WO2024128499A1 - 탯줄 유래 부착형 줄기세포를 포함하는 난소부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

탯줄 유래 부착형 줄기세포를 포함하는 난소부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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WO2024128499A1
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stem cells
cells
umbilical cord
derived adherent
pharmaceutical composition
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PCT/KR2023/015837
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유지민
김현지
송채영
김경민
김지향
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(주)차바이오텍
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/51—Umbilical cord; Umbilical cord blood; Umbilical stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis

Definitions

  • Another aspect is to provide a method of preventing or treating ovarian insufficiency comprising administering an effective amount of umbilical cord-derived adherent stem cells, a cell population thereof, or a culture medium thereof to a subject in need thereof.
  • Another aspect is a method for increasing the number of follicles or primordial follicles in a subject, comprising administering an effective amount of umbilical cord-derived adherent stem cells, a cell population thereof, or a culture medium thereof to a subject in need thereof. It provides a method.
  • the present invention provides the use of umbilical cord-derived adherent stem cells, their cell populations, or their culture medium for the prevention or treatment of ovarian insufficiency.
  • Another aspect provides a method of preventing or treating ovarian failure comprising administering an effective amount of umbilical cord-derived adherent stem cells, a cell population thereof, or a culture medium thereof to a subject in need thereof.
  • Another aspect is a method for increasing the number of follicles or primordial follicles in a subject, comprising administering an effective amount of umbilical cord-derived adherent stem cells, a cell population thereof, or a culture medium thereof to a subject in need thereof. Provides a method.
  • Another aspect is a method for increasing or decreasing, respectively, the function or activity of cells that are decreased or increased in ovarian failure, comprising administering an effective amount of umbilical cord-derived adherent stem cells, a cell population thereof, or a culture medium thereof to a subject in need thereof.
  • a method for increasing or decreasing, respectively, the function or activity of cells that are decreased or increased in ovarian failure comprising administering an effective amount of umbilical cord-derived adherent stem cells, a cell population thereof, or a culture medium thereof to a subject in need thereof.
  • the umbilical cord-derived adherent stem cells of the present specification are cells having the same cell characteristics as the cells described in the examples of Korean Patent Application No. 10-2016-0102721, and the entire document is incorporated herein by reference.
  • the cells of the present specification may express MIC A/B in at least 10% or less, at least 5% or less, or at least 1% or less of the total cell population.
  • the cells of the present specification may express SSEA4 in at least 80%, at least 85%, or at least 90% of the total cell population.
  • the cells of the present invention may express Oct4 and Nanog in at least 10% or less, at least 5% or less, or at least 1% or less of the total cell population.
  • the cells of the present invention may express CD200 in at least 85% or more, at least 90% or more, or at least 95% or more of the total cell population.
  • CD61+ may be a surface antigen characteristic that is overexpressed under hypoxic conditions.
  • the immunological characteristics can be determined by conventional methods known in the art to which the present invention pertains. A variety of methods can be used, for example, flow cytometry, immunohistochemical staining, or RT-PCR.
  • the umbilical cord-derived adherent stem cells may have one or more characteristics selected from (a) to (e) below:
  • one or more selected from the group consisting of CCND1, SERPINE1, PRNP, and CYP1B1 is expressed in lower amounts compared to bone marrow stem cells;
  • the umbilical cord-derived adherent stem cells may further have one or more characteristics selected from (f) to (i) below:
  • one or more selected from the group consisting of S100A10, BNIP3, IGFBP5, NDUFA4L2, DPYD and SCARA3 is expressed at a higher level compared to culture under normoxic conditions;
  • one or more selected from the group consisting of IL8, ALDH1A1, DLC1, CTHRC1, and CPA4 is expressed at a lower level compared to culture under normoxic conditions;
  • TPMT TPMT
  • NAGK NAGK
  • ANXA4 TPMT
  • TPMT TPMT
  • NAGK NAGK
  • ANXA4 ANXA4
  • Genes or proteins that are less expressed in umbilical cord-derived adherent stem cells according to one embodiment compared to the bone marrow-derived stem cells may include MTA2A, TM4SF1, HIST1H4C, and NME1.
  • the relationship between the above genes or proteins and umbilical cord-derived adherent stem cells has not been reported.
  • umbilical cord-derived adherent stem cells may exhibit a two-fold or more difference in expression levels of the above genes or proteins compared to bone marrow-derived stem cells.
  • the difference in expression level may be, for example, a comparison of the expression level of a gene at the mRNA level. Additionally, the difference in expression level may be due to, for example, microarray analysis.
  • the umbilical cord-derived adherent stem cells may have the form of subcultured fibroblasts.
  • the cell may have the characteristics of a cell that requires attachment to a surface in order to grow in vitro, and may exhibit a specific shape of a spindle-shaped fibroblast.
  • the umbilical cord-derived adherent stem cells may have colony forming ability.
  • the cells may have a higher colony forming ability compared to those cultured under normal live tank conditions.
  • the umbilical cord-derived adherent stem cells can differentiate into adipocytes, osteocytes, or chondrocytes.
  • the cells can be induced to differentiate along specific cell lineages, including, for example, adipocyte differentiation, chondrocyte differentiation, osteoblast differentiation, hematopoietic differentiation, myocyte differentiation, vascular cell differentiation, neuronal differentiation, and hepatocyte differentiation.
  • the umbilical cord-derived adherent stem cells can differentiate into adipocytes, osteocytes, or chondrocytes.
  • the cells can be induced to differentiate along specific cell lineages, including, for example, adipocyte differentiation, chondrocyte differentiation, osteoblast differentiation, hematopoietic differentiation, myocyte differentiation, vascular cell differentiation, neuronal differentiation, and hepatocyte differentiation.
  • differentiation refers to the phenomenon in which cells become specialized in structure or function while they divide and grow, that is, the form or function of biological cells, tissues, etc. change to perform a given task.
  • Measurement of differentiation into a specific cell type can be performed by methods well known in the art, and differentiation into a specific cell can be induced through known methods. Additionally, the differentiation can be observed using techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry, measuring changes in cell surface labeling (e.g., staining cells with tissue-specific or cell-labeling specific antibodies) and morphology, as well as light microscopy. Alternatively, it can be confirmed by examining the morphology of cells using a confocal microscope, or by measuring changes in gene expression using techniques well known in the art, such as PCR and gene-expression profiling.
  • the term "isolation of umbilical cord-derived adherent stem cells” refers to at least 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% of cells normally associated with stem cells in an untreated mammalian umbilical cord. This may mean removing 80%, 90%, 95% or 99%.
  • a cell population containing stem cells obtained from an organ can be said to be “isolated” when the number of other cells normally associated with the stem cells in the untreated organ is less than 50% of the total cells.
  • the ovarian failure may be any one selected from primary ovarian failure, secondary ovarian failure, hyperandrogenemia, polycystic ovary syndrome, amenorrhea, oligomenorrhea, early menopause, and infertility.
  • the stem cells may increase the number of follicles or primordial follicles.
  • the stem cells may promote ovulation of eggs.
  • the stem cells may promote the development of a fertilized egg.
  • the stem cells may restore the function or activity of any one cell selected from the group consisting of B cells, dendritic cells, and fibroblasts, which are reduced in ovarian failure.
  • the stem cells may reduce the number or activity of luteinizing mural cells or atretic cells that are increased in ovarian failure.
  • the stem cells may increase the expression or activity of Cd 19 or Cd 209a.
  • the stem cells may increase the expression or activity of Itm2a or decrease the expression or activity of Parm1 or Chf.
  • the cells reduced in ovarian failure may be any one cell selected from the group consisting of B cells, dendritic cells, and fibroblasts.
  • the cells increased in ovarian failure may be luteinizing mural cells or atretic cells.
  • the above aspect includes a pharmaceutical composition containing a culture medium of the umbilical cord-derived adherent stem cells.
  • the present specification provides a pharmaceutical composition containing the umbilical cord-derived adherent stem cells, their cell population, or their culture medium as an active ingredient.
  • the dosage of the cell therapy agent or pharmaceutical composition according to one embodiment is 1.0 It can be 8 cells/kg (body weight) or individual.
  • the dosage may be prescribed in various ways depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, gender, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, and reaction sensitivity, and those skilled in the art will Taking these factors into consideration, the dosage can be adjusted appropriately.
  • the number of times of administration can be one time or two or more times within the range of clinically acceptable side effects, and the administration site can be administered at one or two or more places.
  • the same dosage per kg or per individual as for humans is administered, or, for example, the above-mentioned administration is based on the volume ratio (e.g., average value) of the organs (e.g., heart, etc.) between the target animal and human.
  • the converted dose can be administered.
  • animals subject to treatment according to one embodiment include humans and other mammals, specifically humans, monkeys, mice, rats, rabbits, sheep, cows, dogs, horses, pigs, etc. Included.
  • the cell therapy agent or pharmaceutical composition may include the umbilical cord-derived adherent stem cells as active ingredients and a pharmaceutically acceptable carrier and/or additive.
  • a pharmaceutically acceptable carrier and/or additive for example, it contains sterile water, physiological saline, common buffers (phosphoric acid, citric acid, other organic acids, etc.), stabilizers, salts, antioxidants (ascorbic acid, etc.), surfactants, suspending agents, isotonic agents, or preservatives. can do.
  • organic materials such as biopolymers and inorganic materials such as hydroxyapatite, specifically collagen matrices, polylactic acid polymers or copolymers, polyethylene glycol polymers or copolymers, and chemical derivatives thereof.
  • the cell therapy agent or pharmaceutical composition according to one embodiment is prepared in a formulation suitable for injection, the cell aggregate may be dissolved in a pharmaceutically acceptable carrier or frozen in a dissolved solution state.
  • Umbilical cord-derived adherent stem cells are various types of cells in which tissues or organs of the body are strengthened, treated, or replaced by engraftment, transplantation, or injection of a desired cell population, for example, stem cells or derived cell populations. Can be used in treatment protocols.
  • the umbilical cord-derived adherent stem cells can replace or enhance existing tissue, creating new or changed tissue, or combining with biological tissue or structure. Additionally, in treatment protocols where stem cells derived from tissues other than the umbilical cord are typically used, the stem cells may be replaced by the umbilical cord-derived adherent stem cells herein.
  • the cell therapeutic agent or pharmaceutical composition may be used as a suspending agent, solubilizing agent, stabilizer, isotonic agent, preservative, anti-adsorption agent, surfactant, diluent, excipient, pH adjuster, if necessary depending on the administration method or formulation.
  • Analgesics, buffering agents, reducing agents, antioxidants, etc. may be appropriately included.
  • Pharmaceutically acceptable carriers and agents suitable for the present invention including those exemplified above, are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995.
  • the cell therapy or pharmaceutical composition according to one embodiment is formulated using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily performed by a person skilled in the art to which the invention pertains. It can be manufactured in unit dose form or by placing it in a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or aqueous medium, or in the form of powder, granules, tablets or capsules.
  • cell therapy products may be formulated into an injectable formulation. In this case, known conventional ingredients for formulation can be used, and it can be formulated in a conventional manner.
  • umbilical cord-derived attached stem cells have the effect of increasing the number and ratio of follicles or primordial follicles in an individual, inducing superovulation of eggs, or promoting the development of fertilized eggs, thereby preventing early menopause or infertility. It has effects that can be useful in the prevention or treatment of ovarian failure, including:
  • Figures 1 and 2 are graphs confirming the estrous cycle in mice induced by POI by CP treatment.
  • Figure 3 is a graph showing ovarian weight in mice induced by POI by CP treatment.
  • Figure 4 is a tissue photo and graph showing the number and ratio of follicles in mice with POI induced by CP treatment.
  • Figure 5 is a tissue photograph showing the number and ratio of follicles and primitive follicles according to administration of stem cells in one embodiment.
  • Figure 6 is a graph measuring the number and ratio of follicles and primitive follicles according to administration of stem cells in one embodiment.
  • Figure 7 is a tissue photograph showing ovarian apoptosis following administration of stem cells in one embodiment.
  • Figure 8 is a graph measuring ovarian apoptosis according to administration of stem cells in one embodiment.
  • Figure 9 is a tissue photograph showing the AMH (Anti-Mullerian Hormone) staining area following administration of stem cells in one embodiment.
  • AMH Anti-Mullerian Hormone
  • Figure 10 is a graph measuring the AMH (Anti-Mullerian Hormone) staining area according to administration of stem cells in one embodiment.
  • AMH Anti-Mullerian Hormone
  • Figure 11 is a micrograph showing the number of superovulated eggs according to administration of stem cells in one embodiment.
  • Figure 12 is a graph measuring the number of superovulated oocytes according to administration of stem cells in one embodiment.
  • Figure 13 is a micrograph showing the ratio of 2 cells and blastocyst in in vitro fertilization according to administration of stem cells in one embodiment.
  • Figure 14 shows the results of measuring the ratio of 2 cells and blastocysts in in vitro fertilization according to the administration of stem cells in one embodiment.
  • Figure 15 is a graph showing the results of analysis of immune cell populations present in the ovary.
  • Figure 16 is a graph showing changes in immune cell populations according to administration of stem cells in one embodiment.
  • Figure 17 is a graph showing the results of analysis of stroma cell populations present in the ovary.
  • Figure 18 is a graph showing changes in stroma cell population according to administration of stem cells in one embodiment.
  • Figure 19 is a graph showing the results of analysis of the Granulosa cell population present in the ovary.
  • Figure 20 is a graph showing changes in Granulosa cell population according to administration of stem cells in one embodiment.
  • Umbilical cord-derived adherent stem cells were prepared in the same manner as in Korean Patent Application No. 10-2016-0102721, which is incorporated herein by reference in its entirety.
  • the cell shape was confirmed at 40x and 100x magnification under an optical microscope, and then the isolated cells were designated as P0, and 25ng/ml
  • the cells were cultured in MEM alpha GlutaMAX (CS-CM medium) containing FGF4, 1ug/ml heparin, and 10% FBS at 37°C under hypoxic culture conditions (O2 3%).
  • the CS-CM medium was replaced every 3 to 4 days to remove cells that did not adhere to the bottom of the flask, and in the first passage, Invitrogen's TrypLE, an animal component free (ACF) recombinant enzyme, was incubated for a short period of time in an incubator at 37°C. (3 minutes) and subcultured.
  • ACF animal component free
  • the cells were washed three times with DPBS, then 4% paraformaldehyde was added to each culture vessel and fixed at room temperature for 10 minutes. The fixed cells were washed three times with DPBS. Next, 0.2% Triton 10% normal goat serum was added and blocked for 30 minutes at room temperature, primary antibody (Oct4, Nanog) was added, light was blocked, and reaction was performed overnight at 4°C. Afterwards, after washing three times with DPBS, secondary antibody was added and reacted at room temperature for 1 hour. Finally, it was washed three times with DPBS and observed under a fluorescence microscope.
  • the umbilical cord-derived adherent stem cells according to one embodiment are cells that are selectively positive for CD200, CD141, CD61, CD87 SSEA4, TRA-1, CD3, CD1a, CD11c, CD16, CD86, CD8a, CD40, These cells were selectively negative for MIC A/B, and additionally, CD61 was selectively positive under hypoxic conditions.
  • the umbilical cord-derived adherent stem cells according to one embodiment do not express Oct4 and Nanog proteins, which are embryonic stem cell-specific markers.
  • CP Cyclophosphamide
  • CordSTEM In order to confirm the effect of the stem cells prepared in Example 1 on ovarian dysfunction, on the 7th day of CP administration (Day 7), CordSTEM according to one embodiment was administered through the caudal vein once at a dose of 100 uL/head, On day 17 (Day 17), mice were euthanized and sampling was performed.
  • test group was divided as follows.
  • test evaluation items are as follows.
  • mice On the day of necropsy, the mice were euthanized and both ovaries were removed. After measuring the weight of both ovaries, they were fixed in 4% paraformaldehyde solution. After fixation, a paraffin block was created using the two ovarian tissues, left and right. The preparation of the section was repeated until all the ovarian tissue was cut by cutting 10 consecutive pieces of ovarian tissue at a thickness of 5 ⁇ m into one part, and tissue sections were created with an interval of 55 ⁇ m between each part. Afterwards, (1-1) H&E (follicle counting), (1-2) TUNEL analysis (apoptosis) and (1-3) IHC (AMH) were performed.
  • CordSTEM was administered on the 7th day after a single intraperitoneal administration of 200 mg/kg CP.
  • 7.5IU PMSG Pregnant Mare Serum Gonadotropin
  • 7.5IU hCG HUMAN CHORIONIC GONADOTROPIN
  • COCs cumulus-oocyte complexes
  • 7.5 IU PMSG was administered intraperitoneally. 48 hours later, 7.5 IU hCG was administered intraperitoneally. 15 hours later, the oviducts of superovulated female mice were removed.
  • Sperm was extracted from the seminifera of male mice and cultured for 1 hour (37°C, 5% CO2). After removing COCs from the oviduct, they were treated with 10 ⁇ l hyaluronidase to remove cumulus cells. Eggs were collected in the center of the dish, 10 ⁇ l sperm was sprinkled around the eggs, and cultured for 4 hours (37°C, 5% CO2). After washing the eggs to remove all sperm, they were cultured and embryo development was observed.
  • stem cells As shown in Figures 5 and 6, it was found that administration of stem cells according to one embodiment increased the number of follicles, the ratio of follicles in the ovary, and the number of primodial follicles in a dose-dependent manner compared to the untreated control group.
  • stem cells significantly increased the amount of AMH related to ovarian function such as menopause or polycystic ovary syndrome compared to the control group.
  • stem cells significantly increased the number of superovulated eggs in an animal model in which ovulation of eggs was reduced due to decreased ovarian function.
  • stem cells significantly increased the development of fertilized eggs (ratio of 2 cells and blastocysts) during in vitro fertilization compared to the control group.
  • stem cells according to one embodiment can be useful in preventing or treating ovarian failure, including early menopause, infertility, or polycystic ovary syndrome.
  • biomarkers were identified at the single cell level.
  • CD140a+ cells, CD45+ cells, and other cells were placed in lysis buffer (0.1% Triton 1 cell per well was isolated from a 96-well plate, frozen in liquid nitrogen, and stored at -80°C.
  • Reagents for NEXTERA index and sequencing library amplification (1X KAPA bf, 300uM dNTP, 500uM MgCl2, 1u/ ⁇ l KAPA enzyme) were added and reacted. After collecting all samples for which the reaction was completed, 5X the volume of PB used for sequencing was added. Next, it was purified using a PCR product purification kit. Quantitative analysis was performed on the purified DNA using TapeStation. After adding 0.3X beads to the library, they were separated with a magnet. The magnetically separated supernatant was collected, 0.6X beads were added, and magnetically separated. After removing the supernatant, it was washed with 80% ethanol and the ethanol was completely removed. After adding EB buffer, the library was eluted by magnetic separation. Libraries used for sequencing were stored at 4°C. The sequencing library was paired-end sequenced using NextSeq550 equipment.
  • TPM values were converted to log2 (TPM+1), and analysis was performed by selecting cells showing more than 500 genes and genes showing at least 5 cells. Analysis was performed using the Numpy, SciPy, Matplotlib, sckit-learn, and pandas packages in a Python environment. Variable genes were selected and principle component analysis and tSNE visualization were performed based on them. To analyze the cell population, unsupervised hierarchical clustering was performed and differentially expressed genes and marker genes were analyzed using the DESeq2 package in the R software environment.
  • Quantitative results were subjected to statistical analysis using Prism Version 5.03. Student's t-test was used to compare the normal group and the negative control group, and ONE-WAY ANOVA was used to compare the negative control group and the test substance administered group. Statistical significance was determined to be statistically significant when p ⁇ 0.05.
  • the Fibroblast 3 cell population (Gsn) which was reduced in POI-induced mice by CP treatment, was not recovered even after administration of stem cells according to one embodiment, but the Fibroblast 2 cell population (Itm2a) was reduced in one embodiment. It was found that recovery occurred after administration of stem cells according to the example.
  • the stem cells according to one embodiment restored the functions of B cells, dendritic cells, fibroblasts, luteinizing mural cells, and atretic cells in the POI mouse model, and these results were confirmed by the stem cells according to one embodiment. This means that the cells induce the recovery of surrounding cells that are important for the development and maturation of the egg, thereby restoring ovarian function.

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Abstract

탯줄 유래 부착형 줄기세포를 포함하는 난소부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 일 구체예에 따른 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 여포 또는 원시 여포의 수와 비율을 증가시키거나, 난자의 과배란을 유도하거나 수정란의 발달을 촉진시키는 효과가 있어, 조기 폐경, 또는 난임을 포함하는 난소부전의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

탯줄 유래 부착형 줄기세포를 포함하는 난소부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물
난소부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
여성의 경우 연령과 임신은 밀접한 관련이 있으며 연령이 증가함에 따라 임신율이 감소하는 경향이 있다. 이러한 사실에 대한 주요 원인은 난소의 난자 수 감소 및 질 저하를 포함한다. 최근에는 혼인 연령이 해마다 높아지고 있어 뚜렷한 불임의 원인이 없더라도 노화에 따른 난소 기능 저하, 즉, 난소 내 난자의 수 감소 및 질 저하가 나타난다.
난소는 난자를 만들고 에스트로겐, 프로게스테론, 테스토스테론과 같은 성호르몬을 분비하는 여성의 생식기관으로, 여성 생산 시스템의 건강을 유지시킬 뿐만 아니라 호르몬 생산 시스템의 균형을 유지하도록 해 주어 여성의 삶의 질을 유지시키는 데에 중요한 역할을 하는 기관이다.　난소 기능은 난포자극호르몬(FSH), 에스트라디올(estradiol) 또는 AMH(Anti-Mullerian hormone, 항뮬러관 호르몬) 수치의 변화를 측정하여 확인할 수 있다.
최근에는 체외수정, 미세수정 등 보조생식술 기술이 발달했지만, 난소기능 저하는 첨단 생식의학 기술로도 치료가 사실상 불가능하다. 따라서, 난소 기능의 저하를 억제하는 수단에 대한 개발이 요구되고 있다.
일 양상은 탯줄 유래 부착형 줄기세포, 그의 세포집단 또는 그의 배양액을 유효성분으로 포함하는 난소 부전(ovarian insufficiency)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 유효량의 탯줄 유래 부착형 줄기세포, 그의 세포집단 또는 그의 배양액을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 난소 부전(ovarian insufficiency)을 예방하거나 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 유효량의 탯줄 유래 부착형 줄기세포, 그의 세포집단 또는 그의 배양액을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 여포(follicles) 또는 원시 여포(primordial follicles)의 수를 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 유효량의 탯줄 유래 부착형 줄기세포, 그의 세포집단 또는 그의 배양액을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 난자 배란을 촉진시키는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 유효량의 탯줄 유래 부착형 줄기세포, 그의 세포집단 또는 그의 배양액을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 수정란 발달을 촉진시키는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 유효량의 탯줄 유래 부착형 줄기세포, 그의 세포집단 또는 그의 배양액을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 난소 부전에서 감소 또는 증가된 세포의 기능 또는 활성을 각각 증가 또는 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.
난소 부전(ovarian insufficiency)의 예방 또는 치료를 위한 탯줄 유래 부착형 줄기세포, 그의 세포집단 또는 그의 배양액의 용도를 제공하는 것이다.
일 양상은 탯줄 유래 부착형 줄기세포, 그의 세포집단 또는 그의 배양액을 유효성분으로 포함하는 난소 부전(ovrian failure)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
다른 양상은 유효량의 탯줄 유래 부착형 줄기세포, 그의 세포집단 또는 그의 배양액을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 난소 부전(ovrian failure)을 예방하거나 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 양상은 유효량의 탯줄 유래 부착형 줄기세포, 그의 세포집단 또는 그의 배양액을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 여포(follicles) 또는 원시 여포(primordial follicles)의 수를 증가시키는 방법을 제공한다.
또 다른 양상은 유효량의 탯줄 유래 부착형 줄기세포, 그의 세포집단 또는 그의 배양액을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 난자 배란을 촉진시키는 방법을 제공한다.
또 다른 양상은 유효량의 탯줄 유래 부착형 줄기세포, 그의 세포집단 또는 그의 배양액을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 수정란 발달을 촉진시키는 방법을 제공한다.
또 다른 양상은 유효량의 탯줄 유래 부착형 줄기세포, 그의 세포집단 또는 그의 배양액을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 난소 부전에서 감소 또는 증가된 세포의 기능 또는 활성을 각각 증가 또는 감소시키는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "탯줄(umbilical cord)"은 포유류의 태아가 태반에서 성장할 수 있도록 모체와 배를 연결해주는 줄을 의미할 수 있으며, 일반적으로 와튼 젤리로 둘러싸인 3개의 혈관, 즉, 2개의 배꼽 동맥과 1개의 배꼽 정맥으로 구성된 조직을 의미할 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 "탯줄 유래 부착형 줄기세포(Umbilical Cord Adherent Stem cells)"는 탯줄 또는 탯줄의 와튼 젤리(Wharton's Jelly) 조직으로부터 유래되고, 다양한 조직 세포로 분화할 수 있는 능력 및 배양 용기 표면에 부착해서 자라는 특성을 가지는 세포를 의미할 수 있다.
본 명세서의 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 대한민국 특허출원 제10-2016-0102721호의 실시예에 기재된 세포와 동일한 세포 특성을 갖는 세포로서, 해당 문헌은 그 전체가 참조로서 본 명세서에 포함된다.
본 명세서에서 제공되는 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 세포 표면에 발현되는 세포 표지자에 대하여 CD200, CD141, CD61, CD87, 또는 SSEA4 양성 표면 마커를 적어도 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%,98% 또는 약 99% 발현하고, 줄기세포 표지자인 Oct4, Nanog, Tra-1-60, CD3, CD1a, CD11c, CD16, CD86, CD8a, MIC A/B 또는 CD40 음성 마커를 약 적어도 70% 이하, 적어도 60% 이하, 적어도 50% 이하, 적어도 40% 이하, 적어도 30% 이하, 적어도 20%이하, 적어도 10% 이하, 적어도 5%이하, 또는 적어도 1%이하로 발현하는 것일 수 있다. 특히, 본 명세서의 세포는 MIC A/B를 전체 세포 집단의 적어도 10% 이하, 적어도 5%이하, 또는 적어도 1%이하로 발현하는 것일 수 있다. 특히, 본 명세서의 세포는 SSEA4를 전체 세포 집단의 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90%이상으로 발현하는 것일 수 있다. 특히 본 발명의 세포는 Oct4 및 Nanog를 전체 세포 집단의 적어도 적어도 10% 이하, 적어도 5%이하, 또는 적어도 1%이하로 발현하는 것일 수 있다. 특히 본 발명의 세포는 CD200을 전체 세포 집단의 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 적어도 95%이상으로 발현하는 것일 수 있다. 표면 항원 특성 중 CD61+는 저산소 조건에서 과발현하는 표면 항원 특성일 수 있다.
본 발명에서 용어, "양성"은 줄기세포 표지와 관련하여, 그 표지가 기준이 되는 다른 비줄기 세포와 비교하였을 때 더 많은 양, 또는 더 높은 농도로 존재하는 것을 의미할 수 있다. 즉, 세포는 어느 표지가 세포 내부 또는 표면에 존재하기 때문에 그 표지를 이용하여 그 세포를 하나 이상의 다른 세포 유형과 구별할 수 있으면 그 표지에 대하여 양성이 된다. 또한 세포가 배경 값보다 더 큰 값으로 신호, 예를 들어 세포 측정 장치의 신호를 낼 수 있는 만큼의 양으로 그 표지를 가지고 있다는 것을 의미할 수 있다. 예를 들어 세포를 CD200에 특이적인 항체로 검출 가능하게 표지할 수 있고, 이 항체로부터의 신호가 대조군(예를 들어 배경 값)보다 검출 가능하게 더 크면 그 세포는 "CD200+"이다. 본 발명에서 용어, "음성"은 특정 세포 표면 표지에 특이적인 항체를 사용하여도 배경 값에 비교하여 그 표지를 검출할 수 없음을 뜻한다. 예를 들어 CD3에 특이적인 항체로 세포를 검출 가능하게 표지할 수 없으면 그 세포는 "CD3-"이다.
상기 면역학적 특성은 본 발명이 속하는 기술분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 결정할 수 있다. 예를 들면 유세포분석, 면역조직화학염색, 또는 RT-PCR 등 다양한 방법이 이용될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 하기 (a) 내지 (e)로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 가지는 것일 수 있다:
a) COL1A1, IGFBP4, TAGLN, STC1, LRRC17 및 IL33으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 골수 줄기세포에 비하여 더 많이 발현되는 것;
b) CCND1, SERPINE1, PRNP, 및 CYP1B1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 골수 줄기세포에 비하여 더 적게 발현되는 것;
c) 계대 배양하는 동안 부착형 섬유아세포의 형태를 유지하는 것;
d) 지방세포, 골세포, 또는 연골세포로의 분화능; 및
e) CD200+, Tra-1-60-, CD3-, CD1a-, CD11c-, CD16-, CD86-, CD8a-, CD40-, CD141+, CD61+, CD87+, MIC A/B- 및 SSEA4+로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 표면 항원 특성.
일 구체예에 있어서, 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 하기 (f) 내지 (i)로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 더 갖는 것일 수 있다:
f) S100A10, BNIP3, IGFBP5, NDUFA4L2, DPYD 및 SCARA3로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 정상산소 조건에서 배양하는 것에 비하여 더 많이 발현되는 것;
g) IL8, ALDH1A1, DLC1, CTHRC1, 및 CPA4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 정상산소 조건에서 배양하는 것에 비하여 더 적게 발현되는 것;
h) SNCA, DSG2, NRP2, 및 PLAT로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 골수 줄기세포에 비하여 더 많이 발현되는 것;
i) TPMT, NAGK, 및 ANXA4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 골수 줄기세포에 비하여 더 적게 발현되는 것.
일 구체예에 따른 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 COL1A1, IGFBP4, TAGLN, STC1, LRRC17 및 IL33로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질을 골수 유래 줄기세포에 비해 더 많이 발현할 수 있다. 구체적으로 상기 세포에서 COL1A1, IGFBP4, TAGLN, STC1, LRRC17 및 IL33로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 이상, 또는 3 이상의 유전자 또는 단백질, 또는 더욱 구체적으로는 모든 유전자 또는 단백질이 골수 유래 줄기세포에 비해 더 많이 발현될 수 있다. 상기 골수 유래 줄기세포에 비해 일 구체예에 따른 탯줄 유래 부착형 줄기세포에서 더 많이 발현되는 유전자는 S100A10, SQSTM1, DSTN, DCN, PHGDH, FBLN1, MFGE8, HLA-A, VASN, 또는 KIAA1199를 더 포함할 수 있다. 상기 유전자는 탯줄 유래 부착형 줄기세포와의 관련성에 대해 보고된 바 없다. 일 구체예에 따른 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 골수 유래 줄기세포에 비해 상기의 유전자에 대해 2배 이상의 발현량 차이를 나타낼 수 있다. 상기의 발현 수준의 차이는 예를 들면 mRNA 수준에서 유전자의 발현량을 비교한 것일 수 있다. 또한 상기 발현 수준 차이는 예를 들면 마이크로어레이 분석에 의한 것일 수 있다.
또한 일 구체예에 따른 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 CCND1, SERPINE1, PRNP 및 CYP1B1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질을 골수 유래 줄기세포에 비해 더 적게 발현할 수 있다. 구체적으로 상기 세포에서 CCND1, SERPINE1, PRNP 및 CYP1B1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 이상, 또는 3 이상의 유전자 또는 단백질, 또는 더욱 구체적으로는 모든 유전자 또는 단백질이 골수 유래 줄기세포에 비해 더 적게 발현될 수 있다. 상기 골수 유래 줄기세포에 비해 일 구체예에 따른 탯줄 유래 부착형 줄기세포에서 더 적게 발현되는 유전자 또는 단백질은 MTA2A, TM4SF1, HIST1H4C, 및 NME1을 포함할 수 있다. 상기 유전자 또는 단백질은 탯줄 유래 부착형 줄기세포와의 관련성에 대해 보고된 바 없다. 일 구체예에 따른 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 골수 유래 줄기세포에 비해 상기의 유전자 또는 단백질들 대해 2배 이상의 발현량 차이를 나타낼 수 있다. 상기의 발현 수준의 차이는 예를 들면 mRNA 수준에서의 유전자의 발현량을 비교한 것일 수 있다. 또한 상기 발현 수준 차이는 예를 들면 마이크로어레이 분석에 의한 것일 수 있다.
또한 상기 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 계대 배양하는 섬유아세포의 형태를 가질 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 세포는 시험관 내에서 성장하기 위해 표면에 부착을 요하는 세포의 성질을 갖는 것일 수 있으며, 방추형의 섬유아세포의 특이적 형태를 나타낼 수 있다
다른 구체예에 있어서, 상기 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 콜로니 형성능을 갖는 것일 수 있다. 상기 세포는 정상산조 조건에서 배양하는 것에 비해 높은 콜로니 형성능을 갖는 것일 수 있다.
또한 상기 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 지방세포, 골세포 또는 연골세포 등으로 분화할 수 있다. 상기 세포는 예를 들면 지방세포분화, 연골세포 분화, 골아세포 분화, 조혈세포 분화, 근세포 분화, 혈관세포 분화, 신경세포 분화, 간세포 분화를 비롯한, 특정 세포 계통을 따라 분화하도록 유도될 수 있다.
또한 상기 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 지방세포, 골세포 또는 연골세포 등으로 분화할 수 있다. 상기 세포는 예를 들면 지방세포분화, 연골세포 분화, 골아세포 분화, 조혈세포 분화, 근세포 분화, 혈관세포 분화, 신경세포 분화, 간세포 분화를 비롯한, 특정 세포 계통을 따라 분화하도록 유도될 수 있다.
용어 "분화(differentiation)"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 특정 세포 유형으로의 분화 측정은 당해 분야에 익히 공지된 방법에 의해 수행될 수 있으며, 공지된 방법을 통해 특정 세포로 분화를 유도할 수 있다. 또한, 상기 분화들은 유세포 분석 또는 면역세포화학과 같은 기법을 사용하여 세포 표면 표지(예를 들어 조직-특이적 또는 세포-표지 특이적 항체로 세포를 염색함) 및 형태의 변화를 측정하면서, 광학 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 세포의 형태를 조사함으로써, 또는 PCR 및 유전자-발현 프로파일과 같은 당해 분야에 익히 공지된 기법을 사용하여 유전자 발현상의 변화를 측정함으로써 확인될 수 있다.
본 명세서에서 용어, " 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 분리"는 처리하지 않은 포유류 탯줄에서 줄기세포와 정상적으로 결부되어 있는 세포의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%를 제거하는 것을 의미할 수 있다. 한 장기에서 얻은 줄기세포를 포함하는 세포군은 처리하지 않은 상태의 그 장기 속에서 그 줄기세포와 정상적으로 결부되어 있는 다른 세포가 전체 세포의 50% 미만일 때 "분리"되었다고 할 수 있다.
상기 난소 부전은 1차 난소부전, 2차 난소부전, 고안드로겐 혈증, 다낭성 난소 증후군(polycystic ovary syndrome), 무월경, 희발월경, 조기폐경 및 난임 중에서 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 줄기세포는 여포(follicles) 또는 원시 여포(primordial follicles)의 수를 증가시키는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 줄기세포는 난자의 배란을 촉진하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 줄기세포는 수정란의 발달을 촉진하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 줄기세포는 난소 부전에서 감소된 B cell, dendritic cell, 및 fibroblast로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 세포의 기능 또는 활성을 회복시키는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 줄기세포는 난소 부전에서 증가된 luteinizing mural cell 또는 atretic cell의 수 또는 활성을 감소시키는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 줄기세포는 Cd 19 또는 Cd 209a의 발현 또는 활성을 증가시키는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 줄기세포는 Itm2a의 발현 또는 활성을 증가시키거나, Parm1 또는 Chf의 발현 또는 활성을 감소시키는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 난소 부전에서 감소된 세포는 B cell, dendritic cell, 및 fibroblast로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 세포인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 난소 부전에서 증가된 세포는 luteinizing mural cell 또는 atretic cell인 것일 수 있다.
또한, 상기 양상은 상기 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 배양액을 포함하는 약학적 조성물을 포함한다. 또한, 예를 들면, 본 명세서는 상기 탯줄 유래 부착형 줄기세포, 그의 세포집단, 또는 그의 배양액을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
일 구체예 따른 세포치료제 또는 약학적 조성물의 투여량은 탯줄 유래 부착형 줄기세포를 기준으로 1.0 X 103 내지 1.0 X 1010 세포/kg(체중) 또는 개체, 또는 1.0 X 107 내지 1.0 X 108 세포/kg(체중) 또는 개체일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1회 또는 임상적으로 용인 가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 또는 개체당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 일 구체예에 따른 치료의 대상동물로서는, 인간 및 그 밖의 목적으로 하는 포유동물을 예로 들 수 있고, 구체적으로는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개, 말, 돼지 등이 포함된다.
일 구체예에 따른 세포치료제 또는 약학적 조성물은 유효성분으로서 상기 탯줄 유래 부착형 줄기세포와 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 첨가물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 멸균수, 생리식염수, 관용의 완충제(인산, 구연산, 그 밖의 유기산 등), 안정제, 염, 산화방지제(아스코르브산 등), 계면활성제, 현탁제, 등장화제, 또는 보존제 등을 포함할 수 있다. 국소 투여를 위해, 생체고분자(biopolymer) 등의 유기물, 하이드록시아파타이트 등의 무기물, 구체적으로는 콜라겐 매트릭스, 폴리락트산 중합체 또는 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 중합체 또는 공중합체 및 그의 화학적 유도체 등과 조합시키는 것도 바람직하다. 일 구체예에 따른 세포치료제 또는 약학적 조성물이 주사에 적당한 제형으로 조제되는 경우에는, 세포집합체가 약학적으로 허용가능한 담체 중에 용해되어 있거나 또는 용해되어 있는 용액상태로 동결된 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 탯줄 유래 부착형 줄기세포는, 신체의 조직 또는 기관이 목적하는 세포 군집, 예를 들어 줄기세포 또는 유래세포군집의 생착, 이식 또는 주입에 의해 강화, 치료 또는 대체되는 다양한 종류의 치료 프로토콜에 사용될 수 있다. 상기 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 존재하는 조직을 대체 또는 강화시켜, 새롭거나 변화된 조직이 되게 하거나 생물학적 조직 또는 구조와 결합시킬 수 있다. 또한, 전형적으로 탯줄 이외의 다른 조직 유래 줄기세포가 사용되는 치료 프로토콜에서 줄기세포가 본 명세서의 탯줄 유래 부착형 줄기세포로 대체될 수 있다.
일 구체예에 따른 세포 치료제 또는 약학적 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 환원제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995]에 상세히 기재되어 있다.
일 구체예에 따른 세포 치료제 또는 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 분말, 과립, 정제 또는 캡슐 형태일 수 있다. 또한, 세포치료제는 주사용 제형으로 제형화될 수 있다. 이 경우 제형화하기 위한 공지된 통상적 성분이 이용될 수 있고, 통상적인 방법으로 제형화될 수 있다.
일 양상에 따른 탯줄 유래 부착형 줄기세포에 의하면, 개체 내 여포 또는 원시 여포의 수와 비율을 증가시키거나, 난자의 과배란을 유도하거나 수정란의 발달을 촉진시키는 효과가 있어, 조기 폐경, 또는 난임을 포함하는 난소부전의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.
도 1및 도 2는 CP 처리에 의해 POI 유도된 마우스에서의 발정주기를 확인한 그래프이다.
도 3은 CP 처리에 의해 POI 유도된 마우스에서의 난소 무게를 나타낸 그래프이다.
도 4는 CP 처리에 의해 POI 유도된 마우스에서의 Follicles의 수 및 비율을 나타낸 조직사진 및 그래프이다.
도 5는 일 구체예의 줄기세포의 투여에 따른 follicles 및 Primordial follicles의 수 및 비율을 나타낸 조직사진이다.
도 6은 일 구체예의 줄기세포의 투여에 따른 follicles 및 Primordial follicles의 수 및 비율을 측정한 그래프이다.
도 7은 일 구체예의 줄기세포의 투여에 따른 난소 apoptosis를 나타낸 조직사진이다.
도 8은 일 구체예의 줄기세포의 투여에 따른 난소 apoptosis를 측정한 그래프이다.
도 9는 일 구체예의 줄기세포의 투여에 따른 AMH(Anti-Mullerian Hormone) 염색 영역을 나타낸 조직사진이다.
도 10은 일 구체예의 줄기세포의 투여에 따른 AMH(Anti-Mullerian Hormone) 염색 영역을 측정한 그래프이다.
도 11은 일 구체예의 줄기세포의 투여에 따른 과배란 난자 수를 나타낸 현미경 사진이다.
도 12는 일 구체예의 줄기세포의 투여에 따른 과배란 난자 수를 측정한 그래프이다.
도 13은 일 구체예의 줄기세포의 투여에 따른 체외수정에서의 2 cell 및 blastocyst의 비율을 나타낸 현미경 사진이다.
도 14는 일 구체예의 줄기세포의 투여에 따른 체외수정에서의 2 cell 및 blastocyst의 비율을 측정한 결과이다.
도 15는 난소에 존재하는 immune 세포군 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 16은 일 구체예의 줄기세포의 투여에 따른 immune 세포군 변화를 나타낸 그래프이다.
도 17은 난소에 존재하는 stroma 세포군 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 18은 일 구체예의 줄기세포의 투여에 따른 stroma 세포군 변화를 나타낸 그래프이다.
도 19는 난소에 존재하는 Granulosa 세포군 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 20은 일 구체예의 줄기세포의 투여에 따른 Granulosa 세포군 변화를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다. 실시예들은 다양한 변환을 가할 수 있는 바, 실시예들은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 다양한 형태로 구현될 수 있다.
실시예. 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 제조 및 특성 분석
1. 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 제조
대한민국 특허출원 제10-2016-0102721호와 동일한 방법으로 탯줄 유래 부착형 줄기세포를 제조하였으며, 상기 문헌은 그 전체가 참조로서 본 명세서에 포함된다.
정상적으로 분만한 건강한 산모로부터 사전에 충분한 설명에 근거한 동의(informed consent)를 받고, 정상 태반 분만 시에 수집된 태반조직으로부터 탯줄을 분리하였다. 분리된 탯줄을 Ca/Mg free DPBS로 2 내지 5회 세척하여 혈액을 제거하였다. 이후, 외부 양막은 벗겨내지 않고, 동맥 2개와 정맥 1개를 제거한 뒤 1 내지 5 mm 정도 크기로 탯줄을 잘라내었다. 이후, 상기 탯줄을 배양용기에 부착하여 10 내지 15일 배양을 하였고, 상기 배양된 조직에서 세포가 뻗어나오는 것을 확인한 후, 5 내지 6시간 동안 200 U/ml의 콜라게나아제 I을 처리하여 탯줄 유래 부착형 줄기세포를 분리하였다. 상기 콜라게나아제 I 처리 전, 후에 탯줄 부착된 조직에서 세포가 뻗어나오는 것을 확인하기 위하여 광학현미경하에서 40x, 100x 배율로 세포형태를 확인하였고, 이후, 상기 분리된 세포를 P0으로 하여, 25ng/ml FGF4, 1ug/ml 헤파린, 10% FBS가 함유된 MEM alpha GlutaMAX(CS-CM 배지)에서 37℃, 저산소 배양조건 (O2 3%) 하에서 배양하였다. 이후 3 내지 4일마다 CS-CM배지를 교체하여 플라스크 바닥에 붙지 않은 세포를 제거하고 첫 계대에서 동물 유래 성분이 없는(Animal Component Free) (ACF) 재조합 효소인 Invitrogen사의 TrypLE를 37℃인큐베이터에서 단기간 (3분) 처리하여 계대 배양하였다. 이하에서는 상기 분리된 줄기세포를 “CordSTEM”이라고 한다.
2. 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 특성분석
상기 실시예 1에서 제조한 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 표면 단백질 분석을 위해 유세포 분석 및 면역형광염색 분석을 수행하였다. 이는 대한민국 특허출원 제10-2016-0102721호에 기재된 바와 같이 동일한 방법으로 수행하였으며, 해당 문헌은 그 전체가 참조로서 본 명세서에 포함된다.
구체적으로, 유세포 분석을 위해 세포는 DPBS를 사용하여 세척 후, 2% FBS가 함유된 DPBS에 담아 Tra-1-60, CD3, CD1a, CD11c, CD16, CD14, CD86, CD8a, CD19, CD40, CD80, CD200, CD141, CD61, CD87, MIC A/B, SSEA4 마커를 아이스에서 20분간 반응시켰다. 이후, 유세포 분석기(FACS Calibur, Becton Bickinson)를 통해 표면 항원을 분석하였다. 또한, 배아줄기세포마커인 Oct4와 Nanog의 발현을 확인하고자 면역형광염색을 수행하였다. 먼저 세포를 DPBS로 3회 세척 후, 4% 파라포름알데하이드를 배양 용기에 각각 넣고 상온에서 10분간 고정하였다. 고정이 끝난 세포를 DPBS로 3회 세척하였다. 다음으로, 0.2% Triton X-100 용액을 넣고 상온에서 10분간 침투시킨 후 DPBS로 3회 세척하였다. 10% 정상 고트 혈청(Normal goat serum)을 넣고 상온에서 30분간 블로킹하고, 1차 항체(Oct4, Nanog)를 넣고 빛 차단한 후 4 ℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 이후, DPBS로 3회 세척 후 2차 항체를 넣고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 마지막으로, DPBS로 3회 세척 후 형광현미경 하에서 관찰하였다.
그 결과, 일 구체예에 따른 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 CD200, CD141, CD61, CD87 SSEA4에 선택적으로 양성을 나타내는 세포이고, TRA-1, CD3, CD1a, CD11c, CD16, CD86, CD8a, CD40, MIC A/B에 선택적으로 음성을 나타내는 세포이며, 추가적으로, CD61은 저산소 조건에서 선택적으로 양성을 나타내었다. 또한, 일 구체예에 따른 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 배아줄기세포 특이적 마커인 Oct4, Nanog 단백질은 발현하지 않음을 알 수 있다.
실험예. 난소기능부전에 대한 비임상 효력 검증
1. POI(Primary Ovarian Insufficiency) 마우스 모델 확립
POI 마우스 모델 확립을 위해 - 6주령 C57BL/6N 암컷 마우스에 CP(Cyclophosphamide)를 100, 200, 300, 400 mg/kg 농도로 투여하였고, 발정주기(estrous cycle), 난소 무게 (Ovary weight), 및 여포 수(follicle counting)를 측정하였고, 그 결과를 도 1 내지 도 4에 나타내었다.
도 1 내지 도 4에 나타낸 바와 같이 CP 투여 결과 난소의 기능부전이 일어난 것을 확인하였고, 이후의 실험에서는 CP 200 mg/kg 투여군을 효력 검증에 사용하였다.
2. 비임상 효력 검증
상기 실시예 1.에서 제조한 줄기세포의 난소기능부전에 대한 효력을 확인하기 위하여 CP 투여 7일째(Day 7), 일 구체예에 따른 CordSTEM을 100 uL/head의 용량으로 단회 미정맥 투여하였고, 17일째(Day 17)에 마우스를 안락사한 후 샘플링을 수행하였다.
시험군을 아래와 같이 나누어 진행하였다.
Group 1: 정상군 (N=10)
Group 2: Sham (CP 200 mg/kg 투여군, N=10)
Group 3: 저농도 세포 투여군 (N=10, CordSTEM 5.33 x 104 cells/mouse)
Group 4: 중농도 세포 투여군 (N=10, CordSTEM 8 x 104 cells/mouse)
Group 5: 고농도 세포 투여군 (N=10, CordSTEM 1.07 x 105 cells/mouse)
시험 평가 항목은 아래와 같다.
(1) 조직학적 검사
부검일에 마우스를 안락사 한 후, 양측 난소를 적출하였다. 양측 난소의 무게를 측정한 후, 4% paraformaldehyde 용액에 고정하였다. 고정시킨 후 좌측 및 우측 2개의 난소 조직을 이용하여 파라핀 블록을 제작하였다. 절편의 제작은 난소 조직을 5μm 두께로 10장씩 연속하여 절단한 것을 하나의 파트로 지정하여 난소 조직이 모두 잘릴 때까지 반복하였으며, 각 파트 사이에는 55μm의 간격을 띄어 조직 절편을 만들었다. 이후에 (1-1) H&E (follicle counting) (1-2) TUNEL 분석 (apoptosis) 및 (1-3) IHC (AMH)를 수행하였다.
(2) 과배란 난자 수 확인
200 mg/kg CP를 복강 내 단회 투여 후 7일차에 CordSTEM을 투여하였다. 시험물질 투여 후 21일차에 7.5IU PMSG(Pregnant Mare Serum Gonadotropin)를 복강 내 투여하였다. 48시간 후, 7.5IU hCG(HUMAN CHORIONIC GONADOTROPIN)를 복강 내 투여하였다. 15시간 후, 과배란 시킨 암컷 마우스의 난관을 적출하였다. 난관에서 꺼낸 COCs(cumulus-oocyte complexes)에 10 μl 히알루로니데이즈(hyaluronidase) 를 처리하여 cumulus cell을 벗겨낸 후 난자 수를 카운팅하였다
(3) 체외 수정: 난자 수정률 및 배아발달률 검증
시험물질 투여 후 7일째에 7.5 IU PMSG 복강 내 투여하였다. 48시간 후, 7.5 IU hCG 복강 내 투여하였다. 15시간 후, 과배란 시킨 암컷 마우스의 난관을 적출하였다. 수컷 마우스의 부정소에서 sperm을 짠 후, 1시간동안 배양하였다 (37℃, 5% CO2). 난관에서 COCs를 꺼낸 후 10 μl hyaluronidase를 처리하여 cumulus cell을 벗겨내었다. 난자들을 dish 가운데로 모으고 10 μl sperm을 난자 주변에 뿌린 후 4시간동안 배양하였다 (37℃, 5% CO2). Sperm이 모두 제거되도록 난자들을 washing 한 후 배양하여 배아 발달을 관찰하였다.
상기 (1-1)의 결과는 도 5 및 도 6에 나타내었고, 상기 (1-2)의 결과는 도 7및 도 8에 나타내었고, 상기 (1-3)의 결과는 도 9 및 도 10에 나타내었고, 상기 (2)의 결과는 도 11 및 도 12에 나타내었고, 상기 (3)의 결과는 도 13 및 도 14에 나타내었다.
도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 줄기세포의 투여는 follicles의 수 및 난소 내 follicles의 비율, 및 primodial follicles의 수를 무처리 대조군 대비 용량의존적으로 증가시킴을 알 수 있었다.
또한, 도 7및 도 8에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 줄기세포의 투여는 난소의 apoptosis를 대조군 대비 현저하게 감소시킴을 알 수 있었다.
또한, 도 9 및 도 10에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 줄기세포의 투여는 폐경 또는 다낭성 난소 증후군 등 난소의 기능과 관련된 AMH의 양을 대조군 대비 현저하게 증가시킴을 알 수 있었다.
또한, 도 11 및 도 12에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 줄기세포의 투여는 난소기능이 저하되어 난자의 배란이 저하된 동물 모델에서 과배란 난자의 수를 현저하게 증가시킴을 알 수 있었다.
또한, 도 13 및 도 14에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 줄기세포의 투여는 체외 수정 시의 수정란의 발달(2 cell 및 Blastocyst의 비율)을 대조군 대비 현저하게 증가시킴을 알 수 있었다.
이상의 결과는 일 구체예에 따른 줄기세포의 투여가 조기폐경, 난임, 또는 다낭성 난소 증후군 등을 포함하는 난소 부전의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 의미한다.
3. 단일세포 수준에서의 바이오마커 검증
상기 실시예 1.에서 제조한 줄기세포의 난소기능부전의 치료 기전을 확인하기 위해 단일세포 수준에서의 바이오마커를 확인하였다.
정상군, 음성 대조군, CordSTEM 저농도 투여군, CordSTEM 고농도 투여군 난소 샘플을 외과용 칼을 이용하여 잘게 자른 후 0.2% 콜라게네이즈(collagenase)에 담근 후 37℃에서 20분 반응시켰다. FACS 버퍼 (2% FBS/PBS)를 넣어서 콜라게네이즈 를 비활성화 시킨 후 원심분리법을 활용하여 2번 씻었다. 난소 조직으로부터 분리된 단일 세포들을 다음의 FACS 항체 (PE-Cy7 conjugated CD140a 항체, Alexa488 conjugated CD45항체)와 함께 반응시켰다. DAPI를 통해 죽은 세포를 걸러낸 후 CD140a+ 세포, CD45+ 세포, 그 외 세포 (CD140a-/CD45-)를 lysis buffer (0.1% Triton X-100, 1U/μl RNase 저해제, 0.25uM oligo dT와 2.5mM dNTP 포함)가 담긴 96-well plate에 well 당 1세포씩 분리하고 액체 질소에 담가 얼린 후 -80℃에 보관하였다.
얼렸던 96-well plate를 얼음 위에서 녹인 후 역전사반응을 위한 시약 (1X Maxima H- buffer, 1M Betaine, 5uM MgCl2, 1uM TSO, 40U/μl RNase 저해제, 200 U/μl Maxima H-RTase)을 넣어 역전사반응을 일으켰다. 96-well plate에 전장유전체증폭을 위한 시약 (1X KAPA HiFi buffer, 300uM dNTP, 500uM MgCl2, 0.167uM, 0.1uM ISPCR Primers, 1U/μl KAPA HiFi DNA Polymerase)을 넣은 후 전장유전체증복 반응을 일으켰다. 증폭된 cDNA를 sera-mag speed bead를 이용하여 정제하고 GAPDH qPCR을 통해 QC를 진행하였다. qPCR 결과 Ct 값이 확인되지 않은 샘플은 시퀀싱 라이브러리 제작 시 제외하였다. 시퀀싱 라이브러리 제작을 위해서 제작한 Single cell cDNA 라이브러리에 1X homemade Tn5 buffer와 Tn5를 넣어준 뒤, 55℃에서 5분 반응 시킨 후 얼음에 두었다. 이후에, Neutralize tagment buffer를 넣어주고 상온에 5분 두었다. NEXTERA index와 시퀀싱 라이브러리 증폭을 위한 시약 (1X KAPA bf, 300uM dNTP, 500uM MgCl2, 1u/μl KAPA enzyme)을 넣어 반응시켰다. 반응이 완료된 샘플을 모두 모은 후, 시퀀싱에 사용하는 용량의 5X 만큼의 PB를 넣어주었다. 다음으로 PCR 산물 정제 키트를 사용하여 정제하였다. 정제된 DNA를 TapeStation을 통해 정량분석을 수행하였다. 라이브러리에 0.3X bead를 넣어준 뒤 자석 분리하였다. 자석 분리된 상층액을 모아 0.6X bead를 넣어주고 자석 분리하였다. 상층액을 제거한 후 80% 에탄올로 씻어준 뒤 에탄올을 완전히 제거하였다. EB buffer를 넣어준 뒤 자석 분리해 라이브러리를 용출하였다. 시퀀싱에 사용되는 라이브러리는 4℃에 보관하였다. 시퀀싱 라이브러리는 NextSeq550 장비를 사용하여 paired-end 시퀀싱을 하였다.
다음으로, 시퀀싱 후 reads를 STAR aligner를 사용하여 mm10 mouse transcriptome에 align 하고 RSEM을 활용하여 샘플 별로 TPM과 count를 계산하였다. TPM 값은 log2 (TPM+1)로 변환하고 500개 이상의 유전자를 보인 세포와 적어도 5개 이상의 세포에서 보인 유전자를 선별하여 분석을 진행하였다. 분석은 Python환경에서 Numpy, SciPy, Matplotlib, sckit-learn, pandas 패키지를 사용하여 수행하였다. Variable 유전자를 고르고 이를 바탕으로 Principle component 분석과 tSNE 시각화를 진행하였다. 세포군을 분석하기 위해서 unsupervised hierarchical clustering을 수행하고 R software 환경에서 DESeq2 패키지를 사용하여 differentially expressed 유전자와 marker 유전자를 분석하였다.
정량 결과는 Prism Version 5.03을 사용하여 통계학적 분석을 실시하였다. Student's t-test를 실시하여 정상군과 음성 대조군의 비교를 실시하였으며, ONE-WAY ANOVA를 이용하여 음성 대조군과 시험물질 투여군의 비교를 실시하였다. 통계의 유의성은 p<0.05인 경우 통계학적으로 유의하다고 판정하였다.
immune 세포군 분석 결과는 도 15 및 16에 나타내었고, stroma 세포군 분석 결과는 도 17 및 18에 나타내었고, Granulosa(GC) 세포군 분석 결과는 도 19 및 20에 나타내었다.
도 15 및 16에 나타낸 바와 같이, CP 처리에 의해 POI 유도된 마우스에서 감소된 B 세포군 및 수지상 세포군들은 일 구체예에 따른 줄기세포의 투여에 따라 회복되는 것을 확인할 수 있었고, 특히 고농도 세포 투여군에서는 정상군과 유사한 수준으로 수지상 세포군들이 회복되는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 일 구체예에 따른 줄기세포의 난소기능회복은 난소에 존재하는 수지상 세포들의 회복을 통해 일어날 수 있다는 것을 의미한다.
도 17 및 18에 나타낸 바와 같이, CP 처리에 의해 POI 유도된 마우스에서 감소된 Fibroblast 3 세포군(Gsn)은 일 구체예에 따른 줄기세포의 투여 후에도 회복되지 않았지만, Fibroblast 2 세포군(Itm2a)은 일 구체예에 따른 줄기세포의 투여 후에 회복된 것을 알 수 있었다.
도 19 및 20에 나타낸 바와 같이, CP 처리에 의해 POI 유도된 마우스에서 증가된 Luteinizing mural 세포군(Parm1), 및 atretic 세포군(Cfh)은 일 구체예에 따른 줄기세포의 투여 후에 감소된 것을 확인할 수 있었다. 특히 Luteinizing mural 세포군과 atretic 세포군은 정상 대조군과 유사한 수준으로 회복되는 것을 알 수 있었고, Atretic 세포는 여포가 발달을 하지 못하고 죽어가는 세포임을 고려했을 때, 일 구체예에 따른 세포는 atretic 세포를 감소시키므로 난소기능부전의 치료에 현저한 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
이상의 결과로, 일 구체예에 따른 줄기세포가 POI 마우스 모델에서 B cell, dendritic cell, fibroblast, luteinizing mural cell, 및 atretic cell의 기능을 회복시키는 것을 알 수 있었고, 이러한 결과는 일 구체예에 따른 줄기세포가 난자의 발달과 성숙에 중요한 주위 구성 세포들의 회복을 유도하고, 이를 통해 난소 기능을 회복시킨다는 것을 의미한다.

Claims (19)

  1. 탯줄 유래 부착형 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 난소 부전(ovarian insufficiency)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 탯줄 유래 부착형 줄기세포는 D200+, Tra-1-60-, CD3-, CD1a-, CD11c-, CD16-, CD86-, CD8a-, CD40-, CD141+, CD61+, CD87+, MIC A/B- 및 SSEA4+로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 표면 항원 특성을 갖는 것인 약학적 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 난소 부전은 1차 난소부전, 2차 난소부전, 고안드로겐 혈증, 다낭성 난소 증후군(polycystic ovary syndrome), 무월경, 희발월경, 조기폐경 및 난임 중에서 선택된 어느 하나인 것인 약학적 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포는 여포(follicles) 또는 원시 여포(primordial follicles)의 수를 증가시키는 것인 약학적 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포는 난자의 배란을 촉진하는 것인 약학적 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포는 수정란의 발달을 촉진하는 것인 약학적 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포는 난소 부전에서 감소된 B cell, dendritic cell, 및 fibroblast로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 세포의 기능 또는 활성을 회복시키는 것인 약학적 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포는 난소 부전에서 증가된 luteinizing mural cell 또는 atretic cell의 수 또는 활성을 감소시키는 것인 약학적 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포는 Cd 19 또는 Cd 209a의 발현 또는 활성을 증가시키는 것인 약학적 조성물.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포는 Itm2a의 발현 또는 활성을 증가시키거나, Parm1 또는 Chf의 발현 또는 활성을 감소시키는 것인 약학적 조성물.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포는 1.0 X 103 내지 1.0 X 1010 cells/개체의 양으로 투여되는 것인 약학적 조성물.
  12. 유효량의 탯줄 유래 부착형 줄기세포를 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 난소 부전(ovarian insufficiency)을 예방하거나 치료하는 방법.
  13. 유효량의 탯줄 유래 부착형 줄기세포를 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 여포(follicles) 또는 원시 여포(primordial follicles)의 수를 증가시키는 방법.
  14. 유효량의 탯줄 유래 부착형 줄기세포를 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 난자 배란을 촉진시키는 방법.
  15. 유효량의 탯줄 유래 부착형 줄기세포를 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 수정란 발달을 촉진시키는 방법.
  16. 유효량의 탯줄 유래 부착형 줄기세포를 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 난소 부전에서 감소 또는 증가된 세포의 기능 또는 활성을 각각 증가 또는 감소시키는 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 난소 부전에서 감소된 세포는 B cell, dendritic cell, 및 fibroblast로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 세포인 것인 방법.
  18. 청구항 16에 있어서, 상기 난소 부전에서 증가된 세포는 luteinizing mural cell 또는 atretic cell인 것인 방법.
  19. 난소 부전의 예방 또는 치료를 위한 약학적 제제의 제조에 사용하기 위한 탯줄 유래 부착형 줄기세포의 용도.
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