WO2023228969A1 - 遺伝子導入のための糸状菌 - Google Patents

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WO2023228969A1
WO2023228969A1 PCT/JP2023/019297 JP2023019297W WO2023228969A1 WO 2023228969 A1 WO2023228969 A1 WO 2023228969A1 JP 2023019297 W JP2023019297 W JP 2023019297W WO 2023228969 A1 WO2023228969 A1 WO 2023228969A1
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filamentous fungus
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cassette
strain
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精一 原
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キッコーマン株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi

Definitions

  • the present invention relates to a technique for introducing genes into multiple locations into filamentous fungi. More specifically, the present invention relates to a filamentous fungus that has been modified to introduce genes into multiple locations, and a method and kit for producing a filamentous fungus that has genes introduced into multiple locations.
  • Filamentous fungi including the Aspergillus genus, are often used as food, and while there are few safety issues, they secrete a large amount of protein and are used as hosts for material production through genetic engineering.
  • Various production systems such as E. coli, yeast, insect cells, and animal cells are known as heterologous protein production systems, but among these, filamentous fungi have a high ability to secrete proteins outside of the bacterial body, and are difficult to culture. It has the advantage of having extensive experience in processes such as product purification, and because it is evolutionarily more advanced than E. coli and yeast, it can produce proteins from higher organisms such as humans with correct folding.
  • Non-Patent Document 1 Nature 438(7071), 1157-1161 (2005)
  • AoLTR an LTR type retrotransposon
  • Patent No. 6990385 Re-table 2019/240243 publication Patent No. 6261039 Japanese Patent Application Publication No. 2018-064484 Re-table 2019/168062 publication
  • the purpose of the present invention is to establish a novel gene transfer system to easily express heterologous proteins and produce specific metabolites in filamentous fungi.
  • the present inventors conducted intensive research to establish a new gene transfer system in filamentous fungi, and developed a filamentous fungus in which a nuclease recognition sequence was introduced into the retrotransposon sequence of the filamentous fungus. It has been discovered that desired expression cassettes can be easily introduced into multiple introduction sites by using this method, leading to the present invention.
  • the present invention therefore relates to: [1] 2 or more copies present in the genome, such as 3 or more copies, 4 or more copies, 5 or more copies, 6 or more copies, 7 or more copies, 8 or more copies, 9 or more copies, 10 or more copies, 12 or more copies,
  • a nuclease recognition sequence is introduced into the base sequence caused by the existing moving genetic element at 15 copies or more, 18 copies or more, or 20 copies or more, and 200 copies or less, 100 copies or less, 50 copies or less, and 30 copies or less, respectively.
  • filamentous fungi [2] The filamentous fungus according to item 1, wherein the moving genetic element is a retrotransposon, such as Mg-sine, AFLAV, AoLTR, grasshopper, skippy, or a transposon.
  • the base sequence caused by the moving genetic element is 450 to 10,000 bp, for example, 470 bp or more, 500 bp or more, 800 bp or more, 1,000 bp or more, 2,000 bp or more, or 3,000 bp or more, and 10,000 bp or less, 8,000 bp or less, 7,000 bp or less, or 6000 bp or less, the filamentous fungus according to item 1 or 2.
  • nuclease recognition sequence is a sequence that is not included in the filamentous fungus genome.
  • the nuclease recognition sequence is 13 bp to 40 bp, for example, 13 bp or more, 14 bp or more, 15 bp or more, 16 bp or more, 17 bp or more, 18 bp or more, 19 bp or more, or 20 bp or more, and 40 bp or less, 36 bp or less, or 34 bp Filamentous fungi according to any one of items 1 to 5, in which an upper limit selected from the following may be used: [7] The filamentous fungus according to any one of items 1 to 6, wherein the nuclease is an endonuclease, a zinc finger nuclease, a transcription activation-like effector nuclease (TALENs), or a CRISPR/Cas system.
  • TALENs transcription activation-like effector nuclease
  • the endonuclease is a mega-endonuclease, such as I-SceI, I-CreI, I-DmoI, I-CeuI, I-AniI, I-MsoI, or PI-PfuI.
  • [9] 2 or more copies present in the genome such as 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, 10 or more, 12 or more, 15 or more, 18 or more, or 20 or more , and a filamentous fungus in which a mega-endonuclease recognition sequence has been introduced into the base sequence of an existing retrotransposon of 200 or less, 100 or less, 50 or less, and 30 or less.
  • [10] 2 or more copies present in the genome such as 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, 10 or more, 12 or more, 15 or more, 18 or more, or 20 or more and 200 or less, 100 or less, 50 or less, and 30 or less, and a filamentous fungus in which a transgene has been introduced into each of the base sequences caused by an existing moving genetic element.
  • [11] 2 or more genomic regions of filamentous fungi such as 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, 10 or more, 12 or more, 15 or more, 18 or more, or 20 or more,
  • a nucleic acid comprising the filamentous fungus according to any one of items 1 to 9 and an expression cassette comprising upstream and downstream sequences for homologous recombination, A gene expression kit, wherein the upstream and downstream sequences for homologous recombination are each homologous to a part of a base sequence derived from a moving genetic element.
  • filamentous fungus of the present invention By using the filamentous fungus of the present invention, it becomes possible to introduce expression cassettes into multiple introduction positions all at once. This allows a plurality of identical or different genes to be introduced into filamentous fungi.
  • FIG. 1 shows the plasmid map of plasmid pRT_I-SceI_LO.
  • FIG. 2A shows an outline of the introduction of the I-SceI site introduction cassette by homologous recombination.
  • FIG. 2B shows an overview of pyrG removal by loop-out in a cassette-introduced strain obtained by homologous recombination.
  • Figure 3 shows the plasmid map of plasmid pdCglA_LO.
  • Figure 4 shows the plasmid map of plasmid pCglA_PGdelC_ISc_LO.
  • FIG. 5A shows an overview of introduction of a cassette for constructing a site for marker introduction by homologous recombination.
  • FIG. 5A shows an overview of introduction of a cassette for constructing a site for marker introduction by homologous recombination.
  • FIG. 5B shows an overview of pyrG removal by loop-out in a cassette-introduced strain obtained by homologous recombination.
  • Figure 6 shows the results of PCR confirming the introduction of the I-SceI site. The left side shows the PCR amplification product at the introduction site of each I-SceI site, and the right side shows that the amplification product is cleaved by I-SceI digestion.
  • Figure 7 shows the plasmid map of plasmid pRT_Penox.
  • FIG. 8 shows an overview of the introduction of (A) the expression cassette and (B) the pyrG fragment introduction cassette by homologous recombination.
  • FIG. 9 shows the plasmid map of plasmid pPGdelN_ICe_CglA.
  • FIG. 10 shows the results of agarose gel electrophoresis of the PCR products showing that the expression cassette was introduced into the predetermined I-SceI target site by homologous recombination.
  • Figure 11 shows that the oxidation activity of pentosidine oxidase 2 toward L-arginine increases depending on the number of expression cassettes encoding pentosidine oxidase 2 (penox2) introduced into the I-SceI target site by homologous recombination.
  • Figure 12 shows the plasmid map of plasmid pRT_1M_M7d49C-T8.
  • FIG. 13 shows the plasmid map of plasmid pRT_LrEAOX.
  • FIG. 14 shows a method for producing a strain in which the gene encoding Ku70, which is involved in the non-homologous end-joining repair mechanism, is restored to the RT_ISc8_7_P strain into which eight I-SceI recognition sites have been introduced.
  • Figure 15 shows the plasmid map of plasmid pUC19-ku70.
  • Figure 16 shows the plasmid map of plasmid pUC19-GDH-pyrG3.
  • the present invention relates to a filamentous fungus in which a nuclease recognition sequence is introduced into each base sequence caused by a moving genetic element present in two or more copies in the genome.
  • the invention also relates to a method for introducing genes into two or more positions in the genomic region of the filamentous fungi of the invention.
  • Yet another aspect of the invention also relates to a gene expression kit comprising a filamentous fungus of the invention and a nucleic acid comprising an expression cassette.
  • Sequences due to mobile genetic elements consist of repetitive sequences that are scattered throughout the genome as a result of movement and repair within the genome.
  • a sequence caused by a moving genetic element refers to a sequence caused by a moving genetic element, and includes sequences that have undergone mutations or recombination during the evolutionary process.
  • the moving genetic element may be a DNA-type transposon or an RNA-type retrotransposon, or a retrovirus, pararetrovirus, or retrointron. Sequences resulting from moving genetic elements usually have a length of 450 bp or more.
  • the length of the moving gene-induced sequence may be 470 bp or more, 500 bp or more, 800 bp or more, 1000 bp or more, 2000 bp or more, or 3000 bp or more.
  • the upper limit of the length of the moving gene sequence is not particularly limited, but from examples of known retrotransposons, usually 10,000 bp or less, 8,000 bp or less, 7,000 bp or less, or 6,000 bp or less can be used.
  • the sequence caused by the moving genetic element targeted in the present invention exists in multiple copies in the genome of the filamentous fungus.
  • the copy number is 2 or more, and from the viewpoint of increasing the number of introduced genes, the lower limit of the copy number is 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, 10 or more, 12 or more. , 15 or more, 18 or more, and 20 or more.
  • the upper limit of the copy number is not particularly limited, but considering the reported examples of retrotransposon copy numbers, it can be selected from 200 or less, 100 or less, 50 or less, and 30 or less.
  • a nuclease recognition sequence may be introduced into all of the sequences resulting from the moving genetic element, or into a portion thereof.
  • a DNA-type transposon has a short inverted repeat sequence at both ends and a transposase-encoding sequence.
  • Transposition of DNA-type transposons usually requires transposase activity.
  • the monomeric transposase recognizes each of the short inverted repeat sequences of the transposon and forms a dimer, thereby forming a loop structure and excision.
  • the excised loop structure is inserted into the cut site by the activity of transposase, thereby causing cut-paste transposition.
  • RNA-type transposons are broadly classified into LTR-type retrotransposons and non-LTR-type retrotransposons.
  • LTR-type retrotransposons are characterized by long terminal repeats (LTRs) with repeats in the same direction at both ends.
  • LTR-type retrotransposons generate cDNA from an RNA intermediate transcribed by a promoter present in LTR by the action of reverse transcriptase, and the resulting cDNA is introduced into genomic DNA by the action of integrase, resulting in replication movement. arise.
  • Non-LTR retrotransposons are characterized by having polyA at the 3' end of the transcript RNA, and generate an RNA intermediate transcribed from the adjacent promoter, which generates cDNA by the action of reverse transcriptase. Replication movement occurs when cDNA is introduced into genomic DNA by the action of endonuclease.
  • non-LTR retrotransposons examples include those having "long interspersed repeats (LINE)” and those having “short interspersed repeats (SINE).”
  • LINE present in Aspergillus sojae is used.
  • retrotransposons in Aspergillus sawjae NBRC4239 strain RT1-11.
  • sequences of RT2, RT5, RT7, and RT9 are identical to each other and are SEQ ID NO: 1
  • the sequence of RT4 is SEQ ID NO: 2
  • the sequence of RT6 is SEQ ID NO: 3
  • the sequence of RT8 is SEQ ID NO: 4.
  • the sequence of RT11 is SEQ ID NO:5.
  • nuclease refers to a molecule that has the activity of recognizing a specific nuclease recognition sequence and cleaving DNA.
  • a nuclease may be a single protein or a complex.
  • the complex may also include components other than proteins, such as nucleic acids.
  • the nuclease of the invention is required to recognize the nuclease recognition sequence described below.
  • nucleases with long recognition sequences mega-endonucleases, zinc finger nucleases, transcription activation-like effector nucleases (TALENs), and the CRISPR/Cas system can be used.
  • the nuclease can be introduced into filamentous fungi by a known method, and for example, it may be introduced into protoplasts whose cell walls have been destroyed by the PEG method or electroporation method. Alternatively, the nuclease may be introduced into filamentous fungi by inducibly or temporarily expressing the nuclease. For inducible or transient expression of nucleases, well-known techniques can be used. As an example, an expression vector can be used that is provided with a promoter and terminator sequence and into which a nuclease sequence is introduced. When a nuclease is introduced into a filamentous fungus, the nuclease recognition sequence in the moving genetic element sequence is specifically cleaved. Homologous recombination or non-homologous end joining with the cassette containing the introduced gene occurs during repair of the break, allowing site-specific gene introduction.
  • Megaendonuclease is a nuclease found in a wide variety of organisms such as archaea, bacteria, phages, fungi, yeast, algae, and plants. Mega-endonucleases are characterized by having long recognition sequences and having few off-targets. Wild-type mega-endonucleases such as I-SceI, I-CreI, I-DmoI, I-CeuI, I-AniI, I-MsoI, or PI-PfuI can also be used, in which the recognition sequence It is also possible to use a nuclease produced by newly designing a nuclease.
  • the recognition sequence for I-SceI (hereinafter also referred to as I-SceI site (ISc)) is TAGGGATAACAGGGTAAT: SEQ ID NO: 49
  • the recognition sequence for I-CeuI (hereinafter also referred to as I-CeuI site (ICe)) is TAGGGATAACAGGGTAAT: SEQ ID NO: 49.
  • ICe recognition sequence for I-CeuI site
  • Zinc finger nuclease is a site-specific nuclease created by fusing the DNA cleavage site of a non-specific nuclease such as FokI with a recognition site containing a zinc finger stabilized by zinc ions.
  • One zinc finger can recognize a DNA sequence of 3 base pairs or more, and by combining multiple zinc fingers depending on the recognition sequence, it is possible to prepare a zinc finger that can recognize a relatively long recognition site. .
  • An existing zinc finger nuclease whose recognition sequence has already been determined may be used, or a zinc nuclease prepared by setting a new recognition sequence may be used.
  • Transcription activation-like effector nucleases are site-specific nucleases created by fusing the DNA cleavage site of a non-specific nuclease such as FokI with a transcription activator-like (TAL) protein.
  • TAL protein has a repeating structure of modules of about 34 amino acids, and by changing the amino acids at the 12th and 13th positions of one module, it is possible to manipulate the DNA-binding domain structure.
  • One module can recognize one nucleotide, the TAL protein created by combining the modules enables DNA sequence-specific binding, and the nuclease fused to the TAL protein allows DNA sequence-specific binding. Cut into.
  • An existing TALEN whose recognition sequence has already been determined may be used, or a TALEN prepared by setting a new recognition sequence may be used.
  • the CRISPR/Cas system provides a site-specific nuclease composed of CRISPR RNA (crRNA), transactivating RNA (tracrRNA), and a Cas protein with nuclease activity.
  • CRISPR RNA CRISPR RNA
  • tracrRNA transactivating RNA
  • Cas protein Cas protein with nuclease activity.
  • crRNA and tracrRNA single-stranded guide RNA (sgRNA), which is made by linking crRNA and tracrRNA into a single strand, may be used.
  • sgRNA single-stranded guide RNA
  • a complementary sequence of DNA is recognized by the target nucleotide sequence in the crRNA, and cleavage occurs site-specifically by the CAS protein.
  • the CRISPR/Cas system may be introduced by carrying the guide RNA and Cas protein in the same or different expression vectors by methods known in the art.
  • a nuclease recognition sequence refers to a sequence that is recognized and cleaved by a nuclease. Nuclease recognition sequences vary depending on the type of nuclease, and vary in length and sequence. From the viewpoint of target site-specific cleavage, it is preferable that the nuclease recognition sequence exists only as a target sequence in the genome. From the viewpoint of reducing the possibility of off-target occurrence, the length of the nuclease recognition sequence is selected from the group consisting of 13 bp or more, 14 bp or more, 15 bp or more, 16 bp or more, 17 bp or more, 18 bp or more, 19 bp or more, and 20 bp or more. array is used.
  • the upper limit of the length of the nuclease recognition sequence is not particularly limited, but from the viewpoint of target performance of the nuclease, an upper limit selected from 40 bp or less, 36 bp or less, and 34 bp or less may be used.
  • an existing nuclease recognition sequence may be used, or a newly designed recognition sequence may be used.
  • novel nucleases with designed recognition sequences can be used.
  • the nuclease recognition sequence is introduced into two or more movable genetic element originating sequences present in the genome of the filamentous fungus using a nuclease recognition sequence introduction cassette described below.
  • filamentous fungi any filamentous fungi can be used; examples include Aspergillus spp., Penicillium spp., Rasamsonia spp., Talaromyces spp., Trichoderma spp., Acremonium spp.
  • Genus Acremonium Genus Mucor, Genus Rhizopus, Genus Fusarium, Genus Monascus, Genus Neurospora, Genus Myceliophthora, Genus Chrysosporium, Genus Thermomyces, Genus Mortierella, Genus Blakeslea, Genus Ashbya, Genus Ustilago, Genus Emericella, Genus Cladosporium, Genus Coniochaeta.
  • Filamentous fungi selected from the group consisting of can be used.
  • Aspergillus genus filamentous fungi examples include Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus luchuensis, Aspergillus tamarii, and Aspergillus niger. Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus aculeatus, Aspergillus usamii, Aspergillus saitoi, and Aspergillus terreus.
  • filamentous fungi a filamentous fungus having a desired number of copies of a moving genetic element can be appropriately selected.
  • the present invention relates to a filamentous fungus in which a nuclease recognition sequence is introduced into each base sequence caused by a moving genetic element present in two or more copies in the genome.
  • Such filamentous fungi can be produced using any method.
  • a nuclease recognition sequence is introduced into a host filamentous fungus using homologous recombination using a nuclease recognition sequence introduction cassette described below.
  • introduction of nuclease recognition sequences can also be performed using known genome editing techniques.
  • a nuclease recognition sequence can be introduced using site-specific cleavage and homologous recombination using the CRISPR/Cas system.
  • the presence or absence of introduction can be determined by PCR amplification using primers specific to the nucleotide sequence resulting from each moving genetic element.
  • a nuclease recognition sequence introduction cassette introduce a cassette for constructing a marker introduction site, which will be described later, into filamentous fungi into which a nuclease recognition sequence has been introduced into each base sequence caused by a moving genetic element present in two or more copies. You can also.
  • Another aspect of the invention may relate to the filamentous fungus thus produced.
  • a nuclease recognition sequence is introduced into each base sequence caused by a moving genetic element present in two or more copies, and a nuclease recognition sequence and a marker introduction sequence, for example, a marker fragment sequence, are introduced in an arbitrary region. is introduced (FIGS. 8A and B).
  • a marker introduction sequence for example, a marker fragment sequence
  • a filamentous fungus in which a nuclease recognition sequence has been introduced into the base sequence caused by a mobile genetic element that exists in two or more copies can be used to introduce additional genes. Specifically, when a nuclease is co-introduced during gene transfer, cleavage occurs based on the nuclease recognition sequence. This allows efficient homologous recombination or non-homologous end joining to occur, making it possible to introduce a gene into each base sequence caused by a moving genetic element that exists in two or more copies in a single operation. .
  • a cassette for introducing a nuclease recognition sequence can be prepared by placing sequences homologous to the sequence of the moving genetic element upstream and downstream of the nuclease recognition sequence.
  • a marker sequence can be further introduced into the nuclease recognition sequence introduction cassette, and the marker sequence can be arranged to be removable in the future by inducing loop-out.
  • a cassette is prepared by arranging the sequences in the order of region 1 - nuclease recognition sequence - region 3 - marker sequence - region 2 from upstream (FIG. 2A).
  • Region 1, region 2, and region 3 each have to have a length and identity that allow homologous recombination.
  • the nuclease recognition sequence introduction cassette may contain other sequences as long as they are arranged in this order.
  • This transformed strain can be selected using markers.
  • a transformed strain into which a nuclease recognition sequence introduction cassette has been introduced there are region 3 contained in the introduced cassette and region 3 of the genetic element that originally moves.
  • Marker sequences include pyrimidine biosynthetic pathway gene (pyrG or pyrF), tryptophan biosynthetic pathway gene (trpC), nitrate reductase gene (niaD), acetamidase gene (amdS), ATP sulfurylase gene (sC), etc. can be used.
  • pyrG or pyrF complements the uracil auxotrophy exhibited by the host strain, making it possible to screen for transformed strains in a uracil-free medium.
  • transformed strains expressing pyrG or pyrF cannot grow in a medium supplemented with 5-fluoroorotic acid (5-FOA)
  • screening in a medium supplemented with 5-FOA allows for loop-out through region 3, for example.
  • a strain in which pyrG has been removed can be obtained by this method (Fig. 2B).
  • the nucleotide sequence encoding Aspergillus sojae pyrG is shown in SEQ ID NO: 51.
  • trpC-deficient strains exhibit tryptophan auxotrophy, it becomes possible to screen for transformed strains into which trpC has been introduced in a tryptophan-free medium.
  • trpC-deficient strains exhibit resistance to 5-fluoroanthranilic acid, it becomes possible to select strains from which the marker has been removed via loop-out.
  • niaD-deficient strains cannot assimilate nitrate, it becomes possible to screen for transformed strains into which niaD has been introduced in a selective medium using nitrate as a nitrogen source.
  • the niaD-deficient strain exhibits resistance to chlorate, it becomes possible to select a strain from which the marker has been removed via loop-out.
  • Introduction of amdS makes it possible to assimilate acetamide, making it possible to screen for transformed strains in a selective medium using acetamide as a nitrogen source. Since the acetamidase encoded by amdS also acts on fluoroacetamide and produces toxic fluoroacetic acid, fluoroacetamide resistance allows the selection of strains in which the marker has been removed via loop-out.
  • sC-deficient strains cannot assimilate sulfate, it becomes possible to screen for transformed strains that are complemented with sC in a selective medium using sulfate as the sulfur source. sC-deficient strains become resistant to selenate. Therefore, it becomes possible to select strains from which markers have been removed through loop-out.
  • a marker introduction site can be introduced into any region of the host.
  • the region into which the marker introduction site is introduced may be any region that does not affect growth when the marker introduction site is introduced.
  • the cglA gene region can be selected as a region into which a marker introduction site is introduced.
  • the marker introduction site construction cassette is, for example, region 5 - marker sequence - region 4 - nuclease recognition sequence -C. It is created so that the end-defective marker sequence-region 6 is obtained.
  • the C-terminal deleted marker sequence is a homologous group with the marker sequence of the cassette for constructing a site for marker introduction. It can be used in the opposite direction to avoid damage.
  • the cassette for constructing a site for marker introduction is introduced into a host cell, homologous recombination occurs between region 5 and region 6, and the cassette for constructing a site for marker introduction is introduced (FIG. 5A).
  • Region 4, region 5, and region 6 each have to have a length and identity that allow homologous recombination. This transformed strain can be selected using markers.
  • region 4 contained in the introduced cassette and region 4 of the original host are present.
  • the marker any of the markers described above can be used, and as an example, the gene for the pyrimidine biosynthetic pathway (pyrG: SEQ ID NO: 51) can be used.
  • Regions 1 to 3 of the nuclease recognition sequence introduction cassette and regions 4 to 6 of the marker introduction site construction cassette are respectively referred to as homologous recombination sequences.
  • Homologous recombination sequences may be of any length and identity as long as they result in homologous recombination.
  • the homologous recombination sequence may have a length of, for example, 30 bp or more. As an example, 40 bp or more, 50 bp or more, 75 bp or more, 100 bp or more, 200 bp or more, 300 bp or more, 500 bp or more, or 1000 bp or more can be used.
  • the upper limit of the length of the homologous recombination sequence is not particularly limited, but from the viewpoint of ease of cassette construction, 5000 bp or less, 4000 bp or less, 3000 bp or less, 2000 bp or less, or 1000 bp or less may be used.
  • the identity of homologous recombination sequences can be, for example, at least 80% or greater, preferably at least about 85% or greater, more preferably at least about 90% or greater, and most preferably about 95-100%. Identity can be determined by known methods.
  • the present invention also relates to a method for introducing genes into filamentous fungi in which nuclease recognition sequences have been introduced into base sequences derived from moving genetic elements present in two or more copies.
  • the genes to be introduced a plurality of the same genes may be introduced, or one or more different genes may be introduced.
  • a filamentous fungus having genes introduced into two or more positions in the genomic region of the filamentous fungus can be obtained. Therefore, the method for introducing a gene can also be called a method for producing a filamentous fungus into which genes have been introduced at two or more positions in the genomic region of the filamentous fungus.
  • An expression cassette containing the introduced gene for the filamentous fungus according to the present invention and a step of introducing a nuclease that recognizes and cleaves the nuclease recognition sequence.
  • a transgene contained in an expression cassette can be introduced into a sequence originating from a moving genetic element at two or more positions by a homologous recombination mechanism or a non-homologous end joining mechanism.
  • the marker gene can be further introduced into the marker introduction site by introducing a marker introduction cassette, for example, a marker fragment introduction cassette.
  • the transgene expression cassette has an upstream sequence for homologous recombination (region 1 described above) that has homology to the sequence upstream of the nuclease cleavage position, and an upstream sequence for homologous recombination that has homology to the sequence downstream of the nuclease cleavage position. (region 3 above) and the transgene.
  • the introduced gene is placed between an upstream sequence and a downstream sequence.
  • the introduced gene is further operably added with a promoter sequence and a terminator sequence that promote expression in the host.
  • Promoter sequences that can be used in filamentous fungi include, but are not limited to, the promoter sequence of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene (gpd) and the cellobiohydrolase gene (cbh1). It's not something you can do.
  • Terminator sequences that can be used in filamentous fungi include, but are limited to, the terminator sequence of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene (gpd) and the cellobiohydrolase gene (cbh1). It's not a thing.
  • the transgene expression cassette may further include an enhancer sequence, a splicing signal sequence, a polyA addition signal, and/or a linker sequence.
  • the upstream sequence (region 1) and downstream sequence (region 3) for homologous recombination are designed to the extent that homologous recombination can occur, respectively, with sequences that include part of the base sequence of the moving genetic element (i.e., regions 1 and 3). They are homologous.
  • any gene can be selected as the introduced gene, and a single gene may be introduced, or a plurality of genes arranged consecutively in tandem may be introduced.
  • the length of the introduced gene is not particularly limited as long as it does not interfere with homologous recombination, but an example is 200 to 40,000 bp.
  • the length of the introduced gene sequence is 200 bp or more, 500 bp or more, 1000 bp or more, 2000 bp or more, 3000 bp or more, 4000 bp or more, 5000 bp or more, 6000 bp or more, 7000 bp or more in terms of the length required for functional expression of the protein encoded by the gene. , or 8,000 bp or more, and from the viewpoint of ease of cassette construction, it is 40,000 bp or less, 20,000 bp or less, or 10,000 bp or less, as long as it does not hinder the functional expression of the protein.
  • promoter sequences include the promoter sequence of the translation elongation factor gene tef1 (Ptef), the promoter sequence of the ⁇ -amylase gene (amy), the promoter sequence of the alkaline protease gene (alp), and tryptophan. Examples include the promoter sequence of the synthetic gene trpC.
  • the terminator sequence the terminator sequence of the alkaline protease gene alp (Talp), the terminator sequence of amy, the terminator sequence of tef1, the terminator sequence of trpC, etc. can be used.
  • the marker fragment introduction cassette can be appropriately prepared in correspondence with the marker introduction site construction cassette introduced into the host strain.
  • the marker fragment introduction cassette is configured to include the N-terminally deleted marker sequence, and is further configured to undergo homologous recombination with the marker introduction site. Constructed to include areas that cause
  • the marker fragment introduction cassette may further include a nuclease recognition sequence.
  • the additional nuclease recognition sequence thus introduced is preferably a different sequence from the nuclease recognition sequence used in the nuclease recognition sequence introduction cassette.
  • the marker fragment introduction cassette includes region 4-ICeuI recognition sequence-N-terminal deletion marker sequence.
  • the nuclease recognition sequence of the marker introduction site introduced into the host strain is cleaved, and the region 4 of the marker fragment introduction cassette and the N-terminally deleted marker sequence are homologous with the region 4 of the host strain and the C-terminally deleted marker sequence.
  • the complete marker sequence and ICeuI recognition sequence are introduced into the host.
  • a nuclease recognition sequence introduction cassette, a marker introduction site construction cassette, a transgene expression cassette, and a marker fragment introduction cassette can each be introduced into filamentous fungi. These cassettes may be introduced into host cells as part of a plasmid, or as a nucleic acid fragment, such as an amplification product amplified by PCR, or as a purified product obtained by enzymatically treating these nucleic acids. You can.
  • the cassette can be introduced into the cells of filamentous fungi by methods known in the art. As an example, protoplasts with disrupted cell walls are prepared, and a nuclease is introduced along with an expression cassette by PEG or electroporation. The cell wall can be disrupted to obtain protoplasts by applying a cell wall lytic enzyme such as Yatalase under appropriate conditions.
  • the PEG method or electroporation method can use conditions well known in the art.
  • the gene expression kit includes a filamentous fungus of the invention and a nucleic acid containing an expression cassette containing upstream and downstream sequences for homologous recombination.
  • the protein expression kit of the present invention may further include a nuclease capable of degrading the nuclease recognition sequence.
  • the protein expression kit of the present invention may further include a nucleic acid containing a cassette for introducing a marker fragment.
  • an expression cassette in which a gene encoding a desired protein is placed between the upstream and downstream sequences of the expression cassette is prepared, and the desired protein gene is introduced into a host filamentous fungus together with a nuclease.
  • the expression kit includes enzymes used to prepare or introduce the expression cassette, such as restriction enzymes, yatalase, polymerase, and ligase, as well as a primer set that can confirm the introduction of a gene encoding a protein into the expression cassette. Furthermore, it may further contain a buffer solution suitable for each enzyme reaction.
  • Example 1 Whole genome analysis including transposons and retrotransposons Regarding Aspergillus sawjae NBRC4239 strain, a sequence containing a retrotransposon-like sequence was amplified by PCR, and sequence information was obtained. Primers were provided in the surrounding sequence of a gap region of an appropriate length in the scaffold so as to sandwich the gap region, and the sequence was amplified by PCR to obtain sequence information. The scaffold was amplified by PCR to obtain sequence information. Chromosomal DNA was cut with restriction enzymes, self-ligated, and amplified by inverse PCR using a template and a sequence in the retrotransposon-like sequence as a primer to obtain surrounding sequence information.
  • Example 2 Preparation of host filamentous fungus (1) Preparation of cassette for introducing I-SceI site A cassette for introducing I-SceI site into retrotransposon-like sequences scattered on the chromosome was prepared. Using the plasmid pEgtA_sLO_Py described in Re-Table 2019/240243 (Patent Document 2) as a template, the following primers, as a PCR enzyme, Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix (New England Biolab), and as a PCR device. A DNA fragment was amplified by performing PCR using a T100 thermal cycler (Bio-Rad) according to the protocol attached to this enzyme.
  • Plasmid pRT_I-SceI_LO contains region 1 for homologous recombination - I-SceI site - region 3 for loop-out - pyrG - region 2 for homologous recombination is inserted into the multiple cloning site of pUC19 plasmid. ( Figure 1).
  • the resulting plasmid pRT_I-SceI_LO was used as a template and amplified by PCR using the following primers to obtain a cassette for introducing the I-SceI site.
  • Such an I-SecI site introduction cassette consists of region 1 for homologous recombination, I-SceI site, region 3 for loop-out, pyrG, and region 2 for homologous recombination (FIG. 2).
  • Bacterial cells were collected from the obtained culture solution by filtration, placed between paper towels to remove moisture, and crushed while cooling with liquid nitrogen using a mortar and pestle that had been previously cooled with liquid nitrogen. Chromosomal DNA was extracted from the obtained crushed bacterial cells using DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen).
  • the DNA consisting of region 5 for homologous recombination was amplified by PCR using the following primer set 1 (CglA_-939F_pUC and CglA_-138R_pyrG).
  • a DNA fragment consisting of region 4 for loop-out was obtained by amplifying the fragment by PCR using the following primer set 2 (CglA_-2026F_pyrG and CglA_-932R_1627R), and the following primer set 3 (CglA_1613F and A DNA fragment consisting of region 6 for loop-out was obtained by PCR amplification using CglA_3357R_pUC).
  • Each amplified DNA fragment was purified using QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen).
  • a DNA fragment was obtained by PCR amplification using the plasmid pEgtA_sLO_Py described in Example 1 as a template and the following primers (pyrG).
  • the obtained DNA was treated with restriction enzyme DpnI (manufactured by NEW ENGLAND BIOLABS) to cut the remaining template DNA, and then purified using QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen).
  • Plasmid pdCglA_LO has region 5 for homologous recombination, pyrG, region 4 for loop-out, and region 6 for homologous recombination inserted into the multiple cloning site of the pUC19 plasmid (FIG. 3).
  • a DNA fragment was obtained by amplifying by PCR with the following primers. This DNA fragment consists of region 6 for homologous recombination - pUC19 - region 5 for homologous recombination - pyrG - region 4 for loopout.
  • the obtained DNA was treated with restriction enzyme DpnI and then purified using QIAquick PCR Purification Kit.
  • a DNA fragment was obtained by PCR amplification using the plasmid pdCglA_LO as a template and the following primers (fragment lacking pyrG downstream part).
  • the obtained DNA was treated with restriction enzyme DpnI and then purified using QIAquick PCR Purification Kit.
  • Plasmid pCglA_PGdelC_ISc_LO consists of region 5 for homologous recombination - pyrG - region 4 for loopout - I - SceI site - pyrG downstream partial deletion fragment (complementary strand) - region 6 for homologous recombination of pUC19 plasmid. It is inserted into the multiple cloning site ( Figure 4).
  • a cassette for constructing a site for marker introduction (region 5 for homologous recombination - pyrG - region 4 for loopout - I - SceI site - pyrG downstream partial deletion) was prepared.
  • the fragment (complementary strand) (consisting of region 6 for homologous recombination) was separated from pUC19 to obtain a cassette for constructing a marker introduction site (FIG. 5).
  • the reverse primer (pyrG_869R) used the sequence in pyrG in the I-SceI site introduction cassette.
  • a PCR product is generated.
  • a strain that produced a product in one of the eight combinations was selected as a strain in which the I-SceI site introduction cassette was introduced at one location by homologous recombination.
  • a region that has the same sequence as “region 3 for loopout” in the I-SceI site introduction cassette is common downstream of the eight sites that can be introduced by homologous recombination. exist.
  • the cassette was introduced by homologous recombination, when homologous recombination occurs between "region 3 for loop-out" and the same sequence region downstream, it consists of pyrG-region 2 for homologous recombination. The region is removed by looping out ( Figure 2).
  • Conidia of the strain obtained above in which the I-SceI site introduction cassette was introduced at one site by homologous recombination were prepared using 20 mM uracil containing 3 mg/ml 5-fluoroorotic acid (5-FOA, Fluorochem).
  • a 5-FOA resistant strain was obtained by inoculating and culturing on a supplemented Czapek-Dox agar medium (FIG. 2).
  • the chromosomal DNA of the obtained 5-FOA resistant strain was used as a template, and among the primers used to confirm the introduction site of the I-SceI site introduction cassette, a combination of primers that produced a product in the transformed strain was used. PCR was performed and it was confirmed that no product was produced in the 5-FOA resistant strain.
  • the obtained 5-FOA-resistant strain grew on Czapek-Dox agar medium containing 20mM uracil, but did not grow on Czapek-Dox agar medium without uracil, that is, it showed uracil auxotrophy. did.
  • the resulting pyrG-deleted strain was used below as a host for further introduction of the I-SceI site introduction cassette.
  • PCR was performed using the following primer set 1 (CglA_-2120F and PyrG_140R) to generate a 2.5 kb product, and using the following primer set 2 (PyrG_140R and CglA_3393R) PCR was performed, and a strain that produced a 2.3 kb product was selected as a strain in which a cassette for constructing a marker introduction site was introduced into the cglA locus by homologous recombination.
  • primer set 1 CglA_-2120F and PyrG_140R
  • primer set 2 PyrG_140R and CglA_3393R
  • a region having the same sequence as "region 4 for loop-out" in the marker introduction site construction cassette is located upstream of the cglA gene locus.
  • the region 5 for homologous recombination consists of pyrG. Regions are removed by looping out.
  • 5-FOA-resistant strains were obtained by inoculating conidia of the strains selected above onto a Czapek-Dox agar medium containing 3 mg/ml 5-fluoroorotic acid (5-FOA) and supplemented with 20 mM uracil. Obtained.
  • PCR was performed using the following primers, and it was confirmed that a 4.3 kb product was produced. Furthermore, it was confirmed that this PCR product was cleaved into two fragments by I-SceI digestion, that is, an I-SceI site was introduced at the cglA locus.
  • the strain thus obtained was designated as RI8_PGdelC_ISc_P strain.
  • the RI8_PGdelC_ISc_P strain grows on a Czapek-Dox agar medium containing 20 mM uracil, but does not grow on a Czapek-Dox agar medium to which uracil is not added, that is, it exhibits uracil auxotrophy.
  • Example 3 Introduction of expression cassette (1) Production of expression cassette Expression vector p19-pG3-penox2 (Ptef-penox2-Talp-pyrG3 is the multi-cloning site of pUC19 plasmid A DNA fragment consisting of Ptef-penox2-Talp was obtained by PCR amplification using the following primers as a template. The obtained DNA was treated with restriction enzyme DpnI and then purified using QIAquick PCR Purification Kit.
  • PCR amplification was performed using the following primer set 1 (RT_1233R_TaA and pUC19_418F) to obtain a DNA fragment consisting of region 1 for pUC19-homologous recombination, and the following primer set was obtained.
  • primer set 1 RT_1233R_TaA and pUC19_418F
  • 2 RT_3731F and RT_4771R_pUC
  • a DNA fragment consisting of region 3 for loop-out was obtained.
  • Plasmid pRT_Penox has region 1 for homologous recombination-Ptef-penox2-Talp-region 3 for loopout inserted into the multiple cloning site of pUC19 plasmid (FIG. 7).
  • an expression cassette was obtained by amplifying by PCR using the following primers.
  • the expression cassette consists of region 1 for homologous recombination-Ptef-penox2-Talp-region 3 for loopout (FIG. 8).
  • Region 3 for loop-out functions as a region for homologous recombination in the following transformation.
  • the length of region 1 for homologous recombination was 1201 bp
  • the length of region 3 for loop-out was 1041 bp.
  • a DNA fragment (region 4 for loop-out) was obtained by amplifying by PCR using the following primers.
  • the obtained DNA was treated with restriction enzyme DpnI and then purified using QIAquick PCR Purification Kit.
  • Plasmid pPGdelN_ICe_CglA has pyrG upstream partial deletion fragment-I-CeuI site-region 4 for loop-out (complementary strand) inserted into the multi-cloning site of pUC19 plasmid (FIG. 9).
  • the plasmid pPGdelN_ICe_CglA obtained above was used as a template and amplified by PCR using the following primers to obtain a pyrG fragment introduction cassette (FIG. 8B).
  • the pyrG fragment introduction cassette consists of a pyrG upstream partial deletion fragment, an I site, a CeuI site, and a loop-out region 4 (complementary strand). Region 4 for loop-out functions as a region for homologous recombination in the following transformation.
  • PCR was performed using the chromosomal DNA of the transformed strain as a template and using eight combinations of the following eight types of forward primers (described above) and one type of reverse primer.
  • the sequence in the Tef1 promoter in the expression cassette was used as the reverse primer. This will generate a PCR product if the expression cassette has been introduced.
  • PCR products were generated in all eight combinations, that is, there were five transformed strains in which the expression cassette was introduced at all eight locations (FIG. 10). The transformed strains ranged from those in which no expression cassette was introduced to those in which expression cassettes were introduced at all eight locations.
  • the RT_ISc8_7 strain of Example 2 (3-5) was used as a strain in which no expression cassette had been introduced (the strain before eight I-SceI sites were introduced and pyrG was removed). Three strains were cultured in liquid for each introduced site.
  • Example 4 Introduction of glutamate oxidase expression cassette (1) Cloning of glutamate oxidase gene As the gene for glutamate oxidase (GLOD), a gene encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 52) of M7GLOD ⁇ 49C-T8 was chemically synthesized and used ( SEQ ID NO: 53). The upstream end of this gene contains an additional sequence CGCACCACCTTCAAA (SEQ ID NO: 54) for linking with the following DNA fragment, and the downstream end contains a stop codon TGA, followed by an additional sequence GTACCAGGAGTACAT for linking with the following DNA fragment. (SEQ ID NO: 55) was provided.
  • CGCACCACCTTCAAA SEQ ID NO: 54
  • a DNA fragment consisting of Talp-pyrG3-pUC19-Ptef was obtained by PCR amplification using the above expression vector p19-pG3-penox2 as a template and the following primers.
  • the obtained DNA was treated with restriction enzyme DpnI and then purified using QIAquick PCR Purification Kit.
  • Plasmid p1M_M7d49C-T8_PG3 has Ptef-M7GLOD ⁇ 49C-T8-Talp-pyrG3 inserted into the multiple cloning site of pUC19 plasmid.
  • Plasmid pRT_1M_M7d49C-T8 has region 1 for homologous recombination-Ptef-M7GLOD ⁇ 49C-T8-Talp-region 3 for loopout inserted into the multiple cloning site of pUC19 plasmid (FIG. 12).
  • a GLOD expression cassette was obtained by amplifying by PCR using primers RT_33F (SEQ ID NO: 9) and RT_4771R_2 (SEQ ID NO: 41).
  • the GLOD expression cassette consists of region 1 for homologous recombination-Ptef-M7GLOD ⁇ 49C-T8-Talp-region 3 for loopout. Region 3 for loop-out functions as a region for homologous recombination in the following transformation.
  • GLOD activity (U/ml) was calculated based on the following formula. "39.2" in the formula indicates the millimolar extinction coefficient (mM ⁇ 1 cm ⁇ 1 ) of the quinone imine dye formed by condensation of 4-AA and TOOS to light with a wavelength of 555 nm. "df” indicates the dilution factor when diluting the GLOD solution.
  • Two of the strains obtained above into which the GLOD expression cassette had been introduced at eight locations were cultured in liquid according to the method described above, crude enzyme solutions were prepared, and GLOD activity was measured. As a result, activity was clearly detected in all of the strains. No GLOD activity was detected in the crude enzyme solution prepared in the same manner from the RT_ISc8_7 strain (Example 2 (3-5)), which was a strain in which no expression cassette had been introduced.
  • Example 5 Introduction of ethanolamine oxidase expression cassette
  • EAOX ethanolamine oxidase gene
  • the amino acid sequence of LrHP derived from Lichtheimia ramosa SEQ ID NO: 58
  • a gene encoding the was chemically synthesized and used (SEQ ID NO: 59).
  • the upstream end of this gene contains an additional sequence CGCACCACCTTTCAAA (SEQ ID NO: 54) for linking with the following DNA fragment, and the downstream end contains a stop codon TGA, followed by an additional sequence GTACCAGGAGTACAT for linking with the following DNA fragment. (SEQ ID NO: 55) was provided.
  • a DNA fragment consisting of Talp-pyrG3-pUC19-Ptef was obtained by PCR amplification using the above expression vector p19-pG3-penox2 as a template and the following primers.
  • the obtained DNA was treated with restriction enzyme DpnI and then purified using QIAquick PCR Purification Kit. After ligating the obtained DNA fragment and the above synthetic gene by infusion reaction, E. coli strain JM109 was transformed, the obtained transformed E. coli was liquid cultured, and plasmid DNA was extracted to obtain plasmid pLrEAOX_PG3. Ta. Plasmid pLrEAOX_PG3 has Ptef-LrHP-Talp-pyrG3 inserted into the multiple cloning site of pUC19 plasmid.
  • EAOX expression cassette A DNA fragment consisting of Ptef-LrHP-Talp was obtained by PCR amplification using the above plasmid pLrEAOX_PG3 as a template and the following primers. The obtained DNA was treated with restriction enzyme DpnI and then purified using QIAquick PCR Purification Kit.
  • the region 3-pUC19-homologous recombination for loop-out was obtained.
  • a DNA fragment consisting of region 1 was obtained.
  • the obtained DNA was treated with restriction enzyme DpnI and then purified using QIAquick PCR Purification Kit.
  • Plasmid pRT_LrEAOX has region 1 for homologous recombination-Ptef-LrHP-Talp-region 3 for loopout inserted into the multiple cloning site of pUC19 plasmid (FIG. 13).
  • an EAOX expression cassette was obtained by amplifying it by PCR using primers RT_33F (SEQ ID NO: 9) and RT_4771R_2 (SEQ ID NO: 41).
  • the EAOX expression cassette consists of region 1 for homologous recombination-Ptef-LrHP-Talp-region 3 for loopout. Region 3 for loop-out functions as a region for homologous recombination in the following transformation.
  • Example 6 Introduction of an expression cassette with a region length of 50 bp for homologous recombination (1) Production of an expression cassette with a region length of 50 bp for homologous recombination Using the plasmid pRT_Penox obtained in Example 3 as a template, the following A pentosidine oxidase 2 expression cassette was obtained by PCR amplification using the primers. The resulting expression cassette consists of region 1 for homologous recombination-Ptef-penox2-Talp-region 3 for loopout, but with region 1 for homologous recombination and region 3 for loopout. Both lengths were 50 bp. Region 3 for loop-out functions as a region for homologous recombination in the following transformation.
  • Example 7 Introduction of multiple copies of a foreign gene using a strain into which I-SceI recognition site has been introduced A technology has been disclosed that enables the introduction of multiple copies of . Therefore, by applying this technology to a strain into which an I-SceI recognition site has been introduced, we verified whether the efficiency of multi-copy introduction is improved compared to when applying this technology to a strain in which an I-SceI recognition site has not been introduced.
  • a DNA fragment consisting of region 7-ku70 for homologous recombination was obtained by PCR amplification using the chromosomal DNA of Aspergillus sojae NBRC4239 strain as a template and the following primer set 1 (Pku70-1500F1 and Pku70orfR1).
  • a DNA fragment consisting of region 8 for homologous recombination was obtained by PCR amplification using the following primer set 2 (Pku70+1F1 and Pku70+1500R1), and PCR was performed using the following primer set 3 (Pku70+1500F1 and Pku70+2500R1).
  • a DNA fragment consisting of region 9 for loop-out was obtained by amplification, and a DNA fragment containing the AmyA terminator (Tamy) was amplified by PCR using the following primer set 4 (Ptamy_F1 and Ptamy_R2).
  • a DNA fragment containing the pyrG marker was obtained by PCR amplification using the following primer set 5 (PpyrG_F1 and PpyrG_R1).
  • Each amplified DNA fragment was purified using QIAquick PCR Purification Kit.
  • the underline indicates an additional sequence for joining adjacent DNA fragments in an infusion reaction.
  • Plasmid pUC19-ku70 contains region 7 for homologous recombination - ku70 - Tamy - region 9 for loopout - pyrG marker - region 8 for homologous recombination inserted into the multiple cloning site of pUC19 plasmid. ( Figure 15).
  • the plasmid pUC19-ku70 obtained above was used as a template and amplified by PCR using primers Pku70-1500F1 (SEQ ID NO: 66) and Pku70+1500R1 (SEQ ID NO: 65) to obtain a cassette for constructing a ku70 introduced strain.
  • the cassette for constructing a ku70 introduced strain consists of region 7 for homologous recombination, ku70, Tamy, region 9 for loopout, pyrG marker, and region 8 for homologous recombination (FIG. 14).
  • the RT_ISc8_7_P strain was transformed using the DNA fragment by the protoplast PEG method to obtain the RT_ISc8_7_P+ku70 strain.
  • this strain can be amplified by PCR using the chromosomal DNA of the obtained transformed strain as a template and using the following primer set 6 (Pku-2000F1 and Pku+2000R1) to generate a 5.6 kbp DNA fragment, and The selection was made by confirming that a 3.9 kbp DNA fragment was generated by PCR amplification using primer set 7 (PpyrG_F1 and Pku+2000R1).
  • pyrG marker was removed from the RT_ISc8_7_P+ku70 strain.
  • Conidia of the RT_ISc8_7_P+ku70 strain were inoculated onto a Czapek-Dox agar medium containing 3 mg/ml of 5-FOA and supplemented with 20 mM uracil and cultured to obtain a 5-FOA-resistant strain.
  • the DNA fragment obtained by PCR using the following primer set 8 (Ptamy_F1 and Pku70+3000R1) is 2.3 kbp, indicating that loop-out has been completed. was confirmed, and this strain was designated as RT_ISc8_7_P+ku70_P strain.
  • p19-GDH-pyrG3 was used to generate the pyrG gene disrupted strain of Aspergillus sojae described in JP-A-2018-068292 (a strain lacking 48 bp upstream of the pyrG gene, 896 bp in the coding region, and 240 bp downstream) and the RT_ISc8_7_P+ku70_P strain obtained above. , transformation was performed by the protoplast PEG method. At this time, I-SceI at a final concentration of 250 U/mL was added together with p19-GDH-pyrG3 only to the RT_ISc8_7_P+ku70_P strain.
  • the obtained transformed strain was grown in Paindex medium (2% Paindex #2 (Matsuya Chemical Industries), 1% Hypolypeptone (Nippon Pharmaceutical), 0.5% yeast extract, 0.25% monopotassium dihydrogen phosphate, 0 .25% dipotassium monohydrogen phosphate, 0.05% magnesium sulfate heptahydrate, 0.4% soy sauce oil) and cultured at 30°C for 4 days.
  • the cultured bacterial cells were homogenized using a homogenizer, then disrupted using a multi-bead shocker, and the supernatant after centrifugation was collected to prepare a crude enzyme solution.
  • the GDH activity of this crude enzyme solution was measured according to the measurement method described below, and the GDH activity per mL of culture solution was calculated.
  • ⁇ GDH activity measurement method Mix 1.025 mL of 100 mM phosphate buffer (pH 7.0), 0.3 mL of 1M D-glucose solution, and 0.075 mL of 2 mM DCIP solution, and incubate at 37° C. for 5 minutes. Next, 0.05 mL of 15 mM PMS solution and 0.05 mL of enzyme sample solution are added to start the reaction. The absorbance at the start of the reaction and over time is measured, the amount of decrease in absorbance at 600 nm per minute ( ⁇ A600) as the enzymatic reaction progresses is determined, and the GDH activity is calculated according to the following formula. At this time, GDH activity is defined as 1 U, which is the amount of enzyme that reduces 1 ⁇ mol of DCIP per minute in the presence of D-glucose at a concentration of 200 mM at 37°C.
  • 1.5 in the formula is the liquid volume (mL) of the reaction reagent + enzyme reagent, 16.3 is the millimolar molecular extinction coefficient (cm2/ ⁇ mol) under this activity measurement condition, and 0.05 is the liquid volume of the enzyme solution ( mL), 1.0 is the optical path length of the cell (cm), and ⁇ A600blank is the amount of decrease in absorbance per minute at 600 nm when the reaction is started by adding the buffer used to dilute the enzyme instead of the enzyme sample solution. represents.
  • the proportion of strains with GDH activity of 5 copies or more, 10 copies or more, and 20 copies or more was higher in the As-RT_ISc8-pyrG3 group than in the As-pyrG3 group, and from this result, it was found that I-SceI in the retrotransposon It was found that the GDH gene could be efficiently inserted in multiple copies by introducing the recognition site and cleaving it by adding I-SceI during transformation. From the above, it was found that the method of introducing an I-SceI recognition site into a retrotransposon and cleaving it by adding I-SceI during transformation is also effective as a method for inserting multiple copies of any gene. .

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Abstract

糸状菌における異種タンパク質の発現や特定の代謝産物の生成を簡便に達成するための新規の遺伝子導入系を確立することを目的とする。糸状菌のレトロトランスポゾンに、メガエンドヌクレアーゼの認識配列を導入した糸状菌を開発し、かかる糸状菌を用いることで、複数の導入箇所に、所望の発現カセットを簡便に導入できる遺伝子導入系を確立した。これによりゲノムに存在する、２コピー以上で存在する動く遺伝因子の塩基配列に、ヌクレアーゼ認識配列がそれぞれ導入された糸状菌を提供する。

Description

遺伝子導入のための糸状菌
　本発明は、糸状菌に対し複数個所に遺伝子を導入する技術に関する。より具体的に、複数個所に遺伝子を導入するために改変された糸状菌、並びに複数個所に遺伝子を導入された糸状菌を製造するための方法及びキットに関する。
　アスペルギルス属をはじめとする糸状菌は、食品として用いられるものも多く、安全性の問題が少ない一方で、タンパク質の分泌量が多く遺伝子工学による物質生産の宿主として使用されている。異種タンパク質生産系としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞など様々な生産系が知られているが、そのなかでも糸状菌は、タンパク質の菌体外への分泌能が高いという点、培養や生成物の精製などのプロセスに関する蓄積がある点、大腸菌や酵母よりも進化的に高度であることから、ヒトなどの高等生物のタンパク質についても正しいホールディングで生産できるという点などの利点がある。
　異種タンパク質の生産以外にも、代謝経路にかかわる酵素群の遺伝子群を導入することにより、特定の代謝産物の生産に利用することができる。この場合、代謝経路にかかわる複数の遺伝子を導入することが必要である。遺伝子導入には、複数の手法が知られており、近年、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を利用したゲノム編集法の開発により、所望される位置への遺伝子導入がより容易にできるようになってきている。
　しかしながら、従来の遺伝子導入法では、１度の遺伝子導入で基本的に１つの遺伝子しか導入できず、宿主ゲノムに、複数の遺伝子を導入することは、コストと時間の点で技術的な課題があった。かかる技術的課題を解決するため、ゲノムＤＮＡに複数存在するレトロトランスポゾン／トランスポゾンに着目し、レトロトランスポゾン／トランスポゾンに含まれる標的配列特異的に切断するヌクレアーゼを用いて、レトロトランスポゾン／トランスポゾン相同組換えを利用して多重的に遺伝子を導入する手法が開発された（特許文献１：特許第６９９０３８５号）。しかしながら、レトロトランスポゾン/トランスポゾンは、宿主によってその種類及び頻度が異なっており、任意の宿主で、多重的に遺伝子を導入する手法が利用できるわけではなかった。また、レトロトランスポゾン/トランスポゾンは複数コピーの反復配列であるため、生物種によっては、その出現頻度及び位置が正確に把握されていない。アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）の研究株であるＲＩＢ４０株については、全ゲノム解析が完了し（非特許文献１：Nature 438(7071), 1157-1161 (2005))、ＬＴＲ型レトロトランスポゾンであるＡｏＬＴＲについては２コピー存在することが報告されている（非特許文献２：J Gen Appl Microbiol. 2014;60(1):1-6. doi: 10.2323/jgam.60.1）。一方、その他の産業上有用な糸状菌の大部分では、動く遺伝因子についての解析は十分に行われていない。
特許第６９９０３８５号公報 再表２０１９／２４０２４３号公報 特許第６２６１０３９号公報 特開２０１８－０６４４８４号公報 再表２０１９／１６８０６２号公報
Nature 438(7071), 1157-1161 (2005) J Gen Appl Microbiol. 2014;60(1):1-6.
　本発明は、糸状菌において異種タンパク質の発現や特定の代謝産物の生成を簡便に達成するための新規の遺伝子導入系を確立することを目的とする。
　本発明者らが、糸状菌において新規の遺伝子導入系を確立すべく鋭意研究を行ったところ、糸状菌のレトロトランスポゾンの配列に、ヌクレアーゼの認識配列を導入した糸状菌を開発し、かかる糸状菌を用いることで、複数の導入箇所に、所望の発現カセットを簡便に導入できることを見出し、本発明に至った。
　そこで本発明は下記に関する：
［１］　ゲノムに存在する、２コピー以上で、例えば３コピー以上、４コピー以上、５コピー以上、６コピー以上、７コピー以上、８コピー以上、９コピー以上、１０コピー以上、１２コピー以上、１５コピー以上、１８コピー以上又は２０コピー以上で、かつ２００コピー以下、１００コピー以下、５０コピー以下、及び３０コピー以下で、存在する動く遺伝因子起因の塩基配列に、ヌクレアーゼ認識配列がそれぞれ導入された糸状菌。
［２］　前記動く遺伝因子が、レトロトランスポゾン、例えばＭｇ－ｓｉｎｅ、ＡＦＬＡＶ、ＡｏＬＴＲ、ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ、ｓｋｉｐｐｙ又はトランスポゾンである、項目１に記載の糸状菌。
［３］　前記動く遺伝因子起因の塩基配列が、４５０～１００００ｂｐであり、例えば４７０ｂｐ以上、５００ｂｐ以上、８００ｂｐ以上、１０００ｂｐ以上、２０００ｂｐ以上、又は３０００ｂｐ以上であり、１００００ｂｐ以下、８０００ｂｐ以下、７０００ｂｐ以下、又は６０００ｂｐ以下である、項目１又は２に記載の糸状菌。
［４］　前記動く遺伝因子起因の塩基配列が、同一又は異なる染色体上に存在する、項目１～３のいずれか一項に記載の糸状菌。
［５］　前記ヌクレアーゼ認識配列が、糸状菌ゲノム内に含まれない配列である、項目１～４のいずれか一項に記載の糸状菌。
［６］　前記ヌクレアーゼ認識配列が１３ｂｐ～４０ｂｐであり、例えば１３ｂｐ以上、１４ｂｐ以上、１５ｂｐ以上、１６ｂｐ以上、１７ｂｐ以上、１８ｂｐ以上、１９ｂｐ以上、又は２０ｂｐ以上であり、４０ｂｐ以下、３６ｂｐ以下、又は３４ｂｐ以下から選ばれる上限が使用されうる、項目１～５のいずれか一項に記載の糸状菌。
［７］　前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮｓ）、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムである、項目１～６のいずれか一項に記載の糸状菌。
［８］　前記エンドヌクレアーゼが、メガエンドヌクレアーゼ、例えばＩ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＤｍｏＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＭｓｏＩ、又はＰＩ－ＰｆｕＩである、項目１～７のいずれか一項に記載の糸状菌。
［９］　ゲノムに存在する、２コピー以上で、例えば３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１２以上、１５以上、１８以上又は２０以上で、かつ２００以下、１００以下、５０以下、及び３０以下で、存在するレトロトランスポゾンの塩基配列にそれぞれメガエンドヌクレアーゼ認識配列が導入された糸状菌。
［１０］　ゲノムに存在する、２コピー以上で、例えば３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１２以上、１５以上、１８以上又は２０以上で、かつ２００以下、１００以下、５０以下、及び３０以下で、存在する動く遺伝因子起因の塩基配列にそれぞれ導入遺伝子が導入された糸状菌。
［１１］　糸状菌のゲノム領域の２以上、例えば３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１２以上、１５以上、１８以上又は２０以上で、かつ２００以下、１００以下、５０以下、及び３０以下の位置に遺伝子が導入された糸状菌を製造するための方法であって、
　項目１～９のいずれか一項に記載の糸状菌に、導入遺伝子と、相同組換え用の上流及び下流配列とを含む発現カセットと、
　前記ヌクレアーゼ認識配列を認識して切断するヌクレアーゼと
　を導入することを含み、ここで相同組換え用の上流及び下流配列が、動く遺伝因子起因の塩基配列の一部とそれぞれ相同である、前記方法。
［１２］　前記導入遺伝子が、発現カセット内において、プロモーター及びターミネーターと作動可能に連結されている、項目１１に記載の方法。
［１３］　項目１～９のいずれか一項に記載の糸状菌と、相同組換え用の上流及び下流配列とを含む発現カセットを含む核酸とを含み、
前記相同組換え用の上流及び下流配列が、動く遺伝因子起因の塩基配列の一部とそれぞれ相同である、遺伝子発現キット。
　本発明に係る糸状菌を用いることで、発現カセットを複数の導入位置にまとめて導入することが可能になる。これにより、複数の同一又は異なる遺伝子を糸状菌に導入することができる。
図１は、プラスミドｐＲＴ＿Ｉ－ＳｃｅＩ＿ＬＯのプラスミドマップを示す。 図２Ａは、Ｉ－ＳｃｅＩサイト導入用カセットの相同組換えによる導入の概要を示す。図２Ｂは、相同組換えにより得られたカセット導入株において、ループアウトによるｐｙｒＧの除去の概要を示す。 図３は、プラスミドｐｄＣｇｌＡ＿ＬＯのプラスミドマップを示す。 図４は、プラスミドｐＣｇｌＡ＿ＰＧｄｅｌＣ＿ＩＳｃ＿ＬＯのプラスミドマップを示す。 図５Ａは、マーカー導入用サイト構築用カセットの相同組換えによる導入の概要を示す。図５Ｂは、相同組換えにより得られたカセット導入株において、ループアウトによるｐｙｒＧの除去の概要を示す。 図６は、Ｉ－ＳｃｅＩサイトが導入されていることを確認するＰＣＲの結果を示す。左側が、各Ｉ－ＳｃｅＩサイトの導入部位におけるＰＣＲの増幅産物を示し、右側は、Ｉ－ＳｃｅＩ消化により増幅産物が切断されることを示す。 図７は、プラスミドｐＲＴ＿Ｐｅｎｏｘのプラスミドマップを示す。 図８は、（Ａ）発現カセットと（Ｂ）ｐｙｒＧ断片導入用カセットの相同組換えによる導入の概要を示す。 図９は、プラスミドｐＰＧｄｅｌＮ＿ＩＣｅ＿ＣｇｌＡのプラスミドマップを示す。 図１０は、発現カセットが相同組換えにより、所定のＩ－ＳｃｅＩ標的サイトに導入されたことを示すＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。 図１１は、ペントシジンオキシターゼ２（ｐｅｎｏｘ２）をコードする発現カセットが相同組換えにより、Ｉ－ＳｃｅＩ標的サイトに導入された数に応じ、ペントシジンオキシターゼ２によるＬ－アルギニンに対する酸化活性が増大することを示す。 図１２は、プラスミドｐＲＴ＿１Ｍ＿Ｍ７ｄ４９Ｃ－Ｔ８のプラスミドマップを示す。 図１３は、プラスミドｐＲＴ＿ＬｒＥＡＯＸのプラスミドマップを示す。 図１４は、Ｉ－ＳｃｅＩ認識サイトを８箇所導入したＲＴ＿ＩＳｃ８＿７＿Ｐ株に、非相同末端結合修復機構に関与するＫｕ７０をコードする遺伝子を復帰させた株の作製方法を示す。 図１５は、プラスミドｐＵＣ１９－ｋｕ７０のプラスミドマップを示す。 図１６は、プラスミドｐＵＣ１９‐ＧＤＨ－ｐｙｒＧ３のプラスミドマップを示す。
　本発明はゲノムに存在する、２コピー以上で存在する動く遺伝因子起因の塩基配列に、ヌクレアーゼ認識配列がそれぞれ導入された糸状菌に関する。本発明の別の態様では、本発明は本発明の糸状菌のゲノム領域の２以上の位置に遺伝子を導入する方法にも関する。本発明のさらに別の態様は、本発明の糸状菌と、発現カセットを含む核酸とを含む、遺伝子発現キットにも関する。以下、本発明に使用される用語を説明する。
［動く遺伝因子］
　動く遺伝因子起因の配列とは、ゲノム内の移動と修復の結果として、ゲノム中において散在する反復配列から構成される。動く遺伝因子起因の配列は、動く遺伝因子に起因している配列をいい、進化の過程で変異や組換えが加わった配列を包含する。動く遺伝因子は、ＤＮＡ型のトランスポゾン又はＲＮＡ型のレトロトランスポゾンであってもよいし、レトロウイルス、パラレトロウイルス、又はレトロイントロンであってもよい。動く遺伝因子起因の配列は、通常４５０ｂｐ以上の長さを有する。糸状菌における遺伝子導入の効率を担保する観点から、動く遺伝子起因の配列は、４７０ｂｐ以上、５００ｂｐ以上、８００ｂｐ以上、１０００ｂｐ以上、２０００ｂｐ以上又は３０００ｂｐ以上の長さであってもよい。動く遺伝子の配列の長さの上限は、特に限定されないが、公知のレトロトランスポゾンの例から、通常１００００ｂｐ以下、８０００ｂｐ以下、７０００ｂｐ以下又は６０００ｂｐ以下が使用されうる。
　本発明において対象となる動く遺伝因子起因の配列は、糸状菌のゲノムに複数コピー数が存在することが好ましい。コピー数は、２以上であり、導入遺伝子数を増加させる観点から、コピー数の下限は、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１２以上、１５以上、１８以上及び２０以上から選択されうる。一方、コピー数の上限は特に限定されないが、レトロトランスポゾンのコピー数の報告例を考慮すると、２００以下、１００以下、５０以下、及び３０以下から選択されうる。動く遺伝因子起因の配列の全てにヌクレアーゼ認識配列が導入されてもよいし、その一部にヌクレアーゼ認識配列が導入されてもよい。
　ＤＮＡ型トランスポゾンは、両端に短い逆方向反復配列と、トランスポザーゼをコードする配列を有する。ＤＮＡ型トランスポゾンの転移には、通常トランスポザーゼの活性が必要とされる。トランスポザーゼが発現すると、単量体のトランスポザーゼは、トランスポゾンの短い逆方向反復配列をそれぞれ認識して二量体を形成することで、ループ構造を形成して切り出される。切り出されたループ構造は、トランスポザーゼの活性により切れ目が入った箇所にループ構造を組み込むことで、切り貼り転移を起こす。
　ＲＮＡ型トランスポゾンは、ＬＴＲ型レトロトランスポゾンと、非ＬＴＲ型レトロトランスポゾンに大別される。ＬＴＲ型レトロトランスポゾンは、両端に同方向の繰り返しのある長い末端反復配列（ＬＴＲ）により特徴づけられる。ＬＴＲ型レトロトランスポゾンは、ＬＴＲに存在するプロモーターによって転写されたＲＮＡ中間体から、逆転写酵素の作用によりｃＤＮＡを生じ、生じたｃＤＮＡがインテグラーゼの作用によりゲノムＤＮＡに導入されることで複製移動が生じる。ＬＴＲ型レトロトランスポゾンとしては、マグナポルセ・グリセア（Magnaporthe grisea）由来のＭｇ－ｓｉｎｅ、ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ、アスペルギルス・フラブス（Aspergillus flavus）のＡＦＬＡＶ、アスペルギルス・オリゼーのＡｏＬＴＲ、フザリウム　オキシスポラム（Fusarium oxysporum）のｓｋｉｐｐｙが挙げられる。非ＬＴＲ型レトロトランスポゾンは、転写産物ＲＮＡの３’末端にポリＡがあるという特徴を有し、隣接するプロモーターから転写されたＲＮＡ中間体を生じ、逆転写酵素の作用によりｃＤＮＡを生じ、生じたｃＤＮＡがエンドヌクレアーゼの作用によりゲノムＤＮＡに導入されることで複製移動が生じる。非ＬＴＲ型レトロトランスポゾンとしては、「長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ）」を有するものと、「短鎖散在反復配列（ＳＩＮＥ）」を有する物が挙げられる。本発明において用いられるレトロトランスポゾンとして、一例としてアスペルギルス・ソーヤに存在するＬＩＮＥが使用される。このレトロトランスポゾンは、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株には１１個存在する（ＲＴ１～１１）。このうち、ＲＴ２、ＲＴ５、ＲＴ７、ＲＴ９の配列は互いに同一で配列番号１であり、ＲＴ４の配列は配列番号２であり、ＲＴ６の配列は配列番号３であり、ＲＴ８の配列は配列番号４であり、及びＲＴ１１の配列は配列番号５である。
［ヌクレアーゼ］
　本発明において「ヌクレアーゼ」は、特定のヌクレアーゼ認識配列を認識してＤＮＡを切断する活性を有する分子をいう。ヌクレアーゼは、単一のタンパク質であってもよいし、複合体であってもよい。複合体は、タンパク質以外の構成因子、例えば核酸などを含んでもよい。本発明のヌクレアーゼは、下記に説明するヌクレアーゼ認識配列を認識することを必要とする。認識配列が長いヌクレアーゼとして、メガエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮｓ）、並びにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが使用されうる。ヌクレアーゼは、糸状菌に既知の方法で導入することができ、一例として細胞壁を破壊したプロトプラストに対してＰＥＧ法や電気穿孔法などにより取り込ませてもよい。また、糸状菌において、ヌクレアーゼを誘導的又は一時的に発現させることにより導入してもよい。ヌクレアーゼの誘導的又は一時的な発現については、周知の技術を用いることができる。一例として、プロモーター及びターミネーター配列を備え、ヌクレアーゼの配列が導入された発現ベクターを用いることができる。ヌクレアーゼが糸状菌に導入されると、動く遺伝因子の配列中のヌクレアーゼ認識配列が特異的に切断される。切断の修復の際に導入遺伝子を含むカセットとの相同組換え又は非相同末端結合が生じることで、部位特異的な遺伝子導入が可能になる。
　メガエンドヌクレアーゼは、古細菌、細菌、ファージ、真菌、酵母、藻類、植物など多種の生物において見いだされたヌクレアーゼである。メガエンドヌクレアーゼは、長い認識配列を有しており、オフターゲットが少ない点を特徴とする。Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＤｍｏＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＭｓｏＩ、又はＰＩ－ＰｆｕＩ等の野生型メガエンドヌクレアーゼを使用することもでき、野生型メガエンドヌクレアーゼにおいて認識配列を新たに設計することにより製造されたヌクレアーゼを使用することもできる。一例として、Ｉ-ＳｃｅＩの認識配列（以下、I-SceIサイト（ISc）ともいう）は、TAGGGATAACAGGGTAAT：配列番号４９であり、Ｉ－ＣｅｕＩの認識配列（以下、I-CeuIサイト(ICe)ともいう）は、TAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAA：配列番号５０である。
　ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ＦｏｋＩなどの非特異的ヌクレアーゼのＤＮＡ開裂部位と、亜鉛イオンによって安定化されたジンクフィンガーを含む認識部位とを融合させて作製された部位特異的ヌクレアーゼである。１つのジンクフィンガーあたり３塩基対又はそれ以上のＤＮＡ配列を認識可能であり、認識配列に応じて複数のジンクフィンガーを組み合わせることで、比較的長い認識部位を認識可能なジンクフィンガーを調製可能である。すでに認識配列が確定された既存のジンクフィンガーヌクレアーゼを用いてもよいし、新たに認識配列を設定して作製されたジンクヌクレアーゼを用いてもよい。
　転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮｓ）は、ＦｏｋＩなどの非特異的ヌクレアーゼのＤＮＡ開裂部位と、転写アクチベーター様（ＴＡＬ）タンパク質とを融合させて作製された部位特異的ヌクレアーゼである。ＴＡＬタンパク質は、約３４アミノ酸のモジュールの繰り返し構造を有しており、１つのモジュールの第１２位及び第１３位のアミノ酸を変化させることで、ＤＮＡ結合ドメイン構造を操作することが可能になる。１つのモジュールが、１のヌクレオチドを認識することができ、モジュールを組み合わせて作製されたＴＡＬタンパク質により、ＤＮＡ配列特異的な結合が可能になり、ＴＡＬタンパク質に融合されたヌクレアーゼがＤＮＡを配列特異的に切断する。すでに認識配列が確定された既存のＴＡＬＥＮを用いてもよいし、新たに認識配列を設定して作製されたＴＡＬＥＮを用いてもよい。
　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲ　ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と、ヌクレアーゼ活性を有するＣａｓタンパク質で構成された部位特異的ヌクレアーゼを提供する。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの代わりに、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとをつなげて一本鎖とした一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を用いてもよい。ｃｒＲＮＡ中の標的ヌクレオチド配列により、ＤＮＡの相補配列が認識され、ＣＡＳタンパク質により部位特異的に切断が生じる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、本技術分野において既知の方法により、ガイドＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を同一又は異なる発現ベクターに搭載して導入してもよい。既知の標的ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いてもよいし、新たに設計された標的ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いてもよい。
　ヌクレアーゼ認識配列とは、ヌクレアーゼが認識し、切断する配列のことをいう。ヌクレアーゼ認識配列は、ヌクレアーゼの種類に応じて異なり、その長さも配列も異なる。標的部位特異的に切断をする観点から、ヌクレアーゼ認識配列は、ゲノム中で標的配列としてのみ存在することが好ましい。オフターゲットが発生する可能性を減少させる観点から、ヌクレアーゼ認識配列として、１３ｂｐ以上、１４ｂｐ以上、１５ｂｐ以上、１６ｂｐ以上、１７ｂｐ以上、１８ｂｐ以上、１９ｂｐ以上、及び２０ｂｐ以上からなる群から選択される長さの配列が使用される。ヌクレアーゼ認識配列の長さの上限は特に限定されないが、ヌクレアーゼの標的性能の観点から通常、４０ｂｐ以下、３６ｂｐ以下、及び３４ｂｐ以下から選ばれる上限が使用されうる。ヌクレアーゼの認識配列は、既存のヌクレアーゼの認識配列を使用することができ、また新たに設計された認識配列を使用してもよい。ヌクレアーゼとしては、既存のヌクレアーゼの他、認識配列を設計された新規のヌクレアーゼを使用することができる。ヌクレアーゼ認識配列は、後述するヌクレアーゼ認識配列導入用カセットを用いて、糸状菌のゲノムに存在する２以上の動く遺伝因子起因配列中に導入される。
［糸状菌］
　糸状菌としては、任意の糸状菌が使用されうるが、一例として、アスペルギルス（Aspergillus）属、ペニシリウム（Penicillium）属、ラサムソニア（Rasamsonia）属、タラロマイセス（Talaromyces）属、トリコデルマ（Trichoderma）属、アクレモニウム（Acremonium）属、ムコール（Mucor）属、リゾプス（Rhizopus）属、フザリウム（Fusarium）属、モナスカス（Monascus）属、ニューロスポラ（Neurospora）属、ミセリオフソラ（Myceliophthora）属、クリソスポリウム（Chrysosporium）属、サーモマイセス（Thermomyces）属、モルティエレラ（Mortierella）属、ブラケスレア（Blakeslea）属、アシュビア（Ashbya）属、ウスチラゴ（Ustilago）属、エメリセラ（Emericella）属、クラドスポリウム（Cladosporium）属、コニオカエタ（Coniochaeta）属からなる群から選択される糸状菌が使用されうる。アスペルギルス属としては、アスペルギルス属の糸状菌の一例として、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・ルチュエンシス（Aspergillus luchuensis）、アスペルギルス・タマリ（Aspergillus tamarii）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・アクレアタス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・ウサミ（Aspergillus usamii）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）が挙げられる。これらの糸状菌のなかで、所望のコピー数の動く遺伝因子を有する糸状菌が適宜選択されうる。
　本発明は、ゲノムに存在する、２コピー以上で存在する動く遺伝因子起因の塩基配列に、ヌクレアーゼ認識配列をそれぞれ導入された糸状菌に関する。かかる糸状菌は、任意の手法を用いて製造することができる。一例として、ヌクレアーゼ認識配列は、後述するヌクレアーゼ認識配列導入用カセットを用い、相同組換えを利用して宿主の糸状菌に導入することで行われる。さらに別の方法では、ヌクレアーゼ認識配列の導入は、既知のゲノム編集技術を用いることもできる。一例として、ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓシステムを利用した部位特異的切断と相同組換えを利用することで、ヌクレアーゼ認識配列を導入することができる。導入の有無は、個々の動く遺伝因子起因の塩基配列に特異的なプライマーを用いてＰＣＲにより増幅して決定することができる。ヌクレアーゼ認識配列導入用カセットを用いて、２コピー以上で存在する動く遺伝因子起因の塩基配列に、ヌクレアーゼ認識配列をそれぞれ導入された糸状菌に対し、さらに後述するマーカー導入用サイト構築用カセットを導入することもできる。本発明の別の態様は、こうして作製された糸状菌に関してもよい。かかる糸状菌は、２コピー以上で存在する動く遺伝因子起因の塩基配列に、ヌクレアーゼ認識配列がそれぞれ導入されているとともに、任意の領域にヌクレアーゼ認識配列とマーカー導入用の配列、一例としてマーカー断片配列が導入される（図８Ａ及びＢ）。かかる糸状菌により、後の導入用遺伝子を導入する際に、糸状菌を選別することができる。
　２コピー以上で存在する動く遺伝因子起因の塩基配列に、ヌクレアーゼ認識配列が導入された糸状菌は、更なる遺伝子の導入に使用することができる。具体的に、遺伝子導入の際に、ヌクレアーゼを一緒に導入することにより、ヌクレアーゼ認識配列に基づいて切断が生じる。これにより、効率よく相同組換え又は非相同末端結合を生じさせることができ、２コピー以上で存在する動く遺伝因子起因の塩基配列のそれぞれに、一度の操作で遺伝子を導入することが可能になる。
［ヌクレアーゼ認識配列導入用カセット］
　ヌクレアーゼ認識配列導入用カセットは、ヌクレアーゼ認識配列の上流及び下流において、動く遺伝因子の配列と相同な配列を配置することで調製することができる。ヌクレアーゼ認識配列導入用カセットには、さらにマーカー配列を導入することができ、マーカー配列は将来的にループアウトを誘導することで除去可能に配置することができる。マーカー配列を将来的にループアウトにより除去可能なヌクレアーゼ認識配列導入用カセットとしては、動く遺伝因子の配列を、上流から領域１、領域２、及び領域３と分割した場合に、ヌクレアーゼ認識配列導入用カセットを、一例として、上流から領域１-ヌクレアーゼ認識配列-領域３-マーカー配列-領域２という順番となるように配列を配置することで調製される（図２Ａ）。領域１、領域２及び領域３は、それぞれ相同組換えを可能とする長さ及び同一性を有していればよい。ヌクレアーゼ認識配列導入用カセットは、この順番で配置されていれば、他の配列を含んでいてもよい。ヌクレアーゼ認識配列導入用カセットを宿主細胞に導入することで、ヌクレアーゼ認識配列導入用カセットの領域１と領域２、並びに宿主の動く遺伝因子の領域１と領域２との間で相同組換えが生じ、ヌクレアーゼ認識配列導入用カセットが導入された形質転換株を取得することができる。この形質転換株については、マーカーを用いた選別を行うことができる。ヌクレアーゼ認識配列導入用カセットが導入された形質転換株では、導入されたカセットに含まれる領域３と、元々動く遺伝因子の領域３とが存在する。これによりマーカー配列に対する負の選択圧をかけることで、マーカーがループアウトにより除去された株の選別を行うことができる。マーカー配列としては、ピリミジン生合成経路の遺伝子（ｐｙｒＧ、又はｐｙｒＦ）、トリプトファン生合成経路の遺伝子（ｔｒｐＣ）、硝酸還元酵素遺伝子（ｎｉａＤ）、アセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ）、ＡＴＰスルフリラーゼ遺伝子（ｓＣ）等を使用することができる。ｐｙｒＧ又はｐｙｒＦが導入されることで、宿主株が示していたウラシル要求性を相補し、ウラシル未添加培地において形質転換株のスクリーニングが可能になる。また、ｐｙｒＧ又はｐｙｒＦを発現する形質転換株は、５－フルオロオロチン酸（５－ＦＯＡ）添加培地では生育できないため、５－ＦＯＡ添加培地でスクリーニングを行うことで、例えば領域３を介したループアウトによりｐｙｒＧが除去された株を取得することができる（図２Ｂ）。アスペルギルス・ソーヤのｐｙｒＧをコードする塩基配列を配列番号５１に示す。ｔｒｐＣ欠損株はトリプトファン要求性を示すことから、トリプトファン未添加培地においてｔｒｐＣが導入された形質転換株のスクリーニングが可能になる。一方、ｔｒｐＣ欠損株は５－フルオロアントラニル酸に耐性を示すことから、ループアウトを介してマーカーが除去された株の選抜が可能になる。ｎｉａＤ欠損株は硝酸塩を資化できないことから、硝酸塩を窒素源とした選択培地においてｎｉａＤが導入された形質転換株のスクリーニングが可能になる。一方、ｎｉａＤ欠損株は塩素酸塩に耐性を示すことから、ループアウトを介してマーカーが除去された株の選抜が可能になる。ａｍｄＳが導入されることで、アセトアミドを資化できるようになるため、アセトアミドを窒素源とした選択培地において形質転換株のスクリーニングが可能になる。ａｍｄＳにコードされているアセトアミダーゼは、フルオロアセトアミドにも作用し、毒性のフルオロ酢酸を生成するため、フルオロアセトアミド耐性によりループアウトを介してマーカーが除去された株の選抜が可能になる。ｓＣ欠損株は硫酸塩を資化できないことから、硫酸塩を硫黄源とした選択培地においてｓＣが相補された形質転換株のスクリーニングが可能になる、ｓＣ欠損株は、セレン酸塩に耐性となるため、ループアウトを介してマーカーが除去された株の選抜が可能になる。
［マーカー導入用サイト構築用カセット］
　宿主の任意の領域にマーカー導入用サイトを導入することができる。マーカー導入用サイトが導入される領域は、マーカー導入用サイトが導入された際に生育に影響のない領域であればよい。そのような領域の一例として、ｃｇｌＡ遺伝子の領域を、マーカー導入用サイトを導入する領域として選択することができる。ｃｇｌＡ遺伝子の上流を領域４及び領域５とし、ｃｇｌＡ遺伝子の下流を領域６と設定した場合に、マーカー導入用サイト構築用カセットを、一例として領域５－マーカー配列－領域４－ヌクレアーゼ認識配列－Ｃ末欠損マーカー配列－領域６となるようにして作製する。マーカー導入用サイト構築用カセットに用いるマーカーと、後のマーカー断片導入用カセットに用いるマーカーが同種である場合において、Ｃ末欠損マーカー配列は、マーカー導入用サイト構築用カセットのマーカー配列との相同組換えを避けるため、逆向きにして使用することができる。マーカー導入用サイト構築用カセットを宿主細胞に導入すると、領域５と領域６との間で相同組換えが生じ、マーカー導入用サイト構築用カセットが導入される（図５Ａ）。領域４、領域５及び領域６は、それぞれ相同組換えを可能とする長さ及び同一性を有していればよい。この形質転換株については、マーカーを用いた選別を行うことができる。マーカー導入用サイト構築用カセットが導入された形質転換株では、導入されたカセットに含まれる領域４と、元々宿主の領域４とが存在する。これにより、マーカー配列に対する負の選択圧をかけることで、マーカーがループアウトにより除去された株の選別を行うことができる（図５Ｂ）。マーカーとしては、上述の任意のマーカーを使用できるが、一例としてピリミジン生合成経路の遺伝子（ｐｙｒＧ：配列番号５１）を使用することができる。ｐｙｒＧが導入されることで、ウラシル未添加培地において相同組換え株のスクリーニングが可能になる。また、ｐｙｒＧを発現する形質転換株は、５－フルオロオロチン酸（５－ＦＯＡ）添加培地では生育できないため、５－ＦＯＡ添加培地でスクリーニングを行うことで、領域４を介したループアウトによりｐｙｒＧが除去された株を取得することができる（図５Ｂ）。Ｃ末欠損ｐｙｒＧは、Ｃ末端を欠失させることで機能を欠損させており、Ｎ末欠損ｐｙｒＧ配列と相同組換えされることで、ｐｙｒＧのマーカー機能を発揮することができる。
　ヌクレアーゼ認識配列導入用カセットの領域１～３、及びマーカー導入用サイト構築用カセットの領域４～６をそれぞれ、相同組換え配列と呼ぶ。相同組換え配列は、相同組換えを生じる配列であれば、任意の長さ及び同一性であってよい。相同組換え配列は、例えば３０ｂｐ以上の長さであればよい。一例として、４０ｂｐ以上、５０ｂｐ以上、７５ｂｐ以上、１００ｂｐ以上、２００ｂｐ以上、３００ｂｐ以上、５００ｂｐ以上、又は１０００ｂｐ以上が使用されうる。相同組換え配列の長さの上限は特に限定されないが、カセット構築のしやすさの観点から、通常５０００ｂｐ以下、４０００ｂｐ以下、３０００ｂｐ以下、２０００ｂｐ以下、又は１０００ｂｐ以下が使用されうる。相同組換え配列の同一性は、例えば少なくとも８０％以上、好ましくは少なくとも約８５％以上、より好ましくは少なくとも約９０％以上、最も好ましくは約９５～１００％であり得る。同一性は、公知の方法により決定できる。
［遺伝子導入方法］
　本発明は、２コピー以上で存在する動く遺伝因子起因の塩基配列にヌクレアーゼ認識配列をそれぞれ導入された糸状菌に遺伝子を導入する方法にも関する。導入する遺伝子は、同じ遺伝子を複数導入してもよいし、異なる遺伝子を１又は複数導入してもよい。かかる方法により、糸状菌のゲノム領域の２以上の位置に遺伝子を導入された糸状菌が得られる。したがって、遺伝子を導入する方法は、糸状菌のゲノム領域の２以上の位置に遺伝子を導入された糸状菌を製造するための方法ということもできる。より具体的に、以下の：
　本発明に係る糸状菌に、導入遺伝子を含む発現カセットと、
　前記ヌクレアーゼ認識配列を認識して切断するヌクレアーゼと
　を導入する工程を含む。本発明の方法により、発現カセットに含まれる導入遺伝子を、相同組換え機構又は非相同末端結合機構により、２以上の位置の動く遺伝因子起因の配列に導入することができる。本発明の方法は、さらに、マーカー導入用カセット、例えば、マーカー断片導入用カセットを導入することにより、マーカー遺伝子を、マーカー導入用サイトに導入することができる。
［導入遺伝子発現カセット］
　導入遺伝子発現カセットは、ヌクレアーゼ切断位置よりも上流の配列に相同性を有する相同組換え用の上流配列（前述の領域１）と、ヌクレアーゼ切断位置よりも下流の配列に相同性を有する相同組換え用の下流配列（前述の領域３）と、導入遺伝子とを含む。導入遺伝子は、上流配列と下流配列とに挟まれるように配置される。導入遺伝子には、宿主における発現を促進するプロモーター配列及びターミネーター配列がさらに作動可能に付加される。糸状菌において使用可能なプロモーター配列としては、グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素遺伝子（ｇｐｄ）のプロモーター配列、セロビオヒドロラーゼ遺伝子（ｃｂｈ１）のプロモーター配列が挙げられるがこれらの配列に限定されるものではない。糸状菌において使用可能なターミネーター配列としてはグリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素遺伝子（ｇｐｄ）のターミネーター配列、セロビオヒドロラーゼ遺伝子（ｃｂｈ１）のターミネーター配列が挙げられるがこれらの配列に限定されるものではない。導入遺伝子発現カセットには、さらにエンハンサー配列、スプライシングシグナル配列、ポリＡ付加シグナル、及び/又はリンカー配列が含まれていてもよい。相同組換え用の上流配列（領域１）及び下流配列（領域３）は、動く遺伝因子の塩基配列の一部（すなわち領域１及び領域３）を含む配列とそれぞれ相同組換えが生じうる程度に相同である。
　導入遺伝子は、任意の遺伝子を選択することができ、単独の遺伝子を導入してもよいし、タンデムに連続して配置された複数の遺伝子を導入してもよい。導入遺伝子は、相同組換えを妨げない長さであれば、特に限定されないが、一例として２００～４００００ｂｐである。導入遺伝子配列の長さは、遺伝子がコードするタンパク質の機能発現に必要な長さの観点から２００ｂｐ以上、５００ｂｐ以上、１０００ｂｐ以上、２０００ｂｐ以上、３０００ｂｐ以上、４０００ｂｐ以上、５０００ｂｐ以上、６０００ｂｐ以上、７０００ｂｐ以上、又は８０００ｂｐ以上であり、カセット構築のしやすさの観点から、タンパク質の機能発現を妨げない限りにおいて４００００ｂｐ以下、２００００ｂｐ以下、又は１００００ｂｐ以下である。
　プロモーター配列及びターミネーター配列は、宿主に応じて適宜選択することができる。一例として、糸状菌としてアスペルギルス属を用いる場合、プロモーター配列として、翻訳伸長因子遺伝子ｔｅｆ１のプロモーター配列（Ｐｔｅｆ）、α-アミラーゼ遺伝子（ａｍｙ）のプロモーター配列、アルカリプロテアーゼ遺伝子（ａｌｐ）のプロモーター配列、トリプトファン合成系の遺伝子ｔｒｐＣのプロモーター配列などが挙げられる。ターミネーター配列としては、アルカリプロテアーゼ遺伝子ａｌｐのターミネーター配列（Ｔａｌｐ）、ａｍｙのターミネーター配列、ｔｅｆ１のターミネーター配列、ｔｒｐＣのターミネーター配列などを使用することができる。
［マーカー断片導入用カセット］
　マーカー断片導入用カセットは、宿主株に導入されたマーカー導入用サイト構築用カセットに対応させて適宜作製することができる。一例として、マーカー導入用サイトにＣ末欠損マーカー配列を導入している場合、マーカー断片導入用カセットには、Ｎ－末欠損マーカー配列を含むように構成され、さらにマーカー導入用サイトと相同組換えを引き起こす領域を含むように構成される。マーカー断片導入用カセットは、さらにヌクレアーゼ認識配列を含めてもよい。こうして導入される更なるヌクレアーゼ認識配列は、ヌクレアーゼ認識配列導入用カセットで使用されたヌクレアーゼ認識配列と異なる配列であることが望ましい。一例として、マーカー断片導入用カセットは、領域４-ＩＣｅｕＩ認識配列－Ｎ末欠損マーカー配列とを含む。宿主株に導入されたマーカー導入用サイトのヌクレアーゼ認識配列が切断され、マーカー断片導入用カセットの領域４とＮ末欠損マーカー配列と、宿主株の領域４と、Ｃ末欠損マーカー配列とが相同組換えを起こすことにより、完全なマーカー配列とＩＣｅｕＩ認識配列とが宿主に導入される。
　ヌクレアーゼ認識配列導入用カセット、マーカー導入用サイト構築用カセット、導入遺伝子発現カセット、マーカー断片導入用カセットが、それぞれ糸状菌に導入されうる。これらのカセットは、プラスミドの一部として、又は核酸断片、例えばＰＣＲにより増幅した増幅産物として宿主細胞に導入されてもよいし、これらの核酸を酵素処理し精製された産物として宿主細胞に導入されてもよい。カセットは、本技術分野に既知の方法により、糸状菌の菌体内へと導入することができる。一例として、細胞壁が破壊されたプロトプラストを調製し、ＰＥＧ法又は電気穿孔法で、発現カセットと共にヌクレアーゼが導入される。細胞壁は、例えばヤタラーゼ（Ｙａｔａｌａｓｅ）等の細胞壁溶解酵素を適切な条件で適用することにより破壊され、プロトプラストを得ることができる。ＰＥＧ法又は電気穿孔法は、本技術分野に周知の条件を用いることができる。
［発現キット］
　遺伝子発現キットは、本発明の糸状菌と、相同組換え用の上流及び下流配列とを含む発現カセットを含む核酸とを含む。本発明のタンパク質発現キットは、さらにヌクレアーゼ認識配列を分解可能なヌクレアーゼをさらに含んでもよい。また、本発明のタンパク質発現キットは、マーカー断片導入用カセットを含む核酸をさらに含んでもよい。タンパク質発現キットにおいて、所望のタンパク質をコードする遺伝子を発現カセットの上流配列と下流配列との間に配置した発現カセットを調製し、宿主糸状菌へと、ヌクレアーゼと共に導入することで、所望のタンパク質遺伝子の発現を誘導することができる。発現キットは、発現カセットを調製又は導入のために使用する酵素、例えば制限酵素、ヤタラーゼ、ポリメラーゼ、リガーゼ、並びに、さらには発現カセット内へのタンパク質をコードする遺伝子の導入を確認可能なプライマーセット、さらには各酵素反応に適した緩衝液などをさらに含んでいてもよい。
実施例１：トランスポゾン・レトロトランスポゾンを含めた全ゲノム解析
　アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株について、レトロトランスポゾン様配列を含む配列をＰＣＲで増幅し、配列情報を取得した。Ｓｃａｆｆｏｌｄ中の適切な長さのギャップ領域の周辺配列中に、ギャップ領域を挟むようにプライマーを設けてＰＣＲで増幅し、配列情報を取得した。Ｓｃａｆｆｏｌｄ間についてＰＣＲで増幅し、配列情報を取得した。染色体ＤＮＡを制限酵素で切断し、セルフライゲーションしたものを鋳型に、レトロトランスポゾン様配列中の配列をプライマーに用いてインバースＰＣＲで増幅し、周辺の配列情報を取得した。その後、ＰａｃＢｉｏシーケンサーでゲノム配列を特定したことにより、ほぼ染色体レベルでつながった配列情報を得ることができた。これにより、上記ＰＣＲによる解析では不明だった部分についても配列情報を得た。糸状菌の公知のリバーストランスクリプターゼとしてアノテーションされているＬＩＮＥ型レトロトランスポゾン様配列の部分配列（配列番号６）をｑｕｅｒｙに用いて、特定した配列に対し、Ｇｅｎｅｔｙｘソフトウエアを用いてＬｏｃａｌ　ＢＬＡＳＴ検索を行った。その結果、相同性を示す配列が複数あることを特定した（ＲＴ１～ＲＴ１１）。そのうち、Ｉ－ＳｃｅＩサイト導入用カセットを相同組換えで導入することが可能な部位はアスペルギルス・ソーヤの染色体上に８箇所存在した（ＲＴ２、ＲＴ４～９、ＲＴ１１）。
実施例２：宿主糸状菌の作製
（１）Ｉ－ＳｃｅＩサイト導入用カセットの作製
　染色体上に散在するレトロトランスポゾン様配列にＩ－ＳｃｅＩサイトを導入するためのカセットを作製した。再表２０１９／２４０２４３（特許文献２）に記載のプラスミドｐＥｇｔＡ＿ｓＬＯ＿Ｐｙを鋳型とし、以下のプライマーと、ＰＣＲの酵素として、Ｑ５　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　２Ｘ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）、ＰＣＲ装置として、Ｔ１００サーマルサイクラー（バイオ・ラッド社）を用い、本酵素に添付されたプロトコールに従ってＰＣＲを実施することにより、ＤＮＡ断片を増幅して得た。
　得られたＤＮＡの制限酵素ＤｐｎＩによる処理及びセルフライゲーション反応を、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（東洋紡社）を用いて行った。セルフライゲーション反応液を用いて、コンピテントセルであるＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ニッポンジーン社）を、製造業者の指示に従って形質転換することにより、形質転換大腸菌を得た。得られた形質転換大腸菌を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地中で３７℃、一晩振とう培養した。培養液を遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体から、ＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社）を用いて、本キットに添付されたプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。これにより、プラスミドｐＲＴ＿Ｉ－ＳｃｅＩ＿ＬＯを得た。プラスミドｐＲＴ＿Ｉ－ＳｃｅＩ＿ＬＯは、相同組換えのための領域１－Ｉ－ＳｃｅＩサイト－ループアウトのための領域３－ｐｙｒＧ－相同組換えのための領域２がｐＵＣ１９プラスミドのマルチクローニングサイトに挿入されている（図１）。
　得られたプラスミドｐＲＴ＿Ｉ－ＳｃｅＩ＿ＬＯを鋳型とし、以下のプライマーを用いてＰＣＲで増幅することによりＩ－ＳｃｅＩサイト導入用カセットを得た。かかるＩ－ＳｅｃＩサイト導入用カセットは、相同組換えのための領域１－Ｉ－ＳｃｅＩサイト－ループアウトのための領域３－ｐｙｒＧ－相同組換えのための領域２からなる（図２）。
（２）マーカー導入用サイト構築用カセットの作製
　ｐｙｒＧ導入用サイト及びＩ－ＳｃｅＩサイトをシスタチオニンγ－リアーゼ遺伝子（ｃｇｌＡとする）座に構築するためのカセットを以下の通り作製した。
（２－１）プラスミドｐｄＣｇｌＡ＿ＬＯの構築
アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の染色体ＤＮＡの抽出
　アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株を５０ｍＬ三角フラスコに入れた１５ｍＬのポリペプトンデキストリン培地（１％（ｗ／ｖ）ハイポリペプトン（日本製薬社）、２％（ｗ／ｖ）デキストリン（富士フイルム和光純薬社）、０．１％（ｗ／ｖ）カザミノ酸（ベクトン・ディッキンソン社）、０．５％（ｗ／ｖ）リン酸二水素カリウム、０．１％（ｗ／ｖ）硝酸ナトリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム・７水和物）に植菌し、３０℃で一晩振とう培養を行った。得られた培養液からろ過により菌体を回収し、ペーパータオルに挟んで水分を除き、予め液体窒素で冷却した乳鉢と乳棒を用いて液体窒素で冷却しながら菌体を粉砕した。得られた粉砕菌体からＤＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて染色体ＤＮＡを抽出した。
　上記で得たＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ　ＮＢＲＣ４２３９株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーセット１（ＣｇｌＡ＿－９３９Ｆ＿ｐＵＣとＣｇｌＡ＿－１３８Ｒ＿ｐｙｒＧ）を用いてＰＣＲで増幅することにより、相同組換えのための領域５から成るＤＮＡ断片を得、以下のプライマーセット２（ＣｇｌＡ＿－２０２６Ｆ＿ｐｙｒＧとＣｇｌＡ＿－９３２Ｒ＿１６２７Ｒ）を用いてＰＣＲで増幅することにより、ループアウトのための領域４からなるＤＮＡ断片を得、以下のプライマーセット３（ＣｇｌＡ＿１６１３ＦとＣｇｌＡ＿３３５７Ｒ＿ｐＵＣ）を用いてＰＣＲで増幅することにより、ループアウトのための領域６からなるＤＮＡ断片を得た。）。増幅したそれぞれのＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
　実施例１に記載のプラスミドｐＥｇｔＡ＿ｓＬＯ＿Ｐｙを鋳型とし、以下のプライマーを用いてＰＣＲで増幅することによりＤＮＡ断片を得た（ｐｙｒＧ）。
　得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ社製）で処理し、残存している鋳型ＤＮＡを切断した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
　上記で得た４種の断片と直鎖状ｐＵＣ１９（Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（クロンテック社）に付属されているｐＵＣ１９　ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ　Ｖｅｃｔｏｒ）を、同キットを用いてインフュージョン反応で連結した。その後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られた形質転換大腸菌を液体培養してプラスミドＤＮＡを抽出した。これにより、プラスミドｐｄＣｇｌＡ＿ＬＯを得た。プラスミドｐｄＣｇｌＡ＿ＬＯは、相同組換えのための領域５－ｐｙｒＧ－ループアウトのための領域４－相同組換えのための領域６がｐＵＣ１９プラスミドのマルチクローニングサイトに挿入されている（図３）。
　上記で得たプラスミドｐｄＣｇｌＡ＿ＬＯを鋳型とし、以下のプライマーと、ＰＣＲで増幅することによりＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片は、相同組換えのための領域６－ｐＵＣ１９－相同組換えのための領域５－ｐｙｒＧ－ループアウトのための領域４から成る。
得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩで処理した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて精製した。
　同じくプラスミドｐｄＣｇｌＡ＿ＬＯを鋳型とし、以下のプライマーを使用してＰＣＲで増幅することによりＤＮＡ断片を得た（ｐｙｒＧ下流部分欠損断片）。
得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩで処理した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて精製した。
　上記で得た２種の断片をインフュージョン反応で連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られた形質転換大腸菌を液体培養してプラスミドＤＮＡを抽出することで、プラスミドｐＣｇｌＡ＿ＰＧｄｅｌＣ＿ＩＳｃ＿ＬＯを得た。プラスミドｐＣｇｌＡ＿ＰＧｄｅｌＣ＿ＩＳｃ＿ＬＯは、相同組換えのための領域５－ｐｙｒＧ－ループアウトのための領域４－Ｉ－ＳｃｅＩサイト－ｐｙｒＧ下流部分欠損断片（相補鎖）－相同組換えのための領域６がｐＵＣ１９プラスミドのマルチクローニングサイトに挿入されている（図４）。
　プラスミドｐＣｇｌＡ＿ＰＧｄｅｌＣ＿ＩＳｃ＿ＬＯを制限酵素ＳｍａＩとＳａｌＩで消化することにより、マーカー導入用サイト構築用カセット（相同組換えのための領域５－ｐｙｒＧ－ループアウトのための領域４－Ｉ－ＳｃｅＩサイト－ｐｙｒＧ下流部分欠損断片（相補鎖）－相同組換えのための領域６から成る）とｐＵＣ１９とを切り離し、マーカー導入用サイト構築用カセットを取得した（図５）。
（３）宿主糸状菌の形質転換
（３－１）宿主糸状菌
　特許第６２６１０３９号公報（特許文献３）の実施例２に記載のアスペルギルス・ソーヤＫＰ－ｄｅｌ株を宿主糸状菌として用いた。
（３－２）糸状菌の形質転換
　５００ｍｌ容三角フラスコ中の２０　ｍＭウラシルを含むポリペプトンデキストリン培地１００ｍｌに、アスペルギルス・ソーヤＫＰ－ｄｅｌ株の分生子を接種し、３０℃で１８時間振とう培養を行った後、菌体を回収した。回収した菌体から、特開２０１８－０６４４８４号公報（特許文献４）に記載の方法に従ってプロトプラストを調製した。得られたプロトプラスト及びＩ－ＳｃｅＩサイト導入用カセットを用いてプロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行った。次いで０．５％（ｗ／ｖ）寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地（ディフコ社；ｐＨ６）を用いて、３０℃、５日間以上インキュベートし、コロニー形成能があるものとして形質転換株を得た（図２）。
（３－３）　Ｉ－ＳｃｅＩサイト導入用カセットの導入箇所の確認
　Ｉ－ＳｃｅＩサイト導入用カセットを相同組換えで導入することが可能な部位はアスペルギルス・ソーヤの染色体上に８箇所ある。
　いずれかの部位にＩ－ＳｃｅＩサイト導入用カセットが１コピー導入された株を選抜した。形質転換株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、以下の８種フォワードプライマーと、１種のリバースプライマー（ｐｙｒＧ＿８６９Ｒ）との８通りの組み合わせでＰＣＲを行った。なお、フォワードプライマーはいずれもレトロトランスポゾン様配列の上流に位置し、各レトロトランスポゾン様配列特異的に増幅可能なプライマーである。リバースプライマー（ｐｙｒＧ＿８６９Ｒ）はＩ－ＳｃｅＩサイト導入用カセット中にあるｐｙｒＧ中の配列を用いた。
　Ｉ－ＳｃｅＩサイト導入用カセットが相同組換えで導入されているとＰＣＲ産物が生じる。
８通りの組み合わせのうち１つの組合せで産物が生じた株を、Ｉ－ＳｃｅＩサイト導入用カセットが相同組換えで１箇所に導入された株として選抜した。
（３－４）マーカー除去
　Ｉ－ＳｃｅＩサイト導入用カセット中の「ループアウトのための領域３」と同じ配列をもつ領域が、相同組換えで導入可能な８箇所の部位の下流に共通して存在する。相同組換えでカセットが導入された領域において、「ループアウトのための領域３」と下流の同じ配列領域との間で相同組換えが起きると、ｐｙｒＧ－相同組換えのための領域２からなる領域はループアウトにより除去される（図２）。
　上記で得た、Ｉ－ＳｃｅＩサイト導入用カセットが相同組換えで１箇所に導入された株の分生子を、３ｍｇ／ｍｌ　５－フルオロオロチン酸（５－ＦＯＡ、Ｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍ社）を含有する２０ｍＭウラシル添加Ｃｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ寒天培地に植菌して培養することにより、５－ＦＯＡ耐性株を取得した（図２）。
　得られた５－ＦＯＡ耐性株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、先のＩ－ＳｃｅＩサイト導入用カセットの導入箇所の確認に用いたプライマーのうち、形質転換株で産物が生じた組合せのプライマーを用いてＰＣＲを行い、５－ＦＯＡ耐性株では産物が生じないことを確認した。
　さらに、得られた５－ＦＯＡ耐性株は、２０ｍＭウラシルを含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ寒天培地では成育し、かつ、ウラシル未添加Ｃｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ寒天培地では生育しないこと、すなわち、ウラシル要求性を示すことを確認した。
　得られたｐｙｒＧ除去株を、Ｉ－ＳｃｅＩサイト導入用カセットをさらに導入するための宿主として以下で用いた。
（３－５）　Ｉ－ＳｃｅＩサイト導入用カセットによる形質転換
　Ｉ－ＳｃｅＩサイト導入用カセットを導入した形質転換アスペルギルス・ソーヤの選抜及びｐｙｒＧ除去株の作製までの操作を繰り返すことにより、Ｉ－ＳｃｅＩサイトを２、３、４、５、６、７及び８箇所導入した株を逐次得た。この際、ループアウトによりｐｙｒＧを除去した株を、次の回の宿主として用いた。また、相同組換え株の選抜のためのＰＣＲの際に、産物が生じるプライマーの組み合わせが宿主と比べて新たに１組増えた株を選抜した。
Ｉ－ＳｃｅＩサイトを８箇所導入し、ｐｙｒＧを除去する前の株をＲＴ＿ＩＳｃ８＿７株、ｐｙｒＧを除去した後の株をＲＴ＿ＩＳｃ８＿７＿Ｐ株とした。
（３－６）Ｉ－ＳｃｅＩサイトが導入されていることの確認
　ＲＴ＿ＩＳｃ８＿７＿Ｐ株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、以下のフォワードプライマー（前出）と、リバースプライマー（ＲＴ＿４７７１Ｒ＿２）との８種の組み合わせを用いて、いずれも組合せでもＰＣＲで産物が生じること、さらにＩ－ＳｃｅＩ消化によりいずれのＰＣＲ産物も２本の断片に切断されること、すなわち、いずれの箇所においてもＩ－ＳｃｅＩサイトが導入されていることを確認した（図６）。リバースプライマー（ＲＴ＿４７７１Ｒ＿２）はＩ－ＳｃｅＩサイト導入用カセットが相同組換えで導入された領域よりも下流にある配列を用いた。
（３－７）マーカー導入用サイトの構築
　上記で得たＲＴ＿ＩＳｃ８＿７＿Ｐ株を宿主麹菌とし、先の実施例２（３－２）と同様に振とう培養により菌体を得て、回収した菌体から、特開２０１８－０６４４８４号公報（特許文献４）に記載の方法に従ってプロトプラストを調製した。得られたプロトプラスト及び形質転換用のＤＮＡとしてマーカー導入用サイト構築用カセット（実施例２（２）で調製）を用いてプロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行った。次いで０．５％（ｗ／ｖ）寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地（ディフコ社；ｐＨ６）を用いて、３０℃、５日間以上インキュベートし、コロニー形成能があるものとして形質転換株を得た（図５）。
　形質転換株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーセット１（ＣｇｌＡ＿－２１２０Ｆ及びＰｙｒＧ＿１４０Ｒ）を用いてＰＣＲを行い、２．５ｋｂ産物が生じ、且つ、以下のプライマーセット２（ＰｙｒＧ＿１４０Ｒと　ＣｇｌＡ＿３３９３Ｒ）を用いてＰＣＲを行い、２．３ｋｂ産物が生じた株を、ｃｇｌＡ座にマーカー導入用サイト構築用カセットが相同組換えで導入された株として選抜した。
（３－８）マーカー除去
　マーカー導入用サイト構築用カセット中の「ループアウトのための領域４」と同じ配列をもつ領域が、ｃｇｌＡ遺伝子座の上流にある。相同組換えでカセットが導入された領域において、「ループアウトのための領域４」と上流の同じ配列領域との間で相同組換えが起きると、相同組換えのための領域５－ｐｙｒＧからなる領域はループアウトにより除去される。
上記で選抜した株の分生子を、３ｍｇ／ｍｌ　５－フルオロオロチン酸（５－ＦＯＡ）を含有する２０ｍＭウラシル添加Ｃｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ寒天培地に植菌して培養することにより、５－ＦＯＡ耐性株を取得した。得られた５－ＦＯＡ耐性株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、４．３ｋｂの産物が生じることを確認した。
　さらにＩ－ＳｃｅＩ消化によりこのＰＣＲ産物は２本の断片に切断されること、すなわち、ｃｇｌＡ座にＩ－ＳｃｅＩサイトが導入されていることを確認した。こうして得られた株をＲＩ８＿ＰＧｄｅｌＣ＿ＩＳｃ＿Ｐ株とした。さらに、ＲＩ８＿ＰＧｄｅｌＣ＿ＩＳｃ＿Ｐ株は、２０ｍＭウラシルを含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ寒天培地では成育し、かつ、ウラシル未添加Ｃｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ寒天培地では生育しないこと、すなわち、ウラシル要求性を示すことを確認した。
実施例３：発現カセットの導入
（１）発現カセットの作製
　再表２０１９／１６８０６２（特許文献５）に記載の発現ベクターｐ１９－ｐＧ３－ｐｅｎｏｘ２（Ｐｔｅｆ－ｐｅｎｏｘ２－Ｔａｌｐ－ｐｙｒＧ３がｐＵＣ１９プラスミドのマルチクローニングサイトに挿入されている）を鋳型とし、以下のプライマーを用いてＰＣＲで増幅することによりＰｔｅｆ－ｐｅｎｏｘ２－Ｔａｌｐから成るＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩで処理した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて精製した。
　前出のプラスミドｐＥｇｔＡ＿ｓＬＯ＿Ｐｙを鋳型とし、以下のプライマーセット１（ＲＴ＿１２３３Ｒ＿ＴａＡとｐＵＣ１９＿４１８Ｆ）を用いてＰＣＲで増幅することにより、ｐＵＣ１９－相同組換えのための領域１から成るＤＮＡ断片を得、以下のプライマーセット２（ＲＴ＿３７３１ＦとＲＴ＿４７７１Ｒ＿ｐＵＣ）を用いてＰＣＲで増幅することにより、ループアウトのための領域３からなるＤＮＡ断片を得た。
　得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩで処理した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて精製した。上記で得た３種の断片をインフュージョン反応で連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られた形質転換大腸菌を液体培養してプラスミドＤＮＡを抽出することで、プラスミドｐＲＴ＿Ｐｅｎｏｘを得た。プラスミドｐＲＴ＿Ｐｅｎｏｘは、相同組換えのための領域１－Ｐｔｅｆ－ｐｅｎｏｘ２－Ｔａｌｐ－ループアウトのための領域３がｐＵＣ１９プラスミドのマルチクローニングサイトに挿入されている（図７）。
　上記のｐＲＴ＿Ｐｅｎｏｘを鋳型とし、以下のプライマーを用いてＰＣＲで増幅することにより発現カセットを得た。発現カセットは、相同組換えのための領域１－Ｐｔｅｆ－ｐｅｎｏｘ２－Ｔａｌｐ－ループアウトのための領域３から成る（図８）。ループアウトのための領域３は、以下の形質転換において相同組換えのための領域として機能する。ここで、相同組換えのための領域１の長さは１２０１ｂｐであり、ループアウトのための領域３の長さは１０４１ｂｐであった。
（２）ｐｙｒＧ断片導入用カセットの作製
　前出のプラスミドｐＥｇｔＡ＿ｓＬＯ＿Ｐｙを鋳型とし、以下のプライマーを用いてＰＣＲで増幅することによりＤＮＡ断片（ｐｙｒＧ上流部分欠損断片）を得た。得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩで処理した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて精製した。
　前出のプラスミドｐＣｇｌＡ＿ＰＧｄｅｌＣ＿ＩＳｃ＿ＬＯを鋳型とし、以下のプライマーを用いて、ＰＣＲで増幅することによりＤＮＡ断片（ループアウトのための領域４）を得た。得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩで処理した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて精製した。
　上記で得た２種の断片と直鎖状ｐＵＣ１９をインフュージョン反応で連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られた形質転換大腸菌を液体培養し、プラスミドＤＮＡ抽出し、そしてプラスミドｐＰＧｄｅｌＮ＿ＩＣｅ＿ＣｇｌＡを得た。プラスミドｐＰＧｄｅｌＮ＿ＩＣｅ＿ＣｇｌＡは、ｐｙｒＧ上流部分欠損断片－Ｉ－ＣｅｕＩサイト－ループアウトのための領域４（相補鎖）がｐＵＣ１９プラスミドのマルチクローニングサイトに挿入されている（図９）。
　上記で得たプラスミドｐＰＧｄｅｌＮ＿ＩＣｅ＿ＣｇｌＡを鋳型とし、以下のプライマーを用いてＰＣＲで増幅することによりｐｙｒＧ断片導入用カセットを得た（図８Ｂ）。ｐｙｒＧ断片導入用カセットは、ｐｙｒＧ上流部分欠損断片－Ｉ－ＣｅｕＩサイト－ループアウトのための領域４（相補鎖）から成る。ループアウトのための領域４は、以下の形質転換において相同組換えのための領域として機能する。
（３）形質転換
　上記で得たＲＩ８＿ＰＧｄｅｌＣ＿ＩＳｃ＿Ｐ株を宿主麹菌に用いた。実施例２（３－２）と同様にして菌体を得てプロトプラストを調製し、調製したプロトプラスト懸濁液の１８０μｌ（プロトプラスト：約２×１０７個）に発現カセット４μｇ、ｐｙｒＧ断片導入用カセット４０ｎｇ、及びＩ－ＳｃｅＩ（ＮＥＷ　ＥＮＧＬＡＮＤ　ＢＩＯＬＡＢＳ社）２０ユニットを加えてプロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行った。次いで０．５％（ｗ／ｖ）寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地（ディフコ社；ｐＨ６）を用いて、３０℃、５日間以上インキュベートし、コロニー形成能があるものとして形質転換株を得た。４６株の形質転換株を得た。
（４）発現カセット導入箇所の確認
形質転換株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、以下の８種のフォワードプライマー（前出）と、リバースプライマー１種との８通りの組み合わせを用いてＰＣＲを行った。リバースプライマーは発現カセット中にあるＴｅｆ１プロモーター中の配列を用いた。これにより、発現カセットが導入されているとＰＣＲ産物が生じる。８通りの組み合わせ全てでＰＣＲ産物が生じた、すなわち、発現カセットが８箇所全てに導入された形質転換株は５株あった（図１０）。形質転換株として、発現カセットが導入されていないものから発現カセットが８箇所全てに導入されたものまでがあった。
（５）発現カセット導入株の液体培養
　取得したアスペルギルス・ソーヤ形質転換株を５０ｍＬ三角フラスコに入れた１５ｍＬのＰＰＹ液体培地（２％（ｗ／ｖ）パインデックス＃２（松谷化学工業社）、２％（ｗ／ｖ）ハイポリペプトン（日本製薬社）、１％（ｗ／ｖ）酵母エキス（ベクトン・ディッキンソン社）、０．２５％（ｗ／ｖ）リン酸二水素カリウム、０．２５％（ｗ／ｖ）リン酸水素二カリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム・７水和物）に植菌し、３０℃で４日間振とう培養を行った。
　発現カセットが導入されていない株として実施例２（３－５）のＲＴ＿ＩＳｃ８＿７株を用いた（Ｉ－ＳｃｅＩサイトを８箇所導入し、ｐｙｒＧを除去する前の株）。導入箇所数に付き３株ずつ液体培養した。
（６）Ｌ－アルギニン酸化活性測定
　再表２０１９／１６８０６２（特許文献５）の実施例５に記載の方法で粗酵素液を調製し、Ｌ－アルギニンに対する酸化活性を測定した。結果、導入箇所数が多くなるに従って活性が強くなる傾向が見られた（図１１）。
実施例４：グルタミン酸オキシダーゼ発現カセットの導入
（１）グルタミン酸オキシダーゼ遺伝子のクローニング
　グルタミン酸オキシダーゼ（ＧＬＯＤ）の遺伝子として、M7GLODΔ49C-T8のアミノ酸配列（配列番号５２）をコードする遺伝子を化学合成して用いた（配列番号５３）。なお、この遺伝子の上流末端には、以下のDNA断片と連結するための付加配列CGCACCACCTTCAAA（配列番号５４）を、下流末端には終止コドンTGA、次いで以下のDNA断片と連結するための付加配列GTACCAGGAGTACAT（配列番号５５）を設けた。
　上記の発現用ベクターｐ１９－ｐＧ３－ｐｅｎｏｘ２を鋳型とし、以下のプライマーを用いてＰＣＲで増幅することにより、Ｔａｌｐ－ｐｙｒＧ３－ｐＵＣ１９－Ｐｔｅｆから成るＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩで処理した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて精製した。
　得られたＤＮＡ断片と上記の合成遺伝子をインフュージョン反応で連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られた形質転換大腸菌を液体培養してプラスミドＤＮＡを抽出することで、プラスミドｐ１Ｍ＿Ｍ７ｄ４９Ｃ－Ｔ８＿ＰＧ３を得た。プラスミドｐ１Ｍ＿Ｍ７ｄ４９Ｃ－Ｔ８＿ＰＧ３は、Ｐｔｅｆ－Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ８－Ｔａｌｐ－ｐｙｒＧ３がｐＵＣ１９プラスミドのマルチクローニングサイトに挿入されている。
（２）ＧＬＯＤ発現カセットの作製
　上記のプラスミドｐ１Ｍ＿Ｍ７ｄ４９Ｃ－Ｔ８＿ＰＧ３を鋳型とし、以下のプライマーを用いてＰＣＲで増幅することにより、Ｐｔｅｆ－Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ８－Ｔａｌｐから成るＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩで処理した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて精製した。
　実施例３で得たプラスミドｐＲＴ＿Ｐｅｎｏｘを鋳型とし、プライマー　RT_1233R_TaA（配列番号３７）とRT_3731F（配列番号３９）を用いてＰＣＲで増幅することにより、ループアウトのための領域３－ｐＵＣ１９－相同組換えのための領域１から成るＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩで処理した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて精製した。
　上記で得た２種の断片をインフュージョン反応で連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られた形質転換大腸菌を液体培養してプラスミドＤＮＡを抽出することで、プラスミドｐＲＴ＿１Ｍ＿Ｍ７ｄ４９Ｃ－Ｔ８を得た。プラスミドｐＲＴ＿１Ｍ＿Ｍ７ｄ４９Ｃ－Ｔ８は、相同組換えのための領域１－Ｐｔｅｆ－Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ８－Ｔａｌｐ－ループアウトのための領域３がｐＵＣ１９プラスミドのマルチクローニングサイトに挿入されている（図１２）。
　上記で得たプラスミドｐＲＴ＿１Ｍ＿Ｍ７ｄ４９Ｃ－Ｔ８を鋳型とし、プライマーＲＴ＿３３Ｆ（配列番号９）とＲＴ＿４７７１Ｒ＿２（配列番号４１）を用いてＰＣＲで増幅することによりＧＬＯＤ発現カセットを得た。ＧＬＯＤ発現カセットは、相同組換えのための領域１－Ｐｔｅｆ－Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ８－Ｔａｌｐ－ループアウトのための領域３から成る。ループアウトのための領域３は、以下の形質転換において相同組換えのための領域として機能する。
（３）形質転換
　上記で得たＲＩ８＿ＰＧｄｅｌＣ＿ＩＳｃ＿Ｐ株を宿主麹菌に用いた。実施例２（３－２）と同様にして菌体を得てプロトプラストを調製し、調製したプロトプラスト懸濁液の１８０μｌ（プロトプラスト：約２×１０７個）にＧＬＯＤ発現カセット８μｇ、ｐｙｒＧ断片導入用カセット４０ｎｇ、及びＩ－ＳｃｅＩ　２６ユニットを加えてプロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行った。次いで０．５％（ｗ／ｖ）寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地（ディフコ社；ｐＨ６）を用いて、３０℃、５日間以上インキュベートし、コロニー形成能があるものとして形質転換株を得た。１９株の形質転換株を得た。
（４）発現カセット導入箇所の確認
　得られた形質転換株について、実施例３と同様にして発現カセットの導入箇所を確認した結果、５株において８箇所全てに発現カセットが導入されていた。従って、発現対象遺伝子を変えても８箇所導入が可能であることが示された。
（５）形質転換株の液体培養
　形質転換株を５０ｍＬ三角フラスコに入れた１５ｍＬの２×ＰＰＹ液体培地（４％（ｗ／ｖ）パインデックス＃２（松谷化学工業社）、４％（ｗ／ｖ）ハイポリペプトン（日本製薬社）、２％（ｗ／ｖ）酵母エキス（ベクトン・ディッキンソン社）、０．５％（ｗ／ｖ）リン酸二水素カリウム、０．５％（ｗ／ｖ）リン酸水素二カリウム、０．１％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム・７水和物）に植菌し、３０℃で４日間振とう培養を行った。
（６）粗酵素液の調製
　得られた培養液をＭｉｒａｃｌｏｔｈ （ メルクミリポア社）を用いてろ過し、培養上清を取り除いて菌体を取得した。得られた菌体を８ｍＬの１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ＰＰＢ、ｐＨ６．０）に再懸濁した後、ヒスコトロンＮＳ－５２（ＭＩＣＲＯＴＥＣ社）、次いで、ビーズ式細胞破砕装置ＭＳ－１００Ｒ（トミー精工社）を用いて菌体を破砕した。菌体破砕液を１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上清を粗酵素液として回収した。
（７）ＧＬＯＤ活性の測定
　活性測定試薬には４－アミノアンチピリン（４－ＡＡ、富士フイルム和光純薬社）、ＴＯＯＳ（同仁化学研究所社）、西洋わさびペルオキシダーゼ （ＰＯＤ、東洋紡社）を用いた。活性測定試薬組成を以下の表に示した。粗酵素液（ＧＬＯＤ溶液）の希釈には、０．１５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含む１０ｍＭ　ＰＰＢ（ｐＨ６．０）を用いた。
　上記の表の試薬７２５μｌを３０℃で５分間保温した後、３００ｍＭグルタミン酸水素ナトリウム（ＧｌｕＮａ、富士フイルム和光純薬社）溶液２５μｌを添加して混合し、セルホルダーを３０℃に保温した分光光度計Ｕ－３９００（日立ハイテクサイエンス社）を使用して波長５５５ｎｍの光の吸光度（Ａ５５５）を測定し、１分間あたりのＡ５５５変化量（ΔＡＳ）を算出した。基質溶液（ＧｌｕＮａ溶液）の代わりにイオン交換水２５μｌを添加した測定も行い、１分間あたりのＡ５５５変化量（ΔＡ０）を算出した。
　ＧＬＯＤ活性（Ｕ／ｍｌ）は下記計算式に基づいて算出した。式中の「３９．２」は、４－ＡＡとＴＯＯＳが縮合して形成されるキノンイミン色素の、波長５５５ｎｍの光に対するミリモル吸光係数（ｍＭ－１ｃｍ－１）を示す。「ｄｆ」はＧＬＯＤ溶液を希釈して用いた際の希釈倍率を示す。
　上記で得たＧＬＯＤ発現カセット８箇所導入株のうち２株について上記の方法で液体培養を行い、粗酵素液を調製してＧＬＯＤ活性を測定した結果、いずれも活性が明らかに検出された。発現カセットが導入されていない株としてＲＴ＿ＩＳｃ８＿７株（実施例２（３－５））から同様に調製した粗酵素液では、ＧＬＯＤ活性は検出されなかった。
実施例５：エタノールアミンオキシダーゼ発現カセットの導入
（１）エタノールアミンオキシダーゼ遺伝子のクローニング
　エタノールアミンオキシダーゼ（ＥＡＯＸ）の遺伝子として、再表２０２０／１２２２３１に記載のＬｉｃｈｔｈｅｉｍｉａ　ｒａｍｏｓａ由来ＬｒＨＰのアミノ酸配列（配列番号５８）をコードする遺伝子を化学合成して用いた（配列番号５９）。なお、この遺伝子の上流末端には、以下のＤＮＡ断片と連結するための付加配列ＣＧＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＡＡ（配列番号５４）を、下流末端には終止コドンＴＧＡ、次いで以下のＤＮＡ断片と連結するための付加配列ＧＴＡＣＣＡＧＧＡＧＴＡＣＡＴ（配列番号５５）を設けた。
　上記の発現用ベクターｐ１９－ｐＧ３－ｐｅｎｏｘ２を鋳型とし、以下のプライマーを用いてＰＣＲで増幅することにより、Ｔａｌｐ－ｐｙｒＧ３－ｐＵＣ１９－Ｐｔｅｆから成るＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩで処理した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて精製した。
　得られたＤＮＡ断片と上記の合成遺伝子をインフュージョン反応で連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られた形質転換大腸菌を液体培養してプラスミドＤＮＡを抽出することで、プラスミドｐＬｒＥＡＯＸ＿ＰＧ３を得た。プラスミドｐＬｒＥＡＯＸ＿ＰＧ３は、Ｐｔｅｆ－ＬｒＨＰ－Ｔａｌｐ－ｐｙｒＧ３がｐＵＣ１９プラスミドのマルチクローニングサイトに挿入されている。
（２）ＥＡＯＸ発現カセットの作製
　上記のプラスミドｐＬｒＥＡＯＸ＿ＰＧ３を鋳型とし、以下のプライマーを用いてＰＣＲで増幅することにより、Ｐｔｅｆ－ＬｒＨＰ－Ｔａｌｐから成るＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩで処理した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて精製した。
　実施例３で得たプラスミドｐＲＴ＿Ｐｅｎｏｘを鋳型とし、プライマー　ＲＴ＿１２３３Ｒ＿ＴａＡ（配列番号３７）とＲＴ＿３７３１Ｆ（配列番号３９）を用いてＰＣＲで増幅することにより、ループアウトのための領域３－ｐＵＣ１９－相同組換えのための領域１から成るＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩで処理した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて精製した。
　上記で得た２種の断片をインフュージョン反応で連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られた形質転換大腸菌を液体培養してプラスミドＤＮＡを抽出することで、プラスミドｐＲＴ＿ＬｒＥＡＯＸを得た。プラスミドｐＲＴ＿ＬｒＥＡＯＸは、相同組換えのための領域１－Ｐｔｅｆ－ＬｒＨＰ－Ｔａｌｐ－ループアウトのための領域３がｐＵＣ１９プラスミドのマルチクローニングサイトに挿入されている（図１３）。
　上記で得たプラスミドｐＲＴ＿ＬｒＥＡＯＸを鋳型とし、プライマーＲＴ＿３３Ｆ（配列番号９）とＲＴ＿４７７１Ｒ＿２（配列番号４１）を用いてＰＣＲで増幅することによりＥＡＯＸ発現カセットを得た。ＥＡＯＸ発現カセットは、相同組換えのための領域１－Ｐｔｅｆ－ＬｒＨＰ－Ｔａｌｐ－ループアウトのための領域３から成る。ループアウトのための領域３は、以下の形質転換において相同組換えのための領域として機能する。
（３）形質転換
　上記で得たＲＩ８＿ＰＧｄｅｌＣ＿ＩＳｃ＿Ｐ株を宿主麹菌に用いた。実施例２（３－２）と同様にして菌体を得てプロトプラストを調製し、調製したプロトプラスト懸濁液の１８０μｌ（プロトプラスト：約２×１０７個）にＥＡＯＸ発現カセット８μｇ、ｐｙｒＧ断片導入用カセット４０ｎｇ、及びＩ－ＳｃｅＩ　２５ユニットを加えてプロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行った。次いで０．５％（ｗ／ｖ）寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地（ディフコ社；ｐＨ６）を用いて、３０℃、５日間以上インキュベートし、コロニー形成能があるものとして形質転換株を得た。１５株の形質転換株を得た。
（４）発現カセット導入箇所の確認
　得られた形質転換株について、実施例３と同様にして発現カセットの導入箇所を確認した結果、２株において８箇所全てに発現カセットが導入されていた。従って、発現対象遺伝子の種類に関わらず８箇所への導入が可能であることが示された。
実施例６：相同組換えのための領域長が５０ｂｐの発現カセットの導入
（１）相同組換えのための領域長が５０ｂｐの発現カセットの作製
　実施例３で得たプラスミドｐＲＴ＿Ｐｅｎｏｘを鋳型とし、以下のプライマーを用いてＰＣＲで増幅することによりペントシジンオキシターゼ２発現カセットを得た。得られた発現カセットは、相同組換えのための領域１－Ｐｔｅｆ－ｐｅｎｏｘ２－Ｔａｌｐ－ループアウトのための領域３から成るが、相同組換えのための領域１、ループアウトのための領域３の長さは共に５０ｂｐとした。ループアウトのための領域３は、以下の形質転換において相同組換えのための領域として機能する。
（２）形質転換
　上記で得たＲＩ８＿ＰＧｄｅｌＣ＿ＩＳｃ＿Ｐ株を宿主麹菌に用いた。実施例２（３－２）と同様にして菌体を得てプロトプラストを調製し、調製したプロトプラスト懸濁液の１８０μｌ（プロトプラスト：約２×１０７個）に発現カセット８μｇ、ｐｙｒＧ断片導入用カセット４０ｎｇ、及びＩ－ＳｃｅＩ　２５ユニットを加えてプロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行った。次いで０．５％（ｗ／ｖ）寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地（ディフコ社；ｐＨ６）を用いて、３０℃、５日間以上インキュベートし、コロニー形成能があるものとして形質転換株を得た。９株の形質転換株を得た。
（３）発現カセット導入箇所の確認
　得られた形質転換株について、実施例３と同様にして発現カセットの導入箇所を確認した結果、１株において８箇所全てに発現カセットが導入されていた。従って、相同組換えのための領域長が５０ｂｐのカセットを用いても、８箇所導入が可能であることが示された。
実施例７：Ｉ－ＳｃｅＩ認識サイトを導入した株を用いた外来遺伝子の多コピー導入
　特開２０１８－０６８２９２において、プロモーター長を短縮化し、発現量を低下させた選択マーカーを用いることで、外来遺伝子の多コピー導入が可能となる技術が開示されている。そこで、本技術をＩ－ＳｃｅＩ認識サイトを導入した株に適用することで、Ｉ－ＳｃｅＩ認識サイトを導入していない株に適用する場合と比べて、多コピー導入効率が向上するか検証した。
（１）外来遺伝子の多コピー導入を目的としたＩ－ＳｃｅＩ認識サイト導入株の作製
　Ｉ－ＳｃｅＩ認識サイトを導入した株において非相同末端結合により外来遺伝子を多コピーで導入できようにするために、Ｉ－ＳｃｅＩ認識サイトを８箇所導入したＲＴ＿ＩＳｃ８＿７＿Ｐ株に、非相同末端結合に関与するＫｕ７０をコードする遺伝子を復帰させた株を下記のように作製した。株の作製方法の概略を図１４に示した。
　アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーセット１（Ｐｋｕ７０－１５００Ｆ１とＰｋｕ７０ｏｒｆＲ１）を用いてＰＣＲで増幅することにより、相同組換えのための領域７－ｋｕ７０から成るＤＮＡ断片を得、以下のプライマーセット２（Ｐｋｕ７０＋１Ｆ１とＰｋｕ７０＋１５００Ｒ１）を用いてＰＣＲで増幅することにより、相同組換えのための領域８からなるＤＮＡ断片を得、以下のプライマーセット３（Ｐｋｕ７０＋１５００Ｆ１とＰｋｕ７０＋２５００Ｒ１）を用いてＰＣＲで増幅することにより、ループアウトのための領域９からなるＤＮＡ断片を得、以下のプライマーセット４（Ｐｔａｍｙ＿Ｆ１とＰｔａｍｙ＿Ｒ２）を用いてＰＣＲで増幅することにより、ＡｍｙＡターミネーター（Ｔａｍｙ）を含むＤＮＡ断片を得、以下のプライマーセット５（ＰｐｙｒＧ＿Ｆ１とＰｐｙｒＧ＿Ｒ１）を用いてＰＣＲで増幅することにより、ｐｙｒＧマーカーを含むＤＮＡ断片を得た。増幅したそれぞれのＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて精製した。
下線はインフュージョン反応で隣り合うＤＮＡ断片と連結するための付加配列を示す。
　上記で得た５種のＤＮＡ断片と直鎖状ｐＵＣ１９（Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（クロンテック社）に付属されているｐＵＣ１９　ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ Ｖｅｃｔｏｒ）を、同キットを用いてインフュージョン反応で連結した。その後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られた形質転換大腸菌を液体培養してプラスミドＤＮＡを抽出することで、プラスミドｐＵＣ１９－ｋｕ７０を得た。プラスミドｐＵＣ１９－ｋｕ７０は、相同組換えのための領域７－ｋｕ７０－Ｔａｍｙ－ループアウトのための領域９－ｐｙｒＧマーカー－相同組換えのための領域８がｐＵＣ１９プラスミドのマルチクローニングサイトに挿入されている（図１５）。
　上記で得たプラスミドｐＵＣ１９－ｋｕ７０を鋳型とし、プライマーＰｋｕ７０－１５００Ｆ１（配列番号６６）とＰｋｕ７０＋１５００Ｒ１（配列番号６５）を用いてＰＣＲで増幅することによりｋｕ７０導入株構築用カセットを得た。ｋｕ７０導入株構築用カセットは、相同組換えのための領域７－ｋｕ７０－Ｔａｍｙ－ループアウトのための領域９－ｐｙｒＧマーカー－相同組換えのための領域８から成る（図１４）。該ＤＮＡ断片を用いてＲＴ＿ＩＳｃ８＿７＿Ｐ株をプロトプラストＰＥＧ法により形質転換することでＲＴ＿ＩＳｃ８＿７＿Ｐ＋ｋｕ７０株を取得した。なお、本株は、取得した形質転換株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーセット６（Ｐｋｕ－２０００Ｆ１とＰｋｕ＋２０００Ｒ１）を用いてＰＣＲで増幅することで５．６ｋｂｐのＤＮＡ断片が生じること、且つ、プライマーセット７（ＰｐｙｒＧ＿Ｆ１とＰｋｕ＋２０００Ｒ１）を用いてＰＣＲで増幅することで３．９ｋｂｐのＤＮＡ断片が生じることを確認することにより選抜した。
　次にＲＴ＿ＩＳｃ８＿７＿Ｐ＋ｋｕ７０株のｐｙｒＧマーカー除去を行った。
　ＲＴ＿ＩＳｃ８＿７＿Ｐ＋ｋｕ７０株の分生子を、３ｍｇ／ｍｌの５－ＦＯＡを含有する２０ｍＭウラシル添加Ｃｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ寒天培地に植菌して培養することにより、５－ＦＯＡ耐性株を取得した。得られた５－ＦＯＡ耐性株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーセット８（Ｐｔａｍｙ＿Ｆ１とＰｋｕ７０＋３０００Ｒ１）を用いたＰＣＲにより得られるＤＮＡ断片が２．３ｋｂｐであることからループアウトが完了していることを確認し、この株をＲＴ＿ＩＳｃ８＿７＿Ｐ＋ｋｕ７０＿Ｐ株とした。
（２）ＲＴ＿ＩＳｃ８＿７＿Ｐ＋ｋｕ７０＿Ｐ株へのＧＤＨ遺伝子の多コピー導入
　外来遺伝子として、特開２０１８－０６８２９２と同様にＭｕｃｏｒ属由来のグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）の遺伝子（配列番号７６）を用いることとし、特開２０１８－０６８２９２の実施例１で作製されたｐ１９－ＧＤＨ－ｐｙｒＧ３をＧＤＨ遺伝子多コピー導入用プラスミドとして用いた。このプラスミドはｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにＧＤＨ発現カセット（Ｐｔｅｆ－ＧＤＨ－Ｔａｌｐ）及びｐｙｒＧ３（プロモーター長が５６ｂｐであるｐｙｒＧマーカー：配列番号７５）が挿入されている（図１６）。
　ｐ１９－ＧＤＨ－ｐｙｒＧ３を用いて、特開２０１８－０６８２９２に記載のアスペルギルス・ソーヤのｐｙｒＧ遺伝子破壊株（ｐｙｒＧ遺伝子の上流４８ｂｐ、コード領域８９６ｂｐ、下流２４０ｂｐ欠損株）および上記で得たＲＴ＿ＩＳｃ８＿７＿Ｐ＋ｋｕ７０＿Ｐ株に対し、プロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行った。この際、ＲＴ＿ＩＳｃ８＿７＿Ｐ＋ｋｕ７０＿Ｐ株に対してのみ、ｐ１９－ＧＤＨ－ｐｙｒＧ３とともに終濃度２５０Ｕ／ｍＬのＩ－ＳｃｅＩを添加した。これによりアスペルギルス・ソーヤのｐｙｒＧ遺伝子破壊株宿主とした場合に３１株の形質転換株を取得し（Ａｓ－ｐｙｒＧ３群とする）、ＲＴ＿ＩＳｃ８＿７＿Ｐ＋ｋｕ７０＿Ｐ株を宿主とした場合に２１株の形質転換株を取得した（Ａｓ－ＲＴ＿ＩＳｃ８－ｐｙｒＧ３群とする）。
　取得した形質転換株をパインデックス培地（２％パインデックス＃２（松谷化学工業）、１％ハイポリペプトン（日本製薬）、０．５％酵母エキス、０．２５％リン酸２水素１カリウム、０．２５％リン酸１水素２カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム・７水和物、０．４％しょうゆ油）に植菌し、３０℃で４日間培養した。培養後の菌体をホモジナイザーにより均一化し、次いでマルチビーズショッカーにより破砕し、遠心分離後の上清を回収することで粗酵素液を調製した。この粗酵素液のＧＤＨ活性を下記の測定方法に従って測定し、培養液１ｍＬあたりのＧＤＨ活性を算出した。
＜ＧＤＨ活性測定方法＞
　１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） １．０２５ｍＬ、１Ｍ Ｄ－グルコース溶液 ０．３ｍＬおよび２ｍＭ ＤＣＩＰ溶液 ０．０７５ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温する。次いで、１５ｍＭ ＰＭＳ溶液 ０．０５ｍＬおよび酵素サンプル溶液０．０５ｍＬを添加し、反応を開始する。反応開始時、および経時的な吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を求め、次式に従いＧＤＨ活性を算出する。この際、ＧＤＨ活性は、３７℃において濃度２００ｍＭのＤ－グルコース存在下で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義する。
　なお、式中の１．５は反応試薬＋酵素試薬の液量（ｍＬ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／μｍｏｌ）、０．０５は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、ΔＡ６００ｂｌａｎｋは酵素の希釈に用いた緩衝液を酵素サンプル溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量を表す。
　取得した形質転換株の全てについて上記の方法で液体培養、粗酵素液の調製、ＧＤＨ活性測定行い、Ａｓ－ｐｙｒＧ３群及びＡｓ－ＲＴ＿ＩＳｃ８－ｐｙｒＧ３群におけるＧＤＨ遺伝子のコピー数と株数の割合を求めた。なお、ＧＤＨ遺伝子のコピー数は、特開２０１８－０６８２９２に記載の方法と同様にして、ＧＤＨが１コピー挿入された株に対する相対ＧＤＨ活性から算出した。結果を表２７に示した。
　５コピー以上、１０コピー以上、２０コピー以上のＧＤＨ活性を有する株の割合はいずれもＡｓ－ｐｙｒＧ３群よりもＡｓ－ＲＴ＿ＩＳｃ８－ｐｙｒＧ３群で高くなっており、この結果から、レトロトランスポゾンにＩ－ＳｃｅＩの認識サイトを導入し、形質転換時にＩ－ＳｃｅＩを添加して切断することで、ＧＤＨ遺伝子を効率よく多コピーで挿入できることがわかった。
　以上より、レトロトランスポゾンにＩ－ＳｃｅＩの認識サイトを導入し、形質転換時にＩ－ＳｃｅＩを添加して切断する方法は任意の遺伝子を多コピー挿入するための方法としても有効であることがわかった。

Claims (13)

  1. 　ゲノムに存在する、２コピー以上で存在する動く遺伝因子の塩基配列に、ヌクレアーゼ認識配列がそれぞれ導入された糸状菌。
  2. 　前記動く遺伝因子が、レトロトランスポゾン又はトランスポゾンである、請求項１に記載の糸状菌。
  3. 　前記動く遺伝因子が、４５０ｂｐ～１００００ｂｐ以上である、請求項１に記載の糸状菌。
  4. 　前記動く遺伝因子の塩基配列が、同一又は異なる染色体上に存在する、請求項１に記載の糸状菌。
  5. 　前記ヌクレアーゼ認識配列が、糸状菌ゲノム内に含まれない配列である、請求項１に記載の糸状菌。
  6. 　前記ヌクレアーゼ認識配列が１３ｂｐ～４０ｂｐである、請求項５に記載の糸状菌。
  7. 　前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼである、請求項１に記載の糸状菌。
  8. 　前記エンドヌクレアーゼが、メガエンドヌクレアーゼである、請求項７に記載の糸状菌。
  9. 　ゲノムに存在する、２コピー以上で存在するレトロトランスポゾンの塩基配列にそれぞれメガエンドヌクレアーゼ認識配列が導入された糸状菌。
  10. 　ゲノムに存在する、２コピー以上で存在する動く遺伝因子の塩基配列にそれぞれ導入遺伝子が導入された糸状菌。
  11. 　糸状菌のゲノム領域の２以上の位置に遺伝子が導入された糸状菌を製造するための方法であって、
    　請求項１～９のいずれか一項に記載の糸状菌に、導入遺伝子と、相同組換え用の上流及び下流配列とを含む発現カセットと、
    　前記ヌクレアーゼ認識配列を認識して切断するヌクレアーゼと
    　を導入することを含み、ここで相同組換え用の上流及び下流配列が、動く遺伝因子の塩基配列の一部とそれぞれ相同である、前記方法。
  12. 　前記導入遺伝子が、発現カセット内において、プロモーター及びターミネーターと作動可能に連結されている、請求項１１に記載の方法。
  13. 　請求項１～９いずれか一項に記載の糸状菌と、相同組換え用の上流及び下流配列とを含む発現カセットを含む核酸とを含み、
    前記相同組換え用の上流及び下流配列が、動く遺伝因子の塩基配列の一部とそれぞれ相同である、遺伝子発現キット。
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