WO2024126503A1 - Vorrichtung und verfahren zur dynamischen fluoreszenzanalyse, insbesondere für die molekulardiagnostik - Google Patents

Vorrichtung und verfahren zur dynamischen fluoreszenzanalyse, insbesondere für die molekulardiagnostik Download PDF

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hoe
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temporally
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Reinhold Fiess
Ingo Ramsteiner
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Robert Bosch Gmbh
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    • G01N2021/6463—Optics

Definitions

  • Molecular diagnostic methods such as the quantitative polymerase chain reaction (qPCR or RT-PCR for short) and various isothermal amplification methods use a fluorescence-based method to read the assay.
  • the sample is irradiated with light of selected wavelengths at regular time intervals or synchronously with temperature cycles and the fluorescence emitted by the sample is measured.
  • multiplex methods in which different fluorescent dyes in the sample provide information independently of one another.
  • four different dyes can be included in one assay, which fluoresce depending on their binding to four different nucleotide sequences, thus enabling testing for three different pathogens plus a human control, for example.
  • the technical challenge always lies in quantitatively detecting weak fluorescence signals against a radiation background of fluorescence excitation that is several orders of magnitude stronger.
  • the separation is usually carried out spectrally, ie with very steep edges.
  • High-quality bandpass filters in the detection optics only allow wavelengths that correspond to the respective fluorescence band to pass through to the detector.
  • time-resolved detection methods are known (Fluorescence Lifetime Imaging - FLIM), in which the separation between excitation and detection light occurs on the time axis.
  • JINST 14 P05019 also describes a concept for exciting a sample obtained from PCR with modulated UV light and an analysis based on exploiting the phase shift between excitation and fluorescence radiation using a silicon photomultiplier. Disclosure of the invention
  • the invention relates to a method and a device for temporally and spectrally resolved fluorescence analysis, in particular for molecular diagnostics.
  • the device comprises a sample region for the temporally modulated irradiation of a sample with excitation light from an excitation light source and at least one first detector for the temporally resolved detection of fluorescent light generated by the excited sample.
  • the device further comprises a holographic optical element (HOE for short) for the local spectral separation of light, wherein the HOE is designed to deflect light of a first wavelength range incident on the HOE from the sample region in order to selectively guide light from the first wavelength range to the first detector.
  • HOE holographic optical element
  • the device is also set up to analyze fluorescent light incident on the first detector, in particular the light from the first wavelength range deflected by the HOE, in a temporally resolved manner.
  • electronic signal processing of the detector or device can be set up to carry out the time-resolved analysis.
  • light incident on the detector during a first time interval from the start of the excitation of the sample is not used for the analysis or is considered for the analysis as predominantly or completely excitation light.
  • the invention advantageously enables a cooperating double separation, on the one hand an effective temporal separation of the fluorescent light from the excitation light by the time-resolved analysis and on the other hand an effective spectral and spatial separation of the wavelength range of the fluorescent light to be detected by the HOE.
  • the device and the method carried out with it thus have the advantage that the reduced analyzable amount of the fluorescent light to be detected due to the time-based evaluation can be effectively compensated for by using the HOE.
  • the HOE unlike a bandpass filter in particular, can be designed to process various to practically any wavefront. This makes it possible to record the fluorescent light emitted by the sample at a large solid angle and to focus it onto a detector element in a wavelength-selective manner.
  • the sample area is understood to mean a specific spatial area relative to the HOE and preferably relative to the first detector, in particular a specific solid angle area in which a sample can be placed and preferably fixed.
  • the sample can in particular be a biological or chemical sample which is mixed with dyes, in particular fluorophores.
  • the sample can comprise parts of a body fluid of an animal or a human, for example components of blood, urine, sputum or a smear or from a tissue sample.
  • the sample can contain nucleic acids or sections of nucleic acids, preferably amplified parts of nucleic acids from an isothermal or polymerase chain reaction (“PCR”)-based amplification of nucleic acid sections.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the sample can comprise a product from a detection method for detecting pathogens, in particular a product from an isothermal or PCR-based DNA amplification, wherein the detection of the presence of certain pathogens is carried out in particular via a fluorescence-based selection of Fluorophores.
  • a device designed in this way can therefore be used particularly advantageously as a compact device for point-of-care applications in molecular diagnostics.
  • the invention therefore also relates to a device for carrying out nucleic acid amplification, in particular for detecting pathogens, comprising a device according to the invention, in particular a point-of-care device.
  • the device is based on the commercially available VivalyticO analyzer.
  • the excitation light source can comprise, for example, a light-emitting diode, a superluminescence diode or preferably a laser or a laser diode, for example also a VCSEL (vertical cavity or a VCSEL array).
  • the excitation light source can be part of the device. Alternatively, the device can be designed to allow light from the excitation source to enter the sample area, for example via an opening or transparent wall.
  • the holographic optical element also referred to as a holographic optical component, is a component whose holographic properties can be used for the optics of devices, for example to replace conventional lenses, mirrors and prisms.
  • the HOE is preferably a transmission HOE comprising one or more transmission holograms, which is preferably designed as a volume hologram, or alternatively a reflection HOE comprising one or more reflection holograms.
  • a transmission HOE comprising one or more transmission holograms
  • a reflection HOE comprising one or more reflection holograms.
  • such an HOE is characterized by a particularly high efficiency and effectiveness for spectral and local separation of light components of predetermined wavelengths, without the need for additional optical aids such as bandpass filters or lenses.
  • the HOE is designed to direct fluorescent light of a second wavelength range coming from the sample area via the HOE to a second detector of the device, which is then preferably also analyzed in a time-resolved manner in order to separate fluorescent light from possible excitation light of a similar wavelength to distinguish.
  • the device can have further detectors for further wavelength ranges, wherein the HOE is designed to direct light from these wavelength ranges to one of these detectors in each case.
  • the device can also comprise a second or more than two HOEs, which direct fluorescent light from different wavelength ranges to different detectors.
  • the device is set up to analyze fluorescent light for several samples arranged in the sample area via the HOE or, according to special embodiments of the invention, via several HOEs and via several detectors in a time-resolved manner.
  • the several samples can, for example, be samples which are arranged in a cavity array. This advantageously allows geometric multiplexing.
  • the invention also relates to a method for temporally and spectrally resolved fluorescence analysis, in particular for molecular diagnostics.
  • excitation light is radiated in a temporally modulated manner onto a sample to generate fluorescent light
  • light of a first wavelength range from the fluorescent light is directed with a holographic optical element onto a first detector for the temporally resolved analysis.
  • the temporal modulation has a pulse shape at least temporarily. This supports the temporal separation of excitation light and fluorescent light as described above.
  • Figure 1 shows a diagram as described above showing the time-dependent intensity of excitation light incident on a sample and the subsequent fluorescence light emitted by fluorophores in the sample
  • FIG. 2 shows an embodiment of the device according to the invention and the device according to the invention
  • Figure 3 is a flow chart of an embodiment of the method according to the invention.
  • FIG. 2 An embodiment of the device 100 according to the invention is outlined in Figure 2.
  • the device 100 can be part of a device 1000 described above for carrying out nucleic acid amplification, for example a point-of-care device for detecting pathogens.
  • Figure 3 shows a flow chart for a method 600 that can be carried out with the device 100.
  • the intensity of the excitation light 15 is temporally modulated and its wavelength spectrum is suitable for exciting at least one of the dyes contained in the sample 20 to fluoresce.
  • the light source 60 can be a light-emitting diode, superluminescent diode or preferably a laser or a laser diode, for example also a VCSEL (vertical cavity or a VCSEL array).
  • the entire excitation optics can contain additional light sources and optical components (lenses, hollow or freeform mirrors, interference filters, dichroic mirrors, gratings, holographic or diffractive elements, etc.).
  • the intrinsic wavelength selectivity of the HOE is used to redirect only light in the first wavelength range 17 in this way. It is advantageous if spherical wave fronts are processed, i.e. light is collected on the sample side and focused on the detector side.
  • the HOE can also be set up to direct light from other wavelength ranges 18, 19, 13 to further, in particular different detectors 132, 133, 134, for example light from the disjoint ranges 567-579 nm, 613-627 nm and/or 685-699 nm.
  • geometric multiplexing can also advantageously be operated.
  • a sample 20 (in particular a point in the sample plane) is imaged spectrally dependently onto N, for example four, different detectors 131, 132, 133, 134, as indicated in Figure 2.
  • the HOE 110 can now be set up in such a way that it fulfills this function for M samples (i.e.
  • M points/areas on the sample plane directs each of them to N different detectors.
  • M samples in N color channels can thus be directed to NxM detectors.
  • several HOEs can alternatively be used for the different samples, whereby the several HOEs are arranged, for example, along a line or an arc with respect to the sample area for high efficiency.
  • the HOE 110 is preferably a transmission hologram in the form of one or more volume holograms that are incorporated into one or more layers, in particular photopolymer layers.
  • the layers can be applied to a suitable, in particular transparent, carrier, for example a glass plate, or embedded between two carriers. be in laminated form, for example.
  • the hologram can be exposed into the layer(s) according to the desired arrangement of the light sources to the HOE and the sample area.
  • the hologram can be embossed into the layer, for example, using an embossing template (also called a "master").
  • the detector 131 or the detectors 131, 132 and the electronic signal processing connected behind them are set up to separate scattered light and fluorescent light using temporal resolution in a third step 603 in conjunction with the temporal modulation of the excitation light 15.
  • light striking the detector during a first time interval from the start of the excitation of the sample is not used for the analysis, since this light can be strongly dominated by excitation light, as illustrated at the beginning.
  • Such a dynamic measurement can be carried out, for example, in the following ways:
  • the light source 60 emits very short pulses, depending on the type of light source in the micro- or nanosecond range, at the end of which the intensity drops within 10' 9 s or faster.
  • the detector 131 for example an avalanche photodiode (APD) or a silicon photomultiplier (SiPM), has sufficient time resolution to identify photons that are only registered after the scattered excitation pulse has decayed, or is only activated electronically then. The measurement can be repeated several times to improve the signal statistics.
  • APD avalanche photodiode
  • SiPM silicon photomultiplier
  • the light source 60 is modulated with a frequency that is preferably between 10 kHz and 100 MHz and a PMD (Photon Mixing Device) is used as the detector 131, 132.
  • PMD Photon Mixing Device
  • These commercially available sensors also as a pixel array) have two charge carrier wells, between which switching takes place in time with the reference signal (i.e. the light source 60).
  • a transmission HOE 110 a reflection HOE based on one or more reflection holograms can also be used, which can have a higher spectral quality and even better scattered light suppression, but a reflection arrangement with spherical wavefronts leads to larger differences in the running time of the light paths, which
  • Pulse edges of the scattered excitation light can be softened and temporal separation can thus be made more difficult.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung (100) zur zeitlich und spektral aufgelösten Fluoreszenzanalyse, insbesondere für die Molekulardiagnostik, umfassend einen Probenbereich (120) zum zeitlich modulierten Bestrahlen einer Probe (20) mit Anregungslicht (15) aus einer Anregungslichtquelle (60), zumindest einen ersten Detektor (131) zur zeitlich aufgelösten Detektion von Fluoreszenzlicht (16) und ein holografisch-optisches Element (110) zur örtlichen Auftrennung von Licht, wobei das HOE (110) ausgebildet ist, von dem Probenbereich (120) auf das HOE (110) einfallendes Licht (17) eines ersten Wellenlängenbereichs abzulenken, um selektiv Licht (17) aus dem ersten Wellenlängenbereich auf den ersten Detektor (131) zu leiten und wobei der Vorrichtung (100) eingerichtet ist, auf den ersten Detektor (131) einfallendes Fluoreszenzlicht (17) zeitlich aufgelöst zu analysieren. Ferner betrifft die Erfindung ein zugehöriges Verfahren (600) und eine Einrichtung (1000) zur Durchführung einer Nukleinsäure-Vervielfältigung umfassend eine solche Vorrichtung (100).

Description

Beschreibung
Titel insbesondere
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Stand der Technik
Molekulardiagnostische Verfahren wie die quantitative Polymerase Kettenreaktion (kurz qPCR oder RT -PCR)sowie diverse isotherme Amplifikationsverfahren nutzen ein fluoreszenzbasiertes Verfahren zum Auslesen des Assays. Dabei wird die Probe in regelmäßigen Zeitintervallen oder synchron zu Temperaturzyklen mit Licht ausgewählter Wellenlängen bestrahlt und die von der Probe daraufhin abgestrahlte Fluoreszenz gemessen.
Besondere Bedeutung haben hierbei Multiplex-Verfahren, bei denen verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe in der Probe unabhängig voneinander Informationen geben. So können beispielsweise vier verschiedene Farbstoffe in einem Assay erhalten sein, die abhängig von der Bindung an vier unterschiedliche Nukleotidsequenzen fluoreszieren und damit beispielsweise den Test auf drei verschiedene Krankheitserreger plus eine Humankontrolle realisieren.
Ob im Rahmen aufwendiger Labordiagnostik oder einfacherer Lab-on-Chip- Systeme besteht die technische Herausforderung stets darin, schwache Fluoreszenzsignale vor einem mehrere Größenordnungen stärkeren Strahlungshintergrund der Fluoreszenzanregung quantitativ zu detektieren. Üblicherweise erfolgt die Trennung spektral, d.h. sehr flankensteile, hochwertige Bandpassfilter lassen in der Nachweisoptik nur Wellenlängen zum Detektor passieren, die dem jeweiligen Fluoreszenzband entsprechen. Im High-End Bereich der Fluoreszenzmikroskopie sind zeitaufgelöste Detektionsverfahren bekannt (Fluorescence Lifetime Imaging - FLIM), bei denen hingegen die Trennung zwischen Anregungs- und Nachweislicht auf der Zeitachse erfolgt Die intrinsische Fluoreszenzlebensdauer (typischerweise einige Nanosekunden) wird also ausgenutzt, um das Detektionssystem erst nach Abschalten der Anregung scharf zu schalten. Bei solch zeitaufgelösten Verfahren ist grundsätzlich ein Trade-Off zwischen Nachweisgrenze und spektraler Selektivität zu berücksichtigen. Wie in Figur 1 dargestellt, erzeugt ein kurzer Puls 15 Anregungslicht Fluoreszenzlicht 16, das auch nach Ende des Pulses exponentiell abfallend nachleuchtet, gemäß der Fluorophor-abhängigen Zeitkonstante. Die Intensitäten 15, 16 in der skizzierten Lichtintensität 12 über Zeit 11 Darstellung 10 der Figur 1 sind dabei unterschiedlich skaliert - tatsächlich ist die Intensität des Fluoreszenzlichts insbesondere bei molekulardiagnostischen Anwendungen um Größenordnungen schwächer als das Anregungslicht. Da somit nur ein abklingendes Fluoreszenz-„Echo“ gemessen werden kann, steht vergleichsweise wenig Intensität zur Verfügung. Beim Multiplexing ist dieses Licht noch spektral zu filtern, um die unterschiedlichen Fluorophore zu trennen. Dabei geht viel Licht verloren, insbesondere bei üblicher Verwendung von hochwertigen, also flankensteilen Bandpassfiltern, welche nur eine kleine Strahldivergenz akzeptieren. Nach den Regeln der technischen Optik (Etendue- Erhaltung) müssen diese Filter dann entweder sehr großflächig und somit teuer und aufwändig verbaubar sein, oder man muss auch hier wieder viel Licht verwerfen.
Aus einer Publikation von Siminfar und Shoaei (JINST 14 P05019, 2019) ist ferner ein Konzept zur Anregung einer aus PCR gewonnenen Probe mit moduliertem UV-Licht und einer auf Ausnutzung der Phasenverschiebung zwischen Anregungs- und Fluoreszenzstrahlung basierten Analyse mit einem Silizium-Photomultiplier bekannt. Offenbarung der Erfindung
Vorteile der Erfindung
Vor diesem Hintergrund betrifft die Erfindung ein Verfahren und eine Vorrichtung zur zeitlich und spektral aufgelösten Fluoreszenzanalyse, insbesondere für die Molekulardiagnostik.
Die Vorrichtung umfasst einen Probenbereich zum zeitlich modulierten Bestrahlen einer Probe mit Anregungslicht aus einer Anregungslichtquelle sowie zumindest einen ersten Detektor zur zeitlich aufgelösten Detektion von durch die angeregte Probe erzeugtem Fluoreszenzlicht. Ferner umfasst die Vorrichtung ein holografisch-optisches Element (kurz HOE) zur örtlichen spektralen Auftrennung von Licht, wobei das HOE ausgebildet ist, von dem Probenbereich auf das HOE einfallendes Licht eines ersten Wellenlängenbereichs abzulenken, um selektiv Licht aus dem ersten Wellenlängenbereich auf den ersten Detektor zu leiten. Unter einer örtlichen spektralen Auftrennung von Licht ist dabei insbesondere zu verstehen, dass Licht aus dem ersten Wellenlängenbereich durch das HOE in eine andere Raumrichtung gelenkt wird als Licht aus einem disjunkten zweiten Wellenlängenbereich. Die Vorrichtung ist darüber hinaus eingerichtet, auf den ersten Detektor einfallendes Fluoreszenzlicht, insbesondere das durch das HOE abgelenkte Licht aus dem ersten Wellenlängenbereich, zeitlich aufgelöst zu analysieren. Insbesondere kann dabei eine elektronische Signalverarbeitung des Detektors bzw. der Vorrichtung eingerichtet sein, die zeitlich aufgelöste Analyse durchzuführen. Insbesondere wird dabei während eines ersten Zeitintervalls ab Beginn der Anregung der Probe auf den Detektor auftreffendes Licht nicht für die Analyse verwendet oder für die Analyse als überwiegend oder vollständig Anregungslicht berücksichtigt.
Die Erfindung ermöglicht vorteilhafterweise eine zusammenwirkende doppelte Trennung, einerseits eine effektive zeitliche Trennung des Fluoreszenzlichts vom Anregungslicht durch die zeitlich aufgelöste Analyse und andererseits eine effektive spektrale und örtliche Trennung des nachzuweisenden Wellenlängenbereichs des Fluoreszenzlichts durch das HOE. Die Vorrichtung und das damit durchzuführende Verfahren haben somit den Vorteil, dass die aufgrund der zeitbasierten Auswertung verringerte analysierbare Menge des nachzuweisenden Fluoreszenzlichts durch die Verwendung des HOEs vorteilhafterweise effektiv kompensiert werden kann. Vorteilhafterweise kann das HOE, anders als insbesondere ein Bandpassfilter, ausgelegt werden, um verschiedene bis praktisch beliebige Wellenfronten zu verarbeiten. Damit ist es möglich, das von der Probe abgestrahlte Fluoreszenzlicht in einem großen Raumwinkel aufzunehmen und wellenlängenselektiv auf ein Detektorelement zu bündeln. Konventionelle Spektrometeranordnungen wie zum Beispiel nach Czerny-Turner erfordern hingegen zunächst eine Parallelisierung der Lichtstrahlen für das dispersive Element und anschließend wieder eine Fokussierung. Somit ist von besonderem Vorteil, dass aufgrund dieser Kombination eines dynamischen Messverfahrens mit einem HOE auf die Verwendung von Bandpassfiltern, Linsen und anderen beweglichen Teilen verzichtet werden kann, welche für hohe Effizienz kostenintensiv und für Multiplexing aufgrund der erforderlichen Mechanik aufwändig einzurichten wären.
Unter dem Probenbereich ist ein bestimmter räumlicher Bereich relativ zum HOE und vorzugsweise relativ zum ersten Detektor zu verstehen, insbesondere ein bestimmter Raumwinkelbereich, in welchem eine Probe platziert und vorzugsweise fixiert werden kann.
Bei der Probe kann es sich insbesondere um eine biologische oder chemische Probe handeln, welche mit Farbestoffen, insbesondere Fluorophoren versetzt ist. Beispielsweise kann die Probe Teile einer Körperflüssigkeit eines Tieres oder eines Menschen umfassen, beispielsweise Bestandteile aus Blut, Urin, Sputum oder einem Abstrich oder aus einer Gewebeprobe. Insbesondere kann die Probe Nukleinsäuren oder Abschnitte von Nukleinsäuren beinhalten, bevorzugt vervielfältigte Teile von Nukleinsäuren aus einer isothermalen oder auf Polymerase- Kettenreaktion („PCR“) basierenden Vervielfältigung von Nukleinsäure-Abschnitten. Beispielsweise kann die Probe ein Produkt aus einem Nachweisverfahren zum Nachweis von Krankheitserregern umfassen, insbesondere ein Produkt aus einer isothermalen oder PCR-basierten DNA- Amplifikation, wobei der Nachweis eines Vorliegens bestimmter Krankheitserreger insbesondere über eine fluoreszenz-basierte Auslese von mit Fluorophoren gekennzeichneten DNA-Proben erfolgen soll. Eine derart ausgebildete Vorrichtung ist somit besonders vorteilhaft als kompaktes Gerät für Point-of-Care-Anwendungen in der Molekulardiagnostik einsetzbar. Die Erfindung betrifft somit auch eine Einrichtung zur Durchführung einer Nukleinsäure-Vervielfältigung, insbesondere zum Nachweis von Krankheitserregern, umfassend eine erfindungsgemäße Vorrichtung, insbesondere eine Point-of-Care-Einrichtung. Beispielsweise basiert die Einrichtung auf dem kommerziell erhältlichen VivalyticO-Analyser.
Die Anregungslichtquelle kann beispielsweise eine Leuchtdiode, eine Superlumineszenzdiode oder vorzugsweise einen Laser oder eine Laserdiode, beispielsweise auch ein VCSEL (vertical cavity oder ein VCSEL-Array) umfassen. Die Anregungslichtquelle kann Bestandteil der Vorrichtung sein. Alternativ kann die Vorrichtung ausgestaltet sein, Licht der Anregungsquelle, beispielsweise über eine Öffnung oder transparente Wand, zum Probenbereich eintreten zu lassen.
Bei dem holografisch-optisches Element (HOE), auch als holografisch-optisches Bauelement bezeichnet, handelt es sich um ein Bauelement, dessen holografische Eigenschaften für die Optik von Geräten verwendet werden kann, um beispielsweise herkömmliche Linsen, Spiegel und Prismen zu ersetzen. Das HOE ist vorzugsweise ein Transmissions-HOE umfassend ein oder mehrere Transmissionshologramme, welches bevorzugt als Volumenhologramm ausgestaltet ist, oder alternativ ein Reflexions-HOE umfassend ein oder mehrere Reflexionshologramme. Wie oben ausgeführt, zeichnet sich ein solches HOE durch eine besonders hohe Effizienz und Effektivität für eine spektrale und örtliche Abtrennung von Lichtanteilen vorgegebener Wellenlängen aus, ohne dass es zusätzlicher optischer Hilfsmittel wie insbesondere Bandpassfilter oder Linsen bedarf.
In einer besonders vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung ist das HOE eingerichtet, aus dem Probenbereich kommendes Fluoreszenzlicht eines zweiten Wellenlängenbereichs über das HOE auf einen zweiten Detektor der Vorrichtung zu lenken, welches dann vorzugsweise ebenfalls zeitlich aufgelöst analysiert wird, um Fluoreszenzlicht von möglichem Anregungslicht ähnlicher Wellenlänge zu unterscheiden. Mit anderen Worten werden Lichtanteile aus verschiedenen, vorzugsweise disjunkten (=nicht überlappenden) Wellenlängenbereichen über das HOE auf unterschiedliche Detektoren geleitet Gemäß weiteren Ausgestaltungen kann die Vorrichtung weitere Detektoren für weitere Wellenlängenbereiche aufweisen, wobei das HOE entsprechend ausgebildet ist, Licht aus diesen Wellenlängenbereichen auf jeweils einen dieser Detektoren zu lenken. Alternativ oder zusätzlich kann die Vorrichtung auch ein zweites oder mehr als zwei HOEs umfassen, welche Fluoreszenzlicht verschiedener Wellenlängenbereiche auf unterschiedliche Detektoren lenken.
In einer besonders bevorzugten Weiterbildung der Erfindung ist die Vorrichtung eingerichtet, für mehrere im Probenbereich angeordnete Proben Fluoreszenzlicht über das HOE oder, gemäß besonderen Ausgestaltungen der Erfindung, über mehrere HOEs und über mehrere Detektoren zeitlich aufgelöst zu analysieren. Bei den mehreren Proben kann es sich beispielsweise um Proben handeln, welche in einem Kavitätenarray angeordnet sind. Dies erlaubt vorteilhafterweise ein geometrisches Multiplexing.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur zeitlich und spektral aufgelösten Fluoreszenzanalyse, insbesondere für die Molekulardiagnostik. Dabei wird Anregungslicht zeitlich moduliert auf eine Probe zur Erzeugung von Fluoreszenzlicht gestrahlt und Licht eines ersten Wellenlängenbereichs aus dem Fluoreszenzlicht mit einem holografisch-optischen Element auf einen ersten Detektor für die zeitlich aufgelöste Analyse gelenkt. Vorzugsweise weist die zeitliche Modulation dazu zumindest zeitweise eine Pulsform auf. Dies unterstützt die zeitliche Trennung von Anregungslicht und Fluoreszenzlicht wie oben beschrieben.
Zu den Vorteilen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird auch auf die oben ausgeführten Vorteile der erfindungsgemäßen Vorrichtung verwiesen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen schematisch dargestellt und in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert. Für die in den verschiedenen Figuren dargestellten und ähnlich wirkenden Elemente werden gleiche Bezugszeichen verwendet, wobei auf eine wiederholte Beschreibung der Elemente verzichtet wird.
Es zeigen
Figur 1 ein eingangs beschriebenes Diagramm zur zeitlich abhängigen Intensität von auf eine Probe einfallendem Anregungslicht und daraufhin von Fluorophoren in der Probe abgegebenem Fluoreszenzlicht,
Figur 2 ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung und der erfindungsgemäßen Einrichtung,
Figur 3 ein Flussdiagramm eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Ausführungsformen der Erfindung
Ein Ausführungsbeispiel zur erfindungsgemäßen Vorrichtung 100 ist in Figur 2 skizziert. Die Vorrichtung 100 kann dabei Teil einer oben beschriebenen Einrichtung 1000 zur Durchführung einer Nukleinsäure-Vervielfältigung sein, beispielsweise einer Point-of-Care-Einrichtung zum Nachweis von Krankheitserregern. Figur 3 zeigt ein Flussdiagramm zu einem mit der Vorrichtung 100 ausführbarem Verfahren 600. Eine beispielsweise biologische Probe 20, welche in einem vorgegebenen Probenbereich 120 der Vorrichtung 100 platziert wurde, wird in einem ersten Schritt 601 mit Anregungslicht 15 aus einer Lichtquelle 60 beleuchtet. Die Intensität des Anregungslichts 15 ist zeitlich moduliert und sein Wellenlängenspektrum ist geeignet, mindestens einen der in der Probe 20 enthaltenen Farbstoffe zur Fluoreszenz anzuregen. Bei der Lichtquelle 60 kann es sich um eine Leuchtdiode, Superlumineszenzdiode oder vorzugsweise einen Laser oder eine Laserdiode, beispielsweise auch ein VCSEL (vertical cavity oder ein VCSEL-Array handeln). Die gesamte Anregungsoptik kann weitere Lichtquellen und optische Komponenten (Linsen, Hohl- oder Freiformspiegel, Interferenzfilter, dichroitische Spiegel, Gitter, holografische oder diffraktive Elemente, etc.) umfassen.
Von der Probe 20 ausgesendetes Fluoreszenzlicht 16 eines ersten Wellenlängenbereichs 17, beispielsweise Licht mit Wellenlängen zwischen 519 und 531 nm, wird einem zweiten Schritt 602 über einen gewissen, vorzugsweise möglichst großen Raumwinkel von einem holografisch optischen Element (HOE) 110 aufgenommen und auf einen ersten Detektor 131 umgelenkt. Die intrinsische Wellenlängenselektivität des HOE wird dabei genutzt, nur Licht des ersten Wellenlängenbereichs 17 in dieser Weise umzulenken. Es ist vorteilhaft, wenn dabei kugelförmige Wellenfronten verarbeitet werden, also probenseitig Licht gesammelt und detektorseitig fokussiert wird. Das HOE kann außerdem eingerichtet sein, Licht anderer Wellenlängenbereiche 18, 19, 13 auf weitere, insbesondere jeweils verschiedene Detektoren 132, 133, 134 zu lenken, beispielsweise Licht aus den disjunkten Bereichen 567-579 nm, 613-627 nm und/oder 685-699 nm. Insbesondere bei Verwendung eines größeren Detektor- Arrays kann zusätzlich vorteilhafterweise geometrisches Multiplexing betrieben werden. Dabei bildet eine Probe 20 (insbesondere ein Punkt in der Probenebene) spektral abhängig auf N, beispielsweise vier, verschiedene Detektoren 131 , 132, 133, 134 ab, wie in Figur 2 angedeutet. Das HOE 110 kann nun so eingerichtet sein, dass es diese Funktion für M Proben (also M Punkte/Bereiche auf der Probenebene) erfüllt und jede davon auf jeweils N unterschiedliche Detektoren lenkt. Somit können allgemein M Proben in N Farbkanälen auf NxM Detektoren gelenkt werden. Statt des einen HOE 110 können alternativ auch mehrere HOEs für die verschiedenen Proben verwendet werden, wobei die mehreren HOEs für hohe Effektivität beispielsweise entlang einer Linie oder eines Bogens bezüglich des Probenbereichs angeordnet werden.
Bei dem HOE 110 handelt es sich vorzugsweise um ein Transmissionshologramm in Form von ein oder mehreren Volumenhologrammen, die in ein oder mehrere Schichten, insbesondere Photopolymerschichten, eingebracht sind. Die Schichten können auf einem geeigneten, insbesondere transparenten, Träger aufgebracht sein, beispielsweise eine Glasplatte, oder auch zwischen zwei Trägern eingebettet sein, beispielsweise in laminierter Form. Bei einer Ausgestaltung als Volumenhologramm kann das Hologramm in die Schicht(en) entsprechend der gewünschten Anordnung der Lichtquellen zum HOE und zum Probenbereich einbelichtet werden. Bei einer Ausgestaltung als Hologramm mit lokaler Variation der Schichtdicke kann das Hologramm beispielsweise mit Hilfe einer Prägevorlage (auch „Master“ genannt) in die Schicht eingeprägt werden.
Der Detektor 131 bzw. die Detektoren 131 , 132 und die dahinter geschaltete elektronische Signalverarbeitung sind eingerichtet, im Zusammenspiel mit der zeitlichen Modulation des Anregungslichts 15 in einem dritten Schritt 603 Streulicht und Fluoreszenzlicht über zeitliche Auflösung zu trennen. Dabei wird ausgenutzt, dass wie eingangs beschrieben die Fluoreszenz der relevanten Farbstoffe eine Abklingzeit von mehreren Nanosekunden aufweist, also nach Abschalten der Anregungsstrahlung entsprechend „nachleuchtet“. .Insbesondere wird dabei während eines ersten Zeitintervalls ab Beginn der Anregung der Probe auf den Detektor auftreffendes Licht nicht für die Analyse verwendet, da dieses Licht stark von Anregungslicht dominiert sein kann, wie eingangs illustriert. Solch eine dynamische Messung kann beispielsweise über folgende Weisen erfolgen:
- Die Lichtquelle 60 sendet sehr kurze Pulse, abhängig von der Art der Lichtuqelle im Mikro- oder Nanosekundenbereich, an deren Ende die Intensität innerhalb 10'9 s oder schneller abfällt. Der Detektor 131 , beispielsweise eine Avalanche-Photodiode (APD) oder ein Silizium-Photomultiplier (SiPM) hat eine hinreichende Zeitauflösung, um Photonen zu identifizieren, die erst nach Abklingen des gestreuten Anregungspulses registriert werden, oder wird erst dann elektronisch aktiviert. Die Messung kann mehrmals wiederholt werden, um die Signalstatistik zu verbessern.
- Die Lichtquelle 60 ist mit einer Frequenz moduliert, die bevorzugt zwischen 10 kHz und 100 MHz liegt und als Detektor 131 , 132 wird ein PMD (Photon Mixing Device) verwendet. Diese kommerziell (auch als Pixelarray) erhältlichen Sensoren haben zwei Ladungsträgertöpfe, zwischen denen im Takt des Referenzsignals (also der Lichtquelle 60) umgeschaltet wird. Statt eines Transmissions-HOE 110 kann auch auf einem oder mehreren Reflektionshologrammen basierendes Reflexions-HOE verwendet werden, welche eine höhere spektrale Güte und noch bessere Streulichtunterdrückung aufweisen können, dafür aber eine Reflektionsanordnung mit sphärischen Wellenfronten zu größeren Laufzeitunterschieden der Lichtwege führen, die
Pulsflanken des gestreuten Anregungslichts aufweichen und die zeitliche Trennung damit erschweren kann.

Claims

Ansprüche
1 . Vorrichtung (100) zur zeitlich und spektral aufgelösten Fluoreszenzanalyse, insbesondere für die Molekulardiagnostik, umfassend einen Probenbereich (120) zum zeitlich modulierten Bestrahlen einer Probe (20) mit Anregungslicht (15) aus einer Anregungslichtquelle (60), zumindest einen ersten Detektor (131) zur zeitlich aufgelösten Detektion von Fluoreszenzlicht (16) und ein holografisch-optisches Element (110) zur örtlichen Auftrennung von Licht, wobei das HOE (110) ausgebildet ist, von dem Probenbereich (120) auf das HOE (110) einfallendes Licht (17) eines ersten Wellenlängenbereichs abzulenken, um selektiv Licht (17) aus dem ersten Wellenlängenbereich auf den ersten Detektor (131) zu leiten und wobei der Vorrichtung (100) eingerichtet ist, auf den ersten Detektor (131) einfallendes Fluoreszenzlicht (17) zeitlich aufgelöst zu analysieren.
2. Vorrichtung (100) nach Anspruch 1 , wobei die Vorrichtung (100) eingerichtet ist, aus dem Probenbereich (120) kommendes Fluoreszenzlicht (18) eines zweiten Wellenlängenbereichs über das HOE (110) auf einen zweiten Detektor (132) der Vorrichtung (100) zu lenken.
3. Vorrichtung (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das HOE (110) als Transmissions-HOE (110) ausgestaltet ist.
4. Vorrichtung (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung (100) eingerichtet ist, für mehrere im Probenbereich (120) angeordnete Proben Fluoreszenzlicht (17, 18, 19, 13) über das HOE (110) oder über mehrere HOEs (110) und über mehrere Detektoren (131 , 132, 133, 134) zeitlich aufgelöst zu analysieren.
5. Einrichtung (1000) zur Durchführung einer Nukleinsäure-Vervielfältigung, insbesondere zum Nachweis von Krankheitserregern, umfassend eine Vorrichtung (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche.
6. Verfahren (600) zur zeitlich und spektral aufgelösten Fluoreszenzanalyse, insbesondere für die Molekulardiagnostik, wobei Anregungslicht (15) zeitlich moduliert auf eine Probe (20) zur Erzeugung von Fluoreszenzlicht (16) gestrahlt wird und wobei
Licht (17) eines ersten Wellenlängenbereichs aus dem Fluoreszenzlicht (16) mit einem holografisch-optischen Element (110) auf einen ersten Detektor (131) für die zeitlich aufgelöste Analyse gelenkt wird.
7. Verfahren (600) nach Anspruch 6, wobei die zeitliche Modulation des
Anregungslichts zumindest zeitweise eine Pulsform aufweist.
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