WO2024029598A1 - 筋肉量若しくは筋力を向上又は維持するための組成物 - Google Patents

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WO2024029598A1
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proteoglycans
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竜哉 和田
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Definitions

  • the present invention provides compositions and methods for improving or maintaining muscle mass or strength containing specific proteoglycans, as well as for preventing obesity, reducing body fat percentage, reducing body fat mass, or reducing fat-free mass. Compositions and methods for.
  • Proteoglycan is a general term for glycoproteins with extremely complex and diverse structures in which several to dozens of linear sugar chains are covalently bonded to a single core protein, and are present in cartilage tissue.
  • a typical sugar chain contained in proteoglycans is chondroitin sulfate.
  • Chondroitin sulfate is a component that has attracted attention in industry due to its high usefulness such as excellent moisturizing properties, biocompatibility, and lubricity, and various effective recovery and production methods have been developed for it from natural resources.
  • chondroitin sulfate does not exist alone, but in the form of a complex formed through covalent bonds with proteins, ie, proteoglycan.
  • proteoglycans it is often difficult to extract proteoglycans as they are due to the complex structure of glycoprotein complexes, and for this reason, the most commonly used method is to thoroughly decompose the core protein part of proteoglycans and extract only chondroitin sulfate. It's here.
  • the product of this process is a mucopolysaccharide such as chondroitin sulfate.
  • Patent Document 1 describes a method for producing proteoglycan from cartilage tissue, which includes immersing a biological sample such as cartilage tissue containing proteoglycan in an aqueous solution of a surfactant, and recovering the solution after immersion. , a method for producing proteoglycans is described.
  • the proteoglycan described in Patent Document 1 is known to be useful for preventing, alleviating, or treating symptoms of arthropathy (Patent Document 2).
  • proteoglycans produced by a specific method can improve or maintain muscle mass or muscle strength, prevent obesity, lower body fat percentage, and reduce body fat percentage.
  • the present inventors have discovered that it is possible to reduce fat mass or fat-free mass, and have completed the present invention.
  • the present invention provides the following.
  • Muscle mass or muscle mass containing proteoglycans obtained by a method for producing proteoglycans which includes the steps of immersing a biological sample containing proteoglycans in an aqueous solution of a surfactant, and recovering the solution after immersion.
  • a composition for improving or maintaining muscle strength [2] Preventing obesity, containing proteoglycans obtained by a proteoglycan production method, which includes a step of immersing a biological sample containing proteoglycans in an aqueous solution of a surfactant, and a step of recovering the solution after immersion. , a composition for reducing body fat percentage, reducing body fat mass, or reducing fat free mass.
  • the biological sample containing proteoglycan is at least one type selected from the group consisting of cartilage tissue, muscle fiber, and skin of fish, molluscs, birds, and mammals, [1] to [3].
  • composition according to any one of [1] to [5] for improving or maintaining muscle mass or muscle strength in a healthy human subject [7] The composition according to any one of [1] to [6], which is a cosmetic composition, a food composition, or a pharmaceutical composition.
  • An effective amount of proteoglycan obtained by a method for producing proteoglycan which includes the step of immersing a biological sample containing proteoglycan in an aqueous solution of a surfactant, and the step of recovering the solution after immersion.
  • a method for increasing or maintaining muscle mass or strength comprising administering to a subject in need thereof.
  • An effective amount of proteoglycan obtained by a method for producing proteoglycan which includes the step of immersing a biological sample containing proteoglycan in an aqueous solution of a surfactant, and the step of recovering the solution after immersion, is A method for preventing obesity, reducing body fat percentage, reducing body fat mass, or reducing fat-free mass, the method comprising administering to a subject in need thereof.
  • the surfactant is at least one selected from the group consisting of saponin, lecithin, and sucrose fatty acid ester.
  • the biological sample containing proteoglycan is at least one selected from the group consisting of cartilage tissue, muscle fiber, and skin of fish, molluscs, birds, and mammals.
  • the biological sample containing proteoglycan is at least one type selected from the group consisting of fish, bird, and mammalian cartilage tissues.
  • a proteoglycan for use in improving or maintaining muscle mass or muscle strength which includes a step of immersing a biological sample containing the proteoglycan in an aqueous solution of a surfactant, and a step of recovering the solution after immersion.
  • a proteoglycan obtained by a proteoglycan production method including.
  • a proteoglycan obtained by a proteoglycan manufacturing method including a step of soaking and a step of recovering a solution after soaking.
  • the biological sample containing proteoglycan is at least one selected from the group consisting of cartilage tissue, muscle fiber, and skin of fish, molluscs, birds, and mammals. The proteoglycans described.
  • the proteoglycan according to [17], wherein the biological sample containing proteoglycan is at least one type selected from the group consisting of fish, bird, and mammalian cartilage tissues.
  • proteoglycan for improving or maintaining muscle mass or muscle strength in a healthy human subject.
  • proteoglycans for improving or maintaining muscle mass or muscle strength, the proteoglycans comprising the step of immersing a biological sample containing the proteoglycans in an aqueous solution of a surfactant, and recovering the solution after immersion.
  • the use is obtained by a method for producing proteoglycans, which comprises the step of: [21] Use of a proteoglycan to prevent obesity, reduce body fat percentage, reduce body fat mass, or reduce fat-free mass, the proteoglycan comprising a biological sample containing the proteoglycan with a surfactant. 1.
  • Use of a proteoglycan obtained by a method for producing a proteoglycan which includes the steps of immersing the proteoglycan in an aqueous solution of the molecule, and recovering the solution after immersion.
  • FIG. 1 shows the muscle mass test results.
  • FIG. 2 shows the test results of physical measurements excluding muscle mass, grip strength, 10 m walk test, time up and go test, and blood test (baseline).
  • FIG. 3 shows the test results of physical measurements excluding muscle mass, grip strength, 10 m walk test, time up and go test, and blood test (actual measurements).
  • FIG. 4 shows the test results of physical measurements excluding muscle mass, grip strength, 10 m walk test, time up and go test, and blood test (amount of change).
  • the proteoglycan used in the present invention (hereinafter also referred to as "the proteoglycan of the present invention") is a glycoprotein that has a very complex and diverse structure, and it is impossible to express its structure by a structural formula etc. Therefore, in the present invention, the proteoglycan is specified by the production method.
  • the proteoglycan of the present invention can be produced according to the method described in JP-A-2014-9164, and the method is explained below.
  • the method for producing proteoglycans of the present invention includes the steps of immersing a biological sample containing proteoglycans in an aqueous solution of a surfactant, and recovering the solution after immersion.
  • Biological samples containing proteoglycans include cartilage tissues, muscle fibers, and skins of fish, molluscs, birds, and mammals, and among them, cartilage tissues are preferred.
  • cartilage tissue any cartilage tissue of fish, birds, or mammals, or a discarded part of the cartilage tissue can be used.
  • the cartilage tissue includes either cartilage alone or tissues surrounding the cartilage, such as bones, muscle fibers, skin, and the like.
  • Cartilage tissues in fish include the fins and cartilage of commonly available cartilaginous fishes such as blue sharks and shortfin mako sharks, but especially ice heads, which contain approximately 6% of the average weight in the heads of salmon. Nasal cartilage tissue that is exposed is preferred.
  • cartilage tissues derived from fish such as ray cartilage tissue and shark cartilage tissue, avian cartilage tissues such as chicken cartilage tissue, bovine throat cartilage and bronchial cartilage, and whale cartilage.
  • Cartilage tissues derived from mammals such as the following can also be used.
  • proteoglycans exist in the epidermis and cartilage tissues of squid and octopus, which are molluscs, and the epidermis and cartilage of these molluscs can also be used in the present invention.
  • chondroitin protein complex (bikunin) that contains almost no sulfate in mammalian blood, and it has been reported that this chondroitin accounts for almost 100% of the mucopolysaccharides in mammalian blood.
  • proteoglycans can also be used as a biological sample containing proteoglycans in the present invention.
  • Many of the biological samples containing the proteoglycans mentioned above are industrial wastes and are easily available.
  • pretreatment such as crushing them as finely as possible and degreasing them in order to increase the surface area and increase the amount of proteoglycan extracted.
  • any surfactant can be used, such as anionic surfactants, cationic surfactants, double-faced surfactants, and nonionic surfactants.
  • anionic surfactants such as anionic surfactants, cationic surfactants, double-faced surfactants, and nonionic surfactants.
  • preferred are glycerin fatty acid esters, polyglycerin fatty acid esters, propylene glycol fatty acid esters, sucrose fatty acid esters, sorbitan fatty acid esters, soybean phospholipids (lecithin), saponins, etc., which are approved as food additives or food emulsifiers. , lecithin, or sucrose fatty acid ester alone, or a mixture of any of these is particularly preferred.
  • saponins examples include Quillaja saponin, soybean saponin, and tea saponin. Among them, Quillaja saponin is preferred.
  • lecithin examples include plant lecithin, fractionated lecithin, egg yolk lecithin, enzyme-treated lecithin, and enzymatically decomposed lecithin.
  • plant lecithin fractionated lecithin, egg yolk lecithin, enzyme-treated lecithin, and enzymatically decomposed lecithin.
  • vegetable lecithins with HLB 3 to 4 are preferred.
  • sucrose fatty acid esters examples include sucrose fatty acid monoesters formed by adding one molecule of fatty acid to one molecule of sucrose, diesters formed by adding two molecules of fatty acids, and triesters formed by adding three molecules of fatty acids.
  • sucrose fatty acid esters can include up to octaesters with eight fatty acid molecules added, but monoesters, diesters, triesters, and mixtures of any of these are suitable for food use.
  • sucrose fatty acid esters with HLB 13 to 19, particularly 14 to 19, most preferably HLB 19, are preferred.
  • sucrose fatty acid mixed ester a mixture of monoester, diester, and triester
  • HLB 14 to 16 a mixture of monoester, diester, and triester
  • HLB 14 to 16 a mixture of monoester, diester, and triester
  • HLB 14 to 16 a mixture of monoester, diester, and triester
  • HLB 14 to 16 a mixture of monoester, diester, and triester
  • HLB 14 to 16 sucrose with HLB 19
  • HLB 19 sucrose fatty acid mixed ester
  • the fatty acid is preferably a saturated or unsaturated fatty acid having 10 to 22 carbon atoms, and more preferably a saturated or unsaturated fatty acid having 12 to 18 carbon atoms.
  • sucrose fatty acid esters are preferred from the viewpoint of proteoglycan extraction efficiency, ease of post-treatment, etc.
  • sucrose fatty acid esters of lauric acid a saturated fatty acid with 12 carbon atoms, are preferred.
  • Lauric acid esters are preferred.
  • the concentration of the surfactant in the aqueous surfactant solution is preferably 0.01 to 20% by weight, particularly preferably 0.1 to 10% by weight, and even more preferably 0.5 to 5% by weight.
  • the immersion time can be set appropriately as necessary, but for example, the immersion time is , preferably for 10 hours or more. Further, when using a solution of 2 to 5% by weight of a surfactant such as saponin, lecithin, sucrose fatty acid ester, or a mixture thereof, the immersion time is preferably about 12 hours. These conditions allow efficient recovery and production of higher molecular weight proteoglycans.
  • the immersion of the biological sample in the surfactant aqueous solution is preferably carried out at 30°C to 100°C, more preferably 40°C to 80°C, particularly preferably 50°C to 70°C.
  • the immersion temperature is set to 50° C. to 60° C., proteoglycans are hardly decomposed and can be extracted as macromolecular glycoprotein complexes.
  • an aqueous surfactant solution is added to 1 part by weight of cartilage, preferably 1 to 50 parts by weight, more preferably 2 to 30 parts by weight, even more preferably 4 to 20 parts by weight, particularly preferably 6 to 15 parts by weight. It is done using It is preferable to immerse while stirring using a mixer or stirrer.
  • the extraction of proteoglycans from cartilage tissue can be monitored, for example, by detecting or quantifying the amount of uronic acid by the carbazole method (John et al., ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, 1967, Vol. 19, pp. 119-132). Uronic acid may be detected and monitored by other known methods.
  • aqueous surfactant solution after immersion contains a large amount of residue after proteoglycan extraction, it is preferable to remove these by filtration, centrifugation, or other methods.
  • the extract containing proteoglycans may be used as a product as is, it is preferable to separate or purify the proteoglycans by an appropriate method to the purity required for the various uses of proteoglycans.
  • known purification methods can be used to purify proteoglycans.
  • a preferred purification method includes centrifugation. Fine solid matter can be easily removed as a precipitated residue by centrifugation.
  • the liquid phase containing proteoglycans recovered by centrifugation may be further filtered using filter paper or an ultrafiltration membrane separation device having an appropriate molecular weight cutoff.
  • the exclusion molecular weight may be in the range of approximately 50,000 to 1,000,000.
  • collagen can also be removed from the liquid phase and the purity of the proteoglycan can be increased.
  • water added to the liquid phase containing proteoglycans to lower the viscosity of the liquid phase, it is possible to make it easier to pass through the membrane, and by repeating this process, it is also possible to remove the slight peculiar odor originating from the raw materials. It is.
  • gel-like proteoglycans can also be recovered by adding the obtained concentrate to ethanol saturated with sodium chloride.
  • This gel-like proteoglycan may be made into a solid substance using a vacuum freeze dryer, or may be dried using a spray dryer to form a powdery solid substance.
  • the molecular weight of the proteoglycan of the present invention is not particularly limited as long as the object of the present invention can be achieved, but for example, it is preferably 1 million or more, preferably 1.5 million or more, more preferably 1.8 million or more, and the upper limit is not particularly limited. However, it is preferably about 3 million or less, for example.
  • a method for measuring molecular weight includes a method using a high performance liquid chromatography device.
  • a composition containing the proteoglycan of the present invention (hereinafter also referred to as the composition of the present invention) can improve or maintain muscle mass or muscle strength by applying it to a subject.
  • the method for measuring muscle mass or muscle strength is not particularly limited, and, for example, it can be measured using an instrument or device that can measure muscle mass or muscle strength of a subject.
  • an instrument or device that can measure muscle mass or muscle strength of a subject.
  • a commercially available grip dynamometer may be used to measure the muscle strength of the arm, or a commercially available body composition meter may be used to measure the muscle mass of the whole body. can do.
  • the target muscles are not particularly limited, and muscles throughout the body can be targeted.
  • the composition of the present invention can be applied to mammals such as mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, cats, dogs, cows, horses, sheep, monkeys, and humans, but is not particularly limited. Can be mentioned.
  • the composition of the present invention is preferably applied to human subjects, more preferably healthy human subjects, and particularly preferably healthy humans who are aware of a decrease in muscle mass or muscle strength due to aging etc. It is a target.
  • composition of the present invention can be prepared into, for example, a cosmetic composition, a food composition, a pharmaceutical composition, and the like.
  • composition of the present invention may contain, if necessary, inactive ingredients known or well-known in the production of cosmetic compositions, food compositions, and pharmaceutical compositions, and may also contain inactive ingredients for enhancing the action or for other purposes. Active ingredients other than the proteoglycan of the present invention may also be included in order to achieve the desired effect.
  • Inert ingredients that can be included in the composition of the present invention are not particularly limited as long as the effects of the present invention are achieved, but examples include carriers acceptable for cosmetics, foods, or pharmaceuticals, such as excipients. Examples include excipients, binders, fillers, disintegrants, surfactants, lubricants, dispersants, buffers, preservatives, flavoring agents, fragrances, coating agents, carriers, diluents, and the like.
  • the specific application amount and application interval of the composition of the present invention may vary according to the subject's weight, sex, age, condition, route of application, or other factors.
  • the specific application amount and application interval can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • the daily intake of the proteoglycan of the present invention for one adult (60 kg) is, for example, 5 mg or more, preferably 10 mg or more. , more preferably 20 mg or more, still more preferably 30 mg or more, preferably 1000 mg or less, more preferably 500 mg or less, even more preferably 200 mg, even more preferably 100 mg or less, even more preferably 80 mg or less, and , particularly preferably 40 mg.
  • the period of application is not particularly limited, but it is preferable to apply repeatedly or continuously, more preferably to apply continuously for 5 days or more, even more preferably to apply continuously for 12 weeks or more, and still more preferably to apply continuously for 24 weeks or more. It is particularly preferable to apply the method as follows.
  • the specific shape of the composition of the present invention is not particularly limited as long as the effects of the present invention are achieved.
  • composition of the present invention When the composition of the present invention is applied as a cosmetic composition or a parenteral pharmaceutical composition, it can be applied in the form of, for example, a skin external preparation.
  • external preparations for the skin include creams, lotions, milky lotions, foundations, packs, foams, plasters, ointments, poultices, aerosols, and the like.
  • parenteral pharmaceutical composition When applied as a parenteral pharmaceutical composition, it may be applied in the form of an injection, for example.
  • the composition of the present invention When the composition of the present invention is applied as a food composition or an oral pharmaceutical composition, it is applied in the form of a tablet, capsule, granule, powder, troche, liquid, syrup, suspension, etc. can do.
  • the forms of the food composition include soft drinks, tea drinks, coffee drinks, fruit juice drinks, carbonated drinks, milk drinks, jellies, wafers, biscuits, bread, noodles, sausages, and the like.
  • solid preparations such as tablets, capsules, granules, powders, and troches are preferable, and tablets and capsules are more preferable because they can be easily ingested, and tablets are particularly preferable. .
  • composition of the present invention When the composition of the present invention is made into a tablet, it is preferable to include crystalline cellulose and a lubricant.
  • the content of crystalline cellulose in the tablet is 1 to 80% by weight, preferably 3 to 75% by weight. If the content of crystalline cellulose in the tablet is too high, sticking tends to occur. Conversely, if the content of crystalline cellulose is too low, the hardness of the tablet will decrease.
  • lubricants included in tablets include commonly used lubricants such as calcium stearate, silicon dioxide, calcium carboxymethylcellulose, sucrose fatty acid esters, calcium silicate, magnesium silicate, talc and silica hydrogel. Among them, calcium stearate, silicon dioxide, and calcium carboxymethylcellulose are preferred.
  • the content of lubricant in the tablet is 0.5 to 5% by weight, preferably 0.5 to 3% by weight. If the content of the lubricant in the tablet is too low, problems such as sticking and capping are likely to occur during the tablet manufacturing process. On the other hand, if the content of the lubricant is too high, the tablet formability will deteriorate and sufficient tablet hardness will not be obtained.
  • Tablets can be manufactured by blending the raw materials simultaneously or sequentially, mixing them uniformly, and compression molding.
  • Compression molding generally refers to a manufacturing method by tabletting, and there are two methods: granule tableting, in which granules are granulated from a raw material mixed powder, and then compression molded, and direct compression molding, in which the raw mixed powder is directly compressed. Including the lock method. Since the tablets of the present invention have good compressibility, both the granule tableting method and the direct tableting method can be used for manufacturing the tablets, but the direct tableting method is advantageous because the process is simple. is preferred. Tablet compression can be carried out in a conventional manner using a single tablet press or a continuous tablet press such as a rotary tablet press. The tableting pressure can be appropriately set in consideration of the desired size and hardness of the tablet, which will be described later, and can be set, for example, to 2,000 to 4,000 kgf.
  • the size of the tablet should be a general size, for example, about 5 to 12 mm in diameter and about 100 to 400 mg in weight, but considering ease of swallowing, it should be about 5 to 10 mm in diameter and 200 to 300 mg in weight. It is preferable.
  • the hardness of the tablet should be the hardness of general tablets, for example, 6 kgf or higher, but considering the prevention of breakage such as cracking and chipping, the smoothness of the surface, and the disintegration after ingestion, it should be 6.5 to 6.5 kgf. It is preferable that it is about 15 kgf.
  • the hardness of a tablet can be measured using a general-purpose tablet hardness meter (eg, Freund's tablet hardness meter).
  • Nasal cartilage was removed from the head of a chum salmon that had been stored frozen at -40°C, and was finely chopped using an electric meat chopper to form minced meat. Minced nasal cartilage was defatted and dehydrated. The starting material was 24 g of treated nasal cartilage that was dried through ventilation or under reduced pressure. Pour 2970 g of distilled water pre-cooled to 5°C into a 5 liter extraction container, and add 30 g of the solid sucrose fatty acid ester used in Production Example 1 to obtain a total amount of 3000 g (1% by weight) of sucrose fatty acid ester. An aqueous solution was prepared.
  • this liquid phase was filtered using filter paper (manufactured by Advantech), and after adding distilled water in an amount 6 times the amount of the filtrate, it was fractionated using BIOMAX 100K POLYETHERSULFONE (molecular weight cut off: 100,000) manufactured by Nippon Millipore. and concentration were performed simultaneously. A portion of the obtained concentrated liquid was collected and the weight of solid content in the liquid was measured. The measurement was performed by drying at 105° C. for 16 hours in a drying oven (YAMATO DX401) to completely evaporate water, and then precisely measuring the remaining solid content using a digital measuring instrument (GF-400, A&D).
  • BIOMAX 100K POLYETHERSULFONE molecular weight cut off: 100,000
  • the amount of collagen in the concentrated solution was determined by measuring the amount of amino acids in the concentrated solution using an automatic amino acid analyzer (manufactured by Hitachi, Ltd., L-8500 Amino Acid Analyzer), and the amount of uronic acid was determined using the galambos method.
  • the amount of proteoglycan was calculated by quantification.
  • the molecular weight of the proteoglycan was measured using a high performance liquid chromatography device (Shimadzu Corporation, column TSK-GEL G4000PWXL). As a result of these analyses, it was found that the solid content contained 14.8% protein, 18.4% ash, 64.8% carbohydrate, and 0% lipid. Furthermore, the molecular weight of the proteoglycan was approximately 1.3 million.
  • Nasal cartilage was removed from the head of a chum salmon that had been stored frozen at -40°C, and was finely chopped using an electric meat chopper to form minced meat. Minced nasal cartilage was defatted and dehydrated. The starting material was 17.9 g of treated nasal cartilage that was dried through ventilation or under reduced pressure. 2495 g of distilled water previously cooled to 5° C. was placed in a 5 liter extraction container, and 5 g of solid Quillaja saponin was added to prepare a saponin aqueous solution having a total amount of 2500 g (0.2% by weight). 17.9 g of the starting material was put into this extraction container and immersed for 12 hours while stirring using a stirrer.
  • the contents were transferred to another container equipped with a 1 mm square stainless steel strainer, the nasal cartilage was removed, and the extract containing proteoglycans was collected.
  • the extract was centrifuged at 3000 rpm for 20 minutes using a Hitachi himac CF7D2 type centrifuge to remove solids and fats and oils, and a liquid phase containing proteoglycans was recovered. Furthermore, this liquid phase was filtered using filter paper (manufactured by Advantech), and after adding distilled water in an amount 6 times the amount of the filtrate, it was fractionated using BIOMAX 100K POLYETHERSULFONE (molecular weight cut off: 100,000) manufactured by Nippon Millipore. and concentration were performed simultaneously.
  • a portion of the obtained concentrated liquid was collected and the weight of solid content in the liquid was measured.
  • the measurement was performed by drying at 105° C. for 16 hours in a drying oven (YAMATO DX401) to completely evaporate water, and then precisely measuring the remaining solid content using a digital measuring instrument (GF-400, A&D).
  • GF-400, A&D digital measuring instrument
  • the amount of collagen in the concentrated solution was determined by measuring the amount of amino acids in the concentrated solution using an automatic amino acid analyzer (manufactured by Hitachi, Ltd., L-8500 Amino Acid Analyzer), and the amount of uronic acid was determined using the galambos method.
  • the amount of proteoglycan was calculated by quantification. Furthermore, the molecular weight of the proteoglycan was measured using a high performance liquid chromatography device (Shimadzu Corporation, column TSK-GEL G4000PWXL). As a result of these analyses, it was found that the solid content contained 17% protein, 22.4% ash, 60.6% carbohydrate, and 0% lipid. Furthermore, the molecular weight of the proteoglycan was approximately 1.2 million.
  • the contents were transferred to another container equipped with a 1 mm square stainless steel strainer, and the extract containing proteoglycans was collected.
  • the extract was centrifuged at 1500 ⁇ g for 30 minutes using an IWAKI CFS-400 type centrifuge to remove solids and fat, and a liquid phase containing proteoglycans was recovered. Furthermore, this liquid phase was filtered using filter paper (manufactured by Advantech), and after adding distilled water in an amount 6 times the amount of the filtrate, it was filtered using a PREP/SCALE TFF membrane (molecular weight cut off: 100,000) manufactured by Nippon Millipore. Fractionation and concentration were performed simultaneously.
  • a portion of the obtained concentrated liquid was collected and the weight of solid content in the liquid was measured.
  • the measurement was performed by drying at 105° C. for 16 hours in a drying oven (YAMATO DX401) to completely evaporate water, and then precisely measuring the remaining solid content using a digital measuring instrument (GF-400, A&D).
  • GF-400, A&D digital measuring instrument
  • the amount of collagen in the concentrated solution was determined by measuring the amount of amino acids in the concentrated solution using an automatic amino acid analyzer (manufactured by Hitachi, Ltd., L-8500 Amino Acid Analyzer), and the amount of uronic acid was determined using the carbazole method.
  • the amount of proteoglycan was calculated by quantification. Furthermore, the molecular weight of the proteoglycan was measured using a high performance liquid chromatography device (Shimadzu Corporation, Column Asahipak). As a result of these analyses, it was found that the solid content contained 35% protein, 21.5% ash, 42.9% carbohydrate, and 0.6% lipid. According to Patent Document 1, the weight ratio of the core protein of proteoglycan is described to be about 7%, and therefore, the proteoglycan in the present invention has a purity of about 46%, calculated from the carbohydrate content of about 42.9%. %It is estimated to be. Furthermore, the molecular weight of the proteoglycan was approximately 2 million.
  • compositions of the invention were tested using a placebo-controlled, randomized, double-blind, parallel-group comparison method.
  • the efficacy of the compositions of the invention was tested using a placebo-controlled, randomized, double-blind, parallel-group comparison method.
  • the formulation of Test Composition In the following Examples, the proteoglycan produced in Production Example 1 (hereinafter also referred to as "proteoglycan complex") was used, and a test composition having the following formulation was used.
  • Each raw material was mixed in such a proportion that one tablet had the above composition, and the resulting mixture was directly compressed to produce tablets.
  • Test period 24 weeks 3. Administration method One tablet was taken by the subject once a day with water or hot water after dinner.
  • Subjects were selected as subjects.
  • Registration criteria i. Japanese ii. Adult men and women iii. Healthy person iv. Persons who feel muscle weakness
  • Exclusion criteria i. Those who are undergoing treatment for or have a history of malignant tumor, heart failure, or myocardial infarction ii. Persons with implanted pacemakers or implantable cardioverter defibrillatorsiii. Persons undergoing treatment for the following chronic diseases: arrhythmia, liver damage, kidney damage, cerebrovascular disease, rheumatism, diabetes, Dyslipidemia, hypertension, and other chronic diseases iv. Persons diagnosed with sarcopenia v.
  • Grip strength Grip strength will be investigated at the conducting medical institution using a grip dynamometer.
  • Survey item Grip strength iii.
  • Evaluation method Screening and pre-intake test, 12-week post-intake test, and 24-week post-intake test.
  • 10m walking test i.
  • Implementation details Perform a 10m walk test to evaluate walking ability.
  • ii. Survey items: walking time, number of steps, stride length, walking rate (number of steps per unit time)
  • iii Evaluation method: Screening and pre-intake test, 12-week post-intake test, and 24-week post-intake test.
  • Time up and go Test i.
  • Grip strength walking time, number of steps, stride length, walking rate, normal walking speed, maximum walking speed, body fat percentage, body fat mass, fat-free mass, body weight, high-sensitivity CRP, 12 weeks after intake and 24 weeks after intake.
  • Test results Study Participants This study targeted healthy Japanese adult men and women who were experiencing muscle weakness. Of the 114 people who consented to the study, 56 people who met the eligibility criteria were included in the study, and 28 people were assigned to the test food group and the placebo group. There was one test participant (one in the test food group) who did not visit the hospital after 24 weeks of intake.
  • Per protocol set included 1 patient with no post-allocation data (1 patient in the test food group) and 7 patients with a test product intake rate of less than 80% (4 patients in the placebo group, 1 patient in the test food group). 3 people) were excluded.
  • Safety analysis population (SAF) excluded 1 patient (1 patient in the test food group) who had never measured the safety evaluation items after assignment.
  • Muscle mass after 24 weeks of intake was significantly higher in the test food group than in the placebo group ( Figure 1), and the estimated marginal mean (EMM) and its 95% confidence interval were The difference between the groups was 36.6 kg (36.3 to 36.9), the placebo group 36.1 kg (35.8 to 36.4), and the difference between the groups was 0.4 kg (0.0 to 0.9). .
  • the amount of change from the screening and pre-intake test 24 weeks after intake was significantly higher in the test food group than in the placebo group, and the EMM and its 95% confidence interval were 0.5 kg (0.1 to 0.8), the placebo group to 0.0 kg (-0.3 to 0.3), and the difference between the groups to 0.4 kg (0.0 to 0.9) ( Figure 1).
  • the EMM and its 95% confidence interval for each group difference were 0.6 kg (0.1 to 1.0). It is thought that it significantly contributes to the increase in muscle mass. After 12 weeks of intake and 24 weeks after intake, significant differences between the groups were observed in body fat percentage, fat mass, and fat-free mass in addition to muscle mass ( Figures 3 and 4).
  • the method for measuring body composition in this test is the bioelectrical impedance analysis (BIA method) using a body composition analyzer (MC-780A-N33). Fat-free mass is determined from the body height and the resistance value (impedance) of the living body, but since most of the body is muscle tissue, the muscle mass measured by the BIA method is estimated from the fat-free mass.
  • fat mass is calculated by subtracting fat-free mass from body weight, but since no effect of intake of the test food on body weight was observed ( Figures 3 and 4), based on the measurement principle of the BIA method, fat-free mass is If it increases, fat mass will inevitably decrease. From the above, it is thought that fat-free mass increased with the increase in skeletal muscle mass due to the intake of the test food, which inevitably led to a decrease in fat mass, resulting in a decrease in body fat percentage, and a significant difference between the groups was observed. .
  • composition of the present invention is effective in improving or maintaining muscle mass or strength, and in preventing obesity, decreasing body fat percentage, decreasing body fat mass, or reducing body fat mass. It was confirmed that it is effective in reducing the amount of
  • muscle mass or muscle strength can be improved or maintained, and thereby obesity can be prevented, body fat percentage can be decreased, body fat mass can be decreased, or fat-free mass can be decreased.
  • the proteoglycan used in the present invention is derived from living organisms and has low toxicity. Furthermore, since the proteoglycan used in the present invention can be produced from raw materials that are normally discarded, the present invention can contribute to the effective use of resources and can also suppress increases in medical costs. It is.

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Abstract

本発明は、筋肉量若しくは筋力を向上又は維持できる新規な方法及び肥満を防止、体脂肪率を低下、体脂肪量を低下、又は除脂肪量を低下できる新規な方法を提供する。本発明で使用されるプロテオグリカンは、プロテオグリカンを含有する生物学的試料を界面活性剤の水溶液に浸漬する工程、及び浸漬後の溶液を回収する工程を含む、プロテオグリカンの製造方法によって得られたものである。

Description

筋肉量若しくは筋力を向上又は維持するための組成物
　本発明は、特定のプロテオグリカンを含有する、筋肉量若しくは筋力を向上又は維持するための組成物及び方法、並びに肥満を防止、体脂肪率を低下、体脂肪量を低下又は除脂肪量を低下するための組成物及び方法に関する。
　日本では平均寿命と健康寿命が約１０年乖離しており、健康寿命の延伸が喫緊の課題である。介護が必要になった主な原因のうち、関節疾患、高齢による衰弱、骨折・転倒といった運動器の機能低下が全体の約３５％を占めており、要支援者に限定すると約５０％を占めている。つまり、健康寿命の延伸のためには、運動器（骨格筋、関節、骨）を健康に保つことが重要であると考えられる。しかし、筋肉量は加齢に伴って減少することがよく知られており、加齢の他にも炎症や、膝の違和感や痛みに伴う日常生活動作（ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｄａｉｌｙ　ｌｉｖｉｎｇ：　ＡＤＬ）の減少が、筋肉量や筋力の低下を招くことが分かっている。
　プロテオグリカンは、１本のコアタンパク質に数本から数十本の直鎖状の糖鎖が共有結合している、非常に複雑かつ多種の構造を有する糖タンパク質の総称であり、軟骨組織に存在するプロテオグリカンに含まれる糖鎖の代表的なものがコンドロイチン硫酸である。
　コンドロイチン硫酸は、保湿性、生体適合性或いは潤滑性に優れる等の高い有用性から産業上注目されている成分であり、天然資源からの効果的な回収、製造法が種々開発されている。
　軟骨組織においては、コンドロイチン硫酸はそれ自体単独では存在せず、タンパク質と共有結合を介して形成された複合体すなわちプロテオグリカンの形で存在している。しかし、プロテオグリカンをそのまま抽出することは糖タンパク質複合体という複雑な構造故に困難な場合が多く、そのためプロテオグリカンのコアタンパク質部分を徹底的に分解してコンドロイチン硫酸のみを抽出しようという方法が主に採用されてきた。この方法の製造物はコンドロイチン硫酸等のムコ多糖類である。
　一方、コンドロイチン硫酸としてではなく、プロテオグリカンそのままを回収、製造し利用する試みもなされている。特に、魚類、鳥類及び哺乳類の軟骨組織には、コンドロイチン硫酸を主要糖鎖とするプロテオグリカンが含まれている一方、これらの軟骨組織は通常廃棄処分となっていたことから、廃棄物の有効利用を兼ねた軟骨組織からのプロテオグリカンの製造法が幾つか提唱されている。
　例えば、軟骨組織からのプロテオグリカンの製造法として、特許文献１には、プロテオグリカンを含有する軟骨組織等の生物学的試料を界面活性剤の水溶液に浸漬し、浸漬後の溶液を回収することを含む、プロテオグリカンの製造方法が記載されている。そして、特許文献１に記載されたプロテオグリカンは、関節症の症状の予防、軽減又は治療に有用であることが知られている（特許文献２）。
特開２０１４－９１６４号公報 特開２０１８－５８７８１号公報
　上述したように、健康寿命の延伸が喫緊の課題であり、健康寿命の延伸のためには、筋肉量や筋力の低下を防止すること、すなわち、筋肉量や筋力を向上又は維持することが有用と考えられる。
　本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討を行ったところ、特定の方法により製造されるプロテオグリカンによれば、筋肉量若しくは筋力を向上又は維持できること及び肥満を防止、体脂肪率を低下、体脂肪量を低下又は除脂肪量を低下できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　したがって、本発明は、以下のものを提供する。
〔１〕プロテオグリカンを含有する生物学的試料を界面活性剤の水溶液に浸漬する工程、及び浸漬後の溶液を回収する工程を含む、プロテオグリカンの製造方法によって得られたプロテオグリカンを含有する、筋肉量若しくは筋力を向上又は維持するための組成物。
〔２〕プロテオグリカンを含有する生物学的試料を界面活性剤の水溶液に浸漬する工程、及び浸漬後の溶液を回収する工程を含む、プロテオグリカンの製造方法によって得られたプロテオグリカンを含有する、肥満を防止、体脂肪率を低下、体脂肪量を低下、又は除脂肪量を低下するための組成物。
〔３〕界面活性剤が、サポニン、レシチン、スクロース脂肪酸エステルからなる群から選択される少なくとも１種である、〔１〕又は〔２〕に記載の組成物。
〔４〕プロテオグリカンを含有する生物学的試料が、魚類、軟体動物、鳥類及び哺乳類の軟骨組織、筋肉繊維並びに皮からなる群から選択される少なくとも１種である、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の組成物。
〔５〕プロテオグリカンを含有する生物学的試料が、魚類、鳥類及び哺乳類の軟骨組織からなる群から選択される少なくとも１種である、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の組成物。
〔６〕健常なヒト対象の筋肉量若しくは筋力を向上又は維持するための、〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の組成物。
〔７〕化粧料組成物、食品組成物、又は医薬組成物である、〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の組成物。
〔８〕プロテオグリカンを含有する生物学的試料を界面活性剤の水溶液に浸漬する工程、及び浸漬後の溶液を回収する工程を含む、プロテオグリカンの製造方法によって得られたプロテオグリカンの有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、筋肉量若しくは筋力を向上又は維持するための方法。
〔９〕プロテオグリカンを含有する生物学的試料を界面活性剤の水溶液に浸漬する工程、及び浸漬後の溶液を回収する工程を含む、プロテオグリカンの製造方法によって得られたプロテオグリカンの有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、肥満を防止、体脂肪率を低下、体脂肪量を低下、又は除脂肪量を低下するための方法。
〔１０〕界面活性剤が、サポニン、レシチン、スクロース脂肪酸エステルからなる群から選択される少なくとも１種である、〔８〕又は〔９〕に記載の方法。
〔１１〕プロテオグリカンを含有する生物学的試料が、魚類、軟体動物、鳥類及び哺乳類の軟骨組織、筋肉繊維並びに皮からなる群から選択される少なくとも１種である、〔８〕又は〔９〕に記載の方法。
〔１２〕プロテオグリカンを含有する生物学的試料が、魚類、鳥類及び哺乳類の軟骨組織からなる群から選択される少なくとも１種である、〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕健常なヒト対象の筋肉量若しくは筋力を向上又は維持するための、〔８〕に記載の方法。
〔１４〕筋肉量若しくは筋力の向上又は維持に使用するためのプロテオグリカンであって、プロテオグリカンを含有する生物学的試料を界面活性剤の水溶液に浸漬する工程、及び浸漬後の溶液を回収する工程を含む、プロテオグリカンの製造方法によって得られた、プロテオグリカン。
〔１５〕肥満の防止、体脂肪率の低下、体脂肪量の低下、又は除脂肪量の低下に使用するためのプロテオグリカンであって、プロテオグリカンを含有する生物学的試料を界面活性剤の水溶液に浸漬する工程、及び浸漬後の溶液を回収する工程を含む、プロテオグリカンの製造方法によって得られた、プロテオグリカン。
〔１６〕界面活性剤が、サポニン、レシチン、スクロース脂肪酸エステルからなる群から選択される少なくとも１種である、〔１４〕又は〔１５〕に記載のプロテオグリカン。
〔１７〕プロテオグリカンを含有する生物学的試料が、魚類、軟体動物、鳥類及び哺乳類の軟骨組織、筋肉繊維並びに皮からなる群から選択される少なくとも１種である、〔１４〕又は〔１５〕に記載のプロテオグリカン。
〔１８〕プロテオグリカンを含有する生物学的試料が、魚類、鳥類及び哺乳類の軟骨組織からなる群から選択される少なくとも１種である、〔１７〕に記載のプロテオグリカン。
〔１９〕健常なヒト対象の筋肉量若しくは筋力を向上又は維持するための、〔１４〕に記載のプロテオグリカン。
〔２０〕筋肉量若しくは筋力を向上又は維持するためのプロテオグリカンの使用であって、プロテオグリカンが、プロテオグリカンを含有する生物学的試料を界面活性剤の水溶液に浸漬する工程、及び浸漬後の溶液を回収する工程を含む、プロテオグリカンの製造方法によって得られたものである、使用。
〔２１〕肥満を防止、体脂肪率を低下、体脂肪量を低下、又は除脂肪量を低下するためのプロテオグリカンの使用であって、プロテオグリカンが、プロテオグリカンを含有する生物学的試料を界面活性剤の水溶液に浸漬する工程、及び浸漬後の溶液を回収する工程を含む、プロテオグリカンの製造方法によって得られたものである、使用。
図１は、筋肉量の試験結果を示す。 図２は、筋肉量を除く身体測定、握力、１０ｍ歩行テスト、Ｔｉｍｅ　ｕｐ　ａｎｄ　ｇｏ　Ｔｅｓｔ、血液検査（ベースライン）の試験結果を示す。 図３は、筋肉量を除く身体測定、握力、１０ｍ歩行テスト、Ｔｉｍｅ　ｕｐ　ａｎｄ　ｇｏ　Ｔｅｓｔ、血液検査（実測値）の試験結果を示す。 図４は、筋肉量を除く身体測定、握力、１０ｍ歩行テスト、Ｔｉｍｅ　ｕｐ　ａｎｄ　ｇｏ　Ｔｅｓｔ、血液検査（変化量）の試験結果を示す。
　本発明で使用するプロテオグリカン（以下、「本発明のプロテオグリカン」ともいう。）は、非常に複雑かつ多種の構造を有する糖タンパク質であり、その構造を構造式等で表現することは不可能であるかおよそ実際的ではないため、本発明では、製造方法により当該プロテオグリカンを特定する。
　本発明のプロテオグリカンは、特開２０１４－９１６４号公報に記載される方法に準じて製造することができ、その方法を以下に説明する。
　本発明のプロテオグリカンを製造する方法は、プロテオグリカンを含有する生物学的試料を界面活性剤の水溶液に浸漬する工程、及び浸漬後の溶液を回収する工程を含む。
　プロテオグリカンを含む生物学的試料としては、魚類、軟体動物、鳥類及び哺乳類の軟骨組織、筋肉繊維並びに皮が挙げられるが、中でも、軟骨組織が好ましい。軟骨組織としては、魚類、鳥類及び哺乳類の軟骨組織や、当該軟骨組織の廃棄部位のいずれも、利用することができる。ここで、軟骨組織とは、軟骨単独或いは軟骨の周辺部位、例えば骨、筋肉繊維、皮等を含む組織のいずれも包含する。魚類の軟骨組織としては、一般に流通しているヨシキリザメ、アオザメなどの軟骨魚類のヒレ、軟骨部分はもちろん、特に、サケの頭部にその平均重量で約６％含まれている、氷頭とよばれる鼻軟骨組織が好ましい。北海道沿岸部で漁獲されたサケ（大半はシロサケ）が、様々な加工品として処理される際、その頭部は不要とされることが多く、そのため切断された頭部は、一部魚粉に加工され利用されてはいるものの、その大半は産業廃棄物として廃棄処理されており、氷頭は、その様な廃棄物から簡便、安価かつ安定的に入手することができる。
　本発明では、氷頭の他、エイの軟骨組織、サメの軟骨組織等の魚類由来の軟骨組織、ニワトリの軟骨組織等の鳥類の軟骨組織、更にはウシの喉軟骨や気管支軟骨、クジラの軟骨等の哺乳動物由来の軟骨組織も使用することができる。更に、軟体動物であるイカやタコの表皮・軟骨組織にもプロテオグリカンが存在することが知られており、これら軟体動物の表皮・軟骨等も本発明で使用することができる。また、哺乳動物血液中には硫酸をほとんど含まないコンドロイチン・タンパク質複合体（ビクニン）が存在しており、このコンドロイチンは、哺乳動物血液中のムコ多糖のほぼ１００％を占めることが報告されている（Salier J.P., Rouet P., Raguenez G., Daveau M.: The inter-alpha-inhibitor family: from structure to regulation Biochem. J., 315, 1-9, 1996）ことから、哺乳動物の血液由来コンドロイチンも、本発明におけるプロテオグリカンを含む生物学的試料として使用できる。上記のプロテオグリカンを含む生物学的試料の多くは産業廃棄物であり、その入手は容易である。これらの原料は、界面活性剤水溶液への浸漬に先だって、表面積を増加させてプロテオグリカンの抽出量を上げるために、可能な限り細かく破砕すること、脱脂することなどの前処理を行なうことが好ましい。
　界面活性剤としては、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両面界面活性剤及び非イオン界面活性剤等の任意の界面活性剤が使用できる。中でも、食品添加物又は食品用乳化剤として承認されている、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、スクロース脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、大豆リン脂質（レシチン）、サポニン等が好ましく、サポニン、レシチン或いはスクロース脂肪酸エステル単体或いはこれらいずれかの混合物が特に好ましい。
　サポニンとしては、キラヤサポニン、大豆サポニン、茶サポニンが挙げられる。中でも、キラヤサポニンが好ましい。
　レシチンとしては、植物レシチン、分別レシチン、卵黄レシチン、酵素処理レシチン、酵素分解レシチンが挙げられる。中でも、ＨＬＢ ３～４の植物性レシチンが好ましい。
　スクロース脂肪酸エステルとしては、スクロース１分子に脂肪酸１分子が付加してできるスクロース脂肪酸モノエステル、脂肪酸２分子が付加してできるジエステル、脂肪酸３分子が付価してできるトリエステルが挙げられる。理論上は、スクロース脂肪酸エステルとしては、脂肪酸８分子の付加したオクタエステルまで存在し得るが、食品用に適するのは、モノエステル、ジエステル、トリエステル及びこれらいずれかの混合物である。中でも、エマルジョンの乳化安定性の観点から、ＨＬＢ １３～１９、特に１４～１９、最適にはＨＬＢ １９のスクロース脂肪酸エステルが好ましい。エマルジョンコストの低減の観点も加えれば、モノエステルとジエステルとトリエステルの混合物（以下、「スクロース脂肪酸混合エステル」ともいう）が望ましく、特に、ＨＬＢ １４～１６のスクロース脂肪酸混合エステルとＨＬＢ １９のスクロース脂肪酸モノエステルとの混合物が望ましい。脂肪酸としては、炭素数１０～２２の飽和又は不飽和脂肪酸が好ましく、炭素数１２～１８の飽和又は不飽和脂肪酸が更に好ましい。
　本発明で使用する界面活性剤の中でも、プロテオグリカンの抽出効率、後処理の簡便さ等から、スクロース脂肪酸エステル類が好ましく、特に、炭素数１２の飽和脂肪酸であるラウリン酸のスクロース脂肪酸エステルであるスクロースラウリン酸エステルが好ましい。
　界面活性剤水溶液中の界面活性剤の濃度は、好ましくは０．０１～２０重量％、特に好ましくは０．１～１０重量％、更に好ましくは０．５～５重量％である。浸漬時間は、必要に応じて適宜設定できるが、例えば０．１～２重量％の界面活性剤、例えばサポニン、レシチン若しくはスクロース脂肪酸エステル、又はこれらいずれかの混合物の水溶液を用いる場合の浸漬時間は、１０時間以上とすることが好ましい。また、２～５重量％の界面活性剤、例えばサポニン、レシチン若しくはスクロース脂肪酸エステル又はこれらいずれかの混合物の溶液を用いる場合の浸漬時間は、１２時間程度とすることが好ましい。これら条件により、より高い分子量のプロテオグリカンを効率的に回収し、製造することができる。
　界面活性剤水溶液への生物学的試料の浸漬は、好ましくは３０℃～１００℃、より好ましくは４０℃～８０℃、特に好ましくは５０℃～７０℃で行う。特に、浸漬温度を５０℃～６０℃とすることにより、プロテオグリカンは、ほとんど分解されず、高分子の糖タンパク質複合体として抽出することができる。
　浸漬は、軟骨１重量部に対して界面活性剤水溶液を、好ましくは１～５０重量部、より好ましくは２～３０重量部、更に好ましくは４～２０重量部、特に好ましくは６～１５重量部用いて行う。ミキサー又はスターラーなどを用いて攪拌しながら浸漬するのが好ましい。
　軟骨組織からのプロテオグリカンの抽出は、例えばカルバゾール法（Johnら、ANALYTICAL BIOCHEMISTRY、1967年、第19巻、第119-132頁）によってウロン酸量を検出ないし定量することでモニターすることができるが、その他公知の方法によってウロン酸を検出し、モニターしてもよい。
　浸漬が終了した界面活性剤水溶液は、プロテオグリカンを抽出した後の残渣を多く含むので、これらを濾過、遠心分離その他の方法で取り除くことが好ましい。
　プロテオグリカンを含む抽出液はそのまま製品として利用してもよいが、プロテオグリカンの各種用途に対して求められる純度にまで適当な方法でプロテオグリカンを分離ないし精製することが好ましい。
　本発明において、プロテオグリカンの精製方法には公知の精製方法を使用することができる。好ましい精製方法としては、遠心分離法を挙げることができる。遠心分離法によって、細かい固形物を沈殿残渣として簡便に除去することができる。
　また、遠心分離法によって回収されるプロテオグリカンを含む液相を、更にフィルターペーパー又は適当な分画分子量を有する限外濾過膜分離装置などを用いて濾過してもよい。排除分子量としては概ね５万～１００万の範囲であればよい。この操作において、分画分子量５０万以上のものを使用すれば、液相からコラーゲンも除去することができ、プロテオグリカンの純度を上げることが可能である。また、プロテオグリカンを含む液相に水を加えて液相の粘度を下げることで、膜の通過を容易にするとともに、これを繰り返すことで、わずかに生じる原料由来の特異臭を除去することも可能である。
　更に、得られた濃縮液を食塩飽和エタノールに加えることで、ゲル状のプロテオグリカンを回収することもできる。このゲル状プロテオグリカンは真空凍結乾燥機を用いて固形物にしてもよいし、スプレードライヤーで乾燥させ、粉末状固形物としてもよい。
　本発明のプロテオグリカンの分子量は、本発明の目的が達成できる限り特段限定されるものではないが、例えば１００万以上、好ましくは１５０万以上、更に好ましくは１８０万以上が好ましく、上限は特段制限されないが、例えば３００万程度以下が好ましい。
　分子量の測定方法としては、高速液体クロマトグラフィ装置を用いる方法が挙げられる。
　本発明のプロテオグリカンを含有する組成物（以下、本発明の組成物ともいう）は、対象に適用することにより、筋肉量若しくは筋力を向上又は維持することができる。
　「筋肉量若しくは筋力を向上又は維持する」とは、対象の筋肉量又は筋力を、適用前の状態に比べて向上又は維持することを意味する。したがって、本発明の組成物によれば、筋肉量の低下又は筋力の低下を防止することもできる。
　筋肉量又は筋力の測定方法は、特に制限されず、例えば、対象の筋肉量又は筋力を測定可能な器具や装置を用いて測定することができる。そのような器具又は装置としては、例えば、腕の筋力を測定する場合には、市販の握力計を用いたり、また、全身の筋肉量を測定する場合には、市販の体組成計を用いたりすることができる。
　対象となる筋肉は、特に制限されず、全身の筋肉を対象とすることができる。
　例えば、表情筋を対象とした場合には、顔の筋肉量又は筋力の低下を防止することができるので、結果的に、しわやたるみを防止することができる。
　例えば、骨格筋を対象とした場合には、身体を稼働する筋肉の筋肉量又は筋力の低下を防止することができるので、結果的に、寝たきりになることやロコモーティブシンドロームを防止することができるし、肥満を防止、体脂肪率を低下、体脂肪量を低下、又は除脂肪量を低下することにも繋がる。
　本発明の組成物の適用対象としては、特段限定されるものではないが、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、ヒト等の哺乳動物が挙げられる。本発明の組成物の適用対象としては、ヒト対象が好ましく、より好ましくは、健常なヒト対象であり、特に好ましくは、加齢などにより筋肉量又は筋力が低下している自覚がある健常なヒト対象である。
　本発明の組成物を対象に適用する方法は、特に制限されず、経口でも非経口でも適用することができる。したがって、本発明の組成物は、例えば、化粧料組成物、食品組成物、及び医薬組成物などに調製することができる。
　本発明の組成物には、必要に応じて、化粧料組成物、食品組成物、及び医薬組成物の製造において公知ないし周知の不活性成分を含めてもよいし、また、作用の増強や他の作用を期待して、本発明のプロテオグリカン以外の有効成分を含めてもよい。
　本発明の組成物に含められ得る不活性成分としては、本発明の効果が達成される限り特段制限されるものではないが、例えば、化粧料、食品又は医薬として許容される担体、例えば、賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤などが挙げられる。
　本発明の組成物の具体的な適用量や適用間隔は、対象の体重、性別、年齢、状態、適用経路、又はその他の要因に従って変動し得る。具体的な適用量や適用間隔は、当業者により適宜決定され得る。しかしながら、非限定的な具体例を挙げるとすれば、通常、経口投与の場合、成人１人（６０ｋｇ）に対して、本発明のプロテオグリカンの１日摂取量は、例えば５ｍｇ以上、好ましくは１０ｍｇ以上、より好ましくは２０ｍｇ以上、更に好ましくは３０ｍｇ以上であって、好ましくは１０００ｍｇ以下、より好ましくは５００ｍｇ以下、更に好ましくは２００ｍｇ、より更に好ましくは１００ｍｇ以下、なお更により好ましくは８０ｍｇ以下であり、そして、特に好ましくは４０ｍｇである。本発明ではこのような量を、１日に１回～複数回で適用するのが好ましい。
　適用期間は特に限定されないが、反復又は連続して適用することが好ましく、５日間以上連続して適用することがより好ましく、１２週間以上連続して適用することがなお更に好ましく、２４週間以上連続して適用することが特に好ましい。
　本発明の組成物の具体的な形状としては、本発明の効果が達成される限り特段の制限はない。
　本発明の組成物を化粧料組成物又は非経口医薬組成物として適用する場合には、例えば、皮膚外用剤などの剤形で適用することができる。皮膚外用剤の例としては、例えば、クリーム、ローション、乳液、ファンデーション、パック剤、フォーム剤、硬膏剤、軟膏剤、パップ剤、エアゾール剤などの形態が挙げられる。非経口医薬組成物として適用する場合には、例えば、注射剤などの剤形で適用してもよい。
　本発明の組成物を食品組成物又は経口医薬組成物として適用する場合には、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、トローチ剤、液剤、シロップ剤、懸濁剤などの剤形で適用することができる。また、食品組成物の形状には、清涼飲料水、茶系飲料、コーヒー飲料、果汁飲料、炭酸飲料、乳飲料、ゼリー、ウエハース、ビスケット、パン、麺、ソーセージなども挙げられる。
　食品組成物又は医薬組成物の形状としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、トローチ剤などの固形製剤が好ましく、簡便に摂取ができることから、錠剤及びカプセル剤が更に好ましく、錠剤が特に好ましい。
　本発明の組成物を錠剤とする場合には、結晶セルロース及び滑沢剤を含めることが好ましい。
　錠剤中における結晶セルロースの含有量は、１～８０重量％、好ましくは３～７５重量％である。錠剤中における結晶セルロースの含有割合が高すぎると、スティッキングが発生しやすくなる。逆に、結晶セルロースの含有割合が低すぎると、錠剤の硬度が低下する。
　錠剤中に含める滑沢剤としては、ステアリン酸カルシウム、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースカルシウム、スクロース脂肪酸エステル、ケイ酸カルシウム、ケイ酸マグネシウム、タルク及びシリカヒドロゲルなどの一般的に使用されている滑沢剤が挙げられるが、中でも、ステアリン酸カルシウム、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースカルシウムが好ましい。錠剤中における滑沢剤の含有量は、０．５～５質量％、好ましくは０．５～３質量％である。錠剤中における滑沢剤の含有割合が少なすぎると、錠剤の製造過程でスティッキングやキャッピングなどの障害が発生しやすくなる。逆に、滑沢剤の含有割合が多すぎると錠剤の成形性が悪くなり、十分な錠剤硬度が得られない。
　錠剤は、原料を同時に又は順次配合して均一に混合し、圧縮成形することにより製造することができる。圧縮成形法とは、一般的に打錠による製造法をいい、原料混合粉末から顆粒を造粒した後、これを圧縮成形する顆粒打錠法と、原料混合粉末をそのまま直接圧縮成形する直接打錠法とを含む。本発明の錠剤は打錠性が良好であるため、その製造法としては、顆粒打錠法及び直接打錠法のいずれを用いることもできるが、工程が簡便であるという点で直接打錠法が好ましい。打錠は、単発打錠機や、ロータリー打錠機等の連続打錠機を利用して、常法に従って行うことができる。打錠の圧力は、後述する所望される錠剤の大きさや硬度を考慮して適宜設定することができるが、例えば、２０００～４０００ｋｇｆに設定することができる。
　錠剤の大きさは、一般的な大きさ、例えば直径５～１２ｍｍ程度、質量１００～４００ｍｇ程度であればよいが、飲みやすさを考慮すると、直径５～１０ｍｍ程度、質量２００～３００ｍｇ程度であることが好ましい。錠剤の硬度は、一般的な錠剤の硬度、例えば６ｋｇｆ以上であればよいが、割れや欠け等の破損の抑制や、表面の平滑性、摂取後の崩壊性などを考慮すると、６．５～１５ｋｇｆ程度であることが好ましい。錠剤の硬度は、汎用の錠剤硬度計（例えば、フロイントの錠剤硬度計）を用いて測定することができる。
　以下に製造例及び実施例を用いて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
〔製造例１〕
　－４０℃で冷凍保管したシロサケの頭部から摘出した鼻軟骨を電動のミートチョッパーで細かく破砕しミンチ状にした。ミンチ状にした鼻軟骨から脱脂及び脱水を行った。処理後の鼻軟骨を通風又は減圧乾燥したもの２４ｇを出発原料とした。５リットルの抽出用容器にあらかじめ５℃に冷却しておいた蒸留水２９７０ｇを入れ、更に製造例１で使用した固形のスクロース脂肪酸エステル３０ｇを投入し、総量３０００ｇ（１重量％）のスクロース脂肪酸エステル水溶液を準備した。この抽出容器に出発原料２４ｇを投入し、スターラーを用いて攪拌しながら、１２時間浸漬した。
　浸漬終了後、内容物を１mm角のステンレススチール製こし器をセットした別の容器に移し、鼻軟骨を除去して、プロテオグリカンを含む抽出液を回収した。
　抽出液を日立ｈｉｍａｃＣＦ７Ｄ２型の遠心分離機を用いて３０００rpm、２０分の遠心分離を行い、固形分ならびに油脂分を除去して、プロテオグリカンを含む液相を回収した。
　更に、この液相をフィルターペーパー（アドバンテック社製）を用いて濾過し、濾液の６倍量の蒸留水を加えた後、日本ミリポア製　ＢＩＯＭＡＸ　１００Ｋ　ＰＯＬＹＥＴＨＥＲＳＵＬＦＯＮＥ（分画分子量１０万）を用いて分画と濃縮を同時に行った。
　得られた濃縮液の一部を採取し、液中の固形分重量を測定した。測定は、乾燥炉（ＹＡＭＡＴＯ　ＤＸ４０１）により、１０５℃、１６時間乾燥させ、完全に水分を蒸発させた後、残った固形分をデジタル計量器（Ａ＆Ｄ社　ＧＦ－４００）で精密に測定した。その結果、２４ｇの出発原料から、換算値でその２２．２１％に相当する５．５ｇの乾燥固形分を得ることができた。
　また、濃縮液をアミノ酸自動分析装置（日立製作所社製、Ｌ－８５００　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄ　Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いてアミノ酸量を測定することで濃縮液中のコラーゲン量を定量するとともに、ガランボス法によりウロン酸量を定量してプロテオグリカン量を計算した。更に高速液体クロマトグラフィ装置（島津製作所、カラムＴＳＫ－ＧＥＬ　Ｇ４０００ＰＷＸＬ）を用いて、プロテオグリカンの分子量を測定した。
　これらの分析の結果、固形分中にタンパク質１４．８％、灰分１８．４％、炭水化物６４．８％、脂質０％が存在することが判った。また、プロテオグリカンの分子量は約１３０万であった。
〔製造例２〕
　－４０℃で冷凍保管したシロサケの頭部から摘出した鼻軟骨を電動のミートチョッパーで細かく破砕しミンチ状にした。ミンチ状にした鼻軟骨から脱脂及び脱水を行った。処理後の鼻軟骨を通風又は減圧乾燥したもの１７．９ｇを出発原料とした。５リットルの抽出用容器にあらかじめ５℃に冷却しておいた蒸留水２４９５ｇを入れ、更に固形のキラヤサポニン５ｇを投入し、総量２５００ｇ（０．２重量％）のサポニン水溶液を準備した。この抽出容器に出発原料１７．９ｇを投入し、スターラーを用いて攪拌しながら、１２時間浸漬した。
　浸漬終了後、内容物を１mm角のステンレススチール製こし器をセットした別の容器に移し、鼻軟骨を除去して、プロテオグリカンを含む抽出液を回収した。
　抽出液を日立ｈｉｍａｃＣＦ７Ｄ２型の遠心分離機を用いて３０００rpm、２０分の遠心分離を行い、固形分ならびに油脂分を除去して、プロテオグリカンを含む液相を回収した。
　更に、この液相をフィルターペーパー（アドバンテック社製）を用いて濾過し、濾液の６倍量の蒸留水を加えた後、日本ミリポア製　ＢＩＯＭＡＸ　１００Ｋ　ＰＯＬＹＥＴＨＥＲＳＵＬＦＯＮＥ（分画分子量１０万）を用いて分画と濃縮を同時に行った。
　得られた濃縮液の一部を採取し、液中の固形分重量を測定した。測定は、乾燥炉（ＹＡＭＡＴＯ　ＤＸ４０１）により、１０５℃、１６時間乾燥させ、完全に水分を蒸発させた後、残った固形分をデジタル計量器（Ａ＆Ｄ社　ＧＦ－４００）で精密に測定した。その結果、１７．９ｇの出発原料から換算値でその１８．４１％に相当する３．２９ｇの乾燥固形分を得ることができた。
　また、濃縮液をアミノ酸自動分析装置（日立製作所社製、Ｌ－８５００　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄ　Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いてアミノ酸量を測定することで濃縮液中のコラーゲン量を定量するとともに、ガランボス法によりウロン酸量を定量してプロテオグリカン量を計算した。更に高速液体クロマトグラフィ装置（島津製作所、カラムＴＳＫ－ＧＥＬ　Ｇ４０００ＰＷＸＬ）を用いて、プロテオグリカンの分子量を測定した。
　これらの分析の結果、固形分中にタンパク質１７％、灰分２２．４％、炭水化物６０．６％、脂質０％が存在することが判った。また、プロテオグリカンの分子量は約１２０万であった。
〔製造例３〕
　－４０℃で冷凍保管したアオザメから摘出した軟骨を電動のミートチョッパーで細かく破砕しミンチ状にしたものを２００ｇ用意し、出発原料とした。５リットルの抽出用容器にあらかじめ０℃に冷却しておいた蒸留水２３７６ｇを入れ、更に固形のスクロース脂肪酸エステル（Ｃ１２；ＨＬＢ１４ ～１８）２４ｇを投入し、総量２４００ｇ（１重量％）のスクロース脂肪酸エステル水溶液を準備した。この抽出用容器に出発原料２００ｇを投入し、スターラーを用いて攪拌しながら、１２時間浸漬した。
　浸漬終了後、内容物を１mm角のステンレススチール製こし器をセットした別の容器に移し、プロテオグリカンを含む抽出液を回収した。
　抽出液をＩＷＡＫＩ　ＣＦＳ－４００型の遠心分離機を用いて１５００×ｇ、３０分の遠心分離を行い、固形分ならびに油脂分を除去して、プロテオグリカンを含む液相を回収した。
　更にこの液相を、フィルターペーパー（アドバンテック社製）を用いて濾過し、濾液の６倍量の蒸留水を加えた後、日本ミリポア製　ＰＲＥＰ／ＳＣＡＬＥ　ＴＦＦ膜（分画分子量１０万）を用いて分画と濃縮を同時に行った。
　得られた濃縮液の一部を採取し、液中の固形分重量を測定した。測定は、乾燥炉（ＹＡＭＡＴＯ　ＤＸ４０１）により、１０５℃、１６時間乾燥させ、完全に水分を蒸発させた後、残った固形分をデジタル計量器（Ａ＆Ｄ社　ＧＦ－４００）で精密に測定した。その結果、２００ｇの出発原料から、換算値でその２．７５％に相当する５．５ｇの乾燥固形分を得ることができた。
　また、濃縮液をアミノ酸自動分析装置（日立製作所社製、Ｌ－８５００　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄ　Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いてアミノ酸量を測定することで濃縮液中のコラーゲン量を定量するとともに、カルバゾール法によりウロン酸量を定量してプロテオグリカン量を計算した。
　更に高速液体クロマトグラフィ装置（島津製作所、カラムＡｓａｈｉｐａｋ）を用いて、プロテオグリカンの分子量を測定した。
　これらの分析の結果、固形分中にタンパク質３５％、灰分２１．５％、炭水化物４２．９％、脂質０．６％が存在することが判った。特許文献１によれば、プロテオグリカンのコアタンパク質の重量比は約７％と記載されており、従って本発明におけるプロテオグリカンは、炭水化物が約４２．９％であることから計算して、純度は約４６％と推定される。またプロテオグリカンの分子量は約２００万であった。
　上記の製造例３に示す操作において、スクロース脂肪酸エステル溶液の濃度を０．１％、５％、１０％に変えて２４時間浸漬、抽出を行ったときのプロテオグリカンの回収量（ウロン酸量）の経時変化を調べた結果、ほぼ同様な結果が得られた。
　また、上記の製造例１に示す操作において、スクロース脂肪酸エステルを０．６６６Ｎの酢酸に変えて２４時間浸漬、抽出を行ったときのプロテオグリカンの回収量（ウロン酸量）の経時変化を調べてみたところ、製造例３に比べて劣っていた。
〔実施例〕
　プラセボ対照ランダム化二重盲検並行群間比較法により、本発明の組成物の効果を試験した。
１．試験組成物の処方
　以下の実施例では、製造例１で製造したプロテオグリカン（以下、「プロテオグリカン複合体」ともいう。）を使用し、以下の処方の試験組成物を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　１錠が上記の組成を有するようになる割合で、各原料を混合し、得られた混合物を直接打錠して錠剤を製造した。
２．試験期間
　２４週間
３．投与方法
　１日１回１錠を、夕食後に水又は湯とともに被験者に摂取させた。
４．被験者
　以下の者を被験者として選択した。
（１）登録基準
ｉ．日本人
ｉｉ．成人男女
ｉｉｉ．健常者
ｉｖ．筋力の衰えを感じている者
（２）除外基準
ｉ．悪性腫瘍、心不全、心筋梗塞の治療中もしくは既往歴がある者
ｉｉ．ペースメーカーや植え込み型除細動器を埋め込んでいる者
ｉｉｉ．以下の慢性疾患で治療中の者
　　　　不整脈、肝障害、腎障害、脳血管障害、リウマチ、糖尿病、
　　　　脂質異常症、高血圧症、その他の慢性疾患
ｉｖ．サルコペニアと診断された者
ｖ．特定保健用食品、機能性表示食品、その他の機能性が考えられる食品／飲料を日頃から摂取している者
ｖｉ．医薬品（漢方薬を含む）・サプリメントを常用している者
ｖｉｉ．アレルギー（医薬品・試験食品関連食品）がある者
ｖｉｉｉ．妊娠中、授乳中、あるいは試験期間中に妊娠する意思のある者
ｉｘ．同意書取得日以前の３ヶ月間において他の臨床試験に参加していた者、あるいは試験期間中に参加予定のある者
ｘ．その他、試験責任医師が本試験の対象として不適切と判断した者
（３）選抜基準選抜基準
ｉ．試験責任医師が試験の参加に問題ないと判断した者試験責任医師が試験の参加に問題ないと判断した者
ｉｉ．以下の基準のうち、以下の基準のうち、２項目以上当てはまる者は除外する。
　　　ａ．握力が男性で握力が男性で２８ｋｇ未満、女性で未満、女性で１８ｋｇ未満の者未満の者
　　　ｂ．通常の歩行速度が通常の歩行速度が１ｍ／ｓ未満の者
　　　ｃ．骨格筋量が男性で骨格筋量が男性で７．０ｋｇ／ｍ２、女性で５．７ｋｇ／ｍ２未満の者
ｉｉｉ．筋肉量の値が相対的に低いもの筋肉量の値が相対的に低い者
５．評価項目
　以下の項目を評価した。
（１）握力
ｉ．実施内容：握力計を用い、実施医療機関にて握力を調査する。
ｉｉ．調査項目：握力
ｉｉｉ．評価方法：スクリーニング兼摂取前検査、摂取１２週間後検査及び摂取２４週間後検査で測定する。
（２）１０ｍ歩行テスト
ｉ．実施内容：１０ｍ歩行テストを行い、歩行能力を評価する。
ｉｉ．調査項目：歩行時間、歩数、歩幅、歩行率（単位時間における歩数）
ｉｉｉ．評価方法：スクリーニング兼摂取前検査、摂取１２週間後検査及び摂取２４週間後検査で測定する。
（３）Ｔｉｍｅ　ｕｐ　ａｎｄ　ｇｏ　Ｔｅｓｔ
ｉ．実施内容：Ｔｉｍｅ　ｕｐ　ａｎｄ　ｇｏ　Ｔｅｓｔを行い、歩行能力を評価する。
ｉｉ．調査項目：通常の歩行速度、最大の歩行速度
ｉｉｉ．評価方法：スクリーニング兼摂取前検査、摂取１２週間後検査及び摂取２４週間後検査で測定する。
６．アウトカム
（１）有効性評価項目
ｉ．主要アウトカム
　ａ．摂取２４週間後における筋肉量の実測値
ｉｉ．副次的アウトカム
　ａ．摂取１２週間後における筋肉量の実測値
　ｂ．摂取１２週間後、摂取２４週間後における筋肉量のスクリーニング兼摂取前検査時からの変化量
　ｃ．摂取１２週間後、摂取２４週間後における握力、歩行時間、歩数、歩幅、歩行率、通常の歩行速度、最大の歩行速度、体脂肪率、体脂肪量、除脂肪量、体重、高感度ＣＲＰ、Ｔｏｔａｌ　Ｐ１ＮＰ、ＢＡＰの実測値及びスクリーニング兼摂取前検査時からの変化量
７．試験結果
１．試験参加者
　本試験は筋力の衰えを感じている健常な日本人成人男女を対象とした。試験に同意した１１４名のうち適格基準を満たす５６名を本試験に組み入れ、被験食品群とプラセボ群に２８名ずつ割り付けた。
　摂取２４週間後に来院しなかった試験参加者は１名（被験食品群に１名）であった。
　Ｐｅｒ　ｐｒｏｔｏｃｏｌ　ｓｅｔ（ＰＰＳ）は、割り付け後のデータが全くない症例１名（被験食品群に１名）、試験品の摂取率が８０％未満の症例７名（プラセボ群に４名、被験食品群に３名）が除外された。Ｓａｆｅｔｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ（ＳＡＦ）は、割り付け後に安全性評価項目を一度も測定していない症例１名（被験食品群に１名）を除外した。よって、各解析データセットの症例数は、ＰＰＳが４８名（プラセボ群に２４名、被験食品群に２４名）であり、ＳＡＦが５５名（プラセボ群に２８名、被験食品群に２７名）であった。試験参加者の背景を以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
２．主要アウトカム
　筋肉量の平均値（Ｍｅａｎ）と標準偏差（ＳＤ）、推定周辺平均（ＥＭＭ）とその９５％信頼区間（９５％ＣＩ－、９５％ＣＩ＋）、ＥＭＭの群間差とその９５％ＣＩ－、９５％ＣＩ＋、統計解析結果を図１に示した。
　摂取２４週間後（２４ｗ）における筋肉量の実測値は、被験食品群がプラセボ群と比較して有意に高値を示した（Ｐ＝０．０４３）。
３．副次的アウトカム
３－１．筋肉量（主要アウトカムを除く）
　筋肉量のＭｅａｎとＳＤ、ＥＭＭとその９５％ＣＩ－、９５％ＣＩ＋、ＥＭＭの群間差｛スクリーニング兼摂取前検査（Ｓｃｒ）時はＭｅａｎの群間差｝とその９５％ＣＩ－、９５％ＣＩ＋、統計解析結果を図１に示す。
（１）実測値
　有意差が認められた時点のうち被験食品群がプラセボ群よりも高値を示した時点は、摂取１２週間後検査（１２ｗ）（Ｐ＝０．０１２）であった。
（２）変化量
　有意差が認められた時点のうち被験商品群がプラセボ群よりも高値を示した時点は、１２ｗ（Ｐ＝０．０１２）、２４ｗ（Ｐ＝０．０４３）であった。
３－２．筋肉量を除く身体測定、握力、１０ｍ歩行テスト、Ｔｉｍｅ　ｕｐ　ａｎｄ　ｇｏ　Ｔｅｓｔ、血液検査
　筋肉量を除く身体測定、握力、１０ｍ歩行テスト、Ｔｉｍｅ　ｕｐ　ａｎｄ　ｇｏ　Ｔｅｓｔ、血液検査のＭｅａｎとＳＤ、群間差と９５％ＣＩ－、９５％ＣＩ＋、統計解析結果を図２～４に示す。
（１）Ｓｃｒ
　有意差が認められた項目のうち被験食品群がプラセボ群よりも低値を示した項目は、ＢＡＰ（Ｐ＝０．０４５）であった。
（２）実測値
ａ．１２ｗ
　有意差が認められた項目のうち被験食品群がプラセボ群よりも低値を示した項目は、体脂肪率（Ｐ＝０．０１９）、脂肪量（Ｐ＝０．０３１）であり、高値を示した項目は、除脂肪量（Ｐ＝０．０１４）であった。
ｂ．２４ｗ
　有意差が認められた項目のうち被験食品群がプラセボ群よりも低値を示した項目は、体脂肪率（Ｐ＝０．００８）、脂肪量、（Ｐ＝０．００５）であり、高値を示した項目は、除脂肪量（Ｐ＝０．０４２）であった。
（３）変化量
ａ．１２ｗ－Ｓｃｒ
　有意差が認められた項目のうち被験食品群がプラセボ群よりも低値を示した項目は、体脂肪率（Ｐ＝０．０１９）、脂肪量（Ｐ＝０．０３１）であり、高値を示した項目は、除脂肪量（Ｐ＝０．０１４）であった。
ｂ．２４ｗ－Ｓｃｒ
　有意差が認められた項目のうち被験食品群がプラセボ群よりも低値を示した項目は、体脂肪率（Ｐ＝０．００８）、脂肪量（Ｐ＝０．００５）であり、高値を示した項目は、除脂肪量（Ｐ＝０．０４２）であった。
８．考察
　主要アウトカムに設定した摂取２４週間後の筋肉量は、被験食品群においてプラセボ群と比べて有意に高値を示し（図１）、推定周辺平均（ＥＭＭ）とその９５％信頼区間は、被験食品群が３６．６ｋｇ（３６．３　ｔｏ　３６．９）、プラセボ群が３６．１ｋｇ（３５．８　ｔｏ　３６．４）、群間差が０．４ｋｇ（０．０　ｔｏ　０．９）であった。また、摂取２４週間後におけるスクリーニング兼摂取前検査からの変化量も被験食品群がプラセボ群よりも有意に高値を示し、ＥＭＭとその９５％信頼区間は被験食品群が０．５ｋｇ（０．１　ｔｏ　０．８）、プラセボ群が０．０ｋｇ（－０．３　ｔｏ　０．３）、群間差が０．４ｋｇ（０．０　ｔｏ　０．９）であった（図１）。本試験はスクリーニング兼摂取前検査及び摂取２４週間後検査を冬季から夏季にかけて実施したが、冬季から夏季にかけては除脂肪量（体重から脂肪を除いた筋肉や内臓などの重量）が０．３ｋｇ～０．４ｋｇ変化するという報告がある（池内隆治、森本武利、西川弘恭、Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ　ｉｍｐｅｄａｎｃｅ法による体組成の季節変動－高齢者と青年の比較－、日生気誌、１９９４；３１（２）：６９－７３）。さらに、同一男性の７年間の体組成の変化を観察した岡ら（岡拓矢、加藤元海、ヒトにおける体重と体組成の変動パターン及び体脂肪率に変化を与える要因、黒潮圏科学、２０１２；５（２）：１６１－７）の報告では、７年間の骨格筋率の変動幅は０．７％であり、本試験の筋肉量にあてはめると０．４ｋｇ弱である。以上より、筋肉量の０．４ｋｇ以上の変化は臨床的に意義があると考えられる。また、筋肉量の０．４ｋｇ以上の変化は摂取１２週間後から確認されており、実測値及びスクリーニング兼摂取前検査からの変化量はいずれも被験食品群がプラセボ群よりも高値であった（図１）。そして、それぞれの群間差におけるＥＭＭとその９５％信頼区間は０．６ｋｇ（０．１　ｔｏ　１．０）であったことから、本試験において被験食品の摂取は摂取１２週間後以降から臨床的意義を持って筋肉量の増加に寄与すると考えられる。
　摂取１２週間後、摂取２４週間後においては筋肉量の他に、体脂肪率、脂肪量、除脂肪量に群間有意差が認められた（図３、４）。本試験の体組成の測定方法は体組成計ＭＣ－７８０Ａ－Ｎ３３）を用いた生体電気インピーダンス法（ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ　ｉｍｐｅｄａｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ：　ＢＩＡ法）である。除脂肪量は身長と生体の抵抗値（インピーダンス）から求められるが、大部分が筋組織であるため、ＢＩＡ法で測定する筋肉量は除脂肪量から推測される。したがって、生体内の骨格筋量が増加すれば、除脂肪量と筋肉量は同時に増加する。一方で、脂肪量は体重から除脂肪量を引いて求められるが、被験食品の摂取による体重への影響は認められなかったため（図３、４）、ＢＩＡ法の測定原理上、除脂肪量が増加すれば脂肪量は必然的に減少する。以上より、被験食品の摂取による骨格筋量の増加に伴って除脂肪量が増加し、必然的に脂肪量が減少した結果、体脂肪率も減少し、群間有意差が認められたと考えられる。
９．まとめ
　これら実施例の結果から、本発明の組成物が、筋肉量若しくは筋力を向上又は維持するのに有効であること、及び肥満を防止、体脂肪率を低下、体脂肪量を低下又は除脂肪量を低下するのに有効であることが確認された。
　本発明によれば、筋肉量若しくは筋力を向上又は維持すること、またそれにより、肥満を防止、体脂肪率を低下、体脂肪量を低下又は除脂肪量を低下することができる。また、本発明で使用するプロテオグリカンは、生物由来のものであり毒性が低い。更に、本発明で使用されるプロテオグリカンは、通常廃棄されるような原料から製造することができることから、本発明は、資源の有効活用に寄与し得、医療費等の上昇をも抑制し得るものである。
　本出願は、日本で出願された特願２０２２－１２４６６１号を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含される。

Claims (21)

  1. 　プロテオグリカンを含有する生物学的試料を界面活性剤の水溶液に浸漬する工程、及び浸漬後の溶液を回収する工程を含む、プロテオグリカンの製造方法によって得られたプロテオグリカンを含有する、筋肉量若しくは筋力を向上又は維持するための組成物。
  2. 　プロテオグリカンを含有する生物学的試料を界面活性剤の水溶液に浸漬する工程、及び浸漬後の溶液を回収する工程を含む、プロテオグリカンの製造方法によって得られたプロテオグリカンを含有する、肥満を防止、体脂肪率を低下、体脂肪量を低下、又は除脂肪量を低下するための組成物。
  3. 　界面活性剤が、サポニン、レシチン、スクロース脂肪酸エステルからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１又は２に記載の組成物。
  4. 　プロテオグリカンを含有する生物学的試料が、魚類、軟体動物、鳥類及び哺乳類の軟骨組織、筋肉繊維並びに皮からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１又は２に記載の組成物。
  5. 　プロテオグリカンを含有する生物学的試料が、魚類、鳥類及び哺乳類の軟骨組織からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項４に記載の組成物。
  6. 　健常なヒト対象の筋肉量若しくは筋力を向上又は維持するための、請求項１に記載の組成物。
  7. 　化粧料組成物、食品組成物、又は医薬組成物である、請求項１又は２に記載の組成物。
  8. 　プロテオグリカンを含有する生物学的試料を界面活性剤の水溶液に浸漬する工程、及び浸漬後の溶液を回収する工程を含む、プロテオグリカンの製造方法によって得られたプロテオグリカンの有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、筋肉量若しくは筋力を向上又は維持するための方法。
  9. 　プロテオグリカンを含有する生物学的試料を界面活性剤の水溶液に浸漬する工程、及び浸漬後の溶液を回収する工程を含む、プロテオグリカンの製造方法によって得られたプロテオグリカンの有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、肥満を防止、体脂肪率を低下、体脂肪量を低下、又は除脂肪量を低下するための方法。
  10. 　界面活性剤が、サポニン、レシチン、スクロース脂肪酸エステルからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項８又は９に記載の方法。
  11. 　プロテオグリカンを含有する生物学的試料が、魚類、軟体動物、鳥類及び哺乳類の軟骨組織、筋肉繊維並びに皮からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項８又は９に記載の方法。
  12. 　プロテオグリカンを含有する生物学的試料が、魚類、鳥類及び哺乳類の軟骨組織からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１１に記載の方法。
  13. 　健常なヒト対象の筋肉量若しくは筋力を向上又は維持するための、請求項８に記載の方法。
  14. 　筋肉量若しくは筋力の向上又は維持に使用するためのプロテオグリカンであって、プロテオグリカンを含有する生物学的試料を界面活性剤の水溶液に浸漬する工程、及び浸漬後の溶液を回収する工程を含む、プロテオグリカンの製造方法によって得られた、プロテオグリカン。
  15. 　肥満の防止、体脂肪率の低下、体脂肪量の低下、又は除脂肪量の低下に使用するためのプロテオグリカンであって、プロテオグリカンを含有する生物学的試料を界面活性剤の水溶液に浸漬する工程、及び浸漬後の溶液を回収する工程を含む、プロテオグリカンの製造方法によって得られた、プロテオグリカン。
  16. 　界面活性剤が、サポニン、レシチン、スクロース脂肪酸エステルからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１４又は１５に記載のプロテオグリカン。
  17. 　プロテオグリカンを含有する生物学的試料が、魚類、軟体動物、鳥類及び哺乳類の軟骨組織、筋肉繊維並びに皮からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１４又は１５に記載のプロテオグリカン。
  18. 　プロテオグリカンを含有する生物学的試料が、魚類、鳥類及び哺乳類の軟骨組織からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１７に記載のプロテオグリカン。
  19. 　健常なヒト対象の筋肉量若しくは筋力を向上又は維持するための、請求項１４に記載のプロテオグリカン。
  20. 　筋肉量若しくは筋力を向上又は維持するためのプロテオグリカンの使用であって、プロテオグリカンが、プロテオグリカンを含有する生物学的試料を界面活性剤の水溶液に浸漬する工程、及び浸漬後の溶液を回収する工程を含む、プロテオグリカンの製造方法によって得られたものである、使用。
  21. 　肥満を防止、体脂肪率を低下、体脂肪量を低下、又は除脂肪量を低下するためのプロテオグリカンの使用であって、プロテオグリカンが、プロテオグリカンを含有する生物学的試料を界面活性剤の水溶液に浸漬する工程、及び浸漬後の溶液を回収する工程を含む、プロテオグリカンの製造方法によって得られたものである、使用。
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