AT382885B

AT382885B - Verfahren zur enzymkatalysierten konzentrations- bestimmung von substraten

Info

Publication number: AT382885B
Application number: AT123084A
Authority: AT
Inventors: Franz Dr Knauseder; Georg Dr Decristoforo
Original assignee: Biochemie Gmbh
Priority date: 1984-04-12
Filing date: 1984-04-12
Publication date: 1987-04-27
Also published as: ATA123084A

Description

EMI1.1

C = Kontrolleitung
S = Signalleitung
In diesem Fall wird das Verhalten der Probelösung im ultravioletten Spektralbereich als Mess- prinzip herangezogen. Die mobile Phase, die meist aus einer wässerigen Pufferlösung besteht, wird mit einer geeigneten Pumpvorrichtung mit einer Flussrate zwischen 0, 1 bis 5, 0 ml/min durch das
System gepumpt. Die Flüssigkeitsleitungen bestehen aus Edelstahlkapillaren mit einem Innendurch- messer von 0, 2 mm. Alle Verbindungsteile bestehen aus Swagelok-Teilen, wobei die Gesamtlänge der Kapillarleitung vom Injektionsventil bis zum Detektor so kurz wie möglich gehalten wird.
Probenvolumina zwischen 10 und 100 III werden mit einem automatischen Probengeber in das flie- ssende, wässerige System injiziert.

Die Reaktorsäulen bestehen aus einem Edelstahl-316-Rohr mit den Abmessungen 0, 64 x 0, 47 x 56, 0 cm (Aussendurchmesser x Innendurchmesser x Länge), die an beiden Enden durch mit 2 Ilm-Stahlfritten versehene Swagelok-Reduktionsstücken (1/4'I auf 1/16 I,) verschlossen. Die Enzymreaktionen werden bei geeigneter Temperatur durchgeführt. Die Umschaltung zwischen Reaktions- und Blindsäule erfolgt durch ein pneumatisch aktiviertes 6-Wegeventil.

Art und Beschaltung dieses 6-Wegeventils sind in der Prinzipschaltskizze in Fig. 3 dargestellt, worin die Symbole folgende Bedeutung besitzen :
P = Pumpe
S = Probengeber
BR = Blindreaktor
ER = Enzymreaktor
M = Durchflusszelle
V = Reaktorwechselventil
Die Kommunikation zwischen Probengeber, Analog-Digital-Converter (ADC) und Datensystem wird von einem Interface durchgeführt, welches die Probeninjektionen zählt, das Säulenschaltventil steuert, Probengeber und ADC startet und anhält und den gesamten Analysenablauf synchronisiert.

Beispiel 2 : Analyse von Cephalosporinen
Die in Beispiel 1 beschriebene Vorrichtung kann zur enzymphotometrischen Analyse von verschiedenen Cephalosporinderivaten eingesetzt werden. Die Enzymreaktorsäulen werden mit immobilisierten Cephalosporinasen, entweder aus Enterobacter Cloacae P 99 oder aus Bacillus Cereus 569/H, gefüllt. Als Laufmittel wird Phosphatpuffer (0, 15 M) mit PH = 7 und 0, 001 M an Na-Azid verwendet, die Flussrate beträgt 3 ml/min, die UV-Absorption wird bei X = 260 nm gemessen, und die injizierte Probemenge ist 100 il. Der Gegendruck im Flow Injection-System beträgt 6 bis 8 bar.

Eine Einzelanalyse dauert weniger als 2 min. Als gut analysierbar erweisen sich unter anderem Fermentationslösungen von Cephalosporin C und Desacetylcephalosporin C, sowie reine wässerige Lösungen von Cefalotin, Cefaloglycin, Cefaloridin, Cefalexin und Cefazolin im Konzentrationsbereich von 10 bis 1000 Ilglml Lösung. Die Langzeitstabilität der Reaktorfüllungen erweist sich als sehr gut, es konnten mehrere tausend Proben ohne nennenswerte Signalverminderung mit demselben IMER analysiert werden. Im angegebenen Konzentrationsbereich arbeitet die Methode linear. Die Präzision wird durch 15malige Einspritzung einer identischen Probe, die Cephalosporin C enthielt, bestimmt.

Die gefundene relative Standardabweichung beträgt 0, 7% (N = 15 ; x = 207, 2 mg/ml ; s = 1, 368 tig/ml ; RSD 0, 66%). Ein typisches Bild eines Analysenlaufes ist aus Fig. 2 ersichtlich, worin die Ergebnisse eines Analysenlaufes mit 20 Cephalosporin C Bestimmungen wiedergegeben sind.

Beispiel 3 : Analyse von Carbapenemen :
Die in Beispiel 1 beschriebene Vorrichtung kann als Enzymphotometer auch zur Analyse von Carbapenemderivaten verwendet werden. Die Arbeitsbedingungen werden weitgehend entsprechend denen in Beispiel 2 gewählt, ausgenommen, dass als Reaktorenzym immobilisierte Dehydropeptidase I (gereinigt aus Schweinenieren) eingesetzt wird, dass als mobile Phase Phosphatpuffer (0, 15 M) mit
EMI2.1
gen bei einer Wellenlänge von 300 nm erfasst wird. Die Carbaphenemsubstanzen OA-6129 B2 und OA-6129 B1 werden in biologischen Proben und in reinen Lösungen in einem Bereich zwischen 20 und 1000 Ilglml analysiert.

Beispiel 4 : Analyse von Zuckern :
Die in Beispiel 1 beschriebene Vorrichtung kann mit einem Differentialrefraktometer als Detek-

tor zur Konzentrationsbestimmung verschiedener Zucker eingesetzt werden. Glukose wird mit den koimmobilisierten Enzymen Glukoseoxydase und Katalase bestimmt, für Laktosebestimmungen werden ss-Galaktosidase und Glukoseoxydase/Katalase im Enzymreaktor verwendet. Das Reaktionsmedium besteht aus Phosphatpuffer PH = 7, die Flussrate beträgt 3 ml/min. Laktose und Glukose werden in Lösungen mit Konzentrationen von 20 bis 1000 tg/ml bei Raumtemperatur analysiert.

PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur enzymkatalysierten Konzentrationsbestimmung durch Reaktion von Substraten mit immobilisierten Enzymen in einem Flüssigkeitsstrom, wobei die Substrate eine von ihrer Konzentration abhängige Änderung der physikalisch-chemischen Eigenschaften erfahren, welche durch Messung vor und nach der Enzymreaktion quantitativ erfasst wird, dadurch gekennzeichnet, dass der die Probe enthaltende Flüssigkeitsstrom abwechselnd einmal über einen Enzymreaktor bzw. über einen Blindreaktor gleicher Geometrie, jedoch ohne Enzymaktivität und anschliessend durch die Messzelle geleitet wird.

Claims

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Enzymreaktion in einem Festbettreaktor, in dem sich ausreichende an inerte unlösliche Partikel gebundene Enzymaktivitäten befinden, oder in einer Kapillare, an deren Innenwand sich ausreichende gebundene Enzymaktivitäten befinden, durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Konzentration der Substrate an Hand der durch die Enzymreaktion bedingten Veränderung ihres spektralen, elektrochemischen oder optischen Verhaltens misst.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Substrate einem kontinuierlich fliessenden Strom eines wässerigen Systems nach dem Prinzip der Flow Injection Analysis in diskreten Portionen zufügt und anschliessend die Enzymreaktion in diesem Medium durchführt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei an Stelle eines nach Anspruch 1 gekennzeichneten Blindreaktors ein gemäss Anspruch 2 gekennzeichneter Reaktor mit Enzymaktivität verwendet wird und sich im Enzymreaktor zwei oder mehrere trägergebundene Enzyme befinden, dadurch gekennzeichnet, dass im ersten Reaktor nur ein Teil der in der Probelösung enthaltenen Substrate selektiv umgesetzt wird und im zweiten Reaktor die Summe an Substanzen gemeinsam erfasst wird.