WO2024069058A1 - Equipement optique pour une imagerie microscopique de tomographie à cohérence optique temporelle en plein champ autoréférencée, installation et procédé associés - Google Patents

Equipement optique pour une imagerie microscopique de tomographie à cohérence optique temporelle en plein champ autoréférencée, installation et procédé associés Download PDF

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WO2024069058A1
WO2024069058A1 PCT/FR2022/000084 FR2022000084W WO2024069058A1 WO 2024069058 A1 WO2024069058 A1 WO 2024069058A1 FR 2022000084 W FR2022000084 W FR 2022000084W WO 2024069058 A1 WO2024069058 A1 WO 2024069058A1
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sample
installation
objective
source
specular
Prior art date
Application number
PCT/FR2022/000084
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Kate GRIEVE
Olivier Thouvenin
Tual MONFORT
Salvatore AZZOLLINI
Sacha Reichman
Original Assignee
Sorbonne Universite
Centre National De La Recherche Scientifique
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
Ecole Superieure De Physique Et De Chimie Industrielles De La Ville De Paris
Centre Hospitalier D'ophtalmologie Des Quinze-Vingts
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Publication date
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    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0056—Optical details of the image generation based on optical coherence, e.g. phase-contrast arrangements, interference arrangements

Definitions

  • the invention relates to optical equipment for microscopic imaging of optical coherence tomography and at least one sample.
  • the invention also relates to a corresponding installation and method.
  • optical coherence tomography (better known by the English acronym OCT for “Optical Coherence Tomography”) makes it possible to acquire images with great precision and in particular an axial resolution greater than that which can be obtained. with a confocal microscope.
  • optical coherence tomography imaging allows:
  • Temporal optical coherence tomography imaging consists of measuring the inter ferometric signal between a signal of a retrodif light flared by a sample when it is illuminated by a source with a reference light signal emitted by this same source and being propagated over the same optical distance.
  • CMOS complementary metal-oxide-semiconductor
  • CDD complementary metal-oxide-semiconductor
  • Document FR 2 817 030 describes an example of an interference microscopic imaging system with full-field optical coherence.
  • D-FFOCT Dynamic FFOCT
  • morphological structures in a sample such as collagen fibers, cells and their nuclei, etc.
  • metabolic elements which compose a tissue of one of said structures of the same sample (such as the organelles of a cell (mitochondria for example) and/or the general metabolic state of one of these structures and in particular the cells and nuclei - by dynamic imaging .
  • Full-field optical coherence tomography imaging proves to be particularly advantageous for performing non-invasive imaging of three-dimensional structures making it possible to implement multiple applications: the study of organoids, the modeling of diseases, the making of a cancer diagnosis...
  • FFOCT - static imaging and D-FFOCT make it possible to obtain a lot of information on the functioning of living things thanks to the particularity of its signal, while being non-invasive and non-destructive.
  • FFOCT - static and D-FFOCT imaging makes it possible to obtain local amplification - spatially decorrelated - of the backscattered signal within the sample (generally a three-dimensional volume) as well as associated local phase information. and this with a transverse resolution similar to that which can be obtained by confocal microcopy and with an axial resolution greater than that which can be obtained by confocal microcopy.
  • FFOCT - static and D-FFOCT imagery are sensitive to weak scattering objects and weak longitudinal movements.
  • FFOCT - static and D-FFOCT imaging makes it possible to greatly limit the presence of speckles (better known by the English term "speckles") compared to analogous imaging techniques having phase resolution (scattering microscopy). interference, holographic microscopy, etc.). This allows a direct interpretation of the object studied.
  • FFOCT-static imaging and D-FFOCT imaging are virtually insensitive to spatial aberrations, allowing imaging within three-dimensional structures.
  • FFOCT - static imaging and D-FFOCT imaging thus make it possible to detect small organs - such as sub-cellular constituents - within more complex three-dimensional structures, such as tissues, even without marking.
  • D-FFCOT imaging it is possible, by temporal analysis of the signals obtained, to highlight other contrasts linked for example to cellular activity (such as for example cellular activity of organelles and for example example mitochondria, microvesicles, etc.).
  • inverted microscopy (remember that an inverted microscope is a microscope in which a sample is observed from below). It is also specified that a stratum is a two-dimensional section of the sample along a cutting plane in the thickness of the sample i.e. along a cutting plane parallel to the face of the sample holder on which the sample rests.
  • static FFOCT imaging and D-FFOCT imaging are not usually used to image these strata close to this surface, and particularly in the case of studies of very thin samples such as for example two-dimensional cell culture samples.
  • two-dimensional cell culture remains the majority used in disease modeling and drug development. despite the emergence of three-dimensional cell culture.
  • the study of elements in transition from a thin three-dimensional structure to a thicker three-dimensional structure is key in certain applications, such as for example for the study of intestinal organoids.
  • static FFOCT imaging and D-FFOCT imaging seem difficult to use for imaging the latter configuration.
  • the invention aims in particular to allow microscopic imaging of full-field optical coherence tomography which makes it possible to limit the appearance of optical artifacts during the imaging of at least one sample.
  • a method for full-field optical coherence tomography microscopic imaging of at least one sample comprising the steps of:
  • the reference wave is generated by reflection of light on a specular interface arranged on the object arm.
  • a stratum being a two-dimensional section of the sample along a cutting plane in the thickness of the sample i.e. a cutting plane parallel to a face of the sample holder on which the sample rests
  • the sample being for example a sample of a two-dimensional cell culture, a sample of graphene ... and more generally a sample having a thickness less than 15 micrometers, and for example less than 10 micrometers, and for example less than 5 micrometers;
  • one or more interface strata of a sample of greater thickness (such as an organoid for example), that is to say the strata closest to a face of an element carrying the sample ( glass slide, plastic slide, incubator, etc.).
  • the invention is based on the general principle of FFOCT imaging but improves this principle by being "self-referenced”: in fact the invention operates without a specific reference arm as in the FFOCT devices of the prior art since the Reference wave is generated from the specular interface which is also cleverly placed in the path of the object wave.
  • the particular position of the specular interface allows automatic alignment between a reference field (linked to the reference wave) and an object field (linked to the object wave).
  • This interference is otherwise homogeneous. This interference is also of very good quality since there is no optical aberration.
  • the invention can also be implemented by an installation of simple structure.
  • the invention thus proves to be less sensitive to vibrations than the static and dynamic FFOCT devices of the prior art due to the fact that the reference waves and the object waves propagate along the same object arm and that the specular interface is thus found at a less significant distance from the sample (for example the specular interface is at a distance between 0 and 15 micrometers).
  • the invention can thus make it possible to create a uniform mosaic (a mosaic being an assembly of N images acquired from different zones of the same stratum of a given sample), that is to say without overlapping artifacts between two images of the adjacent mosaic.
  • the invention can be implemented in a miniaturized installation depending on the intended application.
  • the invention uses only one objective due to its self-referencing.
  • the invention can advantageously be implemented in noisy environments such as for example on a vehicle (land, air, sea, etc.), a production line, etc.
  • the invention can also be associated with:
  • a processing unit for example a processor to process the interference signal(s).
  • the invention is also configured to perform dynamic full-field optical coherence tomography microscopic imaging.
  • the method includes an additional step for studying the temporal evolution of a resulting signal or of the interference(s) between the reference waves and the object waves.
  • the method makes it possible to carry out static FFOCT imaging as well as D-FFOCT imaging.
  • the method is configured to perform temporal optical coherence tomography microscopic imaging.
  • the process makes it possible, for example, to be able to look at morphological elements in a sample (such as collagen fibers, cells and their nuclei) - static imaging - as well as metabolic elements which make up a tissue, elements of the same sample (such as the organelles of a cell (mitochondria for example)) and/or the general metabolic state of one of these elements and in particular the cells and nuclei - dynamic imaging.
  • the elements can for example be cells, structures and in particular subcellular structures such as nuclei, mitochondria, pigments, etc.
  • the invention is less sensitive susceptible to vibrations than the static and dynamic FFOCT devices of the prior art.
  • This aspect is particularly interesting if the invention is used in a D-FFOCT imaging context.
  • D-FFOCT imaging devices of the prior art are difficult to deploy outside optical laboratories while the invention can be implemented in demanding and/or noisy environments (a noisy environment being an environment subject to to mechanical vibrations).
  • object arm we mean the part of the installation located between the sample and an optical element making it possible to generate the interfaces such as for example an optical beam splitter element (a light ray can thus propagate in said object arm following a given optical path).
  • the specular interface is arranged so as to be at a given distance from a plane imaged by the installation, a distance which is greater than or equal to zero and less than or equal to:
  • imaged plan (which can also be called “image plan”), we mean a plan which is imaged on an acquisition device (whether or not part of the invention), a device adapted to acquire at least one signal resulting from interference between the reference waves and the object waves.
  • the “imaged plan” therefore corresponds to one of the strata of the sample combined with the device of acquisition.
  • the “lens depth of field” is defined by 2 ⁇ /NA 2 (with ⁇ the central wavelength of the light emitted by the source) and NA the numerical aperture of the lens).
  • the method thus proves to be particularly effective for imaging strata distances of zero to two times 2 ⁇ / NA 2 from the specular interface.
  • the invention also relates to optical equipment for full-field optical coherence tomography microscopic imaging of at least one sample, the equipment comprising an objective for in-service observation of the sample, the device comprising an interface specular, the device thus being able in service to allow the production of at least one interference between:
  • the specular interface is arranged so as to be at a given distance from a plane imaged by the installation, a distance which is greater than or equal to zero and less than or equal to:
  • the specular interface of the equipment belongs to a glass slide or a plastic slide.
  • the source is part of the equipment.
  • the equipment comprises an acquisition device adapted to acquire at least one signal resulting from interference between the reference waves and the object waves.
  • the equipment according to the invention can also be configured to allow dynamic full-field optical coherence tomograph microscopic imaging.
  • the equipment according to the invention may further comprise an incubator intended to receive the sample.
  • the source of the equipment illuminates a beam splitter element of the installation through an optical unit comprising at least one optic and at least one diaphragm.
  • the specular interface is part of the sample holder. Even more advantageously, the specular interface is a face of the sample holder turned in use towards the sample.
  • the invention also relates to an installation comprising equipment as mentioned above.
  • the installation includes a reference arm, the installation thus being able in service to also allow the production of at least one interference between: • at least one reference wave obtained by reflection of the light emitted by the light source on a reflection surface of the additional reference arm, and
  • the installation comprising means for blocking the reference arm.
  • At least part of the installation according to the invention can be integrated into a mobile telephone.
  • the facility is configured to perform dynamic full-field optical coherence tomography microscopic imaging.
  • the equipment can advantageously be installed relatively simply in already existing static or dynamic FFOCT installations.
  • the term “reference arm” means the part of the installation located between the reflection surface and an optical element making it possible to generate the interfaces (a light ray thus being able to propagate in said reference arm following a given optical path).
  • the term "lighting arm” means the part of the installation located between the source and the optical element making it possible to generate the interfaces (a light ray thus being able to propagate in said object arm following a given optical path ) .
  • FIG. 1 Figure 1 is a schematic view of equipment according to a first embodiment of the invention
  • Figure 2a Figure 2a is a schematic view of equipment according to a second embodiment of the invention when a reference arm of said equipment is blocked
  • Figure 2b is a schematic view of the equipment illustrated in Figure 2a when the reference arm is functional.
  • the installation 1 is configured to carry out static and dynamic full-field optical coherence tomography microscopic imaging, particularly at one or more strata. interface of a sample 100 (whatever the thickness of the sample 100).
  • the sample 100 is carried by a sample holder.
  • the sample holder is for example a glass slide, a plastic slide, an incubator...
  • the installation 1 further comprises optical equipment 2 which is configured to allow the observation of the sample 100, here from below the sample 100.
  • the equipment 2 also comprises a frame (not shown here) and a stage (not shown here) intended to carry the sample holder with the sample 100 to be observed, the stage being movable in translation with respect to the frame along at least two axes of translation.
  • the equipment also includes an interference device which here comprises a source 5 and a specular interface 3, the interference device thus being able, in service, to produce optical interference between:
  • Source 5 is a source which is said to be spatially incoherent.
  • the source 5 is for example a halogen lamp or a light-emitting diode (better known by the acronym LED) or even a block formed of a spatially coherent source (the coherent source being for example a laser) and a structure crossed by the rays at the output of the spatially coherent source, structure making it possible to make said rays spatially incoherent at the output of the structure (and therefore of the block).
  • the structure is for example provided with a multimode type cavity, a multimode fiber, a hexagonal rod, etc.
  • Source 5 is here a temporally incoherent source, i.e. a source of short temporal coherence length (i.e. for example in a range of 0.5 to 15 micrometers and preferably from 1 to 10 micrometers).
  • a temporally incoherent source i.e. a source of short temporal coherence length (i.e. for example in a range of 0.5 to 15 micrometers and preferably from 1 to 10 micrometers).
  • the installation also includes here an acquisition device 7.
  • the acquisition device 7 is part of the equipment.
  • the acquisition device 7 allows the acquisition of at least one signal resulting from interference between the reference waves and the object waves.
  • the acquisition device 7 comprises an optical sensor.
  • the optical sensor is preferably an optical sensor with semiconductors complementary to the metal oxide (better known by the English term CMOS for Complementarity metal-oxide-semiconductor).
  • the optical sensor is chosen to acquire images at a high rate. This makes it possible to follow, if desired, a dynamic of movements within the sample when it includes at least one living cell.
  • the optical sensor is capable of acquiring images at a frequency greater than 100 Hertz and preferably greater than 200 Hertz and preferably greater than 400 Hertz.
  • the optical sensor is chosen to acquire raw images (i.e. at the input of the acquisition device) according to a high signal-to-noise ratio.
  • the optical sensor is capable of acquiring raw images with a signal-to-noise ratio greater than 500 and preferably greater than 800 and preferably greater than 1000.
  • the optical sensor is a camera, and by example a high well capacity camera (better known by the English term “full well capacity”) and for example a CMOS camera and for example a Q-2A750 camera or a Q-2HFW camera both marketed by the company Adimec .
  • the assembly 1 also comprises here a signal processing device (not shown here) emitted by the acquisition device 7 to, for example, generate an image of at least part of the sample.
  • the signal processing device is external to the equipment 2.
  • the signal processing device comprises at least one processing unit such as a processor.
  • the signal processing device includes, for example, a computer.
  • the installation 1 comprises an incubator for a microscope (not shown here) then forming the sample holder for the sample 100.
  • the incubator 1 is for example arranged in the equipment 2 so as to be carried by the stage , the sample 100 being placed directly in the incubator.
  • the incubator is preferably portable so that it can be temporarily returned to the equipment 2.
  • the incubator facilitates the study of samples comprising at least one living cell. Indeed, the incubator makes it possible to keep such samples alive for several days or even several weeks.
  • the incubator is shaped to be able to receive multi-well plates.
  • the incubator is equipped with temperature control within the incubator.
  • the incubator is equipped with a check for the presence of at least one gas in the incubator.
  • the incubator is equipped with a control of the presence of carbon dioxide in the incubator and/or the presence of nitrogen in the incubator and/or the presence of oxygen in the incubator.
  • the incubator is preferably configured to maintain the sample 100 at a given temperature and for example at a temperature substantially equal to 37 degrees Celsius (for example human cells, primates, pork, etc.).
  • the incubator is configured to allow the oxygenation of the sample (in particular by a supply of a nitrogen and dioxygen mixture and an evacuation of carbon dioxide) this oxygenation being ensured by at least the control of the carbon dioxide level. carbon in the incubator.
  • the incubator is configured to manage the humidity level of the sample so that the sample does not dehydrate.
  • the incubator is equipped with a sensor to ensure that the humidity level in the incubator 9 is between 70 and 100%.
  • the incubator here is advantageously a conventional incubator.
  • the incubator is an H201-K incubator marketed by the company Okolab.
  • the interference device will now be detailed.
  • the interference device comprises a base which is fixed with respect to the frame.
  • Said base carries a beam splitter element 10 which is here a non-polarizing beam splitter element 10 (better known by the English acronym NPBS for Non-Polarizing Beamsplitters).
  • the separator element 10 is for example a non-polarizing separator cube, a separating blade non-polarizing...
  • the source 5 is intended to illuminate the separator element 10 via an optical unit 4.
  • the optical unit 4 like the source 5 are arranged in the extension of the separator element 10.
  • the optical unit 4 like the source 5 are here carried by the base and are therefore fixed relative to the element separator 10 and therefore in relation to the frame.
  • the optical unit 4 comprises, inside a housing of the optical unit which is the part of the optical unit 4 fixed to the base, successively between the source 5 and the separator element 10:
  • a first optic 13 (such as for example a single lens, a single doublet or a pair of lenses or a pair of doublets) arranged downstream of the first diaphragm 12,
  • a second optic 15 (such as for example a single lens, a single doublet or a pair of lenses or a pair of doublets) arranged downstream of the second diaphragm 14 and upstream of the separator element 10.
  • the four aforementioned elements are fixed in the casing and are therefore fixed relative to the separator element 10 and therefore relative to the frame.
  • the first optic 13 makes it possible, for example, to reduce the divergence of the rays generated by the source 5. This limits a loss of power of the light radiation generated by the source 5.
  • the first diaphragm 12 is for example an aperture diaphragm.
  • the first diaphragm 12 is arranged in a focal plane of the first optics 13 and preferably in the image focal plane of the first optics 13.
  • the first optics 13 images the source 5 at the image focal plane of the first optics 13 which coincides with the first diaphragm 12.
  • the first diaphragm 12 therefore makes it possible, through its opening, for example to control the degree of spatial incoherence of the source 5 and/or the quantity of light received by the sample 100 and/or the numerical illumination aperture of the installation 1...
  • first diaphragm 12 is also arranged in a focal plane of the second optic 15 and preferably in the object focal plane of the second optic 15. Furthermore, the focal length of the second optic 15 must be less than or equal to the distance separating the first optic 13 from the first diaphragm 12.
  • the second diaphragm 14 is for example a field diaphragm.
  • the second diaphragm 14 makes it possible to restrict the illumination of the sample to illuminate only the portion of the sample which will be imaged by the installation 1 and/or to reduce incoherent reflections.
  • the second diaphragm 14 is arranged in a focal plane of the second optics 15 and preferably in the object focal plane of the second optics 15.
  • diaphragm we mean for this description any organ making it possible to control the passage of light radiation generated by source 5: iris diaphragm, hole in a dedicated wall, etc.
  • upstream of the separator element 10 is thus successively the source 5, the first diaphragm 12, the first optics 13, the second optics 15 and the second diaphragm 14.
  • the first optics 13, the first diaphragm 12, the second optics 15 and the second diaphragm 14 are fixed in the equipment.
  • the source 5 therefore illuminates the separator element 10 (via the optical unit) which makes it possible to define a “lighting arm” of said separator element 10.
  • the separator element 10 makes it possible, following its illumination by the source, to form an arm called the “object arm” which is associated, in operation, with the sample.
  • Source 5 is not on the object arm but is indeed on the lighting arm.
  • the installation 1 comprises a first objective 21 associated with the object arm.
  • the numerical aperture of the first objective 21 is high.
  • “high” we mean a numerical aperture greater than 0.8 and preferably greater than 1 and preferably greater than 1.4 for the present application.
  • the second optics 15 makes it possible to image the source 5 on the focal plane of the objective and for example on the object focal plane of the objective.
  • the first objective 21 is for example part of equipment 2.
  • the sample 100 (or at least the stratum of the sample 100 which we seek to image) is intended to be positioned at one of the foci of the first objective 21 and for example at the image focal point of the first objective 21.
  • the first objective 21 is on the arm ob-j and.
  • the second diaphragm 14 is arranged in a focal plane of the second optic 15, and for example in the object focal plane of the second optic 15.
  • the second diaphragm 14 is conjugated to the sample via the first objective 21 (the sample being at a focus of the first objective 21 and for example at the image focus of the first objective 21).
  • the source 5 is conjugated to a focus of the first objective and for example to the object focus (pupil plane) of the first objective 21 (via the first optic 13.
  • the first objective 21 is arranged so as to observe the sample 100 from below the sample 100.
  • the first objective 21 is arranged under the stage and in the present case under the incubator.
  • the equipment 2 comprises a reflection surface 22 so that a ray passing through the first objective 21 along the optical axis of said first objective 21 can be reflected as far as the separator element 10. This makes it possible to have the first objective vertically.
  • the reflection surface 22 is planar.
  • the reflection surface 22 is a mirror and for example a thick mirror and for example a mirror having a thickness greater than or equal to 3 millimeters and for example a thickness greater than or equal to 4 millimeters.
  • said reflection surface 22 is a plane mirror carried by a prism or else a plane mirror carried by a cube.
  • said reflection surface 22 is arranged so that a ray propagating along the optical axis of the first objective 21 is then propagated, after reflection on the reflection surface 22, to then propagate up to the separator element 10 along the arm ob- j and.
  • the interference device also includes the specular interface 3 previously described arranged between the first objective 21 and here the sample 100.
  • the specular interface 3 is for example part of a glass slide.
  • the specular interface 3 is for example part of the sample holder carrying the sample 100.
  • the specular interface 3 is movable with respect to the first objective 21 and is therefore movable in the frame.
  • the specular interface 3 is associated with at least one member for moving the specular interface 3 relative to the frame and in particular with respect to the first objective 21 (in particular to approach or move back the specular interface 3 of objective 21).
  • the specular interface 3 is carried by a base which is moved via the displacement member.
  • the displacement member is configured to move the specular interface according to at least one translation.
  • the displacement member is configured to move the specular interface 3 according to at least one translation along the optical axis of the first objective 21.
  • the plate and the specular interface 3 are fixed relative to each other.
  • the plate is therefore linked in translation to the specular interface 3: the plate is for this purpose fixed to the base on which the specular interface is also fixed. Consequently, when the specular interface of the first objective 21 is brought closer or further away, the stage (and therefore the sample) is similarly moved closer or further away from the first objective 21.
  • the specular interface 3 is arranged in the equipment 2 so that the distance between the specular interface and the plane imaged by the installation, is here included (limits included) between zero and three times or more the depth of field of the first objective 21 and preferably included (limits inclusive) between zero and two times the depth of field of the first objective 21 and preferably here included (limits included) between zero and one time the depth of field of the first objective 21.
  • the plate + specular interface 3 assembly can advantageously be moved if necessary with respect to the first objective 21 to fulfill this function.
  • the imaged plane is the image focal plane of the first objective 21.
  • the imaged plane may, however, be different from said image focal plane depending on the relative position of the acquisition device 7 in the installation 1.
  • the stratum of the sample 100 that we wish to image is located here in the image focal plane of the first objective 21, we therefore ensure that the distance between said stratum and the specular interface 3 is preferably less than or equal to twice the depth of field. Preferably, we therefore ensure that the distance between said stratum and the specular interface 3 is less than once the depth of field of the first objective 21.
  • the first objective 21 and the specular interface 3 are arranged so that the distance AZ between the image focal plane of the first objective 21 and the face of the specular interface 3 facing the sample 100 is preferably less at twice the depth of field of the first objective 21 ie less than twice
  • AZ is for example between 0 and 5 micrometers. This value interval is not limiting and will mainly depend on the characteristics of the first objective 21. In reality AZ is linked to the maximum wavelength emitted by the light source 5 for which it is still possible to form interference.
  • the specular interface 3 is on the object arm.
  • the specular interface 3 must be sufficiently transparent to allow the light rays to pass through it so that they can reach the sample 100 and leave via the source 5.
  • the specular interface 3 is the element of equipment 2 making it possible to obtain the reference waves.
  • the specular interface 3 is cleverly arranged on the object arm.
  • the equipment 2 thus described does not need a dedicated reference arm thanks to the use of the cleverly placed specular interface 3.
  • equipment 2 here includes a third op- tick 23 arranged at the output of the interference device, that is to say arranged between the separator element 10 and the acquisition device 7.
  • the third optic 23 may be part of the interference device or may not be part of said interference device.
  • the third optic 23 is a single lens, a single doublet or a pair of lenses or a pair of doublets.
  • the acquisition device 7 is arranged in the focal plane of the third optic 23 and for example in the object focal plane of the third optic 23.
  • the optical axis of the acquisition device 7 is perpendicular to the lighting arm.
  • the installation 1 thus described is an improvement of a Linnik interferometer in a Koehler illumination configuration.
  • the installation 1 described it is for example possible to acquire images of cells, but also to visualize cellular activity and to distinguish the metabolic state of a cell.
  • the cells can for example be two-dimensional cultures such as monolayer two-dimensional cultures, three-dimensional cultures such as organoids or many other multilayer three-dimensional cultures...
  • the installation 1 thus described can be used for example for the study of organoids, two-dimensional single-layer cultures, three-dimensional multi-layer cultures, fibroblasts, retinas and corneas, the study of explants. of retinas and corneas of mice, pigs, macaques, etc., quality control of the production of organoids on a large scale, helping in the micro-fluidics field, disease modeling, to carry out effectiveness tests new treatments (gene, pharmaceutical, etc.), for a transplant...
  • the installation 1 described makes it possible to generate a static signal making it possible to visualize the three-dimensional structure of a tissue as well as a dynamic signal making it possible to identify the cells of a tissue and to measure them by example their metabolism.
  • installation 1 is of reduced dimensions due to its absence of a reference arm (and in particular due to the absence of a second objective arranged on the reference arm). Installation 1 can thus be miniaturized.
  • the installation 1 described turns out to be simple in its structure and is therefore easy to implement even with means other than those mentioned above.
  • the acquisition device 7 can be a simple mobile phone equipped with a camera, for example a smart phone or “smartphone”.
  • the acquisition device 7 is then not part of the installation 1.
  • the installation 1 may for example include a location (optionally arranged on the equipment frame) and it will be enough for a user, even inexperienced, to place its phone in the location provided for this purpose to be able to produce high quality imaging simply and quickly.
  • the third optic 23 can optionally also be part of the mobile telephone.
  • Installation 1 is of reduced dimensions due to its absence of a reference arm. Installation 1 can thus be miniaturized.
  • the light source 5 can also be part of the mobile telephone.
  • the processing device can also be part of the mobile telephone.
  • the installation 1 and/or the equipment 2 is manufactured from an existing microscope.
  • the stage, the frame, the reflection surface 3 and the first objective 21 are those of an existing microscope such as for example an inverted microscope.
  • the inverted microscope is a turret microscope.
  • said microscope is modified so that:
  • the specular interface 3 (as well as optionally its associated displacement member) is arranged between the first objective 21 and the plate,
  • the microscope can be a microscope for which optical modules [differential interference contrast module better known by the acronym an- DIG module glass (for Differential Interference Contrast), coherent anti-Stokes Raman scattering module better known by the acronym CARS module (for Coherent AntiStokes Raman Scattering), second harmonic generation module better known by the English acronym module SHG (for Second Harmonic Generation), third harmonic generation module better known by the English acronym THG module (for Third Harmonic Generation), Raman module, one or two photon fluorescence module, etc. have already been developed .
  • optical modules differential interference contrast module better known by the acronym an- DIG module glass (for Differential Interference Contrast), coherent anti-Stokes Raman scattering module better known by the acronym CARS module (for Coherent AntiStokes Raman Scattering), second harmonic generation module better known by the English acronym module SHG (for Second Harmonic Generation), third harmonic generation module better known by the English acronym THG module (for Third Harmonic Generation), Raman module, one or two photon fluorescence
  • the installation 1 can thus easily be coupled to these modules of the prior art, which makes it possible to enrich the imaging possibilities of the sample 100.
  • the associated microscope can be a microscope for which accessories have already been developed so that starting from such a microscope, the installation allows you to benefit from the accessories of the microscope.
  • the aforementioned incubator may be such an accessory of the prior art.
  • the installation 1 was devoid of an additional physical reference arm (the specular interface 3 being carried by the object arm), in the second embodiment the installation 1 also includes a reference arm. additional physical reference. The entire installation which was described according to the first embodiment is therefore also present here.
  • the interference device is thus also capable, in service, of producing optical interference between: • reference waves obtained by reflection of the light emitted by the source 5 on a reflection surface 6 of the additional object arm, and
  • the reflection surface 6 is flat.
  • the reflection surface 6 is for example a mirror.
  • the installation includes a second objective 24.
  • the two objectives 21, 24 are identical and are associated with one of the arms respectively.
  • the two objectives 21, 24 have an identical numerical aperture (better known by the English acronym NA for “numerical aperture”).
  • the numerical aperture of the second objective 24 is high.
  • “high” we mean a numerical aperture greater than 0.8 and preferably greater than 1 for the present application.
  • the second optics 15 makes it possible to image the source 5 on a focal plane of the two objectives and for example on the object focal plane of the two objectives 21, 24.
  • the second objective 24 is part of the interference device.
  • the second objective 24 is arranged at the level of the reflection surface 6.
  • the optical axis of the second objective 24 is for example normal to a plane along which the reflection surface 6 extends.
  • the second objective 24 is arranged so that the reflection surface 6 is in one of the foci of the second objective 24 and for example at the image focal point of the second objective 24.
  • the second objective 24 is therefore on the reference arm.
  • the acquisition device 7, the third optic 23, the interface element 10, the second objective 24 and the reflection surface 6 are an extension of one another.
  • the reflection surface 6 is movable in a translational movement along the optical axis of the second objective 24.
  • the reflection surface 6 is mounted movably in the interference device relative to the frame in order to be able to be moved relative to the second objective 24.
  • the reflection surface 6 is mounted on a base which can be moved in translation opposite the building.
  • the base can be moved in translation with respect to the frame via at least one pi ezo-electric actuator.
  • the reference arm is associated with blocking means (not visible here) of said reference arm in order to temporarily prevent light rays from moving along the reference arm.
  • blocking means for example, a cover or a shutter or a mirror can be temporarily arranged at the level of the separator element 10 or else the separator element 10 can be oriented differently or even the reference arm is mounted on a base which can be moved with respect to the separator element 10...
  • the distance AZ is defined between the imaged plane and the specular interface 3. This distance is preferably less than twice the depth of field of the first objective 21 (or equal to twice the Ion- coherence length of the central wavelength of the source 5 if the depth of field of the first objective is greater than said coherence length).
  • this possibility is primarily used to image the interface strata(s) of the sample 100 or to image samples 100 in two dimensions.
  • the blocking means are then deactivated to allow the light rays to move along the reference arm.
  • the specular interface 3 remains in place in installation 1 and this characteristic is taken into account in the adjustment of the reference arm.
  • the distance AZ is defined between the imaged plane and the reflection surface 6.
  • the imaged plane corresponds to the image focal plane of the second objective 24 (but the imaged plane could correspond to another plane depending on the position of the device acquisition 7 in the installation).
  • This distance AZ is preferably less than at least two times the depth of field of the second objective 24 (or twice the coherence length of the source if the coherence length of the source is less than the depth of field of the second objective ) .
  • this possibility is primarily used to image the sample 100 in the strata furthest from the first objective.
  • the incubator may or may not be part of the installation and/or the acquisition device may or may not be part of the installation and/or the processing device may or may not be part of the installation and/ or the source may or may not be part of the installation and/or the mobile telephone may or may not be part of the installation.
  • the acquisition device may or may not be part of the equipment and/or the processing device may or may not be part of the equipment and/or the source may or may not be part of the equipment.
  • the equipment may not be reversed.
  • the illumination of the sample can thus be carried out from above (the collection of the signal by the first objective then taking place preferably also from above) as well as from below (the collection of the signal by the first objective then taking place preferably from the bottom as well).
  • the optical sensor may be different from what was indicated for example the optical sensor could be a charge-coupled sensor (better known by the English term CCD for Charge-Coupled Device).
  • the optical sensor may be able to work in the visible and/or in another domain such as for example in the infrared.
  • the optical sensor could be a near-infrared image sensor (better known by the English term SWIR sensor for Short-Wave-Infrared).
  • the optical sensor could for example be an InGaAs sensor (for indium-gallium arsenide) or even an InGaAs SWIR sensor.
  • the equipment and/or installation may be shaped so that the optical sensor (and/or the acquisition device) is interchangeable in order, for example, to be able to work in the visible and then to be able to work in a field other than the visible and for example in the infrared.
  • the installation may not include an incubator (portable or not).
  • the installation may include a heating enclosure in which the microscope is at least arranged to be able, for example, to maintain the sample at a given temperature.
  • the microscope could be without a turret.
  • the equipment may be devoid of a reflection surface arranged on the object arm as has been described.
  • the first objective could be in aligning the source.
  • the specular interface may include a particular surface treatment allowing its reflection coefficient to be modified.
  • the specular interface can be temporarily removed from the equipment or can be fixed without the possibility of disassembly of equipment.
  • the specular interface which moves with respect to the first objective
  • the first objective and the specular interface may be at a fixed distance in the frame relative to each other.
  • the specular interface belongs to a glass slide
  • the specular interface could belong to a slide in another material and for example a plastic slide.
  • the specular interface may belong to an element made of glass, plastic or any other material allowing light rays to pass through it, the material being preferably planar and/or smooth.
  • the specular interface may be part of a blade or part of another element shaped differently and for example in a plate or in any other shape allowing the light rays to pass through said specular interface.
  • the specular interface may or may not be integrated into the sample holder, particularly when the latter is a slide (made of glass, plastic, etc.). Although here the specular interface is distinct from the plate, the specular interface can be integrated into the plate.
  • the specular interface is the face of the blade facing the sample
  • the specular interface could be the face of the blade facing the first objective or any other layer inside the blade.
  • the beam splitter element could be polarizing and associated with an additional device ensuring non-polarization (such as delay plates such as quarter-wave plates).
  • the beam splitter element could thus be any splitter element such as a non-polarizing beam splitter element (NPBS), a polarizing beam splitter element, a “Polka dot” type beam splitter element, one or more membranes, etc.
  • NPBS non-polarizing beam splitter element
  • polarizing beam splitter element a polarizing beam splitter element
  • a “Polka dot” type beam splitter element one or more membranes, etc.
  • the installation will be able to overcome the reflection surface 22.
  • the specular interface remains in place in the second configuration, as a variant the specular interface can be temporarily removed from the installation as long as one is placed in the second configuration.

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Abstract

Equipement optique pour une imagerie microscopique de tomographie à cohérence optique en plein champ d'au moins un échantillon, l'équipement comportant un objectif pour l'observation en service de l'échantillon, le dispositif comprenant une interface spéculaire, le dispositif étant ainsi apte en service à permettre la production d'au moins une interférence entre au moins une onde de référence obtenue par réflexion d'une lumière émise par une source lumineuse associée à l'équipement sur l'interface spéculaire, et au moins une onde objet obtenue par rétrodiffusion de la lumière émise par ladite source sur l'échantillon, l'interface spéculaire étant agencée vis-à-vis de l'objectif de sorte que l'onde objet traverse en service ladite interface spéculaire lors de son trajet entre l'échantillon et la source. Installation et procédé correspondants.

Description

Equipement optique pour une imagerie microscopique de tomographie à cohérence optique temporelle en plein champ auto- référencée, installation et procédé associés
L' invention concerne un équipement optique pour une imagerie microscopique de tomographie à cohérence optique et d'au moins un échantillon.
L' invention concerne également une installation et un procédé correspondants.
ARRIERE PLAN DE L' INVENTION
Dans le domaine de l'imagerie optique, la tomographie à cohérence optique (plus connue sous le sigle anglais OCT pour « Optical Coherence Tomography ») permet de pouvoir acquérir des images avec une grande précision et notamment une résolution axiale supérieure a celle pouvant être obtenue avec un microscope confocal.
En particulier, l'imagerie de tomographie à cohérence optique permet :
- d' imager de nombreux composants comme des composants cellulaires ,
- d' imager au sein d'un échantillon en trois dimensions,
- d' imager avec un haut sectionnement optique, indépendamment de l'ouverture numérique du système d'imagerie associé ,
- d' imager de manière non-invasive,
- d' imager sans marqueur.
L' imagerie de tomographie à cohérence optique temporelle consiste à mesurer le signal inter férométrique entre un signal d'une lumière rétrodif fusée par un échantillon lorsqu'il est éclairé par une source avec un signal lumineux de référence émis par cette même source et s'étant propagé sur la même distance optique.
L' imagerie de tomographie à cohérence optique en plein champ permet de paralléliser ce principe de manière que le signal interf érométrique atteigne un capteur de type caméra (CMOS, CDD ...) afin d'obtenir en sortie une image en deux dimensions .
Le document FR 2 817 030 décrit un exemple de système d'imagerie microscopique interf érentielle a cohérence optique plein champ.
Deux grandes déclinaisons de l' imagerie de tomographie à cohérence optique en plein champ existent :
- l'imagerie de tomographie à cohérence optique en plein champ statique (plus connue sous le sigle FFOCT pour « Full-Field Optical Coherence Tomography » statique) c'est-à-dire de l'imagerie dite « statique » qui se base sur différentes approches pour isoler le signal interféro- métrique entre le champ de référence et le champ de l'échantillon ;
- l'imagerie de tomographie à cohérence optique temporelle plein champ dynamique (plus connue sous le sigle D-FFOCT pour « Dynamic FFOCT ») qui se base sur l'analyse temporelle du signal généré par FFOCT statique ce qui permet de quantifier l'évolution temporelle du signal généré par FFOCT statique.
Ainsi, en utilisant ces deux déclinaisons, il est tout aussi bien possible de distinguer des structures morphologiques dans un échantillon (comme les fibres de collagènes, les cellules et leurs noyaux, ...) - par imagerie statique - tout comme des éléments métaboliques qui composent un tissu d'une desdites structures d'un même échantillon (comme les organelles d'une cellule (mitochondries par exemple) et/ou l'état métabolique général d'une de ces structures et notamment les cellules et noyaux - par imagerie dynamique.
L' imagerie de tomographie à cohérence optique plein champ s'avère particulièrement avantageuse pour réaliser de l'imagerie non-invasive de structure en trois dimensions permettant de mettre en œuvre de multiples applications : l'étude d' organoïdes , la modélisation de maladies, la pose d'un diagnostic cancéreux ...
En effet, l'imagerie FFOCT - statique et D-FFOCT permettent d'obtenir de nombreuses informations sur le fonctionnement du vivant grâce à la particularité de son signal, tout en étant non-invasive et non-destructive.
Plus précisément, l'imagerie FFOCT - statique et D-FFOCT permet d'obtenir une amplification locale - décorrélée spatialement - du signal rétrodiffusé au sein de l'échantillon (généralement un volume en trois dimensions) ainsi qu'une information de phase locale associée et ce avec une résolution transverse similaire à celle pouvant être obtenue par microcopie confocale et avec une résolution axiale supérieure à celle pouvant être obtenue par microcopie confocale. Ainsi les imageries FFOCT - statique et D-FFOCT sont sensibles aux faibles objets diffuseurs et aux faibles mouvements longitudinaux.
De plus, l'imagerie FFOCT - statique et D-FFOCT permet de limiter grandement la présence de tavelures (plus connues sous le terme anglais de « speckles ») par rapport à des techniques d' imagerie analogue ayant une résolution de phase (microscopie diffusante interf érentielle, microscopie holographique ...) . Ceci permet une interprétation directe de l'objet étudié.
En outre, l'imagerie FFOCT - statique et l'imagerie D-FFOCT sont pratiquement insensibles aux aberrations spatiales, permettant d' imager au sein de structures en trois dimensions .
L'imagerie FFOCT - statique et l'imagerie D-FFOCT permettent ainsi de détecter de petits organes - tels que des constituants sub-cellulaires - au sein de structures en trois dimensions plus complexes, comme des tissus, et ce même sans marquage. De plus dans le contexte particulier de l' imagerie D-FFCOT, il est possible, par analyse temporelle des signaux obtenus, de faire ressortir d'autre contrastes liés par exemple a une activité cellulaire (comme par exemple une activité cellulaire des organelles et par exemple les mitochondries, les microvésicules ...) .
Cependant, avec l'imagerie FFOCT - statique et l'imagerie D-FFOCT, dans le contexte d'imagerie en conditions ex-vivo ou in vitro, lorsque l'on souhaite imager des strates des échantillons les plus proches d'une face du porte- échantillon sur laquelle repose l'échantillon (conventionnellement le porte-échantillon étant une lame de verre ou une lame en plastique) des artéfacts d'interférence optiques apparaissent. Ces artefacts, que l'on appelle aussi parfois « artefacts d'interface » ou « artefacts de franges », gênent fortement l'étude des échantillons ou l'empêchent totalement.
Cet inconvénient est augmenté dans le cas de la microscopie inversée (on rappelle qu'un microscope inversé est un microscope dans lequel un échantillon est observé par le dessous) . On précise par ailleurs qu'une strate est une coupe en deux dimensions de l'échantillon selon un plan de coupe dans l'épaisseur de l'échantillon i.e. selon un plan de coupe parallèle a la face du porte-échantillon sur laquelle repose échantillon.
En conséquence, l'imagerie FFOCT - statique et l'imagerie D-FFOCT ne sont usuellement pas utilisées pour imager ces strates proches de cette surface, et notamment dans le cas d'études d'échantillons de très faibles épaisseurs tels que par exemple des échantillons de cultures cellulaires en deux dimensions. Or, la culture cellulaire en deux dimensions reste très majoritairement celle utilisée dans la modélisation de maladies et le développement de médicaments malgré l'émergence de la culture cellulaire en trois dimensions. De plus, l'étude d'éléments en transition d'une structure en trois dimensions à faible épaisseur à une structure en trois dimensions à plus forte épaisseur est clef dans certaines applications, comme par exemple pour l'étude des organoïdes intestinaux. Or l'imagerie FFOCT - statique et l'imagerie D-FFOCT semble délicate à utiliser pour l'imagerie de cette dernière configuration.
OBJET DE L' INVENTION
L' invention a notamment pour but de permettre une imagerie microscopique de tomographie à cohérence optique en plein champ qui permette de limiter l'apparition d'artefacts optiques lors de l'imagerie d'au moins un échantillon.
RESUME DE L’INVENTION
A cet effet, on prévoit un procédé d'imagerie microscopique de tomographie a cohérence optique en plein champ d'au moins un échantillon, le procédé comprenant les étapes de :
- émettre une lumière se propageant dans un bras objet d'une installation dans laquelle est agencée l'échantillon de sorte que la lumière se rétrodiffuse dans l'échantillon pour produire une onde objet,
- générer au moins une interférence entre l'onde objet et une onde de référence.
Selon l'invention, l'onde de référence est générée par réflexion de la lumière sur une interface spéculaire agencée sur le bras objet.
Les inventeurs ont pu constater qu'un tel procédé permettait de pouvoir imager l'échantillon en évitant au maximum les artefacts optiques et même en supprimant totalement les artefacts optiques présents avec les dispositifs FFOCT - statique et D-FFOCT usuels, et notamment les artefacts de frange .
Cet avantage est encore augmenté lorsque l'on souhaite imager :
- une des strates d'un échantillon de faible épaisseur (comme indiqué ci-dessus une strate étant une coupe en deux dimensions de l'échantillon selon un plan de coupe dans l'épaisseur de l'échantillon i.e. un plan de coupe parallèle à une face du porte-échantillon sur lequel repose l'échantillon) ; l'échantillon étant par exemple un échantillon d'une culture cellulaire en deux dimensions, un échantillon de graphène ... et de manière plus générale un échantillon présentant une épaisseur inférieure à 15 micromètres, et par exemple inférieure à 10 micromètres, et par exemple inférieure à 5 micromètres ;
- une ou des strates d'interface d'un échantillon d'épaisseur plus importante (comme un organoïde par exemple) , c'est-à-dire les strates les plus proches d'une face d'un élément portant l'échantillon (lame de verre, lame plastique, incubateur ...) .
L'invention se base sur le principe général de l'imagerie FFOCT mais améliore ce principe en étant « auto- référencée » : en effet l'invention fonctionne sans bras de référence spécifique comme dans les dispositifs FFOCT de l'art antérieur puisque l'onde de référence est générée à partir de l'interface spéculaire qui se trouve également astucieusement placée sur le trajet de l'onde objet.
Par ailleurs, la position particulière de l'interface spéculaire permet un alignement automatique entre un champ de référence (lié à l'onde de référence) et un champ objet (lié à l'onde objet) .
On obtient ainsi automatiquement une interférence entre l'onde de référence et l'onde objet.
Cette interférence est par ailleurs homogène. Cette interférence est par ailleurs de très bonne qualité puisque sans aberration optique.
L'invention peut en outre être mise en œuvre par une installation de structure simple.
De plus l'invention s'avère ainsi moins sensible aux vibrations que les dispositifs FFOCT statique et dynamique de l'art antérieur du fait que les ondes de référence et les ondes objet se propagent selon le même bras objet et que l'interface spéculaire se trouve ainsi à une distance moins importante de l'échantillon (par exemple l'interface spéculaire se trouve à une distance comprise entre 0 et 15 micromètres) .
L' invention peut ainsi permettre de créer une mosaïque uniforme (une mosaïque étant un assemblage de N images acquises de différentes zones d'une même strate d'un échantillon donné) c'est-à-dire sans artefacts de recouvrement entre deux images de la mosaïque accolée.
En outre, l'invention peut être mise en œuvre dans une installation miniaturisée selon l'application visée. Entre autres, l'invention n'utilise qu'un seul objectif du fait de son auto-réf érençage .
L'invention peut avantageusement être mise en œuvre dans des environnements bruyants comme par exemple sur un véhicule (terrestre, aérien, maritime ...) une chaine de production, etc.
L' invention peut en outre être associée :
- a des éléments technologiquement pointus dans le domaine de l'imagerie (faisant ou non partie de l'invention) tels que par exemple un objectif à haute ouverture numérique (plus connue sous l'acronyme anglais NA pour « numerical aperture ») ;
- à des éléments technologiquement peu pointus dans le domaine de l' imagerie (faisant ou non partie de l'invention) tel que par exemple un téléphone portable :
• muni d'une caméra pour acquérir des images de l'échantillon après interférence des ondes, et/ou
• muni d'un éclairage (par exemple diode électroluminescente, communément désignée par l'acronyme anglais LED, et notamment LED flash) pour jouer le rôle de la source lumineuse, et/ou
• muni d'un organe de traitement (par exemple un processeur) pour traiter le ou les signaux d' interférence.
Optionnellement, l'invention est également configurée pour effectuer de l'imagerie microscopique de tomographie a cohérence optique en plein champ dynamique.
A cet effet, le procédé comporte une étape supplémentaire pour étudier l'évolution temporelle d'un signal résultant ou de la ou des interférences entre les ondes de références et les ondes objet.
Le procédé permet de pouvoir réaliser de l'imagerie FFOCT- statique tout comme de l'imagerie D-FFOCT.
Le procédé est configuré pour réaliser de l' imagerie microscopique de tomographie à cohérence optique temporelle. Ainsi le procédé permet par exemple tout aussi bien de pouvoir regarder des éléments morphologiques dans un échantillon (comme les fibres de collagènes, les cellules et leurs noyaux) - imagerie statique - tout comme des éléments métaboliques qui composent un tissu des éléments d'un même échantillon (comme les organelles d'une cellule (mitochondries par exemple) ) et/ou l'état métabolique général d'un de ces éléments et notamment les cellules et noyaux - imagerie dynamique. Les éléments peuvent par exemple être des cellules, des structures et notamment des structures subcellulaires telles que des noyaux, des mitochondries, des pigments ...
Il est par ailleurs rappelé que l' invention est moins sen- sible aux vibrations que les dispositifs FFOCT statique et dynamique de l'art antérieur.
Cet aspect est particulièrement intéressant si l'invention est utilisée dans un contexte d'imagerie D-FFOCT.
En effet, les dispositifs d'imagerie D-FFOCT de l'art antérieur sont difficilement déployables en dehors des laboratoires d'optique alors que l'invention peut être implantée dans des environnements sollicitant et/ou bruyant (un environnement bruyant étant un environnement soumis à des vibrations mécaniques) .
Pour la présente demande par « bras objet » on entend la partie de l'installation située entre l'échantillon et un élément optique permettant de générer les interfaces comme par exemple un élément optique séparateur de faisceaux (un rayon lumineux pouvant ainsi se propager dans ledit bras objet suivant un chemin optique donné) .
Optionnellement, l' interface spéculaire est agencée de sorte à se trouver à une distance donnée d'un plan imagé par l'installation, distance qui est supérieure ou égale a zéro et inférieure ou égale :
- à deux fois une profondeur de champ d'un objectif de l'installation destiné à observer l'échantillon, ou
- à deux fois une longueur de cohérence temporelle d'une source lumineuse générant la lumière si la longueur de cohérence est inférieure à la profondeur de champ de 1 ' obj ectif .
Par « plan imagé » (que l'on peut aussi appeler « plan image ») , on entend un plan qui est imagé sur un dispositif d'acquisition (faisant ou non partie de l'invention) , dispositif adapté pour acquérir au moins un signal résultant des interférences entre les ondes de références et les ondes objet. Le « plan imagé » correspond donc à l'une des strates de l'échantillon conjugué au dispositif d' acquisition .
La « profondeur de champ de l'objectif » est définie par 2À / NA2 (avec À la longueur d'onde centrale de la lumière émise par la source) et NA l'ouverture numérique de 1' obj ectif ) .
La « longueur de cohérence temporelle » Lc est définie comme la largeur à mi-hauteur de la fonction d'autocorrélation du spectre du ou des interférences. Par exemple, pour une source de spectre de distribution gaussienne, elle s'écrit : Lc = V2 ln2 A2 / miAA (avec n l'indice de réfraction du milieu dans lequel baigne l'échantillon) .
Le procédé s'avère ainsi particulièrement efficace pour l'imagerie de strates distances de zéro à deux fois 2À / NA2 de l'interface spéculaire.
L'invention concerne également, un équipement optique pour une imagerie microscopique de tomographie à cohérence optique en plein champ d'au moins un échantillon, l'équipement comportant un objectif pour l'observation en service de l'échantillon, le dispositif comprenant une interface spéculaire, le dispositif étant ainsi apte en service à permettre la production d'au moins une interférence entre :
• au moins une onde de référence obtenue par réflexion d'une lumière émise par une source lumineuse associée à l'équipement sur l'interface spéculaire, et
• au moins une onde objet obtenue par rétrodiffusion de la lumière émise par ladite source sur l'échantillon, l'interface spéculaire étant agencée vis-à-vis de l'objectif de sorte que l'onde objet traverse en service ladite interface spéculaire lors de son trajet entre l'échantillon et la source.
Optionnellement, l' interface spéculaire est agencée de sorte à se trouver à une distance donnée d'un plan imagé par l'installation, distance qui est supérieure ou égale à zéro et inférieure ou égale :
- à deux fois une profondeur de champ de l'objectif, ou
- à deux fois une longueur de cohérence temporelle de la source lumineuse si la longueur de cohérence temporelle est inférieure à la profondeur de champ de 1 ' obj ectif .
Optionnellement, l'interface spéculaire de l'équipement appartient à une lame de verre ou une lame en plastique. Avantageusement, la source fait partie de l'équipement.
Avantageusement encore, l'équipement comprend un dispositif d'acquisition adapté pour acquérir au moins un signal résultant des interférences entre les ondes de références et les ondes objet.
L'équipement selon l'invention peut être également configuré pour permettre une imagerie microscopique de tomographe a cohérence optique en plein champ dynamique.
L'équipement conforme à l'invention peut comprendre en outre un incubateur destiné à recevoir l'échantillon.
Avantageusement, la source de l'équipement éclaire un élément séparateur de faisceaux de l' installation à travers un bloc optique comprenant au moins une optique et au moins un diaphragme .
De manière avantageuse, l'interface spéculaire fait partie du porte-échantillon. De manière plus avantageuse encore, l'interface spéculaire est une face du porte-échantillon tournée en service vers l'échantillon.
L'invention concerne également une installation comprenant un équipement tel que précité.
Optionnellement, l'installation comporte un bras de référence, l' installation étant ainsi apte en service à permettre également la production d'au moins une interférence entre : • au moins une onde de référence obtenue par réflexion de la lumière émise par la source lumineuse sur une surface de réflexion du bras de référence additionnel, et
• au moins une onde objet obtenue par rétrodiffusion de la lumière émise par ladite source sur l'échantillon, l'installation comprenant des moyens de blocage du bras de référence .
Ces moyens de blocage du bras de référence peuvent être temporaires .
Une partie au moins de l'installation selon l'invention peut être intégrée à un téléphone portable.
Ainsi lorsque l'on souhaite imager l'échantillon on peut soit avoir recours à la création d' interférence par l'interface spéculaire (les moyens de blocage empêchant les trajets lumineux vers et provenant du bras de référence) soit avoir recours à la création d' interférence par la surface de réflexion (les moyens de blocage étant alors inactifs) .
L'installation permet ainsi de profiter avantageusement et de manière simple de deux technologies différentes pour imager au mieux un échantillon.
Optionnellement, l'installation est configurée pour effectuer de l'imagerie microscopique de tomographie à cohérence optique en plein champ dynamique.
Ainsi il est possible de mettre en œuvre de l'imagerie FFOCT tout comme de l'imagerie D-FFOCT lorsque l'on a recours au bras de référence, afin d'augmenter la profondeur d' imagerie .
De par sa structure simple, l'équipement peut avantageusement être implanté relativement simplement dans des installations FFOCT statique ou dynamique déjà existantes.
Pour la présente demande par « bras de référence » on entend la partie de l' installation située entre la surface de réflexion et un élément optique permettant de générer les interfaces (un rayon lumineux pouvant ainsi se propager dans ledit bras de référence suivant un chemin optique donné) .
Pour la présente demande par « bras d' éclairage » on entend la partie de l'installation située entre la source et l'élément optique permettant de générer les interfaces (un rayon lumineux pouvant ainsi se propager dans ledit bras objet suivant un chemin optique donné) .
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront à la lecture de la description qui suit de modes de réalisation particuliers et non limitatifs de 1 ' invention .
BREVE DESCRIPTION DES DESSINS
Il sera fait référence aux dessins annexés parmi lesquels : [Fig. 1] la figure 1 est une vue schématique d'un équipement selon un premier mode de réalisation de l'invention ; [Fig. 2a] la figure 2a est une vue schématique d'un équipement selon un deuxième mode de réalisation de l'invention lorsqu'un bras de référence dudit équipement est bloqué ;
[Fig. 2b] la figure 2b est une vue schématique de l'équipement illustré à la figure 2a lorsque le bras de référence est fonctionnel.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L' INVENTION
En référence à la figure 1, l'installation 1 selon un premier mode de réalisation de l'invention est configurée pour réaliser de l'imagerie microscopique de tomographie à cohérence optique en plein champ statique et dynamique notamment au niveau d'une ou des strates d' interface d'un échantillon 100 (quelle que soit l'épaisseur de l'échantillon 100) . L'échantillon 100 est porté par un porte-échantillon. Le porte-échantillon est par exemple une lame de verre, une lame de plastique, un incubateur ...
L'installation 1 comporte en outre un équipement 2 optique qui est configuré pour permettre l'observation de l'échantillon 100, ici par le dessous de l'échantillon 100. L'équipement 2 comporte par ailleurs un bâti (non représenté ici) et une platine (non représentée ici) destinée à porter le porte-échantillon avec l'échantillon 100 à observer, la platine étant déplaçable en translation vis-à-vis du bâti selon au moins deux axes de translation.
L'équipement comprend par ailleurs un dispositif d' interférence qui comporte ici une source 5 et une interface spéculaire 3, le dispositif d'interférence étant ainsi apte, en service, à produire des interférences optiques entre :
• des ondes de référence obtenues par réflexion de la lumière émise par la source 5 sur l'interface spéculaire 3, et
• des ondes objet obtenues par rétrodiffusion de la lumière émise par ladite source 5 sur l'échantillon.
La source 5 est une source qui est dite spatialement incohérente .
La source 5 est par exemple une lampe halogène ou bien une diode électroluminescente (plus connue sous l'acronyme LED) ou bien encore un bloc formé d'une source spatialement cohérente (la source cohérente étant par exemple un laser) et d'une structure traversée par les rayons en sortie de la source spatialement cohérente, structure permettant de rendre lesdits rayons spatialement incohérents en sortie de la structure (et donc du bloc) . La structure est par exemple munie d'une cavité de type multimode, d'une fibre multimode, d'un bâtonnet hexagonal ...
La source 5 est ici une source temporellement incohérente soit une source de faible longueur de cohérence temporelle (soit par exemple dans une gamme de 0.5 à 15 micromètres et de préférence de 1 à 10 micromètres) . On comprend donc que même si la source 5 est dite temporellement incohérente, il est toujours possible de lui définir une longueur de cohérence (cette longueur sera cependant faible) .
L'installation comporte par ailleurs ici un dispositif d'acquisition 7. Dans le cas présent, le dispositif d'acquisition 7 fait partie de l'équipement. Le dispositif d'acquisition 7 permet l'acquisition d'au moins un signal résultant des interférences entre les ondes de référence et les ondes objet.
A cet effet, le dispositif d'acquisition 7 comporte un capteur optique. Le capteur optique est de préférence un capteur optique à semi-conducteurs complémentaires à l'oxyde de métal (plus connu sous le terme anglais de CMOS pour Complementarity metal-oxide-semiconductor ) .
De préférence, le capteur optique est choisi pour acquérir des images à une cadence élevée. Ceci permet de pouvoir suivre, si voulu, une dynamique de mouvements au sein de l'échantillon lorsque celui-ci comporte au moins une cellule vivante. Par exemple le capteur optique est apte à acquérir des images à une fréquence supérieure à 100 Hertz et de préférence supérieure à 200 Hertz et de préférence supérieure à 400 Hertz.
De préférence, le capteur optique est choisi pour acquérir des images brutes (i.e. à l'entrée du dispositif d'acquisition) selon un rapport signal sur bruit important. Ceci permet au capteur optique d'être sensible mêmes a des structures du vivant très petites et/ou à des mouvements même très petits. Par exemple le capteur optique est apte à acquérir des images brutes avec un rapport signal sur bruit supérieur à 500 et de préférence supérieur à 800 et de préférence supérieur à 1000.
Par exemple le capteur optique est une caméra, et par exemple une caméra à haute capacité de puits (plus connue sous le terme anglais de « full well capacity ») et par exemple une caméra CMOS et par exemple une caméra Q-2A750 ou une caméra Q-2HFW toutes les deux commercialisées par la société Adimec.
L'ensemble 1 comporte par ailleurs ici un dispositif de traitement du signal (non représenté ici) émis par le dispositif d'acquisition 7 pour par exemple générer une image d'au moins une partie de l'échantillon. Dans le cas présent, le dispositif de traitement du signal est externe à l'équipement 2. Le dispositif de traitement du signal comporte au moins une unité de traitement tel qu'un processeur. Le dispositif de traitement du signal comporte par exemple un ordinateur.
De préférence, l' installation 1 comporte un incubateur pour microscope (non représenté ici) formant alors le porte- échantillon de l'échantillon 100. L'incubateur 1 est par exemple agencé dans l'équipement 2 de sorte à être porté par la platine, l'échantillon 100 étant placé directement dans l'incubateur.
L'incubateur est de préférence portable pour pouvoir être rapporté de manière temporaire dans l'équipement 2.
L'incubateur permet de faciliter l'étude d'échantillons comprenant au moins une cellule vivante. En effet, l'incubateur permet de garder de tels échantillons en vie sur plusieurs jours voire plusieurs semaines.
De préférence, l' incubateur est conformé pour pouvoir recevoir des plaques multi-puits.
De préférence, l'incubateur est équipé d'un contrôle de la température au sein de l'incubateur.
Ceci permet par exemple d'éviter un réchauffement de l'échantillon 100 ce qui pourrait altérer ou détruire l'échantillon 100. De préférence, l'incubateur est équipé d'un contrôle de la présence d'au moins un gaz dans l'incubateur. Par exemple, l'incubateur est équipé d'un contrôle de la présence de dioxyde de carbone dans l'incubateur et/ou de la présence d'azote dans l'incubateur et/ou de la présence de dioxygène dans l'incubateur.
Dans le cas où l'échantillon comprend des cellules vivantes, l'incubateur est de préférence configuré pour maintenir l'échantillon 100 à une température donnée et comme par exemple à une température sensiblement égale à 37 degrés Celsius (pour par exemple des cellules humaines, de primates, de porc ...) . De préférence l' incubateur est configuré pour permettre l'oxygénation de l'échantillon (notamment par un apport d'un mélange azote et dioxygène et une évacuation du dioxyde de carbone) cette oxygénation étant assurée par au moins le contrôle du taux de dioxyde de carbone dans l'incubateur. De préférence, l'incubateur est configuré pour permettre de gérer le taux d'humidité de l'échantillon afin que l'échantillon ne se déshydrate pas. Par exemple l'incubateur est muni d'un capteur permettant de s'assurer que le taux d'humidité dans l'incubateur 9 soit compris entre 70 et 100%.
L' incubateur est avantageusement ici un incubateur conventionnel. Par exemple l'incubateur est un incubateur H201-K commercialisé par la société Okolab.
Le dispositif d'interférence va être à présent détaillé.
Le dispositif d'interférence comprend une embase qui est fixe vis-à-vis du bâti.
Ladite embase porte un élément séparateur 10 de faisceaux qui est ici un élément séparateur 10 de faisceaux non polarisant (plus connu sous le sigle anglais NPBS pour Non- Polarizing Beamsplitters) . L'élément séparateur 10 est par exemple un cube séparateur non polarisant, une lame sépara- trice non polarisante ...
La source 5 est destinée à éclairer l'élément séparateur 10 par l'intermédiaire d'un bloc optique 4.
Dans le cas présent, le bloc optique 4 comme la source 5 sont agencés dans le prolongement de l'élément séparateur 10. Le bloc optique 4 comme la source 5 sont ici portés par l'embase et sont donc fixes par rapport à l'élément séparateur 10 et donc par rapport au bâti.
Le bloc optique 4 comporte, à l' intérieur d'un carter du bloc optique qui est la partie du bloc optique 4 fixée à l'embase, successivement entre la source 5 et l'élément séparateur 10 :
- un premier diaphragme 12 agencé en aval de la source 5,
- une première optique 13 (comme par exemple une unique lentille, un unique doublet ou bien un couple de lentilles ou bien un couple de doublets) agencée en aval du premier diaphragme 12,
- un deuxième diaphragme 14 agencé en aval de la première optique 13,
- une deuxième optique 15 (comme par exemple une unique lentille, un unique doublet ou bien un couple de lentilles ou bien un couple de doublets) agencée en aval du deuxième diaphragme 14 et en amont de l'élément séparateur 10.
Les quatre éléments précités sont fixes dans le carter et sont donc fixes par rapport à l'élément séparateur 10 et donc par rapport au bâti.
La première optique 13 permet par exemple de réduire la divergence des rayons générés par la source 5. On limite ainsi une perte de puissance du rayonnement lumineux généré par la source 5.
Le premier diaphragme 12 est par exemple un diaphragme d'ouverture. Le premier diaphragme 12 est agencé dans un plan focal de la première optique 13 et de préférence dans le plan focal image de la première optique 13. Ainsi la première optique 13 image la source 5 au plan focal image de la première optique 13 qui coïncide avec le premier diaphragme 12. On retient ainsi que la source 5 est conjuguée au premier diaphragme 12 par l'intermédiaire de la première optique 13. Le premier diaphragme 12 permet donc, par son ouverture, par exemple de contrôler le degré d'incohérence spatial de la source 5 et/ou la quantité de lumière reçue par l'échantillon 100 et/ou l'ouverture numérique d'illumination de l'installation 1 ... Par ailleurs, le premier diaphragme 12 est également agencé dans un plan focal de la deuxième optique 15 et de préférence dans le plan focal objet de la deuxième optique 15. Par ailleurs, la focale de la deuxième optique 15 doit être inférieure ou égale a la distance séparant la première optique 13 du premier diaphragme 12.
Le deuxième diaphragme 14 est par exemple un diaphragme de champ. Le deuxième diaphragme 14 permet de restreindre l'illumination de l'échantillon pour n'illuminer que la portion de l'échantillon qui sera imagée par l'installation 1 et/ou de réduire les réflexions incohérentes. Le deuxième diaphragme 14 est agencé dans un plan focal de la deuxième optique 15 et de préférence dans le plan focal objet de la deuxième optique 15.
Pour la présente demande, les notions de « amont » et « aval » s'entendant selon le sens de circulation de la lumière .
Par « diaphragme » on entend pour la présente description tout organe permettant de contrôler le passage du rayonnement lumineux généré par la source 5 : diaphragme à iris, trou dans une paroi dédiée ...
Dans l'exemple illustré, en amont de l'élément séparateur 10 se trouve ainsi successivement la source 5, le premier diaphragme 12, la première optique 13, la deuxième optique 15 et le deuxième diaphragme 14.
Comme déjà indiqué, la première optique 13, le premier diaphragme 12, la deuxième optique 15 et le deuxième diaphragme 14 sont fixes dans l'équipement.
La source 5 vient donc éclairer l'élément séparateur 10 (via le bloc optique) ce qui permet de définir un « bras d'éclairage » dudit élément séparateur 10.
Par ailleurs, l'élément séparateur 10 permet, suite à son éclairement par la source, de former un bras dit « bras objet » qui est associé, en fonctionnement, à l'échantillon. La source 5 n'est pas sur le bras objet mais est bien sur le bras d'éclairage.
Par ailleurs, l'installation 1 comprend un premier objectif 21 associé au bras objet.
De préférence, l'ouverture numérique du premier objectif 21 est haute. Par « haute » on entend une ouverture numérique supérieure à 0.8 et de préférence supérieure à 1 et de préférence supérieure à 1.4 pour la présente demande.
On retient que la deuxième optique 15 permet d' imager la source 5 sur le plan focal de l'objectif et par exemple sur le plan focal objet de l'objectif.
Le premier objectif 21 fait par exemple partie de l'équipement 2.
L'échantillon 100 (ou du moins la strate de l'échantillon 100 que l'on cherche à imager) est destiné à être positionné à l'un des foyers du premier objectif 21 et par exemple au foyer image du premier objectif 21.
En conséquence, le premier objectif 21 est sur le bras ob- j et .
De préférence, le deuxième diaphragme 14 est agencé dans un plan focal de la deuxième optique 15, et par exemple dans le plan focal objet de la deuxième optique 15. Ainsi le deuxième diaphragme 14 est conjugué à l'échantillon par l'intermédiaire du premier objectif 21 (l'échantillon étant a un foyer du premier objectif 21 et par exemple au foyer image du premier objectif 21) . Par ailleurs, la source 5 est conjuguée à un foyer du premier objectif et par exemple au foyer objet (plan pupille) du premier objectif 21 (par l'intermédiaire de la première optique 13.
Du fait que l'équipement est ici à « observation inversée », le premier objectif 21 est agencé de sorte à observer l'échantillon 100 par le dessous de l'échantillon 100. Par exemple le premier objectif 21 est agencé sous la platine et dans le cas présent sous l'incubateur.
L'équipement 2 comporte une surface de réflexion 22 de sorte qu'un rayon traversant le premier objectif 21 selon l'axe optique dudit premier objectif 21 puisse être réfléchi jusqu'à l'élément séparateur 10. Ceci permet d'avoir le premier objectif à la verticale.
Typiquement, la surface de réflexion 22 est plane. Par exemple, la surface de réflexion 22 est un miroir et par exemple un miroir épais et par exemple un miroir présentant une épaisseur supérieure ou égale à 3 millimètres et par exemple une épaisseur supérieure ou égale à 4 millimètres. De préférence ladite surface de réflexion 22 est un miroir plan porté par un prisme ou bien un miroir plan porté par un cube.
Dans le cas présent, ladite surface de réflexion 22 est agencée de sorte qu'un rayon se propageant selon l'axe optique du premier objectif 21 soit ensuite propagé, après réflexion sur la surface de réflexion 22, pour se propage ensuite jusqu'à l'élément séparateur 10 le long du bras ob- j et .
Le dispositif d'interférence comporte par ailleurs l'interface spéculaire 3 précédemment décrite agencée entre le premier objectif 21 et ici l'échantillon 100.
L'interface spéculaire 3 fait par exemple partie d'une lame de verre. L'interface spéculaire 3 fait par exemple partie du porte-échantillon portant l'échantillon 100.
De préférence, l' interface spéculaire 3 est déplaçable vis- à-vis du premier objectif 21 et est donc déplaçable dans le bâti .
A cet effet, l'interface spéculaire 3 est associée à au moins un organe de déplacement de l'interface spéculaire 3 relativement au bâti et notamment vis-à-vis du premier objectif 21 (en particulier pour approcher ou reculer l'interface spéculaire 3 de l'objectif 21) . Par exemple l'interface spéculaire 3 est portée par un piètement qui est déplacé via l'organe de déplacement. Par exemple l'organe de déplacement est configuré pour déplacer l'interface spéculaire selon au moins une translation. Par exemple l'organe de déplacement est configuré pour déplacer l'interface spéculaire 3 selon au moins une translation le long de l'axe optique du premier objectif 21.
Préférentiellement la platine et l'interface spéculaire 3 sont fixes l'une par rapport à l'autre. Ici la platine est donc liée en translation à l'interface spéculaire 3 : la platine est à cet effet fixée au piètement sur lequel est également fixée l'interface spéculaire. En conséquence, lorsque l'on rapproche, ou éloigne, l'interface spéculaire du premier objectif 21, la platine (et donc l'échantillon) et de manière identique rapprochée ou éloignée du premier objectif 21.
Par ailleurs, l'interface spéculaire 3 est agencée dans l'équipement 2 de sorte que la distance entre l' interface spéculaire et le plan imagé par l'installation, soit ici comprise (bornes incluses) entre zéro et trois fois ou plus la profondeur de champ du premier objectif 21 et de préférence compris (bornes incluses) entre zéro et deux fois la profondeur de champ du premier objectif 21 et de préférence soit ici compris (bornes incluses) entre zéro et une fois la profondeur de champ du premier objectif 21.
A cet effet, on peut avantageusement déplacer si besoin l'ensemble platine + interface spéculaire 3 vis-à-vis du premier objectif 21 pour remplir cette fonction.
Dans un cas particulier, le plan imagé est le plan focal image du premier objectif 21. Le plan imagé pourra toutefois être différent dudit plan focal image selon la position relative du dispositif d'acquisition 7 dans l'installation 1.
La strate de l'échantillon 100 que l'on souhaite imager se situant ici dans le plan focal image du premier objectif 21, on s'assure donc que la distance entre ladite strate et l'interface spéculaire 3 soit de préférence inférieure ou égale à deux fois la profondeur de champ. De préférence, on s'assure donc que la distance entre ladite strate et l'interface spéculaire 3 soit inférieure à une fois la profondeur de champ du premier objectif 21.
Ceci permet que l'interface spéculaire 3 puisse servir de champ de référence pour les ondes de références.
Dans le cas où la source 5 émet des rayons lumineux selon une distribution spectrale obéissant à une loi gaussienne, on peut définir Ào la longueur d'onde centrale de ladite distribution et AA la largueur spectrale de ladite définition .
Dans ce cas, on agence le premier objectif 21 et l'interface spéculaire 3 de sorte que la distance AZ entre le plan focal image du premier objectif 21 et la face de l'interface spéculaire 3 tournée vers l'échantillon 100 soit de préférence inférieure à deux fois la profondeur de champ du premier objectif 21 i.e. inférieure à deux fois
2Ào / NA2 (avec NA le champ d'ouverture du premier objectif 21) .
On note que dans le cas où la profondeur de champ serait supérieure à la longueur de cohérence Lc de la longueur d'onde centrale de la source lumineuse 5, alors la distance AZ serait prise de préférence inférieure à deux fois ladite longueur de cohérence Lc. Pour rappel Lc vaut :
Figure imgf000026_0001
AZ est par exemple compris entre 0 et 5 micromètres. Cet intervalle de valeur n' est pas limitatif et dépendra principalement des caractéristiques du premier objectif 21. En réalité AZ est lié à la longueur d'onde maximale émise par la source lumineuse 5 pour laquelle il est encore possible de former des interférences.
On comprend donc avec cette configuration, que l'on trouve sur le bras objet, entre l'élément séparateur 10 et l'échantillon 100 successivement la surface de réflexion 22, le premier objectif 21 et l'interface spéculaire 3. Ainsi, l'interface spéculaire 3 se trouve sur le bras objet. On comprend en conséquence que l'interface spéculaire 3 doit être suffisamment transparente pour laisser passer les rayons lumineux à travers elle afin qu'ils puissent atteindre l'échantillon 100 et repartir par la source 5.
Par ailleurs, on note que l'interface spéculaire 3 est l'élément de l'équipement 2 permettant d'obtenir les ondes de références. Or l'interface spéculaire 3 est astucieusement agencée sur le bras objet.
Dès lors l'équipement 2 ainsi décrit s'affranchit d'un bras de référence dédié grâce au recours à l' interface spéculaire 3 astucieusement placée.
Par ailleurs, l'équipement 2 comporte ici une troisième op- tique 23 agencée à la sortie du dispositif d'interférence c'est-à-dire agencée entre l'élément séparateur 10 et le dispositif d'acquisition 7. La troisième optique 23 peut faire partie du dispositif d'interférence ou peut ne pas faire partie dudit dispositif d'interférence.
Par exemple la troisième optique 23 est une unique lentille, un unique doublet ou bien un couple de lentilles ou bien un couple de doublets.
Le dispositif d'acquisition 7 est agencé dans le plan focal de la troisième optique 23 et par exemple dans le plan focal objet de la troisième optique 23.
Dans le cas présent, l'axe optique du dispositif d'acquisition 7 est perpendiculaire au bras d'éclairage. L'installation 1 ainsi décrite est une amélioration d'un interf éromètre de Linnik dans une configuration d'illumination de Koehler.
A partir de l'ensemble 1 décrit, il est possible d'effectuer de l'imagerie de tomographie à cohérence optique plein champ statique comme d'effectuer de l'imagerie de tomographie à cohérence optique plein champ dynamique. Dans le cas de l'imagerie de tomographie à cohérence optique plein champ dynamique, un échantillon est placé dans l'équipement 2 et une succession temporelle de N signaux interf érométriques bidimensionnels d'une strate de l'échantillon 100 est acquise par le dispositif d'acquisition 7. Par ailleurs, l'installation 1 ainsi décrite permet notamment (bien que non exclusivement) de pouvoir imager la strate ou les strates de l'échantillon 100 les plus proches de l'interface spéculaire 3.
Par ailleurs, il est possible d'effectuer de l'imagerie de tomographie à cohérence optique plein champ avec l'incubateur ou sans l'incubateur.
En conséquence l'installation 1 ainsi décrite permet de mettre en œuvre de nombreuses possibilités d'imagerie.
Grâce à l'installation 1 décrite, il est par exemple possible d'acquérir des images de cellules, mais également de visualiser l'activité cellulaire et de distinguer l'état métabolique d'une cellule. Les cellules peuvent par exemple être des cultures en deux dimensions telles que des cultures en deux dimensions monocouches, des cultures en trois dimensions telles que des organoïdes ou bien d'autres cultures en trois dimensions multicouche ...
Il est en effet possible d'étudier les cellules de manière invasive mais non destructive.
Une des forces de l' installation 1 décrite est donc son habilité à imager sans perturber le milieu naturel. L'installation 1 ainsi décrite peut être utilisée par exemple pour l'étude d' organoïdes , de cultures en deux dimensions monocouche, de cultures en trois dimensions multi- couches, de fibroblastes, de rétines et de cornées, l'étude d'explants de rétines et de cornées de souris, de porc, de macaque..., le contrôle qualité de la production d' organoïdes à grande échelle, aider dans le domaine micro- fluidique, la modélisation de maladies, pour effectuer des tests d'efficacité de nouveaux traitements (géniques, pharmaceutiques, etc. ) , pour une greffe ...
Par ailleurs, l'installation 1 décrite permet tout aussi bien de générer un signal statique permettant de visualiser la structure en trois dimensions d'un tissu qu'un signal dynamique permettant d'identifier les cellules d'un tissu et d'en mesurer par exemple leur métabolisme.
D'autres applications de l'installation 1 décrit sont envisageables comme par exemple toutes études de microscopie à haute résolution spatiale (par exemple une résolution comprise entre 100 et 400 nanomètres) et/ou temporelle (par exemple une résolution de l'ordre de la milliseconde comme par exemple 2 millisecondes) en particulier celles excluant la destruction de l'échantillon et/ou intégrant l'absence de marqueurs endogènes.
De plus, il est possible de générer un suivi en temps réel d'un échantillon avec par exemple la génération d'une image présentant un contraste reflétant des mécanismes de mouvements de l'ordre de X millisecondes, X étant compris entre 100 et 200 millisecondes, X étant par exemple de 160 millisecondes .
En outre, l'installation 1 est de dimensions réduites du fait de son absence de bras de référence (et notamment du fait de l'absence d'un deuxième objectif agencé sur le bras de référence) . L'installation 1 peut ainsi être miniaturisée .
Par ailleurs, l'installation 1 décrite s'avère simple dans sa structure et est donc aisée à être mise en œuvre même avec d'autres moyens que ceux précités.
Selon une première option, le dispositif d'acquisition 7 peut être un simple téléphone portable muni d'une caméra comme par exemple un téléphone intelligent ou « smartphone ». Le dispositif d'acquisition 7 ne fait alors pas partie de l'installation 1. L'installation 1 pourra par exemple comporter un emplacement (optionnellement agencé sur le bâti de l'équipement) et il suffira à un utilisateur même non expérimenté de placer son téléphone dans l'emplacement prévu a cet effet pour pouvoir réaliser de l'imagerie de haute qualité de manière simple et rapide.
On note que la troisième optique 23 peut optionnellement faire également partie du téléphone portable.
L'installation 1 est de dimensions réduites du fait de son absence de bras de référence. L'installation 1 peut ainsi être miniaturisée. Optionnellement encore, la source lumineuse 5 peut également faire partie du téléphone portable.
Optionnellement encore, le dispositif de traitement peut également faire partie du téléphone portable.
Selon une deuxième option (éventuellement combinable avec la première option précitée) , l' installation 1 et/ou l'équipement 2 est fabriqué à partir d'un microscope existant. Par exemple, la platine, le bâti, la surface de réflexion 3 et le premier objectif 21 sont ceux d'un microscope existant comme par exemple un microscope inversé. Par exemple le microscope inversé est un microscope à tourelle. Toutefois ledit microscope est modifié de sorte que :
- l'interface spéculaire 3 (ainsi qu' optionnellement son organe de déplacement associé) soit agencée entre le premier objectif 21 et la platine,
- de sorte qu'on ajoute au microscope le dispositif d'interférence ainsi qu' éventuellement la source 5 et le dispositif d'acquisition 7,
- qu'on règle la distance interface spéculaire 3/premier objectif 21 comme ce qui a été indiqué ci-dessus.
Ceci permet avantageusement de réduire les coûts de construction de l'installation 1.
En outre ceci facilite l'utilisation de l'installation 1 par un utilisateur ayant déjà l'habitude de travailler sur des microscopes.
En outre, ceci permet de profiter des avantages d'un microscope conventionnel comme par exemple les caractéristiques d'imagerie particulières (imagerie sous lumière visible, imagerie en fluorescence ...) , des objectifs particuliers ... En particulier, le microscope peut être un microscope pour lequel des modules optiques [module de contraste interf érentiel différentiel plus connu sous l'acronyme an- glais de module DIG (pour Differential Interference Contrast) , module de diffusion de Raman anti-Stokes cohérente plus connu sous l' acronyme module CARS (pour Coherent AntiStokes Raman Scattering) , module de génération de second harmonique plus connu sous le sigle anglais de module SHG (pour Second Harmonic Generation) , module de génération de troisième harmonique plus connu sous le sigle anglais de module THG (pour Third Harmonic Generation) , module Raman, module de fluorescence à un ou deux photons ...] ont déjà pu être développés.
Avec cette deuxième option, l'installation 1 peut ainsi aisément se coupler à ces modules de l'art antérieur ce qui permet d'enrichir les possibilités d'imagerie de l'échantillon 100. De plus, le microscope associé peut être un microscope pour lequel des accessoires ont déjà été développés de sorte qu'en partant d'un tel microscope, l'installation permet de bénéficier des accessoires du microscope. Par exemple l'incubateur précité peut être un tel accessoire de l'art antérieur.
Un deuxième mode de réalisation va être à présent décrit en référence aux figures 2a et 2b.
Alors que dans le premier mode de réalisation, l'installation 1 était dépourvue de bras de référence physique additionnel (l' interface spéculaire 3 étant portée par le bras objet) , dans le deuxième mode de réalisation l'installation 1 comporte également un bras de référence physique additionnel. Toute l'installation qui a été décrite selon le premier mode de réalisation est donc également présente ici.
Avec le bras de référence additionnel, le dispositif d'interférence est ainsi également apte, en service, à produire des interférences optiques entre : • des ondes de référence obtenues par réflexion de la lumière émise par la source 5 sur une surface de réflexion 6 du bras objet additionnel, et
• des ondes objet obtenues par rétrodiffusion de la lumière émise par ladite source 5 sur l'échantillon.
La surface de réflexion 6 est plane. La surface de réflexion 6 est par exemple un miroir.
Par ailleurs, l' installation comprend un deuxième objectif 24. Les deux objectifs 21, 24 sont identiques et sont associés à respectivement l'un des bras. Les deux objectifs 21, 24 ont une ouverture numérique (plus connue sous le sigle anglais NA pour « numerical aperture ») identique.
Optionnellement, l'ouverture numérique du deuxième objectif 24 est haute. Par « haute » on entend une ouverture numérique supérieure à 0.8 et de préférence supérieure à 1 pour la présente demande.
On retient que la deuxième optique 15 permet d' imager la source 5 sur un plan focal des deux objectifs et par exemple sur le plan focal objet des deux objectifs 21, 24.
Le deuxième objectif 24 fait partie du dispositif d'interférence. Ainsi le deuxième objectif 24 est agencé au niveau de la surface de réflexion 6. L'axe optique du deuxième objectif 24 est par exemple normal à un plan selon lequel s'étend la surface de réflexion 6.
Plus précisément ici, le deuxième objectif 24 est agencé de sorte que la surface de réflexion 6 se trouve dans un des foyers du deuxième objectif 24 et par exemple au foyer image du deuxième objectif 24.
Le deuxième objectif 24 est donc sur le bras de référence.
Dans l'exemple illustré, en aval de l'élément séparateur 10, côté bras de référence, se trouve ainsi successivement le deuxième objectif 24 et la surface de réflexion 6.
Dans le cas présent, le dispositif d'acquisition 7, la troisième optique 23, l'élément d' interface 10, le deuxième objectif 24 et la surface de réflexion 6 sont dans le prolongement l'un de l'autre.
De préférence la surface de réflexion 6 est déplaçable selon un mouvement de translation le long de l'axe optique du deuxième objectif 24.
A cet effet, la surface de réflexion 6 est montée mobile dans le dispositif d'interférence relativement au bâti afin de pouvoir être déplacée relativement au deuxième objectif 24. Par exemple, la surface de réflexion 6 est montée sur une base qui est déplaçable en translation vis-à-vis du bâti. Par exemple la base est déplaçable en translation vis- à-vis du bâti par l'intermédiaire d'au moins un actionneur pi ézo- électrique .
Par ailleurs, le bras de référence est associé à des moyens de blocage (non visibles ici) dudit bras de référence afin d'éviter temporairement que des rayons lumineux ne se déplace le long du bras de référence. Par exemple, un cache ou un obturateur ou un miroir peut être temporairement agencé au niveau de l'élément séparateur 10 ou bien encore l'élément séparateur 10 peut être orienté autrement ou bien encore le bras de référence est monté sur une embase qui peut être déplacée vis-à-vis de l'élément séparateur 10 ... Ainsi selon une première possibilité d'utilisation de l'installation illustrée à la figure 2a, il est possible d' imager l'échantillon 100 comme dans le premier mode de réalisation sans recours au bras de référence. Les moyens de blocage sont alors activés pour éviter que des rayons lumineux ne se déplacent le long du bras de référence.
Dans cette configuration la distance AZ est définie entre le plan imagé et l' interface spéculaire 3. Cette distance est de préférence inférieure à deux fois la profondeur de champ du premier objectif 21 (ou égale à deux fois la Ion- gueur de cohérence de la longueur d'onde centrale de la source 5 si la profondeur de champ du premier objectif est supérieure à ladite longueur de cohérence) .
De préférence cette possibilité est avant tout utilisée pour imager la ou les strates d'interface de l'échantillon 100 ou pour imager des échantillons 100 en deux dimensions. Selon une deuxième possibilité d'utilisation de l'installation illustrée à la figure 2b, il est possible d' imager l'échantillon 100 de manière plus traditionnelle en ayant recours au bras de référence. Les moyens de blocage sont alors désactivés pour permettre aux rayons lumineux de se déplacer le long du bras de référence.
Par exemple l'interface spéculaire 3 demeure en place dans l'installation 1 et cette caractéristique est prise en compte dans le réglage du bras de référence.
Dans cette configuration la distance AZ est définie entre le plan imagé et la surface de réflexion 6. Par exemple le plan imagé correspond au plan focal image du deuxième objectif 24 (mais le plan imagé pourra correspondre à un autre plan selon la position du dispositif d'acquisition 7 dans l'installation) .
Cette distance AZ est inférieure de préférence à au moins deux la profondeur de champ du deuxième objectif 24 (ou bien à deux fois la longueur de cohérence de la source si la longueur de cohérence de la source est inférieure à la profondeur de champ du deuxième objectif) .
De préférence cette possibilité est avant tout utilisée pour imager l'échantillon 100 dans les strates les plus éloignées du premier objectif.
De manière avantageuse il est ainsi possible de passer aisément d'une première possibilité d'utilisation à une deuxième ce qui augmente encore les possibilités d' imagerie de l'échantillon 100. On note en particulier que pour la première possibilité d'utilisation comme pour la deuxième il est ainsi possible de réaliser de l' imagerie FFOCT comme de l'imagerie D-FFOCT que l'on se place dans la première possibilité d'utilisation ou dans la deuxième possibilité d' utilisation .
On note que la première option et la deuxième option précitées pour le premier mode de réalisation sont également applicables au présent deuxième mode de réalisation.
Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation décrits mais englobe toute variante entrant dans le champ de l'invention telle que définie par les revendications .
En particulier, l'incubateur pourra faire partie ou non de l'installation et/ou le dispositif d'acquisition pourra faire partie ou non de l'installation et/ou le dispositif de traitement pourra faire partie ou non de l'installation et/ou la source pourra faire partie ou non de l'installation et/ou le téléphone portable pourra faire partie ou non de l'installation.
En outre, le dispositif d'acquisition pourra faire partie ou non de l'équipement et/ou le dispositif de traitement pourra faire partie ou non de l'équipement et/ou la source pourra faire partie ou non de l'équipement.
L'équipement pourra ne pas être inversé. L'illumination de l'échantillon pourra ainsi être effectuée par le haut (la collection du signal par le premier objectif s'effectuant alors préférentiellement par le haut également) comme par le bas (la collection du signal par le premier objectif s'effectuant alors préférentiellement par le bas également) .
Le capteur optique pourra être différent de ce qui a été indiqué par exemple le capteur optique pourra être un capteur à couplage de charge (plus connu sous le terme anglais CCD pour Charge-Coupled Device) . Le capteur optique pourra être apte à travailler dans le visible et/ou dans un autre domaine comme par exemple dans l'infra-rouge. Ainsi, le capteur optique pourra être un capteur d' image proche infra-rouge (plus connu sous le terme anglais de capteur SWIR pour Short-Wave- Infrared) . Le capteur optique pourra par exemple être un capteur InGaAs (pour arséniure d'indium- gallium) ou encore un capteur SWIR InGaAs. L'équipement et/ou l'installation pourra être conformé de sorte que le capteur optique (et/ou le dispositif d'acquisition) soit interchangeable afin par exemple de pouvoir travailler dans le visible puis ensuite de pouvoir travailler dans un autre domaine que le visible et par exemple dans l'infra-rouge. L'installation pourra ne pas comporter d' incubateur (portable ou non) . L' installation pourra comporter une enceinte chauffante dans laquelle est au moins agencé le microscope pour pouvoir par exemple maintenir l'échantillon à une température donnée.
Bien qu' ici on utilise des objectifs à haute ouverture numérique, on pourra bien entendu utiliser des objectifs à ouverture numérique de plus basse valeur.
Le microscope pourra être sans tourelle.
L'équipement pourra être dépourvu de surface de réflexion agencé sur le bras objet comme ce qui a été décrit.
Le premier objectif pourra être dans l'alignement de la source .
L' interface spéculaire pourra comporter un traitement de surface particulier permettant de modifier son coefficient de réflexion.
L' interface spéculaire peut être retirable temporairement de l'équipement ou pourra être fixée sans possibilité de démontage de l'équipement.
Bien qu' ici ce soit l'interface spéculaire qui se déplace vis-à-vis du premier objectif, ce pourra être le premier objectif qui se déplace vis-à-vis de ladite interface spéculaire. En variante le premier objectif et l'interface spéculaire pourront être à une distance fixe dans le bâti l'un par rapport à l'autre.
Bien qu' ici l'interface spéculaire appartienne à une lame de verre, l'interface spéculaire pourra appartenir à une lame dans une autre matière et par exemple une lame en plastique. L'interface spéculaire pourra appartenir à un élément en verre, en plastique ou en tout autre matériau permettant de laisser les rayons lumineux la traverser, le matériau étant préférentiellement plan et/ou lisse. L'interface spéculaire pourra faire partie d'une lame ou bien faire partie d'un autre élément conformé différemment et par exemple en plaque ou en toute autre forme permettant de laisser les rayons lumineux traverser ladite interface spéculaire .
L' interface spéculaire pourra ou non être intégrée au porte-échantillon en particulier lorsque celui-ci est une lame (en verre, en plastique ...) . Bien qu' ici l'interface spéculaire soit distincte de la platine, l'interface spéculaire pourra être intégrée à la platine.
Bien qu' ici l'interface spéculaire soit la face de la lame tournée vers l'échantillon, l'interface spéculaire pourra être la face de la lame tournée vers le premier objectif ou toute autre couche à l'intérieur de la lame. On pourrait également pour un même échantillon considérer alternativement l'interface spéculaire formée par la face tournée vers le premier objectif et l'interface spéculaire formée par la face tournée vers l'échantillon ce qui permettrait d' imager au moins deux strates différentes dudit même échantillon (une strate d' interface et une strate distance de ladite strate d'interface d'une distance égale à la distance séparant les deux interfaces) .
Bien gu' ici l'élément séparateur de faisceaux soit non polarisant, l'élément séparateur de faisceaux pourra être polarisant et associé à un appareil additionnel assurant la non-polarisation (comme des lames à retard telles que des lames quart d'onde) . L'élément séparateur de faisceaux pourra ainsi être tout élément séparateur tel qu'un élément séparateur de faisceaux non polarisant (NPBS) , un élément séparateur de faisceaux polarisant, un élément séparateur de faisceaux de type « Polka dot », une ou des membranes, etc.
L'installation pourra s'affranchir de la surface de réflexion 22.
Bien qu' ici l'interface spéculaire demeure en place dans la deuxième configuration, en variante l'interface spéculaire pourra être retirée temporairement de l'installation aussi longtemps que l'on se place dans la deuxième configuration.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'imagerie microscopique de tomographie à cohérence optique en plein champ d'au moins un échantillon, le procédé comprenant les étapes de :
- émettre une lumière se propageant dans un bras objet d'une installation dans laquelle est agencée l'échantillon de sorte que la lumière se rétrodiffuse dans l'échantillon pour produire une onde objet,
- générer au moins une interférence entre l'onde objet et une onde de référence, le procédé étant caractérisé en ce que l'onde de référence est générée par réflexion de la lumière sur une interface spéculaire agencée sur le bras objet.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'interface spéculaire est agencée de sorte à se trouver à une distance donnée d'un plan imagé par l'installation, distance qui est supérieure ou égale à zéro et qui est inférieure ou égale :
- a deux fois une profondeur de champ d'un objectif de l'installation destiné à observer l'échantillon, ou
- à deux fois une longueur de cohérence d'une source lumineuse générant la lumière si la longueur de cohérence est inférieure à la profondeur de champ de l'objectif.
3. Equipement optique pour une imagerie microscopique de tomographie à cohérence optique en plein champ d'au moins un échantillon, l'équipement comportant un objectif pour l'observation en service de l'échantillon, le dispositif comprenant une interface spéculaire, le dispositif étant ainsi apte en service à permettre la production d'au moins une interférence entre :
- au moins une onde de référence obtenue par réflexion d'une lumière émise par une source lumineuse associée à l'équipement sur l'interface spéculaire, et
- au moins une onde objet obtenue par rétrodiffusion de la lumière émise par ladite source sur l'échantillon, l'interface spéculaire étant agencée vis-à-vis de l'objectif de sorte que l'onde objet traverse en service ladite interface spéculaire lors de son trajet entre l'échantillon et la source.
4. Equipement selon la revendication 3, dans lequel l'interface spéculaire (3) appartient à une lame de verre ou une lame en plastique.
5. Equipement selon l'une des revendications 3 à 4, dans lequel la source (5) fait partie de l'équipement.
6. Equipement selon l'une des revendications 3 à 5, comprenant un dispositif d'acquisition (7) adapté pour acquérir au moins un signal résultant des interférences entre les ondes de références et les ondes objet.
7. Equipement selon l'une des revendications 3 à 6, dans lequel l'équipement est également configuré pour permettre une imagerie microscopique de tomographie à cohérence optique en plein champ dynamique.
8. Equipement selon l'une des revendications 3 à 7, comprenant un incubateur destiné à recevoir l'échantillon.
9. Equipement selon l'une des revendications 3 à 8, dans lequel la source (5) éclaire un élément séparateur de faisceaux de l'installation à travers un bloc optique comprenant au moins une optique et au moins un diaphragme.
10. Equipement selon l'une des revendications 3 à 9, dans lequel l'interface spéculaire fait partie du porte- échantillon .
11. Equipement selon la revendication 10, dans lequel l'interface spéculaire est une face du porte-échantillon tournée en service vers l'échantillon.
12. Installation comprenant un équipement selon l'une des revendications 3 à 11 ainsi qu'un bras de référence, l'installation étant ainsi apte en service à permettre également la production d'au moins une interférence entre :
- au moins une onde de référence obtenue par réflexion de la lumière émise par la source lumineuse (5) sur une surface de réflexion (6) du bras de référence additionnel, et
- au moins une onde objet obtenue par rétrodiffusion de la lumière émise par ladite source sur l'échantillon.
13. Installation selon la revendication 12, comprenant des moyens de blocage temporaires du bras de référence.
14. Installation selon l'une des revendications 8 à 13, dans laquelle au moins une partie de l'installation est intégrée à un téléphone portable.
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