheit ergeben haben, ist Faktor VIII in Plasma mit einer Stöchiometrie von 1:50 eng, nicht kovalent an vWF gebunden, was darauf hinweist, dass nicht jede Untereinheit von vWF für eine Bindung zugänglich ist (Vlot A.J. et al. , Thromb. Haemost. 79:456, 1998).

Veränderungen der Plasmakonzentration von vWF führen zu entsprechenden Veränderungen der Faktor VIII-Werte. Die pathophysiolo-gische Bedeutung dieser Wechselwirkung wird am besten an Patien- 2 AT 004 923 Ul ten mit vWD gezeigt (Morfini M. et al., Thromb. Haemost. 70:270, 1993, Lethagen S. et al., Ann. Hematol. 65:253, 1992). Patienten mit vWD vom Typ 1 entwickeln einen sekundären Faktor VIII-Man-gel, mit z.B. 50% Rückgang von vWF-Antigen (vWF:Ag), was einer Reduktion von 50% des zirkulierenden Faktor VIII entspricht. Solche Patienten weisen daher nicht nur eine gestörte primäre Blutstillung, sondern auch eine Störung des intrinsischen Gerinnungsweges auf. Die Halbwertszeit von infundiertem Faktor VIII ist bei Patienten mit vWD signifikant verkürzt (auf weniger als 3 Stunden), und eine Substitutionstherapie mit vWF-Konzentrat führt zu einer raschen und dauernden Erhöhung von endogenem Faktor VIII mit einer Halbwertszeit von bis zu 12 bis 14 Stunden. Die Verabreichung von menschlichem rekombinantem vWF an Hunde mit schwerem vWD induziert auch einen raschen Anstieg von Hunde-Faktor VIII (Turecek P.L. et al., Blood 90:3555-3567, 1997). Die Abhängigkeit des Überlebens von Faktor VIII von vWF spiegelt sich weiters in vWD Normandie wider, einem Subtypus des vWD, wobei Patienten normale Werte von vWF-Antigen- und Ristocetin-Kofaktoraktivität sowie ein normales multimeres Muster aufweisen, ihre Faktor VIII-Aktivität jedoch auf Grund einer Mutation der Faktor VIII-Bindungsregion von vWF herabgesetzt ist, was zu einer verminderten oder nicht vorhandenen Affinität von vWF für Faktor VIII und einer beschleunigten Clearance von Faktor VIII aus dem Kreislauf führt (Sadler J.E., Thromb. Haemost. 71:520, 1994; Mazurier C. et al., Blood 75:20, 1990).

In vitro reguliert vWF die Faktor VIII-Aktivität durch die Verhinderung der Aktivierung von Faktor VIII durch Faktor Xa und die Verhinderung der Bindung von Faktor VIII an Phospholipide und aktivierte Plättchen (Koedam J.A. et al., Eur. J. Biochem. 189: 229, 1990, Gilbert G.E. et al., J. Biol. Chem. 267:15861, 1992, Nesheim M. et al., J. Biol. Chem. 266:17815, 1991). Faktor VIII ist für enzymatische Proteolyse sehr empfindlich, und vWF schützt Faktor VIII auch vor dem proteolytischen Abbau durch sowohl aktiviertes Protein C als auch Faktor Xa in vitro (Koppelman S.J. et al., Blood 87:2292, 1996; Koedam J.A. et al., J. Clin. Invest. 82:1236, 1988). Es ist jedoch noch nie gezeigt worden, ob diese Auswirkungen die kurze Halbwertszeit von Faktor VIII in Abwesenheit von vWF in vivo erklären. 3 AT 004 923 Ul

Ein jüngster Bericht, dass das mit dem Low density Lipoproteinrezeptor verwandte Protein (LRP) die Internalisation von Throm-bin-aktiviertem Faktor VIII in vitro mediiert, weist auf einen neuen Aspekt der Komplexität des Faktor VHI-Stoffwechsels hin (A. Yakhyaev et al., Blood, Bd. 90 (Suppl. 1), 1997, 126-1 (Abstract)). LRP ist ein ubiquitär exprimierter, großer, multifunktionaler endozytischer Rezeptor mit strukturell und funktionell verschiedenen Stellen (Bu G., Current Opinion Lipidology 9:155, 1998). LRP bindet eine diverse Gruppe von Liganden, einschließlich Lipoproteinen, Lipoproteinlipasen, Proteaseinhibitoren und Protease-Inhibitor-Komplexen, bakteriellen Toxinen, Viren, Lactoferrin und Thrombospondin (Neels J.G. et al., Fibrinolysis & Proteolysis 12:219, 1998). Einige dieser Moleküle konkurrieren miteinander um eine gemeinsame Region am LRP, während andere an unabhängige Stellen binden. Basierend auf diesem Spektrum unzusammenhängender Liganden kann angenommen werden, dass LRP an einer Vielzahl von pathophysiologischen Prozessen beteiligt ist. Zum Beispiel ist gezeigt worden, dass LRP bei Nagetieren eine Rolle bei der Clearance zirkulierender Liganden, wie t-PA, Gewebefaktorweg-Inhibitor (TF-PI) und Faktor Xa spielt (I. Warshawsky et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 1994, Bd. 91, S. 6664-6668; F. Noorman et al., Blood, 1995, Bd. 86, S. 3421-3427; Bu G. et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 1992, Bd. 89, S. 7427-7431). Es ist weiters gefunden worden, dass ein 39 kD Rezeptorassoziiertes Protein (RAP) mit mehreren Mitgliedern der Genfamilie der Low density Lipoproteinrezeptoren interagiert und alle Ligandenwechselwirkungen mit dem Rezeptor hemmt, was zu einer zumindest reduzierten Clearance verschiedener Proteine, wie t-PA, führt (I. Warshawsky et al. , J. Clin. Invest., 1993, Bd. 92, S. 937-944; Strickland D. et al. , J. Biol. Chem., 1991, Bd. 266, S. 13364-13369).

Das derzeitige Wissen über den Mechanismus der Clearance von Faktor VIII aus dem Kreislauf ist beschränkt. Infusionsstudien an Menschen mit vWF-Konzentraten aus Plasma haben den Nachteil, dass Faktor VIII immer mitinfundiert wird, wodurch die Interpretation des Faktor Vlll-Stoffwechsels kompliziert wird. Therapeutische Proteine, insbesondere Präparationen für die Behandlung von Gerinnungsstörungen, einschließlich Blutgerinnungsproteine, 4 AT 004 923 Ul wie Faktor II, VII, VIII, IX, X, XI, XIII, vWF und Protein C, haben jedoch oft eine sehr kurze Halbwertszeit im Organismus. Dies führt zu dem Problem, dass diese Präparate innerhalb einer kurzen Zeitspanne inaktiviert oder zumindest in ihrer Wirksamkeit stark eingeschränkt werden.

Es ist daher das Ziel der vorliegenden Erfindung, ein pharmazeu-zeutisches Präparat zur Verfügung zu stellen, das zur Verlängerung der Halbwertszeit von Blutproteinen verwendet werden kann. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Verwendung dieses Präparats zur Stabilisierung endogener Blutproteine und zur Steigerung der Wirksamkeit exogener Blutproteine.

Erfindungsgemäß wird das Ziel durch ein pharmazeutisches Präparat erreicht, das ein Konkurrenzprotein für die Rezeptorbindung als einzige aktive Komponente enthält. Der erfindungsgemäße Rezeptorbindungskonkurrent kann jeglicher natürlich vorkommende Rezeptorbindungskonkurrent sein, der die Clearance eines physiologisch oder therapeutisch wirksamen Proteins (oder Peptids) durch dieses Rezeptor beeinflusst, oder Derivate solcher Konkurrenten, z.B. Fragmente davon oder gentechnisch modifizierte Konkurrenten. Mit der Verabreichung eines solchen Konkurrenzproteins für die Rezeptorbindung (oder eines Derivats davon) konkurriert dieses Protein mit einem physiologisch oder therapeutisch aktiven Protein, wie einem Blutprotein, um die Bindung an einen solchen Rezeptor. Die Bindung des Konkurrenten kann zur Blockade des Rezeptors führen, wobei dieser Rezeptor dann nicht mehr in der Lage ist, das physiologisch und therapeutisch aktive Protein weiter zu binden. Da die Bindung nicht mehr stattfindet oder verlangsamt ist, ist die Clearance dieses aktiven Proteins reduziert, was zu einer längeren Halbwertszeit dieser Proteine führt. Das erfindungsgemäße Präparat kann insbesondere für die Behandlung von Blutfcrankneitan,,—worrngswoico Corinnungootörun . gonj. mehr bevorzugt Hämophilie A oder vWD, verwendet werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Rezeptorbindungskonkurrent ein Ligand von LRP, vorzugsweise RAP oder ein Derivat davon. Vorzugsweise kann er ein Fragment von RAP sein, das eine Region enthält, die die Bindung von Proteinen an LRP hemmt, wo- 5 AT 004 923 Ul durch die Internalisation und Clearance dieser Proteine vermieden wird (I. Warshawsky et al. , J. Biol. Chem. 1993, Bd. 15, S. 22046-22054; G. Bu, EMBO J., 1995, Bd. 14, S. 2269-2280)). Gemäß der Sequenz des menschlichen RAP-Polypeptids, wie in Fig. 1 dargestellt ist, befinden sich diese Regionen vorzugsweise zwischen den Aminosäuren 55 und 62, den Aminosäuren 136 und 144, den Aminosäuren 239 und 264 und/oder zwischen den Aminosäuren 351 und 361. Auf Grund der großen Homologie zwischen verschiedenen Arten, wie Menschen, Mäusen und Ratten, umfassen die erfindungsgemäßen RAP-Fragmente auch RAP-Regionen, die die Bindung von Proteinen an einen Rezeptor bei Mäusen oder Ratten oder anderen Tieren inhibieren, die in diesen Domänen eine Aminosäurekonservierung aufweisen.

Bezogen auf die Bindekapazität von RAP an LRP haben die erfindungsgemäßen RAP-Fragmente eine Bindekapazität von mindestens 50%, vorzugsweise mindestens 100%, mehr bevorzugt mindestens 150%. Tests der Bindungseffizient von Liganden an die Rezeptoren können unter Verwendung von Standardtechniken (für eine Übersicht, siehe Brodersen et al., Trends Pharmacol Sei, 1988, 9, 252-257) unter Verwendung von Western Blotting-Verfahren (Catty und Raykundalia, Gel Immunodiffusion, immunoelectrophoresis and immunostaining methods. In: Antibodies, a practical approach,

Hg. Catty, IRL Press, Oxford, Washington DC, 1988, Bd. I, 6, 137-167) erfolgen. Andere Techniken, wie die Oberflächenplasmon-resonanzanalyse mit einem BIAcore 2000 Biosensorsystem (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Schweden) mit Rezeptoren, die an Sensorchips immobilisiert sind, durchgeführt entsprechend den Anweisungen des Lieferanten (Pharmacia Biosensor AG; Uppsala, Schweden), mit Datenanalyse mittels Biacore Evaluation Software werden verwendet, um die Affinitätskonstanten von Rezeptoren und Liganden zu berechnen.

Eine bevorzugte Länge der Fragmente oder Derivate von RAP beträgt zwischen 6 und 320 Aminosäuren, vorzugsweise zwischen 20 und 150, insbesondere länger als 30 Aminosäuren. Ein bevorzugtes Derivat enthält nicht mehr als 10, vorzugsweise nicht mehr als 5 ausgetauschte Aminosäuren ohne natürlich vorkommendes Aminosäure-Gegenstück in einer Säugetierart. Ein Derivat kann auch zwei 6 AT 004 923 Ul oder mehr LRP-Binderegionen enthalten, die miteinander verbunden sind, z.B. durch spezielle Linkersequenzen.

Zum Beispiel können erfindungsgemäße Fragmente die folgenden Aminosäuresequenzen umfassen: a) Ein RAP-Fragment, das die Aminosäuresequenz Glu-Phe-Arg-Met-Glu-Lys enthält. b) Ein RAP-Derivat, das ein RAP-Fragment ist, das die folgende Aminosäuresequenz enthält: R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8, wobei a) Rl His oder Ser ist, b) R2 Ser oder Asn ist, c) R3 Asn ist, d) R4 Ala oder Leu ist, e) R5 Leu oder Ser ist, f) R6 Asn oder Gly ist, g) R7 Glu oder Thr ist, h) R8 Asp oder Gin ist. c) Ein RAP-Derivat, das ein RAP-Fragment ist, das die folgende

Aminosäuresequenz enthält: R1-R27, wobei Rl Arg ist, R2 Leu ist, R3 Arg ist, R4 Lys oder Arg ist, R5 Val ist, R6 Ser ist, R7 His ist, R8 Gin ist, R9 Gly ist, RIO Tyr ist, Rll Gly oder Ser ist, R12 Thr, Ser oder Pro ist, R13 Glu, Ala oder Thr ist, R14 Ala oder Thr ist, R15 Glu ist, R16 Phe ist, R17 Glu ist, R18 Glu ist, R19 Pro ist, R20 Arg ist, R21 Val ist, R22 Ile ist, R23 Asp ist, R24 Leu ist, R25 Trp ist, R26 Asp ist und R27 Leu ist. d) Das RAP-Derivat, das ein RAP-Fragment ist, das die folgende Aminosäuresequenz enthält: R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R9, wobei Rl Val oder Ile ist, R2 Ser ist, R3 Arg ist, R4 Ala ist, R5 Arg ist, R6 His ist, R7 Asn ist, R8 Glu ist und R9 Leu ist.

Die erfindungsgemäßen Fragmente können auch in Antikörper oder Antikörperderivate inkorporiert sein, z.B. einzelkettige Antikörper, Antikörperfragmente, wie Fv, Fab, Fab' oder F(ab)'2 etc. 7 AT 004 923 Ul

Das erfindungsgemäße Präparat kann für die Behandlung von Gerinnungsstörungen verwendet werden, vorzugsweise vWD oder Hämophilie A. Bei therapeutischer Anwendung führt es zu einer Verlängerung der Halbwertszeit von Proteinen, wie Faktor II, V, VII, IX, X, XI, XII und Protein C, vorzugsweise Faktor VIII oder vWF. Außerdem können die Proteine auch alle anderen zirkulierenden Proteine sein, die in einem Rezeptor-mediierten Internalisati-onsprozess aus dem Blutstrom entfernt werden.

Der erfindungsgemäße Rezeptorbindungskonkurrent kann aus Blut, Plasma oder Fraktionen davon, Zellkulturüberständen etc. isoliert werden. Er wird vorzugsweise durch rekombinante Expression hergestellt. Er kann als Einzelprotein oder als Fusionsprotein synthetisiert werden, z.B. mit Glutathion-S-Transferase; GST-RAP (Herz et al., J. Biol. Chem., 1991, Bd. 266, S. 21232-21238). Es kann mit Hilfe der genetischen Verfahrenstechnik mit jeglichen üblichen Expressionssystemen, wie z.B. permanenten Zelllinien oder viralen Expressionssystemen, hergestellt werden. Permanente Zelllinien werden durch die stabile Integration der Fremd-DNA in das Wirtszellengenom von z.B. Vero, MRC5, CHO, BHK, 293, Sk-Hepl, insbesondere Leber- und Nierenzellen, Fibroblasten, Kera-tinozyten oder Myoblasten, Hepatozyten oder Stammzellen, z.B. hämatopoetischen Stammzellen, oder durch einen episomalen Vektor, der z.B. vom Papillomavirus abgeleitet ist, hergestellt. Virale Expressionssysteme, wie z.B. das Vacciniavirus-, Baculo-virus- oder retrovirale System, können ebenfalls verwendet werden. Als Zelllinien werden allgemein Vero, MRC5, CHO, BHK, 293, Sk-Hepl, Drüsen-, Leber- und Nierenzellen verwendet. Als euka-ryontische Expressionssysteme können auch Hefen, endogene Drüsen (z.B. Drüsen transgener Tiere) und andere Arten von Zellen verwendet werden. Natürlich können auch transgene Tiere für die Expression der Polypeptide (Rezeptorbindungskonkurrent oder Derivate davon) gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Für die Expression rekombinanter Proteine haben sich CHO-DHFR-Zellen als besonders nützlich erwiesen (Urlaub et al., Proc.

Natl. Acad. Sei., USA, Bd. 77, S. 4216-4220, 1980).

Um einen raschen proteolytischen Abbau zu vermeiden, können der erfindungsgemäße Konkurrent oder seine Derivate, insbesondere 8 AT 004 923 Ul seine Fragmente, durch Koppelung gewisser Strukturelemente am Amino- und Carboxy-Terminus geschützt werden, wie aus dem Stand der Technik bekannt ist.

Die Bindungskapazität kann durch bekannte Verfahren gemessen werden, vorzugsweise durch Ligandbindungsassays (für eine Übersicht siehe Brodersen et al., Trends Pharmacol. Sei., 1988, 9, 252-257) unter Verwendung von standardmäßigen Western Blotting-Verfahren (Catty und Raykundalia, Gel Immunodiffusion, immuno-electrophoresis and immunostaining methods. In: Antibodies, a practical approach, Hg. Catty, IRL Press, Oxford, Washington DC, 1988, Bd. I, 6, 137-157) oder Oberflächenplasmonresonanzanalyse

TM mit einem BIAcore 2000 Biosensorsystem (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Schweden).

Das in der vorliegenden Erfindung geoffenbarte pharmazeutische Präparat kann für die Verabreichung auf jegliche praktische Weise formuliert sein, und die Erfindung beinhaltet in ihrem Umfang pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine therapeutisch wirksame Menge des Rezeptorbindungskonkurrenten, insbesondere RAP, oder eines Derivats davon enthalten. Solche Zusammensetzungen können unter Verwendung eines oder mehrerer pharmazeutisch annehmbarer Träger oder Vehikel auf herkömmliche Weise formuliert werden. Geeignete Träger schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Verdünnungsmittel oder Füllstoffe, sterile wässerige Medien und verschiedene ungiftige organische Lösungsmittel. Die Zusammensetzungen können in Form von Pulvern, wässerigen Suspensionen oder Lösungen, Injektionslösungen u.ä. formuliert sein. Geeignete Dosierungsformen können von einem Fachmann leicht ermittelt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Behandlung von BlutfcrankheA-/ ' fe«| sollte unter Verwendung eines Dosierungsschemas erfolgen, das eine maximale therapeutische Antwort sicherstellt, bis eine Verbesserung erzielt worden ist, gefolgt vom geringsten wirksamen Niveau, das geeigneten Schutz gegen Blutungen bietet. Das Medikament kann durch kontinuierliche Infusion oder in regelmäßigen Abständen verabreicht werden, um die therapeutische Wirkung auf dem gewünschten Niveau zu halten. 9 AT 004 923 Ul

Die folgenden Beispiele stellen die vorliegende Erfindung dar, sie schränken jedoch den Umfang der Erfindung auf keine Weise ein.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen:

Fig. 1: Aminosäuresequenz von RAP

Fig. 2: Zeitlicher Verlauf von Plasmawerten von Faktor VIII von Mäusen mit vWD, die entweder mit RAP (-□-) oder mit rpvWF (- -ο- -) behandelt wurden.

Fig. 3: Pharmakokinetik von humanem rFVIII in vWF-Knockout-Mäusen mit (-□-) und ohne (- -O- -) Vorbehandlung mit RAP.

Beispiel 1: Messung der Wirkungen von RAP

Das rezeptorassoziierte Protein (RAP) wurde als ein rekombinan-tes Fusionsprotein mit Glutathion-S-Transferase hergestellt, wie von Smith und Johnson beschrieben, in DH5a Bakterien exprimiert und auf Glutathion-Agarose gereinigt, wie von Herz et al. beschrieben (Herz et al., J. Biol. Chem., 1991, Bd. 266, S. 21232-21238, Smith DB and Johnson KS, Gene 67:31-40, 1988). Das so erhaltene Fusionsprotein wurde in einem physiologisch annehmbaren Puffer formuliert, der 5 g/1 Glycin, 5 g/1 Lysin.HCl, 2,5 g/1 Trinatriumcitrat.2Η?0, 0,6 g/1 Calciumchlorid.2H20 und 3 g/1 Natriumchlorid enthielt. Der gleiche Puffer ohne RAP wurde als Kontrolle und für die Formulierung von rekombinantem vWF verwendet.

Die humane rekombinante vWF-Präparation wurde durch Expression in einer Nagetierzelllinie, Eierstockzellen vom Chinesischen Hamster (CHO) (Fischer B. et al., FEBS Lett. 351:345, 1994) hergestellt. Der rekombinante vWF wurde aus dem Zellkultur-überstand durch Ionenaustauschchromatographie gereinigt, gefolgt von Immunaffinitätschromatographie an einem immobilisierten monoklonalen Antikörper, gerichtet gegen reifen vWF gemäß Mejan et al. (Mejan O. et al., Thromb. Haemostas. 59:364, 1998). Etwa 50% des vWF in der resultierenden Präparation (rpvWF) enthielten 10 AT 004 923 Ul

Propeptid, das kovalent an den reifen vWF gebunden war, da das proteolytische System der CHO-Zellen nur einen Teil des expri-mierten vWF prozessieren konnte t-¥ajpeook P .·ίπ—ot al. ,—TU nod i ni «"(in·· Dru-ek) )i. Die Präparation war auf Grund der Spezifizität des letzten Reinigungsschritts im Wesentlichen frei von anderen Proteinen .

Rekombinanter menschlicher FVIII wurde aus dem Downstream-Prozessieren eines industriell hergestellten rekombinanten Faktor VIII, Recombinate® (Baxter Hyland Immuno, Thousand Oaks, CA) als Rohmaterial vor der Albuminstabilisierung erhalten.

Die Faktor VIII-Aktivität wurde im Vergleich zu einem humanen Faktor VIII-Standard unter Verwendung eines zweistufigen Gerinnungsverfahrens sowie eines chromogenen Verfahrens gemessen. Das zweistufige Gerinnungsverfahren wurde wie von Austen und Rhymes % beschrieben unter Verwendung der Reagenzien aus dem zweistufigen Faktor VIII-Assaykit von IMMUNO, Wien, Österreich, einschließlich Plasmafaktor VIII Referenzstandard enthaltend 1 IU Faktor VHI/ml, graduiert gegen den 3. Internationalen Standard 91/666, durchgeführt (Austen D.E.G. and Rhymes I.L.: A Laboratory Manual of Blood Coagulation, Oxford, Blackwell Scientific Publications, 1975) . Der chromogene Assay war das Immunochrom Faktor VIII:C Kit von IMMUNO, wie jüngst beschrieben (Lang H. et al. , Thromb. Haemost. 65:943, 1991 (abstr.)). Humane Faktor VIII Plasma-Äquivalent -Einheiten wurden in U/ml·ausgedrückt. FVIII-Antigen (FVIII:Ag) wurde durch einen ELISA-Assay auf Basis zweier verschiedener monoklonaler Antikörper bestimmt, die gegen Epitope in der intakten leichten Kette des FVIII-Moleküls gerichtet waren, wie jüngst beschrieben. Der ELISA war spezifisch für humanen FVIII und kreuzreagierte nicht mit FVIII, der von Mäusen stammte.

Das gesamte von-Willebrand-Faktor-Antigen (reif und pro-vWF) wurde mittels ELISA unter Verwendung eines polyklönalen Hasen-anti-human-vWF-Antikörpers von Diagnostica Stago (Asserachrom vWF, Boehringer-Mannheim, Mannheim, Deutschland) gemessen und unter Verwendung des Standardpräparats vom Testkit in Humanplas- 11 AT 004 923 Ul ma-Äquivalent-Einheiten pro Milliliter (U/ml) ausgedrückt.

Drei Stämme normaler Mäuse dienten als Kontrolle, um unter Verwendung unserer Assaysysteme physiologisch normale Mäuse-FVIII-Werte festzustellen: NMRI-Mäuse (Crl NMRI BR) und Balb/c Mäuse (Balb/cAnNCrlBR) wurden von Charles River, Sulzfeld, Deutschland, erhalten und hatten ein Körpergewicht zwischen 22 und 27 g. Mäuse vom schwarzen C57-Stamm aus den Jackson Laboratories (C57B1/6J) wurden von Charles River, Lyon, Frankreich, erworben.

Eine Mäusekolonie mit der angestrebten Störung des vWF-Gens wurde unter Verwendung eines Zuchtpaares aus der ursprünglichen Kolonie etabliert, was durch Mikroinjektionen der angestrebten Embrionalstammzellen in die Blastozölhöhle der Blastozysten von schwarzen C57-Mäusen erreicht wurde. Den vWF-Knockout-Mäusen fehlt das vWF-Protein völlig, und es ist berichtet worden, dass sie einen sekundären Faktor VIII-Mangel mit Werten von etwa 20% der Werte normaler Mäuse haben (Denis C. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:9524, 1998).

Alle Experimente, Behandlung der Mäuse mit verschiedenen Verbindungen oder Blutabnahme erfolgten unter Anästhesie. Ketaminhyd-rochlorid (Ketavet, Parke Davis, Berlin, Deutschland), Xylazin-hydrochlorid 2% Lösung (Rompun, Bayer, Leverkusen, Deutschland) und Natriumpentobarbital (Nembutal, Sanofi, Libourne,

Frankreich) wurden als Anästhetika verwendet.

Die Tiere waren in den Tierpflegestationen der Baxter AG in Wien und Orth/Donau untergebracht. Alle Tierstudien erfolgten in Übereinstimmung mit dem Österreichischen Bundesgesetz (BG 501/1989) zur Regelung von Tierversuchen. a) Behandlung von vWD-Mäusen mit RAP: RAP wurde bei drei Gruppen von vWF-Knockout-Mäusen (5 Männchen und 5 Weibchen pro Gruppe) in einer Dosis von 80 mg/kg Körpergewicht in eine Schwanzvene injiziert. Nach 30 Minuten, 1 Stunde bzw. 3 Stunden wurden die Tiere getötet, und durch Herzpunktion wurden Blutproben genommen. Eine vierte Gruppe (5 Männchen und 5 12 AT 004 923 Ul

Weibchen), die 30 Minuten nach der Injektion von 20 ml Formulierungspuffer pro kg Körpergewicht getötet wurde, diente als Nullzeitpunktkontrolle . b) Behandlung von vWD-Mäusen mit rpvWF:

In einer zweiten Serie von Experimenten erhielten zwei Gruppen von Mäusen mit vWF-Mangel (2 Männchen und 2 Weibchen pro Gruppe) 70 U rpvWF pro kg Körpergewicht, injiziert in eine Schwanzvene, und wurden 1 bzw. 3 Stunden nach der Injektion zur Blutabnahme mittels Herzpunktion getötet. Eine dritte Gruppe (2 Männchen und 2 Weibchen) ohne Behandlung dienten als Nullzeitpunktkontrolle. c) Vorbehandlung mit RAP, gefolgt von rekombinantem Faktor VIII:

In einem weiteren Experiment wurden vWF-Knockout-Mäuse mit RAP in einer Dosis von 40 mg/kg Körpergewicht vorbehandelt, und 15 min später wurden ihnen 200 U/kg menschlicher rekombinanter Faktor VIII (rFVIII) in eine Schwanzvene injiziert. In der Kon-trollgruppe wurden die Mäuse nur mit 200 U/kg rFVIII behandelt. In jeder Gruppe wurden 3 Tiere verwendet, und Plasma wurde von jedem einzelnen Tier zu Zeitpunkten vor sowie 15 min, 1 und 3 Stunden nach der Verabreichung von rFVIII genommen. Für die Blutabnahme wurde ein 2-3 mm großes Stück vom Schwanz mit einem Skalpell abgeschnitten, und das Blut wurde mit einem Lithium-heparinisierten Kapillarröhrchen gesammelt, das üblicherweise für die Hämatokritmessung verwendet wird (32 Mikroliter Li-Hepa-rin-Ringkappen für Reflotron, Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Deutschland), und versiegelt. Die Schwanzwunden wurden verätzt, und für den nächsten Zeitpunkt wurde ein weiteres 2-3 mm Schwanzstück abgeschnitten. Die Kapillaren wurden mit einer Hämatokritzentrifuge (Typ 2075, Hettich, Tuttlingen, Deutschland) zentrifugiert, und der Hämatokrit wurde ausgewertet. Danach wurde das Gewicht der Kapillare gemessen, und das Durchschnittsgewicht von 10 versiegelten, leeren Kapillaren wurde subtrahiert, um das Blutvolumen zu errechnen. Aus Gründen der Vereinfachung wurde die relative Dichte des Blutes mit 1000 g/1 angenommen.

Die gefüllten Kapillaren wurden mit einem Ampullenschneider an der Grenzfläche des zellulären und des flüssigen Teils der Ka- 13 AT 004 923 Ul pillare geschnitten. Das zellfreie Plasma wurde unter Verwendung von Luftdruck in eine Eppendorf-Röhre entleert, die ein bekanntes Volumen von 3,8% Citratlösung als Antikoagulans enthielt.

Das verdünnte und antikoagulationsbehandelte Plasma wurde dann bei 1200 g 10 min lang bei Zimmertemperatur zentrifugiert (Eppendorf Zentrifuge 5415C, Hamburg, Deutschland). Der Überstand wurde einer FVIII-Bestimmung unterzogen. Die Verdünnung des Plasmas durch die Herstellung einer Probe mußte für weitere Berechnungen des tatsächlichen FVIII-Werts berücksichtigt werden.

Biometrische Verfahren:

Die Ergebnisse wurden unter Verwendung von Students T-Test statistisch ausgewertet. Die Signifikanz der Erhöhung der endogenen Mäuse-Faktor VHI-Werte in den Infusionsexperimenten zu den Zeitpunkten 1 und 3 Stunden nach Anwendung der entsprechenden Testsubstanzen wurde im Vergleich zu den Werten in den Nullkontrollen wie oben definiert errechnet.

Der Erhalt von humanem FVIII in vivo wurde für die 15 min-Plasmaprobe nach der Formel errechnet: IVR(%) = [FVlIl-Aktivität (U/ml)] x [Plasmavolumen (ml)] x 100 FVIII infundiert (U)

Ergebnisse:

Normale und Bezugslinienwerte von Faktor VIII

Da unsere Assaysysteme für die Messung von humanem Faktor VIII etabliert worden waren, bestimmten wird die Normalwerte von Mäuse-Faktor VIII für diese Systeme durch Auswertung von Plasmaproben von drei typischen Labormausstämmen: NMRI, C57 schwarz und Balb/c-Mäusen (Tabelle 1). Im Allgemeinen lagen die Werte von Mäuse-Faktor VIII nicht über den menschlichen, obwohl der mit dem chromogenen Assay bei männlichen Balb/c-Mäusen gemessene durchschnittliche Faktor VHI-Wert 225% humaner Normalwerte betrug. Männliche Mäuse hatten bei allen Stämmen wesentlich höhere Faktor VIII-Werte als weibliche. Die mit dem chromogenen Assay 14 AT 004 923 Ul gemessenen Werte waren mindestens doppelt so hoch wie jene, die mit dem Zweistufenassay gemessen wurden. Die Standardabweichung des chromogenen Assays war ebenfalls größer als auf Basis des Screenings von Humanplasmaproben zu erwarten wäre. Daher berechneten wir zur Interpretation der Experimente auch den Durchschnitt der chromogenen und Zweistufenassays für eine einfachere graphische Darstellung.

Die Plasma-Faktor VHI-Werte bei den vWF-Knockout-Mäusen betrugen etwa 20% jener der schwarzen C57-Mäuse, die auf Grund ihrer genetischen Verwandtschaft mit den vWF-Knockout-Mäusen als die relevanteste Kontrolle betrachtet wurden. Dieses Ergebnis entsprach den Plasmawerten, die für die ursprüngliche vWF-Knockout-Kolonie berichtet wurden (Denis C. et al., Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 95:9524, 1998).

Wirkungen von RAP

Die Verabreichung von RAP an die vWF-Knockout-Mäuse führte zu einem 100%-igen Anstieg der Faktor VIII-Aktivität (Tabelle 2,

Fig. 1), der statistisch äußerst signifikant war.

Wirkungen von humanem rpvWF

Die Behandlung von vWF-Knockout-Mäusen mit der humanen rpvWF-Präparation führte zu einem sofortigen Anstieg an Gesamt-vWF-Antigen von 0 auf 1,6 U/ml, gefolgt von einem schrittweisen Absinken (auf 0,8 U/ml nach 3 Stunden). Wie nach der Verabreichung von RAP stiegen die Faktor VHI-Plasmawerte nach der Injektion von rpvWF (Tabelle 3, Fig. 1). Faktor VIII stieg jedoch gradueller an und erreichte 3 Stunden nach Verabreichung von rpvWF höhere Werte als nach der Verabreichung von RAP.

Wirkungen der Vorbehandlung mit RÄP, gefolgt von rekombinantem Faktor VIII

Die Ausbeute von infundiertem humanem rFVUI (200 U/kg) in Mäusen mit vWF-Mangel in vivo betrug nur 6,2%, bezogen auf die Messung von Faktor VIII-Antigenwerten. Der infundierte rFVIII wurde 15 AT 004 923 Ul schnell entfernt, so dass es nach 3 Stunden keine messbaren Antigenwerte mehr gab. Die rFVIII-Ausbeute war nach der Vor-Verabreichung von RAP zu 40 U/kg, gefolgt von 200 U/kg rFVIII, so gut wie ident (6,4%). Die Konzentration von zirkulierendem Faktor VIII-Antigen nach der Vorbehandlung mit RAP war zum Zeitpunkt von 1 Stunde 2 Mal so hoch wie jene von rFVIII alleine (Fig. 2). Obwohl dieser Unterschied statistisch nicht signifikant war, war in der Gruppe von Tieren, die nur mit rFVIII behandelt worden waren, Faktor VIII-Antigen bei 1 der 3 Tiere bereits völlig verschwunden, während in der RAP-Gruppe alle 3 Mäuse messbare Humanfaktor VIII-Antigenwerte aufwiesen.

Wir erhielten ähnliche Ergebnisse mit der gleichen Präparation nach Injektion in Hunde, Schweine und Mäuse mit vWF-Mangel und in gesunde Paviane, sowie auch mit einer rekombinanten Präparation, die nur reifen vWF enthielt, bei Schweinen und Hunden mit vWF-Mangel. Es ist unwahrscheinlich, dass dies auf eine verstärkte Faktor VIII-Synthese in der Leber zurückzuführen ist, da jüngst in einem Schweinemodell von vWD gezeigt wurde, dass vWF den Plasma-Faktor VIII erhöht, ohne Faktor VHI-spezifische Messenger-RNA in der Leber zu induzieren. Rekombinanter humaner vWF interagiert also, um Mäuse-Faktor VIII zu binden, um eine gewisse Stabilisierung von Faktor VIII im Kreislauf zu erreichen .

Die in dieser Studie verwendete rpvWF-Präparation enthielt 50% pro-vWF und nur 50% reifen vWF, der in der Lage war, zu binden und so Faktor VIII zu stabilisieren. Die oben erwähnte Studie an Hunden, Schweinen, Mäusen und Pavianen zeigte jedoch, dass menschlicher rekombinanter pro-vWF im Kreislauf rasch in reifen vWF umgewandelt wird. Obwohl wir auf Grund der beschränkten Anzahl von ausgewerteten Zeitpunkten die Halbwertszeit von rpvWF in der vorliegenden Studie an Mäusen nicht berechnen konnten, hat unsere Erfahrung mit der Infusion von menschlichem rekombi-nantem vWF in Schweinen und Hunden mit vWF-Mangel gezeigt, dass die Halbwertszeit von menschlichem reifem vWF in Plasma lang genug ist, um sogar 24 Stunden nach der Verabreichung die Stabilisierung von Faktor VIII zu unterstützen. Es könnte daher erwartet werden, dass der Plasmawert von Faktor VIII bei den 16 AT 004 923 Ul Mäusen nach den 3 Stunden nach der Verabreichung von rpvWF noch weiter steigt.

Das anfängliche Verhalten von Faktor VIII nach der Injektion des rekombinanten 39 kD Proteins RAP war bei den hier untersuchten Mäusen mit schwerer vWD fast ident mit jenem nach rpvWF. Innerhalb einer kurzen Zeitspanne verdoppelten sich die endogenen Faktor VIII-Plasmawerte und blieben während des gesamten Experiments fast konstant. Die Inhibierung von LRP durch die Verabreichung eines einzigen Bolus von RAP führt also zu einer verlängerten Halbwertszeit von Mäuse-Faktor VIII. Auf Grund der kurzen Halbwertszeit von RAP, das rasch aus dem Kreislauf entfernt wird, wobei die zweiphasige Halbwertszeit 30 Sekunden und 9 Minuten beträgt, ist es nicht verwunderlich, dass die Wirkung auf die Faktor VHI-Werte nicht so lang anhaltend war wie die von rpvWF.

Die Beteiligung von LRP am Faktor VIII-Stoffwechsel wurde auch durch die Infusionsexperimente mit rekombinantem Faktor VIII gezeigt, wobei die in Abwesenheit von vWF zu sehende beschleunigte Clearance von Faktor VIII durch die Vorverabreichung von RAP abgeschwächt wurde. 17 AT 004 923 Ul

Tabelle 1: Faktor VIII-Plasmawerte von vWF-Knockout-Mäusen im Vergleich zu normalen Mäusestämmen

Stamm n FVUI 2-Stufen-Assay U/ml FVllI chromo-gen. Assay U/ml FVllI Durchschnitt U/ml männlich+weiblich SD 53 0,49 ± 80% 0,39 1,03 ±62% 0,64 0,76 ±78% 0,59 q: männlich 25 sd 2 33 0,57 ±75% 0,43 1,17 ±64% 0,75 0,87 ±78% 0,68 weiblich SD 20 0,37 ±73% 0,27 0,80 ±38% 0,30 0,58 ±60% 0,35 männlich+weiblich —2 SD m 20 0,28 ±61% 0,17 0,66 ± 59% 0,39 0,47 ±74% 0,35 “ männlich 00 SD p* 9 0,37 ±51% 0,19 0,80 ±64% 0,51 0,59 ±75% 0,44 U) Q weiblich SD 20 0,37 ±73% 0,27 0,79 ±38% 0,30 0,58 ±60% 0,35 männlich+weiblich SD o 14 0,29 ±66% 0,19 1,60 ±53% 0,85 0,95 ±95% 0,90 •O männlich 05 SD rn 8 0,34 ±72% 0,25 2,25 ±12% 0,26 1,30 ±78% 1,02 weiblich SD 6 0,23 ±23% 0,05 0,74 ±63% 0,47 0,49 ± 85% 0,41 männl ich+weibl ich SD 4 0,07 ± 40% 0,03 0,02 ±44% 0,01 0,05 ± 68% 0,03 Q männlich § SD > 2 0,06 ±40% 0,02 0,02 ± 16% 0,00 0,04 ± 69% 0,03 weiblich SD 2 0,09 ± 34% 0,03 0,03 ±46% 0,01 0,06 ± 66% 0,04 18 AT 004 923 Ul

Tabelle 2: Wirkung von RAP bei vWD-Mäusen zt. von xigen. 3 0.09 0.03 I H CO 0.0304 | Λ d Λ d Ä d • n.b. I Ch o o 0.03 I rH CO 0.0260 1 hschnil + chroi ay) 1 1 O o in o o CO in ID rH N* CN O O O rH rH O in o o in O rH O in O O O 0.07 0.05 ! VD VO VO CN CD «*< H O III:Durc Stufen-Ass 0.5 | 0.10 co o o o· 03 ID H 0.000001 0.11 co o o rH co 00 0.0015 o\ o o 03 O ’.o 03 03 00 rH O O O O £ « O in o o 03 o o VD O 03 in o o 0.03 00 in O rH in o o 0.01 <*< CN o t-H Assay 3 0.11 0.01 H rH CN o co o o o Λ d Λ d JQ d 1 n.b. 0.11 rH o O rH rH 03 0.0091! d 0 H tJ) 0 Γΐ O H O 0.,06 rH VO 00 0.0421 0.11 VO O O CO in in 0.0867 00 o o O O 00 co m 0.2450 ¢3 — 0 £ “Ϊ ü O H H H O m o o o m co 0.0013 H «H O o o o 0.0742 0.11 cn o o O 03 N* CN o o o H - H £ 90 ’ 0 co o o m in o H 90*0 o o o VD ui i 0.05 0.02 co co m in CO 03 ‘ 03 < O- o o o o o cd (N 0.0052 Λ d Λ d n.b. 1 n.b. 0.07 0.004 vo <N 00 H H O σ ß «W H 0 V <J\ o o o o oo 0.0108 o H O o o o U3 0.0144 vo o o rH O O H CO 0.0702 CO 1 <n in H ° H 0.10 03 O O in 03 co 0.0002 0.11 0.03 CN 0.0043 co o o 0.01 t- rH 0.0052 £ o 0.05 03 O o co o rH O O 03 O O r-( in in 0.05 H O O rH in Stunden U/ml P M cv% ö Signifikanz (p) ü/ml P co cv% d Signifikanz (p) U/ml P co cv% d Signifikanz (p) _U q....... £ + 0 0 £ nicht bestimmt 19 AT 004 923 Ul

Tabelle 3: Wirkung von rpvWF bei vWD-Mäusen I ίDurchschnitt !2-Stufen- + mgen. Assay) 00 0,18 CN H O Iß σ\ o o «* o in CN o 1 ζτ Ό CN 0,0217 | O H O oo o o CN CO CO o rH O H 0,09 03 rH O 0,1795 ro Η ·» o 0,16 CN o CTi rH O O o CO o o CN 0,4906 Η O h b H t> O £ > ü o o o 0,03 in o o CO o o CN o o 0,03 CN g Q) Ul 0 e CO 00 rH O 0,13 0,0481 0,27 0,12 CN o o o H O 00 o o CN o o CN 0,0774 PVIII chroti Assay H 0,13 0,15 H 00 H o CN O o 0,24 | CN 0,2500 0,07 rH o o CN H 00 o o o CN O O 0,00 0,02 o o o CN CN O o o o ** o CN PVIII 2-Stufen— Assay co 00 rH O 0,14 o 10 o H o CO 03 O 0,17 CN 0,2107 0,13 ZT'Q CN 0,3117 rH in o o iß o o 0,2396 r~- o o 60'0 CN 0,4924 CN O O 0,02 CN 0,0567 o 0,07 H O O 0,07 H o o CN J 0,07 CN O o CN Stunden U/ml QS d Signifikanz (p) U/ml SD Ö 0. N α rä Id -H MH Ή Ö tn ü) U/ml QS d Signifikanz (p) Ge - * schlecht 5: + ß 6 5 20

Claims (9)

1. AT 004 923 Ul ANSPRÜCHE: 'feLd leVtAU^w 1. Pharmazeutisches Präparat zur Behandlung von ftl ntlrj enthaltend RAP (Rezeptor assoziiertes Protein), oder ein Derivat oder Fragment davon, als einzige aktive Komponente.
2. 2. Präparat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das RAP-Fragment eine Region repräsentiert, die die Bindung von Proteinen an das dem Lipoproteinrezeptor verwandte Protein (LRP) hemmt.
3. 3. Präparat gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das RAP-Fragment die Aminosäuresequenz Glu-Phe-Arg-Met-Glu-Lys enthält.
4. 4. Präparat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das RAP-Derivat ein RAP-Fragment ist, das die folgende Aminosäuresequenz enthält: R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8, worin a) RI His oder Ser ist, b) R2 Ser oder Asn ist, c) R3 Asn ist, d) R4 Ala oder Leu ist, e) R5 Leu oder Ser ist. f) R6 Asn oder Gly ist, g) R7 Glu oder Thr ist. h) R8 Asp oder Gin ist.
5. 5. Präparat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das RAP-Derivat ein RAP-Fragment ist, das die folgende Aminosäuresequenz enthält: R1-R27, wobei RI Arg ist, R2 Leu ist, R3 Arg ist, R4 Lys oder Arg ist, R5 Val ist, R6 Ser ist, R7 His ist, R8 Gin ist, R9 Gly ist, RIO Tyr ist, Rll Gly oder Ser ist, R12 Thr, Ser oder Pro ist, R13 Glu, Ala oder Thr ist, R14 Ala oder Thr ist, R15 Glu ist, R16 Phe ist, R17 Glu ist, R18 Glu ist, R19 Pro ist, R20 Arg ist, R21 Val ist, R22 Ile ist, R23 Asp ist, R24 Leu ist, R25 Trp ist, R26 Asp ist und R27 21 AT 004 923 Ul Leu ist.
6. 6. Präparat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das RAP-Derivat ein RAP-Fragment ist, das die folgende Aminosäuresequenz enthält: R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R9, wobei RI Val oder Ile ist, R2 Ser ist, R3 Arg ist, R4 Ala ist, R5 Arg ist, R6 His ist, R7 Asn ist, R8 Glu ist und R9 Leu ist.
7. 7. Verwendung eines Präparats gemäß Anspruch 1 bis 6 zur Herstellung eines Medikaments zur Verlängerung der biologischen Halbwertszeit eines Proteins.
8. 8. Verwendung eines Präparats gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein Faktor VIII ist.
9. 9. Verwendung eines Präparats gemäß Anspruch 1 bis 6 zur Herstellung eines Medikaments zur Verhütung und Behandlung von Blut^-ankh^t^'yuTt'<" ft-Q. Präpargi-g nngpjam-ΐι dadurch gckerm- aoichnc-fe;—dass die Blutkrankheit eino Go-rinnungastörung· intΆ 5 1Verwendung des Präparats gemäß Anspruch yjtf, dadurch gekennzeichnet, dass die Gerinnungsstörung Hämophilie A ist. /> 5 Ipi. Verwendung eines Präparats gemäß Anspruch J/Ö, dadurch gekennzeichnet, dass die Gerinnungsstörung vWF-Mangel ist. 22