WO2023074135A1 - 肺がんの予後の判定を補助する方法及び試薬キット - Google Patents

肺がんの予後の判定を補助する方法及び試薬キット Download PDF

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WO2023074135A1
WO2023074135A1 PCT/JP2022/033651 JP2022033651W WO2023074135A1 WO 2023074135 A1 WO2023074135 A1 WO 2023074135A1 JP 2022033651 W JP2022033651 W JP 2022033651W WO 2023074135 A1 WO2023074135 A1 WO 2023074135A1
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lung cancer
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直人 土屋
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国立研究開発法人国立がん研究センター
シスメックス株式会社
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer

Definitions

  • the present invention relates to a method for assisting prognosis determination of lung cancer.
  • the present invention relates to a reagent kit for use in that method.
  • Lung cancer is a malignant tumor that develops in the bronchi and alveoli. Lung cancer is known to cause a large number of deaths among cancers and to be prone to postoperative recurrence.
  • Adjuvant chemotherapy is applied after surgery for lung cancer patients to prevent recurrence and improve prognosis. However, the criteria for its application are not clear.
  • adjuvant chemotherapy is useful for lung cancer patients with high risk of recurrence, but it can be said to be excessive treatment for patients with low risk of recurrence. Therefore, it is necessary to appropriately evaluate the prognosis of lung cancer patients.
  • microRNAs also described as miRNAs or miRs
  • microRNAs have attracted attention as prognostic factors for cancer.
  • MicroRNAs are short non-coding RNAs of about 20 to 25 bases in length.
  • Patent Document 1 describes that miR-21 is highly expressed in lung cancer tissues than in non-cancer tissues.
  • multiple miRNAs including miR-21 are correlated with the survival rate of lung adenocarcinoma patients, and the prognosis of lung adenocarcinoma patients with high expression of any of these miRNAs is Significantly worse is described.
  • the present invention includes measuring miR-21C in a measurement sample prepared from a specimen of a lung cancer patient, and the expression level of miR-21C obtained by the measurement serves as a prognostic indicator for lung cancer prognosis. provide a way to assist
  • the present invention provides a lung cancer comprising a step of measuring miR-21C in a measurement sample prepared from a specimen of a lung cancer patient, and a step of determining the prognosis of lung cancer based on the expression level of miR-21C obtained by the measurement.
  • the present invention provides a reagent kit for use in the above method, which contains a primer set that specifically hybridizes to miR-21C-derived cDNA.
  • the prognosis of lung cancer can be determined.
  • FIG. 3 is a survival curve showing the overall survival (OS) of a group of lung cancer patients with high miR-21C measurements and a group of lung cancer patients with low miR-21C measurements.
  • FIG. 10 is a survival curve showing OS for a group of early-stage lung cancer patients with high miR-21C measurements and a group of early-stage lung cancer patients with low miR-21C measurements.
  • FIG. 10 is a survival curve showing OS for a group of lung cancer patients with high miR-21 measurements and a group of lung cancer patients with low miR-21 measurements.
  • FIG. 10 is a survival curve showing OS for a group of lung cancer patients with high miR-21 measurements and a group of lung cancer patients with low miR-21 measurements.
  • FIG. 10 is a survival curve showing OS for a group of early-stage lung cancer patients with high miR-21 measurements and a group of early-stage lung cancer patients with low miR-21 measurements.
  • Fig. 10 is a survival curve showing the recurrence-free survival (RFS) of a group of lung cancer patients with high miR-21C measurements and a group of lung cancer patients with low miR-21C measurements.
  • Figure 10 is a survival curve showing the RFS of a group of early stage lung cancer patients with high miR-21C measurements and a group of early stage lung cancer patients with low miR-21C measurements.
  • FIG. 10 is a survival curve showing RFS for a group of lung cancer patients with high miR-21 measurements and a group of lung cancer patients with low miR-21 measurements.
  • FIG. 10 is a survival curve showing RFS for a group of lung cancer patients with high miR-21 measurements and a group of lung cancer patients with low miR-21 measurements.
  • FIG. 10 is a survival curve showing RFS for a group of early stage lung cancer patients with high miR-21 measurements and a group of early stage lung cancer patients with low miR-21 measurements.
  • Fig. 10 shows survival curves showing RFS of a group of lung cancer patients with a high relative value of the measured value of miR-21C to the measured value of miR-21 and a group of lung cancer patients with a low relative value. It is a survival curve showing the RFS of the group of early-stage lung cancer patients with high relative values and the group of early-stage lung cancer patients with low relative values.
  • 1 is a survival curve showing the RFS of a group of lung cancer patients with a high dominance score (hereinafter also referred to as "D score") and a group of lung cancer patients with a low D score.
  • D score dominance score
  • FIG. 10 is a survival curve showing the RFS of a group of early lung cancer patients with a high D-score and a group of early-stage lung cancer patients with a low D-score.
  • FIG. 10 is a survival curve showing RFS of a group of well-differentiated lung cancer patients with high D-score and a group of well-differentiated lung cancer patients with low D-score.
  • FIG. It is a survival curve showing the RFS of the group of early-stage lung cancer patients with high relative values and the group of early-stage lung cancer patients with low relative values.
  • Fig. 2 is a survival curve showing RFS of a group of early lung cancer patients with p53 gene mutation and a group of early lung cancer patients without p53 gene mutation.
  • lung cancer prognosis is a concept that includes the patient's survival rate, the risk of lung cancer recurrence, and the time to recurrence or death after initial treatment for lung cancer.
  • Primary treatment refers to the first treatment received after being diagnosed with lung cancer.
  • prognosis of lung cancer is a concept that includes the survival rate after diagnosis, the period from diagnosis to death, and the like.
  • lung cancer recurrence is a concept encompassing metastasis of lung cancer.
  • “poor prognosis of lung cancer” means that there is a low possibility that the patient is alive or that the lung cancer has recurred after a predetermined period of time has passed since the initial treatment for lung cancer. means high.
  • “Good prognosis of lung cancer” means that the patient is likely to be alive and the likelihood of lung cancer recurrence is low after a predetermined period of time has passed since the initial treatment for lung cancer.
  • the predetermined period is not particularly limited, it may be, for example, 1 year, 2 years, 3 years, 4 years, 5 years, 6 years, 7 years, 8 years, 9 years or 10 years.
  • miR-21C is measured in a measurement sample prepared from a specimen of a lung cancer patient.
  • the type of lung cancer is not particularly limited, and may be, for example, adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, large cell carcinoma, or small cell carcinoma. Among them, it is more suitable for determining the prognosis of patients with adenocarcinoma.
  • the degree of differentiation of lung cancer is not particularly limited, and may be any of well-differentiated cancer, moderately-differentiated cancer, and poorly-differentiated cancer.
  • the stage of lung cancer is not particularly limited, and may be stage I (stage Ia or stage Ib), stage II (stage IIa or stage IIb), stage III (stage IIIa or stage IIIb), or stage IV. may On the other hand, lung cancer is already known to have a poor prognosis as the stage advances. Therefore, the method of the present embodiment is believed to be more useful for patients with early stage lung cancer, such as stage I or stage II lung cancer.
  • Lung cancer patients may be untreated patients at the time of collecting the specimens described below, or they may be patients who have undergone treatment.
  • the type of treatment is not particularly limited, and examples thereof include treatment methods such as surgery, radiation therapy, chemotherapy, and immunotherapy.
  • the therapeutic methods for lung cancer may be one type or a combination of two or more types.
  • the specimen is not particularly limited as long as it contains miRNA derived from lung cancer cells.
  • the specimen is preferably a biological sample collected from a lung cancer patient, and examples thereof include tissues, cells, blood, lymph, sputum, and bronchoalveolar lavage fluid. Among them, tissue, cells and blood are preferred.
  • the tissue comprises or is lung cancer tissue itself.
  • the cells comprise or are lung cancer cells themselves.
  • lung cancer tissue and lung cancer cells collected from lung cancer sites by surgery or biopsy can be used as specimens.
  • a culture obtained by culturing lung cancer tissue or lung cancer cells collected from a lung cancer patient may be used as a specimen. Plasma or serum prepared from blood by a conventional method may be used as a sample.
  • the sample may be stored under conditions that allow stable maintenance of RNA until the miRNA measurement described below.
  • specimens are stored frozen at -20°C or lower, preferably -80°C or lower.
  • tissue or cells may be preserved in a commercially available cell or tissue preservation solution. Examples of such a preservation solution include RNAlater® Stabilization Solution (Invitrogen).
  • RNAlater® Stabilization Solution Invitrogen
  • the tissue may be preserved as a formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) sample. That is, in the method of this embodiment, an FFPE sample can be used as a sample.
  • FFPE formalin-fixed paraffin-embedded
  • a measurement sample can be prepared, for example, by extracting RNA from a specimen of a lung cancer patient.
  • the measurement sample can be an RNA solution containing miRNA. Extraction of RNA from a specimen can be performed by a known method.
  • the specimen is a cell or tissue
  • RNA can be extracted, for example, as follows. First, a sample is mixed with a lysate containing guanidine thiocyanate and a surfactant. The resulting mixed solution is subjected to physical treatment (agitation, homogenization, ultrasonic disruption, etc.) to liberate RNA contained in the sample into the mixed solution. RNA can thus be extracted from the sample. The extracted RNA may be purified.
  • RNA can be purified by centrifuging a mixed solution containing RNA, collecting the supernatant, and extracting the supernatant with phenol/chloroform.
  • Commercially available reagents such as TRIzol (registered trademark) reagent and ISOGEN II (Nippon Gene Co., Ltd.) may be used as the lysate.
  • Commercially available reagent kits for extracting miRNA-containing total RNA such as miRNeasy (registered trademark) mini kit (QIAGEN) and High Pure miRNA Isolation kit (Roche), may also be used.
  • RNA extraction can be performed, for example, as follows. First, the FFPE sample is deparaffinized by adding xylene. The deparaffinized sample is immersed in ethanol for hydrophilization. RNA can be extracted from tissues in FFPE samples by treating the hydrophilized specimen with proteases to release formalin-crosslinked nucleic acids. Commercially available reagent kits for RNA extraction and purification from FFPE samples, such as the miRNeasy® FFPE kit (QIAGEN) may also be used.
  • QIAGEN miRNeasy® FFPE kit
  • the measurement sample may be prepared by reverse transcription of RNA extracted from lung cancer patient specimens.
  • the measurement sample can be a solution containing cDNA obtained by reverse transcription of RNA containing miRNA.
  • a measurement sample may be prepared by in vitro transcription (IVT) amplification of cDNA derived from a specimen.
  • the measurement sample can be a solution containing cRNA obtained by IVT amplification of cDNA synthesized from RNA containing miRNA.
  • miR-21C is a variant of miR-21 and has a nucleotide sequence with cytosine (C) added to the 3' end of the miR-21 nucleotide sequence.
  • C cytosine
  • miR-21C 5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGAC-3' (SEQ ID NO: 1) miR-21: 5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3' (SEQ ID NO: 2)
  • the method for measuring miR-21C is not particularly limited, and known methods can be used.
  • a measurement method using probe hybridization a measurement method using a nucleic acid amplification method, a measurement method using mass spectrometry, a measurement method using sequencing, and the like can be mentioned.
  • Measurement methods using probe hybridization include, for example, the microarray method, Northern hybridization method, RNase protection assay, and the like.
  • a measurement method using a nucleic acid amplification method quantitative PCR method using cDNA obtained by reverse transcription of miRNA as a template is preferable, and examples thereof include quantitative RT-PCR method and quantitative RT-LAMP method.
  • Quantitative RT-PCR methods include, for example, the SYBRTM Green method and the TaqMan® method. Since miRNA is a short chain, a stem-loop primer, a poly(A) addition method, or the like may be used in a method using a nucleic acid amplification method. In this embodiment, commercially available reagent kits for miRNA quantification such as TaqMan (registered trademark) MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) and TaqMan (registered trademark) MicroRNA assays (Applied Biosystems) may be used.
  • TaqMan registered trademark
  • MicroRNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems
  • TaqMan registered trademark
  • MicroRNA assays Applied Biosystems
  • miR-21C and miR-21 are measured.
  • miR-21C and miR-21 in a measurement sample can be distinguished and measured, for example, by appropriately designing the nucleotide sequences of primers and/or probes.
  • the expression level of miR-21C is a value that reflects the abundance of miR-21C in the measurement sample. For example, it is a value obtained by measuring miR-21C (hereinafter also referred to as "measured value of miR-21C").
  • Measured values of miR-21C include, for example, optical measurements, the number of reaction cycles (Ct value) or reaction time when the optical measurements reach a predetermined reference value, and quantitative values of miR-21C. .
  • Optical measurements include, for example, fluorescence intensity, turbidity, absorbance, and the like.
  • Quantitative values of miR-21C include, for example, copy number, mass, and concentration.
  • the predetermined reference value can be appropriately set depending on the type of value indicating the abundance or concentration of miR-21C.
  • the amount of change in fluorescence intensity when the nucleic acid amplification reaction exhibits logarithmic amplification can be set using a predetermined number of cycles as a reference value.
  • An endogenous control serving as an internal standard may also be measured, and the measured value of miR-21C may be normalized with the measured value of the endogenous control.
  • Endogenous controls include, for example, RNU48 small nuclear RNA (snRNA), RNU6B snRNA, TBP (TATA box binding protein) mRNA and the like.
  • the expression level of miR-21C may be a relative value of the measured value of miR-21C to the measured value of miR-21 (hereinafter also simply referred to as "relative value").
  • the expression level of miR-21C is a concept that includes values calculated based on the above-mentioned measured values or relative values of miR-21C within the scope of common general knowledge in the field. Specifically, powers or roots of the above values, values obtained by arithmetic operations between the above values and predetermined constants, and the like can be mentioned.
  • the expression level of miR-21C is the relative value of the measured value of miR-21C to the measured value of miR-21.
  • This relative value can be calculated by dividing the N-th power of the measured value of miR-21C by the measured value of miR-21, as shown in formula (I) below.
  • N is a positive integer, preferably 1 or 2.
  • the relative value obtained by formula (I) is also called D-score.
  • the measured value of miR-21C and miR-21 is the Ct value
  • it is calculated by introducing the value ( ⁇ Ct) obtained by subtracting the Ct value of miR-21 from the Ct value of miR-21C into the following formula (II).
  • ⁇ Ct the value obtained by subtracting the Ct value of miR-21 from the Ct value of miR-21C into the following formula (II).
  • a value calculated by the comparative Ct method also called the ⁇ Ct method
  • the value calculated by the comparative Ct method is the relative expression level of miR-21C based on the expression level of miR-21.
  • the comparative Ct method itself is known.
  • the overall survival rate of the patient group with high miR-21C expression was significantly better than the patient group with low miR-21C expression.
  • the recurrence-free survival rate of the patient group with high miR-21C expression tended to be significantly higher than that of the patient group with low miR-21C expression.
  • the expression level of miR-21C can serve as a prognostic indicator for lung cancer.
  • the prognosis of lung cancer is determined by comparing the expression level of miR-21C with a predetermined threshold. For example, when the expression level of miR-21C is equal to or higher than a predetermined threshold, it is suggested that the prognosis of lung cancer is poor. A favorable prognosis of lung cancer is suggested when the expression level of miR-21C is lower than a predetermined threshold.
  • the prognosis of lung cancer is determined by comparing the relative value of the measured value of miR-21C to the measured value of miR-21 and a predetermined threshold value corresponding to the relative value. For example, when the relative value is equal to or greater than a predetermined threshold corresponding to the relative value, it is suggested that the prognosis of lung cancer is poor. A good prognosis for lung cancer is suggested when the relative value is lower than a predetermined threshold corresponding to the relative value.
  • a method of another embodiment of the present invention provides a prognosis of lung cancer comprising the steps of measuring the expression level of miR-21C and determining the prognosis of lung cancer in lung cancer patients based on the expression level of miR-21C. It relates to a method for assisting the determination of The step of measuring the expression level of miR-21C is as described above.
  • the “miR-21C expression level” is as described above.
  • the prognosis of lung cancer in lung cancer patients is preferably determined based on the result of comparison between the expression level of miR-21C and a predetermined threshold value. Specifically, when the expression level of miR-21C is equal to or higher than a predetermined threshold, the prognosis of lung cancer is determined to be poor. When the expression level of miR-21C is lower than a predetermined threshold, the prognosis of lung cancer is determined to be good.
  • the predetermined threshold corresponding to the expression level of miR-21C is not particularly limited and can be set as appropriate.
  • specimens are collected from multiple lung cancer patients, and miR-21C and miR-21 in the measurement specimens are measured.
  • the patient's survival and recurrence of lung cancer are confirmed and recorded after a certain period of time (for example, 1 to 12 months) has passed from the date of sample collection.
  • a certain period of time for example, 1 to 12 months
  • miR-21C expression level data is divided into data from a group of patients with a good prognosis and data from a group of patients with a poor prognosis. classified into Then, a value that can distinguish these groups with the highest accuracy is obtained, and that value is set as a threshold value.
  • Sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value, etc. can be considered in setting the threshold.
  • Another embodiment of the invention relates to a method of treating lung cancer.
  • This treatment method includes the steps of measuring the expression level of miR-21C in a measurement sample prepared from a specimen of a lung cancer patient who has undergone lung cancer treatment, and determining the prognosis of lung cancer based on the expression level of miR-21C. and administering adjuvant chemotherapy to the lung cancer patient determined to have a poor prognosis for lung cancer.
  • the details of the measuring and judging steps are the same as those described for the method of this embodiment.
  • the drug itself used for adjuvant chemotherapy is known and can be determined appropriately according to the type and stage of lung cancer.
  • Such drugs include, for example, tegafur/uracil combination drugs, cisplatin, carboplatin, vinorelbine, docetaxel, paclitaxel, pemetrexed, vindesine, EGFR tyrosine kinase inhibitors, and the like.
  • One type of drug may be used, or two or more types may be used in combination.
  • FIG. 1A An example reagent kit is shown in FIG. 1A.
  • 11 indicates a reagent kit
  • 12 indicates a first container containing a primer set that specifically hybridizes to cDNA derived from miR-21C
  • 13 indicates a packing box
  • 14 indicates a packaging box. Show the package insert.
  • the package insert may describe the sequence of each primer, usage methods such as PCR conditions, storage methods, and the like.
  • the reagent kit of this embodiment may further include a reverse transcription primer (hereinafter also referred to as "RT primer").
  • RT primer a reverse transcription primer
  • the RT primer may be a random primer or a primer that specifically hybridizes to miR-21C. good.
  • cDNA synthesis from miRNA and cDNA amplification are performed in one step, ie, at the same time, a primer that specifically hybridizes to miR-21C is used as the RT primer.
  • the reagent kit of this embodiment may further include a primer set that specifically hybridizes to cDNA derived from miR-21.
  • the primer set consists of a forward primer and a reverse primer that specifically hybridize to cDNA derived from miR-21.
  • An example reagent kit is shown in FIG. 1B.
  • 21 indicates a reagent kit
  • 22 indicates a first container containing a primer set that specifically hybridizes to cDNA derived from miR-21C
  • 23 indicates a primer set specific for cDNA derived from miR-21.
  • 24 indicates a packing box
  • 25 indicates an insert.
  • the reagent kit of this embodiment contains a primer that specifically hybridizes to miR-21C as an RT primer
  • the reagent kit may further contain a primer that specifically hybridizes to miR-21.
  • each of the above primers can be appropriately designed according to each base sequence of miR-21C and miR-21. Since miR-21C and miR-21 are short in length, the RT primers and/or primer sets may be stem-loop primers. RT primers and/or primer sets may also be attached to a solid phase such as a plate, particle, or the like.
  • the reagent kit of this embodiment may further include a probe that specifically hybridizes to cDNA derived from miR-21C.
  • the reagent kit of the present embodiment may further include a probe that specifically hybridizes to cDNA derived from miR-21.
  • These probes are preferably modified at the 5' end with a fluorescent substance and at the 3' end with a quencher substance.
  • these probes are preferably designed to hybridize to a region in miR-21C- or miR-21-derived cDNA that is different from the region hybridized by the primer set described above. In a cDNA amplification method using such probes, amplification products can be detected quantitatively by detecting fluorescence generated from the probes.
  • target nucleic acid molecule is miR-21C, miR-21C-derived cDNA, miR-21, or miR-21-derived cDNA.
  • stringent conditions refer to conditions under which a target nucleic acid molecule can hybridize to a detectably greater degree (eg, at least two times greater than background) than nucleic acid molecules other than the target nucleic acid molecule. Stringent conditions are generally sequence-dependent and will be different in different circumstances. Generally, stringent conditions are selected to be about 5°C lower than the thermal melting point (Tm) for the specific sequence at a defined ionic strength and pH.
  • the Tm is the temperature at which 50% of the probes complementary to the base sequence of the target nucleic acid molecule hybridize in equilibrium under a defined ionic strength, pH and nucleic acid composition. Such conditions may be those used in known hybridization methods between polynucleotides.
  • the reagent kit of this embodiment may further contain DNA polymerase and/or reverse transcriptase.
  • DNA polymerases include Taq polymerase, Pfu polymerase, Tth polymerase and the like.
  • reverse transcriptase include AMV reverse transcriptase and MMLV reverse transcriptase.
  • the reagent kit of the present embodiment may further contain buffers, dNTPs (dATP, dTTP, dGTP and dCTP) and the like.
  • another embodiment of the present invention is the use of a primer set that specifically hybridizes to cDNA derived from miR-21C for the manufacture of a reagent kit for use in a method of assisting in determining the prognosis of lung cancer.
  • a further embodiment provides a primer set that specifically hybridizes to a miR-21C-derived cDNA and a miR-21-derived cDNA for the manufacture of a reagent kit for use in a method of aiding prognosis of lung cancer. is the use of primer sets that hybridize to . The details of the method, reagent kit and primer set for assisting prognosis of lung cancer are as described above.
  • Example 1 Lung cancer prognosis determination based on miR-21C measurements 1. Specimens Lung cancer tissues were collected from multiple lung cancer patients with different lung cancer classifications and stages. Written informed consent was obtained from each patient. Tumor aliquots were harvested from these patients at the time of surgery and stored in liquid nitrogen or RNAlater® Stabilization Solution (Invitrogen), respectively.
  • RNU48 snRNA, RNU6B snRNA or TBP mRNA were similarly measured. All PCRs were performed in triplicate using the Applied Biosystems ViiATM 7 Quantitative PCR System. Amplification conditions were 40 cycles of 95°C for 1 second and 60°C for 20 seconds.
  • Example 2 Determination of recurrence risk of lung adenocarcinoma based on miR-21C measurements 1. Specimens Lung adenocarcinoma tissues were collected from multiple lung adenocarcinoma patients with different disease stages. Written informed consent was obtained from each patient. Tumor aliquots were harvested at the time of surgery from these patients and either cryopreserved in liquid nitrogen or preserved in RNAlater® Stabilization Solution (Invitrogen).
  • Example 2 Quantitative RT-PCR and Analysis Reverse transcription and quantitative RT-PCR were performed in the same manner as in Example 1 using total RNA extracted from the collected tissue. The obtained miR-21C and miR-21 measurement data were statistically analyzed using Prism (GraphPad) in the same manner as in Example 1. As in Example 1, lung adenocarcinoma patients were classified based on miR-21C and miR-21 measurements. Survival curves for recurrence-free survival (RFS) of patients in each group were constructed. Survival curves for RFS for each group of patients with stage I and II lung adenocarcinoma were also generated. Differences in RFS were evaluated with the log-rank test. A p-value less than 0.05 (p ⁇ 0.05) was considered statistically significant.
  • RFS recurrence-free survival
  • Example 3 Determination of recurrence risk of lung cancer based on the relative value of miR-21C measurement value to miR-21 measurement value1.
  • Samples and Analysis Using the measurement data of lung cancer tissue samples in Example 1, relative values were calculated by the comparative Ct method based on the difference in Ct values at the same threshold. Specifically, it was as follows. First, the Ct values of miR-21C, miR-21 and internal control were calculated with threshold 1.5. The Ct values of miR-21C and miR-21 were then normalized by subtracting the Ct value of the internal control from the respective Ct values of miR-21C and miR-21. Then, the value ( ⁇ Ct) obtained by subtracting the standardized Ct value of miR-21 from the standardized Ct value of miR-21C was introduced into the following formula to calculate the relative value.
  • results survival curves generated are shown in FIGS. 4A and 4B.
  • the miR-21C/miR-21 low group tended to have significantly higher RFS than the miR-21C/miR-21 high group. That is, it was suggested that the higher the relative value, the higher the recurrence risk, and the lower the relative value, the lower the recurrence risk.
  • FIG. 4B in early stage (stage I and II) lung cancer, the difference in RFS between the miR-21C/miR-21 high group and the miR-21C/miR-21 low group was significant. became. Thus, it was suggested that determination of recurrence risk based on relative values is more suitable for early-stage lung cancer.
  • Example 4 Determination of recurrence risk of lung adenocarcinoma based on D score 1. Specimens and Analysis Measurement data of lung adenocarcinoma tissue specimens of Example 2 were used. Specifically, using the measured values of miR-21C and miR-21, the D score was calculated according to the following formula.
  • results survival curves generated are shown in FIGS. 5A-5C.
  • FIG. 5A it was shown that the RFS tended to be significantly higher in the Low group than in the High group. That is, it was suggested that the higher the D score, the higher the recurrence risk, and the lower the D score, the lower the recurrence risk.
  • Similar results were also obtained in early stage (stage I and II) lung cancer, as shown in FIG. 5B. Differences in RFS between the High and Low groups were significant with p-values less than 0.0001, both at all stages and early. That is, it was suggested that the recurrence risk can be determined with extremely high accuracy by using the D score.
  • Example 5 Comparison with existing prognostic predictor p53 gene mutation 1. Specimens Lung cancer tissues were collected from patients different from the lung cancer patients in Example 1 and either cryopreserved in liquid nitrogen or preserved in RNAlater® Stabilization Solution (Invitrogen).
  • Results Survival curves generated are shown in Figures 6A and 6B.
  • the miR-21C/miR-21 low group tended to have significantly higher RFS than the miR-21C/miR-21 high group.
  • FIG. 6B no significant difference in RFS was observed between the p53 WT group and the p53 MUT group classified based on the presence or absence of p53 gene mutation.
  • determination of recurrence risk based on the relative value of measured miR-21C to measured value of miR-21 was shown to be more accurate than determination based on p53 gene mutation.

Abstract

本発明は、肺がん患者の検体から調製した測定試料におけるmiR-21Cを測定することを含み、測定により取得されたmiR-21Cの発現量が、肺がんの予後の指標となる、肺がんの予後の判定を補助する方法に関する。また、本発明は、その方法に用いられる試薬キットに関する。

Description

肺がんの予後の判定を補助する方法及び試薬キット
　本発明は、肺がんの予後の判定を補助する方法に関する。本発明は、その方法に用いられる試薬キットに関する。
　肺がんは、気管支や肺胞に発生する悪性腫瘍である。肺がんは、がんの中でも死亡者数が多く、且つ術後再発しやすいことが知られている。再発の防止及び予後の改善のため、肺がん患者には、手術後に補助化学療法が適用される。しかし、その適用の基準は明確とはいえない。また、補助化学療法は、再発リスクの高い肺がん患者には有用であるが、再発リスクの低い患者にとっては過剰な治療といえる。そのため、肺がん患者の予後を適切に評価することが必要となる。
　近年、がんの予後因子として、マイクロRNA(miRNA又はmiRとも記載される)が注目されている。マイクロRNAとは、20～25塩基程度の短い鎖長の非コーディングRNAである。例えば、特許文献１には、miR-21は、非がん組織よりも肺がん組織において高発現していることが記載されている。また、特許文献１には、miR-21を含む複数のmiRNAが、肺腺がん患者の生存率と相関し、それらのmiRNAのいずれかが高発現している肺腺がん患者の予後は有意に悪いことが記載されている。
米国特許第8,361,710号明細書
　現在のところ、肺がんの予後に関連するバイオマーカーはまだ少ない。そのため、肺がんの予後を判定するための新規バイオマーカーのさらなる開発が望まれている。
　本発明者は、肺がん患者のがん組織において、miR-21のバリアントであるmiR-21Cの発現量が高いほど、予後が不良であることを見出した。そして、本発明者は、miR-21Cの発現量に基づいて、肺がんの予後を予測できることを見出して、本発明を完成させた。
　本発明は、肺がん患者の検体から調製した測定試料におけるmiR-21Cを測定することを含み、測定により取得されたmiR-21Cの発現量が、肺がんの予後の指標となる、肺がんの予後の判定を補助する方法を提供する。
　本発明は、肺がん患者の検体から調製した測定試料におけるmiR-21Cを測定する工程と、測定により取得されたmiR-21Cの発現量に基づいて、肺がんの予後を判定する工程とを含む、肺がんの予後の判定を補助する方法を提供する。
　本発明は、miR-21C由来のcDNAに特異的にハイブリダイズするプライマーセットを含む、上記の方法に用いられる試薬キットを提供する。
　本発明によれば、肺がんの予後を判定することができる。
本実施形態の試薬キットの一例を示す概略図である。 本実施形態の試薬キットの一例を示す概略図である。 miR-21Cの測定値が高い肺がん患者の群と、miR-21Cの測定値が低い肺がん患者の群の全生存率(OS)を示す生存曲線である。 miR-21Cの測定値が高い早期肺がん患者の群と、miR-21Cの測定値が低い早期肺がん患者の群のOSを示す生存曲線である。 miR-21の測定値が高い肺がん患者の群と、miR-21の測定値が低い肺がん患者の群のOSを示す生存曲線である。 miR-21の測定値が高い早期肺がん患者の群と、miR-21の測定値が低い早期肺がん患者の群のOSを示す生存曲線である。 miR-21Cの測定値が高い肺がん患者の群と、miR-21Cの測定値が低い肺がん患者の群の無再発生存率(RFS)を示す生存曲線である。 miR-21Cの測定値が高い早期肺がん患者の群と、miR-21Cの測定値が低い早期肺がん患者の群のRFSを示す生存曲線である。 miR-21の測定値が高い肺がん患者の群と、miR-21の測定値が低い肺がん患者の群のRFSを示す生存曲線である。 miR-21の測定値が高い早期肺がん患者の群と、miR-21の測定値が低い早期肺がん患者の群のRFSを示す生存曲線である。 miR-21Cの測定値のmiR-21の測定値に対する相対値が高い肺がん患者の群と、当該相対値が低い肺がん患者の群のRFSを示す生存曲線である。 上記の相対値が高い早期肺がん患者の群と、当該相対値が低い早期肺がん患者の群のRFSを示す生存曲線である。 ドミナンス・スコア(以下、「Ｄスコア」ともいう)が高い肺がん患者の群と、Ｄスコアが低い肺がん患者の群のRFSを示す生存曲線である。 Ｄスコアが高い早期肺がん患者の群と、Ｄスコアが低い早期肺がん患者の群のRFSを示す生存曲線である。 Ｄスコアが高い高分化肺がん患者の群と、Ｄスコアが低い高分化肺がん患者の群のRFSを示す生存曲線である。 上記の相対値が高い早期肺がん患者の群と、当該相対値が低い早期肺がん患者の群のRFSを示す生存曲線である。 p53遺伝子の変異を有する早期肺がん患者の群と、p53遺伝子の変異がない早期肺がん患者の群のRFSを示す生存曲線である。
　本明細書において、「肺がんの予後」とは、肺がんの初期治療後における、患者の生存率、肺がんの再発リスク、及び再発又は死亡までの期間を包含する概念である。「初期治療」とは、肺がんと診断された後、最初に受ける治療をいう。また、手術できないステージの肺がんの場合は、「肺がんの予後」は、診断後の生存率、診断から死亡までの期間などを包含する概念である。「肺がんの再発」は、肺がんの転移を包含する概念である。本実施形態では、「肺がんの予後が不良」とは、肺がんの初期治療から所定の期間が経過したときに、患者が生存している可能性が低いこと又は肺がんが再発している可能性が高いことを指す。「肺がんの予後が良好」とは、肺がんの初期治療から所定の期間が経過したときに、患者が生存している可能性が高く、且つ肺がんが再発している可能性が低いことを指す。所定の期間は特に限定されないが、例えば１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年又は10年であり得る。
　本実施形態の肺がんの予後の判定を補助する方法(以下、単に「本実施形態の方法」ともいう)では、肺がん患者の検体から調製した測定試料におけるmiR-21Cを測定する。
　肺がんの種類は特に限定されず、例えば腺がん、扁平上皮がん、大細胞がん及び小細胞がんのいずれであってもよい。それらの中でも、腺がんの患者の予後の判定により適している。肺がんの分化度は特に限定されず、高分化がん、中分化がん及び低分化がんのいずれであってもよい。肺がんの病期(ステージ)は特に限定されず、例えばＩ期(Ia期又はIb期)、II期(IIa期又はIIb期)、III期(IIIa期又はIIIb期)及びIV期のいずれであってもよい。一方で、肺がんは、ステージが進むほど予後不良であることが既に知られている。よって、本実施形態の方法は、早期肺がん、例えばＩ期又はII期の肺がんの患者にとって、より有用であると考えられる。
　肺がん患者は、後述の検体を採取する時点において未治療の患者であってもよいし、治療を受けた患者であってもよい。治療の種類は特に限定されず、例えば外科手術、放射線療法、化学療法、免疫療法などの治療法が挙げられる。肺がんの治療法は、１種でもよいし、２種以上の組み合わせでもよい。
　検体は、肺がん細胞由来のmiRNAを含むかぎり、特に限定されない。検体は、肺がん患者から採取された生体試料が好ましく、例えば組織、細胞、血液、リンパ液、喀痰、気管支肺胞洗浄液などが挙げられる。それらの中でも、組織、細胞及び血液が好ましい。組織は、肺がん組織を含むか又は肺がん組織そのものであることが好ましい。細胞は、肺がん細胞を含むか又は肺がん細胞そのものであることが好ましい。例えば、手術又は生検により、肺がんの発生部位から採取した肺がん組織及び肺がん細胞を、検体として用いることができる。肺がん患者から採取した肺がん組織又は肺がん細胞を培養して得られた培養物を、検体として用いてもよい。常法により血液から調製した血漿又は血清を、検体として用いてもよい。
　検体は、後述のmiRNA測定まで、RNAを安定に維持できる条件下で保存されてもよい。例えば、検体は－20℃以下、好ましくは－80℃以下で凍結保存される。検体が、被検者から採取された組織又は細胞である場合、当該組織又は細胞は、市販の細胞又は組織の保存液中に保存されてもよい。そのような保存液として、例えばRNAlater(登録商標)Stabilization Solution(Invitrogen社)が挙げられる。検体が、被検者から採取された組織である場合、当該組織は、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料として保存されてもよい。すなわち、本実施形態の方法では、検体としてFFPE試料を用いることができる。
　測定試料は、例えば、肺がん患者の検体からRNAを抽出することにより調製できる。例えば、測定試料は、miRNAを含むRNA溶液であり得る。検体からのRNAの抽出は公知の方法により行うことができる。検体が細胞又は組織である場合、RNAの抽出は、例えば次にようにして行うことができる。まず、検体と、チオシアン酸グアニジン及び界面活性剤を含む可溶化液とを混合する。得られた混合液に物理的処理(撹拌、ホモジナイズ、超音波破砕など)を行い、検体に含まれるRNAを該混合液中に遊離させる。これにより、検体からRNAを抽出できる。抽出したRNAを精製してもよい。例えば、RNAを含む混合液を遠心分離して上清を回収し、この上清をフェノール／クロロホルム抽出することにより、RNAを精製できる。上記の可溶化液として、TRIzol(登録商標)試薬、ISOGEN II(株式会社ニッポンジーン)などの市販の試薬を用いてもよい。miRNeasy(登録商標)ミニキット(QIAGEN社)やHigh Pure miRNA Isolationキット(Roche社)などのmiRNA含有トータルRNAを抽出するための市販の試薬キットを用いてもよい。
　検体がFFPE試料である場合、RNAの抽出は、例えば次にようにして行うことができる。まず、FFPE試料にキシレンを添加して、脱パラフィン処理をする。脱パラフィン処理した試料をエタノールに浸して、親水化処理をする。親水化処理した検体をプロテアーゼで処理して、ホルマリンで架橋された核酸を放出させることにより、FFPE試料中の組織からRNAを抽出できる。miRNeasy(登録商標) FFPEキット(QIAGEN社)などの、FFPE試料からRNA抽出及び精製をするための市販の試薬キットを用いてもよい。
　測定試料は、肺がん患者の検体から抽出したRNAを逆転写することにより調製してもよい。例えば、測定試料は、miRNAを含むRNAを逆転写して得られるcDNAを含む溶液であり得る。また、測定試料は、検体由来のcDNAをインビトロ転写(IVT)増幅することにより調製してもよい。例えば、測定試料は、miRNAを含むRNAから合成したcDNAをIVT増幅して得られるcRNAを含む溶液であり得る。
　miR-21Cは、miR-21のバリアントであり、miR-21の塩基配列の3’末端にシトシン(Ｃ)が付加された塩基配列を有する。miR-21C及びmiR-21の塩基配列は、下記のとおりである。
miR-21C：5’- UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGAC -3’ (配列番号１)
miR-21 ：5’- UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA -3’  (配列番号２)
　miR-21Cを測定する方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、プローブのハイブリダイゼーションを利用した測定法、核酸増幅法を利用した測定法、質量分析法を利用した測定法、シークエンシングを利用した測定法などが挙げられる。プローブのハイブリダイゼーションを利用した測定法としては、例えばマイクロアレイ法、ノーザンハイブリダイゼーション法、RNaseプロテクションアッセイなどが挙げられる。核酸増幅法を利用した測定法としては、miRNAを逆転写して得たcDNAを鋳型として用いる定量的PCR方が好ましく、例えば定量的RT-PCR法、定量的RT-LAMP法などが挙げられる。定量的RT-PCR法としては、例えばSYBR(商標)Green法、TaqMan(登録商標)法などが挙げられる。miRNAは短鎖であるので、核酸増幅法を利用した方法においては、ステムループプライマー、poly(A)付加法などを用いてもよい。本実施形態では、TaqMan(登録商標) MicroRNA逆転写キット(Applied Biosystems社)及びTaqMan(登録商標) MicroRNA assays(Applied Biosystems社)などの市販のmiRNA定量用試薬キットを用いてもよい。
　miR-21Cの測定値のmiR-21の測定値に対する相対値を算出する場合は、miR-21C及びmiR-21が測定される。当該技術分野では、例えば、プライマー及び／又はプローブの塩基配列を適切に設計することで、測定試料中のmiR-21CとmiR-21とを区別して測定することができる。
　miR-21Cの発現量は、測定試料中のmiR-21Cの存在量を反映する値である。例えば、miR-21Cの測定によって取得される値(以下、「miR-21Cの測定値」ともいう)である。miR-21Cの測定値としては、例えば光学的測定値、光学的測定値が所定の基準値に達したときの反応サイクル数(Ct値)又は反応時間、miR-21Cの定量値などが挙げられる。光学的測定値としては、例えば蛍光強度、濁度、吸光度などが挙げられる。miR-21Cの定量値としては、例えばコピー数、質量、濃度などが挙げられる。所定の基準値は、miR-21Cの存在量又は濃度を示す値の種類によって適宜設定できる。例えば、定量的RT-PCR法を用いる場合、所定のサイクル数を基準値として、核酸増幅反応が対数増幅を示すときの蛍光強度の変化量を設定できる。内部標準となる内在性コントロールについても測定し、内在性コントロールの測定値でmiR-21Cの測定値を標準化してもよい。内在性コントロールとしては、例えばRNU48核内低分子RNA(snRNA)、RNU6B snRNA、TBP(TATAボックス結合タンパク質) mRNAなどが挙げられる。miR-21Cの発現量は、miR-21Cの測定値のmiR-21の測定値に対する相対値(以下、単に「相対値」ともいう)であってもよい。miR-21Cの発現量は、当該分野の技術常識の範囲内で上記のmiR-21Cの測定値又は相対値に基づいて算出される値を包含する概念である。具体的には、上記の値の累乗又は累乗根、上記の値と所定の定数との四則演算により得られる値などが挙げられる。
　好ましくは、miR-21Cの発現量は、miR-21Cの測定値のmiR-21の測定値に対する相対値である。この相対値は、下記の式(I)に示すように、miR-21Cの測定値のＮ乗をmiR-21の測定値で除することにより算出することができる。式(I)中、Ｎは正の整数であり、好ましくは１又は２である。Ｎが２であるとき、式(I)により取得される相対値は、Ｄスコアとも呼ばれる。
(相対値)＝(miR-21Cの測定値)N/(miR-21の測定値)　・・・式(I)
　miR-21C及びmiR-21の測定値がCt値である場合、miR-21CのCt値からmiR-21のCt値を差し引いた値(ΔCt)を下記の式(II)に導入して算出される値を、miR-21Cの測定値のmiR-21の測定値に対する相対値として用いてもよい。あるいは、比較Ct法(ΔΔCt法とも呼ばれる)により算出される値を、相対値として用いてもよい。比較Ct法により算出される値は、miR-21の発現量を基準とするmiR-21Cの相対的発現量である。比較Ct法自体は公知である。
(相対値)＝2^-(ΔCt)　・・・式(II)
　後述の実施例に示されるように、miR-21Cの発現量が高かった患者群の全生存率は、miR-21Cの発現量が低かった患者群に比べて、有意に良好であった。また、後述の実施例では、miR-21Cの発現量が高かった患者群の無再発生存率は、miR-21Cの発現量が低かった患者群に比べて、有意に高い傾向にあった。このように、miR-21Cの発現量は、肺がんの予後の指標となり得る。
　好ましくは、miR-21Cの発現量と、所定の閾値とを比較することにより、肺がんの予後を判定する。例えば、miR-21Cの発現量が所定の閾値以上であるとき、肺がんの予後が不良であることが示唆される。miR-21Cの発現量が所定の閾値より低いとき、肺がんの予後が良好であることが示唆される。
　好ましくは、miR-21Cの測定値のmiR-21の測定値に対する相対値と、当該相対値に対応する所定の閾値とを比較することにより、肺がんの予後を判定する。例えば、相対値が、相対値に対応する所定の閾値以上であるとき、肺がんの予後が不良であることが示唆される。相対値が、相対値に対応する所定の閾値より低いとき、肺がんの予後が良好であることが示唆される。
　本発明の別の実施形態の方法は、miR-21Cの発現量を測定する工程と、miR-21Cの発現量に基づいて、肺がん患者の肺がんの予後を判定する工程とを含む、肺がんの予後の判定を補助する方法に関する。miR-21Cの発現量を測定する工程については、上述のとおりである。「miR-21Cの発現量」については、上述のとおりである。判定工程においては、好ましくは、miR-21Cの発現量と、所定の閾値との比較結果に基づいて、肺がん患者の肺がんの予後を判定する。具体的には、miR-21Cの発現量が所定の閾値以上であるとき、肺がんの予後は不良であると判定する。miR-21Cの発現量が所定の閾値より低いとき、肺がんの予後は良好であると判定する。
　miR-21Cの発現量に対応する所定の閾値は特に限定されず、適宜設定できる。例えば、複数の肺がん患者から検体を採取し、測定試料中のmiR-21C及びmiR-21を測定する。検体を採取した日から一定の期間(例えば１ヶ月～12ヶ月)が経過するごとに、当該患者の生存及び肺がんの再発を確認して記録する。このような記録を、例えば２年～15年間継続して行い、miR-21Cの発現量のデータを、予後が良好であった患者群のデータと、予後が不良であった患者群のデータとに分類する。そして、これらの群を最も精度よく区別可能な値を求め、その値を閾値として設定する。閾値の設定においては、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率などを考慮することができる。
　本発明の別の実施形態は、肺がんの治療方法に関する。この治療方法は、肺がんの治療を受けた肺がん患者の検体から調製した測定試料におけるmiR-21Cの発現量を測定する工程と、miR-21Cの発現量に基づいて、肺がんの予後を判定する工程と、肺がんの予後が不良と判定された前記肺がん患者に、補助化学療法を行う工程とを含む。測定する工程及び判定する工程の詳細は、本実施形態の方法について述べたことと同じである。
　補助化学療法に用いられる薬剤自体は公知であり、肺がんの種類やステージに応じて適宜決定できる。そのような薬剤としては、例えばテガフール・ウラシル配合剤、シスプラチン、カルボプラチン、ビノレルビン、ドセタキセル、パクリタキセル、ペメトレキセド、ビンデシン、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤などが挙げられる。薬剤は１種でもよいし、２種以上を組み合わせてもよい。
　本発明の別の実施形態は、試薬キット(以下、「本実施形態の試薬キット」という)に関する。この試薬キットは、miR-21C由来のcDNAに特異的にハイブリダイズするプライマーセットを含む。当該プライマーセットは、miR-21C由来のcDNAに特異的にハイブリダイズするフォワードプライマー及びリバースプライマーからなる。試薬キットの一例を図１Ａに示す。図１Ａにおいて、１１は、試薬キットを示し、１２は、miR-21C由来のcDNAに特異的にハイブリダイズするプライマーセットを収容した第１容器を示し、１３は、梱包箱を示し、１４は、添付文書を示す。添付文書には、各プライマーの配列、PCR条件などの使用方法、保存方法などが記載されてもよい。
　本実施形態の試薬キットは、逆転写用プライマー(以下、「RTプライマー」ともいう)をさらに含んでもよい。miRNAからのcDNAの合成と、cDNAの増幅とを２ステップで、すなわち逐次行う場合、RTプライマーは、ランダムプライマーであってもよいし、miR-21Cに特異的にハイブリダイズするプライマーであってもよい。miRNAからのcDNAの合成と、cDNAの増幅とを１ステップで、すなわち同時に行う場合、RTプライマーとして、miR-21Cに特異的にハイブリダイズするプライマーを用いる。
　本実施形態の試薬キットは、miR-21由来のcDNAに特異的にハイブリダイズするプライマーセットをさらに含んでもよい。当該プライマーセットは、miR-21由来のcDNAに特異的にハイブリダイズするフォワードプライマー及びリバースプライマーからなる。試薬キットの一例を図１Ｂに示す。図１Ｂにおいて、２１は、試薬キットを示し、２２は、miR-21C由来のcDNAに特異的にハイブリダイズするプライマーセットを収容した第１容器を示し、２３は、miR-21由来のcDNAに特異的にハイブリダイズするプライマーセットを収容した第２容器を示し、２４は、梱包箱を示し、２５は、添付文書を示す。
　本実施形態の試薬キットが、RTプライマーとして、miR-21Cに特異的にハイブリダイズするプライマーを含む場合、当該試薬キットは、miR-21に特異的にハイブリダイズするプライマーをさらに含んでもよい。
　上記の各プライマーは、miR-21C及びmiR-21の各塩基配列に応じて適宜設計できる。miR-21C及びmiR-21は鎖長が短いので、RTプライマー及び／又はプライマーセットは、ステムループプライマーであってもよい。また、RTプライマー及び／又はプライマーセットは、プレート、粒子などの固相に結合されていてもよい。
　本実施形態の試薬キットは、miR-21C由来のcDNAに特異的にハイブリダイズするプローブをさらに含んでもよい。また、本実施形態の試薬キットは、miR-21由来のcDNAに特異的にハイブリダイズするプローブをさらに含んでもよい。これらのプローブは、5'末端が蛍光物質で修飾され、且つ3'末端がクエンチャー物質で修飾されることが好ましい。また、これらのプローブは、miR-21C又はmiR-21由来のcDNAにおいて、上記のプライマーセットがハイブリダイズする領域とは異なる領域にハイブリダイズするように設計されることが好ましい。このようなプローブを用いるcDNAの増幅法では、該プローブから生じた蛍光を検出することにより、増幅産物を定量的に検出できる。
　本明細書において、「特異的にハイブリダイズできる」とは、プライマー又はプローブがストリンジェントな条件下で、標的核酸分子にハイブリダイズできることを意味する。本実施形態では、標的核酸分子は、miR-21C、miR-21C由来のcDNA、miR-21、又はmiR-21由来のcDNAである。「ストリンジェントな条件」とは、標的核酸分子に、当該標的核酸分子以外の核酸分子よりも検出可能に大きい程度(例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍を超える)でハイブリダイズできる条件をいう。ストリンジェントな条件は、通常、配列依存性であり、種々の環境において異なる。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度及びpHでの特定の配列の熱的融点(thermal melting point：Tm)よりも、約５℃低くなるように選択される。このTmは、規定されたイオン強度、pH及び核酸組成の下で標的核酸分子の塩基配列と相補的なプローブの50%が平衡してハイブリダイズする温度である。このような条件は、公知のポリヌクレオチド同士のハイブリダイゼーション法に用いられる条件であればよい。
　本実施形態の試薬キットは、DNAポリメラーゼ及び／又は逆転写酵素をさらに含んでもよい。DNAポリメラーゼとしては、例えばTaqポリメラーゼ、Pfuポリメラーゼ、Tthポリメラーゼなどが挙げられる。逆転写酵素としては、例えばAMV逆転写酵素、MMLV逆転写酵素などが挙げられる。本実施形態の試薬キットは、緩衝液、dNTPs(dATP、dTTP、dGTP及びdCTP)などをさらに含んでいてもよい。
　上記のプライマーセットは、本実施形態の試薬キットの製造のために使用されるとも言える。すなわち、本発明の別の実施形態は、肺がんの予後の判定を補助する方法に用いられる試薬キットの製造のための、miR-21C由来のcDNAに特異的にハイブリダイズするプライマーセットの使用である。さらなる実施形態は、肺がんの予後の判定を補助する方法に用いられる試薬キットの製造のための、miR-21C由来のcDNAに特異的にハイブリダイズするプライマーセット及びmiR-21由来のcDNAに特異的にハイブリダイズするプライマーセットの使用である。肺がんの予後の判定を補助する方法、試薬キット及びプライマーセットの詳細は、上記のとおりである。
　以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：miR-21Cの測定値に基づく肺がんの予後の判定
１．検体
　肺がんの分類及び病期の異なる複数の肺がん患者から、肺がん組織を採取した。各患者からは、文書によりインフォームドコンセントを得た。これらの患者の手術時に腫瘍の一部を採取し、それぞれ液体窒素中又はRNAlater(登録商標) Stabilization Solution(Invitrogen社)中に保存した。
２．定量的RT-PCR
　TRIzol(登録商標)試薬(Invitrogen社)を用いて、採取した組織からトータルRNAを抽出した。Qubit(商標) RNA HSアッセイキット(Invitrogen社)を用いて、得られたトータルRNAを定量した。RNAの抽出及び定量は、試薬及びキットの添付文書に従って行った。TaqMan(登録商標) MicroRNA逆転写キット(Applied Biosystems社)を用いて、10 ngのトータルRNAを逆転写した。得られたcDNAを鋳型として、TaqMan(登録商標)ファスト・アドバンスド・マスターミックス(Applied Biosystems社)及びTaqMan(登録商標) MicroRNA assays(Applied Biosystems社)を用いて定量的PCRを行って、miR-21C及びmiR-21を測定した。内部コントロールとして、RNU48 snRNA、RNU6B snRNA又はTBP mRNAも同様に測定した。すべてのPCRは、Applied Biosystems ViiA(商標)7定量的PCRシステムを用いて、トリプリケートで行った。増幅の条件は、95℃で１秒及び60℃で20秒を40サイクルであった。
３．解析
　統計解析は、医療統計解析ソフトPrism(GraphPad社)を用いて行った。miR-21Cの測定値が所定の閾値以上であった患者を「miR-21C exp. high」群に分類し、miR-21Cの測定値が所定の閾値未満であった患者を「miR-21C exp. low」群に分類した。同様に、miR-21の測定値が所定の閾値以上であった患者を「miR-21 exp. high」群に分類し、miR-21の測定値が所定の閾値未満であった患者を「miR-21 exp. low」群に分類した。測定値の差は、スチューデントのｔ検定により評価した。各群の患者の全生存率(OS)についての生存曲線を作成した。また、ステージI及びIIの肺がんである各群の患者のOSについての生存曲線も作成した。OSの差は、ログランク検定で評価した。p値が0.05未満(p<0.05)である場合を統計的に有意とした。
４．結果
　作成した生存曲線を図２Ａ～図２Ｄに示す。図２Ａに示されるように、miR-21C exp. high群に比べてmiR-21C exp. low群の方が、OSが有意に高い傾向にあることが示された。すなわち、miR-21Cの発現量が高いほど予後が悪く、発現量が低いほど予後がよいことが示唆された。また、図２Ｂに示されるように、早期(ステージI及びII)の肺がんでは、miR-21C exp. high群とmiR-21C exp. low群との間のOSの差が顕著になった。この結果から、早期の肺がんの場合は、miR-21Cの測定値に基づいて、より精度の高い予後の判定が可能であることが示唆された。
　一方、図２Ｃに示されるように、miR-21の測定値により分類したmiR-21 exp. high群及びmiR-21 exp. lowの間では、OSに有意差は認められなかった。図２Ｄに示されるように、早期の肺がんでは、miR-21 exp. high群及びmiR-21 exp. low群の間でOSに有意差が認められた。しかし、図２Ｂに示される結果と比較すると、予後予測の精度は、miR-21Cの測定値に基づく判定の方が高いことが示された。
実施例２：miR-21Cの測定値に基づく肺腺がんの再発リスクの判定
１．検体
　病期の異なる複数の肺腺がん患者から、肺腺がん組織を採取した。各患者からは、文書によりインフォームドコンセントを得た。これらの患者の手術時に腫瘍の一部を採取し、液体窒素中に凍結保存したか、又はRNAlater(登録商標) Stabilization Solution(Invitrogen社)中に保存した。
２．定量的RT-PCR及び解析
　実施例１と同様にして、採取した組織から抽出したトータルRNAを用いて、逆転写及び定量的RT-PCRを行った。取得したmiR-21C及びmiR-21の測定値のデータを、実施例１と同様にして、Prism(GraphPad社)により統計解析した。実施例１と同様に、肺腺がん患者を、miR-21C及びmiR-21の測定値に基づいて分類した。各群の患者の無再発生存率(RFS)についての生存曲線を作成した。また、ステージI及びIIの肺腺がんである各群の患者のRFSについての生存曲線も作成した。RFSの差は、ログランク検定で評価した。p値が0.05未満(p<0.05)である場合を統計的に有意とした。
３．結果
　作成した生存曲線を図３Ａ～図３Ｄに示す。図３Ａに示されるように、miR-21C exp. high群に比べてmiR-21C exp. low群の方が、RFSが有意に高い傾向にあることが示された。すなわち、miR-21Cの測定値が高いほど再発リスクが高く、測定値が低いほど再発リスクが低いことが示唆された。また、図３Ｂに示されるように、早期(ステージI及びII)の肺腺がんでは、miR-21C exp. high群とmiR-21C exp. low群との間のRFSの差が顕著になった。この結果から、早期の肺腺がんの場合は、miR-21Cの測定値に基づいて、より精度の高い再発リスクの判定が可能であることが示唆された。
　図３Ｃ及び図３Ｄに示されるように、全ステージ及び早期の肺腺がんで、miR-21 exp. high群及びmiR-21 exp. low群の間でRFSに有意差が認められた。しかし、図３Ａ及び図３Ｂに示される結果と比較すると、再発リスクの予測の精度は、miR-21Cの測定値に基づく判定の方が高いことが示された。
実施例３：miR-21Cの測定値のmiR-21の測定値に対する相対値に基づく肺がんの再発リスクの判定
１．検体及び解析
　実施例１の肺がん組織検体の測定データを用いて、相対値を、同一閾値でのCt値の差に基づいて比較Ct法により算出した。具体的には、次のとおりであった。まず、miR-21C、miR-21及び内部コントロールのCt値を、threshold=1.5で算出した。次いで、miR-21C及びmiR-21のそれぞれのCt値から、内部コントロールのCt値を差し引いて、miR-21C及びmiR-21のCt値を標準化した。そして、標準化したmiR-21CのCt値から、標準化したmiR-21のCt値を差し引いた値(ΔCt)を下記の式に導入して、相対値を算出した。
(相対値)＝2^-(ΔCt)
　相対値が所定の閾値以上であった患者を「miR-21C/miR-21 high」群に分類し、相対値が所定の閾値未満であった患者を「miR-21C/miR-21 low」群に分類した。相対値の差は、スチューデントのｔ検定により評価した。各群の患者のRFSについての生存曲線を作成した。また、ステージI及びIIの肺がんである各群の患者のRFSについての生存曲線も作成した。RFSの差は、ログランク検定で評価した。p値が0.05未満(p<0.05)である場合を統計的に有意とした。
２．結果
　作成した生存曲線を図４Ａ及び図４Ｂに示す。図４Ａに示されるように、miR-21C/miR-21 high群に比べてmiR-21C/miR-21 low群の方が、RFSが有意に高い傾向にあることが示された。すなわち、相対値が高いほど再発リスクが高く、相対値が低いほど再発リスクが低いことが示唆された。また、図４Ｂに示されるように、早期(ステージI及びII)の肺がんでは、miR-21C/miR-21 high群とmiR-21C/miR-21 low群との間のRFSの差が顕著になった。このように、相対値に基づく再発リスクの判定は、早期の肺がんにより適していることが示唆された。
実施例４：Ｄスコアに基づく肺腺がんの再発リスクの判定
１．検体及び解析
　実施例２の肺腺がん組織検体の測定データを用いた。具体的には、miR-21C及びmiR-21の測定値を用いて、下記の式によりＤスコアを算出した。
(Ｄスコア)＝(miR-21Cの測定値)2/(miR-21の測定値)
　Ｄスコアが所定の閾値以上であった患者を「High」群に分類し、Ｄスコアが所定の閾値未満であった患者を「Low」群に分類した。Ｄスコアの差は、スチューデントのｔ検定により評価した。各群の患者のRFSについての生存曲線を作成した。また、ステージI及びIIの肺腺がんである各群の患者のRFSについての生存曲線も作成した。さらに、全ステージの高分化肺腺がんである各群の患者のRFSについての生存曲線も作成した。RFSの差は、ログランク検定で評価した。p値が0.05未満(p<0.05)である場合を統計的に有意とした。
２．結果
　作成した生存曲線を図５Ａ～図５Ｃに示す。図５Ａに示されるように、High群に比べてLow群の方が、RFSが有意に高い傾向にあることが示された。すなわち、Ｄスコアが高いほど再発リスクが高く、Ｄスコアが低いほど再発リスクが低いことが示唆された。また、図５Ｂに示されるように、早期(ステージI及びII)の肺がんにおいても同様の結果が得られた。全ステージ及び早期のいずれにおいても、High群とLow群との間のRFSの差は、p値が0.0001未満で有意であった。すなわち、Ｄスコアを用いることにより、極めて高い精度で再発リスクを判定できることが示唆された。
　図５Ｃに示されるように、高分化肺腺がんにおいても、High群に比べてLow群の方が、RFSが有意に高い傾向にあることが示された。この結果より、Ｄスコアにより、高分化肺腺がんの再発リスク群を明確に層別化できることが示された。
実施例５：既存の予後予測因子であるp53遺伝子変異との比較
１．検体
　実施例１の肺がん患者とは異なる患者から肺がん組織を採取し、液体窒素中に凍結保存したか、又はRNAlater(登録商標) Stabilization Solution(Invitrogen社)中に保存した。
２．定量的RT-PCR及び解析
　実施例１と同様にして、採取した組織から抽出したトータルRNAを用いて、逆転写及び定量的RT-PCRを行い、miR-21C及びmiR-21を測定した。また、p53遺伝子の変異を配列解析により検出した。統計解析は、医療統計解析ソフトPrism(GraphPad社)を用いて行った。
実施例３と同様にして、miR-21Cの測定値のmiR-21の測定値に対する相対値が所定の閾値以上であった患者を「miR-21C/miR-21 high」群に分類し、当該相対値が所定の閾値未満であった患者を「miR-21C/miR-21 low」群に分類した。また、p53遺伝子が変異していなかった患者を「p53 WT」群に分類し、p53遺伝子が変異していた患者を「p53 MUT」群に分類した。ステージI及びIIの肺がんである各群の患者のRFSについての生存曲線を作成した。RFSの差は、ログランク検定で評価した。p値が0.05未満(p<0.05)である場合を統計的に有意とした。
３．結果
　作成した生存曲線を図６Ａ及び図６Ｂに示す。図６Ａに示されるように、miR-21C/miR-21 high群に比べてmiR-21C/miR-21 low群の方が、RFSが有意に高い傾向にあることが示された。一方、図６Ｂに示されるように、p53遺伝子の変異の有無に基づいて分類したp53 WT群及びp53 MUTの間では、RFSに有意差は認められなかった。このように、miR-21Cの測定値のmiR-21の測定値に対する相対値に基づく再発リスクの判定は、p53遺伝子変異に基づく判定よりも、精度が高いことが示された。
１１、２１：　試薬キット
１２、２２：　第１容器
２３：　第２容器
１３、２４：　梱包箱
１４、２５：　添付文書

Claims (20)

  1. 　肺がん患者の検体から調製した測定試料におけるmiR-21Cを測定することを含み、前記測定により取得されたmiR-21Cの発現量が、肺がんの予後の指標となる、肺がんの予後の判定を補助する方法。
  2. 　前記miR-21Cの発現量が、所定の閾値以上であるとき、肺がんの予後が不良であることが示唆され、
    　前記miR-21Cの発現量が、前記所定の閾値より低いとき、肺がんの予後が良好であることが示唆される請求項１に記載の方法。
  3. 　前記測定試料におけるmiR-21を測定することをさらに含む請求項１に記載の方法。
  4. 　前記miR-21Cの発現量が、前記miR-21Cの測定値の前記miR-21の測定値に対する相対値である請求項３に記載の方法。
  5. 　前記相対値が、下記の式により算出される値である請求項４に記載の方法：
    (相対値)＝(miR-21Cの測定値)N/(miR-21の測定値)
    (式中、Ｎは、正の整数である)。
  6. 　前記Ｎが１又は２である請求項５に記載の方法。
  7. 　前記相対値が、前記相対値に対応する所定の閾値以上であるとき、肺がんの予後が不良であることが示唆され、
    　前記相対値が、前記相対値に対応する所定の閾値より低いとき、肺がんの予後が良好であることが示唆される請求項５又は６に記載の方法。
  8. 　肺がん患者の検体から調製した測定試料におけるmiR-21Cを測定する工程と、
    　前記測定により取得されたmiR-21Cの発現量に基づいて、肺がんの予後を判定する工程
    と
    を含む、肺がんの予後の判定を補助する方法。
  9. 　前記判定する工程において、
    　前記miR-21Cの発現量が、所定の閾値以上であるとき、肺がんの予後が不良であると判定し、
    　前記miR-21Cの発現量が、前記所定の閾値より低いとき、肺がんの予後が良好であると判定する請求項８に記載の方法。
  10. 　前記測定する工程において、前記測定試料におけるmiR-21をさらに測定する請求項８に記載の方法。
  11. 　前記miR-21Cの発現量が、前記miR-21Cの測定値の前記miR-21の測定値に対する相対値である請求項１０に記載の方法。
  12. 　前記相対値が、下記の式により算出される値である請求項１１に記載の方法：
    (相対値)＝(miR-21Cの測定値)N/(miR-21の測定値)
    (式中、Ｎは、正の整数である)。
  13. 　前記Ｎが１又は２である請求項１２に記載の方法。
  14. 　前記判定する工程において、
    　前記相対値が、前記相対値に対応する所定の閾値以上であるとき、肺がんの予後が不良であると判定し、
    　前記相対値が、前記相対値に対応する所定の閾値より低いとき、肺がんの予後が良好であると判定する請求項１２又は１３に記載の方法。
  15. 　前記肺がんが、早期肺がんである請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 　前記早期肺がんが、ステージＩ又はIIの肺がんである請求項１５に記載の方法。
  17. 　前記肺がんが、腺がんである請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 　前記検体が、肺がん組織を含む請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 　miR-21C由来のcDNAに特異的にハイブリダイズするプライマーセットを含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法に用いられる、試薬キット。
  20. 　miR-21由来のcDNAに特異的にハイブリダイズするプライマーセットをさらに含む、請求項１９に記載の試薬キット。
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