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Verfahren zur Trennung von Tetracyclin und
Chlortetracyclin aus wässerigen Lösungen
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Trennung von Tetracyclin und ehlorttracycl1" aus wässerigen Lösungen, wie beispielsweise aus Fermentationsbrühen.
Tetracyclin ist ein Breitband-Antibiotikum, über dessen Struktur bereits (Joum. Amer. Chem. Soc.
Bd. 74 [1952], S. 4976 berichtet wurde. Die Herstellung dieses Antibiotikums aus Chlortetracyclin durch katalytische Reduktion wurde ebenfalls schon beschrieben (Journ. Amer. Soc. Bd. 74 [ 1953], S. 4621 bis 4623).
Chlo. tetracyclin ist ebenfalls ein Breitband-Antibiotikum, das aus Streptomyces aureofaciens nach dem in der USA-Patentschrift Nr. 2, 482,055 beschriebenen Verfahren gewonnen werden kann und die Handelsbezeichnung Aureomycin trägt.
Wenn es auch möglich ist, Tetracyclin durch katalytische Reduktion von Chlortetracyelin heizustel- len, hat seine Erzeugung unmittelbar durch einen Fermentationsvorgang doch verschiedene Vorteile. So wird z. B. die für die Hydrierung des Chlortetracyclins erforderliche Einrichtung erspart. Ausserdem entfällt der kostspielige Katalysator und schliesslich wird das bei Hydrierreaktionen stets vorhandene Gefahrenmoment ausgeschaltet. Die Erzeugung von Tetracyclin direkt durch Fermentation ist durch Züchtung ausgewählter Streptomyceten-Stämme unter aerobenBedingungen möglich. Jedoch entsteht nach den mei- sten Verfahren in der Fermentationsbrühe zugleich mit dem gewünschten Tetracyclin auch Chlortetracyc- lin.
Der Anteil an Chlortetracyclin schwankt dabei je nach den für die Fermentation verwendeten speziellen Mikroorganismen, dem Fermentationsmedium und den Arbeitsbedingungen beträchtilch. Wenn neben Tetracyclin beträchtliche Mengen Chlortetracyclin vorhanden sind, so wird'die Trennung zufolge der ähnlichen physikalischen und chemischen Eigenschaften der beiden Antibiotika zu einem schwierigen Problem, so dass unter diesen Umständen zur Herstellung von reinem Tetracyclin aus dem Gemisch eine anschliessende katalytische Reduktion des Chlortetracyclins erforderlich ist. Ein ähnliches Problem tritt auf, wenn bei der katalytischen Reduktion von Chlortetracyclin die Reduktion nicht vollständig verläuft, so dass eine Mischung von Tetracyclin mit dem restlichen Chlortetracyclin entsteht.
Daraus ist die Wich- tigkeit eines Verfahrens zur Trennung des Tetracyclins vom Chlortetracyclin leicht zu emhen.
Es wurde nun gefunden, dass das Tetracyclin von Chlortetracyclin in FermenMtionsbrühenodet an- dem, die beiden Antibiotika enthaltenden wässerigen Lösungen getrennt werden kann, wenn man LösungendesGemischesderAntibiotikaaufeinenpH-Wertzwischen0,5und3,5einstelltund, gegebenenfalls nach Zusatz wasserlöslicher anorganischer Salze, mit einem mit Wasser nicht mischbaren niedrigmole-
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Nach der Ansäuerung der die Antibiotika enthaltenden wässerigen Lösung auf ein ppj von vorzugsweise 2 können verschiedene Reagenzen zugesetzt werden, um die Qualität desEndproduktes Tetracyclin zu verbessern. So kann z. B. Kaliumferrocyanid zugesetzt werden, um nicht erwünschte, färbende Stoffe zu entfernen und so ihre Mitfällung mit dem Tetracyclin zu vermeiden. Ferner kann Ammonoxalat zugesetzt werden, um zu verhindern, dass aus einer verhältnismässig vielKalziumionen enthaltenden Lösung Kalziumsalze mit dem. Endprodukt ausfallen.
Zur Extraktion der so behandelten angesäuerten, wässerigen Lösung kommen insbesondere Butanol, Isobutanol, Pentanole und Hexanole in Betracht. Gewöhnlich genügen 0, 2-2, 0 Volumsteile des orga- nischen Lösungsmittels auf ein Volumsteil der wässerigen Lösung, aber auch grössere Mengen Lösungsmittel können angewendet werden.
Es wurde gefunden, dass der Übergang der beiden Antiblotika in das organische Lösungsmittel sehr gefördert wird, wenn die angesäuerte, wässerige Lösung vor der Extraktion mit einem wasserlöslichen, anorganischet. Salz, wie Natriumchlorid, NatriumsuJfat, Kaliumsulfat, Kaliumchlorid, Ammonchlorid, Ammonsulfat usw., versetzt wird. Dieser Zusatz scheint auf die beiden Antibiotika eine aussalzende Wirkung auszuüben und ermöglicht die Anwendung geringerer Mengen organischer Lösungsmittel als sonst für die Extraktion erforderlich ist. Die erforderliche Sal2. menge schwankt beträchtlich je nach der Menge der gelogen Antibiotika und liegt im allgemeinen zwischen ungefähr 3, 0 - 25, 0 %.
Nach der Extraktion wird der Extrakt zweckmässig filtriert, und mit wässeriger Lösung von Alkalien, wie z. B. Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd, Ammoniumhydroxyd, Triäthylamin oder andern aliphatischenAminen neutralisiert, indem er mit Wasser vermischt und das Alkali nach und nach zugesetzt wird, bis der pH-Wert der Wasserschicht zwischen ungefähr 5 und 8, vorzugsweise zwischen etwa 6 und 7 liegt.
Tetracyclin kristallisiert als Base aus, wenn die so erhaltene Mischung von Wasser und organsichem L6- sungsmittel in Bewegung gehalten oder einfach eine Zeit lang, etwa 8-12 Stunden stehen gelassen wird.
Die Mischung kann zur vollständigen oder teilweisen Entfernung des organischen Lösungsmittels auch im Vakuum eingeengt werden, wobei im Konzentrat soviel Wasser verbleiben muss, dass sich das Trihydrat des Tetracyclins bildet. Drs auf diese Weise gewonnene kristalline Tetracyclin kann durch Umkristallisieren aus Aceton, Monoäthem des Äthylenglykols oder andern organischen Lösungsmitteln weiter gereinigt werden.
Das im Extrakt gelöste Chlortetracyclin verbleibt nach Abtrennung des Tetracyclins im Filtrat, welches zweckmässig nochmals in der erwähnten Weise behandelt wird, um restliche Tetracyclinmengen daraus zu entfernen. Das Chlortetracyclin kann dann durch Eindampfen des Filtrates zur Trockene gewonnen werden und in bekannter Art gereinigt werden.
Die erfindungsgemässe Trennung des Tetracyclins vom Chlortetracyclin ist im Hinblick auf die ähnlichen physikalischen und chemischen Eigenschaften von Tetracyclin und Chlortetracyclin durchaus überraschend. Beide Antibiotika bilden z. B. mit Säuren Salze, die mit organischen Lösungsmitteln nach Ansäuerung aus wässeriger Lösung leicht extrahierbar sind. Die Säuresalze beider Antibiotika können leicht neutralisiert werden und liefern nach Zusatz von Alkalien die freien Basen. Während jedoch das neutralisierte Tetracyclin dabei aus der Lösung ausfällt, bleibt das Chlortetracyclin unter den beschriebenen Bedingungen in Lösung.
Die folgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung des Verfahrens gemäss der Erfindung, Beispiel l : 408 l einer Fermentationsbrühe, die bei der Kultur von Streptomyces ATCC Nr. 11654 erhalten wurde und einen Gehalt an 715 y Antibioticum je cms aufweist, werden mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert. von 2, 5 bis 3 gebracht una mit Hilfe von"Supercel"filtriert, um das Mycel abzutrennen.
Nach dem Waschen des Filterkuchens mit Wasser werden dem Filtrat 0, 4 % Zitronensäure und dann
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he zugesetzt. Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxyd auf 9 - 9, 5 eingestellt, um die quaternären Ammoniumsalze des Tetracyclins und Chlortetracyclins auszufällen, welche dann abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet werden.
50 g der gemischten Salze, die je g ungefähr 30 mg wirksame Substanz enthalten, werden in 200 cm3 Wasser suspendiert. Nach Einstellung auf pH=2, mit 6 n HC1, werden 2 g Kaliumferrocyanid und 25 cm 5 ; tge Ammonoxalatlösung zugesetzt. Die Mischung wird 15 Minuten gerührt, der pH-Wert wieder auf 2 eingestellt und filtriert, worauf der Filterkuchen mit 100 cms Wasser von pH=2 gewaschen wird. Die vereinigter. Filtrate (305 cm3) mit einem Gehalt von 1, 690 g an wirksamer Substanz, werden dann sechsmal mit je 100 cm3 n-Butanol extrahiert, wonach in der wässerigen Schicht (217 cm3), 211 mg an wirksamer Substanz, das sind 12,4 % der Ausgangsliisun ft Ekbleiben.
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Die vereinigten Butanolextrakte werden filtriert, mit 100 cm 3 Wasser geschüttelt und dann langsam mit 10 goriger Natronlauge versetzt, bis der pH-Wert der wässerigen Schicht auf 6 - 7 eingestellt ist. Die 'Butanol-Wassermischung wird dann im Vakuum eingeengt, wobei Wasser zugesetzt wird, um die Entfernung des Butanols zu erleichtern. Es verbleiben 80 - 100 cm3 einer wässerigen Lösung der freien Tetra- cyclinbase, die mit 10 5piger Natronlauge wieder auf einen pH-Wert von 5 bis 6,8 eingestellt und nach
Abkühlung filtriert wird. Das wässerige Filtrat enthielt 374 mg an wirksamer Substanz, das sind 22, 1 % der Ausgangslösung. Es werden 0,89 g Kristalle mit einem Tetracyclingehalt von 882 mg (990 y Tetra- cyclin je mg) erhalten.
Dieses Ergebnis entspricht ungefähr 52 % der antibiotischen Gesamtaktivität der wässerigen Ausgangslösung. Es zeigt, dass ein wesentlicher Teil des in dieser Lösung vorhandenen Tetra- cyclins gewonnen wurde. Ultraviolett-Analyse und papierchromatographische Untersuchungen ergaben, dass das kristalline Produkt aus reinem Tetracyclin besteht.
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Analyse <SEP> : <SEP>
<tb> Berechnet <SEP> für <SEP> C <SEP> HN <SEP> : <SEP> C <SEP> 59,45 <SEP> ; <SEP> H <SEP> 5,44
<tb> Gefunden <SEP> : <SEP> C <SEP> 59,59 <SEP> : <SEP> H <SEP> 5,44
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Beispiel 2 : 500 g eines Gemisches quaternärer Ammoniumsalze des Tetracyclins und Chlortetracyclins werden in 1500 cm Wasser bei einem PH von 2 gelöst und mit 20 g Natriumferrocyanid versetzt.
Die Lösung wird filtriert und mit 1000 cm3 Wasser, das auf einen pH-Wert von 2 eingestellt wurde, gewaschen. Die vereinigten Filtrate mit einem Gesamtgehalt von 61100 mg an wirksamersubstanz werden zunächst mit. 340 g Natriumchlorid versetzt und dann dreimal mit je 800 cm3 n-Butanol extrahiert. Die zurückbleibende wässerige Lösung enthält 870 mg an wirksamer Substanz, das sind 1, 4 % der Wirksubstanz in der ursprünglichen Lösung vor der Extraktion. Die Butanolextrakte werden vereinigt, mit Wasser geschut- telt und mit 10 % iger Natronlauge versetzt, bis die Wasserschicht einen pH-Wert von 6,8 zeigt. Dann wird das Butanol im Vakuum teilweise entfernt und die Mischung über Nacht unter Kühlung stehen gelassen.
Das Tetracyclin kristallisiert als freie Base aus, es wird durch Filtration abgetrennt und im Vakuum getrocknet. Ausbeute : 22, 1 g Tetracyclin, das kein Chlortetracyclin enthäit, entsprechend einer Gesamtausbeute von 37, 7 % der Ausgangslösung.
Das im Filtrat noch vorhandene Butanol wird im Vakuum entfernt und 5,9 g Tetracyclin mit einer Aktivität von 950 y/mg, entsprechend einer Gesamtaktivität von 5,610 mg, das sind 9,2 % der antibiotischen Gesamtaktivität der Ausgangslösung erhalten. Die vereinigten Filtrate entsprechen einer Aktivität 28,500. 000 y an wirksamer Substanz, wovon 30 bis 40 % auf Chlortetracyclin entfallen. Durch Wiederholung des beschriebenen Verfahrens wird aus den Mutterlaugen noch weiteres Tetracyclin gewonnen. Das Chlortetracyclin kann daraus auf bekannte Weise, z. B. durch Extraktion mit Butanol gewonnen werden.