WO2023120762A1 - Immunoevasive anti-tumor adenovirus - Google Patents

Immunoevasive anti-tumor adenovirus Download PDF

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WO2023120762A1
WO2023120762A1 PCT/KR2021/019511 KR2021019511W WO2023120762A1 WO 2023120762 A1 WO2023120762 A1 WO 2023120762A1 KR 2021019511 W KR2021019511 W KR 2021019511W WO 2023120762 A1 WO2023120762 A1 WO 2023120762A1
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WO
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adenovirus
genome
gene
adenovirus genome
promoter
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Application number
PCT/KR2021/019511
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Korean (ko)
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이완
유중기
엄기환
김미순
최진우
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(주)큐리진
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors

Definitions

  • the present invention relates to an anti-tumor adenovirus capable of evading the immune system in vivo.
  • Cancer is one of the diseases that cause the most deaths worldwide, and the development of innovative cancer treatments can reduce medical costs and create high added value at the same time. Also, according to statistics in 2008, molecular therapies that can overcome resistance to existing anticancer drugs accounted for $17.5 billion in 7 major countries (US, Japan, France, Germany, Italy, Spain, UK), and in 2018 In the case of 2008, it is expected to account for a market size of about $45 billion, showing a growth rate of 9.5% compared to 2008. Cancer treatment is divided into surgery, radiotherapy, chemotherapy, and biological treatment. Among them, chemotherapy is a treatment that suppresses or kills the proliferation of cancer cells with chemical substances.
  • Oncorine modified by the E1B-55KD deletion enabling conditional replication in P53-deficient cancer cells.
  • Oncorine is administered by intratumoral injection for head and neck cancer.
  • Adenoviruses have been widely used as gene transfer vectors for gene therapy as well as oncolytic agents for cancer treatment. Adenoviruses exhibit several characteristics that make them suitable for this use.
  • adenovirus in terms of safety, does not cause life-threatening diseases in humans, and its viral genome is non-integrative, preventing insertional mutations. Clinical trials using adenovirus-based vectors report that these viruses have good toxicity and safety profiles, although the need for improved efficacy remains for systemic administration.
  • systemic administration i.e., intravenous or intraarterial injection into the bloodstream
  • systemic administration is essential to treat disseminated tumors in an advanced or metastatic state.
  • adenovirus shows significant limitations in reducing the therapeutic effect when injected into the bloodstream.
  • Adenovirus type 5 (Ad5) undergoes several neutralizing interactions that dramatically reduce the bioavailability of the virus in the bloodstream.
  • liver sequestration since >90% of the injected dose resides in the liver, mainly hepatic macrophages, also called Kupffer cells, but also liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) and liver cells.
  • LSECs liver sinusoidal endothelial cells
  • Direct interaction with blood cells and proteins is also a major obstacle.
  • Ad5 directly binds to blood cells such as red blood cells through CAR receptors and can bind to platelets through integrins.
  • Antibodies not only neutralize viruses directly, but can also trigger an innate immune response by complement activation and docking of viral particles to Fc receptors on monocytes and neutrophils.
  • viral re-administration increases the concentration of anti-Ad neutralizing antibody (NAb), thus enhancing viral neutralization.
  • NAb anti-Ad neutralizing antibody
  • Opsonization of adenovirus by antibodies and complement can also enhance clearance by Kupffer cells. Overall, these interactions result in a significant shortening of the half-life of Ad in the blood to about minutes in mice and humans. Considerable efforts have been made to avoid neutralization by antibodies and immune cells during systemic administration of adenovirus, but it has been reported that systemic spread is still limited, transient and usually ineffective (Ferguson et al. 2012).
  • An object of the present invention is to provide an anti-tumor adenovirus.
  • an object of the present invention is to provide a composition for treating cancer.
  • the present invention provides an anti-tumor adenovirus comprising a nucleic acid encoding a transferrin binding domain.
  • the present invention provides a composition for treating cancer comprising the anti-tumor adenovirus.
  • the adenovirus with high oncolytic activity of the present invention contains a nucleic acid encoding a transferrin binding domain, so that the effect of infecting and killing tumor cells is significantly increased, and the binding with transferrin is increased.
  • the plasma half-life is increased by avoiding the reaction, it is delivered specifically to cancer cells and has a systemic therapeutic effect, local delivery is possible, and anti-tumor efficacy is excellent with excellent selectivity. It can be usefully used as an adjuvant.
  • FIG. 1 is a diagram showing the antibody avoidance mechanism of adenovirus containing the transferrin-binding domain of the present invention.
  • Figure 2 is a diagram showing the production process of adenovirus containing the transferrin-binding domain of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing a vector map related to the envelope of adenovirus including the transferrin-binding domain of the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram showing a vector map of adenovirus including an albumin binding domain (CA10G-A)
  • FIG. 5 is a diagram showing a vector map of an adenovirus including a transferrin binding domain in hexon of the adenovirus vector of the present invention (HVR1-Tbp29aa).
  • FIG. 6 is a diagram showing a vector map of an adenovirus including a transferrin binding domain in hexon of the adenoviral vector of the present invention (HVR1-Tbp(G 4 S 1 ) 3 55aa).
  • FIG. 7 and 8 are diagrams showing the immune evasion ability of adenovirus containing a transferrin-binding domain.
  • CA10G control adenovirus
  • CA10G-A adenovirus containing albumin binding domain
  • HVR1-Tbp29aa Adenovirus containing transferrin binding domain (Tbp29aa) in hexon of adenoviral vector
  • HVR1-Tbp(G 4 S 1 ) 3 55aa adenovirus containing transferrin binding domain (Tbp55aa) in hexon of adenoviral vector
  • an IRES sequence (SEQ ID NO: 15) may be further included between E1A and E1B.
  • the anti-tumor adenovirus of the present invention may further include an hTERT promoter-E1A-IRES-E1B sequence including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15.
  • the adenovirus of the present invention can be selectively dispersed in certain tissues in vivo, thereby avoiding or significantly reducing expression in non-target or non-tumor tissues.
  • the replicating adenovirus of the present invention may have modifications in its genome sequence that confer selective replication in cells.
  • the adenovirus of the present invention may contain a tissue-specific promoter or a tumor-specific promoter.
  • the adenovirus further comprises a tissue-specific promoter or a tumor-specific promoter.
  • an expression cassette expressing the foreign gene of the present invention may be further included, and the expression cassette expressing the foreign gene may be included in the E3 region of the endogenous gene of adenovirus.
  • the anti-tumor adenovirus of the present invention may further include a CMV promoter and a foreign gene, and the CMV promoter and a foreign gene operably linked thereto may be included in the E3 region of the endogenous gene of the adenovirus.
  • the anti-tumor adenovirus of the present invention may have higher oncolytic activity than wild-type adenovirus and may be an oncolytic adenovirus.
  • the anti-tumor adenovirus of the present invention can be used for cancer gene therapy.
  • the "promoter” is an untranslated nucleic acid sequence upstream of a coding region that includes a binding site for RNA polymerase and has an activity of initiating transcription of a gene downstream of the promoter into mRNA. says In the expression cassette of the present invention, the promoter may be any promoter capable of initiating shRNA expression.
  • a promoter that constantly induces the expression of the target gene at all times or a promoter that induces the expression of the target gene at a specific location and time (inducible promoter)
  • examples include the U6 promoter, the H1 promoter, the cytomegalovirus (CMV) promoter, the SV40 promoter, the CAG promoter (Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199, 1991), the CaMV 35S promoter (Odell et al., Nature 313: 810-812, 1985), Rsyn7 promoter (U.S. Patent Application No.
  • the promoter of the present invention may be a U6 promoter, HI promoter, or CMV promoter, and according to a preferred embodiment of the present invention, a CMV promoter may be used.
  • the adenovirus is an oncolytic adenovirus, and preferably the adenovirus genome has a mutation in one or more genes selected from the group consisting of E1a, E1b, E4 and VA-RNA to achieve selective replication in tumors. further comprising, adenovirus.
  • the adenovirus genome further comprises capsid modifications to increase adenovirus infectivity or target it to receptors present on tumor cells.
  • the modification of the capsid is to insert the RGD motif into the H1 loop of the adenoviral fibroprotein.
  • the adenovirus genome is a chimeric adenovirus genome derived from one given serotype, comprising fragments or regions of the genome that have been replaced with homologous regions of the genome from another serotype.
  • such chimeric adenovirus is a human derived from serotype 5, comprising a portion of the fiber gene replaced with a homologous region derived from another serotype, preferably human adenovirus 3 or human adenovirus 35. It is an adenovirus.
  • modification of the capsid is by substituting a portion of the fiber gene with a homologous portion derived from another adenovirus serotype to form a chimeric adenovirus.
  • the type 5/3 adenovirus includes a part of the fiber gene derived from type 3 adenovirus, and the other genome means a virus derived from type 5 adenovirus.
  • the adenovirus genome comprises additional genes inserted into its genome.
  • the gene is used for gene therapy or vaccine immunization.
  • the gene is a gene used for cancer gene therapy, more preferably a group consisting of at least a prodrug-activating gene, a tumor-suppressor gene, a gene encoding an anti-tumor interfering RNA, and an immunostimulatory gene. It is a gene selected from.
  • the present invention relates to a composition for treating cancer comprising the anti-tumor adenovirus of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the adenovirus of the present invention is an oncolytic adenovirus.
  • oncolytic adenovirus refers to any adenovirus that is replication-competent or capable of replicating in tumors, even without selectivity.
  • the therapeutic action of oncolytic adenoviruses is based on their ability to cytolyze tumor cells to replicate and eradicate.
  • Apoptosis of tumor cells can be assessed by measuring the number of viable cells, cytopathic effect, apoptosis of tumor cells, by PCR in tumor cells (e.g., metabolic markers, Western blot of viral proteins or reverse transcription of viral genes required for replication). It can be detected by any state-of-the-art method, such as protein synthesis or tumor size reduction.
  • composition of the present invention can be administered systemically.
  • composition of the present invention may be for intravenous administration.
  • the composition of the present invention may further include an anti-cancer agent, for example, acibacin, aclarubicin, acodazole, acronisin, adozelesin, alanosin, aldesleukin, allo Purinol Sodium, Altretamine, Aminoglutethimide, Amonafide, Amplogen, Amsacrine, Androgens, Anguidin, Aphidicolin Glycinate, Asaray, Asparaginase, 5-Azacytidine , Azathioprine, Bacillus Calmete-Guerin (BCG), Baker's Antipol, Beta-2-deoxythioguanosine, Bisantrene HCl, Bleomycin Sulfate, Bulseppan, Butionine Sulfoximin, BWA 773U82 , BW 502U83/HCl, BW 7U85 mesylate, cerasemide, carbetimer, carboplatin, car
  • cisplatin paclitaxel, 5-fluorouracil (5-FU), methotrexate, doxorubicin, daunorubicin, cytosine arabinoside, etoposide, melparan, chlorambucil, cyclophosphamide, vindesine, mycobacteria Tomycin, bleomycin, tamoxifen and taxol, more preferably cisplatin, paclitaxel or 5-fluorouracil (5-FU), but combined treatment with the composition of the present invention to achieve the purpose of showing a synergistic effect on anticancer effect To do so, it is not limited thereto.
  • the cancer is colorectal cancer, breast cancer, uterine cancer, cervical cancer, ovarian cancer, prostate cancer, brain tumor, head and neck carcinoma, melanoma, myeloma, leukemia, lymphoma, stomach cancer, lung cancer, pancreatic cancer, non-small cell lung cancer, liver cancer , esophageal cancer, small intestine cancer, perianal cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, bladder cancer, kidney cancer, ureteral cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, bone cancer, skin cancer, head cancer, Cervical cancer, cutaneous melanoma, intraocular melanoma, endocrine gland cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, central nervous system (CNS) tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, It may be any one selected from the group consisting of
  • composition of the present invention may further include an adjuvant.
  • adjuvant any one may be used without limitation, but, for example, Freund's complete adjuvant or incomplete adjuvant may be further included to increase the effect.
  • composition according to the present invention may be prepared in the form of incorporating the active ingredient into a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier includes carriers, excipients and diluents commonly used in the pharmaceutical field.
  • Pharmaceutically acceptable carriers that can be used in the composition of the present invention include, but are not limited to, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • composition of the present invention may be formulated and used in the form of oral formulations such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories or sterile injection solutions according to conventional methods.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and such solid preparations contain at least one or more excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, and gelatin in addition to active ingredients. It can be prepared by mixing etc. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions for oral administration, emulsions, syrups, etc.
  • compositions for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried formulations and suppositories.
  • Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used as non-aqueous solvents and suspending agents.
  • a base for suppositories witepsol, tween 61, cacao paper, laurin paper, glycerogelatin, and the like may be used.
  • the holy substance according to the present invention can be administered to a subject by various routes. All modes of administration can be envisaged, eg oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal injection, but intravenous administration is most preferred.
  • the dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention is selected in consideration of the age, weight, sex, and physical condition of the subject. It is obvious that the concentration of the single domain antibody included in the pharmaceutical composition can be variously selected depending on the subject, and is preferably included in the pharmaceutical composition at a concentration of 0.01 to 5,000 ⁇ g/ml. If the concentration is less than 0.01 ⁇ g/ml, pharmacological activity may not appear, and if the concentration exceeds 5,000 ⁇ g/ml, toxicity to the human body may be exhibited.
  • composition of the present invention can be used for the prevention or treatment of cancer and its complications, and can also be used as an anticancer adjuvant.
  • composition of the present invention is administered in a therapeutically effective amount or a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is dependent on the type and severity of the subject, age, sex, activity of the drug, and drug. sensitivity, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, factors including concomitantly used drugs, and other factors well known in the medical field.
  • SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 By inserting the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3) encoding the transferrin binding protein (TBD) derived from Neisseria Meningitidis strain K454, S3131, B16B6 into the HVR1 region of the hexon of the adenovirus vector, the sequence The sequence of SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10 was prepared. More specifically, Bio Basic Inc.
  • TBP Transferrin binding protein
  • pAd1128 OD260, adenoviral plasmid
  • hexon HVR1 position 154aa of SEQ ID NO: 14
  • adenovirus genome (comid) to be used as a material for producing adenovirus
  • pAd1127 (including E and PIX sites), pAd1128-tbp (including TBP coding sequence), and pAd1129 (E3
  • pAd1128-tbp including TBP coding sequence
  • pAd1129 E3
  • four plasmids, including Fiber) -GFP and pAd1130 (including E4) with a restriction enzyme (Sfil)
  • Sfil restriction enzyme
  • FIG. 3 A schematic diagram of the vector of the seed virus envelope is shown in FIG. 3 .
  • FIG. 4 the structure of an adenovirus vector containing an albumin binding moiety is shown in FIG. 4 .
  • the lung cancer cell line A549 was seeded in 100ul at a rate of 1 ⁇ 10 4 cells per well in a 96-well plate.
  • CA10G-A control: type 5/3 adenovirus containing an albumin-binding moiety in the HVR1 region: adenovirus containing the sequence of SEQ ID NO: 12
  • the binding reaction was performed at 4° C.
  • HVR1-TBP 29aa type 5/3 adenovirus comprising the transferrin-binding domain of SEQ ID NO: 1 in the HVR1 region
  • HVR1-(G 4 S 1 ) 3 -TBP 55aa HVR1
  • the binding reaction was performed at 4° C. for 4 hours in a solution of 1 mg/ml of transferrin before cell treatment (CA10G is 5/3 adenovirus).
  • the virus infectious units, IFU
  • albumin or transferrin was treated 0, 5, 10, 20, 50, 100 times compared to the number of cells
  • the adenovirus type 5 antibody (Abcam, ab6982) was 0.1 ng/ml
  • the culture medium was treated at a concentration of In order to obtain a quantitative result of the apoptotic ability by the virus, Sigma's cell division kit (XTT assay kit) was used 72 hours after the virus treatment.
  • the 96-well plate was stained using a crystal violet reagent 72 hours after the virus treatment.

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Abstract

The present invention relates to an anti-tumor adenovirus that can evade the in-vivo immune system. The adenovirus having high ability to kill tumor of the present invention, by comprising a nucleic acid encoding a transferrin binding moiety, has significantly increased effects of infecting and killing tumor cells, exhibits an increase in binding with transferrin to thereby evade in-vivo immune responses, leading to an increase in plasma half-life, is specifically delivered to cancer cells to produce systemic therapeutic effects, and can be topically delivered and has excellent selectivity, resulting in a remarkable effect in anti-tumor efficacy and, therefore, the adenovirus can be advantageously used as an anticancer composition or anticancer adjuvant in various types of cancer.

Description

면역 회피성 항종양 아데노바이러스Immune evasion antitumor adenovirus
본 발명은 생체 내 면역 체계를 회피할 수 있는 항종양 아데노바이러스에 관한 것이다.The present invention relates to an anti-tumor adenovirus capable of evading the immune system in vivo.
암은 전세계적으로 가장 많은 사망자를 내는 질병 중 하나로, 혁신적인 암 치료제의 개발은 이에 대한 치료시 발생되는 의료비를 절감할 수 있음과 동시에 고부가가치를 창출할 수 있다. 또한, 2008년의 통계에 따르면, 기존항암제 내성을 극복 할 수 있는 분자 치료제는 주요 7개국 (US, Japan, France, Germany, Italy, Spain, UK)에서 $17.5 빌리언(billion)을 차지했고, 2018년의 경우 약 $45 빌리언정도의 시장 크기(market size)를 차지하여, 2008년 대비 9.5%의 성장률을 보일 것이라 예측되고 있다. 암의 치료는 수술, 방사선치료, 화학요법, 생물학적 치료로 구분되는데, 이 중에 화학요법은 화학물질로서 암 세포의 증식을 억제하거나 죽이는 치료법으로 항암제에 의하여 나타나는 독성은 상당부분 정상세포에서도 나타나기 때문에 일정 정도의 독성을 나타내며, 항암제가 효과를 나타내다가도 일정 기간의 사용 후에는 효과가 상실되는 내성이 발생하기 때문에 암세포에 선택적으로 작용하고 내성이 생기지 않는 항암제의 개발이 절실하다. 최근 암에 대한 분자유전정보의 확보를 통해 암의 분자적 특성을 표적으로 한 새로운 항암제의 개발이 진행되고 있으며, 암세포만이 가지고 있는 특징적인 분자적 표적(molecular target)을 겨냥하는 항암제들도 약제 내성이 생긴다는 보고도 있다. 따라서, 새로운 개념의 항암제 개발이 필요하다.Cancer is one of the diseases that cause the most deaths worldwide, and the development of innovative cancer treatments can reduce medical costs and create high added value at the same time. Also, according to statistics in 2008, molecular therapies that can overcome resistance to existing anticancer drugs accounted for $17.5 billion in 7 major countries (US, Japan, France, Germany, Italy, Spain, UK), and in 2018 In the case of 2008, it is expected to account for a market size of about $45 billion, showing a growth rate of 9.5% compared to 2008. Cancer treatment is divided into surgery, radiotherapy, chemotherapy, and biological treatment. Among them, chemotherapy is a treatment that suppresses or kills the proliferation of cancer cells with chemical substances. It exhibits a degree of toxicity, and even if the anticancer drug exhibits an effect, after a certain period of use, resistance to losing the effect occurs. Therefore, it is urgent to develop an anticancer agent that selectively acts on cancer cells and does not develop resistance. Recently, the development of new anticancer drugs targeting the molecular characteristics of cancer is in progress through the acquisition of molecular genetic information on cancer, and anticancer drugs targeting molecular targets unique to cancer cells are also being developed. There are also reports of developing tolerance. Therefore, it is necessary to develop a novel anticancer agent.
한편, 자연 바이러스 감염 또는 바이러스 예방접종 후의 일시적인 암 차도의 입증되지 않은 보고로 인해, 암 치료를 위해 바이러스를 사용한 실험들이 있다. 최초 보고는 광견병을 위해 백신접종된 환자에서의 자궁경부암의 감소에 기인한 1912년으로, 유사한 결과가 천연두 예방접종 또는 천연 바이러스 감염 예컨대 볼거리 또는 홍역이 뒤따르는 암 환자에게서 나타났다. 이들 보고 및 동물 데이터에 기초한 암 치료를 위해 환자에 생 바이러스를 접종한 것은 1940년대 후반 및 1950년대 초반 경의 일이다. 그러나, 때때로 일시적 종양 감소 이후, 종양이 재성장하고 환자가 사망하는 문제들이 발생했다. 이들 접종은 장기-지속적인 차도가 나타나지 않았다. 1957년에, 생경구 소아마비 백신을 개발한 Albert B. Sabin, M.D.는 종양용해성 바이러스가 종양을 사멸시키는 경우에도 바이러스에 대한 개인의 면역 반응이 너무 빨라 그 효과가 급속하게 소진되는 문제가 가장 큰 것으로 언급하였다.On the other hand, due to unsubstantiated reports of natural viral infection or transient cancer remissions after viral vaccination, there are experiments using viruses for cancer treatment. The first report was in 1912 attributable to a reduction in cervical cancer in patients vaccinated for rabies, and similar results were seen in cancer patients following smallpox vaccination or natural viral infections such as mumps or measles. Based on these reports and animal data, patients were inoculated with live viruses for cancer treatment in the late 1940's and early 1950's. However, sometimes after a temporary tumor reduction, the tumor regrows and the patient dies. These inoculations did not produce long-lasting remission. In 1957, Albert B. Sabin, M.D., who developed a live oral polio vaccine, found that even when an oncolytic virus kills tumors, the individual's immune response to the virus is so rapid that its effectiveness wears off rapidly. mentioned.
현 시점에서, 수많은 종양용해성 아데노바이러스가 확인되었으나 현재까지 세상 어디에서도 임상 사용을 위해 승인된 유일한 바이러스는 P53-결핍된 암세포에서 조건적 복제를 가능하게 하는 E1B-55KD 결실에 의해 개질된 Oncorine (H101) 하위그룹 C 아데노바이러스이다 (H101은 1996년에 Bischoff 등에 의해 기재된 ONYX015의 밀접한 유사체임). Oncorine은 두경부암에 대한 종양 내 주사에 의해 투여된다. 아데노바이러스는 유전자 테라피를 위한 유전자 전달 벡터로서 뿐 아니라 암 치료를 위한 종양분해제(oncolytic agent)로서 널리 사용되어 왔다. 아데노바이러스는 이러한 용도에 적합한 몇가지 특징들을 나타낸다. 즉, 아데노바이러스의 구조와 생물학적 특성은 널리 연구되어 있어, 이들의 게놈을 용이하게 변형시킬 수 있으며, 이들 바이러스는 복제성 세포 및 복제불가 세포 모두를 감염시킬 수 있으며, 임상적으로 사용하기에 높은 역가 (titer)로 쉽게 생산될 수 있다. 아데노바이러스는, 안전성 측면에서, 인간에게서 생명을 위협하는 질병을 유발하지 않으며, 그 바이러스 게놈은 삽입 돌연변이가 방지되는 비-삽입형 (non-integrative)이다. 아데노바이러스계 벡터를 이용한 임상 실험들은, 이 바이러스가, 전신 투여의 경우에는 효능 개선의 필요성이 아직 남아있긴 하지만, 양호한 독성 및 안전성 프로파일을 가진 것으로 보고되고 있다.At the present time, numerous oncolytic adenoviruses have been identified, but to date the only virus approved for clinical use anywhere in the world is Oncorine (H101) modified by the E1B-55KD deletion enabling conditional replication in P53-deficient cancer cells. ) is a subgroup C adenovirus (H101 is a close analogue of ONYX015 described by Bischoff et al. in 1996). Oncorine is administered by intratumoral injection for head and neck cancer. Adenoviruses have been widely used as gene transfer vectors for gene therapy as well as oncolytic agents for cancer treatment. Adenoviruses exhibit several characteristics that make them suitable for this use. That is, the structure and biological properties of adenoviruses have been widely studied, their genomes can be easily modified, these viruses can infect both replicating cells and non-replicating cells, and are highly suitable for clinical use. It can be easily produced to titer. Adenovirus, in terms of safety, does not cause life-threatening diseases in humans, and its viral genome is non-integrative, preventing insertional mutations. Clinical trials using adenovirus-based vectors report that these viruses have good toxicity and safety profiles, although the need for improved efficacy remains for systemic administration.
이와 같이, 유전자 테라피 분야에서, 전신 투여, 즉 정맥내 또는 동맥내 혈류로의 주입은, 다수 장기들과 파종성 세포(disseminated cell)들에 도달하기 위해 필요할 수도 있다. 예를 들어, 아데노바이러스 벡터 및 종양분해성 아데노바이러스를 이용한 암 테라피에서, 진행된 상태이거나 전이성 상태의 파종성 종양들을 치료하기 위해서는 전신 투여가 필수적이다. 그러나, 아데노바이러스는 혈류로의 주입시 테라피 효과를 떨어뜨리는 상당한 한계를 보인다. 아데노바이러스 타입 5 (Ad5)는 혈류에서 바이러스의 생체이용성을 급격하게 떨어뜨리는 여러가지 중화성 상호작용(neutralizing interaction)을 겪게 된다. 주입된 투여량의 >90%가 간, 주로 쿠퍼 세포로 지칭되는 간 대식세포와, 또한 간의 LSEC (liver sinusoidal endothelial cell) 및 간 세포에 체류하기 때문에, 이 테라피의 가장 큰 문제점은 간 격리이다. 혈액 세포 및 단백질과의 직접적인 상호작용 역시 주요한 장애가 된다. Ad5는 CAR 수용체를 통해 적혈구 등의 혈액 세포에 직접 결합하며, 인테그린을 통해 혈소판에 결합할 수 있다. 항체는 바이러스를 직접 중화시킬 뿐만 아니라 보체 활성화 및 단핵세포와 호중구의 Fc 수용체에 바이러스 입자를 도킹(docking)시킴으로써 선천적인 면역 반응을 촉발시킬 수도 있다. 또한, 바이러스 재-투여는 항-Ad 중화 항체(NAb)의 농도를 증가시키며, 따라서, 바이러스 중화도 강화된다. 항체 및 보체에 의한 아데노바이러스의 옵소닌 작용(opsonization) 역시 쿠퍼 세포에 의한 제거(clearance)를 강화할 수 있다. 전체적으로, 이들 상호작용은 마우스 및 인간에서 혈중 Ad의 반감기를 약 수분으로 크게 단축시키는 결과를 발생시킨다. 아데노바이러스의 전신 투여시 항체 및 면역 세포에 의한 중화를 회피하기 위한 상당한 노력들이 행해져왔으나, 아직도 전신 전파에 한계가 있으며, 일시적인 것이면서 대개 비효과적인 것으로 보고되었다 (Ferguson 등 2012).Thus, in the field of gene therapy, systemic administration, i.e., intravenous or intraarterial injection into the bloodstream, may be required to reach multiple organs and disseminated cells. For example, in cancer therapy using adenoviral vectors and oncolytic adenoviruses, systemic administration is essential to treat disseminated tumors in an advanced or metastatic state. However, adenovirus shows significant limitations in reducing the therapeutic effect when injected into the bloodstream. Adenovirus type 5 (Ad5) undergoes several neutralizing interactions that dramatically reduce the bioavailability of the virus in the bloodstream. The biggest problem with this therapy is liver sequestration, since >90% of the injected dose resides in the liver, mainly hepatic macrophages, also called Kupffer cells, but also liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) and liver cells. Direct interaction with blood cells and proteins is also a major obstacle. Ad5 directly binds to blood cells such as red blood cells through CAR receptors and can bind to platelets through integrins. Antibodies not only neutralize viruses directly, but can also trigger an innate immune response by complement activation and docking of viral particles to Fc receptors on monocytes and neutrophils. In addition, viral re-administration increases the concentration of anti-Ad neutralizing antibody (NAb), thus enhancing viral neutralization. Opsonization of adenovirus by antibodies and complement can also enhance clearance by Kupffer cells. Overall, these interactions result in a significant shortening of the half-life of Ad in the blood to about minutes in mice and humans. Considerable efforts have been made to avoid neutralization by antibodies and immune cells during systemic administration of adenovirus, but it has been reported that systemic spread is still limited, transient and usually ineffective (Ferguson et al. 2012).
따라서, 전신 투여에 적합하며 중화 항체를 회피할 수 있는 암 치료제로서의 아데노바이러스에 대한 연구가 여전히 요구되고 있다.Therefore, there is still a need for research on adenovirus as a cancer treatment that is suitable for systemic administration and can avoid neutralizing antibodies.
본 발명의 목적은 항종양 아데노바이러스를 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide an anti-tumor adenovirus.
아울러, 본 발명의 목적은 암 치료용 조성물을 제공하는 것이다.In addition, an object of the present invention is to provide a composition for treating cancer.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 트랜스페린 바인딩 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하는 항종양 아데노바이러스를 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides an anti-tumor adenovirus comprising a nucleic acid encoding a transferrin binding domain.
아울러, 본 발명은 상기 항종양 아데노바이러스를 포함하는 암 치료용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for treating cancer comprising the anti-tumor adenovirus.
본 발명에 따르면, 본 발명의 종양살상능이 높은 아데노바이러스는 트랜스페린 바인딩 도메인을 코딩하는 핵산을 포함함으로써, 종양 세포 감염 및 사멸 효과가 현저히 증가하였으며, 트랜스페린과의 결합이 증가하므로, 이로 인해, 체내 면역 반응을 회피하여 혈장 반감기가 증가하고, 암세포에 특이적으로 전달되어 전신 치료 효과가 있으며, 국소 전달이 가능하고, 선택성이 뛰어나 항-종양 효능이 현저한 효과를 나타내, 다양한 암종에 항암용 조성물 또는 항암보조제로서 유용하게 이용될 수 있다. According to the present invention, the adenovirus with high oncolytic activity of the present invention contains a nucleic acid encoding a transferrin binding domain, so that the effect of infecting and killing tumor cells is significantly increased, and the binding with transferrin is increased. The plasma half-life is increased by avoiding the reaction, it is delivered specifically to cancer cells and has a systemic therapeutic effect, local delivery is possible, and anti-tumor efficacy is excellent with excellent selectivity. It can be usefully used as an adjuvant.
도 1은 본 발명의 트랜스페린 결합 도메인을 포함하는 아데노바이러스의 항체 회피 기작을 나타낸 도이다.1 is a diagram showing the antibody avoidance mechanism of adenovirus containing the transferrin-binding domain of the present invention.
도 2는 본 발명의 트랜스페린 결합 도메인을 포함하는 아데노바이러스의 제조 과정을 나타낸 도이다.Figure 2 is a diagram showing the production process of adenovirus containing the transferrin-binding domain of the present invention.
도 3은 본 발명의 트랜스페린 결합 도메인을 포함한 아데노바이러스의 외피에 관련된 벡터맵을 나타낸 도이다.3 is a diagram showing a vector map related to the envelope of adenovirus including the transferrin-binding domain of the present invention.
도 4는 알부민 바인딩 도메인을 포함한 아데노바이러스의 벡터맵을 나타낸 도이다(CA10G-A)4 is a diagram showing a vector map of adenovirus including an albumin binding domain (CA10G-A)
도 5는 본 발명의 아데노바이러스 벡터의 헥손(Hexon)에 트랜스페린 결합 도메인을 포함하는 아데노바이러스의 벡터맵을 나태낸 도이다(HVR1-Tbp29aa).5 is a diagram showing a vector map of an adenovirus including a transferrin binding domain in hexon of the adenovirus vector of the present invention (HVR1-Tbp29aa).
도 6은 본 발명의 아데노바이러스 벡터의 헥손(Hexon)에 트랜스페린 결합 도메인을 포함하는 아데노바이러스의 벡터맵을 나태낸 도이다(HVR1-Tbp(G4S1)3 55aa).6 is a diagram showing a vector map of an adenovirus including a transferrin binding domain in hexon of the adenoviral vector of the present invention (HVR1-Tbp(G 4 S 1 ) 3 55aa).
도 7 및 도 8은 트랜스페린 결합 도메인을 포함하는 아데노바이러스의 면역회피능을 나타낸 도이다. 7 and 8 are diagrams showing the immune evasion ability of adenovirus containing a transferrin-binding domain.
CA10G: 대조군 아데노바이러스;CA10G: control adenovirus;
CA10G-A:알부민 바인딩 도메인을 포함하는 아데노바이러스CA10G-A: adenovirus containing albumin binding domain
HVR1-Tbp29aa: 아데노바이러스 벡터의 헥손(Hexon)에 트랜스페린 결합 도메인(Tbp29aa)을 포함하는 아데노바이러스HVR1-Tbp29aa: Adenovirus containing transferrin binding domain (Tbp29aa) in hexon of adenoviral vector
HVR1-Tbp(G4S1)3 55aa: 아데노바이러스 벡터의 헥손에 트랜스페린 결합 도메인(Tbp55aa)를 포함하는 아데노바이러스HVR1-Tbp(G 4 S 1 ) 3 55aa: adenovirus containing transferrin binding domain (Tbp55aa) in hexon of adenoviral vector
일 구현예에서, E1A 및 E1B 사이에 IRES 서열 (서열번호 15)이 추가로 포함될 수 있다.In one embodiment, an IRES sequence (SEQ ID NO: 15) may be further included between E1A and E1B.
일 구현예에서, 본 발명의 항종양 아데노바이러스는 서열번호 15의 염기서열을 포함하는 hTERT 프로모터-E1A-IRES-E1B 서열을 추가로 포함할 수 있다.In one embodiment, the anti-tumor adenovirus of the present invention may further include an hTERT promoter-E1A-IRES-E1B sequence including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15.
본 발명의 아데노바이러스는 생체내에서 소정의 조직에 선택적으로 분산될 수 있어, 비-표적 또는 비-종양 조직에서의 발현을 회피하거나 또는 현저하게 줄일 수 있다.The adenovirus of the present invention can be selectively dispersed in certain tissues in vivo, thereby avoiding or significantly reducing expression in non-target or non-tumor tissues.
본 발명의 복제 아데노바이러스는 세포에 선택적인 복제를 부여하는 변형을 게놈 서열에 가질 수 있다. 아데노바이러스의 발현이 필요한 조직 또는 치료할 종양 조직에 아데노바이러스의 발현을 인가하기 위해, 본 발명의 아데노바이러스는 조직-특이적 프로모터 또는 종양-특이적 프로모터를 포함할 수 있다. 따라서, 일구현예에서, 아데노바이러스는 조직-특이적 프로모터 또는 종양-특이적 프로모터를 더 포함한다.The replicating adenovirus of the present invention may have modifications in its genome sequence that confer selective replication in cells. In order to apply adenovirus expression to a tissue in need of adenovirus expression or to a tumor tissue to be treated, the adenovirus of the present invention may contain a tissue-specific promoter or a tumor-specific promoter. Thus, in one embodiment, the adenovirus further comprises a tissue-specific promoter or a tumor-specific promoter.
일 구현예에서, 본 발명의 외래 유전자를 발현하는 발현 카세트를 추가로 포함할 수 있으며, 외래 유전자를 발현하는 발현 카세트를 아데노바이러스의 내재적 유전자의 E3 부위에 포함할 수 있다.In one embodiment, an expression cassette expressing the foreign gene of the present invention may be further included, and the expression cassette expressing the foreign gene may be included in the E3 region of the endogenous gene of adenovirus.
일 구현예에서, 본 발명의 항종양 아데노바이러스는 CMV 프로모터 및 외래유전자를 추가로 포함할 수 있으며 CMV 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 외래유전자를 아데노바이러스의 내재적 유전자의 E3 부위에 포함할 수 있다.In one embodiment, the anti-tumor adenovirus of the present invention may further include a CMV promoter and a foreign gene, and the CMV promoter and a foreign gene operably linked thereto may be included in the E3 region of the endogenous gene of the adenovirus.
일 구현예에서, 본 발명의 항종양 아데노바이러스는 야생형 아데노바이러스에 비해 종양살상능이 높을 수 있으며, 종양분해성 아데노바이러스일 수 있다.In one embodiment, the anti-tumor adenovirus of the present invention may have higher oncolytic activity than wild-type adenovirus and may be an oncolytic adenovirus.
일 구현예에서, 본 발명의 항종양 아데노바이러스는 암 유전자 치료에 사용될 수 있다.In one embodiment, the anti-tumor adenovirus of the present invention can be used for cancer gene therapy.
본 발명에 있어서, 상기 "프로모터"란, RNA 중합효소에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 다운스트림 (downstream) 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 암호화 영역의 상위(upstream)의 비해독된 핵산 서열을 말한다. 본 발명의 발현 카세트에 있어서, 상기 프로모터는 shRNA의 발현을 개시할 수 있는 어떤 프로모터도 가능하다. 구체적으로, 본 발명의 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터 (inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 U6 프로모터, H1 프로모터, CMV (cytomegalovirus) 프로모터, SV40 프로모터, CAG 프로모터 (Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199, 1991), CaMV 35S 프로모터 (Odell et al.,Nature 313:810-812, 1985), Rsyn7 프로모터 (미국특허출원 제08/991,601호), 라이스 액틴 (rice actin) 프로모터 (McElroy et al., Plant Cell 2:163-171, 1990), 유비퀴틴 프로모터 (Christensen et al., Plant Mol. Biol. 12:619-632, 1989), ALS 프로모터(미국 특허출원 제08/409,297) 등이 있다. 이외에도 미국특허 제5,608,149; 제5,608,144호 제5,604,121호 제5,569,597호 제5,466,785호, 제5,399,680호 제5,268,463호 및 제5,608,142호 등에 개시된 프로모터 등 당업자에게 자명한 공지의 모든 프로모터를 사용할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 본 발명의 프로모터는 U6 프로모터, HI 프로모터, CMV 프로모터일 수 있으며, 본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면 CMV 프로모터를 사용할 수 있다.In the present invention, the "promoter" is an untranslated nucleic acid sequence upstream of a coding region that includes a binding site for RNA polymerase and has an activity of initiating transcription of a gene downstream of the promoter into mRNA. says In the expression cassette of the present invention, the promoter may be any promoter capable of initiating shRNA expression. Specifically, as the promoter of the present invention, a promoter that constantly induces the expression of the target gene at all times (constitutive promoter) or a promoter that induces the expression of the target gene at a specific location and time (inducible promoter) can be used, Examples include the U6 promoter, the H1 promoter, the cytomegalovirus (CMV) promoter, the SV40 promoter, the CAG promoter (Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199, 1991), the CaMV 35S promoter (Odell et al., Nature 313: 810-812, 1985), Rsyn7 promoter (U.S. Patent Application No. 08/991,601), rice actin promoter (McElroy et al., Plant Cell 2: 163-171, 1990), ubiquitin promoter (Christensen et al. ., Plant Mol. Biol. 12:619-632, 1989), the ALS promoter (US Patent Application Serial No. 08/409,297), and the like. In addition, U.S. Patent Nos. 5,608,149; 5,608,144, 5,604,121, 5,569,597, 5,466,785, 5,399,680, 5,268,463, and 5,608,142, etc. All known promoters known to those skilled in the art can be used, but are not limited thereto. Preferably, the promoter of the present invention may be a U6 promoter, HI promoter, or CMV promoter, and according to a preferred embodiment of the present invention, a CMV promoter may be used.
본 발명에서 아데노바이러스는 종양분해성 아데노바이러스이며, 바람직하게는 아데노바이러스 게놈이 종양에서의 선택적인 복제를 달성하기 위해 E1a, E1b, E4 및 VA-RNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 돌연변이를 더 포함하는, 아데노바이러스이다.In the present invention, the adenovirus is an oncolytic adenovirus, and preferably the adenovirus genome has a mutation in one or more genes selected from the group consisting of E1a, E1b, E4 and VA-RNA to achieve selective replication in tumors. further comprising, adenovirus.
다른 구현예에서, 아데노바이러스 게놈은, 아데노바이러스 감염성을 높이거나 또는 이를 종양 세포에 존재하는 수용체로 표적화하기 위해 캡시드 변형을 더 포함한다. 바람직하게는, 캡시드의 변형은 아데노바이러스 섬유단백질의 H1 루프에 RGD 모티프를 삽입하는 것이다. 다른 구현예에서, 아데노바이러스 게놈은, 다른 혈청형 유래 게놈의 상동적인 영역으로 치환된 게놈의 단편 또는 영역을 포함하는, 하나의 소정의 혈청형으로부터 유래되는 키메라 아데노바이러스 게놈이다. 바람직하게는, 이러한 키메라 아데노바이러스는, 다른 혈청형, 바람직하게는 인간 아데노바이러스 3 또는 인간 아데노바이러스 35로부터 유래되는 상동적인 영역으로 치환된 섬유 유전자의 일부를 포함하는, 혈청형 5로부터 파생되는 인간 아데노바이러스이다. 바람직한 구현예에서, 캡시드의 변형은, 섬유 유전자의 일부를 다른 아데노바이러스 혈청형으로부터 유래된 상동적인 부분으로 치환하여, 키메라 아데노바이러스를 형성하는 것이다. 본 발명에서 5/3형 아데노바이러스는 3형 아데노바이러스 유래의 섬유 유전자 일부를 포함하고, 이외 다른 게놈은 5형 아데노바이러스 유래의 바이러스를 의미한다.In another embodiment, the adenovirus genome further comprises capsid modifications to increase adenovirus infectivity or target it to receptors present on tumor cells. Preferably, the modification of the capsid is to insert the RGD motif into the H1 loop of the adenoviral fibroprotein. In another embodiment, the adenovirus genome is a chimeric adenovirus genome derived from one given serotype, comprising fragments or regions of the genome that have been replaced with homologous regions of the genome from another serotype. Preferably, such chimeric adenovirus is a human derived from serotype 5, comprising a portion of the fiber gene replaced with a homologous region derived from another serotype, preferably human adenovirus 3 or human adenovirus 35. It is an adenovirus. In a preferred embodiment, modification of the capsid is by substituting a portion of the fiber gene with a homologous portion derived from another adenovirus serotype to form a chimeric adenovirus. In the present invention, the type 5/3 adenovirus includes a part of the fiber gene derived from type 3 adenovirus, and the other genome means a virus derived from type 5 adenovirus.
다른 구현예에서, 아데노바이러스 게놈은 그 게놈에 삽입되는 추가의 유전자를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 유전자는 유전자 테라피 또는 백신면역화에 사용된다. 바람직하게는, 상기 유전자는 암 유전자 테라피에 사용되는 유전자이며, 더 바람직하게는 적어도 프로드럭-활성화 유전자, 종양-억제인자 유전자, 항-종양성 간섭 RNA를 코딩하는 유전자 및 면역자극성 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자이다.In another embodiment, the adenovirus genome comprises additional genes inserted into its genome. In one embodiment, the gene is used for gene therapy or vaccine immunization. Preferably, the gene is a gene used for cancer gene therapy, more preferably a group consisting of at least a prodrug-activating gene, a tumor-suppressor gene, a gene encoding an anti-tumor interfering RNA, and an immunostimulatory gene. It is a gene selected from.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항종양 아데노바이러스와 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 암 치료용 조성물에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to a composition for treating cancer comprising the anti-tumor adenovirus of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 아데노바이러스는 종양분해성 아데노바이러스이다. 본원에서, 용어 "종양분해성 아데노바이러스"는, 심지어 선택성 없이, 종양에서 복제-가능 (replication competent)하거나 또는 복제할 수 있는 임의의 아데노바이러스를 지칭한다. 종양분해성 아데노바이러스의 치료작용은 복제하여 소거할 종양 세포를 세포 분해하는 능력에 기초한다. 종양 세포의 사멸은 생존 세포의 수 측정, 세포변성 효과, 종양 세포의 세포자살, 종양 세포에서의 (예, 대사 표지, 바이러스 단백질의 웨스턴 블롯 또는 복제에 필요한 바이러스 유전자의 역 전사를 이용한 PCR) 바이러스 단백질 합성 또는 종양 크기 축소등의, 임의의 최신 방법에 의해 검출할 수 있다.In a preferred embodiment, the adenovirus of the present invention is an oncolytic adenovirus. As used herein, the term "oncolytic adenovirus" refers to any adenovirus that is replication-competent or capable of replicating in tumors, even without selectivity. The therapeutic action of oncolytic adenoviruses is based on their ability to cytolyze tumor cells to replicate and eradicate. Apoptosis of tumor cells can be assessed by measuring the number of viable cells, cytopathic effect, apoptosis of tumor cells, by PCR in tumor cells (e.g., metabolic markers, Western blot of viral proteins or reverse transcription of viral genes required for replication). It can be detected by any state-of-the-art method, such as protein synthesis or tumor size reduction.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 전신으로 투여될 수 있다.In one embodiment, a composition of the present invention can be administered systemically.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 정맥 투여용일 수 있다.In one embodiment, the composition of the present invention may be for intravenous administration.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 항암제를 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들어, 아시바이신, 아클라루비신, 아코다졸, 아크로나이신, 아도젤레신, 알라노신, 알데스루킨, 알로푸리놀 소듐, 알트레타민, 아미노글루테티미드, 아모나파이드, 암플리겐, 암사크린, 안드로겐스, 안구이딘, 아피디콜린 글리시네이트, 아사레이, 아스파라기나아제, 5-아자시티딘, 아자티오프린, 바실러스 칼메테-구에린(BCG), 베이커스 안티폴, 베타-2-디옥시티오구아노신, 비스안트렌 HCl, 블레오마이신 설페이트, 불서판, 부티오닌 설폭시민, BWA 773U82, BW 502U83/HCl, BW 7U85 메실레이트, 세라세미드, 카르베티머, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클로람부실, 클로로퀴녹살린-설포나미드, 클로로조토신, 크로모마이신 A3, 시스플라틴, 클라드리빈, 코르티코스테로이드, 코리너박테리움 파르붐, CPT-11, 크리스나톨, 사이클로사이티딘, 사이클로포스파미드, 사이타라빈, 사이템베나, 다비스 말리에이트, 데카르바진, 닥티노마이신, 다우노루바이신 HCl, 디아자유리딘, 덱스라족산, 디언하이드로 갈락티톨, 디아지쿠온, 디브로모둘시톨, 디데민 B, 디에틸디티오카르바메이트, 디클라이코알데하이드, 다이하이드로-5-아자사이틴, 독소루비신, 에치노마이신, 데다트렉세이트, 에델포신, 에플롤니틴, 엘리옷스 용액, 엘사미트루신, 에피루비신, 에소루비신, 에스트라머스틴 포스페이트, 에스트로겐, 에타니다졸, 에티오포스, 에토포사이드, 파드라졸, 파자라빈, 펜레티나이드, 필그라스팀, 피나스테라이드, 플라본 아세트산, 플록스유리딘, 플루다라빈 포스페이트, 5'-플루오로우라실, Fluosol™, 플루타미드, 갈륨 나이트레이트, 겜사이타빈, 고세레린 아세테이트, 헤프설팜, 헥사메틸렌 비스아세트아미드, 호모하링토닌, 하이드라진 설페이트, 4-하이드록시안드로스테네디온, 하이드로지우레아, 이다루비신 HCl, 이포스파미드, 4-이포메아놀, 이프로플라틴, 이소트레티노인, 류코보린 칼슘, 류프로라이드 아세테이트, 레바미솔, 리포좀 다우노루비신, 리포좀 포집 독소루비신, 로머스틴, 로니다민, 마이탄신, 메클로레타민 하이드로클로라이드, 멜팔란, 메노가릴, 메르바론, 6-머캅토푸린, 메스나, 바실러스 칼레테-구에린의 메탄올 추출물, 메토트렉세이트, N-메틸포름아미드, 미페프리스톤, 미토구아존, 마이토마이신-C, 미토탄, 미톡산트론 하이드로클로라이드, 모노사이트/마크로파아지 콜로니-자극 인자, 나빌론, 나폭시딘, 네오카르지노스타틴, 옥트레오타이드 아세테이트, 오르마플라틴, 옥살리플라틴, 파크리탁셀, 팔라, 펜토스타틴, 피페라진디온, 피포브로만, 피라루비신, 피리트렉심, 피록산트론 하이드로클로라이드, PIXY-321, 플리카마이신, 포르피머 소듐, 프레드니무스틴, 프로카르바진, 프로게스틴스, 파이라조푸린, 라족산, 사르그라모스팀, 세무스틴, 스피로게르마늄, 스피로무스틴, 스트렙토나이그린, 스트렙토조신, 술로페너르, 수라민 소듐, 타목시펜, 탁소레레, 테가푸르, 테니포사이드, 테레프탈아미딘, 테록시론, 티오구아닌, 티오테파, 티미딘 인젝션, 티아조푸린, 토포테칸, 토레미펜, 트레티노인, 트리플루오페라진 하이드로클로라이드, 트리플루리딘, 트리메트렉세이트, TNF(tumor necrosis factor), 우라실 머스타드, 빈블라스틴 설페이트, 빈크리스틴 설페이트, 빈데신, 비노렐빈, 빈졸리딘, Yoshi 864, 조루비신, 사이토신아라비노시드, 에토포시드, 멜파란, 탁솔 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 바람직하게는 시스플라틴, 파클리탁셀, 5-FU(5-fluorouracil), 메토트렉세이트, 독소루비신, 다우노루비신, 사이토신아라비노시드, 에토포시드, 멜파란, 클로람부실, 사이클로포스파마이드, 빈데신, 마이토마이신, 블레오마이신, 타목시펜 및 탁솔이고, 더욱 바람직하게는, 시스플라틴, 파클리탁셀 또는 5-FU(5-fluorouracil)이나, 본 발명의 조성물과 병용 처리하여 항암 효과에 시너지 효과를 나타낼 수 있는 목적을 달성하기 위해서라면, 이에 제한되지 않는다. In one embodiment, the composition of the present invention may further include an anti-cancer agent, for example, acibacin, aclarubicin, acodazole, acronisin, adozelesin, alanosin, aldesleukin, allo Purinol Sodium, Altretamine, Aminoglutethimide, Amonafide, Amplogen, Amsacrine, Androgens, Anguidin, Aphidicolin Glycinate, Asaray, Asparaginase, 5-Azacytidine , Azathioprine, Bacillus Calmete-Guerin (BCG), Baker's Antipol, Beta-2-deoxythioguanosine, Bisantrene HCl, Bleomycin Sulfate, Bulseppan, Butionine Sulfoximin, BWA 773U82 , BW 502U83/HCl, BW 7U85 mesylate, cerasemide, carbetimer, carboplatin, carmustine, chlorambucil, chloroquinoxaline-sulfonamide, chlorozotocin, chromomycin A3, cisplatin, Cladribine, corticosteroids, Corynerbacterium parvum, CPT-11, cristinol, cyclocytidine, cyclophosphamide, cytarabine, cytombena, davis maleate, decarbazine, dactinomycin, dow Norubicin HCl, diazauridine, dexrazoxic acid, dianhydrogalactitol, diaziquone, dibromodulcitol, didemin B, diethyldithiocarbamate, diclicoaldehyde, dihydro-5- Azacytin, doxorubicin, ethinomycin, dedatrexate, edelphosine, eprolnitine, elliox solution, elsamitrucin, epirubicin, esorubicin, estramustine phosphate, estrogen, ethanidazole, etio Phosphorus, Etoposide, Fadrazole, Fajalabine, Fenretinide, Filgrastim, Finasteride, Flavone Acetic Acid, Floxuridine, Fludarabine Phosphate, 5'-Fluorouracil, Fluosol™, Flutamide, Gallium Nate Late, gemcitabine, gosereline acetate, hepsulfam, hexamethylene bisacetamide, homoharringtonine, hydrazine sulfate, 4-hydroxyandrostenedione, hydroziurea, idarubicin HCl, ifosfamide, 4 -Ipomeanol, iproplatin, isotretinoin, leucovorin calcium, leuprolide acetate, levamisole, liposomal daunorubicin, liposomal entrapped doxorubicin, lomustine, lonidamine, maytansine, mechlorethamine hydrochloride, melphalan , Menogaril, Mervalon, 6-Mercaptopurine, Mesna, Methanol Extract of Bacillus Calete-Guerin, Methotrexate, N-Methylformamide, Mifepristone, Mitoguazone, Mitomycin-C, Mitotan, Toxantrone Hydrochloride, Monocyte/Macrophage Colony-Stimulating Factor, Navilon, Nafoxidine, Neocarzinostatin, Octreotide Acetate, Ormaplatin, Oxaliplatin, Paclitaxel, Pala, Pentostatin, Piperazinedione , pipobroman, pyrarubicin, pyritrexim, pyroxantrone hydrochloride, PIXY-321, plicamycin, porfimer sodium, prednimustine, procarbazine, progestins, pyrazopurine, razoxane, sar Gramostim, Semustine, Spirogermanium, Spiromustine, Streptonigreen, Streptozocin, Sulophener, Suramin Sodium, Tamoxifen, Taxolere, Tegapur, Teniposide, Terephthalamidine, Teroxirone, Thioguanine , thiotepa, thymidine injection, thiazopurine, topotecan, toremifene, tretinoin, trifluoperazine hydrochloride, trifluridine, trimetrexate, tumor necrosis factor (TNF), uracil mustard, vinblastine sulfate , vincristine sulfate, vindesine, vinorelbine, vinzolidine, Yoshi 864, zorubicin, cytosine arabinoside, etoposide, melparan, taxol, and mixtures thereof. Preferably cisplatin, paclitaxel, 5-fluorouracil (5-FU), methotrexate, doxorubicin, daunorubicin, cytosine arabinoside, etoposide, melparan, chlorambucil, cyclophosphamide, vindesine, mycobacteria Tomycin, bleomycin, tamoxifen and taxol, more preferably cisplatin, paclitaxel or 5-fluorouracil (5-FU), but combined treatment with the composition of the present invention to achieve the purpose of showing a synergistic effect on anticancer effect To do so, it is not limited thereto.
일 구현예에서, 상기 암은 대장암, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 뇌종양, 두경부암종, 흑색종, 골수종, 백혈병, 림프종, 위암, 폐암, 췌장암, 비소세포성폐암, 간암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 골암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부흑색종, 안구내흑색종, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직육종, 요도암, 음경암, 중추신경계(central nervous system; CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수종양, 다형성교모세포종 및 뇌하수체선종으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.In one embodiment, the cancer is colorectal cancer, breast cancer, uterine cancer, cervical cancer, ovarian cancer, prostate cancer, brain tumor, head and neck carcinoma, melanoma, myeloma, leukemia, lymphoma, stomach cancer, lung cancer, pancreatic cancer, non-small cell lung cancer, liver cancer , esophageal cancer, small intestine cancer, perianal cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, bladder cancer, kidney cancer, ureteral cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, bone cancer, skin cancer, head cancer, Cervical cancer, cutaneous melanoma, intraocular melanoma, endocrine gland cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, central nervous system (CNS) tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, It may be any one selected from the group consisting of glioblastoma multiforme and pituitary adenoma.
본 발명의 조성물에는 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 효과를 증가시킬 수 있다. The composition of the present invention may further include an adjuvant. As long as the adjuvant is known in the art, any one may be used without limitation, but, for example, Freund's complete adjuvant or incomplete adjuvant may be further included to increase the effect.
본 발명에 따른 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.The composition according to the present invention may be prepared in the form of incorporating the active ingredient into a pharmaceutically acceptable carrier. Here, the pharmaceutically acceptable carrier includes carriers, excipients and diluents commonly used in the pharmaceutical field. Pharmaceutically acceptable carriers that can be used in the composition of the present invention include, but are not limited to, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.The composition of the present invention may be formulated and used in the form of oral formulations such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories or sterile injection solutions according to conventional methods.
제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.When formulated, it may be prepared using diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants. Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and such solid preparations contain at least one or more excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, and gelatin in addition to active ingredients. It can be prepared by mixing etc. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used. Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions for oral administration, emulsions, syrups, etc. In addition to commonly used diluents such as water and liquid paraffin, various excipients such as wetting agents, sweeteners, aromatics, and preservatives may be included. can Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried formulations and suppositories. Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used as non-aqueous solvents and suspending agents. As a base for suppositories, witepsol, tween 61, cacao paper, laurin paper, glycerogelatin, and the like may be used.
본 발명에 따른 성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있으나, 정맥 투여되는 것이 가장 바람직하다.The holy substance according to the present invention can be administered to a subject by various routes. All modes of administration can be envisaged, eg oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal injection, but intravenous administration is most preferred.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 상기 약학 조성물 중 포함되는 단일 도메인 항체 의 농도는 대상에 따라 다양하게 선택할 수 있음은 자명하며, 바람직하게는 약학 조성물에 0.01 ~ 5,000 ㎍/ml의 농도로 포함되는 것이다. 그 농도가 0.01 ㎍/ml 미만일 경우에는 약학 활성이 나타나지 않을 수 있고, 5,000 ㎍/ml를 초과할 경우에는 인체에 독성을 나타낼 수 있다.The dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention is selected in consideration of the age, weight, sex, and physical condition of the subject. It is obvious that the concentration of the single domain antibody included in the pharmaceutical composition can be variously selected depending on the subject, and is preferably included in the pharmaceutical composition at a concentration of 0.01 to 5,000 μg/ml. If the concentration is less than 0.01 μg/ml, pharmacological activity may not appear, and if the concentration exceeds 5,000 μg/ml, toxicity to the human body may be exhibited.
본 발명의 조성물은 암 및 이의 합병증의 예방 또는 치료에 이용될 수 있으며, 항암보조제로도 사용될 수 있다. The composition of the present invention can be used for the prevention or treatment of cancer and its complications, and can also be used as an anticancer adjuvant.
본 발명의 조성물은 치료적 유효량 또는 약학으로 유효한 양으로 투여한다. 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.The composition of the present invention is administered in a therapeutically effective amount or a pharmaceutically effective amount. The term "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is dependent on the type and severity of the subject, age, sex, activity of the drug, and drug. sensitivity, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, factors including concomitantly used drugs, and other factors well known in the medical field.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.The present invention will be described in more detail through the following examples. However, the following examples are only for specifying the content of the present invention, and the present invention is not limited thereto.
실시예 1. 트랜스페린 결합 도메인을 포함하는 항암(항종양) 바이러스 제작Example 1. Preparation of anti-cancer (anti-tumor) virus containing transferrin binding domain
Neisseria Meningitidis strain K454, S3131, B16B6 유래 트랜스페린 결합 도메인(Transferrin binding protein, TBD)을 코딩하는 염기서열 (서열번호 1 또는 서열번호 3)을 아데노바이러스 벡터의 헥손(Hexon)의 HVR1 영역 내에 삽입하여, 서열번호 8 또는 서열번호 10의 서열을 제조하였다. 보다 구체적으로, TBP(Transferrin binding protein)의 N-말단, C-말단에 링커를 위치한 염기서열을 Bio Basic Inc.에 합성 의뢰한 후, 합성 완료된 TBP는 PCR 방법으로 타겟 서열을 증폭한 다음 pAd1128(OD260, adenoviral plasmid)플라스미드의 헥손 HVR1(서열번호 14의 154aa 위치)위치에 삽입하여 E.Coli DH10B에 형질전환하였다. 이 후, 콜로니 PCR을 통해 TBP의 삽입이 확인된 클론은 mini prep 후, macrogen에 서열분석을 의뢰하여 염기서열을 재차 확인하였다. 이 후, 아데노바이러스를 생산하기 위한 재료로 쓰일 아데노바이러스 게놈(comid)를 제작하기 위하여, 도 3에서 나타낸 pAd1127(E 및 PIX 부위 포함), pAd1128-tbp(TBP 코딩 서열을 포함), pAd1129(E3 및, Fiber를 포함)-GFP, pAd1130(E4를 포함)의 네가지 플라스미드를 제한효소(Sfil)로 처리한 후, 라이게이션하여 코스미드를 제조하였다. 이 후, 코스미드는 람다파지에 패키징한 후, E.coli(OD101)에 감염시켜 형질도입하였다. 몇 개의 클론을 액체배양하여 mini prep 후, 제한효소를 처리하여 DNA 단편의 크기를 예상되는 패턴과 비교하여 예상 패턴과 같은 클론을 취하였다. 이 후, 확인된 클론은 mini prep하여 복제원점, 항생제 내성 유전자등을 제거하기 위하여, 제한효소를 처리하여 선형 아데노바이러스 게놈을 만든 후, 7ug을 HE293 세포 주에 형질도입하여 씨드 바이러스(seed virus)를 제조하여, 이를 이 후 실험에 사용하였다. 상기 씨드 바이러스 외피의 벡터 모식도는 도 3에 나타내었다.By inserting the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3) encoding the transferrin binding protein (TBD) derived from Neisseria Meningitidis strain K454, S3131, B16B6 into the HVR1 region of the hexon of the adenovirus vector, the sequence The sequence of SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10 was prepared. More specifically, Bio Basic Inc. was requested to synthesize the base sequence at the N-terminus and C-terminus of TBP (Transferrin binding protein), and then the synthesized TBP was amplified by PCR to amplify the target sequence and then pAd1128 ( OD260, adenoviral plasmid) was inserted into hexon HVR1 (position 154aa of SEQ ID NO: 14) of the plasmid to transform E. coli DH10B. Thereafter, clones in which TBP insertion was confirmed through colony PCR were subjected to mini-preparation, followed by sequencing by macrogen, and the nucleotide sequence was confirmed again. Thereafter, in order to prepare an adenovirus genome (comid) to be used as a material for producing adenovirus, pAd1127 (including E and PIX sites), pAd1128-tbp (including TBP coding sequence), and pAd1129 (E3 And, after treating four plasmids, including Fiber) -GFP and pAd1130 (including E4) with a restriction enzyme (Sfil), they were ligated to prepare a cosmid. Thereafter, the cosmid was packaged in lambda phage and transduced by infecting E.coli (OD101). Several clones were liquid-cultured, mini-prepared, treated with restriction enzymes, and the size of the DNA fragment was compared with the expected pattern, and clones with the expected pattern were obtained. Thereafter, the identified clones were mini-prepared to remove the origin of replication, antibiotic resistance genes, etc., and treated with restriction enzymes to create a linear adenovirus genome. was prepared and used in subsequent experiments. A schematic diagram of the vector of the seed virus envelope is shown in FIG. 3 .
또한, 알부민 바인딩 모이어티를 포함하는 아데노바이러스의 벡터 구조를 도 4에 나타내었다.In addition, the structure of an adenovirus vector containing an albumin binding moiety is shown in FIG. 4 .
또한, 본원 발명의 트랜스페린 바인딩 모이어티를 포함하는 아데노바이러스이 벡터 구조를 도 5(서열번호 8을 포함하는 아데노바이러스; HVR1-TBP 29aa) 및 도 6(서열번호 10을 포함하는 아데노바이러스; HVR1-(G4S1)3-TBP 55aa)에 나타내었다.5 (adenovirus comprising SEQ ID NO: 8; HVR1-TBP 29aa) and 6 (adenovirus comprising SEQ ID NO: 10; HVR1-( G 4 S 1 ) 3 -TBP 55aa).
실시예 2. 항암 바이러스의 중화 항체 회피능 확인Example 2. Confirmation of anti-cancer virus neutralizing antibody evasion ability
상기 실시예 1에서 제작한 트랜스페린 바인딩 도메인을 포함하는 아데노바이러스가 생체 내에서 트랜스페린과 결합함으로써 항체 공격을 피해 암세포를 사멸시키는지 확인하였다. 구체적으로, 96웰 플레이트에 폐암 세포주 A549를 웰당 1 x 104 cells이 되도록 100ul 씩 시딩하였다. CA10G-A(대조군: 알부민 바인딩 모이어티를 HVR1 영역에 포함하는 5/3형 아데노바이러스: 서열번호 12의 서열을 포함하는 아데노바이러스)는 항체 회피를 위하여 세포 처리전 알부민 10mg/ml의 용액에서 4시간동안 4℃에서 결합반응을 시키고, HVR1-TBP 29aa(HVR1 영역에 서열번호 1의 트랜스페린 결합 도메인을 포함하는 5/3형 아데노바이러스), HVR1-(G4S1)3-TBP 55aa(HVR1 영역에 서열번호 3의 트랜스페린 결합 도메인 및 링커를 포함하는 5/3형 아데노바이러스)의 경우, 세포 처리전에 트랜스페린 1mg/ml의 용액에서 4시간동안 4℃에서 결합반응을 시켰다(CA10G는 5/3형 아데노바이러스). 이 후, 알부민 또는 트랜스페린과 반응시킨 바이러스(infectious units, IFU)를 세포수 대비 0, 5, 10, 20, 50, 100배 처리했고, 아데노바이러스 타입 5 항체(Abcam, ab6982)는 0.1ng/ml의 농도로 배양액에 처리하였다. 바이러스에 의한 세포사멸능의 정량적 결과를 얻기 위하여, 바이러스 처리 후, 72시간 후에 시그마사의 세포 분열키트(XTT assay kit)를 사용하였다. 또한, 바이러스의 의한 세포사멸능을 시각화하기 위하여, 바이러스 처리 후 72시간 후에 크리스탈바이올렛 시약을 사용하여 96-웰 플레이트를 염색하였다.It was confirmed whether the adenovirus containing the transferrin-binding domain prepared in Example 1 binds to transferrin in vivo to avoid antibody attack and kills cancer cells. Specifically, the lung cancer cell line A549 was seeded in 100ul at a rate of 1×10 4 cells per well in a 96-well plate. CA10G-A (control: type 5/3 adenovirus containing an albumin-binding moiety in the HVR1 region: adenovirus containing the sequence of SEQ ID NO: 12) was treated with 4 mg/ml albumin in a solution of 10 mg/ml before cell treatment to avoid antibodies. The binding reaction was performed at 4° C. for a period of time, and HVR1-TBP 29aa (type 5/3 adenovirus comprising the transferrin-binding domain of SEQ ID NO: 1 in the HVR1 region), HVR1-(G 4 S 1 ) 3 -TBP 55aa (HVR1 In the case of type 5/3 adenovirus comprising the transferrin-binding domain of SEQ ID NO: 3 and a linker in the region), the binding reaction was performed at 4° C. for 4 hours in a solution of 1 mg/ml of transferrin before cell treatment (CA10G is 5/3 adenovirus). Then, the virus (infectious units, IFU) reacted with albumin or transferrin was treated 0, 5, 10, 20, 50, 100 times compared to the number of cells, and the adenovirus type 5 antibody (Abcam, ab6982) was 0.1 ng/ml The culture medium was treated at a concentration of In order to obtain a quantitative result of the apoptotic ability by the virus, Sigma's cell division kit (XTT assay kit) was used 72 hours after the virus treatment. In addition, in order to visualize the apoptotic ability of the virus, the 96-well plate was stained using a crystal violet reagent 72 hours after the virus treatment.
이의 결과를 도 7 및 도 8에 나타내었다.The results are shown in Figures 7 and 8.
도 7 및 도 8에서 나타난 바와 같이, 50MOI에서 HVR1 Tbp(GAS1)3 55aa 바이러스가 CA10G-a보다 항체 회피능이 우수한 것을 확인하였다.As shown in Figures 7 and 8, it was confirmed that the HVR1 Tbp(GAS1)3 55aa virus at 50MOI had better antibody evasion than CA10G-a.

Claims (34)

  1. 헥손(hexon) 단백질의 과가변부(HVR)의 코딩 영역에 삽입된 트랜스페린 바인딩 모이어티를 코딩하는 서열을 포함하며, 상기 서열은 헥손 단백질과 트랜스페린 결합 모이어티를 포함하는 융합 단백질을 발현하는, 아데노바이러스 게놈.An adeno protein comprising a sequence encoding a transferrin binding moiety inserted into a coding region of a hypervariable region (HVR) of a hexon protein, wherein the sequence expresses a fusion protein comprising a hexon protein and a transferrin binding moiety. virus genome.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 헥손 단백질이 아데노바이러스의 캡시드로 조립될 때, 상기 트랜스페린 결합 모이어티가 상기 헥손 단백질의 외표면 상에 위치하게 되는 것을 특징으로 하는, 아데노바이러스 게놈.The adenovirus genome according to claim 1, characterized in that when the hexon protein is assembled into an adenovirus capsid, the transferrin binding moiety is located on the outer surface of the hexon protein.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 트랜스페린 결합 모이어티를 코딩하는 핵산을 아데노바이러스의 HVR1의 코딩 영역에 포함하는, 아데노바이러스 게놈.The adenovirus genome according to claim 1, wherein the nucleic acid encoding the transferrin binding moiety is included in the coding region of HVR1 of adenovirus.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 트랜스페린 결합 모이어티를 코딩하는 핵산이 서열번호 7로 표시되는 염기서열로 코딩된 헥손 단백질의 154번째 아미노산 (gaa, Glu) 및 155번째 아미노산 (gca, Asp)의 코돈 사이 위치에 삽입된 것인, 아데노바이러스 게놈.The method of claim 1, wherein the nucleic acid encoding the transferrin binding moiety is between the codons of the 154th amino acid (gaa, Glu) and the 155th amino acid (gca, Asp) of the hexon protein encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 Adenovirus genome, inserted in position.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 트랜스페린 결합 모이어티를 코딩하는 핵산은 서열번호 1로 표시되는 염기서열인 것인, 아데노바이러스 게놈.The adenovirus genome according to claim 1, wherein the nucleic acid encoding the transferrin binding moiety is the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 트랜스페린 결합 모이어티를 코딩하는 핵산은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 발현하는, 아데노바이러스 게놈.The adenovirus genome according to claim 1, wherein the nucleic acid encoding the transferrin binding moiety expresses the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 트랜스페린 결합 모이어티를 코딩하는 핵산은 서열번호 3으로 표시되는 염기서열인 것인, 아데노바이러스 게놈.The adenovirus genome according to claim 1, wherein the nucleic acid encoding the transferrin binding moiety is the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 트랜스페린 바인딩 모이어티를 코딩하는 핵산은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 발현하는 것인, 아데노바이러스 게놈.The adenovirus genome according to claim 1, wherein the nucleic acid encoding the transferrin binding moiety expresses the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 아데노바이러스가 인간 아데노바이러스인, 아데노바이러스 게놈.The adenovirus genome of claim 1 , wherein the adenovirus is a human adenovirus.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 인간 아데노바이러스가 인간 아데노바이러스 1 내지 57로 이루어진 군으로부터 선택되는 아데노바이러스 게놈. 10. The adenovirus genome of claim 9, wherein said human adenovirus is selected from the group consisting of human adenoviruses 1 to 57.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 인간 아데노바이러스가 인간 아데노바이러스 혈청형 5인 것인 아데노바이러스 게놈.11. The adenovirus genome of claim 10, wherein the human adenovirus is human adenovirus serotype 5.
  12. 제 10항에 있어서, 상기 인간 아데노바이러스가 인간 아데노바이러스 혈청형 5/3인 것인 아데노바이러스 게놈.11. The adenovirus genome of claim 10, wherein the human adenovirus is human adenovirus serotype 5/3.
  13. 제 1항에 있어서, 상기 트랜스페린-바인딩 모이어티의 N-말단 및/또는 C-말단이 링커서열을 통해 헥손 단백질과 연결되는, 아데노바이러스 게놈.The adenovirus genome according to claim 1, wherein the N-terminus and/or C-terminus of the transferrin-binding moiety is linked to the hexon protein through a linker sequence.
  14. 제 1항에 있어서, 상기 링커서열은 서열번호 5로 표시되는 것인, 아데노바이러스 게놈.The adenovirus genome according to claim 1, wherein the linker sequence is represented by SEQ ID NO: 5.
  15. 제 1항에 있어서, 상기 아데노바이러스 게놈이 조직-특이적 프로모터 또는 종양-특이적 프로모터를 더 포함하는, 아데노바이러스 게놈.The adenovirus genome of claim 1 , wherein the adenovirus genome further comprises a tissue-specific promoter or a tumor-specific promoter.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 프로모터는 아데노바이러스의 내재적 유전자를 조절하기 위한 프로모터인 것인, 아데노바이러스 게놈. The adenovirus genome according to claim 15, wherein the promoter is a promoter for regulating endogenous genes of adenovirus.
  17. 제16항에 있어서, 상기 아데노바이러스의 내재적 유전자는 5'ITR-C1-C2-C3-C4-C5 3'ITR의 구조를 가지며;The method of claim 16, wherein the endogenous gene of the adenovirus has a structure of 5'ITR-C1-C2-C3-C4-C5 3'ITR;
    상기 C1은 E1A, E1B 또는 E1A-E1B를 포함하고;C1 includes E1A, E1B or E1A-E1B;
    상기 C2는 E2B-L1-L2-L3-E2A-L4를 포함하며;C2 includes E2B-L1-L2-L3-E2A-L4;
    상기 C3는 E3가 포함하지 않거나 E3를 포함하고;C3 does not include E3 or includes E3;
    상기 C4는 L5를 포함하며; 및said C4 includes L5; and
    상기 C5는 E4를 포함하지 않거나 E4를 포함하는, 아데노바이러스 게놈. The C5 does not contain E4 or contains E4, the adenovirus genome.
  18. 제 16항에 있어서, 상기 프로모터가 아데노바이러스의 내재적 유전자의 E1A 및 E1B와 작동가능하게 연결된, 아데노바이러스 게놈. 17. The adenovirus genome of claim 16, wherein the promoter is operably linked to E1A and E1B of the endogenous adenovirus genes.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 E1A 및 E1B 사이에 IRES 서열이 추가로 포함된, 아데노바이러스 게놈. The adenovirus genome according to claim 18, further comprising an IRES sequence between the E1A and E1B.
  20. 제 16항에 있어서, 상기 프로모터가 E2F 프로모터, 텔로머라제 hTERT 프로모터, 티로시나제 프로모터, 전립선-특이 항원 프로모터, alpha-페토프로테인 프로모터 및 COX-2 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 아데노바이러스 게놈. 17. The adenovirus genome of claim 16, wherein the promoter is selected from the group consisting of E2F promoter, telomerase hTERT promoter, tyrosinase promoter, prostate-specific antigen promoter, alpha-fetoprotein promoter and COX-2 promoter.
  21. 제 1항에 있어서, 상기 외래 유전자를 발현하는 발현 카세트를 추가로 포함하는, 아데노바이러스 게놈.The adenovirus genome of claim 1 , further comprising an expression cassette expressing the foreign gene.
  22. 제 22항에 있어서, 상기 발현 카세트를 아데노바이러스의 내재적 유전자의 E3 부위에 포함하는, 아데노바이러스 게놈. 23. The adenovirus genome of claim 22, comprising the expression cassette in the E3 region of an endogenous adenovirus gene.
  23. 제 1항에 있어서, 상기 아데노바이러스는 항종양 아데노바이러스인 것인, 아데노바이러스 게놈.The adenovirus genome according to claim 1, wherein the adenovirus is an anti-tumor adenovirus.
  24. 제 1항에 있어서, 상기 아데노바이러스는 종양분해성 아데노바이러스 (oncolytic adenovirus)인, 아데노바이러스 게놈.The adenovirus genome of claim 1 , wherein the adenovirus is an oncolytic adenovirus.
  25. 제 1항에 있어서, 상기 아데노바이러스 게놈이 아데노바이러스의 감염성을 높이거나 또는 이를 종양 세포에 존재하는 수용체로 표적화하기 위한 캡시드 변형을 더 포함하는, 아데노바이러스 게놈2. The adenovirus genome of claim 1, wherein the adenovirus genome further comprises capsid modifications to increase the infectivity of the adenovirus or to target it to receptors present on tumor cells.
  26. 제 1항에 있어서, 상기 캡시드의 변형이 아데노바이러스 섬유 단백질의 H1 루프내 RGD 모티프의 삽입인 것인. 아데노바이러스 게놈.The method of claim 1, wherein the modification of the capsid is the insertion of the RGD motif in the H1 loop of the adenovirus fiber protein. Adenovirus genome.
  27. 제 16항 또는 제 17항에 있어서, 상기 캡시드의 변형이 상기 섬유 유전자의 부분을 다른 아데노바이러스 혈청형으로부터 유래된 상동적인 부분으로 치환하여, 키메라 아데노바이러스를 형성하는, 아데노바이러스 게놈.18. The adenovirus genome of claim 16 or 17, wherein the modification of the capsid replaces a portion of the fiber gene with a homologous portion derived from another adenovirus serotype, forming a chimeric adenovirus.
  28. 제 27항에 있어서, 상기 아데노바이러스는 상기 섬유 유전자의 부분은 제3형 아데노바이러스 혈청형으로부터 유래된 캡시드이고, 상기 섬유 유전자를 제외한 다른 부분은 5형 아데노바이러스로부터 유래된 것인, 아데노바이러스 게놈.28. The adenovirus genome according to claim 27, wherein a portion of the fiber gene is a capsid derived from type 3 adenovirus serotype, and a portion other than the fiber gene is derived from type 5 adenovirus. .
  29. 제 1항에 있어서, 상기 아데노바이러스 게놈이 상기 게놈에 삽입되는 하나 이상의 비-아데노바이러스성 유전자를 포함하는, 아데노바이러스 게놈.The adenoviral genome of claim 1 , wherein the adenoviral genome comprises one or more non-adenoviral genes inserted into the genome.
  30. 제 29항에 있어서, 상기 유전자가 암 유전자 치료에 사용되는 유전자인, 아데노바이러스 게놈.The adenovirus genome according to claim 29, wherein the gene is a gene used for cancer gene therapy.
  31. 제 30항에 있어서, 상기 암 유전자 치료에 사용되는 상기 유전자가 종양-억제인자 유전자, 항-종양성 간섭 RNA를 코딩하는 유전자 및 면역자극 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자인, 아데노바이러스 게놈.The adenovirus genome according to claim 30, wherein the gene used in the cancer gene therapy is a gene selected from the group consisting of a tumor-suppressor gene, a gene encoding an anti-tumor interfering RNA, and an immunostimulatory gene.
  32. 제1항 내지 32항 중 어느 한항에 따른 아데노바이러스 게놈을 가진 재조합 아데노바이러스.A recombinant adenovirus having an adenovirus genome according to any one of claims 1 to 32.
  33. 제 32항에 따른 재조합 아데노바이러스를 유효성분으로 포함하는 암치료용 약학적 조성물.A pharmaceutical composition for cancer treatment comprising the recombinant adenovirus according to claim 32 as an active ingredient.
  34. 제 33항에 있어서, 상기 아데노바이러스가 전신으로 투여되는 것인, 암치료용 약학적 조성물.The pharmaceutical composition for treating cancer according to claim 33, wherein the adenovirus is administered systemically.
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