WO2023222986A1 - Procédé de préparation de glycolipides, glycolipides et leurs utilisations - Google Patents
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- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
Definitions
- the present invention relates to the field of enzymatic preparation of glycolipids.
- the present invention also relates to glycolipids and their uses.
- Glycolipids are compounds comprising a sugar part and a lipid part. Glycolipids can be of natural or biosynthetic origin. Glycolipids have a certain attractiveness due to their amphiphilic character and their solubility properties.
- Natural glycolipids are mainly sophorolipids, made up of a sophorose entity (0-1,2-linked glucose disaccharide) and a C16 or C18 fatty acid chain with unsaturation. Another category of natural glycolipids is represented by those of rhamnolipids consisting of one or two rhamnosyl units linked to a fatty tail of 3-(hydroxyalkanoyloxy)-alkanoic acid (mainly C10 fatty acids).
- Synthetic glycolipids are mainly carbohydrate esters (glucose, sucrose, maltose) also called sucroesters, in which the sugar part and the lipid part are linked by an ester bond, or else alkyl-(poly-)glucosides also called polyglucosides. alkyl, in which the sugar part and the lipid part are connected by an ether bond.
- glycolipids are classically synthesized via chemical pathways.
- the most common procedures for synthesizing alkyl-(poly-)glycosides include the Fischer method, the Koenig-Knorr method, or the Schmidt method.
- Fischer's method is the most widely used in industry. It allows the production of short-chain alkyl-polyglucosides in a single step.
- the carbohydrate is solubilized in an excess of alcohol in the presence of an acid catalyst (sulfonic acid, hydrochloric acid) and at elevated temperature (von Rybinski and Hill, Angew. Chem. Int. Ed. 37, 1328-1345, 1998) .
- Obtaining APGs of larger sizes requires an additional step in which a small alkyl (generally butyl) is exchanged with an alcohol of higher degree, thus making it possible to circumvent the problems of solubility of the reagents. This synthesis method is efficient but the acid catalysts are difficult to recycle.
- glycolipids of the alkyl-polyglucoside type therefore involves a multitude of reaction steps including carbohydrate protection/deprotection steps; the use of acidic, alkaline or metallic catalysts and large quantities of solvents to be recycled; risks of side reactions due to the reactivity of the catalysts and the drastic synthesis conditions; the formation of both anomers in glycosylation products which are difficult to separate.
- the biosynthesis of ether-linked glycolipids is possible enzymatically.
- the enzymes most studied in this regard are those of the p-glycosidases family.
- the latter are enzymes without co-factors which naturally hydrolyze saccharide bonds present in polysaccharides to produce mono- or oligosaccharides.
- these enzymes are capable of using a glycosylated donor and catalyzing the transfer of the glycosylated onto a free hydroxyl of an acceptor molecule and thus catalyzing the formation of an ether bond between the acceptor molecule and the glycosylated residue.
- alkyl-polyglucosides catalyzed by p-glycosidases generally retains a p-configuration bond between the sugars and the alkyl part (P-alkyl-polyglucosides).
- the glycosylated donors are polysaccharides or carbohydrates such as starch, cellulose, sucrose or glucose.
- the thermodynamic equilibrium is rather favorable to hydrolysis, the production yields of alkyl-polyglucosides are therefore generally very modest.
- several teams working on almond p-glucosidase have obtained production yields lower than 62% with short chain alcohols (ie methylglucoside/xyloside or ethylglucoside/xyloside).
- the yields with longer chain alcohols are even lower and between 1 and 13% (Drouet et al., Biotechnol. Bioeng. 43, 1075-1080, 1994; Vie et al., Enzyme Microb. Technol. 20, 597-603, 1997; Yan and Liau, Biotechnol. Lett. 20, 653-657, 1998).
- Bousquet et al. showed the possibility of obtaining a-alkyl-polyglucosides using a-transglucosidase from Aspergillus niger (Bousquet et al., Bucke, C. (Ed.), Carbohydrate Biotechnology Protocols. Humana Press, Totowa, NJ, 291-296, 1999) or Talaromyces dupont! (Bousquet et al., Enzyme Microb. Technol. 23, 83-90, 1998).
- a-butyl-glucoside was obtained by transfer reaction of glucosyl units from maltodextrins onto butanol in a biphasic medium.
- Dahiya and co-workers successfully produced 1-O-alkylyl-a-D-mono, di- and tri-glucopyranosides (a-alkyl-polyglycosides) from hexanol or octanol and sucrose using a strain of Microbacterium paraoxydans presenting an amylosucrase type membrane transglycosylation activity with a maximum yield of 14.8% (Dahiya et al., Biotechnol. Lett. 37, 1431-1437, 2015).
- Glucan Succharases of families 13 and 70 of Glycoside Hydrolases (GH13 and GH70) have been used in acceptor reactions with the aim of elongating the carbohydrate moiety of alkyl monoglucosides with a short alkyl group (1 to 8 carbon atoms) from sucrose.
- GH70 GSs have also been used in direct glucosylation reactions of alcohols. Indeed, Seibel and collaborator showed the capacity of dextran saccharase from Streptococcus oralis GTFR to glucosylate alcohols ranging from (chloro-) methanol to (4-chloro)-1-butanol (Seibel et al., ChemBioChem 7, 310- 320, 2006). Furthermore, Kim and colleagues have shown, during glucosylation tests of short alcohols of 1 to 4 atoms of carbon, a preference of the dextran saccharase of L.
- mesenteroides B-1299CB for primary alcohols compared to secondary alcohols, the tertiary alcohols not having been able to be converted (Kim et al., Biotechnol. Lett. 31, 1433-1438 , 2009).
- glycolipids having new particular molecular architectures in particular glycolipids with a bolaamphiphilic structure, which are likely to find applications in fields such as pharmacy, cosmetics, fine chemicals, biocontrol, phytosanitary, depollution and even the agri-food industry.
- the enzymes are grouped according to their specificity of saccharide binding on dextrans ie a-1,2 for BRS-A, BRS-D A1, GBD-CD2 AN123 or a-1,3 for BRS-B A1, BRS-C , BRS-E A1 ).
- AHUD 11-hydroxy-undecanoic acid
- the enzymes are grouped according to their specificity of saccharide bond synthesis on dextrans i.e. a-1,2 for BRS-A, BRS-D A1, GBD-CD2 AN123 or a-1,3 for BRS-B A1, BRS -C, BRS-E A1.
- AEA erythro-aleuritic acid
- FIG. 10 represents a chromatogram of the glucosylation products of 11-[(2-hydroxy-ethyl) sulfanyl)]-undecanoic acid (AHESll) obtained with the BRS-A enzyme after elimination of free sugars by chromatography on Purasorb PAD910 resin .
- FIG. 11 represents a chromatogram of the glucosylation products of 11-hydroxyundecanoic acid (AHIID) after elimination of free sugars by flash chromatography and mass spectrometry analysis of the purified products corresponding to peaks 1 and 2 (glucosylation products no. 1 and No. 2).
- AHIID 11-hydroxyundecanoic acid
- FIG. 12 represents a chromatogram of the glucosylation products of erythro-aleuritic acid (EAA) after pre-purification (elimination of free sugars) by flash chromatography and mass spectrometry analysis of the purified products.
- EAA erythro-aleuritic acid
- FIG.13A] [Fig. 13B] [Fig.13C] represent the glucosylation profile of 12-hydroxydodecanoic acid (AHDD) ([Fig.13A]), 15-hydroxypentadecanoic acid (AHPD) ([Fig. 13B]) and l 16-hydroxy-hexadecanoic acid (AHHD) ([Fig. 13C]) by the branching enzymes BRS-A, BRS-B A1, BRS-C, BRS-D A1, BRS-E A1 and GBD-CD2 AN123.
- AHDD 12-hydroxydodecanoic acid
- AHPD 15-hydroxypentadecanoic acid
- AHHD l 16-hydroxy-hexadecanoic acid
- ADHO dihydroxyoctanoic acid
- HEO trihydroxyoctadecanoic acid
- the enzymes are grouped according to their specificity of saccharide bond synthesis on dextrans ie a-1,2 for BRS-A, BRS-D A1, GBD-CD2 AN123 or a-1,3 for BRS-B A1, BRS -C, BRS-E A1.
- FIG. 15 illustrates the characterization at OJ of emulsions consisting of an aqueous solution of 2% Glc-AHESU and 20% by weight of dodecane, at the different pHs studied.
- the D(4.3) represents the volume average diameter and P the polydispersity.
- FIG. 16 illustrates the stability monitoring over 14 days of emulsions whose aqueous phase includes 2% by weight of Glc-AHESU (O/W 20/80). The size of the drops is determined by particle size and confirmed by optical microscopy.
- FIG.18 illustrates the characterization on D0 of the emulsions consisting of an aqueous solution of 2% Glc-AHUD and 20% by weight of dodecane, at the different pHs studied.
- the D(4.3) represents the volume average diameter and P the polydispersity.
- FIG. 19 Monitoring the stability over several weeks of emulsions containing 2% surfactant (O/W 20/80). The size of the drops is determined by particle size and confirmed by optical microscopy.
- FIG. 20 illustrates the destabilization of the emulsion (2% GAH in water/Dodecane 80/20).
- GAH glucosylated form of AHED
- FIG. 21 represents the influence of the hydrophobicity of the support, the nature of the oil, evaporation, the size and concentration of the drops on the intensity of the phenomena observed during the deposition of a drop of emulsion on a solid support.
- FIG. 22 shows the macroscopic appearance of the primary emulsion (a), the macroscopic appearance of the dry emulsion (powder) (b), the microscopic observation of the emulsion before drying (c), the microscopic observation of the emulsion after drying and redispersion in water (d); measuring the droplet size distribution before drying and after drying and redispersion in water (e).
- FIG. 23 represents the monitoring of cultures of E. coli K12 (OD 600 nm) in the presence of concentrations of 0% w/v (O), 0.5% w/v ( ⁇ ), 1% w/v (A), 2% w/v (X) and 2.5% w/v (*) of glucosylation products (A) of AHUD and AEA (B) in aqueous phase.
- An aim of the present invention is to overcome the drawbacks of the prior art and to provide a process for preparing a glycolipid of formula (I) by enzymatic catalysis.
- a-transglucosylases are capable of glucosylating hydroxylated fatty acids.
- An advantage of the process according to the invention is that it uses renewable and inexpensive substrates, namely sucrose or one of its analogues and biosourced hydroxylated fatty acids.
- the process also has the advantage that it makes it possible to obtain glycolipids having a bolaamphiphilic type structure (i.e. made up of two polar parts separated by a hydrophobic part) which suggests interesting surfactant and biological properties.
- the glycolipids according to the invention are, however, distinguished from sophorolipids in that their saccharide unit can comprise a single glucosyl unit or several glucosyl units connected by a-bonds whose nature can be modulated (a-1, 2 and/or a- 1,3 and/or a-1,4 and/or a-1,6) depending on the a-transglucosylase used.
- the process according to the invention makes it possible to prepare bolaamphiphilic glycolipids whose hydrophobic part comprises a carbon chain of large size, typically greater than 8 carbon atoms, which can be interrupted by at least one sulfanyl group, and substituted for example by at least one hydroxyl group.
- the process according to the invention therefore makes it possible to obtain a great diversity of glycolipids in terms of the size of their hydrophobic part and the structure of their glucosidic part.
- This diversity is very advantageous for producing new glycolipids of interest useful in fields such as pharmacy, cosmetics, fine chemicals, biocontrol, phytosanitary, depollution or even the agri-food industry.
- Another aim according to the invention is to provide glycolipids, in particular bolaamphiphilic glycolipids of a wide diversity of molecular architecture, and which can be useful as a surfactant or an antimicrobial agent, in particular an antibacterial agent.
- an object according to the invention relates to a process for preparing at least one glycolipid corresponding to formula (I):
- [Glc] n represents a linear or branched saccharide unit comprising n glucosyl units, with n between 1 and 7, with the condition that when the saccharide unit comprises several glucosyl units these are linked together by type a saccharide bonds ;
- R represents a fatty acid radical comprising between 4 and 24 carbon atoms, the carbon chain of which is linear or branched, saturated or unsaturated, optionally interrupted by one or more sulfur atoms, optionally still being able to comprise one or more chosen substituent(s) (s) from the hydroxyl group, the carbonyl group, the methoxyl group, the amine group, the nitrosyl group, and the thiol group,
- R is a fatty acid radical as defined in formula (I),
- -yOH represents a hydroxyl group attached to a Cy carbon atom as defined above; said step comprising bringing the hydroxylated fatty acid of formula (II) into contact with at least one a-transglucosylase of the GH70 family in the presence of sucrose or a sucrose analogue.
- Another object according to the invention relates to a glycolipid corresponding to formula (I): [Glc] n -xOy-R (I) in which
- [Glc] n represents a linear or branched saccharide unit comprising n glucosyl units, with n between 1 and 7, with the condition that when the saccharide unit comprises several glucosyl units these are linked together by type a saccharide bonds ;
- R represents a fatty acid radical comprising between 4 and 24 carbon atoms, the carbon chain of which is linear or branched, saturated or unsaturated, optionally interrupted by one or more sulfur atoms, optionally still being able to comprise one or more chosen substituent(s) (s) from the hydroxyl group, the carbonyl group, the methoxyl group, the amine group, the nitrosyl group, and the thiol group,
- -xOy- symbolizes the attachment of the fatty acid radical to the saccharide unit by an ether bond connecting a Cx carbon atom of a glucosyl residue of the saccharide unit, previously carrying a hydroxyl group, to a Cy carbon atom of the fatty acid radical, previously carrying a hydroxyl group, with Cx the position of the atom of the glucosyl residue on which the bond takes place, Cx representing the C1 carbon atom of the glucosyl residue, Cy being a carbon atom positioned along the carbon chain of the fatty acid radical or at the omega end thereof.
- Another object according to the invention concerns the use of a glycolipid according to the invention, as a surfactant. Another object according to the invention concerns the use of a glycolipid according to the invention as defined above, as an antimicrobial agent.
- Another object according to the invention relates to an oil-in-water emulsion comprising an oily phase dispersed in an aqueous phase and at least one glycolipid of formula (I) according to the invention, characterized in that the emulsion is kinetically stable when the pH of the aqueous phase is greater than a threshold hydrogen potential pH s advantageously between 2 and 5.
- Another subject concerns the use of an emulsion according to the invention for cleaning surfaces.
- glycolipid of formula (I) can be used interchangeably.
- glycolipid and “glucolipid” may be used interchangeably.
- hydroxylated fatty acid of formula (II) hydroxylated fatty acid
- hydroxylated fatty acid according to the invention can be used interchangeably.
- saccharide unit designates a linear or branched polymer consisting of glucosyl units linked together by saccharide bonds.
- the terms “osidic bond” or “glucosidic bond” can be used interchangeably and designate a covalent bond which links a glucosyl to another adjacent glucosyl within the saccharide unit.
- the [Glc] n saccharide motif corresponds to the n glucosyl units grafted during the glucosylation step at the Cy carbon of the hydroxylated fatty acid according to the invention by the a-transglucosylase of the GH70 family.
- n represents the number of glucosyl units in the [Glc] n saccharide unit of the glycolipid according to the invention, n is advantageously between 1 and 7, preferably between 1 and 4. Preferably, n is equal to 1 or 2.
- the glycolipid according to the invention is a glycolipid whose saccharide unit comprises several glucosyl units.
- the glycolipid according to the invention is such that n is between 2 and 7, preferably between 2 and 4.
- the expression “a bond” designates a covalent bond which binds the C1 carbon atom of a glucosyl unit in its a configuration
- the expression “0 bond” designates a covalent bond that binds the C1 carbon atom of a glucosyl unit in its 0 configuration.
- the saccharide unit comprises several glucosyl units, these are linked together by an ⁇ saccharide bond.
- the choice of the a-transglucosylase type of the GH70 family makes it possible to modulate the type of bond within the saccharide motif.
- the saccharide bond(s) within the saccharide unit are advantageously chosen from an a-1,2 saccharide bond, an a-1,3 bond, an a-1,4 bond or a bond a-1,6, or a mixture thereof; preferably also chosen from an a-1,2 bond, an a-1,3 bond, an a-1,4 bond, an a-1,6 bond or a mixture of these.
- the term "a-1,3 bond” designates the covalent ether bond which links the C1 carbon atom of a glucosyl unit formerly carrying the hemi-acetal function in its a configuration and the hydroxyl carried by carbon 03 of another adjacent glucosyl unit.
- the term “a-1,2 bond” designates the covalent ether bond which binds the carbon atom 01 of a glucosyl unit formerly carrying the hemi-function. acetal in its a configuration and the hydroxyl carried by the C2 carbon of another adjacent glucosyl unit.
- the term "a-1,4 bond” designates the covalent ether bond which links the C1 carbon atom of a glucosyl unit formerly carrying the hemi-acetal function in its a configuration and the hydroxyl carried by the C4 carbon of another adjacent glucosyl unit.
- the term "a-1,6 bond” designates the covalent ether bond which links the C1 carbon atom of a glucosyl unit formerly carrying the hemi-acetal function in its a configuration and the hydroxyl carried by the C6 carbon of another adjacent glucosyl unit.
- the ⁇ -glucosyl units are preferably ⁇ -D-glucosyl units.
- saccharide bonds can be carried out by methods known to those skilled in the art.
- the osidic bonds within the osidic motif can be analyzed by nuclear magnetic resonance (NMR) or mass spectrometry (MS).
- NMR nuclear magnetic resonance
- MS mass spectrometry
- -xOy- symbolizes the attachment of the fatty acid radical to the saccharide unit by an ether bond connecting a Cx carbon atom of a glucosyl residue of the saccharide unit, previously carrying a hemiacetal group, to a Cy carbon atom of the fatty acid radical, previously carrying a hydroxyl group, with Cx the position of the atom of the glucosyl residue on which the bond takes place, Cx representing the C1 carbon atom of the glucosyl residue, Cy being a carbon atom positioned along the carbon chain of the fatty acid radical or at the omega end thereof.
- the position of the carbon atoms of a glucosyl unit is numbered so that the C1 carbon atom of a glucosyl unit is the carbon atom which carries the aldehyde -CHO function under the open form of this glucosyl unit.
- the position of the carbon atoms of the fatty acid radical is numbered so that C'1 represents the carbon atom of the carboxylic acid function of the fatty acid radical.
- the omega end of the fatty acid radical is the end terminated by a carbon called omega carbon whose position is opposite to the carbon carrying the carboxylic acid group of the fatty acid radical.
- the glucosyl unit adjacent to the fatty acid radical is advantageously linked to the fatty acid radical by an ⁇ bond.
- the glucosyl unit adjacent to the fatty acid radical is preferably in the a configuration.
- the analysis of the bond between the saccharide motif and the fatty acid radical can be carried out using any method known to those skilled in the art, for example by nuclear magnetic resonance (NMR).
- NMR nuclear magnetic resonance
- the fatty acid radical comprises at least 6, 7, 8, 9, 10, or 11 carbon atoms.
- the fatty acid radical comprises at most 24 carbon atoms.
- the fatty acid radical comprises between 6 and 24 carbon atoms, between 7 and 24 carbon atoms, between 8 and 24 carbon atoms, between 9 and 24 carbon atoms, between 10 and 24 carbon atoms, preferably between 11 and 24 carbon atoms, preferably between 11 and 20 carbon atoms.
- the radical R can be represented by the following general formula: in which o the wavy line* ⁇ represents the point of attachment to -xOy- o C y is as defined above and o R a represents H or a carbon chain comprising between 1 and 22 carbon atoms, said chain being linear or branched, saturated or unsaturated, optionally interrupted by one or more sulfur atoms, optionally still being able to comprise one or more substituent(s) chosen from the hydroxyl group, the carbonyl group, the methoxyl group, the amine group, the nitrosyl group, and the thiol group, o R b represents a carbon chain comprising between 1 and 22 carbon atoms, said chain being linear or branched, saturated or unsaturated, optionally interrupted by one or more sulfur atoms, optionally still being able to comprise one or more substituent(s) chosen from the hydroxyl group, the carbonyl group, the methoxyl group, the amine group, the nitrosy
- R a represents H (case where Cy is the carbon at the omega end of the fatty acid radical) or a linear carbon chain, optionally interrupted by one or more sulfur atoms, optionally still being able to comprise one or more substituent(s). ) chosen from the hydroxyl group, the carbonyl group, the methoxyl group, the amine group, the nitrosyl group, and the thiol group (case where Cy is a carbon positioned along the carbon chain of the fatty acid radical) and R b represents a linear carbon chain, optionally interrupted by one or more sulfur atoms, optionally still being able to comprise one or more substituent(s) chosen from the hydroxyl group, the carbonyl group, the methoxyl group, the amine group, the nitrosyl group, and the thiol group.
- the carbon chain of the fatty acid radical is linear, that is to say that Cy is the carbon at the omega end of the fatty acid radical.
- R a represents H and R b represents a linear carbon chain comprising between 2 and 22 carbon atoms and preferably between 4 and 22 carbon atoms, optionally interrupted by one or more sulfur atoms, optionally still being able to comprise one or more substituent(s) chosen from the hydroxyl group, the carbonyl group, the methoxyl group, the amine group, the nitrosyl group, and the thiol group.
- the fatty acid radical comprises an amine substituent (NH or NH2 group)
- this amine group is not located in position a relative to the carboxyl function.
- the possible substituent(s) of the carbon chain is(are) chosen from the hydroxyl group, the carbonyl group, the methoxyl group or the thiol group, more preferably from the hydroxyl or thiol group.
- the carbon chain (or radical) R optionally comprises at most three hydroxyl groups, preferably at most three substituents chosen from the hydroxyl group, the carbonyl group, the methoxyl group, the amine group, the nitrosyl group, and the thiol group, preferably chosen from the hydroxyl group, the carbonyl group, the methoxyl group, and the thiol group, preferably at most three substituents.
- said carbon chain comprises at most one hydroxyl group, preferably at most one substituent chosen from the hydroxyl group, the carbonyl group, methoxyl group, and thiol group, preferably at most one substituent;
- said carbon chain comprises between 12 and 16 carbon atoms, said carbon chain comprises at most two hydroxyl groups, preferably at most two substituents chosen from the hydroxyl group, the carbonyl group, the methoxyl group, and the thiol group, preferably at most two substituents;
- when the carbon chain comprises between 17 and 24 carbon atoms said carbon chain comprises at most three hydroxyl groups, preferably at most three substituents chosen from the hydroxyl group, the carbonyl group, the methoxyl group, and the thiol group, preferably at plus three substituents.
- the radical R can be represented by the following general formula: in which the wavy line , Cy, R a and R b are as defined above (any of the embodiments described above); and ii) R a and R b together optionally comprise at most three hydroxyl groups (in other words, at most three hydroxyl groups are distributed over R a and Rb), preferably at most three substituents chosen from the hydroxyl group , the carbonyl group, the methoxyl group, the amine group, the nitrosyl group, and the group thiol, preferably chosen from the hydroxyl group, the carbonyl group, the methoxyl group, and the thiol group, preferably at most three substituents; and iii) when R a or R b comprises an amine substituent (NH or NH2 group), this amine group is not located in position a relative to the carboxyl function.
- R a or R b comprises an amine substituent (NH or NH2 group), this amine group is
- characteristic ii) is preferably such that: o when R a and R b together comprise between 2 and 9 carbon atoms (preferably between 4 and 9 carbon atoms), R a and R b together comprise at most one hydroxyl group, preferably at most one substituent chosen from the hydroxyl group, the carbonyl group, the methoxyl group, and the thiol group, preferably at most one substituent; o when R a and R b together comprise between 10 and 14 carbon atoms, R a and R b between them comprise at most two hydroxyl groups, preferably at most two substituents chosen from the hydroxyl group, the carbonyl group, the methoxyl group, and the thiol group, preferably at most two substituents; o when R a and R b between them comprise between 15 and 22 carbon atoms R a and R b between them comprise at most three hydroxyl groups, preferably at most three substituents chosen from the hydroxyl group, the carbonyl group,
- the process according to the invention allows the preparation of a mixture of glycolipids according to the invention.
- the mixture contains glycolipids according to the invention which differ only in the number of glucosyl units of their saccharide unit and possibly in the nature of the saccharide bond.
- the mixture essentially consists of glycolipids in which n is between 1 and 7, preferably n is between 1 and 4, preferably in which n is equal to 1, 2 or 3, more preferably in which n is equal to 1 or 2.
- the mixture of glycolipids according to the invention comprises from 70% to 100%, preferably from 90% to 100% by weight of glycolipids according to the invention in which n is between 1 and 7, preferably n is between 1 and 4, preferably in which n is equal to 1, 2 or 3, more preferably in which n is equal to 1 or 2, in % by weight relative to the total weight of glycolipids of the mixture.
- R is a fatty acid radical as defined in formula (I),
- -yOH- represents a hydroxyl group attached to a Cy carbon atom as defined above.
- the process can in particular be implemented with three categories of hydroxylated fatty acids.
- the process according to the invention is carried out with a sulfanylated hydroxy fatty acid.
- hydroxylated fatty acid advantageously corresponds to the formula (HA):
- the hydroxylated fatty acid of formula (HB) is for example 11-[(2-hydroxyethyl)sulfanyl]-undecanoic acid OH-(CH 2 ) 2 -S-(CH 2 )IO-COOH.
- the process according to the invention is carried out with a fatty acid hydroxylated in the omega position.
- the hydroxylated fatty acid corresponds to the formula (I IB):
- a is between 11 and 15.
- the hydroxylated fatty acid of formula (IIB) is for example 11-hydroxy-undecanoic acid OH-(CH 2 )IO-COOH.
- the process according to the invention is carried out with a poly-hydroxy fatty acid, preferably chosen from a di-hydroxy fatty acid and a tri-hydroxy fatty acid.
- the di-hydroxy fatty acid is: a di-hydroxy fatty acid whose carbon chain is substituted by two hydroxyl groups positioned along the carbon chain, for example 9, 10-dihydroxy-octadecanoic acid, or a di-hydroxy fatty acid whose carbon chain is substituted by a hydroxyl group positioned along the chain and by a hydroxyl group positioned at the omega end thereof.
- the tri-hydroxy fatty acid is: a tri-hydroxy fatty acid whose carbon chain is substituted by two hydroxyl groups positioned along the carbon chain and by a hydroxyl group in the omega position thereof, for example l erythro-aleuritic acid, or a tri-hydroxy fatty acid whose carbon chain is substituted by three groups positioned along the carbon chain, for example 9, 10, 12-trihydroxy-octadecanoic acid or 9, 10,12-trihydroxystearic.
- g-transglucosylase a tri-hydroxy fatty acid whose carbon chain is substituted by two hydroxyl groups positioned along the carbon chain and by a hydroxyl group in the omega position thereof, for example l erythro-aleuritic acid, or a tri-hydroxy fatty acid whose carbon chain is substituted by three groups positioned along the carbon chain, for example 9, 10, 12-trihydroxy-octadecanoic acid or 9, 10,12-trihydroxystearic.
- the inventors have, for the first time, shown that a-transglucosylases of the GH70 family are capable of catalyzing the glucosylation of hydroxylated fatty acids from sucrose.
- the inventors have further shown that, unexpectedly, this glucosylation is particularly effective when the a-transglucosylases of the GH70 family used are branching saccharases of the GH70 family.
- a-transglucosylase designates an enzyme capable of polymerizing glucosyl units along ⁇ -linkages, by catalyzing the transfer of a glucosyl unit from a glucosyl donor sugar to a hydroxylated acceptor compound.
- the expression "of the GH70 family", relating to a-transglucosylase, means that the a-transglucosylase according to the invention belongs to family 70 of glycosidehydrolases according to the Q Z classification (www.cazy. org).
- CAZy from the English “Carbohydrate-Active enZYmes” (abbreviated "CKZ ⁇ /"), is a bioinformatics database for the classification of enzymes active on sugars i.e. capable of catalyzing their dissociation or their synthesis according to sequence homologies or of structure, in particular of their catalytic and carbohydrate-binding modules.
- the group of glycoside hydrolases (GH) includes 173 families composed of enzymes active on sugars capable of catalyzing hydrolysis reactions of glycosidic bonds or transglucosylation.
- the a-transglucosylases of the GH70 family are typically produced naturally by lactic acid bacteria of the genera Streptococcus, Leuconostoc (abbreviated “L.”), Weisella, Oenococcus or Lactobacillus (abbreviated “Lb.”).
- the a-transglucosylases of the GH70 family according to the invention are active on sucrose, which means that the a-transglucosylases according to the invention specifically use sucrose or one of its analogues as a glucosyl donor.
- sucrose analogs are compounds of formula (I): X-a-D-glucopyranosyl (I) in which -p-D-fructofuranosyl-(2->1) and a-L-sorbofuranoside.
- the LG group represents a chemical group which can be easily displaced by a nucleophile during a nucleophilic substitution reaction, the nucleophile being more particularly a group originating from the a-transglucosylase of the GH70 family.
- a leaving group may more particularly be a halogen atom such as a chlorine, bromine or fluorine atom, a tosylate group (-OS(O)2-(p-Me-CeH4)), or a group optionally substituted aromatic, in particular an -O-C6H5-NO2 group
- an “aromatic” group means an aryl or heteroaryl group optionally substituted, preferably by 1 to 2 substituents, in particular chosen from a nitro group (-NO2), a halogen, an alkyl group in C1-C4 or an optionally substituted aryl.
- aryl is meant, for the purposes of the present invention, an aromatic hydrocarbon group, preferably comprising from 6 to 14 carbon atoms, and comprising one or more attached rings, for example a phenyl or naphthyl group.
- aryl is meant, for the purposes of the present invention, an aromatic hydrocarbon group, preferably comprising from 6 to 14 carbon atoms, and comprising one or more attached rings, for example a phenyl or naphthyl group.
- it is phenyl.
- heteroaryl or “heteroaromatic” is meant, within the meaning of the present invention, an aromatic group comprising 5 to 14 cyclic atoms including one or more heteroatoms, advantageously 1 to 4 and even more advantageously 1 or 2, such as for example nitrogen or oxygen atoms, the other cyclic atoms being carbon atoms.
- heteroaryl groups are indyl, umbelliferyl or resorufin.
- halogen is meant, within the meaning of the present invention, the atoms of fluorine, chlorine, bromine and iodine. Preferably, it is a chlorine or fluorine atom.
- (C1-C4) alkyl” group is meant, for the purposes of the present invention, a saturated monovalent hydrocarbon chain, linear or branched, comprising 1 to 4 carbon atoms, and preferably methyl.
- An aryl is preferentially substituted by one or two substituents preferably chosen from a nitro group (-NO2), a halogen, a C1-C4 alkyl group and/or a -C(O)-heteroaryl group, such as a group 2-acyl-N-methylpyrrole.
- substituents preferably chosen from a nitro group (-NO2), a halogen, a C1-C4 alkyl group and/or a -C(O)-heteroaryl group, such as a group 2-acyl-N-methylpyrrole.
- sucrose analogs can in particular be chosen from the group comprising a-D-glucopyranosyl fluoride (in English "a-D-glucopyranosyl fluoride”), O-p-D-galactopyranosyl-(1 ->-4)-p-D-fructofuranosyl- (2->1)-a-D-glucopyranoside (in English “Lactulosucrose”), p-nitrophenyl a-D-glucopyranoside, a-D-glucopyranosyl a-L-sorbofuranoside, 4-Methylumbelliferyl a-D-glucosaminide (or 4-methylumbelliferyl 2-Amino- 2-deoxy-a-D-glucopyranoside, CAS no.
- a-D-glucopyranosyl fluoride in English "a-D-glucopyranosyl fluoride”
- sucrose analogs may in particular be chosen from the group comprising a-D-glucopyranosyl fluoride (in English “a-D-glucopyranosyl fluoride”), O-p-D-galactopyranosyl-(1 ⁇ 4)-p-D-fructofuranosyl-(2— >1)-a-D-glucopyranoside (in English “Lactulosucrose”), p-nitrophenyl a-D-glucopyranoside, a-D-glucopyranosyl a-L-sorbofuranoside and their mixtures.
- a-D-glucopyranosyl fluoride in English “a-D-glucopyranosyl fluoride”
- O-p-D-galactopyranosyl-(1 ⁇ 4)-p-D-fructofuranosyl-(2— >1)-a-D-glucopyranoside in English “Lactulosucrose”
- Sucrose is preferred because this substrate is biosourced and inexpensive.
- the a-transglucosylase of the GH70 family is a branching saccharase of the GH70 family, a glucan-sucrase of the GH70 family, or a mixture of these.
- branching sucrase of the GH70 family in English “branching sucrase”, sometimes abbreviated BRS
- a-transglucosylase of the GH70 family with branching activity or “branching enzyme of the family GH70” are used interchangeably and refer to an a-transglucosylase of the GH70 family capable of catalyzing the addition of glucosyl units in the main chain of a pre-existing dextran type glucan forming branches (or in other words branches ).
- connections a-1,2; a-1,3; a-1,4 or a- 1, 6) and the length of the chains of glucosyl units constituting the branches vary depending on the specificity of the branching saccharase considered.
- the branching saccharase of the GH70 family has as its amino acid sequence a sequence chosen from the group comprising GBD-CD2 AN123 (SEQ ID NO: 1), BRS-A (SEQ ID NO: 2), BRS- B A1 (SEQ ID NO: 3), BRS-C (SEQ ID NO: 4), BRS-D A1 (SEQ ID NO: 5), BRS-E A1 (SEQ ID NO: 6), or a sequence of amino acids having at least 70%, 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% sequence identity with at least minus one of the sequences SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6.
- the branching saccharase of the GH70 family is a mutant of GBD-CD2AN123 (SEQ ID NO: 1) having an amino acid sequence chosen from GBD-CD2 AN123 W2135L F2136L (SEQ ID NO: 7), GBD -CD2 AN123 W2135L (SEQ ID NO: 8), GBD-CD2 AN123 W2135I F2136Y (SEQ ID NO: 9), GBD-CD2 AN123 W2135I F2136C (SEQ ID NO: 10), GBD-CD2 AN123 W2135V (SEQ ID NO: 11), or an amino acid sequence having at least 70%, 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % sequence identity with at least one of the sequences SEQ ID NO:
- GS glucan-sucrase of the GH70 family
- GS refers to an a-transglucosylase of the GH70 family capable of catalyzing the synthesis of a-glucans, ie of polysaccharides composed exclusively of glucosyl units linked together by a-linkages.
- dextran-sucrases (sometimes abbreviated DSR), which synthesize dextrans, ie glucans whose main chain residues are mainly linked at a-1,6; reuteran-sucrases, which synthesize reuterans, ie glucans whose main chain residues are linked at a-1,4 and a1,6; mutane-sucroses, which synthesize mutanes, ie glucans whose main chain residues are mainly linked in a-1,3; alternan-sucrases, ie glucans whose main chain residues are linked alternately at a-1,3 and a-1,6.
- DSR dextran-sucrases
- the glucan-sucrase of the GH70 family has as its amino acid sequence a sequence chosen from the group comprising DSR-OK (SEQ ID NO: 12), DSR-M DP (SEQ ID NO: 13), DRS- S vardelA4N (SEQ ID NO: 14), ASR Cdelbis-Athio (SEQ ID NO: 15), GTF-SI (SEQ ID NO: 16), GTF-J (SEQ ID NO: 17), DSR-M A1 (SEQ ID NO: 18), or an amino acid sequence having at least 70%, 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99% sequence identity with at least one of the sequences SEQ ID NO: 12 to SEQ ID NO: 18.
- DSR-OK SEQ ID NO: 12
- DSR-M DP SEQ ID NO: 13
- DRS- S vardelA4N SEQ ID NO: 14
- sequence identity refers to the number (%) of matches (identical amino acid residues) to positions originating from an alignment of two polypeptide sequences. Sequence identity is determined by comparing sequences when aligned in a manner that maximizes overlap and identity while minimizing sequence interruptions. In particular, sequence identity can be determined using any of several global or local alignment algorithms, depending on the length of the two sequences. Sequences of similar lengths are preferably aligned using global alignment algorithms (eg Néedleman & Wunsch, J. Mol.
- Biol 48:443, 1970 which align sequences optimally over the entire length, while sequences of similar lengths of significantly different lengths are preferably aligned using a local alignment algorithm, for example the Smith and Waterman algorithm (Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981) or the AltschuI algorithm (Altschul et al (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Altschul et al (2005) FEBS J. 272:5101-5109).
- the alignment for the purpose of determining the percentage of amino acid sequence identity can be carried out by any method known to those skilled in the art, for example by using software available on Internet sites such as http: // blast. ncbi.nlm.
- step i) is carried out in solution at a controlled pH, in particular by the use of a buffer solution.
- step i) is carried out at a pH value of between 5 and 8.
- Step i) is advantageously carried out with an initial concentration of sucrose or a sucrose analogue of between 100 and 650 g.L'1 .
- Step i) is preferably carried out with a molar ratio of sucrose or sucrose analogue: hydroxylated fatty acid of formula (II) of between 1 and 100, preferably between 10 and 100.
- step i) is carried out at a temperature between 10°C and 80°C.
- step i) is carried out with an a-transglucosylase of the GH70 family in solution, suspension or immobilized.
- the process may also comprise a step ii) of purification of one or more glycolipid(s) of formula (I).
- a second object according to the invention relates to a glycolipid of formula (I) as defined in the first object according to the invention.
- glycolipids according to the invention have the advantage of being biodegradable.
- the glycolipid of the second object according to the invention is a glycolipid in which n is greater than or equal to 2, preferably between 2 and 7, more preferably between 2 and 4.
- the glycolipid of the second object according to the invention is a glycolipid in which the fatty acid radical comprises at least 6, 7, 8, 9, 10, or 11 carbon atoms.
- the fatty acid radical comprises between 10 and 24 carbon atoms, preferably between 11 and 24 carbon atoms, preferably between 11 and 20 carbon atoms.
- glycolipid comprising a sulfanylated carbon chain
- the glycolipid comprises a sulfanylated carbon chain.
- the glycolipid advantageously corresponds to formula (IA): [Glc] n -xOy-(CH 2 )bS-(CH 2 )a-COOH in which a is between 9 and 14 b is greater or equal to 2 the sum of a and b is less than 23.
- glycolipid of formula (IA) corresponds to the formula [Glc] n -xOy-(CH 2 ) 2 -S-(CH 2 )io-COOH
- Glycolipid comprising an alkyl type carbon chain
- the glycolipid of formula (I) comprises a carbon chain of the alkyl type, advantageously of the linear alkyl type.
- glycolipid of formula (I) advantageously corresponds to formula (IB):
- glycolipid of formula (IB) corresponds to the formula [Glc] n -xOy-(CH 2 )io-COOH.
- 3rd variant Glycolipid comprising a hydroxylated carbon chain
- the fatty acid radical is substituted by one or two hydroxyl groups.
- the glycolipid of formula (I) is preferably a glycolipid in which: the carbon atom Cy is a carbon atom positioned at the omega end, and the carbon chain of the fatty acid radical is substituted by one or two hydroxyl groups positioned along the carbon chain, or the carbon atom Cy is a carbon atom positioned along the carbon chain, and the carbon chain of the fatty acid radical is substituted by two hydroxyl groups, with one hydroxyl group positioned along the carbon chain and one hydroxyl group positioned in the omega position thereof, or with two hydroxyl groups positioned along the carbon chain.
- glycolipid as an antimicrobial agent
- glycolipid according to the invention has antimicrobial properties, in particular antibacterial properties.
- the invention therefore also relates to the use of the glycolipid as defined above as an antimicrobial agent, in particular as an antibacterial agent.
- the term “antimicrobial agent” designates a compound capable of destroying microbes (i.e. a microbiocidal agent) or slowing their growth (i.e. microbiostatic agent).
- microbe we mean viruses or unicellular or multicellular microorganisms.
- the glycolipid according to the invention can be used as a preservative agent which inhibits the development of microorganisms and makes it possible to increase the shelf life of products, in particular in the cosmetic, pharmaceutical, or food.
- glycolipid as a surfactant
- glycolipid according to the invention can also be used as a surfactant, in particular as an emulsifying agent.
- the invention therefore also relates to the use of the glycolipid as defined above as a surfactant, in particular as an emulsifying agent.
- a surfactant is a substance modifying the surface tension between two surfaces;
- an emulsifying agent is a surfactant which facilitates the formation of an emulsion, or improves its stability by reducing its rate of aggregation and/or coalescence.
- glycolipid according to the invention can be used as an emulsifier for the preparation of an oil-in-water emulsion.
- an oil-in-water emulsion comprises an oily phase dispersed within an aqueous phase
- a water-in-oil emulsion comprises an aqueous phase dispersed within an oily phase
- a glycolipid according to the invention when used as an emulsifying agent for the preparation of an oil-in-water emulsion, this emulsion is sensitive to pH, more particularly that it is kinetically stable as long as the pH of the aqueous phase of the emulsion is greater than a threshold hydrogen potential pH s , and that it destabilizes when this pH is adjusted so as to be lower than the pH s .
- Another object according to the invention is therefore an oil-in-water emulsion comprising an oily phase dispersed in an aqueous phase and at least one glycolipid of formula (I), characterized in that the emulsion is stable when the pH of the aqueous phase is greater than a threshold hydrogen potential pH s .
- the expression "kinetically stable as long as the pH of the aqueous phase of the emulsion is greater than a threshold hydrogen potential pH s " means that the pH of the aqueous phase of the emulsion must be greater than pH s so that the emulsion is stable.
- the pH s corresponds to the pKa of the glycolipid according to the invention used as emulsifier.
- pH s advantageously corresponds to the pKa of the mixture of glycolipids according to the invention.
- the threshold hydrogen potential pH s ranges from 2 to 5, and preferably from 2 to 4, and more preferably is approximately 4.
- the emulsion destabilizes in a few minutes, typically 5 to 20 minutes, and is completely destroyed in a few hours, typically 2 at 24h.
- the emulsion comprises a mixture of glycolipids according to the invention as described above.
- the inventors believe that the instability of the emulsions observed at low pH reflects the existence of a strong electrostatic component in the stabilization of the emulsions by the glycolipids according to the invention.
- the aqueous phase advantageously represents at least 50% by weight of the emulsion, relative to the total weight of the emulsion.
- the emulsion according to the invention comprises at least 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, or 85% by weight of aqueous phase, relative to the total weight of the emulsion.
- the quantity of aqueous phase in the emulsion according to the invention is notably between 50 to 80% by weight, preferably between 50 to 70% by weight, and more preferably between 50 to 60% by weight relative to the total weight of the emulsion.
- the aqueous phase represents between 50 and 70% by weight of the emulsion.
- the aqueous phase of the emulsion according to the invention mainly comprises water, a glycolipid or a mixture of glycolipids according to the invention and optionally one or more compounds miscible with water.
- the aqueous phase comprises, in % by weight of aqueous phase, from 0.5 to 5%, preferably from 0.5 to 3%, more preferably from 1 to 3% of a glycolipid or a mixture of glycolipids according to the invention.
- the aqueous phase may also include ionic species, pH regulators, active ingredients, preservatives, or even dyes, said active ingredients, preservatives and dyes being water-soluble or water-dispersible.
- the oily phase of the emulsion according to the invention is a fatty phase comprising at least one fatty substance chosen from liquid fatty substances at room temperature (20-25°C) or oils, volatile or not, of vegetable or mineral origin. or synthetic, and mixtures thereof.
- oil we mean a liquid fatty substance at room temperature (25°C).
- the oily phase may also include any liposoluble or lipodispersible additive.
- oils are chosen from physiologically acceptable oils.
- hydrocarbons of the crude formula C n H m with n and m being two whole numbers linear, aromatic and cyclic hydrocarbons can be used, whatever their boiling point. Mention will more particularly be made as hydrocarbons which may be present in the oily phase according to the invention: cyclopentane (C5H10), hexane (C6H14), methylcyclohexane (C7H14), heptane (C7H16), decane (C10H22), dodecane (C12H26), hexadecane (C16H34), and toluene (C7H8).
- the oily phase in the emulsion according to the invention may be composed of a single oil, in particular a single hydrocarbon, or may also consist of a mixture of two, three or even four different oils.
- the oily phase is typically in the form of drops of oily phase suspended in the aqueous phase.
- the oil phase drops are preferably monodisperse.
- the particle size distribution of the oil phase drops can be characterized in terms of average drop diameter in volume, D(4.3), and polydispersity in size, P, defined by: where Ni is the number of drops of diameter Di, and D m is the median diameter (diameter which divides the distribution into two parts of equal areas).
- the measurement of the median diameter of the drops can be carried out from a size histogram obtained by measuring the individual diameters of an assembly of drops (minimum 500) on one or more images taken by optical microscopy or by measuring diffusion static of light.
- the drops of oily phase advantageously have a volume average diameter of the order of a few micrometers.
- the droplets generally have a volume average diameter of between 2 and 10 pm, preferably between 3 and 6 pm, more preferably between 4 and 5 pm.
- the emulsion according to the invention can be subjected to a treatment to produce a dry emulsion, the treatment consisting of eliminating the majority or all of the aqueous phase of the emulsion according to the invention by drying or freeze-drying.
- An object according to the invention therefore relates to an emulsion according to the invention in the form of a dry emulsion.
- a dry emulsion is in the form of a powder consisting of oily particles capable of restoring an oil-in-water emulsion after rehydration, that is to say after dispersion of the dry emulsion in an aqueous phase.
- emulsion in the form of a dry emulsion and “dry emulsion” are used interchangeably.
- the dry emulsion comprises drops of oily phase, a glycolipid according to the invention and less than 20%, preferably less than 10% by weight of aqueous phase, relative to the total weight of the dry emulsion.
- the dry emulsion comprises at most 1, or 2% by weight of aqueous phase, relative to the total weight of the dry emulsion.
- the dry emulsion is devoid of aqueous phase.
- the oily phase drops have an average size of around 4 pm.
- the dry emulsions according to the invention contain a protective saccharide compound, in particular chosen from the group consisting of sucrose, lactose, fructose, trehalose, dextrins, maltodextrins, yellow dextrins, invert sugars, sorbitol, polydextrose, starch syrup, glucose syrup and mixtures thereof.
- a protective saccharide compound in particular chosen from the group consisting of sucrose, lactose, fructose, trehalose, dextrins, maltodextrins, yellow dextrins, invert sugars, sorbitol, polydextrose, starch syrup, glucose syrup and mixtures thereof.
- the protective saccharide compound is lactose.
- the dry emulsion is advantageously obtained by freezing an emulsion according to the invention, typically at a temperature between -50°C and -100°C and lyophilizing it.
- the invention also relates to the preparation of an emulsion according to the invention, comprising: a) preparation of an aqueous phase and an oily phase, in which the oily phase and/or the aqueous phase comprises the glycolipid according to invention; b) combination of the aqueous phase and the oily phase and stirring until an emulsion is obtained.
- the oily phase and/or the aqueous phase comprises the glycolipid according to the invention in an aqueous phase/glycolipid mass ratio of between 60 and 10.
- the aqueous phase of step a) comprises, in % by weight of aqueous phase, from 0.5 to 5%, preferably from 0.5 to 3%, more preferably from 1 to 3% of glycolipid. according to the invention.
- the oily phase does not comprise a glycolipid according to the invention.
- the pH of the aqueous phase is preferably adjusted so as to be greater than the pKa of the glycolipid according to the invention.
- step b) is carried out by adding the oily phase to the aqueous phase while stirring the resulting combination.
- Another object according to the invention concerns the use of an emulsion according to the invention for cleaning surfaces.
- the inventors discovered that when a drop of emulsion according to the invention is deposited on a solid substrate, such as a glass slide, or a plastic support, it moves, s spreads and contracts spasmodically and almost periodically on the support. This gives the emulsion the ability to be self-spreading or even self-stirring, which is of interest in the field of surface cleaning. Without wanting to be bound by a particular theory, the inventors attribute these properties to convective phenomena taking place within the emulsion drop.
- Table 1 GH70 a-transglucosylases, specificity of bonds during the synthesis of the natural polymer.
- P polymerase ie glucan-sucrase GH70;
- B branching sucrase GH70;
- nd not determined
- the origin of the enzymes in Table 1 are listed in Table 2.
- Recombinant enzymes are produced from cells of E. coli BL21 Star DE3 (SEQ ID NO 18, 13, 1, 3, 4, 5, 6, 16 and 17), BL21 Al DE3 (SEQ ID NO 12, 14, and 2) or Top 10 (SEQ ID NO: 15 ) transformed with the plasmid containing the gene for the targeted enzymes (see Table 3).
- the cells are then broken with ultrasound according to the following protocol: 5 cycles of 20 seconds at 30% of the maximum power of the probe, cold, spaced by 4 minutes of rest on ice.
- the sonication supernatants containing the soluble enzymes of interest are then recovered after 30 minutes of centrifugation (10,000 rpm, 10°C) and stored at 4°C.
- Enzymatic activity is determined by measuring the initial rate of production of reducing sugars using the 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) method (Miller, 1959).
- DNS 3,5-dinitrosalicylic acid
- An enzyme unit represents the quantity of enzyme which releases one pmole of fructose per minute, at 30°C, from 100 g.L'1 of sucrose in 50 mM sodium acetate buffer, pH 5.75.
- the activity is determined by measuring the initial rate of production of the reducing sugars using the 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) method.
- DNS 3,5-dinitrosalicylic acid
- Example 1 Screening of enzymes in acceptor reaction with different hydroxy fatty acids
- the acceptor reactions are carried out in conical microtubes, in a volume of 1 mL.
- the screening of GH family 70 enzymes was carried out under the following conditions:
- the hydroxy fatty acid is initially dissolved in 100% DMSO.
- the hydroxylated fatty acids (hereinafter AGH) tested are respectively: a sulfanyl hydroxylated fatty acid: 11-[2-[hydroxy-alkyl)-sulfanyl]-undecanoic acid (hereinafter AHESll) a co-hydroxylated fatty acid: acid 11 hydroxyundecanoic acid (hereinafter AHIID) a poly-hydroxy fatty acid: erythro-aleuritic acid (hereinafter AEA)
- the final concentration of DMSO in the reaction medium is 10% (v/v).
- the reaction is initiated by the addition of a volume of cell lysate sufficient to obtain an enzymatic activity in reaction of 1 U.mL'1 .
- the reactions are incubated at 30°C and stirred at 800 rpm using an Eppendorf ThermoMixer C. After 24 hours, the enzymes were denatured at 95°C for 5 min.
- reaction media are diluted one-half in absolute ethanol. This dilution allows, among other things, the elimination by precipitation of potential high molecular mass polymers.
- the separation of the lipid acceptors and their glucosylated forms is carried out in reverse phase with a SynergiTM Fusion-RP column (porosity of 80 ⁇ , particle size of 4 ⁇ m, C18 grafting with polar termination, Phenomenex, USA).
- This column is maintained at 30°C on a Thermo U3000 HPLC system coupled to a Corona CAD Véo detector (Charged Aerosol Detector) (Thermo Scientific, USA).
- the nebulization temperature is set at 50°C and the filter maintained at 3.2 seconds.
- the mobile phase is composed of a mixture of ultrapure water (solvent A) / HPLC quality acetonitrile (solvent B) each containing 0.05% (v/v) formic acid.
- the elution is carried out at a flow rate of 1 mL.min' 1 according to the following gradient: Between 0 min and 5 min, a first elution phase at 0% (v/v) of route B allows the elimination of residual simple sugars (fructose, glucose, leucrose, and residual sucrose or possible short oligosaccharides),
- a second isocratic elution phase at a percentage of 35% of route B is carried out for 25 minutes to separate the different glucosylated lipid compounds
- a final phase of 10 minutes at 75% of channel B allows the regeneration of the column.
- the ability of enzymes to glucosylate an acceptor is determined by measuring the conversion rate of the acceptor between the start and the end of the reaction.
- the conversion rate is calculated as follows:
- Figure 1 illustrates the ability of the enzymes to glucosylate AHESU under the conditions set out above.
- the GH family 70 enzymes tested were found to be active on AHESU.
- the branching enzymes BRS-A, BRS-B A1, BRS-B, BRS-E A1 and GBD-CD2 AN123 were found to be particularly active. Indeed, conversion rates ranging from 20% to rates greater than 80% under the screen conditions tested were obtained with these enzymes. Glucosylation of AHIID
- Figure 2 illustrates the ability of the enzymes to glucosylate AHUD under the conditions set out above.
- the branching enzymes BRS-A, BRS-B A1, BRS-B, BRS-E A1 and GBD-CD2 AN123 were found to be particularly active. Indeed, conversion rates ranging from 18% to rates greater than 60% under the screen conditions tested were obtained with these enzymes.
- Figure 3 illustrates the ability of the enzymes to glucosylate AEA under the conditions set out above.
- the branching enzymes BRS-A, BRS-B A1, BRS-B, BRS-E A1 and GBD-CD2 AN123 were found to be particularly active. Indeed, conversion rates ranging from 20% to rates greater than 60% under the screen conditions tested were obtained with these enzymes.
- Example 2 Comparison of the profiles of glucosylation products of AHESU, AHUD and AEA by the BRS-A branching enzymes; BRS-B A1; BRS-C; BRS-D A1, BRS-E A1 and GBD-CD2 AN 123
- Figure 4 illustrates the diversity of glucosylation products obtained under the conditions set out above.
- the glucosylation products are eluted between 10 and 16 minutes of the HPLC analysis.
- the product detected at 26.5 minutes corresponding to the residual AHESU acid.
- the chromatographic profiles show numerous glucosylation peaks. For example, six major products are obtained when BRS-A catalyzes the reaction.
- the profile of glucosylation products depends on the enzyme considered.
- BRS-B A1 BRS-C and BRS-EA1.
- the glucosylation efficiency is very high with AHESU as acceptor, particularly for BRS-A, BRS-B A1, BRS-D A1, and GBD- CD2 AN123.
- the conversion rates of AHESU obtained with 438.5 mM (150 g.L'1 ) of sucrose are 94%, 84% and 75% for BRS-A, BRS-D A1, and GBD-CD2 AN 123 respectively (BRS specific for the a-1,2 bond) and 89%, 26%, 22% for BRS-B A1, BRS-C and BRS-E A1 (BRS specific for the a-1,3 bond).
- Figure 5 illustrates the diversity of glucosylation products obtained under the conditions set out above.
- the glucosylation products obtained are eluted between 10 and 25 minutes.
- the product profiles obtained are complex with numerous glucosylation peaks detected (a dozen different products for BRS-A for example).
- the profile of glucosylation products is also dependent on the enzyme considered.
- the majority products Nos. 1 and 2 are, for example, in varying proportions depending on the enzymes: a high production of glucosylation product No. 1 is observed with GBD-CD2 AN 123; on the contrary, a production of the same order of magnitude of the two glucosylation products (1 and 2) is obtained with BRS-E A1.
- the products eluted in the first moments of the analysis appear in greater quantities in the reactions catalyzed by enzymes specific to the a-1,2 bond, ie. BRS-A, BRS-D A1 and GBD-CD2 AN 123.
- the AHUD conversion rates obtained are 78%, 40%, 17%, 54%, 32% and 67% for BRS-A, BRS-B A1, BRS-C, BRS-D A1, BRS-E A1 and GBD-CD2 AN123 respectively under the conditions shown in Figure 5.
- Figure 6 illustrates the diversity of glucosylation products obtained under the conditions set out above.
- the glucosylation products obtained are eluted between 10 and 30 minutes of the HPLC analysis, the product detected at 43 minutes corresponding to the residual AEA.
- the glucosylation product profiles appear complex, with numerous glucosylation peaks being detected (more than 16 major products for BRS-A for example).
- glucosylation products are very dependent on the enzyme considered. Indeed, if peak 4 is common to all enzymes, peak 5 is characteristic of the BRS-B A1 enzyme. Peak 10 is essentially present in the products obtained with the enzymes BRS-A and BRS-D A1, two enzymes specific for the ⁇ -1,2 bond.
- the products of glucosylation 1 to 3 are essentially produced by BRS-B A1 and BRS-E A1, two enzymes specific for the a-1,3 bond.
- the efficiency of glucosylation is also dependent on the enzyme considered. Indeed, the AEA conversion rates obtained are 63%, 74%, 30%, 60%, 65% and 74% for BRS-A, BRS-B A1, BRS-C, BRS-D A1, BRS-E A1 and GBD-CD2 AN123 respectively under the conditions shown in Figure 6.
- Example 3 Effect of the initial concentration of sucrose on the profile of the glucosylation products of AHESU, AHUD and AEA obtained with BRS-A; BRS-B A1; BRS-C; BRS-D A1, BRS-E A1 or GBD-CD2 AN123.
- This effect is mainly marked for enzymes with a-1,2 specificity. Indeed, the conversion rate of between 25% and 55%, obtained at an initial concentration of 146 mM with BRS-A, BRS-D A1 and GBD-CD2 AN 123 increases to a rate of between 60% and 85 % for a concentration greater than 146 mM. This effect of the initial sucrose concentration is less marked for BSR-B A1, BSR-C and BSR-E A1.
- glucosylation product no. 4 In the case of a-1,3 branching enzymes, the synthesis of glucosylation product no. 4 is disadvantaged in favor of that of other glucosylation products, especially glucosylation product no. 5 in the case of the BRS enzyme -B.
- Example 4 Structural characterization of the main glucosylation products of AHESU by BRS-A, of AHUD by BSR-B A1 and of AEA by BSR-B A1
- Glucosylation of AHESU is catalyzed by the BRS-A enzyme on 500 mg of AHESU.
- the reaction conditions are as follows:
- the reaction is carried out at 37°C with magnetic stirring. After 24 hours, the reaction is stopped by incubation at 95°C for 10 minutes. The mixture is stored at -20°C before purification.
- a prepurification step of the glucosylated hydroxy-lipids from AHESU is carried out by flash chromatography using a column containing 250 mL of stationary phase. Purosorb PAD910, Purolite, USA. The glucosylation products are thus separated from the residual free sugars using the following elution steps:
- the glucosylation products are collected and concentrated by rotary evaporation under vacuum then analyzed by chromatography.
- the chromatogram obtained at this prepurification step is presented in Figure 10.
- Product no. 1 corresponds to that eluted closest to AHESU, a lipid acceptor that has not completely reacted.
- the majority glucosylated forms of AHESU (glucosylation products no. 1 to 3) are isolated using a semi-preparative system consisting of an Agilent 1260 Infinite HPLC chain coupled to a “Dionex Ultimate 3000 automated fraction collector” . Separation is ensured by a SynergiTM Fusion-RP column (porosity of 80 ⁇ , particle size of 4 ⁇ m, C18 grafting with polar termination, Phenomenex, USA). The elution is carried out isocratically with a mixture of H2O/Acetonitrile 65%/35% v/v at a flow rate of 1 mL.min' 1 .
- Thermo U3000 HPLC system was coupled to a high-resolution LTQ Orbitrap Vélos spectrometer (ThermoScientific, USA). Ionization is carried out in negative electrospray mode (H ESI II -) with a mass delta of +/- 5 ppm.
- H ESI II - negative electrospray mode
- the high-resolution mass spectra of glucosylation products #1 to 3 are obtained ( Figure 10).
- glucosylation product no. 3 (peak no. 3 at 5.92 min) gives a main ion at m/z 585.2571 for ([M-H]').
- Compound no. 3 is therefore also a diglucosylated form of AHESU but with a different sugar bond from that of product no. 2.
- AHESU No. 1 (monoglucosylated AHESU), No. 2 and 3 (diglucosylated AHESU) is carried out by NMR.
- the 1 H, 13 C, JMod, HSQC and HMBC spectra were recorded on Bruker Avance 500 MHz equipment at 298K with a BBI probe H-BB-D Z-Grd 5mm.
- the data were acquired and processed using TopSpin 3 software.
- a 1 H spectrum and a 13 C spectrum of the glucosylation product no. 1 of AHESU are produced.
- Peak No. 1 of the chromatograms presented in Figure 10 corresponds to 11-[(2-O-g-D-glucopyranosyl-ethyl)-sulfanyl]-undecanoic acid.
- a 1 H spectrum and a 13 C spectrum of the glucosylation product no. 2 of AHESU are produced.
- the presence of two anomeric protons at chemical shifts 4.84 and 5.13 ppm and two negative carbons at chemical shifts 100.54 ppm and 101.94 ppm (anomeric carbons) are consistent with a diglucosylated form of the lipid acceptor.
- a 2D HSQC spectrum of AHESU glucosylation product no. 2 allows the assignment of anomeric protons and carbons for each sugar unit.
- a 2D HMBC NMR spectrum of AHESU glycosylation product no. 2 shows an a-1,3 type saccharide bond between the two glucosyl units.
- Peak No. 2 of the chromatograms presented in Figure 10 therefore corresponds to 11- [(2-O-a-D-glucopyranosyl-(1,3)-a-D-glucopyranosyl-ethyl) sulfanyl]-undecanoic acid.
- a 1 H spectrum and a 13 C spectrum of the glucosylation product no. 3 of AHESU are produced.
- the presence of two anomeric protons at chemical shifts 4.99 and 5.05 ppm and two negative carbons at chemical shifts 97.56 ppm and 98.28 ppm (anomeric carbons) are consistent with a second diglucosylated form of the acceptor lipid.
- a 2D HSQC spectrum of AHESU glucosylation product no. 3 allows the assignment of anomeric protons and carbons for each sugar unit.
- a 2D HMBC spectrum of glucosylation product no. 3 shows an a-1,2 type saccharide bond between the two glucosyl units.
- Peak No. 3 of the chromatogram presented in Figure 10 therefore corresponds to 11-[(2- O-a-D-glucopyranosyl-(1,2)-a-D-glucopyranosyl-ethyl) sulfanyl]-undecanoic acid.
- the production of glucosylation products is carried out by the BRS-B enzyme on 1 g of AHUD.
- the reaction conditions are as follows:
- the reaction is carried out at 30°C with magnetic stirring. After 24 hours, the reaction is stopped by incubation at 95°C for 10 minutes. The mixture is stored at -20°C before purification.
- a prepurification step of the glycolipids from the AHUD is carried out by flash chromatography using a REVELERIS® X2 Flash Chromatography System (GRACE, USA) equipped with a column containing 80 g of silica-C18 stationary phase.
- the glucosylation products are separated from the residual free sugars under the following conditions:
- AHUD glucosylated forms of AHUD are then purified on a semi-preparative system consisting of an Agilent 1260 Infinite CHLP chain coupled to a collector of fraction Dionex Ultimate 3000 automated fraction collector. Separation is ensured by a SynergiTM Fusion-RP column (porosity of 80 ⁇ , particle size of 4 ⁇ m, C18 grafting with polar termination, Phenomenex, USA). The elution is carried out isocratically with a FW/Acetonitrile mixture 75%/25% v/v at a flow rate of 1 mL.min' 1 .
- AHUD No. 1 monoglucosylated AHUD
- No. 2 diglucosylated AHUD
- the 1H, 13C, JMod, HSQC and HMBC spectra were recorded on Bruker Avance 500 MHz equipment at 298 K with a BBI probe H-BB-D Z-Grd 5mm. The data were acquired and processed using TopSpin 3 software.
- a 1 H spectrum and a 13 C spectrum of the glucosylation product no. 1 of AHUD are produced.
- Peak No. 1 of the chromatogram presented in Figure 11 corresponds to 11-O-(a-D-glucopyranosyl)-undecanoic acid.
- the production of AEA glucosylation products is carried out by the BRS-B A1 enzyme on 1.5 g of AEA.
- the reaction conditions are as follows:
- a prepurification step of the glycolipids from AEA is carried out by flash chromatography using a REVELERIS® X2 Flash Chromatography System (GRACE, USA) equipped with a column containing 80 g of Silica-Ci 8 stationary phase. glucosylation are separated from residual free sugars using the following elution steps at a flow rate of 60 ml. min -1 :
- Glucosylation products are collected during the acetonitrile gradient.
- Figure 12 illustrates the chromatogram obtained during this pre-purification step by flash chromatography.
- the 1 H spectrum highlights an anomeric proton at a chemical shift of 4.77 ppm.
- the 13 C spectrum highlights the presence of negative carbon peaks C9 and C10 superimposed at a chemical shift of 75.38 ppm, which proves the absence of glucosylation on the two secondary hydroxyls. Glucosylation is therefore found at the level of positive carbon no. 16 deshielded at 69.21 ppm.
- Peak No. 4 of the chromatogram presented in Figure 12 corresponds to 16-O-(a-D-glucopyranosyl)-9,10-dihydroxy-hexadecanoic acid.
- a 1 H spectrum and a 13 C spectrum of the AEA glucosylation product no. 5 are produced.
- the 1 H spectrum highlights two anomeric protons at a chemical shift of 4.79 ppm and 5.14 ppm and two anomeric carbons at 100.34 ppm and 101.89 ppm. Like the monoglucosylated form, the negative carbon peaks C9 and C10 are still present at 75.41 ppm, which demonstrates diglucosylation at position C16.
- the 2D HMBC spectrum of AEA shows an a-1,3 type saccharide bond between the two glucosyl units.
- Peak No. 5 of the chromatogram presented in Figure 12 corresponds to a diglucosylated AEA of the 16-O-(a-D-glucopyranosyl)-(1,3)-a-D-glucopyranosyl)-9,10-dihydroxy-hexadecanoic acid type.
- Example 5 Glucosylation of omega-hydroxy fatty acids having a hydrocarbon chain comprising a carbon number greater than 11
- branching enzymes BRS-A, BRS-B A1, BRS-C, BRS-D A1, BRS-E A1 and GBD-CD2 AN 123 were tested to glucosylate 12-HydroxyDoDecanoic Acids (AHDD), 15-HydroxyPentaDecanoic Acids (AHPD) and 16-HydroxyHexaHecanoic (AHHD) comprising 12, 15 and 16 carbon atoms respectively.
- AHDD 12-HydroxyDoDecanoic Acids
- AHPD 15-HydroxyPentaDecanoic Acids
- AHHD 16-HydroxyHexaHecanoic
- Figure 13 shows the glucosylation products obtained at 37°C with 800 rpm stirring under the following synthesis conditions:
- the reaction media are diluted one-half in absolute ethanol.
- the separation is carried out with a SynergiTM Fusion-RP column (porosity of 80 ⁇ , particle size of 4 ⁇ m, C18 grafting with polar termination, Phenomenex, USA).
- the elution is carried out at 30°C on a Thermo U3000 HPLC system coupled to a Corona CAD Véo detector (Charged Aerosol Detector) (Thermo Scientific, USA).
- the nebulization temperature is set at 50°C and the filter maintained at 3.2 seconds.
- the mobile phase is composed of a mixture of ultrapure water (solvent A) / HPLC quality acetonitrile (solvent B) containing 0.05% (v/v) formic acid.
- solvent A ultrapure water
- solvent B HPLC quality acetonitrile
- the elution is carried out at a flow rate of 1 mL.min' 1 according to the following gradient:
- the comparison of the initial (control) and final reaction times shows the appearance of numerous glucosylation products between elution times 17 minutes and 22 minutes for AHDD, between 19 minutes and 25 minutes for AHPD. and between 21 minutes and 27 minutes for AHPD.
- the glucosylation efficiency is dependent on the chain size of the co-hydroxylated acceptors considered. Glucosylation of acceptors of higher chain length is obtained only by decreasing the working concentrations (from 10 mM for AHDD to 0.5 mM for AHHD for example).
- the branching enzymes BRS-A, BRS-D A1, GBD-CD2 AN123 (specific for the ⁇ -1,2 bond) and the BRS-E enzyme (specific for the ⁇ -1,3 bond) appear in this case still be the most effective enzymes.
- the conversion rates for AHDD are 60%; 40% and 42% for enzymes.
- BRS-A, BRS-D A1 and GBD-CD2 AN 123 respectively and only 18%; 11% and 17% for the enzymes BRS-B A1, BRS-C and BRS-E A1 respectively.
- AHPD 15-hydroxypentadecanoic acid
- AHHD 16-hydroxyhexadecanoic acid
- Glucosylation of longer chain acceptors is more efficient with the two branching enzymes BRS-A (a-1,2 specific) and BRS-B (a-1,3 specific).
- BRS-A a-1,2 specific
- BRS-B a-1,3 specific
- AHHD 38% for BRS-A and 21% for BRS-C.
- the transformation yields of AHHD are only 5%, 12%, 6% and 12% for BRS-C, BRS-D A1, BRS-E A1 and GBD-CD2 AN 123 respectively.
- Example 6 Glucosylation of 9,10-dihydroxyoctadecanoic and 9,10,12-trihydroxyoctadecanoic acids by the enzymes BRS-A, BRS-B A1, BRS-C, BRS-D A1, BRS-E A1 and GBD-CD2 AN 123
- the enzymes BRS-A, BRS-B A1, BRS-C, BRS-D A1, BRS-E A1 and GBD-CD2 AN123 were tested to glucosylate 9,10-dihydroxyoctadecanoic acids (ADHO ) and 9, 10, 12-trihydroxyoctadecanoic acid (ATHO).
- Figure 14 shows the glucosylation products obtained at 37°C with 800 rpm stirring under the following synthesis conditions:
- the reaction media are diluted one-half in absolute ethanol.
- the separation is carried out with a SynergiTM Fusion-RP column (porosity of 80 ⁇ , particle size of 4 m, C18 grafting with polar termination, Phenomenex, USA).
- the elution is carried out at 30°C on a Thermo U3000 HPLC system coupled to a Corona CAD Véo detector (Charged Aerosol Detector) (Thermo Scientific, USA).
- the nebulization temperature is set at 50°C and the filter maintained at 3.2 seconds.
- the mobile phase is composed of a mixture of ultrapure water (solvent A) / HPLC grade acetonitrile (solvent B) containing 0.05% (v/v) formic acid.
- solvent A ultrapure water
- solvent B HPLC grade acetonitrile
- the elution is carried out at a flow rate of 1 mL.min' 1 according to the following gradient:
- the conversion rates vary between 2% and 30% for ATHO and between 1% and 11% for ADHO depending on the branching enzymes considered.
- the branching enzymes BRS-A, BRS-D A1, GBD-CD2 AN123 (specific for the ⁇ -1,2 linkage) and the enzyme BRS-E (specific for the ⁇ -1,3 linkage) appear to be the enzymes most effective in both cases.
- Example 7 Glucosylation of hydroxylated fatty acids by mutants of the GBD CD2 AN123 enzyme
- Mutants of the GBD CD2 AN 123 enzyme were tested to glucosylate the following hydroxy fatty acids: 11-[2-[hydroxy-alkyl)-sulfanyl]-undecanoic acid (AHESU), 11-hydroxyundecanoic acid (AHUD), 12-acid -hydroxydodecanoic acid (AHDD), 15-hydroxypentanoic acid (AHPD), erythro-aleuritic acid (AEA), 9,10,12-trihydroxy octadecanoic acid (ATHO).
- AHESU 11-[2-[hydroxy-alkyl)-sulfanyl]-undecanoic acid
- AHDD 11-hydroxyundecanoic acid
- AHDD 12-acid -hydroxydodecanoic acid
- AHPD 15-hydroxypentanoic acid
- AEA erythro-aleuritic acid
- HEO 9,10,12-trihydroxy octadecanoic acid
- the GBD-CD2 AN 123 mutants also make it possible to obtain glucosylation products having larger saccharide units.
- Example 8 Study of the emulsifying properties of the glucosylation products of AHESU by BRS-A and of AHUD by BRS-B A1
- Glc-AHESU The emulsifying properties of the glucosylation products of AHESU by the enzyme BRS-A (hereinafter referred to as Glc-AHESU) and of AHUD by BRS-B A1 (hereinafter Glc-AHUD) were evaluated.
- Aqueous phase Aqueous phase
- An aqueous solution comprising 2% by weight of Glc-AHESU is prepared.
- the pH of the aqueous solution is adjusted using a 1 M NaOH solution (the pHs studied are 4, 5, 6 and 10.5).
- Dodecane is used as a model oil.
- the oil is added slowly to the aqueous solution while homogenizing using an Ultra Turrax T25 (Janke & Kunkel, IKA) set at 3000 rpm.
- the final percentage of oil is 20% by weight.
- the preparation is then stirred for 10 minutes by increasing the speed of the Ultra Turrax to 9,000 rpm.
- the kinetic evolution of the emulsions thus formed is followed over time by laser granulometry (static light scattering) (Mastersizer 2000, Malvern Instruments), optical microscope and macroscopic observation.
- the particle size distribution of the emulsions is characterized in terms of the volume average drop diameter, D(4.3), and polydispersity, P, defined above ([Chem 1] and [Chem 2]). 8.2. Emulsions obtained with Glc-AHESU
- Figure 15 shows the characteristics of the emulsions on the day of their preparation (JO) at the different pHs studied.
- the emulsions formed have a milky white appearance.
- the initial particle sizes are generally quite similar whatever the pH: the average diameter is of the order of 4-5 pm and the polydispersity is between 0.27 and 0.49.
- the size of the drops remains almost unchanged as shown by monitoring the diameter of the drops D(4.3) as a function of time ( Figure 16).
- the glucosylation product Glc-AHESU therefore makes it possible to stabilize emulsions whose aqueous phase has a pH greater than the pKa.
- the instability observed at low pH reflects the existence of a strong electrostatic component in the stabilization of emulsions.
- the electrostatic repulsion that prevents droplet coalescence (recombination) results from charged surfactant molecules adsorbed at interfaces.
- An HCI solution (0.1 M) is then added to drop the pH to 2.
- the emulsion is completely destroyed after 24 hours.
- the emulsions can also be stimulated by adding salt. Indeed, an emulsion at pH 10.5 prepared with 0.1 M NaCl destabilizes after five days while it is still stable after 6 months in the absence of salt. This supports the hypothesis according to which the stabilization is of electrostatic origin to the extent that it is known that the addition of salt screens electrostatic repulsion.
- Figure 18 shows the characteristics of the emulsions on the day of their preparation (JO) at the different pHs studied.
- the emulsions formed have a milky white appearance.
- the size of the drops remains almost unchanged for up to 14 days as shown by monitoring the diameter of the drops D(4.3) as a function of time (Figure 19).
- the particle size measurements are interrupted as soon as this layer visually becomes perceptible.
- pH 10.5 a progressive increase in the size of the drops without the macroscopic appearance being impacted at this stage is observed.
- the 6-month follow-up shows the appearance of a thin layer of oil.
- Glc-AHUD therefore acts as a surfactant stabilizing emulsions at pH values higher than pKa and more particularly at strongly basic pH (greater stability at pH 10.5 than at pH 6).
- the instability observed at low pH reflects the existence of a strong electrostatic component in the stabilization of emulsions.
- the electrostatic repulsion that prevents droplet coalescence results from charged surfactant molecules adsorbed at interfaces.
- Glc-AHU makes it possible to manufacture pH-stimulable emulsions, that is to say stable in a range of pH and which destabilize at a given pH, “on demand”.
- Such emulsions have the advantage of being “self-spreading” and “self-stirring”, which makes it possible to envisage different applications in the field of surface cleaning.
- Example 9 Study of the preparation of dry emulsions using glycolipids according to the invention
- the composition is in the form of a dry powder, said dry powder being advantageously redispersible in water.
- the redispersible dry form has many advantages: ease of transport, extended shelf life due to the absence of bacteriological development.
- emulsions stabilized by surfactants destabilize during drying (oil exudation).
- the emulsions based on the glycolipids synthesized in the present invention can be dried without destabilizing and are redispersible in water.
- aqueous solution comprising 2% by weight of Glc-AHESU and 10% lactose is prepared. Lactose is added to the aqueous phase as a cryoprotective agent.
- Dodecane is used as a model oil.
- the oil is added slowly to the aqueous solution while homogenizing using an Ultra Turrax T25 (Janke & Kunkel, I KA) set at 3000 rpm.
- the oil percentage is 20% by weight.
- the preparation is then stirred for 10 minutes by increasing the speed of the Ultra Turrax to 9,500 rpm.
- a dry emulsion is obtained by freeze-drying the previously frozen primary emulsion at -80°C.
- the dry emulsion is redispersed by adding pure water in a quantity equivalent to that evaporated during drying.
- Strains of E. Coli K12 are cultured in the presence of concentration of 0% w/v, 0.5% w/v, 1% w/v, 2% w/v and 2.5% w/v of glucosylation products of AHUD or AEA in aqueous phase.
- the absorbance of the cultures in the presence of the glucosylation products of AHUD or AEA is monitored at an optical density of 600 nm.
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Abstract
La présente invention concerne un procédé de préparation d'au moins un glycolipide répondant à la formule (I) : [Glc]n-xOy-R (I) [Glc]n représentant un motif osidique linéaire ou ramifié comprenant n unités glucosyle, avec n compris entre 1 et 7, avec la condition que lorsque le motif osidique comprend plusieurs unités glucosyle celles-ci sont liées entre elles par des liaisons osidiques de type α; R représentant un radical acide gras comprenant entre 4 et 24 atomes de carbone, dont la chaine carbonée est linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, -xOy- symbolisant le rattachement du radical acide gras au motif osidique par une liaison éther reliant un atome de carbone Cx d'un résidu glucosyle du motif osidique, antérieurement portant un groupe hydroxyle, à un atome de carbone Cy du radical acide gras, antérieurement portant un groupe hydroxyle, avec Cx la position de l'atome du résidu glucosyle sur lequel s'effectue la liaison, Cx représentant l'atome de carbone C1 du résidu glucosyle, Cy étant un atome de carbone positionné le long de la chaine carbonée du radical acide gras ou à l'extrémité oméga de celle-ci; ledit procédé comprenant une étape de glucosylation d'un acide gras hydroxylé de formule (II) : R-yOH (II) -yOH représentant un groupe hydroxyle rattaché à un atome de carbone Cy tel que défini ci-dessus; ladite étape comprenant la mise en contact de l'acide gras hydroxylé de formule (II) avec au moins une α-transglucosylase de la famille GH70 en présence de saccharose ou d'un analogue de saccharose.
Description
PROCÉDÉ DE PRÉPARATION DE GLYCOLIPIDES, GLYCOLIPIDES ET LEURS UTILISATIONS
La présente invention se rapporte au domaine de la préparation par voie enzymatique de glycolipides. La présente invention se rapporte également à des glycolipides et à leurs utilisations.
Les glycolipides sont des composés comprenant une partie osidique et une partie lipidique. Les glycolipides peuvent être d’origine naturelle ou biosynthétique. Les glycolipides présentent une certaine attractivité de par leur caractère amphiphile et de par leurs propriétés de solubilité.
Les glycolipides naturels sont majoritairement des sophorolipides, constitués d’une entité sophorose (disaccharide de glucose à liaison 0-1 ,2) et d’une chaîne d’acide gras C16 ou C18 avec une insaturation. Une autre catégorie de glycolipides naturels est représentée par celles des rhamnolipides constitués d’une ou deux unités rhamnosyle liées à une queue grasse d'acide 3-(hydroxyalcanoyloxy)-alcanoïque (acides gras en C10 essentiellement).
Les glycolipides synthétiques sont majoritairement des esters de carbohydrates (glucose, saccharose, maltose) encore appelés sucroesters, dans lesquels la partie osidique et la partie lipidique sont reliées par une liaison ester, ou bien des alkyl-(poly-)glucosides encore appelés polyglucosides d’alkyle, dans lesquels la partie osidique et la partie lipidique sont reliées par une liaison éther.
Actuellement, les glycolipides sont classiquement synthétisés via des voies chimiques. Par exemple, les procédures les plus communes de synthèse d’alkyl-(poly-)glycosides incluent la méthode de Fischer, de Koenig-Knorr ou celle de Schmidt.
La méthode de Fischer est la plus largement utilisée en industrie. Elle permet la production d’alkyl-polyglucosides de courte chaine en une seule étape. Le carbohydrate est solubilisé dans un excès d’alcool en présence d’un catalyseur acide (acide sulfonique, acide chlorhydrique) et à température élevée (von Rybinski et Hill, Angew. Chem. Int. Ed. 37, 1328-1345,1998). L’obtention d’APGs de plus grandes tailles nécessite une étape supplémentaire dans laquelle un alkyle de petite taille (en général butyl) est échangé avec un alcool de degré supérieur permettant ainsi de contourner les problèmes de solubilité des réactifs.
Cette méthode de synthèse est efficace mais les catalyseurs acides sont difficiles à recycler. De plus, elle est difficilement applicable à l’obtention de dérivés di- ou tri- glycosylés en raison d’une réaction compétitive d’alcoolyse des liaisons interglycosidiques (Koto et al., Simple preparations of alkyl and cycloalkyl a-glycosides of maltose, cellobiose and lactose, Carbohydr. Res. 339, 2415-2424, 2004).
La synthèse chimique de glycolipides du type alkyl-polyglucosides implique donc une multitude d’étapes de réaction incluant des étapes de protection/déprotection des carbohydrates ; l’utilisation de catalyseurs acides, alcalins ou métalliques et de grandes quantités de solvants à recycler ; des risques de réactions secondaires du fait de la réactivité des catalyseurs et des conditions drastiques de synthèse ; la formation des deux anomères dans les produits de glycosylation qui sont difficiles à séparer.
La biosynthèse de glycolipides à liaison éther est possible par voie enzymatique. Les enzymes les plus étudiées dans cette optique sont celles de la famille des p-glycosidases. Ces dernières sont des enzymes sans co-facteur qui hydrolysent naturellement des liaisons osidiques présentes dans les polysaccharides pour produire des mono- ou des oligosaccharides. In vitro, ces enzymes sont capables d’utiliser un donneur de glycosylé et de catalyser le transfert du glycosylé sur un hydroxyle libre d’une molécule acceptrice et ainsi catalyser la formation d’une liaison éther entre la molécule acceptrice et le résidu glycosylé. La synthèse des alkyl-polyglucosides catalysée par les p-glycosidases conserve en général une liaison de configuration p entre les sucres et la partie alkyle (P-alkyl- polyglucosides).
Cette synthèse est possible soit par réversion d’hydrolyse soit par transglycosylation.
Dans l’approche par réversion d’hydrolyse, les donneurs de glycosylé sont des polysaccharides ou des carbohydrates tels que l’amidon, la cellulose, le saccharose ou le glucose. Dans ce cas, l’équilibre thermodynamique est plutôt favorable à l’hydrolyse, les rendements de production d’alkyl-polyglucosides sont donc en général très modestes. Par exemple, plusieurs équipes travaillant sur la p-glucosidase d’amande ont obtenu des rendements de production inférieurs à 62% avec des alcools de courtes chaînes (i.e. méthylglucoside/xyloside ou éthylglucoside/xyloside). Les rendements avec des alcools de plus longues chaînes (nombre de carbone supérieur à 6) sont encore plus faibles et
compris entre 1 et 13 % (Drouet et al., Biotechnol. Bioeng. 43, 1075-1080, 1994 ; Vie et al., Enzyme Microb. Technol. 20, 597-603, 1997 ; Yan et Liau, Biotechnol. Lett. 20, 653-657, 1998).
D’autres familles d’enzymes ont permis l’obtention d’alkyl-polyglycosides.
Bousquet et al. ont montré la possibilité d’obtenir des a-alkyl-polyglucosides en utilisant l’a- transglucosidase d'Aspergillus niger (Bousquet et al., Bucke, C. (Ed.), Carbohydrate Biotechnology Protocols. Humana Press, Totowa, NJ, 291-296, 1999) ou de Talaromyces dupont! (Bousquet et al., Enzyme Microb. Technol. 23, 83-90, 1998). Ainsi de l’a-butyl- glucoside a été obtenu par réaction de transfert d’unités glucosyle issues de maltodextrines sur du butanol dans un milieu biphasique.
Dahiya et collaborateurs ont réussi à produire des 1-O-alkylyl-a-D-mono, di- et tri- glucopyranosides (a-alkyl-polyglycosides) à partir d’hexanol ou d’octanol et de saccharose en utilisant une souche de Microbacterium paraoxydans présentant une activité de transglycosylation membranaire de type amylosaccharase avec un rendement maximum de 14,8 % (Dahiya et al., Biotechnol. Lett. 37, 1431-1437, 2015).
Ochs et collaborateur, 2011 , ont montré la possibilité de produire des pentyl- et octyl- polyxylosides (alkyl-polyxylosides) par réaction de transglycosylation entre le pentanol ou l’octanol et des xylanes issus du bois de bouleau catalysée par différentes xylanases dont celle de Thermobacillus xylanaticus (Ochs et al., Green Chem. 13, 2380-2388, 2011 ; Rémond et al., FR2967164, 2012).
Quelques Glucane-Saccharases (GS) des familles 13 et 70 des Glycosides Hydrolases (GH13 et GH70) ont été utilisées dans des réactions d’accepteurs dans le but d’allonger la partie glucidique d’alkyl monoglucosides à groupe alkyle court (1 à 8 atomes de carbone) à partir de saccharose.
Des GS des GH70 ont également été utilisées dans des réactions de glucosylation directe d’alcools. En effet, Seibel et collaborateur ont montré la capacité de la dextrane saccharase de Streptococcus oralis GTFR à glucosyler des alcools allant du (chloro-) méthanol au (4- chloro)-1 -butanol (Seibel et al., ChemBioChem 7, 310-320, 2006). Par ailleurs, Kim et collaborateurs ont montré, lors d’essai de glucosylation d’alcools courts de 1 à 4 atomes
de carbone, une préférence de la dextrane saccharase de L. mesenteroides B-1299CB pour les alcools primaires par rapport aux alcools secondaires, les alcools tertiaires n’ayant pu être convertis (Kim et al., Biotechnol. Lett. 31 , 1433-1438, 2009).
Toutefois, la plupart des procédés enzymatiques connus sont limités car ils permettent rarement l’obtention de glycolipides ayant des chaînes carbonées comprenant plus de 8 atomes de carbone.
Il existe donc un besoin pour un procédé économique et simple à mettre en oeuvre à l’échelle industrielle, qui permette de préparer des glycolipides ayant de nouvelles architectures moléculaires particulières, en particulier des glycolipides à structure bolaamphiphiles, qui sont susceptibles de trouver des applications dans des domaines tels que la pharmacie, la cosmétique, la chimie fine, le biocontrôle, le phytosanitaire, la dépollution ou encore l’agroalimentaire.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
[Fig.1 ] représente le criblage d’a-transglucosylases de la famille GH70 pour leur capacité à glucosyler l’Acide 11-[(2-Hydroxy-Ethyl) Sulfanyl)]-llndécanoique (AHESU). Détermination du taux de conversion de l’accepteur lipidique dans les conditions testées : [AHESU] = 10 mM, [saccharose] = 292 mM, DMSO = 10% v/v ; Tampon Acétate de sodium 50 mM pH=5,75, Activité enzymatique = 1 U.mL'1, T = 30°C.
[Fig. 2] représente le criblage d’a-transglucosylases de la famille GH70 pour leur capacité à glucosyler l’Acide 11-HydroxyUnDecanoique (AHUD). Détermination du taux de conversion de l’accepteur lipidique dans les conditions testées : [AHUD] = 10 mM ; [Saccharose] = 292 mM ; DMSO = 10% v/v ; Tampon Acétate de sodium 50 mM pH=5,75, Activité enzymatique = 1 U.mL'1, T = 30°C.
[Fig. 3] représente le criblage d’a-transglucosylases de la famille GH70 pour leur capacité à glucosyler l’Acide Erythro-Aleuritique (AEA). Détermination du taux de conversion des accepteurs lipidiques dans les conditions testées : [AEA] = 10mM ; [saccharose] = 292 mM ; DMSO = 10% v/v ; tampon acétate de sodium 50 mM pH=5,75, Activité enzymatique = 1 U.mL'1, T = 30°C.
[Fig. 4] illustre une comparaison des profils de produits de glucosylation de l’acide 11 -[(2- hydroxy-ethyl) sulfanyl)]-undécanoïque (AHESll) par les enzymes de branchement BRS- A, BRS-B A1 , BRS-C, BRS-D A1 , BRS-E et GBD-CD2 AN 123. Réactions réalisées à 30°C sous 800 rpm d’agitation en présence de 438,5 mM de saccharose, 10 mM d’AHESU, 10% v/v de DMSO et un tampon acétate de sodium 50 mM à pH=5,75. Les chiffres 1 à 6 représentent les produits de glucosylation majeurs. Les enzymes sont regroupées en fonction de leur spécificité de liaison osidique sur les dextranes i.e. a-1 ,2 pour BRS-A, BRS-D A1 , GBD-CD2 AN123 ou a-1 ,3 pour BRS-B A1 , BRS-C, BRS-E A1 ).
[Fig. 5] illustre une comparaison des profils de produits de glucosylation de l’acide 11- hydroxy-undécanoïque (AHUD) synthétisés par les enzymes de branchement BRS-A, BRS-B A1 , BRS-C, BRS-D A1 , BRS-E A1 et GBD-CD2 AN 123. Réactions réalisées à 30°C sous 800 rpm d’agitation en présence de 438,5 mM de saccharose, 10 mM d’AHUD, 10 % v/v de DMSO et un tampon acétate de sodium 50 mM à pH=5,75. Les enzymes sont regroupées en fonction de leur spécificité de synthèse de liaison osidique sur les dextranes i.e. a-1 ,2 pour BRS-A, BRS-D A1 , GBD-CD2 AN123 ou a-1 ,3 pour BRS-B A1 , BRS-C, BRS-E A1.
[Fig.6] représente une comparaison des profils de produits de glucosylation de l’acide érythro-aleuritique (AEA) synthétisés par les enzymes BRS-A, BRS-B A1 , BRS-C, BRS-D A1 , BRS-E A1 et GBD-CD2 AN123. Réactions réalisées à 30°C sous 800 rpm d’agitation en présence de 438,5 mM de saccharose, 10 mM d’AEA, 10 % v/v de DMSO et un tampon acétate de sodium 50 mM à pH=5,75. Les chiffres 1 à 16 représentent les pics de produits de glucosylation majeurs. Les enzymes sont regroupées en fonction de leur spécificité de synthèse de liaison osidique sur les dextranes i.e. a-1 ,2 pour BRS-A, BRS-D A1 , GBD- CD2 AN123 ou a-1 ,3 pour BRS-B A1 , BRS-C, BRS-E A1.
[Fig. 7] représente le taux de conversion de l’acide 11-[(2-hydroxy-ethyl) sulfanyl)]- undécanoïque (AHESU) obtenus lors de sa glucosylation par les enzymes de branchement BRS-A, BRS-B A1 , BRS-C, BRS-D A1 , BRS-E A1 et GBD-CD2 AN123 en fonction de la concentration initiale de saccharose. Réactions réalisées à 30°C sous 800 rpm d’agitation en présence de concentrations croissantes de saccharose ; 10 mM d’acide 11-[(2-hydroxy- ethyl) sulfanyl)]-undécanoïque ; 10 % v/v de DMSO et un tampon acétate de sodium 50 mM à pH=5,75.
[Fig. 8] représente le taux de conversion de l’AHUD obtenus lors de sa glucosylation par les enzymes de branchements BRS-A, BRS-B A1 , BRS-C, BRS-D A1 , BRS-E A1 et GBD- CD2 AN 123 en fonction de la concentration initiale de saccharose. Réactions réalisées à 30°C sous 800 rpm d’agitation en présence de concentrations croissantes de saccharose ; 10 mM d’AHUD ; 10 % v/v de DMSO et un tampon acétate de sodium 50 mM à pH=5,75.
[Fig. 9] représente le taux de conversion de l’acide érythro-aleuritique (AEA) obtenus lors de sa glucosylation par les enzymes de branchements BRS-A, BRS-B A1 , BRS-C, BRS-D A1 , BRS-E A1 et GBD-CD2 AN 123 en fonction de la concentration initiale de saccharose. Réactions réalisées à 30°C sous 800 rpm d’agitation en présence de concentrations croissantes de saccharose ; 10 mM d’AEA ; 10% v/v de DMSO, 1 II. mL'1 d’activité enzymatique en réaction et un tampon acétate de sodium 50 mM à pH=5,75.
[Fig. 10] représente un chromatogramme des produits de glucosylation de l’acide 11-[(2- hydroxy-ethyl) sulfanyl)]-undécanoïque (AHESll) obtenus avec l’enzyme BRS-A après élimination des sucres libres par chromatographie sur résine Purasorb PAD910.
[Fig. 11] représente un chromatogramme des produits de glucosylation de l’acide 11- hydroxyundécanoïque (AHIID) après élimination des sucres libres par flash chromatographie et analyse en spectrométrie de masse des produits purifiés correspondants aux pics 1 et 2 (produits de glucosylation n°1 et n°2).
[Fig. 12] représente un chromatogramme des produits de glucosylation de l’acide érythro- aleuritique (AEA) après pré-purification (élimination des sucres libres) par chromatographie flash et analyse en spectrométrie de masse des produits purifiés.
[Fig.13A] [Fig. 13B] [Fig.13C] représentent le profil de glucosylation de l’acide 12- hydroxydodécanoïque (AHDD) ([Fig.13A]), de l’acide 15-hydroxypentadécanoïque(AHPD) ([Fig. 13B]) et de l’acide 16-hydroxy-hexadécanoïque (AHHD) ([Fig.13C]) par les enzymes de branchement BRS-A, BRS-B A1 , BRS-C, BRS-D A1 , BRS-E A1 et GBD-CD2 AN123.
[Fig. 14A] [Fig. 14B] représentent le profil de glucosylation de l’acide 9, 10 dihydroxyoctanoïque (ADHO) (Figure 14A) et de l’acide 9, 10, 12 trihydroxyoctadécanoïque (ATHO) (Figure 14B) par les enzymes de branchement BRS-A, BRS-B A1 , BRS-C, BRS-D A1 , BRS-E A1 et GBD-CD2 AN 123. Réactions réalisées à 37°C
sous 800 rpm d’agitation en présence de 877 mM de saccharose, 5 mM d’acide gras, une activité enzymatique de 1 U.mL'1, 10 % v/v de DMSO et un tampon acétate de sodium 50 mM à pH=5,75. Les enzymes sont regroupées en fonction de leur spécificité de synthèse de liaison osidique sur les dextranes i.e. a-1 ,2 pour BRS-A, BRS-D A1 , GBD- CD2 AN123 ou a-1 ,3 pour BRS-B A1 , BRS-C, BRS-E A1.
[Fig. 15] illustre la caractérisation à JO des émulsions constituées d’une solution aqueuse à 2 % de Glc-AHESU et de 20 % massique de dodécane, aux différents pH étudiés. Le D(4,3) représente le diamètre moyen en volume et P la polydispersité.
[Fig. 16] illustre le suivi de stabilité sur 14 jours d’émulsions dont la phase aqueuse comprend 2 % en poids de Glc-AHESU (H/E 20/80). La taille des gouttes est déterminée par granulométrie et confirmée par microscopie optique.
[Fig. 17] : Etude de la déstabilisation de l’émulsion (2% Glc-AHESU dans eau/dodécane 80/20). A gauche, l’émulsion est fabriquée et maintenue à pH=6. A droite, l’émulsion est fabriquée à pH=6 puis ajustée à pH=2 à l’aide d’une solution d’HCI à 0,1 M.
[Fig.18] illustre la caractérisation à J0 des émulsions constituées d’une solution aqueuse à 2 % de Glc-AHUD et de 20 % massique de dodécane, aux différents pH étudiés. Le D(4,3) représente le diamètre moyen en volume et P la polydispersité.
[Fig. 19] : Suivi de stabilité sur plusieurs semaines des émulsions contenant 2 % de tensio- actif (H/E 20/80). La taille des gouttes est déterminée par granulométrie et confirmée par microscopie optique.
[Fig. 20] illustre la déstabilisation de l’émulsion (2 % GAH dans eau/Dodécane 80/20). A gauche, l’émulsion est fabriquée et maintenue à pH=6. A droite, l’émulsion est fabriquée à pH=6 puis ajustée à pH=2 à l’aide d’une solution d’HCI à 0,1 M. GAH = forme glucosylée de l’AHED
[Fig. 21] représente l’influence de l’hydrophobicité du support, de la nature de l’huile, l’évaporation, la taille et la concentration des gouttes sur l’intensité des phénomènes observés lors du dépôt d’une goutte d’émulsion sur un support solide.
[Fig. 22] montre l’aspect macroscopique de l’émulsion primaire (a), l’aspect macroscopique de l'émulsion sèche (poudre) (b), l’observation microscopique de l’émulsion avant séchage (c), l’observation microscopique de l’émulsion après séchage et redispersion dans l’eau (d) ; la mesure de la distribution de la taille des gouttelettes avant séchage et après séchage puis redispersion dans l’eau (e).
[Fig. 23] représente le suivi de cultures d’E. coli K12 (DO 600 nm) en présence de concentration de 0 % w/v (O), 0.5 % w/v (□), 1 % w/v (A), 2 % w/v (X) et 2.5 % w/v (*) de produits de glucosylation (A) de l’AHUD et de l’AEA (B) en phase aqueuse.
BREVE DESCRIPTION SELON L’INVENTION
Un but de la présente invention est de pallier les inconvénients de l’art antérieur et de fournir un procédé de préparation d’un glycolipide de formule (I) par catalyse enzymatique.
De manière surprenante, les inventeurs ont découvert que des a-transglucosylases sont capable de glucosyler des acides gras hydroxylés.
Un avantage du procédé selon l’invention est qu’il utilise des substrats renouvelables et bon marché, à savoir le saccharose ou l’un de ses analogues et des acides gras hydroxylés biosourcés.
Le procédé a également pour avantage qu’il permet d’obtenir des glycolipides ayant une structure de type bolaamphiphile (i.e. constitués de deux parties polaires séparées par une partie hydrophobe) ce qui laisse présager de propriétés tensio-actives et biologiques intéressantes. Les glycolipides selon l’invention se distinguent cependant des sophorolipides en ce que leur motif osidique peut comprendre une seule unité glucosyle ou bien plusieurs unités glucosyle reliées par des liaisons a dont on peut moduler la nature (a-1 ,2 et/ou a-1 ,3 et/ou a-1 ,4 et/ou a-1 ,6) en fonction de l’a-transglucosylase utilisée.
De manière importante, le procédé selon l’invention permet de préparer des glycolipides bolaamphiphile dont la partie hydrophobe comprend une chaine carbonée de taille importante, typiquement supérieure à 8 atomes de carbone, pouvant être interrompue par au moins un groupe sulfanyle, et substituée par exemple par au moins un groupe hydroxyle.
Le procédé selon l’invention permet donc d’obtenir une grande diversité de glycolipides en termes de taille de leur partie hydrophobe et de structure de leur partie glucosidique.
Cette diversité est très avantageuse pour produire de nouveaux glycolipides d'intérêt utiles dans des domaines tel que la pharmacie, la cosmétique, la chimie fine, le biocontrôle, le phytosanitaire, la dépollution ou encore l’agroalimentaire.
Un autre but selon l’invention est de fournir des glycolipides, en particulier des glycolipides bolaamphiphiles d’une grande diversité d’architecture moléculaire, et pouvant être utiles à titre d’agent tensioactif ou d’agent antimicrobien, notamment d’agent antibactérien.
Ces buts sont atteints par l’invention qui va être décrite ci-après.
Ainsi, un objet selon l’invention a pour objet un procédé de préparation d’au moins un glycolipide répondant à la formule (I) :
[Glc]n-xOy-R (I) dans laquelle
[Glc]n représente un motif osidique linéaire ou ramifié comprenant n unités glucosyle, avec n compris entre 1 et 7, avec la condition que lorsque le motif osidique comprend plusieurs unités glucosyle celles-ci sont liées entre elles par des liaisons osidique de type a ;
R représente un radical acide gras comprenant entre 4 et 24 atomes de carbone, dont la chaine carbonée est linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, optionnellement interrompue par un ou plusieurs atomes de soufre, optionnellement encore pouvant comprendre un ou plusieurs substituant(s) choisi(s) parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, le groupe amine, le groupe nitrosyle, et le groupe thiol,
-xOy- symbolise le rattachement du radical acide gras au motif osidique par une liaison éther reliant un atome de carbone Cx d’un résidu glucosyle du motif osidique, antérieurement portant un groupe hydroxyle, à un atome de carbone Gy du radical acide gras, antérieurement portant un groupe hydroxyle, avec Cx la position de l’atome du résidu glucosyle sur lequel s’effectue la liaison, Cx représentant l’atome de carbone C1 du résidu glucosyle, Cy étant un atome de carbone positionné le long de la chaine carbonée du radical acide gras ou à l’extrémité oméga de celle-ci ;
ledit procédé comprenant une étape de glucosylation d’un acide gras hydroxylé de formule (II) :
R-yOH (II) dans laquelle
R est un radical acide gras tel que défini dans la formule (I),
-yOH représente un groupe hydroxylé rattaché à un atome de carbone Cy tel que défini ci-dessus ; ladite étape comprenant la mise en contact de l’acide gras hydroxylé de formule (II) avec au moins une a-transglucosylase de la famille GH70 en présence de saccharose ou d’un analogue de saccharose.
Un autre objet selon l’invention concerne un glycolipide répondant à la formule (I) : [Glc]n-xOy-R (I) dans laquelle
[Glc]n représente un motif osidique linéaire ou ramifié comprenant n unités glucosyle, avec n compris entre 1 et 7, avec la condition que lorsque le motif osidique comprend plusieurs unités glucosyle celles-ci sont liées entre elles par des liaisons osidique de type a ;
R représente un radical acide gras comprenant entre 4 et 24 atomes de carbone, dont la chaine carbonée est linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, optionnellement interrompue par un ou plusieurs atomes de soufre, optionnellement encore pouvant comprendre un ou plusieurs substituant(s) choisi(s) parmi le groupe hydroxylé, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, le groupe amine, le groupe nitrosyle, et le groupe thiol,
-xOy- symbolise le rattachement du radical acide gras au motif osidique par une liaison éther reliant un atome de carbone Cx d’un résidu glucosyle du motif osidique, antérieurement portant un groupe hydroxylé, à un atome de carbone Cy du radical acide gras, antérieurement portant un groupe hydroxylé, avec Cx la position de l’atome du résidu glucosyle sur lequel s’effectue la liaison, Cx représentant l’atome de carbone C1 du résidu glucosyle, Cy étant un atome de carbone positionné le long de la chaine carbonée du radical acide gras ou à l’extrémité oméga de celle-ci.
Un autre objet selon l’invention concerne l’utilisation d’un glycolipide selon l’invention, à titre d’agent tensioactif.
Un autre objet selon l’invention concerne l’utilisation d’un glycolipide selon l’invention tel que défini ci-dessus, à titre de d’agent antimicrobien.
Un autre objet selon l’invention concerne une émulsion huile-dans-eau comprenant une phase huileuse dispersée dans une phase aqueuse et au moins un glycolipide de formule (I) selon l’invention, caractérisée en ce que l’émulsion est cinétiquement stable lorsque le pH de la phase aqueuse est supérieur à un potentiel hydrogène seuil pHs avantageusement compris entre 2 et 5.
Un autre objet concerne utilisation d’une émulsion selon l’invention pour le nettoyage de surfaces.
DESCRIPTION DETAILLEE SELON L’INVENTION
Procédé de préparation d’au moins un glycolipide selon l’invention
Dans le cadre de la présente invention, les expressions « glycolipide de formule (I) », « glycolipide », « glycolipide selon l’invention » peuvent être utilisées de manière interchangeable. Dans le présent document, les termes « glycolipide » et « glucolipide » peuvent être utilisés de manière interchangeable.
Dans le cadre de la présente invention, les expressions « acide gras hydroxylé de formule (II) », « acide gras hydroxylé » et « acide gras hydroxylé selon l’invention » peuvent être utilisées de manière interchangeable.
Motif osidique
Selon l’invention, l’expression « motif osidique », désigne un polymère linéaire ou ramifié constitué d’unités glucosyle liées entre elles par des liaisons osidiques.
Selon l’invention, les termes « liaison osidique » ou « liaison glucosidique » peuvent être utilisés indifféremment et désignent un lien covalent qui lie un glucosyle à un autre glucosyle adjacent au sein du motif osidique.
Le motif osidique [Glc]n correspond aux n unités glucosyle greffées lors de l’étape de glucosylation au niveau du carbone Cy de l’acide gras hydroxylé selon l’invention par l’a- transglucosylase de la famille GH70. n représente le nombre d'unités glucosyle dans le motif osidique [Glc]n du glycolipide selon l’invention, n est avantageusement compris entre 1 et 7, de préférence est compris entre 1 et 4. De manière préférée, n est égal à 1 ou 2.
Dans un mode de réalisation particulier, le glycolipide selon l’invention est un glycolipide dont le motif osidique comporte plusieurs unités glucosyle. Avantageusement, le glycolipide selon l’invention est tel que n est compris entre 2 et 7, de préférence entre 2 et 4.
Liaisons au sein du motif osidique
Selon l’invention, l’expression « liaison a » désigne un lien covalent qui lie l’atome de carbone C1 d’une unité glucosyle dans sa configuration a ; l’expression « liaison 0 » désigne un lien covalent qui lie l’atome de carbone C1 d’une unité glucosyle dans sa configuration 0.
Lorsque le motif osidique comprend plusieurs unités glucosyle, celles-ci sont liées entre elles par une liaison osidique a. De manière avantageuse, le choix du type a- transglucosylase de la famille GH70 permet de moduler le type de liaison au sein du motif osidique.
La ou les liaison(s) osidique(s) au sein du motif osidique sont avantageusement choisie(s) parmi une liaison osidique a-1 ,2, une liaison a-1 ,3, une liaison a-1 ,4 ou une liaison a-1 ,6, ou un mélange de celles-ci ; de préférence encore choisie(s) parmi une liaison a-1 ,2, une liaison a-1 ,3, une liaison a-1 ,4, une liaison a-1 ,6 ou un mélange de celles-ci.
Selon l’invention, le terme « liaison a-1 ,3 » désigne le lien éther covalent qui lie l’atome de carbone C1 d’une unité glucosyle anciennement porteur de la fonction hémi-acétal dans sa configuration a et l’hydroxyle porté par le carbone 03 d’une autre unité glucosyle adjacente. Selon l’invention, le terme « liaison a-1 ,2 » désigne le lien éther covalent qui lie l’atome de carbone 01 d’une unité glucosyle anciennement porteur de la fonction hémi-
acétal dans sa configuration a et l’hydroxyle porté par le carbone C2 d’une autre unité glucosyle adjacente. Selon l’invention, le terme « liaison a-1 ,4 » désigne le lien éther covalent qui lie l’atome de carbone C1 d’une unité glucosyle anciennement porteur de la fonction hémi-acétal dans sa configuration a et l’hydroxyle porté par le carbone C4 d’une autre unité glucosyle adjacente. Selon l’invention, le terme « liaison a-1 ,6 » désigne le lien éther covalent qui lie l’atome de carbone C1 d’une unité glucosyle anciennement porteur de la fonction hémi-acétal dans sa configuration a et l’hydroxyle porté par le carbone C6 d’une autre unité glucosyle adjacente.
Les unités a-glucosyle sont de préférence des unités a-D-glucosyle.
L’analyse des liaisons osidiques peut être réalisée par des méthodes connues de l’homme du métier.
Par exemple, les liaisons osidiques au sein du motif osidique peuvent être analysées par résonance magnétique nucléaire (RMN) ou par spectrométrie de masse (MS).
Liaison entre le motif osidique et le radical acide gras
-xOy- symbolise le rattachement du radical acide gras au motif osidique par une liaison éther reliant un atome de carbone Cx d’un résidu glucosyle du motif osidique, antérieurement portant un groupe hémiacétal, à un atome de carbone Cy du radical acide gras, antérieurement portant un groupe hydroxyle, avec Cx la position de l’atome du résidu glucosyle sur lequel s’effectue la liaison, Cx représentant l’atome de carbone C1 du résidu glucosyle, Cy étant un atome de carbone positionné le long de la chaine carbonée du radical acide gras ou à l’extrémité oméga de celle-ci.
Au sens de la présente invention, la position des atomes de carbone d’une unité glucosyle est numérotée de sorte à ce que l'atome de carbone C1 d’une unité glucosyle soit l’atome de carbone qui porte la fonction aldéhyde -CHO sous la forme ouverte de cette unité glucosyle.
Au sens de la présente invention, la position des atomes de carbone du radical acide gras est numérotée de sorte à ce que C’1 représente l’atome de carbone de la fonction acide carboxylique du radical acide gras.
Au sens de la présente invention, l’extrémité oméga du radical acide gras est l’extrémité terminée par un carbone dit carbone oméga dont la position est opposée au carbone portant le groupe acide carboxylique du radical acide gras.
Au sein du glycolipide selon l’invention, l’unité glucosyle adjacente au radical acide gras est avantageusement liée au radical acide gras par une liaison a.
En d’autres termes, dans le glycolipide de formule (I), l’unité glucosyle adjacente au radical acide gras est de préférence en configuration a.
L’analyse de la liaison entre le motif osidique et le radical acide gras peut être réalisée grâce à n’importe quelle méthode connue de l’homme du métier, par exemple par résonance magnétique nucléaire (RMN).
Radical Acide gras
Avantageusement, le radical acide gras comprend au moins 6, 7, 8, 9, 10, ou 11 atomes de carbone. Avantageusement, le radical acide gras comprend au plus 24 atomes de carbone. Avantageusement, le radical acide gras comprend entre 6 et 24 atomes de carbone, entre 7 et 24 atomes de carbone, entre 8 et 24 atomes de carbone, entre 9 et 24 atomes de carbone, entre 10 et 24 atomes de carbone, de préférence entre 11 et 24 atomes de carbone, de préférence entre 11 et 20 atomes de carbone.
Selon un mode de réalisation particulier, le radical R peut être représenté par la formule générale suivante :
dans laquelle o la ligne ondulée*^ représente le point d’attachement à -xOy- o Cy est tel que défini ci-dessus et o Ra représente H ou une chaine carbonée comprenant entre 1 et 22 atomes de carbone, ladite chaine étant linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, optionnellement interrompue par un ou plusieurs atomes de soufre, optionnellement encore pouvant comprendre un ou plusieurs substituant(s)
choisi(s) parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, le groupe amine, le groupe nitrosyle, et le groupe thiol, o Rb représente une chaine carbonée comprenant entre 1 et 22 atomes de carbone, ladite chaine étant linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, optionnellement interrompue par un ou plusieurs atomes de soufre, optionnellement encore pouvant comprendre un ou plusieurs substituant(s) choisi(s) parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, le groupe amine, le groupe nitrosyle, et le groupe thiol, o étant entendu que la somme des atomes de carbone compris dans les deux radicaux Ra et Rb est comprise entre 2 et 22, et de préférence entre 4 et 22.
De préférence, Ra représente H (cas où Cy est le carbone à l’extrémité omega du radical acide gras) ou une chaine carbonée linéaire, optionnellement interrompue par un ou plusieurs atomes de soufre, optionnellement encore pouvant comprendre un ou plusieurs substituant(s) choisi(s) parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, le groupe amine, le groupe nitrosyle, et le groupe thiol (cas où Cy est un carbone positionné le long de la chaine carbonée du radical acide gras) et Rb représente une chaine carbonée linéaire, optionnellement interrompue par un ou plusieurs atomes de soufre, optionnellement encore pouvant comprendre un ou plusieurs substituant(s) choisi(s) parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, le groupe amine, le groupe nitrosyle, et le groupe thiol.
Selon un mode de réalisation particulier, la chaine carbonée du radical acide gras est linéaire, c’est-à-dire que Cy est le carbone à l’extrémité omega du radical acide gras. Dans ce mode de réalisation, Ra représente H et Rb représente une chaine carbonée linéaire comprenant entre 2 et 22 atomes de carbone et de préférence entre 4 et 22 atomes de carbone, optionnellement interrompue par un ou plusieurs atomes de soufre, optionnellement encore pouvant comprendre un ou plusieurs substituant(s) choisi(s) parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, le groupe amine, le groupe nitrosyle, et le groupe thiol.
Selon un mode de réalisation préféré, lorsque le radical acide gras comprend un substituant amine (groupe NH ou NH2), ce groupe amine ne se situe pas en position a par rapport à la fonction carboxyle.
De préférence, le(s) éventuel(s) substituant(s) de la chaîne carbonée est(sont) choisi(s) parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle ou le groupe thiol, de manière encore préférée parmi le groupe hydroxyle ou thiol.
Typiquement, la chaîne carbonée (ou radical) R comprend optionnellement au plus trois groupes hydroxyles, de préférence au plus trois substituants choisi(s) parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, le groupe amine, le groupe nitrosyle, et le groupe thiol, de préférence choisi(s) parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, et le groupe thiol, de préférence au plus trois substituants. Plus spécifiquement : lorsque la chaîne carbonée comprend entre 4 et 11 atomes de carbone (de préférence entre 6 et 11 atomes de carbone), ladite chaîne carbonée comprend au plus un groupe hydroxyle, de préférence au plus un substituant choisi parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, et le groupe thiol, de préférence au plus un substituant ; lorsque la chaîne carbonée comprend entre 12 et 16 atomes de carbone, ladite chaîne carbonée comprend au plus deux groupes hydroxyles, de préférence au plus deux substituants choisis parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, et le groupe thiol, de préférence au plus deux substituants ; lorsque la chaîne carbonée comprend entre 17 et 24 atomes de carbone ladite chaîne carbonée comprend au plus trois groupes hydroxyles, de préférence au plus trois substituants choisis parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, et le groupe thiol, de préférence au plus trois substituants.
De manière particulièrement avantageuse : i) le radical R peut être représenté par la formule générale suivante :
dans laquelle la ligne ondulée
, Cy, Ra et Rb sont tels que définis ci-dessus (l’un quelconque des modes de réalisation décrits ci-dessus) ; et ii) Raet Rb comprennent à eux deux optionnellement au plus trois groupes hydroxyles (autrement dit, au plus trois groupes hydroxyles sont répartis sur Ra et Rb), de préférence au plus trois substituants choisi(s) parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, le groupe amine, le groupe nitrosyle, et le groupe
thiol, de préférence choisi(s) parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, et le groupe thiol, de préférence au plus trois substituants ; et iii) lorsque Ra ou Rb comprend un substituant amine (groupe NH ou NH2), ce groupe amine ne se situe pas en position a par rapport à la fonction carboxyle.
Dans ce mode de réalisation particulièrement préféré, la caractéristique ii) est de préférence telle que : o lorsque Ra et Rb comprennent à eux deux entre 2 et 9 atomes de carbone (de préférence entre 4 et 9 atomes de carbone), Ra et Rb comprennent à eux deux au plus un groupe hydroxyle, de préférence au plus un substituant choisi parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, et le groupe thiol, de préférence au plus un substituant ; o lorsque Raet Rb comprennent à eux deux entre 10 et 14 atomes de carbone, Ra et Rb comprennent à eux deux au plus deux groupes hydroxyles, de préférence au plus deux substituants choisis parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, et le groupe thiol, de préférence au plus deux substituants ; o lorsque Ra et Rb comprennent à eux deux entre 15 et 22 atomes de carbone Ra et Rb comprennent à eux deux au plus trois groupes hydroxyles, de préférence au plus trois substituants choisis parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, et le groupe thiol, de préférence au plus trois substituants.
Mélange de glycolipides
Dans un mode de réalisation, le procédé selon l’invention permet la préparation d’un mélange de glycolipides selon l’invention. Avantageusement, le mélange contient des glycolipides selon l’invention qui ne diffèrent que par le nombre d’unités glucosyle de leur motif osidique et éventuellement de la nature du lien osidique.
De préférence, le mélange est essentiellement constitué de glycolipides dans lesquels n est compris entre 1 et 7, de préférence n est compris entre 1 et 4, de préférence dans lesquels n égal à 1 , 2 ou 3, de préférence encore dans lesquels n est égal à 1 ou 2. De préférence, le mélange de glycolipides selon l’invention comprend de 70 % à 100 %, de préférence de 90% à 100% en poids de glycolipides selon l’invention dans lesquels n est
compris entre 1 et 7, de préférence n est compris entre 1 et 4, de préférence dans lesquels n égal à 1 , 2 ou 3, de préférence encore dans lesquels n est égal à 1 ou 2, en % en poids relativement au poids total de glycolipides du mélange.
Acides gras hydroxylés
Le procédé selon l’invention est mis en oeuvre avec un acide gras hydroxylé de formule (II) R-yOH (H) dans laquelle
R est un radical acide gras tel que défini dans la formule (I),
-yOH- représente un groupe hydroxylé rattaché à un atome de carbone Cy tel que défini ci-dessus.
Le procédé peut notamment être mis en oeuvre avec trois catégories d’acides gras hydroxylés.
1 ère variante : acide gras hydroxylé sulfanylé
Selon une première variante, le procédé selon l’invention est mis en oeuvre avec un acide gras hydroxylé sulfanylé.
Dans ce mode de réalisation, l’acide gras hydroxylé répond avantageusement à la formule (HA) :
HO-(CH2)b-S-(CH2)a-COOH (HA) dans lequel a est compris entre 9 et 14, b est supérieur ou égal à 2, et avec la somme de a et b inférieure à 23.
L’acide gras hydroxylé de formule (HB) est par exemple l’acide 11-[(2- hydroxyéthyl)sulfanyl]-undécanoique OH-(CH2)2-S-(CH2)IO-COOH.
2ème variante : acide gras hydroxylé en position oméga
Selon une seconde variante, le procédé selon l’invention est mis en oeuvre avec un acide gras hydroxylé en position oméga.
Dans un mode de réalisation, l’acide gras hydroxylé répond à la formule (I IB) :
OH-(CH2)a-COOH (IIB) dans lequel a est compris entre 3 et 23, de préférence entre 10 et 15.
Avantageusement, a est compris entre 11 et 15.
L’acide gras hydroxylé de formule (IIB) est par exemple l’acide 11-hydroxy-undécanoique OH-(CH2)IO-COOH.
3ème variante : Acide gras poly-hydroxylé
Selon une 3ème variante, le procédé selon l’invention est mis en oeuvre avec un acide gras poly-hydroxylé, de préférence choisi parmi un acide gras di-hydroxylé et un acide gras tri- hydroxylé.
De préférence, l’acide gras di-hydroxylé est : un acide gras di-hydroxylé dont la chaine carbonée est substituée par deux groupes hydroxylé positionnés le long de la chaine carbonée, par exemple l’acide 9, 10- dihydroxy-octadécanoique, ou un acide gras di-hydroxylé dont la chaine carbonée est substituée par un groupe hydroxylé positionné le long de la chaine et par un groupe hydroxylé positionné en extrémité oméga de celle-ci.
Avantageusement, l’acide gras tri-hydroxylé est : un acide gras tri-hydroxylé dont la chaine carbonée est substituée par deux groupes hydroxylé positionnés le long de la chaine carbonée et par un groupe hydroxylé en position oméga de celle-ci, par exemple l’acide érythro-aleuritique, ou un acide gras tri-hydroxylé dont la chaine carbonée est substituée par trois groupes positionnés le long de la chaine carbonée, par exemple l’acide 9, 10, 12-trihydroxy- octadécanoique ou l’acide 9,10,12-trihydroxystéarique. g-transglucosylase
Les inventeurs ont, pour la première fois, montré que les a-transglucosylases de la famille GH70 sont capables de catalyser la glucosylation d’acides gras hydroxylés à partir de saccharose.
Les inventeurs ont en outre montré que, de manière inattendue, cette glucosylation est particulièrement efficace lorsque les a-transglucosylase de la famille GH70 mises en oeuvre sont des saccharases de branchement de la famille GH70.
Selon l’invention, le terme « a-transglucosylase » désigne une enzyme capable de polymériser des unités glucosyle selon des liaisons a, en catalysant le transfert d'une unité glucosyle depuis un sucre donneur de glucosyle vers un composé accepteur hydroxylé.
Selon l’invention, l’expression « de la famille GH70 », relatif à l’a-transglucosylase, signifie que l’a-transglucosylase selon l’invention appartient à la famille 70 des glycosidehydrolases selon la classification Q Z (www.cazy.org). CAZy, de l'anglais « Carbohydrate-Active enZYmes » (abrégé « CKZ\/ »), est une base de données bioinformatique de classification des enzymes actives sur les sucres i.e. capables de catalyser leur dissociation ou leur synthèse selon des homologies de séquences ou de structure, en particulier de leurs modules catalytiques et de liaison aux glucides. Dans la classification CAZy, le groupe des glycoside-hydrolases (GH) compte 173 familles composées d’enzymes actives sur les sucres capables de catalyser des réactions d’hydrolyse de liaisons glycosidique ou de transglucosylation.
Les a-transglucosylases de la famille GH70 sont typiquement produites de façon naturelle par des bactéries lactiques des genres Streptococcus, Leuconostoc (abrégé « L. »), Weisella, Oenococcus ou Lactobacillus (abrégé « Lb. »).
Les a-transglucosylases de la famille GH70 selon l’invention sont actives sur le saccharose, ce qui signifie que les a-transglucosylases selon l’invention utilisent spécifiquement le saccharose ou un de ses analogues comme donneur de glucosyle.
Avantageusement, les analogues de saccharose sont des composés de formule (I) : X-a-D-glucopyranosyl (I) dans laquelle X représente soit un groupe partant LG ou une unité osidique activée en particulier choisie parmi le O-p-D-galactopyranosyl-(1 — >4)-p-D-fructofuranosyl-(2— >1 ) et a- L-sorbofuranoside.
Selon la présente invention, le groupe LG représente un groupement chimique qui peut être facilement déplacé par un nucléophile lors d’une réaction de substitution nucléophile, le nucléophile étant plus particulièrement un groupement issu de l’a-transglucosylase de
la famille GH70. Un tel groupe partant peut être plus particulièrement un atome d’halogène tel qu’un atome de chlore, de brome ou de fluor, un groupe tosylate (-OS(O)2-(p-Me-CeH4)), ou un groupe aromatique éventuellement substitué, notamment un groupe -O-C6H5-NO2
(de préférence p-nitrophenyl ou o-nitrophenyl), un groupe 4-Méthylumbelliféryle
groupe résorufine (groupe phénoxazine 3-one substitué en position 7) ou un groupe
Au sens de la présente invention, un groupe « aromatique » s’entend d’un groupe aryle ou hétéroaryle optionnellement substitué, de préférence par 1 à 2 substituants, notamment choisis parmi un groupe nitro (-NO2), un halogène, un groupement alkyle en C1-C4 ou un aryle optionnellement substitué.
Par « aryle », on entend, au sens de la présente invention, un groupement hydrocarboné aromatique, comportant de préférence de 6 à 14 atomes de carbone, et comprenant un ou plusieurs cycles accolés, par exemple un groupement phényle ou naphtyle. Avantageusement, il s’agit du phényle.
Par « hétéroaryle » ou « hétéroaromatique », on entend, au sens de la présente invention, un groupe aromatique comprenant 5 à 14 atomes cycliques dont un ou plusieurs hétéroatomes, avantageusement 1 à 4 et encore plus avantageusement 1 ou 2, tels que par exemple des atomes d’azote ou d’oxygène, les autres atomes cycliques étant des atomes de carbone. Des exemples de groupes hétéroaryle sont les groupes indyle, umbelliféryle ou résorufine.
Par « halogène », on entend, au sens de la présente invention, les atomes de fluor, de chlore, de brome et d’iode. De préférence, il s’agit d’un atome de chlore ou de fluor.
Par groupement « alkyle en (C1-C4) », on entend, au sens de la présente invention, une chaîne hydrocarbonée monovalente saturée, linéaire ou ramifiée, comportant 1 à 4 atomes de carbone, et de préférence un méthyle.
Un aryle est préférentiellement substitué par un ou deux substituants de préférence choisis parmi un groupe nitro (-NO2), un halogène, un groupement alkyle en C1-C4 et/ou un groupe -C(O)-hétéroaryle, tel qu’un groupe 2-acyl-N-méthylpyrrole.
Ainsi, les analogues de saccharose peuvent notamment être choisis dans le groupe comprenant le fluorure d’a D-glucopyranosyle (en anglais « a-D-glucopyranosyl fluoride »), le O-p-D-galactopyranosyl-(1 — >-4)-p-D-fructofuranosyl-(2— >1 )-a-D-glucopyranoside (en anglais « Lactulosucrose »), le p-nitrophenyl a-D-glucopyranoside, le a-D-glucopyranosyl a-L-sorbofuranoside, le 4-Méthylumbelliferyl a-D-glucosaminide (ou 4-méthylumbelliferyl 2-Amino-2-déoxy-a-D-glucopyranoside, n° CAS [137687-00-4]), le résorufin a-D- glucopyranoside (n° CAS : [136565-96-3]), I’ Aldol® 484 alpha-D-glucopyranoside (n° CAS : [2484872-56-0]) et leurs mélanges. Les analogues de saccharose peuvent en particulier être choisis dans le groupe comprenant le fluorure d’a D-glucopyranosyle (en anglais « a-D-glucopyranosyl fluoride »), le O-p-D-galactopyranosyl-(1 ^4)-p-D- fructofuranosyl-(2— >1 )-a-D-glucopyranoside (en anglais « Lactulosucrose »), le p- nitrophenyl a-D-glucopyranoside, le a-D-glucopyranosyl a-L-sorbofuranoside et leurs mélanges.
Le saccharose est préféré car ce substrat est biosourcé et bon marché.
Avantageusement, l’a-transglucosylase de la famille GH70 est une saccharase de branchement de la famille GH70, une glucane-saccharase de la famille GH70, ou un mélange de celles-ci.
Dans le présent document, les termes « saccharase de branchement de la famille GH70 » (en anglais « branching sucrase », parfois abrégé BRS) ou « a-transglucosylase de la famille GH70 à activité de branchement » ou « enzyme de branchement de la famille GH70 » sont utilisées indifféremment et se réfèrent à une a-transglucosylase de la famille GH70 capable de catalyser l’ajout d’unités glucosyle dans la chaine principale d’un glucane de type dextrane pré-existant formant des branchements (ou autrement dit des ramifications). La nature de la liaison de branchement (liaisons a-1 ,2 ; a-1 ,3 ; a-1 ,4 ou a-
1 ,6) et la longueur des chaînes d’unités glucosyle constituant les branchements varient selon la spécificité de la saccharase de branchement considérée.
De préférence, la saccharase de branchement de la famille GH70 a pour séquence d’acides aminés une séquence choisie dans le groupe comprenant GBD-CD2 AN123 (SEQ ID NO : 1 ), BRS-A (SEQ ID NO : 2), BRS-B A1 (SEQ ID NO : 3), BRS-C (SEQ ID NO : 4), BRS-D A1 (SEQ ID NO : 5), BRS-E A1 (SEQ ID NO : 6) , ou une séquence d’acides aminés présentant au moins 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % d’identité de séquence avec au moins l’une des séquences SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 6.
Les inventeurs ont en outre montré que des mutants de GBD-CD2AN123 (SEQ ID NO : 1 ) étaient particulièrement efficaces pour la glucosylation d’acides gras hydroxylés. De manière préférée, la saccharase de branchement de la famille GH70 est un mutant de GBD-CD2AN123 (SEQ ID NO :1 ) ayant une séquence d’acides aminés choisie parmi GBD- CD2 AN123 W2135L F2136L (SEQ ID NO :7), GBD-CD2 AN123 W2135L (SEQ ID NO : 8), GBD-CD2 AN123 W2135I F2136Y (SEQ ID NO: 9), GBD-CD2 AN123 W2135I F2136C (SEQ ID NO : 10), GBD-CD2 AN123 W2135V (SEQ ID NO : 11 ) , ou une séquence d’acides aminés présentant au moins 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % d’identité de séquence avec au moins l’une des séquences SEQ ID NO : 7 à SEQ ID NO : 11.
Dans le présent document, l’expression « glucane-saccharase de la famille GH70 » parfois abrégée « GS » se réfère à une a-transglucosylase de la famille GH70 capable de catalyser la synthèse d’a-glucanes i.e. de polysaccharides composés exclusivement d’unités glucosyle liées entre elles par des liaisons a. Parmi les glucane-saccharases, on peut citer les dextrane-saccharases (parfois abrégé DSR), qui synthétisent des dextranes, i.e. des glucanes dont les résidus de la chaine principale sont liés majoritairement en a- 1 ,6 ; les reuterane-saccharases, qui synthétisent des reuteranes, i.e. des glucanes dont les résidus de la chaine principale sont liés en a-1 ,4 et a1 ,6 ; les mutane-saccharases, qui synthétisent des mutanes, i.e. des glucanes dont les résidus de la chaine principale sont liés majoritairement en a-1 ,3 ; des alternane-saccharase, i.e. des glucanes dont les résidus de la chaine principale sont liés alternativement en a-1 ,3 et a-1 ,6.
De préférence, la glucane-saccharase de la famille GH70 a pour séquence d’acides aminés une séquence choisie dans le groupe comprenant DSR-OK (SEQ ID NO : 12), DSR-M DP (SEQ ID NO : 13), DRS-S vardelA4N (SEQ ID NO : 14), ASR Cdelbis-Athio (SEQ ID NO : 15), GTF-SI (SEQ ID NO : 16), GTF-J (SEQ ID NO : 17), DSR-M A1 (SEQ ID NO : 18), ou une séquence d’acides aminés présentant au moins 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % d’identité de séquence avec au moins l’une des séquences SEQ ID NO : 12 à SEQ ID NO : 18.
Tel qu'utilisé ici, le terme « identité de séquence » ou « identité » se réfère au nombre (%) d'appariements (résidus d'acides aminés identiques) aux positions provenant d'un alignement de deux séquences polypeptidiques. L'identité de séquence est déterminée en comparant les séquences lorsqu'elles sont alignées de manière à maximiser le chevauchement et l'identité tout en minimisant les interruptions de séquence. En particulier, l'identité de séquence peut être déterminée en utilisant l'un quelconque des nombreux algorithmes d'alignement global ou local, en fonction de la longueur des deux séquences. Des séquences de longueurs similaires sont de préférence alignées en utilisant des algorithmes d'alignement global (e.g. Néedleman & Wunsch, J. Mol. Biol 48:443, 1970) qui alignent les séquences de manière optimale sur toute la longueur, tandis que des séquences de longueurs sensiblement différentes sont de préférence alignées en utilisant un algorithme d'alignement local, par exemple l'algorithme de Smith et Waterman (Smith et Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981 ) ou l'algorithme d'AltschuI (Altschul et al (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 ; Altschul et al (2005) FEBS J. 272:5101-5109). L'alignement dans le but de déterminer le pourcentage d'identité de séquence d'acides aminés peut être réalisé par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple en utilisant un logiciel disponible sur des sites Internet tels que http: //blast. ncbi.nlm. nih.gov / ou http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/. L'homme de l'art peut aisément déterminer les paramètres appropriés pour mesurer l'alignement. Aux fins de la présente invention, les valeurs de pourcentage d'identité de séquence d'acides aminés désignent des valeurs générées en utilisant le programme « Protein BLAST » (ou Blastp) dans lequel les paramètres sont les paramètres par défaut (seuil attendu (en anglais « Expect threshold ») : 10, Taille de mot (en anglais « Word size » : 6, Matrice (en anglais « Matrix ») = BLOSUM62, Coûts d’écarts (en anglais « Gap Costs ») : Existence = 11 , Extension = 1 , Ajustement conditionnel de la matrice des scores de composition (en anglais « Conditional compositional score matrix adjustment »).
Mise en œuyre du procédé
Dans un mode de réalisation, l’étape i) est effectuée en solution à un pH contrôlé, en particulier par l’emploi d’une solution tampon.
Avantageusement, l’étape i) est conduite à une valeur de pH comprise entre 5 et 8.
L’étape i) est avantageusement conduite avec une concentration initiale de saccharose ou d’un analogue de saccharose comprise entre 100 et 650 g.L'1.
L’étape i) est de préférence réalisée avec un rapport molaire saccharose ou analogue de saccharose : acide gras hydroxylé de formule (II) compris entre 1 et 100, de préférence entre 10 et 100.
De préférence, l’étape i) est mise en œuvre à une température comprise entre 10°C et 80°C.
Avantageusement, l’étape i) est conduite avec une a-transglucosylase de la famille GH70 en solution, en suspension ou immobilisée.
Lorsqu’un mélange de glycolipide est obtenu à l’issue de l’étape (i), le procédé peut en outre comprendre une étape ii) de purification d’un ou plusieurs glycolipide(s) de formule (I).
Glycolipide
Un deuxième objet selon l’invention concerne un glycolipide de formule (I) tel que défini au premier objet selon l’invention.
Les glycolipides selon l’invention présentent l’avantage d’être biodégradables.
Avantageusement, le glycolipide du deuxième objet selon l’invention est un glycolipide dans lequel n est supérieur ou égal à 2, de préférence est compris entre 2 et 7, de préférence encore est compris entre 2 et 4.
Avantageusement, le glycolipide du deuxième objet selon l’invention est un glycolipide dans lequel le radical acide gras comprend au moins 6, 7, 8, 9, 10, ou 11 atomes de carbone. Avantageusement, le radical acide gras comprend entre 10 et 24 atomes de carbone, de préférence entre 11 et 24 atomes de carbone, de préférence entre 11 et 20 atomes de carbone.
1ère variante : glycolipide comprenant une chaîne carbonée sulfanylée
Selon une première variante, le glycolipide comprend une chaîne carbonée sulfanylée. Dans ce mode de réalisation, le glycolipide répond avantageusement à la formule (IA) : [Glc]n-xOy-(CH2)b-S-(CH2)a-COOH dans lequel a est compris entre 9 et 14 b est supérieur ou égal à 2 la somme de a et b est inférieure à 23.
Avantageusement, le glycolipide de formule (IA) répond à la formule [Glc]n-xOy-(CH2)2-S-(CH2)io-COOH
2ème variante : Glycolipide comprenant une chaîne carbonée de type alkyl
Dans une seconde variante selon l’invention, le glycolipide de formule (I) comprend une chaîne carbonée de type alkyl, avantageusement de type alkyl linéaire.
Dans ce mode de réalisation, le glycolipide de formule (I) répond avantageusement à la formule (IB) :
[Glc]n-xOy-(CH2)a-COOH (IB) dans lequel a est compris entre 3 et 23, de préférence entre 10 et 15.
Avantageusement, le glycolipide de formule (IB) répond à la formule [Glc]n-xOy-(CH2)io- COOH.
3ème variante : Glycolipide comprenant une chaîne carbonée hydroxylée
Dans une troisième variante selon l’invention, le radical acide gras est substitué par un ou deux groupes hydroxyle.
Dans ce mode de réalisation, le glycolipide de formule (I) est de préférence un glycolipide dans lequel : l’atome de carbone Cy est un atome de carbone positionné à l’extrémité oméga, et la chaine carbonée du radical acide gras est substituée par un ou deux groupes hydroxyle positionnés le long de la chaine carbonée, ou l’atome de carbone Cy est un atome de carbone positionné le long de la chaine carbonée, et la chaine carbonée du radical acide gras est substituée par deux groupes hydroxyle, avec un groupe hydroxyle positionné le long de la chaine carbonée et un groupe hydroxyle positionné en position oméga de celle-ci, ou avec deux groupes hydroxyle positionnés le long de la chaine carbonée.
Utilisation du glycolipide à titre d’agent antimicrobien
Les inventeurs ont découvert que le glycolipide selon l’invention présente des propriétés antimicrobiennes, en particulier des propriétés antibactériennes.
L’invention a donc également pour objet l’utilisation du glycolipide tel que défini ci-dessus à titre d’agent antimicrobien, notamment à titre d’agent antibactérien.
Au sens selon l’invention, le terme « agent antimicrobien » désigne un composé apte à détruire des microbes (i.e. un agent microbiocide) ou à ralentir leur croissance (i.e. agent microbiostatique). Par « microbe », on entend des virus ou des micro-organismes unicellulaires ou pluricellulaires.
A titre d’exemple, le glycolipide selon l’invention peut être utilisé en tant qu’agent conservateur qui inhibent le développement des micro-organismes et permettent d'accroître la durée de conservation de produits, en particulier dans le domaine cosmétique, pharmaceutique, ou alimentaire.
Utilisation du glycolipide à titre d’agent tensioactif
Les inventeurs ont également découvert que le glycolipide selon l’invention peut également être utilisé à titre d’agent tensioactif, en particulier à titre d’agent émulsifiant.
L’invention a donc également pour objet l’utilisation du glycolipide tel que défini ci-dessus à titre d’agent tensioactif, notamment à titre d’agent émulsifiant.
Au sens selon l’invention, un agent tensioactif est une substance modifiant la tension superficielle entre deux surfaces ; un agent émulsifiant est un agent tensioactif qui facilite la formation d'une émulsion, ou améliore sa stabilité en diminuant son taux d'agrégation et/ou de coalescence.
En particulier, le glycolipide selon l’invention peut être utilisé en tant qu’émulsifiant pour la préparation d’une émulsion huile-dans-eau.
Au sens selon l’invention, une émulsion huile-dans-eau comprend une phase huileuse dispersée au sein d'une phase aqueuse, et une émulsion eau-dans-huile comprend une phase aqueuse dispersée au sein d'une phase huileuse.
Les inventeurs ont découvert que, de manière étonnante, lorsqu’un glycolipide selon l’invention est utilisé comme agent émulsifiant pour la préparation d’une émulsion huile- dans-eau, cette émulsion est sensible au pH, plus particulièrement que celle-ci est cinétiquement stable tant que le pH de la phase aqueuse de l’émulsion est supérieur à un potentiel hydrogène seuil pHs, et qu’elle se déstabilise lorsque ce pH est ajusté de manière à être inférieur au pHs.
Emulsion sensible au pH
Un autre objet selon l’invention est donc une émulsion huile-dans-eau comprenant une phase huileuse dispersée dans une phase aqueuse et au moins un glycolipide de formule (I), caractérisée en ce que l’émulsion est stable lorsque le pH de la phase aqueuse est supérieur à un potentiel hydrogène seuil pHs.
Dans la présente invention, l’expression « cinétiquement stable tant que le pH de la phase aqueuse de l’émulsion est supérieur à un potentiel hydrogène seuil pHs » signifie que le pH de la phase aqueuse de l’émulsion doit être supérieur à pHs pour que l’émulsion soit stable.
Avantageusement, le pHs correspond au pKa du glycolipide selon l’invention utilisé comme émulsifiant. Dans le cas où l’émulsion comprend un mélange de glycolipides selon l’invention, pHs correspond avantageusement au pKa du mélange de glycolipides selon l’invention.
De préférence, le potentiel hydrogène seuil pHs va de 2 à 5, et de préférence de 2 à 4, et de préférence encore est de 4 environ.
Lorsque le pH de la phase aqueuse de l’émulsion est inférieur au pHs tel que décrit ci- dessus, l’émulsion se déstabilise en quelques minutes, typiquement de 5 à 20 minutes, et est complètement détruite en quelques heures, typiquement de 2 à 24h.
Dans un mode de réalisation, l’émulsion comprend un mélange de glycolipides selon l’invention tel que décrit-ci-dessus.
Sans vouloir être liés par une théorie particulière, les inventeurs pensent que l’instabilité des émulsions observée pour des pH faibles traduit l’existence d’une composante électrostatique forte dans la stabilisation des émulsions par les glycolipides selon l’invention.
Nature et quantité des phases huileuse et aqueuse
De préférence, la phase aqueuse représente avantageusement au moins 50 % en poids de l'émulsion, par rapport au poids total de l'émulsion. De préférence, l'émulsion selon l'invention comprend au moins 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, ou 85 % en poids de phase aqueuse, relativement au poids total de l'émulsion.
La quantité de phase aqueuse dans l'émulsion selon l'invention est comprise notamment entre 50 à 80 % en poids, de préférence entre 50 à 70 % en poids, et plus préférentiellement entre 50 à 60 % en poids par rapport au poids total de l'émulsion.
Avantageusement, la phase aqueuse représente entre 50 et 70 % en poids de l'émulsion.
La phase aqueuse de l'émulsion selon l'invention comprend principalement de l'eau, un glycolipide ou un mélange de glycolipides selon l’invention et éventuellement un ou plusieurs composés miscibles à l'eau.
De préférence, la phase aqueuse comprend, en % en poids de phase aqueuse, de 0,5 à 5 %, de préférence de 0,5 à 3 %, de préférence encore de 1 à 3 % d’un glycolipide ou d’un mélange de glycolipides selon l’invention.
La phase aqueuse peut comprendre aussi des espèces ioniques, des régulateurs de pH, des principes actifs, des conservateurs, ou encore des colorants, lesdits principes actifs, conservateurs et colorants sont hydrosolubles ou hydrodispersibles.
La phase huileuse de l'émulsion selon l'invention est une phase grasse comprenant au moins un corps gras choisi parmi les corps gras liquides à température ambiante (20-25°C) ou huiles, volatiles ou non, d'origine végétale, minérale ou synthétique, et leurs mélanges. On entend par « huile » un corps gras liquide à la température ambiante (25°C). La phase huileuse peut comprendre aussi tout additif liposoluble ou lipodispersible.
Pour une application dans le domaine cosmétique ou pharmaceutique, ces huiles sont choisies parmi des huiles physiologiquement acceptables.
Comme huiles utilisables dans l’émulsion selon l’invention, on peut citer par exemple les huiles hydrocarbonées d'origine animale ; les huiles hydrocarbonées d'origine végétale ; les esters et les éthers de synthèse, notamment d'acides gras ; les hydrocarbures linéaires ou ramifiés, d'origine minérale ou synthétique, tels que les huiles de paraffine, volatiles ou non, et leurs dérivés ; les huiles fluorées partiellement hydrocarbonées et/ou siliconées ; les huiles de silicone ; et leurs mélanges.
Parmi les hydrocarbures de formule brute CnHm avec n et m étant deux chiffres entiers, les hydrocarbures linéaires, aromatiques et cycliques peuvent être utilisés, et ce quel que soit leur point d'ébullition. On citera plus particulièrement comme hydrocarbure pouvant être présent dans la phase huileuse selon l’invention le cyclopentane (C5H10), l'hexane (C6H14), le méthylcyclohexane (C7H14), l'heptane (C7H16), le décane (C10H22), le dodécane (C12H26), l’hexadécane (C16H34), et le toluène (C7H8).
La phase huileuse dans l'émulsion selon l'invention pourra être composée d'une seule huile, en particulier d'un seul hydrocarbure, ou pourra également être constituée d'un mélange de deux, trois voire quatre huiles différentes.
Dans l’émulsion, la phase huileuse se présente typiquement sous la forme de gouttes de phase huileuse en suspension dans la phase aqueuse.
Les gouttes de phase huileuse sont de préférence monodisperses.
La distribution granulométrique des gouttes de phase huileuse peut être caractérisée en termes de diamètre moyen des gouttes en volume, D(4,3), et de polydispersité en taille, P, définis par :
où Ni est le nombre de gouttes de diamètre Di, et Dm est le diamètre médian (diamètre qui divise la distribution en deux parties d'aires égales).
La mesure du diamètre médian des gouttes peut s'effectuer à partir d'un histogramme de taille obtenu par mesure des diamètres individuels d'une assemblée de gouttes (minimum 500) sur un ou plusieurs clichés pris en microscopie optique ou bien par mesure de diffusion statique de la lumière.
Les gouttes de phase huileuse présentent avantageusement un diamètre moyen en volume de l’ordre de quelques micromètres. Ainsi, les gouttelettes présentent généralement un diamètre moyen en volume compris entre 2 et 10 pm, de préférence entre 3 et 6 pm, de préférence encore entre 4 et 5 pm.
Emulsion sèche
Les inventeurs ont également montré que l’émulsion selon l'invention peut être soumise à un traitement pour réaliser une émulsion sèche, le traitement consistant à éliminer la majorité ou la totalité de la phase aqueuse de l’émulsion selon l’invention par séchage ou lyophilisation.
Un objet selon l’invention concerne donc une émulsion selon l’invention sous la forme d’une émulsion sèche.
Au sens selon l’invention, une émulsion sèche se présente sous la forme d’une poudre constituée de particules huileuses capables de redonner une émulsion huile-dans-eau après réhydratation, c’est-à-dire après dispersion de l’émulsion sèche dans une phase aqueuse. Les expressions « émulsion sous la forme d’une émulsion sèche » et « émulsion sèche » sont utilisées de manière interchangeable.
De préférence, l’émulsion sèche comprend des gouttes de phase huileuse, un glycolipide selon l’invention et moins de 20 %, de préférence moins de 10 % en poids de phase aqueuse, relativement au poids total de l'émulsion sèche. Avantageusement, l’émulsion sèche comprend au plus 1 , ou 2 % en poids de phase aqueuse, relativement au poids total de l'émulsion sèche. Avantageusement encore, l’émulsion sèche est dépourvue de phase aqueuse.
Les gouttes de phase huileuses ont une taille moyenne de l’ordre de 4 pm.
Selon un mode préférentiel, les émulsions sèches selon l’invention contiennent un composé saccharidique protecteur, notamment choisi dans le groupe constitué du saccharose, du lactose, du fructose, du tréhalose, des dextrines, des maltodextrines, des dextrines jaunes, des sucres invertis, du sorbitol, du polydextrose, du sirop d'amidon, du sirop de glucose et de leurs mélanges. De préférence, le composé saccharidique protecteur est le lactose.
L’émulsion sèche est avantageusement obtenue en congelant une émulsion selon l’invention, typiquement à une température comprise entre -50°C et -100°C et en la lyophilisant.
Procédé de préparation d'une émulsion
L’invention concerne également la préparation d’une émulsion selon l’invention, comprenant : a) préparation d’une phase aqueuse et d’une phase huileuse, dans lequel la phase huileuse et/ou la phase aqueuse comprend le glycolipide selon l’invention ; b) combinaison de la phase aqueuse et de la phase huileuse et agitation jusqu’à obtenir une émulsion.
De préférence, la phase huileuse et/ou la phase aqueuse comprend le glycolipide selon l’invention selon un ratio massique phase aqueuse/glycolipide compris entre 60 et 10.
De préférence, la phase aqueuse de l’étape a) comprend, en % en poids de phase aqueuse, de 0,5 à 5 %, de préférence de 0,5 à 3 %, de préférence encore de 1 à 3 % en glycolipide selon l’invention. Dans un mode de réalisation, la phase huileuse ne comprend pas de glycolipide selon l’invention.
Lors de l’étape a), le pH de la phase aqueuse est de préférence ajusté de sorte à être supérieur au pKa du glycolipide selon l’invention.
La combinaison de la phase huileuse et de la phase aqueuse se fait dans l'ordre le plus approprié, comme cela est connu par l'homme du métier. Dans un mode de réalisation particulier, l’étape b) est menée en ajoutant la phase huileuse à la phase aqueuse tout en agitant la combinaison obtenue.
Utilisation de l’émulsion pour le nettoyage de surfaces
Un autre objet selon l’invention concerne l’utilisation d’une émulsion selon l’invention pour le nettoyage de surfaces.
En effet, de manière étonnante, les inventeurs ont découvert que lorsqu’une goutte d’émulsion selon l’invention est déposée sur un substrat solide, tel qu’une lame de verre, ou un support plastique, celle-ci se déplace, s’étale et se contracte de façon spasmodique et quasi-périodique sur le support. Ceci confère à l’émulsion d’être auto-étalable ou bien encore auto-agitée, ce qui présente un intérêt dans le domaine du nettoyage des surfaces.
Sans vouloir être liés par une théorie particulière, les inventeurs attribuent ces propriétés à des phénomènes convectifs se déroulant au sein de la goutte d’émulsion.
EXEMPLES
Enzymes étudiées, organismes d’origine et spécificité
Tableau 1 : a-transglucosylases GH70, spécificité de liaisons lors de la synthèse du polymère naturel. P : polymérase i.e. glucane-saccharase GH70 ; B : saccharase de branchement GH70 (« Branching sucrase » en anglais) ; nd= non déterminé L’origine des enzymes du Tableau 1 sont listées dans le Tableau 2.
Tableau 2 : Organismes d’origine des a-transglucosylases GH70
Expression hétérologue des enzymes chez Escherichia Coli
Les gènes codant pour les enzymes citées ci-dessus sont clonés dans des vecteurs permettant l’expression recombinante chez E. coli (voir Tableau 3).
Les enzymes recombinantes sont produites à partir des cellules d’E. coli BL21 Star DE3 (SEQ ID NO 18, 13, 1 , 3, 4, 5, 6, 16 et 17), BL21 Al DE3 (SEQ ID NO 12, 14, et 2) ou Top 10 (SEQ ID NO : 15) transformées avec le plasmide contenant le gène des enzymes ciblées (voir Tableau 3).
Tableau 3 : Plasmides des enzymes utilisées et systèmes d’expression adaptés aux différentes enzymes. (Gly : Glycérol ; Glu : Glucose ; a-Lac : a-Lactose ; L-Ara : L- Arabinose)
Trois cents microlitres du mélange de transformation permettent d’ensemencer un volume de 30 mL de LB (Lysogeny Broth), supplémenté avec 100 pg.mL'1 d’ampiciline. Le milieu est mis à incuber sur la nuit à 37°C afin de préparer une préculture. Des cultures d’1 L en milieu ZYM5052 modifié (Studier, 2005) dont les caractéristiques sont présentées dans le Tableau 3 sont ensemencées à une DOx=6oonm initiale de 0,05 à partir de la préculture de la veille, puis mises à incuber 26 heures à 21 °C et à 150 rpm.
En fin de fermentation, les milieux de culture sont centrifugés (15 min, 6500 rpm, 4°C) et les culots sont concentrés à une DOx=6oonm de 80 dans du tampon d’activité (voir Tableau 3). Les cellules sont alors cassées aux ultrasons selon le protocole suivant : 5 cycles de 20 secondes à 30 % de la puissance maximale de la sonde, à froid, espacés de 4 minutes de repos dans la glace. Les surnageants de sonication contenant les enzymes d’intérêt solubles sont ensuite récupérés après 30 minutes de centrifugation (10 000 rpm, 10°C) et conservés à 4°C.
Détermination de l’activité des enzymes par dosage des sucres réducteurs au DNS.
L’activité enzymatique est déterminée en mesurant la vitesse initiale de production des sucres réducteurs à l’aide de la méthode à l’acide 3,5-dinitrosalicylique (DNS) (Miller, 1959).
Une unité enzymatique représente la quantité d’enzyme qui libère une pmole de fructose par minute, à 30 °C, à partir de 100 g.L'1 de saccharose dans 50 mM de tampon acétate de sodium, pH 5,75. L’activité est déterminée par mesure de la vitesse initiale de production des sucres réducteurs à l’aide de la méthode à l’acide 3,5-dinitrosalicylique (DNS).
Au cours d’une cinétique, 100 pL de milieu réactionnel sont prélevés et la réaction est stoppée par ajout d’un volume équivalent de DNS. Les échantillons sont ensuite chauffés 5 min à 95°C, refroidis dans la glace, dilués au demi dans de l’eau, et l’absorbance est lue à 540 nm. Une gamme étalon de 0 à 2 g.L'1 de fructose permet d’établir le lien entre valeur d’absorbance et concentration en sucres réducteurs.
Exemple 1 : Criblage des enzymes en réaction d’accepteur avec différents acides gras hydroxy lés
1.1. Matériel et méthodes
Conditions réactionnelles
Les réactions d’accepteurs sont réalisées en microtubes coniques, dans un volume de 1 mL. Le criblage des enzymes de la famille 70 des GH a été réalisé dans les conditions suivantes :
- [saccharose]o = 292 mM (100 g.L'1)
- [acide gras hydroxylé]o = 10 mM,
- 10% v/v de DMSO
- tampon acétate de sodium 50 mM à pH=5,75
- activité enzymatique : 1 U.mL'1
- température : 30°C
- agitation : 800 rpm
L’acide gras hydroxylé est initialement dissous dans 100% DMSO.
Les acides gras hydroxylés (ci-après AGH) testés sont respectivement : un acide gras hydroxylé sulfanylé : acide 11-[2-[hydroxy-alkyl)-sulfanyl]- undécanoique (ci-après AHESll) un acide gras co-hydroxylé : acide 11 hydroxyundécanoique (ci-après AHIID) un acide gras poly-hydroxylé : l’acide érythro-aleuritique (ci-après AEA)
La concentration finale en DMSO dans le milieu réactionnel est de 10 % (v/v). La réaction est initiée par l’addition d’un volume de lysat cellulaire suffisant pour obtenir une activité enzymatique en réaction de 1 U.mL'1. Les réactions sont incubées à 30°C et agitées à 800 rpm grâce à un Eppendorf ThermoMixer C. Au bout de 24h, les enzymes ont été dénaturées à 95°C pendant 5 min.
Techniques analytiques
En vue de leurs analyses par CLHP, les milieux réactionnels sont dilués au demi dans de l’éthanol absolu. Cette dilution permet entre autres l’élimination par précipitation des potentiels polymères de haute masse moléculaire.
La séparation des accepteurs lipidiques et de leurs formes glucosylées, est effectuée en phase inverse avec une colonne Synergi™ Fusion-RP (porosité de 80 Â, granulométrie de 4 pm, greffage C18 avec terminaison polaire, Phenomenex, USA). Cette colonne est maintenue à 30°C sur un système CLHP Thermo U3000 couplé à un détecteur Corona CAD Véo (Charged Aerosol Detector) (Thermo Scientific, USA). La température de nébulisation est fixée à 50°C et le filtre maintenu à 3,2 secondes.
La phase mobile est composée d’un mélange eau ultrapure (solvant A) / acétonitrile de qualité CLHP (solvant B) contenant chacun 0,05% (v/v) d’acide formique. L’élution est réalisée à un débit de 1 mL.min'1 selon le gradient suivant :
Entre 0 min et 5 min, une première phase d’élution à 0% (v/v) de la voie B permet l’élimination des sucres simples résiduels (fructose, glucose, leucrose, et saccharose résiduels ou éventuels oligosaccharides courts),
Une seconde phase d’élution isocratique à un pourcentage de 35% de la voie B est réalisée pendant 25 minutes pour séparer les différents composés lipidiques glucosylés,
Une dernière phase de 10 minutes à 75 % de la voie B permet la régénération de la colonne.
Taux de conversion de l’accepteur
La capacité des enzymes à glucosyler un accepteur, ici AHESU, AHUD ou AEA, est déterminée grâce à la mesure du taux de conversion de l’accepteur entre le début et la fin de la réaction. Le taux de conversion est calculé comme suit :
[Math. 1]
où Accepteur est le taux de conversion de l’accepteur, [Accepteur^ sa concentration initiale et [Accepteur^ sa concentration finale.
1.2. Résultats
Glucosylation de l’AHESU
La Figure 1 illustre la capacité des enzymes à glucosyler l’AHESU dans les conditions énoncées ci-dessus.
Les enzymes de la famille 70 des GH testées se sont révélées actives sur AHESU.
Les enzymes de branchement BRS-A, BRS-B A1 , BRS-B, BRS-E A1 et GBD-CD2 AN123 se sont révélées particulièrement actives. En effet, des taux de conversion allant de 20 % à des taux supérieurs à 80% dans les conditions de crible testées ont été obtenus avec ces enzymes.
Glucosylation de AHIID
La Figure 2 illustre la capacité des enzymes à glucosyler l’AHUD dans les conditions énoncées ci-dessus.
Toutes les enzymes de la famille 70 des GH se sont révélées actives sur AHIID.
Les enzymes de branchement BRS-A, BRS-B A1 , BRS-B, BRS-E A1 et GBD-CD2 AN123 se sont révélées particulièrement actives. En effet, des taux de conversion allant de 18 % à des taux supérieurs à 60 % dans les conditions de crible testées ont été obtenus avec ces enzymes.
Glucosylation de IAEA
La Figure 3 illustre la capacité des enzymes à glucosyler l’AEA dans les conditions énoncées ci-dessus.
Toutes les enzymes de la famille 70 des GH se sont révélées actives sur AEA.
Les enzymes de branchement BRS-A, BRS-B A1 , BRS-B, BRS-E A1 et GBD-CD2 AN123 se sont révélées particulièrement actives. En effet, des taux de conversion allant de 20 % à des taux supérieurs à 60 % dans les conditions de crible testées ont été obtenus avec ces enzymes.
Exemple 2 : Comparaison des profils de produits de glucosylation de AHESU, AHUD et AEA par les enzymes de branchement BRS-A ; BRS-B A1 ; BRS-C ; BRS-D A1, BRS-E A1 et GBD-CD2 AN 123
2.1. Matériel et méthodes
Les réactions sont réalisées à 30°C sous 800 rpm d’agitation en présence de 438,5 mM de saccharose, 10 mM d’AGH (AHESU, AHUD ou AEA), 10% v/v de DMSO et un tampon acétate de sodium 50 mM à pH=5,75 et BRS-A ; BRS-B A1 ; BRS-C ; BRS-D A1 , BRS-E A1 ou GBD-CD2 AN123 (activité enzymatique de 1 U.mL'1).
2.2. Résultats
2.2.1 . Profils de produits de qlucosylation de AHESll
La Figure 4 illustre la diversité des produits de glucosylation obtenus dans les conditions énoncées ci-dessus.
Les produits de glucosylation sont élués entre 10 et 16 minutes de l’analyse CLHP. Le produit détecté à 26,5 minutes correspondant à l’acide AHESU résiduel.
Pour chaque enzyme testée, les profils chromatographiques présentent de nombreux pics de glucosylation. Par exemple, six produits majeurs sont obtenus quand BRS-A catalyse la réaction.
Le profil des produits de glucosylation est dépendant de l’enzyme considérée.
Les produits de glucosylation majoritaires semblent plus nombreux avec les enzymes de branchement BRS-A, BRS-D A1 et GBD-CD2 AN123 spécifique de la liaison a-1 ,2, notamment dans les produits élués dans les premiers temps de l’analyse. En effet, trois à quatre pics de forte intensité sont observables avec ces enzymes.
A contrario, seuls deux produits principaux sont obtenus avec BRS-B A1 , BRS-C et BRS- EA1.
A l’exception des enzymes BRS-C et BRS-E A1 , l’efficacité de glucosylation est très élevée avec l’AHESU comme accepteur, en particulier pour BRS-A, BRS-B A1 , BRS-D A1 , et GBD-CD2 AN123. En effet, les taux de conversion de l’AHESU obtenus avec 438,5 mM (150 g.L'1) de saccharose sont de 94%, 84% et 75% pour BRS-A, BRS-D A1 , et GBD-CD2 AN 123 respectivement (BRS spécifiques de la liaison a-1 ,2) et 89%, 26%, 22% pour BRS- B A1 , BRS-C et BRS-E A1 (BRS spécifiques de la liaison a-1 ,3).
2.2.2. Profils de produits de glucosylation de AHUD
La Figure 5 illustre la diversité des produits de glucosylation obtenus dans les conditions énoncées ci-dessus.
Les produits de glucosylation obtenus sont élués entre 10 et 25 minutes. Le produit détecté à 49 minutes correspondant à l’acide 11-hydroxyundécanoïque (AHUD) résiduel. Les profils de produits obtenus sont complexes avec de nombreux pics de glucosylation détectés (une douzaine de produits différents pour BRS-A par exemple).
Le profil des produits de glucosylation est également dépendant de l’enzyme considérée. Les produits majoritaires n°1 et 2 sont, par exemple, en proportions variables selon les enzymes : une forte production de produit de glucosylation n°1 est observée avec GBD- CD2 AN 123 ; au contraire, une production du même ordre de grandeur des deux produits (1 et 2) de glucosylation est obtenue avec BRS-E A1 .
Les produits élués dans les premiers instants de l’analyse (entre 10 et 15 minutes) apparaissent en quantité supérieure dans les réactions catalysées par les enzymes spécifiques de la liaison a-1 ,2 ie. BRS-A, BRS-D A1 et GBD-CD2 AN 123.
L’efficacité de glucosylation est également dépendante de l’enzyme considérée.
En effet, les taux de conversion de l’AHUD obtenus sont de 78 %, 40 %, 17 %, 54 %, 32 % et 67 % pour BRS-A, BRS-B A1 , BRS-C, BRS-D A1 , BRS-E A1 et GBD-CD2 AN123 respectivement dans les conditions illustrées dans la Figure 5.
2.2.3. Profils de produits de glucosylation de AEA
La Figure 6 illustre la diversité des produits de glucosylation obtenus dans les conditions énoncées ci-dessus.
Les produits de glucosylation obtenus sont élués entre 10 et 30 minutes de l’analyse CLHP, le produit détecté à 43 minutes correspondant à l’AEA résiduel. Les profils de produits de glucosylation apparaissent complexes, de nombreux pics de glucosylation étant détectés (plus de 16 produits majeurs pour BRS-A par exemple).
Le profil des produits de glucosylation est très dépendant de l’enzyme considérée. En effet, si le pic 4 est commun à toutes les enzymes, le pic 5 est caractéristique de l’enzyme BRS- B A1 . Le pic 10 est lui essentiellement présent dans les produits obtenus avec les enzymes BRS-A et BRS-D A1 deux enzymes spécifiques de la liaison a-1 ,2. Les produits de
glucosylation 1 à 3 sont, eux, essentiellement produits par BRS-B A1 et BRS-E A1 deux enzymes spécifiques de la liaison a-1 ,3.
L’efficacité de glucosylation est également dépendante de l’enzyme considérée. En effet, les taux de conversion de l’AEA obtenus sont de 63 %, 74 %, 30 %, 60 %, 65 % et 74 % pour BRS-A, BRS-B A1 , BRS-C, BRS-D A1 , BRS-E A1 et GBD-CD2 AN123 respectivement dans les conditions illustrées dans la Figure 6.
Exemple 3 : Effet de la concentration initiale de saccharose sur le profil des produits de glucosylation de AHESU, AHUD et AEA obtenus avec BRS-A ; BRS-B A1 ; BRS- C ; BRS-D A1 , BRS-E A1 ou GBD-CD2 AN123.
3.1. Matériel et méthodes
Profil des produits de glucosylation
Les réactions sont réalisées à 30°C sous 800 rpm d’agitation en présence de 146 mM, 292 mM, 439 mM, 585 mM ou 731 mM de saccharose ; 10 mM d’AGH (AHESU, AHUD ou AEA) ; 10 % v/v de DMSO et un tampon acétate de sodium 50 mM à pH=5,75 en présence BRS-A ; BRS-B A1 ; BRS-C ; BRS-D A1 , BRS-E A1 ou GBD-CD2 AN123 (Activité enzymatique 1 U.mL'1, T=30°C)
3.2. Résultats
3.2.1 . Effet de la concentration initiale de saccharose sur le taux de conversion et le profil des produits de glucosylation de l’AHESU
L’augmentation de la concentration initiale en saccharose a pour effet d’optimiser le taux de conversion de l’AHESU (Figure 7). Cet effet est particulièrement marqué pour les enzymes BRS-A, BRS-B A1 , BRS-D A1 et GBD-CD2 AN123. En effet, le taux de conversion compris entre 25 % et 55 %, obtenu à une concentration initiale de 146 mM augmente jusqu’à un taux supérieur à 85 % (jusqu’à 98 % pour BRS-A).
Les concentrations initiales croissantes en saccharose ont également un effet sur les profils des produits de glucosylation (non représenté). Par exemple, pour les quatre enzymes BRS-A, BRS-B A1 , BRS-D A1 et GBD-CD2 AN123, les produits de glucosylation élués
dans les premiers instants de l’analyse (certainement des produits de degré de glucosylation plus élevé) sont nettement favorisés par l’augmentation de la concentration initiale en saccharose.
3.2.2. Effet de la concentration initiale de saccharose sur le taux de conversion et le profil des produits de glucosylation de l’AHUD
L’augmentation de la concentration initiale en saccharose a pour effet d’optimiser le taux de conversion de l’AHUD (Figure 8).
Cet effet est principalement marqué pour les enzymes de spécificité a-1 ,2. En effet, le taux de conversion compris entre 25 % et 55 %, obtenu à une concentration initiale de 146 mM avec BRS-A, BRS-D A1 et GBD-CD2 AN 123 augmente jusqu’à un taux compris entre 60 % et 85 % pour une concentration supérieure à 146 mM. Cet effet de la concentration initiale de saccharose est moins marqué pour BSR-B A1 , BSR-C et BSR-E A1 .
En comparaison le taux de conversion obtenu avec les enzymes de spécificité a-1 ,3 ne dépassent pas 40 % pour une concentration initiale en saccharose de 730 mM.
Les concentrations initiales croissantes en saccharose ont également un effet sur le profil global des produits de glucosylation (non représenté). Par exemple, pour les trois enzymes de branchement BRS-A, BRS-D A1 et GBD-CD2 AN 123, les produits de glucosylation élués dans les premiers instants de l’analyse sont nettement favorisés par l’augmentation de la concentration initiale de saccharose. Ces produits sont certainement des produits de degré de glucosylation plus élevé. Dans le cas des enzymes de branchement a-1 ,3, cet effet est beaucoup moins marqué.
3.2.3. Effet de la concentration initiale de saccharose sur le taux de conversion et le profil des produits de glucosylation de l’AEA
L’augmentation de la concentration initiale en saccharose a pour effet de diminuer le pic d’AEA résiduel. La conversion de l’accepteur est donc optimisée. En effet, le taux de conversion compris entre 37 et 50 % obtenu à une concentration initiale de 146 mM augmente jusqu’à un taux compris entre 76 % et 85 % selon les enzymes considérées (BRS-B A1 , BRS-D A1 , BRS-E A1 et GBD-CD2 AN123). Cet effet de la concentration
initiale de saccharose est moins marqué pour l’enzyme BRS-C. Cette optimisation de la conversion de l’AEA est illustrée dans la Figure 9.
Les concentrations initiales croissantes en saccharose ont également un effet sur le profil global des produits de glucosylation (non représenté). Par exemple, pour les deux enzymes de branchement BRS-A et BRS-D A1 (qui glucosylent le dextrane en a-1 ,2), les produits de glucosylation élués dans les premiers instants de l’analyse sont nettement favorisés avec l’augmentation de la concentration initiale de saccharose. Ces produits sont certainement des produits de degrés de glucosylation plus élevés.
Dans le cas des enzymes de branchement a-1 ,3, la synthèse du produit de glucosylation n°4 est défavorisée au profit de celle des autres produits de glucosylation, spécialement le produit de glucosylation n°5 dans le cas de l’enzyme BRS-B.
Exemple 4 : Caractérisation structurale des principaux produits de glucosylation de AHESU par BRS-A, de AHUD par BSR-B A1 et de AEA par BSR-B A1
4.1. Production et caractérisation structurale des produits de glucosylation de l’AHESU
4.1.1. Production d’un lot de glycolipides de l’AHESU à l’échelle du gramme
La glucosylation de l’AHESU est catalysée par l’enzyme BRS-A sur 500 mg d’AHESU. Les conditions réactionnelles sont les suivantes :
- [saccharose]o = 438,5 mM
- [AHESU]o = 10 mM (initialement dissoute dans le DMSO à 100 mM)
- tampon acétate de sodium à 50mM et à pH = 5,75
- eau ultra-pure qsp 200mL
- activité de BRS-A en réaction : 1 U.mL'1
La réaction est menée à 37°C sous agitation magnétique. Après 24 heures, la réaction est arrêtée par incubation à 95°C pendant 10 minutes. Le mélange est conservé à -20°C avant purification.
Une étape de prépurification des hydroxy-lipides glucosylés issus de AHESU est réalisée par chromatographie flash grâce à une colonne contenant 250 mL de phase stationnaire
Purosorb PAD910, Purolite, USA. Les produits de glucosylation sont ainsi séparés des sucres libres résiduels grâce aux étapes d’élution suivantes :
- 4 volumes de colonne (VC) d’eau ultra-pure jusqu’à élution complète des sucres résiduels
- Elution des produits de glycosylation grâce à 4 VC d’un mélange l- O/Ethanol 35% / 65% v/v.
- Retour à 100% H2O ultra pure en 5 VC.
Les produits de glucosylation sont recueillis et concentrés par évaporation rotative sous vide puis analysés par chromatographie. Le chromatogramme obtenu à cette étape de prépurification est présenté dans la Figure 10. Y figurent au minimum 6 produits de glucosylation principaux notés dans l’ordre inverse de leur polarité. Le produit n°1 correspond à celui élué au plus proche de l’AHESU, accepteur lipidique n’ayant pas complètement réagi.
Les formes glucosylées majoritaire de l’AHESU (produits de glucosylation n°1 à 3) sont isolées grâce à un système semi-préparatif constitué d’une chaine CLHP Agilent 1260 Infinite couplée à un collecteur de fraction « Dionex Ultimate 3000 automated fraction collector ». La séparation est assurée par une colonne Synergi™ Fusion-RP (porosité de 80 Â, granulométrie de 4 pm, greffage C18 avec terminaison polaire, Phenomenex, USA). L’élution est réalisée de manière isocratique avec un mélange H2O/Acétonitrile 65% / 35% v/v à un débit de 1 mL.min'1.
4.1.2. Caractérisation des produits de glucosylation de l’AHESU a) Spectre de masse haute résolution (LTQ Orbitrap) des produits de glucosylation de l’AHESU
Dans le but de déterminer les masses exactes des produits de glucosylation purifiés, le système CLHP Thermo U3000 a été couplé à un spectromètre haute résolution de type LTQ Orbitrap Vélos (ThermoScientific, USA). L’ionisation est réalisée en mode électrospray négatif (H ESI II -) avec un delta de masse de +/- 5 ppm. Les spectres de masse haute résolution des produits de glucosylation n°1 à 3 sont obtenus (Figure 10).
L’analyse LC-MS haute résolution du produit de glucosylation de l’AHESU n°1 dont le temps de rétention est 7,8 min conduit à l’identification d’un ion majoritaire à m/z 423,20492 pour [M-H]' correspondant à une forme mono-glucosylée de l’AHESU.
Un ion majoritaire obtenu avec le produit de glucosylation n°2 (temps d’élution = 6,5 minutes) à m/z 585,25716 pour [M-H]' correspond à une forme diglucosylée de l’AHESU.
De façon surprenante le produit de glucosylation n°3 (pic n°3 à 5,92 min) donne un ion principal à m/z 585,2571 pour ([M-H]'). Le composé n°3 est donc également une forme diglucosylée de l’AHESU mais avec une liaison osidique différente de celle du produit n°2. b) Analyse par RMN des produits de glucosylation n°1 à 3 de l’AHESU
La caractérisation des produits de glucosylation de l’AHESU n°1 (AHESU monoglucosylé), n°2 et 3 (AHESU diglucosylés) est réalisée par RMN. Les spectres 1H, 13C, JMod, HSQC et HMBC ont été enregistrés sur un équipement Bruker Avance 500 MHz à 298K avec une sonde BBI probe H-BB-D Z-Grd 5mm. Les données ont été acquises et traitées grâce au logiciel TopSpin 3.
Caractérisation RMN du produit de glucosylation n°1 de l’AHESU
Un spectre 1H et un spectre 13C du produit de glucosylation n°1 de l’AHESU sont réalisés.
Les spectres 1H et 13C obtenus avec le produit de glucosylation n°1 sont en accord avec une monoglucosylation de l’AHESU.
Le pic n°1 des chromatogrammes présentés en Figure 10 correspond à l’acide 11-[(2-O- g-D-glucopyranosyl-éthyl)-sulfanyl]-undécanoïque.
Caractérisation RMN du produit de glucosylation n°2 de l’AHESU
Un spectre 1H et un spectre 13C du produit de glucosylation n°2 de l’AHESU sont réalisés. La présence de deux protons anomériques aux déplacements chimiques 4,84 et 5,13 ppm et de deux carbones négatifs aux déplacements chimiques 100,54 ppm et 101 ,94 ppm
(carbones anomériques) sont en accord avec une forme diglucosylée de l’accepteur lipidique.
Un spectre 2D HSQC du produit de glucosylation n°2 de l’AHESU permet l’attribution des protons et carbones anomériques pour chaque unité osidique.
Un spectre RMN 2D HMBC du produit de glycosylation n°2 de l’AHESU montre une liaison osidique du type a-1 ,3 entre les deux unités glucosyle.
Le pic n°2 des chromatogrammes présentés en Figure 10 correspond donc à l’acide 11- [(2-O-a-D-glucopyranosyl-(1 ,3)-a-D-glucopyranosyl-éthyl) sulfanyl]-undécanoïque.
Caractérisation RMN du produit de glucosylation n°3 de l’AHESU
Un spectre 1H et un spectre 13C du produit de glucosylation n°3 de l’AHESU sont réalisés. La présence de deux protons anomériques aux déplacements chimiques 4,99 et 5,05 ppm et de deux carbones négatifs aux déplacements chimiques 97,56 ppm et 98,28 ppm (carbones anomériques) sont en accord avec une deuxième forme diglucosylée de l’accepteur lipidique.
Un spectre 2D HSQC du produit de glucosylation n°3 de l’AHESU permet l’attribution des protons et carbones anomériques pour chaque unité osidique. Un spectre 2D HMBC du produit de glucosylation n°3 montre une liaison osidique du type a-1 ,2 entre les deux unités glucosyle.
Le pic n°3 du chromatogramme présenté en Figure 10 correspond donc à l’acide 11-[(2- O-a-D-glucopyranosyl-(1 ,2)-a-D-glucopyranosyl-éthyl) sulfanyl]-undécanoïque.
4.2. Production et caractérisation structurale de produits de glucosylation de AHUD
4.2.1 . Production d’un lot de glycolipides AHUD à l’échelle du gramme.
La production de produits de glucosylation est réalisée par l’enzyme BRS-B sur 1 g d’AHUD. Les conditions réactionnelles sont les suivantes :
- concentration finale en saccharose : 438,5 mM
- concentration finale en AHUD : 10 mM (initialement dissout dans le DMSO à 100 mM)
- tampon acétate de sodium à 50mM et à pH = 5,75
- eau ultra-pure qsp 500 ml_
- activité de BRS-B en réaction : 1 U.mL'1
La réaction est réalisée à 30°C sous agitation magnétique. Après 24 heures, la réaction est arrêtée par incubation à 95°C pendant 10 minutes. Le mélange est conservé à -20°C avant purification.
4.2.2. Purification des glycolipides de l’AHUD produits par l’enzyme BRS-B.
Une étape de prépurification des glycolipides issus de l’AHUD est réalisée par chromatographie flash grâce à un système REVELERIS® X2 Flash Chromatography System (GRACE, USA) équipé d’une colonne contenant 80 g de phase stationnaire silice- C18. Les produits de glucosylation sont séparés des sucres libres résiduels dans les conditions suivantes :
- débit de 60 ml. min-1
- 3 volumes de colonne (VC) à 100 % H2O
- gradient passant de 100 % H2O ultra pure à 100 % acétonitrile en 2 VC
- 1 VC à 100 % acétonitrile
- retour à 100 % H2O ultra pure en 0,5 VC
- équilbration à 100 % H2O ultra pure pendant 1 ,5 VC
Le pic correspondant aux produits de glucosylation est recueilli lors du gradient en acétonitrile. Le chromatogramme obtenu lors de cette étape de pré-purification par chromatographie flash est présenté Figure 11.
L’analyse LC-MS en mode électrospray négatif du produit de glucosylation de l’AHUD n°1 (temps de rétention de 15,34 min) donne deux ions majoritaires à m/z 363,2 pour [M-H]' correspondant à la forme mono-glucosylé et m/z 725,3 pour [2M-3H]' correspondant à un dimère.
L’analyse LC-MS en mode électrospray négatif du produit de glucosylation de l’AHUD n°2 (temps de rétention de 14,12 min) donne un ion majoritaire à m/z 525,3 pour [M-H]' correspondant à la forme di-glucosylée.
Les différentes formes glucosylées de l’AHUD sont ensuite purifiées sur un système semi- préparatif constitué d’une chaine CHLP Agilent 1260 Infinite couplée à un collecteur de
fraction Dionex Ultimate 3000 automated fraction collector. La séparation est assurée par une colonne Synergi™ Fusion-RP (porosité de 80 Â, granulométrie de 4 pm, greffage C18 avec terminaison polaire, Phenomenex, USA). L’élution est réalisée de manière isocratique avec un mélange FW/Acétonitrile 75 % / 25 % v/v à un débit de 1 mL.min'1.
4.2.3. Analyse RMN des glycolipides de AHUD purifiés.
La caractérisation des produits de glucosylation de l’AHUD n°1 (AHUD monoglucosylé) et n°2 (AHUD diglucosylé) est réalisée par RMN. Les spectres 1 H, 13C, JMod, HSQC et HMBC ont été enregistrés sur un équipement Bruker Avance 500 MHz à 298 K avec une sonde BBI probe H-BB-D Z-Grd 5mm. Les données ont été acquises et traitées grâce au logiciel TopSpin 3.
Caractérisation RMN du produit de glucosylation n°1 de l’AHUD
Un spectre 1H et un spectre 13C du produit de glucosylation n°1 de AHUD sont réalisés.
Les spectres 1H et 13C obtenus avec le produit de glucosylation n°1 de l’AHUD sont en accord avec une monoglucosylation de l’AHUD.
Le pic n°1 du chromatogramme présenté en Figure 11 correspond à l’acide 11-O-(a-D- glucopyranosyl)-undécanoïque.
4.3. Production et caractérisation structurale de produits de glucosylation de l’AEA par BRS-B A1
4.3.1. Production de lots de dérivés glycosylés de l’acide érythro-aleuritigue à l’échelle du gramme.
La production des produits de glucosylation de l’AEA est réalisée par l’enzyme BRS-B A1 sur 1 ,5 g d’AEA. Les conditions réactionnelles sont les suivantes :
- Concentration finale en saccharose : 584,7 mM
- Concentration finale en AEA : 10 mM (initialement dissoute dans le DMSO à 100 mM)
- Tampon acétate de sodium à 50mM et à pH = 5,75
- Eau ultra-pure qsp 500 mL
- Activité de BRS-B en réaction : 1 U.mL'1
La réaction est menée à 30°C sous agitation magnétique. Après 24 heures, la réaction est arrêtée par incubation à 95°C pendant 10 minutes. Le mélange est conservé à -20°C avant purification.
4.3.2. Purification des glycolipides issus de AEA produits par l’enzyme BRS-B A1 .
Une étape de prépurification des glycolipides issus de l’AEA est réalisée par chromatographie flash grâce à un système REVELERIS® X2 Flash Chromatography System (GRACE, USA) équipé d’une colonne contenant 80 g de phase stationnaire Silice- Ci 8. Les produits de glucosylation sont séparés des sucres libres résiduels grâce aux étapes d’élution suivantes à un débit de 60 ml. min-1 :
- 3 volumes de colonne (VC) d’F O ultra pure 100 %.
- Gradient passant de 100 % H2O ultra pure à 100 % acétonitrile en 2 VC.
- 1 VC à 100 % acétonitrile.
- Retour à 100 % H2O ultra pure en 0,5 VC
- Ré-équilibration à 100 % H2O ultra pure pendant 1 ,5 VC
Les produits de glucosylation sont recueillis lors du gradient en acétonitrile.
La Figure 12 illustre le chromatogramme obtenu au cours de cette étape de pré-purification par chromatographie flash.
L’analyse LC-MS en mode électrospray négatif du produit de glucosylation de l’AEA n°4 dont le temps de rétention est 16,16 min conduit à deux ions majoritaires à m/z 465,4 [M- H]’ et m/z 579,3 [M+TFA-H]'. Ces ions confirment l’obtention d’une forme mono-glucosylée de l’AEA.
L’analyse LC-MS en mode électrospray négatif du produit de glucosylation l’AEA n°5 dont le temps de rétention est 14,12 min conduit à deux ions majoritaires à m/z 627,4 [M-H]' et m/z 741 ,4 [M+TFA-H]'). Ces deux ions à + 162 uma par rapport au pic 4 (m/z 465,4), confirment l’obtention d’une forme di-glucosylée de l’AEA.
Ces deux principales formes glucosylées de l’acide éryhtro-aleuritique sont alors purifiées sur un système semi-préparatif constitué d’une chaine CLHP Agilent 1260 Infinite couplée à un collecteur de fraction « Dionex Ultimate 3000 automated fraction collector ». La séparation est assurée par une colonne Synergi™ Fusion-RP (porosité de 80 Â,
granulométrie de 4 pm, greffage C18 avec terminaison polaire, Phenomenex, USA). L’élution est réalisée de manière isocratique avec un mélange FW/Acétonitrile 78 %/22 % v/v à un débit de 1 mL.min'1.
4.3.3. Analyse RMN des produits du qlucosylation de l’AEA purifiés.
La caractérisation des produits de glucosylation de l’AEA n°4 (AEA monoglucosylé) et n°5 (AEA diglucosylé) est réalisée par RMN. Les spectres 1 H, 13C, HSQC et HMBC ont été enregistrés sur un équipement Bruker Avance 500 MHz à 298K avec une sonde BBI probe H-BB-D Z-Grd 5mm. Les données ont été acquises et traitées grâce au logiciel TopSpin 3.
Caractérisation du produit de glycosylation n°4 de l’AEA (AEA monoglucosylé)
Un spectre 1 H et un spectre 13C du produit de glucosylation n°4 de AEA sont réalisés.
Les spectres 1H et 13C obtenus avec le produit de glucosylation n°4 de AEA sont en accord avec une monoglucosylation de l’AEA.
Le spectre 1H met en évidence un proton anomérique à un déplacement chimique de 4,77 ppm. Le spectre 13C met en évidence la présence des pics négatifs carbone C9 et C10 superposés à un déplacement chimique de 75,38 ppm, ce qui prouve l’absence de glucosylation sur les deux hydroxyles secondaires. La glucosylation se trouve donc au niveau du carbone positif n°16 déblindé à 69,21 ppm.
Le pic n°4 du chromatogramme présenté en Figure 12 correspond à l’acide-16-O-(a-D- glucopyranosyl)-9,10-dihydroxy-hexadécanoïque.
Caractérisation du produit de glucosylation n°5 de l’AEA (AEA diglucosylé)
Un spectre 1 H et un spectre 13C du produit de glucosylation n°5 de l’AEA sont réalisés.
Les spectres 1H et 13C obtenus avec le produit de glucosylation n°4 de l’AEA sont en accord avec une diglucosylation de l’AEA.
Le spectre 1H met en évidence deux protons anomériques à un déplacement chimique de 4,79 ppm et 5,14 ppm et des deux carbones anomériques à 100,34 ppm et 101 ,89 ppm.
Comme la forme monoglucosylée, les pics carbones négatifs C9 et C10 sont toujours présents à 75,41 ppm, ce qui démontre une diglucosylation en position C16.
Le spectre 2D HMBC de l’AEA montre une liaison osidique du type a-1 ,3 entre les deux unités glucosyle.
Le pic n°5 du chromatogramme présenté en Figure 12 correspond à un AEA diglucosylé de type acide-16-O-(a-D-glucopyranosyl)-(1 ,3)-a-D-glucopyranosyl)-9,10-dihydroxy- hexadécanoïque.
Exemple 5 : Glucosylation d’acides gras oméga-hydroxylés ayant une chaine hydrocarbonée comportant un nombre de carbone supérieur à 11
Les enzymes BRS-A, BRS-B A1 , BRS-C, BRS-D A1 , BRS-E A1 et GBD-CD2 AN 123 dites de branchement ont été testées pour glucosyler les Acides 12-HydroxyDoDécanoïque (AHDD), 15-HydroxyPentaDecanoïque (AHPD) et 16-HydroxyHexaHecanoïque (AHHD) comprenant respectivement 12, 15 et 16 atomes de carbone.
La Figure 13 montre les produits de glucosylation obtenus à 37°C sous 800 rpm d’agitation dans les conditions de synthèse suivantes :
- Concentration initiale de saccharose : 877 mM
- Concentration initiale d’acide oméga-hydroxylé : [AHDD]=10mM ; [AHPD]=1 mM et [AHHD]= 0,5 mM,
- 10% v/v de DMSO
- Tampon acétate de sodium 50 mM à pH=5,75
- Activité enzymatique : 1 U.mL'1
En vue de leur analyse par CLHP, les milieux réactionnels sont dilués au demi dans de l’éthanol absolu. La séparation est réalisée avec une colonne Synergi™ Fusion-RP (porosité de 80 Â, granulométrie de 4 pm, greffage C18 avec terminaison polaire, Phenomenex, USA). L’élution est réalisée à 30°C sur un système CLHP Thermo U3000 couplé à un détecteur Corona CAD Véo (Charged Aerosol Detector) (Thermo Scientific, USA). La température de nébulisation est fixée à 50°C et le filtre maintenu à 3,2 secondes.
La phase mobile est composée d’un mélange eau ultrapure (solvant A) / acétonitrile de qualité CLHP (solvant B) contenant 0,05% (v/v) d’acide formique. L’élution est réalisée à un débit de 1 mL.min'1 selon le gradient suivant :
- Entre 0 min et 5 min, une première phase d’élution à 0% (v/v) de la voie B.
- Une phase de gradient passant de 0% de la voie B à 100% de la voie B en 35 minutes.
L’analyse des deux chromatogrammes présentés en Figure 14 prouve la possibilité de glucosyler des acides gras longues chaînes porteurs d’hydroxyle primaire en position œ (jusqu'à C16 au moins).
En effet, la comparaison des temps initiaux (témoin) et finaux des réactions montre l’apparition de nombreux produits de glucosylation entre les temps d’élution 17 minutes et 22 minutes pour l’AHDD, entre 19 minutes et 25 minutes pour l’AHPD et entre 21 minutes et 27 minutes pour l’AHPD.
L’efficacité de glucosylation est dépendante de la taille de chaîne des accepteurs co- hydroxylés considérés. La glucosylation des accepteurs de longueur de chaîne plus élevée est obtenue uniquement en diminuant les concentrations de travail (de 10 mM pour le AHDD à 0,5 mM pour le AHHD par exemple).
Glucosylation de l’acide 12-hvdroxydodécanoïque (AHDD)
Les enzymes de branchements BRS-A, BRS-D A1 , GBD-CD2 AN123 (spécifiques de la liaison a-1 ,2) et l’enzyme BRS-E (spécifique de la liaison a-1 ,3) semblent dans ce cas encore être les enzymes les plus efficaces.
En effet, les taux de conversion sont pour l’AHDD, de 60% ; 40% et 42% pour les enzymes. BRS-A, BRS-D A1 et GBD-CD2 AN 123 respectivement et seulement de 18% ; 11% et 17% pour les enzymes BRS-B A1 , BRS-C et BRS-E A1 respectivement.
Les chromatogrammes obtenus montrent des profils de multi-glucosylation avec de nombreux pics dont deux majoritaires élués à 21 et 22 minutes.
Glucosylation de l’acide 15-hydroxypentadécanoïque (AHPD) et l’acide 16- hydroxyhexadécanoïque (AHHD)
La glucosylation des accepteurs de plus longues chaînes est plus efficace avec les deux enzymes de branchement BRS-A (a-1 ,2 spécifique) et BRS-B (a-1 ,3 spécifique). En effet, les taux de conversion obtenus avec ces accepteurs sont :
- pour le AHPD, de 70 % pour BRS-A et de 33 % pour BRS-C. Les rendements de transformation du AHPD sont uniquement de 5,0 %, 22 %, 13 %, 29 % pour BRS-C, BRS- D A1 , BRS-E A1 et GBD-CD2 AN 123 respectivement.
Pour le AHHD, de 38 % pour BRS-A et de 21 % pour BRS-C. Les rendements de transformation du AHHD sont uniquement de 5 %, 12 %, 6 % et 12 % pour BRS-C, BRS- D A1 , BRS-E A1 et GBD-CD2 AN 123 respectivement.
Exemple 6 : Glucosylation des acides 9,10-dihydroxyoctadécanoïque et 9, 10, 12- trihydroxyoctadécanoïque par les enzymes BRS-A, BRS-B A1 , BRS-C, BRS-D A1 , BRS-E A1 et GBD-CD2 AN 123
Les enzymes BRS-A, BRS-B A1 , BRS-C, BRS-D A1 , BRS-E A1 et GBD-CD2 AN123 (a- transglucosylase de branchement) ont été testées pour glucosyler les acides 9, 10- dihydroxyoctadécanoïque (ADHO) et 9, 10, 12-trihydroxyoctadécanoïque (ATHO).
La Figure 14 montre les produits de glucosylation obtenus à 37°C sous 800 rpm d’agitation dans les conditions de synthèse suivantes :
- Concentration initiale de saccharose : 877 mM
- Concentration initiale d’acide gras poly-hydroxylé (ADHO et ATHO) : 5 mM, - 10% v/v de DMSO
- Tampon acétate de sodium 50 mM à pH=5,75
- Activité enzymatique : 1 U.mL'1
En vue de leur analyse par CLHP, les milieux réactionnels sont dilués au demi dans de l’éthanol absolu. La séparation est réalisée avec une colonne Synergi™ Fusion-RP (porosité de 80 Â, granulométrie de 4 m, greffage C18 avec terminaison polaire, Phenomenex, USA). L’élution est réalisée à 30°C sur un système CLHP Thermo U3000 couplé à un détecteur Corona CAD Véo (Charged Aerosol Detector) (Thermo Scientific, USA). La température de nébulisation est fixée à 50°C et le filtre maintenu à 3,2 secondes.
La phase mobile est composée d’un mélange eau ultrapure (solvant A) / acétonitrile de qualité CLHP (solvant B) contenant 0,05 % (v/v) d’acide formique. L’élution est réalisée à un débit de 1 mL.min'1 selon le gradient suivant :
- Entre 0 min et 5 min, une première phase d’élution à 0 % (v/v) de la voie B.
- Une phase de gradient passant de 0 % de la voie B à 100 % de la voie B en 30 minutes.
L’analyse des deux chromatogrammes présentés en Figure 14A et Figure 14B prouve la possibilité de glucosyler des acides gras porteurs d’hydroxyle secondaire présent au sein même de la chaine carbonée uniquement.
En effet, la comparaison des temps initiaux (témoin) et finaux des réactions montre l’apparition de nombreux produits de glucosylation entre les temps d’élution 21 minutes et 26 minutes pour l’ADHO et 19 minutes et 23 minutes pour l’ATHO. La formation de ces produits de glucosylation parait beaucoup plus efficace avec l’acide gras trihydroxylé (ATHO) qu’avec la forme dihydroxylée ADHO, l’intensité des pics observés étant nettement plus importante dans le premier cas (ATHO).
De même, les taux de conversion varient entre 2 % et 30 % pour l’ATHO et entre 1% et 11 % pour l’ADHO selon les enzymes de branchement considérées.
Les enzymes de branchement BRS-A, BRS-D A1 , GBD-CD2 AN123 (spécifiques de la liaison a-1 ,2) et l’enzyme BRS-E (spécifique de la liaison a-1 ,3) semblent être les enzymes les plus efficaces dans les deux cas.
Exemple 7 : Glucosylation d’acides gras hydroxylés par des mutants de l’enzyme GBD CD2 AN123
Des mutants de l’enzyme GBD CD2 AN 123 ont été testés pour glucosyler les acides gras hydroxylés suivants : acide 11-[2-[hydroxy-alkyl)-sulfanyl]-undécanoïque (AHESU), acide 11-hydroxyundécanoïque (AHUD) acide 12-hydroxydodécanoïque (AHDD), acide 15-hydroxypentanoïque (AHPD), acide érythro-aleuritique (AEA), acide 9,10,12-trihydroxy octadécanoïque (ATHO).
Les résultats montrent que ces mutants sont très performants dans la mesure où ils présentent des taux de conversion très supérieurs. Des taux de conversion des acides gras hydroxylés suivants sont obtenus :
Taux de conversion obtenus avec des mutants de GBD CD2 AN 123.
Les mutants de GBD-CD2 AN 123 permettent également d’obtenir des produits de glucosylation ayant des motifs osidiques de taille plus élevée.
Exemple 8 : Etude des propriétés émulsifiantes des produits de glucosylation de l’AHESU par BRS-A et de AHUD par BRS-B A1
8.1. Préparation des émulsions
Les propriétés émulsifiantes des produits de glucosylation de l’AHESU par l’enzyme BRS- A (ci-après désigné Glc-AHESU) et de l’AHUD par BRS-B A1 (ci-après Glc-AHUD) ont été évaluées.
Phase aqueuse
Une solution aqueuse comprenant 2 % massique de Glc-AHESU est préparée.
Le pH de la solution aqueuse est ajusté à l’aide d’une solution de NaOH à 1 M (les pH étudiés sont de 4, 5, 6 et 10,5).
Ces différents pH permettent de balayer les différents états d’ionisation de la fonction carboxyle des composés qu’ils se situent en dessous, à proximité et au-dessus du pKa (pKa moyen de Glc-AHESU = 4,88 ; pKa moyen de Glc-AHUD = 5, déterminés par dosage acido-basique).
Phase huileuse
Le dodécane est utilisé comme huile modèle.
Emulsification
L’huile est ajoutée lentement à la solution aqueuse tout en homogénéisant à l’aide d’un Ultra Turrax T25 (Janke & kunkel, IKA) réglé à 3000 rpm.
Le pourcentage final en huile est de 20 % massique.
La préparation est ensuite mise sous agitation pendant 10 minutes en augmentant la vitesse de l’Ultra Turrax à 9 000 rpm.
L’évolution cinétique des émulsions ainsi formées est suivie dans le temps par granulométrie laser (diffusion statique de la lumière) (Mastersizer 2000, Malvern Instruments), microscope optique et observation macroscopique.
La distribution granulométrique des émulsions est caractérisée en termes du diamètre moyen des gouttes en volume, D(4,3), et de polydispersité, P, définis ci-dessus ([Chem 1] et [Chem 2]).
8.2. Emulsions obtenues avec Glc-AHESU
8.2.1. Caractérisation des émulsions obtenues avec Glc-AHESU
La Figure 15 montre les caractéristiques des émulsions le jour de leur préparation (JO) aux différents pH étudiés.
Les émulsions formées sont d’un aspect blanc laiteux. Les granulométries initiales sont globalement assez proches quel que soit le pH : le diamètre moyen est de l’ordre de 4- 5 pm et la polydispersité est comprise entre 0,27 et 0,49. L’émulsion à pH=10,5 est plus polydisperse que les autres avec un élargissement vers les faibles diamètres.
L’émulsion à pH=4 se déstabilise par coalescence (fusion entre gouttes) dans les heures qui suivent sa fabrication et est détruite au bout de 3 jours (séparation macroscopique de l’huile et de la phase aqueuse) (Figure 16). Les émulsions au pH=5, 6 et 10,5 sont cinétiquement stables dans le temps sur au moins 6 mois. La taille des gouttes reste quasi inchangée comme le montre le suivi du diamètre des gouttes D(4,3) en fonction du temps (Figure 16).
On peut également noter un phénomène de crémage (Figure 16), qui consiste en la concentration des gouttes d’huile à la surface de l’émulsion sous l’effet de la gravité, les gouttes ayant une densité inférieure à celle de la phase aqueuse.
Le produit de glucosylation Glc-AHESU permet donc de stabiliser les émulsions dont la phase aqueuse présente un pH supérieur au pKa. L’instabilité observée à faible pH traduit l’existence d’une composante électrostatique forte dans la stabilisation des émulsions. La répulsion électrostatique qui empêche la coalescence (recombinaison) des gouttes résulte des molécules de tensioactifs chargées adsorbées aux interfaces.
8.2.2 Etude de la déstabilisation d’une émulsion obtenue avec Glc-AHESU par modulation de pH
Du fait de la présence d’une fonction acide sur Glc-AHESU et de la dépendance en pH de la stabilité des émulsions décrites ci-dessus (coalescence observée rapidement à
pH=4), on peut envisager l’obtention d’émulsions pH-stimulables i.e. stables dans une gamme de pH et se déstabilisant à un pH donné, « à la demande ».
Des essais ont été réalisés dans ce but (Figure 17).
L’émulsion initiale est préparée à pH=6, pH où l’émulsion est stable dans le temps comme montré précédemment. Une solution d’HCI (0,1 M) est alors ajoutée pour faire chuter le pH à 2. L’émulsion est complètement détruite après 24h.
Les émulsions sont également stimulables par ajout de sel. En effet, une émulsion à pH 10,5 préparée avec 0,1 M de NaCI se déstabilise au bout de cinq jours alors qu’elle est toujours stable au bout de 6 mois en absence de sel. Ceci conforte l’hypothèse selon laquelle la stabilisation est d’origine électrostatique dans la mesure où il est connu que l’ajout de sel écrante la répulsion électrostatique.
8.3. Propriétés des émulsions obtenues avec Glc-AHUD
8.3.1. Caractérisation des émulsions obtenues avec Glc-AHUD
La Figure 18 montre les caractéristiques des émulsions le jour de leur préparation (JO) aux différents pH étudiés.
Les émulsions formées sont d’un aspect blanc laiteux. Les granulométries initiales sont globalement assez proches pour les pH supérieurs à 5 : le diamètre moyen est de l’ordre de 4-5 pm et la polydispersité est comprise entre 0,30 et 0,34. On notera qu’à pH=4 le diamètre moyen des gouttes est plus important (8,51 pm), avec une polydispersité de 0,39.
L’émulsion à pH= 3,6 est détruite au bout de 1 jour (Figure 19). Les émulsions au pH=5 ; 6,1 et 10,5 sont cinétiquement stables dans le temps pendant au moins 14 jours.
La taille des gouttes reste quasi inchangée jusqu’à 14 jours comme le montre le suivi du diamètre des gouttes D(4,3) en fonction du temps (Figure 19). On observe sur les émulsions à pH 5 et pH 6,1 l’apparition d’une fine couche d’huile entre 14 et 30 jours, traduisant une déstabilisation de l’émulsion par coalescence. Les mesures granulométriques sont interrompues dès lors que cette couche devient visuellement
perceptible. Pour le pH 10,5, une augmentation progressive de la taille des gouttes sans que l’aspect macroscopique ne soit impacté à ce stade est observée. Le suivi à 6 mois montre l’apparition d’une fine couche d’huile. Pour toutes les émulsions, on note un phénomène de crémage qui consiste en la concentration des gouttes d’huile à la surface de l’émulsion sous l’effet de la gravité, les gouttes ayant une densité inférieure à celle de la phase aqueuse. Ce phénomène peut être limité en ajoutant un épaississant dans la phase aqueuse.
Glc-AHUD agit donc comme un agent tensio-actif stabilisant des émulsions aux valeurs de pH supérieures au pKa et plus particulièrement à pH fortement basique (stabilité plus importante à pH 10,5 qu’à pH 6). L’instabilité observée à faible pH traduit l’existence d’une composante électrostatique forte dans la stabilisation des émulsions. La répulsion électrostatique qui empêche la coalescence des gouttes résulte des molécules de tensioactifs chargées adsorbées aux interfaces.
8.3.2. Etude de la déstabilisation d’une émulsion obtenue avec Glc-AHUD par modulation de pH
Glc-AHU permet de fabriquer des émulsions pH-stimulables c’est-à-dire stables dans une gamme de pH et qui se déstabilisent à un pH donné, « à la demande ».
Des essais préliminaires ont été réalisés dans ce but (Figure 20). L’émulsion initiale est préparée à pH 6, pH où l’émulsion est stable dans le temps comme montré précédemment. Une solution d’HCI (0,1 M) est alors ajoutée pour faire chuter le pH à 2. L’émulsion est totalement déstabilisée après deux heures.
8.4. Propriétés d’auto-motilité des émulsions préparées avec Glc-AHESU et Glc-AHUD
Un phénomène d’auto-motilité a été observé avec une émulsion préparée avec Glc- AHESU et Glc-AHUD.
En effet, lorsque qu’une goutte d’émulsion (environ 20 pL) est déposée sur un substrat solide (lame de verre, support plastique, support modifié afin de modifier l’hydrophobicité), on observe que celle-ci est soumise à des phénomènes convectifs très intenses. La goutte
non seulement se déplace mais s’étale et se contracte de façon spasmodique et périodique sur son support.
Un phénomène consistant en l’apparition/disparition subite de zones transparentes au voisinage de la surface de l’émulsion a en outre été observé avec les émulsion préparées avec Glc-AHESU et Glc-AHUD.
En effet, dans certains cas, des zones transparentes (non laiteuses) et donc déplétées en gouttes, se forment de façon spontanée à proximité de la surface de la goutte et disparaissent aussitôt (phénomène semblable à un phénomène d'ébullition sans toutefois que des bulles ne se forment). Là encore, le phénomène semble se produire avec une certaine périodicité de l’ordre de quelques secondes à quelques minutes selon la composition des systèmes.
Ces phénomènes dépendent de nombreux facteurs : évaporation, nature du support, taille des gouttes de phase dispersée et concentration, nature de l’huile comme le montre la Figure 21 qui récapitule l’influence de ces paramètres sur l’intensité de ces phénomènes.
Ces phénomènes sont vraisemblablement la manifestation de l’effet Marangoni, sous différentes formes (R. T. van Gaalen, C.Diddens, H.M.A. Wijshoff, J. G. M. Kuerten (2021 ). Marangoni circulation in evaporating droplets in the presence of soluble surfactants, Journal of Colloid and Interface Science, Volume 584, Pages 622-633). Celui-ci se traduit par la convection de matière à grande échelle, consécutivement à l’apparition d’un gradient de tension interfaciale.
De telles émulsions présentent l’avantage d’être « auto-étalables » et « auto-agitées », ce qui permet d’entrevoir différentes applications dans le domaine du nettoyage des surfaces.
Exemple 9 : Etude de la préparation d’émulsions sèches à l’aide de glycolipides selon l’invention
Selon un autre mode de réalisation, la composition se présente sous forme de poudre sèche, ladite poudre sèche étant avantageusement redispersable dans l’eau. La forme sèche redispersable présente de nombreux avantages : facilité de transport, durée de conservation prolongée du fait de l’absence de développement bactériologique.
Généralement, les émulsions stabilisées par des tensioactifs se déstabilisent lors du séchage (exsudation d’huile). Avantageusement, les émulsions à base des glycolipides synthétisés dans la présente invention peuvent être séchées sans se déstabiliser et sont redispersables dans l’eau.
9.1. Matériel et méthodes
9.1.1. Préparation d’une émulsion primaire
Phase aqueuse
Une solution aqueuse comprenant 2 % massique de Glc-AHESU et 10 % de lactose est préparée. Le lactose est ajouté dans la phase aqueuse comme agent cryoprotecteur.
Le pH de la solution aqueuse est ajusté à pH=6 à l’aide d’une solution de NaOH.
Phase huileuse
Le dodécane est utilisé comme huile modèle.
Emulsification
L’huile est ajoutée lentement à la solution aqueuse tout en homogénéisant à l’aide d’un Ultra Turrax T25 (Janke & Kunkel, I KA) réglé à 3000 rpm.
Le pourcentage en huile est de 20 % massique.
La préparation est ensuite mise sous agitation pendant 10 minutes en augmentant la vitesse de l’Ultra Turrax à 9 500 rpm.
Une émulsion primaire est obtenue. Son diamètre moyen est de 4,94 pm (P = 0.27) (Figure 22).
9.2.2. Préparation de l’émulsion sèche
Une émulsion sèche est obtenue en lyophilisant l’émulsion primaire préalablement congelée à -80°C.
9.2.3. Redispersion de l’émulsion sèche
L’émulsion sèche est redispersée en rajoutant de l’eau pure en quantité équivalente à celle évaporer lors du séchage.
9.3. Résultats
Les résultats montrent qu’une émulsion primaire préparée avec Glc-AHESU peut être mise sous forme d’émulsion sèche et redispersée sous faible agitation. Aucune exsudation d’huile n’est observée à l’issue du séchage et le diamètre moyen de l’émulsion redispersée est inférieur à 10 pm (Figure 22)
Exemple 10 : Etude des propriétés antimicrobiennes des produits de glucosylation
10.1. Matériel et méthodes
Des souches d’E. Coli K12 sont cultivées en présence de concentration de 0 % w/v, 0,5 % w/v, 1 % w/v, 2 % w/v et 2,5 % w/v de produits de glucosylation de AHUD ou AEA en phase aqueuse.
L’absorbance des cultures en présence des produits de glucosylation de AHUD ou AEA est suivie à une densité optique de 600 nm.
10.2. Résultats
Les résultats (Figure 23) montrent que les produits de glucosylation de l’AHUD et de l’AEA sont bactériostatiques pour des teneurs de 1 % w/v.
Claims
1. Procédé de préparation d’au moins un glycolipide répondant à la formule (I) : [Glc]n-xOy-R (I) dans laquelle
[Glc]n représente un motif osidique linéaire ou ramifié comprenant n unités glucosyle, avec n compris entre 1 et 7, avec la condition que lorsque le motif osidique comprend plusieurs unités glucosyle celles- ci sont liées entre elles par des liaisons osidique de type a ;
R représente un radical acide gras comprenant entre 4 et 24 atomes de carbone, dont la chaine carbonée est linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, optionnellement interrompue par un ou plusieurs atomes de soufre, optionnellement encore pouvant comprendre un ou plusieurs substituant(s) choisi(s) parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, le groupe amine, le groupe nitrosyle, et le groupe thiol, -xOy- symbolise le rattachement du radical acide gras au motif osidique par une liaison éther reliant un atome de carbone Cx d’un résidu glucosyle du motif osidique, antérieurement portant un groupe hydroxyle, à un atome de carbone Gy du radical acide gras, antérieurement portant un groupe hydroxyle, avec Cx la position de l’atome du résidu glucosyle sur lequel s’effectue la liaison, Cx représentant l’atome de carbone C1 du résidu glucosyle, Cy étant un atome de carbone positionné le long de la chaine carbonée du radical acide gras ou à l’extrémité oméga de celle-ci ; ledit procédé comprenant une étape de glucosylation d’un acide gras hydroxylé de formule (II) :
R-yOH (ll) dans laquelle R est un radical acide gras tel que défini dans la formule (I), -yOH représente un groupe hydroxyle rattaché à un atome de carbone Cy tel que défini ci- dessus ; ladite étape comprenant la mise en contact de l’acide gras hydroxylé de formule (II) avec au moins une a-transglucosylase de la famille GH70 en présence de saccharose ou d’un analogue de saccharose.
2. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel l’a-transglucosylase de la famille GH70 est une saccharase de branchement de la famille GH70, une glucane- saccharase de la famille GH70, ou un mélange de celles-ci.
3. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la saccharase de branchement de la famille GH70 pour séquence d’acides aminés une séquence choisie dans le groupe comprenant GBD-CD2 AN123 (SEQ ID NO : 1 ), BRS-A (SEQ ID NO : 2), BRS-B A1 (SEQ ID NO : 3), BRS-C (SEQ ID NO : 4), BRS-D A1 (SEQ ID NO : 5), BRS-E A1 (SEQ ID NO : 6), ou une séquence d’acides aminés présentant au moins 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % d’homologie de séquence avec au moins l’une des séquences SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 6.
4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel la saccharase de branchement de la famille GH70 pour séquence d’acides aminés une séquence choisie dans le groupe comprenant GBD-CD2 AN123 W2135L F2136L (SEQ ID NO :7), GBD-CD2 AN123 W2135L (SEQ ID NO : 8), GBD-CD2 AN123 W2135I F2136Y (SEQ ID NO: 9), GBD-CD2 AN123 W2135I F2136C (SEQ ID NO :10), GBD-CD2 AN123 W2135V (SEQ ID NO : 11 ) ), ou une séquence d’acides aminés présentant au moins 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % d’homologie de séquence avec au moins l’une des séquences SEQ ID NO : 7 à SEQ ID NO : 11 .
5. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’étape i) est de préférence réalisée avec un rapport molaire saccharose ou analogue de saccharose : acide gras hydroxylé de formule (II) compris entre 1 et 100, de préférence entre 10 et 100.
6. Glycolipide répondant à la formule (I) : [Glc]n-xOy-R (I) dans laquelle [Glc]n représente un motif osidique linéaire ou ramifié comprenant n unités glucosyle, avec n compris entre 1 et 7, avec la condition que lorsque le motif osidique comprend plusieurs unités glucosyle celles- ci sont liées entre elles par des liaisons osidique de type a ;
R représente un radical acide gras comprenant entre 4 et 24 atomes de carbone, dont la chaine carbonée est linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, optionnellement interrompue par un ou plusieurs atomes de soufre, optionnellement encore pouvant comprendre un ou plusieurs substituants choisis parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, le groupe amine, le groupe nitrosyle, et le groupe thiol, -xOy- symbolise le rattachement du radical acide gras au motif osidique par une liaison éther reliant un atome de carbone Cx d’un résidu glucosyle du motif osidique, antérieurement portant un groupe hydroxyle, à un atome de carbone Cy du radical acide gras, antérieurement portant un groupe hydroxyle, avec Cx la position de l’atome du résidu glucosyle sur lequel s’effectue la liaison, Cx représentant l’atome de carbone C1 du résidu glucosyle, Cy étant un atome de carbone positionné le long de la chaine carbonée du radical acide gras ou à l’extrémité oméga de celle-ci.
7. Glycolipide selon la revendication 6, dans lequel l’atome de carbone Cy est un atome de carbone positionné à l’extrémité oméga du radical acide gras.
8. Glycolipide selon l’une quelconque des revendications 6 ou 7, dans lequel le glycolipide répond à la formule (la) :
[Glc]n-xOy-(CH2)b-S-(CH2)a-COOH dans lequel a est compris entre 9 et 14, b est supérieur ou égal à 2, et la somme de a et b est inférieure à 23.
9. Glycolipide selon l’une quelconque des revendications 6 ou 7 dans lequel le glycolipide répond à la formule (Ib) :
[Glc]n-xOy-(CH2)a-COOH (Ib) dans lequel a est compris entre 3 et 23, de préférence est compris entre 10 et 15.
10. Glycolipide selon la revendication 6, dans lequel le radical acide gras est substitué par un ou deux groupes hydroxyle, et de préférence dans lequel : l’atome de carbone Cy est un atome de carbone positionné à l’extrémité oméga, et la chaine carbonée du radical acide gras est substituée par un ou deux groupes hydroxyle positionnés le long de la chaine carbonée, ou
l’atome de carbone Cy est un atome de carbone positionné le long de la chaine carbonée, et la chaine carbonée du radical acide gras est substituée par deux groupes hydroxyle, avec un groupe hydroxyle positionné le long de la chaine carbonée et un groupe hydroxyle positionné en position oméga de celle-ci, ou avec deux groupes hydroxyle positionnés le long de la chaine carbonée.
11. Utilisation d’un glycolipide de formule (I) tel que défini à l’une quelconque des revendications 6 à 10, à titre d’agent antimicrobien.
12. Utilisation d’un glycolipide de formule (I) tel que défini à l’une quelconque des revendications 6 à 10, à titre d’agent tensioactif.
13. Emulsion huile-dans-eau comprenant une phase huileuse dispersée dans une phase aqueuse et au moins un glycolipide de formule (I) tel que défini à l’une quelconque des revendications 6 à 10, caractérisée en ce que l’émulsion est cinétiquement stable lorsque le pH de la phase aqueuse est supérieur à un potentiel hydrogène seuil pHs avantageusement compris entre 2 et 5.
14. Emulsion selon la revendication 13 sous la forme d’une émulsion sèche.
15. Utilisation d’une émulsion selon la revendication 14 pour le nettoyage de surfaces.
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