WO2023152344A1 - Procédé de production de protéines héminiques à base de microalgues pour utilisation en alimentaire - Google Patents

Procédé de production de protéines héminiques à base de microalgues pour utilisation en alimentaire Download PDF

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WO2023152344A1
WO2023152344A1 PCT/EP2023/053403 EP2023053403W WO2023152344A1 WO 2023152344 A1 WO2023152344 A1 WO 2023152344A1 EP 2023053403 W EP2023053403 W EP 2023053403W WO 2023152344 A1 WO2023152344 A1 WO 2023152344A1
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WO
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heme proteins
heme
proteins
centrifugation
microalgae
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Application number
PCT/EP2023/053403
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Léa VERNES
Jean-Paul Cadoret
Original Assignee
Algama
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Publication date
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    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G33/00—Cultivation of seaweed or algae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
    • A23J1/009—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from unicellular algae
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    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/195—Proteins from microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/405—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from algae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Definitions

  • This patent application relates to a process for the production of heme proteins in microalgae, as well as the use of said heme proteins obtained to color a food, preferably a vegetable steak.
  • Meat products occupy an important place in our diet. They are consumed in many different forms, such as whole muscles or minced pieces of meat that are cooked, grilled, smoked, dried or fermented in the form of hamburgers, patties, sausages, meatballs, or nuggets. .
  • Patent CN111449203 (A) describes a vegetable meat substitute composition incorporating soybeans, white beans and kidney beans as main compounds to which are added 8 other ingredients. No mention of color is made.
  • patent CN110292098 mentions the use of soybeans, lotus leaves, peanuts, wheat proteins and starch in the composition of its vegetable meat. Again, the notion of color is not discussed here.
  • patent US2019292217 (A1) describes the use of transgenic plants overexpressing the heme protein biosynthesis pathway.
  • Patent CN111655042 (A) thus presents a technique for obtaining algae overexpressing protoporphyrin IX through genetic engineering.
  • This process also has the advantage of being natural and therefore better accepted by the consumer.
  • the invention relates to a process for the production of heme proteins in microalgae.
  • This process via a culture in heterotrophy in a situation of oxidative stress in a medium optionally concentrated in iron, makes it possible to favor the accumulation of heme proteins in the algae. Indeed, oxidative stress provokes a defense response in the algae which produces a greater quantity of heme proteins using the iron available in the environment. The algae thus cultured will produce 5% to 30% more heme proteins than an algae cultured under conventional conditions of photoautotrophy and/or heterotrophy.
  • strains of microalgae unable to survive these stress conditions via the production of heme proteins will be eliminated as the culture continues in a turbidostat, thus favoring a line of microalgae with a high content of heme proteins which can be preserved in order to make a natural food ingredient used to color vegetable meat.
  • strains of microalgae By “acclimatization of strains of microalgae” is understood according to the invention that said strains are put in condition, in a medium, so that they adapt to it.
  • step a. acclimatization is carried out, preferably in flasks, at a temperature between 15°C and 35°C, preferably between 25°C and 30°C, for a period of between 3 and 6 days.
  • continuous culturing is understood according to the invention that the system is an open system in which the population of cells is maintained constantly in a medium balanced in nutrient and cell concentration.
  • cellular compounds are meant all the elements contained in the cell or in its membranes, including heme proteins.
  • Step b cultivation in a turbidostat under oxidative stress conditions increases the production of heme in the microalgae.
  • microalgae due to the rapid life cycle of microalgae, it is possible to rapidly accumulate mutations during the natural cell division of the microorganism by mitosis. This makes it possible to obtain several hundred generations of microalgae in a short period of time.
  • a turbidostat is defined as a continuous culture bio-reactor with continuous turbidity measurement. This device makes it possible to carry out the culture or the continuous fermentation of microorganisms, in this case microalgae.
  • Turbidity is measured as optical density every 6 minutes using a microcomputer and an optical sensor.
  • a peristaltic pump is activated to regulate the algae density to around 25% of the maximum yield density.
  • Culture in the turbidostat is carried out in the presence of a culture medium allowing the development of microalgae. A person skilled in the art is able to determine such a culture medium.
  • This medium is autoclaved after addition of all components.
  • Knop's solutions which comprises in g/L: 1.25, KNO 3 ; 1.25 KH 2 PO 4 ; 2.5 MgSO 4 7H 2 O; 0.30 Nacitrate; 0.004 Fe 2 (SO4) 3 ; 0.0029 H 3 BO 3 ; 0.0018, MnCl 2 4H 2 O; 0.00022 ZnSO 4 7H 2 O; 0.000080 CuS0 4 5H 2 O; 0.000018 MoO 3
  • Oxidative stress is a type of attack on cell constituents, which occurs when reactive oxygen species (or free radicals) and/or reactive oxygen and nitrogen oxidizing species enter or form in the cell; these molecules are unstable and very cytotoxic because they "oxidize" other molecules by removing an electron from them, which in turn makes them unstable.
  • This applied oxidative stress will vary depending on the species of algae grown.
  • Salt stress is not used for salt-tolerant species such as Dunaliella.
  • the salt stress is carried out by adding 300 mM of NaCl.
  • Oxidative stress may optionally be associated or not with an excess of iron in the culture medium with a concentration of 0.5 to 40 mg/L.
  • Iron can be found in different forms: ferric chloride, ferrous chloride, ferric EDTA, ferrous EDTA, ferric ammonium sulphate and ferrous ammonium sulphate.
  • it may be FeCl3 6H2O at 5 g/L.
  • harvest of microalgae is understood within the meaning of the invention that the culture medium is removed, in order to isolate the microalgae obtained at this stage.
  • flocs By “flocculation” is understood within the meaning of the invention this physico-chemical process during which materials suspended in a liquid agglomerate to form larger particles, generally very porous, called flocs.
  • slotation is understood within the meaning of the invention this process of separation based on the differences in hydrophobicity of the surfaces of the particles to be separated.
  • coagulation is understood within the meaning of the invention this separation process based on the destabilization of particles by adding a chemical reagent.
  • filtration is understood within the meaning of the invention the technique which makes it possible to separate the constituents of a mixture using a filter making it possible to retain the particles larger than the pores of the filter.
  • centrifugation is understood in the sense of the invention this technique allowing, by the action of centrifugal force, to separate the phases of a mixture. This mixture is driven in a very rapid rotational movement, and the heaviest particles are then pushed towards the walls of the container under the action of centrifugal force, while the lighter particles and the liquids remain on the surface (supernatant) .
  • step c. harvesting the microalgae cells obtained in step b. is carried out by centrifugation lasts 5 to 20 min at a speed of rotation comprised between 1000 and 2500 G and at a temperature comprised between 10° C. and 20° C., in order to remove the culture medium.
  • the method comprises a step d. conservation of the microalgae cells harvested in step c. at a temperature between -20°C and -90°C preferably at -80°C while waiting for step e. extraction.
  • membrane rupture is understood within the meaning of the invention the lysis of cells in order to obtain all of its membrane and intracellular content.
  • high pressure homogenization is understood in the sense of the invention that the mixing is carried out in a device capable, by the application of a high pressure, of being able to create microscopic particles allowing substances to be mixed.
  • ball milling is understood within the meaning of the invention the use of a device consisting of a horizontal drum rotated by a motor.
  • the drum is partially filled with the product to be ground to which the grinding elements are added (metal balls for example).
  • step f. solid-liquid separation of the cells obtained in step e. is carried out by centrifugation at a speed between 2,000 and 10,000 rpm for 5 to 30 min at a temperature between 10°C and 20°C.
  • solid-liquid separation is understood within the meaning of the invention this process making it possible to separate the solid phase and the liquid phase of a mixture.
  • protein precipitate is meant the solid cluster of proteins obtained as a result of step f. solid-liquid separation.
  • size exclusion chromatography is understood within the meaning of the invention this method of liquid phase chromatography making it possible to separate macromolecules according to their hydrodynamic volume.
  • step g. of separation of the solid fraction comprising the proteins is carried out by precipitation with ammonium sulphate, with a saturation of 40% to 80%.
  • step h. centrifugation of the precipitate obtained in step g. lasts 5 to 30 minutes, at a rotation speed of between 2,000 and 10,000 rpm at a temperature of 4 -15°C, making it possible to obtain a protein precipitate.
  • centrifugation pellet is understood within the meaning of the invention what is at the bottom of the tube once the centrifugation is complete, and which therefore includes the elements having formed the protein precipitate.
  • step i. recovery of the centrifugation pellet containing the protein precipitate and solubilization of the protein precipitate obtained in step h. is carried out in an aqueous phase with a pH between 6.5 and 12.
  • precipitate By “solubilization of the precipitate” is understood in the sense of the invention that the precipitate obtained is brought into contact with water in order to find a form in solution of the heme proteins.
  • drying is understood within the meaning of the invention the action of removing the aqueous phase from the solution, in order to obtain the targeted compounds in powder form.
  • in powder form is meant that the heme proteins obtained are in solid form, consisting of very fine particles.
  • Microalgae is understood to mean: all unicellular eukaryotic organisms (microalgae), as well as prokaryotic organisms such as cyanobacteria that can be cultured in heterotrophy.
  • microalgae the genera concerned are: Chlorella , Nannochloropsis , Scenedesmus , Tetraselmis , Phaeodactylum , Dunaliella, Isochrysis and Tisochrysis , preferably Nannochloropsis or Chlorella .
  • heme protein or hemoproteins
  • heme protein all the heteroproteins comprising a heme as a prosthetic group. These are metalloproteins for which the heme gives them functionality such as oxygen transport, oxygen reduction, electron transfer, etc.
  • the heme, covalently bound or not to the protein, consists of an iron cation bonded to the center of the conjugate base of the porphyrin.
  • the iron-complexed heme proteins of interest are: cytochromes (cytochrome P450, cytochrome c oxidase, etc.) and certain enzymes such as ligninases, catalase and peroxidases.
  • cytochromes cytochrome P450, cytochrome c oxidase, etc.
  • enzymes such as ligninases, catalase and peroxidases.
  • Cytochromes are intermediate oxidoreductases of the respiratory chain
  • Cytochromes P450 are hemoproteins (proteins having a heme molecule as a cofactor) that are involved in redox reactions
  • Cytochrome c oxidase is a membrane oxidoreductase that contains two hemes and catalyzes the oxygen reduction reaction
  • Ligninases are polymeric oxidoreductases constituting an important fraction of the plant cell wall. These enzymes include lignin peroxidase, manganese peroxidase, polyvalent peroxidase and laccase type phenol oxidizing enzymes.
  • Catalase is a heme oxidoreductase made up of four polypeptide chains of approximately 500 amino acid residues, each containing a heme molecule.
  • the heme proteins within the meaning of the invention comprise at least one protein chosen from: cytochromes, cytochromes P450, cytochrome c oxidase, heme peroxidases, cyclooxygenase, prostaglandin endoperoxide H synthases, lactoperoxidases, myeloperoxidases, alpha-dioxygenases, cytochrome C peroxidases, catalase, DyP-type A/B/C/D peroxidases, ascorbate peroxidases, lignin peroxidase, manganese peroxidase, polyvalent peroxidase, and/or the laccases.
  • cytochromes cytochromes P450, cytochrome c oxidase, heme peroxidases, cyclooxygenase, prostaglandin endoperoxide H synthases, lactoperoxidases, myeloperoxidases, alpha-dioxygenases,
  • the invention relates to a composition of heme proteins as obtained by the process according to the invention.
  • This composition is in the form of a powder or in the form of an aqueous solution.
  • the invention also relates to the use of the heme proteins obtained according to the invention to color a food, preferably a vegetable steak to imitate the characteristic browning of red meat during cooking.
  • these heme proteins are included in a ready-to-use formulation for vegetable meat substitute applications.
  • the invention relates to a vegetable steak comprising the heme protein composition obtained according to the invention as a colorant.
  • vegetable steak is understood within the meaning of the invention a vegetable food product having the appearance of a red meat steak.
  • the invention relates to a meat substitute comprising the heme protein composition obtained according to the invention as a colorant.
  • meal substitute is meant a substitute product for meat, for food consumption.
  • colorant or “coloring agent” is understood according to the invention an additive or foodstuff with coloring properties which makes it possible to give color to the product.
  • the coloring makes it possible to imitate the characteristic browning of red meat during cooking.
  • said heme proteins according to the invention make it possible to imitate the characteristic browning of red meat during cooking.
  • the invention relates to the use of heme proteins as a food coloring agent, making it possible to imitate the characteristic browning of red meat during the cooking of said food.
  • said heme proteins are obtained by the process according to the invention.
  • said food is a vegetable steak as a substitute for red meat steaks.
  • said heme proteins comprise at least one protein chosen from: cytochromes, cytochromes P450, cytochrome c oxidase, heme peroxidases, cyclooxygenase, prostaglandin endoperoxide H synthases, lactoperoxidases, myeloperoxidases, alpha- dioxygenases, cytochrome C peroxidases, catalase, DyP-type A/B/C/D peroxidases, ascorbate peroxidases, lignin peroxidase, manganese peroxidase, polyvalent peroxidase, and/or laccases.
  • cytochromes cytochromes P450, cytochrome c oxidase, heme peroxidases, cyclooxygenase, prostaglandin endoperoxide H synthases, lactoperoxidases, myeloperoxidases, alpha- dioxygenases, cytochrome C peroxidases
  • red meat during cooking is meant the change from a bright red color when the meat is raw to a darker red color, approaching chestnut/brown, when the outer layer of the meat is cooked.
  • Example 1 Process for obtaining strains of Nannochloropsis enriched in heme proteins by directed evolution under oxidative stress .
  • Nannochloropsis was cultured by heterotrophy in a turbidostat in a medium supplemented with iron and subjected to oxidative stress (excess salt). Before the turbidostat culture step, the cells were cultured in 250 mL flasks with 150 mL of f/2 culture medium for 4 days at 25°C with continuous stirring and with a light source of 150 mol photons/m2 /s to acclimate them.
  • the fraction containing the proteins is recovered and the heme proteins are quantified by HPLC.
  • Example 2 Process for obtaining Chlorella enriched in heme proteins by directed evolution.
  • Chlorella was cultured by heterotrophy in a turbidostat in a medium supplemented with iron and subjected to oxidative stress (excess salt). Before the turbidostat culture step, the cells were cultured in 250 mL flasks with 150 mL of Knop's culture medium for 4 days at 25°C with continuous stirring and with a light source of 150 mol photons/m 2 /s to acclimate them.
  • Example 2 culture setting Settings Values Inoculum 10% (v/v) Temperature 25°C pH 5.6 – 5.8 CO2 5% (v/v) Culture centre Knop's solution (g/L): 1.25, KNO 3 ; 1.25 KH 2 PO 4 ; 2.5 MgSO 4 7H 2 O; 0.30 Nacitrate; 0.004 Fe 2 (SO4) 3 ; 0.0029 H 3 BO 3 ; 0.0018, MnCl 2 4H 2 O; 0.00022 ZnSO 4 7H 2 O; 0.000080 CuS0 4 5H 2 O; 0.000018 MoO 3 Carbon source 10g/L glucose Hustle Continuous, 150 rpm Brightness No light Salt stress 300mM NaCl
  • the fraction containing the proteins is recovered and the heme proteins are quantified by HPLC.
  • Example 3 Extraction of hemoproteins from Chlorella by high pressure homogenization (HPH)
  • the fresh chlorella biomass enriched in heme proteins by directed evolution is subjected to cell disruption by high-pressure homogenization according to the protocol in Table 3.
  • the protein fraction is then isolated by precipitation in a 60% saturated solution of ammonium sulphate.
  • Example 4 Formulation of 430 g of vegetable steak from the algal heme fraction.
  • the black bean puree is then mixed with 2 g of garlic powder, 100 g of chopped onion and 1 g of heme protein according to the invention in powder form at a speed of 400 rpm for 5 min.
  • This preparation is then left to stand for a quarter of an hour at room temperature.
  • the steak is red before cooking and becomes brown after cooking.

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Abstract

La présente demande de brevet concerne un procédé de production de protéines héminiques dans des microalgues, ainsi que l'utilisation desdites protéines héminiques obtenues pour colorer un aliment, de préférence un steak végétal.

Description

Procédé de production de protéines héminiques à base de microalgues pour utilisation en alimentaire
La présente demande de brevet concerne un procédé de production de protéines héminiques dans des microalgues, ainsi que l’utilisation desdites protéines héminiques obtenues pour colorer un aliment, de préférence un steak végétal.
Art antérieur
Les produits carnés occupent une place importante dans notre alimentation. Ils sont consommés sous de nombreuses formes différentes, comme des muscles entiers ou des morceaux de viande hachés qui sont cuits, grillés, fumés, séchés ou fermentés sous forme de hamburgers, de galettes, de saucisses, de boulettes de viande, ou encore de nuggets.
Les consommateurs sont de plus en plus nombreux à vouloir réduire ou supprimer complètement les produits animaux de leur alimentation, en particulier la viande rouge. Ceux-ci se tournent alors vers les substituts de viande d'origine végétale pour diverses raisons telles que des préoccupations de santé, des préoccupations environnementales, la durabilité ou le bien-être des animaux.
Pour qu'un consommateur régulier de viande choisisse de consommer des substituts de viande, il est essentiel que ces substituts imitent les produits carnés transformés en termes de texture, de propriétés organoleptiques comme l'apparence, la saveur, et la sensation en bouche.
Divers ingrédients fonctionnels dans les substituts de viande sont nécessaires pour imiter le goût, la saveur, la texture, la sensation en bouche et l'apparence des produits à base de viande.
Il existe aujourd’hui des procédés/compositions qui permettent d'obtenir des alternatives végétales à la viande composées de soja et de légumineuses principalement. Cependant, ces formules comportent souvent un grand nombre d’ingrédients, dont des additifs alimentaires synthétiques, et présentent des problèmes de couleur. En effet, rares sont les substituts végétaux qui parviennent à imiter la couleur de la viande rouge avec son brunissement caractéristique à la cuisson.
Le brevet CN111449203 (A) décrit une composition de substitut végétal de viande intégrant du soja, des haricots blancs et des haricots rouges comme composés principaux auxquels s’ajoutent 8 autres ingrédients. Aucune mention de la couleur n’est faite.
De manière similaire, le brevet CN110292098 (A) mentionne l’emploi de soja, feuille de lotus, cacahuètes, protéines de blé et amidon dans la composition de sa viande végétale. A nouveau, la notion de couleur n’est pas abordée ici.
Afin de conférer à la viande végétale une couleur la plus ressemblante possible à celle de la viande animale, différents ingrédients peuvent être employés tels que le caramel, l’extrait de malt, ou le jus de betterave (Asgar et al. 2010). Néanmoins, ces ingrédients ne permettent pas le changement caractéristique de couleur de la viande durant la cuisson. En effet pour mimer ce brunissement lié à l’oxydation du fer de la myoglobine présente dans les muscles de l’animal, il convient d’employer des protéines héminiques d’origine végétale de structure et comportement similaire à la myoglobine.
Ainsi, le brevet US2019292217 (A1) décrit l’utilisation de plantes transgéniques surexprimant la voie de biosynthèse des protéines héminiques.
De manière similaire, Triton a déposé des brevets liés à la production de protéines héminiques telles que la protohème ou protoporphyrine IX par les algues. Le brevet CN111655042 (A) présente ainsi une technique permettant l’obtention d’algues surexprimant la protoporphyrine IX grâce à l’ingénierie génétique.
Cependant la plupart des compositions de viande végétale détaillées dans les brevets cités précédemment n’abordent pas la question de la couleur et les options naturelles disponibles sur le marché ne permettent pas de réaliser le changement de couleur caractéristique (brunissement) de la viande à la cuisson.
Afin de proposer un ingrédient naturel conférant à la viande végétale une couleur similaire à celle de la viande animale, évoluant du rouge au brun après chauffage, le Demandeur a mis au point une technique permettant la production de microalgues naturellement riches en protéines héminiques (ex : cytochrome c), sans recourt à des modification génétiques (OGMs).
Ce procédé présente en outre l’avantage d’être naturel et donc mieux accepté par le consommateur.
Description de l’invention
Ainsi, selon un premier aspect, l’invention concerne un procédé de production de protéines héminiques dans des microalgues.
Selon un mode de réalisation, ce procédé de production de protéines héminiques dans des microalgues comprend les étapes de :
  1. Acclimatation de souches de microalgues ;
  2. Mise en culture en continue desdites souches acclimatées à l’étape a. dans un turbidostat en conditions de stress oxydatif pour les cellules desdites souches, de préférence par stress salin, lumineux ou métallique, optionnellement associé à un excès de fer ;
  3. Récolte des cellules de microalgue obtenues à l’étape b. afin de retirer le milieu de culture par floculation, flottation, coagulation, filtration ou centrifugation, de préférence par centrifugation ;
  4. Optionnellement, conservation des cellules de microalgues récoltées à l’étape c. à une température comprise entre -20°C et -90°C de préférence à -80°C jusqu’à l’étape e. d’extraction ;
  5. Extraction des composés cellulaires par rupture membranaire des cellules obtenues à l’étape c. ou d. ;
  6. Séparation solide-liquide des cellules obtenues à l’étape e., de préférence par filtration, décantation ou centrifugation, de manière plus préférée centrifugation ;
  7. Séparation de la fraction solide comprenant les protéines obtenues à l’étape f., de préférence par précipitation au sulfate d’ammonium, par chromatographie par exclusion stérique, par chromatographie par échange d’ion, par filtration, de manière encore plus préférée par précipitation au sulfate d’ammonium.
  8. Centrifugation du précipitât obtenu à l’étape g. permettant d’obtenir un précipitât de protéine héminiques ;
  9. Récupération du culot de centrifugation contenant le précipitât de protéines héminiques et solubilisation du précipitât de protéines héminiques obtenu à l’étape h. dans une phase aqueuse ;
  10. Obtention de protéines héminiques en solution aqueuse.
Ce procédé, via une culture en hétérotrophie en situation de stress-oxydatif dans un milieu optionnellement concentré en fer, permet de privilégier l’accumulation de protéines héminiques dans l’algue. En effet, le stress-oxydatif provoque une réponse de défense de l’algue qui produit une plus grande quantité de protéines héminiques utilisant le fer du milieu à disposition. L’algue ainsi cultivée produira de 5% à 30% plus de protéines héminiques qu’une algue cultivée conditions classiques de photoautotrophie et/ou hétérotrophie. Les souches de microalgues incapables de survivre à ces conditions de stress via la production de protéines héminiques seront éliminées au fur et à mesure de la culture continue en turbidostat, favorisant ainsi une lignée de microalgue à forte teneur en protéines héminiques qui pourra être conservée afin de réaliser un ingrédient alimentaire naturel servant à colorer la viande végétale.
Par « acclimatation de souches de microalgues » est entendu selon l’invention que lesdites souches sont mises en condition, dans un milieu, afin qu’elles s’y s’adaptent.
De manière préférée, l’étape a. d’acclimatation est réalisée, de préférence dans des fioles, à une température comprise entre 15°C et 35°C, de préférence entre 25°C et 30°C, pour une durée comprise entre 3 et 6 jours.
Par « mise en culture en continue » est entendu selon l’invention que le système est un système ouvert dans lequel la population de cellules est maintenue constamment dans un milieu équilibré en nutriment et en concentration cellulaire.
Par « composés cellulaires » sont entendus tous les éléments contenus dans la cellule ou dans ses membranes, y compris les protéines héminiques.
L’étape b. de mise en culture en turbidostat en condition de stress oxydatif permet d’augmenter la production d’hème dans les microalgues.
Durant cette étape, du fait de la rapidité du cycle de vie des microalgues, il est possible d’accumuler rapidement des mutations lors de la division cellulaire naturelle du microorganisme par mitose. Cela permet d’obtenir plusieurs centaines de générations de microalgues en un laps de temps réduit.
Un turbidostat se définie comme un bio-réacteur de culture en continue avec mesure de la turbidité en continue. Ce dispositif permet d'effectuer la culture ou la fermentation continue de microorganismes, en l’occurrence ici de microalgues.
La turbidité est mesurée sous forme de densité optique toutes les 6 minutes à l’aide d’un micro-ordinateur et d’un capteur optique. Lorsque le signal tombe en dessous d'une valeur prédéfinie, une pompe péristaltique se met en route afin de réguler la densité d'algues à environ 25% de la densité de rendement maximum.
La culture dans le turbidostat est réalisée en présence d’un milieu de culture permettant le développement des microalgues. L’homme du métier est à même de déterminer un tel milieu de culture.
Un exemple de tel milieu de culture est le milieu de culture f/2, comprenant :
  • Na NO3 (75.0 g/L dH2O)
  • Na H2 PO4·H2O (5.0 g/L dH2O)
  • Na2 SiO3·9H2O (30.0 g/L dH2O)
  • Na2H2EDTA (4,36 g/L)
  • FeCl3 6H2O (3,15 g/L)
  • MnCl2 4H2O (180 mg/L)
  • ZnSO4 (22 mg/L)
  • CoCl2 6H2O (10 mg/L)
  • CuSO4 5H2O (9,8 mg/L)
  • Na2MoO4 2H2O (6,3 mg/L)
  • Thiamine HCl (200 mg/L)
  • Cyanocobalamine (10 mg/L)
  • Biotine (100 mg/L)
  • Eau de mer filtrée
Ce milieu est passé à l’autoclave après ajout de tous les composants.
Un autre exemple de tel milieu de culture est le milieu « Knop’s solutions » qui comprend en g/L : 1,25, KNO3; 1,25 KH2PO4; 2.5 MgSO4 7H2O; 0.30 Na citrate; 0.004 Fe2(SO4)3; 0.0029 H3BO3; 0.0018, MnCl2 4H2O; 0,00022 ZnSO4 7H2O; 0,000080 CuS04 5H2O; 0,000018 MoO3
Le stress oxydatif est un type d'agression des constituants de la cellule, qui apparait quand les espèces réactives oxygénées (ou radicaux libres) et/ou les espèces réactives oxygénées et azotées oxydant pénètrent la cellule ou s'y forment ; ces molécules sont instables et très cytotoxiques car elles « oxydent » d'autres molécules en leur soustrayant un électron ce qui les rend à leurs tours instables.
Ce stress oxydatif appliqué sera variable en fonction des espèces d’algues cultivées.
Il peut ainsi prendre la forme d’un :
  1. Stress salin, comprenant l’utilisation d’une concentration en sel comprises entre 30 et 500 mM de NaCl durant 1 à 5 jours ; ou
  2. Stress lumineux, par exposition intermittente à 30 et à 500 µmol de photons/m2/s durant 30 à 120 minutes, ou une exposition prolongée à une intensité lumineuse élevée de l’ordre de 200 – 500 µmol de photons/m2/s durant 0,5h à 72h ; ou
  3. Stress métallique, par ajout de cuivre dans des concentrations de l’ordre de 5 à 500 µM ou des concentrations de l’ordre de 5 à 500 µg/L pendant 1 à 5 jours ;
Le stress salin n’est pas employé pour les espèces halotolérantes comme Dunaliella.
Selon un mode de réalisation, le stress salin est effectué par ajout de 300 mM de NaCl.
Le stress oxydatif pourra optionnellement être associé ou non à un excès de fer dans le milieu de culture avec une concentration de 0,5 à 40 mg/L.
Le fer pourra se trouver sous différentes formes : chlorure ferrique, chlorure ferreux, EDTA ferrique, EDTA ferreux, sulfate d'ammonium ferrique et sulfate d'ammonium ferreux.
De manière préférée, il peut s’agir de FeCl3 6H2O à 5 g/L.
Par « récolte des microalgues » est entendu au sens de l’invention que le milieu de culture est retiré, afin d’isoler les microalgues obtenues à cette étape.
Par « floculation » est entendu au sens de l’invention ce processus physico-chimique au cours duquel des matières en suspension dans un liquide s'agglomèrent pour former des particules plus grosses, généralement très poreuses, nommées flocs.
Par « flottation » est entendu au sens de l’invention ce processus de séparation fondé sur les différences d’hydrophobicité des surfaces des particules à séparer.
Par « coagulation » est entendu au sens de l’invention ce processus de séparation fondé sur la déstabilisation de particules par addition d'un réactif chimique.
Par « filtration » est entendu au sens de l’invention la technique qui permet de séparer les constituants d’un mélange à l’aide d’un filtre permettant de retenir les particules plus grosses que les pores du filtre.
Par « centrifugation » est entendu au sens de l’invention cette technique permettant par l’action de la force centrifuge, de séparer les phases d'un mélange. Ce mélange est entrainé dans un mouvement de rotation très rapide, et les particules les plus lourdes sont alors poussées vers les parois du récipient sous l'action de la force centrifuge, alors que les particules plus légères et les liquides restent en surface (surnageant).
De préférence, l’étape c. de récolte des cellules de microalgues obtenues à l’étape b. est réalisée par centrifugation dure 5 à 20 min à une vitesse de rotation comprise entre 1000 et 2500 G et à une température comprise entre 10°C et 20°C, afin de retirer le milieu de culture.
Selon un mode de réalisation, le procédé comprend une étape d. de conservation des cellules de microalgues récoltées à l’étape c. à une température comprise entre -20°C et -90°C de préférence à -80°C en attendant l’étape e. d’extraction.
Par « rupture membranaire » est entendu au sens de l’invention la lyse des cellules afin d’obtenir l’ensemble de son contenu membranaire et intracellulaire.
De préférence, l’étape e. d’extraction des composés cellulaires est réalisée par rupture membranaire des cellules obtenues à l’étape c. ou d. avec un ratio biomasse/solvant compris entre 1:5 et 1:50 (v/v) dans un solvant de nature aqueuse et de pH compris entre 6 et 12 à une température comprise entre 5°C et 45°C :
  1. Soit par utilisation d’ultrasons à une fréquence comprise entre 10 et 40 kHz, de puissance 50-1000 W pour une durée comprise entre 5 et 60 minutes ; ou
  2. Soit par homogénéisation haute pression (HPH), de 1 à 4 cycles à une pression comprise entre 800 bars et 2500 bars ; ou
  3. Soit par le broyage à billes, avec des billes de diamètre 0,4 à 2 mm, un remplissage de la chambre d’extraction compris entre 60 et 90%, à une vitesse de rotation de 1000 à 4000 rpm durant 15 à 90 minutes.
Par « utilisation d’ultrasons » est entendu au sens de l’invention que l’extraction est réalisée par l’apposition à la solution d’ondes ultrasonores qui se propagent à travers le milieu liquide.
Par « homogénéisation haute pression » est entendu au sens de l’invention que le mélange est réalisé dans un dispositif capable par l’application d’une pression importante de pouvoir créer des particules microscopiques permettant de mélanger des substances.
Par « broyage à billes » est entendu au sens de l’invention l’utilisation d’un dispositif composé d'un tambour horizontal mis en rotation par un moteur. Le tambour est rempli partiellement du produit à broyer auquel sont ajoutés les éléments de broyage (billes métalliques par exemple).
De préférence, l’étape f. de séparation solide-liquide des cellules obtenues à l’étape e. est réalisée par centrifugation à une vitesse comprise entre 2 000 et 10 000 rpm pendant 5 à 30 min à une température comprise entre 10°C et 20°C.
Par « séparation solide-liquide » est entendu au sens de l’invention ce procédé permettant de séparer la phase solide et la phase liquide d’un mélange.
Par « précipitât de protéines » est entendu l’amas solide de protéines obtenu à la suite de l’étape f. de séparation solide-liquide.
Par « précipitation au sulfate d’ammonium » est entendu au sens de l’invention cette méthode permettant de purifier des protéines par précipitation. En raison de sa nature ionique, le sulfate d'ammonium est très soluble dans l'eau et peut donc "précipiter" les protéines par précipitation.
Par « chromatographie par exclusion stérique » est entendu au sens de l’invention cette méthode de chromatographie en phase liquide permettant de séparer des macromolécules en fonction de leur volume hydrodynamique.
Par « chromatographie par échange d’ion » ou « chromatographie ionique » est entendu au sens de l’invention cette technique qui sépare les molécules selon leurs groupes chargés respectifs.
De manière préférée, l’étape g.de séparation de la fraction solide comprenant les protéines est réalisée par précipitation au sulfate d’ammonium, avec une saturation de 40% à 80%.
De préférence, l’étape h. de centrifugation du précipitât obtenu à l’étape g. dure 5 à 30 minutes, à une vitesse de rotation comprise entre 2 000 et 10 000 rpm à une température de 4 -15°C, permettant d’obtenir un précipitât de protéine.
Par « culot de centrifugation » est entendu au sens de l’invention ce qui se trouve au fond du tube une fois la centrifugation terminée, et qui comprend donc les éléments ayant formé le précipitât de protéines.
De préférence, l’étape i. de récupération du culot de centrifugation contenant le précipitât de protéines et de solubilisation du précipitât de protéines obtenu à l’étape h. est réalisée dans une phase aqueuse de pH compris entre 6,5 et 12.
Par « solubilisation du précipitât » est entendu au sens de l’invention que le précipitât obtenu est mis en contact avec de l’eau afin de retrouver une forme en solution des protéines héminiques.
De manière préférée, afin d’obtenir les protéines héminiques sous forme de poudre, ledit procédé selon l’invention comprend en outre :
  1. Séchage de la solution de protéines héminiques obtenues à l’étape j, par lyophilisation, atomisation, séchage basse température ou séchage sous pression, de préférence par atomisation ou lyophilisation.
  1. Obtention de protéines héminiques sous forme de poudre.
Par « séchage » est entendu au sens de l’invention l’action de retirer la phase aqueuse de la solution, afin d’obtenir les composés visés sous forme de poudre.
Par « sous forme de poudre » est entendu que les protéines héminiques obtenues sont sous forme solide, constituée de particules très fines.
Selon un mode de réalisation, le procédé selon l’invention comprend les étapes de :
  1. Acclimatation de souches de microalgues, de préférence dans des fioles, à une température comprise entre 15°C et 35°C, de préférence entre 25°C et 30°C, pour une durée comprise entre 3 et 6 jours ;
  2. Mise en culture en continue desdites souches acclimatées à l’étape a. dans un turbidostat en conditions de stress oxydatif pour les cellules desdites souches, ledit stress oxydatif étant choisi parmi :
    1. Stress salin, comprenant l’utilisation d’une concentration en sel comprises entre 30 et 500 mM de NaCl durant 1 à 5 jours ; ou
    2. Stress lumineux, par exposition intermittente à 30 et à 500 µmol de photons/m2/s durant 30 à 120 minutes, ou une exposition prolongée à une intensité lumineuse élevée de l’ordre de 200 – 500 µmol de photons/m2/s durant 0,5h à 72h ; ou
    3. Stress métallique, par ajout de cuivre dans des concentrations de l’ordre de 5 à 500 µM ou des concentrations de l’ordre de 5 à 500 µg/L pendant 1 à 5 jours ;
ledit stress pouvant optionnellement être associé à un excès de fer dans le milieu de culture avec une concentration de 0,5 à 40 mg/L.
  1. Récolte des cellules de microalgue obtenues à l’étape b. par centrifugation durant 5 à 20 min à une vitesse de rotation comprise entre 1000 et 2500 G et à une température comprise entre 10°C et 20°C, afin de retirer le milieu de culture ;
  2. Optionnellement, conservation des cellules de microalgues récoltées à l’étape c. à une température comprise entre -20°C et -90°C de préférence à -80°C en attendant l’étape e. d’extraction ;
  3. Extraction des composés cellulaires par rupture membranaire des cellules obtenues à l’étape c. ou d. avec un ratio biomasse/solvant compris entre 1 :5 et 1 :50 (v/v) dans un solvant de nature aqueuse et de pH compris entre 6 et 12 à une température comprise entre 5°C et 45°C :
    1. Soit par utilisation d’ultrasons à une fréquence comprise entre 10 et 40 kHz, de puissance 50-1000 W pour une durée comprise entre 5 et 60 minutes ; ou
    2. Soit par homogénéisation haute pression (HPH), de 1 à 4 cycles à une pression comprise entre 800 bars et 2500 bars ; ou
    3. Soit par le broyage à billes, avec des billes de diamètre 0,4 à 2 mm, un remplissage de la chambre d’extraction compris entre 60 et 90%, à une vitesse de rotation de 1000 à 4000 rpm durant 15 à 90 minutes ;
  4. Séparation solide-liquide des cellules obtenues à l’étape e. par centrifugation à une vitesse comprise entre 2 000 et 10 000 rpm pendant 5 à 30 min à une température comprise entre 10°C et 20°C ;
  5. Séparation de la fraction solide comprenant les protéines par précipitation au sulfate d’ammonium, avec une saturation de 40% à 80% ;
  6. Centrifugation du précipitât obtenu à l’étape g. durant 5 à 30 minutes, à une vitesse de rotation comprise entre 2 000 et 10 000 rpm à une température de 4 -15°C, permettant d’obtenir un précipitât de protéine héminiques ;
  7. Récupération du culot de centrifugation contenant le précipitât de protéines et solubilisation du précipitât de protéines héminiques obtenues à l’étape h. dans une phase aqueuse de pH compris entre 6,5 et 12 ;
  8. Obtention de protéines héminiques en solution aqueuse.
De manière préférée, afin d’obtenir les protéines héminiques sous forme de poudre, ledit procédé selon l’invention comprend en outre :
  1. Séchage de la solution de protéines héminiques obtenues à l’étape j par atomisation dans un flux d’air chaud à une température comprise entre 80°C et 300°C, de préférence entre 90°C à 220°C ;
  1. Obtention de protéines héminiques sous forme de poudre.
Par microalgue est entendu : tous les organismes eucaryotes unicellulaires (microalgue), ainsi que les organismes procaryotes tels que les cyanobactéries pouvant être cultivés en hétérotrophie. Parmi les microalgues, les genres concernés sont : Chlorella , Nannochloropsis , Scenedesmus , Tetraselmis , Phaeodactylum , Dunaliella, Isochrysis et Tisochrysis , de préférence Nannochloropsis ou Chlorella.
Par protéine héminique (ou hémoprotéines) est entendu : toutes les hétéroprotéines comprenant un hème comme groupement prosthétique. Il s’agit de métalloprotéines pour lesquelles l’hème leur confère une fonctionnalité comme transport d'oxygène, la réduction de l'oxygène, le transfert d'électrons… L'hème, lié de manière covalente ou non à la protéine, consiste en un cation de fer lié au centre de la base conjuguée de la porphyrine.
De préférence, les protéines héminiques complexées au fer d’intérêt sont : les cytochromes (cytochrome P450, la cytochrome c oxydase…) et certaines enzymes comme les ligninases, la catalase et les peroxydases.
Les cytochromes sont des oxydoréductases intermédiaires de la chaîne respiratoire
Les cytochromes P450 (CYP450) sont des hémoprotéines (protéines ayant une molécule d'hème comme cofacteur) qui interviennent dans les réactions d'oxydoréduction
La cytochrome c oxydase est une oxydoréductase membranaire qui contient deux hèmes et qui catalyse la réaction de réduction du dioxygène
Les peroxydases sont des enzymes de type oxydase. Elles sont dans certains cas associées à un hème. Les peroxydases à hèmes sont en particulier :
  • La famille des cyclooxygenases : cyclooxygénase, Prostaglandin Endoperoxide H Synthases (PGHS), lactoperoxydases (LPO), myéloperoxydases (MPO), alpha-dioxygénase ('DiOx').
  • Les peroxydases à 2 hèmes : cytochromes C peroxydases (DiHCcP),
  • La famille des catalases : la catalase
  • La famille des peroxydases DyP-type A/B/C/D
  • Les peroxydases de classe I : ascorbate peroxydases (APx) et cytochromes C peroxydases
  • Les peroxydases de classe II : lignine peroxydases
Les ligninases sont des oxydoréductases polymériques constituant une fraction importante de la paroi cellulaire végétale. Ces enzymes, parmi lesquelles on compte la lignine peroxydase, la manganèse peroxydase, la peroxydase polyvalente et des enzymes oxydant les phénols de type laccase.
La catalase est une oxydoréductase héminique formées de quatre chaînes polypeptidiques d’environ 500 résidus d'acides aminés, comportant chacune une molécule d'hème.
Ainsi, de manière préférée, les protéines héminiques au sens de l’invention comprennent au moins une protéine choisie parmi : les cytochromes, les cytochromes P450, la cytochrome c oxydase, les peroxydases à hème, la cyclooxygénase, les prostaglandin endoperoxide H synthases, les lactoperoxydases, les myéloperoxydases, les alpha-dioxygénases, les cytochromes C peroxydases, la catalase, les peroxydases DyP-type A/B/C/D, les ascorbate peroxydases, la lignine peroxydase, la manganèse peroxydase, la peroxydase polyvalente, et/ou les laccases.
Selon un deuxième aspect, l’invention concerne une composition de protéines héminiques telle qu’obtenue par le procédé selon l’invention.
Cette composition est sous forme de poudre ou sous forme de solution aqueuse.
Selon un troisième aspect, l’invention concerne également l’utilisation des protéines héminiques obtenues selon l’invention pour colorer un aliment, de préférence un steak végétal pour imiter le brunissement caractéristique de la viande rouge lors de la cuisson.
De préférence, ces protéines héminiques sont incluses dans une formulation prête à l'emploi pour des applications de substituts de viande végétale.
Selon un quatrième aspect, l’invention concerne un steak végétal comprenant la composition de protéines héminiques obtenue selon l’invention en tant que colorant.
Par « steak végétal » est entendu au sens de l’invention un produit alimentaire végétal ayant l’apparence d’un steak de viande rouge.
Selon un cinquième aspect, l’invention concerne un substitut à la viande comprenant la composition de protéines héminiques obtenue selon l’invention en tant que colorant.
Par « substitut à la viande » est entendu un produit de remplacement à la viande, pour consommation alimentaire.
Par « colorant » ou « agent de coloration » est entendu selon l’invention un additif ou denrée à propriétés colorantes qui permet de donner de la couleur au produit. En particulier, dans le cadre de l’invention, la coloration permet d’imiter le brunissement caractéristique de la viande rouge lors de la cuisson.
En particulier, lesdites protéines héminiques selon l’invention permettent d’imiter le brunissement caractéristique de la viande rouge lors de la cuisson.
Selon un sixième aspect, l’invention concerne l’utilisation de protéines héminiques en tant qu’agent de coloration d’un aliment, permettant d’imiter le brunissement caractéristique de la viande rouge lors de la cuisson dudit aliment.
De manière préférée, dans ladite utilisation, lesdites protéines héminiques sont obtenues par le procédé selon l’invention.
De manière préférée, ledit aliment est un steak végétal de substitution aux steaks de viande rouge.
De manière préférée, lesdites protéines héminiques comprennent au moins une protéine choisie parmi : les cytochromes, les cytochromes P450, la cytochrome c oxydase, les peroxydases à hème, la cyclooxygénase, les prostaglandin endoperoxide H synthases, les lactoperoxydases, les myéloperoxydases, les alpha-dioxygénases, les cytochromes C peroxydases, la catalase, les peroxydases DyP-type A/B/C/D, les ascorbate peroxydases, la lignine peroxydase, la manganèse peroxydase, la peroxydase polyvalente, et/ou les laccases.
Par « brunissement de la viande rouge lors de la cuisson » est entendu le passage d’une couleur rouge vive lorsque la viande est crue à une couleur rouge plus foncée, s’approchant du marron / brun, quand la couche extérieure de la viande est cuite.
Par « imiter » est entendu dans le cadre de l’invention que la couleur de la viande cuite est reproduite.
Dans la description et dans les exemples suivants, sauf indication contraire, les pourcentages sont des pourcentages en poids et les plages de valeurs libellées sous la forme « entre ... et ... » incluent les bornes inférieure et supérieure précisées. Les exemples ci-après sont présentés à titre illustratif et non limitatif du domaine de l'invention.
Exemples
Exemple 1 : Procédé d’obtention de souches de Nannochloropsis enrichies en protéines héminique par évolution dirigée en milieu de stress oxydatif .
Nannochloropsis a été cultivée par hétérotrophie en turbidostat dans un milieu supplémenté en fer et soumis à un stress oxydatif (excès de sel). Avant l’étape de culture en turbidostat, les cellules ont été cultivées en fioles de 250 mL avec 150 mL de milieu de culture f/2 durant 4 jours à 25°C sous agitation continue et avec une source lumineuse de 150 mol photons/m2/s pour les acclimater.
Les conditions de culture présentes dans le Tableau 1 ont ensuite été utilisées pour l’évolution dirigée en turbidostat.
Paramètre de culture de l’exemple 1
Paramètre Valeurs
Inoculum 10 % (v/v) (30 mL dans 300 mL)
Température 27 +-1 °C
pH 7,8 +-0,2
Milieu de culture Milieu de culture f/2 :
Na NO3 (75.0 g/L dH2O)
Na H2 PO4·H2O (5.0 g/L dH2O)
Na2 SiO3·9H2O (30.0 g/L dH2O)
Na2H2EDTA (4,36 g/L)
FeCl3 6H2O (3,15 g/L)
MnCl2 4H2O (180 mg/L)
ZnSO4 (22 mg/L)
CoCl2 6H2O (10 mg/L)
CuSO4 5H2O (9,8 mg/L)
Na2MoO4 2H2O (6,3 mg/L)
Thiamine HCl (200 mg/L)
Cyanocobalamine (10 mg/L)
Biotine (100 mg/L)
Eau de mer filtrée
Autoclave du milieu après ajout de tous les composants.
Supplément en fer FeCl3 6H2O (5 g/L)
Source de carbone 2 - 4 g/L de glucose
Agitation 130 rpm en continue
Luminosité Absence de lumière
Stress salin 300 mM de NaCl
Centrifuger les cellules de microalgue obtenues durant 15 min à une vitesse de rotation de 1500 G et à une température de 15°C afin de retirer le milieu de culture.
La fraction contenant les protéines est récupérée et les protéines héminiques sont quantifiées par HPLC.
Après quantification sont obtenues des teneurs qui sont 5% à 30% plus élevées que dans le cas d’une souche contrôle cultivée en conditions classiques.
Exemple 2 : Procédé d’obtention de Chlorella enrichie en protéines héminiques par évolution dirigée.
Chlorella a été cultivée par hétérotrophie en turbidostat dans un milieu supplémenté en fer et soumis à un stress oxydatif (excès de sel). Avant l’étape de culture en turbidostat, les cellules ont été cultivées en fioles de 250 mL avec 150 mL de milieu de culture de Knop durant 4 jours à 25°C sous agitation continue et avec une source lumineuse de 150 mol photons/m2/s pour les acclimater.
Les conditions de culture présentes dans le Tableau 2 ont ensuite été utilisées pour l’évolution dirigée en turbidostat.
Paramètre de culture de l’exemple 2
Paramètres Valeurs
Inoculum 10% (v/v)
Température 25 °C
pH 5,6 – 5,8
CO2 5% (v/v)
Milieu de culture Knop’s solution (g/L) :
1,25, KNO3; 1,25 KH2PO4; 2.5 MgSO4 7H2O; 0.30 Na citrate; 0.004 Fe2(SO4)3; 0.0029 H3BO3; 0.0018, MnCl2 4H2O; 0,00022 ZnSO4 7H2O; 0,000080 CuS04 5H2O; 0,000018 MoO3
Source de carbone 10 g/L de glucose
Agitation Continue, 150 rpm
Luminosité Absence de lumière
Stress salin 300 mM de NaCl
Centrifuger les cellules d’algue obtenues durant 12 min à une vitesse de rotation de 2000 G et à une température de 8°C afin de retirer le milieu de culture.
La fraction contenant les protéines est récupérée et les protéines héminiques sont quantifiées par HPLC.
Après quantification par HPLC des protéines héminiques obtenues par évolution dirigée de Chlorella, sont obtenues des teneurs qui sont 5 à 30% plus élevées que dans le cas d’une souche contrôle, non sélectionnée.
Exemple 3  : Extraction des hémoprotéines de Chlorella par homogénéisation haute pression (HPH)
La biomasse de chlorelle fraiche enrichie en protéines héminique par évolution dirigée est soumise à une rupture cellulaire par homogénéisation haute pression selon le protocole du tableau 3.
Paramètre HPH de l’exemple 3
Paramètres d’extraction Valeurs
Ratio biomasse/solvent (v/v) 1:10
Nature du solvent Eau distillée
pH 8
Pression 2000 bars
Nombre de cycle 3
Temperature 35°C
Après extraction, une séparation solide-liquide par centrifugation à une vitesse de 5 000 pendant 20 minutes à une température de 14°C est réalisée afin de séparer les débris cellulaires de l’extrait aqueux contenant les protéines héminiques.
La fraction protéique est ensuite isolée par précipitation dans une solution saturée à 60% en sulfate d’ammonium.
Enfin, le précipitât est solubilisé dans un tampon aqueux à pH 7.
Exemple 4 : Formulation de 430 g de steak végétal à partir de la fraction algale héminique.
200 grammes de haricots noirs et 20 mL d’eau sont mixés dans un mixeur à lame à 500 rpm pendant 3 min.
Une purée de haricots noirs est ainsi obtenue.
La purée de haricot noir est ensuite mélangée avec 2g de poudre d’ail, 100 g d’oignon haché et 1g de protéine héminique selon l’invention sous forme de poudre à une vitesse de 400 rpm pendant 5 min.
Sous agitation continue à 400 rpm, est ajouté progressivement 75 g de farine de sarrasin, 30 g d’amidon de maïs, 1g de sel et 1 g de poivre.
Cette préparation est ensuite laissée à reposer un quart d’heure à température ambiante.
Des produits alimentaires similaires visuellement à des steaks sont préparés par l’utilisateur avec ses mains, et sont ensuite mis à cuire 3 minutes de chaque côté dans une poêle huilée.
Grâce aux protéines héminiques selon l’invention, le steak est rouge avant la cuisson et devient brun après la cuisson.

Claims (15)

  1. Procédé de production de protéines héminiques dans des microalgues comprenant les étapes de :
    1. Acclimatation de souches de microalgues ;
    2. Mise en culture en continue desdites souches acclimatées à l’étape a. dans un turbidostat en conditions de stress oxydatif pour les cellules desdites souches, de préférence par stress salin, lumineux ou métallique, optionnellement associé à un excès de fer ;
    3. Récolte des cellules de microalgues obtenues à l’étape b. afin de retirer le milieu de culture par floculation, flottation, coagulation, filtration ou centrifugation, de préférence par centrifugation ;
    4. Optionnellement, conservation des cellules de microalgue récoltées à l’étape c, à une température comprise entre -20°C et -90°C de préférence à -80°C jusqu’à l’étape e. d’extraction ;
    5. Extraction des composés cellulaires par rupture membranaire des cellules obtenues à l’étape c. ou d. ;
    6. Séparation solide-liquide des cellules obtenues à l’étape e., de préférence par filtration, décantation ou centrifugation, de manière plus préférée centrifugation ;
    7. Séparation de la fraction solide comprenant les protéines obtenues à l’étape f., de préférence par précipitation au sulfate d’ammonium, par chromatographie par exclusion stérique, par chromatographie par échange d’ion, par filtration, , de manière encore plus préférée par précipitation au sulfate d’ammonium ;
    8. Centrifugation du précipitât obtenu à l’étape g. permettant d’obtenir un précipitât de protéine héminiques ;
    9. Récupération du culot de centrifugation contenant le précipitât de protéines héminiques et solubilisation du précipitât de protéines héminiques obtenu à l’étape h. dans une phase aqueuse ;
    10. Obtention de protéines héminiques en solution aqueuse.
  2. Procédé de production de protéines héminiques selon la revendication précédente, où afin d’obtenir les protéines héminiques sous forme de poudre, ledit procédé comprend en outre des étapes de :
    1. Séchage de la solution de protéines héminiques obtenues à l’étape j, par lyophilisation, atomisation, séchage basse température ou séchage sous pression, de préférence par atomisation ou lyophilisation.
    1. Obtention de protéines héminiques sous forme de poudre.
  3. Procédé de production de protéines héminiques selon l’une quelconque des revendications précédentes, où à l’étape b., ledit stress oxydatif est choisi parmi :
    1. Stress salin, comprenant l’utilisation d’une concentration en sel comprises entre 30 et 500 mM de NaCl durant 1 à 5 jours ; ou
    2. Stress lumineux, par exposition intermittente à 30 et à 500 µmol de photons/m2/s durant 30 à 120 minutes, ou une exposition prolongée à une intensité lumineuse élevée de l’ordre de 200 – 500 µmol de photons/m2/s durant 0,5h à 72h ; ou
    3. Stress métallique, par ajout de cuivre dans des concentrations de l’ordre de 5 à 500 µM ou des concentrations de l’ordre de 5 à 500 µg/L pendant 1 à 5 jours.
  4. Procédé de production de protéines héminiques selon l’une quelconque des revendications précédentes, où l’étape b. est réalisée en association avec un excès de fer dans le milieu de culture, à une concentration de 0,5 à 40 mg/L.
  5. Procédé de production de protéines héminiques selon l’une quelconque des revendications précédentes, où l’étape e. est réalisée par extraction des composés cellulaires par rupture membranaire des cellules obtenues à l’étape c. ou d. avec un ratio biomasse/solvant compris entre 1:5 et 1:50 (v/v) dans un solvant de nature aqueuse et de pH compris entre 6 et 12 à une température comprise entre 5°C et 45°C :
    1. Par utilisation d’ultrasons à une fréquence comprise entre 10 et 40 kHz, de puissance 50-1000 W pour une durée comprise entre 5 et 60 minutes ; ou
    2. Par homogénéisation haute pression, de 1 à 4 cycles à une pression comprise entre 800 bars et 2500 bars ; ou
    3. Par broyage à billes, avec des billes de diamètre 0,4 à 2 mm, un remplissage de la chambre d’extraction compris entre 60 et 90%, à une vitesse de rotation de 1000 à 4000 rpm durant 15 à 90 minutes.
  6. Procédé de production de protéines héminiques selon l’une quelconque des revendications précédentes, où à l’étape g. la séparation de la fraction solide comprenant les protéines par précipitation est réalisée au sulfate d’ammonium, avec une saturation de 40% à 80%.
  7. Procédé de production de protéines héminiques selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant les étapes de :
    1. Acclimatation de souches de microalgues, de préférence dans des fioles, à une température comprise entre 15°C et 35°C, de préférence entre 25°C et 30°C, pour une durée comprise entre 3 et 6 jours ;
    2. Mise en culture en continue desdites souches acclimatées à l’étape a. dans un turbidostat en conditions de stress oxydatif pour les cellules desdites souches, ledit stress oxydatif étant choisi parmi :
      1. Stress salin, comprenant l’utilisation d’une concentration en sel comprises entre 30 et 500 mM de NaCl durant 1 à 5 jours ; ou
      2. Stress lumineux, par exposition intermittente à 30 et à 500 µmol de photons/m2/s durant 30 à 120 minutes, ou une exposition prolongée à une intensité lumineuse élevée de l’ordre de 200 – 500 µmol de photons/m2/s durant 0,5h à 72h ; ou
      3. Stress métallique, par ajout de cuivre dans des concentrations de l’ordre de 5 à 500 µM ou des concentrations de l’ordre de 5 à 500 µg/L pendant 1 à 5 jours ;
    ledit stress pouvant optionnellement être associé à un excès de fer dans le milieu de culture avec une concentration de 0,5 à 40 mg/L.
    1. Récolte des cellules de microalgue obtenues à l’étape b. par centrifugation durant 5 à 20 min à une vitesse de rotation comprise entre 1000 et 2500 G et à une température comprise entre 10°C et 20°C, afin de retirer le milieu de culture ;
    2. Optionnellement, conservation des cellules de microalgues récoltées à l’étape c. à une température comprise entre -20°C et -90°C de préférence à -80°C en attendant l’étape e. d’extraction ;
    3. Extraction des composés cellulaires par rupture membranaire des cellules obtenues à l’étape c. ou d. avec un ratio biomasse/solvant compris entre 1 :5 et 1 :50 (v/v) dans un solvant de nature aqueuse et de pH compris entre 6 et 12 à une température comprise entre 5°C et 45°C :
      1. Par utilisation d’ultrasons à une fréquence comprise entre 10 et 40 kHz, de puissance 50-1000 W pour une durée comprise entre 5 et 60 minutes ; ou
      2. Par homogénéisation haute pression, de 1 à 4 cycles à une pression comprise entre 800 bars et 2500 bars ; ou
      3. Par broyage à billes, avec des billes de diamètre 0,4 à 2 mm, un remplissage de la chambre d’extraction compris entre 60 et 90%, à une vitesse de rotation de 1000 à 4000 rpm durant 15 à 90 minutes ;
    4. Séparation solide-liquide des cellules obtenues à l’étape e. par centrifugation à une vitesse comprise entre 2 000 et 10 000 rpm pendant 5 à 30 min à une température comprise entre 10°C et 20°C ;
    5. Séparation de la fraction solide comprenant les protéines par précipitation au sulfate d’ammonium, avec une saturation de 40% à 80% ;
    6. Centrifugation du précipitât obtenu à l’étape g. durant 5 à 30 minutes, à une vitesse de rotation comprise entre 2 000 et 10 000 rpm à une température de 4 -15°C, permettant d’obtenir un précipitât de protéine héminiques ;
    7. Récupération du culot de centrifugation contenant le précipitât de protéines héminiques et solubilisation du précipitât de protéines héminiques obtenu à l’étape h. dans une phase aqueuse de pH compris entre 6,5 et 12 ;
    8. Obtention de protéines héminiques en solution aqueuse.
  8. Procédé de production de protéines héminiques selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu’afin d’obtenir les protéines héminiques sous forme de poudre, ledit procédé comprend en outre des étapes de :
    1. Séchage de la solution de protéines héminiques obtenues à l’étape j par atomisation dans un flux d’air chaud à une température comprise entre 80°C et 300°C, de préférence entre 90°C à 220°C.
    2. Obtention de protéines héminiques sous forme de poudre.
  9. Procédé de production de protéines héminiques selon l’une quelconque des revendications précédentes, où lesdites microalgues sont choisies parmi : Chlorella, Nannochloropsis, Scenedesmus, Tetraselmis, Phaeodactylum, Dunaliella, Isochrysis et Tisochrysis, de préférence Nannochloropsis ou Chlorella.
  10. Procédé de production de protéines héminiques selon la revendication précédente, où lesdites microalgues sont du genre Nannochloropsis ou Chlorella.
  11. Procédé de production de protéines héminiques selon l’une quelconque des revendications précédentes, où lesdites protéines héminiques comprennent au moins une protéine héminique choisie parmi : les cytochromes, les cytochromes P450, la cytochrome c oxydase, les peroxydases à hème, la cyclooxygénase, les prostaglandin endoperoxide H synthases, les lactoperoxydases, les myéloperoxydases, les alpha-dioxygénases, les cytochromes C peroxydases, la catalase, les peroxydases DyP-type A/B/C/D, les ascorbate peroxydases, la lignine peroxydase, la manganèse peroxydase, la peroxydase polyvalente, et/ou les laccases.
  12. Utilisation de protéines héminiques en tant qu’agent de coloration d’un aliment, permettant d’imiter le brunissement de la viande rouge lors de la cuisson dudit aliment.
  13. Utilisation selon la revendication précédente, où lesdites protéines héminiques sont obtenues par le procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 11.
  14. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 12 et 13, où ledit aliment est un steak végétal de substitution aux steaks de viande rouge.
  15. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 12 à 14, où lesdites protéines héminiques comprennent au moins une protéine choisie parmi : les cytochromes, les cytochromes P450, la cytochrome c oxydase, les peroxydases à hème, la cyclooxygénase, les prostaglandin endoperoxide H synthases, les lactoperoxydases, les myéloperoxydases, les alpha-dioxygénases, les cytochromes C peroxydases, la catalase, les peroxydases DyP-type A/B/C/D, les ascorbate peroxydases, la lignine peroxydase, la manganèse peroxydase, la peroxydase polyvalente, et/ou les laccases.
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Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170253851A1 (en) * 2014-08-26 2017-09-07 Fermentalg Novel method for culture of algae, in particular microalgae
US20190292217A1 (en) 2016-12-02 2019-09-26 Impossible Foods Inc. Transgenic plants with upregulated heme biosynthesis
CN110292098A (zh) 2019-08-06 2019-10-01 四川眉山清心莲花农业有限公司 一种荷叶花生蛋白素肉及其制备方法
US20200095292A1 (en) * 2014-07-18 2020-03-26 Corbion Biotech, Inc. Method for extracting soluble proteins from microalgal biomass
CN111449203A (zh) 2020-04-15 2020-07-28 安徽昊东食品科技有限公司 一种全素肉松加工方法
CN111655042A (zh) 2018-11-08 2020-09-11 特里同阿盖亚创新公司 藻类中过量产生原卟啉ix的方法及由此产生的组合物
US20210051977A1 (en) * 2013-01-11 2021-02-25 Impossible Foods Inc. Methods and compositions for consumables
WO2021195708A1 (fr) * 2020-03-31 2021-10-07 v2food Pty Ltd Agents colorants alimentaires

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20210051977A1 (en) * 2013-01-11 2021-02-25 Impossible Foods Inc. Methods and compositions for consumables
US20200095292A1 (en) * 2014-07-18 2020-03-26 Corbion Biotech, Inc. Method for extracting soluble proteins from microalgal biomass
US20170253851A1 (en) * 2014-08-26 2017-09-07 Fermentalg Novel method for culture of algae, in particular microalgae
US20190292217A1 (en) 2016-12-02 2019-09-26 Impossible Foods Inc. Transgenic plants with upregulated heme biosynthesis
CN111655042A (zh) 2018-11-08 2020-09-11 特里同阿盖亚创新公司 藻类中过量产生原卟啉ix的方法及由此产生的组合物
CN110292098A (zh) 2019-08-06 2019-10-01 四川眉山清心莲花农业有限公司 一种荷叶花生蛋白素肉及其制备方法
WO2021195708A1 (fr) * 2020-03-31 2021-10-07 v2food Pty Ltd Agents colorants alimentaires
CN111449203A (zh) 2020-04-15 2020-07-28 安徽昊东食品科技有限公司 一种全素肉松加工方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PANAHI YUNES ET AL: "Impact of Cultivation Condition and Media Content on Chlorella vulgaris Composition", ADVANCED PHARMACEUTICAL BULLETIN, vol. 9, no. 2, 1 June 2019 (2019-06-01), Iran, pages 182 - 194, XP055807258, ISSN: 2228-5881, Retrieved from the Internet <URL:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6664117/pdf/apb-9-182.pdf> [retrieved on 20210525], DOI: 10.15171/apb.2019.022 *

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