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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von tuberkulinaktiven Einfachproteinen und Peptiden, welche folgende Peptidgruppierung
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als tuberkulinaktive funktionelle Gruppe aufweisen.
Es ist bekannt, dass gereinigtes Proteinderivat (PPD) aus extrazellulärem Alttuberkulin (OT) ausschliesslich für die Diagnose von Tuberkulose verwendet worden ist. Leider enthält PPD ausser den tuberkulinaktiven Proteinen andere inaktive Proteine, Nukleinsäuren, Polysaccharide und Fettsäuren. Im Zusammenhang mit der Herstellung von Tuberkulinantigenen ist eine Anzahl von Verfahren vorgeschlagen worden. Beispielsweise wird in der deutschen Offenlegungsschrift 2222092 ein Verfahren zur Herstellung von Tuberkulinantigenen durch fraktionierte Zellextraktion von Tuberkelbazillus beschrieben. In der deutschen Patentschrift Nr. 892047 ist ein Verfahren zur Herstellung von tuberkuloziden Substanzen durch Extraktion von Zellkörperflüssigkeiten oder Körperausscheidungsprodukten des Wirtsorganismus von E. coli und Fraktionierung des entstehenden Extraktes beschrieben. Aus der brit.
Patentschrift Nr. 860,305 ist ein Verfahren zur Herstellung eines tuberkulinaktiven Peptids durchExtraktion von Zellkörpern des TuberkelbazillusundFällung des extrahierten Tuberkulinpeptids mit Pikrin- säure bekannt. In der USA-Patentschrift Nr. 1, 586,937 wird ein Verfahren zur Herstellung von Vaccinmaterial durch Extraktion einer Kulturlösung von Tuberkelbazillus mit Alkohol und Abbau des erhaltenen Extraktes mit Pankreatin oder Trypsin beschrieben.
Auf Grund der unvollständigen Fraktionierungen oder der Unterschiede bezüglich ihrer Fraktionierung gegenüber jener gemäss der Erfindung war es bei den bekannten Verfahren nicht möglich, reine und starke tuberkulinaktive Einzelproteine und Peptide zu erhalten, die jenen, wie sie gemäss der Erfindung erhalten werden, ähnlich sind. Da tuberkulinaktive Einfachproteine und Peptide nicht erhalten wurden, sind auch deren phys. chem., chemische und biologische Eigenschaften nicht entdeckt worden.
Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung von tuberkulinaktiven Einfachproteinen aus Zellen der Tuberkelbazillen gefunden und ferner gelang die Isolierung dieser Einfachproteine in kristalliner Form. Es wurden auch die Aminosäuresequenzen und Aminosäurezusammensetzungen der erhaltenen Proteine bestimmt. Ausserdem wurden tub erku linaktive Peptide durch Hydrolysieren der obigen erhaltenen Proteine und Fraktionieren der erhaltenen Hydrolysate hergestellt. Als Ergebnis dieser Untersuchungen wurde festgestellt, dass die Tuberkulinaktivität in enger Verbindung mit der tuberkulinfunktionellen Gruppe in Proteinen und Peptiden steht.
Die tuberkulinaktiven Einfachproteine werden gemäss der Erfindung aus Tuberkelbazilluszellen durch Behandlung dieser Bazillenzellen mit organischen Lösungsmitteln, Abbauen des erhaltenen Rückstandes mit Nucleasen, Dialysieren der erhaltenen wasserlöslichen Proteine und Fraktionieren der entstehenden Dialysate durch Chromatographie, Elektrophorese und/oder Gelfiltration hergestellt. Die im Rahmen der Erfindung verwendeten Tuberkelbazillen sind Menschen-, Rinder- oder Geflügeltuberkelbazillen einschliesslich Bacille de Calmette et Guérin (BCG) u. a. Die erhältlichen tuberkulinaktiven Einfachproteine sind von den Tuberkelbazillen und den Herstellungsbedingungen, die im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens angewendet werden, abhängig.
Beispielsweise ist das tuberkulinaktive Einfachprotein vom Menschentypus Mycobacterium tuberculosis-Stamm Aoyama B aus 89 Aminosäureresten je Molekül zusammengesetzt. Anderseits ist das aktive Protein aus BCG aus 135 Aminosäureresten je Molekül aufgebaut.
Die obigen Tuberkelbazillen werden mit organischen Lösungsmitteln, wie Ketonen, Alkoholen oder Carbonsäuren, zur Entfernung fettlöslicher Komponenten aus den Bazillenzellen behandelt. Vorzugsweise wird Aceton, Methanol oder Essigsäure angewendet. Diese organischen Lösungsmittel können auch gemeinsam mit Wasser benützt werden. Die lösungsmittelextrahierten Rückstände werden mit Nucleasen, wie Ribonucleasen, Desoxyribonucleasen u. dgl., abgebaut. Von den beim Abbau erhaltenen Mischungen werden wasserlösliche Proteine abgetrennt und gegen Puffer mit pH-Werten von 5,5 bis 7,8, wie tris- (Hydroxymethyl)-aminomethan-
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0,phat-Monokaliumhydrogenphosphat-Puffer vom pH 7, 2, der Äthylendiamintetraessigsäure enthält, u. dgl. dialysiert.
Die entstehenden Dialysate werden durch Chromatographie, Elektrophorese und/oder Gelfiltration fraktioniert. Insbesondere werden Säulenchromatographie unter Verwendung von Ionenaustauschercellulosen oder Gelfiltrationunter Verwendung von Dextranpolymeren mit Brückenbindungen besonders bevorzugt angewendet. Die Ionenaustauschercellulosen, die zur Fraktionierung der obigen Dialysate angewendet werden können, können beispielsweise Aminoäthylcellulose, Diäthylaminoäthylcellulose, Triäthylaminoäthylcellulose oder Epichlorhydrintriäthanolamincellulose sein. Zur Verwendung bei der Gelfiltration werden Dextranpolymeren mit Brückenbindung, Carboxymethyldextranpolymeren mit Brückenbindung oder Sulfoäthyldextranpolymeren mit Brückenbindung bevorzugt verwendet. Die dialysierten Proteine werden mit den oben erwähnten Puffern eluiert.
Die tuberkulinaktiven Einzelproteine, die erfindungsgemäss erhältlich sind, sind in Wasser löslich und ihre Molekulargewichte von 3000 bis 35000 hängen vonden für deren Herstellung verwendeten Tuberkelbazillen und den Herstellungsbedingungen derselben ab.
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Tuberkulinhauttests ergeben, dass die tuberkulinaktiven Einzelproteine, wie sie erfindungsgemäss erhältlich sind, gegenüber Meerschweinchen, die mit hitzeabgetötetem Mycobacterium tuberculosis-Stamm Aoyama B oder BCG sensitiviert worden sind, Tuberkulinaktivitäten aufweisen, die 10- bis 100-mal stärker sind als jene von PPD.
Die erfindungsgemäss erhältlichen tuberkulinaktiven Peptide werden durch Hydrolysieren der oben erwähnten kristallinen Tuberkulinproteine hergestellt und durch Fraktionierung der entstehenden Hydrolysate durch Chromatographie, Elektrophorese und/oder Gelfiltration erhalten. Die tuberkulinaktiven Einfachproteine werden durch chemische oder enzymatische Methoden hydrolysiert. Die chemische Hydrolyse wird mit einer Mineralsäure ausgeführt. Die enzymatische Hydrolyse führt man mit einem proteolytischen Enzym, wie Trypsin, Chymotrypsin, Pepsin, Papain, bakteriellen Proteinasen, Carboxypeptidase A oder B u. dgl., aus. Die Gelfil - tration wird durch Eluieren mit Ammoniumacetatpuffern oder Pyridinacetatpuffern durch Säulen mit Gelfiltrationsmitteln vorgenommen.
Dieerfindungsgemäss erhältlichen tuberkulinaktiven Peptide sind weisse, kristalline Festkörper, die in Wasser löslich sind und ein Molekulargewicht von etwa 500 bis 3000 aufweisen. Tuberkulin-Hauttests zeigen, dass die erfindungsgemäss erhältlichen tuberkulinaktiven Peptide Tuberkulinaktivitäten aufweisen, die mit jenen von PPD bei Meerschweinchen, die mit wärmeabgetötetem Macobacterium tuberculosis-Stamm Aoyama B oder BCG sensitiviert worden sind, vergleichbar oder wesentlich stärker als diese sind.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Herstellung und Isolierung der tuberkulinaktiven Einfachproteine und Peptide nach dem erfindungsgemässen Verfahren.
Beispiel l : Eine Zellkultur (100 g) vom Mycobacterium tuberculosis-Stamm Aoyama B wurde durch 30 min dauerndes Erhitzen auf 1200C abgetötet. Die Zellen wurden vom Kulturmedium durch Filtration abgetrennt, dann unter Schalleinwirkung zerkleinert und mit Aceton behandelt, um fettlösliche Komponenten von den Zellen zu entfernen. Der acetonbehandelte Rückstand wird mit Ribonuclease und Desoxyribonuclease abgebautund die abgebaute Mischung wird zentrifugiert, um wasserlösliche Proteine abzutrennen. Die so erhaltenen wasserlöslichen Proteine werden gegen 0, 001-molaren tris- (Hydroxymethyl)-aminomethan-Salzsäurepuffer vom PH 7, 0, der 0, 0001 Mol Äthylendiamintetraessigsäure enthält, dialysiert.
Das entstehende Dialysat wird über eine Diäthylaminoäthylcellulosesäule chromatographiert. Die Eluierung wurde in einem Natriumchloridgradienten vorgenommen. Praktisch die gesamte Tuberkulinaktivität wurde in der zweiten Proteinfraktion gefunden. Weiteres Fraktionieren über eine Säule aus Dextranpolymeren mit Brückenbindung wurde im gleichen Puffer wie oben vorgenommen und führte zu drei Fraktionen. Nahezu das gesamte aktive Material findet sich in der grösseren Proteinfraktion. Das tuberkulinaktive Material kristallisierte spontan, wenn die Lösung bei 40C in eine Mischung des gleichen Puffers mit gereinigtem Aceton gebracht wurde. Aus 100 g Zellen (Nassgewicht) des Mycobacterium tuberculosis-Stammes Aoyama B wurden 25 mg kristallines tuberkulinaktives Protein erhalten.
Das so erhaltene tuberkulinaktive Einfachprotein mit einem Molekulargewicht von 9500 war aus 89 Amino-
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ist, wurde aus BCG nach der gleichen Methode, wie in Beispiel 1 angegeben ist, hergestellt. Die Aminosäuresequenz und die Aminosäurezusammensetzung/Molekül dieses Proteins wurde ermittelt, wobei festgestellt wurde, dass Ähnlichkeit mit dem tuberkulinaktiven Protein, wie es gemäss Beispiel l erhalten wird, besteht.
Beim Tuberkulin-Hauttest zeigte sich, dass dieses tuberkulinaktive Protein eine Tuberkulinaktivität aufweist, die nahezu gleich ist jener des tuberkulinaktiven Proteins, wie es nach Beispiel 1 erhalten wird, wobei die Ermittlung bei Meerschweinchen durchgeführt wurde, die mit einem wärmeabgetöteten Mycobacterium tuberculosis Aoyama B-Stamm oder BCG sensitiviert worden sind.
Beispiel 3 : Das tuberkulinaktive Einfachprotein, das gemäss Beispiel 1 erhalten worden ist, wurde bei
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spannungspapierelektrophorese des entstehenden Hydrolysats auf Whatman-Papier bei 75 V/cm in Pyridin-acetatpuffer vom pH 4, 5 und anschliessend eine Papierchromatographie in einem Gemisch aus Butanol/Essigsäure/ Wasser (Vol. - Verhältnis 4 : 1 : 4) ausgeführt.
Die obige Entwicklung führte zur Trennung der verschiedenen tuberkulinaktiven Peptide. Eines davon war
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ein Pentapeptid mit der folgenden Aminosäuresequenz :
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<tb>
<tb> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP>
<tb> HN-Asn-Gly-Ser-Gln-Met-COOH
<tb>
Ein anderes war ein Nonapeptid mit einem Molekulargewicht von etwa 950.
Tuberkulin-Hauttests zeigten, dass diese tuberkulinaktiven Peptide eine Aktivität von 1 bis 10% des Ausgangstuberkulinproteins aufwiesen.
Beispiel 4 : Das gemäss Beispiel 1 erhaltene tuberkulinaktive Protein wurde in o, 5% iger Chymotrypsinlösung hydrolysiert. Das entstehende Hydrolysat wurde auf einer Säule aus Dextranpolymeren mit Brückenbindung chromatographiert, wobei die Eluierung mit einem Ammoniumacetatpuffer vom pH 5, 9 vorgenommen wurde. Diese erhaltenen tuberkulinaktiven Peptide wurden mit Pyridinacetatpuffer vom pH 3, 1 auf einer Ionenaustauscherharzsäule weiter fraktioniert. Das so erhaltene tuberkulinaktive Pentapeptid war das gleiche wie in Beispiel 3.
Beispiel 5: Das tuberkulinaktive Protein des Beispiels 2 wurde in der gleichen Weise wie oben behandelt. Es wurde das gleiche tuberkulinaktive Pentapeptid wie im Beispiel 3 erhalten.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von tuberkulinaktiven Einfachproteinen und Peptiden mit der folgenden Peptidbindung
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behandelt, (c) den lösungsmittelbehandelten Rückstand gegen einen Puffer mit einem pH-Wert im Bereich von 5, 5 bis 7, 8 dialysiert, (d) das Dialysat durch Säulenchromatographie, Papierchromatographie, Papierelektrophorese und/oder Gelfiltration fraktioniert und gegebenenfalls (e) das tuberkulinaktive Protein hydrolysiert und dasentstehendeHydrolysatdurch Säulenchromatographie, Papierchromatographie, Papierelektrophorese und/oder Gelfiltration fraktioniert.
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bacterium tuberculosis-Stamm Aoyama B verwendet.
3. Verfahren nachAnspruchl, dadurch gekennzeichnet, dassmanalsTuberkelbazillusBacille de Calmette et Guérin (BCG) verwendet.