WO2024003227A1

WO2024003227A1 - Artificial peptide having pkmt-inhibitory effect

Info

Publication number: WO2024003227A1
Application number: PCT/EP2023/067788
Authority: WO
Inventors: Albert Jeltsch; Philipp SCHNEE; Sara WEIRICH
Original assignee: Universität Stuttgart
Priority date: 2022-06-29
Filing date: 2023-06-29
Publication date: 2024-01-04
Also published as: DE102022116235A1

Abstract

The invention relates to an artificial peptide having a length in the range of 10 to 20 amino acids with an amino acid sequence derived from a section of a substrate for a protein lysine methyltransferase, the peptide having a strong binding affinity to protein lysine methyltransferase, the amino acid sequence allowing a loop structure to be formed, and the peptide having inhibitory effect on the enzymatic activity of the protein lysine methyltransferase.

Description

Artifizielles Peptid mit PKMT-inhibitorischer Wirkung Artificial peptide with PKMT inhibitory activity

Die Erfindung betrifft ein artifizielles Peptid mit einer starken Bindungsaffinität zu einer Protein-Lysin-Methyltransferase, ein Verfahren zum Herstellen des Peptides sowie Verwendungen des Peptides. The invention relates to an artificial peptide with a strong binding affinity to a protein lysine methyltransferase, a method for producing the peptide and uses of the peptide.

Die menschliche Erbinformation ist im Zellkern einer jeden Zelle in Form von Chromatin als Komplex der DNA mit Histonproteinen gespeichert. Welche Gene daraus an- oder abgeschaltet werden, entscheidet die Organisation des Chromatins. Protein-Lysin-Methyltransferasen (PKMT) sind Enzyme, die im Zellkern agieren und maßgeblich die Struktur und Organisation des Chromatins beeinflussen [Boriack-Sjodin & Swinger, 2015], Um das zu bewerkstelligen, binden PKMTs an Regionen der Histonproteine (auch Histonpeptide genannt) und übertragen auf Lysinreste in diesen Strukturen eine oder mehrere Methylgruppen. Häufig finden diese Lysinmethylierungen in den unstrukturierten N-terminalen Enden der Histonproteine statt. Die Interaktion zwischen der PKMT und den Histonpeptiden ist dabei von elementarer Bedeutung. Verschiedene PKMTs fügen Methylgruppen an verschiedenen Stellen an verschiedenen Histonpeptiden ein, und ein spezifisches Interaktionsmuster sorgt dafür, dass exakt die richtige Bindestelle gefunden und methyliert wird. The human genetic information is stored in the nucleus of every cell in the form of chromatin as a complex of DNA with histone proteins. The organization of the chromatin determines which genes are switched on or off. Protein lysine methyltransferases (PKMT) are enzymes that act in the cell nucleus and significantly influence the structure and organization of chromatin [Boriack-Sjodin & Swinger, 2015]. To accomplish this, PKMTs bind to regions of histone proteins (also called histone peptides). and transfer one or more methyl groups to lysine residues in these structures. These lysine methylations often take place in the unstructured N-terminal ends of the histone proteins. The interaction between the PKMT and the histone peptides is of fundamental importance. Different PKMTs insert methyl groups at different locations on different histone peptides, and a specific interaction pattern ensures that exactly the right binding site is found and methylated.

Der Einbau der Methylgruppe durch PKMTs wird mithilfe eines Kofaktors bewerkstelligt, der eine aktivierte Methylgruppe zur Verfügung stellt. Dieser Kofaktor heißt S-Adenosyl-L-Methionin (SAM) und bindet zusammen mit dem Histonpeptid in dem aktiven Zentrum der PKMT (Fig. 1 ) [Boriack-Sjodin & Swinger, 2015], Die übertragene Methylgruppe fungiert danach als Signal und setzt eine Kaskade in Gang, die zur Restrukturierung des Chromatins führt [Ailis & Jenuwein, 2016], Diese Restrukturierung entscheidet darüber welche Gene angeschaltet werden und welche nicht [Ailis & Jenuwein, 2016], Damit nehmen PKMTs eine zentrale Rolle in der Genregulation ein. The incorporation of the methyl group by PKMTs is accomplished using a cofactor that provides an activated methyl group. This cofactor is called S-Adenosyl-L-Methionine (SAM) and binds together with the histone peptide in the active site of the PKMT (Fig. 1) [Boriack-Sjodin & Swinger, 2015]. The transferred methyl group then acts as a signal and sets a Cascade in motion, which leads to the restructuring of the chromatin [Ailis & Jenuwein, 2016], This restructuring decides which genes are switched on and which are not [Ailis & Jenuwein, 2016], so PKMTs play a central role in gene regulation.

Eine fehlerhafte Methylierung von Histonen und anderen Proteinen kann weitreichende Folgen verursachen. Mutationen in der PKMT führen beispielsweise zu einer Hyperaktivität der PKMT und damit zu einem Überfluss an übertragenen Methylgruppen [Kudithipudi & Jeltsch, 2014], Diese Übermethylierung führt zu einer gestörten Genregulation, welche sich in der Entstehung verschiedener Krebsformen äußern kann [Kudithipudi & Jeltsch, 2014], Gleichermaßen kann auch eine Fehlregulation oder Überexpression der PKMT zu fehlerhaften Histon-Methylierungsmustern führen. Hyperaktivität von PKMTs zu unterbinden ist deshalb ein vielversprechender Ansatz für viele Krebspatienten und wird bereits in klinischen Phasen getestet [Copeland, 2018], Incorrect methylation of histones and other proteins can have far-reaching consequences. Mutations in the PKMT lead, for example to hyperactivity of the PKMT and thus to an overabundance of transferred methyl groups [Kudithipudi & Jeltsch, 2014]. This overmethylation leads to disturbed gene regulation, which can manifest itself in the development of various forms of cancer [Kudithipudi & Jeltsch, 2014]. Likewise, a Dysregulation or overexpression of PKMT leads to defective histone methylation patterns. Preventing hyperactivity of PKMTs is therefore a promising approach for many cancer patients and is already being tested in clinical phases [Copeland, 2018],

In vielen herkömmlichen Ansätzen, PKMTs zu inhibieren, wird versucht, das Zusammenspiel zwischen PKMT und dem Kofaktor SAM zu stören [Schapira, 2016; Copeland, 2018], Das wird mithilfe von Inhibitoren versucht, die so entworfen sind, dass sie anstelle von SAM von der PKMT gebunden werden (sog. kompetitive Inhibitoren, hier kompetitiv für SAM). Durch die Bindung des Inhibitors wird das Enzym blockiert und es kann keine Methylgruppe mehr übertragen werden. Many conventional approaches to inhibit PKMTs attempt to disrupt the interaction between PKMT and the cofactor SAM [Schapira, 2016; Copeland, 2018], This is attempted using inhibitors that are designed to be bound by the PKMT instead of SAM (so-called competitive inhibitors, here competitive for SAM). When the inhibitor binds, the enzyme is blocked and no methyl group can be transferred.

Die Anwendung von SAM-Inhibitoren für PKMTs ist allerdings problematisch in Bezug auf die Spezifität der Moleküle, weil auch andere Methyltransferase- Enzymfamilien, wie z.B. DNA-Methyltransferasen, RNA-Methyltransferasen oder Protein Arginin Methyltransferasen, SAM als Donor für Methylgruppen verwenden. SAM-Derivate können daher auch mit ihnen interagieren und ihre Aktivität beeinflussen. In definierten Krebsformen sind darüber hinaus immer spezifische PKMTs in ihrer Aktivität verändert und diese müssen spezifisch reguliert werden [Kudithipudi & Jeltsch, 2014; Copeland et al. 2013], Spezifische PKMT Inhibitoren wären außerdem wertvolle Reagenzien in der Forschung, die es erlauben die biologische Funktion einer bestimmten PKMT genauer zu untersuchen. However, the use of SAM inhibitors for PKMTs is problematic in terms of the specificity of the molecules because other methyltransferase enzyme families, such as DNA methyltransferases, RNA methyltransferases or protein arginine methyltransferases, also use SAM as a donor for methyl groups. SAM derivatives can therefore also interact with them and influence their activity. In defined forms of cancer, the activity of specific PKMTs is always altered and these must be specifically regulated [Kudithipudi & Jeltsch, 2014; Copeland et al. 2013], Specific PKMT inhibitors would also be valuable reagents in research that allow the biological function of a specific PKMT to be examined in more detail.

Es besteht daher die Aufgabe, einen dringenden Bedarf an Inhibitoren zu erfüllen, die spezifisch bestimmte PKMTs hemmen. The task is therefore to meet an urgent need for inhibitors that specifically inhibit certain PKMTs.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 , ein artifiziellesThis task is achieved by a method according to claim 1, an artificial one

Peptid gemäß Anspruch 8, eine Verwendung gemäß Anspruch 14 sowie eine Verwendung gemäß Anspruch 15 gelöst. Weitere vorteilhafte Ausführungsformen und Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen, den Abbildungen und den Ausführungsbeispielen. Die Ausführungsformen der Erfindung sind in vorteilhafter Weise kombinierbar. A peptide according to claim 8, a use according to claim 14 and one Use solved according to claim 15. Further advantageous embodiments and refinements of the invention result from the subclaims, the illustrations and the exemplary embodiments. The embodiments of the invention can be combined in an advantageous manner.

Ein erster Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen eines artifiziellen Peptides mit einer Länge im Bereich von 10 bis 20 Aminosäuren mit einer aus einem Abschnitt eines Substrats für eine Protein-Lysin-Methyltrans- ferase (PKMT) abgeleiteten Aminosäuresequenz, wobei das Peptid eine starke Bindungsaffinität zu einer PKMT aufweist, mit den Schritten: A first aspect of the invention relates to a method for producing an artificial peptide with a length in the range of 10 to 20 amino acids with an amino acid sequence derived from a portion of a substrate for a protein lysine methyltransferase (PKMT), wherein the peptide has a strong Has binding affinity to a PKMT, with the steps:

- Identifizieren eines PKMT-Peptid-Substrats mit maximaler Methylierbarkeit in einem ersten Designprozess S1 , wobei - Identifying a PKMT peptide substrate with maximum methylation in a first design process S1, where

- in einem ersten Unterschritt S1.1 ein Peptidarray mit ersten Peptiden mit einer Länge von 10 bis 20 Aminosäuren mit aus einem Abschnitt des Substrats für eine PKMT abgeleiteten Aminosäuresequenzen bereitgestellt wird, wobei die ersten Peptide verschiedene Aminosäuresequenz-Varianten und jeweils mindestens eine zu methylierende basische Aminosäure aufweisen, und Methylieren der Peptide durch eine PKMT, - In a first substep S1.1, a peptide array with first peptides with a length of 10 to 20 amino acids with amino acid sequences derived from a section of the substrate for a PKMT is provided, the first peptides having different amino acid sequence variants and each having at least one basic one to be methylated amino acid, and methylation of the peptides by a PKMT,

- in einem zweiten Unterschritt S1 .2 mindestens ein erstes Peptid identifiziert wird, das im Vergleich mit bekannten Substratpeptiden einer bestimmten Protein-Lysin-Methyltransferase eine besonders starke Me- thylierbarkeit aufweist, - in a second sub-step S1.2, at least one first peptide is identified which has a particularly strong methylation ability compared to known substrate peptides of a specific protein lysine methyltransferase,

- in einem dritten Unterschritt S1.3 Design und Herstellen von abgeleiteten Peptiden, deren Aminosäuresequenz das Ausbilden einer Schleifenstruktur ermöglichen soll und eine zu methylierende basische Aminosäure im Zentrum der Schleifenstruktur positioniert sein soll,- in a third substep S1.3 design and manufacture of derived peptides, the amino acid sequence of which should enable the formation of a loop structure and a basic amino acid to be methylated should be positioned in the center of the loop structure,

- in einem vierten Unterschritt S1 .4 Testen der Methylierbarkeit der abgeleiteten Peptide, - in a fourth sub-step S1 .4 testing the methylationability of the derived peptides,

- Optimieren der Bindung der artifiziellen Peptide an die PKMT in einem zweiten Designprozess S2, wobei - in einem ersten Unterschritt 2.1 Herstellen von abgeleiteten Peptiden aus S1 , deren Aminosäuresequenz das Ausbilden einer Schleifenstruktur ermöglichen soll, wobei eine zu methylierende basische Aminosäure im Zentrum der Schleifenstruktur positioniert sein soll, und Identifizieren von mindestens einem Peptid, das im Vergleich mit bekannten Substratpeptiden einer bestimmten Protein-Lysin-Methyltransferase eine besonders starke Bindung aufweist, - Optimizing the binding of the artificial peptides to the PKMT in a second design process S2, where - in a first sub-step 2.1 producing derived peptides from S1, the amino acid sequence of which should enable the formation of a loop structure, with a basic amino acid to be methylated being positioned in the center of the loop structure, and identifying at least one peptide which, in comparison with known substrate peptides, is one certain protein lysine methyltransferase has a particularly strong bond,

- in einem zweiten Unterschritt 2.2 Design und Herstellen von abgeleiteten Peptiden auf der Basis der beim bisherigen Designprozess erhaltenen Daten, deren Aminosäuresequenz das Ausbilden einer Schleifenstruktur ermöglichen soll, wobei eine zu methylierende basische Aminosäure im Zentrum der Schleifenstruktur positioniert sein soll,- in a second sub-step 2.2 design and manufacture of derived peptides based on the data obtained in the previous design process, the amino acid sequence of which should enable the formation of a loop structure, with a basic amino acid to be methylated being positioned in the center of the loop structure,

- in einem dritten Unterschritt S2.3 Testen der Bindungsaktivität der abgeleiteten Peptide, wobei die Schritte S2.2 und S2.3 bei Bedarf zyklisch wiederholt werden, - in a third sub-step S2.3 testing the binding activity of the derived peptides, with steps S2.2 and S2.3 being repeated cyclically if necessary,

- Optimieren der Hemmung der PKMT durch die artifiziellen Peptide in einem dritten Designprozess S3, wobei - Optimizing the inhibition of PKMT by the artificial peptides in a third design process S3, where

- auf der Basis der beim bisherigen Designprozess erhaltenen Daten abgeleitete Peptide hergestellt werden, deren Aminosäuresequenz das Ausbilden einer Schleifenstruktur ermöglichen soll, wobei eine zu methylierende basische Aminosäure im Zentrum der Schleifenstruktur positioniert sein soll, und anschließend die Hemmung der PKMT durch die Peptide untersucht wird, um mindestens ein Peptid zu identifizieren, das eine besonders starke Hemmung der PKMT aufweist, wobei der dritte Designprozess bei Bedarf wiederholt werden kann. - derived peptides are produced on the basis of the data obtained in the previous design process, the amino acid sequence of which should enable the formation of a loop structure, with a basic amino acid to be methylated being positioned in the center of the loop structure, and the inhibition of PKMT by the peptides is then examined, to identify at least one peptide that exhibits particularly strong inhibition of PKMT, whereby the third design process can be repeated if necessary.

Die Schritte werden auch als Designprozess bezeichnet, die sich in Unterschritte gliedern. In einem ersten Designprozess werden zunächst in mehreren Zyklen artifizielle Substratpeptide identifiziert, die mit möglichst großer Rate von der PKMT methyliert werden. Im nächsten Designprozess werden dann in mehreren Zyklen artifizielle Substratpeptide identifiziert, die mit möglichst gro- ßer Affinität an die PKMT binden. Im dritten Designprozess werden dann daraus Peptide identifiziert, welche die PKMT mit möglichst hoher Effizienz hemmen. The steps are also known as the design process, which are divided into sub-steps. In an initial design process, artificial substrate peptides are identified in several cycles that are methylated by the PKMT at the highest possible rate. In the next design process, artificial substrate peptides are identified in several cycles that have the largest possible bind to the PKMT via affinity. In the third design process, peptides are then identified that inhibit PKMT with the highest possible efficiency.

Dabei werden die Peptide aus dem zweiten Designprozesses mit einer Länge im Bereich von 10 bis 20 Aminosäuren hergestellt, die auf der Aminosäuresequenz des identifizierten Substratpeptids beruhen, wobei die Aminosäuresequenz der abgeleiteten Peptide ein Ausbilden einer Schleifenstruktur ermöglichen soll und eine zu methylierende basische Aminosäure im Zentrum der Schleifenstruktur positioniert sein soll. Anschließend wird die Hemmung der PKMT durch diese Peptide untersucht, um mindestens ein Peptid zu identifizieren, das eine besonders starke Hemmung aufweist. The peptides from the second design process are produced with a length in the range of 10 to 20 amino acids, which are based on the amino acid sequence of the identified substrate peptide, the amino acid sequence of the derived peptides being intended to enable the formation of a loop structure and a basic amino acid to be methylated in the center of the Loop structure should be positioned. The inhibition of PKMT by these peptides is then examined in order to identify at least one peptide that exhibits particularly strong inhibition.

Mit anderen Worten wird das Verfahren mit ersten Peptiden gestartet, aus denen die abgeleiteten Peptide abgeleitet werden, aus denen wiederum ein neues Peptid identifiziert wird. Dieser Prozess kann mehrfach durchlaufen werden und optimiert schrittweise die Methylierbarkeit, Bindung und Hemmwirkung der abgeleiteten Peptide. Die finalen, am besten interagierenden und hemmenden Peptide sind identisch mit dem erfindungsgemäßen artifiziellen Peptid. In other words, the process is started with first peptides, from which the derived peptides are derived, from which a new peptide is in turn identified. This process can be repeated several times and gradually optimizes the methylation, binding and inhibitory effects of the derived peptides. The final, best interacting and inhibitory peptides are identical to the artificial peptide according to the invention.

Es hat sich überraschend herausgestellt, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren mindestens ein Peptid identifiziert werden kann, das die Aktivität einer PKMT inhibiert. It has surprisingly been found that the method according to the invention can be used to identify at least one peptide that inhibits the activity of a PKMT.

Der Begriff der Schleifenstruktur bezieht sich auf eine Konformation eines Proteins bzw. im Sinne der Erfindung eines Peptids, die im biochemischen Sinne des Schlüssel-Schloss-Prinzips besonders gut zur Bindungstasche des Enzyms passt. Die Schleifenstruktur ist insbesondere ein Strukturelement, in dem eine sich zurückfaltende Schleife („Schleifenbereich“) durch Wechselwirkungen der Aminosäuren vor und nach dem Schleifenbereich stabilisiert wird („Stammbereich“). Eine Positionierung der zu methylierenden basischen Aminosäure im Zentrum der Schleifenstruktur bedeutet hierbei, dass die zu methylierende basische Aminosäure im Schleifenbereich positioniert ist. Eine vorteilhafte Form einer Schleifenstruktur bezieht sich auf eine U-förmige Struktur des Peptids mit einem kurzen Ende-zu-Ende-Abstand. Dabei wird eine Haarnadel-artige Schleife des Peptids gebildet. Es sind auch andere Konformationen möglich. The term loop structure refers to a conformation of a protein or, in the sense of the invention, a peptide, which fits particularly well to the binding pocket of the enzyme in the biochemical sense of the key-lock principle. The loop structure is in particular a structural element in which a folding-back loop (“loop region”) is stabilized by interactions of the amino acids before and after the loop region (“stem region”). Positioning the basic amino acid to be methylated in the center of the loop structure means that the basic amino acid to be methylated is positioned in the loop area. An advantageous form of a loop structure refers to a U-shaped structure of the peptide with a short end-to-end distance. A hairpin-like loop of the peptide is formed. Other conformations are also possible.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird als Substrat für eine PKMT ein Histonprotein gewählt. In a preferred embodiment of the method, a histone protein is chosen as the substrate for a PKMT.

Vorzugsweise ist die besagte basische Aminosäure eine proteinogene, nichtproteinogene oder modifizierte Aminosäure. Preferably said basic amino acid is a proteinogenic, non-proteinogenic or modified amino acid.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ist die basische Aminosäure Lysin. In a preferred embodiment of the method, the basic amino acid is lysine.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens übertrifft die starke Bindungsaffinität des Peptids zu einer PKMT die Bindungsaffinität eines natürlichen Histonproteins. In a preferred embodiment of the method, the strong binding affinity of the peptide to a PKMT exceeds the binding affinity of a natural histone protein.

Die Begriffe „stark“ und „besonders stark“ in Bezug auf die Bindung von Peptiden an eine PKMT, die durch einen Grad der Methylierung veranschaulicht werden kann, sind relativ zu anderen Peptiden zu sehen. Dabei ist eine starke Bindung um ein mehrfaches höher als die herkömmlicher Peptide. Sehr starke Bindungen sind wiederum sind um ein mehrfaches höher als die von stark bindenden Peptiden. The terms “strong” and “particularly strong” in relation to the binding of peptides to a PKMT, which can be illustrated by a degree of methylation, are to be seen relative to other peptides. A strong bond is several times higher than that of conventional peptides. Very strong bonds are several times higher than those of strongly binding peptides.

In diesem Sinne ist eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens vorteilhaft, in der eine PKMT gewählt wird, die in Bezug auf ihre Enzymaktivität mit einer Krankheit korreliert ist. Dadurch wird das Design eines Peptids ermöglicht, das zum Behandeln einer entsprechenden Krankheit geeignet ist. In this sense, a preferred embodiment of the method is advantageous in which a PKMT is chosen that is correlated with a disease in terms of its enzyme activity. This enables the design of a peptide that is suitable for treating a corresponding disease.

Es ist besonders bevorzugt, wenn in dem Verfahren eine PKMT gewählt wird, die in Bezug auf ihre Enzymaktivität mit einer Krebskrankheit korreliert ist. Dadurch kann vorteilhaft ein Peptid bereitgestellt werden, das zum Behandeln einer Krebskrankheit geeignet ist. It is particularly preferred if a PKMT is chosen in the method that is correlated with a cancer disease in terms of its enzyme activity. This can advantageously provide a peptide that is suitable for treating a cancer disease.

Es ist ganz besonders bevorzugt, wenn in dem Verfahren eine PKMT aus einer Gruppe umfassend NSD2, SETD2, EZH2 und DOT1 L gewählt wird. Für diese PKMT konnte gezeigt werden, dass sie mit der Entstehung bestimmter Krebsarten korreliert werden. Es ist daher besonders vorteilhaft, wenn ein Peptid zum Hemmen dieser PKMT bereitgestellt werden, das zum Behandeln entsprechender Krebsarten geeignet ist. It is particularly preferred if, in the process, a PKMT is selected from a group comprising NSD2, SETD2, EZH2 and DOT1L. For this PKMT has been shown to be correlated with the development of certain types of cancer. It is therefore particularly advantageous if a peptide for inhibiting this PKMT is provided that is suitable for treating corresponding types of cancer.

Ein zweiter Aspekt der Erfindung betrifft ein durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestelltes artifizielles Peptid mit einer Länge im Bereich von 10 bis 20 Aminosäuren mit einer aus einem Abschnitt eines Substrats für eine Pro- tein-Lysin-Methyltransferase (PKMT) abgeleiteten Aminosäuresequenz, wobei das Peptid eine starke Bindungsaffinität zu einer PKMT aufweist. Die spezielle Aminosäuresequenz ermöglicht eine Ausbildung einer Schleifenstruktur. Eine zu methylierende basische Aminosäure ist im Zentrum der Schleifenstruktur positioniert. Das Peptid weist eine inhibitorische Wirkung auf die Enzymaktivität der Protein-Lysin-Methyltransferase auf. A second aspect of the invention relates to an artificial peptide produced by the method according to the invention with a length in the range of 10 to 20 amino acids with an amino acid sequence derived from a section of a substrate for a protein lysine methyltransferase (PKMT), the peptide being a has strong binding affinity to a PKMT. The special amino acid sequence enables the formation of a loop structure. A basic amino acid to be methylated is positioned at the center of the loop structure. The peptide has an inhibitory effect on the enzyme activity of protein lysine methyltransferase.

Das erfindungsgemäße Peptid ist vorteilhaft, weil es hochspezifisch eine bestimmte PKMT bindet und damit die Aktivität der PKMT reduziert wird. Die initiale Bindung erfolgt in einer Schleifen-Konformation, in der das erfindungsgemäße Peptid schneller und effizienter an die PKMT binden kann. Die finale Bindung im aktiven Zentrum der PKMT kann in einer Schleifen-Konformation oder nach Auffalten in einer gestreckten Form erfolgen. Die inhibitorische Wirkung der Peptide tritt durch eine kompetitive Inhibition der Bindung des Histonproteins an die Protein-Lysin-Methyltransferase ein. Dadurch wird die Bindung von Histonen (d.h. der echten Substrate) an die entsprechenden PKMT selektiv unterbunden. Vorteilhaft spezifisch ist das erfindungsgemäße Peptid in diesem Kontext gegenüber herkömmlichen Ansätzen, weil es nicht die SAM Bindungsstelle des Enzyms adressiert und damit nicht andere Methyltrans- ferasen oder andere PKMTs inhibiert. Weiterhin kann das erfindungsgemäße Peptid zum Untersuchen der biologischen Funktion einer bestimmten PKMT genutzt werden. The peptide according to the invention is advantageous because it binds a specific PKMT in a highly specific manner and thus reduces the activity of the PKMT. The initial binding occurs in a loop conformation in which the peptide according to the invention can bind to the PKMT more quickly and efficiently. The final binding in the active site of the PKMT can occur in a loop conformation or in an extended form after unfolding. The inhibitory effect of the peptides occurs through a competitive inhibition of the binding of the histone protein to the protein lysine methyltransferase. This selectively prevents the binding of histones (i.e. the real substrates) to the corresponding PKMT. In this context, the peptide according to the invention is advantageously specific compared to conventional approaches because it does not address the SAM binding site of the enzyme and therefore does not inhibit other methyltransferases or other PKMTs. Furthermore, the peptide according to the invention can be used to examine the biological function of a specific PKMT.

Es hat sich überraschend herausgestellt, dass ein Peptid mit einer Schleifenstruktur von PKMT effizienter als das entsprechende lineare Peptid methyliert wird und es schneller und effizienter an die PKMT assoziiert. Es ist daher vorteilhaft, im Design des erfindungsgemäßen Peptids eine Schleifen-Konformation vorzusehen. Weitere Arbeiten zeigten, dass die Ausbildung einer Schleifenstruktur eine schnellere Bindung an eine erwünschte PKMT ermöglicht (zur Veranschaulichung siehe Fig. 6). It was surprisingly found that a peptide with a loop structure of PKMT methylates more efficiently than the corresponding linear peptide and it associates with the PKMT more quickly and efficiently. It is therefore advantageous to provide a loop conformation in the design of the peptide according to the invention. Further work showed that the formation of a loop structure allows for faster binding to a desired PKMT (see Figure 6 for illustration).

Die Schleifenstruktur kann insbesondere durch eine chemische Bindung ausgewählt aus der Gruppe kovalente Bindung, Wasserstoffbrückenbindung oder hydrophobe Wechselwirkung zusammengehalten werden. Besonders vorteilhaft ist eine kovalente Bindung, die stabil ist und sich über eine Reaktion funktioneller Gruppen, die sich im Rahmen der chemischen Synthese der Peptide einbauen lassen, verwirklichen lässt. Geeignet ist z.B. die Ausbildung einer Disulfidbrücke über zwei Cystein-Reste. Vorteilhaft sind daher Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Peptides, deren Aminosäuresequenz jeweils mindestens zwei Aminosäuren aufweist, die miteinander eine die Schleifenstruktur stabilisierende Disulfidbrücke oder eine andere chemische Bindung ausbilden können. The loop structure can be held together in particular by a chemical bond selected from the group of covalent bonds, hydrogen bonds or hydrophobic interactions. A covalent bond that is stable and can be achieved via a reaction of functional groups that can be incorporated during the chemical synthesis of the peptides is particularly advantageous. For example, the formation of a disulfide bridge across two cysteine residues is suitable. Embodiments of the peptide according to the invention are therefore advantageous, the amino acid sequence of which each has at least two amino acids which can form a disulfide bridge or another chemical bond that stabilizes the loop structure.

Vorzugsweise ist das Substrat für eine PKMT ein Histonprotein. Preferably the substrate for a PKMT is a histone protein.

Vorzugsweise ist die besagte basische Aminosäure eine proteinogene, nichtproteinogene oder modifizierte proteinogene Aminosäure. Damit kann eine Aminosäure aus einem weiten biochemischen Spektrum herangezogen werden. Proteinogen sind dabei Aminosäuren, die natürlicherweise in Proteinen vorkommen. Nicht-proteinogen sind Aminosäuren (d.h. Säuren mit einer Aminogruppe am Ca), die natürlich vorkommen, aber nicht als Bausteine von Proteinen. Modifiziert sind proteinogene Aminosäuren, die eine künstliche oder natürliche chemische Modifikation aufweisen. Preferably said basic amino acid is a proteinogenic, non-proteinogenic or modified proteinogenic amino acid. This means that an amino acid from a wide biochemical spectrum can be used. Proteinogenic are amino acids that occur naturally in proteins. Non-proteinogenic are amino acids (i.e. acids with an amino group on Ca) that occur naturally, but not as building blocks of proteins. Modified are proteinogenic amino acids that have an artificial or natural chemical modification.

Als proteinogene basische Aminosäure kommt Lysin, Arginin oder Histidin in Frage. Als nicht-proteinogene basische Aminosäure kommt beispielsweise Ornithin oder Meta-Amino-Phenylalanin in Frage. Als modifizierte proteinogene basische Aminosäure kommt beispielsweise methyliertes Lysin, methyliertes Arginin oder methyliertes Histidin in Frage. Bevorzugt ist die basische Aminosäure ein Lysin. Es sind aber auch andere basische Aminosäuren möglich und ebenfalls bevorzugt, insbesondere Ornithin. Lysine, arginine or histidine can be used as proteinogenic basic amino acids. Ornithine or meta-amino-phenylalanine, for example, can be used as non-proteinogenic basic amino acids. Possible modified proteinogenic basic amino acids are, for example, methylated lysine, methylated arginine or methylated histidine. The basic amino acid is preferably a lysine. However, other basic amino acids are also possible and also preferred, especially ornithine.

Bevorzugt ist das Peptid für das Binden durch eine spezifische PKMT spezifisch. Die finale Bindung kann in Schleifenform oder gestreckter Form erfolgen. Insbesondere ist das Peptid z.B. für die SETD2 (SET-domain containing protein 2, auch bekannt als KMT3A) spezifisch. Es konnte gezeigt werden, dass dieses Enzym mit entsprechenden Peptiden besonders effizient interagiert. Eine Korrelation einer Hyperaktivität von PKMTs wie z.B. NSD2, DOT1 L und EZH und Krebsentstehung konnte gezeigt werden. Mit einem analogen Vorgehen können Peptide entwickelt werden, die z.B. für NSD2, EZH2 und DOT1 L spezifisch sind. Preferably the peptide is specific for binding by a specific PKMT. The final binding can be in a loop shape or a stretched shape. In particular, the peptide is specific, for example, for SETD2 (SET-domain containing protein 2, also known as KMT3A). It was shown that this enzyme interacts particularly efficiently with corresponding peptides. A correlation of hyperactivity of PKMTs such as NSD2, DOT1 L and EZH and cancer development has been shown. Using an analogous procedure, peptides can be developed that are specific for NSD2, EZH2 and DOT1 L, for example.

Vorzugsweise ist die spezifische Protein-Lysin-Methyltransferase in Bezug auf ihre Enzymaktivität mit einer Krankheit korreliert. Es kann davon ausgegangen werden, dass viele Krankheiten mit einer Hyperaktivität von PKMT korreliert sind. Besonders ist die spezifische PKMT mit Krebserkrankungen, neurologischen Störungen, Hirnerkrankungen, inflammatorischen Störungen, Stoffwechselerkrankungen und Erkrankungen des kardiovaskulären Systems korreliert. Hier liegt ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Peptids, dass durch die hohe Spezifität für eine bestimmte PKMT eine Therapie für einen bestimmten Krankheitstyp, insbesondere einen bestimmten Tumortyp und sogar einen bestimmten Patienten zugeschnitten ist. Dies ermöglicht z.B. eine personalisierte Krebstherapie, die der Erfindung einen Platz neben bereits etablierten Methoden wie der Antikörper- oder CAR-T-Zell-Therapie einräumen könnte. Preferably, the specific protein lysine methyltransferase is correlated with a disease in terms of its enzyme activity. It can be assumed that many diseases are correlated with hyperactivity of PKMT. In particular, the specific PKMT is correlated with cancer, neurological disorders, brain diseases, inflammatory disorders, metabolic diseases and diseases of the cardiovascular system. Here lies a further advantage of the peptide according to the invention that, due to the high specificity for a specific PKMT, a therapy is tailored to a specific type of disease, in particular a specific tumor type and even a specific patient. This enables, for example, personalized cancer therapy, which could give the invention a place alongside already established methods such as antibody or CAR T-cell therapy.

Vorzugsweise übertrifft die starke Bindungsaffinität des Peptids zu einer PKMT die Bindungsaffinität eines natürlichen Histonproteins. Preferably, the strong binding affinity of the peptide to a PKMT exceeds the binding affinity of a natural histone protein.

Vorzugsweise ist die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Peptids von einem bekannten PKMT-Substrat abgeleitet, beispielsweise im Falle von SETD2 von der N-terminalen Schwanzregion des Histonproteins H3. Die Bindung von PKMTs an Histonproteine erfolgt durch Binden des Enzyms an den frei zugänglichen, sogenannten „Histon-Schwanz“. Dieser Schwanz stellt das N-terminale Ende des Histonproteins dar, besteht aus einer spezifischen Abfolge von etwa 20 bis 40 Aminosäuren und enthält an bestimmten Positionen charakteristische Lysin-Reste. Es werden aber auch andere Reste innerhalb der Histon-Proteine (z.B. H3K79) und auch in Nicht-Histon-Proteinen von PKMTs methyliert. Diese Methylierungsereignisse haben ebenfalls wichtige biologische Funktionen und sind somit auch potentielle Zielpunkte für PKMT Inhibitoren. Preferably, the amino acid sequence of the peptide according to the invention is derived from a known PKMT substrate, for example in the case of SETD2 from the N-terminal tail region of the histone protein H3. The binding of PKMTs to histone proteins occurs by binding the enzyme to the freely accessible, so-called “histone tail”. This tail represents the N-terminal end of the histone protein, consists of a specific sequence of around 20 to 40 amino acids and contains characteristic lysine residues at certain positions. However, other residues within the histone proteins (e.g. H3K79) and also in non-histone proteins are also methylated by PKMTs. These methylation events also have important biological functions and are therefore also potential targets for PKMT inhibitors.

Ein dritter Aspekt der Erfindung betrifft eine Verwendung eines erfindungsgemäßen Peptides zum Inhibieren der Enzymaktivität einer spezifischen Protein- Lysin-Methyltransferase. Beispielhaft geeignete PKMTs sind NSD2, SETD2, EZH2 und DOT1 L. Diese Verwendung betrifft insbesondere eine medizinische Verwendung zum Behandeln unten genannter Krankheiten, besonders Krebskrankheiten. A third aspect of the invention relates to a use of a peptide according to the invention for inhibiting the enzyme activity of a specific protein lysine methyltransferase. Examples of suitable PKMTs are NSD2, SETD2, EZH2 and DOT1 L. This use relates in particular to a medical use for treating the diseases mentioned below, especially cancer diseases.

Ein vierter Aspekt der Erfindung betrifft eine Verwendung eines Peptides zum Inhibieren der Enzymaktivität einer spezifischen Protein-Lysin-Methyltrans- ferase, wobei ein in Schritt S1 , S2 oder S3 des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenes Peptid verwendet wird. Dabei sind alle Peptide möglich, die im Designprozess in Schritt S1 , S2 oder S3 des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten und getestet werden. Dies umfasst damit nicht nur das final erhaltene Peptid, sondern auch die in den Zwischenschritten erhaltenen Peptide. Die letztgenannten werden als Substrate oder, wenn sie bereits sehr effektiv die PKMT binden, als Supersubstrate bezeichnet. Diese Peptide können ebenfalls als Inhibitoren einer PKMT verwendet werden. Auf der anderen Seite sind Substratpeptide, für die bereits eine starke inh ibitorische Wirkung gezeigt werden kann, vorteilhaft, um sie im weiteren Designprozess zum Generieren noch effektiverer Inhibitoren zu verwenden. A fourth aspect of the invention relates to a use of a peptide for inhibiting the enzyme activity of a specific protein lysine methyltransferase, using a peptide obtained in step S1, S2 or S3 of the method according to the invention. All peptides that are obtained and tested in the design process in step S1, S2 or S3 of the method according to the invention are possible. This includes not only the final peptide obtained, but also the peptides obtained in the intermediate steps. The latter are referred to as substrates or, if they already bind PKMT very effectively, as supersubstrates. These peptides can also be used as PKMT inhibitors. On the other hand, substrate peptides that can already be shown to have a strong inhibitory effect are advantageous for use in the further design process to generate even more effective inhibitors.

Für die Verwendung des erfindungsgemäßen Peptids, insbesondere für eine medizinische Verwendung, ist eine pharmazeutische Zusammensetzung vorteilhaft, die mindestens ein erfindungsgemäßes Peptid mit mindestens einer pharmazeutisch annehmbaren Trägersubstanz, mesoporen Nanopartikeln, einem Gefrierschutzmedium, einem Lyoprotektionsmittel, einem Hilfsstoff und/oder einem Verdünnungsmittel umfasst. For the use of the peptide according to the invention, in particular for medical use, a pharmaceutical composition is advantageous which contains at least one peptide according to the invention with at least one pharmaceutically acceptable carrier substance, mesopore nanoparticles, an antifreeze medium, a lyoprotectant, an excipient and / or a diluent.

Ein weitererAspekt der Erfindung betrifft ein erfindungsgemäßes Peptid zur Verwendung als Medikament. Dabei ist ein Medikament gegen jede Krankheit möglich, bei der das Peptid als Inhibitor einer in der Krankheitsursache involvierten PKMT wirksam ist. Besonders vorteilhaft kann das Medikament in der Krebstherapie verwendet werden, da eine Behandlung von Krebs durch Hemmen von PKMT durch andere Strategien bereits bekannt ist. Möglich ist aber auch ein Medikament, das in der Behandlung von neurologischen Störungen, Hirnerkrankungen, inflammatorischen Störungen, Stoffwechselerkrankungen und Erkrankungen des kardiovaskulären Systems verwendet werden kann. A further aspect of the invention relates to a peptide according to the invention for use as a medication. A drug is possible against any disease in which the peptide is effective as an inhibitor of a PKMT that is involved in the cause of the disease. The drug can be used particularly advantageously in cancer therapy, since treating cancer by inhibiting PKMT using other strategies is already known. However, a drug that can be used in the treatment of neurological disorders, brain diseases, inflammatory disorders, metabolic diseases and diseases of the cardiovascular system is also possible.

Ein weitererAspekt der Erfindung betrifft ein erfindungsgemäßes Peptid zur Verwendung bei der Behandlung von Krebs, insbesondere von einer Krebskrankheit, bei der eine fehlerhafte Methylierung von Histonproteinen durch eine Protein-Lysin-Methyltransferase auftritt. A further aspect of the invention relates to a peptide according to the invention for use in the treatment of cancer, in particular a cancer disease in which defective methylation of histone proteins by a protein lysine methyltransferase occurs.

Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Peptid zur Behandlung von einem Krebs der Leber, einem Krebs des Pankreas, einem Krebs der Prostata, Brustkrebs, eines anderen soliden Tumors oder einer Krebskrankheit des blutbildenden Systems verwendet. The peptide according to the invention is preferably used for the treatment of cancer of the liver, cancer of the pancreas, cancer of the prostate, breast cancer, another solid tumor or a cancer of the hematopoietic system.

Zur Verwendung eines erfindungsgemäßen Peptides muss es in einer geeigneten Form bereitgestellt werden. Dabei wird das Peptid zur Herstellung einer Formulierung für eine orale, intravenöse, topische, intranasale, intraperitoneale und/oder subkutane Administration und/oder Inhalation und/oder einer anderen injizierbaren Form verwendet. In order to use a peptide according to the invention, it must be provided in a suitable form. The peptide is used to produce a formulation for oral, intravenous, topical, intranasal, intraperitoneal and/or subcutaneous administration and/or inhalation and/or another injectable form.

Offenbart ist zudem ein Verfahren zum Herstellen eines erfindungsgemäßen Peptides mittels Festphasenpeptidsynthese. Also disclosed is a method for producing a peptide according to the invention by means of solid phase peptide synthesis.

Offenbart ist zudem ein ein Verfahren zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Krebs in einem Subjekt, wobei dem Subjekt ein erfindungsgemäßes Peptid oder eine entsprechende pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht wird. Das Subjekt ist dabei ein Säugetier, und in einer besonderen Ausführungsform ein Mensch. Also disclosed is a method for the prophylaxis and/or treatment of cancer in a subject, wherein the subject is administered a peptide according to the invention or a corresponding pharmaceutical composition becomes. The subject is a mammal and, in a special embodiment, a human.

Die Erfindung wird anhand der Figuren näher erläutert. Es zeigen The invention is explained in more detail with reference to the figures. Show it

Figur 1 eine schematische Darstellung einer Übertragung einer Methylgruppe von SAM auf das N-terminale Ende eines Histonproteins durch die PKMT. Figure 1 shows a schematic representation of a transfer of a methyl group from SAM to the N-terminal end of a histone protein by the PKMT.

Figur 2 eine schematische Darstellung eines an eine PKMT gebundenen erfindungsgemäßen Peptids, das das Andocken des N-terminalen Endes eines Histonproteins verhindert. Figure 2 shows a schematic representation of a peptide according to the invention bound to a PKMT, which prevents the docking of the N-terminal end of a histone protein.

Figur 3 ein Fließdiagramm einer Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens. Figure 3 shows a flow diagram of an embodiment of a method according to the invention.

Figur 4 ein Autoradiogramm eines Spot Array zum Identifizieren eines erfindungsgemäßen Peptids in Designzyklen. Figure 4 shows an autoradiogram of a spot array for identifying a peptide according to the invention in design cycles.

Figur 5 ein Autoradiogramm eines Spot Array zum Nachweis der Spezifität von Substraten für bestimmte PKMT. Figure 5 shows an autoradiogram of a spot array to demonstrate the specificity of substrates for certain PKMT.

Figur 6 Daten eines FRET-Experiments zum Belegen einer Schleifenkonformation, die das erfindungsgemäße Peptid in Lösung Schleifen- einnimmt. Figure 6 Data from a FRET experiment to demonstrate a loop conformation that the peptide according to the invention adopts in solution.

Figur ? Ergebnisse einer gesteuerten Molekulardynamiksimulation zum Belegen, dass ein erfindungsgemäßes Peptid durch seine Schleifenkonformation schneller an eine PKMT bindet. figure? Results of a controlled molecular dynamics simulation to demonstrate that a peptide according to the invention binds more quickly to a PKMT due to its loop conformation.

Figur 8 ein Autoradiogramm zum Nachweis der Hemmungswirkung bestimmter Peptide auf eine PKMT. Figure 8 shows an autoradiogram to demonstrate the inhibitory effect of certain peptides on a PKMT.

In Fig. 1 ist schematisch die Methylierung eines Histonproteins 1 dargestellt. Die zu übertragende Methylgruppe 3 wird von einem Kofaktor namens S-Ade- nosyl-L-Methionin (SAM) 4 bereitgestellt. Der SAM 4 wird zusammen mit dem Histonprotein 1 im aktiven Zentrum der PKMT 2 gebunden. Dort wird die Methylgruppe 3 wird auf eine Region des Histonproteins 1 übertragen. Die übertragene Methylgruppe 3 fungiert als Signal und setzt eine Kaskade in Gang, die zu einer Restrukturierung des Chromatins führt, in dem genomische DNA und Histone miteinander angeordnet sind. Diese Restrukturierung entscheidet darüber, welche Gene angeschaltet werden können und welche nicht. The methylation of a histone protein 1 is shown schematically in FIG. The methyl group 3 to be transferred is provided by a cofactor called S-adenosyl-L-methionine (SAM) 4. The SAM 4 is delivered together with the Histone protein 1 bound in the active site of PKMT 2. There the methyl group 3 is transferred to a region of histone protein 1. The transferred methyl group 3 acts as a signal and sets in motion a cascade that leads to a restructuring of the chromatin in which genomic DNA and histones are arranged together. This restructuring determines which genes can be switched on and which cannot.

In Fig. 2 ist schematisch dargestellt, wie gemäß der Erfindung dem Binden des N-terminalen Endes des Histonproteins 1 an die PKMT 2 entgegengewirkt wird. Eine Protein-Lysin-Methyltransferase (PKMT) 2 weist ein aktives Zentrum für die Methylierung von Regionen von Histonproteinen auf, in dem der Kofaktor SAM 4 und das zu methylierende Peptid 10c binden. Es wird ein artifizielles Peptid 10 bereitgestellt, das in Lösung in einer Schleifen 10b oder gestreckten Konformation 10a vorliegt. Das artifizielle Peptid assoziiert an eine spezifische PKMT bevorzugt in einer Schleifenkonformation 10b und bindet schließlich im Bereich des aktiven Zentrums der PKMT in Schleifenform oder gestreckter Form 10c. Das gebundene Peptid 10c bindet stärker als das Histonprotein 1 und verhindert dadurch dessen Bindung an die PKMT 2. Damit kann das Histonprotein nicht methyliert werden. 2 shows schematically how the binding of the N-terminal end of the histone protein 1 to the PKMT 2 is counteracted according to the invention. A protein lysine methyltransferase (PKMT) 2 has an active site for the methylation of regions of histone proteins, in which the cofactor SAM 4 and the peptide to be methylated 10c bind. An artificial peptide 10 is provided which is present in solution in a looped 10b or stretched conformation 10a. The artificial peptide associates with a specific PKMT preferentially in a loop conformation 10b and finally binds in the active site region of the PKMT in a loop or stretched form 10c. The bound peptide 10c binds more strongly than histone protein 1 and thereby prevents it from binding to PKMT 2. This means that the histone protein cannot be methylated.

In einer Ausführungsform eines Verfahrens gemäß dem Fließdiagramm von Fig. 3 zum Herstellen eines erfindungsgemäßen Peptides wird das Verfahren in drei Designprozesse gegliedert. In one embodiment of a method according to the flow diagram of FIG. 3 for producing a peptide according to the invention, the method is divided into three design processes.

In einem ersten Designprozess S1 werden artifizielle-PKMT Peptid-Substrate mit maximaler Methylierbarkeit identifiziert. Dabei wird in einem ersten Unterschritt S1 .1 ein Peptidarray mit ersten Peptiden mit aus einem Abschnitt eines Histonproteins abgeleiteten Aminosäuresequenzen bereitgestellt. Die ersten Peptide weisen verschiedene Aminosäuresequenz-Varianten auf. In einem zweiten Unterschritt S1 .2 wird mindestens ein erstes Peptid als Substrat identifiziert, das im Vergleich mit bekannten Substratpeptiden einer bestimmten Protein-Lysin-Methyltransferase eine besonders starke Methylierbarkeit aufweist. Auf Basis dieser Daten werden in einem dritten Unterschritt 1 .3 weitere abgeleitete Peptide designet und hergestellt. Diese abgeleiteten Peptide weisen eine Länge von 10 bis 20 Aminosäuren auf. Wesentlich ist, dass die Aminosäuresequenz der abgeleiteten, neuen Peptide das Ausbilden einer Schleifenstruktur ermöglichen soll und eine zu methylierende basische Aminosäure im Zentrum der Schleifenstruktur positioniert sein soll. Die Schleifenstruktur ist insbesondere ein Strukturelement, in dem eine sich zurückfaltende Schleife („Schleifenbereich“) durch Wechselwirkungen der Aminosäuren vor und nach dem Schleifenbereich stabilisiert wird („Stammbereich“). Eine Positionierung der zu methylierenden basischen Aminosäure im Zentrum der Schleifenstruktur bedeutet hierbei, dass die zu methylierende basische Aminosäure im Schleifenbereich positioniert ist. In diesem Ausführungsbeispiel wird als basische Aminosäure Lysin gewählt. In einem vierten Unterschritt S1.4 wird die Methylierbarkeit dieser Peptide getestet. Die Schritte S1.3 und S1.4 werden, falls notwendig, mehrfach wiederholt. In a first design process S1, artificial PKMT peptide substrates with maximum methylation ability are identified. In a first substep S1.1, a peptide array with first peptides with amino acid sequences derived from a section of a histone protein is provided. The first peptides have different amino acid sequence variants. In a second substep S1.2, at least one first peptide is identified as a substrate, which has a particularly strong methylation ability compared to known substrate peptides of a specific protein lysine methyltransferase. Based on this data, further derived peptides are designed and produced in a third substep 1.3. These derived peptides are 10 to 20 amino acids in length. It is essential that the amino acid sequence of the derived, new peptides should enable the formation of a loop structure and that a basic amino acid to be methylated should be positioned in the center of the loop structure. The loop structure is in particular a structural element in which a folding-back loop (“loop region”) is stabilized by interactions of the amino acids before and after the loop region (“stem region”). Positioning the basic amino acid to be methylated in the center of the loop structure means that the basic amino acid to be methylated is positioned in the loop area. In this exemplary embodiment, lysine is chosen as the basic amino acid. In a fourth substep S1.4, the methylation ability of these peptides is tested. Steps S1.3 and S1.4 are repeated several times if necessary.

In einem zweiten Designprozess S2 wird die Bindung der artifiziellen Peptide an die PKMT optimiert. Dazu werden in einem ersten Unterschritt S2.1 die zuvor optimierten Peptide hergestellt. Diese Peptide weisen eine Länge im Bereich von 10 bis 20 Am inosäuren auf und beruhen auf der Am inosäuresequenz des identifizierten Substratpeptids, wobei die Aminosäuresequenz der abgeleiteten Peptide ein Ausbilden einer Schleifenstruktur ermöglichen soll und ein zu methylierendes Lysin im Zentrum der Schleifenstruktur positioniert sein soll. Anschließend wird mindestens ein Peptid identifiziert, das im Vergleich mit bekannten Substratpeptiden einer bestimmten Protein-Lysin-Methyltransferase eine besonders starke Bindung aufweist. In a second design process S2, the binding of the artificial peptides to the PKMT is optimized. For this purpose, the previously optimized peptides are produced in a first substep S2.1. These peptides have a length in the range of 10 to 20 amino acids and are based on the amino acid sequence of the identified substrate peptide, whereby the amino acid sequence of the derived peptides should enable the formation of a loop structure and a lysine to be methylated should be positioned in the center of the loop structure. At least one peptide is then identified that has a particularly strong binding compared to known substrate peptides of a specific protein lysine methyltransferase.

Auf Basis dieser Daten werden in einem zweiten Unterschritt S2.2 weitere abgeleitete Peptide designet und hergestellt. Diese abgeleiteten Peptide weisen eine Länge von 10 bis 20 Aminosäuren auf. Wesentlich ist, dass die Aminosäuresequenz der abgeleiteten, neuen Peptide ein Ausbilden einer Schleifenstruktur ermöglichen soll und ein zu methylierendes Lysin im Zentrum der Schleifenstruktur positioniert sein soll. In einem dritten Unterschritt S2.3 wird die Bindung dieser Peptide an die PKMT getestet. Diese Schritte S2.2 und S2.3 werden, falls notwendig, mehrfach wiederholt (angedeutet durch gestrichelte Linienführung). Based on this data, further derived peptides are designed and produced in a second substep S2.2. These derived peptides are 10 to 20 amino acids in length. It is essential that the amino acid sequence of the derived, new peptides should enable the formation of a loop structure and that a lysine to be methylated should be positioned in the center of the loop structure. In a third substep S2.3, the binding of these peptides to the PKMT is tested. These steps S2.2 and S2.3 are repeated several times if necessary (indicated by dashed lines).

In einem dritten Designprozess S3 wird die Hemmung der PKMT durch die artifiziellen Peptide optimiert. Dabei werden in S2 optimierte Peptide mit einer Länge im Bereich von 10 bis 20 Aminosäuren designet und hergestellt, die auf der Aminosäuresequenz des identifizierten Substratpeptids beruhen, wobei die Aminosäuresequenz der abgeleiteten Peptide ein Ausbilden einer Schleifenstruktur ermöglichen soll. Anschließend wird die Hemmung der PKMT durch diese Peptide untersucht, um mindestens ein Peptid zu identifizieren, das eine besonders starke Hemmung aufweist. Auch dieser Schritt kann, falls notwendig, in Zyklen wiederholt werden (angedeutet durch gestrichelte Linienführung). In a third design process S3, the inhibition of PKMT is optimized by the artificial peptides. In S2, optimized peptides with a length in the range of 10 to 20 amino acids are designed and produced, which are based on the amino acid sequence of the identified substrate peptide, whereby the amino acid sequence of the derived peptides should enable the formation of a loop structure. The inhibition of PKMT by these peptides is then examined in order to identify at least one peptide that exhibits particularly strong inhibition. If necessary, this step can also be repeated in cycles (indicated by dashed lines).

In Fig. 4 ist ein SPOT Array gezeigt, auf welchen verschiedene Peptidsequenzen synthetisiert wurden, die von der Histon 3 Protein Sequenz abgeleitet sind. Diese wurden anschließend mit der NSD2 PKMT unter Verwendung von radioaktiv markiertem SAM methyliert (Fig. 4a). Verschiedene Positionen zeigen aufgrund der einzelnen Aminosäureänderungen ein stärkeres Methylierungssignal. Darauf aufbauend sind erneut Peptide auf einen SPOT Array synthetisiert worden (Experiment (2)), die durch den initialen Array identifiziert wurden. Die neu entdeckten Peptide (Tabelle 1 und 2) zeigen ein erneut erhöhtes Methylierungssignal. Beispielweise zeigen die Peptide in A16, B10, B13 ein stärkeres Methylierungssignal als H3K36, das natürliche Substrat von NSD2 (A1 und B15) (Fig. 4b). In Experiment 3 wird das Peptid in A8 als am stärksten methyliert identifiziert (Fig. 4c). Die Methylierbarkeit dieser Peptide kann in weiteren Designzyklen weiter verbessert werden. In den folgenden Designprozessen 2 und 3 wird die Bindung der artifiziellen Peptide 10 an NSD2, möglicherweise ebenfalls in mehreren Zyklen, optimiert und schließlich die am besten hemmenden Peptide identifiziert. Tabelle 1: Peptidsequenzen in Experiment (2)

Tabelle 2: Peptidsequenzen in Experiment (3)

4 shows a SPOT array on which various peptide sequences derived from the histone 3 protein sequence were synthesized. These were subsequently methylated with the NSD2 PKMT using radiolabeled SAM (Fig. 4a). Different positions show a stronger methylation signal due to the individual amino acid changes. Based on this, peptides were synthesized again on a SPOT array (experiment (2)), which were identified by the initial array. The newly discovered peptides (Tables 1 and 2) show a further increased methylation signal. For example, the peptides in A16, B10, B13 show a stronger methylation signal than H3K36, the natural substrate of NSD2 (A1 and B15) (Fig. 4b). In experiment 3, the peptide in A8 is identified as the most methylated (Fig. 4c). The methylationability of these peptides can be further improved in further design cycles. In the following design processes 2 and 3, the binding of the artificial peptides 10 to NSD2 is optimized, possibly also in several cycles, and the best inhibitory peptides are finally identified. Table 1: Peptide sequences in experiment (2)

Table 2: Peptide sequences in experiment (3)

In Fig. 5 sind die Ergebnisse von Methylierungsassays gezeigt, die zum Nachweis der Spezifität von im Designprozess erhaltenen Peptiden dienen. Die Autoradiogramme auf der linken Seite zeigen die Methylierung mit der PKMT NSD2. Die Autoradiogramme auf der linken Seite zeigen die Methylierung mit der PKMT SETD2. Unter den Autoradiogrammen sind die Expositionszeiten angegeben. Es ist zu sehen, dass das Peptid B1 besonders effektiv von NSD2 methyliert wird, und das Peptid B3 von SETD2. Die Peptidzuordnung ist der nebenstehenden Tabelle zu entnehmen. Shown in Figure 5 are the results of methylation assays used to demonstrate the specificity of peptides obtained in the design process. The autoradiographs on the left show methylation with the PKMT NSD2. The autoradiographs on the left show methylation with the PKMT SETD2. The exposure times are indicated below the autoradiographs. It can be seen that peptide B1 is particularly effectively methylated by NSD2, and peptide B3 by SETD2. The peptide assignment can be found in the table opposite.

In Fig. 6 sind Daten aus einem FRET Experiment mit Peptiden in Lösung gezeigt, die belegen, dass ein erfindungsgemäßes Peptid in Lösung eine Schleifenstruktur annimmt. Im Beispiel sind Daten des Histonpeptids (H3K36) und eines erfindungsgemäßen Peptids (ssK36) gezeigt, das bevorzugt an die PKMT SETD2 bindet. 6 shows data from a FRET experiment with peptides in solution, which prove that a peptide according to the invention adopts a loop structure in solution. The example shows data for the histone peptide (H3K36) and a peptide according to the invention (ssK36), which preferentially binds to the PKMT SETD2.

A) Schema des FRET-Systems. Die H3K36- und ssK36-Peptide wurden mit einem EDANS-Fluorophor am C-Terminus und einem Dabcyl-Quencher am N-Terminus synthetisiert. EDANS wurde bei 340 nm angeregt und die Fluoreszenzemission wurde bei 490 nm gemessen. Aufgrund von FRET wird die Fluoreszenzemission teilweise durch Dabcyl gequencht, und nur die verbleibende Fluoreszenz wurde gemessen. Die FRET-Experimente wurden bei mehreren Temperaturen, beginnend bei 5 °C bis zu 95 °C, unter Verwendung von Peptidkonzentrationen von 10 pM durchgeführt. B) Bei 5°C zeigte EDANS- ssK36-Dabcyl eine um ca. 33 % niedrigere Fluoreszenzintensität als EDANS- ssK36-Dabcyl. Bei 95°C zeigten beide Peptide die gleiche Intensität. Dies zeigt die bevorzugte Schleifenstruktur des erfindungsgemäßen Peptides ssK36 an, die bei hohen Temperaturen durch die verstärkte thermische Bewegung aufgehoben ist. Die durchschnittliche Fluoreszenzintensitäten von Dabcyl-ssK36- EDANS stammen aus drei Versuchswiederholungen wurden normalisiert auf 95°C und Dabcyl-H3K36-EDANS. C) Ein Kontrollexperiment zeigte keinen Unterschied in der Fluoreszenzintensität von EDANS-H3K36-Dabcyl und E- DANS-ssK36-Dabcyl nach ihrem Verdau mit Proteinase K. A) Schematic of the FRET system. The H3K36 and ssK36 peptides were synthesized with an EDANS fluorophore at the C-terminus and a Dabcyl quencher at the N-terminus. EDANS was excited at 340 nm and fluorescence emission was measured at 490 nm. Due to FRET, the fluorescence emission is partially quenched by Dabcyl, and only the remaining fluorescence was measured. The FRET experiments were performed at multiple temperatures starting from 5 °C up to 95 °C using peptide concentrations of 10 pM. B) At 5°C, EDANS-ssK36-Dabcyl showed approximately 33% lower fluorescence intensity than EDANS-ssK36-Dabcyl. At 95°C both peptides showed the same intensity. This indicates the preferred loop structure of the peptide ssK36 according to the invention, which is canceled at high temperatures by the increased thermal movement. The average fluorescence intensities of Dabcyl-ssK36-EDANS from three experimental replicates were normalized to 95°C and Dabcyl-H3K36-EDANS. C) A control experiment showed no difference in the fluorescence intensity of EDANS-H3K36-Dabcyl and E-DANS-ssK36-Dabcyl after their digestion with proteinase K.

H3K36: APATGGVKKPHRYRP ssK36: APRFGGVKRPNRYRP H3K36: APATGGVKKPHRYRP ssK36: APRFGGVKRPNRYRP

In Fig. 7 sind die Ergebnisse von steered molecular dynamics Simulationen (sMD) gezeigt, die belegen, dass ein erfindungsgemäßes Peptid durch seine Schleifenstruktur schneller an eine PKMT bindet. Die finale Bindung kann an verschiedenen Stellen im PKMT Enzym in Schleifen- oder gestreckter Konformation erfolgen. 7 shows the results of steered molecular simulations (sMD), which prove that a peptide according to the invention binds more quickly to a PKMT due to its loop structure. The final binding can occur at various locations in the PKMT enzyme in a loop or stretched conformation.

Die sMD der Bindung von H3K36 und ssK36 and die SETD2 PKMT wurden mit einer abstandsabhängigen externen Kraft von 0,5 kJ/(mol ■ A²) zwischen dem Ns-Atom von K36 und dem Methylgruppen-C-Atom von SAM das in SETD2 gebunden ist durchgeführt. Es wurde gemessen wie oft es hierbei zu einem erfolgreichen Andocken von ssK36 an das aktive Zentrum von SETD2 nach 50 ns sMD kommt. Kriterien, die zur Definition eines erfolgreichen Docking-Ereignisses verwendet werden, sind von der dem Fachmann bekannten Geometrie des SN2 Übergangszustands der Methylgruppenübertragung abgeleitet. Die sMD-Simulation wurden in Anwesenheit und Abwesenheit einer zusätzlichen, abstandsabhängigen Abstoßungskraft von 0,3 kJ/(mol ■ A²) zwischen den Peptidenden durchgeführt, die die Bildung einer Schleifenstruktur verhindert. Die Abbildung zeigt die Anzahl erfolgreicher Docking-Ereignisse in 100 sMD-Simulationen mit H3K36 oder ssK36 basierend auf den SN2 Überganszustands Kriterien. The sMD of binding of H3K36 and ssK36 and the SETD2 PKMT were determined with a distance-dependent external force of 0.5 kJ/(mol ■ A ² ) between the Ns atom of K36 and the methyl group C atom of SAM bound in SETD2 is carried out. It was measured how often ssK36 successfully docked to the active site of SETD2 after 50 ns sMD. Criteria used to define a successful docking event are derived from the geometry of the SN2 methyl group transfer transition state known to those skilled in the art. The sMD simulations were performed in the presence and absence of an additional distance-dependent repulsion force of 0.3 kJ/(mol ■ A ² ) between the peptide ends, which prevents the formation of a loop structure. The figure shows the number of successful docking events in 100 sMD simulations with H3K36 or ssK36 based on the SN2 transition state criteria.

In Fig. 8 ist ein Autoradiogramm eines Methylierungsassays dargestellt, mit dem der biochemische Nachweis der Hemmungswirkung der im beschriebenen Designprozess erhaltenen Peptide durchgeführt wird. Untersucht wurde hier speziell die Hemmung der PKMT SETD2. Gezeigt ist die Methylierung eines Histonprotein-Analogons mit der charakteristischen N-terminalen Schwanzregion des Histonproteins H3. Die Methylierung wird durch Zugabe des designten Peptids schwächer (ssK36), wodurch die inh ibitorische Wirkung des Peptids gezeigt wird (linke Bildseite). In einem Kontrollexperiment mit einem aus der Startsequenz des Designprozesses aus einem Histonprotein H3 abgeleiteten Peptid (H3K36), wurde gezeigt, dass ein herkömmliches Peptid keine messbare inhibitorische Wirkung auf die PKMT aufweist (rechte Bildseite). 8 shows an autoradiogram of a methylation assay with which the biochemical detection of the inhibitory effect of the peptides obtained in the described design process is carried out. The inhibition of PKMT SETD2 was specifically examined here. Shown is the methylation of a histone protein analog with the characteristic N-terminal tail region of the histone protein H3. The methylation becomes weaker by adding the designed peptide (ssK36), which shows the inhibitory effect of the peptide (left side of the picture). In a control experiment with a peptide (H3K36) derived from the starting sequence of the design process from a histone protein H3, it was shown that a conventional peptide has no measurable inhibitory effect on PKMT (right side of the image).

Bezugszeichenliste Reference symbol list

1 Histon 1 histone

2 PKMT 2 PKMT

3 Methylgruppe 4 SAM 3 methyl group 4 SAM

10 artifizielles Peptid 10 artificial peptide

10a artifizielles Peptid in Lösung in gestreckter Struktur 10a artificial peptide in solution in an elongated structure

10b artifizielles Peptid in Lösung in Schleifenstruktur 10b artificial peptide in solution in a loop structure

10c artifizielles Peptid gebunden an PKMT (die Bindung kann gestreckt oder in Schleifenkonformation erfolgen) 10c artificial peptide bound to PKMT (binding can be stretched or in loop conformation)

Claims

Patentansprüche Verfahren zum Herstellen eines artifiziellen Peptides (10) mit einer Länge im Bereich von 10 bis 20 Aminosäuren mit einer aus einem Abschnitt eines Substrats für eine Protein-Lysin-Methyltransferase (PKMT) (2) abgeleiteten Aminosäuresequenz, wobei das Peptid (10) eine starke Bindungsaffinität zu einer PKMT (2) aufweist, mit den Schritten: Claims Method for producing an artificial peptide (10) with a length in the range of 10 to 20 amino acids with an amino acid sequence derived from a section of a substrate for a protein lysine methyltransferase (PKMT) (2), the peptide (10) being a has strong binding affinity to a PKMT (2), with the steps:

- Optimieren der Bindung der artifiziellen Peptide an die PKMT in einem zweiten Designprozess S2, wobei - Optimizing the binding of the artificial peptides to the PKMT in a second design process S2, where

- in einem ersten Unterschritt 2.1 Herstellen von abgeleiteten Peptiden aus S1 , deren Aminosäuresequenz das Ausbilden einer Schleifenstruktur ermöglichen soll, wobei eine zu methylierende basische Aminosäure im Zentrum der Schleifenstruktur positioniert sein soll, und Identifizieren von mindestens einem Peptid, das im Vergleich mit bekannten Substratpeptiden einer bestimmten Protein-Lysin-Methyltransferase eine besonders starke Bindung aufweist, - in a first substep 2.1 producing derived peptides from S1, the amino acid sequence of which should enable the formation of a loop structure, with a basic amino acid to be methylated being positioned in the center of the loop structure, and identifying of at least one peptide that has a particularly strong binding compared to known substrate peptides of a specific protein lysine methyltransferase,

- auf der Basis der beim bisherigen Designprozess erhaltenen Daten abgeleitete Peptide hergestellt werden, deren Aminosäuresequenz das Ausbilden einer Schleifenstruktur ermöglichen soll, wobei eine zu methylierende basische Aminosäure im Zentrum der Schleifenstruktur positioniert sein soll, und anschließend die Hemmung der PKMT durch die Peptide untersucht wird, um mindestens ein Peptid zu identifizieren, das eine besonders starke Hemmung der PKMT aufweist, wobei der dritte Designprozess bei Bedarf wiederholt werden kann. Verfahren nach Anspruch 1 , bei dem als Substrat für eine PKMT (2) ein Histonprotein (1 ) gewählt wird. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die basische Aminosäure Lysin ist. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die starke Bindungsaffinität des Peptids (10) zu einer PKMT (2) die Bindungsaffinität eines natürlichen Histonproteins übertrifft. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei eine PKMT (2) gewählt wird, die in Bezug auf ihre Enzymaktivität mit einer Krankheit korreliert ist. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei eine PKMT (2) gewählt wird, die in Bezug auf ihre Enzymaktivität mit einer Krebskrankheit korreliert ist. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei eine PKMT (2) aus einer Gruppe umfassend NSD2, SETD2, EZH2 und DOT1 L gewählt wird. Artifizielles Peptid (10), hergestellt durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, mit einer Länge im Bereich von 10 bis 20 Aminosäuren mit einer aus einem Abschnitt eines Substrats für eine Pro- tein-Lysin-Methyltransferase (PKMT) (2) abgeleiteten Aminosäuresequenz, wobei das Peptid (10) eine starke Bindungsaffinität zu einer PKMT (2) aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz eine Ausbildung einer Schleifenstruktur ermöglicht, eine zu methylierende basische Aminosäure im Zentrum der Schleifenstruktur positioniert ist, und das Peptid (10) eine inhibitorische Wirkung auf die Enzymaktivität der Protein-Lysin-Methyltransferase (2) aufweist. Peptid (10) nach Anspruch 8, wobei das Substrat für eine PKMT (2) ein Histonprotein (1 ) ist. Peptid (10) nach Anspruch 8 oder 9, bei dem die basische Aminosäure eine proteinogene, nicht-proteinogene oder modifizierte proteinogene Aminosäure ist. Peptid (10) nach einem der Ansprüche 8 bis 10, bei dem die basische Aminosäure Lysin ist. Peptid (10) nach einem der Ansprüche 8 bis 11 , bei dem das Peptid (10) für ein Binden durch eine spezifische Protein-Lysin-Methyltrans- ferase (2) spezifisch ist. Peptid (10) nach einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei die starke Bindungsaffinität des Peptids (10) zu einer PKMT (2) die Bindungsaffinität eines natürlichen Histonproteins übertrifft. Verwendung eines Peptides (10) gemäß einem der Ansprüche 8 bis 13 zum Inhibieren der Enzymaktivität einer spezifischen Protein-Lysin-Me- thyltransferase (2). Verwendung eines Peptides zum Inhibieren der Enzymaktivität einer spezifischen Protein-Lysin-Methyltransferase (2), wobei ein in Schritt S1 , S2 oder S3 des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 erhaltenes Peptid verwendet wird. Peptid (10) gemäß einem der Ansprüche 8 bis 13 zur Verwendung als Medikament. Peptid (10) gemäß einem der Ansprüche 8 bis 13 zur Verwendung bei der Behandlung von Krebs, insbesondere von einer Krebskrankheit, bei der eine fehlerhafte Methylierung von Histonproteinen (1 ) durch eine Protein-Lysin-Methyltransferase (2) auftritt, wobei die Krebskrankheit insbesondere ein Krebs der Leber, ein Krebs des Pankreas, ein Krebs der Prostata, Brustkrebs, ein anderer solider Tumor oder eine Krebskrankheit des blutbildenden Systems ist. - derived peptides are produced on the basis of the data obtained in the previous design process, the amino acid sequence of which should enable the formation of a loop structure, with a basic amino acid to be methylated being positioned in the center of the loop structure, and the inhibition of PKMT by the peptides is then examined, to identify at least one peptide that exhibits particularly strong inhibition of PKMT, whereby the third design process can be repeated if necessary. Method according to claim 1, in which a histone protein (1) is chosen as the substrate for a PKMT (2). A method according to claim 1 or 2, wherein the basic amino acid is lysine. Method according to one of the preceding claims, wherein the strong binding affinity of the peptide (10) to a PKMT (2) exceeds the binding affinity of a natural histone protein. Method according to one of the preceding claims, wherein a PKMT (2) is selected which is correlated with a disease in terms of its enzyme activity. Method according to one of the preceding claims, wherein a PKMT (2) is selected which is correlated with a cancer disease in terms of its enzyme activity. Method according to one of the preceding claims, wherein a PKMT (2) is selected from a group comprising NSD2, SETD2, EZH2 and DOT1 L. Artificial peptide (10), produced by a method according to any one of claims 1 to 7, having a length in the range of 10 to 20 amino acids and comprising a portion of a substrate for a protein lysine methyltransferase (PKMT) (2) derived amino acid sequence, wherein the peptide (10) has a strong binding affinity to a PKMT (2), characterized in that the amino acid sequence enables a loop structure to be formed, a basic amino acid to be methylated is positioned in the center of the loop structure, and the peptide (10) has an inhibitory effect on the enzyme activity of protein lysine methyltransferase (2). A peptide (10) according to claim 8, wherein the substrate for a PKMT (2) is a histone protein (1). A peptide (10) according to claim 8 or 9, wherein the basic amino acid is a proteinogenic, non-proteinogenic or modified proteinogenic amino acid. A peptide (10) according to any one of claims 8 to 10, wherein the basic amino acid is lysine. Peptide (10) according to one of claims 8 to 11, in which the peptide (10) is specific for binding by a specific protein lysine methyltransferase (2). A peptide (10) according to any one of claims 8 to 12, wherein the strong binding affinity of the peptide (10) to a PKMT (2) exceeds the binding affinity of a natural histone protein. Use of a peptide (10) according to one of claims 8 to 13 for inhibiting the enzyme activity of a specific protein lysine methyltransferase (2). Use of a peptide for inhibiting the enzyme activity of a specific protein lysine methyltransferase (2), using a peptide obtained in step S1, S2 or S3 of the method according to any one of claims 1 to 7. Peptide (10) according to any one of claims 8 to 13 for use as a medicament. Peptide (10) according to one of claims 8 to 13 for use in the treatment of cancer, in particular a cancer disease in which incorrect methylation of histone proteins (1) by a protein lysine methyltransferase (2) occurs, the cancer disease in particular a cancer of the liver, a cancer of the pancreas, a cancer of the prostate, breast cancer, another solid tumor or a cancer of the hematopoietic system.