WO2023166269A1 - Reconstituted-skin model - Google Patents

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WO2023166269A1
WO2023166269A1 PCT/FR2023/050288 FR2023050288W WO2023166269A1 WO 2023166269 A1 WO2023166269 A1 WO 2023166269A1 FR 2023050288 W FR2023050288 W FR 2023050288W WO 2023166269 A1 WO2023166269 A1 WO 2023166269A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
skin
model
expression
active ingredient
microbiota
Prior art date
Application number
PCT/FR2023/050288
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French (fr)
Inventor
Carine JACQUES
Martine MAITRE
Pascale BIANCHI
Hélène DUPLAN
Sandrine BESSOU TOUYA
Original Assignee
Pierre Fabre Dermo-Cosmetique
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pierre Fabre Dermo-Cosmetique filed Critical Pierre Fabre Dermo-Cosmetique
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C12N5/0629—Keratinocytes; Whole skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0697—Artificial constructs associating cells of different lineages, e.g. tissue equivalents
    • C12N5/0698—Skin equivalents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/36—Lipids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/72—Undefined extracts from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2529/00—Culture process characterised by the use of electromagnetic stimulation
    • C12N2529/10—Stimulation by light

Definitions

  • the field of the invention relates to a new skin model integrating a microbial component and a lipid component.
  • This model is particularly suitable for studying and developing new active ingredients/products in the dermo-cosmetic field. Indeed, to this integrated model, a physical or chemical stress can be added to reproduce lesions or pathological situations, which can cause imbalances in the skin microbiota.
  • the skin is much more than an outer envelope, it is indeed a real organ necessary for life. It constitutes a ground of exchange between our internal environment and the external environment and is therefore exposed to multiple attacks and variations to which it adapts permanently.
  • the skin therefore ensures, among other things, a real barrier function, formerly attributed to its structure and composition alone.
  • the skin is made up of cells grouped together to form a fabric that is both resistant and flexible. These cells are divided into three layers: the hypodermis, the dermis and the epidermis.
  • the hypodermis is the deepest layer of the skin. It is made up of white adipose tissue which helps protect the body from shocks, builds up an energy reserve and thermoregulates the body.
  • the dermis is the layer between the hypodermis and the epidermis. It is the thickest layer of the skin.
  • the dermis houses blood and lymphatic vessels, nerves, sweat glands that produce sweat, and pilosebaceous follicles. It is mainly composed of macromolecules, fibroblast cells and immune system cells.
  • the epidermis is the thinnest surface of the skin. It is made up of 90% keratinocytes which are used to synthesize keratin and, thanks to their differentiation, ensure impermeability and protection for the skin.
  • the epidermis is made up of four main layers: the basal layer (basal stratum), made up of keratinocytes with large nuclei, which ensure the constant renewal of the epidermis; the spinous layer (stratum spinosuni), made up of voluminous keratinocytes which gradually flatten as they move towards the upper layers; the granular layer (stratum granulosuni), composed of flattened keratinocytes which allow the keratinocytes to be transformed into comeocytes (anucleate cells) and finally the horny layer (stratum corneum), the upper layer composed of comeocytes which will desquamate.
  • the epidermis is not only composed of comeocytes but also of lipids between these different cells. Lipids are organized in the form of lipid bilayers. The main classes of these lipids are ceramides, cholesterol and free fatty acids. They partly ensure the barrier function of the skin.
  • Sebum is a hydrolipidic film produced by the sebaceous glands. It is excreted on the surface of the skin where it will form a protective layer, but also serve as a substrate for the skin microbiota.
  • the sebum is mainly lipophilic and anaerobic, and will therefore allow the preservation of lipophilic and anaerobic microbial species. It will also protect the skin by lubricating it and acidifying it to regulate the skin's pH.
  • the skin microbiota also plays a key role in the protective functions of the skin. It also participates in the regulation of the pH of the skin.
  • the skin microbiota also called skin flora, is located in the epidermis. It is made up of microorganisms such as bacteria, viruses, fungi and parasites.
  • the skin microbiota evolves as you age, reaching an average of 1,000 billion bacteria, and 1,000 species of viruses, parasites and fungi.
  • bacteria the most known and studied strains are Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis and Cutibacterium acnes. Some are aerobic and therefore live with the supply of oxygen and others are anaerobic and live deeper in the stratum corneum without the supply of oxygen. Some of these bacteria produce fatty acids, others antimicrobial peptides and in some cases even amino acids. Most of these bacteria use sebum lipids to grow and produce these compounds.
  • the skin microbiota varies quantitatively and qualitatively from one person to another. Variables such as age, sex, immune system, pH, temperature or even humidity can modify the composition of the microbiota of the skin. For example, the use of cosmetic or pharmaceutical products create differences. However, two distinct categories can be identified within the skin microbiota: “resident” flora and “transient” flora.
  • the resident skin flora lives in total symbiosis with the skin. These are called commensal organisms. It is important for the defense against pathogenic microorganisms, because the place it occupies saturates the space and prevents the attachment of undesirable organisms.
  • the transient flora does not establish itself permanently on the surface of the skin, it varies during the day, depends on the activities carried out and variations in the surrounding conditions. It can be present for a few hours or a few days.
  • the microorganisms that make it up are mostly harmless, called saprophytes.
  • This flora can also consist of opportunistic pathogenic bacteria and lead to diseases, if the host defenses weaken.
  • One of the most common transient species is S. aureus, implicated in atopic dermatitis (AD).
  • the microorganisms present on the skin and making up the resident flora are not opportunistic, they perform very useful functions for the protection of the organism. Indeed, the skin microbiota plays different roles in maintaining the integrity of our skin. It constitutes a barrier by regulating the homeostasis of the skin, by supplying it with nutrients or even by competing with pathogens.
  • S. epidermidis for example, secretes antimicrobial peptides against S. aureus.
  • Corynebacterium striatum and C. acnes inhibit the expression of virulence genes of the latter (Sanford and Gallo, Seminars in Immunology, 25, pp370-7, 2013).
  • dysbiosis The symbiosis between host and microorganisms is particularly essential for the good health of the skin. When this balance is broken, it is called dysbiosis. It has been shown in numerous studies that dysbioses are correlated with the appearance of certain inflammatory skin pathologies, such as acne, atopic dermatitis or eczema. Understanding the interactions between the cutaneous microbiota and the skin is therefore an issue in the development of new cosmetic and pharmaceutical treatments.
  • lipids having a protective role for the skin and the microbiota and which are secreted by the sebaceous glands does not contain viable keratinocytes.
  • viable keratinocytes does not contain viable keratinocytes.
  • 3D models of reconstructed epidermis with a microbial compound have also been used to study the interactions between the microbiota and the skin (Rademacher et al., Experimental Dermatology, 27, pp489-494, 2018).
  • most of these models include the colonization of a single species of microorganism, such as C. amycolatum, and therefore do not reflect the actual conditions of our skin. The presence of lipids in the models healthy skin is also not described.
  • the inventors have developed a new skin model comprising a microbial component and a lipid component which advantageously makes it possible to approach real skin.
  • the cost associated with such a model is notably reduced compared to explants.
  • this model can be used with different stresses to mimic skin disorders. Indeed, the inventors observed in particular that the application of an exogenous stress on the skin model induced molecular and metabolic characteristics similar to those observed in vivo in subjects having skin exposed to the sun or to inflammatory conditions.
  • the model can advantageously be used as a tool to screen active ingredients or even cosmetic or pharmacological formulations of interest.
  • the first object of the invention therefore relates to a reconstituted skin model comprising:
  • Another object of the invention relates to a method for obtaining a model of reconstituted skin comprising: a) Supply of a skin substitute, b) Application to said skin substitute, concomitantly or sequentially, of a component microbial and a lipid component.
  • the invention also relates to a screening method for the in vitro identification of an active ingredient or of a cosmetic formulation for preventing and/or improving at least one skin disorder induced following at least one exogenous stress comprising the following steps: a ) Applying said active ingredient or said cosmetic formulation to the reconstituted skin model according to the invention; b) The realization of at least one exogenous stress on said model; c) At least one measurement of the level of expression of at least one biological marker; And d) Determining whether said active ingredient or said cosmetic formulation makes it possible to prevent and/or improve at least one skin disorder as a function of at least one level of expression measured in step c).
  • the invention also relates to a method for evaluating the in vitro efficacy of an active ingredient or of a cosmetic formulation for preventing and/or treating at least one skin disorder induced following at least one exogenous stress comprising the following steps: a) Applying said active ingredient or said cosmetic formulation to the reconstituted skin model according to the invention; b) The realization of at least one exogenous stress on the said model; c) At least one measurement of the level of expression of at least one biological marker; and d) Evaluating the efficacy of said active ingredient or of said cosmetic formulation as a function of at least one level of expression measured in step c).
  • the invention also relates to a method for in vitro evaluation of the tolerance of an active ingredient or of a cosmetic formulation, comprising the following steps: a) The application of the said active ingredient or of the said cosmetic formulation on the reconstituted skin model according to invention; b) At least one measurement of the level of expression of at least one biological marker in the skin model of step a); and c) Assessing whether said active ingredient or cosmetic formulation is well tolerated by the skin model.
  • the invention finally relates to a kit comprising a microbial component and a lipid component intended to be applied to a skin substitute, the microbial component comprising at least four genera of microorganisms selected from the genera Cutibacterium, Staphylococcus, Streptococcus, Burkholderia, Finegoldia, Gemella, Veillonella, Kocuia, Corynebacterium, Methylobacterium, and Brevibacterium.
  • the invention relates to a reconstituted skin model comprising:
  • skin substitute is meant a culture of skin cells composed of at least one layer.
  • the skin substitutes according to the invention include in particular cultures of skin cells in monolayer, cultures of skin cells in bilayer and tissue models, including cultures of reconstructed epidermis or of reconstructed skin. Indeed, as it is often difficult to work on fresh explants, it is particularly advantageous, in the context of the present invention, to use cutaneous cell cultures.
  • reconstructed epidermis is meant an epidermis generated in vitro by conventional techniques well known to those skilled in the art (cf., for example, Limât and Hunziger.
  • reconstructed skin is meant a culture containing at least two compartments: a dermal compartment, and an epidermal compartment.
  • the epidermal component of the reconstructed skin contains keratinocytes.
  • the dermal component contains fibroblasts.
  • the skin cells comprise normal, healthy or pathological cells which can cause skin disorders, or cells resulting from lines.
  • Cultured skin cells can in particular be obtained from skin tissue explant.
  • explant or “skin explant” is meant here a removal of cells or of skin tissue, which can be carried out for a surgical purpose or to carry out analyses.
  • an explant can be obtained during surgical excision.
  • excision we mean here a surgical intervention consisting in cutting (excising) a more or less large or deep part of the skin to treat an anomaly or an outgrowth. Excision is performed either to remove a tumor that is cancerous or suspected of being cancerous, or to treat a benign skin abnormality that is bothersome, whether for functional or aesthetic reasons.
  • An excision within the meaning of the invention includes, for example, skin samples obtained after plastic surgery (mammaplasty, abdominal surgery, facelift, preputial removal, otoplasty, that is to say ear reattachment, syndactyly or supernumerary finger, etc. .).
  • An explant can also be obtained by biopsy.
  • biopsy is meant here a sample of cells or skin tissue taken for analysis purposes. Several types of biopsy procedures are known and practiced in the field.
  • incisional biopsy in which only a sample of the tissue is taken
  • excisional biopsy or surgical biopsy
  • needle biopsy in which a sample of tissue is taken with a needle, which can be large or fine.
  • others types of biopsy exist, such as smear or curettage, for example, and are also included in the present invention.
  • said skin cells can be obtained by differentiation of stem cells (Guenou et al., Lancet, 374(9703): 1745-1753, 2009; Nissan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 108(36) : 14861-14866, 2011; Kraehenbuehl et al., Nature Methods, 8: 731-736, 2011).
  • Said stem cells are not human embryonic stem cells.
  • the skin cells according to the invention comprise at least one type of cells usually present in the hypodermis, the dermis and/or the epidermis. . These cells thus include, inter alia, keratinocytes, melanocytes, fibroblasts, adipocytes, endothelial cells, mast cells, Langerhans cells and/or Merkel cells.
  • the skin cells according to the invention comprise at least keratinocytes and/or fibroblasts. More preferably, the skin cells according to the invention comprise keratinocytes and/or fibroblasts.
  • the skin substitute is cultured and/or stored under conditions maintaining, at least partially, cellular metabolism and/or cellular functions.
  • the culture of the skin substitute therefore includes both cultures of skin cells in monolayer (eg of keratinocytes) or cultures of skin cells in bilayer and tissue models, including cultures of reconstructed skin.
  • the reconstructed skin model is selected from the group comprising epidermis models consisting mainly of keratinocytes, skin models comprising a dermis and an epidermis, and skin models comprising a dermis, an epidermis and a hypodermis.
  • the models comprising at least one dermis form tissues of the connective type, while the models comprising at least one epidermis form stratified epithelia comprising the characteristic layers of the tissue considered.
  • stratified epithelia comprising the characteristic layers of the tissue considered.
  • said skin model is an epidermis model comprising a matrix support preferably chosen from: an inert support chosen from the group consisting of a semi-permeable synthetic membrane, in particular a semi-permeable nitrocellulose membrane, a of semi-permeable nylon, a membrane or a sponge of Teflon, a membrane of polycarbonate or of polyethylene, polypropylene, of semi-permeable polyethylene terephthalate (PET), a semi-permeable inorganic Anopore membrane, of acetate or ester of cellulose (HATF), semi-permeable Biopore-CM membrane, semi-permeable polyester membrane; in this group we find the reconstructed Epidermis models (Skinethic®) as well as the EpiDerm® model, (Mattek Corporation); a film or a membrane based on hyaluronic acid and/or collagen and/or fibronectin and/or fibrin.
  • an inert support chosen from the group consisting of a semi-per
  • Laserskin® Fidia Advanced Biopolymers
  • Episkin® L'Oréal
  • These models can be seeded by fibroblasts in the dermal part.
  • fibroblasts may or may not be integrated, serve as a support for the seeding of keratinocytes and the reconstitution of the epidermis.
  • pigment cells, immunocompetent cells, nerve cells are introduced; preferably immunocompetent cells are Langerhans cells.
  • the matrix support is then seeded with keratinocytes to reconstruct the epidermis and finally obtain reconstructed skin.
  • the skin model used comprises a model in which at least one complementary cell type has been incorporated, such as endothelial cells (EC) and/or immune cells such as lymphocytes, macrophages, mast cells, dendritic cells and/or cells fat and/or skin appendages, such as body hair, hair, sebaceous glands.
  • EC endothelial cells
  • immune cells such as lymphocytes, macrophages, mast cells, dendritic cells and/or cells fat and/or skin appendages, such as body hair, hair, sebaceous glands.
  • the reconstituted skin model of the invention is particularly simple to implement. In addition, it does not require the use of a particular commercial cell line, and is advantageously adaptable.
  • microbial component is meant a set of microorganisms composed of at least four different genera of bacteria.
  • the microbial component is a skin microbial component.
  • cutaneous microbial component is meant a set of microorganisms composed of at least four different genera of bacteria, said at least four genera of bacteria being present on the skin of a subject, preferably of a human subject.
  • the microbial component comprises at least four, five, six, seven, eight, nine, or ten genera of microorganisms selected from the genera Cutibacterium, Staphylococcus, Streptococcus, Burkholderia, Finegoldia, Gemella, Veillonella, Kocuia, Corynebacterium, Methylobacterium, and Brevibacterium, more preferably the set of genera described above.
  • the at least four genera includes the following genera: Cutibacterium, Staphylococcus, Streptococcus, and Burkholderia.
  • the microbial component may also include one or more genera or species of fungus and/or virus.
  • the microbial component corresponds to the microbiota of the skin of at least one subject.
  • microbiota is meant the set of microorganisms present in an environment.
  • the skin microbiota therefore corresponds to the set of microorganisms present on the skin.
  • the composition of the microbiota can vary depending on the site of the skin.
  • the cutaneous microbial component corresponds to the microbiota of the skin face, preferably the forehead, of at least one subject.
  • the cutaneous microbial component comes from a sample taken from at least one subject, more preferentially at the level of the face and even more preferentially at the level of the forehead.
  • the sampling of the microbial component can be done on an area of skin affected by a skin disorder such as, for example, an inflammatory dermatosis.
  • a skin disorder such as, for example, an inflammatory dermatosis.
  • the microbial component has a viability of 5,000 RLU (2 x 10 5 CFU/ml) when it is added to the surface of the skin substitute. After 48 hours of incubation, the microbial component preferably has a viability of approximately 100,000 RLU/0.66 cm 2 of skin substitute. Viability is determined using the "BacTiter ATP Lite" kit from Promega.
  • lipid component is meant a mixture of at least two, three or four components chosen from free fatty acids, triglycerides, squalene, wax and/or wax esters, and cholesterol and/or esters of cholesterol.
  • the lipid component is a source of nutrients for at least one bacterial species present in the microbial component.
  • the lipid component makes it possible to protect the skin substitute and/or at least one bacterial species from desiccation.
  • the lipid component comprises a mixture of free fatty acids, triglycerides, squalene, wax and/or wax esters, and cholesterol and/or cholesterol esters.
  • the free fatty acids include C16:0, C18:0, C16:1, C18:1, and/or C18:2.
  • the waxes and/or wax esters comprise C16:0/C16:0, C18:0/C18:0, C16:1/C16:1, and/or Cl 8:1/C18:1.
  • the triglycerides include C16:0, C18:0, C16:1, and/or C 18:1.
  • the lipid component comprises 30 to 50% w/w triglycerides.
  • the lipid component comprises 15 to 30% w/w free fatty acids.
  • the lipid component comprises 25 to 30% w/w waxes and/or wax esters.
  • the lipid component comprises 12-20% w/w squalene.
  • the lipid component comprises 4.5 to 8.5% w/w cholesterol and/or cholesterol esters.
  • the lipid component is composed of 30 to 50% w/w of triglycerides, 15 to 30% w/w of free fatty acids, 25 to 30% w/w of waxes and/or wax esters, from 12 to 20% w/w squalene and from 4.5 to 8.5% w/w cholesterol and/or cholesterol esters.
  • the lipid component comprises 3.0 to 6.0% w/w cholesterol and 1.5 to 2.5% w/w cholesterol esters.
  • the lipid component is in hydrolipid form, ie.
  • the lipid component is sebum.
  • the lipid component comes from a sample taken from at least one subject, more preferably from the face and even more preferentially at the level of the forehead.
  • the lipid component is added at a final concentration of 30 to 70 ug/cm 2 , more preferably at a final concentration of 40 ug/cm 2 of skin substitute.
  • the skin substitute being composed of at least one layer of skin cells, the microbial component and the lipid component are present on the surface of said substitute.
  • subject is meant here any human person, whether an adult or a child.
  • child according to the invention, is meant an individual whose age is less than or equal to 16 years. Are thus included in the category of children according to the invention, newborns, whose age is between 0 and 1 month, infants, who are between 1 month and 2 years old, and children themselves, who are at least 2 years old. A “newborn”, as we understand it here, can be born at term as well as premature.
  • An "adult” within the meaning of the present invention is a person who is not a child, in other words a person over the age of 16.
  • Another object of the invention relates to a method for obtaining a model of reconstituted skin comprising: a) Supply of a skin substitute, b) Application to said skin substitute, concomitantly or sequentially, of a component microbial and a lipid component.
  • the skin substitute is as described above.
  • the lipid component can be applied before the microbial component, or vice versa.
  • the microbial component and the lipid component are mixed together before application to the skin substitute.
  • the microbial component and/or the lipid component is/are applied to the skin substitute using a pipette and a finger cot.
  • the microbial component is applied fresh; in other words, it has not been frozen beforehand.
  • the reconstituted skin is stressed.
  • the method for obtaining further comprises a step of producing at least one exogenous stress.
  • the method for obtaining a model of reconstituted skin is characterized in that the reconstituted skin is stressed and in that the method further comprises a step c) of carrying out at least one stress exogenous.
  • Step c) can be carried out before or after step b) of the process for obtaining the model.
  • step c) can be carried out on the microbial component and/or the component lipid before their application on the skin substitute.
  • step c) is carried out after step b) of the process.
  • exogenous stress is meant any external factor affecting the integrity of the skin and which may lead, where appropriate, to a progressive reduction in the effectiveness of its functions. Exogenous stress can be chemical and/or physical stress.
  • Physical stresses include environmental stresses (eg temperature) and mechanical stresses (eg friction).
  • the physical stress is chosen from ultraviolet radiation, sunlight, infrared, near infrared, heat, hertzian radiation including microwaves and waves from mobile phones, ionizing radiation including beta, gamma, X, non-ionizing radiation , the radiation of a magnetic field, ozone, a change in pressure, heat, cold, friction, stretching, particles.
  • the physical stress is radiation mimicking solar radiation, more preferably radiation in the UV range including UVA and/or UVB; and/or visible light including visible and/or infrared high energy blue light.
  • ultraviolet radiation we mean electromagnetic rays whose wavelength is between 153 nm and 400 nm.
  • exposure to UV according to the invention comprises exposure to UVA and/or UVB.
  • UVA is meant in the sense of the invention radiation whose wavelength is between 400 and 320 nm.
  • UVB is meant in the sense of the invention radiation whose wavelength is between 320 and 290 nm.
  • “Visible light” means radiation whose wavelength is between 400 and 700 nm.
  • “Visible high-energy blue light” means visible light with a wavelength of 400 to 450 nm.
  • infrared we mean radiation whose wavelength is between 700 nm and 2500 nm.
  • the exposure to UV according to the invention comprises or consists of exposure to UVA.
  • the exposure to UV according to the invention comprises or consists of exposure to UVB.
  • the exposure to UV according to the invention comprises or consists of exposure to UVA and to UVB.
  • the exposure to radiation according to the invention comprises or consists of exposure to UVA and/or UVB and/or visible and/or IR high-energy blue light.
  • the wavelengths applied are between 290 and 450 nm or between 290 and 400nm.
  • the skin model is exposed to a single acute UV dose of 16.5 J/cm 2 for approximately 45 minutes.
  • the dose of UVB is between 80 and 150 mJ/cm 2 of UVB; preferably 120 mJ/cm 2 of UVB.
  • the realization of an irradiation can be carried out under conditions well known to the person skilled in the art (cf. for example Lordanov et al, J. Biol. Chem. 1998).
  • the chemical stress is at least one chemical substance whose topical application leads to an alteration of the structure and/or the function of the skin.
  • the chemical stress is at least one allergen, a polluting agent, a surfactant, a solvent, or at least one pro-inflammatory stimulation reagent such as a cytokine; preferably a cocktail of specific cytokines capable of inducing the skin disorder studied.
  • a pro-inflammatory stimulation reagent such as a cytokine; preferably a cocktail of specific cytokines capable of inducing the skin disorder studied.
  • reagents are well known, and are described for example in application WO 2015/014949.
  • the chemical stress comprises one or two components chosen from interleukin 1b, a ligand of the TLR-2 receptor, and a ligand of the TLR-3 receptor.
  • the chemical stress comprises interleukin 1b and optionally the TLR ligand (Poly (1:C) and/or Pam3CSK4, more preferably all three components.
  • Performing chemical stress comprising the application of at least interleukin IL-1 P on the reconstituted skin model advantageously makes it possible to mimic DA
  • other chemical stresses can also make it possible to mimic DA, such as the combination of Poly I:C and TNF ⁇ ; the combination IL4 and IL13; the Poly LC, IL-4, IL13 combination; the IL-4, IL-13, IL-31 and optionally TNF ⁇ combination; the IL-4, IL-13, IL-22, TNF ⁇ combination.
  • particles or molecules can in particular be brought into contact with the skin substitute.
  • particles matter PM10
  • particles matter 10 ⁇ L/cm 2 of solution of fine particles suspended in acetone can be deposited on the surface of the reconstructed epidermis before adding the microbiota and the sebum.
  • benzo(a)pyrene B(a)P
  • B(a)P is a good representative of outdoor pollutants because it leads to very toxic metabolites.
  • TABPA Tetrabisphenol A
  • cortisol is known as the stress hormone.
  • Negative effects may include unwanted visible signs of aging such as fine lines and wrinkles, thinning of the skin, reduced elasticity and reduced functionality of the skin barrier.
  • step (c) may correspond to bringing the skin substitute into contact with cortisol, for example at a concentration of 4 ⁇ M.
  • the invention also relates to a model of reconstituted skin obtained by the method as described here.
  • At least two exogenous stresses are carried out on the reconstituted skin model according to the invention.
  • the invention makes it possible to identify active agents or formulations making it possible to prevent and/or improve at least one skin disorder or to evaluate the effectiveness of the active agents or formulations making it possible to prevent and/or improve at least a skin disorder.
  • the invention makes it possible in particular to distinguish the active agents or the formulations according to their activity for preventing and/or improving at least one skin disorder.
  • the invention therefore also relates to a screening method for the in vitro identification of an active ingredient or of a cosmetic formulation to prevent and/or improve at least one skin disorder induced following at least one exogenous stress comprising the steps following steps: a) Applying said active ingredient or said cosmetic formulation to the reconstituted skin model; b) The realization of at least one exogenous stress on the said model; c) At least one measurement of the level of expression of at least one biological marker; and d) Determining whether said active ingredient or said cosmetic formulation makes it possible to prevent and/or improve at least one skin disorder according to at least one level of expression measured in step c).
  • the invention also relates to a method for evaluating the in vitro efficacy of an active or a cosmetic formulation for preventing and/or treating at least one skin disorder induced following at least one exogenous stress comprising the following steps: a) applying said active ingredient or said cosmetic formulation to the reconstituted skin model; b) The realization of at least one exogenous stress on said model; c) At least one measurement of the level of expression of at least one biological marker; and d) Evaluating the efficacy of said active ingredient or of said cosmetic formulation as a function of at least one level of expression measured in step c).
  • Step a) can be carried out before or after step b) of the screening method for the in vitro identification of an active ingredient or of a cosmetic formulation or in the method for evaluating the in vitro efficacy an active ingredient or a cosmetic formulation.
  • carrying out step a) before step b) can in particular make it possible to evaluate the ability of an active ingredient or cosmetic formulation to prevent at least one skin disorder
  • carrying out step a) after step b) can in particular make it possible to evaluate the ability of an active ingredient or cosmetic formulation to improve at least one skin disorder.
  • the application of the active ingredient of interest to the skin model according to step a) can be done directly.
  • the method further comprises a step of formulating the active ingredient, in particular in the form of a liquid solution, in particular aqueous, prior to step a) of applying said active with a skin model.
  • the candidate active ingredient is an active ingredient for the prevention and/or improvement of at least one skin disorder if said candidate active ingredient makes it possible to modulate the expression of at least one biological marker of the invention.
  • This modulation may correspond, depending on the case, and in particular depending on the nature of the biological marker, to an increase or a decrease in the expression of said marker.
  • the candidate formulation is a formulation for preventing and/or improving at least one skin disorder, if said candidate formulation makes it possible to modulate the expression of at least one biological marker of the invention. This modulation may correspond, depending on the case, and in particular depending on the nature of the biological marker, to an increase or a decrease in the expression of said marker.
  • the in vitro efficacy of an active ingredient or of a cosmetic formulation for preventing and/or treating at least one skin disorder is meant within the meaning of the present application the ability of the formulation or of the active ingredient to cancel or decrease the effects related to at least one skin disorder.
  • Prevention in the present case means treatment that is administered before the development of the skin disorder (i.e. before the realization of an exogenous stress in step b)), while reduction corresponds to a treatment that is administered once the effects of the skin disorder have appeared (i.e. after the achievement of an exogenous stress in step b)).
  • creased means a larger amount, e.g., an amount slightly greater than the original amount, or e.g., an amount in great excess of the original amount. , including all quantities in between.
  • crease may refer to an amount or activity that is at least 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11 %, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% or 20% more than the quantity or activity for which the increased quantity or activity is compared , or at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650%, 700%, 750%, 800%, 900%, 950% , 1000%, 1100%, 1200%, 1300%
  • decreased means a lesser amount, for example, a slightly lower amount than the original amount, or for example a greatly reduced amount compared to the original amount, including all quantities in between.
  • decrease may refer to an amount or activity that is at least 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11 %, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% or 20% less than the quantity or activity for which the decreased quantity or activity is compared , or at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650%, 700%, 750%, 800%, 900%, 950% , 1000%, 1100%, 1200%, 1300%, 1400%, 1500%
  • the level of expression of said marker can be compared with a reference level of expression.
  • step d) making it possible to determine whether the active ingredient or the cosmetic formulation prevents and/or improves at least one skin disorder, can comprise a comparison of the level of expression of the biological marker of step c) with a reference level of expression.
  • a reference level of expression of a biological marker is meant within the meaning of the present application any level of expression of said marker used as a reference.
  • a baseline expression level can be obtained by measuring the expression level of the marker of interest in a normal skin model.
  • a normal skin model can, for example, correspond to a reconstituted skin model obtained from skin cells of a healthy subject or without apparent pathology. It is also possible to use, as a model of normal skin, a model of reconstituted skin without realization of the exogenous stress.
  • the expression of the biological marker can be measured before step b); the level thus determined is then the reference expression level of said biological marker.
  • the reference level of expression of a biological marker corresponds to the level of expression of said marker in the skin model in the absence or in the presence of a particular treatment.
  • the reference level of expression of a biological marker is obtained by measuring the expression of said marker in the skin model which has not been brought into contact with an active ingredient or a formulation and/or which has not been subjected to exogenous stress.
  • the expression of said marker is measured in the skin model treated with an active ingredient or a formulation known to be effective against a skin disorder.
  • step d) is preferably carried out between measurements of expression levels obtained for skin models obtained from skin substitutes of similar, or even identical, histological structures.
  • similar histological structures is meant within the meaning of the present application that the relative proportions of the cell types included in the compared skin models are similar.
  • the relative proportions of the cell types and/or types of microorganisms comprised in the skin model of step a) do not differ by more than 5% from the relative proportions of the cell types and/or of types of microorganisms included in the skin model used to obtain the reference expression level of step d).
  • relative proportion of a cell type is meant within the meaning of the present application the ratio of the number of cells corresponding to this cell type to the number of total cells included in the skin model.
  • the proportion of keratinocytes on the number of total cells in the skin model of step a) does not differ by more than 5% from the proportion of keratinocytes on the number of total cells in the skin model used to obtain the reference expression level of step d).
  • relative proportion of a type of microorganism is meant within the meaning of the present application the ratio of the abundance of a genus or species of microorganism to the number of total microorganisms included in the model of skin.
  • the relative proportion of a genus or species of bacteria is the ratio of the abundance of said genus or species to the number of total bacteria.
  • the relative proportions of the cell types included in the compared skin models are identical.
  • the relative proportions of the cell types included in the skin model of step a) are identical to the relative proportions of the cell types included in the skin model used to obtain the level of expression of reference from step d) when they do not differ by more than 0.1%.
  • the proportion of keratinocytes to the number of total cells in the skin model of step a) does not differ by more than 0.1% from the proportion of keratinocytes to the number of total cells in the skin model used to obtain the reference expression level of step d).
  • step d) is preferably carried out between measurements of expression levels obtained for skin models which are of similar size, volume or weight, or even identical.
  • the size, volume, or weight of the skin model of step a) does not differ by more than 5% from the size, volume, or weight of the skin model used for the obtaining the reference expression level of step d).
  • the size, and the volume and the weight of the skin model of step a) do not differ by more than 5% from the size, the volume and the weight of the skin model used to obtain the level step reference expression d).
  • the size, and the volume and the weight of the skin model of step a) do not differ by more than 0.1% from the size, the volume and the weight of the skin model used for the obtaining the reference expression level of step d).
  • the person skilled in the art can standardize the level obtained in step c) and the reference level in step d ) using a normalization factor.
  • This normalization factor could for example be a directly accessible physical marker such as the mass of cells in the sample, or the mass of a cellular constituent, such as the mass of cellular DNA or the mass of cellular proteins.
  • the level of expression of a housekeeping gene is used as a normalization factor.
  • the level obtained in step c) and the reference level in step d) are normalized using the level of expression, not of the housekeeping genes, but of the proteins coded by those -this.
  • a housekeeping gene is a gene expressed in all cell types, which encodes a protein with a basic function necessary for the survival of all cell types.
  • the housekeeping genes according to the invention include for example the RPS28, GAPDH, B2M, TFRC, YWHAZ, RPLO, 18S, GUSB, UBC, TBP, GAPDH, PPIA, POLR2A, ACTB, PGK1, HPRT1, IPO8 and HMBS genes.
  • Step c) is carried out after steps a) and b).
  • the determination of step d) will advantageously be done by comparing the level of expression of step c) with a reference level of expression (see above).
  • the skin model which has not been treated with the active ingredient or the formulation can be used as a control.
  • the level of expression of the biological marker of the invention is measured in said skin model before and after application of the active ingredient or of the cosmetic formulation.
  • the level of expression of the biological marker of the invention is measured in a skin model without application of the active ingredient or of the cosmetic formulation and in a skin model with active ingredient or of the cosmetic formulation .
  • the level of expression of the biological marker of the invention can also be compared with that measured in vivo in normal skin or in vivo in skin having undergone exogenous stress.
  • normal skin is meant here skin originating from a healthy subject or one with no apparent skin pathology.
  • the reference expression level is preferably the expression level of said biological marker in a skin model which has not been in contact with the active ingredient or the formulation, which makes it possible to carry out a significant comparison between the expression level of step c) and said reference level.
  • a skin model that has not been treated with the active ingredient or the formulation i.e. without performing step a) or before performing step a)
  • the level of expression of the biological marker of the invention is measured in said skin model with and without application of the active agent or the cosmetic formulation (or before and after performing step a)).
  • the method of the invention may also comprise a comparison of cell viability in the skin model treated with the active ingredient or the formulation and in the control sample.
  • the active agent or the cosmetic formulation is well tolerated by the skin if the cell viability of the sample is not affected by the presence of the active agent or the cosmetic formulation.
  • the method of the invention therefore comprises an additional step of determining the cell viability in the skin model treated with the active ingredient or the cosmetic formulation, of determining the cell viability in the sample control and comparison between the two.
  • skin disorders it is here understood all the abnormal reactions which can occur on the skin of an individual. These conditions affect both the skin itself (i.e. the epidermis, dermis and/or hypodermis), as well as the pores of the skin, the sweat and sebaceous glands attached to it, and/or the microbiota.
  • the skin disorders according to the invention result more particularly in lesions, which corresponds to skin that is damaged or in poor condition.
  • Damaged skin includes for example reactive sensitive skin, dry skin (xerosis), skin damaged by the sun, by radiation, by cold, by stress or by pollution, by an allergy, by hives, by eczema and other forms of dermatitis such as atopic dermatitis, impetigo, irritative dermatitis, in particular irritative diaper dermatitis or diaper rash, contact dermatitis, seborrheic dermatitis of the skin and scalp ( cradle cap), psoriasis, Lainer-Moussous disease, or wounds or burns.
  • skin disorder we thus means disorders as diverse as scabs, angiomas (including tuberous, subcutaneous or flat), hemangiomas, infant acne, adolescent acne, ichthyosis (eg vulgaris, congenital, harlequin...), rosacea, pruritus, etc.
  • a skin disorder can also be caused or exacerbated by an external infection, for example of parasitic, viral, bacterial or fungal origin.
  • parasitic, viral, bacterial or fungal origin are thus included in particular in skin disorders warts, prurigo strophulus, scabies, pediculosis of the scalp, or even mycoses.
  • the latter are parasitoses caused by the proliferation of parasitic microscopic fungi in the body.
  • the skin disorder is chosen from disorders linked to ageing, pollution, radiation; inflammatory dermatoses, preferably atopic dermatitis, acne, psoriasis; rosacea; pruritus; impaired barrier function; reactive skin; xeroses.
  • biological marker is meant within the meaning of the present application a characteristic which is objectively measured and evaluated as an indicator of normal biological processes, of pathogenic processes, or of pharmacological responses to a therapeutic intervention.
  • a biological marker therefore designates a whole range of substances and various parameters.
  • a biological marker can be a substance whose detection indicates a particular pathological state (for example the presence of C-reactive protein as a marker of an infection), or on the contrary a substance whose detection indicates a physiological state. specific.
  • said biological marker is a biological marker of a skin disorder if its level of expression is different in healthy skin and in skin exhibiting the clinical characteristics of said skin disorder.
  • said marker characterizes a skin disorder if said marker is differentially expressed in a skin model in which an exogenous stress has been carried out and the skin model not having undergone exogenous stress. This results in a ratio in step d) that is different from 1 when the expression level measurement is compared between these two conditions.
  • the biological marker according to the invention is preferably a gene, the products of a gene such as its transcripts and the peptides derived from its transcripts, a lipid, a sugar or a metabolite.
  • a gene such as its transcripts and the peptides derived from its transcripts, a lipid, a sugar or a metabolite.
  • biological markers according to the invention are in particular provided in Table 1, as well as below.
  • many methods are available to the person skilled in the art for measuring the expression of said biological marker.
  • at least two, three, four, five, six, seven, eight, nine, or ten biomarkers are measured. Said biomarkers are discriminating, thus making it possible to screen cosmetic actives or formulations for preventing or treating skin disorders or to evaluate the effectiveness of cosmetic actives or formulations for preventing or treating skin disorders.
  • the biological marker of the invention is advantageously a marker selected from markers of inflammation, oxidative stress, barrier function, and/or microbial component.
  • the biomarker can be measured in the skin substitute and/or in the microbial component/lipid component which are present on the surface of said model skin substitute.
  • the biomarker is measured at least in the microbial component, preferably in the microbial component.
  • the biological marker is measured at least in the skin substitute, preferably in the skin substitute.
  • the "markers of inflammation” include markers which are modulated during an inflammatory response in the skin. They include cytokines, such as IL-8 or TSLP, as well as anti-microbial peptides, such as psoriasin, encoded by the S100A7 gene, and beta-defensin 2, encoded by the DEFB4A gene.
  • cytokines such as IL-8 or TSLP
  • anti-microbial peptides such as psoriasin, encoded by the S100A7 gene, and beta-defensin 2, encoded by the DEFB4A gene.
  • the IL-8 protein is a cytokine which is induced early in cutaneous inflammation. It is in particular produced by de novo synthesis in keratinocytes stimulated by ILla and/or TNF. It is therefore a predictive marker of a biological response, even in the absence of visible signs of skin irritation.
  • the protein sequence of human interleukin IL-8 corresponds to the NCBI reference sequence: NP 000575. This protein is encoded by the human IL8 gene (NCBI reference: Gene ID: 3576). The sequence of this one is accessible under the NCBI reference: NM_000584.
  • the TSLP protein is an inflammatory cytokine characteristic of AD. Its secretion is clearly stimulated in the case of atopic dermatitis and promotes the initiation of an inflammatory response by Th2. Therefore, it is a good marker of AD. Other markers, such as RANTES/CCL5, MCP-3/CCL7 and/or IL-6 are also indicative of AD and can be measured within the scope of the present invention.
  • the "markers of oxidative stress" according to the invention include markers which are expressed in the skin and/or in the microbial component in the event of oxidative stress.
  • the oxidative stress markers are metabolites.
  • at least one metabolite of xanthine, uric acid, and glutathione is measured.
  • the “barrier function markers” according to the invention include markers which are specifically expressed in the outermost layers of the epidermis and which participate in the barrier function.
  • the barrier function markers according to the invention are markers expressed in the stratum corneum or markers expressed in the tight junctions of the stratum granulosum.
  • markers include in particular claudins, including claudin-1 (CLDN1), transglutaminases, such as for example transglutaminase 1 (TGM1), keratins, in particular keratin 1 (KRT1) and keratin 10 (KRT10), peptidyl arginine human deiminase type 1 (PAD1), caspase 14 (CASP14), aquaporin 3 (AQP3), loricin (LOR), sciellin (SCEL), BARX Homeobox protein 2 (BARX2), desmoglein-1 (DSG1 ), filaggrin (FLG), involucrin (IVL), sphingomyelinase or sphingomyelin diesterase (SMPD), comeodesmosine (CSDN), etc.
  • CLDN1 claudin-1
  • transglutaminases such as for example transglutaminase 1 (TGM1)
  • keratins in particular keratin 1 (
  • the barrier function markers comprise one or more barrier function discriminating metabolites.
  • at least one metabolite of octanoic acid, serine, glutamate, phosphorylcholine, histidine, L-glutamine, L-alanine, methionine, and xanthine is measured.
  • the "microbial component markers” include markers which are modulated in the microbial component in response to an exogenous stress and/or an active ingredient or cosmetic formulation. They include in particular metabolites, such as formate, acetate, glucose and maltose, glycerol, betaine, octanoate, tyrosine, panthenol, phenylalanine.
  • metabolites such as formate, acetate, glucose and maltose, glycerol, betaine, octanoate, tyrosine, panthenol, phenylalanine.
  • the expression of a gene can be measured for example at the nucleotide level, by measuring the amount of transcripts of said gene, and can also be measured for example at the peptide level, by measuring for example the amount of proteins from said transcripts.
  • the level of expression of a gene is meant within the meaning of the invention the measurement of the quantity or of the cellular concentration of product of the gene in its peptide form or in its nucleotide form.
  • the expression of at least one gene e.g. 16S
  • the expression of at least one gene can be measured in order to determine the presence or absence of at least one microorganism in the model microbiota.
  • the expression of the biological marker according to the invention will be detected in vitro from the reconstituted skin model.
  • the method of the invention may comprise one or more intermediate steps between obtaining the reconstituted skin model and measuring the expression of the biological marker, said steps corresponding to the extraction from said reconstructed skin model of a lipid sample, an NMF sample, an mRNA sample (or the corresponding cDNA) or a protein sample. This can then be directly used to measure the expression of the marker.
  • the preparation or extraction of mRNA (as well as the reverse transcription thereof into cDNA), proteins, lipids or NMFs from a sample of skin cells are only well-known routine procedures of the person in the trade.
  • the expression of the marker can be measured.
  • the method used to do this then depends on the type of transformation (mRNA, cDNA or protein) and the type of sample available.
  • transcriptome analysis When the expression of the marker is measured at the mRNA (or corresponding cDNA) level, any technology usually used by the person skilled in the art can be implemented.
  • gene expression level analysis technologies include well-known methods such as PCR (Polymerase Chain Reaction, if starting from DNA), RT-PCR (Reverse Transcription-PCR, if starting from RNA) or quantitative RT-PCR or even nucleic acid chips (including DNA chips and oligonucleotide chips) for higher throughput.
  • nucleic acid chips we mean here several different nucleic acid probes which are attached to a substrate, which can be a microchip, a glass slide, or a bead the size of a microsphere.
  • the microchip can be made of polymers, plastics, resins, polysaccharides, silica or silica-based material, carbon, metals, inorganic glass, or nitrocellulose.
  • the probes can be nucleic acids such as cDNAs (“cDNA chip”), mRNAs (“mRNA chip”) or oligonucleotides (“oligonucleotide chip”), said oligonucleotides typically being able to have a length of between about 25 and 60 nucleotides.
  • cDNA chip cDNA chip
  • mRNA chip mRNA chip
  • oligonucleotide chip oligonucleotides
  • nucleic acid corresponding to all or part of said gene is labeled, then brought into contact with the chip under hybridization conditions, leading to the formation of complexes between said nucleic acid labeled target and probes attached to the chip surface that are complementary to that nucleic acid. The presence of labeled hybridized complexes is then detected.
  • any current or future technology that can determine gene expression based on the amount of mRNA in the sample can be used.
  • the person skilled in the art can measure the expression of a gene by hybridization with a labeled nucleic acid probe, such as for example by Northern blot (for mRNA) or by Southern blot (for cDNA), but also by techniques such as the Serial Gene Expression Analysis (SAGE) method and its derivatives, such as LongSAGE, SuperSAGE, DeepSAGE, etc.
  • SAGE Serial Gene Expression Analysis
  • tissue microarrays also known as TMAs
  • Typical tests employed with tissue microarrays include immunohistochemistry and fluorescent in situ hybridization.
  • tissue microarrays can be coupled with fluorescent in situ hybridization.
  • RNA-Seq or “Whole Transcriptome Shotgun Sequencing”.
  • massive parallel sequencing methods are available. Such methods are described in, for example, US 4,882,127; US 4,849,077; US 7,556,922; US 6,723,513; WO 03/066896; WO 2007/111924; US 2008/0020392; WO 2006/084132; US 2009/0186349; US 2009/0181860; US 2009/0181385; US 2006/0275782; EP-B1-1141399; Shendure & Ji, Nat Biotechnol., 26(10):1135-45, 2008; Pihlak et al., Nat Biotechnol., 26(6):676-684, 2008; Fuller et al., Nature Biotechnol., 27(11):1013-1023, 2009; Tuesdays, Genome Med., 1(4): 40,
  • marker expression When marker expression is measured at the protein level, specific antibodies can be employed, particularly in well-known technologies such as immunoprecipitation, immunohistology, western blot, dot blot, ELISA or ELISPOT, protein chips, antibody chips, or tissue chips coupled with immunohistochemistry.
  • FRET or BRET techniques flow cytometry, microscopy or histochemistry methods, including in particular confocal microscopy, fluorescence microscopy, electron microscopy, atomic force microscopy, methods based on the use of one or more excitation wavelengths and a suitable optical method, such as an electrochemical method (voltammetry and amperometry techniques), and methods of radiofrequency, such as multipolar, confocal and non-confocal resonance spectroscopy, such as the detection of fluorescence, luminescence, chemiluminescence, absorbance, reflectance, transmittance, birefringence or index of refraction (for example, by surface plasmon resonance, or "surface plasmon resonance” in English, by ellipsometry, by resonant mirror method, etc.), radioisotopic or magnetic resonance imaging, analysis by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE); by two-dimensional electrophoresis, by spectrophotometry, by
  • the biological marker is a lipid, in particular a ceramide or a fatty acid, or a metabolite
  • the person skilled in the art can use all the methods at his disposal to measure the lipid content in a sample of skin cells. These methods include, among others, liquid chromatography (HPLC, see for example Sullivan et al., Arch Ophthalmol., 120(12): 1689-99, 2002), liquid chromatography coupled with an evaporative light scattering detector (HPLC-ESD, see Nordbâck et al., J. High Résolut. Chromatogr., 22: 483-486, 1999; Torres et al., J. Chromatogr.
  • HPLC liquid chromatography
  • HPLC-ESD evaporative light scattering detector
  • the NMF assay is a procedure well known to those skilled in the art. In particular, it is possible to measure NMF using in vivo confocal Raman microspectroscopy. This is a commonly used procedure in the field for at least 15 years.
  • the evaluated asset is at least one sunscreen.
  • sunscreen is meant any substance capable of filtering solar radiation to protect a surface, typically the skin or the hair, against the harmful effects of this radiation.
  • the sunscreen is chosen from those conventionally known including organic sunscreens such as triazine derivatives, benzotriazole and phenyl benzotriazole derivatives, dibenzoylmethane derivatives, amino-substituted benzophenone and 2-hydroxybenzophenone derivatives, merocyanine derivatives including methoxypropylamino cyclohexenylidene ethoxyethylcyanoacetate, para-aminobenzoic acid derivatives, salicylic derivatives, cinnamic derivatives, P,P'-diphenylacrylate derivatives, benzylidenecamphor derivatives, phenylbenzimidazole, anthranilic derivatives, imidazoline derivatives, and benzalmalonate derivatives.
  • organic sunscreens such as triazine derivatives, benzotriazole and phenyl benzotriazole derivatives, dibenzoylmethane derivatives, amino-substituted benzophenone and 2-
  • the active evaluated in is at least one sunscreen.
  • the method for evaluating the in vitro efficacy of at least one sunscreen or of a cosmetic formulation comprising it or them for preventing and/or treating at least one skin disorder induced following at least one exogenous stress consisting of UV, infrared, or blue light irradiation.
  • Method for in vitro evaluation of the tolerance of an active ingredient or of a cosmetic formulation comprising the following steps: a) The application of the said active ingredient or of the said cosmetic formulation on the reconstituted skin model; b) At least one measurement of the level of expression of at least one biological marker in the skin model of step a); and c) Assessing whether said active ingredient or cosmetic formulation is well tolerated by the skin model.
  • the active ingredient is an active ingredient which is well tolerated by the skin if said active ingredient does not significantly modulate the expression of the biological marker.
  • the cosmetic formulation is well tolerated if the expression of the biological marker is not significantly modulated by its addition to the reconstituted skin model.
  • a statistical test such as a univariate Wilcoxon test, and having a p value less than 0.05, preferably a p value less than 0.01, more preferably a p-value of less than 0.001.
  • Said modulation may correspond, depending on the case, and in particular depending on the nature of the biological marker, to an increase or a decrease in the expression of said marker.
  • the expression of inflammatory markers is known to be increased when the skin is attacked, for example by exogenous stress.
  • the expression of these markers of inflammation is not affected by well-tolerated active ingredients or formulations.
  • the biological marker of step b) is an inflammation marker, for example among those described here.
  • the tolerance consists in maintaining the balance of the microbial component.
  • maintaining the balance is meant that at least one microorganism, preferably at least one bacterial genus or species, is maintained in the microbial component of the model following application of the cosmetic agent or formulation to the step a).
  • the abundance of said at least one microorganism is not significantly modified following the application of the cosmetic agent or formulation in step a).
  • the presence of the microorganism, or its level of abundance is compared to a condition or reference level, for example in a model in which the agent was not applied or in normal skin in vivo.
  • kits comprising a microbial component and a lipid component intended to be applied to a skin substitute, the microbial component comprising at least four genera of microorganisms selected from the genera Cutibacterium, Staphylococcus, Streptococcus, Burkholderia, Finegoldia, Gemella, Veillonella, Kocuia, Corynebacterium, Methylobacterium, and Brevibacterium.
  • the microbial component comprises at least five, six, seven, eight, nine, or ten genera of microorganisms selected from the genera Cutibacterium, Staphylococcus, Streptococcus, Burkholderia, Finegoldia, Gemella, Veillonella, Kocuia, Corynebacterium, Methylobacterium, and Brevibacterium, more preferably the set of genera described above.
  • the at least four genera includes the following genera: Cutibacterium, Staphylococcus, Streptococcus, and Burkholderia.
  • the microbial component may also include one or more genera or species of fungus and/or virus.
  • the microbial component corresponds to the microbiota of the skin of at least one subject.
  • microbiota we mean the set of microorganisms present in an environment.
  • the skin microbiota therefore corresponds to the set of microorganisms present on the skin.
  • the composition of the microbiota can vary depending on the site of the skin.
  • the cutaneous microbial component corresponds to the microbiota of the skin of the face, preferably of the forehead, of at least one subject.
  • the cutaneous microbial component comes from a sample taken from at least one subject, more preferentially at the level of the face and even more preferentially at the level of the forehead.
  • the microbial component has a viability of 5000 RLU.
  • the lipid component is as described above.
  • the kit further comprises an instruction manual.
  • the kit further comprises at least one chemical component as described herein.
  • the kit comprises an allergen, a polluting agent, a surfactant, a solvent, or at least one pro-inflammatory stimulation reagent such as a cytokine, or cortisol. Said kit advantageously makes it possible to obtain the reconstituted skin model.
  • the sebum is sampled from the forehead of 10 volunteers with no apparent skin pathology with a standard sampling kit. Each collection tube is then washed 3 times with hexane to extract the sebum. The extracts are then combined and then the solvent is evaporated under vacuum. The mass of sebum collected is checked (eg 1100 mg for a preparation) then the sebum is taken up in 20 ml of hexane. 100 vials of sebum are produced with 9 mg of substance per vial and packaged under argon.
  • the vials are then taken up with 250 ⁇ l of absolute ethanol (Fischer Scientific, Illkirch, France) then diluted to 1/20 th in physiological saline.
  • the sebum was characterized by GC/MS ( Figure 1).
  • microbiota is sampled from 18 volunteers with no apparent skin pathology using a swab soaked in physiological saline (Fischer Scientific, Illkirch, France) containing 0.1% by volume of Triton X-100 (Fischer Scientific , Illkirch, France).
  • the swab is rubbed energetically on the forehead of the donor for 4 seconds.
  • Each swab is then placed in a tube to be centrifuged. After centrifugation, a colorless liquid is recovered (approximately 60 pL) and its volume is adjusted up to 120 pL with saline.
  • Each microbiota is then mixed with the sebum in order to be able to make the deposit.
  • 22 pL of the sebum/microbiota mixture is deposited on the surface of a reconstructed human epidermis and spread using a finger cot.
  • a given sebum/microbiota mixture can be applied to up to 6 reconstructed epidermis.
  • the reconstructed human epidermis are incubated at 32° C., 5% CO2, 60% humidity.
  • the incubation time is set at 48 h which allows to have a sufficient quantity of bacteria without damaging the reconstructed human epidermis.
  • the inventors deposited on the reconstructed epidermis of 0.6 cm 2 , 24 pg of sebum which corresponds to a concentration of 40 pg/cm 2 .
  • Example 2 Establishment of the reconstructed skin model with or without the addition of a stress Methods
  • the epidermis was reconstructed from skin resections from plastic surgery according to the method described by Frankart et al. (Frankart et al., Exp. Dermatol. 2012, 21(11), 871-875).
  • the cells were isolated from skin resections, then cultured before being seeded on culture inserts immersed in culture medium then the culture inserts are placed at the air/liquid interface in an incubator at 37°C in a humidified atmosphere with 5% CO2, to form the stratum corneum.
  • the reconstructed epidermis are placed in a culture medium without antibiotics.
  • the reconstructed epidermis are placed in 12-well plates with maintenance medium without antibiotics (see Frankart et al., 2012) and with Phenol Red.
  • a sebum/microbiota mixture obtained as described in Example 1, is deposited on the surface of each reconstructed human epidermis and spread using a finger cot.
  • the reconstructed human epidermis are seeded with an inoculum of microbiota with a viability of approximately 5000 RLU.
  • the survival of the epidermis is carried out under sterile conditions.
  • Each insert containing an epidermis is placed in a well of a new 12-well plate containing the new maintenance medium alone or supplemented in order to induce stress.
  • the plate is incubated at 32°C under 5% CO2 and 60% relative humidity.
  • the culture medium is renewed every 24 hours up to 48 hours of incubation.
  • the medium used is maintenance medium (1 mL/well) supplemented with interleukin 10 at 0.06 ug/mL, TLR ligand (Poly (1:C) at lOpg/ ml, and Pam3CSK4 at 5pg/ml).
  • the viability of the microbiota is measured using the BacTiter ATP Lite kit, Promega following the supplier's protocol.
  • the viability of the microbiota after culture is evaluated using this same kit.
  • the viability measurement is a bioluminescent test involving luciferase.
  • the amount of light emitted is proportional to the amount of ATP present in the sample and therefore to the number of living cells.
  • a viability reading is carried out in duplicate on the microbiota sampled from each epidermis (BacTiter-Glo Microbial Viability Cell Assay kit, Promega).
  • the ATP mix and the microbiota are placed in each well in a 1:1 ratio.
  • the plate Low Binding Greiner 655209
  • the reading is then carried out using a Clariostar plate reader.
  • the DNA of microorganisms before and/or after growth on reconstructed epidermis is extracted using a Qiacube following the QIAamp DNA Investigator Kit protocol from Qiagen.
  • Droplet Digital PCR is a digital PCR technique based on the generation of droplets using a water/oil emulsion. From a sample, it makes it possible to generate more than 20,000 droplets within which the PCR amplification is carried out. After amplification, each droplet is analyzed to quantify the number of positive droplets in the sample. This technique has the particular advantage of allowing the amplification of DNA present in small quantities in a sample.
  • the ddPCR is performed in a 96-well plate: 5 pL of sample are added to 15 pL of ddPCR mix as explained in the Biorad protocol.
  • the probes used correspond to the species sought, e.g. S. epidermidis, S. aureus, C. acnes.
  • Droplets are generated using Biorad's QX200 Droplets Generator device, then the plate is placed in the thermal cycler for amplification. The plate is then read using Biorad's QX200 Droplet Reader device and analyzed using QuantaSoft software.
  • the sequencing was carried out on a MiSeq sequencer (Illumina) with the primers adapted to each of the targets.
  • the pre-processing of the sequences is carried out by a computer pipeline developed by INRAE running under Mothur (version 1.44.0).
  • the pre-processing of the sequences is carried out by a computer pipeline developed by INRAE running under Mothur (version 1.44.0). Barcodes and primers as well as chimeras were removed from sequence files during filtering steps. The sequences presenting 100% homology between them were grouped into unique sequences, then into OTU (operational taxonomy unit: threshold of 97%) which will be identified subsequently.
  • the bioinformatics analysis of the sequencing data makes it possible to identify the microorganisms present at different taxonomic levels (phylum, genus (e.g. for Staphylococcus), and species (e.g. for C. acnes)).
  • the analysis allowing the phylogenetic affiliation down to the genus level was carried out using bioinformatics tools for processing large amounts of sequence data (Mothur). Identification was performed based on the Greengenes taxonomy for bacteria.
  • the bioinformatics analysis of the sequencing data makes it possible to identify the Staphylococcus present at different taxonomic levels (genus and species are targeted).
  • the analysis allowing the phylogenetic affiliation down to the species level was carried out using bioinformatics tools for processing large amounts of sequence data (Mothur). The identification was carried out on the list of Staphylococcus.
  • barrier function proteins Claudin 1, Filaggrin and TGM1
  • human antimicrobial peptides DEFB4A and S100A7
  • the reconstructed epidermis halves are stored in 300 ⁇ l of a 1% ⁇ -mercaptoethanol RLT (Qiagen) solution and frozen at ⁇ 80° C. while awaiting extraction.
  • RLT 1% ⁇ -mercaptoethanol
  • the RHEs are separated from their membrane using forceps.
  • a 5 mm Stainless Steel Beads ball Qiagen
  • the Tissue Lyser Qiagen
  • the RNA is extracted using Qiagen's RNA Fibrous Tissue Mini Kit extraction protocol. The extractions are carried out via Qiacube (Qiagen).
  • the quantity of RNA extracted is measured with the Nanodrop.
  • RNA is then adjusted so as to reverse-transcribe 1 pg of RNA per sample.
  • the cDNAs obtained are then diluted to one-twentieth and placed in a 384-well plate (triplicates) using Qiagen's EpMotion robot. 5.5 pL of reaction mix (5 pL of TaqMan Fast Advanced Master Mix + 0.5 pL of probes per reaction) are then added to each well. GAPDH, YWHAZ and UBC are the reference genes chosen for qPCR analysis.
  • IL-8 is assayed in the culture supernatants (24H, 48H and 72H) using the Bioplex ELISA IL-8 kit from R&D Bio-Techne.
  • the supernatants are assayed in triplicates. Plate reading (Costar 3590 Corning) is performed on the Clariostar plate reader.
  • the TSLP is assayed in the supernatants using the Bioplex TSLP kit from R&D Bio-Techne.
  • the monitoring of viability during the time of implementation of this model accounts for the growth of the microbiota on the epidermis.
  • microbiota growth results on healthy or inflammatory epidermis are presented in Table 2 below.
  • microbiota The growth of microbiota on complete epidermis is 1 to 2 log in 48 hours. Significantly greater growth is observed on inflammatory epidermis than on healthy epidermis. Without being bound by theory, one can think that the barrier is altered in the inflamed epidermis, which allows microorganisms to access additional nutrients and therefore to grow more.
  • the bacterial composition of the microbiota was evaluated on D13 (before inoculation on the model).
  • Cutibacterium especially C. acnes
  • Staphylococcus Streptococcus
  • Burkholderia Finegoldia
  • Gemella Veillonella
  • Kocuia Corynebacterium, Methylobacterium and Brevibacterium.
  • Staphylococcus species have been determined more precisely. Staphylococcus species identified in the microbiota are: S. epidermidis, S. capitis, S. warneri, S. hominis and S. aureus.
  • Staphylococcus species have been determined more precisely.
  • the species of Staphylococcus identified in the microbiota at 48 hours are the same as those initially present (S. epidermidis, S. capitis, S. aureus, S. warneri, S. hominis).
  • microbiota/sebum on healthy epidermis leads to the production of IL-8, so there is a reaction of the epidermis to the presence of microorganisms.
  • TSLP TSLP is an inflammatory cytokine characteristic of atopic dermatitis. Its secretion is clearly stimulated in the case of atopic dermatitis and promotes the initiation of an inflammatory response by Th2. It is measured in the supernatant after 24 hours of culture.
  • TSLP TSLP
  • the DEEB4A gene encodes P-defensin 2, a skin antimicrobial peptide secreted by keratinocytes. The production of anti-microbial peptides is stimulated by the presence of microorganisms.
  • S100A7 codes for the protein known as psoriasin with antimicrobial properties.
  • RQ “Relative quantification”, RQ > 2: overexpression, 0.5 ⁇ RQ: underexpression
  • RQ “Relative quantification”
  • RQ > 2 overexpression
  • RQ underexpression
  • the presence of microbiota/sebum on healthy epidermis leads to a slight increase in the expression of the antimicrobial peptides DEFB4A and S100A7 by the epidermis.
  • the presence of microbiota/sebum on healthy epidermis stimulates an “innate” immune response.
  • the inventors quantified by RT-qPCR the expression of the gene coding for Claudin-1, a protein involved in tight junctions and the expression of the gene encoding Filaggrin.
  • the TGM1 gene codes for transglutaminase-1, an enzyme involved in stratum corneum formation and barrier function.
  • the presence of microbiota/sebum on healthy epidermis does not cause any significant modification in the expression of the genes coding for the proteins involved in the barrier function, Filaggrin and Claudine 1 (results not shown).
  • the expression of the gene coding for the TGM1 enzyme is increased.
  • IL-8 The production of IL-8 is multiplied by 1.7 to 2.2 times.
  • TSLP TSLP by inflammatory epidermis
  • TSLP is produced under inflammatory conditions compared to the "healthy" model (without addition of inflammatory stress), but the presence of the microbiota/sebum does not significantly modify the production of TSLP.
  • microbiota/sebum on inflammatory epidermis leads to a significant increase in the expression of the antimicrobial peptides DEFB4A and S100A7 by the epidermis. As expected, an exacerbated sensitivity of the inflammatory epidermis is observed in the presence of microbiota/sebum.
  • TGM1 The effects of microbiota/sebum on the expression of TGM1 are shown in Table 10. Expression of TGM1 by inflammatory epidermis with and without microbiota/sebum.
  • the inventors clearly demonstrate the advantage of the reconstituted skin model comprising a skin substitute as well as a microbial component and a lipid component.
  • a microbial component and a lipid component induces the production of certain inflammatory markers such as, for example, IL-8, and a slight increase in the expression of antimicrobial peptides thus stimulating innate immunity.
  • the microbiota induces a basal level of inflammation under these conditions.
  • the microbiota induces an exacerbated inflammatory response, which leads to an impaired barrier function.
  • the model advantageously reproduces an inflammation of the atopic dermatitis type.
  • This model is therefore quite suitable for evaluating new active ingredients that would be potentially useful in the prevention or treatment of atopic dermatitis.
  • This model is also suitable for evaluating new active ingredients that would be potentially useful in the prevention or treatment of inflammatory dermatoses, such as psoriasis, acne, seborrheic dermatitis, chronic urticaria, eczema, rosacea.
  • inflammatory dermatoses such as psoriasis, acne, seborrheic dermatitis, chronic urticaria, eczema, rosacea.
  • this integrated model is particularly interesting for testing new active ingredients with a putative activity in the protection, or even the reinforcement of the barrier function.
  • Example 3 Evaluation of the effect of a stress imitating sun exposure on the reconstructed skin model as well as the effect of a sunscreen
  • the reconstructed epidermis are irradiated by simulated solar radiation using a Suntest CPS+ ATLAS chamber, Material Testing Technology BV, Moussy le Neuf, France) equipped with an NXE 1500 xenon lamp, and fitted with a UV filter to eliminate lengths waves below 290 nm.
  • the irradiance in the UV spectra is about 70 W/m2 from 290 to 400 nm.
  • the skin models are exposed to a single acute UV dose of 16.5 J/cm2 (approximately 45 min) and the irradiation chamber is maintained at 37°C using ice water and a air flow.
  • Formulation A is applied at a dose of 2 mg/cm 2 on the surface of the skin model reconstituted 2 hours before exposure to radiation. After irradiation with the total solar spectrum (up to 790 nm), the model is maintained in culture for 24 hours at 32° C. and 60% humidity. At the end of the experiment, the surface of the reconstructed epidermis is washed twice with 100 ⁇ l of physiological serum, and then dried with a cotton swab. The purpose of this step is to recover the cutaneous microbiota as well as the lipids (here the sebum) for analysis separately from the skin cells.
  • the reconstructed epidermis are separated from the insert and are weighed in order to standardize the results obtained with the metabolomic approach.
  • the reconstructed epidermis are crushed and 108 samples are extracted. Briefly, the samples are ground in 2 ⁇ ImL of acetonitrile/water 1/9 (v:v) with a fastprep using Lysing Matrix M tubes, 6 cycles of 20 seconds at force 4, with 2 min on ice between each cycle. An 800pL volume of each sample was evaporated to dryness with a SpeedVac, then normalized in 220pL D2O. The samples were analyzed by NMR and then mass spectrometry.
  • 1H NMR spectra are obtained at 300 K on a Bruker Avance III HD 600 MHz NMR spectrometer (Bruker Biospin, Rheinstetten, Germany), operating at 600.13 MHz for the 1H resonance frequency, using a 1H-13C-15N cryoprobe -31P 5 mm reverse sensing attached to a Cryoplatform (the preamp unit).
  • 1H NMR spectra are acquired using the NOESY 1D experiment with pre-saturation for water removal (noesyprld), with a mixing time of 100 ms.
  • the samples are transferred from the NMR tubes to the UHPLC vials.
  • the samples are centrifuged at 9000 g for 5 min.
  • a volume of 10 pL is then injected into the UHPLC ACQUITY system from Waters (Manchester, UK), using water/methanol/acetic acid 95/5/0.1 (v:v:v) as mobile phase A and 100/0.1 (v:v) methanol/acetic acid as mobile phase B, at a flow rate of 0.3 mL/min.
  • the following gradient is used: 0-30 min: 0% to 100% B, 30-34 min: 100% B.
  • the separation is carried out at 30°C with a Hypersil Gold C18 column (100 x 2.1 mm , 1.9 ⁇ m) from Thermo Scientific (Les Ulis, France).
  • Thermo Scientific Les Ulis, France.
  • the following electrospray parameters are applied: capillary voltage of 0.5 kV, sample cone voltage of 30 V, source temperature of 120°C, desolvation temperature of 350°C, cone gas flow of 50 L/h and 600 L/h desolvation gas flow in positive mode; capillary voltage of 0.5 kV, sample cone voltage of 30 V, source temperature of 120°C, desolvation temperature of 550°C, cone gas flow of 30 L/h and gas flow of desolvation of 600 L/h in mode negative.
  • High-resolution mass spectra are acquired with a Synapt G2-Si mass spectrometer from Waters (Manchester, UK), between m/z 50 and 800 in sensitivity and centroid modes. The samples are analyzed randomly, and a QC sample corresponding to a pool of all samples, is analyzed 11 times along the sequence.
  • Structural identifications of discriminating metabolites are carried out on an LTQ Orbitrap XL mass spectrometer (Thermo Scientific, Les Ulis, France) coupled to a U3000 liquid chromatography system (Thermo Scientific, Les Ulis, France).
  • the data is normalized to allow quantification of signals detected in multiple samples.
  • Principal component analysis is first applied to check the validity of the acquisition, to detect potential outliers and internal clusters.
  • Multivariate analyzes are performed using SIM CA vl5 software (Umetrics, Umeâ, Sweden).
  • the mixOmics package (Rohart et al., 2017) is used to perform multilevel analyses.
  • the analytics pipeline includes the mapping metabolomic data to an organism's specific metabolic network, then applying graph-based methods and advanced visualization tools to enhance data analysis.
  • MI Non-irradiated
  • IR Irradiated
  • CTRL Control
  • FA Formulation A
  • ns not significant
  • results show a significant protective effect of a formulation comprising phenylene bis-diphenyltriazine (Formulation A) on oxidative stress due to sun exposure.
  • the model also makes it possible to identify or evaluate the in vitro efficacy of an active ingredient in preventing and/or treating at least one skin disorder induced following at least one exogenous stress such as UV irradiation.
  • MI Non-irradiated
  • IR Irradiated
  • CTRL Control
  • FA Formulation A
  • ns not significant
  • C. acnes is a very abundant bacterial species in the model's microbiota.
  • the inventors have demonstrated a significantly increased abundance under the effect of irradiation (see Table 15).
  • MI Non-irradiated
  • IR Irradiated
  • CTRL Control
  • FA Formulation A
  • ns not significant
  • This integrated model is particularly interesting because it makes it possible to approach the conditions observed in vivo.

Landscapes

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Abstract

The present invention relates to a reconstituted-skin model comprising 1) a skin substitute and 2) a microbial component and a lipid component on the surface of said skin substitute, and also to a method for obtaining the reconstituted-skin model. The reconstituted-skin model can in particular be used in a screening method for the identification in vitro of an active agent or of a cosmetic formulation for preventing and/or improving at least one skin disorder induced following at least one exogenous stress; a method for the evaluation of the efficacy in vitro of an active agent or of a cosmetic formulation for preventing and/or treating at least one skin disorder induced following at least one exogenous stress; or an evaluation in vitro of the tolerance with respect to an active agent or a cosmetic formulation.

Description

MODELE DE PEAU RECONSTITUEE RECONSTITUTED SKIN MODEL
Domaine de l’invention Field of invention
Le domaine de l’invention concerne un nouveau modèle cutané intégrant une composante microbienne et un composant lipidique. Ce modèle est particulièrement adapté pour étudier et développer des nouveaux actifs/produits dans le domaine dermo-cosmétique. En effet, à ce modèle intégré, un stress physique ou chimique peut être ajouté pour reproduire des lésions ou des situations pathologiques, pouvant provoquer des déséquilibres du microbiote cutané. The field of the invention relates to a new skin model integrating a microbial component and a lipid component. This model is particularly suitable for studying and developing new active ingredients/products in the dermo-cosmetic field. Indeed, to this integrated model, a physical or chemical stress can be added to reproduce lesions or pathological situations, which can cause imbalances in the skin microbiota.
État de la technique State of the art
La peau est bien plus qu’une enveloppe externe, elle est en effet un véritable organe nécessaire à la vie. Elle constitue un terrain d’échange entre notre environnement intérieur et l’environnement extérieur et est de ce fait exposée à de multiples agressions et variations auxquelles elle s’adapte en permanence. La peau assure donc, entre autres, une véritable fonction barrière, autrefois attribuée à sa seule structure et composition. La peau est composée de cellules regroupées entre elles pour former un tissu à la fois résistant et souple. Ces cellules sont réparties en trois couches : l’hypoderme, le derme et l’épiderme. L’hypoderme est la couche la plus profonde de la peau. Il est constitué de tissu adipeux blanc qui permet de protéger l’organisme des chocs, de constituer une réserve énergétique et de thermoréguler le corps. Le derme est la couche comprise entre l’hypoderme et l’épiderme. Elle est la couche la plus épaisse de la peau. Le derme héberge les vaisseaux sanguins et lymphatiques, les nerfs, les glandes sudoripares qui produisent la sueur et les follicules pilo-sébacés. Il est majoritairement composé de macromolécules, de cellules fibroblastiques et de cellules du système immunitaire. L’épiderme est la surface la plus mince de la peau. Il est composé à 90 % de kératinocytes qui servent à synthétiser la kératine et permettent, grâce à leur différenciation, d’assurer une imperméabilité et une protection à la peau. L’épiderme est constitué de quatre principales couches : la couche basale (stratum basalé), constituée de kératinocytes à larges noyaux, qui permettent d’assurer le renouvellement constant de l’épiderme ; la couche spineuse (stratum spinosuni), composée de kératinocytes volumineux qui s’aplatissent progressivement en allant vers les couches supérieures ; la couche granuleuse (stratum granulosuni), composé de kératinocytes aplatis qui permettent de transformer les kératinocytes en coméocytes (cellules anucléées) et enfin la couche cornée (stratum corneum), couche supérieure composée des coméocytes qui vont desquamer. L’épiderme n’est pas uniquement composé de coméocytes mais aussi de lipides entre ces différentes cellules. Les lipides sont organisés sous forme de bicouches lipidiques. Les principales classes de ces lipides sont les céramides, le cholestérol et les acides gras libres. Ils assurent en partie la fonction barrière de la peau. The skin is much more than an outer envelope, it is indeed a real organ necessary for life. It constitutes a ground of exchange between our internal environment and the external environment and is therefore exposed to multiple attacks and variations to which it adapts permanently. The skin therefore ensures, among other things, a real barrier function, formerly attributed to its structure and composition alone. The skin is made up of cells grouped together to form a fabric that is both resistant and flexible. These cells are divided into three layers: the hypodermis, the dermis and the epidermis. The hypodermis is the deepest layer of the skin. It is made up of white adipose tissue which helps protect the body from shocks, builds up an energy reserve and thermoregulates the body. The dermis is the layer between the hypodermis and the epidermis. It is the thickest layer of the skin. The dermis houses blood and lymphatic vessels, nerves, sweat glands that produce sweat, and pilosebaceous follicles. It is mainly composed of macromolecules, fibroblast cells and immune system cells. The epidermis is the thinnest surface of the skin. It is made up of 90% keratinocytes which are used to synthesize keratin and, thanks to their differentiation, ensure impermeability and protection for the skin. The epidermis is made up of four main layers: the basal layer (basal stratum), made up of keratinocytes with large nuclei, which ensure the constant renewal of the epidermis; the spinous layer (stratum spinosuni), made up of voluminous keratinocytes which gradually flatten as they move towards the upper layers; the granular layer (stratum granulosuni), composed of flattened keratinocytes which allow the keratinocytes to be transformed into comeocytes (anucleate cells) and finally the horny layer (stratum corneum), the upper layer composed of comeocytes which will desquamate. The epidermis is not only composed of comeocytes but also of lipids between these different cells. Lipids are organized in the form of lipid bilayers. The main classes of these lipids are ceramides, cholesterol and free fatty acids. They partly ensure the barrier function of the skin.
Le sébum est un film hydro lipidique produit par les glandes sébacées. Il est excrété à la surface de la peau où il va former une couche protectrice, mais aussi servir de substrat au microbiote cutané. Le sébum est majoritairement lipophile et anaérobie, et va donc permettre de conserver des espèces microbiennes lipophiles et anaérobies. Il va aussi protéger la peau en la graissant et en l’acidifiant pour réguler le pH cutané. Sebum is a hydrolipidic film produced by the sebaceous glands. It is excreted on the surface of the skin where it will form a protective layer, but also serve as a substrate for the skin microbiota. The sebum is mainly lipophilic and anaerobic, and will therefore allow the preservation of lipophilic and anaerobic microbial species. It will also protect the skin by lubricating it and acidifying it to regulate the skin's pH.
Le microbiote cutané joue également un rôle clé dans les fonctions protectrices de la peau. Il participe également à la régulation du pH de la peau. Le microbiote cutané, appelé également flore cutanée, se situe au niveau de l’épiderme. Il est constitué de micro-organismes comme des bactéries, des virus, des champignons et parasites. Le microbiote cutané évolue au fur et à mesure de l’avancée en âge, pour atteindre en moyenne 1 000 milliards de bactéries, et 1 000 espèces de virus, parasites et champignons. Pour les bactéries, les souches les plus connues et étudiées sont Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis et Cutibacterium acnés. Certaines sont aérobies et vivent donc avec l’apport d’oxygène et d’autres sont anaérobies et vivent plus en profondeur dans le stratum corneum sans apport d’oxygène. Certaines de ces bactéries produisent des acides gras, d’autres des peptides antimicrobiens et même dans certains cas des acides aminés. La plupart de ces bactéries utilisent les lipides du sébum pour croitre et produire ces composés. The skin microbiota also plays a key role in the protective functions of the skin. It also participates in the regulation of the pH of the skin. The skin microbiota, also called skin flora, is located in the epidermis. It is made up of microorganisms such as bacteria, viruses, fungi and parasites. The skin microbiota evolves as you age, reaching an average of 1,000 billion bacteria, and 1,000 species of viruses, parasites and fungi. For bacteria, the most known and studied strains are Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis and Cutibacterium acnes. Some are aerobic and therefore live with the supply of oxygen and others are anaerobic and live deeper in the stratum corneum without the supply of oxygen. Some of these bacteria produce fatty acids, others antimicrobial peptides and in some cases even amino acids. Most of these bacteria use sebum lipids to grow and produce these compounds.
Le microbiote cutané varie de manière quantitative et qualitative d’une personne à l’autre. Des variables telles que l’âge, le sexe, le système immunitaire, le pH, la température ou encore l’humidité peuvent modifier la composition du microbiote de la peau. Par exemple, l’utilisation de produits cosmétiques ou pharmaceutiques créent des différences. Toutefois, deux catégories distinctes peuvent être identifiées au sein du microbiote cutané : la flore « résidente » et la flore « transitoire ». The skin microbiota varies quantitatively and qualitatively from one person to another. Variables such as age, sex, immune system, pH, temperature or even humidity can modify the composition of the microbiota of the skin. For example, the use of cosmetic or pharmaceutical products create differences. However, two distinct categories can be identified within the skin microbiota: “resident” flora and “transient” flora.
Comme son nom l’indique, la flore cutanée résidente vit en totale symbiose avec la peau. On parle d’organismes commensaux. Elle est importante pour la défense contre les microorganismes pathogènes, car la place qu’elle occupe sature l’espace et empêche la fixation d’organismes indésirables. As its name suggests, the resident skin flora lives in total symbiosis with the skin. These are called commensal organisms. It is important for the defense against pathogenic microorganisms, because the place it occupies saturates the space and prevents the attachment of undesirable organisms.
La flore transitoire ne s’établit pas de façon permanente à la surface de la peau, elle varie au cours de la journée, dépend des activités réalisées et des variations des conditions environnantes. Elle peut être présente quelques heures, ou quelques jours. Les microorganismes qui la composent sont pour la plupart inoffensifs, dits saprophytes. Cette flore peut également être constituée de bactéries pathogènes opportunistes et entraîner des maladies, si les défenses de l’hôte faiblissent. Une des espèces transitoires les plus communes est S. aureus, mise en cause dans la dermatite atopique (DA). The transient flora does not establish itself permanently on the surface of the skin, it varies during the day, depends on the activities carried out and variations in the surrounding conditions. It can be present for a few hours or a few days. The microorganisms that make it up are mostly harmless, called saprophytes. This flora can also consist of opportunistic pathogenic bacteria and lead to diseases, if the host defenses weaken. One of the most common transient species is S. aureus, implicated in atopic dermatitis (AD).
Les micro-organismes présents sur la peau et composant la flore résidente ne sont pas opportunistes, ils remplissent des fonctions très utiles pour la protection de l’organisme. En effet, le microbiote cutané assure différents rôles dans le maintien de l’intégrité de notre peau. Il constitue une barrière en régulant l’homéostasie de la peau, en lui fournissant des nutriments ou bien encore en rentrant en compétition avec des pathogènes. S. epidermidis sécrète par exemple des peptides antimicrobiens contre S. aureus. Corynebacterium striatum et C. acnés inhibent quant à eux l’expression de gènes de virulence de ce dernier (Sanford and Gallo, Seminars in Immunology, 25, pp370-7, 2013). La symbiose entre hôte et microorganismes est notamment indispensable à la bonne santé de la peau. Lorsque cet équilibre est rompu, on parle alors de dysbiose. Il a été montré dans de nombreuses études que les dysbioses sont corrélées à l’apparition de certaines pathologies cutanées inflammatoires, comme l’acné, la dermatite atopique ou l’eczéma. La compréhension des interactions entre le microbiote cutané et la peau constitue donc un enjeu dans l’élaboration de nouveaux traitements cosmétiques et pharmaceutiques . The microorganisms present on the skin and making up the resident flora are not opportunistic, they perform very useful functions for the protection of the organism. Indeed, the skin microbiota plays different roles in maintaining the integrity of our skin. It constitutes a barrier by regulating the homeostasis of the skin, by supplying it with nutrients or even by competing with pathogens. S. epidermidis, for example, secretes antimicrobial peptides against S. aureus. Corynebacterium striatum and C. acnes inhibit the expression of virulence genes of the latter (Sanford and Gallo, Seminars in Immunology, 25, pp370-7, 2013). The symbiosis between host and microorganisms is particularly essential for the good health of the skin. When this balance is broken, it is called dysbiosis. It has been shown in numerous studies that dysbioses are correlated with the appearance of certain inflammatory skin pathologies, such as acne, atopic dermatitis or eczema. Understanding the interactions between the cutaneous microbiota and the skin is therefore an issue in the development of new cosmetic and pharmaceutical treatments.
Aujourd’hui, l’évaluation d’agents cosmétiques et pharmacologiques peut notamment être fait sur des modèles de peaux humaines reconstruites in vitro. Ces modèles contiennent une barrière épidermique différenciée et reflètent les conditions morphologiques d’une peau humaine in vivo. Parmi les modèles de peau humaines reconstruites, Van Der Krieken et son équipe ont développé un modèle de stratum corneum à partir de kératinocytes prélevés au talon de volontaires (Acta Derm Venereol. 2016 ; 96(7) : 873-879). Un microbiote est notamment ajouté aux kératinocytes en suspension. Cependant, la composition de ces modèles de peaux diffère encore beaucoup de la composition réelle de la peau humaine. En particulier, il ne comprend pas de lipides ayant un rôle protecteur pour la peau et le microbiote et qui sont sécrétés par les glandes sébacées. De plus, il ne comporte pas de kératinocytes viables. Ainsi, l’interaction entre micro-organismes et kératinocytes (sécrétion de cytokines, de peptides antimicrobiens, etc.) n’est pas observable. Today, the evaluation of cosmetic and pharmacological agents can be done in particular on models of human skin reconstructed in vitro. These models contain a differentiated epidermal barrier and reflect the morphological conditions of human skin in vivo. Among the models of reconstructed human skin, Van Der Krieken and his team developed a model of the stratum corneum from keratinocytes taken from the heels of volunteers (Acta Derm Venereol. 2016; 96(7): 873-879). A microbiota is notably added to the keratinocytes in suspension. However, the composition of these skin models still differs greatly from the actual composition of human skin. In particular, it does not include lipids having a protective role for the skin and the microbiota and which are secreted by the sebaceous glands. Moreover, it does not contain viable keratinocytes. Thus, the interaction between microorganisms and keratinocytes (secretion of cytokines, antimicrobial peptides, etc.) is not observable.
Des modèles 3D d’épidermes reconstruites ayant un composé microbien ont également été utilisés pour étudier les interactions entre le microbiote et la peau (Rademacher et al., Experimental Dermatology, 27, pp489-494, 2018). Toutefois, la plupart de ces modèles comprend la colonisation d’une seule espèce de micro-organisme, tel que C. amycolatum, et ne reflètent donc pas les conditions réelles de notre peau. La présence de lipides dans les modèles de peau sain n’est pas non plus décrite. 3D models of reconstructed epidermis with a microbial compound have also been used to study the interactions between the microbiota and the skin (Rademacher et al., Experimental Dermatology, 27, pp489-494, 2018). However, most of these models include the colonization of a single species of microorganism, such as C. amycolatum, and therefore do not reflect the actual conditions of our skin. The presence of lipids in the models healthy skin is also not described.
Par conséquent, il existe toujours un besoin de modèle permettant de reproduire les conditions les plus proches de la peau naturelle, de préférence pouvant être obtenu de façon aisée et à un coût réduit. Consequently, there is still a need for a model making it possible to reproduce the conditions closest to natural skin, preferably being able to be obtained easily and at a reduced cost.
De façon avantageuse, les inventeurs ont mis au point un nouveau modèle de peau comprenant une composante microbienne et une composante lipidique qui permet avantageusement de se rapprocher de la véritable peau. De façon avantageuse, le coût associé à un tel modèle est notamment réduit comparé aux expiants. Par ailleurs, ce modèle peut être utilisé avec différents stress afin de mimer des troubles de la peau. En effet, les inventeurs ont notamment observé que l’application d’un stress exogène sur le modèle de peau induisait des caractéristiques moléculaires et métaboliques semblables à celles observées in vivo chez les sujets ayant une peau exposée au soleil ou à des conditions inflammatoires. Le modèle peut avantageusement servir d’outil afin de cribler des actifs ou encore des formulations cosmétiques ou pharmacologiques d’intérêts. Advantageously, the inventors have developed a new skin model comprising a microbial component and a lipid component which advantageously makes it possible to approach real skin. Advantageously, the cost associated with such a model is notably reduced compared to explants. In addition, this model can be used with different stresses to mimic skin disorders. Indeed, the inventors observed in particular that the application of an exogenous stress on the skin model induced molecular and metabolic characteristics similar to those observed in vivo in subjects having skin exposed to the sun or to inflammatory conditions. The model can advantageously be used as a tool to screen active ingredients or even cosmetic or pharmacological formulations of interest.
Expose de l'invention Disclosure of invention
Le premier objet de l’invention concerne donc un modèle de peau reconstituée comprenant : The first object of the invention therefore relates to a reconstituted skin model comprising:
- un substitut cutané, et - a skin substitute, and
- une composante microbienne et une composante lipidique sur la surface dudit substitut cutané. - a microbial component and a lipid component on the surface of said skin substitute.
Un autre objet de l’invention porte sur un procédé d’obtention d’un modèle de peau reconstituée comprenant : a) Fourniture d’un substitut cutané, b) Application sur ledit substitut cutané, de façon concomitante ou séquentielle, d’une composante microbienne et d’une composante lipidique. Another object of the invention relates to a method for obtaining a model of reconstituted skin comprising: a) Supply of a skin substitute, b) Application to said skin substitute, concomitantly or sequentially, of a component microbial and a lipid component.
L’invention concerne également une méthode de criblage pour l’identification in vitro d’un actif ou d’une formulation cosmétique pour prévenir et/ou améliorer au moins un trouble cutané induit suite à au moins un stress exogène comprenant les étapes suivantes : a) L’application dudit actif ou de ladite formulation cosmétique sur le modèle de peau reconstituée selon l’invention ; b) La réalisation d’au moins un stress exogène sur ledit modèle ; c) Au moins une mesure du niveau d’expression d’au moins un marqueur biologique ; et d) Déterminer si ledit actif ou de ladite formulation cosmétique permet de prévenir et/ou améliorer au moins un trouble cutané en fonction d’au moins un niveau d’expression mesuré à l’étape c). The invention also relates to a screening method for the in vitro identification of an active ingredient or of a cosmetic formulation for preventing and/or improving at least one skin disorder induced following at least one exogenous stress comprising the following steps: a ) Applying said active ingredient or said cosmetic formulation to the reconstituted skin model according to the invention; b) The realization of at least one exogenous stress on said model; c) At least one measurement of the level of expression of at least one biological marker; And d) Determining whether said active ingredient or said cosmetic formulation makes it possible to prevent and/or improve at least one skin disorder as a function of at least one level of expression measured in step c).
L’invention concerne également une méthode d’évaluation de l’efficacité in vitro d’un actif ou d’une formulation cosmétique pour prévenir et/ou traiter au moins un trouble cutané induit suite à au moins un stress exogène comprenant les étapes suivantes : a) L’application dudit actif ou de ladite formulation cosmétique sur le modèle de peau reconstituée selon l’invention ; b) La réalisation d’au moins un stress exogène sur ledit modèle ; c) Au moins une mesure du niveau d’expression d’au moins un marqueur biologique ; et d) Évaluer l’efficacité dudit actif ou de ladite formulation cosmétique en fonction d’au moins un niveau d’expression mesuré à l’étape c). The invention also relates to a method for evaluating the in vitro efficacy of an active ingredient or of a cosmetic formulation for preventing and/or treating at least one skin disorder induced following at least one exogenous stress comprising the following steps: a) Applying said active ingredient or said cosmetic formulation to the reconstituted skin model according to the invention; b) The realization of at least one exogenous stress on the said model; c) At least one measurement of the level of expression of at least one biological marker; and d) Evaluating the efficacy of said active ingredient or of said cosmetic formulation as a function of at least one level of expression measured in step c).
L’invention concerne également une méthode d'évaluation in vitro de la tolérance d’un actif ou d’une formulation cosmétique, comprenant les étapes suivantes : a) L’application dudit actif ou de ladite formulation cosmétique sur le modèle de peau reconstituée selon l’invention ; b) Au moins une mesure du niveau d’expression d’au moins un marqueur biologique dans le modèle de peau de l’étape a) ; et c) Évaluer si ledit actif ou formulation cosmétique est bien toléré par le modèle de peau. L’invention concerne enfin un kit comprenant une composante microbienne et une composante lipidique destiné à être appliqué sur un substitut cutané, la composante microbienne comprenant au moins quatre genres de micro-organismes sélectionnés parmi les genres Cutibacterium, Staphylococcus, Streptococcus, Burkholderia, Finegoldia, Gemella, Veillonella, Kocuia, Corynebacterium, Methylobacterium, et Brevibacterium. The invention also relates to a method for in vitro evaluation of the tolerance of an active ingredient or of a cosmetic formulation, comprising the following steps: a) The application of the said active ingredient or of the said cosmetic formulation on the reconstituted skin model according to invention; b) At least one measurement of the level of expression of at least one biological marker in the skin model of step a); and c) Assessing whether said active ingredient or cosmetic formulation is well tolerated by the skin model. The invention finally relates to a kit comprising a microbial component and a lipid component intended to be applied to a skin substitute, the microbial component comprising at least four genera of microorganisms selected from the genera Cutibacterium, Staphylococcus, Streptococcus, Burkholderia, Finegoldia, Gemella, Veillonella, Kocuia, Corynebacterium, Methylobacterium, and Brevibacterium.
Description des figures Description of figures
[Fig. 1] Profil chromatographique du sébum collecté [Fig. 1] Chromatographic profile of the collected sebum
Description détaillée de l'invention Detailed description of the invention
Comme indiqué ci-dessus, l’invention porte sur un modèle de peau reconstituée comprenant : As indicated above, the invention relates to a reconstituted skin model comprising:
- un substitut cutané, et - a skin substitute, and
- une composante microbienne et une composante lipidique sur la surface dudit substitut cutané. Par « substitut cutané » on entend une culture de cellules cutanées composée d’au moins une couche. Les substituts cutanés selon l’invention comprennent notamment les cultures de cellules cutanées en monocouche, les cultures de cellules cutanées en bicouche et les modèles tissulaires, dont les cultures d’épiderme reconstruit ou de peau reconstruite. En effet, comme il est souvent difficile de travailler sur des expiants frais, il est particulièrement avantageux, dans le cadre de la présente invention, d’utiliser des cultures de cellules cutanées. Par « épiderme reconstruit », on entend un épiderme généré in vitro par des techniques classiques bien connues de la personne du métier (cf., par exemple, Limât et Hunziger. Cells Tissues Organs 2002;172:79-85 ; Poumay et al., Arch Dermatol Res. 2004;296(5):203-l 1). Par « peau reconstruite » on entend une culture contenant au moins deux compartiments : un compartiment dermique, et un compartiment épidermique. De préférence, la composante épidermique de la peau reconstruite contient des kératinocytes. De préférence, la composante dermique contient des fibroblastes. - a microbial component and a lipid component on the surface of said skin substitute. By “skin substitute” is meant a culture of skin cells composed of at least one layer. The skin substitutes according to the invention include in particular cultures of skin cells in monolayer, cultures of skin cells in bilayer and tissue models, including cultures of reconstructed epidermis or of reconstructed skin. Indeed, as it is often difficult to work on fresh explants, it is particularly advantageous, in the context of the present invention, to use cutaneous cell cultures. By “reconstructed epidermis”, is meant an epidermis generated in vitro by conventional techniques well known to those skilled in the art (cf., for example, Limât and Hunziger. Cells Tissues Organs 2002; 172:79-85; Poumay et al. , Arch Dermatol Res. 2004;296(5):203-11). By “reconstructed skin” is meant a culture containing at least two compartments: a dermal compartment, and an epidermal compartment. Preferably, the epidermal component of the reconstructed skin contains keratinocytes. Preferably, the dermal component contains fibroblasts.
Avantageusement, les cellules cutanées comprennent des cellules normales, saines ou pathologiques pouvant entrainer des troubles cutanés, ou des cellules issues de lignées. Des cellules cutanées mises en culture peuvent notamment être obtenues à partir d’explant de tissu cutané. Par « expiant » ou « expiant de peau », on entend ici un prélèvement de cellules ou de tissu cutané, lequel peut être réalisé dans un but chirurgical ou pour effectuer des analyses. En particulier, un expiant peut être obtenu lors d’une exérèse chirurgicale. Par « exérèse », on entend ici une intervention chirurgicale consistant à découper (exciser) une partie plus ou moins large ou profonde de la peau pour en traiter une anomalie ou une excroissance. On procède à une exérèse soit pour retirer une tumeur cancéreuse ou suspecte de l'être, soit pour traiter une anomalie bénigne de la peau qui est gênante, que ce soit pour des raisons fonctionnelles ou esthétiques. Une exérèse au sens de l’invention inclut par exemple les échantillons de peau obtenus après chirurgie plastique (plastie mammaire, abdominale, lifting, prélèvement préputial, otoplastie, c’est-à-dire recollement d’oreille, syndactylie ou doigt surnuméraire, etc.). Un expiant peut aussi être obtenu par biopsie. Par « biopsie », on entend ici un prélèvement de cellules ou tissu cutané réalisé à des fins d’analyse. Plusieurs types de procédures de biopsies sont connus et pratiqués dans le domaine. Les types les plus communs comprennent (1) la biopsie incisionnelle, dans laquelle seul un échantillon du tissu est prélevé, (2) la biopsie excisionnelle (ou biopsie chirurgicale) qui consiste en l’ablation totale d’une masse tumorale, réalisant ainsi un geste thérapeutique et diagnostique, et (3) la biopsie à l’aiguille, dans laquelle un échantillon de tissu est prélevé avec une aiguille, celle-ci pouvant être large ou fine. D’autres types de biopsie existent, comme par exemple le frottis ou le curettage, et sont aussi englobés dans la présente invention. Advantageously, the skin cells comprise normal, healthy or pathological cells which can cause skin disorders, or cells resulting from lines. Cultured skin cells can in particular be obtained from skin tissue explant. By “explant” or “skin explant” is meant here a removal of cells or of skin tissue, which can be carried out for a surgical purpose or to carry out analyses. In particular, an explant can be obtained during surgical excision. By “excision”, we mean here a surgical intervention consisting in cutting (excising) a more or less large or deep part of the skin to treat an anomaly or an outgrowth. Excision is performed either to remove a tumor that is cancerous or suspected of being cancerous, or to treat a benign skin abnormality that is bothersome, whether for functional or aesthetic reasons. An excision within the meaning of the invention includes, for example, skin samples obtained after plastic surgery (mammaplasty, abdominal surgery, facelift, preputial removal, otoplasty, that is to say ear reattachment, syndactyly or supernumerary finger, etc. .). An explant can also be obtained by biopsy. By “biopsy” is meant here a sample of cells or skin tissue taken for analysis purposes. Several types of biopsy procedures are known and practiced in the field. The most common types include (1) incisional biopsy, in which only a sample of the tissue is taken, (2) excisional biopsy (or surgical biopsy) which consists of the total removal of a tumor mass, thus achieving a therapeutic and diagnostic procedure, and (3) needle biopsy, in which a sample of tissue is taken with a needle, which can be large or fine. others types of biopsy exist, such as smear or curettage, for example, and are also included in the present invention.
Alternativement, lesdites cellules cutanées peuvent être obtenues par différentiation de cellules souches (Guenou et al., Lancet, 374(9703) : 1745-1753, 2009 ; Nissan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 108(36) : 14861-14866, 2011 ; Kraehenbuehl et al., Nature Methods, 8 : 731-736, 2011). Lesdites cellules souches ne sont pas des cellules souches embryonnaires humaines. Alternatively, said skin cells can be obtained by differentiation of stem cells (Guenou et al., Lancet, 374(9703): 1745-1753, 2009; Nissan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 108(36) : 14861-14866, 2011; Kraehenbuehl et al., Nature Methods, 8: 731-736, 2011). Said stem cells are not human embryonic stem cells.
Les cellules cutanées selon l’invention, qu’elles proviennent d’une biopsie ou qu’elles soient obtenues par différentiation de cellules souches, comprennent au moins un type de cellules habituellement présentes dans l’hypoderme, le derme et/ou l’épiderme. Ces cellules comprennent ainsi, entre autres, des kératinocytes, des mélanocytes, des fibroblastes, des adipocytes, des cellules endothéliales, des mastocytes, des cellules de Langerhans et/ou des cellules de Merkel. De façon préférentielle, les cellules cutanées selon l’invention comprennent au moins des kératinocytes et/ou des fibroblastes. De façon plus préférentielle, les cellules cutanées selon l’invention comprennent des kératinocytes et/ou des fibroblastes. The skin cells according to the invention, whether they come from a biopsy or whether they are obtained by differentiation of stem cells, comprise at least one type of cells usually present in the hypodermis, the dermis and/or the epidermis. . These cells thus include, inter alia, keratinocytes, melanocytes, fibroblasts, adipocytes, endothelial cells, mast cells, Langerhans cells and/or Merkel cells. Preferably, the skin cells according to the invention comprise at least keratinocytes and/or fibroblasts. More preferably, the skin cells according to the invention comprise keratinocytes and/or fibroblasts.
De nombreuses méthodes de culture de cellules cutanées sont connues de la personne du métier. N’importe laquelle de ces méthodes peut être utilisée pour cultiver le substitut cutané de l’invention. Le substitut cutané est cultivé et/ou conservé dans des conditions maintenant, au moins partiellement, un métabolisme cellulaire et/ou des fonctions cellulaires. La culture du substitut cutané comprend donc aussi bien les cultures de cellules cutanées en monocouche (par ex. de kératinocytes) ou les cultures de cellules cutanées en bicouche que des modèles tissulaires, dont les cultures de peaux reconstruites. Many methods for culturing skin cells are known to those skilled in the art. Any of these methods can be used to culture the skin substitute of the invention. The skin substitute is cultured and/or stored under conditions maintaining, at least partially, cellular metabolism and/or cellular functions. The culture of the skin substitute therefore includes both cultures of skin cells in monolayer (eg of keratinocytes) or cultures of skin cells in bilayer and tissue models, including cultures of reconstructed skin.
Les cultures de cellules cutanées en monocouche ou en bicouche sont connues et utilisées depuis très longtemps. Par ailleurs, de nombreux modèles tissulaires, dont en particulier des modèles de peaux reconstruites (Rosdy et al., In Vitro Toxicol., 10(1) : 39-47, 1997 ; Ponec et al., J Invest Dermatol., 109(3) : 348-355, 1997 ; Ponec et al., Int J Pharm., 203(1-2) : 211-225, 2000 ; Schmalz et al., EurJ Oral Sci., 108(5) : 442-448, 2000 ; Black et al., Tissue Eng, 11(5- 6) : 723-733, 2005 ; Dongari-Batgtzoglou et Kashleva, Nat Protoc, 1(4) : 2012-2018, 2006 ; Bechtoille et al., Tissue Eng, 13(11) : 2667-2679, 2007 ; Vrana et al., Invest Ophthalmol Vis Sci, 49(12) : 5325-5331, 2008 ; Kinicoglu et al., Biomaterials, 30(32) : 6418-6425, 2009 ; Auxenfans et al., Eur J Dermatol, 19(2) : 107-113, 2009 ; Kinicoglu et al., Biomaterials, 32(25) : 5756-5764, 2011 ; Costin et al., Altern Lab Anim, 39(4) : 317-337, 2011 ; Auxenfans et al., J Tissue Eng Regen Med, 6(7) : 512-518, 2012 ; Lequeux ét al., Skin Pharmacol Physiol, 25(1) : 47-55, 2012 ; EP 29 678 ; EP 285 471 ; EP 789 074 ; EP 1 451 302 Bl ; EP 1 878 790 Bl ; EP 1 974 718 ; US 2007/0148,771 ; US 2010/0,099,576 ; WO 02/070729 ; WO 2006/063864 ; WO 2006/0,63865 ; WO 2007/064305) sont à la disposition de la personne du métier et sont compris dans la portée de l’invention. Monolayer or bilayer skin cell cultures have been known and used for a very long time. Furthermore, numerous tissue models, including in particular reconstructed skin models (Rosdy et al., In Vitro Toxicol., 10(1): 39-47, 1997; Ponec et al., J Invest Dermatol., 109( 3): 348-355, 1997; Ponec et al., Int J Pharm., 203(1-2): 211-225, 2000; Schmalz et al., EurJ Oral Sci., 108(5): 442-448 , 2000; Black et al., Tissue Eng, 11(5-6): 723-733, 2005; Dongari-Batgtzoglou and Kashleva, Nat Protoc, 1(4): 2012-2018, 2006; Bechtoille et al., Tissue Eng, 13(11): 2667-2679, 2007; Vrana et al., Invest Ophthalmol Vis Sci, 49(12): 5325-5331, 2008; Kinicoglu et al., Biomaterials, 30(32): 6418-6425, 2009; Auxenfans et al., Eur J Dermatol, 19(2): 107-113, 2009; Kinicoglu et al., Biomaterials, 32(25): 5756-5764, 2011; Costin et al., Altern Lab Anim, 39 (4): 317-337, 2011; Auxenfans et al., J Tissue Eng Regen Med, 6(7): 512-518, 2012; Lequeux et al., Skin Pharmacol Physiol, 25(1): 47-55, 2012; EP 29 678; EP 285 471; EP 789 074; EP 1 451 302 B1; EP 1 878 790 Bl; EP 1 974 718; US 2007/0148,771; US 2010/0,099,576; WO 02/070729; WO 2006/063864; WO 2006/0.63865; WO 2007/064305) are available to the person skilled in the art and are included in the scope of the invention.
Préférablement, le modèle de peau reconstruite est sélectionné dans le groupe comprenant les modèles d’épiderme constitué principalement de kératinocytes, les modèles de peau comprenant un derme et un épiderme, et les modèles de peau comprenant un derme, un épiderme et un hypoderme. Les modèles comprenant au moins un derme, forment des tissus de type conjonctifs, tandis que les modèles comprenant au moins un épiderme forment des épithélia stratifiés comprenant les couches caractéristiques du tissu considéré. Par exemple, on peut identifier dans les modèles d’épiderme une couche basale (stratum basalts), une couche épineuse (stratum spinosum), une couche granuleuse (stratum granulosum), et une couche cornée (stratum corneum). Preferably, the reconstructed skin model is selected from the group comprising epidermis models consisting mainly of keratinocytes, skin models comprising a dermis and an epidermis, and skin models comprising a dermis, an epidermis and a hypodermis. The models comprising at least one dermis form tissues of the connective type, while the models comprising at least one epidermis form stratified epithelia comprising the characteristic layers of the tissue considered. For example, we can identify in epidermis models a basal layer (stratum basalts), a prickly layer (stratum spinosum), a granular layer (stratum granulosum), and a horny layer (stratum corneum).
Avantageusement, ledit modèle de peau est un modèle d'épiderme comprenant un support matriciel de préférence choisi parmi : un support inerte choisi parmi le groupe consistant d'une membrane synthétique semi- perméable, en particulier une membrane de nitrocellulose semi-perméable, une membrane de nylon semi- perméable, une membrane ou une éponge de téflon, une membrane de polycarbonate ou de polyéthylène, polypropylène, de polyéthylène téréphtalate (PET) semi-perméable, une membrane inorganique Anopore semi- perméable, d'acétate ou d'ester de cellulose (HATF), une membrane Biopore-CM semi- perméable, une membrane de polyester semi-perméable ; dans ce groupe on trouve les modèles Epiderme reconstruits (Skinethic®) ainsi que le modèle EpiDerm®, (Mattek Corporation) ; un film ou une membrane à base d'acide hyaluronique et/ou de collagène et/ou de fibronectine et/ou de fibrine. Advantageously, said skin model is an epidermis model comprising a matrix support preferably chosen from: an inert support chosen from the group consisting of a semi-permeable synthetic membrane, in particular a semi-permeable nitrocellulose membrane, a of semi-permeable nylon, a membrane or a sponge of Teflon, a membrane of polycarbonate or of polyethylene, polypropylene, of semi-permeable polyethylene terephthalate (PET), a semi-permeable inorganic Anopore membrane, of acetate or ester of cellulose (HATF), semi-permeable Biopore-CM membrane, semi-permeable polyester membrane; in this group we find the reconstructed Epidermis models (Skinethic®) as well as the EpiDerm® model, (Mattek Corporation); a film or a membrane based on hyaluronic acid and/or collagen and/or fibronectin and/or fibrin.
Dans ce groupe on peut citer particulièrement les modèles : Laserskin® (Fidia Advanced Biopolymers), Episkin ® (L'Oréal). In this group, particular mention may be made of the models: Laserskin® (Fidia Advanced Biopolymers), Episkin® (L'Oréal).
Ces modèles peuvent être ensemencés par des fibroblastes dans la partie dermique. These models can be seeded by fibroblasts in the dermal part.
Ces modèles, dans lesquels peuvent être intégrés ou non des fibroblastes, servent de support pour l’ensemencement des kératinocytes et la reconstitution de l’épiderme. Avantageusement, sont introduites, outre les kératinocytes, des cellules pigmentaires, des cellules immunocompétentes, des cellules nerveuses ; de préférence les cellules immunocompétentes sont des cellules de Langerhans. These models, in which fibroblasts may or may not be integrated, serve as a support for the seeding of keratinocytes and the reconstitution of the epidermis. Advantageously, in addition to the keratinocytes, pigment cells, immunocompetent cells, nerve cells are introduced; preferably immunocompetent cells are Langerhans cells.
Il existe par ailleurs des modèles dédiés à la thérapie tissulaire qui peuvent également être utilisés dans le cadre de la présente invention. On peut citer les modèles Epidex (Modex Thérapeutiques), Epibase® (Laboratoire Genévrier), Epicell™ (Genzyme), Autoderm™ et Transderm™ (Innogenetics). There are also models dedicated to tissue therapy which can also be used in the context of the present invention. Mention may be made of the Epidex (Modex Therapeutics), Epibase® (Juniper Laboratory), Epicell™ (Genzyme), Autoderm™ and Transderm™ (Innogenetics) models.
Le support matriciel est ensuite ensemencé par des kératinocytes pour reconstruire l’épiderme et obtenir finalement une peau reconstruite. The matrix support is then seeded with keratinocytes to reconstruct the epidermis and finally obtain reconstructed skin.
Avantageusement, le modèle de peau utilisé comprend un modèle dans lequel a été incorporé au moins un type cellulaire complémentaire, comme des cellules endothéliales (CE) et/ou des cellules immunitaires telles que lymphocytes, macrophages, mastocytes, cellules dendritiques et/ou des cellules adipeuses et/ou des annexes cutanées, comme des poils, des cheveux, des glandes sébacées. Advantageously, the skin model used comprises a model in which at least one complementary cell type has been incorporated, such as endothelial cells (EC) and/or immune cells such as lymphocytes, macrophages, mast cells, dendritic cells and/or cells fat and/or skin appendages, such as body hair, hair, sebaceous glands.
Le modèle de peau reconstituée de l’invention est particulièrement simple à mettre en œuvre. En outre, il ne nécessite pas d’utiliser une lignée cellulaire commerciale particulière, et s’avère avantageusement adaptable. The reconstituted skin model of the invention is particularly simple to implement. In addition, it does not require the use of a particular commercial cell line, and is advantageously adaptable.
Par « composante microbienne » on entend un ensemble de micro-organismes composés d’au moins quatre genres de bactéries différentes. De préférence, la composante microbienne est une composante microbienne cutanée. Par « composante microbienne cutanée » on entend un ensemble de micro-organismes composés d’au moins quatre genres de bactéries différentes, ledit au moins quatre genres de bactéries étant présents sur la peau d’un sujet, de préférence d’un sujet humain. De préférence, la composante microbienne comprend au moins quatre, cinq, six, sept, huit, neuf, ou dix genres de micro-organismes sélectionnés parmi les genres Cutibacterium, Staphylococcus, Streptococcus, Burkholderia, Finegoldia, Gemella, Veillonella, Kocuia, Corynebacterium, Methylobacterium, et Brevibacterium, plus préférentiellement l’ensemble de genres décrits ci-dessus. De préférence, les au moins quatre genres comprend les genres suivants : Cutibacterium, Staphylococcus, Streptococcus, et Burkholderia. La composante microbienne peut également comprendre un ou plusieurs genres ou espèces de champignon et/ou de virus. By “microbial component” is meant a set of microorganisms composed of at least four different genera of bacteria. Preferably, the microbial component is a skin microbial component. By “cutaneous microbial component” is meant a set of microorganisms composed of at least four different genera of bacteria, said at least four genera of bacteria being present on the skin of a subject, preferably of a human subject. Preferably, the microbial component comprises at least four, five, six, seven, eight, nine, or ten genera of microorganisms selected from the genera Cutibacterium, Staphylococcus, Streptococcus, Burkholderia, Finegoldia, Gemella, Veillonella, Kocuia, Corynebacterium, Methylobacterium, and Brevibacterium, more preferably the set of genera described above. Preferably, the at least four genera includes the following genera: Cutibacterium, Staphylococcus, Streptococcus, and Burkholderia. The microbial component may also include one or more genera or species of fungus and/or virus.
De préférence, la composante microbienne correspond au microbiote de la peau d’au moins un sujet. Par « microbiote » on entend l’ensemble de micro-organismes qui est présent dans un environnement. Le microbiote de la peau correspond donc à l’ensemble de micro-organismes présent sur la peau. Bien entendu, la composition du microbiote peut varier selon le site de la peau. De préférence, la composante microbienne cutanée correspond au microbiote de la peau de visage, de préférence du front, d’au moins un sujet. Aussi, selon un mode de réalisation préférentielle, la composante microbienne cutanée est issue d’un prélèvement d’au moins un sujet, plus préférentiellement au niveau du visage et encore plus préférentiellement au niveau du front. Dans un mode de réalisation particulier, le prélèvement de la composante microbienne peut se faire sur une zone de peau atteinte d’un trouble cutané comme par exemple une dermatose inflammatoire. De préférence, la composante microbienne à une viabilité de 5 000 RLU (2 x 105 CFU / ml) au moment qu’elle est ajoutée sur la surface du substitut cutané. Après 48h d’incubation, la composante microbienne à de préférence une viabilité d’environ 100 000 RLU/0,66 cm2 de substitut cutané. La viabilité est déterminée en utilisant le kit « BacTiter ATP Lite » de Promega. Preferably, the microbial component corresponds to the microbiota of the skin of at least one subject. By "microbiota" is meant the set of microorganisms present in an environment. The skin microbiota therefore corresponds to the set of microorganisms present on the skin. Of course, the composition of the microbiota can vary depending on the site of the skin. Preferably, the cutaneous microbial component corresponds to the microbiota of the skin face, preferably the forehead, of at least one subject. Also, according to a preferential embodiment, the cutaneous microbial component comes from a sample taken from at least one subject, more preferentially at the level of the face and even more preferentially at the level of the forehead. In a particular embodiment, the sampling of the microbial component can be done on an area of skin affected by a skin disorder such as, for example, an inflammatory dermatosis. Preferably, the microbial component has a viability of 5,000 RLU (2 x 10 5 CFU/ml) when it is added to the surface of the skin substitute. After 48 hours of incubation, the microbial component preferably has a viability of approximately 100,000 RLU/0.66 cm 2 of skin substitute. Viability is determined using the "BacTiter ATP Lite" kit from Promega.
Par « composante lipidique » on entend un mélange d’au moins deux, trois, ou quatre composants choisis parmi les acides gras libres, les triglycérides, le squalène, le cire et/ou esters de cire, et le cholestérol et/ou esters de cholestérol. De préférence, la composant lipidique est une source de nutriments pour au moins une espèce bactérienne présente dans la composante microbienne. De préférence, la composante lipidique permet de protéger le substitut cutané et/ou au moins une espèce bactérienne de la dessiccation. De préférence, la composant lipidique comprend un mélange de d’acides gras libres, de triglycérides, de squalène, de cire et/ou esters de cire, et de cholestérol et/ou esters de cholestérol. De préférence, les acides gras libres comprennent C16:0, C18:0, C16:l, C 18: 1 , et/ou C18:2. De préférence, les cires et/ou esters de cire comprennent C16:0/C16:0, C18:0/C18:0, C16: 1/C16: 1 , et/ou Cl 8: 1/C18: 1. De préférence, les triglycérides comprennent C16:0, C18:0, C16:l, et/ou C 18: 1. De préférence, la composante lipidique comprend 30 à 50 % p/p de triglycérides. De préférence, la composante lipidique comprend 15 à 30 % p/p d’acides gras libres. De préférence, la composante lipidique comprend 25 à 30 % p/p de cires et/ou esters de cire. De préférence, la composante lipidique comprend 12 à 20 % p/p de squalène. De préférence, la composante lipidique comprend 4,5 à 8,5 % p/p de cholestérol et/ou esters de cholestérol. Plus préférentiellement, la composante lipidique est composée de 30 à 50 % p/p de triglycérides, de 15 à 30 % p/p d’acides gras libres, de 25 à 30 % p/p de cires et/ou esters de cire, de 12 à 20 % p/p de squalène et de 4,5 à 8,5 % p/p de cholestérol et/ou esters de cholestérol. De préférence, la composante lipidique comprend 3,0 à 6,0 % p/p de cholestérol et de 1,5 à 2,5% p/p d’esters de cholestérol. De préférence, la composante lipidique est en forme de hydrolipide, c.-à-d. en forme d’émulsion avec de l’eau. De préférence, la composante lipidique est du sébum. De préférence, la composante lipidique est issue d’un prélèvement d’au moins un sujet, plus préférentiellement au niveau du visage et encore plus préférentiellement au niveau du front. De préférence, la composante lipidique est ajoutée à une concentration finale de 30 à 70ug/cm2, plus préférentiellement à une concentration finale de 40ug/cm2 de substitut cutané. Le substitut cutané étant composé d’au moins une couche de cellules cutanées, la composante microbienne et la composante lipidique sont présentes sur la surface dudit substitut. By "lipid component" is meant a mixture of at least two, three or four components chosen from free fatty acids, triglycerides, squalene, wax and/or wax esters, and cholesterol and/or esters of cholesterol. Preferably, the lipid component is a source of nutrients for at least one bacterial species present in the microbial component. Preferably, the lipid component makes it possible to protect the skin substitute and/or at least one bacterial species from desiccation. Preferably, the lipid component comprises a mixture of free fatty acids, triglycerides, squalene, wax and/or wax esters, and cholesterol and/or cholesterol esters. Preferably, the free fatty acids include C16:0, C18:0, C16:1, C18:1, and/or C18:2. Preferably, the waxes and/or wax esters comprise C16:0/C16:0, C18:0/C18:0, C16:1/C16:1, and/or Cl 8:1/C18:1. , the triglycerides include C16:0, C18:0, C16:1, and/or C 18:1. Preferably, the lipid component comprises 30 to 50% w/w triglycerides. Preferably, the lipid component comprises 15 to 30% w/w free fatty acids. Preferably, the lipid component comprises 25 to 30% w/w waxes and/or wax esters. Preferably the lipid component comprises 12-20% w/w squalene. Preferably, the lipid component comprises 4.5 to 8.5% w/w cholesterol and/or cholesterol esters. More preferably, the lipid component is composed of 30 to 50% w/w of triglycerides, 15 to 30% w/w of free fatty acids, 25 to 30% w/w of waxes and/or wax esters, from 12 to 20% w/w squalene and from 4.5 to 8.5% w/w cholesterol and/or cholesterol esters. Preferably, the lipid component comprises 3.0 to 6.0% w/w cholesterol and 1.5 to 2.5% w/w cholesterol esters. Preferably, the lipid component is in hydrolipid form, ie. in the form of an emulsion with water. Preferably, the lipid component is sebum. Preferably, the lipid component comes from a sample taken from at least one subject, more preferably from the face and even more preferentially at the level of the forehead. Preferably, the lipid component is added at a final concentration of 30 to 70 ug/cm 2 , more preferably at a final concentration of 40 ug/cm 2 of skin substitute. The skin substitute being composed of at least one layer of skin cells, the microbial component and the lipid component are present on the surface of said substitute.
Par « sujet », on entend ici toute personne humaine, que ce soit un adulte ou un enfant. Par « enfant », on entend selon l’invention un individu dont l’âge est inférieur ou égal à 16 ans. Sont ainsi compris dans la catégorie des enfants selon l’invention, les nouveau-nés, dont l’âge est compris entre 0 et 1 mois, les nourrissons, qui ont entre 1 mois et 2 ans, et les enfants proprement dits, qui sont âgés d’au moins 2 ans. Un « nouveau-né », comme on l’entend ici, peut aussi bien être né à terme qu’être prématuré. Un « adulte » au sens de la présente invention est une personne qui n’est pas un enfant, autrement dit une personne âgée de plus de 16 ans. By “subject” is meant here any human person, whether an adult or a child. By “child”, according to the invention, is meant an individual whose age is less than or equal to 16 years. Are thus included in the category of children according to the invention, newborns, whose age is between 0 and 1 month, infants, who are between 1 month and 2 years old, and children themselves, who are at least 2 years old. A “newborn”, as we understand it here, can be born at term as well as premature. An "adult" within the meaning of the present invention is a person who is not a child, in other words a person over the age of 16.
Un autre objet de l’invention porte sur un procédé d’obtention d’un modèle de peau reconstituée comprenant : a) Fourniture d’un substitut cutané, b) Application sur ledit substitut cutané, de façon concomitante ou séquentielle, d’une composante microbienne et d’une composante lipidique. Another object of the invention relates to a method for obtaining a model of reconstituted skin comprising: a) Supply of a skin substitute, b) Application to said skin substitute, concomitantly or sequentially, of a component microbial and a lipid component.
Le substitut cutané est tel que décrit ci-dessus. La composante lipidique peut être appliqué avant la composant microbienne, ou inversement. De préférence, la composante microbienne et la composante lipidique sont mélangés ensemble avant application sur le substitut cutané. De préférence, la composante microbienne et/ou la composante lipidique est/sont appliquée(s) sur le substitut cutané à l’aide d’une pipette et d’un doigtier. De préférence, la composante microbienne est appliquée frais ; autrement dit, elle n’a pas subi d’étape de congélation au préalable. The skin substitute is as described above. The lipid component can be applied before the microbial component, or vice versa. Preferably, the microbial component and the lipid component are mixed together before application to the skin substitute. Preferably, the microbial component and/or the lipid component is/are applied to the skin substitute using a pipette and a finger cot. Preferably, the microbial component is applied fresh; in other words, it has not been frozen beforehand.
Selon un aspect particulier, la peau reconstituée est stressée. De préférence, le procédé d’obtention comprend en outre une étape de réalisation d’au moins un stress exogène. Aussi, selon un autre aspect, le procédé d’obtention d’un modèle de peau reconstituée est caractérisé en ce que la peau reconstituée est stressée et en ce que le procédé comprend en outre une étape c) de réalisation d’au moins un stress exogène. According to a particular aspect, the reconstituted skin is stressed. Preferably, the method for obtaining further comprises a step of producing at least one exogenous stress. Also, according to another aspect, the method for obtaining a model of reconstituted skin is characterized in that the reconstituted skin is stressed and in that the method further comprises a step c) of carrying out at least one stress exogenous.
L’étape c) peut être réalisée avant ou après l’étape b) du procédé d’obtention du modèle. Dans certains cas, l’étape c) peut être réalisée sur la composante microbienne et/ou la composante lipidique avant leur application sur le substitut cutané. De préférence, l’étape c) est réalisé après l’étape b) du procédé. Step c) can be carried out before or after step b) of the process for obtaining the model. In some cases, step c) can be carried out on the microbial component and/or the component lipid before their application on the skin substitute. Preferably, step c) is carried out after step b) of the process.
Par « stress exogène » on entend tout facteur extérieur affectant l’intégrité de la peau et pouvant entraîner, le cas échéant, une diminution progressive de l’efficacité des fonctions de celle-ci. Le stress exogène peut être un stress chimique et/ou physique. By "exogenous stress" is meant any external factor affecting the integrity of the skin and which may lead, where appropriate, to a progressive reduction in the effectiveness of its functions. Exogenous stress can be chemical and/or physical stress.
Les stress physiques englobent notamment les stress environnementaux (par ex. le température) et les stress mécaniques (par ex. les frottements). De préférence le stress physique est choisi parmi rayonnement ultraviolet, lumière solaire, infra-rouge, proche infra-rouge, thermique, rayonnement hertzien dont, micro-ondes et ondes des téléphones portables, rayonnements ionisants dont beta, gamma, X, rayonnements non ionisants, le rayonnement d'un champ magnétique, ozone, un changement de pression, le chaud, le froid, les frottements, les étirements, des particules. Physical stresses include environmental stresses (eg temperature) and mechanical stresses (eg friction). Preferably, the physical stress is chosen from ultraviolet radiation, sunlight, infrared, near infrared, heat, hertzian radiation including microwaves and waves from mobile phones, ionizing radiation including beta, gamma, X, non-ionizing radiation , the radiation of a magnetic field, ozone, a change in pressure, heat, cold, friction, stretching, particles.
De préférence, le stress physique est un rayonnement mimant un rayonnement solaire, plus préférentiellement une irradiation dans le domaine UV dont UVA et/ou UVB ; et/ou lumière visible dont lumière bleue haute énergie visible et/ou infrarouge. Par « rayonnement ultraviolet » on entend des rayons électromagnétiques dont la longueur d’onde est comprise de 153 nm à 400 nm. Préférentiellement, l’exposition aux UV selon l’invention comprend l’exposition à des UVA et/ou à des UVB. Par UVA, on entend au sens de l’invention des rayonnements dont la longueur d’onde est comprise de 400 à 320 nm. Par UVB, on entend au sens de l’invention des rayonnements dont la longueur d’onde est comprise de 320 à 290 nm. Par « lumière visible » on entend des rayonnements dont la longueur d’onde est comprise de 400 à 700 nm. Par « lumière bleue haute énergie visible » on entend la lumière visible avec une longueur d'onde compris de 400 à 450 nm. Par « infrarouge » on entend des rayonnements dont la longueur d’onde est comprise de 700 nm à 2500 nm. Preferably, the physical stress is radiation mimicking solar radiation, more preferably radiation in the UV range including UVA and/or UVB; and/or visible light including visible and/or infrared high energy blue light. By “ultraviolet radiation” we mean electromagnetic rays whose wavelength is between 153 nm and 400 nm. Preferably, exposure to UV according to the invention comprises exposure to UVA and/or UVB. By UVA, is meant in the sense of the invention radiation whose wavelength is between 400 and 320 nm. By UVB is meant in the sense of the invention radiation whose wavelength is between 320 and 290 nm. “Visible light” means radiation whose wavelength is between 400 and 700 nm. “Visible high-energy blue light” means visible light with a wavelength of 400 to 450 nm. By “infrared” we mean radiation whose wavelength is between 700 nm and 2500 nm.
Selon un mode de réalisation préféré, l’exposition aux UV selon l’invention comprend ou consiste en l’exposition à des UVA. Selon un autre mode de réalisation préféré, l’exposition aux UV selon l’invention comprend ou consiste en l’exposition à des UVB. Selon un mode de réalisation avantageux, l’exposition aux UV selon l’invention comprend ou consiste en l’exposition à des UVA et à des UVB. Selon un autre mode de réalisation avantageux, l’exposition aux rayonnements selon l’invention comprend ou consiste en l’exposition à des UVA et/ou UVB et/ou lumière bleue haute énergie visible et/ou IR. Dans un mode de réalisation particulier, les longueurs d’onde appliques sont comprises entre 290 et 450 nm ou entre 290 à 400 nm. Dans un autre mode de réalisation particulier, le modèle de peau est exposé à une dose unique aiguë d'UV de 16,5 J/cm2 pendant environ 45 minutes. Dans un autre mode de réalisation particulier, la dose d’UVB est comprise entre 80 et 150 mJ/cm2 d’UVB ; de préférence 120 mJ/cm2 d’UVB. La réalisation d’une irradiation peut être effectué dans des conditions bien connues de la personne du métier (cf. par ex. lordanov et al, J. Biol. Chem. 1998). According to a preferred embodiment, the exposure to UV according to the invention comprises or consists of exposure to UVA. According to another preferred embodiment, the exposure to UV according to the invention comprises or consists of exposure to UVB. According to an advantageous embodiment, the exposure to UV according to the invention comprises or consists of exposure to UVA and to UVB. According to another advantageous embodiment, the exposure to radiation according to the invention comprises or consists of exposure to UVA and/or UVB and/or visible and/or IR high-energy blue light. In a particular embodiment, the wavelengths applied are between 290 and 450 nm or between 290 and 400nm. In another particular embodiment, the skin model is exposed to a single acute UV dose of 16.5 J/cm 2 for approximately 45 minutes. In another particular embodiment, the dose of UVB is between 80 and 150 mJ/cm 2 of UVB; preferably 120 mJ/cm 2 of UVB. The realization of an irradiation can be carried out under conditions well known to the person skilled in the art (cf. for example Lordanov et al, J. Biol. Chem. 1998).
De préférence, le stress chimique est au moins une substance chimique dont l’application topique conduit à une altération de la structure et/ou de la fonction de la peau. De préférence, le stress chimique est au moins un allergène un agent polluant, un tensioactif, un solvant, ou au moins un réactif de stimulation pro-inflammatoire tel qu’une cytokine ; préférentiellement un cocktail de cytokines spécifiques apte à induire le trouble cutané étudié. De tels réactifs sont bien connus, et sont décrits par exemple dans la demande WO 2015/014949. Selon un aspect particulier, le stress chimique comprend un ou deux composantes choisies parmi l’interleukine 1b, un ligand du récepteur TLR-2, et un ligand du récepteur TLR-3. De préférence, le stress chimique comprend l’interleukine 1b et optionnellement le ligand TLR (Poly (1:C) et/ou Pam3CSK4, plus préférentiellement les trois composantes. La réalisation d’un stress chimique comprenant l’application d’au moins l’interleukine IL- 1 P sur le modèle de peau reconstituée permet avantageusement de mimer la DA. Bien entendu, d’autres stress chimiques peuvent également permettre de mimer la DA, tels que la combinaison de Poly I:C et TNFa ; la combinaison IL4 et IL13 ; la combinaison Poly LC, IL-4, IL13 ; la combinaison IL-4, IL-13, IL-31 et optionnellement TNFa ; la combinaison IL-4, IL-13, IL-22, TNFa. Preferably, the chemical stress is at least one chemical substance whose topical application leads to an alteration of the structure and/or the function of the skin. Preferably, the chemical stress is at least one allergen, a polluting agent, a surfactant, a solvent, or at least one pro-inflammatory stimulation reagent such as a cytokine; preferably a cocktail of specific cytokines capable of inducing the skin disorder studied. Such reagents are well known, and are described for example in application WO 2015/014949. According to a particular aspect, the chemical stress comprises one or two components chosen from interleukin 1b, a ligand of the TLR-2 receptor, and a ligand of the TLR-3 receptor. Preferably, the chemical stress comprises interleukin 1b and optionally the TLR ligand (Poly (1:C) and/or Pam3CSK4, more preferably all three components. Performing chemical stress comprising the application of at least interleukin IL-1 P on the reconstituted skin model advantageously makes it possible to mimic DA Of course, other chemical stresses can also make it possible to mimic DA, such as the combination of Poly I:C and TNFα; the combination IL4 and IL13; the Poly LC, IL-4, IL13 combination; the IL-4, IL-13, IL-31 and optionally TNFα combination; the IL-4, IL-13, IL-22, TNFα combination.
À titre d’exemple particulier, afin de mimer l’effet de la pollution sur la peau, des particules ou des molécules chimiques peuvent notamment être mise(s) en contact avec le substitut cutané. Par exemple, des «particles matter » (PM10), issue de lots ERM-CZ100/CZ120, sont sous forme de poussière très fine. À titre d’exemple, 10 uL/cm2 de solution de particules fines suspendues dans l’acétone peut être déposée à la surface des épidermes reconstruits avant ajout du microbiote et du sébum. De façon alternative, le benzo(a)pyrène (B(a)P) peut être appliqué à la surface du substitut cutané. Le B(a)P est un bon représentant des polluants extérieurs car conduisant à des métabolites très toxiques. De façon alternative, le Tetrabisphenol A (TBBPA), qui est un retardateur de flammes bromé retrouvé dans la majorité des fournitures intérieur (meubles, tissus, ...) et considéré comme un polluant de l’intérieur, peut être appliqué à la surface du substitut cutané. Enfin, le cortisol est connu comme l’hormone du stress. Des niveaux élevés et persistants de cortisol peuvent être très dommageables pour la peau. Les effets négatifs peuvent inclure des signes visibles indésirables du vieillissement tels que les rides et ridules, l’amincissement de la peau, une élasticité réduite et une fonctionnalité moindre de la barrière cutanée. Afin d’obtenir un modèle de peau stressée, l’étape (c) peut correspondre à une mise en contact du le substitut cutané avec du cortisol, par exemple à une concentration de 4 pM. By way of specific example, in order to mimic the effect of pollution on the skin, chemical particles or molecules can in particular be brought into contact with the skin substitute. For example, “particles matter” (PM10), from ERM-CZ100/CZ120 batches, are in the form of very fine dust. For example, 10 μL/cm 2 of solution of fine particles suspended in acetone can be deposited on the surface of the reconstructed epidermis before adding the microbiota and the sebum. Alternatively, benzo(a)pyrene (B(a)P) can be applied to the surface of the skin substitute. B(a)P is a good representative of outdoor pollutants because it leads to very toxic metabolites. Alternatively, Tetrabisphenol A (TBBPA), which is a brominated flame retardant found in most interior supplies (furniture, fabrics, etc.) and considered an indoor pollutant, can be applied to the surface. skin substitute. Finally, cortisol is known as the stress hormone. Of the High and persistent levels of cortisol can be very damaging to the skin. Negative effects may include unwanted visible signs of aging such as fine lines and wrinkles, thinning of the skin, reduced elasticity and reduced functionality of the skin barrier. In order to obtain a model of stressed skin, step (c) may correspond to bringing the skin substitute into contact with cortisol, for example at a concentration of 4 μM.
Sans être limitatif, certains stress exogènes, permettant de mimer certains troubles de la peau, pouvant être réalisé dans le contexte de la présente invention, ainsi que les marqueurs associés audit trouble de la peau qui peuvent être mesurés dans le contexte de la présente invention sont décrits dans le Tableau 1, ci-après. Without being limiting, certain exogenous stresses, making it possible to mimic certain skin disorders, which can be carried out in the context of the present invention, as well as the markers associated with said skin disorder which can be measured in the context of the present invention are described in Table 1, below.
[Table 1]
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[Table 1]
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L’invention porte également sur un modèle de peau reconstituée obtenu par le procédé tel que décrit ici. The invention also relates to a model of reconstituted skin obtained by the method as described here.
Dans un mode de réalisation particulier, au moins deux stress exogènes, identiques ou différents sont réalisés sur le modèle de peau reconstituée selon l’invention. In a particular embodiment, at least two exogenous stresses, identical or different, are carried out on the reconstituted skin model according to the invention.
Dans un autre aspect, l’invention permet d’identifier des actifs ou des formulations permettant de prévenir et/ou améliorer au moins un trouble cutané ou d’évaluer l’efficacité des actifs ou des formulations permettant de prévenir et/ou améliorer au moins un trouble cutané. L’invention permet en particulier de distinguer les actifs ou les formulations selon leur activité pour prévenir et/ou améliorer au moins un trouble cutané. In another aspect, the invention makes it possible to identify active agents or formulations making it possible to prevent and/or improve at least one skin disorder or to evaluate the effectiveness of the active agents or formulations making it possible to prevent and/or improve at least a skin disorder. The invention makes it possible in particular to distinguish the active agents or the formulations according to their activity for preventing and/or improving at least one skin disorder.
L’invention a donc également pour objet une méthode de criblage pour l’identification in vitro d’un actif ou d’une formulation cosmétique pour prévenir et/ou améliorer au moins un trouble cutané induit suite à au moins un stress exogène comprenant les étapes suivantes : a) L’application dudit actif ou de ladite formulation cosmétique sur le modèle de peau reconstituée ; b) La réalisation d’au moins un stress exogène sur ledit modèle ; c) Au moins une mesure du niveau d’expression d’au moins un marqueur biologique ; et d) Déterminer si ledit actif ou de ladite formulation cosmétique permet de prévenir et/ou améliorer au moins un trouble cutané en fonction d’au moins un niveau d’expression mesuré à l’étape c). The invention therefore also relates to a screening method for the in vitro identification of an active ingredient or of a cosmetic formulation to prevent and/or improve at least one skin disorder induced following at least one exogenous stress comprising the steps following steps: a) Applying said active ingredient or said cosmetic formulation to the reconstituted skin model; b) The realization of at least one exogenous stress on the said model; c) At least one measurement of the level of expression of at least one biological marker; and d) Determining whether said active ingredient or said cosmetic formulation makes it possible to prevent and/or improve at least one skin disorder according to at least one level of expression measured in step c).
L’invention a également pour objet une méthode d’évaluation de l’efficacité in vitro d’un actif ou d’une formulation cosmétique pour prévenir et/ou traiter au moins un trouble cutané induit suite à au moins un stress exogène comprenant les étapes suivantes : a) L’application dudit actif ou de ladite formulation cosmétique sur le modèle de peau reconstituée ; b) La réalisation d’au moins un stress exogène sur ledit modèle ; c) Au moins une mesure du niveau d’expression d’au moins un marqueur biologique ; et d) Évaluer l’efficacité dudit actif ou de ladite formulation cosmétique en fonction d’au moins un niveau d’expression mesuré à l’étape c). The invention also relates to a method for evaluating the in vitro efficacy of an active or a cosmetic formulation for preventing and/or treating at least one skin disorder induced following at least one exogenous stress comprising the following steps: a) applying said active ingredient or said cosmetic formulation to the reconstituted skin model; b) The realization of at least one exogenous stress on said model; c) At least one measurement of the level of expression of at least one biological marker; and d) Evaluating the efficacy of said active ingredient or of said cosmetic formulation as a function of at least one level of expression measured in step c).
L’étape a) peut être réalisée avant ou après l’étape b) de la méthode de criblage pour l’identification in vitro d’un actif ou d’une formulation cosmétique ou dans la méthode d’évaluation de l’efficacité in vitro d’un actif ou d’une formulation cosmétique. En effet, la réalisation de l’étape a) avant l’étape b) peut notamment permettre d’évaluer la capacité d’un actif ou formulation cosmétique à prévenir au moins un trouble cutané alors que la réalisation de l’étape a) après l’étape b) peut notamment permettre d’évaluer la capacité d’un actif ou formulation cosmétique à améliorer au moins un trouble cutané. Step a) can be carried out before or after step b) of the screening method for the in vitro identification of an active ingredient or of a cosmetic formulation or in the method for evaluating the in vitro efficacy an active ingredient or a cosmetic formulation. In fact, carrying out step a) before step b) can in particular make it possible to evaluate the ability of an active ingredient or cosmetic formulation to prevent at least one skin disorder, whereas carrying out step a) after step b) can in particular make it possible to evaluate the ability of an active ingredient or cosmetic formulation to improve at least one skin disorder.
L’application de l’actif d’intérêt sur le modèle de peau selon l’étape a) peut être faite directement. Alternativement, il pourra être avantageux de formuler l’actif d’intérêt, par exemple de façon à obtenir une composition liquide, afin de faciliter son application sur le modèle de peau. Ainsi, selon un mode de réalisation de l’invention, le procédé comprend en outre une étape de formulation de l’actif, notamment sous forme d’une solution liquide, en particulier aqueuse, préalablement à l’étape a) d’application dudit actif avec un modèle de peau. The application of the active ingredient of interest to the skin model according to step a) can be done directly. Alternatively, it may be advantageous to formulate the active ingredient of interest, for example so as to obtain a liquid composition, in order to facilitate its application to the skin model. Thus, according to one embodiment of the invention, the method further comprises a step of formulating the active ingredient, in particular in the form of a liquid solution, in particular aqueous, prior to step a) of applying said active with a skin model.
L’actif candidat est un actif pour la prévention et/ou l’amélioration d’au moins un trouble cutané si ledit actif candidat permet de moduler l’expression d’au moins un marqueur biologique de l’invention. Cette modulation peut correspondre, selon les cas, et en particulier selon la nature du marqueur biologique, à une augmentation ou à une diminution de l’expression dudit marqueur. De la même façon, la formulation candidate est une formulation pour la prévention et/ou l’amélioration d’au moins un trouble cutané, si ladite formulation candidate permet de moduler l’expression d’au moins un marqueur biologique de l’invention. Cette modulation peut correspondre, selon les cas, et en particulier selon la nature du marqueur biologique, à une augmentation ou à une diminution de l’expression dudit marqueur. The candidate active ingredient is an active ingredient for the prevention and/or improvement of at least one skin disorder if said candidate active ingredient makes it possible to modulate the expression of at least one biological marker of the invention. This modulation may correspond, depending on the case, and in particular depending on the nature of the biological marker, to an increase or a decrease in the expression of said marker. Similarly, the candidate formulation is a formulation for preventing and/or improving at least one skin disorder, if said candidate formulation makes it possible to modulate the expression of at least one biological marker of the invention. This modulation may correspond, depending on the case, and in particular depending on the nature of the biological marker, to an increase or a decrease in the expression of said marker.
Par exemple, il serait avantageux d’identifier des actifs ou des formulations minimisant les effets du stress exogène ou du trouble cutané sur les marqueurs de la barrière, afin de maintenir l’intégrité de la barrière cutanée. For example, it would be advantageous to identify actives or formulations that minimize the effects of exogenous stress or skin disorder on the barrier markers, in order to maintain the integrity of the skin barrier.
Par « l’efficacité in vitro d’un actif ou d’une formulation cosmétique pour prévenir et/ou traiter au moins un trouble cutané », on entend au sens de la présente demande la capacité de la formulation ou de l’actif à annuler ou diminuer les effets liés à au moins un trouble cutané. La prévention s’entend dans le cas présent d’un traitement qui est administré avant le développement du trouble cutané (c-à-d. avant la réalisation d’un stress exogène à l’étape b)), tandis que la réduction correspond à un traitement qui est administré une fois que les effets du trouble cutané sont apparus (c-à-d. après la réalisation d’un stress exogène à l’étape b)). By “the in vitro efficacy of an active ingredient or of a cosmetic formulation for preventing and/or treating at least one skin disorder”, is meant within the meaning of the present application the ability of the formulation or of the active ingredient to cancel or decrease the effects related to at least one skin disorder. Prevention in the present case means treatment that is administered before the development of the skin disorder (i.e. before the realization of an exogenous stress in step b)), while reduction corresponds to a treatment that is administered once the effects of the skin disorder have appeared (i.e. after the achievement of an exogenous stress in step b)).
Le terme « augmenté », tel qu'il est utilisé ici, signifie une plus grande quantité, par exemple, une quantité légèrement supérieure à la quantité d'origine, ou par exemple une quantité en grand excès par rapport à la quantité d’origine, et notamment toutes les quantités dans l’intervalle. En variante, « augmentation » peut faire référence à une quantité ou une activité qui est au moins 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 % ou 20 % de plus que la quantité ou de l'activité pour laquelle la quantité ou de l'activité accrue est comparé, ou encore au moins 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 %, 200 %, 250 %, 300 %, 350 %, 400 %, 450 %, 500 %, 550 %, 600 %, 650 %, 700 %, 750 %, 800 %, 900 %, 950 %, 1 000 %, 1 100 %, 1 200 %, 1 300 %, 1 400 %, 1 500 %, 1 600 %, 1 700 %, 1 800 %, 1 900 % ou 2 000 % de plus que la quantité ou de l'activité pour laquelle la quantité ou de l'activité accrue est comparé. Les termes « augmenté », « plus grand que », et « accru » sont utilisés ici de manière interchangeable. The term "increased", as used herein, means a larger amount, e.g., an amount slightly greater than the original amount, or e.g., an amount in great excess of the original amount. , including all quantities in between. Alternatively, "increase" may refer to an amount or activity that is at least 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11 %, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% or 20% more than the quantity or activity for which the increased quantity or activity is compared , or at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650%, 700%, 750%, 800%, 900%, 950% , 1000%, 1100%, 1200%, 1300%, 1400%, 1500%, 1600%, 1700%, 1800%, 1900% or 2000% more than the quantity or of the activity for which the increased quantity or activity is being compared. The terms "increased", "greater than", and "increased" are used interchangeably herein.
Le terme « diminué », tel qu'il est utilisé ici, signifie une moins grande quantité, par exemple, une quantité légèrement inférieure à la quantité d’origine, ou par exemple une quantité fortement réduite par rapport à la quantité d’origine, et notamment toutes les quantités dans l’intervalle. En variante, « diminution » peut faire référence à une quantité ou une activité qui est au moins 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 % ou 20 % de moins que la quantité ou de l'activité pour laquelle la quantité ou de l'activité diminuée est comparé, ou encore au moins 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 %, 200 %, 250 %, 300 %, 350 %, 400 %, 450 %, 500 %, 550 %, 600 %, 650 %, 700 %, 750 %, 800 %, 900 %, 950 %, 1 000 %, 1 100 %, 1 200 %, 1 300 %, 1 400 %, 1 500 %, 1 600 %, 1 700 %, 1 800 %, 1 900 % ou 2 000 % de moins que la quantité ou de l'activité pour laquelle la quantité ou de l'activité diminuée est comparé. Les termes « diminué », « plus petit que », et « réduit » sont utilisés ici de manière interchangeable. The term "decreased", as used herein, means a lesser amount, for example, a slightly lower amount than the original amount, or for example a greatly reduced amount compared to the original amount, including all quantities in between. Alternatively, "decrease" may refer to an amount or activity that is at least 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11 %, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% or 20% less than the quantity or activity for which the decreased quantity or activity is compared , or at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650%, 700%, 750%, 800%, 900%, 950% , 1000%, 1100%, 1200%, 1300%, 1400%, 1500%, 1600%, 1700%, 1800%, 1900% or 2000% less than the quantity or activity for which the decreased quantity or activity is being compared. The terms "decreased", "less than", and "reduced" are used interchangeably herein.
Afin de déterminer si l’expression d’un marqueur est accrue ou diminuée dans le modèle de peau de l’invention, le niveau d’expression dudit marqueur pourra être comparé avec un niveau d’expression de référence. In order to determine whether the expression of a marker is increased or decreased in the skin model of the invention, the level of expression of said marker can be compared with a reference level of expression.
Selon ce mode de réalisation préféré, l’étape d), permettant de déterminer si l’actif ou la formulation cosmétique prévient et/ou améliore au moins un trouble cutané, peut comprendre une comparaison du niveau d’expression du marqueur biologique de l’étape c) avec un niveau d’expression de référence. According to this preferred embodiment, step d), making it possible to determine whether the active ingredient or the cosmetic formulation prevents and/or improves at least one skin disorder, can comprise a comparison of the level of expression of the biological marker of step c) with a reference level of expression.
Par « un niveau d’expression de référence d’un marqueur biologique », on entend au sens de la présente demande tout niveau d’expression dudit marqueur utilisé à titre de référence. Par exemple, un niveau d’expression de référence peut être obtenu en mesurant le niveau d’expression du marqueur d’intérêt dans un modèle de peau normale. Un tel modèle de peau normale peut, par exemple, correspondre à un modèle de peau reconstituée obtenu à partir de cellules cutanées d’un sujet sain ou sans pathologie apparente. On peut aussi utiliser comme modèle de peau normale, un modèle de peau reconstituée sans réalisation du stress exogène. Dans ce cas, l’expression du marqueur biologique peut être mesurée avant l’étape b) ; le niveau ainsi déterminé est alors le niveau d’expression de référence dudit marqueur biologique. By "a reference level of expression of a biological marker", is meant within the meaning of the present application any level of expression of said marker used as a reference. For example, a baseline expression level can be obtained by measuring the expression level of the marker of interest in a normal skin model. Such a normal skin model can, for example, correspond to a reconstituted skin model obtained from skin cells of a healthy subject or without apparent pathology. It is also possible to use, as a model of normal skin, a model of reconstituted skin without realization of the exogenous stress. In this case, the expression of the biological marker can be measured before step b); the level thus determined is then the reference expression level of said biological marker.
Dans d’autres modes de réalisation, le niveau d’expression de référence d’un marqueur biologique correspond au niveau d’expression dudit marqueur dans le modèle de peau en absence ou en présence d’un traitement particulier. Par exemple, dans un mode de réalisation particulier, le niveau d’expression de référence d’un marqueur biologique est obtenu en mesurant l’expression dudit marqueur dans le modèle de peau qui n’a pas été mis en contact avec un actif ou une formulation et/ou qui n’a pas subi de stress exogène. Dans un autre mode de réalisation particulier, l’expression dudit marqueur est mesurée dans le modèle de peau traité avec un actif ou une formulation connus pour être efficaces contre un trouble cutané. In other embodiments, the reference level of expression of a biological marker corresponds to the level of expression of said marker in the skin model in the absence or in the presence of a particular treatment. For example, in a particular embodiment, the reference level of expression of a biological marker is obtained by measuring the expression of said marker in the skin model which has not been brought into contact with an active ingredient or a formulation and/or which has not been subjected to exogenous stress. In another particular embodiment, the expression of said marker is measured in the skin model treated with an active ingredient or a formulation known to be effective against a skin disorder.
La personne du métier comprendra en outre aisément que la comparaison de l’étape d) est de préférence effectuée entre des mesures de niveaux d’expression obtenus pour des modèles de peau obtenus à partir de substituts cutanés de structures histologiques similaires, voire identiques. Par « structures histologiques similaires », on entend au sens de la présente demande que les proportions relatives des types cellulaires compris dans les modèles de peau comparés sont similaires. Ainsi, il est préférable que les proportions relatives des types cellulaires et/ou de types de micro-organismes compris dans le modèle de peau de l’étape a) ne diffèrent pas de plus de 5 % des proportions relatives des types cellulaires et/ou de types de micro-organismes compris dans le modèle de peau utilisé pour l’obtention du niveau d’expression de référence de l’étape d). Par « proportion relative d’un type cellulaire » on entend au sens de la présente demande le rapport du nombre de cellules correspondant à ce type cellulaire sur le nombre de cellules totales comprises dans le modèle de peau. Ainsi, il est par exemple préférable que la proportion de kératinocytes sur le nombre de cellules totales dans le modèle de peau de l’étape a) ne diffère pas de plus de 5 % de la proportion de kératinocytes sur le nombre de cellules totales dans le modèle de peau utilisé pour l’obtention du niveau d’expression de référence de l’étape d). Par « proportion relative d’un type de micro-organisme » on entend au sens de la présente demande le rapport de l’abondance d’un genre ou espèce de micro-organisme sur le nombre de micro-organismes totaux compris dans le modèle de peau. De préférence, la proportion relative d’un genre ou espèce de bactérie est le rapport de l’abondance dudit genre ou espèce sur le nombre de bactéries totales. A person skilled in the art will moreover easily understand that the comparison of step d) is preferably carried out between measurements of expression levels obtained for skin models obtained from skin substitutes of similar, or even identical, histological structures. By "similar histological structures" is meant within the meaning of the present application that the relative proportions of the cell types included in the compared skin models are similar. Thus, it is preferable that the relative proportions of the cell types and/or types of microorganisms comprised in the skin model of step a) do not differ by more than 5% from the relative proportions of the cell types and/or of types of microorganisms included in the skin model used to obtain the reference expression level of step d). By “relative proportion of a cell type” is meant within the meaning of the present application the ratio of the number of cells corresponding to this cell type to the number of total cells included in the skin model. Thus, it is for example preferable that the proportion of keratinocytes on the number of total cells in the skin model of step a) does not differ by more than 5% from the proportion of keratinocytes on the number of total cells in the skin model used to obtain the reference expression level of step d). By “relative proportion of a type of microorganism” is meant within the meaning of the present application the ratio of the abundance of a genus or species of microorganism to the number of total microorganisms included in the model of skin. Preferably, the relative proportion of a genus or species of bacteria is the ratio of the abundance of said genus or species to the number of total bacteria.
Par « structures histologiques identiques », on entend au sens de la présente demande que les proportions relatives des types cellulaires compris dans les modèles de peau comparés sont identiques. Au sens de la présente invention, les proportions relatives des types cellulaires compris dans le modèle de peau de l’étape a) sont identiques aux proportions relatives des types cellulaires compris dans le modèle de peau utilisé pour l’obtention du niveau d’expression de référence de l’étape d) lorsqu’elles ne diffèrent pas de plus de 0,1 %. Avantageusement, la proportion de kératinocytes sur le nombre de cellules totales dans le modèle de peau de l’étape a) ne diffère pas de plus de 0,1% de la proportion de kératinocytes sur le nombre de cellules totales dans le modèle de peau utilisé pour l’obtention du niveau d’expression de référence de l’étape d). By “identical histological structures”, it is meant within the meaning of the present application that the relative proportions of the cell types included in the compared skin models are identical. Within the meaning of the present invention, the relative proportions of the cell types included in the skin model of step a) are identical to the relative proportions of the cell types included in the skin model used to obtain the level of expression of reference from step d) when they do not differ by more than 0.1%. Advantageously, the proportion of keratinocytes to the number of total cells in the skin model of step a) does not differ by more than 0.1% from the proportion of keratinocytes to the number of total cells in the skin model used to obtain the reference expression level of step d).
La personne du métier comprendra tout aussi aisément que la comparaison de l’étape d) est de préférence effectuée entre des mesures de niveaux d’expression obtenus pour des modèles de peau qui sont de taille, de volume ou de poids similaires, voire identiques. Ainsi, il est préférable que la taille, le volume, ou le poids du modèle de peau de l’étape a) ne diffère pas de plus de 5 % de la taille, du volume, ou du poids du modèle de peau utilisé pour l’obtention du niveau d’expression de référence de l’étape d). Plus préférentiellement, la taille, et le volume et le poids du modèle de peau de l’étape a) ne diffèrent pas de plus de 5 % de la taille, du volume et du poids du modèle de peau utilisé pour l’obtention du niveau d’expression de référence de l’étape d). Encore plus préférentiellement, la taille, et le volume et le poids du modèle de peau de l’étape a) ne diffèrent pas de plus de 0,1 % de la taille, du volume et du poids du modèle de peau utilisé pour l’obtention du niveau d’expression de référence de l’étape d). The person skilled in the art will understand just as easily that the comparison of step d) is preferably carried out between measurements of expression levels obtained for skin models which are of similar size, volume or weight, or even identical. Thus, it is preferable that the size, volume, or weight of the skin model of step a) does not differ by more than 5% from the size, volume, or weight of the skin model used for the obtaining the reference expression level of step d). More preferentially, the size, and the volume and the weight of the skin model of step a) do not differ by more than 5% from the size, the volume and the weight of the skin model used to obtain the level step reference expression d). Even more preferentially, the size, and the volume and the weight of the skin model of step a) do not differ by more than 0.1% from the size, the volume and the weight of the skin model used for the obtaining the reference expression level of step d).
Alternativement, si les modèles de peau diffèrent de plus de 5 % de par la taille, le volume et le poids, l’homme du métier pourra normaliser le niveau obtenu à l’étape c) et le niveau de référence de l’étape d) à l’aide d’un facteur de normalisation. Alternatively, if the skin models differ by more than 5% in size, volume and weight, the person skilled in the art can standardize the level obtained in step c) and the reference level in step d ) using a normalization factor.
Ce facteur de normalisation pourra par exemple être un marqueur physique directement accessible tel que la masse de cellules de l’échantillon, ou la masse d’un constituant cellulaire, comme la masse d’ADN cellulaire ou la masse de protéines cellulaires. This normalization factor could for example be a directly accessible physical marker such as the mass of cells in the sample, or the mass of a cellular constituent, such as the mass of cellular DNA or the mass of cellular proteins.
Il peut aussi être avantageux d’utiliser comme facteur de normalisation le niveau d’expression d’un gène qui est exprimé au même niveau dans toutes les cellules, ou presque, de l’organisme. En d’autres termes, selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, on utilise comme facteur de normalisation le niveau d’expression d’un gène de ménage. Selon un autre mode de réalisation, le niveau obtenu à l’étape c) et le niveau de référence de l’étape d) sont normalisés en utilisant le niveau d’expression, non pas des gènes de ménage, mais des protéines codées par ceux-ci. Un gène de ménage est un gène exprimé dans tous les types cellulaires, qui code une protéine ayant une fonction de base nécessaire pour la survie de tous les types cellulaires. Une liste de gènes de ménage humains peut être trouvée dans Eisenberg et al. (Trends in Genet, 19 : 362-365, 2003). Les gènes de ménage selon l’invention incluent par exemple les gènes RPS28, GAPDH, B2M, TFRC, YWHAZ, RPLO, 18S, GUSB, UBC, TBP, GAPDH, PPIA, POLR2A, ACTB, PGK1, HPRT1, IPO8 et HMBS. It may also be advantageous to use as a normalizing factor the expression level of a gene that is expressed at the same level in all or most cells of the organism. In other words, according to a particular embodiment of the present invention, the level of expression of a housekeeping gene is used as a normalization factor. According to another embodiment, the level obtained in step c) and the reference level in step d) are normalized using the level of expression, not of the housekeeping genes, but of the proteins coded by those -this. A housekeeping gene is a gene expressed in all cell types, which encodes a protein with a basic function necessary for the survival of all cell types. A list of human housekeeping genes can be found in Eisenberg et al. (Trends in Genet, 19: 362-365, 2003). The housekeeping genes according to the invention include for example the RPS28, GAPDH, B2M, TFRC, YWHAZ, RPLO, 18S, GUSB, UBC, TBP, GAPDH, PPIA, POLR2A, ACTB, PGK1, HPRT1, IPO8 and HMBS genes.
L’étape c) est réalisée après les étapes a) et b). La détermination de l’étape d) se fera avantageusement en comparant le niveau d’expression de l’étape c) avec un niveau d’expression de référence (voir ci-dessus). Par exemple, le modèle de peau qui n'a pas été traité par l’actif ou la formulation peut être utilisé comme témoin. Dans ce cas, le niveau d’expression du marqueur biologique de l'invention est mesuré dans ledit modèle de peau avant et après application de l’actif ou de la formulation cosmétique. De façon alternative, le niveau d’expression du marqueur biologique de l'invention est mesuré dans un modèle de peau sans application de l’actif ou de la formulation cosmétique et dans un modèle de peau avec de l’actif ou de la formulation cosmétique. Le niveau de d'expression du marqueur biologique de l'invention peut aussi être comparé avec celui mesuré in vivo dans une peau normale ou in vivo dans une peau ayant subi un stress exogène. Par « peau normale », on entend ici une peau provenant d’un sujet sain ou sans pathologie cutanée apparente. Le niveau d’expression de référence est de préférence le niveau d’expression dudit marqueur biologique dans un modèle de peau qui n'a pas été en contact avec l’actif ou la formulation, ce qui permet d'effectuer une comparaison significative entre le niveau d'expression de l'étape c) et ledit niveau de référence. Par exemple, un modèle de peau qui n'a pas été traité par l’actif ou la formulation (c.-à-d. sans réalisation de l’étape a) ou avant réalisation de l’étape a)) peut être utilisé comme témoin. Dans ce cas, le niveau d'expression du marqueur biologique de l’invention est mesuré dans ledit modèle de peau avec et sans application de l’agent actif ou la formulation cosmétique (ou avant et après réalisation de l’étape a)). Step c) is carried out after steps a) and b). The determination of step d) will advantageously be done by comparing the level of expression of step c) with a reference level of expression (see above). For example, the skin model which has not been treated with the active ingredient or the formulation can be used as a control. In this case, the level of expression of the biological marker of the invention is measured in said skin model before and after application of the active ingredient or of the cosmetic formulation. Alternatively, the level of expression of the biological marker of the invention is measured in a skin model without application of the active ingredient or of the cosmetic formulation and in a skin model with active ingredient or of the cosmetic formulation . The level of expression of the biological marker of the invention can also be compared with that measured in vivo in normal skin or in vivo in skin having undergone exogenous stress. By “normal skin” is meant here skin originating from a healthy subject or one with no apparent skin pathology. The reference expression level is preferably the expression level of said biological marker in a skin model which has not been in contact with the active ingredient or the formulation, which makes it possible to carry out a significant comparison between the expression level of step c) and said reference level. For example, a skin model that has not been treated with the active ingredient or the formulation (i.e. without performing step a) or before performing step a)) can be used as a witness. In this case, the level of expression of the biological marker of the invention is measured in said skin model with and without application of the active agent or the cosmetic formulation (or before and after performing step a)).
Le procédé de l’invention peut en outre comporter une comparaison de la viabilité cellulaire dans le modèle de peau traité avec l’actif ou la formulation et dans l’échantillon témoin. Dans ce cas, l’actif ou la formulation cosmétique est bien toléré par la peau si la viabilité cellulaire de l’échantillon n’est pas affectée par la présence de l’agent actif ou la formulation cosmétique. Selon un autre mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention comprend donc une étape supplémentaire de détermination de la viabilité cellulaire dans le modèle de peau traité avec l’actif ou la formulation cosmétique, de détermination de la viabilité cellulaire dans l’échantillon témoin et de comparaison entre les deux. The method of the invention may also comprise a comparison of cell viability in the skin model treated with the active ingredient or the formulation and in the control sample. In this case, the active agent or the cosmetic formulation is well tolerated by the skin if the cell viability of the sample is not affected by the presence of the active agent or the cosmetic formulation. According to another preferred embodiment, the method of the invention therefore comprises an additional step of determining the cell viability in the skin model treated with the active ingredient or the cosmetic formulation, of determining the cell viability in the sample control and comparison between the two.
De nombreux tests pour déterminer la viabilité cellulaire sont disponibles pour la personne du métier et sont couramment utilisés en cosmétologie. On citera en particulier le test MTT, décrit par exemple dans Mosman et al. (J Immunol Methods, 65(1-2) : 55-63, 1983). Many tests for determining cell viability are available to those skilled in the art and are commonly used in cosmetology. Mention will be made in particular of the MTT test, described for example in Mosman et al. (J Immunol Methods, 65(1-2):55-63, 1983).
Par « troubles cutanés », il est ici entendu toutes les réactions anormales qui peuvent subvenir sur la peau d’un individu. Ces conditions touchent aussi bien la peau en elle-même (c’est-à-dire l’épiderme, le derme et/ou l’hypoderme), que les pores de la peau, les glandes sudoripares et sébacées qui y sont annexées, et/ou le microbiote. By “skin disorders”, it is here understood all the abnormal reactions which can occur on the skin of an individual. These conditions affect both the skin itself (i.e. the epidermis, dermis and/or hypodermis), as well as the pores of the skin, the sweat and sebaceous glands attached to it, and/or the microbiota.
Les troubles cutanés selon l’invention se traduisent plus particulièrement par des lésions, ce qui correspond à une peau endommagée ou en mauvais état. La peau endommagée comprend par exemple la peau sensible réactive, la peau sèche (la xérose), la peau endommagée par le soleil, par les radiations, par le froid, par le stress ou par la pollution, par une allergie, par un urticaire, par un eczéma et d’autres formes de dermatites comme la dermatite atopique, l’impétigo, la dermatite irritative, en particulier la dermite irritative du siège ou érythème fessier, la dermatite de contact, la dermite séborrhéique de la peau et du cuir chevelu (croûte de lait), le psoriasis, la maladie de Lainer-Moussous, ou encore par des plaies ou des brûlures. Par trouble cutané, on entend donc des troubles aussi divers que les dartres, les angiomes (y compris tubéreux, sous- cutanés ou plans), les hémangiomes, l’acné du nourrisson, l’acné de l’adolescent, les ichtyoses (par exemple vulgaris, congénitale, arlequin...), la rosacé, le prurit, etc. Un trouble cutané peut aussi être causé ou exacerbé par une infection externe par exemple d’origine parasitaire, virale, bactérienne ou fongique. Sont ainsi incluses en particulier dans les troubles cutanés les verrues, le prurigo strophulus, la gale, la pédiculose du cuir chevelu, ou encore les mycoses. Ces dernières sont des parasitoses causées par la prolifération de champignons microscopiques parasites de l’organisme. Parmi les mycoses les plus fréquentes, on peut citer les candidoses et les pityrosporoses, qui sont provoquées par la prolifération de levures de la peau. De préférence, le trouble cutané est choisi parmi les troubles liés au vieillissement, à la pollution, au rayonnement ; les dermatoses inflammatoires, préférentiellement la dermatite atopique, l’acné, le psoriasis ; la rosacée ; le prurit ; une altération de la fonction barrière ; les peaux réactives ; les xéroses. The skin disorders according to the invention result more particularly in lesions, which corresponds to skin that is damaged or in poor condition. Damaged skin includes for example reactive sensitive skin, dry skin (xerosis), skin damaged by the sun, by radiation, by cold, by stress or by pollution, by an allergy, by hives, by eczema and other forms of dermatitis such as atopic dermatitis, impetigo, irritative dermatitis, in particular irritative diaper dermatitis or diaper rash, contact dermatitis, seborrheic dermatitis of the skin and scalp ( cradle cap), psoriasis, Lainer-Moussous disease, or wounds or burns. By skin disorder, we thus means disorders as diverse as scabs, angiomas (including tuberous, subcutaneous or flat), hemangiomas, infant acne, adolescent acne, ichthyosis (eg vulgaris, congenital, harlequin...), rosacea, pruritus, etc. A skin disorder can also be caused or exacerbated by an external infection, for example of parasitic, viral, bacterial or fungal origin. Are thus included in particular in skin disorders warts, prurigo strophulus, scabies, pediculosis of the scalp, or even mycoses. The latter are parasitoses caused by the proliferation of parasitic microscopic fungi in the body. Among the most common fungal infections are candidiasis and pityrosporosis, which are caused by the proliferation of yeasts in the skin. Preferably, the skin disorder is chosen from disorders linked to ageing, pollution, radiation; inflammatory dermatoses, preferably atopic dermatitis, acne, psoriasis; rosacea; pruritus; impaired barrier function; reactive skin; xeroses.
Par « marqueur biologique », on entend au sens de la présente demande une caractéristique qui est objectivement mesurée et évaluée comme indicateur de processus biologiques normaux, de processus pathogéniques, ou de réponses pharmacologiques à une intervention thérapeutique. Un marqueur biologique désigne donc toute une gamme de substances et de paramètre divers. Par exemple, un marqueur biologique peut être une substance dont la détection indique un état pathologique particulier (par exemple la présence de la protéine C réactive en tant que marqueur d'une infection), ou au contraire une substance dont la détection indique un état physiologique spécifique. Préférentiellement, ledit marqueur biologique est un marqueur biologique d’un trouble cutané si son niveau d’expression est différent dans une peau saine et dans une peau présentant les caractères cliniques dudit trouble cutané. De façon plus préférée, ledit marqueur caractérise un trouble cutané si ledit marqueur est exprimé de façon différentielle dans un modèle de peau dans lequel un stress exogène a été réalisé et le modèle de peau n’ayant pas subis de stress exogène. Cela se traduit par un rapport à l’étape d) qui est différent de 1 lorsque le mesure du niveau d’expression est comparé entre ces deux conditions. By "biological marker" is meant within the meaning of the present application a characteristic which is objectively measured and evaluated as an indicator of normal biological processes, of pathogenic processes, or of pharmacological responses to a therapeutic intervention. A biological marker therefore designates a whole range of substances and various parameters. For example, a biological marker can be a substance whose detection indicates a particular pathological state (for example the presence of C-reactive protein as a marker of an infection), or on the contrary a substance whose detection indicates a physiological state. specific. Preferably, said biological marker is a biological marker of a skin disorder if its level of expression is different in healthy skin and in skin exhibiting the clinical characteristics of said skin disorder. More preferably, said marker characterizes a skin disorder if said marker is differentially expressed in a skin model in which an exogenous stress has been carried out and the skin model not having undergone exogenous stress. This results in a ratio in step d) that is different from 1 when the expression level measurement is compared between these two conditions.
Le marqueur biologique selon l’invention est préférablement un gène, les produits d’un gène tels que ses transcrits et les peptides issus de ses transcrits, un lipide, un sucre ou un métabolite. Des exemples de marqueurs biologiques selon l’invention sont notamment fournis dans le Tableau 1, ainsi que ci-après. Pour chacun de ces types de marqueurs, de nombreuses méthodes sont à la disposition de la personne métier pour mesurer l’expression dudit marqueur biologique. Dans un mode de réalisation particulier, au moins deux, trois, quatre, cinq, six, sept, huit, neuf, ou dix biomarqueurs sont mesurés. Lesdits biomarqueurs sont discriminants, permettant ainsi de cribler des actifs ou formulations cosmétiques pour prévenir ou traiter des troubles de la peau ou d’évaluer l’efficacité des actifs ou formulations cosmétiques pour prévenir ou traiter des troubles de la peau. The biological marker according to the invention is preferably a gene, the products of a gene such as its transcripts and the peptides derived from its transcripts, a lipid, a sugar or a metabolite. Examples of biological markers according to the invention are in particular provided in Table 1, as well as below. For each of these types of markers, many methods are available to the person skilled in the art for measuring the expression of said biological marker. In a particular embodiment, at least two, three, four, five, six, seven, eight, nine, or ten biomarkers are measured. Said biomarkers are discriminating, thus making it possible to screen cosmetic actives or formulations for preventing or treating skin disorders or to evaluate the effectiveness of cosmetic actives or formulations for preventing or treating skin disorders.
La personne du métier cherchant à déterminer à quelle classe appartient un marqueur biologique pourra facilement consulter la littérature scientifique pertinente ou se rapporter à des bases de données publiques telles que, par exemple, celles regroupées sur le site internet du National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/). The person skilled in the art seeking to determine to which class a biological marker belongs can easily consult the relevant scientific literature or refer to public databases such as, for example, those grouped together on the website of the National Center for Biotechnology Information (http ://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/).
Le marqueur biologique de l’invention est avantageusement un marqueur sélectionné parmi les marqueurs de l’inflammation, du stress oxydatif, de la fonction barrière, et/ou de la composante microbienne. Le marqueur biologique peut être mesuré dans le substitut cutanée et/ou dans la composante microbienne/composante lipidique qui sont présentes sur la surface dudit substitut cutanée du modèle. Selon un aspect, le marqueur biologique est mesuré au moins dans la composante microbienne, de préférence dans la composante microbienne. Selon un autre aspect, le marqueur biologique est mesuré au moins dans le substitut cutané, de préférence dans le substitut cutané. The biological marker of the invention is advantageously a marker selected from markers of inflammation, oxidative stress, barrier function, and/or microbial component. The biomarker can be measured in the skin substitute and/or in the microbial component/lipid component which are present on the surface of said model skin substitute. In one aspect, the biomarker is measured at least in the microbial component, preferably in the microbial component. According to another aspect, the biological marker is measured at least in the skin substitute, preferably in the skin substitute.
Les « marqueurs de l’inflammation » selon l’invention comprend les marqueurs qui sont modulés lors d’une réponse inflammatoire dans la peau. Ils comprennent des cytokines, telles que l’IL-8 ou la TSLP, ainsi que des peptides anti-microbiens, tels que la psoriasine, codé par le gène S100A7, et la beta-défensine 2, codé par le gène DEFB4A. The "markers of inflammation" according to the invention include markers which are modulated during an inflammatory response in the skin. They include cytokines, such as IL-8 or TSLP, as well as anti-microbial peptides, such as psoriasin, encoded by the S100A7 gene, and beta-defensin 2, encoded by the DEFB4A gene.
Parmi les cytokines, la protéine IL-8 est une cytokine qui est induite précocement dans l’inflammation cutanée. Elle est notamment produite par synthèse de novo dans les kératinocytes stimulés par ILla et/ou TNF. De ce fait, c’est un marqueur prédictif d’une réponse biologique, même en l’absence de signes visibles d’irritation cutanée. La séquence protéique de l’interleukine IL-8 humaine correspond à la séquence de référence NCBI : NP 000575. Cette protéine est codée par le gène IL8 humain (référence NCBI : Gene ID : 3576). La séquence de celui-ci est accessible sous la référence NCBI : NM_000584. Among the cytokines, the IL-8 protein is a cytokine which is induced early in cutaneous inflammation. It is in particular produced by de novo synthesis in keratinocytes stimulated by ILla and/or TNF. It is therefore a predictive marker of a biological response, even in the absence of visible signs of skin irritation. The protein sequence of human interleukin IL-8 corresponds to the NCBI reference sequence: NP 000575. This protein is encoded by the human IL8 gene (NCBI reference: Gene ID: 3576). The sequence of this one is accessible under the NCBI reference: NM_000584.
La protéine TSLP une cytokine inflammatoire caractéristique de la DA. Sa sécrétion est nettement stimulée dans le cas de la dermatite atopique et promeut l’initiation d’une réponse inflammatoire par les Th2. De ce fait, c’est un bon marqueur de la DA. D’autres marqueurs, tels que RANTES/CCL5, MCP-3/CCL7 et/ou IL-6 sont également indicatifs de la DA et peuvent être mesurés dans le cadre de la présente invention. The TSLP protein is an inflammatory cytokine characteristic of AD. Its secretion is clearly stimulated in the case of atopic dermatitis and promotes the initiation of an inflammatory response by Th2. Therefore, it is a good marker of AD. Other markers, such as RANTES/CCL5, MCP-3/CCL7 and/or IL-6 are also indicative of AD and can be measured within the scope of the present invention.
Les « marqueurs du stress oxydatif » selon l’invention comprennent les marqueurs qui sont exprimés dans la peau et/ou dans la composante microbienne en cas de stress oxydatif. De préférence, les marqueurs du stress oxydatif sont des métabolites. De préférence, un moins un métabolite parmi xanthine, acide urique, et glutathion est mesuré. The "markers of oxidative stress" according to the invention include markers which are expressed in the skin and/or in the microbial component in the event of oxidative stress. Preferably, the oxidative stress markers are metabolites. Preferably, at least one metabolite of xanthine, uric acid, and glutathione is measured.
Les « marqueurs de la fonction barrière » selon l’invention comprennent les marqueurs qui sont spécifiquement exprimés dans les couches de l’épiderme les plus externes et qui participent à la fonction barrière. Préférentiellement, les marqueurs de la fonction barrière selon l’invention sont des marqueurs exprimés dans le stratum corneum ou des marqueurs exprimés dans les jonctions serrées du stratum granulosum. Ces marqueurs comprennent notamment les claudines, dont la Claudine- 1 (CLDN1), les transglutaminases, comme par exemple la transglutaminase 1 (TGM1), les kératines, notamment la kératine 1 (KRT1) et la kératine 10 (KRT10), la peptidyl arginine deiminase type 1 humaine (PAD1), la caspase 14 (CASP14), l’aquaporin 3 (AQP3), la loricine (LOR), la scielline (SCEL), la protéine BARX Homeobox 2 (BARX2), la desmogleine-1 (DSG1), la fïlaggrine (FLG), l’involucrine (IVL), la sphingomyélinase ou sphingomyéline diestérase (SMPD), la coméodesmosine (CSDN), etc. De préférence, au moins un marqueur parmi la claudine-1 (CLDN1), la transglutaminase 1 (TGM1) et la fïlaggrine (FLG) est mesuré. Selon un autre aspect, les marqueurs de la fonction barrière comprennent un ou plusieurs métabolites discriminants de la fonction barrière. De préférence, un moins un métabolite parmi acide octanoïque, sérine, glutamate, phosphorylcholine, histidine, L-glutamine, L-alanine, méthionine, et xanthine est mesuré. The “barrier function markers” according to the invention include markers which are specifically expressed in the outermost layers of the epidermis and which participate in the barrier function. Preferably, the barrier function markers according to the invention are markers expressed in the stratum corneum or markers expressed in the tight junctions of the stratum granulosum. These markers include in particular claudins, including claudin-1 (CLDN1), transglutaminases, such as for example transglutaminase 1 (TGM1), keratins, in particular keratin 1 (KRT1) and keratin 10 (KRT10), peptidyl arginine human deiminase type 1 (PAD1), caspase 14 (CASP14), aquaporin 3 (AQP3), loricin (LOR), sciellin (SCEL), BARX Homeobox protein 2 (BARX2), desmoglein-1 (DSG1 ), filaggrin (FLG), involucrin (IVL), sphingomyelinase or sphingomyelin diesterase (SMPD), comeodesmosine (CSDN), etc. Preferably, at least one marker among claudin-1 (CLDN1), transglutaminase 1 (TGM1) and filaggrin (FLG) is measured. In another aspect, the barrier function markers comprise one or more barrier function discriminating metabolites. Preferably, at least one metabolite of octanoic acid, serine, glutamate, phosphorylcholine, histidine, L-glutamine, L-alanine, methionine, and xanthine is measured.
Les « marqueurs de la composante microbienne » selon l’invention comprennent les marqueurs qui sont modulés dans la composant microbienne en réponse à un stress exogène et/ou un actif ou formulation cosmétique. Ils comprennent notamment des métabolites, tels que formate, acétate, glucose et maltose, glycérol, bétaïne, octanoate, tyrosine, panthénol, phénylalanine. L’expression d’un gène peut être mesurée par exemple au niveau nucléotidique, en mesurant la quantité de transcrits dudit gène, et peut aussi être mesurée par exemple au niveau peptidique, en mesurant par exemple la quantité des protéines issus desdits transcrits. Ainsi, par « mesure du niveau d’expression d’un gène » on entend au sens de l’invention la mesure de la quantité ou de la concentration cellulaire de produit du gène sous sa forme peptidique ou sous sa forme nucléotidique. En particulier, l’expression d’au moins un gène (par ex. 16S) peut être mesurée afin de déterminer la présence ou absence d’au moins un micro-organisme dans le microbiote du modèle. The "microbial component markers" according to the invention include markers which are modulated in the microbial component in response to an exogenous stress and/or an active ingredient or cosmetic formulation. They include in particular metabolites, such as formate, acetate, glucose and maltose, glycerol, betaine, octanoate, tyrosine, panthenol, phenylalanine. The expression of a gene can be measured for example at the nucleotide level, by measuring the amount of transcripts of said gene, and can also be measured for example at the peptide level, by measuring for example the amount of proteins from said transcripts. Thus, by “measurement of the level of expression of a gene” is meant within the meaning of the invention the measurement of the quantity or of the cellular concentration of product of the gene in its peptide form or in its nucleotide form. In particular, the expression of at least one gene (e.g. 16S) can be measured in order to determine the presence or absence of at least one microorganism in the model microbiota.
De façon générale, l’expression du marqueur biologique selon l’invention sera détectée in vitro à partir du modèle de peau reconstituée. Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de l’invention peut comprendre une ou plusieurs étapes intermédiaires entre l’obtention du modèle de peau reconstituée et la mesure de l’expression du marqueur biologique, lesdites étapes correspondant à l’extraction à partir dudit modèle de peau reconstituée d’un échantillon lipidique, d’un échantillon de NMF, d’un échantillon d’ARNm (ou de l’ADNc correspondant) ou d’un échantillon de protéine. Celui-ci peut ensuite être directement utilisé pour mesurer l’expression du marqueur. La préparation ou l’extraction d’ARNm (ainsi que la rétrotranscription de celui-ci en ADNc), de protéines, de lipides ou de NMF à partir d’un échantillon de cellules de peau ne sont que des procédures de routine bien connues de la personne du métier. In general, the expression of the biological marker according to the invention will be detected in vitro from the reconstituted skin model. In a particular embodiment, the method of the invention may comprise one or more intermediate steps between obtaining the reconstituted skin model and measuring the expression of the biological marker, said steps corresponding to the extraction from said reconstructed skin model of a lipid sample, an NMF sample, an mRNA sample (or the corresponding cDNA) or a protein sample. This can then be directly used to measure the expression of the marker. The preparation or extraction of mRNA (as well as the reverse transcription thereof into cDNA), proteins, lipids or NMFs from a sample of skin cells are only well-known routine procedures of the person in the trade.
Dans le cas de marqueurs qui sont sécrétés dans le milieu de culture, la personne du métier peut simplement doser le marqueur à partir dudit milieu de culture. In the case of markers which are secreted into the culture medium, the person skilled in the art can simply assay the marker from said culture medium.
Une fois qu’un échantillon d’ARNm (ou d’ADNc correspondant) ou de protéine est obtenu, l’expression du marqueur, au niveau soit des ARNm (c’est-à-dire dans l’ensemble des ARNm ou des ADNc présents dans l’échantillon), soit des protéines (c’est-à-dire dans l’ensemble des protéines présentes dans l’échantillon), peut être mesurée. La méthode utilisée pour ce faire dépend alors du type de transformation (ARNm, ADNc ou protéine) et du type d’échantillon disponible. Once a sample of mRNA (or corresponding cDNA) or protein is obtained, the expression of the marker, either at the level of the mRNAs (i.e. in all the mRNAs or cDNAs present in the sample), or proteins (that is to say in all the proteins present in the sample), can be measured. The method used to do this then depends on the type of transformation (mRNA, cDNA or protein) and the type of sample available.
Quand l’expression du marqueur est mesurée au niveau de l’ARNm (ou d’ADNc correspondant), n’importe quelle technologie habituellement utilisée par la personne du métier peut être mise en œuvre. Ces technologies d’analyse du niveau d’expression des gènes, comme par exemple l’analyse du transcriptome, incluent des méthodes bien connues telles que la PCR (Polymerase Chain Reaction, si on part d’ADN), la RT -PCR (Reverse Transcription-PCR, si on part d’ARN) ou la RT-PCR quantitative ou encore les puces d’acides nucléiques (dont les puces à ADN et les puces à oligonucléotides) pour un plus haut débit. When the expression of the marker is measured at the mRNA (or corresponding cDNA) level, any technology usually used by the person skilled in the art can be implemented. These gene expression level analysis technologies, such as transcriptome analysis, include well-known methods such as PCR (Polymerase Chain Reaction, if starting from DNA), RT-PCR (Reverse Transcription-PCR, if starting from RNA) or quantitative RT-PCR or even nucleic acid chips (including DNA chips and oligonucleotide chips) for higher throughput.
Par « puces d’acides nucléiques », on entend ici plusieurs sondes d’acides nucléiques différentes qui sont attachées à un substrat, lequel peut être une micropuce, une lame de verre, ou une bille de la taille d’une microsphère. La micropuce peut être constituée de polymères, de plastiques, de résines, de polysaccharides, de silice ou d’un matériau à base de silice, de carbone, de métaux, de verre inorganique, ou de nitrocellulose. By “nucleic acid chips”, we mean here several different nucleic acid probes which are attached to a substrate, which can be a microchip, a glass slide, or a bead the size of a microsphere. The microchip can be made of polymers, plastics, resins, polysaccharides, silica or silica-based material, carbon, metals, inorganic glass, or nitrocellulose.
Les sondes peuvent être des acides nucléiques tels que les ADNc (« puce à ADNc »), les ARNm (« puce à ARNm ») ou des oligonucléotides (« puce à oligonucléotides »), lesdits oligonucléotides pouvant typiquement avoir une longueur comprise entre environ 25 et 60 nucléotides. The probes can be nucleic acids such as cDNAs (“cDNA chip”), mRNAs (“mRNA chip”) or oligonucleotides (“oligonucleotide chip”), said oligonucleotides typically being able to have a length of between about 25 and 60 nucleotides.
Pour déterminer le profil d’expression d’un gène particulier, un acide nucléique correspondant à tout ou partie dudit gène est marqué, puis mis en contact avec la puce dans des conditions d’hybridation, conduisant à la formation de complexes entre ledit acide nucléique cible marqué et les sondes attachées à la surface de la puce qui sont complémentaires de cet acide nucléique. La présence de complexes hybridés marqués est ensuite détectée. To determine the expression profile of a particular gene, a nucleic acid corresponding to all or part of said gene is labeled, then brought into contact with the chip under hybridization conditions, leading to the formation of complexes between said nucleic acid labeled target and probes attached to the chip surface that are complementary to that nucleic acid. The presence of labeled hybridized complexes is then detected.
Ces technologies permettent de suivre le niveau d’expression d’un gène en particulier ou de plusieurs gènes voire même de tous les gènes du génome (full genome ou full transcriptome) dans un échantillon biologique (cellules, tissus...). Ces technologies sont utilisées en routine par la personne du métier et il n’est donc pas besoin de les détailler ici. Des exemples de mises en œuvre de l’invention basées sur l’analyse d’expression génique (puces à ADNc) et sur la PCR quantitative sont décrits dans la section expérimentale. These technologies make it possible to monitor the level of expression of a particular gene or of several genes or even of all the genes of the genome (full genome or full transcriptome) in a biological sample (cells, tissues, etc.). These technologies are routinely used by the person skilled in the art and there is therefore no need to detail them here. Examples of implementations of the invention based on gene expression analysis (cDNA chips) and on quantitative PCR are described in the experimental section.
Alternativement, il est possible d’utiliser toute technologie actuelle ou future permettant de déterminer l’expression des gènes sur la base de la quantité d’ARNm dans l’échantillon. Par exemple, la personne du métier peut mesurer l’expression d’un gène par hybridation avec une sonde d’acide nucléique marquée, comme par exemple par Northern blot (pour l’ARNm) ou par Southern blot (pour l’ADNc), mais aussi par des techniques telles que la méthode d'analyse sérielle de l'expression des gènes (SAGE) et ses dérivés, tels que LongSAGE, SuperSAGE, DeepSAGE, etc. Il est aussi possible d’utiliser des puces à tissu (aussi connues en tant que TMAs : « tissue microarrays »). Les tests habituellement employés avec les puces à tissu comprennent l’immunohistochimie et l’hybridation fluorescente in situ. Pour l’analyse au niveau de l’ARNm, les puces à tissu peuvent être couplées avec l’hybridation fluorescente in situ. Enfin, il est possible d’utiliser le séquençage massif en parallèle pour obtenir déterminer la quantité d’ARNm dans l’échantillon (RNA-Seq ou « Whole Transcriptome Shotgun Sequencing »). À cet effet, plusieurs méthodes de séquençage massif en parallèle sont disponibles. De telles méthodes sont décrites dans, par exemple, US 4,882,127 ; US 4,849,077 ; US 7,556,922 ; US 6,723,513 ; WO 03/066896 ; WO 2007/111924 ; US 2008/0020392 ; WO 2006/084132 ; US 2009/0186349 ; US 2009/0181860 ; US 2009/0181385 ; US 2006/0275782 ; EP-B1-1141399 ; Shendure & Ji, Nat Biotechnol., 26(10) : 1135-45, 2008 ; Pihlak et al., Nat Biotechnol., 26(6) : 676- 684, 2008 ; Fuller et al., Nature Biotechnol., 27(11) : 1013-1023, 2009 ; Mardis, Genome Med., 1(4): 40, 2009 ; Metzker, Nature Rev. Genet., 11(1) : 31-46, 2010. Alternatively, any current or future technology that can determine gene expression based on the amount of mRNA in the sample can be used. For example, the person skilled in the art can measure the expression of a gene by hybridization with a labeled nucleic acid probe, such as for example by Northern blot (for mRNA) or by Southern blot (for cDNA), but also by techniques such as the Serial Gene Expression Analysis (SAGE) method and its derivatives, such as LongSAGE, SuperSAGE, DeepSAGE, etc. It is also possible to use tissue microarrays (also known as TMAs). Typical tests employed with tissue microarrays include immunohistochemistry and fluorescent in situ hybridization. For analysis at the mRNA level, tissue microarrays can be coupled with fluorescent in situ hybridization. Finally, it is possible to use massive sequencing in parallel to determine the amount of mRNA in the sample (RNA-Seq or “Whole Transcriptome Shotgun Sequencing”). For this purpose, several massive parallel sequencing methods are available. Such methods are described in, for example, US 4,882,127; US 4,849,077; US 7,556,922; US 6,723,513; WO 03/066896; WO 2007/111924; US 2008/0020392; WO 2006/084132; US 2009/0186349; US 2009/0181860; US 2009/0181385; US 2006/0275782; EP-B1-1141399; Shendure & Ji, Nat Biotechnol., 26(10):1135-45, 2008; Pihlak et al., Nat Biotechnol., 26(6):676-684, 2008; Fuller et al., Nature Biotechnol., 27(11):1013-1023, 2009; Tuesdays, Genome Med., 1(4): 40, 2009; Metzker, Nature Rev. Genet., 11(1): 31-46, 2010.
Quand l’expression du marqueur est mesurée au niveau protéique, il est possible d’employer des anticorps spécifiques, en particulier dans des technologies bien connues telles que l’immunoprécipitation, l’immunohisto logic, le western blot, le dot blot, l’ELISA ou l’ELISPOT, les puces à protéines, les puces à anticorps, ou les puces à tissu couplées à l’immunohistochimie. Parmi les autres techniques qui peuvent être utilisées sont comprises les techniques de FRET ou de BRET, la cytométrie de flux, les méthodes de microscopie ou d’histochimie, dont notamment les méthodes de microscopie confocale, de microscopie à fluorescence, de microscopie électronique, de microscopie à force atomique, les méthodes basées sur l’utilisation d’une ou plusieurs longueurs d’onde d’excitation et d’une méthode optique adaptée, comme une méthode électrochimique (les techniques voltamétrie et d’ampérométrie), et les méthodes de radiofréquence, comme la spectroscopic résonance multipolaire, confocale et non-confocale, comme la détection de fluorescence, luminescence, chemiluminescence, absorbance, réflectance, transmittance, biréfringence ou index de réfraction (par exemple, par résonance des plasmons de surface, ou « surface plasmon resonance » en anglais, par ellipsométrie, par méthode de miroir résonnant, etc.), l’imagerie par résonance radioisotopique ou magnétique, l’analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE); par électrophorèse bidimensionnelle, par spectrophotométrie, par spectrométrie de masse et spectrométrie de masse en tandem, par chromatographie liquide ou gazeuse couplée à la spectrométrie de masse ou à la spectrométrie de masse en tandem. Toutes ces techniques sont bien connues de la personne du métier et il n’est pas nécessaire de les détailler ici. When marker expression is measured at the protein level, specific antibodies can be employed, particularly in well-known technologies such as immunoprecipitation, immunohistology, western blot, dot blot, ELISA or ELISPOT, protein chips, antibody chips, or tissue chips coupled with immunohistochemistry. Among the other techniques which can be used are included FRET or BRET techniques, flow cytometry, microscopy or histochemistry methods, including in particular confocal microscopy, fluorescence microscopy, electron microscopy, atomic force microscopy, methods based on the use of one or more excitation wavelengths and a suitable optical method, such as an electrochemical method (voltammetry and amperometry techniques), and methods of radiofrequency, such as multipolar, confocal and non-confocal resonance spectroscopy, such as the detection of fluorescence, luminescence, chemiluminescence, absorbance, reflectance, transmittance, birefringence or index of refraction (for example, by surface plasmon resonance, or "surface plasmon resonance” in English, by ellipsometry, by resonant mirror method, etc.), radioisotopic or magnetic resonance imaging, analysis by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE); by two-dimensional electrophoresis, by spectrophotometry, by mass spectrometry and tandem mass spectrometry, by liquid or gas chromatography coupled with mass spectrometry or tandem mass spectrometry. All these techniques are well known to those skilled in the art and it is not necessary to detail them here.
Si le marqueur biologique est un lipide, notamment un céramide ou un acide gras, ou un métabolite, la personne du métier pourra utiliser toutes les méthodes à sa disposition pour mesurer la teneur en lipide dans un échantillon de cellules cutanées. Ces méthodes comprennent, entre autres, la chromatographie liquide (HPLC, voir par exemple Sullivan et al., Arch Ophthalmol., 120(12) : 1689-99, 2002), la chromatographie liquide couplée à un détecteur évaporatif à diffraction de la lumière (HPLC-ESD, voir Nordbâck et al., J. High Résolut. Chromatogr., 22 : 483-486, 1999 ; Torres et al., J. Chromatogr. A., 1078 : 28-34, 2005) ; la chromatographie en couche mince (TLC, par exemple Downing et al., J Invest Dermatol., 77(4) : 358-360, 1981; Nordstrom et al., J Invest Dermatol., 87(2) : 260-263, 1986) ; la résonance magnétique nucléaire (NMR, voir par exemple Robosky et al., J Lipid Res., 49(3) : 686-692, 2008) ; la microspectroscopie confocale in vivo de Raman ; la spectrométrie de masse, la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS, voir O’Neill et al., J Chromatogr Sci., 14(1) : 28-36, 1976) ; la chromatographie en phase gazeuse couplée à un détecteur à ionisation de flamme ; la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse (voir par exemple van Smeden et al., J Lipid Res, 52(6): 1211-1221, 2011) ; la chromatographie en phase liquide ultra-performante (UPLC, voir Rainville et al., J Proteome Res., 6(2):552-558, 2007 ; Castro-Perez et al., J Proteome Res., 10(9) : 4281-4290, 2011). On peut également analyser l'organisation de ces lipides dans la peau et plus particulièrement dans le stratum corneum (ou couche cornée), organisation lamellaire ou latérale, par des techniques par exemple de diffraction aux rayons X (Bouwstra et al., J Invest Dermatol., 97 (6): 1005-1012, 1991 ; van Smeden et al., J Lipid Res., 52(6): 1211-1221, 1991) ou par spectroscopic infra-rouge à transformée de Fourier (Gorcea et al., Int J Pharm. Nov 10, 2011) ou par une analyse morphométrique en microscopie électronique (Daehnhardt-Pfeiffer et al., Skin Pharmacol Physiol., 25(3): 155-161, 2012) ou par une analyse en microscopie électronique de section vitreuse de peau combinée à une analyse moléculaire (Iwai et al., J Invest Dermatol., Apr 26, 2012). If the biological marker is a lipid, in particular a ceramide or a fatty acid, or a metabolite, the person skilled in the art can use all the methods at his disposal to measure the lipid content in a sample of skin cells. These methods include, among others, liquid chromatography (HPLC, see for example Sullivan et al., Arch Ophthalmol., 120(12): 1689-99, 2002), liquid chromatography coupled with an evaporative light scattering detector (HPLC-ESD, see Nordbâck et al., J. High Résolut. Chromatogr., 22: 483-486, 1999; Torres et al., J. Chromatogr. A., 1078: 28-34, 2005); thin layer chromatography (TLC, for example Downing et al., J Invest Dermatol., 77(4): 358-360, 1981; Nordstrom et al., J Invest Dermatol., 87(2): 260-263, 1986); nuclear magnetic resonance (NMR, see for example Robosky et al., J Lipid Res., 49(3): 686-692, 2008); in vivo confocal Raman microspectroscopy; mass spectrometry, gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS, see O'Neill et al., J Chromatogr Sci., 14(1): 28-36, 1976); gas chromatography coupled with a flame ionization detector; liquid phase chromatography coupled with mass spectrometry (see for example van Smeden et al., J Lipid Res, 52(6): 1211-1221, 2011); ultra-performance liquid phase chromatography (UPLC, see Rainville et al., J Proteome Res., 6(2):552-558, 2007; Castro-Perez et al., J Proteome Res., 10(9): 4281-4290, 2011). It is also possible to analyze the organization of these lipids in the skin and more particularly in the stratum corneum (or stratum corneum), lamellar or lateral organization, by techniques for example of X-ray diffraction (Bouwstra et al., J Invest Dermatol ., 97 (6): 1005-1012, 1991; van Smeden et al., J Lipid Res., 52(6): 1211-1221, 1991) or by Fourier transform infrared spectroscopy (Gorcea et al. , Int J Pharm. Nov 10, 2011) or by electron microscopy morphometric analysis (Daehnhardt-Pfeiffer et al., Skin Pharmacol Physiol., 25(3): 155-161, 2012) or by electron microscopy analysis of vitreous section of skin combined with molecular analysis (Iwai et al., J Invest Dermatol., Apr 26, 2012).
Le dosage du NMF est une procédure bien connue de la personne du métier. Il est en particulier possible de doser le NMF par l’utilisation de microspectroscopie confocale in vivo de Raman. C’est une procédure couramment utilisée dans le domaine depuis au moins 15 ans. À titre d’exemple, on citera entre autres les publications de Caspers et al. (J Invest Dermatol., 116(3) : 434-442, 2001), Vyumvuhore et al. (J Biomed Opt., 19(11) : 111603, 2014), ou encore Falcone et al. (Skin Pharmacol Physiol, 28 : 307-317, 2015). Il est aussi possible de doser les NMF par la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse. On se référera par exemple à Piraud et al. (Rapid Commun Mass Spectrom, 19(12) : 1587-602, 2005), Petritis et al. (Journal of Chromatography A, 833(2): 147-155, 1999), Henriksen et al. (J Am Soc Mass Spectrom, 16(4): 446-455, 2005) ou encore Yang (Application of biophysics and bioengineering to the assessment of skin barrier function. Thesis (Doctor of Philosophy (PhD)). University of Bath, UK, 2011). The NMF assay is a procedure well known to those skilled in the art. In particular, it is possible to measure NMF using in vivo confocal Raman microspectroscopy. This is a commonly used procedure in the field for at least 15 years. By way of example, we can cite among others the publications of Caspers et al. (J Invest Dermatol., 116(3): 434-442, 2001), Vyumvuhore et al. (J Biomed Opt., 19(11): 111603, 2014), or even Falcone et al. (Skin Pharmacol Physiol, 28:307-317, 2015). It is also possible to assay the NMFs by liquid phase chromatography coupled with mass spectrometry. Reference will be made, for example, to Piraud et al. (Rapid Common Mass Spectrom, 19(12):1587-602, 2005), Petritis et al. (Journal of Chromatography A, 833(2): 147-155, 1999), Henriksen et al. (J Am Soc Mass Spectrom, 16(4): 446-455, 2005) or Yang (Application of biophysics and bioengineering to the assessment of skin barrier function. Thesis (Doctor of Philosophy (PhD)). University of Bath, UK , 2011).
Dans un mode de réalisation particulier, l’actif évalué est au moins un filtre solaire. Par filtre solaire, on entend toute substance capable de filtrer le rayonnement solaire pour protéger une surface, typiquement la peau ou les cheveux, contre les effets nocifs de ces radiations. In a particular embodiment, the evaluated asset is at least one sunscreen. By sunscreen is meant any substance capable of filtering solar radiation to protect a surface, typically the skin or the hair, against the harmful effects of this radiation.
Le filtre solaire est choisi parmi ceux classiquement connus dont les filtres solaires organiques tels que les dérivés de triazine, les dérivés de benzotriazole et phényl benzotriazole, les dérivés du dibenzoylmethane, les dérivés de benzophénone et 2-hydroxybenzophénone amino-substitué, les dérivés de merocyanine dont le methoxypropylamino cyclohexenylidene ethoxyethylcyanoacetate, les dérivés de l’acide para aminobenzoïque, les dérivés salicyliques, les dérivés cinnamiques, les dérivés de P,P’-diphénylacrylate, les dérivés de benzylidène camphre, les dérivés de phenylbenzimidazole, les dérivés anthraniliques, les dérivés d’imidazolines, et les dérivés de benzalmalonate. les filtres solaires inorganiques tels que les oxydes métalliques enrobés ou non comme par exemple les oxydes de titane, de fer, de zinc, de zirconium, ou de cérium. The sunscreen is chosen from those conventionally known including organic sunscreens such as triazine derivatives, benzotriazole and phenyl benzotriazole derivatives, dibenzoylmethane derivatives, amino-substituted benzophenone and 2-hydroxybenzophenone derivatives, merocyanine derivatives including methoxypropylamino cyclohexenylidene ethoxyethylcyanoacetate, para-aminobenzoic acid derivatives, salicylic derivatives, cinnamic derivatives, P,P'-diphenylacrylate derivatives, benzylidenecamphor derivatives, phenylbenzimidazole, anthranilic derivatives, imidazoline derivatives, and benzalmalonate derivatives. inorganic sunscreens such as coated or uncoated metal oxides such as, for example, titanium, iron, zinc, zirconium or cerium oxides.
De préférence, l’actif évalué dans est au moins un filtre solaire. De préférence, la méthode d’évaluation de l’efficacité in vitro d’au moins un filtre solaire ou d’une formulation cosmétique le ou les comprenant pour prévenir et/ou traiter au moins un trouble cutané induit suite à au moins un stress exogène consistant en une irradiation UV, infrarouge, ou lumière bleue. Preferably, the active evaluated in is at least one sunscreen. Preferably, the method for evaluating the in vitro efficacy of at least one sunscreen or of a cosmetic formulation comprising it or them for preventing and/or treating at least one skin disorder induced following at least one exogenous stress consisting of UV, infrared, or blue light irradiation.
Méthode d'évaluation in vitro de la tolérance d’un actif ou d’une formulation cosmétique, comprenant les étapes suivantes : a) L’application dudit actif ou de ladite formulation cosmétique sur le modèle de peau reconstituée ; b) Au moins une mesure du niveau d’expression d’au moins un marqueur biologique dans le modèle de peau de l’étape a) ; et c) Évaluer si ledit actif ou formulation cosmétique est bien toléré par le modèle de peau. L'actif est un actif qui est bien toléré par la peau si ledit actif ne module pas l'expression du marqueur biologique de façon significative. De la même façon, la formulation cosmétique est bien tolérée si l’expression du marqueur biologique n’est pas modulée par son addition sur le modèle de peau reconstituée de façon significative. Par « significative » on entend un résultat obtenu par la mise en œuvre d'un test statistique, tel qu’un test Wilcoxon univarié, et ayant une valeur p inférieure à 0,05, préférentiellement une valeur p inférieure à 0,01, plus préférentiellement un valeur p inférieure à 0,001. Les tests statistiques appropriés sont bien connus de la personne du métier. Ladite modulation peut correspondre, selon les cas, et en particulier selon la nature du marqueur biologique, à une augmentation ou à une diminution de l'expression dudit marqueur. En particulier, l'expression des marqueurs de l'inflammation est connue pour être augmentée quand la peau est agressée, par exemple par un stress exogène. En revanche, l'expression de ces marqueurs de l'inflammation n'est pas affectée par des actifs ou des formulations bien tolérés. Dans un mode de réalisation préféré, le marqueur biologique de l’étape b) est un marqueur de l’inflammation, par exemple parmi ceux décrit ici. Method for in vitro evaluation of the tolerance of an active ingredient or of a cosmetic formulation, comprising the following steps: a) The application of the said active ingredient or of the said cosmetic formulation on the reconstituted skin model; b) At least one measurement of the level of expression of at least one biological marker in the skin model of step a); and c) Assessing whether said active ingredient or cosmetic formulation is well tolerated by the skin model. The active ingredient is an active ingredient which is well tolerated by the skin if said active ingredient does not significantly modulate the expression of the biological marker. Similarly, the cosmetic formulation is well tolerated if the expression of the biological marker is not significantly modulated by its addition to the reconstituted skin model. By "significant" is meant a result obtained by the implementation of a statistical test, such as a univariate Wilcoxon test, and having a p value less than 0.05, preferably a p value less than 0.01, more preferably a p-value of less than 0.001. Appropriate statistical tests are well known to those skilled in the art. Said modulation may correspond, depending on the case, and in particular depending on the nature of the biological marker, to an increase or a decrease in the expression of said marker. In particular, the expression of inflammatory markers is known to be increased when the skin is attacked, for example by exogenous stress. On the other hand, the expression of these markers of inflammation is not affected by well-tolerated active ingredients or formulations. In a preferred embodiment, the biological marker of step b) is an inflammation marker, for example among those described here.
De préférence, la tolérance consiste au maintien de l’équilibre de la composante microbienne. Par « maintien de l’équilibre » on entend qu’au moins un micro-organisme, de préférence au moins un genre ou espèce bactérienne, est maintenu dans la composante microbienne du modèle suite à application de l’agent ou formulation cosmétique à l’étape a). De préférence, l’abondance dudit au moins un micro-organisme n’est pas significativement modifié suite à l’application de l’agent ou formulation cosmétique à l’étape a). Afin de déterminer si ledit au moins un micro-organisme est maintenu, voir à un niveau qui n’est pas significativement diffèrent, la présence du micro-organisme, ou son niveau d’abondance, est comparé à une condition ou niveau de référence, par exemple dans un modèle dans lequel l’agent n’a pas été appliqué ou dans la peau normale in vivo. Preferably, the tolerance consists in maintaining the balance of the microbial component. By "maintaining the balance" is meant that at least one microorganism, preferably at least one bacterial genus or species, is maintained in the microbial component of the model following application of the cosmetic agent or formulation to the step a). Preferably, the abundance of said at least one microorganism is not significantly modified following the application of the cosmetic agent or formulation in step a). In order to determine whether said at least one microorganism is maintained, see at a level which is not significantly different, the presence of the microorganism, or its level of abundance, is compared to a condition or reference level, for example in a model in which the agent was not applied or in normal skin in vivo.
L’invention a pour autre objet un kit comprenant une composante microbienne et une composante lipidique destiné à être appliqué sur un substitut cutané, la composante microbienne comprenant au moins quatre genres de micro-organismes sélectionnés parmi les genres Cutibacterium, Staphylococcus, Streptococcus, Burkholderia, Finegoldia, Gemella, Veillonella, Kocuia, Corynebacterium, Methylobacterium, et Brevibacterium. Another subject of the invention is a kit comprising a microbial component and a lipid component intended to be applied to a skin substitute, the microbial component comprising at least four genera of microorganisms selected from the genera Cutibacterium, Staphylococcus, Streptococcus, Burkholderia, Finegoldia, Gemella, Veillonella, Kocuia, Corynebacterium, Methylobacterium, and Brevibacterium.
De préférence, la composante microbienne comprend au moins cinq, six, sept, huit, neuf, ou dix genres de micro-organismes sélectionnés parmi les genres Cutibacterium, Staphylococcus, Streptococcus, Burkholderia, Finegoldia, Gemella, Veillonella, Kocuia, Corynebacterium, Methylobacterium, et Brevibacterium, plus préférentiellement l’ensemble de genres décrits ci- dessus. De préférence, les au moins quatre genres comprend les genres suivants : Cutibacterium, Staphylococcus, Streptococcus, et Burkholderia. La composante microbienne peut également comprendre un ou plusieurs genres ou espèces de champignon et/ou de virus.Preferably, the microbial component comprises at least five, six, seven, eight, nine, or ten genera of microorganisms selected from the genera Cutibacterium, Staphylococcus, Streptococcus, Burkholderia, Finegoldia, Gemella, Veillonella, Kocuia, Corynebacterium, Methylobacterium, and Brevibacterium, more preferably the set of genera described above. Preferably, the at least four genera includes the following genera: Cutibacterium, Staphylococcus, Streptococcus, and Burkholderia. The microbial component may also include one or more genera or species of fungus and/or virus.
De préférence, la composante microbienne correspond au microbiote de la peau d’au moins un sujet. Par « microbiote » on entend l’ensemble de micro-organismes qui est présent dans un environnement. Le microbiote de la peau correspond donc à l’ensemble de micro-organismes présent sur la peau. Bien entendu, la composition du microbiote peut varier selon le site de la peau. De préférence, la composante microbienne cutanée correspond au microbiote de la peau de visage, de préférence du front, d’au moins un sujet. Aussi, selon un mode de réalisation préférentielle, la composante microbienne cutanée est issue d’un prélèvement d’au moins un sujet, plus préférentiellement au niveau du visage et encore plus préférentiellement au niveau du front. De préférence, la composante microbienne à une viabilité de 5 000 RLU. Preferably, the microbial component corresponds to the microbiota of the skin of at least one subject. By "microbiota" we mean the set of microorganisms present in an environment. The skin microbiota therefore corresponds to the set of microorganisms present on the skin. Of course, the composition of the microbiota can vary depending on the site of the skin. Preferably, the cutaneous microbial component corresponds to the microbiota of the skin of the face, preferably of the forehead, of at least one subject. Also, according to a preferential embodiment, the cutaneous microbial component comes from a sample taken from at least one subject, more preferentially at the level of the face and even more preferentially at the level of the forehead. Preferably, the microbial component has a viability of 5000 RLU.
La composante lipidique est telle que décrite ci-dessus. The lipid component is as described above.
De préférence, le kit comprend en outre une notice d’instructions. Preferably, the kit further comprises an instruction manual.
De préférence, le kit comprend en outre au moins une composante chimique telle que décrite ici. De préférence, le kit comprend un allergène, un agent polluant, un tensioactif, un solvant, ou au moins un réactif de stimulation pro-inflammatoire tel qu’une cytokine, ou le cortisol. Ledit kit permet avantageusement d’obtenir le modèle de peau reconstituée. EXEMPLES Preferably, the kit further comprises at least one chemical component as described herein. Preferably, the kit comprises an allergen, a polluting agent, a surfactant, a solvent, or at least one pro-inflammatory stimulation reagent such as a cytokine, or cortisol. Said kit advantageously makes it possible to obtain the reconstituted skin model. EXAMPLES
Exemple 1 : Préparation du sébum et du microbiote Example 1: Preparation of sebum and microbiota
Préparation du sébum : le sébum est prélevé sur le front de 10 volontaires sans pathologie cutanée apparente avec un kit de prélèvement standard. Chaque tube de prélèvement est ensuite lavé 3 fois avec de 1’ hexane pour extraire le sébum. Les extraits sont ensuite combinés puis le solvant est évaporé sous vide. La masse du sébum récolté est contrôlée (par ex. 1 100 mg pour une préparation) puis le sébum est repris dans 20 ml d’hexane. 100 fioles de sébum sont réalisées avec 9 mg de substance par fiole et conditionnés sous argon. Pour le dépôt du sébum sur l’épiderme reconstruit, les fioles sont ensuite reprises avec 250 pL d’éthanol absolu (Fischer Scientific, Illkirch, France) puis dilué au l/20eme dans du sérum physiologique. Le sébum a été caractérisé par GC/MS (Figure 1). Preparation of the sebum: the sebum is sampled from the forehead of 10 volunteers with no apparent skin pathology with a standard sampling kit. Each collection tube is then washed 3 times with hexane to extract the sebum. The extracts are then combined and then the solvent is evaporated under vacuum. The mass of sebum collected is checked (eg 1100 mg for a preparation) then the sebum is taken up in 20 ml of hexane. 100 vials of sebum are produced with 9 mg of substance per vial and packaged under argon. For the deposition of the sebum on the reconstructed epidermis, the vials are then taken up with 250 μl of absolute ethanol (Fischer Scientific, Illkirch, France) then diluted to 1/20 th in physiological saline. The sebum was characterized by GC/MS (Figure 1).
Préparation du microbiote : Le microbiote est prélevé sur 18 volontaires sans pathologie cutanée apparente à l’aide d’un écouvillon imbibé de sérum physiologique (Fischer Scientific, Illkirch, France) contenant 0,1 % en volume de Triton X-100 (Fischer Scientific, Illkirch, France). L’ écouvillon est frotté énergétiquement sur le front du donneur durant 4 secondes. Chaque écouvillon est ensuite placé dans un tube pour être centrifugé. Après centrifugation, un liquide incolore est récupéré (environ 60 pL) et son volume est ajusté jusqu’à 120 pL avec du sérum physiologique. Chaque microbiote est ensuite mélangé avec le sébum afin de pouvoir réaliser le dépôt. 22 pL du mélange sébum/microbiote est déposé à la surface d’un épiderme reconstruit humain et étalé à l’aide d’un doigtier. Un mélange sébum/microbiote donné peut être appliqué sur jusqu’à 6 épidermes reconstruits. Les épidermes reconstruits humains sont incubés à 32°C, 5 % CO2, 60 % humidité. Preparation of the microbiota: The microbiota is sampled from 18 volunteers with no apparent skin pathology using a swab soaked in physiological saline (Fischer Scientific, Illkirch, France) containing 0.1% by volume of Triton X-100 (Fischer Scientific , Illkirch, France). The swab is rubbed energetically on the forehead of the donor for 4 seconds. Each swab is then placed in a tube to be centrifuged. After centrifugation, a colorless liquid is recovered (approximately 60 pL) and its volume is adjusted up to 120 pL with saline. Each microbiota is then mixed with the sebum in order to be able to make the deposit. 22 pL of the sebum/microbiota mixture is deposited on the surface of a reconstructed human epidermis and spread using a finger cot. A given sebum/microbiota mixture can be applied to up to 6 reconstructed epidermis. The reconstructed human epidermis are incubated at 32° C., 5% CO2, 60% humidity.
Le temps d’incubation est fixé à 48 h ce qui permet d’avoir une quantité de bactéries suffisante sans endommager les épidermes reconstruits humains. The incubation time is set at 48 h which allows to have a sufficient quantity of bacteria without damaging the reconstructed human epidermis.
Sur le visage, on retrouve des quantités de sébum allant de >66pg/cm2 pour la peau grasse, 33-66pg/cm2, peau normale et <33pg/cm2 pour la peau sèche. On the face, we find quantities of sebum ranging from >66pg/cm 2 for oily skin, 33-66pg/cm 2 , normal skin and <33pg/cm 2 for dry skin.
Les inventeurs ont déposé sur les épidermes reconstruits de 0,6cm2, 24pg de sébum ce qui correspond à une concentration de 40pg/cm2. The inventors deposited on the reconstructed epidermis of 0.6 cm 2 , 24 pg of sebum which corresponds to a concentration of 40 pg/cm 2 .
Concernant le microbiote, selon la littérature, il y a environ 1 million de bactéries avec des centaines d’espèces différentes retrouvées par centimètre carré. Ces quantités variant en fonction de la zone étudiée. À la fin des 48h, on retrouve environ 100 000 RLU par RHE de 0,6cm2, ce qui correspond à une croissance de 1 à 2 log. Exemple 2 : Établissement du modèle de peau reconstituée avec ou sans ajout d’un stress Méthodes Regarding the microbiota, according to the literature, there are approximately 1 million bacteria with hundreds of different species found per square centimeter. These quantities vary depending on the area studied. At the end of 48 hours, there are approximately 100,000 RLU per RHE of 0.6 cm 2 , which corresponds to a growth of 1 to 2 log. Example 2: Establishment of the reconstructed skin model with or without the addition of a stress Methods
L’épiderme a été reconstruit à partir d’exérèses cutanées provenant de chirurgie esthétique selon la méthode décrite par Frankart et al. (Frankart et al., Exp. Dermatol. 2012, 21(11), 871-875).The epidermis was reconstructed from skin resections from plastic surgery according to the method described by Frankart et al. (Frankart et al., Exp. Dermatol. 2012, 21(11), 871-875).
Brièvement, les cellules (kératinocytes) ont été isolées des exérèses cutanées, puis mises en culture avant d’être ensemencées sur des inserts de cultures en immersion dans du milieu de culture puis les inserts de cultures sont mis à l’interface air/liquide dans un incubateur à 37°C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO2, pour former le stratum corneum. Briefly, the cells (keratinocytes) were isolated from skin resections, then cultured before being seeded on culture inserts immersed in culture medium then the culture inserts are placed at the air/liquid interface in an incubator at 37°C in a humidified atmosphere with 5% CO2, to form the stratum corneum.
A 14 jours (J14), un épiderme reconstruit d’une surface de 0,6cm2 est formé. Le milieu de culture est renouvelé toutes les 24 heures. At 14 days (D14), a reconstructed epidermis with an area of 0.6 cm 2 is formed. The culture medium is renewed every 24 hours.
À J 10 les épidermes reconstruits sont placés dans un milieu de culture sans antibiotique. À J13, les épidermes reconstruits sont placés dans des plaques 12 puits avec du milieu de maintenance sans antibiotiques (voir Frankart et al., 2012) et avec du Rouge de Phénol. Après 2h, un mélange sébum/microbiote, obtenu comme décrit à F Exemple 1, est déposé à la surface de chaque épiderme reconstruit humain et étalé à l’aide d’un doigtier. Les épidermes humains reconstruits sont ensemencés avec un inoculum de microbiote d’une viabilité d’environ 5000 RLU. On D 10, the reconstructed epidermis are placed in a culture medium without antibiotics. On D13, the reconstructed epidermis are placed in 12-well plates with maintenance medium without antibiotics (see Frankart et al., 2012) and with Phenol Red. After 2 hours, a sebum/microbiota mixture, obtained as described in Example 1, is deposited on the surface of each reconstructed human epidermis and spread using a finger cot. The reconstructed human epidermis are seeded with an inoculum of microbiota with a viability of approximately 5000 RLU.
La mise en survie des épidermes est réalisée en conditions stériles. Chaque insert contenant un épiderme est posé dans un puits d’une nouvelle plaque 12 puits contenant le nouveau milieu de maintenance seul ou supplémenté afin d’induire un stress. La plaque est incubée à 32°C sous 5% de CO2 et 60% d’humidité relative. Le milieu de culture est renouvelé toutes les 24 heures jusqu’à 48h d’incubation. The survival of the epidermis is carried out under sterile conditions. Each insert containing an epidermis is placed in a well of a new 12-well plate containing the new maintenance medium alone or supplemented in order to induce stress. The plate is incubated at 32°C under 5% CO2 and 60% relative humidity. The culture medium is renewed every 24 hours up to 48 hours of incubation.
Afin de mimer un stress inflammatoire de type dermatite atopique, le milieu utilisé est le milieu de maintenance (1 mL/puit) additionné d’interleukine 10 à 0,06ug/mL, du ligand TLR (Poly (1 :C) à lOpg/ml, et Pam3CSK4 à 5pg/ml). In order to mimic an inflammatory stress of the atopic dermatitis type, the medium used is maintenance medium (1 mL/well) supplemented with interleukin 10 at 0.06 ug/mL, TLR ligand (Poly (1:C) at lOpg/ ml, and Pam3CSK4 at 5pg/ml).
Mesure de la viabilité du microbiote Measurement of microbiota viability
A réception, la viabilité du microbiote est mesurée à l’aide du kit BacTiter ATP Lite, Promega suivant le protocole du fournisseur. La viabilité du microbiote après culture est évaluée à l’aide de ce même kit. La mesure de viabilité est un test bio luminescent mettant enjeu la luciférase. La quantité de lumière émise est proportionnelle à la quantité d’ ATP présente dans l’échantillon et donc au nombre de cellules vivantes. Afin de suivre la croissance bactérienne durant l’expérience, une lecture de viabilité est réalisée en duplicat sur le microbiote prélevé à partir de chaque épiderme (kit BacTiter-Glo Microbial Viability Cell Assay, Promega). Le mix ATP et le microbiote sont disposés dans chaque puit selon un ratio 1 :1. Après dépôt, la plaque (Low Binding Greiner 655209) est agitée pendant 30 secondes à 500 rpm puis incubée à température ambiante pendant 5 minutes. La lecture est ensuite réalisée via lecteur de plaques Clariostar. Upon receipt, the viability of the microbiota is measured using the BacTiter ATP Lite kit, Promega following the supplier's protocol. The viability of the microbiota after culture is evaluated using this same kit. The viability measurement is a bioluminescent test involving luciferase. The amount of light emitted is proportional to the amount of ATP present in the sample and therefore to the number of living cells. In order to monitor bacterial growth during During the experiment, a viability reading is carried out in duplicate on the microbiota sampled from each epidermis (BacTiter-Glo Microbial Viability Cell Assay kit, Promega). The ATP mix and the microbiota are placed in each well in a 1:1 ratio. After deposition, the plate (Low Binding Greiner 655209) is shaken for 30 seconds at 500 rpm then incubated at ambient temperature for 5 minutes. The reading is then carried out using a Clariostar plate reader.
Extraction d’ADN du microbiote Extraction of DNA from the microbiota
L’ADN des microorganismes avant et/ou après croissance sur épiderme reconstruit est extrait à l’aide d’un Qiacube en suivant le protocole QIAamp DNA Investigator Kit de Qiagen. The DNA of microorganisms before and/or after growth on reconstructed epidermis is extracted using a Qiacube following the QIAamp DNA Investigator Kit protocol from Qiagen.
Quantification absolue de microorganismes d’intérêt en ddPCR Absolute quantification of microorganisms of interest in ddPCR
La Droplet Digital PCR (ddPCR) est une technique de PCR digitale basée sur la génération de gouttelettes grâce à une émulsion eau/huile. A partir d’un échantillon, elle permet de générer plus de 20 000 gouttelettes au sein desquelles est réalisée l’amplification PCR. Après amplification, chaque gouttelette est analysée afin de quantifier le nombre de gouttelettes positives dans l’échantillon. Cette technique a notamment l’avantage de permettre l’amplification d’ADN présent en faible quantité dans un échantillon. Droplet Digital PCR (ddPCR) is a digital PCR technique based on the generation of droplets using a water/oil emulsion. From a sample, it makes it possible to generate more than 20,000 droplets within which the PCR amplification is carried out. After amplification, each droplet is analyzed to quantify the number of positive droplets in the sample. This technique has the particular advantage of allowing the amplification of DNA present in small quantities in a sample.
La ddPCR est réalisée en plaque 96 puits : 5 pL d’échantillon sont ajoutées à 15 pL de mix ddPCR comme explicité dans le protocole Biorad. Les sondes utilisées correspondent aux espèces recherchées, par ex. S. epidermidis, S. aureus, C. acnés. The ddPCR is performed in a 96-well plate: 5 pL of sample are added to 15 pL of ddPCR mix as explained in the Biorad protocol. The probes used correspond to the species sought, e.g. S. epidermidis, S. aureus, C. acnes.
La génération de droplets est réalisée grâce à l’appareil QX200 Droplets Generator de Biorad puis la plaque est placée dans le thermocycleur pour l’amplification. La plaque est ensuite lue via l’appareil QX200 Droplet Reader de Biorad et analysée grâce au logiciel QuantaSoft. Droplets are generated using Biorad's QX200 Droplets Generator device, then the plate is placed in the thermal cycler for amplification. The plate is then read using Biorad's QX200 Droplet Reader device and analyzed using QuantaSoft software.
Séquençage ciblé Targeted sequencing
L’impact de la « culture sur épiderme humain reconstruit » sur le microbiote est évalué par séquençage ciblé. The impact of “culture on reconstructed human epidermis” on the microbiota is assessed by targeted sequencing.
Le séquençage a été réalisé sur un séquenceur MiSeq (Illumina) avec les amorces adaptées à chacune des cibles. Le prétraitement des séquences est réalisé par un pipeline informatique développé par INRAE fonctionnant sous Mothur (version 1.44.0). The sequencing was carried out on a MiSeq sequencer (Illumina) with the primers adapted to each of the targets. The pre-processing of the sequences is carried out by a computer pipeline developed by INRAE running under Mothur (version 1.44.0).
Séquençage des bactéries 16S 16S Bacteria Sequencing
Les amorces utilisées ciblent les régions variables VI -V3 de la séquence de l’ARN ribosomique 16S des procaryotes (bactéries et archées). Le prétraitement des séquences est réalisé par un pipeline informatique développé par INRAE fonctionnant sous Mothur (version 1.44.0). Les barcodes et les amorces ainsi que les chimères ont été retirés des fichiers de séquences au cours des étapes de filtrage. Les séquences présentant 100% d’homologie entre elles, ont été regroupées en séquences uniques, puis en OTU (operational taxonomie unit : seuil de 97 %) qui seront identifiés par la suite. The primers used target the variable regions VI -V3 of the 16S ribosomal RNA sequence of prokaryotes (bacteria and archaea). The pre-processing of the sequences is carried out by a computer pipeline developed by INRAE running under Mothur (version 1.44.0). Barcodes and primers as well as chimeras were removed from sequence files during filtering steps. The sequences presenting 100% homology between them were grouped into unique sequences, then into OTU (operational taxonomy unit: threshold of 97%) which will be identified subsequently.
L’analyse bioinformatique des données de séquençage permet d’identifier les microorganismes présents à différents niveaux taxonomiques (phylum, genre (par ex. pour Staphylococcus), et espèce (par ex. pour C. acnés)). L’analyse permettant l’affiliation phylogénétique jusqu’au niveau genre a été réalisée à l’aide des outils bioinformatiques pour le traitement des grandes quantités de données de séquences (Mothur). L’identification a été réalisée sur la base de la taxonomie Greengenes pour les bactéries. The bioinformatics analysis of the sequencing data makes it possible to identify the microorganisms present at different taxonomic levels (phylum, genus (e.g. for Staphylococcus), and species (e.g. for C. acnes)). The analysis allowing the phylogenetic affiliation down to the genus level was carried out using bioinformatics tools for processing large amounts of sequence data (Mothur). Identification was performed based on the Greengenes taxonomy for bacteria.
Séquençage des espèces de Staphylococcus cible « Tuf » Sequencing of target Staphylococcus species “Tuff”
Les amorces utilisées ciblent le gène TUF. L’analyse bioinformatique des données de séquençage permet d’identifier les Staphylococcus présents à différents niveaux taxonomiques (genre et espèce sont ciblés). L’analyse permettant l’affiliation phylogénétique jusqu’au niveau espèce a été réalisée à l’aide des outils bioinformatiques pour le traitement des grandes quantités de données de séquences (Mothur). L’identification a été réalisée sur la liste de Staphylococcus. The primers used target the TUF gene. The bioinformatics analysis of the sequencing data makes it possible to identify the Staphylococcus present at different taxonomic levels (genus and species are targeted). The analysis allowing the phylogenetic affiliation down to the species level was carried out using bioinformatics tools for processing large amounts of sequence data (Mothur). The identification was carried out on the list of Staphylococcus.
Évaluation de l’impact du microbiote en culture sur les épidermes reconstruits sains et/ou stressés Evaluation of the impact of cultured microbiota on healthy and/or stressed reconstructed epidermis
L’expression des gènes codant pour des protéines de la fonction barrière (Claudine 1 , Filaggrine et TGM1) ou des peptides anti-microbiens humain (DEFB4A et S100A7) a été évaluée par RT- qPCR. The expression of genes coding for barrier function proteins (Claudin 1, Filaggrin and TGM1) or human antimicrobial peptides (DEFB4A and S100A7) was evaluated by RT-qPCR.
Extraction d’ADN DNA extraction
Les moitiés d’épidermes reconstruits sont conservés dans 300 pL d’une solution de RLT (Qiagen) à 1% de P-mercaptoéthanol et congelés à -80°C en attendant l’extraction. Dans un premier temps, les RHEs sont séparés de leur membrane à l’aide d’une pince. Afin de lyser mécaniquement les cellules, une bille Stainless Steel Beads 5 mm (Qiagen) est ensuite ajoutée dans chaque tube puis ces derniers sont passés au Tissue Lyser (Qiagen) pendant 2 minutes (2x) à 20 Hz. Dans un deuxième temps, l’ARN est extrait selon le protocole d’extraction RNA Fibrous Tissue Mini Kit de Qiagen. Les extractions sont réalisées via Qiacube (Qiagen). La quantité d’ARN extraite est dosée au Nanodrop. RT-qPCR The reconstructed epidermis halves are stored in 300 μl of a 1% β-mercaptoethanol RLT (Qiagen) solution and frozen at −80° C. while awaiting extraction. First, the RHEs are separated from their membrane using forceps. In order to mechanically lyse the cells, a 5 mm Stainless Steel Beads ball (Qiagen) is then added to each tube and then the latter are passed to the Tissue Lyser (Qiagen) for 2 minutes (2x) at 20 Hz. Secondly, the The RNA is extracted using Qiagen's RNA Fibrous Tissue Mini Kit extraction protocol. The extractions are carried out via Qiacube (Qiagen). The quantity of RNA extracted is measured with the Nanodrop. RT-qPCR
Le volume d’ARN est ensuite ajusté de façon à rétro-transcrire 1 pg d’ARN par échantillon. The volume of RNA is then adjusted so as to reverse-transcribe 1 pg of RNA per sample.
4 pL de mix SuperScript VILO MasterMix sont ensuite ajoutés aux échantillons. 4 pL of SuperScript VILO MasterMix is then added to the samples.
Les cDNA obtenus sont ensuite dilués au vingtième et disposés en plaque 384 puits (triplicats) à l’aide du robot EpMotion de Qiagen. 5,5 pL de mix de réaction (5 pL de TaqMan Fast Advanced Master Mix + 0,5 pL de sondes par réaction) sont ensuite ajoutés dans chaque puit. GAPDH, YWHAZ et UBC sont les gènes de référence choisis pour l’analyse de la qPCR. The cDNAs obtained are then diluted to one-twentieth and placed in a 384-well plate (triplicates) using Qiagen's EpMotion robot. 5.5 pL of reaction mix (5 pL of TaqMan Fast Advanced Master Mix + 0.5 pL of probes per reaction) are then added to each well. GAPDH, YWHAZ and UBC are the reference genes chosen for qPCR analysis.
Dosage d’IL-8 et TSLP par ELISA IL-8 and TSLP assay by ELISA
L’IL-8 est dosé dans les surnageants de culture (24H, 48H et 72H) grâce au kit Bioplex ELISA IL-8 de R&D Bio-Techne. Les surnageants sont dosés en triplicats. La lecture de plaques (Costar 3590 Corning) est réalisée sur le lecteur de plaques Clariostar. De la même façon, le TSLP est dosé dans les surnageants grâce au kit Bioplex TSLP de R&D Bio-Techne. IL-8 is assayed in the culture supernatants (24H, 48H and 72H) using the Bioplex ELISA IL-8 kit from R&D Bio-Techne. The supernatants are assayed in triplicates. Plate reading (Costar 3590 Corning) is performed on the Clariostar plate reader. In the same way, the TSLP is assayed in the supernatants using the Bioplex TSLP kit from R&D Bio-Techne.
Résultats Results
Croissance du microbiote dans le modèle de peau reconstituée Growth of microbiota in the reconstructed skin model
Le suivi de la viabilité durant le temps de mise en œuvre de ce modèle rend compte de la croissance du microbiote sur les épidermes. The monitoring of viability during the time of implementation of this model accounts for the growth of the microbiota on the epidermis.
Les résultats de croissance du microbiote sur les épidermes sains ou inflammatoires sont présentés dans le Tableau 2 ci-dessous. The microbiota growth results on healthy or inflammatory epidermis are presented in Table 2 below.
Croissance du microbiote sur épidermes évalué par la différence entre la viabilité à 48h - viabilité à T0. NS : non-significatif ; S : significatif Growth of microbiota on epidermis evaluated by the difference between viability at 48h - viability at T0. NS: not significant; S: significant
[Table 2]
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[Table 2]
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La croissance des microbiotes sur les épidermes complets est de 1 à 2 log en 48h. On observe une croissance significativement plus importante sur les épidermes inflammatoires que sur les épidermes sains. Sans être liée par la théorie, on peut penser que la barrière est altérée dans l’épiderme inflammé, ce qui permet aux micro-organismes d’accéder à des nutriments supplémentaires et donc de croître davantage. The growth of microbiota on complete epidermis is 1 to 2 log in 48 hours. Significantly greater growth is observed on inflammatory epidermis than on healthy epidermis. Without being bound by theory, one can think that the barrier is altered in the inflamed epidermis, which allows microorganisms to access additional nutrients and therefore to grow more.
Analyse du composant microbiote La composition bactérienne du microbiote a été évaluée à J13 (avant inoculation sur le modèle). Analysis of the microbiota component The bacterial composition of the microbiota was evaluated on D13 (before inoculation on the model).
À J13, les genres bactériens identifiés dans le microbiote sont les suivants : On D13, the bacterial genera identified in the microbiota are as follows:
Cutibacterium (plus particulièrement C. acnés), Staphylococcus, Streptococcus, Burkholderia, Finegoldia, Gemella, Veillonella, Kocuia, Corynebacterium, Methylobacterium et Brevibacterium. Cutibacterium (especially C. acnes), Staphylococcus, Streptococcus, Burkholderia, Finegoldia, Gemella, Veillonella, Kocuia, Corynebacterium, Methylobacterium and Brevibacterium.
Les espèces de Staphylococcus ont été déterminé de façon plus précise. Les espèces de Staphylococcus identifiées dans le microbiote sont les suivantes : S. epidermidis, S. capitis, S. warneri, S. hominis et S. aureus. Staphylococcus species have been determined more precisely. Staphylococcus species identified in the microbiota are: S. epidermidis, S. capitis, S. warneri, S. hominis and S. aureus.
Parmi les genres bactériens identifiés dans le microbiote à 48h, Cutibacterium et Staphylococcus ont notamment été détectés. Les espèces de Staphylococcus ont été déterminé de façon plus précise. Les espèces de Staphylococcus identifiées dans le microbiote à 48h sont les mêmes que celles initialement présentes (S. epidermidis, S. capitis, S. aureus, S. warneri, S. hominis). Among the bacterial genera identified in the microbiota at 48 hours, Cutibacterium and Staphylococcus were detected in particular. Staphylococcus species have been determined more precisely. The species of Staphylococcus identified in the microbiota at 48 hours are the same as those initially present (S. epidermidis, S. capitis, S. aureus, S. warneri, S. hominis).
Évaluation de l’impact du microbiote/sébum sur les épidermes sains Evaluation of the impact of microbiota/sebum on healthy epidermis
Effet du microbiote/sébum sur la sécrétion de cytokines inflammatoires par l’épiderme sain 1/ Sécrétion d’IL-8 Effect of microbiota/sebum on the secretion of inflammatory cytokines by healthy epidermis 1/ Secretion of IL-8
Les effets du microbiote/sébum sur la sécrétion d’IL-8 sont résumés dans le Tableau 3. The effects of microbiota/sebum on IL-8 secretion are summarized in Table 3.
Cinétique de production d’IL-8 en fonction du temps de croissance du microbiote/sébum sur épidermes. Kinetics of IL-8 production as a function of microbiota/sebum growth time on epidermis.
[Table 3]
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[Table 3]
Figure imgf000037_0001
La présence de microbiote/sébum sur les épidermes sains, entraine une production d’IL-8, il existe donc une réaction de l’épiderme à la présence de microorganismes. The presence of microbiota/sebum on healthy epidermis leads to the production of IL-8, so there is a reaction of the epidermis to the presence of microorganisms.
2/ Sécrétion de TSLP TSLP est une cytokine inflammatoire caractéristique de la dermatite atopique. Sa sécrétion est nettement stimulée dans le cas de la dermatite atopique et promeut l’initiation d’une réponse inflammatoire par les Th2. Elle est mesurée dans le surnageant après 24h de culture. 2/ Secretion of TSLP TSLP is an inflammatory cytokine characteristic of atopic dermatitis. Its secretion is clearly stimulated in the case of atopic dermatitis and promotes the initiation of an inflammatory response by Th2. It is measured in the supernatant after 24 hours of culture.
Les épidermes sains produisent peu de TSLP. Healthy epidermis produces little TSLP.
Les effets du microbiote/sébum sur la sécrétion de TSLP sont résumés dans le Tableau 4.The effects of microbiota/sebum on TSLP secretion are summarized in Table 4.
Production de TSLP par les épidermes sains avec et sans microbiote/sébum Production of TSLP by healthy epidermis with and without microbiota/sebum
[Table 4]
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[Table 4]
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La production de TSLP n’est pas modifiée par la présence de microbiote sur épidermes sains. The production of TSLP is not modified by the presence of microbiota on healthy epidermis.
3/ Effets sur l’expression des peptides antimicrobiens 3/ Effects on the expression of antimicrobial peptides
Le gène DEEB4A code pour la P-defensine 2, un peptide antimicrobien cutané sécrété par les kératinocytes. La production de peptides anti-microbien est stimulée par la présence des microorganismes. S100A7 code pour la protéine connue sous le nom de psoriasine aux propriétés antimicrobiennes. The DEEB4A gene encodes P-defensin 2, a skin antimicrobial peptide secreted by keratinocytes. The production of anti-microbial peptides is stimulated by the presence of microorganisms. S100A7 codes for the protein known as psoriasin with antimicrobial properties.
Les effets du microbiote/sébum sur l’expression de deux peptides antimicrobiens sont présentés dans le tableau 5. The effects of microbiota/sebum on the expression of two antimicrobial peptides are shown in Table 5.
Expression de DEEB4A et S100A7 par les épidermes sains avec et sans microbioteExpression of DEEB4A and S100A7 by healthy epidermis with and without microbiota
[Table 5]
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[Table 5]
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RQ : « Relative quantification », RQ > 2 : surexpression, 0,5 < RQ : sous-expression La présence de microbiote/sébum sur les épidermes sains entraine une légère augmentation de l’expression des peptides antimicrobien DEFB4A et S100A7 par l’épiderme. La présence de microbiote/sébum sur les épidermes sains stimule une réponse immunitaire « innée ». RQ: “Relative quantification”, RQ > 2: overexpression, 0.5 < RQ: underexpression The presence of microbiota/sebum on healthy epidermis leads to a slight increase in the expression of the antimicrobial peptides DEFB4A and S100A7 by the epidermis. The presence of microbiota/sebum on healthy epidermis stimulates an “innate” immune response.
4/Effets sur l’expression des gènes de la fonction barrière 4/Effects on the expression of barrier function genes
Afin de savoir si le microbiote/sébum a un effet sur la fonction barrière des épidermes sains, les inventeurs ont quantifié par RT-qPCR l’expression du gène codant pour la Claudine- 1, une protéine impliquée dans les jonctions serrées et l’expression du gène codant pour la Filaggrine. Le gène TGM1 code pour la transglutaminase- 1, enzyme impliquée dans la formation du stratum corneum et la fonction barrière. In order to find out whether the microbiota/sebum has an effect on the barrier function of healthy epidermis, the inventors quantified by RT-qPCR the expression of the gene coding for Claudin-1, a protein involved in tight junctions and the expression of the gene encoding Filaggrin. The TGM1 gene codes for transglutaminase-1, an enzyme involved in stratum corneum formation and barrier function.
Les effets du microbiote/sébum sur l’expression de TGM1 est présenté dans le tableau 6.The effects of microbiota/sebum on TGM1 expression is shown in Table 6.
Expression de TGM1 par les épidermes sains avec et sans microbiote [Table 6]
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Expression of TGM1 by healthy epidermis with and without microbiota [Table 6]
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RQ > 2 : surexpression, 0,5 < RQ : sous-expression RQ > 2: overexpression, 0.5 < RQ: underexpression
La présence de microbiote/sébum sur les épidermes sains n’entraine pas de modification significative de l’expression des gènes codants pour les protéines impliquées dans la fonction barrière, Filaggrine et Claudine 1 (résultats non montrés). L’expression du gène codant pour l’enzyme TGM1 est augmentée. The presence of microbiota/sebum on healthy epidermis does not cause any significant modification in the expression of the genes coding for the proteins involved in the barrier function, Filaggrin and Claudine 1 (results not shown). The expression of the gene coding for the TGM1 enzyme is increased.
Évaluation de l’impact du microbiote sur les épidermes inflammatoires 1/ Sécrétion d’IL-8 Evaluation of the impact of the microbiota on inflammatory epidermis 1/ Secretion of IL-8
Les effets du microbiote sur la sécrétion d’IL-8 sont résumés dans le Tableau 7. The effects of microbiota on IL-8 secretion are summarized in Table 7.
Exemple illustratif de la production d’IL-8 à 24h et 48H sur des épidermes inflammatoires [Table 7]
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Illustrative example of the production of IL-8 at 24h and 48H on inflammatory epidermis [Table 7]
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La production d’IL-8 est multiplié de 1.7 à 2.2 fois. La présence de microbiote/sébum sur les épidermes inflammatoires entraine une augmentation significative de la production d’IL-8 ce qui rend compte d’une amplification de la réaction inflammatoire de l’épiderme en présence de microbiote. The production of IL-8 is multiplied by 1.7 to 2.2 times. The presence of microbiota/sebum on inflammatory epidermis leads to a significant increase in the production of IL-8, which reflects an amplification of the inflammatory reaction of the epidermis in the presence of microbiota.
Des résultats similaires sont décrits dans la littérature chez des patients atteints de dermatite atopique (Casas et al., 2008, Skin Pharmacology and Physiology 21, 260-268). Par ailleurs, la production d’IL-8 est augmenté de 2 à 10-fois dans le modèle en condition inflammatoire par rapport au modèle « sain » (sans ajout de stress inflammatoire). Ces résultats sont également similaires à ceux décrits dans Casas et al., 2008, où la production d’IL-8 a été augmenté d’un facteur de 4,3 (2087/487, voir le Tableau 3). Similar results are described in the literature in patients with atopic dermatitis (Casas et al., 2008, Skin Pharmacology and Physiology 21, 260-268). Moreover, the production of IL-8 is increased by 2 to 10-fold in the model in inflammatory condition compared to the “healthy” model (without addition of inflammatory stress). These results are also similar to those described in Casas et al., 2008, where IL-8 production was increased by a factor of 4.3 (2087/487, see Table 3).
Ces résultats illustrent que le modèle selon l’invention, comprenant un microbiote et du sébum, est représentatif de ce qui se passe in vivo, notamment dans des conditions inflammatoires. These results illustrate that the model according to the invention, comprising a microbiota and sebum, is representative of what happens in vivo, in particular under inflammatory conditions.
2/ Sécrétion de TSLP 2/ Secretion of TSLP
Les effets du microbiote/sébum sur la sécrétion de TSLP sont résumés dans le Tableau 8.The effects of microbiota/sebum on TSLP secretion are summarized in Table 8.
Production de TSLP par les épidermes inflammatoires avec et sans microbiote [Table 8]
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Production of TSLP by inflammatory epidermis with and without microbiota [Table 8]
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La production de TSLP par les épidermes inflammatoires nous permet de valider ce modèle.The production of TSLP by inflammatory epidermis allows us to validate this model.
En effet, comme attendu, TSLP est produit dans des conditions inflammatoires par rapport au modèle « sain » (sans ajout de stress inflammatoire), mais la présence du microbiote/sébum ne modifie pas de façon significative la production de TSLP. Indeed, as expected, TSLP is produced under inflammatory conditions compared to the "healthy" model (without addition of inflammatory stress), but the presence of the microbiota/sebum does not significantly modify the production of TSLP.
3/ Effets sur l’expression des peptides antimicrobiens 3/ Effects on the expression of antimicrobial peptides
Les effets du microbiote sur l’expression de deux peptides antimicrobiens sont présentés dans le tableau 9. The effects of microbiota on the expression of two antimicrobial peptides are presented in table 9.
Expression de DEFB4A et S100A7 par les épidermes inflammatoires avec et sans microbiote/ sébum. Expression of DEFB4A and S100A7 by inflammatory epidermis with and without microbiota/sebum.
[Table 9]
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Expression relative au témoin épidermes sains sans microbiote. RQ > 2 : surexpression, 0,5 < RQ : sous-expression [Table 9]
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Expression relative to the control healthy epidermis without microbiota. RQ > 2: overexpression, 0.5 < RQ: underexpression
La présence de microbiote/sébum sur les épidermes inflammatoires entraine une augmentation significative de l’expression des peptides antimicrobien DEFB4A et S100A7 par l’épiderme. Comme attendu, on observe une sensibilité de l’épiderme inflammatoire exacerbée en présence de microbiote/sébum. The presence of microbiota/sebum on inflammatory epidermis leads to a significant increase in the expression of the antimicrobial peptides DEFB4A and S100A7 by the epidermis. As expected, an exacerbated sensitivity of the inflammatory epidermis is observed in the presence of microbiota/sebum.
4/Effets sur l’expression des gènes de la fonction barrière 4/Effects on the expression of barrier function genes
Les effets du microbiote/sébum sur l’expression de TGM1 sont présentés dans le tableau 10. Expression de TGM1 par les épidermes inflammatoires avec et sans microbiote/sébum. The effects of microbiota/sebum on the expression of TGM1 are shown in Table 10. Expression of TGM1 by inflammatory epidermis with and without microbiota/sebum.
[Table 10]
Figure imgf000041_0002
[Table 10]
Figure imgf000041_0002
Calcul des RQ par rapport à l’expression du gène des épidermes sains sans microbiote. RQ > 2 : surexpression, 0,5 < RQ : sous-expression La présence de microbiote sur les épidermes inflammatoires entraine une augmentation significative de l’expression de TGM1 par l’épiderme, ce qui confirme une sensibilité de l’épiderme inflammatoire exacerbée en présence de microbiote. Calculation of the RQs in relation to the expression of the gene of healthy epidermis without microbiota. RQ > 2: overexpression, 0.5 < RQ: underexpression The presence of microbiota on inflammatory epidermis leads to a significant increase in the expression of TGM1 by the epidermis, which confirms an exacerbated sensitivity of the inflammatory epidermis in the presence of microbiota.
Au vu des résultats ci-dessus, les inventeurs mettent clairement en évidence l’intérêt du modèle de peau reconstitué comprenant un substitut cutané ainsi qu’une composante microbienne et un composant lipidique. En effet, dans des conditions non-pathologique, la présence d’une composante microbienne et d’un composant lipidique induit la production de certains marqueurs inflammatoires comme, par exemple, l’IL-8, et une augmentation légère de l’expression de peptides antimicrobiens stimulant donc une immunité innée. Cela suggère que le microbiote induit un niveau basal d’inflammation dans ces conditions. En outre dans des conditions de stress chimique, inflammatoire, le microbiote induit une réponse inflammatoire exacerbée, ce qui conduit à une fonction barrière altérée. Ainsi, en présence de stress chimique inflammatoire, le modèle reproduit avantageusement une inflammation de type dermatite atopique. In view of the above results, the inventors clearly demonstrate the advantage of the reconstituted skin model comprising a skin substitute as well as a microbial component and a lipid component. Indeed, under non-pathological conditions, the presence of a microbial component and a lipid component induces the production of certain inflammatory markers such as, for example, IL-8, and a slight increase in the expression of antimicrobial peptides thus stimulating innate immunity. This suggests that the microbiota induces a basal level of inflammation under these conditions. Furthermore, under conditions of chemical, inflammatory stress, the microbiota induces an exacerbated inflammatory response, which leads to an impaired barrier function. Thus, in the presence of inflammatory chemical stress, the model advantageously reproduces an inflammation of the atopic dermatitis type.
Ce modèle est donc tout à fait adapté pour évaluer de nouveaux actifs qui seraient potentiellement utiles dans la prévention ou le traitement de la dermatite atopique. This model is therefore quite suitable for evaluating new active ingredients that would be potentially useful in the prevention or treatment of atopic dermatitis.
Ce modèle est également adapté pour évaluer de nouveaux actifs qui seraient potentiellement utiles dans la prévention ou le traitement des dermatoses inflammatoires, comme par exemple le psoriasis, l’acné, la dermite séborrhéique, l’urticaire chronique, l’eczéma, la rosacée. This model is also suitable for evaluating new active ingredients that would be potentially useful in the prevention or treatment of inflammatory dermatoses, such as psoriasis, acne, seborrheic dermatitis, chronic urticaria, eczema, rosacea.
Enfin, ce modèle intégré est particulièrement intéressant pour tester de nouveaux actifs ayant une activité putative dans la protection, voire le renforcement de la fonction barrière. Finally, this integrated model is particularly interesting for testing new active ingredients with a putative activity in the protection, or even the reinforcement of the barrier function.
Exemple 3 : Évaluation de l’effet d’un stress imitant l’exposition solaire sur le modèle de peau reconstruite ainsi que l’effet d’un filtre solaire Example 3: Evaluation of the effect of a stress imitating sun exposure on the reconstructed skin model as well as the effect of a sunscreen
Un stress physique est appliqué au modèle de peau reconstruit comprenant du microbiote et du sébum. Précisément, le modèle est exposé à des rayonnements UV mimant ainsi une exposition solaire. Un filtre solaire, la 5,6,5’,6’-tétraphényl-3,3’-(l,4-phénylène)-bis[l,2,4]triazine mise en formulation (Formulation A, décrit dans le Tableau 10 ci-dessous) est appliquée 1 heure avant les rayonnements pour étudier la protection de ce dernier sur ce modèle intégré. Physical stress is applied to the reconstructed skin model comprising microbiota and sebum. Specifically, the model is exposed to UV radiation thus mimicking sun exposure. A sunscreen, 5,6,5',6'-tetraphenyl-3,3'-(l,4-phenylene)-bis[l,2,4]triazine formulated (Formulation A, described in Table 10 below) is applied 1 hour before the radiation to study the protection of the latter on this integrated model.
Tableau 11 : Formulation A Table 11: Formulation A
Formulation A Form A
[Table 11]
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[Table 11]
Figure imgf000043_0001
Méthodes Methods
Le modèle décrit à l’exemple 2 a été utilisé. The model described in Example 2 was used.
Dix-huit épidermes reconstruits (correspondant à 3 donneurs avec six épidermes reconstruits obtenus par donneur) avec du microbiote provenant de 18 donneurs distincts et du sébum sont utilisés par condition (non traité/ non irradié, non traité/ irradié, Formulation A/ irradié, Formulation A/ non irradié). La réalisation d’un stress exogène est effectuée 24h après l’ajout du microbiote/sébum, soit à J14. Eighteen reconstructed epidermis (corresponding to 3 donors with six reconstructed epidermis obtained per donor) with microbiota from 18 different donors and sebum are used per condition (untreated/non-irradiated, untreated/irradiated, Formulation A/irradiated, Formulation A/ non-irradiated). Exogenous stress is carried out 24 hours after the addition of the microbiota/sebum, i.e. on D14.
Les épidermes reconstruits sont irradiés par des rayonnements solaires simulés en utilisant une chambre Suntest CPS+ ATLAS, Material Testing Technology BV, Moussy le Neuf, France) équipée d'une lampe à xénon NXE 1500, et munie d'un filtre UV pour éliminer les longueurs d'onde inférieures à 290 nm. L’irradiance dans les spectres UV est d'environ 70 W/m2 de 290 à 400 nm. Les modèles de peau sont exposés à une dose unique aiguë d'UV de 16,5 J/cm2 (environ 45 min) et la chambre d’irradiation est maintenue à 37 °C à l’aide d’eau glacée et d’un flux d’air. The reconstructed epidermis are irradiated by simulated solar radiation using a Suntest CPS+ ATLAS chamber, Material Testing Technology BV, Moussy le Neuf, France) equipped with an NXE 1500 xenon lamp, and fitted with a UV filter to eliminate lengths waves below 290 nm. The irradiance in the UV spectra is about 70 W/m2 from 290 to 400 nm. The skin models are exposed to a single acute UV dose of 16.5 J/cm2 (approximately 45 min) and the irradiation chamber is maintained at 37°C using ice water and a air flow.
La Formulation A est appliquée à la dose de 2 mg/cm2 sur la surface du modèle de peau reconstituée 2h avant exposition aux rayonnements. Après irradiation avec le spectre solaire total (jusqu’à 790nm), le modèle est maintenu en culture 24 heures à 32 °C et 60 % d’humidité. À la fin de l'expérience, la surface des épidermes reconstruits est lavée deux fois avec lOOpl de sérum physiologique, et ensuite séchée avec un coton-tige. Cette étape a pour but de récupérer le microbiote cutané ainsi que les lipides (ici le sébum) pour analyse séparément des cellules de peau. Formulation A is applied at a dose of 2 mg/cm 2 on the surface of the skin model reconstituted 2 hours before exposure to radiation. After irradiation with the total solar spectrum (up to 790 nm), the model is maintained in culture for 24 hours at 32° C. and 60% humidity. At the end of the experiment, the surface of the reconstructed epidermis is washed twice with 100 μl of physiological serum, and then dried with a cotton swab. The purpose of this step is to recover the cutaneous microbiota as well as the lipids (here the sebum) for analysis separately from the skin cells.
Approche métabolomique Metabolomic approach
À la fin de l’étude, les épidermes reconstruits sont séparés de l’insert et sont pesés afin de standardiser les résultats obtenus avec l’approche métabolomique. Les épidermes reconstruits sont broyés et 108 échantillons sont extraits. Brièvement, les échantillons sont broyés dans 2 x ImL d'acétonitrile/eau 1/9 (v:v) avec un fastprep utilisant des tubes Lysing Matrix M, 6 cycles de 20 secondes à force 4, avec 2min sur glace entre chaque cycle. Un volume de 800pL de chaque échantillon a été évaporé à sec avec un SpeedVac, puis normalisé dans 220pL de D2O. Les échantillons ont été analysés en RMN puis spectrométrie de masse. At the end of the study, the reconstructed epidermis are separated from the insert and are weighed in order to standardize the results obtained with the metabolomic approach. The reconstructed epidermis are crushed and 108 samples are extracted. Briefly, the samples are ground in 2×ImL of acetonitrile/water 1/9 (v:v) with a fastprep using Lysing Matrix M tubes, 6 cycles of 20 seconds at force 4, with 2 min on ice between each cycle. An 800pL volume of each sample was evaporated to dryness with a SpeedVac, then normalized in 220pL D2O. The samples were analyzed by NMR and then mass spectrometry.
Les spectres RMN 1H sont obtenus à 300 K sur un spectromètre RMN Bruker Avance III HD 600 MHz (Bruker Biospin, Rheinstetten, Allemagne), fonctionnant à 600,13 MHz pour la fréquence de résonance 1H, en utilisant une cryosonde 1H-13C-15N-31P de 5 mm à détection inverse attachée à une Cryoplatforme (l'unité de préamp lifïcation). Les spectres de RMN 1H sont acquis en utilisant l'expérience NOESY 1D avec pré-saturation pour la suppression de l'eau (noesyprld), avec un temps de mélange de 100 ms. 1H NMR spectra are obtained at 300 K on a Bruker Avance III HD 600 MHz NMR spectrometer (Bruker Biospin, Rheinstetten, Germany), operating at 600.13 MHz for the 1H resonance frequency, using a 1H-13C-15N cryoprobe -31P 5 mm reverse sensing attached to a Cryoplatform (the preamp unit). 1H NMR spectra are acquired using the NOESY 1D experiment with pre-saturation for water removal (noesyprld), with a mixing time of 100 ms.
Après les analyses par RMN, les échantillons sont transférés des tubes RMN aux flacons UHPLC. Les échantillons sont centrifugés à 9000 g pendant 5 min. Un volume de 10 pL est ensuite injecté dans le système UHPLC ACQUITY de Waters (Manchester, UK), en utilisant de l'eau/méthanol/acide acétique 95/5/0,1 (v:v:v) comme phase mobile A et du méthanol/acide acétique 100/0,1 (v:v) comme phase mobile B, à un débit de 0,3 mL/min. Le gradient suivant est utilisé : 0-30 min : 0% à 100% de B, 30-34 min : 100% de B. La séparation est réalisée à 30°C avec une colonne Hypersil Gold C18 (100 x 2,1 mm, 1,9 pm) de Thermo Scientific (Les Ulis, France). Les paramètres d'électrospray suivants sont appliqués : tension capillaire de 0,5 kV, tension du cône d'échantillonnage de 30 V, température de la source de 120°C, température de désolvatation de 350°C, débit du gaz du cône de 50 L/h et débit du gaz de désolvatation de 600 L/h en mode positif ; tension capillaire de 0,5 kV, tension du cône d'échantillonnage de 30 V, température de la source de 120°C, température de désolvatation de 550°C, débit du gaz du cône de 30 L/h et débit du gaz de désolvatation de 600 L/h en mode négatif. Les spectres de masse à haute résolution sont acquis avec un spectromètre de masse Synapt G2-Si de Waters (Manchester, UK), entre m/z 50 et 800 dans les modes sensibilité et centroïde. Les échantillons sont analysés de manière aléatoire, et un échantillon QC correspondant à un pool de tous les échantillons, est analysé 11 fois le long de la séquence.After the NMR analyses, the samples are transferred from the NMR tubes to the UHPLC vials. The samples are centrifuged at 9000 g for 5 min. A volume of 10 pL is then injected into the UHPLC ACQUITY system from Waters (Manchester, UK), using water/methanol/acetic acid 95/5/0.1 (v:v:v) as mobile phase A and 100/0.1 (v:v) methanol/acetic acid as mobile phase B, at a flow rate of 0.3 mL/min. The following gradient is used: 0-30 min: 0% to 100% B, 30-34 min: 100% B. The separation is carried out at 30°C with a Hypersil Gold C18 column (100 x 2.1 mm , 1.9 µm) from Thermo Scientific (Les Ulis, France). The following electrospray parameters are applied: capillary voltage of 0.5 kV, sample cone voltage of 30 V, source temperature of 120°C, desolvation temperature of 350°C, cone gas flow of 50 L/h and 600 L/h desolvation gas flow in positive mode; capillary voltage of 0.5 kV, sample cone voltage of 30 V, source temperature of 120°C, desolvation temperature of 550°C, cone gas flow of 30 L/h and gas flow of desolvation of 600 L/h in mode negative. High-resolution mass spectra are acquired with a Synapt G2-Si mass spectrometer from Waters (Manchester, UK), between m/z 50 and 800 in sensitivity and centroid modes. The samples are analyzed randomly, and a QC sample corresponding to a pool of all samples, is analyzed 11 times along the sequence.
Les identifications structurelles des métabolites discriminants sont réalisées sur un spectromètre de masse LTQ Orbitrap XL (Thermo Scientific, Les Ulis, France) couplé à un système de chromatographie liquide U3000 (Thermo Scientific, Les Ulis, France Structural identifications of discriminating metabolites are carried out on an LTQ Orbitrap XL mass spectrometer (Thermo Scientific, Les Ulis, France) coupled to a U3000 liquid chromatography system (Thermo Scientific, Les Ulis, France
Analyse des données Data analysis
L'analyse statistique et la cartographie du réseau sont réalisées par la plateforme MetaboHUB- MetaToul-AXIOM. Statistical analysis and network mapping are performed by the MetaboHUB-MetaToul-AXIOM platform.
Les données sont normalisées pour permettre la quantification des signaux détectés dans plusieurs échantillons. The data is normalized to allow quantification of signals detected in multiple samples.
L’analyse des composantes principales est d’abord appliquée pour vérifier la validité de l’acquisition, pour détecter les valeurs aberrantes potentielles et les clusters internes. Principal component analysis is first applied to check the validity of the acquisition, to detect potential outliers and internal clusters.
Dans un contexte biologique, des facteurs de confusion sont généralement rencontrés : ces facteurs ajoutent du bruit dans les données correspondant à une variabilité non désirée. Plusieurs sources de bruit sont possibles : expérimentales, instrumentales... Lorsque la variabilité due à ces facteurs est supérieure à la variabilité due au facteur d’intérêt, aucune discrimination entre les groupes de traitement ne peut être trouvée. L'analyse discriminante par la méthode des moindres carrés partiels orthogonaux (O-PLS-DA) vise à éliminer cette variation indésirable Un test de permutation est effectué pour évaluer la robustesse des modèles PLS-DA. La valeur de la variable Importance on Projection (VIP) (seuil=l) a été utilisée pour trouver des caractéristiques discriminantes. In a biological context, confounding factors are generally encountered: these factors add noise to the data corresponding to unwanted variability. Several sources of noise are possible: experimental, instrumental... When the variability due to these factors is greater than the variability due to the factor of interest, no discrimination between the treatment groups can be found. The discriminant analysis by the method of orthogonal partial least squares (O-PLS-DA) aims to eliminate this undesirable variation. A permutation test is carried out to evaluate the robustness of the PLS-DA models. The value of the Importance on Projection (VIP) variable (threshold=1) was used to find discriminating characteristics.
Pour chaque caractéristique discriminante, un test de Wilcoxon univarié et une correction du taux de fausse découverte (FDR) sont effectués pour prendre en compte les tests multiples (seuil de la valeur de p corrigée par le FDR = 0,05). For each discriminant characteristic, a univariate Wilcoxon test and a correction for the false discovery rate (FDR) are carried out to take into account the multiple tests (threshold of the p-value corrected by the FDR = 0.05).
Les analyses multivariées sont effectuées à l’aide du logiciel SIM CA vl5 (Umetrics, Umeâ, Suède). Le paquet mixOmics (Rohart et al., 2017) est utilisé pour effectuer des analyses multiniveaux. Multivariate analyzes are performed using SIM CA vl5 software (Umetrics, Umeâ, Sweden). The mixOmics package (Rohart et al., 2017) is used to perform multilevel analyses.
Pour créer le réseau métabolique, un logiciel librement accessible est développé et utilisé par l'INRAE, Toxalim : MetExplore. Il s’agit un serveur web qui offre la possibilité de relier les métabolites identifiés dans des expériences métabolomiques non ciblées dans le contexte de réseaux métaboliques reconstruits à l’échelle du génome. Le pipeline d’analyse comprend le mappage des données métabolomiques sur le réseau métabolique spécifique d'un organisme, puis l'application de méthodes basées sur les graphes et d'outils de visualisation avancés pour améliorer l’analyse des données. To create the metabolic network, freely accessible software is developed and used by INRAE, Toxalim: MetExplore. It is a web server that provides the ability to link metabolites identified in untargeted metabolomic experiments in the context of reconstructed genome-wide metabolic networks. The analytics pipeline includes the mapping metabolomic data to an organism's specific metabolic network, then applying graph-based methods and advanced visualization tools to enhance data analysis.
Résultats : Results :
Analyse pharmacologique des voies et des métabolites Pharmacological analysis of pathways and metabolites
1/ stress oxydatif : approche métabolomique 1/ oxidative stress: metabolomic approach
Le tableau qui suit rapporte les variations observées (Log 2 de variations) sous l’effet de l’irradiation UV pour différents métabolites discriminants du stress oxydatif dans l’épiderme du modèle de peau reconstituée. The following table reports the variations observed (Log 2 of variations) under the effect of UV irradiation for different discriminating metabolites of oxidative stress in the epidermis of the reconstructed skin model.
[Table 12]
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[Table 12]
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MI : Non irradié ; IR : Irradié ; CTRL : Contrôle ; FA : Formulation A ; ns : non significatif MI: Non-irradiated; IR: Irradiated; CTRL: Control; FA: Formulation A; ns: not significant
Une modulation importante de ces métabolites est observée après exposition au rayonnement, avec une forte augmentation de la xanthine et de l’acide urique et une diminution significative de glutathion. Ces résultats sont en accord avec les études in vivo sur des volontaires humains (Randhawa et al, PLoS One. 2014 ; 9(3): e90367). Ces résultats montrent la validation du modèle selon l’invention afin d'étudier l'exposition au soleil et de prédire l'effet in vivo sur la peau humaine. A significant modulation of these metabolites is observed after exposure to radiation, with a strong increase in xanthine and uric acid and a significant decrease in glutathione. These results are in agreement with in vivo studies on human volunteers (Randhawa et al, PLoS One. 2014; 9(3): e90367). These results show the validation of the model according to the invention in order to study exposure to the sun and to predict the in vivo effect on human skin.
Par ailleurs, ces résultats montrent un effet protecteur significatif d’une formulation comprenant de la phénylène bis-diphényltriazine (Formulation A) sur le stress oxydatif dû à l’exposition au soleil. Aussi, le modèle permet également d’identifier ou d’évaluer l’efficacité in vitro d’un actif pour prévenir et/ou traiter au moins un trouble cutané induit suite à au moins un stress exogène tel que l’irradiation UV. Furthermore, these results show a significant protective effect of a formulation comprising phenylene bis-diphenyltriazine (Formulation A) on oxidative stress due to sun exposure. Also, the model also makes it possible to identify or evaluate the in vitro efficacy of an active ingredient in preventing and/or treating at least one skin disorder induced following at least one exogenous stress such as UV irradiation.
2/ Fonction barrière et hydratation : approche métabolomique 2/ Barrier function and hydration: metabolomic approach
Le tableau qui suit rapporte les variations observées (Log 2 de variations) sous l’effet de l’irradiation UV pour différents métabolites discriminants de la fonction barrière et de l’hydratation de la peau, dans l’épiderme du modèle. The following table reports the variations observed (Log 2 of variations) under the effect of UV irradiation for different discriminating metabolites of the barrier function and hydration of the skin, in the epidermis of the model.
[Table 13]
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[Table 13]
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''il : Non irradié ; IR : Irradié ; CTRL : Contrôle ; FA : Formulation A ; Ns : non significatif ''he: Not irradiated; IR: Irradiated; CTRL: Control; FA: Formulation A; Ns: not significant
Ces résultats démontrent que l’application topique d’une formulation comprenant de la phénylène bis-diphényltriazine (Formulation A) permet d’amortir très significativement les déséquilibres induits par le rayonnement UV, et ainsi de préserver la fonction barrière et l’hydratation de la peau. These results demonstrate that the topical application of a formulation comprising phenylene bis-diphenyltriazine (Formulation A) makes it possible to very significantly dampen the imbalances induced by UV radiation, and thus to preserve the barrier function and the hydration of the skin.
3/ Microbiote : approche métabolomique 3/ Microbiota: metabolomic approach
Le tableau qui suit rapporte les variations observées (Log 2 de variations) sous l’effet de l’irradiation UV pour différents métabolites détectés en surface du modèle en lien avec le microbiote du modèle. [Table 14]
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The following table reports the variations observed (Log 2 of variations) under the effect of UV irradiation for various metabolites detected on the surface of the model in connection with the microbiota of the model. [Table 14]
Figure imgf000047_0002
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MI : Non irradié ; IR : Irradié ; CTRL : Contrôle ; FA : Formulation A ; ns : non significatif MI: Non-irradiated; IR: Irradiated; CTRL: Control; FA: Formulation A; ns: not significant
L’irradiation UV induit des modifications importantes dans un grand nombre de métabolites. Ces résultats démontrent également que l’application topique d’une formulation comprenant de la phénylène bis-diphényltriazine (Formulation A) permet de réduire très significativement les déséquilibres induits par le rayonnement UV, et ainsi de maintenir l’équilibre de la composante microbienne cutanée. La phénylène bis-diphényltriazine présente donc une véritable action symbiotique. UV irradiation induces significant changes in a large number of metabolites. These results also demonstrate that the topical application of a formulation comprising phenylene bis-diphenyltriazine (Formulation A) makes it possible to very significantly reduce the imbalances induced by UV radiation, and thus to maintain the balance of the cutaneous microbial component. Phenylene bis-diphenyltriazine therefore exhibits a true symbiotic action.
4/ C. acnés 4/ C. acnes
C. acnés est une espèce bactérienne très abondante dans le microbiote du modèle. C. acnes is a very abundant bacterial species in the model's microbiota.
Les inventeurs ont mis en évidence une abondance significativement augmentée sous l’effet de l’irradiation (voir le Tableau 15). The inventors have demonstrated a significantly increased abundance under the effect of irradiation (see Table 15).
[Table 15]
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[Table 15]
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MI : Non irradié ; IR : Irradié ; CTRL : Contrôle ; FA : Formulation A ; ns : non significatif MI: Non-irradiated; IR: Irradiated; CTRL: Control; FA: Formulation A; ns: not significant
Ces résultats démontrent que l’application topique d’une formulation comprenant de la phénylène bis-diphényltriazine (Formulation A) permet de réduire très significativement les déséquilibres induits par le rayonnement UV, et ainsi de protéger le microbiote et de maintenir l’équilibre de la composante microbienne cutanée. These results demonstrate that the topical application of a formulation comprising phenylene bis-diphenyltriazine (Formulation A) makes it possible to very significantly reduce the imbalances induced by UV radiation, and thus to protect the microbiota and maintain the balance of the skin microbial component.
Grâce à ce modèle d’épiderme humain reconstruit avec microbiote et sébum, les inventeurs ont identifié une signature métabolomique très précise de la peau exposée à un rayonnement UV, mimant une exposition solaire. Thanks to this model of human epidermis reconstructed with microbiota and sebum, the inventors have identified a very precise metabolomic signature of the skin exposed to UV radiation, mimicking sun exposure.
Ce modèle intégré est particulièrement intéressant car il permet de se rapprocher des conditions observées in vivo. This integrated model is particularly interesting because it makes it possible to approach the conditions observed in vivo.
En outre, les inventeurs ont montré non seulement que les effets de différents stress peuvent être observés au niveau métabolomique mais également que la Formulation A permet de protéger l'écosystème cutané de l'exposition au soleil et de préserver la symbiose et l'homéostasie de la peau. In addition, the inventors have shown not only that the effects of various stresses can be observed at the metabolomic level but also that Formulation A makes it possible to protect the cutaneous ecosystem from exposure to the sun and to preserve the symbiosis and homeostasis of the skin.
Ces résultats confirment la validité du modèle de peau reconstituée. Ces résultats confirment également la validité du modèle de peau reconstituée pour une utilisation dans des méthodes de criblage ou d’évaluation de l’efficacité d’actifs cosmétiques pour prévenir ou traiter des troubles de la peau, ainsi quand dans des méthodes d’évaluation de la tolérance d’un actif ou d’une formulation cosmétique. De façon très avantageuse, l’effet d’un stress exogène ou d’un actif a pu être déterminé sur la base non seulement d’un seul marqueur mais de plusieurs marqueurs, permettant d’établir une signature métabolomique, et démontrant la pertinence physiopathologique du modèle de peau reconstituée. These results confirm the validity of the reconstructed skin model. These results also confirm the validity of the reconstituted skin model for use in methods for screening or evaluating the effectiveness of cosmetic active ingredients for preventing or treating skin disorders, as well as when in methods for evaluating the the tolerance of an active ingredient or a cosmetic formulation. Very advantageously, the effect of an exogenous stress or of an active ingredient could be determined on the basis not only of a single marker but of several markers, making it possible to establish a metabolomic signature, and demonstrating the physiopathological relevance of the reconstructed skin model.

Claims

REVENDICATIONS Modèle de peau reconstituée comprenant : CLAIMS Reconstituted skin model comprising:
- un substitut cutané, et - a skin substitute, and
- une composante microbienne et une composante lipidique sur la surface dudit substitut cutané - a microbial component and a lipid component on the surface of said skin substitute
Ladite composante microbienne comprenant au moins quatre genres de microorganismes sélectionnés parmi les genres Cutibacterium, Staphylococcus, Streptococcus, Burkholderia, Finegoldia, Gemella, Veillonella, Kocuia, Corynebacterium, Methylobacterium, et Brevibacterium, préférentiellement au moins les genres Cutibacterium, Staphylococcus, Streptococcus, et Burkholderia.. Modèle selon la revendication 1, caractérisé en ce que la composante lipidique comprend un mélange d’acides gras libres, de triglycérides, de squalène, de cire et/ou esters de cire, et de cholestérol et/ou esters de cholestérol. Modèle selon la revendication 2, caractérisé en ce que la composante lipidique comprend 30 à 50 % p/p de triglycérides, de 15 à 30 % p/p d’acides gras libres, de 25 à 30 % p/p de cires et/ou esters de cire, de 12 à 20 % p/p de squalène et de 4,5 à 8,5 % p/p de cholestérol et/ou esters de cholestérol. Modèle selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la composante lipidique est issu d’un prélèvement d’au moins un sujet, préférentiellement au niveau du visage. Modèle selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la composante microbienne est une composante microbienne cutanée issu d’un prélèvement d’au moins un sujet, préférentiellement au niveau du visage et encore plus préférentiellement au niveau du front. Procédé d’obtention d’un modèle de peau reconstituée selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, comprenant a) Fourniture d’un substitut cutané, b) Application sur ledit substitut cutané, de façon concomitante ou séquentielle, d’une composante microbienne et d’une composante lipidique. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que la peau reconstituée est stressée et en ce que le procédé comprend en outre une étape c) Réalisation d’au moins un stress exogène. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que le stress exogène est un stress chimique ou physique. Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que le stress physique est une irradiation dans le domaine UV dont UVA et/ou UVB ; et/ou lumière visible dont lumière bleue haute énergie visible et/ou infrarouge. Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que le stress chimique est un réactif de stimulation pro-inflammatoire ou du cortisol. Méthode de criblage pour l’identification in vitro d’un actif ou d’une formulation cosmétique pour prévenir et/ou améliorer au moins un trouble cutané induit suite à au moins un stress exogène comprenant les étapes suivantes : a) L’application dudit actif ou de ladite formulation cosmétique sur le modèle de peau reconstituée selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 ; b) La réalisation d’au moins un stress exogène sur ledit modèle ; c) Au moins une mesure du niveau d’expression d’au moins un marqueur biologique ; et d) Déterminer si ledit actif ou de ladite formulation cosmétique permet de prévenir et/ou améliorer au moins un trouble cutané en fonction d’au moins un niveau d’expression mesuré à l’étape c). Méthode d’évaluation de l’efficacité in vitro d’un actif ou d’une formulation cosmétique pour prévenir et/ou traiter au moins un trouble cutané induit suite à au moins un stress exogène comprenant les étapes suivantes : a) L’application dudit actif ou de ladite formulation cosmétique sur le modèle de peau reconstituée selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 ; b) La réalisation d’au moins un stress exogène sur ledit modèle ; c) Au moins une mesure du niveau d’expression d’au moins un marqueur biologique ; et d) Évaluer l’efficacité dudit actif ou de ladite formulation cosmétique en fonction d’au moins un niveau d’expression mesuré à l’étape c). Méthode selon la revendication 11 ou 12, selon laquelle le au moins un trouble cutané est choisi parmi les troubles liés au vieillissement, à la pollution, au rayonnement ; les dermatoses inflammatoires, préférentiellement la dermatite atopique, l’acné, le psoriasis ; la rosacée ; le prurit ; une altération de la fonction barrière ; les peaux réactives ; les xéroses. Méthode selon la revendication 12 d’évaluation de l’efficacité in vitro d’au moins un filtre solaire ou d’une formulation cosmétique pour prévenir et/ou traiter au moins un trouble cutané induit suite à au moins un stress exogène consistant en une irradiation UV, infrarouge, ou lumière bleue. Méthode d'évaluation in vitro de la tolérance d’un actif ou d’une formulation cosmétique, comprenant les étapes suivantes : a) L’application dudit actif ou de ladite formulation cosmétique sur le modèle de peau reconstituée selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 ; b) Au moins une mesure du niveau d’expression d’au moins un marqueur biologique dans le modèle de peau de l’étape a) ; et c) Évaluer si ledit actif ou formulation cosmétique est bien toléré par le modèle de peau. Méthode selon la revendication 15, caractérisée en ce que la tolérance consiste au maintien de l’équilibre de la composante microbienne. Kit comprenant une composante microbienne et une composante lipidique destiné à être appliqué sur un substitut cutané, la composante microbienne comprenant au moins quatre genres de micro-organismes sélectionnés parmi les genres Cutibacterium, Staphylococcus, Streptococcus, Burkholderia, Finegoldia, Gemella, Veillonella, Kocuia, Corynebacterium, Methylobacterium, et Brevibacterium. Said microbial component comprising at least four genera of microorganisms selected from the genera Cutibacterium, Staphylococcus, Streptococcus, Burkholderia, Finegoldia, Gemella, Veillonella, Kocuia, Corynebacterium, Methylobacterium, and Brevibacterium, preferably at least the genera Cutibacterium, Staphylococcus, Streptococcus, and Burkholderia .. Model according to claim 1, characterized in that the lipid component comprises a mixture of free fatty acids, triglycerides, squalene, wax and/or wax esters, and cholesterol and/or cholesterol esters. Model according to Claim 2, characterized in that the lipid component comprises 30 to 50 % w/w of triglycerides, from 15 to 30 % w/w of free fatty acids, from 25 to 30 % w/w of waxes and/or or wax esters, 12 to 20% w/w squalene and 4.5 to 8.5% w/w cholesterol and/or cholesterol esters. Model according to any one of Claims 1 to 3, characterized in that the lipid component comes from a sample taken from at least one subject, preferably from the face. Model according to any one of Claims 1 to 4, characterized in that the microbial component is a cutaneous microbial component derived from a sample taken from at least one subject, preferentially from the face and even more preferentially from the forehead. Method for obtaining a reconstituted skin model according to any one of claims 1 to 5, comprising a) providing a skin substitute, b) applying to said skin substitute, concomitantly or sequentially, a component microbial and a lipid component. Method according to Claim 6, characterized in that the reconstituted skin is stressed and in that the method also comprises a step c) Realization of at least one exogenous stress. Process according to Claim 7, characterized in that the exogenous stress is a chemical or physical stress. Process according to Claim 8, characterized in that the physical stress is irradiation in the UV range, including UVA and/or UVB; and/or visible light including visible and/or infrared high energy blue light. Process according to Claim 8, characterized in that the chemical stress is a pro-inflammatory stimulation reagent or cortisol. Screening method for the in vitro identification of an active ingredient or a cosmetic formulation for preventing and/or improving at least one skin disorder induced following at least one exogenous stress comprising the following steps: a) Application of said active ingredient or of said cosmetic formulation on the reconstituted skin model according to any one of claims 1 to 5; b) The realization of at least one exogenous stress on said model; c) At least one measurement of the level of expression of at least one biological marker; and d) Determining whether said active ingredient or said cosmetic formulation makes it possible to prevent and/or improve at least one skin disorder as a function of at least one level of expression measured in step c). Method for evaluating the in vitro efficacy of an active ingredient or of a cosmetic formulation for preventing and/or treating at least one skin disorder induced following at least one exogenous stress comprising the following steps: a) The application of said active agent or of the said cosmetic formulation on the reconstituted skin model according to any one of claims 1 to 5; b) The realization of at least one exogenous stress on said model; c) At least one measurement of the level of expression of at least one biological marker; and d) Evaluating the efficacy of said active ingredient or of said cosmetic formulation as a function of at least one level of expression measured in step c). Method according to claim 11 or 12, according to which the at least one skin disorder is chosen from disorders linked to ageing, pollution, radiation; inflammatory dermatoses, preferably atopic dermatitis, acne, psoriasis; rosacea; pruritus; impaired barrier function; reactive skin; xeroses. Method according to claim 12 for evaluating the in vitro efficacy of at least one sunscreen or of a cosmetic formulation for preventing and/or treating at least one skin disorder induced following at least one exogenous stress consisting of irradiation UV, infrared, or blue light. Method for in vitro evaluation of the tolerance of an active ingredient or of a cosmetic formulation, comprising the following steps: a) The application of the said active ingredient or of the said cosmetic formulation on the reconstituted skin model according to any one of the claims 1 to 5; b) At least one measurement of the level of expression of at least one biological marker in the skin model of step a); and c) Assessing whether said active ingredient or cosmetic formulation is well tolerated by the skin model. Method according to Claim 15, characterized in that the tolerance consists in maintaining the balance of the microbial component. Kit comprising a microbial component and a lipid component intended to be applied to a skin substitute, the microbial component comprising at least four genera of microorganisms selected from the genera Cutibacterium, Staphylococcus, Streptococcus, Burkholderia, Finegoldia, Gemella, Veillonella, Kocuia, Corynebacterium, Methylobacterium, and Brevibacterium.
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Citations (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0029678A1 (en) 1979-11-09 1981-06-03 Air Products And Chemicals, Inc. Recovery of C2 hydrocarbons from demethanizer overhead
EP0285471A1 (en) 1987-03-26 1988-10-05 CENTRE INTERNATIONAL DE RECHERCHES DERMATOLOGIQUES GALDERMA - CIRD GALDERMA Groupement d'Intérêt Economique dit: Method for obtaining a skin equivalent and so obtained skin equivalent
US4849077A (en) 1984-08-06 1989-07-18 Akademie Der Wissenschaften Der Ddr Process for solid phase-sequencing of nucleic acid fragments
EP0789074A1 (en) 1996-01-23 1997-08-13 L'oreal Skin equivalent containing Langerhans cells
WO2002070729A2 (en) 2001-03-02 2002-09-12 Stratatech Corporation Improved skin substitutes and uses thereof
WO2003066896A2 (en) 2002-02-09 2003-08-14 Nanotype Gmbh Method for the detection of mutations
US6723513B2 (en) 1998-12-23 2004-04-20 Lingvitae As Sequencing method using magnifying tags
WO2006063864A2 (en) 2004-12-15 2006-06-22 Universite D'angers Compositions for preventing, reducing or treating keratinocyte-mediated inflammation
WO2006084132A2 (en) 2005-02-01 2006-08-10 Agencourt Bioscience Corp. Reagents, methods, and libraries for bead-based squencing
US20060275782A1 (en) 1999-04-20 2006-12-07 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
WO2007064305A1 (en) 2005-12-01 2007-06-07 Agency For Science, Technology And Research Three-dimensional reconstituted extracellular matrices as scaffolds for tissue engineering
US20070148771A1 (en) 2003-01-30 2007-06-28 L'oreal Reconstructed epidermis/skin equivalent comprising a ceramide 7 and/or 5.5 and lipid lamellar vesicular compositions comprising ceramide 7 and/or 5.5 compounds
WO2007111924A2 (en) 2006-03-23 2007-10-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Motion resolved molecular sequencing
EP1451302B1 (en) 2001-08-03 2008-05-28 Idi Farmaceutici S.P.A. In vitro reconstituted sheets of human corneal epithelium and method of producing the same
EP1974718A1 (en) 2007-02-26 2008-10-01 L'Oreal Cosmetic or dermatological composition comprising a cell culture medium
US20100099576A1 (en) 2001-03-02 2010-04-22 Allen Comer Skin substitutes with improved barrier function
WO2015014949A2 (en) 2013-07-31 2015-02-05 Pierre Fabre Dermo-Cosmetique Stimulation reagent, cutaneous substitute, cutaneous explant and method for reproducing the physiopathology of atopic dermatitis
EP1878790B1 (en) 2006-07-13 2017-08-23 L'Oréal Epidermis equivalent, fähig sich zu pigmentieren, erhältlich aus matrixzellen, verfahren zur herstellung und verwendung

Patent Citations (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0029678A1 (en) 1979-11-09 1981-06-03 Air Products And Chemicals, Inc. Recovery of C2 hydrocarbons from demethanizer overhead
US4849077A (en) 1984-08-06 1989-07-18 Akademie Der Wissenschaften Der Ddr Process for solid phase-sequencing of nucleic acid fragments
US4882127A (en) 1984-08-06 1989-11-21 Akademie Der Wissenschaften Der Ddr Device for solid phase sequencing of nucleic acid fragments
EP0285471A1 (en) 1987-03-26 1988-10-05 CENTRE INTERNATIONAL DE RECHERCHES DERMATOLOGIQUES GALDERMA - CIRD GALDERMA Groupement d'Intérêt Economique dit: Method for obtaining a skin equivalent and so obtained skin equivalent
EP0789074A1 (en) 1996-01-23 1997-08-13 L'oreal Skin equivalent containing Langerhans cells
US6723513B2 (en) 1998-12-23 2004-04-20 Lingvitae As Sequencing method using magnifying tags
EP1141399B1 (en) 1998-12-23 2005-08-17 Preben Lexow Sequencing method using magnifying tags
US20060275782A1 (en) 1999-04-20 2006-12-07 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
US20090186349A1 (en) 1999-04-20 2009-07-23 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
WO2002070729A2 (en) 2001-03-02 2002-09-12 Stratatech Corporation Improved skin substitutes and uses thereof
US20100099576A1 (en) 2001-03-02 2010-04-22 Allen Comer Skin substitutes with improved barrier function
EP1451302B1 (en) 2001-08-03 2008-05-28 Idi Farmaceutici S.P.A. In vitro reconstituted sheets of human corneal epithelium and method of producing the same
WO2003066896A2 (en) 2002-02-09 2003-08-14 Nanotype Gmbh Method for the detection of mutations
US20070148771A1 (en) 2003-01-30 2007-06-28 L'oreal Reconstructed epidermis/skin equivalent comprising a ceramide 7 and/or 5.5 and lipid lamellar vesicular compositions comprising ceramide 7 and/or 5.5 compounds
WO2006063864A2 (en) 2004-12-15 2006-06-22 Universite D'angers Compositions for preventing, reducing or treating keratinocyte-mediated inflammation
WO2006063865A2 (en) 2004-12-15 2006-06-22 Universite D'angers Compositions for enhancing keratinocyte migration and epidermal repair via a receptor containing osmrbeta as a subunit, and applications thereof
US20090181860A1 (en) 2005-02-01 2009-07-16 Applied Biosystems Inc. Reagents, methods, and libraries for bead-based sequencing
WO2006084132A2 (en) 2005-02-01 2006-08-10 Agencourt Bioscience Corp. Reagents, methods, and libraries for bead-based squencing
US20090181385A1 (en) 2005-02-01 2009-07-16 Applied Biosystems Inc. Reagents, methods, and libraries for bead-based sequencing
WO2007064305A1 (en) 2005-12-01 2007-06-07 Agency For Science, Technology And Research Three-dimensional reconstituted extracellular matrices as scaffolds for tissue engineering
US20080020392A1 (en) 2006-03-23 2008-01-24 Block Steven M Motion resolved molecular sequencing
US7556922B2 (en) 2006-03-23 2009-07-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Motion resolved molecular sequencing
WO2007111924A2 (en) 2006-03-23 2007-10-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Motion resolved molecular sequencing
EP1878790B1 (en) 2006-07-13 2017-08-23 L'Oréal Epidermis equivalent, fähig sich zu pigmentieren, erhältlich aus matrixzellen, verfahren zur herstellung und verwendung
EP1974718A1 (en) 2007-02-26 2008-10-01 L'Oreal Cosmetic or dermatological composition comprising a cell culture medium
WO2015014949A2 (en) 2013-07-31 2015-02-05 Pierre Fabre Dermo-Cosmetique Stimulation reagent, cutaneous substitute, cutaneous explant and method for reproducing the physiopathology of atopic dermatitis

Non-Patent Citations (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"NCBI", Database accession no. NM_000584
ACTA DERM VENEREOL, vol. 96, no. 7, 2016, pages 873 - 879
AURÉLIE FRANKART ET AL: "Epidermal morphogenesis during progressive in vitro 3D reconstruction at the air-liquid interface", EXPERIMENTAL DERMATOLOGY, BLACKWELL MUNSGAARD, COPENHAGEN; DK, vol. 21, no. 11, 15 October 2012 (2012-10-15), pages 871 - 875, XP071776696, ISSN: 0906-6705, DOI: 10.1111/EXD.12020 *
AUXENFANS ET AL., EUR J DERMATOL, vol. 19, no. 2, 2009, pages 107 - 113
AUXENFANS ET AL., J TISSUE ENG REGEN MED, vol. 6, no. 7, 2012, pages 512 - 518
BECHTOILLE ET AL., TISSUE ENG, vol. 13, no. 11, 2007, pages 2667 - 2679
BLACK ET AL., TISSUE ENG, vol. 11, no. 5-6, 2005, pages 723 - 733
BOJAR RICHARD A.: "Studying the Human Skin Microbiome Using 3D In Vitro Skin Models", APPLIED IN VITRO TOXICOLOGY, vol. 1, no. 2, 1 June 2015 (2015-06-01), US, pages 165 - 171, XP093011915, ISSN: 2332-1512, DOI: 10.1089/aivt.2015.0002 *
BOUWSTRA ET AL., JINVEST DERMATOL., vol. 97, no. 6, 1991, pages 1005 - 1012
CASAS ET AL., SKIN PHARMACOLOGY AND PHYSIOLOGY, vol. 21, 2008, pages 260 - 268
CASPERS ET AL., JINVEST DERMATOL., vol. 116, no. 3, 2001, pages 434 - 442
CASTRO-PEREZ ET AL., J PROTEOME RES., vol. 10, no. 9, 2011, pages 4281 - 4290
COSTIN ET AL., ALTERN LAB ANIM, vol. 39, no. 4, 2011, pages 317 - 337
DAEHNHARDT-PFEIFFER ET AL., SKIN PHARMACOL PHYSIOL., vol. 25, no. 3, 2012, pages 155 - 161
DONGARI-BATGTZOGLOUKASHLEVA, NAT PROTOC, vol. 1, no. 4, 2006, pages 2012 - 2018
DOWNING ET AL., J INVEST DERMATOL., vol. 77, no. 4, 1981, pages 358 - 360
EISENBERG, TRENDS IN GENET, vol. 19, 2003, pages 362 - 365
FALCONE ET AL., SKIN PHARMACOLPHYSIOL, vol. 28, 2015, pages 307 - 317
FRANKART ET AL., EXP. DERMATOL., vol. 21, no. 11, 2012, pages 871 - 875
FRANZISKA RADEMACHER ET AL: "Skin microbiota and human 3D skin models", EXPERIMENTAL DERMATOLOGY, BLACKWELL MUNSGAARD, COPENHAGEN; DK, vol. 27, no. 5, 10 April 2018 (2018-04-10), pages 489 - 494, XP071778830, ISSN: 0906-6705, DOI: 10.1111/EXD.13517 *
FULLER ET AL., NATURE BIOTECHNOL., vol. 27, no. 11, 2009, pages 1013 - 1023
GORCEA ET AL., INT J PHARM, 10 November 2011 (2011-11-10)
GUENOU ET AL., LANCET, vol. 374, no. 9703, 2009, pages 1745 - 1753
HENRIKSEN ET AL., JAM SOC MASS SPECTROM, vol. 16, no. 4, 2005, pages 446 - 455
IORDANOV ET AL., J. BIOL. CHEM., 1998
IWAI ET AL., J INVEST DERMATOL., 26 April 2012 (2012-04-26)
KINICOGLU ET AL., BIOMATERIALS, vol. 30, no. 32, 2009, pages 6418 - 6425
KINICOGLU ET AL., BIOMATERIALS, vol. 32, no. 25, 2011, pages 5756 - 5764
KRAEHENBUEHL ET AL., NATUREMETHODS, vol. 8, 2011, pages 731 - 736
LARSON PETER J. ET AL: "Challenges in Developing a Human Model System for Skin Microbiome Research", JOURNAL OF INVESTIGATIVE DERMATOLOGY, vol. 141, no. 1, 1 January 2021 (2021-01-01), NL, pages 228 - 231.e4, XP093011913, ISSN: 0022-202X, DOI: 10.1016/j.jid.2020.05.096 *
LEQUEUX ET AL., SKIN PHARMACOL PHYSIOL, vol. 25, no. 1, 2012, pages 47 - 55
LIMATHUNZIGER, CELLS TISSUES ORGANS, vol. 172, 2002, pages 79 - 85
MARDIS, GENOME MED., vol. 1, no. 4, 2009, pages 40
METZKER, NATURE REV. GENET., vol. 11, no. 1, 2010, pages 31 - 46
MOSMAN ET AL., J IMMUNOL METHODS, vol. 65, no. 1-2, 1983, pages 55 - 63
NISSAN ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI., vol. 108, no. 36, 2011, pages 14861 - 14866
NORDBÂCK ET AL., J. HIGH RESOLUT. CHROMATOGR., vol. 22, 1999, pages 483 - 486
NORDSTROM ET AL., J INVEST DERMATOL., vol. 87, no. 2, 1986, pages 260 - 263
O'NEILL ET AL., J CHROMATOGR SCI., vol. 14, no. 1, 1976, pages 28 - 36
PETRITIS ET AL., JOURNAL OFCHROMATOGRAPHY A, vol. 833, no. 2, 1999, pages 147 - 155
PIHLAK ET AL., NAT BIOTECHNOL., vol. 26, no. 10, 2008, pages 1135 - 684
PIRAUD ET AL., RAPID COMMUN MASS SPECTROM, vol. 19, no. 12, 2005, pages 1587 - 602
PONEC ET AL., INT J PHARM., vol. 203, no. 1-2, 2000, pages 211 - 225
PONEC ET AL., JINVESTDERMATOL., vol. 109, no. 3, 1997, pages 348 - 355
POUMAY ET AL., ARCH DERMATOL RES, vol. 296, no. 5, 2004, pages 203 - 11
RADEMACHER ET AL., EXPERIMENTAL DERMATOLOGY, vol. 27, 2018, pages 489 - 494
RAINVILLE ET AL., J PROTEOME RES., vol. 6, no. 2, 2007, pages 552 - 558
RANDHAWA ET AL., PLOS ONE, vol. 9, no. 3, 2014, pages e90367
ROBOSKY ET AL., JLIPID RES., vol. 49, no. 3, 2008, pages 686 - 692
ROSDY ET AL., IN VITRO TOXICOL., vol. 10, no. 1, 1997, pages 39 - 47
SANFORDGALLO, SEMINARS IN IMMUNOLOGY, vol. 25, 2013, pages 370 - 7
SCHMALZ ET AL., EUR J ORAL SCI., vol. 108, no. 5, 2000, pages 442 - 448
SIMARD MÉLISSA ET AL: "Modulation of the Lipid Profile of Reconstructed Skin Substitutes after Essential Fatty Acid Supplementation Affects Testosterone Permeability", CELLS, vol. 8, no. 10, 25 September 2019 (2019-09-25), pages 1142, XP093011897, DOI: 10.3390/cells8101142 *
SULLIVAN ET AL., ARCH OPHTHALMOL., vol. 120, no. 12, 2002, pages 1689 - 99
TERRES ET AL., J. CHROMATOGR. A., vol. 1078, 2005, pages 28 - 34
VAN SMEDEN ET AL., J LIPID RES, vol. 52, no. 6, 2011, pages 1211 - 1221
VAN SMEDEN ET AL., J LIPID RES., vol. 52, no. 6, 1991, pages 1211 - 1221
VRANA ET AL., INVEST OPHTHALMOL VIS SCI, vol. 49, no. 12, 2008, pages 5325 - 5331
VYUMVUHORE ET AL., JBIOMED OPT., vol. 19, no. 11, 2014, pages 111603

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