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Verfahren zur Herstellung eines ein Allergen enthaltenden Extraktes
Es ist seit langem bekannt, dass Personen nachKontakt und insbesondere durch Einatmen bestimmter natürlich vorkommender oder synthetisch erhaltener organischer Teilchen oder Substanzen allergische Reaktionen zeigen, wie z. B. Niessen, Aktivierung von Schleim produzierenden Zellen (Becherzellen), lokale Ödeme, Hautaufbrüche oder Vasodilation. Diese Reaktionen werden im allgemeinen als"Heu- schnupfen"bezeichnet ; obgleich eine solche allergische Reaktion an sich gewöhnlich nicht ernste Folgen hat, kann sie zu Komplikationen sowohl physiologischer als auch psychologischer Art führen.
Bei einem Kleinkind bewirkt ein ständiger allergischer Zustand, oft permanente Deformationen desKörpers und insbesondere Veränderungen der Gesichtszüge, wobei psychologische Auswirkungen meist nicht ausbleiben, Asthmatische Bedingungen sind auch eng mit allergischen Reaktionen verbunden und können gleichfalls zu ernsten Komplikationen führen. Die medizinische Wissenschaft anerkennt derzeitden"Heu- schnupfen" als einen ernsten Krankheitszustand, der mit Sorgfalt und Gründlichkeit behandelt werden muss.
Es ist bereits einige Zeit bekannt, dass subkutane Injektionen von Extrakten der oben erwähnten, als Allergene oder Antigene wirkenden Substanzen eine Milderung allergischer Reaktionen bewirken. Der exakte physiologische Mechanismus dieser Behandlung, die als Hyposensibilisierung bezeichnet wird, wurde bisher nicht vollständig oder zufriedenstellend erklärt. Es gibt jedoch verschiedene Theorien, welche eine Erklärung versuchen. Gemäss einer dieser Theorien wird die Bildung von sogenannten blokkierenden oder neutralisierenden Antikörpern angenommen, die durch Injektionen des Extraktes verursacht werden ; gemäss einer weiteren Theorie soll eine solche Behandlung die Bildung einer Bindung des Antigens (oder Allergens) an den Antikörper eher in der freien Zirkulation als in dem angegriffenen Gewebe erleichtern.
Bei der Herstellung von Allergene enthaltenden Extrakten wird gewöhnlich der Extrakt der organischen Substanz, welche den allergischen Zustand verursacht, einfach mit einer physiologisch annehmbaren wässerigen Extraktionsflüssigkeit, z. B. einer Salzlösung oder einer leicht alkalischen Salzlösung, extrahiert. Nach Abtrennung der Extraktionsflüssigkeit von dem Rückstand wird die den Wirkstoff enthaltende Lösung sterilisiert und ist dann nach entsprechender Verdünnung als solche direkt verwendbar. Die physiologisch annehmbare Extraktionsflüssigkeit soll die strukturelle Gesamtheit des Antigenmoleküls bewahren.
Vor kurzem wurde ein Verfahren beschrieben, das einen vollständigeren und wirksameren Extrakt ergibt. Dieses Verfahren ist in den USA-Patentschriften Nr. 3, 148,] 21 und Nr. 3, 148, 122 beschrieben ; es besteht kurz zusammengefasst darin, dass eine überhaupt nicht entfettete, als Allergen wirkende Substanz mit einem wässerigen heterocyclischen tertiären Amin extrahiert, die flüssige, die Wirkstoffe enthaltende Phase von dem Rückstand getrennt, der Rückstand entfernt und hierauf zu dem Extrakt zwecks Abtrennung des heterocyclischen tertiären Amins von den Wirkstoffen, Wasser und eine Alaunlösung hinzugefügt wird, wobei die Wirkstoffe ausgefällt werden.
Der Niederschlag wird mehrere Male mit Wasser gewaschen, um das gesamte heterocyclische tertiäre Amin sowie den überschüssigen Alaun zu entfernen, und sodann in einem physiologisch annehmbaren Träger, z. B. einer Phosphatpufferlö-
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sung, wieder suspendiert.
Es wurde zunächst angenommen, dass die Verwendung des heterocyclischen tertiären Amins bei diesem Verfahren zu einem vollständigeren, die Allergene enthaltenden Extrakt führt, da in dem Extrakt neben den aminlöslichen Bestandteilen auch die wasserlöslichen Proteine und Kohlehydrate enthaltenden Fraktionen vorliegen. Derzeit wird jedoch angenommen, dass das reaktionsfreudige heterocyclische tertiäre Amin eine Änderung der Struktur des Antigenmoleküle bewirken kann, wobei ein Extrakt erhalten wird, der wirksam und verhältnismässig frei von Nebenreaktionen ist.
Diese mit heterocyclischen tertiären Aminen extrahierten und mit Alaun ausgefällten Extrakte (sie sollen weiter unten als PEAP-Extrakte bezeichnet werden, da bei diesem Verfahren Pyridin das bevorzugt verwendete heterocyclische tertiäre Amin ist) sind wirksam und haben viele Vorteile ; es erwies sich jedoch, dass sie auch gewisse Nachteile aufweisen. So wurde gefunden, dass solche Extrakte für Hauttests nicht verwendbar sind, was nachteilig ist, da Fachleute es vorziehen, den gleichen Extrakt für die Diagnose und für die Behandlung zu verwenden. Hiedurch wird gewährleistet, dass bei der Behandlung das Antigen verwendet wird, von dem festgestellt wurde, dass es die allergische Hautreaktion bedingt.
Die begrenzte Anwendbarkeit von PEAP-Extrakten wird darauf zurückgeführt, dass der Niederschlag unlöslich ist und/oder das mit dem heterocyclischen tertiären Amin extrahierte Antigen mit dem bei der Ausfällung des Antigens aus der Extraktionsflüssigkeit verwendeten Alaun einen Komplex bildet.
Hinzu kommt, dass die bei Herstellung von PEAP-Antigenen verwendeten Verfahren eher langwierig sind und die Ausbeute zu wünschen übrig lässt ; sie liegt im Bereich von ungefähr 50'%o, bezogen auf die ursprünglich extrahierten Protein-Stickstoff-Einheiten.
Erfindungsgemäss soll ein Extrakt geschaffen werden, der vielseitiger anwendbar und wirksamer sein
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zum Überprüfen von Überempfindlichkeit als auch zur längeren Behandlung verwendbar sein ; bei den erfindungsgemässen Extraktionsverfahren soll ein wässeriges organisches Lösungsmittelsystem vorgesehen werden, mittels welchem im wesentlichen das ganze antigene Material bei dessen Aufarbeitung isoliert wird.
Es sei darauf hingewiesen, dass gemäss dem herkömmlichen PEAP-Verfahren die Ausfällung mit dem Alaun ein wesentlicher Teil des Extraktionsverfahrens ist, da diese Verfahrensstufe erforderlich ist, um die Wirkstoffe von der das physiologisch unerwünschte heterocyclische tertiäre Amin enthaltenden Extraktionsflüssigkeit abzutrennen.
Es wurde nunmehr unerwarteterweise festgestellt, dass diese gemäss dem PEAP-Verfahren bisher als unerlässlich gehaltene Verfahrensstufe, nämlich die Ausfällung des Antigens aus dem wässerigen heterocyclischen tertiären Amin unter Verwendung von Alaun, zur Gänze weggelassen werden kann, wenn die Wirkstoffe von der Extraktionsflüssigkeit durch ein Verflüchtigungsverfahren abgetrennt werden, bevor diese Wirkstoffe zu Dosierungseinheiten verarbeitet werden.
Da als Allergene wirkende Substanzen äusserst labile organische Substanzen sind, hat man bisher angenommen, dass ein Verflüchtigungsverfahren zur Isolierung von Allergenen nicht anwendbar ist, und ist es überraschend, dass die Abtrennung der Allergene aus der Extraktionsflüssigkeit entsprechend dem erfindungsgemässen Verfahren durch einen Verflüchtigungsvorgang möglich ist.
Die Erfindung betrifft demnach ein Verfahren zur Herstellung eines Extraktes einer Substanz, die eine Allergie bewirken kann und die physiologisch wirksame Materialien enthält, vorzugsweise inhalierbare Substanzen aus Pollen, Haushaltsstaub, Epithelien, Pilzen, Insektenmaterialien, Saaten oder Federn, wobei von einem Verfahren ausgegangen wird, nach welchem die Substanz mit einer Extraktionsflüssigkeit, die Wasser und ein einen basischen Stickstoff aufweisendes organisches Lösungsmittel, insbesondere ein heterocyclisches tertiäres Amin, wie z. B. Pyridin enthält, vermischt, die Extraktionsflüssigkeit von dem ganzen unlöslichen Material befreit und gegebenenfalls sterilisiert, sowie das unlösliche Material verworfen wird.
Das Verfahren gemäss der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass Jie Extraktionsflüssigkeit verflüchtigt wird und die Allergene in Form eines trockenen stabilen, das Allergen enthaltenden Pulvers isoliert werden und allenfalls das trockene Pulver den jeweiligen Erforiernissen entsprechend weiterbehandelt wird.
Das Verfahren gemäss der Erfindung ist auf alle Allergene enthaltenden Substanzen anwendbar, nämlich solche natürlichen Ursprungs und solche, die synthetisch erhältlich sind. Zu solchen Substanzen wählen Staub, wie z. B. der Staub in Wohnungen sowie der in Staubsaugern gesammelte und auch der in ''abriken vorliegende Staub, z. B. Sägestaub ; Epithelien, z. B. solche von Katzen, Hunden, Pferden
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und Kaninchen ; Federn, z. B. solche von Gänsen und Hühnern : Saaten, z. B. Baumwollsaaten und
Kapok, Insekten sowie Aussonderungen von Insekten, z. B. Bienen, Hornissen und Moskitos ; Pollen von
Bäumen, Gräsern und Pflanzen bzw. Unkraut, z.
B. von Jakobskreuzkraut, Gräsern, in Obstgärten,
Ahornbäumen und Pappen; Pilze, z. B. Aspergillus Niger und Alternaria ; komplexe synthetische Chemi- kalien, z. B. Antibiotika u. dgl.
Mit Bezug auf die Extraktionsflüssigkeit, mittels welcher die Wirkstoffe oder die die Allergene ent- haltenden Substanzen löslich gemacht und von dem unwirksamen Rückstand entfernt werden, wurde fest- gestellt, dass sich für den erfindungsgemässen Zweck am besten eine aus einer Mischung einer wässerigen
Phase mit einer organischenLösungsmittelphase bestehende Flüssigkeit eignet. Die letztere Komponente der Extraktionsflüssigkeitsoll ein einen basischen Stickstoff aufweisendes Lösungsmittel enthalten, dessen
Siedepunkt so nieder liegt, dass die Verflüchtigung des Lösungsmittels ohne Zerstörung der Struktur des behandelten Allergens erfolgen kann.
Im allgemeinen soll das organische Lösungsmittel einen Siede- punkt von unter ungefähr 1200C aufweisen, ausser es wird bei dem angewendeten Verflüchtigungsver- fahren das Allergen nur einen kurzen Augenblick einer höheren Temperatur ausgesetzt, wie z. B. beim
Sprühtrocknen. Vorzugsweise soll der das organische Lösungsmittel enthaltende Teil der Extraktions- flüssigkeit ein Amin enthalten, insbesondere ein heterocyclisches, tertiäres Amin, z. B. Pyridin, Pyri- dinderivate, wie z. B. Lutidin, Chinolin, Kollidin, Picolin u. dgl. Von Vorteil ist, wenn das verwen- dete organische Lösungsmittel mit Wasser mischbar ist.
Die chemische Wirkung des organischen Lösungsmittels auf das Antigenmolekül oder die Struktur desselben ist nicht genau bekannt ; es wird jedoch angenommen, dass die stark polare oder basische Na- tur der oben genannten Lösungsmittel bewirken könnte, dass diese mit dem Antigen eine Verbindung bilden oder die komplexe molekulare Struktur des Proteins, des Kohlehydrates, des Lipoproteins oder Polypeptids, welches die Basis der Allergenwirkung der betreffenden Substanz ist, in irgendeiner Weise ändern.
Die zweite Komponente der Extraktionsflüssigkeit, d. i. die wässerige Phase, kann einfaches destilliertes Wasser oder vorzugsweise eine Salz-und/oder alkalische wässerige Lösung sein. Natriumbikarbonat, Natriumchlorid, Natriumhydroxyd, Phosphatpuffer u. dgl., können zu diesem Zweck eingesetzt werden. Wenn Substanzen mit einer alkalischen Natur, wie z. B. ein heterocyclisches tertiäres Amin in der Extraktionsflüssigkeitverwendet werden, kann diese zweite wässerige Komponente auch aus einem Puffer bestehen, welcher den pH-Wert auf einen dem neutralen Wert näher gelegenen Wert bringt.
Der pH-Wert der Extraktionsflüssigkeit, die durch Vermischen der organischen mit der wässerigen Phase erhalten wird, kann zwischen 7,5 und 12 liegen und wird vorzugsweise zwischen 9 und 12 gehalten. Da verschiedenste, eine Allergie verursachende Substanzen erfindungsgemäss aufgearbeitet werden können, wird der pH-Wert der Extraktionsflüssigkeit und die Zusammensetzung derselben unterschiedlich sein.
Es ist z. B. bekannt, dass Pollen von Jakobskreuzkraut einen hohen Gehalt an toxischem Fett aufweisen, von dem angenommen wird, dass es zu der Allergiewirkung dieser Substanz beträchtlich beiträgt. Bei der Extraktion dieser Pollen kann es erwünscht sein, das Verhältnis von organischer Lösungsmittelphase zur wässerigen Phase zu erhöhen, um die Löslichkeit des gesamten Fettmaterials zu gewährleisten. Es wurde jedoch gefunden, dass ungefähr gleiche Anteile von organischer Lösungsmittelphase und wässeriger Phase eine Extraktionsflüssigkeit mit einem weiten Anwendungsgebiet ergeben.
Das Extraktionsverfahren besteht gewöhnlich aus dem Vermischen der die Allergie bewirkenden Substanz nach physikalischer Entfernung der verunreinigenden Fremdkomponenten mit der Extraktionsflüssigkeit, wonach die Mischung bei ungefähr 20 bis 250C bis zu ungefähr 11 Tagen entweder mit oder ohne Rühren stehen gelassen wird. Der Rückstand wird dann von der flüssigen Phase abgetrennt, welche zu diesem Zeitpunkt die behandelten und löslich gemachten Wirkstoffe enthält, indem der unlösliche Rückstand sich absetzen gelassen und die Mischung zentrifugiert wird oder aber mit Hilfe eines Filtrierverfahrens, z. B. mittels Filtrieren im Vakuum.
Die nach Entfernung des Rückstandes erhaltene flüssige Phase ist eine klare, oft etwas gelblich oder grünlich gefärbte Lösung des Reaktionsproduktes der aus einem organischen Lösungsmittel bestehenden wässerigen Extraktionsflüssigkeit und dem Antigen.
Bei diesem Verfahrensschritt weicht die Erfindung von dem bekannten PEAP-Verfahren ab, nach welchem Kalium-Aluminiumsulfat (Alaun) zu dem Niederschlag hinzugefügt wird, wonach die antigenen oder wirksamen, die Allergie bewirkenden Stoffe von der physiologisch nicht annehmbaren Extraktionsflüssigkeit getrennt werden. Die Abweichung des Verfahrens gemäss der Erfindung von dem herkömmlichen PEAP-Verfahren besteht in der Isolierung der Wirkstoffe von der Extraktionsflüssigkeit durch ein Verflüchtigungsverfahren, indem nämlich die flüssige Phase einem physikalischen Zustand unterworfen wird, bei welchem die flüssige Phase in eine gasförmige Phase übergeht, und die nicht-
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flüchtigen Stoffe durch Diffusion oder Entfernung der gasförmigen Phase von diesen Wirkstoffen isoliert werden.
Dieser wichtige Verfahrensvorgang der Verflüchtigung kann nach beliebigen Verfahren vorgenom- men werden, nach welchen ein Lösungsmittelsystem von einer in diesem gelösten Substanz getrennt wird. Solche Verfahren sind z. B. das Gefriertrocknen, Sprühtrocknen, Vakuumtrocknen, die Verwen- dung einer rotierenden Vakuumtrocknungsvorrichtung u. dgl. Die Temperaturen, bei welchen während dieser Verfahrensstufe gearbeitet wird, können ausgehend von der Minimaltemperatur, die zur Ver- flüchtigung der Extraktionsflüssigkeit bei dem angewendeten Druck erforderlich ist, bis zu ungefähr
850C betragen. Letzteres ist die Temperatur, die beim Sprühtrocknen verwendet wird, wobei das ther- molabile Antigen nur einen kurzen Augenblick hindurch einer solchen extremen Temperatur ausgesetzt wird.
Der bei der Verflüchtigung angewendete Druck hängt gleichfalls von dem jeweils angewendeten
Verfahren ab und kann zwischen einem etwas über dem atmosphärischen Druck gelegenen Druck und einem Druck von nur ungefähr 30 mm Hg liegen, d. i. ein Druck, bei dem während des Gefriertrocknens gearbeitet wird.
Es wurde auch festgestellt, dass es zur Entfernung der letzten Spuren der wässerigen organischen
Extraktionsflüssigkeit erwünscht ist, das nach der Verflüchtigung erhaltene, im wesentlichen trockene
Antigen ungefähr 24 h in einem Vakuumexsikkator zu halten, u. zw. bei Raumtemperatur oder bei un- gefähr 450C.
Nach diesem Verfahren wird eine trockene, das Allergen oder Antigen enthaltende Substanz erhalten, die mit der sehr reaktionsfreudigen Extraktionsflüssigkeit behandelt worden war und die im wesentlichen alle wirkenden Stoffe der ursprünglichen Substanz enthält, und die, wie weiter unten noch näher ausgeführt werden soll, einen sehr vielseitig verwendbaren Antigenextrakt darstellt. Es sei auch darauf hingewiesen, dass bei diesem Verfahren praktisch kein wirksames Material verlorengeht, wogegen bei der herkömmlichen Ausfällung mit Alaun aus einem wässerigen organischen Extrakt ein wesentlicher Teil des extrahierten Proteinstickstoffes verlorengeht. Daher werden erfindungsgemäss die Ausbeute und die Vollständigkeit der Extraktion sehr beträchtlich erhöht.
Es sei auch bemerkt, dass das erfindungsgemässe Verfahren in keiner Weise auf die Anwendung mit einer komplexen, in der Natur vorkommenden Mischung von Antigenen beschränkt ist, sondern vielmehr auch mit einem Extrakt angewendet werden kann, der einem Verfahren unterworfen worden war, bei welchem Antigenfraktionen vor der Behandlung mit der Extraktionsflüssigkeit und/oder vor der Verflüchtigung abgetrennt wurden.
Bei dieser Verfahrensstufe kann der trockene Extrakt weiter verarbeitet werden, um einen das Allergen enthaltenden Extrakt in einer der verschiedenen, bei der Verwendung von Allergenextrakten bekannten Formen vorzusehen. So kann das Pulver einfach mit einem physiologisch annehmbaren Lösungsmittelsystem wieder in Lösung gebracht werden, und sodann sowohl als Extrakt für einen diagnostischen Hauttest als auch als Extrakt zur Behandlung von Allergien verwendet werden. Solche physiologisch annehmbare Flüssigkeiten sind gepufferte Salzlösungen, die Evan-Lösung, die Coca-Lösung, welche Natriumdikarbonat, Natriumchlorid und Phenol enthält, sowie eine glycerinhaltige Salzlösung oder Stier- - Lösung, Dextrose oder Ungar-Lösung, phosphatgepufferte Lösungen u. dgl.
Diese Lösungen haben gewöhnlich einen pH-Wert von ungefähr 7, der jedoch auch bis zu 7,5 betragen kann.
Eine zweite Ausführungsweise zur weiteren Verarbeitung des aus einem trockenen Pulver bestehenden Extraktes kann darin bestehen, dass derselbe mit einer wässerigen Lösung behandelt wird, wonach eine Aluminiumverbindung, z. B. Kaliumalaun oder Aluminiumhydroxyd zugesetzt wird, um das Antigen unlöslich zu machen, und eine therapeutische Dosierungseinheit mit verzögerter Abgabe herzustellen.
Es wurde hiebei überraschenderweise festgestellt, dass der unlöslich gemachte Niederschlag oder das Adsorptionsprodukt bei Verwendung eines erfindungsgemässen, nach Extraktion mit einem wässerig organischen Lösungsmittelsystem erhaltenen, trockenen und dann wieder in Lösung gebrachten Extraktes den in herkömmlicher Weise mit Alaun aus entfettete, nur mit Wasser extrahierten Lösungen ausgefällten Antigenen weit überlegen ist. Die in herkömmlicher Weise erhaltenen Präparate sind gelatinös und pharmazeutisch nicht annehmbar, wogegen die nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltenen Präparate aus einzelnen Teilchen bestehende, homogene Suspensionen darstellen und pharmazeutisch gesehen sehr gut aussehen.
Wesentlich ist auch die unerwartete Feststellung, dass die Ausbeute an Niederschlag, der aus dem wieder in Lösung gebrachten Extrakt nach Zusatz einer Aluminiumverbindung erhalten wird, bedeutend grösser ist als die bei Verwendung des herkömmlichen PEAP-Verfahrens erhaltene Ausbeute. So wurden z. B. bei Verwendung des herkömmlichen PEAP-Verfahrens Ausbeuten von 40 bis 50% erhalten, wo-
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gegen, wenn erfindungsgemäss gearbeitet worden war, die Ausbeuten bei 80 bis 9010 lagen. Diese Aus- beuten sind auf Basis von Vergleichen des Proteinstickstoffes der Extraktionsflüssigkeit mit dem Protein- stickstoff in dem unlöslich gemachten Niederschlag oder Adsorptionsprodukt berechnet.
Bei diesem Verfahrensvorgang des Unlöslichmachens kann eine stöchiometrische Aluminiummenge i angewendet werden, wobei die Suspension auf die gewünschte Stärke durch Zusatz von wässeriger
Flüssigkeit gebracht wird, oder aber es kann eine Aluminiumverbindung zugesetzt und das Nieder- schlags-oder Adsorptionsprodukt von der überstehenden Flüssigkeit getrennt, gewaschen und in einer physiologisch annehmbaren wässerigen Flüssigkeit wieder suspendiert werden.
Um zu gewährleisten, dass der das Allergen enthaltende Extrakt steril ist, wird gewöhnlich eine Lösung, die einen thermolabilen Antigenextrakt enthält, durch ein Bakterien-Filter, das sogenannte
Seitz-Filter, oder durch ein Mikropor- oder Millipore-Filter oder ein Membranfilter filtriert.
Solche Verfahrensweisen sind bekannt und in verschiedenen Literaturstellen beschrieben. Bei der
Erfindung kann eine solche Sterilisierung in einer flüssigen Phase erreicht werden, wenn das Antigen in
Lösung ist. So kann z. B. entweder der ursprüngliche, wässerig-organische Lösungsmittelextrakt oder der wieder in Lösung gebrachte Extrakt durch Filtrieren sterilisiert werden. Selbstverständlich kann auch eine Sprühtrocknung eine Sterilisierung des erhaltenen getrockneten Produktes bewirken, wonach sich ein Filtrieren erübrigt.
Die Verwendungsart erfindungsgemäss erhaltener Präparate ist bekannt und fällt in zwei Gruppen, d. i. erstens die zum Hauttest verwendeten, sogenannten diagnostischen Extrakte und zweitens die Be- handlungsextrakte oder therapeutischen Extrakte. Die ersteren Extrakte sind meist wässerige Extrakte ; sie werden verwendet, indem ein Tropfen des bestimmten Extraktes auf die Haut der Person oder des
Tieres, die bzw. das untersucht werden soll, aufgebracht und die Oberfläche der Haut unter dem Ex- trakt aufgekratzt wird. Wenn nach einer verhältnismässig kurzen Zeit die Haut aufbricht oder Striemen oder Quaddeln entstehen, ist dies ein Zeichen dafür, dass die betreffende Person oder das betreffende
Tier mit Bezug auf das bei diesem Versuch verwendete Antigen allergisch ist.
Eine andere Unter- suchungsmethode besteht in der intrakutaneninjektion des Extraktes und der nachfolgenden Beobachtung einer allfälligen Striemen-oder Quaddelbildung. Es können auch Bindehaut- sowie Riech- und Inhala- tionstests mit dem nach der ursprünglichen Extraktion erhaltenen trockenen Pulver ausgeführt werden ; die
Ergebnisse dieser Versuche sollen mehr aufzeigen und eindeutiger sein als die Hauptversuche.
Die zweite Kategorie der Extrakte, die Behandlungsextrakte oder therapeutischen Extrakte, können z. B. wässerige mit Aluminium ausgefällte Extrakte sein. Die Verwendung solcher Behandlungsextrakte besteht in der subkutanen Injektion einer sehr verdünnten Lösung des Antigens und nachfolgenden täglich oder wöchentlich verabreichten Injektionen mit allmählich ansteigender Konzentration. Auf Grund der sehr unterschiedlichen Empfindlichkeitsgrade verschiedener Personen und der verschiedenen Abgabe- merkmale der therapeutischen Formen des Antigens wird die jeweilige Behandlungsweise von dem Arzt für jeden Fall separat bestimmt.
Mit Bezug auf die Dosierung oder die Stärke des Extraktes können die erfindungsgemäss erhaltenen
Produkte je nach der ursprünglichen Stärke des Extraktes und der gewünschten Stärke des Endextraktes konzentriert oder verdünnt werden. Die gebräuchlichste, wenn auch nicht unbedingt zufriedenstellende
Weise zur Standardisierung des Extraktes ist die Analyse der Lösung hinsichtlich der Proteinstickstoffein- heiten. Der Mangel dieses Verfahrens besteht offensichtlich darin, dass alle antigenen Fraktionen des
Extraktes nicht notwendigerweise eiweisshaltig sein müssen, sondern auch aus Kohlehydraten, Fetten oder andern nicht stickstoffhaltigen Molekülen bestehen können.
Die Stärke von Extrakten wird gewöhnlich auf ungefähr 10 bis ungefähr 5000 PNU (Proteinstickstoffeinheiten) je nach Antigeneigenschaften mit
Bezug auf den Proteinstickstoff eingestellt. Behandlungsextrakte werden gewöhnlich auf ungefähr 10 PNU bis ungefähr 20000 PNU eingestellt, wobei die weniger starken Extrakte bei Beginn der Hyposensibili- sierungstherapie und die stärkeren Extrakte bei den später in grösseren Intervallen vorgenommenen In- jektionen verwendet werden.
Die Erfindung soll an Hand von Beispielen ohne Einschränkung auf dieselben näher erläutert werden.
B Beispiel l : Herstellung des trockenen Pulverextraktes.
Es wurde eine Extraktionsflüssigkeit, bestehend aus einer Mischung von 250 ml Pyridin und 250 ml
0, 1 n-Natriumhydroxyd hergestellt, wonach 50 g einer Mischung von Pollen eines niederen und eines hohen Jakobskreuzkrauts zugesetzt wurden. Das so erhaltene Gemisch wurde 5 Tage bei Raumtempera- tur unter gelegentlichem Rühren stehen gelassen. Die die Wirkstoffe der Pollen enthaltende klare, überstehende flüssige Phase wurde abdekantiert, wonach der Rückstand verworfen wurde.
Die überstehende Flüssigkeit wurde in einen rotierenden, mit einem Kühler versehenen Vakuum-
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verdampfer eingebrachtund in diesem auf 500C erhitzt, bis die flüssige Phase entfernt war. Es wurde auf diese Weise ein im wesentlichen trockenes bräunliches Pulver erhalten, das in einen Vakuumexsikkator gebracht und unter Vakuum über Nacht stehen gelassen wurde, wonach ein frei fliessendes Pulver, das keinerlei Spuren von Lösungsmittel enthielt, zurückblieb.
) Beispiel 2 : Herstellung eines diagnostischen Extraktes.
Eine Lösungvon ausjakobskreuzkrautpollenbestehendem Anti gen mit einem Gehalt von 10000 PNU/ml wurde durch Zusatz von 393, 2 mg des nachBeispiell erhaltenen getrockneten Pulvers zu 100 ml destil- liertem Wasser bei 500C hergestellt. Der pH-Wert der erhaltenen Lösung lag bei 7, 4. Die Lösung wurde, um sie steril zu machen, filtriert. Das Filtrat wurde analysiert, wobei festgestellt wurde, dass es ) 9100 PNU/ml an Jakobskreuzkrautantigen enthielt.
Die obige Lösung wurde mit destilliertem Wasser unter sterilen Bedingungen auf 1000 PNU/ml ver- dünnt, wonach intradermale (intrakutane) Versuche mit vier Individuen gemacht wurden, von denen bekannt war, dass sie auf Jakobskreuzkrautpollen klinisch empfindlich waren. Eine zweite Lösung von
5000 PNU/ml wurde hergestellt, und mit dieser mit zwei Individuen, von denen bekannt war, dass sie i normalerweise mit Bezug auf Jakobskreuzkrautpollen nicht allergisch waren, Versuche unternommen.
Die erhaltenen Resultate sind in Tabelle 1 aufgezeigt. Von den Patienten 1 bis 4 war bekannt, dass sie
Jakobskreuzkrautpollen gegenüber empfindlich waren, wogegen von den Patienten 5 und 6 bekannt war, dass sie solchen Pollen gegenüber nicht allergisch reagierten.
Die in Tabelle 1 enthaltenen Ergebnisse sollen zeigen, dass Lösungen, hergestellt aus erfindungs- gemäss erhaltenen trockenen Pulvern, unverminderte Aktivität aufweisen und für die Diagnose von aller- gischen Reaktionen durch Hauttests gut verwendbar sind.
Tabelle 1 :
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<tb>
<tb> * <SEP> Empfindlichkei <SEP> t <SEP> gegenüber
<tb> Patient <SEP> 1000 <SEP> PNU/ml <SEP> 5000 <SEP> PNU/ml
<tb> 1 <SEP> 2+
<tb> 2 <SEP> 2+
<tb> 3 <SEP> 3+
<tb> 4 <SEP> 2+
<tb> 5 <SEP> 0
<tb> 6 <SEP> 0
<tb>
. 0 negative Reaktion - keine Striemen
1 + geringe Reaktion, 5 mm Striemen mit Erythem
2 + mässige Reaktion, 10 mm Striemen mit Erythem
3 + ausgeprägte Reaktion, 15 mm Striemen mit Erythem und mögliches Pseudopium und Jucken
4 + ausgeprägte Reaktion, 20 mm Striemen mit Erythem,
Pseudopia, Jucken und Schmerzen.
Beispiel 3 : Es wurde gemäss Beispiel 1 ein trockener Pulverextrakt von Jakobskreuzkrautpollen hergestellt. Bei Auflösung in destilliertem Wasser und sterilen Bedingungen und Verdünnen auf die gewünschte Stärke konnte dieser Extrakt zur Behandlung von Überempfindlichkeit bei gegenüber Jakobskreuzkrautpollen allergischen Personen sowie auch zur Diagnose von Allergien mittels Hauttests verwendet werden.
Beispiele 4 bis 9 : Es wurde, wie in den Beispielen 1 bis 3 verfahren, wobei jedoch an Stelle von Jakobskreuzkrautpollen Haushaltsstaub, Pferdekot, Hühnerfedern, Stechinsekten, Timotheusgras und Birkenpollen eingesetzt wurden. Solche Extrakte werden für die Diagnose von allergischen Reaktionen durch Hauttests oder für die Therapie von Allergien verwendet. Die trockenen Pulver können auch für die Diagnose von allergischen Reaktionen mittels Bindehaut- oder durch Riechversuche verwendet werden.
Beispiel 10 : Zu ungefähr 100 ml eines nach Beispiel 3 erhaltenen, mit verdünnter Schwefelsäure auf einen PH-Wert von ungefähr 6, 2 eingestellten Extraktes wurden ungefähr 50 ml einer sterilen 2 gew. -%igen Lösung von Kalium-Aluminiumsulfat langsam unter fortwährendem Rühren hinzu-
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gefügt. Der so erhaltene Niederschlag wurde von der überstehenden Flüssigkeit durch Zentrifugieren entfernt, mit destillierter Salzlösung gewaschen und in einem Phosphatpuffer mit einem PH von ungefähr 7, 0 wieder suspendiert. Die Ausbeute betrug 80%. Diese Suspension ist als Extrakt zur Behandlung von Überempfindlichkeit mit verzögerter Wirkung verwendbar.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung eines Extraktes einer Substanz, die eine Allergie bewirken kann und die physiologisch wirksame Materialien enthält, vorzugsweise inhalierbare Substanzen aus Pollen, Haushaltstaub, Epithelien, Pilzen, Insektenmaterialien, Saaten oder Federn, wobei die Substanz mit einer Extraktionsflüssigkeit, die Wasser und ein einen basischen Stickstoff aufweisendes organisches Lösungsmittel, insbesondere ein heterocyclisches tertiäres Amin wie z. B.
Pyridin enthält, vermischt, die Extraktionsflüssigkeit von dem ganzen unlöslichen Material befreit und gegebenenfalls sterilisiert, sowie
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keit verflüchtigt wird und die Allergene in Form eines trockenen stabilen, das Allergen enthaltenden Pulvers isoliert werden und allenfalls das trockene Pulver den jeweiligen Erfordernissen entsprechend weiterbehandelt wird.
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Process for the preparation of an extract containing an allergen
It has long been known that people show allergic reactions after contact and in particular after inhalation of certain naturally occurring or synthetically obtained organic particles or substances, such as e.g. B. Niessen, activation of mucus-producing cells (goblet cells), local edema, skin cracks or vasodilation. These reactions are commonly referred to as "hay fever"; Although such an allergic reaction does not usually have serious consequences in itself, it can lead to complications both physiological and psychological in nature.
In a toddler, a constant allergic condition often causes permanent deformations of the body and, in particular, changes in facial features, with psychological effects usually inevitable. Asthmatic conditions are also closely linked to allergic reactions and can also lead to serious complications. Medical science currently recognizes "hay fever" as a serious disease that must be treated with care and thoroughness.
It has been known for some time that subcutaneous injections of extracts of the above-mentioned substances that act as allergens or antigens bring about a reduction in allergic reactions. The exact physiological mechanism of this treatment, called desensitization, has not yet been fully or satisfactorily explained. However, there are various theories which attempt to explain it. According to one of these theories, the formation of so-called blocking or neutralizing antibodies caused by injections of the extract is assumed; According to another theory, such treatment should facilitate the formation of binding of the antigen (or allergen) to the antibody in the free circulation rather than in the affected tissue.
In the preparation of extracts containing allergens, the extract of the organic substance causing the allergic condition is usually simply mixed with a physiologically acceptable aqueous extraction liquid, e.g. B. a salt solution or a slightly alkaline salt solution extracted. After the extraction liquid has been separated from the residue, the solution containing the active ingredient is sterilized and, after appropriate dilution, can then be used as such directly. The physiologically acceptable extraction liquid is intended to preserve the structural integrity of the antigen molecule.
Recently, a process has been described which gives a more complete and effective extract. This method is described in U.S. Patent Nos. 3, 148,] 21 and No. 3, 148, 122; In short, it consists in extracting a substance that is not defatted at all and acting as an allergen with an aqueous heterocyclic tertiary amine, separating the liquid phase containing the active ingredients from the residue, removing the residue and then adding it to the extract for the purpose of separating off the heterocyclic tertiary amine of the active ingredients, water and an alum solution is added, whereby the active ingredients are precipitated.
The precipitate is washed several times with water to remove all of the heterocyclic tertiary amine and excess alum and then stored in a physiologically acceptable carrier, e.g. B. a phosphate buffer solution
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sung, suspended again.
It was initially assumed that the use of the heterocyclic tertiary amine in this process leads to a more complete extract containing the allergens, since the fractions containing the water-soluble proteins and carbohydrates are also present in the extract in addition to the amine-soluble components. However, it is currently believed that the reactive heterocyclic tertiary amine can cause a change in the structure of the antigen molecule, with an extract being obtained which is effective and relatively free from side reactions.
These extracts extracted with heterocyclic tertiary amines and precipitated with alum (they shall be referred to below as PEAP extracts since pyridine is the preferred heterocyclic tertiary amine used in this process) are effective and have many advantages; however, they also turned out to have certain disadvantages. It has thus been found that such extracts cannot be used for skin tests, which is disadvantageous since those skilled in the art prefer to use the same extract for diagnosis and for treatment. This ensures that the treatment used is the antigen that has been found to cause the allergic skin reaction.
The limited applicability of PEAP extracts is attributed to the fact that the precipitate is insoluble and / or the antigen extracted with the heterocyclic tertiary amine forms a complex with the alum used in the precipitation of the antigen from the extraction liquid.
In addition, the processes used in the production of PEAP antigens are rather lengthy and the yield leaves something to be desired; it is in the range of approximately 50%, based on the originally extracted protein nitrogen units.
According to the invention, an extract is to be created which is more versatile and more effective
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be useful for checking hypersensitivity as well as for longer treatment; In the extraction process according to the invention, an aqueous organic solvent system is to be provided, by means of which essentially all of the antigenic material is isolated during its processing.
It should be noted that according to the conventional PEAP process, precipitation with the alum is an essential part of the extraction process, since this process step is necessary in order to separate the active ingredients from the extraction liquid containing the physiologically undesirable heterocyclic tertiary amine.
It has now been found, unexpectedly, that this process step, previously considered essential according to the PEAP process, namely the precipitation of the antigen from the aqueous heterocyclic tertiary amine using alum, can be completely omitted if the active ingredients are removed from the extraction liquid by a volatilization process be separated before these active ingredients are processed into dosage units.
Since substances acting as allergens are extremely unstable organic substances, it has been assumed up to now that a volatilization process for the isolation of allergens cannot be used, and it is surprising that the separation of the allergens from the extraction liquid according to the process according to the invention is possible by a volatilization process.
The invention accordingly relates to a method for producing an extract of a substance which can cause an allergy and which contains physiologically active materials, preferably inhalable substances from pollen, household dust, epithelia, fungi, insect materials, seeds or feathers, a method being assumed after which the substance with an extraction liquid, the water and a basic nitrogen containing organic solvent, in particular a heterocyclic tertiary amine, such as. B. pyridine, mixed, the extraction liquid freed from all the insoluble material and, if necessary, sterilized, and the insoluble material is discarded.
The method according to the invention is characterized in that the extraction liquid is volatilized and the allergens are isolated in the form of a dry, stable powder containing the allergen and, if necessary, the dry powder is further treated in accordance with the respective requirements.
The method according to the invention can be applied to all allergens containing substances, namely those of natural origin and those that are synthetically obtainable. For such substances choose dust, such as B. the dust in apartments as well as the dust collected in vacuum cleaners and also the dust present in '' abriken, z. B. sawdust; Epithelia, e.g. B. those of cats, dogs, horses
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and rabbits; Springs, e.g. B. those of geese and chickens: seeds, z. B. Cottonseed and
Kapok, insects and secretions from insects, e.g. B. bees, hornets and mosquitoes; Pollen from
Trees, grasses and plants or weeds, e.g.
B. of ragwort, grasses, in orchards,
Maple trees and cardboard; Mushrooms, e.g. B. Aspergillus Niger and Alternaria; complex synthetic chemicals, e.g. B. antibiotics u. like
With regard to the extraction liquid, by means of which the active ingredients or the substances containing the allergens are made soluble and removed from the inactive residue, it was found that, for the purpose according to the invention, a mixture of an aqueous
Liquid consisting of an organic solvent phase. The latter component of the extraction liquid should contain a basic nitrogen-containing solvent, its
Boiling point is so low that the solvent can evaporate without destroying the structure of the treated allergen.
In general, the organic solvent should have a boiling point below approximately 1200C, unless the evaporation process used is only a brief moment in which the allergen is exposed to a higher temperature, e.g. B. at
Spray drying. The part of the extraction liquid containing the organic solvent should preferably contain an amine, in particular a heterocyclic, tertiary amine, e.g. B. pyridine, pyridine derivatives, such as. B. lutidine, quinoline, collidine, picoline and the like. The like. It is advantageous if the organic solvent used is miscible with water.
The chemical effect of the organic solvent on the antigen molecule or the structure of the same is not precisely known; however, it is believed that the strongly polar or basic nature of the above solvents could cause them to bond with the antigen or the complex molecular structure of the protein, carbohydrate, lipoprotein or polypeptide that is the basis of the allergenic action the substance in question is changing in some way.
The second component of the extraction liquid, i.e. i. the aqueous phase can be simple distilled water or, preferably, a salt and / or alkaline aqueous solution. Sodium bicarbonate, sodium chloride, sodium hydroxide, phosphate buffer and the like Like. Can be used for this purpose. When substances with an alkaline nature, such as. For example, if a heterocyclic tertiary amine is used in the extraction liquid, this second aqueous component can also consist of a buffer which brings the pH to a value closer to the neutral value.
The pH value of the extraction liquid, which is obtained by mixing the organic with the aqueous phase, can be between 7.5 and 12 and is preferably kept between 9 and 12. Since a wide variety of allergy-causing substances can be processed according to the invention, the pH of the extraction liquid and the composition thereof will be different.
It is Z. It is known, for example, that ragwort pollen has a high content of toxic fat, which is believed to contribute significantly to the allergy effects of this substance. When extracting these pollen, it may be desirable to increase the ratio of organic solvent phase to aqueous phase in order to ensure the solubility of the entire fatty material. However, it has been found that approximately equal proportions of organic solvent phase and aqueous phase result in an extraction liquid with a wide field of application.
The extraction process usually consists of mixing the allergenic substance, after physically removing the contaminating foreign components, with the extraction liquid, and then allowing the mixture to stand at about 20 ° to 250 ° C. for up to about 11 days, either with or without stirring. The residue is then separated from the liquid phase, which at this point contains the treated and solubilized active ingredients by allowing the insoluble residue to settle and centrifuging the mixture or by means of a filtering process, e.g. B. by vacuum filtration.
The liquid phase obtained after removal of the residue is a clear, often somewhat yellowish or greenish colored solution of the reaction product of the aqueous extraction liquid consisting of an organic solvent and the antigen.
In this process step, the invention deviates from the known PEAP process, according to which potassium aluminum sulfate (alum) is added to the precipitate, after which the antigenic or active substances causing the allergy are separated from the physiologically unacceptable extraction liquid. The deviation of the method according to the invention from the conventional PEAP method consists in the isolation of the active ingredients from the extraction liquid by a volatilization process, namely by subjecting the liquid phase to a physical state in which the liquid phase changes into a gaseous phase, and the Not-
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volatile substances can be isolated from these active substances by diffusion or removal of the gaseous phase.
This important process of volatilization can be carried out by any process according to which a solvent system is separated from a substance dissolved in it. Such methods are e.g. B. freeze drying, spray drying, vacuum drying, the use of a rotating vacuum drying device and the like. The temperatures at which work is carried out during this process stage can, starting from the minimum temperature which is required for volatilization of the extraction liquid at the pressure used, up to approximately
850C. The latter is the temperature used in spray drying, where the thermolabile antigen is only exposed to such an extreme temperature for a brief moment.
The pressure used for volatilization also depends on the one used
Procedure and can range from a pressure slightly above atmospheric to a pressure as low as about 30 mm Hg; i. a pressure at which to operate during freeze-drying.
It was also found that it removes the last traces of the aqueous organic
Extraction liquid is desired to be the essentially dry one obtained after volatilization
Keeping antigen in a vacuum desiccator for approximately 24 hours, u. between at room temperature or at around 450C.
According to this process, a dry substance containing the allergen or antigen is obtained which has been treated with the very reactive extraction liquid and which contains essentially all of the active substances of the original substance and which, as will be explained in more detail below, is very Versatile antigen extract represents. It should also be noted that practically no active material is lost in this process, whereas in the conventional precipitation with alum from an aqueous organic extract a substantial part of the extracted protein nitrogen is lost. Therefore, according to the invention, the yield and the completeness of the extraction are increased very considerably.
It should also be noted that the method according to the invention is in no way restricted to use with a complex, naturally occurring mixture of antigens, but rather can also be used with an extract that has been subjected to a process in which antigen fractions are present the treatment with the extraction liquid and / or prior to volatilization.
At this stage of the process, the dry extract can be further processed to provide an extract containing the allergen in one of the various forms known in the use of allergen extracts. Thus, the powder can easily be brought back into solution with a physiologically acceptable solvent system and then used both as an extract for a diagnostic skin test and as an extract for the treatment of allergies. Such physiologically acceptable fluids are buffered saline solutions, the Evan solution, the Coca solution, which contains sodium bicarbonate, sodium chloride and phenol, as well as a glycerol-containing saline or Taurus solution, dextrose or Ungar solution, phosphate buffered solutions and the like. like
These solutions usually have a pH of about 7, but can be up to 7.5.
A second embodiment for further processing the extract consisting of a dry powder can consist in treating the same with an aqueous solution, after which an aluminum compound, e.g. B. potassium alum or aluminum hydroxide is added to insolubilize the antigen and prepare a therapeutic dosage unit with sustained release.
It was surprisingly found that the insolubilized precipitate or the adsorption product when using a dry extract according to the invention obtained after extraction with an aqueous organic solvent system and then redissolved the conventionally degreased with alum from solutions extracted only with water is far superior to precipitated antigens. The preparations obtained in a conventional manner are gelatinous and pharmaceutically unacceptable, whereas the preparations obtained by the process according to the invention are homogeneous suspensions consisting of individual particles and look very good pharmaceutically.
Another important aspect is the unexpected finding that the yield of precipitate obtained from the extract brought back into solution after the addition of an aluminum compound is significantly greater than the yield obtained using the conventional PEAP process. So were z. B. when using the conventional PEAP process, yields of 40 to 50% are obtained, where-
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on the other hand, if the procedure was carried out according to the invention, the yields were 80 to 9010. These yields are calculated on the basis of comparisons of the protein nitrogen in the extraction liquid with the protein nitrogen in the insolubilized precipitate or adsorption product.
During this process of insolubilization, a stoichiometric amount of aluminum can be used, the suspension being increased to the desired strength by adding aqueous
Liquid is brought, or an aluminum compound can be added and the precipitate or adsorption product separated from the supernatant liquid, washed and resuspended in a physiologically acceptable aqueous liquid.
To ensure that the extract containing the allergen is sterile, a solution containing a thermolabile antigen extract is usually passed through a bacterial filter, the so-called
Seitz filter, or filtered through a Mikropor or Millipore filter or a membrane filter.
Such procedures are known and described in various literature references. In the
In accordance with the invention, such sterilization can be achieved in a liquid phase when the antigen is in
Solution is. So z. B. either the original, aqueous-organic solvent extract or the redissolved extract can be sterilized by filtration. Of course, spray drying can also effect sterilization of the dried product obtained, after which filtration is unnecessary.
The type of use of preparations obtained according to the invention is known and falls into two groups, d. i. firstly the so-called diagnostic extracts used for the skin test and secondly the treatment extracts or therapeutic extracts. The former extracts are mostly aqueous extracts; They are used by putting a drop of the particular extract on the person or the skin
Of the animal to be examined and the surface of the skin under the extract is scratched open. If, after a relatively short period of time, the skin breaks or welts or wheals appear, this is a sign that the person or the person concerned
Animal is allergic to the antigen used in this experiment.
Another examination method consists in the intracutaneous injection of the extract and the subsequent observation of any welts or wheals. Conjunctival, smell and inhalation tests can also be carried out with the dry powder obtained after the original extraction; the
The results of these tests should reveal more and be clearer than the main tests.
The second category of extracts, the treatment extracts or therapeutic extracts, can e.g. B. be aqueous extracts precipitated with aluminum. The use of such treatment extracts consists in the subcutaneous injection of a very dilute solution of the antigen and subsequent daily or weekly injections with gradually increasing concentrations. Due to the very different degrees of sensitivity of different people and the different release characteristics of the therapeutic forms of the antigen, the respective method of treatment is determined separately by the doctor for each case.
With regard to the dosage or the strength of the extract, the
Products can be concentrated or diluted depending on the original strength of the extract and the desired strength of the final extract. The most common, though not necessarily satisfactory
The way to standardize the extract is to analyze the solution with regard to the protein nitrogen units. The shortcoming of this procedure is obviously that all antigenic fractions of the
The extract does not necessarily have to contain protein, but can also consist of carbohydrates, fats or other non-nitrogenous molecules.
The strength of extracts is usually about 10 to about 5000 PNU (protein nitrogen units) depending on the antigenic properties
Adjusted for protein nitrogen. Treatment extracts are usually adjusted to about 10 PNU to about 20,000 PNU, with the less potent extracts being used at the start of desensitization therapy and the more potent extracts being used for later injections at longer intervals.
The invention is to be explained in more detail by means of examples without being restricted to the same.
B Example 1: Preparation of the dry powder extract.
It became an extraction liquid consisting of a mixture of 250 ml of pyridine and 250 ml
0, 1 n-sodium hydroxide prepared, after which 50 g of a mixture of pollen from a low and a high ragwort were added. The mixture thus obtained was left to stand for 5 days at room temperature with occasional stirring. The clear, supernatant liquid phase containing the active ingredients of the pollen was decanted off, after which the residue was discarded.
The supernatant liquid was placed in a rotating, condenser-equipped vacuum
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Introduced evaporator and heated in this to 500C until the liquid phase was removed. An essentially dry, brownish powder was obtained in this way, which was placed in a vacuum desiccator and left under vacuum overnight, after which a free flowing powder which did not contain any traces of solvent was left.
) Example 2: Production of a diagnostic extract.
A solution of antigen consisting of ragwort pollen with a content of 10,000 PNU / ml was prepared by adding 393.2 mg of the dried powder obtained according to the example to 100 ml of distilled water at 50 ° C. The pH of the resulting solution was 7.4. The solution was filtered to make it sterile. The filtrate was analyzed and found to contain 9,100 PNU / ml of Ragwort antigen.
The above solution was diluted to 1000 PNU / ml with distilled water under sterile conditions, after which intradermal (intracutaneous) tests were performed on four individuals known to be clinically sensitive to ragwort pollen. A second solution from
5000 PNU / ml was prepared and tested on two individuals known to be not normally allergic to ragwort pollen.
The results obtained are shown in Table 1. Patients 1 to 4 were known to have
Were sensitive to ragwort pollen, whereas patients 5 and 6 were known not to be allergic to such pollen.
The results contained in Table 1 are intended to show that solutions prepared from dry powders obtained according to the invention have undiminished activity and can be used for the diagnosis of allergic reactions by skin tests.
Table 1 :
EMI6.1
<tb>
<tb> * <SEP> Sensitivity <SEP> t <SEP> to
<tb> Patient <SEP> 1000 <SEP> PNU / ml <SEP> 5000 <SEP> PNU / ml
<tb> 1 <SEP> 2+
<tb> 2 <SEP> 2+
<tb> 3 <SEP> 3+
<tb> 4 <SEP> 2+
<tb> 5 <SEP> 0
<tb> 6 <SEP> 0
<tb>
. 0 negative reaction - no welts
1 + slight reaction, 5 mm welts with erythema
2 + moderate reaction, 10 mm welts with erythema
3+ pronounced reaction, 15 mm welts with erythema and possible pseudopium and itching
4 + pronounced reaction, 20 mm welts with erythema,
Pseudopia, itching and pain.
Example 3: According to example 1, a dry powder extract of ragwort pollen was produced. When dissolved in distilled water under sterile conditions and diluted to the desired strength, this extract could be used to treat hypersensitivity in people allergic to ragwort pollen and also to diagnose allergies by means of skin tests.
Examples 4 to 9: The procedure was as in Examples 1 to 3, except that household dust, horse droppings, chicken feathers, biting insects, Timothy grass and birch pollen were used instead of ragwort pollen. Such extracts are used for the diagnosis of allergic reactions through skin tests or for the therapy of allergies. The dry powders can also be used to diagnose allergic reactions by means of conjunctival or smell tests.
Example 10: To about 100 ml of an extract obtained according to Example 3 and adjusted to a pH of about 6.2 with dilute sulfuric acid, about 50 ml of a sterile 2 wt. -% solution of potassium aluminum sulphate slowly while stirring continuously.
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joined. The precipitate thus obtained was removed from the supernatant liquid by centrifugation, washed with distilled saline and resuspended in a phosphate buffer with a pH of approximately 7.0. The yield was 80%. This suspension can be used as an extract for the treatment of hypersensitivity with delayed effects.
PATENT CLAIMS:
1. A method for producing an extract of a substance that can cause an allergy and that contains physiologically active materials, preferably inhalable substances from pollen, household dust, epithelia, fungi, insect materials, seeds or feathers, the substance with an extraction liquid, the water and a basic nitrogen containing organic solvent, in particular a heterocyclic tertiary amine such as. B.
Contains pyridine, mixed, the extraction liquid freed from all the insoluble material and, if necessary, sterilized, as well
EMI7.1
ability is volatilized and the allergens are isolated in the form of a dry, stable powder containing the allergen and, if necessary, the dry powder is further treated according to the respective requirements.