WO2024075712A1 - 硝酸生成能を有する固体担体の製造方法、当該固体担体を用いた植物栽培方法、並びに土壌組成物 - Google Patents

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亮也 西田
宏平 西田
俊介 木村
晃規 安藤
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    • C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier

Definitions

  • This disclosure relates to a technology for turning non-soil media into soil, and more specifically, to a method for producing a solid carrier capable of producing nitric acid, a method for cultivating plants using the solid carrier, and a soil composition.
  • nitrate nitrogen In natural soil, when organic matter such as compost is directly added, it is broken down into nitrate nitrogen, which can be used by many plants, through a two-step process: ammonification, which converts organic nitrogen into ammonia nitrogen, and nitrification, which converts ammonia nitrogen into nitrate nitrogen, thanks to the work of microorganisms that decompose organic matter and produce nitrate nitrogen.
  • the nitrifying bacteria responsible for nitrification are not sufficiently immobilized, and adding high concentrations of organic matter can kill the nitrifying bacteria or damage plant roots.
  • Patent Document 1 One of the inventors of this application developed a soil modification technology in which a group of microorganisms that decompose organic matter to produce nitrate nitrogen is immobilized on a solid carrier such as rock wool, enabling the solid carrier to decompose organic matter and produce nitrate nitrogen in the same way as natural soil (see, for example, Patent Document 1 and Non-Patent Document 1).
  • Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 are characterized by the fact that after adding a group of microorganisms to the solid carrier, the microorganisms are immobilized on the solid carrier by repeatedly adding organic matter and washing with water to prevent denitrification reactions (see Figure 11).
  • Denitrification is a phenomenon in which nitrate nitrogen is reduced to nitrous oxide gas or nitrogen gas by denitrifying bacteria, resulting in the loss of nitrate nitrogen. This reaction is likely to be induced under anaerobic conditions when nitrate nitrogen coexists with organic matter, which serves as an energy source for denitrifying bacteria. In recent years, denitrification due to a nitrogen conversion reaction caused by anammox bacteria has also been discovered. This is a phenomenon in which ammonia nitrogen and nitrite nitrogen are converted to nitrogen gas and other gases and lost under anaerobic conditions.
  • the immobilization of microbial groups is limited to the surface layer (upper layer) of the solid carrier, so there has been a demand for the development of a technique that can immobilize soil in deeper layers (lower layers).
  • the objective of this disclosure is to provide a soil immobilization technique that can obtain more appropriate nitrate production capacity.
  • a method for producing a solid carrier having nitric acid production ability which comprises a step of causing all of the following (B) to (E) to coexist in a solid carrier of the following (A), thereby producing a solid carrier on which a group of microorganisms of the following (B) is fixed:
  • A A gas-permeable solid carrier.
  • B A group of microorganisms that mineralize organic matter and produce nitrate nitrogen.
  • C Organic matter.
  • D Water.
  • E A plant body that absorbs nitrate nitrogen.
  • the seeds of the plant body (E) or the tissue capable of vegetative propagation of the plant body (E) can be sown or planted in the solid carrier (A) to allow the plant body (E) to coexist in the solid carrier (A). More specifically, the method may include a step of adding and/or mixing the microorganism group (B) to the upper layer of the solid carrier (A), followed by a step of sowing or planting the seeds of the plant body (E) or the tissue capable of vegetative propagation of the plant body (E) in the solid carrier (A).
  • the method may also include a step of attaching the microorganism group (B) to at least a portion of the surface of the seeds of the plant body (E) or the tissue capable of vegetative propagation of the plant body (E), followed by a step of sowing or planting the seeds of the plant body (E) or the tissue capable of vegetative propagation of the plant body (E) in the solid carrier (A).
  • the plant body of (E) after germination can be planted in the solid carrier of (A) to allow the plant body of (E) to coexist in the solid carrier of (A) described below.
  • the method may include a step of growing the plant body of (E) in soil containing the microorganism group of (B) and a step of planting the plant body of (E) after germination obtained by the step in the solid carrier of (A).
  • the method may also include a step of adding and/or mixing the microorganism group of (B) to the upper layer of the solid carrier of (A) and then a step of planting the plant body of (E) after germination in the solid carrier of (A).
  • the solid carrier (A) can be one or more selected from the group consisting of biochar, ceramics, rock wool, vermiculite, perlite, zeolite, sand, Kanuma soil, glass, urethane, nylon, melamine resin, wood chips, straw, sphagnum moss, cotton, paper, polyacrylamide gel, agar, pumice, soil material, sintered soil material, and field soil.
  • the organic matter in (C) may be one or more of the group consisting of organic matter derived from plants, animals, bacteria, food, and waste.
  • the plant body of (E) may be one or more of the plant bodies of the Asteraceae, Brassicaceae, Solanaceae, Amaranthaceae, Amaryllidaceae, Rosaceae, Fabaceae, Cucurbitaceae, Poaceae, Zingiberaceae, Liliaceae, Umbelliferae, Chenopodiaceae, and Convolvulaceae.
  • the solid carrier (A) can also be used in a state where it is filled in a container.
  • the cultivation method disclosed herein is a method for cultivating a plant, characterized in that a solid carrier having nitric acid production ability is produced by the above-mentioned method, and the obtained solid carrier is used to cultivate a plant.
  • the soil composition disclosed herein is a soil composition for producing a solid carrier capable of generating nitric acid, characterized in that all of (B) to (E) are present in the solid carrier (A).
  • soil composition refers to a composition whose main component is the solid carrier (A) that is in the process of being converted into soil, and refers to an intermediate that is generated in the process of converting the solid carrier into soil.
  • the solid carrier (A) may have a nitric acid recovery rate of 1% or more as measured by the following method.
  • Nitric acid recovery rate measurement method (1) The organic substance of (C) is added to the solid carrier in an amount of 0.05 g or more per 1 L of the solid carrier in terms of nitrogen amount, and the solid carrier is then allowed to stand at 24 to 26° C. for 1 hour or more. (2) Adding 50 mL or more of water per 1 L of the solid carrier and allowing it to flow out of the solid carrier, thereby washing the solid carrier. (3) The effluent flowing out from the solid carrier is collected, and the nitrate nitrogen content in the effluent is measured. (4) The ratio of the nitrate nitrogen content in the effluent measured in the step (3) to the amount of nitrogen in the organic matter added in the step (1) is calculated and this is defined as the nitric acid recovery rate.
  • the solid carrier (A), the organic matter (C), and the plant body (E) may each be as described above.
  • the solid carrier (A) may be filled in a container.
  • the present disclosure it is possible to immobilize microbial communities not only on the surface layer of a solid carrier, but on the entire solid carrier. Furthermore, according to the present disclosure, there is no need for a process of washing the nitrate nitrogen produced during the soil conversion process from the solid carrier, and there is no problem with nitrate nitrogen leaking out of the system. Therefore, according to the present disclosure, it is possible to provide a soil conversion technology that can obtain more appropriate nitrate production ability.
  • FIG. 1 is a flow diagram showing one embodiment of a method for producing a solid support.
  • FIG. 1 is a flow diagram showing one embodiment of a method for producing a solid support.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing one embodiment of a method for producing a solid support.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing one embodiment of a method for producing a solid support.
  • 1 is a graph showing the nitrate nitrogen recovery rate (%) in Example 1.
  • FIG. 1 is a photographic image showing the growth state of plants in a control area in Example 2.
  • FIG. 2 is a photographic image showing the growth state of plants in the test plots in Example 2.
  • FIG. 1 is a photographic image showing the appearance of a plant before harvest in Example 3.
  • 1 is a graph showing the measured values of aboveground part yield (g) in Example 3.
  • Values indicate the average value ⁇ standard error.
  • 1 is a graph showing the measured values of nitrate nitrogen recovery rate (%) in Example 3. Values are shown as average values ⁇ standard error.
  • FIG. 1 is a photographic image showing the appearance of a plant before harvest in Example 4. 1 is a graph showing the measured values of aboveground part yield (g) in Example 4. Values indicate the average value ⁇ standard error. 1 is a graph showing the measured values of nitrate nitrogen recovery rate (%) in Example 4. Values show the average value ⁇ standard error.
  • FIG. 1 is a photographic image showing the pre-harvest appearance of sunny lettuce in Example 5.
  • FIG. 1 is a photographic image showing the appearance of a control group without plants in Example 5.
  • FIG. 1 is a graph showing the measured values of nitrate nitrogen recovery rate (%) before and after disturbance treatment in Example 5. "A" indicates before disturbance, and “B” indicates after disturbance, and the values indicate the average value ⁇ standard error.
  • FIG. 11 is a photographic image showing the appearance of a plant before harvest in Example 7.
  • FIG. 13 is a photographic image showing the appearance of a measurement column in Example 7.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a conventional soil processing technology.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the configuration of a hairy vetch plot in Example 8. The solid carriers packed in the pipe are divided into 8 layers, L1 to L8, from the top.
  • 1 is a schematic diagram showing the configuration of a control area in Example 8. The solid carriers packed in the pipe are divided into 8 layers, L1 to L8, from the top.
  • FIG. 1 is a graph showing the relative value (%) of ammonia oxidizing bacteria (amoA) in each layer L1 to L8 based on the total amount of L1 bacteria in Example 8. Black bars indicate the control group, white bars indicate the hairy vetch group, and values are the mean ⁇ standard error. 1 is a graph showing the relative value (%) of the nitrite oxidizing bacteria group (norB) in each layer L1 to L8 based on the total amount of L1 bacteria in Example 8. Black bars indicate the control group, white bars indicate the hairy vetch group, and values are the mean ⁇ standard error.
  • FIG. 1 is a photographic image showing the growth state of a plant in a comparative example.
  • the first embodiment relates to a method for producing a solid carrier capable of producing nitric acid.
  • the method for producing a solid carrier capable of producing nitric acid includes a step of causing all of the following (B) to (E) to coexist in the following solid carrier (A), and is characterized in that it produces a solid carrier on which the following microbial group (B) is fixed:
  • A A gas-permeable solid carrier.
  • B A group of microorganisms that mineralize organic matter and produce nitrate nitrogen.
  • C Organic matter.
  • D Water.
  • E A plant body that absorbs nitrate nitrogen.
  • the "breathable solid carrier” can be anything that is capable of supporting microorganisms, organic components, and moisture, and is breathable and porous.
  • materials that have a large surface area for immobilizing (fixing) microorganisms relative to their volume are preferred.
  • having breathability means that when the solid carriers are packed into a container or piled up into a pile, the environment in the gaps between and/or within the solid carriers is maintained in aerobic conditions, making it easy for nitrification to proceed, and ensuring a gas phase that makes it difficult for denitrification reactions to occur.
  • the overall environment between and within the solid carriers may be referred to simply as “within the solid carrier” or "the entire solid carrier.”
  • Such solid carriers include rock and mineral-based materials such as rock wool, vermiculite, perlite, zeolite, sand, Kanuma soil, glass (specifically glass beads), ceramics, pumice, soil materials, sintered soil materials, and field soil; synthetic resin-based materials such as urethane, nylon, melamine resin, and polyacrylamide gel; and biological materials such as wood chips (specifically cedar chips), straw, sphagnum moss, charcoal (specifically biochar and activated charcoal), cotton, paper (specifically filter paper), and agar.
  • rock and mineral-based materials such as rock wool, vermiculite, perlite, zeolite, sand, Kanuma soil, glass (specifically glass beads), ceramics, pumice, soil materials, sintered soil materials, and field soil
  • synthetic resin-based materials such as urethane, nylon, melamine resin, and polyacrylamide gel
  • biological materials such as wood chips (specifically cedar chips), straw, sphagnum moss, charcoal (specifically biochar
  • biochar a group consisting of biochar, ceramics, rock wool, vermiculite, perlite, zeolite, sand, Kanuma soil, glass, urethane, nylon, melamine resin, wood chips, straw, sphagnum moss, cotton, paper, polyacrylamide gel, agar, pumice, soil material, sintered soil material, and field soil, with biochar being particularly preferable.
  • biochar is obtained by heating biological resources (e.g. agricultural waste such as grain husks, thinning materials, bamboo, etc.) under low-oxygen conditions, and is produced as a by-product of biofuel.
  • biological resources e.g. agricultural waste such as grain husks, thinning materials, bamboo, etc.
  • specific examples include rice husk charcoal, wood charcoal, and bamboo charcoal.
  • the solid carrier can be used in a state where it is filled in a container.
  • Any container that can be filled with the solid carrier can be used as the container in which the solid carrier is filled.
  • Specific examples include agricultural pots, planters, etc.; bags made of plastic, cloth, paper, etc.; and baskets with a mesh-like structure throughout. It is preferable that these containers have an opening at the bottom and a structure that allows water to flow out after it has been added to the solid carrier.
  • the solid carriers are filled into the container in such a way that voids (gas phase) are secured between and/or within the solid carriers so that the entire container does not become waterlogged due to capillary action after water is added and allowed to flow out. This is because the denitrification reaction is more likely to occur when the container becomes waterlogged and anaerobic conditions are met, which favors the activity of denitrifying bacteria. Therefore, when filling the container with the solid carriers, typically 0.1 to 100,000 ml, and preferably 1 to 10,000 ml of the solid carriers can be filled.
  • the solid carriers can be filled to a layer of 0.1 to 100 cm in height.
  • the "microorganisms that mineralize organic matter to produce nitrate nitrogen include a microorganism that performs ammonification and a microorganism that performs nitrification.
  • the coexistence of these microorganisms makes it possible to continuously carry out the decomposition of organic matter to ammonia nitrogen (ammonification) and the nitrification of ammonia nitrogen to nitrate nitrogen (nitrification) in the same reaction system.
  • Microorganisms that perform ammonification include, for example, protozoa, bacteria, and ammonia-producing bacteria such as filamentous fungi.
  • Microorganisms that perform nitrification include ammonia-oxidizing bacteria (or nitrite-producing bacteria) of the genera Nitrosomonas, Nitrorosococcus, and Nitrosospira (including Nitrosolobus and Nitrosovibrio); nitrite-oxidizing bacteria (or nitrate-producing bacteria) of the genera Nitrobacter, Nitrospira, and Nitrococcus.
  • the "organic matter” can be any organic resource, such as organic fertilizer, food waste, plant waste, animal waste, livestock waste, and excrement.
  • organic fertilizer such as organic fertilizer, food waste, plant waste, animal waste, livestock waste, and excrement.
  • high-nitrogen organic matter with a C/N ratio (carbon to nitrogen content) of 24 or less, preferably 19 or less, in order to increase the recovery efficiency of nitrate nitrogen.
  • the organic matter is preferably one that contains a large amount of protein, protein decomposition products, amino acids, etc.
  • organic matter derived from plants, animals, bacteria, food, and waste can be mentioned. More specifically, food residues such as fish broth, corn soaking liquid, oil cake, fish meal, soybean meal, yeast cake, sake lees, shochu lees, rice bran, and food waste can be mentioned. These are waste materials obtained during the food manufacturing process, and are desirable in that they do not contain toxic components.
  • the organic matter can be excrement such as livestock manure, human feces, and insect feces, insect powder, algae powder, fungus body, methane fermentation digestive liquid, sewage sludge, etc., and organic matter containing ammonia nitrogen can also be used.
  • the organic matter can be food itself such as soybean powder, soup stock base (high amino acid content), milk, and powdered milk.
  • plant body residues which are plant tissues and organs that cannot be used as edible parts, can also be used.
  • one or more of the following group be used as organic matter: fish broth, fish meal, oil cake, food waste, corn soaking liquid, rice bran, soybean meal, plant residues, animal residues, milk, powdered milk, livestock feces, human feces and urine, insect feces, insect powder, algae powder, fungus bodies, methane fermentation digestate, and sewage sludge.
  • fish broth examples include bonito broth.
  • Corn steeping liquid includes corn steeping liquid (CSL: corn steeping liquid, a by-product of corn starch production).
  • Oil cake includes rapeseed oil cake and corn oil cake.
  • Plant residues include stems and leaves generated during defoliation during cultivation management of tomatoes and the like.
  • Food waste includes fish bones, vegetable waste after cooking, and meat pieces.
  • Livestock manure includes cow manure and chicken manure. Bonito broth and corn steep liquor are particularly desirable because they are liquid and therefore easily penetrate the solid carrier.
  • water is not particularly limited, but examples include pure water (distilled water, ion-exchanged water, reverse osmosis membrane water, etc.), well water, river water, lake water, tap water, seawater, etc.
  • the washing step is unnecessary because the excess nitrate nitrogen is absorbed by the plant body, but since water is essential for maintaining the plant body and microbial population, it is necessary to have an appropriate amount of water coexist in the solid carrier.
  • the "plant that absorbs nitrate nitrogen” may be any plant, such as vegetables, fruits, flowers, trees, fruit trees, ornamental plants, pasture grass, or moss.
  • Specific examples include plants belonging to the Asteraceae, Brassicaceae, Solanaceae, Amaranthaceae, Amaryllidaceae, Rosaceae, Fabaceae, Cucurbitaceae, Poaceae, Zingiberaceae, Liliaceae, Apiaceae, Chenopodiaceae, and Convolvulaceae families.
  • the essential step is to cause the microorganisms, the organic matter, the water, and the plant body to all coexist in the solid carrier.
  • any elements other than the above-mentioned components for example, microorganisms other than the above-mentioned microorganisms, media other than the solid carrier, organic matter other than the above-mentioned organic matter, inorganic fertilizers and other agricultural materials, etc.
  • any elements other than the above-mentioned components for example, microorganisms other than the above-mentioned microorganisms, media other than the solid carrier, organic matter other than the above-mentioned organic matter, inorganic fertilizers and other agricultural materials, etc.
  • a means for allowing the microorganisms to "coexist" in the solid carrier may, for example, be to add and/or mix a microbial source containing the microorganisms to the upper layer of the solid carrier.
  • the "upper layer” of the solid carrier refers to the surface portion of the solid carrier, and for example, in the case of a solid carrier packed in a container, the upper layer may be within about 10% from the top in the height direction. Alternatively, in the case of a solid carrier that is not packed in a container and is piled up outdoors, the upper layer may be within about 10 cm from the surface.
  • the microbial groups exist in nature and are contained in, for example, soil, tap water, lake water, spring water, well water, river water, seawater, etc., so these natural objects can be used as microbial sources.
  • a solid carrier that has been turned into soil an effluent that flows out of a solid carrier that has been turned into soil after adding water; a powder obtained by drying the effluent; etc. can also be used as microbial sources.
  • the "solid carrier that has been turned into soil” is not limited to a solid carrier that has been turned into soil by this embodiment, but may also be a solid carrier on which the microbial groups are immobilized by other methods.
  • the amount of microbial source added and/or mixed into the upper layer of the solid carrier is not particularly limited, but for example, in the case of natural soil or soil-treated solid carriers, it is desirable to add 1 to 100 g per 1 L of solid carrier.
  • other means for allowing the microorganisms to "coexist" in the solid carrier include, for example, attaching a microbial source containing the microorganisms to at least a portion of the surface of a seed of a plant body or a tissue capable of vegetative propagation of the plant body, and then sowing or planting the seed or tissue capable of vegetative propagation in the solid carrier.
  • tissue of a plant capable of vegetative propagation are not particularly limited, but include vegetative organs such as roots, stems (including bulbs and tubers), leaves, and branches of vegetatively propagated plants, and more specifically, include potatoes, bulbs, bulbils, strawberry runners, etc.
  • seeds As a method for attaching microbial communities to the surface of seeds or tissues capable of vegetative propagation (hereinafter sometimes referred to as “seeds, etc.”), a conventionally known method such as live coat technology can be used. This process allows microbial communities and plant bodies to "coexist” simultaneously in the solid carrier.
  • another method for allowing the microorganisms to "coexist" in the solid carrier is, for example, growing a plant body in soil containing the microorganisms, allowing the microorganisms to attach to the plant body, and then planting the plant body in the solid carrier (transplanting the plant body from the soil into the solid carrier).
  • the plant body when planting the plant body in the solid carrier, it is preferable to plant the plant body together with the soil in the solid carrier without removing the soil in contact with the roots of the plant body.
  • the plant body may be divided into several stocks and then planted, or if it is a vegetatively propagated plant, it may be divided into several tissues that can be propagated vegetatively and then planted (for example, by cuttings or buds).
  • the "soil” used to cultivate the plant body before planting is not limited to ordinary field soil, but may be any medium in which a group of microorganisms is immobilized. Specifically, a solid carrier that has been made into soil (not limited to a solid carrier that has been made into soil by this embodiment) may be used as the "soil".
  • the organic substance in order to "coexist" an organic substance in a solid carrier, for example, the organic substance may be added to the solid carrier. Specifically, if the organic substance is liquid, it may be added directly to the solid carrier. If the organic substance is solid, it may be suspended or dissolved in a solvent such as water and then added to the solid carrier, or water may be added after the solid organic substance has been added to the solid carrier.
  • a solvent such as water
  • the amount of organic matter added is not particularly limited, but is preferably 0.01 to 20 g, and more preferably 0.1 to 1 g (both calculated as dry weight) per 1 L of solid carrier. Specifically, when bonito broth is used as the organic matter, the amount added is preferably 0.1 to 20 g (liquid weight (0.07 to 14 g in dry weight conversion)) per 1 L of solid carrier, and when corn steep liquor is used, the amount added is preferably 0.1 to 20 g (liquid weight (0.05 to 10 g in dry weight conversion)) per 1 L of solid carrier.
  • the amount of organic matter added is greater than the amount mentioned above, it is not preferable because it may exceed the amount of organic matter supported on the solid carrier. Also, if the amount of organic matter added is less than the amount mentioned above, it is not preferable because the amount of nitrate nitrogen produced will be reduced.
  • the interval between additions of organic matter may be adjusted as appropriate depending on the type of plant, but is usually at least 6 hours, and preferably 1 to 7 days. Addition intervals shorter than the above are not preferred, as they may cause the microbial group to be unable to decompose the organic matter in time, and may exceed the capacity of the solid carrier to carry the organic matter.
  • water may be added to the solid carrier.
  • the solid carrier may be irrigated with water.
  • irrigation techniques such as sprinkling, spraying, dripping, etc. may be used.
  • the amount of water added there are no particular limitations on the amount of water added, so long as the solid carrier is not flooded, but it is desirable to adjust the amount appropriately depending on the type of plant body and solid carrier, for example, in the range of 10 to 200 mL/day per 1 L of solid carrier. Also, watering does not necessarily have to be done every day, and the intervals between watering can be adjusted appropriately depending on the type of plant body and solid carrier.
  • "coexisting" a plant body in a solid carrier means that the plant body is in a state in which it can grow in the solid carrier.
  • the means for this include sowing seeds of the plant body in the solid carrier, planting tissue capable of vegetative propagation of the plant body in the solid carrier, and planting the plant body after germination in the solid carrier.
  • germinated plant body refers to a plant body that has sprouted from a seed or tissue capable of vegetative propagation and is in the growing state.
  • “germinated plant body” may be a young plant body such as a plug seedling or a sapling, or it may be a fully grown plant body.
  • the plant body When planting a germinated plant body in a solid carrier, the plant body may be divided into multiple plants for planting, or, if it is a vegetatively propagated plant, the plant body may be divided into multiple tissues capable of vegetative propagation for planting (for example, cuttings, cuttings, seed potatoes).
  • the density of the plant bodies that are "coexisted" in the solid carrier is not particularly limited, but can be adjusted appropriately depending on the type of plant body, for example, in the range of 1 to 10 plants per 1 L of solid carrier.
  • the organic matter, the water, and the plant body are all allowed to coexist in the solid carrier as described above, the organic matter and the water are added to the solid carrier to grow the plant body.
  • Specific aspects of the growth (cultivation) of the plant body can be appropriately determined by a person skilled in the art based on common technical knowledge according to the type of plant body and the environment.
  • the microorganisms By adding organic matter and water to the solid carrier to which microorganisms have been added, the microorganisms are fixed to the solid carrier. This allows the microorganisms to efficiently break down the organic matter into nitrate nitrogen, promoting the growth of the plant and causing the plant's roots to extend to the lower layers of the solid carrier. As the plant's roots extend, the microbial community expands its habitat to the lower layers.
  • this embodiment can produce a solid carrier capable of producing nitrate by immobilizing a group of microorganisms that mineralize organic matter and produce nitrate nitrogen throughout the solid carrier.
  • Figures 1 and 2 are a flow diagram showing one embodiment of a method for producing a solid carrier.
  • Figures 3 and 4 are schematic diagrams showing one embodiment of a method for producing a solid carrier.
  • step S1 a practitioner of the method for producing a solid carrier adds and/or mixes a group of microorganisms into the upper layer of the solid carrier.
  • the group of microorganisms is added as a source of microorganisms such as soil.
  • the solid carrier can be used by filling a sufficiently hydrated solid carrier into an appropriate container.
  • step S3 the seeds of the plant are sown in the solid carrier to which the microbial source has been added, or the plant tissue capable of vegetative propagation (e.g., bulbs, etc.) is planted. After this step, it is also possible to carry out the step of adding and mixing the microbial group described above.
  • step S4 water and organic matter (fertilizer) are added to the solid carrier to grow the plant.
  • the water and organic matter may be added either mixed or separately.
  • the addition of organic matter also causes the microbial community to grow and become immobilized in the upper layer, allowing the organic matter to be efficiently decomposed into nitrate nitrogen.
  • the nitrate nitrogen produced is absorbed by the plant roots, so denitrification is unlikely to occur even if it is not washed with a large amount of water.
  • the roots extend, and the microbial community living in the upper layer of the solid carrier expands into the solid carrier as the rhizosphere develops.
  • a group of microorganisms is attached to at least a portion of the surface of a seed of a plant body or a tissue capable of vegetative propagation of the plant body (e.g., a bulb, etc.).
  • the group of microorganisms can be attached to the surface of the seed, etc. as the above-mentioned source of microorganisms (e.g., runoff from a solid carrier that has been converted into soil, etc.).
  • step S3 seeds with the microbial source attached thereto are sown in the solid carrier, or tissue of a plant body capable of vegetative propagation with the microbial source attached is planted in the solid carrier.
  • the solid carrier can be used by filling a suitable container with sufficient water.
  • water and organic matter are added to the solid carrier to grow the plant (step S4), and the fully grown plant is harvested (step S5).
  • a plant body is grown in soil containing a microorganism group.
  • the "soil" containing a microorganism group does not mean general soil, but may be any medium in which a microorganism group is immobilized, and a solid carrier that has been immobilized as soil may be used.
  • step S13 the germinated plant body (e.g., plug seedling, etc.) grown in step S11 is planted in a solid carrier.
  • the solid carrier can be used by filling a suitable container with a sufficiently hydrated solid carrier.
  • the plant body may also be divided into several plants and then planted.
  • water and organic matter are added to the solid carrier to grow the plant body (step S14), and the fully grown plant body is harvested (removal of the plant body) (step S15).
  • step S12 a group of microorganisms is added and/or mixed into the upper layer of the solid carrier.
  • the group of microorganisms can be added as a source of microorganisms such as soil as described above.
  • the solid carrier can be used by filling a sufficiently hydrated solid carrier in an appropriate container.
  • step S13 the germinated plant bodies (e.g., plug seedlings, etc.) grown separately in step S13 are planted in the solid carrier. After this step, it is also possible to carry out the step of adding and mixing the aforementioned microbial group.
  • the germinated plant bodies e.g., plug seedlings, etc.
  • water and organic matter are added to the solid carrier to grow the plant (step S14), and the fully grown plant is harvested (step S15).
  • a bag is filled with a solid carrier, and a small amount of a microbial source such as culture soil is inoculated onto the surface of the solid carrier (step S21).
  • a microbial source such as culture soil is inoculated onto the surface of the solid carrier.
  • plant seeds are sown in the solid carrier (step S22).
  • the plant is cultivated while adding water and organic matter (step S23).
  • the microorganisms break down the organic matter to generate nitrate nitrogen, which is then absorbed by the roots of the plant, so there is no need to wash away the nitrate nitrogen with a large amount of water.
  • step S24 the plant continues to grow by absorbing nitrate nitrogen, and the roots extend to the lower part of the solid carrier.
  • the proliferated microbial community expands its habitat to cover the entire solid carrier as the plant roots develop.
  • step S25 a bagged solid carrier capable of producing nitrate is completed.
  • step S31 a cell tray is filled with a microbial source such as culture soil (immobilization of microorganisms), and in step S32, plant seeds are sown there and raised to create cell seedlings.
  • step S33 the cell seedlings are planted in ridges made of a solid carrier, and the plants are cultivated while adding water and organic matter.
  • the cell seedlings themselves act as a microbial source, and the microorganisms grow in the solid carrier.
  • the microorganisms break down the organic matter to generate nitrate nitrogen, which is absorbed by the roots of the plants, so there is no need to wash away the nitrate nitrogen with a large amount of water.
  • step S34 the plant continues to grow by absorbing nitrate nitrogen, and the roots also spread widely within the ridges of the solid carrier.
  • the proliferated microbial group expands its immobilization range to the entire ridge as the plant's roots develop.
  • step S35 the fully grown plant is removed, and ridges of the solid carrier capable of producing nitrate are completed.
  • nitrate production ability can be evaluated by measuring the nitrate recovery rate (%) using the following method.
  • Nitric acid recovery rate measurement method (1) After adding 0.05 g or more of organic matter per 1 L of solid carrier in terms of nitrogen amount to the solid carrier, the solid carrier is left to stand at 24 to 26° C. for 1 hour or more, preferably 6 hours or more. During this standing period, the organic matter is decomposed by the microorganisms, and nitrate nitrogen is produced. (2) The solid carrier is washed by adding at least 50 mL of water per 1 L of the solid carrier and allowing it to flow out of the solid carrier. (3) The effluent that flows out from the solid carrier is collected, and the nitrate nitrogen (nitrate ion) content in the effluent is measured. (4) The ratio of the nitrate nitrogen content in the effluent measured in the step (3) to the amount of nitrogen in the organic matter added in the step (1) is calculated, and this is taken as the nitric acid recovery rate (%).
  • the nitrate recovery rate determined by the above method is usually 30% or more, preferably 33% or more, more preferably 35% or more, even more preferably 37% or more, and particularly preferably 40% or more, it can be evaluated that the solid carrier has been successfully converted into soil.
  • the nitrate recovery rate is 1% or more, preferably 1% or more but less than 30%, and more preferably 1% or more but less than 20%, soil conversion may be in progress and the bacterial flora may be unstable, or a denitrification reaction may have occurred and nitrate nitrogen may have been lost.
  • the bacterial flora may become unstable, and the measured nitrate recovery rate may temporarily exceed 30%. Therefore, it is desirable to measure the nitrate recovery rate by taking multiple samples from different areas of the solid carrier (preferably three or more locations from the middle layer or lower area of the solid carrier) and evaluating soil formation based on the average value of these samples. Alternatively, soil formation can be evaluated comprehensively by combining the multiple evaluation methods described above.
  • the solid carrier with nitrate production ability produced by this embodiment has microbial groups immobilized throughout, and can maintain a high level of nitrate production ability even when subjected to agitation treatment. Therefore, even if this solid carrier is divided and sealed in appropriate containers, there is little variation in quality, and it can be distributed on the market.
  • the solid carrier having the above-mentioned nitric acid generating ability can decompose organic matter into nitrate nitrogen in a short time even when the organic matter is directly added thereto, and therefore can be used as a plant cultivation medium applicable to all plant cultivation methods.
  • this embodiment relates to a method for cultivating a plant, which is characterized by producing a solid carrier capable of producing nitric acid by the above-mentioned method, and cultivating a plant using the obtained solid carrier.
  • the method for cultivating plants using the above-mentioned solid carrier capable of producing nitric acid can be carried out by sowing plant seeds, planting plant tissue capable of vegetative propagation (e.g., bulbs, etc.), or planting germinated plant bodies (e.g., plug seedlings, etc.) in the solid carrier, and adding water and organic fertilizer directly to the solid carrier.
  • sowing plant seeds planting plant tissue capable of vegetative propagation (e.g., bulbs, etc.), or planting germinated plant bodies (e.g., plug seedlings, etc.) in the solid carrier, and adding water and organic fertilizer directly to the solid carrier.
  • the organic matter described above can be used as the organic fertilizer.
  • Either liquid or powdered organic fertilizer can be used, but liquid organic fertilizer, particularly fish broth or corn steep liquor, or a water suspension of powdered organic fertilizer, is preferred.
  • the amount of organic fertilizer to be added is as described above for the manufacturing method of the solid carrier.
  • the cultivation method of this embodiment can be applied to all kinds of plants, including vegetables, fruits, flowers, trees, fruit trees, and ornamental plants.
  • the solid carrier having the above-mentioned nitric acid generating ability can be used as a carrier for a catalyst column for generating nitrate nitrogen (nitrate ion, nitrate salt) from organic matter, in addition to the above-mentioned plant cultivation method. That is, nitrate nitrogen can be obtained by filling a column with the solid carrier, adding an aqueous suspension of liquid organic matter or powdered organic matter to the column, and collecting the effluent that has passed through the solid carrier. The obtained liquid containing nitrate nitrogen can be used as an inorganic fertilizer.
  • the organic matter added to the column can be any of the above-mentioned organic matter.
  • a further embodiment relates to a soil composition for producing a solid carrier having nitric acid generating ability, characterized in that all of the above (B) to (E) are present in the solid carrier (A).
  • the "soil composition” refers to a composition containing as a main component a solid carrier in the process of being converted into soil, as described above, and means an intermediate produced in the process of converting the solid carrier into soil.
  • Each of the above elements (A) to (E) is as described above.
  • the solid carrier of the soil composition in this embodiment only needs to have a certain degree of nitric acid generating ability, and sufficient nitric acid generating ability can be obtained through the above-mentioned method for producing the solid carrier.
  • the nitric acid recovery rate (%) measured by the above-mentioned nitric acid recovery rate measurement method can be used as a criterion for evaluating nitric acid generating ability. In other words, when the nitric acid recovery rate measured for the solid carrier of the soil composition is 1% or more, preferably 1% or more and less than 30%, and more preferably 1% or more and less than 20%, it can be determined that "soil formation is in progress.”
  • soil formation can also be confirmed by checking the condition of the roots of the plant body in the solid carrier.
  • microorganisms especially nitrifying bacteria
  • nitrate nitrogen that can be used by the plant body is not produced, and the roots become exposed to organic matter and are damaged. Therefore, if the roots in the solid carrier are not sufficiently developed, it can be determined that "soil formation is in progress.”
  • the bacterial flora may become unstable, causing the measured value of the nitrate recovery rate to temporarily increase. Therefore, it is desirable to measure the nitrate recovery rate by taking multiple samples from different areas of the solid carrier (preferably three or more locations from the middle layer or lower area of the solid carrier) and evaluating the soil formation from the average value of these samples. Alternatively, the soil formation can be evaluated comprehensively by combining the multiple evaluation methods mentioned above.
  • the soil formation is in progress and the bacterial flora is unstable, but it is believed that at least the upper layer of the solid carrier has been formed into soil.
  • a solid carrier with excellent nitric acid production ability can be manufactured.
  • the soil composition may also be filled in an appropriate container.
  • the soil composition filled in a container is easy to transport and can be distributed on the market. Therefore, the soil composition can be suitably used for the above-mentioned plant cultivation medium, and is therefore industrially applicable.
  • Example 1 We conducted soil preparation tests using coriander (Apiaceae), sunflower (Asteraceae), and lettuce (Asteraceae).
  • nitrate nitrogen in the effluent that flowed out from the bottom of the pot was measured.
  • the amount of nitrate nitrogen was measured using a Reflectoquant (registered trademark) Nitrate Test (Merck) and RQ Flex (Merck) (same below).
  • the nitrate nitrogen recovery rate (%), calculated by dividing the measured amount of nitrate nitrogen by the amount of N in the bonito broth added in (6) above, is shown in Figure 5.
  • the nitrate nitrogen recovery rate was highest in sunflower, followed by coriander and lettuce ( Figure 5). Sunflower showed the highest nitrate nitrogen recovery rate of about 40%, indicating that a solid carrier with sufficient nitrate production ability could be produced.
  • lettuce grew well, but the nitrate nitrogen recovery rate was slightly low at less than 20%. However, the recovery rate may be improved by increasing the amount of organic matter added.
  • Example 2 A soil preparation test was conducted using Komatsuna (Brassicaceae).
  • the komatsuna were cultivated for 4 weeks by irrigating each basket daily with a suspension of 2 g (liquid mass, equivalent to 120 mg N) of bonito broth in 1 L of water. (5) After the cultivation was completed, the growth status of the komatsuna and the root development of the komatsuna in the solid support were observed.
  • FIG. 6 is a photographic image showing the growth of the Komatsuna at the end of cultivation.
  • Figure 6A shows the control
  • Figure 6B shows the test plot.
  • the culture soil which is a source of microorganisms
  • Figure 6A the culture soil, which is a source of microorganisms
  • Figure 6B the test plot.
  • the culture soil which is a source of microorganisms
  • Example 3 A soil preparation test was conducted using sunny lettuce (Asteraceae).
  • nitrate nitrogen recovery rate % (the same applies to the following examples).
  • Figure 7A is a photographic image showing the appearance of the plant before harvest.
  • Figure 7B is a graph showing the aboveground yield (g)
  • Figure 7C is a graph showing the nitrate nitrogen recovery rate (%), with the values showing the average value ⁇ standard error.
  • the sunny lettuce grew well ( Figures 7A and 7B).
  • the nitrate nitrogen recovery rate was very high, at over 40% ( Figure 7C).
  • Example 4 The timing of starting the addition of organic matter was changed from that in Example 3, and a soil preparation test was conducted.
  • Figure 8A is a photograph showing the appearance of the plant before harvest.
  • Figure 8B is a graph showing the aboveground yield (g)
  • Figure 8C is a graph showing the nitrate nitrogen recovery rate (%), with the values showing the mean value ⁇ standard error.
  • the sunny lettuce grew well ( Figures 8A and 8B).
  • the nitrate nitrogen recovery rate was 30% or more (Figure 8C).
  • Example 3 organic matter was added before sowing, but this time, organic matter was not added before sowing, and was added after the true leaves had developed. Nevertheless, the nitrate nitrogen recovery rate was at a sufficient level (Figure 8C), demonstrating that this embodiment can also produce a solid carrier with sufficient nitrate production capacity.
  • Example 5 We examined the presence or absence of plant bodies and the effects of disturbance after soil formation.
  • nitrate nitrogen recovery rate was measured by the following method. 0.3 g of the bonito broth was suspended in 10 mL of water, and the resulting liquid was added to each pot again and allowed to stand at 25° C. for one day. After that, 900 mL of water was added to each pot with the bottom hole open, and the amount of nitrate nitrogen in the effluent (effluent A) that flowed out from the bottom of the pot was measured.
  • Figure 9A is a photograph showing the appearance of the sunny lettuce plot before harvest
  • Figure 9B is a photograph showing the appearance of the plot without plants (control)
  • Figure 9C is a graph showing the nitrate nitrogen recovery rate (%) before and after disturbance treatment, with "A" showing before disturbance and "B” showing after disturbance, and the values showing the average value ⁇ standard error. Plants in the sunny lettuce plot grew well (Figure 9A). In the sunny lettuce plot, the nitrate production ability was about 40% of that before disturbance even after disturbance. On the other hand, in the plot without plants (control), the nitrate production ability decreased to about 16% after disturbance (Figure 9C).
  • Example 6 A soil preparation test was carried out in an embodiment in which the plant bodies after germination were planted.
  • Test method (1) A cell tray with a cell size of 3 x 3 x 6 cm was filled with culture soil (product name "Tsuchitarou”, Sumirin Agricultural Industrial Co., Ltd.), which is a source of microorganisms, and was sufficiently moistened. One lettuce seed was sown in each cell, and the seedlings were grown with only water for two weeks until the primary leaves developed. (2) A 15 L planter was filled with rice husk charcoal as a solid carrier, and 10 plug seedlings from (1) above were planted per planter. Thereafter, a liquid obtained by suspending 1 g of bonito broth (liquid mass, equivalent to 60 mg N) in 10 mL of water as an organic matter was added to the base of the plant every weekday to cultivate the plant.
  • culture soil product name "Tsuchitarou”, Sumirin Agricultural Industrial Co., Ltd.
  • Example 7 The nitrate production potential of the upper and lower layers of the solid carrier after soil transformation was confirmed.
  • Test method (1) A cell tray with a cell size of 3 x 3 x 6 cm was filled with culture soil (product name "Tsuchitarou”, Sumirin Agricultural Industrial Co., Ltd.), which is a source of microorganisms, and was sufficiently moistened. One sunny lettuce seed was sown in each cell, and the seedlings were grown with only water for two weeks until the primary leaves developed. (2) A mesh basket was filled with 2 L of fully hydrated rice husk charcoal as a solid carrier, and a tray was placed underneath. Two plug seedlings from (1) above were planted in the mesh basket.
  • the plants were cultivated by irrigating daily with a liquid obtained by suspending 0.1 g (liquid mass, equivalent to 6 mg N, hereinafter the same) of bonito broth as an organic matter in 100 mL of water.
  • the control was treated in the same manner, except that lettuce seedlings grown in a cell tray filled with vermiculite instead of culture soil were planted.
  • Plants that had grown to a sufficient size were harvested.
  • the remaining rice husk charcoal was separated into an upper layer and a lower layer, and each was packed into a column ( Figure 10B, made by cutting off the top of a 2L plastic bottle).
  • Figure 10 The results are shown in Figure 10 and Table 1.
  • Figure 10A is a photograph showing the appearance of the plants before harvest
  • Figure 10B is a photograph showing the appearance of the measurement column.
  • the sunny lettuce grew well in the test plot ( Figure 10A), whereas the control plot, in which seedlings grown in vermiculite cell trays were planted, did not grow healthily.
  • “Low” indicates that the level is below the detection limit.
  • the production of nitrate nitrogen was confirmed in both the upper and lower layers of the columns. Furthermore, in the test plot, no significant differences were observed in the concentrations of each ion in the upper, lower, or combined upper and lower layers of the columns. On the other hand, in the control, the production of nitrate nitrogen was not detected, and only ammonia nitrogen was detected in high concentrations.
  • Example 8 The expansion of nitrifying bacteria (ammonia oxidizing bacteria, nitrite oxidizing bacteria) into the solid support accompanying the expansion of the rhizosphere of the legume hairy vetch was evaluated by comparing with a control area where no plants were planted.
  • nitrifying bacteria ammonia oxidizing bacteria, nitrite oxidizing bacteria
  • the filled rice husk charcoal from the hairy vetch and control areas was frozen at -20°C.
  • the frozen rice husk charcoal was cut into eight layers, L1 to L8, as shown in Figure 12, and 500 mg of rice husk charcoal taken from each layer was crushed in a microtube.
  • 50 mg of the crushed rice husk charcoal was taken, and DNA was extracted (approximately 100 ng/ ⁇ L) using Nucleospin Soil (Takara Bio Inc.).
  • Ct values were calculated using the 2nd derivative maximum method.
  • the proportion of each nitrifying bacteria was calculated by comparing the Ct values.
  • the abundance ratio of ammonia oxidizing bacteria to the total bacterial mass (2 ⁇ Ct ) was calculated using the following (Equation 1).
  • Figure 13 is a graph showing the relative amount of ammonia oxidizing bacteria (Figure 13A) and the relative amount of nitrite oxidizing bacteria (Figure 13B) to the total bacterial mass of L1, determined by real-time PCR.
  • the Y axis shows the relative value (%) on a logarithmic scale, and the X axis shows each layer from L1 to L8.
  • nitrite oxidizing bacteria were only present in L1, where the nitrifying bacteria had been established, and in L2 directly below, and to a certain extent in L3, but in the hairy vetch plot, nitrite oxidizing bacteria had expanded and been established up to L4, where sufficient root expansion was confirmed, compared to the control plot.
  • Comparative Example A mesh basket was filled with 3 L of fully hydrated rice husk charcoal, and 20 Komatsuna seeds were sown in it.
  • the plants were cultivated by irrigating daily with a liquid prepared by suspending 1 g of bonito broth in 1 L of water for 18 days.
  • the plants were kept in a growth chamber at 25°C with a 12-hour light period and 12-hour dark period.
  • the inorganic nitrogen contained in the rice husk charcoal was analyzed. The analysis was performed using ammonia test, nitrite test, and nitrate test (all from Merck) from Reflectoquant (registered trademark) and measurement with RQ Flex (Merck).
  • the unit is mg/L.
  • a method for producing a solid carrier capable of generating nitric acid using charcoalized rice husks as the solid carrier has been described, but the present disclosure is not limited to this, and any solid carrier having breathability, such as biochar, ceramics, rock wool, vermiculite, perlite, zeolite, sand, Kanuma soil, glass, urethane, nylon, melamine resin, wood chips, straw, sphagnum moss, cotton, paper, polyacrylamide gel, agar, pumice, soil material, sintered soil material, field soil, etc., can also be used.
  • any solid carrier having breathability such as biochar, ceramics, rock wool, vermiculite, perlite, zeolite, sand, Kanuma soil, glass, urethane, nylon, melamine resin, wood chips, straw, sphagnum moss, cotton, paper, polyacrylamide gel, agar, pumice, soil material, sintered soil material, field soil, etc.
  • a method for producing a solid carrier capable of generating nitric acid using bonito broth as an organic matter has been described, but this is not limited to this, and any organic matter, such as fish broth, fish meal, oil cake, food waste, corn soaking liquid, rice bran, soybean flour, plant residues, animal residues, milk, milk powder, livestock manure, human feces and urine, insect feces, insect powder, algae powder, fungus bodies, methane fermentation digestate, sewage sludge, etc., can also be used in the present disclosure.
  • This disclosure is expected to be used by seedling farmers and seed potato farmers who want to minimize the occurrence of disease, as it turns non-soil media with no cultivation history into soil.
  • This disclosure can also be applied to the technology of cultivating plants in regolith (crushed minerals) on the Moon, Mars, etc., and is expected to be used industrially.

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Abstract

固体担体の表層部分だけでなく、固体担体全体に微生物群を固定化できる土壌化技術を提供する。また、土壌化の過程で生成された硝酸態窒素を固体担体から洗い流す工程を必要としない土壌化技術を提供する。　下記（Ａ）の固体担体中に、下記（Ｂ）～（Ｅ）の全てを共存させる工程を含み、下記（Ｂ）の微生物群が固定された固体担体を製造することを特徴とする、硝酸生成能を有する固体担体の製造方法が提供される。前記固体担体はあらゆる植物栽培方法に培地として活用できる。また、前記固体担体を製造するための土壌組成物が提供される。　（Ａ）通気性を有する固体担体。　（Ｂ）有機物を無機化して硝酸態窒素を生成する微生物群。　（Ｃ）有機物。　（Ｄ）水。　（Ｅ）硝酸態窒素を吸収する植物体。

Description

硝酸生成能を有する固体担体の製造方法、当該固体担体を用いた植物栽培方法、並びに土壌組成物
　本開示は、非土壌媒体の土壌化技術に関し、具体的には、硝酸生成能を有する固体担体の製造方法、当該固体担体を用いた植物栽培方法、並びに土壌組成物に関する。
　自然の土壌では、有機物を分解して硝酸態窒素を生成する微生物群の働きにより、堆肥などの有機物を直接添加すると、有機態窒素をアンモニア態窒素に変換するアンモニア化成、アンモニア態窒素を硝酸態窒素に変換する硝酸化成（硝化）、という二段階のプロセスによって、多くの植物が利用可能な硝酸態窒素に分解される。
　一方、土壌化されていない固体担体では、特に硝酸化成を担う硝化菌が十分に固定化されていないため、高濃度の有機物を添加すると硝化菌が死滅したり、植物の根がダメージを受けたりする。
　ロックウールなどの固体担体に、有機物を分解して硝酸態窒素を生成する微生物群を固定化し、固体担体が自然土壌と同じように有機物を分解して硝酸態窒素を生成できるようにする土壌化技術は、本願発明者のうちの一人が開発した（例えば、特許文献１及び非特許文献１参照）。
　特許文献１及び非特許文献１の技術は、固体担体に微生物群を添加した後、脱窒反応を防ぐために有機物の添加と水での洗浄を繰り返すことにより、固体担体に微生物を固定化させることを特徴としている（図１１参照）。
　脱窒反応とは、脱窒菌により硝酸態窒素が亜酸化窒素ガス又は窒素ガスなどに還元され、硝酸態窒素が失われてしまう現象で、嫌気条件下で脱窒菌のエネルギー源になる有機物と硝酸態窒素とが共存する場合に誘発されやすい反応である。また近年、アナモックス細菌による窒素変換反応による脱窒反応も発見された。これは、嫌気性条件下で、アンモニア態窒素と亜硝酸態窒素が、窒素ガスなどに変換されて失われる現象である。
特許第5686352号公報
Jamjan Meeboon, Ryoya Nishida, Takashi Iwai, Kazuki Fujiwara, Masao Takano & Makoto Shinohara, Development of soil-less substrates capable of degrading organic nitrogen into nitrate as in natural soils, Scientific Reports (2022) 12:785
　特許文献１及び非特許文献１の技術では、微生物群の固定化が固体担体の表層部分（上層部）に限られるため、深層部分（下層部）まで土壌化できる技術の開発が望まれていた。本開示の課題は、より適切な硝酸生成能が得られる土壌化技術を提供することである。
　すなわち、本開示によれば、下記（Ａ）の固体担体中に、下記（Ｂ）～（Ｅ）の全てを共存させる工程を含み、下記（Ｂ）の微生物群が固定された固体担体を製造することを特徴とする、硝酸生成能を有する固体担体の製造方法が提供される。
　（Ａ）通気性を有する固体担体。
　（Ｂ）有機物を無機化して硝酸態窒素を生成する微生物群。
　（Ｃ）有機物。
　（Ｄ）水。
　（Ｅ）硝酸態窒素を吸収する植物体。
　本開示の固体担体の製造方法において、前記（Ｅ）の植物体の種子又は前記（Ｅ）の植物体の栄養繁殖可能な組織を、前記（Ａ）の固体担体中に播種又は定植することにより、前記（Ａ）の固体担体中に前記（Ｅ）の植物体を共存させることができる。より具体的には、前記方法は、前記（Ｂ）の微生物群を前記（Ａ）の固体担体の上層部に添加及び／又は混合する工程を実施した後に、前記（Ｅ）の植物体の種子又は前記（Ｅ）の植物体の栄養繁殖可能な組織を前記（Ａ）の固体担体中に播種又は定植する工程を実施するものであってもよい。また、前記方法は、前記（Ｂ）の微生物群を前記（Ｅ）の植物体の種子又は前記（Ｅ）の植物体の栄養繁殖可能な組織の表面の少なくとも一部に付着させる工程を実施した後に、前記（Ｅ）の植物体の種子又は前記（Ｅ）の植物体の栄養繁殖可能な組織を前記（Ａ）の固体担体中に播種又は定植する工程を実施するものであってもよい。
　または、本開示の固体担体の製造方法において、発芽後の前記（Ｅ）の植物体を前記（Ａ）の固体担体中に定植することにより、下記（Ａ）の固体担体中に前記（Ｅ）の植物体を共存させることができる。より具体的には、前記方法は、前記（Ｂ）の微生物群を含む土壌中で前記（Ｅ）の植物体を生育させる工程と、当該工程により得られた発芽後の前記（Ｅ）の植物体を前記（Ａ）の固体担体中に定植する工程と、を含むものであってもよい。また、前記方法は、前記（Ｂ）の微生物群を前記（Ａ）の固体担体の上層部に添加及び／又は混合する工程を実施した後に、発芽後の前記（Ｅ）の植物体を前記（Ａ）の固体担体中に定植する工程を実施するものであってもよい。
　このとき、前記（Ａ）の固体担体は、バイオ炭、セラミックス、ロックウール、バーミキュライト、パーライト、ゼオライト、砂、鹿沼土、ガラス、ウレタン、ナイロン、メラミン樹脂、木質チップ、わら、水苔、木綿、紙、ポリアクリルアミドゲル、寒天、軽石、土質材料、土質材料焼結体、及び畑土からなる群のうち１種以上とすることができる。
　また、前記（Ｃ）の有機物は、植物由来、動物由来、菌由来、食品由来、及び廃棄物由来の有機物からなる群のうち１種以上とすることができる。
　また、前記（Ｅ）の植物体は、キク科、アブラナ科、ナス科、ヒユ科、ヒガンバナ科、バラ科、マメ科、ウリ科、イネ科、ショウガ科、ユリ科、セリ科、アカザ科及びヒルガオ科のうち１種以上の植物体とすることができる。
　また、前記（Ａ）の固体担体は、容器に充填した状態で用いることができる。
　また、本開示の栽培方法は、前記方法により硝酸生成能を有する固体担体を製造し、得られた前記固体担体を用いて植物を栽培することを特徴とする、植物の栽培方法である。
　さらに、本開示の土壌組成物は、前記（Ａ）の固体担体中に、前記（Ｂ）～（Ｅ）の全てを共存させてなることを特徴とする、硝酸生成能を有する固体担体を製造するための土壌組成物である。
　本明細書において「土壌組成物」とは、土壌化が進行途中である前記（Ａ）の固体担体を主要成分とする組成物であって、当該固体担体を土壌化する過程で生じる中間体を意味する。
　前記土壌組成物において、前記（Ａ）の固体担体は、以下の方法により測定される硝酸回収率が１％以上のものであってもよい。
　硝酸回収率測定方法：
（１）前記固体担体に対し、前記（Ｃ）の有機物を窒素量として、前記固体担体１Ｌあたり０．０５ｇ以上添加した後、２４～２６℃で１時間以上静置する。
（２）前記固体担体１Ｌあたり５０ｍＬ以上の水を添加して、前記固体担体から流出させることにより、前記固体担体を洗浄する。
（３）前記固体担体より流出した流出液を回収し、前記流出液中の硝酸態窒素含有量を測定する。
（４）前記工程（１）で添加した前記有機物中の窒素量に対する、前記工程（３）で測定した前記流出液中の硝酸態窒素含有量の比率を求め、硝酸回収率とする。
　前記土壌組成物において、前記（Ａ）の固体担体、前記（Ｃ）の有機物、前記（Ｅ）の植物体は、それぞれ前記したものであってもよい。
　前記土壌組成物において、前記（Ａ）の固体担体は、容器に充填した状態であってもよい。
　本開示によれば、固体担体の表層部分だけでなく、固体担体全体に微生物群を固定化できる。また、本開示によれば、土壌化の過程で生成された硝酸態窒素を固体担体から洗い流す工程を必要とせず、硝酸態窒素が系外に流出する問題がない。したがって、本開示によれば、より適切な硝酸生成能が得られる土壌化技術を提供することができる。
固体担体の製造方法の一実施形態を示すフロー図である。 固体担体の製造方法の一実施形態を示すフロー図である。 固体担体の製造方法の一実施形態を示す概略図である。 固体担体の製造方法の一実施形態を示す概略図である。 実施例１における硝酸態窒素回収率（％）を示すグラフである。 実施例２におけるコントロール区の植物の生育状況を示す写真像図である。 実施例２における試験区の植物の生育状況を示す写真像図である。 実施例３における収穫前の植物の外観を示す写真像図である。 実施例３における地上部収量（ｇ）の測定値を示すグラフである。値は平均値±標準誤差を示す。 実施例３における硝酸態窒素回収率（％）の測定値を示すグラフである。値は平均値±標準誤差を示す。 実施例４における収穫前の植物の外観を示す写真像図である。 実施例４における地上部収量（ｇ）の測定値を示すグラフである。値は平均値±標準誤差を示す。 実施例４における硝酸態窒素回収率（％）の測定値を示すグラフである。値は平均値±標準誤差を示す。 実施例５におけるサニーレタス区の収穫前の外観を示す写真像図である。 実施例５における植物なし区（コントロール）の外観を示す写真像図である。 実施例５における撹乱処理前後の硝酸態窒素回収率（％）の測定値を示すグラフである。「Ａ」は撹乱前、「Ｂ」は撹乱後、をそれぞれ示し、値は平均値±標準誤差を示す。 実施例７における収穫前の植物の外観を示す写真像図である。 実施例７における測定用のカラムの外観を示す写真像図である。 従来技術における土壌化技術を示す概略図である。 実施例８におけるヘアリーベッチ区の構成を示す概略図である。パイプに充填された固体担体は上から順に、Ｌ１～Ｌ８の８層に区分されている。 実施例８におけるコントロール区の構成を示す概略図である。パイプに充填された固体担体は上から順に、Ｌ１～Ｌ８の８層に区分されている。 実施例８におけるＬ１全菌体量を基準としたＬ１～Ｌ８の各層のアンモニア酸化菌群（amoA）の相対値（％）を示すグラフである。黒の棒グラフはコントロール区、白の棒グラフはヘアリーベッチ区、値は平均値±標準誤差、をそれぞれ示す。 実施例８におけるＬ１全菌体量を基準としたＬ１～Ｌ８の各層の亜硝酸酸化菌群（norB）の相対値（％）を示すグラフである。黒の棒グラフはコントロール区、白の棒グラフはヘアリーベッチ区、値は平均値±標準誤差、をそれぞれ示す。 比較例における植物の生育状況を示す写真像図である。
〔硝酸生成能を有する固体担体の製造方法〕
　第一の実施形態は、硝酸生成能を有する固体担体の製造方法に関する。
　本実施形態において、硝酸生成能を有する固体担体の製造方法は、下記（Ａ）の固体担体中に、下記（Ｂ）～（Ｅ）の全てを共存させる工程を含み、下記（Ｂ）の微生物群が固定された固体担体を製造することを特徴とする。
　（Ａ）通気性を有する固体担体。
　（Ｂ）有機物を無機化して硝酸態窒素を生成する微生物群。
　（Ｃ）有機物。
　（Ｄ）水。
　（Ｅ）硝酸態窒素を吸収する植物体。
　本実施形態において、「通気性を有する固体担体」としては、微生物、有機成分、水分を担持することが可能であり、通気性を有する、多孔質のものであれば、如何なるものでも用いることができる。特には、体積に対して微生物が固定化（定着）する表面積が大きい素材のものが好ましい。
　ここで、「通気性を有する」とは、固体担体を容器に充填した際や積み上げて山にした際の固体担体間及び／又は固体担体内の空隙の環境が、好気条件が保たれることで硝酸化成が進行しやすく、且つ、脱窒反応がおこりにくいような気相の確保された状態である。
　なお、以下、当該固体担体間と固体担体内の全体の環境を、単に「固体担体中」あるいは「固体担体全体」と表現することがある。
　そのような固体担体として具体的には、ロックウール、バーミキュライト、パーライト、ゼオライト、砂、鹿沼土、ガラス（具体的にはグラスビーズ）、セラミック、軽石、土質材料、土質材料焼結体、畑土などの岩石鉱物系の資材や、ウレタン、ナイロン、メラミン樹脂、ポリアクリルアミドゲル、などの合成樹脂系の資材、木質チップ（具体的にはスギチップ）、わら、水苔、炭（具体的にはバイオ炭、活性炭）、木綿、紙（具体的にはろ紙）、寒天などの生物由来の資材などを用いることができる。
本実施形態においては、これらの素材のうち、バイオ炭、セラミックス、ロックウール、バーミキュライト、パーライト、ゼオライト、砂、鹿沼土、ガラス、ウレタン、ナイロン、メラミン樹脂、木質チップ、わら、水苔、木綿、紙、ポリアクリルアミドゲル、寒天、軽石、土質材料、土質材料焼結体、及び畑土からなる群のうち１種以上を用いることが望ましく、特にバイオ炭が望ましい。
　なお、ここで、「バイオ炭」とは、生物資源（例えば、穀皮などの農業廃棄物、間伐材、竹など）を低酸素条件下で加熱することによって得られるものであり、バイオ燃料の副産物として製造される。具体例としては、もみ殻燻炭、木炭、竹炭などが挙げられる。
　本実施形態において、前記固体担体は、容器に充填した状態で用いることができる。前記固体担体を充填する容器としては、前記固体担体を充填できる容器であれば如何なる容器でも用いることができる。具体的には、農業用のポット、プランター等；プラスチック、布、紙などでできた袋等；容器の全体が網目状になっている籠等；を挙げることができる。なお、これらの容器は、底部に開口部を備えており、固体担体に水を添加した後、水を流出させることができる構造を有するものが好適である。
　前記容器への前記固体担体の充填は、水を添加して流出させた後に、毛細管現象で全体が湛水状態になってしまわないよう、固体担体間及び／又は固体担体内の空隙（気相）が確保されるようにする。湛水状態となり固体担体中が嫌気条件となって脱窒菌が活動しやすい条件が揃った場合に、脱窒反応が起こりやすくなるためである。そのため、前記容器に前記固体担体を充填する場合、通常は０．１～１０００００ｍｌ、好ましくは１～１００００ｍｌの前記固体担体を充填することができる。また、充填高さとしては、０．１～１００ｃｍの層になるように前記固体担体を充填することができる。
　本実施形態において、「有機物を無機化して硝酸態窒素を生成する微生物群（本明細書において、単に「微生物群」と呼ぶこともある。）」とは、アンモニア化成を行う微生物群と、硝酸化成を行う微生物群と、を含むものである。これらが共存することによって、有機物からアンモニア態窒素への分解（アンモニア化成）と、アンモニア態窒素から硝酸態窒素への硝化（硝酸化成）と、を同一の反応系で連続的に行うことが可能となる。
　アンモニア化成を行う微生物群としては、例えば原生動物や、細菌、糸状菌等のアンモニア化成菌などを挙げることができる。また、硝酸化成を行う微生物群（硝化菌）としては、アンモニア酸化菌（もしくは亜硝酸生成菌）であるNitrosomonas属、Nitorosococcus属、Nitrosospira属（Nitrosolobus属、Nitrosovibrio属を含む）；亜硝酸酸化菌（もしくは硝酸生成菌）であるNitrobacter属、Nitrospira属、Nitrococcus属；などを挙げることができる。
　本実施形態において「有機物」は、有機質肥料や、食品残渣、植物体残渣、動物体残渣、畜産廃棄物、***物といった有機質資源など、如何なるものを用いることができるが、炭素と窒素の含有比であるＣ／Ｎ比が２４以下、好ましくは１９以下の高窒素含有有機物を用いることが、硝酸態窒素の回収効率を高める点で望ましい。
　前記有機物としては、タンパク質、タンパク質分解物、アミノ酸などを多く含むものが望ましい。具体的には、植物由来、動物由来、菌由来、食品由来、廃棄物由来の有機物のうち１種以上を挙げることができる。より具体的には、魚煮汁、トウモロコシ浸漬液、油粕、魚粉、大豆粕、酵母粕、酒粕、焼酎粕、米ぬか、生ゴミなどの食品残渣などを挙げることができる。なお、これらは、食品製造過程で得られる廃棄物であり、毒性のあるような成分が含まれていない点で望ましい。また、前記有機物は、家畜糞、人糞尿、昆虫糞などの***物や、昆虫粉末、藻類粉末、菌体、メタン発酵消化液、下水汚泥などを挙げることができ、アンモニア態窒素を含む有機物も利用できる。さらには、前記有機物は、大豆粉、だしの素（アミノ酸高含有物）、牛乳、粉ミルク、などの食品そのものも利用できる。加えてさらには、可食部として利用できない植物の組織や器官である植物体残渣も利用することができる。
　これらのうち、魚煮汁、魚粉、油粕、生ゴミ、トウモロコシ浸漬液、米ぬか、大豆粉、植物体残渣、動物体残渣、牛乳、粉ミルク、家畜糞、人糞尿、昆虫糞、昆虫粉末、藻類粉末、菌体、メタン発酵消化液、及び下水汚泥からなる群のうち１種以上は、有機物として用いられることがさらに望ましい。
　なお、具体的に、魚煮汁としては、鰹煮汁を挙げることができる。また、トウモロコシ浸漬液としては、コーンスティープリカー（ＣＳＬ：トウモロコシでんぷん製造時の副産物であるトウモロコシ浸漬液）を挙げることができる。また、油粕としては、菜種油粕、コーン油粕、を挙げることができる。また、植物体残渣としては、トマトなどの栽培管理中に摘葉処理で発生した茎葉などを挙げることができる。また、生ゴミとしては、魚のアラ、調理後の野菜くず、肉切片などを挙げることができる。また、家畜糞としては、牛糞や鶏糞などを挙げることができる。なお、さらに特には、鰹煮汁、コーンスティープリカーは、液体であるため前記固体担体に浸透しやすい点で望ましい。
　本実施形態において「水」は、特に限定されないが、例えば、純水（蒸留水、イオン交換水、逆浸透膜水など）、井戸水、河川水、湖水、水道水、海水などを挙げることができる。
　前記した従来技術では、固体担体中に含まれる硝酸態窒素を除去して脱窒反応を抑制するために、固体担体に大量の水を添加して洗浄する必要があった。本実施形態では、植物体に余分な硝酸態窒素を吸収させるため、洗浄工程は不要であるが、水は植物体や微生物群の維持に不可欠であるため、前記固体担体中に適量の水を共存させることが必要である。
　本実施形態において、「硝酸態窒素を吸収する植物体」としては、野菜、果実、花卉、樹木、果樹、観葉植物、牧草、苔など、あらゆる植物を用いることができる。具体的には、キク科、アブラナ科、ナス科、ヒユ科、ヒガンバナ科、バラ科、マメ科、ウリ科、イネ科、ショウガ科、ユリ科、セリ科、アカザ科、ヒルガオ科などに属する植物体を挙げることができる。
　本実施形態は、前記した固体担体中に、前記微生物群、前記有機物、前記水、及び前記植物体の全てを共存させる工程を必須工程とする。なお、本実施形態において、前記した効果が奏される限りにおいて、前記した構成要素以外のいかなる要素（例えば、前記した微生物以外の微生物、前記した固体担体以外の媒体、前記した有機物以外の有機物、無機肥料その他の農業用資材など）を固体担体中に共存させることも可能である。
　本実施形態において、微生物群を固体担体中に「共存」させる手段としては、例えば、微生物群を含む微生物源を、固体担体の上層部に添加及び／又は混合することが挙げられる。ここで、固体担体の「上層部」とは、固体担体の表層部分を指し、例えば容器に充填された固体担体の場合、高さ方向において上から約１０％以内を上層部とすることができる。あるいは、容器に充填せず野積みされた固体担体の場合は、表層から約１０ｃｍ以内を上層部とすることができる。
　前記微生物群は、自然界に存在するものであり、例えば、土壌、水道水、湖沼の水、湧き水、井戸水、川の水、海水などに含まれていることから、これらの自然物を微生物源として用いることができる。また、土壌化された固体担体；土壌化された固体担体に水を添加し、当該固体担体から流出した流出液；前記流出液を乾燥させた粉末；などを微生物源として用いることもできる。なお、ここで、「土壌化された固体担体」は、本実施形態によって土壌化された固体担体に限らず、他の手法によって前記微生物群が固定化された固体担体であってもよい。
　微生物源を固体担体の上層部に添加及び／又は混合する量としては、特に限定されないが、例えば、固体担体１Ｌに対して、自然土壌や土壌化された固体担体の場合では１～１００ｇを添加することが望ましい。
　本実施形態において微生物群を固体担体中に「共存」させる他の手段としては、例えば、微生物群を含む微生物源を、植物体の種子又は植物体の栄養繁殖可能な組織の表面の少なくとも一部に付着させた後に、その種子又は栄養繁殖可能な組織を固体担体中に播種又は定植することが挙げられる。
　ここで、「植物体の栄養繁殖可能な組織」としては、特に限定されないが、栄養繁殖性植物の根、茎（鱗茎、塊茎を含む）、葉、枝などの栄養器官等が挙げられ、具体的には、イモ、球根、むかご、イチゴのランナー等が挙げられる。
　種子又は栄養繁殖可能な組織（以下、「種子等」と呼ぶことがある。）の表面に微生物群を付着させる方法としては、例えばライブコート技術など従来公知の方法を用いることができる。この工程により、微生物群と植物体とを同時に固体担体中に「共存」させることができる。
　本実施形態において微生物群を固体担体中に「共存」させる他の手段としては、例えば、微生物群を含む土壌中で植物体を生育させることで、植物体に前記微生物群を付着させた後に、その植物体を固体担体中に定植する（土壌中から固体担体中に移植する）ことが挙げられる。
　ここで、植物体を固体担体中に定植する際は、植物体の根と接する土壌を除去せずに、土壌ごと固体担体中に定植することが望ましい。その際、植物体は複数の株に分けて定植してもよいし、栄養繁殖性植物であれば、栄養繁殖可能な複数の組織に分割して定植してもよい（例えば、挿し木、挿し芽）。
　なお、定植前の植物体の栽培に用いる「土壌」は、一般的な畑土などの土壌に限られず、微生物群が固定化された媒体であれば如何なるものであってもよい。具体的には、土壌化された固体担体（本実施形態によって土壌化された固体担体に限られない）が「土壌」として用いられてもよい。
　本実施形態において、有機物を固体担体中に「共存」させるためには、例えば、有機物を固体担体に添加すればよい。具体的には、有機物が液体であれば、そのまま固体担体に添加することができる。有機物が固体であれば、水などの溶媒に懸濁又は溶解してから固体担体に添加するか、固体担体に固体の有機物を添加した後に、水を添加することができる。
　ここで、有機物の添加量は特に限定されないが、固体担体１Ｌに対して、好ましくは０．０１～２０ｇ、より好ましくは０．１～１ｇ（いずれも乾燥重量換算）とすることができる。なお、具体的には、有機物として鰹煮汁を用いた場合の添加量は、固体担体１Ｌに対して、好ましくは０．１～２０ｇ（液体重量（乾燥重量換算で０．０７～１４ｇ））であり、コーンスティープリカーを用いた場合の添加量は、固体担体１Ｌに対して、好ましくは０．１～２０ｇ（液体重量（乾燥重量換算で０．０５～１０ｇ））である。
　なお、有機物の添加量が、上記添加量よりも多い場合、固体担体における有機物の担持量を超える場合があるため好ましくない。また、有機物の添加量が、上記添加量よりも少ない場合、硝酸態窒素の生成量が少なくなるため好ましくない。
　有機物の添加間隔としては、植物体の種類に応じて適宜調整すればよいが、通常、６時間以上とすることができ、好ましくは１～７日間とすることができる。添加間隔が上記よりも短い場合、微生物群による有機物の分解が間に合わず、固体担体における有機物の担持量を超える場合があるため好ましくない。
　本実施形態において、水を固体担体中に「共存」させるためには、水を固体担体に添加すればよい。例えば、固体担体に潅水することができ、具体的な手段は特に限定されないが、散水、噴霧、滴下など従来公知の潅水技術を採用することができる。
　水の添加量としては、固体担体が湛水状態とならない限り、特に制限はないが、例えば、固体担体１Ｌ当たり１０～２００ｍＬ／日の範囲で、植物体や固体担体の種類に応じて適宜調整することが望ましい。また、潅水は、必ずしも毎日行う必要はなく、やはり植物体や固体担体の種類に応じて潅水の間隔を適宜調整すればよい。
　本実施形態において、植物体を固体担体中に「共存」させるとは、固体担体中で植物体が生育できる状態にすることを意味する。その手段としては、例えば、植物体の種子を固体担体中に播種すること、植物体の栄養繁殖可能な組織を固体担体中に定植すること、発芽後の植物体を固体担体中に定植すること、などを挙げることができる。
　ここで、「発芽後の植物体」とは、種子や栄養繁殖可能な組織から芽が出て生育中である状態の植物体を意味する。具体的には、「発芽後の植物体」は、プラグ苗や苗木のような幼植物体であってもよいし、十分に成長した植物体であってもよい。なお、発芽後の植物体を固体担体中に定植する際、植物体は複数の株に分けて定植されてもよいし、栄養繁殖性植物であれば、植物体は栄養繁殖可能な複数の組織に分割して定植されてもよい（例えば、挿し木、挿し芽、種芋）。
　固体担体中に「共存」させる植物体の密度は特に限定されないが、例えば、固体担体１Ｌ当たり１～１０株の範囲で、植物体の種類に応じて適宜調整することができる。
　本実施形態では、上記のようにして、前記固体担体中に、前記微生物群、前記有機物、前記水、及び前記植物体の全てを共存させた後に、前記有機物と前記水とを前記固体担体に添加して、前記植物体を生育させる。前記植物体の生育（栽培）に係る具体的な態様は、当業者が技術常識に基づき植物体の種類や環境に応じて適宜決定することができる。
　微生物群を添加した固体担体に、有機物と水を与えることにより、微生物群は固体担体に固定される。それにより、微生物群が有機物を効率よく硝酸態窒素に分解できるようになるので、植物体は生育が促進され、植物体の根が固体担体の下層部まで伸展する。微生物群は、植物体の根の伸展に伴い、下層部まで生息域を広げる。
　このようにして、本実施形態は、有機物を無機化して硝酸態窒素を生成する微生物群を、固体担体全体に固定化することで、硝酸生成能を有する固体担体を製造することができるのである。
　本実施形態の具体的な工程の一態様は、図１～図４を参照して以下のようにして詳細に説明される。図１及び図２は、固体担体の製造方法の一実施形態を示すフロー図である。図３及び図４は、固体担体の製造方法の一実施形態を示す概略図である。
　図１に示す一実施形態において、まず、固体担体の製造方法の実施者は、ステップS1で、微生物群を固体担体の上層部に添加及び／又は混合する。ここで、微生物群は前記した土壌などの微生物源として添加される。また、固体担体は、十分に含水させたものを、適切な容器に充填して用いることができる。
　次に、ステップS3で、微生物源を添加した固体担体中に、植物体の種子を播種するか、又は、植物体の栄養繁殖可能な組織（例えば、球根など）を定植する。なお、本工程の後に、前記した微生物群の添加・混合工程を実施することも可能である。
　そして、ステップS4で、固体担体に水と有機物（肥料）を添加することにより、植物体を生育させる。水と有機物は混合して添加してもよく、別々に添加してもよい。有機物の添加により、微生物群も増殖し、上層部で固定化され、有機物を効率よく硝酸態窒素に分解できるようになる。生成された硝酸態窒素は植物の根から吸収されるため、多量の水で洗浄しなくても脱窒反応は生じにくい。植物体の成長に伴い根が伸展し、固体担体の上層部に生息する微生物群が根圏の発達とともに固体担体中に拡大する。
　最後に、ステップS5で、十分に成長した植物体を収穫する（植物体の除去）。植物体の根が固体担体中に伸展していれば、固体担体全体に微生物群が固定された（土壌化が十分に行われた）ことがわかる。
　図１に示す他の実施形態では、まず、ステップS2で、植物体の種子、又は、植物体の栄養繁殖可能な組織（例えば、球根など）の表面の少なくとも一部に、微生物群を付着させる。ここで、微生物群は前記した微生物源（例えば、土壌化された固体担体からの流出液など）として種子等の表面に付着させることができる。
　次に、ステップS3で、固体担体中に、微生物源を付着させた種子を播種するか、又は、微生物源を付着させた植物体の栄養繁殖可能な組織を定植する。ここで、固体担体は、十分に含水させたものを、適切な容器に充填して用いることができる。
　後は、前記と同様に、固体担体に水と有機物（肥料）を添加して植物体を生育させ（ステップS4）、十分に成長した植物体を収穫する（ステップS5）。
　図２に示す一実施形態において、まず、ステップS11で、微生物群を含む土壌中で植物体を生育させる。ここで、微生物群を含む「土壌」は、前記した通り、一般的な土壌を指すものではなく、微生物群が固定化された媒体であれば如何なるものであってよく、土壌化された固体担体を用いてもよい。
　次に、ステップS13では、前記ステップS11で生育した発芽後の植物体（例えば、プラグ苗など）を、固体担体中に定植する。ここで、固体担体は、十分に含水させたものを、適切な容器に充填して用いることができる。なお、定植する際、植物体の根と接する土壌ごと移植することが望ましい。また、植物体は複数に株分け等して定植してもよい。
　後は、前記と同様に、固体担体に水と有機物（肥料）を添加して植物体を生育させ（ステップS14）、十分に成長した植物体を収穫する（植物体の除去）（ステップS15）。
　図２に示す他の実施形態では、まず、ステップS12で、微生物群を固体担体の上層部に添加及び／又は混合する。ここで、微生物群は前記した土壌などの微生物源として添加することができる。また、固体担体は、十分に含水させたものを、適切な容器に充填して用いることができる。
　次に、ステップS13で別途生育させた発芽後の植物体（例えば、プラグ苗など）を、固体担体中に定植する。なお、本工程の後に、前記した微生物群の添加・混合工程を実施することも可能である。
　後は、前記と同様に、固体担体に水と有機物（肥料）を添加して植物体を生育させ（ステップS14）、十分に成長した植物体を収穫する（ステップS15）。
　図３に示す実施形態では、まず、袋に固体担体を充填し、固体担体表面に培養土などの微生物源を少量接種する（ステップS21）。次に、固体担体中に植物体の種子を播種する（ステップS22）。そして、水と有機物を加えながら植物体を栽培する（ステップS23）。微生物群が有機物を分解して硝酸態窒素を生成し、それを植物体の根に吸収させるため、多量の水で硝酸態窒素を洗い流す必要がない。
　その後、硝酸態窒素を吸収して植物体は成長を続け、根も固体担体の下層部まで伸展する（ステップS24）。増殖した微生物群は、植物の根の発達とともに固体担体全体に生息域を拡大する。最後に、十分に生育した植物体を除去すると、硝酸生成能を有する袋入り固体担体が出来上がる（ステップS25）。
　図４に示す実施形態では、まず、ステップS31で、セルトレーに培養土などの微生物源を充填し（微生物の固定化）、ステップS32で、そこに植物体の種子を播種して育苗し、セル苗を作成する。次に、ステップS33で、固体担体で作成した畝にセル苗を定植し、水と有機物を加えながら植物体を栽培する。セル苗自体が微生物源となり、微生物群が固体担体中で増殖する。微生物群が有機物を分解して硝酸態窒素を生成し、それを植物体の根に吸収させるため、多量の水で硝酸態窒素を洗い流す必要がない。
　その後、ステップS34で、硝酸態窒素を吸収して植物体は成長を続け、根も固体担体の畝の中で広範囲に伸展する。増殖した微生物群は、植物の根の発達とともに畝全体に固定化範囲を拡大する。最後に、ステップS35で、十分に生育した植物体を除去すると、硝酸生成能を有する固体担体の畝が出来上がる。
　本実施形態において、微生物群が固体担体に固定化され、固体担体が土壌化できたか否かの確認は、固体担体の硝酸生成能を評価することにより実施することができる。硝酸生成能の評価は、以下の方法で硝酸回収率（％）を測定することによって実施することができる。
　硝酸回収率測定方法：
（１）固体担体に対し、有機物を窒素量として、固体担体１Ｌあたり０．０５ｇ以上添加した後、２４～２６℃で１時間以上、好ましくは６時間以上静置する。この静置期間中に、有機物が微生物群によって分解され、硝酸態窒素が生成される。
（２）固体担体１Ｌあたり５０ｍＬ以上の水を添加して、固体担体から流出させることにより、固体担体を洗浄する。
（３）固体担体より流出した流出液を回収し、流出液中の硝酸態窒素（硝酸イオン）含有量を測定する。
（４）前記工程（１）で添加した有機物中の窒素量に対する、前記工程（３）で測定した流出液中の硝酸態窒素含有量の比率を求め、硝酸回収率（％）とする。
　上記方法で求めた硝酸回収率が、通常３０％以上、好ましくは３３％以上、より好ましくは３５％以上、さらに好ましくは３７％以上、特に好ましくは４０％以上であれば、固体担体が正常に土壌化できていると評価できる。一方、硝酸回収率が１％以上、好ましくは１％以上３０％未満、より好ましくは１％以上２０％未満である場合は、土壌化が進行中であり菌叢が不安定であるか、脱窒反応が生じて硝酸態窒素が失われている可能性がある。
　また、固体担体中の植物体の根の伸展を確認することによっても、土壌化の確認が可能である。微生物群（特に硝化菌）が固定されていない領域では、植物体が利用できる硝酸態窒素が生成されないために、根が有機物に暴露して痛んでしまうためである。したがって、根が固体担体全体に伸展していれば、固体担体全体に微生物群が固定されていると確認できる。
　なお、土壌化の進行過程では、菌叢が不安定になり、硝酸回収率の測定値が一時的に３０％以上となる場合がある。したがって、前記した硝酸回収率の測定は、固体担体中の異なる領域（好ましくは、固体担体の中層以下の領域から３箇所以上）から複数のサンプルを採取して行い、それらの平均値により土壌化を評価することが望ましい。あるいは、前記した複数の評価方法を併せて総合的に土壌化の評価を行うこともできる。
　本実施形態により製造された硝酸生成能を有する固体担体は、実施例において後述するように、微生物群が全体にわたり固定化されており、撹乱処理を行っても硝酸生成能を高いレベルで維持できる。したがって、この固体担体は適切な容器に分割して封入しても品質のバラつきが少なく、市場で流通させることが可能である。
〔固体担体を用いた植物の栽培方法〕
　前記した硝酸生成能を有する固体担体は、有機物を直接添加しても短時間で硝酸態窒素に分解できるため、あらゆる植物栽培法に適用できる植物栽培用培地として用いることができる。
　すなわち、本実施形態は、前記方法により硝酸生成能を有する固体担体を製造し、得られた前記固体担体を用いて植物を栽培することを特徴とする、植物の栽培方法に関する。
　具体的には、前記した硝酸生成能を有する固体担体を用いた植物の栽培方法は、固体担体に対し、植物の種子を播種するか、植物の栄養繁殖可能な組織（例えば、球根など）を定植するか、発芽後の植物体（例えば、プラグ苗など）を定植して、水と有機質肥料を固体担体に直接添加することにより実施できる。
　ここで、有機質肥料としては、前記した有機物を用いることができる。有機質肥料は、液体であっても粉末であっても使用することができるが、液体の有機質肥料、特に魚煮汁やコーンスティープリカー、あるいは、粉末の有機質肥料の水懸濁液、が好適である。有機質肥料の添加量については、前記した固体担体の製造方法について記載した通りである。
　本実施形態の栽培方法は、野菜、果実、花卉、樹木、果樹、観葉植物など、あらゆる植物に適用することができる。具体的には、キク科、アブラナ科、ナス科、ヒユ科、ヒガンバナ科、バラ科、マメ科、ウリ科、イネ科、ショウガ科、ユリ科、セリ科、アカザ科、ヒルガオ科などに属する植物体を挙げることができる。
　前記した硝酸生成能を有する固体担体は、前記した植物栽培方法の他に、有機物から硝酸態窒素（硝酸イオン、硝酸塩）を生成するための触媒カラムの担体として用いることができる。すなわち、固体担体をカラムに充填し、液体の有機物又は粉末の有機物の水懸濁液をカラムに添加し、固体担体中を通過した流出液を回収することで、硝酸態窒素を得ることができる。得られた硝酸態窒素を含む液体は、無機肥料として利用することができる。ここで、カラムに添加する有機物としては、前記した有機物を用いることができる。
〔固体担体を製造するための土壌組成物（中間体）〕
　さらなる実施形態は、前記（Ａ）の固体担体中に、前記（Ｂ）～（Ｅ）の全てを共存させてなることを特徴とする、硝酸生成能を有する固体担体を製造するための土壌組成物に関する。ここで、「土壌組成物」とは、前記した通り、土壌化が進行途中である固体担体を主要成分とする組成物であって、当該固体担体を土壌化する過程で生じる中間体を意味する。また、前記（Ａ）～（Ｅ）の各要素については前述した通りである。
　本実施形態における土壌組成物の固体担体は、ある程度の硝酸生成能を備えていればよく、前記した固体担体の製造方法を経て、十分な硝酸生成能が得られればよい。硝酸生成能を評価する基準として、前記した硝酸回収率測定方法により測定される硝酸回収率（％）を用いることができる。つまり、土壌組成物の固体担体について測定した硝酸回収率が１％以上、好ましくは１％以上３０％未満、より好ましくは１％以上２０％未満である場合に、「土壌化が進行途中である」と判定することができる。
　また、前記した通り、固体担体中の植物体の根の状態を確認することによっても、土壌化の確認が可能である。微生物群（特に硝化菌）が固定されていない領域では、植物体が利用できる硝酸態窒素が生成されないために、根が有機物に暴露して痛んでしまうためである。したがって、固体担体中での根の発達が不十分である場合に、「土壌化が進行途中である」と判定することができる。
　なお、前記した通り、土壌化の進行過程では、菌叢が不安定になり、硝酸回収率の測定値が一時的に高くなる場合がある。したがって、前記した硝酸回収率の測定は、固体担体中の異なる領域（好ましくは、固体担体の中層以下の領域から３箇所以上）から複数のサンプルを採取して行い、それらの平均値により土壌化を評価することが望ましい。あるいは、前記した複数の評価方法を併せて総合的に土壌化の評価を行うこともできる。
　本実施形態における土壌組成物は、土壌化が進行途中であり菌叢が不安定ではあるが、少なくとも上層部の固体担体については土壌化されていると考えられる。そして、このような土壌組成物を用いることで、硝酸生成能に優れる固体担体を製造できる。また、土壌組成物は、適切な容器に充填されていてもよい。容器に充填された土壌組成物は、運搬が容易であり、市場で流通可能である。したがって、土壌組成物は、前記した植物栽培用培地などに好適に用いることができるため、産業上利用可能である。
　本開示は、実施例、及び比較例を挙げて以下のように具体的に説明される。なお、以下において「％」は、特に言及がない限り、「質量％」を意味する。
〔実施例１〕
　我々は、パクチー（セリ科）、ひまわり（キク科）、及びレタス（キク科）を用いて土壌化試験を行った。
（試験方法）
（１）直径９ｃｍのビニールポットに、固体担体として十分に含水させたもみ殻燻炭３００ｍＬを入れ、その上に微生物源であるバーク堆肥（商品名「サンヨーバーク」、三陽チップ工業（株））を３ｇ撒いた。さらにその上から、有機物として鰹節工場の副産物である鰹煮汁０．３ｇ（液体質量、１８ｍｇ　Ｎ相当、Ｃ／Ｎ比２．９、以下同様。）を１０ｍＬの水に懸濁した液体を添加した。
（２）上記のポットにそれぞれパクチー、ひまわり、又はレタスの種子を５粒播種した（各群４ポット）。
（３）各ポットにつき２０ｍＬの水を、ポット下部から排水しないようにして毎日投入し、植物を栽培した。
（４）本葉展開後、週１回上記（３）の水やり後に、前記鰹煮汁０．３ｇを１０ｍＬの水に懸濁した液体を各ポットに添加し、６週間栽培した。
（５）６週間栽培した後、植物体は根ごと抜き取って収穫し、各ポットに水を６００ｍＬ投入して固体担体を洗浄した。
（６）次の方法で硝酸態窒素回収率を測定した。再度前記鰹煮汁０．３ｇを１０ｍＬの水に懸濁した液体を各ポットに添加し、２５℃で１日間静置した。その後、各ポットに水３００ｍＬを添加して、ポット底部より流出した流出液中の硝酸態窒素量を測定した。硝酸態窒素量（硝酸イオン濃度）の測定は、リフレクトクァント（登録商標）硝酸テスト（メルク社）を用い、ＲＱフレックス（メルク社）で測定することにより行った（以下同様）。
（結果）
　硝酸態窒素量の測定値を、上記（６）で添加した鰹煮汁のＮ量で割って求めた硝酸態窒素回収率（％）を、図５に示す。ひまわり、パクチー、レタスの順に高い硝酸態窒素回収率であった（図５）。最も高いひまわりでは、約４０％の硝酸態窒素回収率を示し、十分に硝酸生成能を有する固体担体を製造できることが示された。一方、レタスは、生育は良かったが、硝酸態窒素回収率が２０％以下と若干低かった。しかし、回収率は、有機物の添加量を増やすことにより、改善できる可能性がある。
　以上の結果から、固体担体中に、微生物群、有機物、水、及び植物体を共存させて、前記植物体を栽培することにより、何度も大量の水で洗浄しなくても固体担体を土壌化できることが示された。また、様々な植物を用いて、本実施形態による土壌化が可能であることが示された。
〔実施例２〕
　コマツナ（アブラナ科）を用いて土壌化試験を行った。
（試験方法）
（１）網かごに、固体担体として十分に含水させたもみ殻燻炭３Ｌを充填し、その上に微生物源である培養土（商品名「土太郎」、スミリン農産工業（株））を３０ｇ散布した。培養土を散布しないこと以外は同様に処理した区をコントロールとした。
（２）上記（１）に、有機物として１０倍希釈鰹煮汁３０ｍＬを噴霧し、２５℃で２週間静置することにより、もみ殻燻炭表層部を土壌化した。
（３）静置後の網かごに、コマツナの種子を１かご当たり２０粒播種した（各群３かご）。
（４）発芽後、各かごにつき２ｇ（液体質量、１２０ｍｇ　Ｎ相当）の鰹煮汁を１Ｌの水に懸濁した液体を毎日潅水することにより、コマツナを４週間栽培した。
（５）栽培終了後、コマツナの生育状況と、固体担体中でのコマツナの根の伸展を観察した。
（結果）
　図６は、栽培終了時点のコマツナの生育状況を示す写真像図である。図６Ａはコントロール、図６Ｂは試験区、をそれぞれ示す。コントロールでは、微生物源である培養土を散布しなかったため、土壌化が行われず、コマツナは生育しなかったことが示された（図６Ａ）。一方、試験区ではコマツナが健全に生育し、もみ殻燻炭全体に根が伸展した（図６Ｂ）。
　コントロールでは、有機物を分解して硝酸態窒素を生成する微生物群（特に硝化菌）が固定されていないため、植物体が利用できる硝酸態窒素がうまく生成されないために、根が有機物に暴露して傷んでしまったと考えられた。一方、試験区では、根が固体担体全体に伸展していることから、固体担体全体に微生物群が固定されていることが分かった。これらの結果から、植物体の根の伸展に伴い、固体担体全体に微生物群の生息域が拡大することが示唆された。
〔実施例３〕
　サニーレタス（キク科）を用いて土壌化試験を行った。
（試験方法）
（１）直径９ｃｍのビニールポットの底部の穴を塞ぎ、固体担体として十分に含水させたもみ殻燻炭３００ｍＬを入れた。その上に微生物源である培養土（商品名「土太郎」、スミリン農産工業（株））を１０ｇ撒いた。さらにその上から、有機物として鰹煮汁０．３ｇ（液体質量、１８ｍｇ　Ｎ相当、以下同様。）を１０ｍＬの水に懸濁した液体を添加した。
（２）上記のポットを３つ用意し、それぞれサニーレタスの種子を６粒播種した。
（３）毎日各ポットの重量を測定し、乾燥で軽くなった分を補充するようにして、１日１０～５０ｍＬの水を各ポットに毎日投入し、植物を栽培した。
（４）本葉展開後、１ポット当たり３株に間引いた。また、平日（月～金曜日）は、上記（３）の水やり後に、前記鰹煮汁０．３ｇを１０ｍＬの水に懸濁した液体を各ポットに毎日添加し、６週間栽培した。
（５）６週間栽培した後、サニーレタスの地上部のみ収穫し、各ポットに水を９００ｍＬ投入して固体担体を洗浄した。
（６）次の方法で硝酸態窒素回収率を測定した。再度前記鰹煮汁０．３ｇを１０ｍＬの水に懸濁した液体を各ポットに添加し、２５℃で１日間静置した。その後、底部の穴を開放した状態で各ポットに水９００ｍＬを添加して、ポット底部より流出した流出液中の硝酸態窒素量を測定した。硝酸態窒素量の測定値を、添加した鰹煮汁のＮ量で割って硝酸態窒素回収率（％）を求めた（以下の実施例でも同様）。
（結果）
　図７に結果を示す。図７Ａは収穫前の植物の外観を示す写真像図である。図７Ｂは地上部収量（ｇ）、図７Ｃは硝酸態窒素回収率（％）、をそれぞれ示すグラフであり、値は平均値±標準誤差を示す。サニーレタスの生育は良好であった（図７Ａ、図７Ｂ）。また、硝酸態窒素回収率は４０％以上と非常に高かった（図７Ｃ）。これらの結果から、本実施形態により十分な硝酸生成能を有する固体担体が製造できることが示された。
〔実施例４〕
　実施例３とは有機物の添加開始のタイミングを変えて、土壌化試験を行った。
（試験方法）
（１）直径９ｃｍのビニールポットの底部の穴を塞ぎ、固体担体として十分に含水させたもみ殻燻炭３００ｍＬを入れた。その上に微生物源である培養土（商品名「土太郎」、スミリン農産工業（株））を１０ｇ撒いた。
（２）上記のポットを３つ用意し、それぞれサニーレタスの種子を６粒播種した。
（３）毎日各ポットの重量を測定し、乾燥で軽くなった分を補充するようにして、１日１０～５０ｍＬの水を各ポットに毎日投入し、植物を栽培した。
（４）本葉展開後、１ポット当たり３株に間引いた。また、平日（月～金曜日）は、上記（３）の水やり後に、鰹煮汁０．３ｇ（液体質量、１８ｍｇ　Ｎ相当、以下同様）を１０ｍＬの水に懸濁した液体を各ポットに毎日添加し、６週間栽培した。
（５）６週間栽培した後、サニーレタスの地上部のみ収穫し、各ポットに水を９００ｍＬ投入して固体担体を洗浄した。
（６）次の方法で硝酸態窒素回収率を測定した。再度前記鰹煮汁０．３ｇを１０ｍＬの水に懸濁した液体を各ポットに添加し、２５℃で１日間静置した。その後、底部の穴を開放した状態で各ポットに水９００ｍＬを添加して、ポット底部より流出した流出液中の硝酸態窒素量を測定した。
（結果）
　図８に結果を示す。図８Ａは収穫前の植物の外観を示す写真像図である。図８Ｂは地上部収量（ｇ）、図８Ｃは硝酸態窒素回収率（％）、をそれぞれ示すグラフであり、値は平均値±標準誤差を示す。サニーレタスの生育は良好であった（図８Ａ、図８Ｂ）。また、硝酸態窒素回収率は３０％以上であった（図８Ｃ）。
　実施例３では播種前にも有機物を添加していたが、今回は播種前の有機物添加は行わず、本葉展開後から開始した。それでも硝酸態窒素回収率は十分なレベルであり（図８Ｃ）、本実施形態によっても十分な硝酸生成能を有する固体担体が製造できることが示された。
〔実施例５〕
　植物体の有無、並びに土壌化後の撹乱による影響を検討した。
（試験方法）
（１）直径９ｃｍのビニールポットの底部の穴を塞ぎ、固体担体として十分に含水させたもみ殻燻炭３００ｍＬを入れた。その上に微生物源である培養土（商品名「土太郎」、スミリン農産工業（株））を１０ｇ撒いた。さらにその上から、有機物として鰹煮汁０．３ｇ（液体質量、１８ｍｇ　Ｎ相当、以下同様）を１０ｍＬの水に懸濁した液体を添加した。
（２）上記のポットを６つ用意し、そのうち３つにそれぞれサニーレタスの種子を６粒播種した（サニーレタス区）。残りの３つのポットは、種子を播種しないこと以外は同様に処理し、コントロール（植物なし区）とした。
（３）毎日各ポットの重量を測定し、乾燥で軽くなった分を補充するようにして、１日１０～５０ｍＬの水を各ポットに毎日投入し、植物を栽培した。
（４）本葉展開後、１ポット当たり３株に間引いた。また、平日（月～金曜日）は、上記（３）の水やり後に、前記鰹煮汁０．３ｇを１０ｍＬの水に懸濁した液体を各ポットに毎日添加し、５週間栽培した。
（５）５週間栽培した後、サニーレタスの地上部のみ収穫し、各ポットに水を９００ｍＬ投入して固体担体を洗浄した。
（６）次の方法で硝酸態窒素回収率を測定した。再度前記鰹煮汁０．３ｇを１０ｍＬの水に懸濁した液体を各ポットに添加し、２５℃で１日間静置した。その後、底部の穴を開放した状態で各ポットに水９００ｍＬを添加して、ポット底部より流出した流出液（流出液Ａ）中の硝酸態窒素量を測定した。
（７）次いで、上記方法により土壌化した固体担体を全てポットから出し、サニーレタスの根を除去した後に、再度ポットへ戻した（撹乱処理）。コントロールについても、同様に固体担体を全てポットから出し、再度ポットに戻す撹乱処理を行った。
（８）撹乱後の固体担体について上記（６）の操作を繰り返し、得られた流出液（流出液Ｂ）中の硝酸態窒素量を測定した。
（結果）
　図９に結果を示す。図９Ａはサニーレタス区の収穫前の外観、図９Ｂは植物なし区（コントロール）の外観、をそれぞれ示す写真像図である。図９Ｃは撹乱処理前後の硝酸態窒素回収率（％）を示すグラフであり、「Ａ」は撹乱前、「Ｂ」は撹乱後、をそれぞれ示し、値は平均値±標準誤差を示す。サニーレタス区における植物の生育は良好であった（図９Ａ）。サニーレタス区では、撹乱前の４０％程の硝酸生成能を撹乱後も示した。一方、植物なし区（コントロール）では、撹乱後に硝酸生成能が１６％程に低下した（図９Ｃ）。
　以上の結果から、植物体を共存させて土壌化を行うことにより、固体担体全体に微生物群の固定化が完了していれば、撹乱処理を行っても硝酸態窒素回収率は大きく落ち込むことなく、高い値を維持できることが示唆された。これに対して、植物なしの場合は、微生物群を撒いて有機物と水を繰り返し与えることによって、表層部のみの土壌化は可能だが、下層部まで土壌化することはできず、撹乱すると硝酸生成能が大きく低下することが示された（図９）。
〔実施例６〕
　発芽後の植物体を定植する実施形態での土壌化試験を行った。
（試験方法）
（１）１つのセルのサイズが３×３×６ｃｍであるセルトレーに、微生物源である培養土（商品名「土太郎」、スミリン農産工業（株））を充填し、十分に含水させた。そこにレタスの種子を各セル１粒播種し、本葉展開まで２週間水のみを与えて育苗した。
（２）１５Ｌプランターに、固体担体としてもみ殻燻炭を充填し、上記（１）のプラグ苗を１プランター当たり１０株定植した。以後、有機物として鰹煮汁１ｇ（液体質量、６０ｍｇ　Ｎ相当）を１０ｍＬの水に懸濁した液体を株元に平日毎日添加して、植物を栽培した。潅水は適宜行った。
（３）十分なサイズに成長した植物を収穫した。潅水時にプランター底部より流出する流出液について、リフレクトクァント（登録商標）硝酸テスト（メルク社）を用いて硝酸イオンの有無を検出した。
（結果）
　レタスの生育は良好であった。潅水時の流出液から硝酸イオンが検出された。これらの結果から、プラグ苗の土壌に含まれる微生物群が、レタスの成長に伴う根圏の広がりとともに固体担体全体に拡大し、固定化されることが示唆された。また、発芽後の植物体を、土壌化されていない固体担体に定植し、有機物と水を添加して植物を栽培することにより、土壌化が実施できることが示された。
〔実施例７〕
　土壌化後の固体担体の上層部と下層部の硝酸生成能を確認した。
（試験方法）
（１）１つのセルのサイズが３×３×６ｃｍｃｍであるセルトレーに微生物源である培養土（商品名「土太郎」、スミリン農産工業（株））を充填し、十分に含水させた。そこにサニーレタスの種子を各セル１粒播種し、本葉展開まで２週間水のみを与えて育苗した。
（２）網かごに、固体担体として十分に含水させたもみ殻燻炭２Ｌを充填し、その下にトレーを設置した。上記（１）のプラグ苗を、前記網かごに２株定植した。以後、有機物として鰹煮汁０．１ｇ（液体質量、６ｍｇ　Ｎ相当、以下同様）を１００ｍＬの水に懸濁した液体を毎日潅水して、植物を栽培した。なお、培養土の代わりにバーミキュライトを充填したセルトレーで育苗したレタス苗を定植したこと以外は同様に処理したものを、コントロールとした。
（３）十分なサイズに成長した植物を収穫した。残ったもみ殻燻炭を上層と下層に分離し、それぞれカラム（図１０Ｂ、２Ｌペットボトルの上部を切り取って作製したもの）に充填した。各カラムに鰹煮汁０．１ｇを１００ｍＬの水に懸濁した液体を添加し、２５℃で一晩静置した。
（４）静置後の各カラムに水１００ｍＬを加え、下部開口部から流出液を回収した。この流出液について、アンモニウムイオン、亜硝酸イオン、硝酸イオンの各濃度を測定した。前記測定は、リフレクトクァント（登録商標）のアンモニアテスト、亜硝酸テスト、硝酸テスト（いずれもメルク社）を用い、ＲＱフレックス（メルク社）で測定することにより行った。なお、比較のため、試験区及びコントロールの上層と下層を合わせてカラムに充填したものについても、同様に測定を行った。
（結果）
　図１０及び表１に結果を示す。図１０Ａは収穫前の植物の外観、図１０Ｂは測定用のカラムの外観、をそれぞれ示す写真像図である。試験区でのサニーレタスの生育は良好であった（図１０Ａ）のに対し、バーミキュライトのセルトレーで育てた苗を定植したコントロールでは、健全に生育しなかった。
　表１は、土壌化後の固体担体の上層及び下層についてのアンモニウムイオン、亜硝酸イオン、硝酸イオンの各測定値の平均値（単位：ｍｇ／Ｌ）を表す（ｎ＝３）。表中、「Ｌｏｗ」は検出限界以下であることを指す。試験区では、上層・下層のいずれのカラムからも硝酸態窒素の生成が確認された。また、試験区では、上層、下層、上層＋下層を合わせたカラムのいずれにおいても、各イオン濃度に目立った差は認められなかった。他方、コントロールでは、硝酸態窒素の生成は検出されず、アンモニア態窒素のみ高濃度で検出された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　これらの結果から、固体担体中に微生物群、有機物、水及び植物体を共存させて、植物体を栽培することにより、固体担体全体がまんべんなく土壌化され、下層部のみでも十分な硝酸生成能を持つようになることが示された。また、微生物群が存在しなければ、固体担体中で植物体を栽培しても土壌化できないことが示された。
〔実施例８〕
　マメ科植物ヘアリーベッチの根圏の拡大に伴う硝化菌群（アンモニア酸化菌、亜硝酸酸化菌）の固体担体内部への拡大に関して、植物を定植しないコントロール区と比較することで評価した。
（試験方法）
（１）底部に穴が開いた直径10ｃｍのプラスチックポットに、固体担体として、オートクレーブにて滅菌処理し十分に含水させたもみ殻燻炭200 mLを入れ、特許文献１ならびに非特許文献１の方法（図１１）に従い、このもみ殻燻炭に微生物群の定着処理を行った。すなわち、もみ殻燻炭の上に微生物源としてバーク堆肥（商品名「サンヨーバーク」、三陽チップ工業（株））を加え、さらに有機物の添加と水によるリンスを繰り返すことで、もみ殻燻炭に微生物群を固定化させた。
（２）滅菌したヘアリーベッチの種を３日間発芽させた後、上記（１）で微生物群を固定化したポットに定植した。一方、上記（１）で固定化したポットにヘアリーベッチを定植しないものを、コントロールとした。
（３）次に、固体担体として、オートクレーブにて滅菌処理し十分に含水させたもみ殻燻炭2 Lを用意し、ビニール袋に入れた。そして、このビニール袋ごと、長さ50 cm×直径9 cmの塩化ビニルパイプに充填した。
（４）上記（２）でヘアリーベッチを定植したポットを、微生物を固定化していない未処理のもみ殻燻炭を充填した上記（３）の塩化ビニルパイプの上面に設置した（ヘアリーベッチ区；図１２Ａ）。一方、上記（２）でヘアリーベッチを定植していないコントロールのポットも、上記と同様に未処理のもみ殻燻炭を充填した塩化ビニルパイプの上面に設置した（コントロール区；図１２Ｂ）。各試験区はそれぞれ３連で試験を行った。
（５）試験０日目に、各試験区のポットの上部に1.5 gの鰹煮汁を添加し、その後は４日おきに0.1 gの鰹煮汁を添加した。また乾燥防止のため、各試験区のポットの上部に毎日ミリＱ水50 mLを添加した。日長：16 h/day、光度：16000 LUX、温度：24℃の条件下、17日間栽培した。コントロール区も同様に処置した。
（６）栽培後、ヘアリーベッチ区とコントロール区の充填したもみ殻燻炭を-20℃にて凍結させた。凍結したもみ殻燻炭を、図１２に図示したＬ１～Ｌ８の８層に切り分け、各層から採取したもみ殻燻炭500 mgを、マイクロチューブ内で粉砕した。続いて粉砕したもみ殻燻炭のうち50 mgを採取し、Nucleospin Soil（タカラバイオ（株））を用いてDNAを抽出（約100 ng/μL）した。
（７）上記（６）で抽出したDNAから、リアルタイムPCR法を用いてアンモニア酸化菌群、亜硝酸酸化菌群及び全細菌の遺伝子を定量し、各層におけるそれぞれの菌体量を調べた。ここで、アンモニア酸化菌群の増幅はアンモニア酸化菌に固有のamoA遺伝子をターゲットとするプライマー、亜硝酸酸化菌群（ニトロバクター属）の増幅は亜硝酸酸化還元酵素のnorB遺伝子をターゲットするプライマー、全細菌の増幅は16S rRNAをターゲットとするプライマーを用いた。各プライマーを以下の表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（８）リアルタイムPCRは、GVP-9600（（株）島津製作所）を用い、TB Green（登録商標）Premix Ex TaqTM II (Tli RNaseH Plus), ROX plus（タカラバイオ（株））を用いて以下の表３に示す PCR 反応液を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（９）PCR条件は、以下の表４に示すシャトルPCR標準プロトコールに従って行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（１０）2nd Derivative Maximum 法でCt値を算出した。また、Ct値の比較により各硝化菌の割合を算出した。例えば、全菌体量に対するアンモニア酸化菌の存在比率（2ΔCt）は、以下の（式１）により計算した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
（結果）
　結果を図１３に示す。図１３は、リアルタイムPCRにより求めた、Ｌ１の全菌体量に対するアンモニア酸化菌群の相対値（図１３Ａ）、亜硝酸酸化菌群の相対値（図１３Ｂ）、を示すグラフである。Ｙ軸は相対値（％）を対数目盛で示し、Ｘ軸はＬ１～Ｌ８の各層を示す。
　栽培17日後の観察では、図１２Ａに示すように、ヘアリーベッチ区においてＬ５まで根の伸張が確認できた。アンモニア酸化菌群に関しては、図１３Ａに示すように、コントロール区では、試験方法（１）で硝化菌群を定着させたＬ１と直下のＬ２にしか存在しなかったが、ヘアリーベッチ区では、根圏の拡大と共にアンモニア酸化菌群が拡大し、Ｌ７までの拡大が確認できた。亜硝酸酸化菌群に関しては、図１３Ｂに示すように、コントロール区では、硝化菌群を定着させたＬ１と直下のＬ２と若干Ｌ３に確認できる程度しか存在しなかったが、ヘアリーベッチ区では、コントロール区と比較して、十分に根の拡大が確認できたＬ４まで亜硝酸酸化菌が拡大し、定着していることが確認できた。
　これらの結果より、本実施形態に従う試験区では、コントロール区と比較して、植物の根圏の拡大に伴い硝化菌群が固体担体内部に拡大することを直接的かつ定量的に示すことができた。
〔比較例〕
　網かごに、十分に含水させたもみ殻燻炭3Lを詰め、そこにコマツナ種子20粒を播種した。播種の１週間後から18日間、鰹煮汁1gを1Lの水に懸濁した液体を毎日潅水して栽培した。栽培期間中は、グロースチャンバー内で25℃、12時間明期、12時間暗期で管理した。栽培終了後、もみ殻燻炭に含まれる無機態窒素分析した。前記分析は、リフレクトクァント（登録商標）のアンモニアテスト、亜硝酸テスト、硝酸テスト（いずれもメルク社）を用い、ＲＱフレックス（メルク社）で測定することにより行った。
　結果を図１４に示す。図１４に示されるように、本栽培試験では、植物は枯死しなかったものの、葉が黄化し、健全に育たなかった。もみ殻燻炭中の無機態窒素の分析結果を、以下の表５に示す。表５から、栽培終了後のもみ殻燻炭中にはアンモニウムイオンのみが検出され、硝酸イオンと亜硝酸イオンは不検出であった。
　この結果から、固体担体に微生物源を加えなければ固体担体の土壌化が進まず、有機物の硝化が進まないため、植物の生育も悪化することが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 単位はmg/L。
　以上、図面を参照して、本開示の実施形態及び実施例について詳述してきたが、具体的な構成は、これらに限らず、本開示の要旨を逸脱しない程度の設計的変更は、本開示に含まれる。
　例えば、前記実施例では、固体担体としてもみ殻燻炭を用いて硝酸生成能を有する固体担体を製造する方法について説明したが、これに限定されるものではなく、通気性を有する任意の固体担体、例えば、バイオ炭、セラミックス、ロックウール、バーミキュライト、パーライト、ゼオライト、砂、鹿沼土、ガラス、ウレタン、ナイロン、メラミン樹脂、木質チップ、わら、水苔、木綿、紙、ポリアクリルアミドゲル、寒天、軽石、土質材料、土質材料焼結体、畑土などを用いた場合も、本開示に含めることができる。
　また、例えば、前記実施例では、有機物として鰹煮汁を用いて硝酸生成能を有する固体担体を製造する方法について説明したが、これに限定されるものではなく、任意の有機物、例えば、魚煮汁、魚粉、油粕、生ゴミ、トウモロコシ浸漬液、米ぬか、大豆粉、植物体残渣、動物体残渣、牛乳、粉ミルク、家畜糞、人糞尿、昆虫糞、昆虫粉末、藻類粉末、菌体、メタン発酵消化液、下水汚泥などを用いた場合も、本開示に含めることができる。
　本開示は、栽培履歴のない非土壌媒体を土壌化するため、病害の発生を極力抑えたい苗生産農家・種芋生産農家などに利用されることが期待される。また、本開示は月や火星などのレゴリス（鉱物の破砕物）で植物を栽培する技術にも応用可能であり、産業上の利用が期待される。
関連出願の相互参照
　本出願は、２０２２年１０月３日に日本国特許庁に出願された特願２０２２－１５９７４１に基づいて優先権を主張し、その全ての開示は完全に本明細書で参照により組み込まれる。

Claims (18)

  1. 　下記（Ａ）の固体担体中に、下記（Ｂ）～（Ｅ）の全てを共存させる工程を含み、下記（Ｂ）の微生物群が固定された固体担体を製造することを特徴とする、硝酸生成能を有する固体担体の製造方法。
    　（Ａ）通気性を有する固体担体。
    　（Ｂ）有機物を無機化して硝酸態窒素を生成する微生物群。
    　（Ｃ）有機物。
    　（Ｄ）水。
    　（Ｅ）硝酸態窒素を吸収する植物体。
  2. 　前記（Ｅ）の植物体の又は前記（Ｅ）の植物体の栄養繁殖可能な組織を、前記（Ａ）の固体担体中に播種又は定植することにより、前記（Ａ）の固体担体中に前記（Ｅ）の植物体を共存させることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記（Ｂ）の微生物群を前記（Ａ）の固体担体の上層部に添加及び／又は混合する工程を実施した後に、前記（Ｅ）の植物体の種子又は前記（Ｅ）の植物体の栄養繁殖可能な組織を前記（Ａ）の固体担体中に播種又は定植する工程を実施することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
  4. 　前記（Ｂ）の微生物群を前記（Ｅ）の植物体の種子又は前記（Ｅ）の植物体の栄養繁殖可能な組織の表面の少なくとも一部に付着させる工程を実施した後に、前記（Ｅ）の植物体の種子又は前記（Ｅ）の植物体の栄養繁殖可能な組織を前記（Ａ）の固体担体中に播種又は定植する工程を実施することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
  5. 　発芽後の前記（Ｅ）の植物体を前記（Ａ）の固体担体中に定植することにより、前記（Ａ）の固体担体中に前記（Ｅ）の植物体を共存させることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  6. 　前記（Ｂ）の微生物群を含む土壌中で前記（Ｅ）の植物体を生育させる工程と、当該工程により得られた発芽後の前記（Ｅ）の植物体を前記（Ａ）の固体担体中に定植する工程と、を含むことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記（Ｂ）の微生物群を前記（Ａ）の固体担体の上層部に添加及び／又は混合する工程を実施した後に、発芽後の前記（Ｅ）の植物体を前記（Ａ）の固体担体中に定植する工程を実施することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
  8. 　前記（Ａ）の固体担体が、バイオ炭、セラミックス、ロックウール、バーミキュライト、パーライト、ゼオライト、砂、鹿沼土、ガラス、ウレタン、ナイロン、メラミン樹脂、木質チップ、わら、水苔、木綿、紙、ポリアクリルアミドゲル、寒天、軽石、土質材料、土質材料焼結体、及び畑土からなる群のうち１種以上であることを特徴とする、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記（Ｃ）の有機物が、植物由来、動物由来、菌由来、食品由来、及び廃棄物由来の有機物からなる群のうち１種以上であることを特徴とする、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　前記（Ｅ）の植物体が、キク科、アブラナ科、ナス科、ヒユ科、ヒガンバナ科、バラ科、マメ科、ウリ科、イネ科、ショウガ科、ユリ科、セリ科、アカザ科及びヒルガオ科のうち１種以上の植物体であることを特徴とする、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　前記（Ａ）の固体担体を、容器に充填した状態で用いることを特徴とする、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の方法により硝酸生成能を有する固体担体を製造し、得られた前記固体担体を用いて植物を栽培することを特徴とする、植物の栽培方法。
  13. 　下記（Ａ）の固体担体中に、下記（Ｂ）～（Ｅ）の全てを共存させてなることを特徴とする、硝酸生成能を有する固体担体を製造するための土壌組成物。
    　（Ａ）通気性を有する固体担体。
    　（Ｂ）有機物を無機化して硝酸態窒素を生成する微生物群。
    　（Ｃ）有機物。
    　（Ｄ）水。
    　（Ｅ）硝酸態窒素を吸収する植物体。
  14. 　前記（Ａ）の固体担体が、以下の方法により測定される硝酸回収率が１％以上であることを特徴とする、請求項１３に記載の土壌組成物。
    　硝酸回収率測定方法：
    （１）前記固体担体に対し、前記（Ｃ）の有機物を窒素量として、前記固体担体１Ｌあたり０．０５ｇ以上添加した後、２４～２６℃で１時間以上静置する。
    （２）前記固体担体１Ｌあたり５０ｍＬ以上の水を添加して、前記固体担体から流出させることにより、前記固体担体を洗浄する。
    （３）前記固体担体より流出した流出液を回収し、前記流出液中の硝酸態窒素含有量を測定する。
    （４）前記工程（１）で添加した前記有機物中の窒素量に対する、前記工程（３）で測定した前記流出液中の硝酸態窒素含有量の比率を求め、硝酸回収率とする。
  15. 　前記（Ａ）の固体担体が、バイオ炭、セラミックス、ロックウール、バーミキュライト、パーライト、ゼオライト、砂、鹿沼土、ガラス、ウレタン、ナイロン、メラミン樹脂、木質チップ、わら、水苔、木綿、紙、ポリアクリルアミドゲル、寒天、軽石、土質材料、土質材料焼結体、及び畑土からなる群のうち１種以上であることを特徴とする、請求項１３に記載の土壌組成物。
  16. 　前記（Ｃ）の有機物が、植物由来、動物由来、菌由来、食品由来、及び廃棄物由来の有機物からなる群のうち１種以上であることを特徴とする、請求項１３に記載の土壌組成物。
  17. 　前記（Ｅ）の植物体が、キク科、アブラナ科、ナス科、ヒユ科、ヒガンバナ科、バラ科、マメ科、ウリ科、イネ科、ショウガ科、ユリ科、セリ科、アカザ科及びヒルガオ科のうち１種以上の植物体であることを特徴とする、請求項１３に記載の土壌組成物。
  18. 　前記（Ａ）の固体担体が、容器に充填されていることを特徴とする、請求項１３～１７のいずれか１項に記載の土壌組成物。
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Title
HIROMASA MORIKUNI: "Recovery of Nitrifying Bacteria after Sterilization and the Method of Nitrogen Application to Decrease Blossom End Rot of Tomatoes Grown in Isolated Bed", JAPANESE JOURNAL OF SOIL SCIENCE AND PLANT NUTRITION, vol. 70, no. 4, 1 January 1999 (1999-01-01), pages 542 - 549, XP093154779 *

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