WO2024096677A1 - Tlr 신호 억제 펩타이드 및 이를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Tlr 신호 억제 펩타이드 및 이를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2024096677A1
WO2024096677A1 PCT/KR2023/017529 KR2023017529W WO2024096677A1 WO 2024096677 A1 WO2024096677 A1 WO 2024096677A1 KR 2023017529 W KR2023017529 W KR 2023017529W WO 2024096677 A1 WO2024096677 A1 WO 2024096677A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptide
clause
tir
tlr
peptides
Prior art date
Application number
PCT/KR2023/017529
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
서문형
이욱빈
박근완
정상훈
김명일
임윤
Original Assignee
한국과학기술연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국과학기술연구원 filed Critical 한국과학기술연구원
Priority claimed from KR1020230150686A external-priority patent/KR20240067017A/ko
Publication of WO2024096677A1 publication Critical patent/WO2024096677A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B30/00—Methods of screening libraries
    • C40B30/04—Methods of screening libraries by measuring the ability to specifically bind a target molecule, e.g. antibody-antigen binding, receptor-ligand binding

Definitions

  • the present invention relates to a peptide library constructed from the sequence of a TIR-like domain, a TLR signal inhibitory peptide involved in the interaction of the TIR domain selected therefrom, and its use in the prevention or treatment of inflammatory diseases.
  • TLR Toll-like receptor
  • TIR Toll/interleukin-1 receptor
  • a protein family that recognizes external pathogens or substances secreted from internal damage or aged tissues has a TIR (Toll/interleukin-1 receptor) domain inside the cell.
  • TIR Toll/interleukin-1 receptor
  • homologous/heterologous binding to the TIR domain of adapter proteins expressed within cells is a key mechanism that protects the human body by transmitting activated signals. Excessive activation and failure to regulate TLR signaling is not only a major cause of chronic inflammatory diseases such as autoimmune diseases and sepsis, but also, during infection with viruses or pathogens, the interaction of the TIR domain is used as a target for immune evasion of the pathogen. .
  • peptide inhibitors derived from human TIR domain sequences have been developed to inhibit TIR-TIR interactions inside cells and have shown efficacy in immunomodulation and treatment of inflammatory diseases.
  • most of them are approached only in a low-throughput method through peptide synthesis. Therefore, there is a limitation in sufficiently utilizing the TIR domain sequences that exist in various biological species.
  • TIR domains of various biological species in the natural world have been reported to have many heterologous bonds between species (bacteria-human, bacteria-plant, etc.)
  • a method of searching for peptide inhibitors that can regulate TIR-TIR interactions from the vast TIR domain sequences in the natural world has been developed. It is necessary, and new peptide inhibitors that can inhibit this TIR-TIR interaction can be used to treat various diseases through immune regulation.
  • the present inventors designed TIR surface sequences from the vast TIR domains possessed by various biological species, produced approximately 190,000 peptide sequences, constructed a phage display library using these, and used these to bind to the human TIR domain to transmit TRL signaling.
  • the present invention regarding a novel peptide candidate sequence that regulates the pathway and its screening method has been completed.
  • the purpose of the present invention is to provide a method for constructing a phage display library of peptides containing the surface sequence of the TIR domain.
  • Another object of the present invention is to provide a method for screening peptides derived from the surface sequence of the TIR domain and having TLR signal transduction inhibitory activity.
  • Another object of the present invention is to provide a TLR signal inhibitory peptide derived from the surface sequence of the TIR domain.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for preventing, improving or treating inflammatory diseases containing a TLR signal inhibitory peptide.
  • the present invention provides a method for constructing a phage display library of peptides containing the surface sequence of the TIR domain.
  • the present invention provides a method for screening peptides having TLR signal transduction inhibitory activity derived from the surface sequence of the TIR domain.
  • the present invention provides a TLR signal inhibitory peptide derived from the surface sequence of the TIR domain.
  • the present invention provides a composition for preventing, improving or treating inflammatory diseases containing a TLR signal inhibitory peptide.
  • the present invention relates to a library of peptides containing the surface sequence of the TIR domain from the TIR domain possessed by various biological species and a method for constructing the same.
  • the peptide library was constructed using a method including the following steps. First, in order to extract TIR domains from various species of organisms based on cross-species linkage of TIR-like domains existing in nature, full sequence alignment of the surface sequence of 13,644 TIR domains (PF01582) from PFAM was performed. was used, and the sequences of all surfaces excluding the inner (core) region of the TIR domain tertiary structure were designed into approximately 16 amino acid sequences to construct a library of 190,946 peptides.
  • peptides with TLR inhibitory activity were screened from the constructed peptide library.
  • the screening may be done through, for example, phage display techniques.
  • phage display technology Through phage display technology, peptides are genetically linked, inserted, or replaced with the phage's coat protein and displayed on the outside of the phage, and the peptide can be encoded by genetic information within the virion.
  • phage or “bacteriophage” are used interchangeably and may refer to a virus that infects bacteria and replicates within the bacteria.
  • the phage or bacteriophage may be used to display a peptide belonging to the library of the present invention, and the peptide may be genetically engineered to be displayed on the phage coat protein or a fragment thereof.
  • the genetic manipulation includes introducing a gene encoding the peptide.
  • the term “phage display” may mean displaying a functional foreign peptide or protein on the surface of a phage or phagemid particle.
  • the surface of the phage may refer to the phage coat protein or a fragment thereof.
  • the phage may be formed in such a manner that the C-terminus of the functional foreign peptide is connected to the N-terminus of the phage coat protein, or the peptide is inserted between the contiguous amino acid sequences of the phage coat protein, or the contiguous amino acid sequence of the coat protein. It may be a phage that replaces a part of .
  • the coat protein is not limited to its type and may be p3, p6, p8, p9, or a fusion thereof.
  • peptides that specifically bind to MAL or MyD88, a key adapter protein of TLR signaling were screened.
  • peptide sequences binding to large-scale MAL or MyD88 were obtained through NGS analysis of the base sequences encoding the selected peptides.
  • the peptide screened through the phage display method was confirmed to have the function of regulating TLR signals and, in particular, inhibiting the signaling pathway.
  • the screened TIR domain-binding peptide having TLR inhibitory activity may include a peptide consisting of the amino acid sequences shown in Tables 1 to 4, and may further include a sequence for intracellular penetration.
  • the TIR domain binding peptide may further include a peptide sequence for cell immersion.
  • peptides combining the TIR domain-binding peptide and the cell-penetrating peptide may be prepared as shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 21, and cloning was performed using the prepared peptide.
  • TLR signaling pathway is a signal transduction pathway regulated by Toll like receptor (TLR), and TLR is a protein or keystone of the defense mechanism that recognizes and removes external pathogens or internal damage and aged tissues.
  • TLR Toll like receptor
  • Excessive activation of TLR signaling can be a major cause of severe chronic inflammatory diseases such as infectious diseases, sepsis, autoimmune diseases, and degenerative brain diseases. Additionally, since TLRs play an important role in controlling inflammatory diseases, various drugs targeting them exist.
  • the TIR domain-binding peptide of the present invention can be used as a treatment for various inflammatory diseases through its TRL signal inhibition effect.
  • the inflammatory disease is an immune response caused by various causes such as infection by pathogens or tissue damage.
  • the inflammatory disease herein is not limited to the type, and is more specifically dermatitis, allergy, atopy, asthma, and periodontitis.
  • rhinitis allergic and non-allergic rhinitis, otitis media, pharyngitis, tonsillitis, pneumonia, gastric ulcer, chronic and acute gastritis, Crohn's disease, colitis, chronic and acute enteritis, hemorrhoids, gout, ankylosing spondylitis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, periarthritis, Tendinitis, tenosynovitis, myositis, acute and chronic hepatitis, cystitis, acute and chronic nephritis, Sjogren's syndrome, multiple sclerosis, rhinitis, chronic obstructive pulmonary disease, irritable bowel syndrome, viral infection, bacterial infection, fungal infection, burn, Any selected from the group consisting of surgical or dental wounds, atherosclerosis, arthritis, Hodgkin's disease, pancreatitis, ulceris, scleritis, uveitis, conjunctivitis,
  • “sepsis” refers to a disease in which a serious inflammatory response occurs throughout the body. In particular, it is a disease that can cause serious organ damage to an individual due to immune system abnormalities caused by microbial infection. The condition in which these symptoms worsen and circulatory, cellular, and metabolic abnormalities occur is called septic shock, and septic shock is a serious disease with a high mortality rate.
  • “preventing, ameliorating or treating sepsis” includes reducing, improving or eliminating all or part of the symptoms associated with sepsis and conditions associated with multi-organ dysfunction syndrome.
  • macular degeneration is a chronic progressive degenerative disease of the macula, caused by excessive free radicals, mitochondrial dysfunction, inflammation, abnormalities in lipid metabolism, genetic factors, environmental factors (smoking, exposure to ultraviolet rays, etc.), etc. It is known to occur, but the exact cause has not been identified.
  • the macular degeneration of the present invention may be particularly dry macular degeneration, and dry macular degeneration accounts for 85 to 90% of all macular degeneration, and end-stage macular degeneration may lead to wet macular degeneration. Dry macular degeneration is specifically characterized by medium-sized or larger yellow deposits called drusen, pigmentary abnormalities of the retinal pigment epithelium, and reticular pseudodrusen beneath the retina. It is characterized by an increase in deposits called , and gradual atrophy of the nerves in the macular area.
  • prevention, improvement or treatment of macular degeneration refers to preventing the formation of waste products in the retinal pigment epithelium (RPE) and the outer nuclear layer (ONL) and the atrophy of photoreceptors, thereby causing macular degeneration and It involves reducing, eliminating and improving associated symptoms.
  • RPE retinal pigment epithelium
  • ONL outer nuclear layer
  • prevention refers to all actions that can suppress or delay the onset of the disease by administering the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • treatment refers to any action in which the symptoms of the disease are improved or benefited by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated and used in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories, and sterile injection solutions according to conventional methods. It may additionally contain carriers or excipients necessary for the formulation.
  • Pharmaceutically acceptable carriers, excipients and diluents that may be additionally included in the active ingredients include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, These include calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, magnesium stearate and mineral oil. When formulated, it is prepared using diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and such solid preparations include the extract or compound with at least one excipient, at least cotton, starch, and calcium carbonate. It is prepared by mixing sucrose, lactose, gelatin, etc. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium styrate talc are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, oral solutions, emulsions, and syrups. In addition to the commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included. there is.
  • Preparations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspensions include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate.
  • injectable ester such as ethyl oleate.
  • As a base for suppositories witepsol, macrogol, tween 61, cacao, laurin, glycerogeratin, etc. can be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally (intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, or topically) depending on the desired method, and the dosage depends on the condition and weight of the patient, the degree of the disease, and the form of the drug. It varies depending on the route and time of administration, and an appropriate form can be selected by a person skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means a reasonable amount applicable to medical treatment and an amount sufficient to treat a disease, and the criteria are the patient's disease, severity, drug activity, sensitivity to the drug, and administration time. , can be determined depending on the route of administration and excretion rate, treatment period, ingredients used together, and other matters.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered individually or in combination with other therapeutic agents, and can be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. Considering all of the above factors, the dosage can be determined at a level that can minimize side effects, and this can be easily determined by a person skilled in the art.
  • the dosage of the pharmaceutical composition may vary depending on the patient's age, weight, severity, gender, etc., and is generally administered in an amount of 0.001 to 150 mg per 1 kg of body weight, more preferably 0.01 to 100 mg per kg of body weight every day or every other day. It can be administered 1 to 3 times a day. However, this is an example, and the dosage can be set differently as needed.
  • the present invention constructs a library of over 190,000 peptides derived from the TIR surface sequence from the vast TIR domains possessed by various biological species, and from this, new peptides that bind to the human TIR domain (MAL, MYD88) can be screened, and these peptides Can be used as a TLR signaling inhibitor.
  • MAL, MYD88 human TIR domain
  • Figure 1 is a schematic diagram explaining the process for constructing a peptide library that binds to the human TIR domain using the entire sequence of the TIR domain in PFAM.
  • Figure 2 shows the results confirming the inhibitory efficacy of the peptide of the present invention against various TRLs.
  • Figure 3 shows the results of selecting peptides that specifically bind to MAL and MyD88 and confirming their efficacy in inhibiting TLR4 activity.
  • Figure 4 shows the results of confirming the concentration-dependent inhibitory effect of peptides confirmed to have TRL4 inhibitory activity.
  • Figure 5 shows the results of confirming the phosphorylation inhibitory effect of IRAK4 and IRF3, which are downstream proteins of TLR4 signal, for four types of peptides whose TLR4 inhibitory activity was confirmed.
  • Figure 6 shows the results of confirming the effect of four types of peptides confirmed to have TRL4 inhibitory activity on phosphorylation inhibition of ERK, p38, and JNK, which are downstream proteins of TLR4 signaling.
  • Figure 7 shows the results of confirming the inhibitory effect of NF-kB nuclear localization of four types of peptides confirmed to have TRL4 inhibitory activity.
  • Figure 8 confirms the inhibitory effect of a peptide having TRL4 inhibitory activity on cytokine secretion in macrophages.
  • Figure 9 shows the sepsis treatment effect of a peptide with TRL4 inhibitory activity and the results of confirming the survival rate of mice.
  • Figure 10 shows the results confirming the effect of suppressing inflammatory cytokine secretion in relation to the sepsis treatment effect of a peptide having TRL4 inhibitory activity.
  • Figure 11 shows the results of confirming the effect on kidney cell death in relation to the sepsis treatment effect of a peptide with TRL4 inhibitory activity.
  • Figure 12 shows the results of confirming the protective effect of retinal pigment epithelial cells (RPE) and outer nuclear layer (ONL) through SD-OCT and H&E staining in relation to the treatment effect of dry macular degeneration of a peptide with TRL4 inhibitory activity.
  • RPE retinal pigment epithelial cells
  • ONL outer nuclear layer
  • Figure 13 shows the results of a quantitative comparative analysis of the thickness of the retinal pigment epithelial cells and the outer nuclear layer observed in Figure 12.
  • a 16 mer amino acid sequence (187,814) was designed with all surface sequences, excluding the core region of the tertiary structure of the TIR domain belonging to the above species, cut to overlap about 7 amino acids.
  • the human TIR domain was designed as a 16 mer amino acid sequence.
  • a list of 3,132 peptide sequences was constructed from the surface sequences of 14 types of bacterial TIR domains, 2 types of bacterial TIR domains, and 3 non-TIR domains known to bind to TIR. As a result, a peptide library of approximately 190,946 16mers was constructed.
  • phage display was performed as follows.
  • DNA sequences for expression of each peptide belonging to the library constructed in Example 1 were synthesized and vector cloning was performed.
  • Vector cloning was performed using p3/p8 phagemid.
  • the vector was introduced into M13 bacteriophage, and the peptide derived from the TIR domain was displayed on the phage surface.
  • peptides that inhibit the activity of MAL and MyD88 which are key proteins of the TLR signaling pathway, were selected through specific binding.
  • MAL and MyD88 proteins produced in E. coli were fixed to a 96-well plate, and the phage-displayed peptide library fused to the P8 or P3 envelope protein was mixed, then non-binding phages were removed, and the remaining phages were amplified in E. coli again. A total of 4 rounds of combining process were performed. After the fourth round, the remaining phages were obtained by binding to the final immobilized target protein, and through NGS analysis of the phagemid in the phage, the peptide sequence binding to the target and the relative distribution of each sequence were confirmed.
  • P3_MyD88 Peptide sequence NGS count Population SSFREGLWRLLELSKK 79510 23.15% NQWRNALTAAANLSGW 28662 8.35% DHHLLDLPRGKAIKPEILG 26722 7.78% YTALTNSGFHTFRDND 17600 5.12% LVAHEISKKMKIFATI 17452 5.08% LKVESWRQALEKAGKL 16847 4.91% EWIREQLRPALKERLP 16821 4.90% YAFTGHLHRYLVQRGV 13420 3.91% NELVHVWSSKANSLVG 8816 2.57% KNLFNELVSKNIRTFM 8543 2.49% LKWGDPYFWSKLRYAM 8310 2.42% YLKWGYPWFWDRLRFA 7321 2.13% SENYATSPWALDELVL 6494 1.89% KEVEGWRDALTKVASL 6187 1.80% SELRVVDDDGSVSPLEM 4872 1.42% AVDKETDKIQTPLKNA 4790
  • a sequence for passing through the cell membrane (CPP; RQIKIWFQNRRMKWKK, SEQ ID NO. 23) was fused to the above sequence and synthesized, and a peptide consisting of the sequences shown in Table 5 below was produced.
  • TLR TLR2, TLR3 of 21 synthetic peptides using HEK-Blue hTLR2, 3, 4, 5, 7, 8, 9 reporter cell lines overexpressing TLRs targeting the screened peptides as shown in Tables 1, 2, 3, and 4 above.
  • TLR4, TLR 5, TLR7, TLR8, and TLR9 TLR2, TLR4, TLR7, and TLR9 inhibitory activity was confirmed for most peptides.
  • inhibitory activity against TLR3 and TLR5 was confirmed in some peptides.
  • Figure 2 In addition, as shown in Figure 3, the inhibitory effect on TLR4 was confirmed through SEAP reporter assay using HEK-Blue hTLR4, and TLR4 inhibitory activity was confirmed in most peptides compared to the control group.
  • mice In order to confirm that the TLR inhibitory activity peptide of the present invention is effective in treating sepsis, an experiment was conducted on mice.
  • the TLR inhibitory peptides (TDIP1, TDIP5, TDIP6, TDIP20) of the present invention were intraperitoneally injected into mice in which sepsis was induced with LPS at an amount of 10 nmol per g of mouse body weight, and the mouse survival rate and 16 hours after LPS and peptide administration were injected intraperitoneally.
  • Cytokines in serum (IL-23, IL-1 ⁇ , IFN ⁇ , TNF- ⁇ , MCP-1, IL-12p70, IL-1 ⁇ , IL-10, IL-6, IL-27, IL-17A, IFN ⁇ ) ELISA analysis was performed to confirm expression level, and TUNEL assay was performed to confirm cell death in kidney tissue.
  • the TLR inhibitory active peptide of the present invention has a therapeutic effect on dry macular degeneration
  • the TLR inhibitory active peptide of the present invention (TDIP1, TDIP5, TDIP6, After directly administering 5 ⁇ l of TDIP20) at a concentration of 20 ⁇ M to the upper corneal surface of the eye once a day for 21 days, the outer nuclear layer (ONL) and retinal cell epithelial thickness (RPE) of the diseased mice were checked, The effect on retinal cell death was confirmed.
  • the present invention provides a surface-exposed sequence involved in inter-domain binding excluding the core region of the tertiary structure of the TIR domain from various biological species, with a length of 16 to 21 amino acids in which some sequences overlap.
  • the overlapping sequence of the peptide fragment is 5 to 8 amino acids long.
  • the present invention provides a TLR signal transduction inhibitory activity comprising screening for a peptide that specifically binds to TIR domains including human MAL or MyD88 from a phage display library constructed by the above method. This is about a screening method for peptides having .
  • the peptide having the TLR signal transduction inhibitory activity specifically binds to the TIR domain contained in humans, bacteria, or plants, including human MAL or MyD88, and inhibits the binding between TIR domains to TLR. It is characterized by suppressing signals.
  • the present invention relates to a TLR (Toll like receptor) signal inhibitory peptide comprising a peptide fragment derived from the surface sequence of the TIR domain.
  • TLR Toll like receptor
  • the TLR may be selected from the group consisting of TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, and TLR9.
  • the peptide is characterized as having been screened by the method of claim 4.
  • the peptide is characterized in that it includes one or more peptides consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 21.
  • the peptide is characterized as being fused with a peptide consisting of the sequence of SEQ ID NO: 23.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing, improving or treating inflammatory diseases comprising the peptide of claim 5.
  • the inflammatory disease includes dermatitis, allergy, atopy, asthma, periodontitis, allergic and non-allergic rhinitis, otitis media, pharyngitis, tonsillitis, pneumonia, gastric ulcer, chronic and acute gastritis, Crohn's disease, and colitis.
  • chronic obstructive pulmonary disease irritable bowel syndrome
  • viral infections bacterial infections, fungal infections, burns, surgical or dental wounds
  • atherosclerosis arthritis
  • Hodgkin's disease pancreatitis
  • scleritis uveitis
  • conjunctivitis conjunctivitis.
  • dry macular degeneration wet macular degeneration, sepsis, or septic shock.
  • the inflammatory disease may be sepsis, septic shock, or symptoms associated with sepsis and multi-organ dysfunction syndrome.
  • the inflammatory disease may be macular degeneration.
  • the macular degeneration may be dry macular degeneration.
  • the composition can reduce the thickness of the retinal cell epithelium (RPE) or outer nuclear layer (ONL).
  • RPE retinal cell epithelium
  • ONL outer nuclear layer
  • the peptide may include one or more of the peptides consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 5, 6, or 20.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 다양한 생물종이 가지고 있는 방대한 TIR 도메인으로부터 유래된 펩타이드 라이브러리 및 이의 구축 방법과, 상기 라이브러리로부터 스크리닝된 인간 TIR 도메인에 결합하여 TLR 신호 전달 경로에 관여하는 신규 펩타이드 및 TLR4 신호전달 억제제로서의 용도에 대한 것이다.

Description

TLR 신호 억제 펩타이드 및 이를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 TIR 유사 도메인의 서열로 구축한 펩타이드 라이브러리 및 이들로부터 선별된 TIR 도메인의 상호 작용에 관여하는 TLR 신호 억제 펩타이드 및 이의 염증성 질환에 대한 예방 또는 치료 용도에 대한 것이다.
외부의 병원체 또는 인체 내부의 손상, 노화된 조직으로부터 분비되는 물질을 인식하는 단백질 패밀리인 톨-유사 수용체(Toll-like receptor, TLR)는 세포 내부의 TIR(Toll/interleukin-1 receptor) 도메인을 가지고 있으며, 세포 내에 발현되는 어댑터 단백질의 TIR 도메인과 동종/이종 결합은 활성화된 신호를 전달하여 인체를 보호하는 핵심 메커니즘이다. 과도한 TLR 신호의 활성화 및 조절의 실패는 자가면역질환, 패혈증과 같은 만성염증질환의 주요 원인이 될 뿐만 아니라, 바이러스 또는 병원균의 감염시 TIR 도메인의 상호작용은 병원체의 면역회피를 위한 타겟으로 활용된다. 이에 따라 세포 내부의 TIR-TIR 상호작용을 억제하기 위한, 인간 TIR 도메인 서열 유래의 펩타이드 저해제가 개발되어 면역조절 및 염증질환 치료 효능을 보여준 바가 있으나, 대부분 펩타이드 합성을 통한 low-throughput 방식으로만 접근하여, 다양한 생물종에 존재하는 TIR 도메인의 서열을 충분히 활용하지 못하는 한계가 존재한다.
자연계의 다양한 생물종이 가진 TIR 도메인은 종간(박테리아-인간, 박테리아-식물 등) 이종 결합이 다수 보고되고 있어, 자연계의 방대한 TIR 도메인 서열로부터 TIR-TIR 상호작용을 조절할 수 있는 펩타이드 저해제의 탐색 방법이 필요하며, 이러한 TIR-TIR 상호작용을 억제할 수 있는 새로운 펩타이드 저해제는 면역 조절을 통해 다양한 질환의 치료에 활용할 수 있다.
이에 본 발명자들은 다양한 생물종이 가지고 있는 방대한 TIR 도메인으로부터 TIR 표면의 서열들을 디자인하여 19만여개의 펩타이드 서열을 제작하고, 이를 통한 파지 디스플레이 라이브러리를 구축하였으며, 이를 이용하여 인간 TIR 도메인에 결합하여 TRL 신호전달 경로를 조절하는 신규 펩타이드 후보 서열 및 이의 스크리닝 방법에 대한 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 TIR 도메인의 표면 서열을 포함하는 펩타이드의 파지 디스플레이 라이브러리 구축 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, TIR 도메인의 표면 서열로부터 유래된, TLR 신호 전달 억제 활성을 가지는 펩타이드의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 TIR 도메인의 표면 서열로부터 유래된 TLR 신호 억제 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 TLR 신호 억제 펩타이드를 포함하는 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TIR 도메인의 표면 서열을 포함하는 펩타이드의 파지 디스플레이 라이브러리 구축 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, TIR 도메인의 표면 서열로부터 유래된, TLR 신호 전달 억제 활성을 가지는 펩타이드의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 TIR 도메인의 표면 서열로부터 유래된 TLR 신호 억제 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 TLR 신호 억제 펩타이드를 포함하는 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 양태로서, 본 발명은 다양한 생물종이 가지고 있는 TIR 도메인으로부터 상기 TIR 도메인의 표면 서열을 포함하는 펩타이드의 라이브러리 및 이의 구축 방법에 대한 것이다.
상기 펩타이드 라이브러리는 하기와 같은 단계를 포함하는 방법으로 구축하였다. 먼저, 자연계에 존재하는 TIR 유사 도메인들의 종간 교차(cross-species) 결합을 바탕으로 다양한 종의 생물로부터 TIR 도메인을 추출하기 위해, PFAM으로부터 13,644개의 TIR 도메인(PF01582)의 표면 서열에 대한 full sequence alignment을 이용하였고, 상기 TIR 도메인 3차 구조의 안쪽(core) 부위를 제외한 모든 표면의 서열을 대상으로 이를 약 16개의 아미노산 서열로 디자인하여, 190,946개의 펩타이드 라이브러리를 구축하였다.
또한, 상기 구축된 펩타이드 라이브러리로부터 TLR 억제 활성을 가지는 펩타이드를 스크리닝하였다. 상기 스크리닝은 예를 들어, 파지 디스플레이 기법을 통해 선별될 수 있다. 파지 디스플레이 기법을 통해 펩타이드가 유전적으로 파지의 외피 단백질에 연결, 삽입 또는 치환되어 파지의 외부에 디스플레이되고, 펩타이드는 비리온 내의 유전 정보에 의해 암호화될 수 있다.
본 발명에서 용어 "파지(phage)" 또는 "박테리오파지(bacteriophage)"는 호환적으로 사용되며, 박테리아를 감염시키고, 박테리아 내에서 복제되는 바이러스를 의미할 수 있다. 상기 파지 또는 박테리오 파지는 상기 본 발명의 라이브러리에 속하는 펩타이드를 디스플레이 하기 위하여 사용될 수 있으며, 상기의 펩타이드가 파지의 외피 단백질 또는 이의 단편에 디스플레이 되도록 유전적으로 조작된 것일 수 있다. 상기 유전적 조작은 상기의 펩타이드를 코딩하는 유전자가 도입되는 것을 포함한다.
본 발명에서 용어 "파지 디스플레이(phage display)"는 파지 또는 파지미드(phagemid) 입자의 표면에 기능적 외래 펩타이드 또는 단백질이 표시(display)되는 것을 의미할 수 있다. 상기 파지의 표면은 파지의 외피 단백질 또는 그의 단편을 의미할 수 있다. 또한 상기 파지는 상기 기능적 외래 펩티드의 C-말단이 파지의 외피 단백질의 N-말단에 연결되거나, 또는 상기 펩타이드가 파지의 외피 단백질의 연속되는 아미노산 서열 사이에 삽입되거나 또는 외피단백질의 연속되는 아미노산 서열의 일 부분을 치환한 것인 파지일 수 있다. 또한, 상기 외피 단백질은 그 종류에 제한되지 않으며, p3, p6, p8, p9 또는 이들이 융합된 것 일 수 있다.
상기 파지 디스플레이된 펩타이드 중에서, TLR 신호전달 경로에 대한 억제 활성을 가지는 펩타이드를 스크리닝 하기 위하여, TLR 신호의 핵심 어댑터 단백질인 MAL 또는 MyD88에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 스크리닝 하였다. 상기 결과, 선별된 펩타이드를 코딩하는 염기 서열에 대한 NGS 분석을 통해 대규모 MAL 또는 MyD88에 결합하는 펩타이드 서열을 확보하였다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 파지디스플레이 방식을 통해 스크리닝된 펩타이드는 TLR 신호를 조절하며, 특히 상기 신호전달 경로를 억제하는 기능을 가지는 것을 확인하였다.
이에 제한되는 것은 아니나, 상기 스크리닝된 TLR 억제 활성을 가지는 TIR 도메인 결합 펩타이드는 표 1 내지 4에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 포함할 수 있으며, 세포 내 침투를 위한 서열을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 TIR 도메인 결합 펩타이드는 세포 침두를 위한 펩타이드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 TIR 도메인 결합 펩타이드와 세포 침투 펩타이드가 결합된 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 21과 같이 제작될 수 있으며, 상기의 제작된 펩타이드를 이용하여 클로닝을 진행하였다.
TLR 신호 경로는 톨 유사 수용체(Toll like receptor; TLR)에 의해 조절되는 신호 전달 경로이며, TLR은 외부의 병원체 또는 인체 내부의 손상, 노화된 조직 등을 인식하여 제거하는 방어 메커니즘의 핵심인 단백질이나, 과도한 TLR 신호의 활성화는 감염병, 패혈증, 자가면역질환, 퇴행성뇌질환과 같은 중증 만성염증질환의 주요 원인이 될 수 있다. 또한 TLR은 염증 질환의 조절에 중요한 역할을 하므로, 이를 타겟으로 하는 다양한 약물이 존재한다.
본 발명의 TIR 도메인 결합 펩타이드는 TRL 신호 억제 효과를 통해 다양한 염증성 질환에 대한 치료제로서 활용될 수 있다. 상기 염증성 질환은 병원체에 의한 감염 또는 조직의 손상 등 다양한 원인에 의해 유발되는 면역 반응으로서, 본 명세서의 염증성 질환은 그 종류에 제한되는 것은 아니며, 보다 구체적으로는 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 치주염, 알레르기성 및 비-알레르기성 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 만성 및 급성 위염, 크론병, 대장염, 만성 및 급성 장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 급성 및 만성 간염, 방광염, 급성 및 만성 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 비염, 만성 폐쇄성 폐질환, 과민성 대장 증후군, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 아테롬성 동맥 경화증, 관절염, 호지킨병, 췌장염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 결막염, 건성황반변성, 습성황반변성, 패혈증 또는 패혈증성 쇼크로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 질환일 수 있으며, 바람직하게는 건성황반변성, 패혈증 또는 패혈증성 쇼크일 수 있다.
특히 본 발명에서 상기 "패혈증(sepsis)"은 전신에 심각한 염증 반응이 나타나는 질환을 의미하는 것으로, 특히 미생물 감염에 의한 면역계 이상으로 개체에 심각한 장기 손상을 유발할 수 있는 질환이다. 이러한 증상이 악화되어, 순환성, 세포성, 대사성 이상이 발생된 상태를 패혈성 쇼크라고 하며, 패혈성 쇼크는 사망률이 높은 심각한 질환이다.
본 발명의 일 양태로서 "패혈증 예방, 개선 또는 치료"란, 패혈증과 연관된 증상 및 다기관 기능 부전 증후군에 연관된 상태의 전부 또는 일부 증상을 감소, 개선 또는 제거하는 것을 포함한다.
또한 본 발명에서 "황반 변성"은 황반의 만성 진행성 퇴행성 질환으로서, 과도한 활성산소, 미토콘드리아의 기능장애, 염증, 지질 대사의 이상, 유전적 요소, 환경적 요소(흡연, 자외선 노출 등) 등에 의해 유발되는 것으로 알려져 있으나, 명확한 원인이 밝혀진 것은 아니다. 본 발명의 상기 황반변성은 특히 건성 황반변성일 수 있으며, 상기 건성 황반변성은 전체 황반변성 중 85 내지 90%를 차지하며, 말기 황반변성은 습성 황반변성으로 이어지기도 한다. 건성 황반변성은 특히 망막 색소 상피 층 아래에 존재하는 드루젠(drusen)으로 불리는 중간 크기 이상의 노란색 침착물, 망막 색소 상피의 색소이상(pigmentary abnormalities), 망막 아래에 존재하는 망상 슈도드루젠(reticular pseudodrusen)으로 불리는 침착물이 증가되며, 황반부의 신경이 점점 위축되는 특징을 가진다.
본 발명의 일 양태로서 "황반변성의 예방, 개선 또는 치료"란, 망막색소 상피(Retinal Pigment Epithelium; RPE)와 외부과립층(outer nuclear layer; ONL)의 노폐물 형성 및 시세포의 위축을 방지하여, 황반변성과 관련된 증상을 감소, 제거 및 개선하는 것을 포함한다.
본 명세서에서 본 명세서에서 용어 "예방"은 본 발명에 따른 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 상기의 질환을 억제시키거나 발병을 지연시킬 수 있는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 용어 "치료"는 본 발명에 따른 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 상기 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 제형화에 필요한 담체 혹은 부형제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 유효 성분에 추가로 포함될 수 있는 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 포함된다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
예를 들어, 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물 또는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 적어도 면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구 투여(정맥주사, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)될 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도 및 약물 형태, 투여 경로 및 시간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절한 형태로 선택될 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은, 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 양으로, 질병을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 그 기준은 환자의 질환, 중증도, 약물 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 병용되는 성분 및 기타 사항에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 조성물은, 개별 치료제 혹은 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용을 최소화할 수 있는 수준으로 투여량을 결정할 수 있고, 이는 당업자에 의해 용이한 수준으로 결정될 수 있다. 구체적으로 상기 약학적 조성물의 투여량은 환자의 연령, 체중, 중증도, 성별 등에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 체중 1kg 당 0.001 내지 150 mg, 보다 바람직하게는 0.01 내지 100mg의 양을 매일 또는 격일, 1일 1 내지 3회 투여할 수 있다. 다만, 이는 예시적인 것으로, 상기 투여량은 필요에 달리 설정할 수 있다.
본 발명은 다양한 생물종이 가지고 있는 방대한 TIR 도메인으로부터 TIR 표면의 서열 유래의 19만여개의 펩타이드 라이브러리를 구축하여, 이로부터 인간 TIR 도메인(MAL, MYD88)에 결합하는 신규 펩타이드를 스크리닝 할 수 있으며, 이들 펩타이드는 TLR 신호 전달 억제제로서의 용도로 사용될 수 있다.
도 1은 PFAM에서 TIR domain에 대한 전체 시퀀스를 이용하여, 이로부터 인간 TIR 도메인과 결합하는 펩타이드 라이브러리를 구축하기 위한 과정을 설명한 모식도이다.
도 2는 다양한 TRL에 대한 본 발명의 펩타이드의 억제 효능을 확인한 결과이다.
도 3은 MAL 및 MyD88 과 특이적 결합을 이루는 펩타이드를 선별하여, TLR4 활성 억제 효능을 확인한 결과이다.
도 4는 TRL4 억제 활성이 확인된 펩타이드들의 농도 의존적 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 5는 TLR4 억제 활성이 확인되 4종의 펩타이드에 대한 TLR4신호의 하위 단백질인 IRAK4와 IRF3의 인산화 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 6은 TRL4 억제 활성이 확인된 4종의 펩타이드에 대한 TLR4신호의 하위 단백질인 ERK, p38, JNK의 인산화 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 7은 TRL4 억제 활성이 확인된 4종의 펩타이드의 NF-kB nuclear localization 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 8은 TRL4 억제 활성을 가지는 펩타이드의 대식세포에서의 사이토카인 분비 억제 효과를 확인한 것이다.
도 9는 TRL4 억제 활성을 가지는 펩타이드 패혈증 치료 효과로서, 마우스의 생존률을 확인한 결과이다.
도 10은 TRL4 억제 활성을 가지는 펩타이드의 패혈증 치료 효과와 관련하여, 염증성 사이토카인 분비 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 11은 TRL4 억제 활성을 가지는 펩타이드의 패혈증 치료 효과와 관련하여, 신장세포 사멸에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 12는 TRL4 억제 활성을 가지는 펩타이드의 건성 황반변성의 치료 효과와 관련하여, 망막색소상피세포(RPE) 및 외핵층(ONL) 보호 효과를 SD-OCT 및 H&E 염색을 통해 확인한 결과이다.
도 13은 상기 도 12에서 관찰된 망막색소상피세포와 외핵층의 두께를 정량적으로 비교분석한 결과이다.
이하, 본 명세서를 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세히 설명한다. 그러나, 본 명세서에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 명세서의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되지는 않는다. 본 명세서의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 명세서를 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. TIR 도메인 결합 펩타이드 라이브러리 구축
다양한 종의 생물에 존재하는 TIR 도메인을 추출하기 위해, PFAM으로부터 13,644개의 TIR 도메인(PF01582)의 표면 서열에 대한 full sequence alignment(#13644)를 이용하였다.
상기 생물종에 속하는 TIR 도메인의 3차 구조 안쪽(core) 부위를 제외한 모든 표면 서열을 대상으로 약 7개 아미노산이 오버랩되도록 자른 16 mer의 아미노산 서열(187,814개)로 디자인하였으며, 추가로 인간 TIR 도메인 14종과 2종의 bacterial TIR 도메인, TIR과 결합하는 것으로 알려진 3개의 non-TIR 도메인의 표면 서열로 3,132개의 펩타이드 서열 리스트를 구축하였다. 그 결과, 약 190,946개의 16mer의 펩타이드 라이브러리를 구축하였다.
실시예 2. TLR 억제 활성 펩타이드 스크리닝
2-1. 파지미드를 이용한 파지 디스플레이
실시예 1로부터 구축된 펩타이드 라이브러리로부터 TLR 억제 활성을 가지는 펩타이드를 스크리닝 하기 위하여, 아래와 같이 파지디스플레이를 수행하였다.
먼저, 실시예 1로부터 구축된 라이브러리에 속하는 펩타이드 각각의 발현을 위한 DNA 서열을 합성하여 벡터 클로닝을 수행하였다. 벡터 클로닝은 p3/p8 파지미드를 이용하여 수행하였다. 상기 벡터는 M13 bacteriophage에 도입되었으며, TIR 도메인으로부터 유래된 상기 펩타이드는 파지 표면에 디스플레이되었다.
2-2. TLR 신호 경로 억제 활성 확인
상기 2-1의 결과 파지 디스플레이된 펩타이드를 대상으로, TLR 신호경로의 핵심 단백질인 MAL및 MyD88과의 특이적 결합을 통해 이의 활성을 억제하는 펩타이드를 선별하였다. 대장균에서 생산된 MAL및 MyD88 단백질을 96-well 플레이트에 고정하고, P8 또는 P3 외피단백질에 융합되어 파지 디스플레이된 펩타이드 라이브러리를 섞어준 다음, 결합하지 않는 파지를 제거하고 남은 파지를 대장균에서 증폭시켜 다시 결합시키는 과정을 총4라운드 진행하였다. 4라운드 이후 최종적으로 고정된 타겟 단백질에 결합하여 남아있는 파지들을 얻고, 파지 속 파지미드에 대한 NGS 분석을 통해서, 타겟에 결합하는 펩타이드 서열과 각 서열의 상대적인 분포를 확인하였다.
P8 또는 P3 외피 단백질을 이용하여 파지디스플레이된 라이브러리를 이용하여 human MAL과 MYD88 도메인에 각각 결합하는 펩타이드 서열을 약 500여개 씩 스크리닝하였으며, 이 중 상위 30개씩의 펩타이드 서열을 하기 표 1 내지 표 4와 같이 나타내었다.
P8_MAL
Peptide sequence NGS count Population
WFYERLVSLILRDTKV 79000 24.40%
AFLYTFLINLTHPTNF 61063 18.86%
AFFWAQLKSVLGNPTM 28801 8.90%
RNFVAYLFQALANKGI 27950 8.63%
TFLGHLYNALVQAGIH 24732 7.64%
LFFWESLKQLLRSDGR 22560 6.97%
YFLHFLLFSRPETEYI 17198 5.31%
AFFWEQLRTVLGKPTM 11826 3.65%
QLIQQWIELHLHQLHL 9394 2.90%
DTKLKKGESIAPELLR 5617 1.74%
KLFWEKFKFFLPSLSR 4888 1.51%
SEFIQKIILWMNPKIV 4458 1.38%
HFFWIQLKSILGETSF 3624 1.12%
WFLFTVRSAIYAMSPA 3156 0.97%
RNNFIGHLYQALYRIG 3120 0.96%
SLLYDHLRWLGIRAFL 2576 0.80%
WFMMKFRTVLDHVNDV 2269 0.70%
KLIQGWFLYRLLKIEQ 2068 0.64%
DFLNWFIALKSTVIEN 867 0.27%
NQWRNALTAAANLSGW 848 0.26%
FTLAVHVRNWLVGGFI 620 0.19%
YLKWGYPWFWDRLRFA 617 0.19%
AYANFRQGLLRLLELA 466 0.14%
WFLTAFRMAMDQVADT 353 0.11%
YLISYIFNELARAGFS 295 0.09%
AWALHQLQQIINWHET 232 0.07%
WALQELVKILQAKIFL 227 0.07%
KFIWDIINAISSQIRV 146 0.05%
P3_MAL
Peptide sequence NGS count Population
YAFTGHLHRYLVQRGV 43764 16.44%
SSFREGLWRLLELSKK 29955 11.26%
PNLRTKVLNYLMRTKT 26931 10.12%
NQWRNALTAAANLSGW 25831 9.71%
RGFLSHLRHHLQAKDH 15065 5.66%
RLLKWKEALHQFHSWV 14924 5.61%
LKVESWRQALEKAGKL 6180 2.32%
LKWGDPYFWSKLRYAM 5128 1.93%
DWFLSKLSQHILKREK 4580 1.72%
KMQKWKDALYEAANLS 4427 1.66%
KEVEGWRDALTKVASL 3758 1.41%
ESILNQLRRSSQSIAN 3680 1.38%
SLRKNLVSNLIEEFKR 3569 1.34%
KNLFNELVSKNIRTFM 3259 1.22%
HHKGSYGEALAEHEKR 3056 1.15%
FLNFRGLDVRNYFLGH 2855 1.07%
KWFWDKLIYALSRNPH 2796 1.05%
YNFISHLYDALHRNRI 2678 1.01%
EWIREQLRPALKERLP 2354 0.88%
SFFWNKLRYHLPAPQH 2297 0.86%
LQNQWKLALTKVANLV 2285 0.86%
VEPTQVRKQSGAVENA 2283 0.86%
DHHLDLPRGKAIKPEILG 2280 0.86%
HQAFWNRLWAKLKPPT 1932 0.73%
NELVHVWSSKANSLVG 1836 0.69%
GFLYQAFAREGFKIFM 1764 0.66%
YLKWGYPWFWDRLRFA 1680 0.63%
LVAHEISKKMKIFATI 1671 0.63%
P8_MyD88
Peptide sequence NGS count Population
DPQDLDWFYERLVSLF 54757 21.10%
LGYHWIDWEYFVGIED 25216 9.72%
DWVWDYLLPNLEGPAG 19394 7.47%
WALDELLQILHARELF 14404 5.55%
DPQDLDWFYERLVSLL 13137 5.06%
PQDLEWFYERLVSLIL 10568 4.07%
WALDELLKILYANETM 10515 4.05%
DSLFWDRLLYSLHVTE 7586 2.92%
WDFASNMEQFWDRLYY 7352 2.83%
YLLLSVFQTIFARRTE 7165 2.76%
YASYDDNDYYWVTHVLLRHL 6893 2.66%
DPQDLQWFYERLVSLI 5730 2.21%
SAAYDDFWDRLIRMIE 5335 2.06%
VQWDDPWFWDKLAYAM 4902 1.89%
DPQDLEWFYERLFSQM 4488 1.73%
DYASSTWWLRELLQIA 4111 1.58%
YLRADDSWFWEKLLYA 4067 1.57%
YAASPWWFDELVKIVG 3433 1.32%
HWIDWEYFVGIEDHIK 3422 1.32%
IDDDHLTYLVRLLLSR 3059 1.18%
YASSSWALDELLRILY 2327 0.90%
VANILGYHWIDWEYFV 2029 0.78%
GLSWGPYEWWMGLYDA 1965 0.76%
SPQEQDGFWVRLIEAL 1842 0.71%
QLIQQWIELHLHQLHL 1605 0.62%
DWVWEHFFPMEEKDQT 1538 0.59%
MFGGDTFHDFLDLISM 1489 0.57%
LEANDSLFWDRLLYSL 1465 0.56%
P3_MyD88
Peptide sequence NGS count Population
SSFREGLWRLLELSKK 79510 23.15%
NQWRNALTAAANLSGW 28662 8.35%
DHHLDLPRGKAIKPEILG 26722 7.78%
YTALTNSGFHTFRDND 17600 5.12%
LVAHEISKKMKIFATI 17452 5.08%
LKVESWRQALEKAGKL 16847 4.91%
EWIREQLRPALKERLP 16821 4.90%
YAFTGHLHRYLVQRGV 13420 3.91%
NELVHVWSSKANSLVG 8816 2.57%
KNLFNELVSKNIRTFM 8543 2.49%
LKWGDPYFWSKLRYAM 8310 2.42%
YLKWGYPWFWDRLRFA 7321 2.13%
SENYATSPWALDELVL 6494 1.89%
KEVEGWRDALTKVASL 6187 1.80%
SELRVVDDGSVSPLEM 4872 1.42%
AVDKETDKIQTPLKNA 4790 1.39%
NGHESEIIKEIVDTIV 4233 1.23%
FLSYRALEKRFGPIGQ 3289 0.96%
YNFISHLYDALHRNRI 2891 0.84%
GFLYQAFAREGFKIFM 2579 0.75%
YYLDPSHLRKQSGEFG 2538 0.74%
PEKDNGGENAFINNIV 2498 0.73%
DTKLKKGESIAPELLR 2465 0.72%
RKGDLISDELLIAIEE 2452 0.71%
HLLKEFDKKLITAFKD 2399 0.70%
PSEVRKQTGSLAKAFA 2253 0.66%
TSHLHHALRLNKIETF 2076 0.60%
ESILNQLRRSSQSIAN 1976 0.58%
또한 상기의 펩타이드의 효능을 확인하기 위하여, 상기 서열에 세포막 통과를 위한 서열(CPP; RQIKIWFQNRRMKWKK, 서열번호 23)을 융합하여 합성하였으며, 하기의 표 5의 서열로 이루어진 펩타이드를 제작하였다.
합성 펩타이드 펩타이드 서열
(Cell penetrating peptide + TIR-binding motif)		 서열번호
TDIP1 RQIKIWFQNRRMKWKK WFYERLVSLILRDTKV 서열번호 1
TDIP2 RQIKIWFQNRRMKWKK AFLYTFLINLTHPTNF 서열번호2
TDIP3 RQIKIWFQNRRMKWKK AFFWAQLKSVLGNPTM 서열번호 3
TDIP4 RQIKIWFQNRRMKWKK RNFVAYLFQALANKGI 서열번호 4
TDIP5 RQIKIWFQNRRMKWKK TFLGHLYNALVQAGIH 서열번호 5
TDIP6 RQIKIWFQNRRMKWKK LFFWESLKQLLRSDGR 서열번호 6
TDIP7 RQIKIWFQNRRMKWKK YAFTGHLHRYLVQRGV 서열번호 7
TDIP8 RQIKIWFQNRRMKWKK SSFREGLWRLLELSKK 서열번호 8
TDIP9 RQIKIWFQNRRMKWKK PNLRTKVLNYLMRTKT 서열번호 9
TDIP10 RQIKIWFQNRRMKWKK NQWRNALTAAANLSGW 서열번호 10
TDIP11 RQIKIWFQNRRMKWKK RGFLSHLRHHLQAKDH 서열번호 11
TDIP12 RQIKIWFQNRRMKWKK KEVEGWRDALTKVASL 서열번호 12
TDIP13 RQIKIWFQNRRMKWKK DPQDLDWFYERLVSLF 서열번호 13
TDIP14 RQIKIWFQNRRMKWKK LGYHWIDWEYFVGIED 서열번호 14
TDIP15 RQIKIWFQNRRMKWKK DWVWDYLLPNLEGPAG 서열번호 15
TDIP16 RQIKIWFQNRRMKWKK WALDELLQILHARELF 서열번호 16
TDIP17 RQIKIWFQNRRMKWKK DPQDLDWFYERLVSLL 서열번호 17
TDIP18 RQIKIWFQNRRMKWKK DHHLDLPRGKAIKPEILG 서열번호 18
TDIP19 RQIKIWFQNRRMKWKK YTALTNSGFHTFRDND 서열번호 19
TDIP20 RQIKIWFQNRRMKWKK LVAHEISKKMKIFATI 서열번호 20
TDIP21 RQIKIWFQNRRMKWKK EWIREQLRPALKERLP 서열번호 21
CP
(Negative control) 		RQIKIWFQNRRMKWKK GGAASSTTGGSSAATT 서열번호 22
상기 표 1, 2, 3 ,4와 같이 스크리닝된 펩타이드를 대상으로 TLR 과발현 HEK-Blue hTLR2, 3, 4, 5, 7, 8, 9 리포터 세포주를 이용하여 21종 합성 펩타이드의 TLR(TLR2, TLR3, TLR4, TLR 5, TLR7, TLR8, TLR9)에 대한 억제 효능을 확인한 결과, 대부분의 펩타이드에서 TLR2, TLR4, TLR7, TLR9 억제 활성이 확인되었다. 또한 일부 펩타이드에서 TLR3, TLR5에 대한 억제 활성이 확인되었다. (도 2)또한, 도 3에서 보듯이, TLR4에 대한 억제 효능을 HEK-Blue hTLR4를 이용한SEAP 리포터 어세이를 통해 확인한 결과, 대조군에 비해 대부분의 펩타이드에서 TLR4 억제 활성이 확인되었다. 또한, 도 4와 같이 상기의 TLR4 억제 활성이 각 펩타이드(TDIP1, TDIP2, TDIP3, TDIP5, TDIP6, TDIP7, TDIP8, TDIP10, TDIP16, TDIP20)의 농도에 따라 변화하는지 여부를 확인한 결과, 실험 대상이 된 모든 펩타이드에서 농도 의존적으로 억제 활성이 높아지는 것을 확인할 수 있었다.
2-3. 마우스 면역 세포를 이용한 면역 조절 효능 검증
상기의 펩타이드 중, TDIP1, TDIP5, TDIP6, TDIP20 펩타이드에 대한 TLR4 억제 효과를 검증하기 위하여, 마우스의 면역 세포(macrophage, RAW264.7)를 이용하여 LPS 처리 후 펩타이드를 처리했을 때, IRAK4의 인산화와 IRF3의 인산화 억제 효과를 확인하였다. 그 결과 도 5에서 보듯이, 본 발명의 펩타이드들은 MyD88-의존적 및 TRIF-의존적 TLR4 신호전달을 모두 억제하고 있음을 확인할 수 있었다.
또한, TRL4-의존적 MAPK 신호의 억제 효과를 확인하였다. RAW264.7세포에 상기 펩타이드를 농도 의존적으로 처리하고, 처리군 및 비 처리군에서의 ERK, JNK 및 p38의 인산화 억제 효과를 확인하였다. 그 결과, 도 6에서 보듯이, 본 발명의 펩타이드를 처리한 경우, MAPK 신호 전달경로에 관여하는 단백질들의 인산화가 현저히 감소된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 상기의 펩타이드가 NF-kB의 핵내 이동에 영향을 주는지 여부를 확인하였다. 마우스 면역 세포에 상기 4종의 펩타이드를 각각 처리하고, NF-kB의 핵 이동에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과, 도 7에서 보듯이, 펩타이드를 처리한 경우에는 NF-kB의 핵내 이동이 저해되는 것을 알 수 있었다.
또한, 상기 펩타이드 처리를 통해 마우스 대식세포에서 사이토카인 분비 억제 효과가 있음을 확인하였다. 마우스의 대식세포에서의 IL-6 및 TNF-α 분비량은 대조군과 비교하여 상기의 펩타이드 처리 시, 감소되는 경향이 있음을 확인하였다. (도 8)
실시예 3. TLR 억제 활성 펩타이드의 패혈증 치료 효과 확인
본 발명의 TLR 억제 활성 펩타이드가 패혈증 치료에 효과가 있음을 확인하기 위하여 마우스를 대상으로 실험을 진행하였다. LPS로 패혈증을 유도한 마우스에 본 발명의 TLR 억제 활성 펩타이드(TDIP1, TDIP5, TDIP6, TDIP20)를 마우스 체중 g당 10 nmol 양으로 각각 복강 내 주사하고, 마우스 생존률과 LPS와 펩타이드 투여 후 16시간 후 혈청 내 사이토카인(IL-23, IL-1α, IFNγ, TNF-α, MCP-1, IL-12p70, IL-1β, IL-10, IL-6, IL-27, IL-17A, IFN β) 발현량 확인을 위한 ELISA 분석을 수행하였으며, 신장 조직의 세포 사멸 확인을 위한 TUNEL assay을 진행하였다.
그 결과, 도 9에서 보듯이, 본 발명의 펩타이드를 투여한 질환 마우스는 비 투여군 및 CP 투여군이 48 내지 96 시간 사이에 사망한 것과 비교하여, 생존률이 크게 증가된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 10에서 보듯이 패혈증이 유발된 마우스에서 분비량이 증가된 사이토카인이 본 발명의 TLR 활성 억제 펩타이드 투여에 의해 분비량이 대부분 감소하였음을 알 수 있었다. 또한, 신장 조직의 세포 사멸 확인을 위한 TUNEL assay 에서도 비 투여군 및 CP 투여군에서 TUNEL positive cell이 증가한 반면 본 발명의 펩타이드 투여군에서는 TUNEL positive cell이 감소되어, 세포 사멸이 감소되었다는 점을 확인할 수 있었다. (도 11)
실시예 4. TLR 억제 활성 펩타이드의 건성황반변성 치료 효과 확인
본 발명의 TLR 억제 활성 펩타이드가 건성 황반변성에 치료 효과가 있음을 확인하기 위하여, NaIO3를 복강에 투여하여 건성 황반변성을 유도한 마우스 모델에 본 발명의 TLR 억제 활성 펩타이드(TDIP1,TDIP5, TDIP6, TDIP20)를 각각 20 μM농도로 5 μl씩 눈의 상부 각막 표면에 21일 동안 1일 1회 직접투여한 후, 상기 질환 마우스의 외핵층(ONL) 및 망막세포 상피 두께(RPE)를 확인하고, 망막 세포 사멸에 미치는 영향을 확인하였다.
그 결과, 도 12 및 13과 같이 NaIO3를 통해 건성황반변성을 유발한 경우, 망막색소상피세포 및 외핵층에 노폐물이 증가되며 두께가 감소되는 것을 확인하였으나, TDIP1, TDIP5, TDIP6 투여군에서는 노폐물이 없이 두께가 유지되는 것을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
본 발명의 일 양태로서, 본 발명은 다양한 생물 종 유래의 TIR 도메인 3차 구조 코어 부위를 제외한 도메인간 결합에 관여하는 표면에 노출되어있는 서열에 대하여, 일부 서열이 오버랩되는 16 내지 21개 아미노산 길이의 펩타이드 단편을 제작하는 단계; 상기 펩타이드 단편을 암호화하는 각각의 DNA를 합성하는 단계; 상기 합성된 DNA를 파지미드(phagemid) 벡터를 이용하여 클로닝하는 단계; 및 상기 클로닝된 벡터를 박테리오파지에 도입하여 파지 디스플레이(phage display)를 위한 라이브러리를 제작하는 단계를 포함하는 TIR 도메인 표면 서열 유래 펩타이드 단편 파지 디스플레이 라이브러리 구축 방법에 대한 것이다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 펩타이드 단편의 오버랩되는 서열은 5 내지 8개 아미노산 길이인 것이다.
본 발명의 일 양태로서, 본 발명은 상기 방법에 의해 구축된 파지 디스플레이 라이브러리로부터 인간 MAL 또는 MyD88등을 포함하는 TIR 도메인들과 특이적 결합을 이루는 펩타이드를 스크리닝하는 단계를 포함하는 TLR 신호 전달 억제 활성을 가지는 펩타이드의 스크리닝 방법에 대한 것이다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 TLR 신호 전달 억제 활성을 가지는 펩타이드는 인간 MAL 또는 MyD88을 포함하는 인간, 박테리아 또는 식물에 포함된 TIR 도메인에 특이적으로 결합하여, TIR 도메인간의 결합을 저해하여 TLR 신호를 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 양태로서, 본 발명은 TIR 도메인의 표면 서열로부터 유래된 펩타이드 단편을 포함하는 TLR(Toll like receptor) 신호 억제 펩타이드에 대한 것이다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 TLR은 TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7 및 TLR9 로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 펩타이드는 제4항의 방법에 의해 스크리닝 된 것임을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호21의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 중 하나 이상을 선택하여 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 펩타이드는 서열번호 23의 서열로 이루어진 펩타이드와 융합된 것임을 특징으로 한다.
본 발명의 일 양태로서, 본 발명은 제5항의 펩타이드를 포함하는 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물에 대한 것이다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 염증성 질환은 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 치주염, 알레르기성 및 비-알레르기성 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 만성 및 급성 위염, 크론병, 대장염, 만성 및 급성 장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 급성 및 만성 간염, 방광염, 급성 및 만성 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 비염, 만성 폐쇄성 폐질환, 과민성 대장 증후군, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 아테롬성 동맥 경화증, 관절염, 호지킨병, 췌장염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 결막염, 건성황반변성, 습성황반변성, 패혈증 또는 패혈증성 쇼크로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 염증성 질환은 패혈증, 패혈성 쇼크 또는 패혈증과 연관된 증상 및 다기관 기능 부전 증후군일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 염증성 질환은 황반변성일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 황반변성은 건성 황반변성일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 조성물은 망막세포 상피(RPE) 또는 외핵층(ONL)의 두께를 감소시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 펩타이드는 서열번호 1, 5. 6 또는 20의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

Claims (16)

  1. 다양한 생물 종 유래의 TIR 도메인 3차 구조 코어 부위를 제외한 도메인간 결합에 관여하는 표면에 노출되어있는 서열에 대하여, 일부 서열이 오버랩되는 16 내지 21개 아미노산 길이의 펩타이드 단편을 제작하는 단계;
    상기 펩타이드 단편을 암호화하는 각각의 DNA를 합성하는 단계;
    상기 합성된 DNA를 파지미드(phagemid) 벡터를 이용하여 클로닝하는 단계; 및
    상기 클로닝된 벡터를 박테리오파지에 도입하여 파지 디스플레이(phage display)를 위한 라이브러리를 제작하는 단계를 포함하는 TIR 도메인 표면 서열 유래 펩타이드 단편 파지 디스플레이 라이브러리 구축 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드 단편의 오버랩되는 서열은 5 내지 8개 아미노산 길이인 것을 특징으로 하는 라이브러리 구축 방법.
  3. 제1항의 방법에 의해 구축된 파지 디스플레이 라이브러리로부터 인간 MAL 또는 MyD88등을 포함하는 TIR 도메인들과 특이적 결합을 이루는 펩타이드를 스크리닝하는 단계를 포함하는 TLR 신호 전달 억제 활성을 가지는 펩타이드의 스크리닝 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 TLR 신호 전달 억제 활성을 가지는 펩타이드는 인간 MAL 또는 MyD88을 포함하는 인간 TIR 도메인들 또는 박테리아, 식물 등이 가지고 있는 TIR 패밀리 도메인에 특이적으로 결합하여, TIR 도메인간의 결합을 저해하여 TLR 신호를 억제하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  5. TIR 도메인의 표면 서열로부터 유래된 펩타이드 단편을 포함하는 TLR(Toll like receptor) 신호 억제 펩타이드.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 TLR은 TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7 및 TLR9 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 신호 억제 펩타이드.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 펩타이드는 제4항의 방법에 의해 스크리닝 된 것임을 특징으로 하는 펩타이드.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호21의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 중 하나 이상을 선택하여 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 펩타이드는 서열번호 23의 서열로 이루어진 펩타이드와 융합된 것임을 특징으로 하는 펩타이드.
  10. 제5항의 펩타이드를 포함하는 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 염증성 질환은 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 치주염, 알레르기성 및 비-알레르기성 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 만성 및 급성 위염, 크론병, 대장염, 만성 및 급성 장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 급성 및 만성 간염, 방광염, 급성 및 만성 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 비염, 만성 폐쇄성 폐질환, 과민성 대장 증후군, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 아테롬성 동맥 경화증, 관절염, 호지킨병, 췌장염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 결막염, 건성황반변성, 습성황반변성, 패혈증 또는 패혈증성 쇼크로 구성된 군으로부터 선택되는 질환인 약학적 조성물.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 염증성 질환은 패혈증, 패혈성 쇼크 또는 패혈증과 연관된 증상 및 다기관 기능 부전 증후군인 약학적 조성물.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 염증성 질환은 황반변성인 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 황반변성은 건성 황반변성인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 조성물은 망막세포 상피(RPE) 또는 외핵층(ONL)의 두께를 감소시키는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  16. 제10항에 있어서,
    상기 펩타이드는 서열번호 1, 5. 6 또는 20의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 중 하나 이상을 포함하는 것인, 약학적 조성물.
PCT/KR2023/017529 2022-11-03 2023-11-03 Tlr 신호 억제 펩타이드 및 이를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 WO2024096677A1 (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20220144971 2022-11-03
KR10-2022-0144971 2022-11-03
KR1020230150686A KR20240067017A (ko) 2022-11-03 2023-11-03 Tlr 신호 억제 펩타이드 및 이를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR10-2023-0150686 2023-11-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2024096677A1 true WO2024096677A1 (ko) 2024-05-10

Family

ID=90931019

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2023/017529 WO2024096677A1 (ko) 2022-11-03 2023-11-03 Tlr 신호 억제 펩타이드 및 이를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2024096677A1 (ko)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20070094802A (ko) * 2004-12-20 2007-09-21 시그마타우 인두스트리에 파르마슈티케 리우니테 에스.피.에이. ＭｙＤ８８ 동종이량체화 억제제
KR20210009197A (ko) * 2019-07-16 2021-01-26 아주대학교산학협력단 자가면역질환 및 염증성질환 펩타이드 치료제
KR102236773B1 (ko) * 2018-04-27 2021-04-06 주식회사 젠센 Tlr4 길항 펩타이드

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20070094802A (ko) * 2004-12-20 2007-09-21 시그마타우 인두스트리에 파르마슈티케 리우니테 에스.피.에이. ＭｙＤ８８ 동종이량체화 억제제
KR102236773B1 (ko) * 2018-04-27 2021-04-06 주식회사 젠센 Tlr4 길항 펩타이드
KR20210009197A (ko) * 2019-07-16 2021-01-26 아주대학교산학협력단 자가면역질환 및 염증성질환 펩타이드 치료제

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
VLADIMIR Y TOSHCHAKOV: "Targeting the TLR signalosome with TIR domain-derived cell-permeable decoy peptides: the current state and perspectives", INNATE IMMUNITY, SAGE PUBLICATIONS LTD., US, vol. 26, no. 1, 1 January 2020 (2020-01-01), Us , pages 35 - 47, XP093166319, ISSN: 1753-4259, DOI: 10.1177/1753425919844310 *
WENJI PIAO, KARI ANN SHIREY, LISA W RU, WENDY LAI, HENRYK SZMACINSKI , GREG A SNYDER , ERIC J SUNDBERG , JOSEPH R LAKOWICZ , STEFA: "A Decoy Peptide that Disrupts TIRAP Recruitment to TLRs Is Protective in a Murine Model of Influenza", CELL REPORTS, vol. 11, 30 June 2015 (2015-06-30), pages 1941 - 1952, XP055963630 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Pineda et al. ES‐62 protects against collagen‐induced arthritis by resetting interleukin‐22 toward resolution of inflammation in the joints
WO2016195159A1 (ko) 신규한 tlr4 길항제
CN112218659A (zh) 用于治疗葡萄球菌感染的治疗性噬菌体组合物
WO2024096677A1 (ko) Tlr 신호 억제 펩타이드 및 이를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2014025202A1 (ko) 작약, 건강 혼합추출물을 포함하는 치매 및 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
WO2022119060A1 (ko) 불멸화 개 줄기세포 또는 이의 용도
WO2017074118A1 (ko) Ｆｏｘｐ3를 발현하는 수지상 세포를 포함하는 면역 조절용 약학적 조성물
WO2013035906A1 (ko) 살모넬라 티피무륨 감염을 방지 및 처치하는 방법
WO2012173319A1 (ko) 봉독 포스포리파아제를 유효성분으로 포함하는 프리온 질병 치료용 조성물
EA022408B1 (ru) Производные санглиферина и способы их получения
KR20240067017A (ko) Tlr 신호 억제 펩타이드 및 이를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물
Asila et al. Immunomodulatory effects of berberine on Staphylococcus aureus-induced septic arthritis through down-regulation of Th17 and Treg signaling pathways
WO2019164195A1 (ko) 신규한 에로모나스 하이드로필라 박테리오파지 aer-hyp-3 및 이의 에로모나스 하이드로필라 균 증식 억제 용도
WO2022139489A1 (ko) 알코올성 및 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학 조성물
WO2022173165A1 (ko) 흑삼을 유효성분으로 포함하는 코로나 바이러스 감염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
WO2021150076A1 (ko) 만성폐쇄성 폐질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 건강기능식품
WO2021215687A1 (ko) 클로스트리디오이데스 디피실리 균에 대하여 용균 활성을 갖는 항균단백질 cdl200
WO2020032680A1 (ko) 재조합 단순 헤르페스 바이러스 및 이의 제조방법
WO2019203555A1 (ko) Ｐｒｏｇｒａｎｕｌｉｎ 단백질을 포함하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2023149725A1 (ko) 코비드-19 항바이러스제
WO2022139487A1 (ko) 신규한 펩타이드 및 이의 용도
WO2023140602A1 (ko) 로세부리아 속 또는 비피도박테리움 속 유래 세포외소포체를 포함하는, 염증성 질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물
WO2023277459A1 (ko) 뇌질환 치료제 스크리닝 방법
WO2024019496A1 (ko) Icp-ni를 포함하는 covid-19 치료 또는 예방용 약학적 조성물
WO2023121153A1 (ko) 척추관절염 치료용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23886371

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1