WO2024095922A1 - 腎細胞の凝集体および腎細胞の凝集体の製造方法 - Google Patents

腎細胞の凝集体および腎細胞の凝集体の製造方法 Download PDF

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WO2024095922A1
WO2024095922A1 PCT/JP2023/038925 JP2023038925W WO2024095922A1 WO 2024095922 A1 WO2024095922 A1 WO 2024095922A1 JP 2023038925 W JP2023038925 W JP 2023038925W WO 2024095922 A1 WO2024095922 A1 WO 2024095922A1
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renal
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gapdh
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越史 高橋
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日機装株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to renal cell aggregates and a method for producing renal cell aggregates.
  • Drugs administered to the living body are absorbed into the body and then excreted from the blood into the urine by the proximal tubules in the kidneys.
  • renal damage is often caused by the nephrotoxicity of drugs.
  • drug discovery support device that can evaluate pharmacokinetics and toxicity using renal cells.
  • such a drug discovery support device would also be useful in developing drugs to treat kidney-related diseases (e.g., diabetes, kidney cancer, hyperuricemia, etc.).
  • Kidney cell aggregates have been proposed as useful for confirming pharmacokinetics and developing new drugs (see Patent Document 1).
  • the present invention has been made in consideration of the above-mentioned problems, and aims to provide renal cell aggregates with improved expression levels of transporter genes and a method for producing renal cell aggregates.
  • One aspect of the present invention is a renal cell aggregate, which satisfies at least one of the following conditions: (a) The expression level of the OAT1 gene is 1 ⁇ 10 ⁇ 3 or more (ratio to GAPDH). (b) the expression level of the OAT3 gene is 1 ⁇ 10 ⁇ 4 or more (ratio to GAPDH); (c) The expression level of the OCT2 gene is 1 ⁇ 10 ⁇ 3 or more (ratio to GAPDH). (d) The expression level of the MATE1 gene is 1 ⁇ 10 ⁇ 4 or more (ratio to GAPDH). (e) The expression level of the MATE2 gene is 1 ⁇ 10 ⁇ 5 or more (ratio to GAPDH). (f) The expression level of the MDR1 gene is 1 ⁇ 10 ⁇ 3 or more (GAPDH ratio). (g) The expression level of the UART1 gene is 1 ⁇ 10 ⁇ 6 or more (ratio to GAPDH).
  • the diameter of the renal cell aggregate in the above-mentioned embodiment may be 150 ⁇ m or more and 350 ⁇ m or less.
  • the number of renal cells constituting the aggregate may be 400 or more and 2100 or less.
  • the number of cell passages of the renal cells may be 3 or 4.
  • the doubling time of the renal cells may be 20 to 36 hours.
  • the method for producing renal cell aggregates includes a pre-culture step of culturing renal cells under conditions such that the doubling time of the renal cells after culture is 20 to 36 hours, an aggregate formation step of forming aggregates of the renal cells that have undergone the pre-culture step, and a settling step of setting the formed aggregates at rest for 24 hours or more.
  • renal cells may be cultured at a seeding density of 2.1 ⁇ 10 3 to 4.4 ⁇ 10 3 cells/cm 2 for 48 to 120 hours.
  • the present invention provides a technology for renal cell aggregates with improved expression levels of transporter genes.
  • FIG. 1 is a graph showing the expression level of each OAT1 gene (ratio to GAPDH) in human renal cortex in Examples 1 to 4.
  • the renal cells used in the present disclosure may be any cell source as long as they can be cultured.
  • the renal cells are preferably derived from mammals, and preferably from primates such as humans and monkeys. Depending on the purpose, the renal cells may be derived from normal kidneys or from diseased kidneys. Examples of renal cells include cells constituting epithelium, cortex, proximal tubules, distal tubules, collecting ducts, glomeruli, etc., specifically proximal tubular epithelial cells (RPTEC), mesangial cells, etc.
  • the renal cells may be renal cells derived from stem cells such as iPS cells or ES cells.
  • the renal cells may be immortalized renal cells, established cell lines (HK-2 cells, etc.), cells derived from other animal species (MDCK cells, LLC-PK1 cells, JTC-12 cells, etc.), or forced expression cells in which genes are introduced into renal cells to express proteins such as specific transporters. More specifically, examples of renal cells include human proximal tubule epithelial cells, human distal tubule epithelial cells, and human collecting duct epithelial cells collected and isolated from the kidney, as well as proximal tubule epithelial cells, distal tubule epithelial cells, and collecting duct epithelial cells induced to differentiate from human iPS cells or human ES cells. For use in drug discovery research, proximal tubule epithelial cells, in particular proximal tubule epithelial cells derived from normal human kidneys, are preferred.
  • aggregates of kidney cells refer to masses of several or more cells. They are also called aggregates or spheroids.
  • a kidney cell aggregate according to an embodiment (hereinafter, the kidney cell aggregate may be simply referred to as an "aggregate") satisfies at least one of the following conditions.
  • the expression level of the OAT1 gene is 1 ⁇ 10 ⁇ 3 or more (ratio to GAPDH).
  • the expression level of the OAT3 gene is 1 ⁇ 10 ⁇ 4 or more (ratio to GAPDH);
  • the expression level of the OCT2 gene is 1 ⁇ 10 ⁇ 3 or more (ratio to GAPDH).
  • the expression level of the MATE1 gene is 1 ⁇ 10 ⁇ 4 or more (ratio to GAPDH).
  • the expression level of the MATE2 gene is 1 ⁇ 10 ⁇ 5 or more (ratio to GAPDH).
  • the expression level of the MDR1 gene is 1 ⁇ 10 ⁇ 3 or more (GAPDH ratio).
  • the expression level of the UART1 gene is 1 ⁇ 10 ⁇ 6 or more (ratio to GAPDH).
  • the expression level of each transporter gene in renal cell cultures can be measured by a general real-time PCR method (qPCR method).
  • the "GAPDH ratio” is a value obtained by correcting the expression level of each transporter gene with the housekeeping gene GAPDH, and is obtained by dividing the expression level of each transporter gene by the expression level of the GAPDH gene. By calculating the "GAPDH ratio", the relative gene expression level of each transporter can be measured regardless of differences in the number of cells collected. This value is corrected for errors between samples during sample preparation in the qPCR method.
  • OAT1 Organic Anion Transporter 1
  • OAT3 Organic Anion Transporter 3
  • OCT2 Organic Cation Transporter 2
  • MATE1 Multidrug And Toxin Extrusion 1
  • MATE2 Multidrug And Toxin Extrusion 2
  • MDR1 Multiple Drug Resistance 1
  • URAT1 Ultra Transporter 1
  • OAT3 When the expression level of the OAT3 gene is 1 ⁇ 10 ⁇ 4 or more (GAPDH ratio) (satisfying condition (b)), it becomes easier to achieve drug uptake and toxicity induction via OAT3. Since OAT3 uses compounds with a larger molecular weight and higher lipid solubility than OAT1 as substrates, it has the effect of enabling uptake of a wider range of drugs.
  • Cisplatin-induced toxicity which is OCT2-mediated toxicity, is easily exerted, and renal cell aggregates suitable for evaluation of Cisplatin-induced toxicity can be obtained.
  • renal cell aggregates preferably satisfy two, three, four, five, six or seven (all) of the conditions. If two or more conditions are satisfied, it is more preferable that at least conditions (a) and (f) are satisfied.
  • OAT1 is a transporter that takes up drugs from the blood vessels after drug administration.
  • MDR1 is a transporter that excretes the taken-up drugs to the ureter. Therefore, by satisfying the conditions (a) and (f), nephrotoxicity or nephrokinetics in drug discovery can be appropriately evaluated.
  • the ratio R of the gene expression level of OAT1 to the gene expression level of MDR1 is preferably 0.01 or more, more preferably 0.1 or more, and even more preferably 0.5 or more.
  • the ratio R is equal to or greater than the lower limit value described above, and as it approaches "1", drug uptake and excretion in the kidney proceeds more normally, resulting in human renal cells with functions similar to those of kidneys in the human body, and thus resulting in cells that can be appropriately evaluated for nephrotoxicity or renal pharmacokinetics in drug discovery.
  • the ratio R is equal to or greater than the lower limit mentioned above, and as it approaches "1", the kidney can have the same function as a normal kidney, that is, excrete a drug taken in through the blood vessels to the ureter side.
  • the diameter of the aggregate is preferably 150 ⁇ m or more and 350 ⁇ m or less, more preferably 200 ⁇ m or more and 350 ⁇ m or less, and even more preferably 250 ⁇ m or more and 350 ⁇ m or less.
  • the number of renal cells constituting the aggregate is preferably 400 to 2100, and more preferably 900 to 1600. By keeping the number of renal cells constituting the aggregate within the above range, higher homogeneity between multiple aggregates is possible.
  • the cell passage number of the kidney cells used in the pre-culture step is preferably 3 or 4.
  • the cell passage number is preferably 3 or 4.
  • the chromosomes of cells have a repeating sequence called telomere, and the shortening of this telomere due to cell proliferation causes cellular aging.
  • the circularity of the aggregate is preferably 0.3 or more and 1.0 or less, and more preferably 0.4 or more and 1.0 or less.
  • the aspect ratio of the aggregate is preferably 1.0 or more and 2.0 or less, and more preferably 1.0 or more and 1.5 or less.
  • the circularity and aspect ratio of the aggregate can be calculated based on well-known methods by recognizing an image (slice image (cross-sectional view)) of one aggregate using a CQ1 (confocal image cytometer, manufactured by Yokogawa Electric Corporation).
  • the method for producing a renal cell aggregate according to the embodiment includes a pre-culture step, an aggregate formation step, and a standing step. Each step will be described in detail below.
  • Pre-culture step In the pre-culture step, renal cells are cultured in a culture vessel such as a culture dish under conditions such that the doubling time of the renal cells after culture is 20 to 36 hours, preferably under conditions such that the doubling time is 24 to 32 hours.
  • Specific pre-culture conditions include a renal cell seeding density of 2.1 x 10 to 4.4 x 10 cells/ cm and a culture time of 48 to 120 hours. The cell confluence at this time is 50 to 80%. Any known medium can be appropriately used as the medium.
  • a commercially available renal tubular cell culture medium can be used, and examples of preferred media include REGM (registered trademark) (LONZA), EpiCM (registered trademark) (ScienCell), and KeratinocyteSFM (registered trademark) (Thermo Fisher Scientific).
  • REGM registered trademark
  • EpiCM registered trademark
  • KeratinocyteSFM registered trademark
  • aggregate formation process In the aggregate formation step, aggregates of renal cells that have undergone the pre-culture step are formed.
  • the culture of kidney cells in the aggregate formation step can be carried out according to a conventional method, for example, at 37°C and 5% CO2 conditions, by using a medium and culture vessel suitable for the cells to be cultured.
  • the culture may be any of stationary culture, shaking culture, and agitation culture.
  • the culture may be adhesion culture, but it is preferable to carry out the culture in a low-adhesion state (e.g., suspension culture) for at least a part of the period.
  • Kidney cells can be cultured in a low-adhesion state in a culture vessel to form aggregates.
  • the "low-adhesion state” refers to a state in which all or most of the cells are not attached to the surface of the culture vessel, and includes a state in which all or most of the cells are present away from the surface of the culture vessel, and a state in which the cells can easily be detached from the surface of the culture vessel by the coating of the culture vessel or convection of the culture medium without using tools, enzymes, etc., even if they are in contact with the surface of the culture vessel.
  • renal cell aggregates are formed within 24 hours after the start of renal cell culture. Then, by culturing renal cells in an aggregate state for a certain period of time, it is possible to restore the physiological functions of renal cells that have been dedifferentiated and reduced.
  • the period during which renal cells are cultured in a low-adhesion state in a culture vessel is generally desirably 120 hours or more. This makes it possible to obtain cultured renal cells in a state where physiological functions are more highly expressed.
  • tubular cell culture media examples include REGM (registered trademark) (LONZA), EpiCM (registered trademark) (ScienCell), and KeratinocyteSFM (registered trademark) (Thermo Fisher Scientific).
  • REGM registered trademark
  • EpiCM registered trademark
  • KeratinocyteSFM registered trademark
  • collagen I type I collagen
  • Collagen I has the effect of adhering renal cells to each other. Therefore, by culturing renal cells in a culture medium containing collagen I, the formation of aggregates is promoted.
  • Collagen I is preferably full-length collagen I, but it may also be the ⁇ 1 chain or ⁇ 2 chain that constitutes collagen I, or even collagen peptides obtained by fragmenting each chain.
  • the source of collagen I is not particularly limited, and it may be derived from humans or other animals.
  • any culture vessel can be used.
  • the vessel is subjected to a non-(low) cell adhesion treatment or is made of a non-(low) cell adhesion material.
  • the non-(low) cell adhesion treatment include a low cell adhesion hydrogel coating treatment on the vessel surface, MPC (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine) coating treatment, ProteoSave (registered trademark) SS coating treatment, and mirror polishing treatment.
  • non-(low) cell adhesion material examples include glass, and polymeric materials such as low-density polyethylene, medium-density polyethylene, polyvinyl chloride, polyethylene-vinyl acetate copolymer, poly(ethylene-ethyl acrylate) copolymer, poly(ethylene-methacrylate) copolymer, poly(ethylene vinyl acetate) copolymer, and mixtures of two or more of these polymers.
  • polymeric materials such as low-density polyethylene, medium-density polyethylene, polyvinyl chloride, polyethylene-vinyl acetate copolymer, poly(ethylene-ethyl acrylate) copolymer, poly(ethylene-methacrylate) copolymer, poly(ethylene vinyl acetate) copolymer, and mixtures of two or more of these polymers.
  • a high-density spheroid-making plate or dish can be used.
  • a culture vessel such as a spinner flask may be used as necessary.
  • ELPLASIA registered trademark
  • EZSPHERE registered trademark
  • These culture vessels are available in types such as 6-well plates, 24-well plates, 96-well plates, 384-well plates, and dishes of various sizes, and the number of aggregates that can be produced varies depending on the size of the bottom area of the vessel. For example, when using a 96-well plate (V-bottom), 96-well plate (U-bottom), or 384-well plate (U-bottom) that has been subjected to low adhesion treatment, one aggregate is formed per well.
  • Aggregates produced using high-density spheroid production plates or dishes can be collected and cultured in suspension with shaking.
  • a reciprocating shaker or a rotating shaker can be used as the shaker.
  • the renal cell aggregates obtained in the aggregate formation step are preferably left standing for 24 hours or more, more preferably for 48 hours or more, after seeding, under conditions of 37°C and 5% CO2 .
  • the upper limit of the standing time is the number of days for which the effect of standing can be obtained, and the number of days for which the supply of medium (nutrients) to the cells is not insufficient is preferable. For example, 5 days or less is preferable, and 4 days or less is more preferable.
  • the medium is not replaced.
  • spherical human renal cell aggregates can be formed in the culture process without applying a load such as shear stress to the renal cells during the formation of the aggregates.
  • the circularity and/or aspect ratio are within the above-mentioned range and are brought close to 1.
  • the period during which the circularity and aspect ratio approach 1 is the standing step, and after the standing step, the medium is replaced once every two days to periodically remove waste products from the medium and supply nutrients.
  • the renal cell aggregates of this embodiment have enhanced expression levels of the above-mentioned transporter genes, and can therefore be provided as renal cell products for drug evaluation systems.
  • drug evaluation systems include systems for evaluating pharmacokinetics in renal cells and nephrotoxicity in drug discovery.
  • renal cells can be used as a tool for analyzing the mechanisms of kidney-related diseases such as diabetes, kidney cancer, and hyperuricemia, and for searching for therapeutic drugs.
  • Example 1 Preparation of Renal Cell Aggregates Human proximal tubular epithelial cells (Clonetics (registered trademark), catalog number CC-2553, RPTEC-renal proximal tubular epithelial cells) obtained from LONZA were used as kidney cells.
  • a frozen vial stored in a liquid nitrogen storage vessel was immersed in a thermostatic bath at 37°C to thaw. After thawing, the cell suspension in the frozen vial was mixed with the recommended medium (REGM (registered trademark), LONZA) and a pre-culture step was carried out in a culture dish.
  • the pre-culture conditions were a seeding density of 4.2 x 10 3 cells/cm 2 , a culture time of 72 hours, and a passage number of 3.
  • the kidney cells that had undergone the pre-culture step were collected, and the doubling time was confirmed based on the cell count before seeding and the cell count at the time of collection, and was found to be 27.5 hours.
  • the renal cells that had undergone the pre-culture step were collected, and an aggregate formation step was carried out. Specifically, the renal cells were cultured under conditions of 37° C. and 5% CO 2 , with the medium being replaced once every two days.
  • the cells were collected before becoming confluent, and were seeded and cultured on a 96-well V-bottom plate (PrimeSurface (registered trademark) plate 96V, Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) that had been subjected to a cell-low adhesion treatment, so that the number of cells was 1000 per well, to form aggregates.
  • the culture plate was left in an incubator as a resting step, without carrying out any culture work such as medium replacement. After the resting step, the aggregates were cultured for 240 hours or more, with the medium being replaced once every two days.
  • the term "confluent" means that the ratio of the area occupied by the cells to the entire culture surface of the culture vessel is about 100%, that is, the state in which the cells have proliferated on the culture surface without any gaps.
  • Example 2 Renal cell aggregates were prepared in the same manner as in Example 1, except that the passage number was 9.
  • Example 3 Renal cell aggregates were prepared in the same manner as in Example 1, except that the passage number was 12.
  • Example 4 Renal cell aggregates were prepared in the same manner as in Example 1, except that the passage number was 17.
  • the expression level of each transporter gene was divided by the expression level of the GAPDH gene to obtain the expression level of each transporter gene (GAPDH ratio).
  • the calculated expression level of each transporter gene is shown in Table 2.
  • the appearance of the obtained renal cell aggregates was recognized by a well-known method, by taking an image (slice image (cross section)) of one aggregate using a CQ1 (confocal image cytometer, manufactured by Yokogawa Electric Corporation), and the diameter, circularity, and aspect ratio of the aggregate were calculated. The results obtained for the diameter, circularity, and aspect ratio of the renal cell aggregates are shown in the table.
  • FIG. 1 shows a graph of the expression level of the OAT1 gene (GAPDH ratio) for each of Example 1, Example 3, Example 4, and human renal cortex.
  • the diameter, circularity, aspect ratio, and OAT1 expression level of the aggregates were calculated on days 0 (immediately after seeding), 1, 2, and 11 after the start of aggregate formation. It was confirmed that the closer the circularity and aspect ratio were to 1, the higher the expression level of the OAT1 gene.
  • the renal cell aggregates of this embodiment have increased expression of the above-mentioned transporter genes, and can therefore be used as renal cell products for drug evaluation systems.
  • the renal cells of this embodiment can be used to analyze the mechanisms of kidney-related diseases such as diabetes, kidney cancer, and hyperuricemia, and as a tool for discovering therapeutic drugs.

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Abstract

トランスポータ遺伝子の発現量が向上した腎細胞の凝集体を提供する。本発明のある態様は、腎細胞の凝集体である。当該凝集体は、以下の条件のうち、少なくとも１以上を満たす。 （ａ）ＯＡＴ１遺伝子の発現量が１×１０－３以上（ＧＡＰＤＨ比）である。 （ｂ）ＯＡＴ３遺伝子の発現量が１×１０－４以上（ＧＡＰＤＨ比）である。 （ｃ）ＯＣＴ２遺伝子の発現量が１×１０－３以上（ＧＡＰＤＨ比）である。 （ｄ）ＭＡＴＥ１遺伝子の発現量が１×１０－４以上（ＧＡＰＤＨ比）である。 （ｅ）ＭＡＴＥ２遺伝子の発現量が１×１０－５以上（ＧＡＰＤＨ比）である。 （ｆ）ＭＤＲ１遺伝子の発現量が１×１０－３以上（ＧＡＰＤＨ比）である。 （ｇ）ＵＡＲＴ１遺伝子の発現量が１×１０－６以上（ＧＡＰＤＨ比）である。

Description

腎細胞の凝集体および腎細胞の凝集体の製造方法
　本発明は、腎細胞の凝集体および腎細胞の凝集体の製造方法に関する。
　生体に投与された薬剤は、生体内に吸収された後、腎臓において近位尿細管で血液から尿中に排出される。そのため、薬剤の腎毒性によりしばしば腎障害が引き起こされる。創薬研究においては、薬剤の作用を明らかにするために腎臓での薬物動態を調べることは非常に重要である。このことから、腎細胞を用いた薬物動態や毒性を評価可能な創薬支援デバイスの開発が望まれている。また、このような創薬支援デバイスは、腎臓に関する疾患（例えば、糖尿病，腎臓がん、高尿酸血症等）の治療薬開発にも有用である。
　薬物動態の確認や創薬に有用なものとして、腎細胞の細胞凝集体が提案されている（特許文献１参照）。
特開２０２１－１９１３０５号公報
　従来の腎細胞の細胞凝集体は、薬物動態や毒性を評価するために必要なトランスポータ遺伝子の発現量が不十分であり、新規な腎細胞の凝集体の開発の余地があった。
　本発明は上述のような課題を鑑みたものであり、トランスポータ遺伝子の発現量が向上した腎細胞の凝集体および腎細胞の凝集体の製造方法を提供することを目的とする。
　本発明のある態様は、腎細胞の凝集体である。当該腎細胞の凝集体は、以下の条件のうち、少なくとも１以上を満たす。
（ａ）ＯＡＴ１遺伝子の発現量が１×１０－３以上（ＧＡＰＤＨ比）である。
（ｂ）ＯＡＴ３遺伝子の発現量が１×１０－４以上（ＧＡＰＤＨ比）である。
（ｃ）ＯＣＴ２遺伝子の発現量が１×１０－３以上（ＧＡＰＤＨ比）である。
（ｄ）ＭＡＴＥ１遺伝子の発現量が１×１０－４以上（ＧＡＰＤＨ比）である。
（ｅ）ＭＡＴＥ２遺伝子の発現量が１×１０－５以上（ＧＡＰＤＨ比）である。
（ｆ）ＭＤＲ１遺伝子の発現量が１×１０－３以上（ＧＡＰＤＨ比）である。
（ｇ）ＵＡＲＴ１遺伝子の発現量が１×１０－６以上（ＧＡＰＤＨ比）である。
　上述した態様の腎細胞の凝集体の直径は１５０μｍ以上３５０μｍ以下であってもよい。前記凝集体を構成する腎細胞の数が４００個以上２１００個以下であってもよい。また、前記腎細胞の細胞継代数が３又は４であってもよい。前記腎細胞の倍加時間は、２０～３６時間であってもよい。
　本発明の他の態様は、腎細胞凝集体の製造方法である。当該腎細胞凝集体の製造方法は、培養後の腎細胞の倍加時間が２０～３６時間になるような条件で、腎細胞を培養する前培養工程と、前記前培養工程を経た前記腎細胞の凝集体を形成する凝集体形成工程と、形成された凝集体を２４時間以上にわたり静置する静置工程と、を備える。
　上述した態様の腎細胞凝集体の製造方法における前記前培養工程において、腎細胞を播種密度２．１×１０３～４．４×１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２にて、４８～１２０時間だけ培養してもよい。
　本発明によれば、トランスポータ遺伝子の発現量が向上した腎細胞の凝集体に関する技術を提供することができる。
実施例１～４、ヒト腎皮質の各ＯＡＴ１遺伝子（ＧＡＰＤＨ比）発現量を示すグラフである。
　以下、本発明の実施形態について、詳細に説明する。なお、本明細書中、数値範囲の説明における「ａ～ｂ」との表記は、特に断らない限り、ａ以上ｂ以下であることを表す。
（腎細胞の凝集体）
　本開示において使用される腎細胞は、培養可能であればよく、その供給源を問わない。腎細胞は、哺乳類由来であることが好ましく、ヒト、サルなどの霊長類由来であることが好ましい。また、目的に応じて、正常腎臓由来であってもよく、疾患を有する腎臓由来であってもよい。腎細胞としては、例えば、上皮、皮質、近位尿細管、遠位尿細管、集合管、糸球体等を構成する細胞、具体的には、近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）、メサンギウム細胞等が挙げられる。腎細胞は、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞などの幹細胞由来の腎細胞でもよい。また、腎細胞は、不死化された腎細胞、株化細胞（ＨＫ－２細胞等）、他動物種由来の細胞（ＭＤＣＫ細胞、ＬＬＣ－ＰＫ１細胞、ＪＴＣ－１２細胞等）、特定のトランスポータ等のタンパク質を発現させるために腎細胞に遺伝子導入した強制発現細胞であってもよい。より具体的には、腎細胞としては、例えば腎臓から採取、単離したヒト近位尿細管上皮細胞、ヒト遠位尿細管上皮細胞及びヒト集合管上皮細胞、並びに、ヒトｉＰＳ細胞又はヒトＥＳ細胞から分化誘導された近位尿細管上皮細胞、遠位尿細管上皮細胞及び集合管上皮細胞が例示される。創薬研究に使用するためには、近位尿細管上皮細胞、特に、ヒト正常腎由来の近位尿細管上皮細胞が好ましい。
　ここで、腎細胞の「凝集体」は、数個以上の細胞の塊状の集合体を指す。凝集塊、スフェロイドともいう。
　実施形態に係る腎細胞の凝集体（以下、腎細胞の凝集体を単に「凝集体」とよぶ場合がある）は、以下の条件のうち、少なくとも１以上を満たす。
（ａ）ＯＡＴ１遺伝子の発現量が１×１０－３以上（ＧＡＰＤＨ比）である。
（ｂ）ＯＡＴ３遺伝子の発現量が１×１０－４以上（ＧＡＰＤＨ比）である。
（ｃ）ＯＣＴ２遺伝子の発現量が１×１０－３以上（ＧＡＰＤＨ比）である。
（ｄ）ＭＡＴＥ１遺伝子の発現量が１×１０－４以上（ＧＡＰＤＨ比）である。
（ｅ）ＭＡＴＥ２遺伝子の発現量が１×１０－５以上（ＧＡＰＤＨ比）である。
（ｆ）ＭＤＲ１遺伝子の発現量が１×１０－３以上（ＧＡＰＤＨ比）である。
（ｇ）ＵＡＲＴ１遺伝子の発現量が１×１０－６以上（ＧＡＰＤＨ比）である。
　腎細胞培養物における各トランスポータ遺伝子の発現量は、一般的なリアルタイムＰＣＲ法（ｑＰＣＲ法）によって測定することができる。「ＧＡＰＤＨ比」とは、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨにより各トランスポータ遺伝子の発現量を補正することで得られる値であり、各トランスポータ遺伝子の発現量をＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量で除すことにより得られる。「ＧＡＰＤＨ比」として算出することで、回収した細胞数の違いに関わらず、各トランスポータの相対的な遺伝子発現量を測定することができる。ｑＰＣＲ法においてサンプル調製時のサンプル間の誤差を補正した値となる。
　ＯＡＴ１（Organic Anion Transporter 1）、ＯＡＴ３（Organic Anion Transporter 3）、ＯＣＴ２（Organic Cation Transporter 2）、ＭＡＴＥ１（Multidrug And Toxin Extrusion 1）、ＭＡＴＥ２（Multidrug And Toxin Extrusion 2）、及びＭＤＲ１（Multiple Drug Resistance 1）は、薬物の輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子である。
　ＵＲＡＴ１（Urate Transporter 1）は、尿酸の再吸収に関与するタンパク質をコードする遺伝子である。
　ＯＡＴ１遺伝子の発現量が１×１０－３以上（ＧＡＰＤＨ比）である（条件（ａ）を満たす）ことにより、ＯＡＴ１を介した毒性であるＴｅｎｏｆｏｖｉｒ誘発毒性を奏しやすくなり、Ｔｅｎｏｆｏｖｉｒ誘発毒性の評価に適した腎細胞の凝集体を得ることができる。
　ＯＡＴ３遺伝子の発現量が１×１０－４以上（ＧＡＰＤＨ比）である（条件（ｂ）を満たす）ことにより、ＯＡＴ３を介した薬物の取込みや毒性の誘発を奏しやすくなる。ＯＡＴ３はＯＡＴ１よりも分子量が大きく脂溶性の高い化合物を基質とするため、より広範囲な薬物の取込が可能となるという効果を奏する。
　ＯＣＴ２遺伝子の発現量が１×１０－３以上（ＧＡＰＤＨ比）である（条件（ｃ）を満たす）ことにより、ＯＣＴ２を介した毒性であるＣｉｓｐｌａｔｉｎ誘発毒性を奏しやすくなり、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ誘発毒性の評価に適した腎細胞の凝集体を得ることができる。
　ＭＡＴＥ１遺伝子の発現量が１×１０－４以上（ＧＡＰＤＨ比）である（条件（ｄ）を満たす）ことにより、腎臓において血中に取り込まれた薬物の尿中への***機能を持った腎細胞の凝集体を得ることができる。
　ＭＡＴＥ２遺伝子の発現量が１×１０－５以上（ＧＡＰＤＨ比）である（条件（ｅ）を満たす）ことにより、腎臓において取り込まれた薬物の尿中への***機能を持った腎細胞の凝集体を得ることができる。ＭＡＴＥ１と同時に発現することで広範囲な薬物の尿中への***機能を持った腎細胞の凝集体を得ることができる。
　ＭＤＲ１遺伝子の発現量が１×１０－３以上（ＧＡＰＤＨ比）である（条件（ｆ）を満たす）ことにより、腎臓において取り込まれた薬物の尿中への***機能を持った腎細胞の凝集体を得ることができる。基質認識性が広いトランスポータであるため、多様な種類の薬物の***機能を持った腎細胞の凝集体を得ることができる。
　ＵＡＲＴ１遺伝子の発現量が１×１０－６以上（ＧＡＰＤＨ比）である（条件（ｇ）を満たす）ことにより、尿酸の再吸収機能を持った腎細胞の凝集体を得ることができる。
　実施形態に係る腎細胞の凝集体は、上述した条件のうち、２個の条件、３個の条件、４個の条件、５個の条件、６個の条件または７個の（すべての）条件を満たすことが好ましい。２個以上の条件を満たす場合には、条件（ａ）および条件（ｆ）を少なくとも満たすことがより好ましい。
　ＯＡＴ１は、薬物投与後、血管内からの薬物の取込を担うトランスポータである。一方、ＭＤＲ１は、取り込まれた薬物を尿管側へ***するトランスポータである。このため、条件（ａ）および条件（ｆ）を満たすことにより、創薬における腎毒性または腎薬物動態を適切に評価することができる。
　ＯＡＴ１の遺伝子発現量とＭＤＲ１の遺伝子発現量の比率Ｒ（ＯＡＴ１の遺伝子発現量／ＭＤＲ１の遺伝子発現量）は０．０１以上が好ましく、０．１以上がより好ましく、０．５以上がさらに好ましい。
　上記比率Ｒが上述の下限値以上であり、「１」に近づくほど腎臓における薬物の取込と***が正常に行われ、ヒト生体内の腎臓と同様の機能を持つヒト腎細胞となり、創薬における腎毒性または腎薬物動態が適切に評価可能な細胞となる。
　また、上記比率Ｒが上述の下限値以上であり、「１」に近づくほど、血管から取り込まれた薬物を尿管側へ排出するという正常な腎臓と同様の機能を持つことができる。
　凝集体の直径は１５０μｍ以上３５０μｍ以下が好ましく、２００μｍ以上３５０μｍ以下がより好ましく、２５０μｍ以上３５０μｍ以下がさらに好ましい。
　凝集体を構成する腎細胞の数は４００個以上２１００個以下が好ましく，９００個以上１６００個以下がより好ましい。凝集体を構成する腎細胞の数が上記範囲内であることにより、複数の凝集体間でのより高い均質性が可能となる。
　前培養工程に用いられる腎細胞の細胞継代数は３又は４が好ましい。細胞継代数を３又は４とすることにより、代謝機能等が活性化された腎細胞の凝集体作製が可能となり、上述した条件（ａ）～（ｇ）のうち少なくとも一つの条件を満たす凝集体を得ることができる。
　ヒトの体細胞の多くは無限に増殖することはないため、ヒト腎細胞もｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養すると、一定数継代された後に細胞が増殖しなくなる。細胞の持つ染色体には、テロメアと呼ばれる繰り返し配列があり、このテロメアが細胞増殖によって短くなることで細胞の老化が引き起こされる。細胞の老化は酸化ストレスなどの外的な環境要因によっても引き起こされるため、生体外であるｉｎ　ｖｉｔｒｏの培養状態では、細胞の老化が見られる。細胞が老化するとＤＮＡの損傷が起こり、細胞周期において増殖サイクルに移行しにくくなる。そのため、腎細胞においても継代を重ねることで細胞が老化し、増殖能が低下（倍加時間が増加）すると考えられる。また、細胞の老化が起こるとタンパク質発現の低下やＤＮＡ損傷による異常タンパク質の発現が誘発されるため、老化した腎細胞を用いて凝集体を形成する際も、薬物トランスポータの発現を増加させる機能自体が低下すると考えられる。
　これらのことから、継代数が３または４の老化していない腎細胞を使用して凝集体を形成することで、薬物トランスポータの発現が高い腎細胞凝集体を得ることができる。また、増殖能が低下した腎細胞では、凝集体を作製するために必要な細胞数の回収が困難であるため、倍加時間が２０～３６時間の増殖サイクルにある腎細胞を使用することで十分量の腎細胞凝集体を作製することができる。
　凝集体の真円度は、０．３以上１．０以下が好ましく、０．４以上１．０以下がより好ましい。また、凝集体の縦横比は、１．０以上２．０以下が好ましく、１．０以上１．５以下がより好ましい。なお、凝集体の真円度および縦横比は、周知手法に基づき、ＣＱ１（共焦点イメージサイトメーター、横河電機社製）により一つの凝集体を画像｛スライス画像（断面図）｝認識して算出することができる。
（腎細胞の凝集体の製造方法）
　実施形態に係る腎細胞の凝集体の製造方法は、前培養工程、凝集体形成工程および静置工程を含む。以下、各工程の詳細について説明する。
（前培養工程）
　前培養工程では、培養後の腎細胞の倍加時間が２０～３６時間になるような条件、好ましくは当該倍加時間が２４～３２時間になるような条件で、培養ディッシュなどの培養容器上で腎細胞が培養される。具体的な前培養の条件としては、腎細胞の播種密度２．１×１０３～４．４×１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、培養時間４８～１２０時間が挙げられる。このときの細胞コンフルエンスは、５０～８０％である。
　培地としては、公知の任意のものを適宜使用することができる。例えば、近位尿細管上皮細胞の培養の場合、市販の尿細管細胞培養培地を使用することができ、好ましい培地の例としては、ＲＥＧＭ（登録商標）（ＬＯＮＺＡ社）、ＥｐｉＣＭ（登録商標）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社）、ＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅＳＦＭ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）が挙げられる。
　培養後の腎細胞の倍加時間が２０～３６時間となるように前培養を行うことにより、腎細胞の増殖能が最も活性化された状態となり、代謝機能が活性化された腎細胞の凝集体作製が可能となり、上述した条件（ａ）～（ｇ）のうち少なくとも一つの条件を満たす凝集体を得ることができる。
（凝集体形成工程）
　凝集体形成工程において、前培養工程を経た腎細胞の凝集体が形成される。
　凝集体形成工程における腎細胞の培養は、培養しようとする細胞に適した培地及び培養容器を用いることにより、常法に従って、例えば３７℃、５％ＣＯ２条件下で行うことができる。培養は、静置培養、振盪培養又は撹拌培養などのいずれであってもよい。培養は、接着培養であってもよいが、少なくとも一部の期間は低接着の状態で培養を行うこと（たとえば浮遊培養）が好ましい。腎細胞は、培養容器に低接着の状態で培養することによって凝集体を形成させることができる。「低接着（の）状態」とは、全て又は大部分の細胞が培養容器表面に接着していない状態を指し、全て又は大部分の細胞が培養容器表面から離れて存在する状態、及び培養容器表面に接触している場合でも、器具や酵素等を用いずに培養容器のコーティングや培地の対流などにより培養容器表面から容易に離れ得る状態、を含む。
　たとえば、ある場合には、腎細胞の凝集体は、腎細胞の培養開始後２４時間以内に形成される。そして、一部の期間は凝集体の状態で腎細胞を培養することで、脱分化して低下した腎細胞の生理機能を回復させることができる。腎細胞を培養容器に低接着の状態で培養する期間は、一般に１２０時間以上が望ましい。これにより、生理機能のより高い発現状態にある培養された腎細胞を得ることができる。培養期間中、培地は定期的に交換することが好ましい。例えば、培地は２日毎に交換される。
　培地としては、公知の任意のものを適宜使用することができる。例えば、近位尿細管上皮細胞の培養の場合、市販の尿細管細胞培養培地を使用することができ、好ましい培地の例としては、ＲＥＧＭ（登録商標）（ＬＯＮＺＡ社）、ＥｐｉＣＭ（登録商標）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社）、ＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅＳＦＭ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）が挙げられる。
　また、細胞培養に有用な従来公知の材料及び添加剤を適宜使用することができる。例えば、培地には、コラーゲンＩ（Ｉ型コラーゲン）を添加することができる。コラーゲンＩは、腎細胞同士を接着させる作用を有する。そのため、コラーゲンＩを含む培地で腎細胞を培養することにより、凝集体の形成が促進される。コラーゲンＩは、完全長のコラーゲンＩであることが好ましいが、コラーゲンＩを構成するα１鎖又はα２鎖、更には各鎖を断片化したコラーゲンペプチドなどであってもよい。また、コラーゲンＩの供給源は特に限定されず、ヒト由来であっても、他の動物由来であってもよい。
　培養容器は、任意のものを使用することができる。ここで、凝集体の形成を促進するためには、細胞非（低）接着処理が施されているか、細胞非（低）接着材料で構成されていることが好ましい。細胞非（低）接着処理としては、容器表面への細胞低接着ハイドロゲルコーティング処理、ＭＰＣ（2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine)コーティング処理、プロテオセーブ（登録商標）ＳＳコーティング処理、鏡面研磨処理などが例示される。細胞非（低）接着材料としては、ガラス、並びに、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン－ビニルアセテートコポリマー、ポリ（エチレン－エチルアクリレート）コポリマー、ポリ（エチレン－メタアクリレート）コポリマー、ポリ（エチレン酢酸ビニル）コポリマー、及びこれらのポリマーの２種以上の混合物といった高分子材料が例示される。
　凝集体を大量に形成させる場合は、高密度スフェロイド作製プレート又はディッシュを使用することができる。更には、必要に応じてスピナーフラスコなどの培養容器を用いてもよい。例えば、ＥＬＰＬＡＳＩＡ（登録商標）シリーズの培養容器（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）、ＥＺＳＰＨＥＲＥ（登録商標）シリーズの培養容器（ＡＧＣテクノグラス社）などを使用することが好ましい。これらの培養容器は、６ウェルプレート、２４ウェルプレート、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、種々のサイズのディッシュなどのタイプがあり、容器の底面積の大きさにより作製できる凝集体の数が異なる。例えば、低接着処理を施された９６ウェルプレート（Ｖ底）、９６ウェルプレート（Ｕ底）、３８４ウェルプレート（Ｕ底）を用いる場合、１ウェルに１つの凝集体が形成される。
　高密度スフェロイド作製プレート又はディッシュなどを使用して作製した凝集体は、回収して浮遊振盪培養することができる。浮遊振盪培養する場合は、細胞非（低）接着処理が施されたディッシュ又はプレートなどをシェーカー上に設置して凝集体を培養することが好ましい。シェーカーとしては、往復型シェーカー及び旋回型シェーカーを使用することができる。
（静置工程）
　静置工程では、凝集体形成工程により得られた腎細胞の凝集体が播種後、たとえば、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間以上静置されることが好ましく、４８時間以上静置されることがより好ましい。静置時間の上限については、静置による効果が得られる日数であり、細胞への培地（栄養分）の供給が不足しない日数が好ましい。たとえば、５日以内が好ましく、４日以内がより好ましい。腎細胞の静置中において、培地の交換は実施されない。得られた凝集体を上記期間だけ静置させることにより、凝集体における細胞間同士の接着をより強固にすることができる。また、凝集体形成中の腎細胞に対してせん断応力などの負荷をかけることなく、培養過程において球形なヒト腎細胞凝集体を形成することができる。換言すると、腎細胞の凝集体が静置工程を経ることにより、真円度および／または縦横比が上述した範囲となり、１に近づけられる。この結果として、上述した各トランスポータ遺伝子の発現量が高まると推察される。真円度および縦横比が１に近づく期間が静置工程であり、静置工程の後は２日に１回の頻度で培地交換し，定期的に培地中の老廃物の除去と栄養分の供給を行う。
（腎細胞の凝集体の用途）
　本実施形態の腎細胞の凝集体は、上述した各トランスポータ遺伝子の発現量が高められているため、薬物評価系用の腎細胞製品として提供することができる。薬物評価系としては、例えば、腎細胞における薬物動態や、創薬における腎毒性の評価系が挙げられる。また、このような腎細胞は、糖尿病や腎臓がん、高尿酸血症といった腎臓に関する疾患のメカニズム解析や、治療薬探索ツールとしても利用できる。
　以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
　以下、本発明を実施例および比較例により説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）
＜腎細胞凝集体の製造＞
　腎細胞として、ＬＯＮＺＡ社から入手したヒト近位尿細管上皮細胞｛Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（登録商標）、カタログ番号ＣＣ－２５５３、ＲＰＴＥＣ－腎臓近位尿細管上皮細胞｝を使用した。液体窒素保管器に保管されてある凍結バイアルを３７℃の恒温槽に浸して解凍した。解凍後、凍結バイアル中の細胞懸濁液を推奨される培地｛ＲＥＧＭ（登録商標）、ＬＯＮＺＡ社｝と混和し、培養ディッシュ中で前培養工程を実施した。前培養時の条件として、播種密度４．２×１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、培養時間７２時間、継代数３とした。前培養により、細胞コンフルエンスがおよそ７０％となった。前培養工程を経た腎細胞を回収し、播種前の細胞数および回収時の細胞数に基づいて、倍加時間を確認したところ、２７．５時間であった。
　前培養工程を経た腎細胞を回収し、凝集体形成工程を実施した。具体的には、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で、２日に１回の頻度で培地交換しながら腎細胞を培養した。細胞を、コンフルエントになる前に回収し、細胞低接着処理された９６ウェルＶ底プレート｛ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）プレート９６Ｖ、住友ベークライト社｝に、１ウェルあたり１０００個の細胞数となるように播種して培養することにより、凝集体を形成させた。凝集体形成後の２日間（４８時間）は静置工程として培地交換等の培養作業は実施せずに培養プレートをインキュベーター内に静置した。静置工程の後、凝集体は、２日に１回の頻度で培地交換しながら２４０時間以上培養した。尚、「コンフルエント」とは、培養容器の培養表面全体に対して細胞の占める面積の割合が約１００％であること、すなわち培養表面に隙間なく細胞が増殖した状態を意味する。
（実施例２）
　継代数を９としたことを除き、実施例１と同様な方法により腎細胞凝集体を作製した。
（実施例３）
　継代数を１２としたことを除き、実施例１と同様な方法により腎細胞凝集体を作製した。
（実施例４）
　継代数を１７としたことを除き、実施例１と同様な方法により腎細胞凝集体を作製した。
　実施例１～４の各腎細胞凝集体について以下の評価または測定を実施した。
＜トランスポータ遺伝子発現量の測定＞
　２日間静置後の各凝集体から、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてｍＲＮＡを抽出及び精製した。さらに、このｍＲＮＡから、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（登録商標）　Ｗｈｏｌｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。これらのｃＤＮＡを鋳型として、Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ（登録商標）　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　１（タカラバイオ社）を用いてリアルタイムＰＣＲ法により、ＧＡＰＤＨ、ＯＡＴ１、ＯＡＴ３、ＯＣＴ２、ＭＡＴＥ１、ＭＡＴＥ２、ＭＤＲ１およびＵＡＲＴ１の各遺伝子発現量を測定した。なお、すべての実験について、１回の実験において各サンプルはそれぞれｎ＝３で測定した。表１にリアルタイムＰＣＲ法で用いた各遺伝子のプライマー名、オリゴ配列を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　得られた各トランスポータ遺伝子の発現量をＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量で除すことにより、各トランスポータ遺伝子の発現量（ＧＡＰＤＨ比）を得た。各トランスポータ遺伝子の発現量（ＧＡＰＤＨ比）の算出結果を表２に示す。
（凝集体の直径・真円度・縦横比）
　得られた腎細胞凝集体の様子を、周知手法に基づき、ＣＱ１（共焦点イメージサイトメーター、横河電機社製）により一つの凝集体を画像｛スライス画像（断面図）｝認識し、凝集体の直径、真円度および縦横比を算出した。腎細胞凝集体の直径、真円度および縦横比について得られた結果を表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　上記表２において、「－」の項目は未実施であることを示す。
　また、腎細胞凝集体の形成に用いたヒト近位尿細管上皮細胞について、ＯＡＴ１遺伝子（ＧＡＰＤＨ比）発現量を測定した。図１に、実施例１、実施例３、実施例４，ヒト腎皮質の各ＯＡＴ１遺伝子（ＧＡＰＤＨ比）発現量のグラフを示す。
（凝集体形成工程における細胞形態と遺伝子発現量の変化）
　上述した腎細胞凝集体の製造に準拠し、凝集体形成開始してからの日数が０日（播種直後）、１日、２日、１１日とした場合において、凝集体の直径、真円度、縦横比、ＯＡＴ１発現量を算出した。真円度及び縦横比が１に近くなるほど、ＯＡＴ１遺伝子の発現量が高まることが確認できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　本実施形態の腎細胞の凝集体は、上述した各トランスポータ遺伝子の発現量が高められているため、薬物評価系用の腎細胞製品として利用することができる。また、本実施形態の腎細胞は、糖尿病や腎臓がん、高尿酸血症といった腎臓に関する疾患のメカニズム解析や、治療薬探索ツールとしても利用できる。

Claims (7)

  1. 　腎細胞の凝集体であって、
    　以下の条件のうち、少なくとも１以上を満たす、腎細胞の凝集体。
    （ａ）ＯＡＴ１遺伝子の発現量が１×１０－３以上（ＧＡＰＤＨ比）である。
    （ｂ）ＯＡＴ３遺伝子の発現量が１×１０－４以上（ＧＡＰＤＨ比）である。
    （ｃ）ＯＣＴ２遺伝子の発現量が１×１０－３以上（ＧＡＰＤＨ比）である。
    （ｄ）ＭＡＴＥ１遺伝子の発現量が１×１０－４以上（ＧＡＰＤＨ比）である。
    （ｅ）ＭＡＴＥ２遺伝子の発現量が１×１０－５以上（ＧＡＰＤＨ比）である。
    （ｆ）ＭＤＲ１遺伝子の発現量が１×１０－３以上（ＧＡＰＤＨ比）である。
    （ｇ）ＵＡＲＴ１遺伝子の発現量が１×１０－６以上（ＧＡＰＤＨ比）である。
  2. 　前記凝集体の直径が１５０μｍ以上３５０μｍ以下である、請求項１に記載の腎細胞の凝集体。
  3. 　前記凝集体を構成する腎細胞の数が４００個以上２１００個以下である、請求項１または２に記載の腎細胞の凝集体。
  4. 　前記腎細胞の細胞継代数が３又は４である、請求項１または２に記載の腎細胞の凝集体。
  5. 　前記腎細胞の倍加時間が２０～３６時間である、請求項１または２に記載の腎細胞の凝集体。
  6. 　培養後の腎細胞の倍加時間が２０～３６時間になるような条件で、腎細胞を培養する前培養工程と、
    　前記前培養工程を経た前記腎細胞の凝集体を形成する凝集体形成工程と、
    　形成された凝集体を２４時間以上にわたり静置する静置工程と、
    　を備える、腎細胞凝集体の製造方法。
  7. 　前記前培養工程において、腎細胞を播種密度２．１×１０３～４．４×１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２にて、４８～１２０時間だけ培養する、請求項６に記載の腎細胞凝集体の製造方法。
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