WO2023053586A1 - イムノクロマトグラフキット及び検査装置 - Google Patents

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WO2023053586A1
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友希乃 伊藤
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富士フイルム株式会社
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    • G01N2021/6439Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks

Definitions

  • the present disclosure relates to immunochromatography kits and inspection devices.
  • Immunological measurement methods are widely used as methods for qualitatively or quantitatively measuring test substances present in biological samples such as urine and blood.
  • the immunochromatography method is highly convenient because the operation is simple and the measurement can be performed in a short time.
  • Immunochromatography uses a test strip in which an antibody (capture antibody) that specifically binds to a test substance (eg, antigen) is immobilized on the test area.
  • a test substance eg, antigen
  • the sandwich method and the competitive method are widely used as assay methods used in immunochromatography.
  • a labeled antibody that specifically binds to the antigen (labeled antibody) and the sample are developed on the test strip, and if the sample contains the antigen, the capture antibody - forming an antigen-labeled antibody complex.
  • the antigen which is the test substance, is qualitatively or quantitatively measured by detecting a signal such as color development due to the labeling of the labeled antibody.
  • the competitive method a labeled pseudo-antigen (labeled pseudo-antigen) and a sample liquid are developed on the test strip, and the antigen in the sample liquid and the labeled pseudo-antigen are competitively captured by the capture antibody in the test area.
  • the antigen which is the test substance, is qualitatively or quantitatively measured by detecting a signal such as coloring caused by the label of the labeled pseudo-antigen captured in the test area.
  • the signal intensity due to labeling increases as the amount of antigen in the sample increases, whereas in the competitive method, the signal intensity due to labeling decreases as the amount of antigen in the sample increases.
  • Chemiluminescence immunochromatography is known in which a luminescent protein is used as a label in the immunochromatographic method described above, and luminescence from the luminescent protein is detected by chemically reacting the luminescent protein with a luminescent substrate (e.g., Japanese Patent Laid-Open No. 2015-105858).
  • a luminescent substrate e.g., Japanese Patent Laid-Open No. 2015-105858.
  • a specimen and a labeled antibody labeled with a luminescent protein are developed on a test strip on which a capture antibody is immobilized in the test area.
  • the test strip is then developed with a luminescent substrate that reacts with the label photoprotein to produce light.
  • the antigen which is the substance to be tested, is qualitatively or quantitatively measured.
  • Japanese Patent Publication No. 2018-522221 discloses a chemiluminescence immunochromatography method using a competitive method, in which bioluminescence resonance energy transfer (BRET: Bioluminescence Resonance Energy Transfer) occurs between a photoprotein and a fluorescent substance. It is disclosed to use the technique of In Japanese Patent Publication No. 2018-522221, a test strip in which a capturing antibody labeled with a luminescent protein is immobilized in the test area is used, and a specimen, a prepared fluorescent substance-labeled pseudoantigen, and a luminescent protein are used. and a luminescent substrate to react with are developed on the test strip. Then, the antigen in the specimen and the labeled pseudo-antigen are competitively captured by the capture antibody.
  • BRET Bioluminescence Resonance Energy Transfer
  • the inspection area when the luminescent protein and the fluorescent substance are close to each other, the energy generated by the reaction between the luminescent substrate and the luminescent protein is transferred to the fluorescent substance to generate fluorescence.
  • the chemiluminescence immunochromatography method described in Japanese Patent Application Publication No. 2018-522221 the larger the amount of antigen captured in the specimen, the less the amount of labeled pseudoantigen captured in the test area. becomes smaller.
  • the antigen, which is the test substance is qualitatively or quantitatively measured by detecting fluorescence from this BRET.
  • a labeled antibody labeled with a luminescent protein is developed over the entire area of the test strip, including the test area.
  • some of the labeled antibodies specifically bind to the antigen through antigen-antibody reaction, but some of the remaining labeled antibodies remain around the test area even though they do not specifically bind to the antigen.
  • the luminescent substrate is developed on the test strip, not only the label of the labeled antibody specifically adsorbed to the antigen but also the luminescent protein, which is the label of the remaining labeled antibody, reacts with the luminescent substrate.
  • the area surrounding the inspection area is used as the background, luminescence due to the remaining labeled antibody will occur even in the background. Since the light signal in the background becomes noise with respect to the light signal generated by the antigen-antibody reaction, the S (Signal)/N (Noise) ratio is lowered, resulting in lower measurement accuracy.
  • JP-A-2018-522221 the photoprotein is immobilized only in the inspection area as a label for the capture antibody. Therefore, fluorescence is generated by BRET only in the examination region where the photoprotein of the capture antibody and the fluorescent material of the labeled antibody are in close proximity, so that no fluorescence is generated in the background in the absence of the capture antibody.
  • the amount of labeled pseudo-antigen that binds to the capture antibody immobilized in the test area is maximized in the absence of antigen in the specimen. The signal intensity is highest in the absence of , and the signal intensity decreases as the amount of antigen increases.
  • the signal intensity becomes maximum in the absence of antigen, and this becomes the baseline signal intensity for measuring the amount of antigen, but there is a problem that the baseline signal intensity varies due to various factors.
  • the amount of labeled pseudo-antigen that binds to the capture antibody in the absence of antigen in the sample depends on the fluid velocity caused by factors such as the momentum with which the sample is spotted onto the test strip and the amount of sample spotted. changes due to fluctuations in
  • BRET the fluorescence signal intensity changes according to the distance between the photoprotein and the fluorescent substance. Therefore, if the binding state of the labeled pseudo-antigen that binds to the capture antibody fluctuates, the baseline will also fluctuate. If the baseline fluctuates, the measurement accuracy will decrease. In particular, the smaller the amount of antigen in the specimen, that is, the lower the concentration of the antigen in the specimen, the greater the influence of variations in signal intensity between baseline measurements on measurement accuracy.
  • the present disclosure has been made in view of the above circumstances, and aims to provide an immunochromatography kit and a testing apparatus that are capable of highly accurate measurement even when the concentration of a test substance in a sample is low compared to conventional methods. aim.
  • the immunochromatography kit of the present disclosure includes a cartridge containing a test strip having a test area on which a sample is developed and which captures a test substance contained in the sample; a capture binding substance that specifically binds to the test substance, the capture binding substance labeled with a photoprotein and immobilized in the test region; a labeled binding substance that specifically binds to the test substance, the labeled binding substance labeled with a fluorescent substance and supplied to the test region;
  • the luminescent substrate supplied to the inspection region generates energy by reacting with the luminescent protein, and in a state in which the labeled binding substance is captured by the binding substance for capture via the test substance, the energy is transferred to the fluorescent substance.
  • a luminescent substrate that produces a translocating bioluminescence energy resonance transfer phenomenon.
  • the luminescent protein may be a luminescent protein that emits blue light
  • the fluorescent substance may be a green fluorescent dye or green fluorescent protein that emits green fluorescence with a quantum yield of 0.7 or more.
  • the photoprotein is a blue photoprotein that emits blue light, and the fluorescent substance may have a peak wavelength of 530 nm or more.
  • It may include a specimen collection tool for collecting specimens.
  • An instruction manual may be included that describes the test procedure for supplying the luminescent substrate to the test area after the sample and the labeled binding substance are supplied to the test area.
  • a label holding pad provided with a label binding substance may be arranged on the test strip at the sample supply position.
  • a luminescent substrate solution holding part containing a substrate solution containing a luminescent substrate may be provided in the cartridge.
  • the washing liquid supplied to the inspection region is used to wash the labeled binding substance non-specifically adsorbed to the inspection region.
  • a cleaning liquid may also be provided.
  • a cleaning liquid holding portion containing cleaning liquid may be provided in the cartridge.
  • the inspection device of the present disclosure includes a loading unit in which the cartridge in the immunochromatograph kit of the present disclosure is detachably loaded, a detection unit that detects the intensity of luminescence from the fluorescent substance in the inspection area; and a processor that determines whether the sample is positive or negative based on the intensity of luminescence obtained from the detection unit.
  • the inspection device of the present disclosure includes a luminescent substrate supply mechanism that supplies the luminescent substrate to the inspection area,
  • the processor may supply the luminescent substrate to the test area by means of a luminescent substrate supply mechanism after the analyte and labeled binding substance have been supplied to the test area.
  • the loading unit is loaded with a cartridge having a cleaning liquid holding unit inside, further comprising a cleaning liquid supply mechanism for supplying the cleaning liquid to the inspection area
  • the processor may supply washing liquid to the examination area by the washing liquid supply mechanism after the specimen and the labeled antibody are supplied to the examination area and before supplying the luminescent substrate to the examination area.
  • the detection unit detects the intensity of luminescence from the fluorescent substance in the inspection region (luminescence intensity at the peak wavelength of the fluorescent substance) as the first luminescence intensity, and the intensity of luminescence from the photoprotein ( The luminescence intensity at the peak wavelength of the photoprotein) is detected as the second luminescence intensity
  • the processor acquires the first luminescence intensity and the second luminescence intensity from the detection unit, and divides the first luminescence intensity by the second luminescence intensity. A value may be used to make the determination.
  • the detection unit detects the intensity of luminescence from the fluorescent substance in the inspection area as the first luminescence intensity, and the peak wavelength of luminescence from the fluorescent substance and the peak wavelength of luminescence from the photoprotein.
  • the processor detects, as a third emission intensity, the intensity of emission at an isoluminescence point existing in the wavelength range between A determination may be made using the value divided by the emission intensity.
  • the immunochromatography kit and testing device of the present disclosure highly accurate measurement is possible even when the concentration of the test substance in the sample is low compared to conventional methods.
  • FIG. 4 is a diagram showing the whole immunochromatography kit composition. 4 is an exploded perspective view of the cartridge; FIG. It is a figure which shows the procedure of an immunochromatography examination.
  • (a) is a diagram for explaining luminescence from the test area when the test is negative, and
  • (b) is a diagram for explaining the luminescence from the test area when the test is positive.
  • (a) is a diagram showing an example of the emission spectrum detected from the test area when negative, and
  • (b) is a diagram showing an example of the emission spectrum detected from the test area when positive.
  • FIG. 4 is a diagram showing the relationship between the intensity of light emitted from a fluorescent substance by BRET and the concentration of a test substance; It is a figure which shows the isoluminous intensity point in negative time and positive time.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining luminescence from an inspection region in a chemiluminescence immunochromatographic inspection (prior art 1) without using BRET.
  • Competitive method and with respect to chemiluminescence immunochromatographic test using BRET (prior art 2), (a) is a diagram explaining luminescence from the test area when negative, and (b) is a diagram illustrating luminescence from the test area when positive. It is a figure explaining light emission.
  • FIG. 10 is a diagram showing the relationship between the emission intensity of light emitted from a fluorescent substance and the concentration of a test substance by BRET in Prior Art 2;
  • FIG. 11 is a perspective view of a cartridge of a modified design;
  • FIG. 11 is an exploded perspective view of a cartridge of a modified design;
  • FIG. 11 is a cutaway side view of the cartridge of the modified design
  • FIG. 4 is a cutaway side view of the cartridge showing a state in which the first pressing operation portion is pushed
  • FIG. 10 is a cutaway side view of the cartridge showing a state in which the second pressing portion is pushed in in addition to the first pressing portion
  • It is a perspective view which shows an inspection apparatus. It is a sectional view showing the inside of an inspection device. It is a block diagram which shows the processing part of CPU of an inspection apparatus. It is a flowchart which shows the processing procedure of an inspection apparatus.
  • an immunochromatography kit 1 of one embodiment includes a cartridge 3 containing a test strip 2, a luminescent substrate solution 5 containing a luminescent substrate 4, a washing solution 6, and a specimen collecting tool 7. and an instruction manual 8.
  • the cartridge 3 is a single-use type that is used one by one for each sample, and has a case 21 in the shape of an elongated rectangular parallelepiped.
  • the case 21 is composed of a case body 22 and a cover member 23 .
  • the case body 22 is shaped like an elongated plate and has a recess for accommodating the test strip 2 .
  • the cover member 23 includes a specimen dropping port 24 , a luminescent substrate dropping port 26 and an observation window 28 .
  • both the X direction and the Y direction in FIG. 2 are directions along the horizontal plane and are orthogonal to each other.
  • the X direction is the direction along the short side of the case 21
  • the Y direction is the direction along the long side of the case 21 .
  • the Z direction is a direction along the vertical direction and is orthogonal to the X and Y directions. The same applies to subsequent drawings
  • the sample dropping port 24 is a round hole into which a sample liquid 70 (see FIG. 3) containing a sample is dropped.
  • the specimen is not particularly limited as long as it can contain the test substance 71 .
  • Specimens are biological samples of individuals to be immunochromatographically tested, particularly animals, more specifically human biological samples, such as blood, serum, plasma, cerebrospinal fluid, tears, sweat, urine, feces, pus, nasal discharge, nasal swabs. Liquids, throat swabs, nasal aspirates, sputum, etc., as well as organs, tissues, mucous membranes, and skin, or swabs containing them, or animals and plants themselves or their dried bodies.
  • the test substance 71 includes antigens, antibodies, proteins, low-molecular-weight compounds, and the like. Note that the washing liquid 6 is also dropped from the specimen dropping port 24 .
  • the luminescent substrate dropping port 26 is a round hole into which the luminescent substrate solution 5 containing the luminescent substrate 4 is dropped.
  • dropping the luminescent substrate solution 5 is synonymous with dropping the luminescent substrate 4 .
  • the luminescent substrate 4 will be described later.
  • the observation window 28 is a rectangular opening for observing the inspection area A of the inspection strip 2 from the outside.
  • An observation window 28 is formed between the sample dropping port 24 and the luminescent substrate dropping port 26 .
  • the specimen collecting tool 7 is a tool for collecting a specimen, and in this example, a swab for collecting nasal swab is used.
  • a sample-collecting tool 7 an appropriate sample-collecting tool can be provided according to the above-described sample.
  • the swab with the sample collected is immersed in a developing solution (also referred to as a sample treatment solution) (not shown) to extract the collected sample to prepare a sample solution 70 (see FIG. 3).
  • the sample liquid 70 containing the specimen thus obtained is dropped from the specimen dropping port 24 . That is, dropping the sample liquid 70 is synonymous with dropping the sample.
  • the instruction manual 8 describes how to use the test strip 2, the luminescent substrate solution 5, the washing liquid 6, the sample collection tool 7, etc., and the test procedure.
  • the instruction manual 8 describes an inspection procedure in which the luminescent substrate 4 is supplied to the inspection area A after the sample and the labeled binding substance are supplied to the inspection area A. The details of the inspection procedure will be described later. .
  • a communication line is provided in the examination procedure manual provided by uploading it to the server in the form of electronic data.
  • FIG. 2 is a diagram showing the configuration of the cartridge 3
  • FIG. 3 is a diagram showing an inspection procedure using the cartridge 3.
  • the test strip 2 has an overall elongated rectangular plate shape and has a carrier 30, a label holding pad 31, an absorbent pad 33, and a back adhesive sheet .
  • the carrier 30 is made of a porous, insoluble material such as a nitrocellulose membrane. Near the center of the carrier 30, there is provided an inspection area A for capturing the test substance 71 (see FIG. 3) contained in the sample. A capture binding substance 74 (see FIG. 3) labeled with a photoprotein 73 (see FIG. 3) is immobilized in the inspection region A.
  • FIG. 3 A capture binding substance 74 (see FIG. 3) labeled with a photoprotein 73 (see FIG. 3) is immobilized in the inspection region A.
  • the capturing binding substance 74 is a binding substance that specifically binds to the test substance 71 .
  • the capturing binding substance 74 is an antibody against the antigen, and when the test substance 71 is an antibody, it is an antigen against the antibody.
  • the binding substance for capture 74 is an aptamer for the protein, a low-molecular-weight compound, or the like.
  • the luminescent protein 73 labeled on the capturing binding substance 74 is a protein that reacts with the luminescent substrate 4 to generate luminescence.
  • the label holding pad 31 is attached at a position of the carrier 30 facing the specimen dropping port 24 .
  • a sample liquid 70 dropped into the specimen dropping port 24 is spotted on the label holding pad 31 . That is, the label holding pad 31 is arranged on the test strip 2 at the sample supply position.
  • the label holding pad 31 contains a label binding substance 77 labeled with a fluorescent substance 76 (see FIG. 3).
  • the labeled binding substance 77 is a binding substance that specifically binds to the test substance 71 .
  • the labeled binding substance 77 is an antibody against the antigen, and when the test substance 71 is an antibody, it is a secondary antibody capable of binding to the antibody.
  • the test substance 71 is a protein, a low-molecular-weight compound, or the like
  • the labeled binding substance 77 is an aptamer for the protein, a low-molecular-weight compound, or the like.
  • the capturing binding substance 74 and the labeling binding substance 77 may be the same or different.
  • the test substance 71 is an influenza A virus or its biomarker
  • an anti-influenza A monoclonal antibody manufactured by Medix Biochemica, product name: Anti-Influenza A SPT N-5 7307
  • Medix Biochemica product name: Anti-Influenza A SPT N-5 7307
  • the fluorescent substance 76 is a fluorescent dye or fluorescent protein that emits fluorescence when excited energy is applied.
  • the luminescent protein 73 and the fluorescent substance 76 are selected so that the wavelength range of the emission spectrum of the luminescent protein 73 and the wavelength range of the excitation spectrum of the fluorescent substance 76 overlap. If there is a wavelength range in which the emission spectrum of the photoprotein 73 overlaps with the excitation spectrum of the fluorescent material 76, energy transfer can occur.
  • the luminescent protein 73 is, for example, a luminescent protein that emits blue light.
  • the fluorescent substance 76 having a quantum yield of 0.7 or more may be a green fluorescent dye or a green fluorescent protein that emits green fluorescence.
  • blue light is light having a maximum emission wavelength (hereinafter referred to as peak wavelength) within a wavelength range of approximately 430 nm to approximately 490 nm
  • green light is light having a peak within a wavelength range of approximately 490 nm to approximately 550 nm. It is light with a wavelength.
  • the peak wavelength of the photoprotein 73 and the peak wavelength of the fluorescent substance 76 differ by 40 nm or more.
  • the fluorescent substance 76 can be a fluorescent dye or fluorescent protein having a peak wavelength of 530 nm or more. The further apart the peak wavelengths are, the easier it is to identify the respective light peaks, which is preferable. For example, when photoprotein 73 has a peak wavelength within the blue light wavelength range of approximately 430 nm to approximately 490 nm, fluorescent substance 76 has a peak wavelength within the red light wavelength range of approximately 640 nm to 770 nm, and so on. is.
  • the luminescent substrate 4 generates energy by reacting with the photoprotein 73 and being oxidized, becomes an excited state, and emits light when transitioning to the ground state.
  • a bioluminescence energy resonance transfer phenomenon BRET
  • the fluorescent substance 76 is excited by the luminescence energy E generated by the reaction between the luminescent substrate 4 and the luminescent protein 73, and the fluorescent substance 76 emits fluorescence.
  • the immunochromatography kit 1 of the present disclosure it is determined whether the specimen is positive or negative by detecting luminescence from the fluorescent substance 76 by this BRET. Details of the inspection procedure will be described later.
  • luminescent protein 73 examples include Blue luminescent protein NanoLuc (registered trademark, Promega), Green fluorescent protein mNeongreen (Allele Biotechnology), and Furimazine ( manufactured by Promega).
  • Blue luminescent protein NanoLuc registered trademark, Promega
  • Green fluorescent protein mNeongreen Allele Biotechnology
  • Furimazine manufactured by Promega
  • the absorbent pad 33 is attached to the other end opposite to the one end of the carrier 30 to which the label holding pad 31 is attached. Like the carrier 30, the absorbent pad 33 is made of a porous material. The absorbent pad 33 absorbs the sample liquid 70 spread on the carrier 30 , the washing liquid 6 and the luminescent substrate solution 5 .
  • the back adhesive sheet 34 is a base material with an adhesive surface to which the carrier 30 is adhesively fixed.
  • the washing liquid 6 is supplied to the inspection area A after supplying the specimen and the labeled binding substance 77 to the inspection area A and before supplying the luminescent substrate 4 to the inspection area A.
  • the washing liquid 6 washes the labeled binding substance 77 non-specifically adsorbed to the inspection region A.
  • non-specific adsorption refers to a state in which the labeled binding substance 77 is adsorbed onto the carrier without specific binding between the test substance 71 and the capturing binding substance 74 .
  • the sample liquid 70 is spotted on the label holding pad 31 as shown in step ST1.
  • the test substance 71 in the sample liquid 70 spotted on the label holding pad 31 specifically binds to the label binding substance 77 of the label holding pad 31 .
  • step ST2 the sample liquid 70 permeates from the label holding pad 31 to the carrier 30 and spreads toward the inspection area A side (downstream side) by capillary action.
  • the test substance 71 that has reached the inspection area A is captured by the capturing binding substance 74 .
  • the fluorescent substance 76 is captured by the capturing binding substance 74 in the inspection area A via the test substance 71 and the labeling binding substance 77 .
  • the labeled binding substance 77 that has not been captured in the inspection area A is further developed to the absorbent pad 33 on the downstream side. Note that part of the labeled binding substance 77 may not spread to the absorbent pad 33 and be non-specifically adsorbed onto the carrier 30 .
  • the cleaning liquid 6 is supplied.
  • the washing liquid 6 is supplied to the carrier 30 through the label holding pad 31 and spreads toward the inspection area A side (downstream side) by capillary action.
  • the labeled binding substance 77 non-specifically adsorbed on the carrier is washed.
  • the labeled binding substance 77 non-specifically adsorbed to the inspection area A is flowed to the absorbent pad 33 together with the washing liquid 6 .
  • the luminescent substrate solution 5 is supplied.
  • the luminescent substrate solution 5 is supplied to the carrier 30 from the downstream side of the inspection area A and spreads toward the inspection area A side (upstream side).
  • step ST6 the luminescent substrate 4 contained in the luminescent substrate solution 5 that has reached the inspection area A reacts with the luminescent protein 73 immobilized on the inspection area A.
  • the energy E generated by this reaction is transferred to the captured fluorescent substance 76 to generate BRET, and fluorescence 78 is generated from the fluorescent substance 76 .
  • the light emitted from the test area A can be used to determine whether the specimen is positive or negative.
  • the light emitted from the inspection area A is detected by a detection unit 110 such as a spectrophotometer in an inspection apparatus 100 (see FIGS. 16 and 17), which will be described later.
  • a detection unit 110 such as a spectrophotometer in an inspection apparatus 100 (see FIGS. 16 and 17), which will be described later.
  • FIG. 4 the luminescence from the inspection area A in each case of positive and negative will be described with reference to FIGS. 4 and 5.
  • FIG. 4 the luminescence from the inspection area A in each case of positive and negative will be described with reference to FIGS. 4 and 5.
  • FIG. 4 illustrates (a) luminescence from test area A when the specimen is negative (negative) and (b) luminescence from test area A when the specimen is positive (positive), respectively.
  • FIG. 5 shows (a) the emission spectrum from test area A when negative and (b) the emission spectrum from test area A when positive.
  • the light 75 emitted by the photoprotein 73 is blue light with a peak wavelength of 460 nm
  • the fluorescence emitted by the fluorescent substance 76 is green light with a peak wavelength of 530 nm.
  • the sample does not contain the test substance 71, so as shown in FIG. As a result, the fluorescent material 76 is also not captured.
  • the luminescent substrate 4 when the luminescent substrate 4 is supplied to the inspection area A, the luminescent substrate 4 reacts with the luminescent protein 73 to generate luminous energy and emit light. At this time, light 75 of photoprotein 73 is generated.
  • an emission spectrum a having a peak at 460 nm is obtained, as shown in FIG. 5(a).
  • An emission spectrum a shown in FIG. 5A is an example of an emission spectrum when the light 75 is blue light having a peak wavelength of 460 nm.
  • the specimen 71 is captured by the binding substance for capture 74 in the inspection region A, and the fluorescent substance 76 is captured via the specimen 71. be.
  • the luminescent substrate 4 reacts with the luminescent protein 73 to generate luminescence energy E, and fluorescence 78 is generated from the fluorescent substance 76 by BRET.
  • Fluorescence 78 is green light with a peak wavelength of 530 nm. Note that even in the case of positive, in the inspection region A, there is also a capturing binding substance 74 that does not capture the test substance 71 .
  • the more the test substance 71 in the sample that is, the higher the concentration of the test substance 71, the higher the intensity of the emitted light from the fluorescent substance 76 by BRET.
  • the luminescent substrate 4 and the luminescent protein 73 react relatively and the light 75 generated from the luminescent substrate 4 becomes smaller. That is, when the test substance 71 does not exist in the specimen and is negative, an emission spectrum of light 75 having a peak wavelength of 460 nm is obtained as shown in FIG. 5A, and the amount of the test substance 71 in the specimen increases. As it increases, the 460 nm peak in the detected emission spectrum becomes smaller and the 530 nm peak becomes relatively larger.
  • the emission spectrum a or b as shown in FIG. ) and the emission intensity IB of the light 75 emitted without causing BRET (hereinafter referred to as the second emission intensity IB) are obtained, and the value IF/ IB (hereinafter referred to as an emission intensity ratio IF/IB) can be obtained to determine whether the test is positive or negative. For example, if the emission intensity ratio IF/IB is greater than a predetermined threshold, it is determined as positive, and if it is equal to or less than the threshold, it is determined as negative.
  • the emission intensity ratio used for determination as shown in FIG. 7, the emission intensity Iiso (hereinafter referred to as , using the third emission intensity Iiso), the emission intensity IF of the fluorescence 78 generated by BRET is divided by the emission intensity Iiso at the isoluminescence point to obtain a ratio IF/Iiso (emission intensity ratio IF/Iiso), A positive or negative determination may be made. For example, if the emission intensity ratio IF/Iiso is greater than a predetermined threshold, it is determined to be positive, and if it is equal to or less than the threshold, it is determined to be negative.
  • FIG. A photoprotein 73 is used as a label for the labeled antibody 207 . If the specimen is positive, the labeled antibody 207 labeled with the photoprotein 73 is captured via the specimen 71 . Since the luminescent substrate 4 is supplied to the inspection area A2 in this state, the luminescent substrate 4 reacts with the luminescent protein 73 to emit light. At this time, the luminescent substrate 4 reacts with the luminescent protein 73 to generate light 75 having the peak wavelength of the luminescent protein 73 .
  • the luminescent protein 73 that is the label of the non-specifically adsorbed labeled antibody 207 and the luminescent substrate 4 reacts with each other to emit light.
  • the luminescence caused by the photoprotein 73 of the non-specifically adsorbed labeled antibody 207 in the region surrounding the inspection region A2 increases the background, lowering the S/N ratio and lowering the measurement accuracy. there were.
  • the immunochromatography kit 1 of the present embodiment includes a cartridge 3 containing a test strip 2 having a test area A in which a sample is developed and which captures a test substance 71 contained in the sample, and a photoprotein 73. It comprises a labeled binding substance 74 immobilized in the inspection area A, a labeled binding substance 77 labeled with a fluorescent substance 76 and supplied to the inspection area A, and a luminescent substrate 4 .
  • the energy E generated by the reaction between the luminescent substrate 4 and the luminescent protein 73 moves to the fluorescent substance 76 in a state where the labeled binding substance 77 is captured via the test substance 71, Fluorescence 78 is produced from the fluorescent material 76 .
  • This energy transfer phenomenon called BRET occurs when the photoprotein 73 and the fluorescent substance 76 are in close proximity (for example, when they are positioned at a distance of about 10 nm or less). Therefore, when the labeling binding substance 77 is not captured by the capturing binding substance 74, BRET does not occur because the photoprotein 73 and the fluorescent substance 76 are not close to each other.
  • the immunochromatography kit 1 of the present embodiment which can be determined by measurement using BRET, can suppress the background compared to the conventional chemiluminescence immunochromatography method that does not use BRET, so measurement accuracy is high. .
  • test area A3 of the test strip 203 A capture antibody 204 labeled with a photoprotein 73 is immobilized.
  • a labeled pseudoantigen 72 labeled with a fluorescent substance 76 and a luminescent substrate 4 are developed on a test strip 203 together with a specimen.
  • FIG. 9 illustrates (a) luminescence from the test area A3 when the specimen is negative (negative) and (b) luminescence from the test area A3 when the specimen is positive (positive). It is schematic for As shown in FIG. 9(a), when negative, the labeled pseudoantigen 72 is captured by the capture antibody 204 in the test area A3, and the luminescence energy E generated by the reaction between the luminescent substrate 4 and the luminescent protein 73 is converted into a fluorescent substance. 76 and fluorescence 78 is generated from the fluorescent material 76 . Further, as shown in FIG. 9(b), when positive, the labeled pseudoantigen 72 and the test substance 71 are competitively captured by the capture antibody 204 in the test area A3.
  • the luminous energy E generated by the reaction between the luminescent protein 73 that labels the capture antibody 204 that captures the test substance 71 and the luminescent substrate 4 does not transfer to the fluorescent substance 76 . , becomes light 75 and emits light. Therefore, in the positive case, the fluorescence 78 from the fluorescent substance 76 due to BRET decreases, and the light 75 generated by the reaction between the photoprotein 73 and the luminescent substrate 4 increases.
  • the emission intensity of fluorescence 78 generated from the fluorescent substance 76 by BRET is the highest when the test substance 71 is not present in the specimen, and the amount of the test substance 71 is the highest.
  • the signal intensity of the fluorescence 78 generated from the fluorescent substance 76 by BRET decreases as the concentration increases (the test substance concentration increases). If the antigen, which is the analyte 71 , is not present in the specimen, it is the labeled pseudo-antigen 72 that binds to the capture antibody 204 .
  • the amount of the antigen that binds to the capture antibody 204 and the manner of binding fluctuate due to fluctuations in fluid velocity and reaction temperature that accompany fluctuations in the amount of specimen, resulting in fluctuations in signal intensity. likely to occur.
  • the difference between the case where the test substance 71 is extremely small and the baseline where the test substance 71 is not present becomes difficult, and the measurement accuracy is low when the test substance 71 is very small.
  • the immunochromatography kit 1 of the present embodiment uses a sandwich method in which the test substance 71 is sandwiched between the capturing binding substance 74 and the labeling binding substance 77 in the test region A of the test strip 2 . Therefore, compared to conventional BRET using a competitive method, measurement accuracy is higher when the amount of test substance in the sample is small.
  • the sandwich method when the test substance 71 does not exist, the signal intensity of fluorescence generated from the fluorescent substance by BRET is zero, and the signal intensity increases as the amount of the test substance 71 increases (FIG. 6). reference). Therefore, it is easy to detect a change in signal intensity when the amount of the test substance 71 is very small, and the measurement accuracy is high when the amount of the test substance 71 is very small.
  • the washing liquid 6 is provided, and is supplied to the inspection area A after the sample and the labeled binding substance 77 are supplied to the inspection area A and before the luminescent substrate 4 is supplied to the inspection area A. Since the washing liquid 6 can remove the non-specifically adsorbed labeled antibody 207, the measurement accuracy can be improved.
  • the immunochromatography kit 1 of the above-described embodiment includes a washing liquid 6 and a luminescent substrate solution 5 containing a luminescent substrate 4 separately from the cartridge.
  • the cartridge includes not only the test strip but also at least the luminescent substrate solution holding portion 52 containing the luminescent substrate solution 5 containing the luminescent substrate 4 and the washing solution holding portion 45 containing the washing solution 6. It may include one side.
  • the modified design cartridge 10 shown in FIGS. 11 and 12 has an elongated rectangular parallelepiped case 11 .
  • the case 11 is composed of a case body 12 and a cover member 13 .
  • the case main body 12 is a box having a storage space surrounded by an elongated rectangular plate-shaped bottom plate and four side plates erected vertically from four sides of the bottom plate.
  • An inspection strip 14 having an inspection area A is accommodated in the accommodation space of the case body 12 .
  • the cover member 13 has an elongated rectangular plate shape like the bottom plate of the case body 12 and functions as a lid that covers the housing space of the case body 12 .
  • a specimen dropping port 17 and an observation window 18 are formed in the cover member 13 . Further, the cover member 13 is provided with a first pressing operation portion 19 and a second pressing operation portion 20 .
  • the specimen dropping port 17, the observation window 18, the first pressing operation part 19, and the second pressing operation part 20 are integrally molded.
  • the sample dropping port 17 is a round hole into which the sample liquid 70 is dropped, and has a boss shape with an edge protruding from the surface.
  • a sample dropping port 17 is formed in the central portion of the cover member 13 .
  • the observation window 18 is a rectangular opening for observing the inspection area A and the like of the inspection strip 14 from the outside.
  • the observation window 18 is formed between the sample dropping port 17 and the second pressing operation section 20 .
  • the first pressing operation portion 19 is provided at one end of the cover member 13 in the Y direction.
  • the first pressing operation part 19 is pressed by the user when supplying the cleaning liquid 6 (see FIG. 14) to the test strip 14 .
  • the second pressing operation portion 20 is provided at the other Y-direction end portion of the cover member 13 opposite to the first pressing operation portion 19 .
  • the second pressing operation part 20 is pressed by the user when supplying the luminescent substrate solution 5 (see FIG. 15) to the test strip 14 .
  • the test strip 14 has a liquid transfer pad 32 in addition to the carrier 30, label holding pad 31, absorbent pad 33, and back adhesive sheet 34.
  • a control area C is provided on one end side of the carrier 30 in the Y direction.
  • the inspection area A is located upstream of the control area C in the development direction.
  • the inspection area A and the control area C are hatched, but this hatching is for convenience of explanation and indicates that the areas A and C are colored. isn't it.
  • FIGS. 13 to 15, FIG. 17, and the like The same applies to FIGS. 13 to 15, FIG. 17, and the like.
  • the liquid transfer pad 32 is attached to the other end of the carrier 30 opposite to the one end of the carrier 30 where the test area A and the like are provided.
  • the liquid-sending pad 32 is made of a porous material like the carrier 30 and the like, and sends the cleaning liquid 6 to the carrier 30 by capillary action.
  • the back adhesive sheet 34 and, by extension, the test strip 14 are placed on convex supports 35 and 36 formed in the housing space of the case body 12 .
  • the support base 35 is provided at the center of the case body 12 .
  • the support base 36 is provided at one end of the case main body 12 on the downstream side in the developing direction of the sample liquid 70 .
  • the supports 35 and 36 are of the same height.
  • a convex support base 37 is also formed at the other end of the case body 12 on the upstream side in the developing direction of the sample liquid 70 .
  • Support base 37 is the same height as support bases 35 and 36 .
  • a liquid transfer pad 32 is placed on the support table 37 .
  • a recessed first accommodating portion 38 is formed in the support base 37 .
  • the first housing portion 38 is provided at a position facing the other end of the liquid transfer pad 32 opposite to the one end attached to the carrier 30 .
  • a cleaning liquid holding portion 45 is accommodated in the first accommodation portion 38 .
  • the cleaning liquid holding part 45 is composed of a container 46 having an opening on one side and a seal 47 that liquid-tightly covers the opening of the container 46 .
  • the container 46 is made of, for example, a resin material.
  • the cleaning liquid 6 is stored inside the container 46 .
  • the seal 47 is an aluminum sheet, for example, and can be easily broken with a sharp knife or the like.
  • the cleaning liquid holding portion 45 is housed in the first housing portion 38 with the seal 47 facing upward so that the seal 47 faces the other end of the liquid feeding pad 32 .
  • a multifunctional member 49 is arranged on the top of the support base 36 .
  • the multifunctional member 49 is made of a transparent resin material such as acrylic resin.
  • the multifunctional member 49 is a member in which the second housing portion 50 and the flow path forming portion 51 are integrally provided.
  • the second storage part 50 is a box with an open top, and a luminescent substrate solution holding part 52 is stored therein.
  • the flow path forming portion 51 is a flat plate extending in the Y direction from the bottom portion of the second housing portion 50 .
  • the flow path forming part 51 extends to the front of the label holding pad 31 and covers the upper part of the inspection area A and the control area C of the carrier 30 .
  • a gap D is provided between the carrier 30 and the channel forming portion 51 (see FIG. 13).
  • the distance D is, for example, in the range of 0.01 mm to 1 mm.
  • the luminescent substrate solution holding part 52 is composed of a container 53 having an opening on one side and a seal 54 that liquid-tightly covers the opening of the container 53 .
  • the container 53 is made of, for example, a resin material.
  • a luminescent substrate solution 5 is stored inside the container 53 .
  • the seal 54 is, for example, an aluminum sheet and can be easily broken with a sharp knife or the like.
  • the luminescent substrate solution holding part 52 is accommodated in the second accommodating part 50 with the seal 54 facing downward so that the seal 54 faces the test strip 2 .
  • the first pressing operation portion 19 is provided with a first breaking protrusion 60 .
  • a luminescent substrate solution holding part 52 is attached to the inner surface of the second pressing operation part 20 .
  • a second breaking projection 61 and a supply port 62 are provided at the bottom of the second housing portion 50 .
  • the first breaking projection 60 and the second breaking projection 61 have sharp tips.
  • the first breaking protrusion 60 abuts the other end of the liquid feeding pad 32 when the first pressing operation portion 19 is pressed, and the other end of the liquid feeding pad 32 holds the cleaning liquid.
  • Push against seal 47 of portion 45 The seal 47 is broken by pushing the other end of the liquid feeding pad 32 by the first breaking protrusion 60 , and the other end of the liquid feeding pad 32 is dropped into the container 46 and immersed in the cleaning liquid 6 .
  • the cleaning liquid 6 is spread from the other end of the liquid transfer pad 32 toward the carrier 30 by capillary action.
  • the first pressing operation part 19 maintains the crushed state even after being crushed by the pressing operation. Therefore, the development of the cleaning liquid 6 is continued until almost all of the cleaning liquid 6 is sucked up by the liquid feeding pad 32 .
  • the luminescent substrate solution holding part 52 moves downward in the second containing part 50, and the second breaking projection 61 having the second breaking projection 61 moves downward. It reaches the bottom of the housing portion 50 . Then, the seal 54 of the luminescent substrate solution holding portion 52 is broken by the second breaking projection 61 .
  • the luminescent substrate solution 5 stored in the luminescent substrate solution holding part 52 flows from the broken portion of the seal 54 to the supply port 62, and further flows through the flow path secured by the interval D (see FIG. 13) to be supplied to the carrier 30. be done.
  • Control region C contains control binding substance 79 labeled with photoprotein 73 .
  • Control binding substance 79 specifically binds to labeled binding substance 77 .
  • the fluorescent substance 76 is trapped in the control area C.
  • FIG. Some labeled binding substances 77 do not bind to the analyte 71 .
  • Such a labeled binding substance 77 reaches the control area C without being captured in the inspection area A, and is captured in the control area C.
  • the fluorescent substance 76 is captured via the label binding substance 77, in the control region C, the photoprotein 73 and the fluorescent substance 76 are positioned close to each other.
  • BRET occurs in the control region C when the luminescent substrate 4 is developed. It can be confirmed that the sample liquid 70 has been fully developed on the carrier 30 and that the development of the sample liquid 70 has been completed by the light emitted from the fluorescent substance 76 by BRET.
  • the control binding substance 79 may be the test substance 71 itself or a compound having a site recognized by the labeled binding substance 77 .
  • a compound having a site recognized by the labeled binding substance 77 includes, for example, a compound obtained by binding a derivative of the test substance 71 to a protein.
  • an anti-mouse IgG antibody manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., product name: anti-mouse IgG (H+L), Rabbit F(ab')2, product code: 566-70621
  • an anti-mouse IgG antibody manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., product name: anti-mouse IgG (H+L), Rabbit F(ab')2, product code: 566-70621
  • the cartridge 10 of the design modification described above includes a luminescent substrate solution holding portion 52 containing the luminescent substrate solution 5 containing the luminescent substrate 4 in the cartridge 10 .
  • the immunochromatography kit 1 since the luminescent substrate solution 5 is provided in the cartridge 10, the work of measuring the luminescent substrate solution 5 from a container such as an ampoule or a vial and supplying it to the inspection area A is reduced. .
  • the cartridge 10 is provided with the second pressing operation portion 20, and by pressing the second pressing operation portion 20, the luminescent substrate solution 5 can be supplied to the test strip 14, thereby realizing a simple test. can.
  • the cartridge 10 includes a cleaning liquid holding portion 45 containing the cleaning liquid 6 inside the cartridge 10 .
  • the washing liquid 6 is provided in the cartridge 10, the work of measuring the luminescent substrate solution 5 from a container such as an ampoule or a vial and supplying it to the inspection area A is reduced.
  • the cartridge 10 is provided with the first pressing operation portion 19, and by pressing the first pressing operation portion 19, the cleaning liquid 6 can be supplied to the test strip 14, so that simple inspection can be realized.
  • the first pressing operation portion 19 and the second pressing operation portion 20 of the cartridge 10 can be operated by the user. 19 and the second pressing operation part 20 can be pressed inside the inspection device 100 .
  • the inspection device 100 includes a rectangular parallelepiped housing 101 .
  • An L-shaped tray-shaped loading section 102 into which the cartridge 10 is loaded is provided in the housing 101 .
  • a loading port 103 for the cartridge 10 is formed on the front surface of the housing 101 .
  • a lid 104 that can be opened and closed to cover the loading port 103 is attached to the front surface of the housing 101 .
  • a power switch 105 of the inspection apparatus 100 is arranged on the front surface of the housing 101 .
  • a touch panel display 106 is attached to the upper surface of the housing 101 .
  • the touch panel display 106 accepts an operation instruction such as an instruction to start an immunochromatographic examination (hereinafter referred to as an instruction to start an examination) from a user. Further, the touch panel display 106 displays information such as determination results.
  • the user opens the lid 104 to expose the loading port 103 , and loads the cartridge 10 spotted with the sample liquid 70 into the loading section 102 through the loading port 103 . After that, the user closes the lid 104 and operates the touch panel display 106 to input an inspection start instruction.
  • the inspection apparatus 100 includes a cleaning liquid supply mechanism 107, a luminescent substrate supply mechanism 108, and a detection section 110 inside a housing 101. As shown in FIG. 17, the inspection apparatus 100 includes a cleaning liquid supply mechanism 107, a luminescent substrate supply mechanism 108, and a detection section 110 inside a housing 101. As shown in FIG. 17, the inspection apparatus 100 includes a cleaning liquid supply mechanism 107, a luminescent substrate supply mechanism 108, and a detection section 110 inside a housing 101. As shown in FIG.
  • the cleaning liquid supply mechanism 107 is a mechanism for starting the supply of the cleaning liquid 6 from the cleaning liquid holding portion 45 to the carrier 30 .
  • the cleaning liquid supply mechanism 107 uses, for example, an actuator such as a solenoid provided with an electromagnet and a plunger movable with respect to the electromagnet. For example, by moving the plunger, the plunger comes into contact with the first pressing operation portion 19 and presses the first pressing operation portion 19 .
  • the cleaning liquid supply mechanism 107 is arranged at a position facing the first pressing operation portion 19 of the loaded cartridge 10 .
  • the cleaning liquid supply mechanism 107 is a pressing mechanism that applies a pressing force to the first pressing operation portion 19 from the outside by pressing the first pressing operation portion 19 of the cartridge 10 .
  • the cleaning liquid supply mechanism 107 applies a pressing force to the first pressing operation portion 19
  • the cleaning liquid 6 is supplied from the cleaning liquid holding section 45 to the carrier 30 by the above-described action.
  • the luminescent substrate supply mechanism 108 is a mechanism for starting the supply of the luminescent substrate solution 5 from the luminescent substrate solution holding part 52 to the carrier 30 .
  • the luminescent substrate supply mechanism 108 also uses an actuator such as a solenoid, like the washing liquid supply mechanism 107 .
  • the luminescent substrate supply mechanism 108 is arranged at a position facing the second pressing operation portion 20 of the loaded cartridge 10 .
  • the luminescent substrate supply mechanism 108 is a pressing mechanism that applies a pressing force to the second pressing operation portion 20 from the outside by pressing the second pressing operation portion 20 of the cartridge 10 .
  • the luminescent substrate supply mechanism 108 applies a pressing force to the second pressing operation portion 20, the luminescent substrate 4 is supplied from the luminescent substrate solution holding portion 52 to the carrier 30 by the above-described action.
  • the detection unit 110 is arranged at a position facing the observation window 18 of the case 11 .
  • the detector 110 detects light emitted from the inspection area A and the control area C.
  • FIG. Specifically, the detection unit 110 is a spectrophotometer capable of detecting light 75 generated by the reaction between the photoprotein 73 and the luminescent substrate 4 and fluorescence 78 from the fluorescent substance 76 .
  • a spectrophotometer can detect light intensity for each wavelength.
  • the inspection apparatus 100 includes a storage 140, a memory 141, and a CPU (Central Processing Unit) 142.
  • Storage 140 , memory 141 and CPU 142 are interconnected via bus line 143 .
  • Storage 140, memory 141, CPU 142, and bus line 143 constitute a computer.
  • the storage 140 is, for example, a hard disk drive or solid state drive.
  • the memory 141 is a work memory for the CPU 142 to execute processing.
  • the CPU 142 loads the program stored in the storage 140 into the memory 141 and executes processing according to the program. Thereby, the CPU 142 comprehensively controls each part of the inspection apparatus 100 .
  • An operating program 145 is stored in the storage 140 .
  • the operating program 145 is an application program for causing a computer to function as the inspection device 100 of the present disclosure.
  • the storage 140 also stores information necessary for identifying the coloring state of the inspection area A, and the like.
  • the CPU 142 cooperates with the memory 141 and the like to operate the instruction receiving unit 150, the washing liquid supply mechanism control unit 151, the luminescent substrate supply mechanism control unit 152, the detection unit control unit 153, and the determination unit 154. , and the display control unit 155 .
  • the instruction reception unit 150 receives various user operation instructions through the touch panel display 106 .
  • the instruction receiving unit 150 receives an inspection start instruction.
  • the instruction reception unit 150 manages time based on the timer 128 and sends a control start trigger signal at each timing to the cleaning liquid supply mechanism control unit 151, the luminescent substrate supply mechanism control unit 152, and the detector. output to the unit control unit 153 .
  • a control start trigger signal is output to the cleaning liquid supply mechanism control unit 151 at time t1 after a predetermined time has passed, and then a control start trigger is output to the luminescent substrate supply mechanism control unit 152 at time t2 after a predetermined time has passed.
  • the supply of the washing liquid 6, the supply of the luminescent substrate 4, and the light detection are performed at optimum timing.
  • the cleaning liquid supply mechanism control unit 151 operates the cleaning liquid supply mechanism 107 to press the first pressing operation unit 19 .
  • the washing liquid supply mechanism control unit 151 supplies the washing liquid 6 to the examination area A after the sample and the labeled binding substance 77 are supplied to the examination area A and before the luminescent substrate 4 is supplied to the examination area A. , the cleaning liquid supply mechanism 107 is operated.
  • the luminescent substrate supply mechanism control unit 152 controls to operate the luminescent substrate supply mechanism 108 and press the second pressing operation unit 20 .
  • the luminescent substrate supply mechanism control unit 152 operates the luminescent substrate supply mechanism 108 so as to supply the luminescent substrate 4 to the inspection area A after the specimen and the labeled binding substance 77 are supplied to the inspection area A.
  • the detection unit control unit 153 controls the operation of the detection unit 110 .
  • the detection unit control unit 153 drives the detection unit 110 to detect light emission from the inspection region A.
  • FIG. Specifically, an emission spectrum in a wavelength range including light 75 and fluorescence 78 is obtained.
  • the detection unit 110 outputs the acquired emission spectrum 156 to the determination unit 154 .
  • the determination unit 154 determines whether the sample is positive or negative based on the emission spectrum 156 acquired from the detection unit 110 .
  • the determination unit 154 determines whether the specimen is positive or negative based on the emission intensity of the fluorescence 78 generated from the fluorescent material 76 by BRET. For determination, not only the emission intensity of the fluorescence 78 but also the emission intensity of the light 75 generated by the reaction between the photoprotein 73 and the luminescent substrate 4 without BRET may be used.
  • the determination unit 154 outputs the determination result 157 to the display control unit 155 .
  • the determination unit 154 acquires, for example, the emission spectrum a or b as shown in FIG. 5 as the emission spectrum 156 from the detection unit 110 .
  • the determining unit 154 acquires a first emission intensity IF, which is the emission intensity of the fluorescence 78 generated by BRET, and a second emission intensity IB, which is the emission intensity of the light 75 emitted without causing BRET, from the emission spectrum a or b,
  • a light emission intensity ratio IF/IB is obtained by dividing the first light emission intensity IF by the second light emission intensity IB.
  • determination of positive or negative is performed. For example, if the emission intensity ratio IF/IB is greater than a predetermined threshold, it is determined as positive, and if it is equal to or less than the threshold, it is determined as negative.
  • the third emission intensity Iiso which is the emission intensity at the isoluminescence point where there is no change
  • the emission intensity ratio IF/Iiso which is the value obtained by dividing the first emission intensity IF by the third emission intensity Iiso.
  • a negative determination may be made. For example, if the emission intensity ratio IF/Iiso is greater than a predetermined threshold, it is determined to be positive, and if it is equal to or less than the threshold, it is determined to be negative.
  • the display control unit 155 controls display of various information on the touch panel display 106 .
  • the display control unit 155 displays the determination result 157 from the determination unit 154 on the touch panel display 106.
  • a step of spotting the sample liquid 70 onto the cartridge 10 is performed by the user.
  • the power switch 105 is operated to turn on the power of the inspection apparatus 100, and the operation program 145 is started.
  • the operation program 145 is activated, as shown in FIG. 18, the CPU 142 of the inspection apparatus 100 controls the instruction reception unit 150, the cleaning liquid supply mechanism control unit 151, the luminescent substrate supply mechanism control unit 152, the detection unit control unit 153, It functions as a determination unit 154 and a display control unit 155 .
  • the lid 104 is opened by the user, and the cartridge 10 is loaded into the loading section 102 through the loading port 103 (step ST100). After that, the lid 104 is closed by the user.
  • the inspection start instruction is accepted by the instruction accepting unit 150 (step ST110).
  • control signals are output from the instruction receiving unit 150 to the cleaning liquid supply mechanism control unit 151, the luminescent substrate supply mechanism control unit 152, and the detection unit control unit 153 at respective timings from the start of the examination.
  • the cleaning liquid supply mechanism 107 is operated under the control of the cleaning liquid supply mechanism control unit 151 at time t1 with reference to the time when the instruction is received, and presses the first pressing operation unit 19 .
  • the first pressing operation part 19 is pressed, and as shown in FIG. (Step ST120).
  • the luminescent substrate supply mechanism 108 is operated under the control of the luminescent substrate supply mechanism control unit 152, and the second pressing operation unit 20 is pressed. As a result, the second pressing operation part 20 is pushed down, and as shown in FIG. . As a result, the luminescent substrate solution 5 flows out from the supply port 62 and is supplied to the test strip 14 (step ST130).
  • the detection unit 110 is driven under the control of the detection unit control unit 153, and the wavelength including the peak wavelength of the fluorescence of the fluorescent substance 76 and the peak wavelength of the photoprotein 73 is detected. A region of emission intensity (emission spectrum 156) is detected. (Step ST140).
  • the determination unit 154 analyzes the emission spectrum 156, calculates the emission intensity ratio, and makes a positive/negative determination (step ST150). This determination result 157 is output from the determination unit 154 to the display control unit 155 .
  • a message indicating the determination result 157 is displayed on the touch panel display 106 under the control of the display control unit 155 (step ST160). This completes the immunochromatographic inspection for one cartridge 10 .
  • the inspection apparatus 100 includes the loading unit 102 in which the cartridge 10 is detachably loaded, the detection unit 110 that detects the intensity of the light emission from the fluorescent substance 76 in the inspection area A, and the and a processor (here, CPU 142) that determines whether the sample is positive or negative based on the intensity of emitted light.
  • the testing apparatus 100 of this embodiment includes a luminescent substrate supply mechanism 108 that supplies the luminescent substrate 4 to the testing area A, and the processor (here, the CPU 142) supplies the specimen and the labeled binding substance 77 to the testing area A.
  • the luminescent substrate 4 is supplied to the inspection area A by the luminescent substrate supplying mechanism 108 . That is, the luminescent substrate 4 is supplied in a state in which the specimen and the labeled binding substance 77 are specifically bound to the inspection region A.
  • the luminescence reaction between the luminescent substrate 4 and the luminescent protein 73 progresses irreversibly when the luminescent substrate 4 and the luminescent protein 73 come into contact with each other, and the luminescence intensity decreases over time. As compared with the case of pre-mixing and incubating, an effect of suppressing a decrease in luminescence intensity when detecting luminescence from the inspection area A can be obtained.
  • the first emission intensity IF which is the intensity of the emission (fluorescence 78) from the fluorescent substance 76 in the inspection area A, is detected, and the intensity of the light 75 emitted from the photoprotein 73 is detected as the second emission intensity.
  • intensity IB Detected as intensity IB, it is possible to determine positive or negative based on the emission intensity ratio IF/IB. By using the emission intensity ratio, it is possible to obtain a more accurate determination result than using only the first emission intensity IF for determination.
  • the intensity of the emission (fluorescence 78) from the fluorescent substance 76 in the inspection region A is detected as the first emission intensity IF
  • the peak wavelength of the emission from the fluorescent substance 76 and the luminescent substrate 4 and the peak wavelength of luminescence produced by the reaction with the photoprotein 73 is detected as the third luminescence intensity Iiso, and based on the luminescence intensity ratio IF/Iiso, A positive or negative determination can be made.
  • the emission intensity ratio it is possible to obtain a more accurate determination result than using only the first emission intensity IF for determination.
  • the following various processors can be used as the hardware structure of the processing unit that executes various processes.
  • the various processors include an FPGA (Field Programmable Gate Array) whose circuit configuration can be changed after manufacture.
  • Programmable Logic Device (PLD) which is a processor, and/or ASIC (Application Specific Integrated Circuit), etc. etc. are included.
  • One processing unit may be configured with one of these various processors, or a combination of two or more processors of the same or different type (for example, a combination of a plurality of FPGAs and/or a CPU and combination with FPGA). Also, a plurality of processing units may be configured by one processor.
  • a single processor is configured by combining one or more CPUs and software.
  • a processor functions as multiple processing units.
  • SoC System On Chip
  • a processor that realizes the functions of the entire system including multiple processing units with a single IC (Integrated Circuit) chip. be.
  • the various processing units are configured using one or more of the above various processors as a hardware structure.
  • an electric circuit combining circuit elements such as semiconductor elements can be used.
  • test device 100 is used to determine whether a sample is positive or negative has been described.
  • the color of light emitted from the test area A changes depending on whether it is negative or positive. It is also possible to determine whether
  • Influenza A antigen was used as the substance to be detected.
  • the test strips of Examples 1 to 3 were strips for chemiluminescence immunochromatographic testing using the sandwich method and utilizing BRET.
  • the test strips of Examples 2 and 3 were similar.
  • carrier A 60 mm ⁇ 300 mm porous carrier
  • a test region was formed by immobilizing a capture binding substance on the test region.
  • Luciferase NeLuc (registered trademark): manufactured by Promega, peak wavelength 460 nm
  • An anti-influenza type A monoclonal antibody Anti-Influenza ASPTN-5 7307, Medix Biochemica
  • a solution containing a capture binder consisting of a Luciferase-labeled anti-influenza A monoclonal antibody was prepared at 1.5 mg/mL. After applying the solution containing the prepared binding material for capture to the test area, the carrier was allowed to dry for 30 minutes.
  • a blocking solution 50 mmol/L borate buffer (pH 8.5) containing 0.5% by mass casein (derived from milk, product number 030-01505, manufactured by FUJIFILM Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • the dried carrier was immersed in the vat and allowed to stand for 30 minutes. After that, the carrier was removed and washed in 500 mL of a washing stabilizing solution (50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5) buffer containing 0.5% by mass of sucrose and 0.05% by mass of sodium cholate) prepared in a separate vat.
  • the carrier was immersed in and allowed to stand still for 30 minutes. After that, the carrier was taken out from the liquid and dried in an environment of 25° C. for 24 hours.
  • the capture antibody was immobilized on the inspection area to form the inspection area.
  • a label-retaining pad holding a label-binding substance was prepared.
  • a glass fiber pad Glass Fiber Conjugate Pad, Millipore
  • Green fluorescent protein mNeogreen Allele Biotechnology, peak wavelength 517 nm
  • an influenza A antibody was used as a labeled binding substance (here, labeled antibody).
  • Influenza A antibody-fluorescent substance conjugate was mixed with a Tris-HCl buffer (pH 8.2) with a concentration of 20 mmol/L, a PEG (Mw.20000) with a concentration of 0.05% by mass, a sucrose with a concentration of 5% by mass, Then, it was diluted with water so that the absorbance at 506 nm when the optical path length was 10 mm was 0.8, to prepare an anti-influenza A fragmented antibody-fluorescent substance complex coating solution. 0.1 mL of this coating liquid was uniformly applied to one pad and dried under reduced pressure for 24 hours. As a result, a label holding pad holding a labeled binding substance labeled with a fluorescent substance (here, a labeled antibody) was obtained.
  • a fluorescent substance here, a labeled antibody
  • back adhesive sheet An adhesive sheet of 60 mm ⁇ 300 nm (manufactured by Nippon Technocluster Co., Ltd.) was prepared as a back adhesive sheet.
  • a glass fiber pad (Glass Fiber Conjugate Pad, manufactured by Millipore) cut to 25 mm ⁇ 300 mm was used as a liquid transfer pad.
  • a glass fiber pad (glass filter paper, manufactured by Advantech) cut into a length of 12 mm and a width of 10 mm was used as an absorbent pad.
  • a test strip was produced according to the following procedure.
  • a carrier having an inspection area formed thereon was attached to the back pressure-sensitive adhesive sheet.
  • a double-faced tape (Nitto Denko) with a width of 3 mm was fixed at a position 26 mm from the downstream end of the 60 mm length of the carrier.
  • the label-retaining pad was fixed to the carrier so that the downstream end of the double-sided tape and the downstream end of the label-retaining pad overlapped.
  • a liquid-feeding pad was attached to the upstream side opposite to the downstream end of the carrier so that the liquid-feeding pad and the carrier overlapped by 7 mm.
  • the sheet member thus prepared was cut parallel to the length direction of 60 mm with a guillotine cutter (CM4000, manufactured by Nippon Technocluster Co., Ltd.) so as to have a width of 5 mm. This gave 60 strips of 5 mm width and 60 mm length.
  • a test strip was formed by placing one absorbent pad over the downstream end of one strip.
  • developing solution -1 Mock-positive specimen (BD Flu Examiner Control A + B - (manufactured by Becton Dickinson)) was mixed with the standard developing solution to obtain a developing solution-1.
  • Developing solution -2 A developer-2 was obtained by mixing the mock-positive specimen with the standard sample liquid so that the amount of the mock-positive specimen (antigen amount) was 300 times that of the developer-1.
  • Luminescent Substrate Solution As a luminescent substrate solution, a solution containing 20 ⁇ 10 ⁇ 6 M luminescent substrate (Furimazine, Promega) was used. 100 ⁇ L of the luminescent substrate solution was used for one test.
  • Example 2 In the production of the label-retaining pad of Example 1, the production method of the labeled antibody was as follows. It is common to Example 1 in that an anti-influenza A monoclonal antibody is used as the antibody. As a fluorescent substance, a fluorescent dye (peak wavelength 525 nm) of a fluorescent antibody labeling kit (Thermo-Fisher) was used. The anti-influenza A monoclonal antibody was labeled with a fluorescent dye according to the procedure of the fluorescent antibody labeling kit to obtain a labeled binding substance labeled with a fluorescent substance (here, labeled antibody). A test strip of Example 2 was prepared in the same manner as in Example 1 otherwise. The developing solution, the luminescent substrate solution and the test procedure were the same as in Example 1.
  • Example 3 The same test strip, developing solution and luminescent substrate solution as in Example 1 were used. However, in Example 3, the inspection procedure of Example 1 was incorporated with a cleaning step using a cleaning liquid. After spotting the sample liquid in 1) of the above inspection procedure, the liquid-feeding pad was immersed in the cleaning liquid, and the cleaning liquid was fed for 10 minutes. By this step, non-specifically adsorbed labeled antibodies were washed away. After that, 2) and 3) of the above inspection procedure were carried out. The cleaning liquid is supplied to the liquid-feeding pad, and the cleaning liquid is fed for 10 minutes. The liquid-feeding pad is immersed in a pot containing 200 ⁇ L of washing liquid, and the washing liquid is spread in the carrier by capillary force.
  • test strips of Comparative Examples 1 and 2 used a competitive method and were strips for chemiluminescence immunochromatography using BRET.
  • labeled pseudoantigen An anti-influenza A pseudoantigen labeled with a fluorescent substance was used as the labeled pseudoantigen.
  • a glass fiber pad Glass Fiber Conjugate Pad, Millipore) cut to 5 mm ⁇ 300 mm was prepared. Green fluorescent protein mNeogreen (peak wavelength 517 nm) was used as the fluorescent substance, and influenza A pseudoantigen was used as the labeled binding substance (here, labeled pseudoantigen).
  • a fluorescent substance-labeled anti-influenza A pseudoantigen was diluted with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.2), 5 mass% sucrose, and water, and the absorbance at 506 nm was 0 when the optical path length was 10 mm.
  • a coating liquid was prepared so as to have a value of 0.8. 0.1 mL of this coating liquid was uniformly applied to each pad to obtain a label holding pad holding a labeled pseudoantigen labeled with a fluorescent substance.
  • a test strip of Comparative Example 1 was prepared in the same manner as in Example 1 except for the above.
  • Comparative Example 2 The inspection strip of Comparative Example 2 was a strip for chemiluminescence immunochromatographic inspection without using BRET.
  • a label holding pad holding a labeled binding substance (labeled antibody in this case) was prepared.
  • a glass fiber pad (Glass Fiber Conjugate Pad, Millipore) cut to 5 mm ⁇ 300 mm was prepared.
  • Green fluorescent protein mNeogreen (Allele Biotechnology, peak wavelength 517 nm) was used as a fluorescent substance, and an anti-influenza A monoclonal antibody (Anti-Influenza ASPTN-5 7307, Medix Biochemica) was used as a labeled antibody.
  • a labeled antibody solution consisting of an anti-influenza A monoclonal antibody labeled with a fluorescent protein, diluted with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.2), 5 mass% sucrose, and water to give an optical path length of 10 mm was adjusted to an absorbance of 0.8 at 506 nm. 0.1 mL of this coating solution was uniformly applied to each glass fiber pad to obtain a holding pad holding a labeled antibody labeled with a fluorescent substance.
  • a test strip of Comparative Example 2 was produced in the same manner as in Example 1 except for the above.
  • a labeled pseudoantigen is immobilized in the test area of the test strip of Comparative Example 2, and the labeled antibody that does not bind to the antigen, which is the test substance, is captured by the labeled pseudoantigen.
  • the antigen, which is the test substance, and the labeled pseudoantigen competitively bind to the labeled antibody.
  • the developing solution, luminescent substrate solution, and test procedure were the same as in Example 1.

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Abstract

イムノクロマトグラフキット及び検査装置に関し、イムノクロマトグラフキットは、検体が展開され、検体に含まれる被検物質を捕捉する検査領域を有する検査用ストリップを収容したカートリッジと、被検物質と特異的に結合する捕捉用結合物質であって、発光タンパク質で標識され、検査領域に固定化された捕捉用結合物質と、被検物質と特異的に結合する標識結合物質であって、蛍光物質で標識され、検査領域に供給される標識結合物質と、検査領域に供給される発光基質であって、発光タンパク質と反応することによりエネルギーを生じ、捕捉用結合物質に、被検物質を介して標識結合物質が捕捉された状態において、エネルギーが蛍光物質に移動する生物発光エネルギー共鳴移動現象を生じさせる発光基質と、を備える。

Description

イムノクロマトグラフキット及び検査装置
 本開示は、イムノクロマトグラフキット及び検査装置に関する。
 尿、血液等の生体試料中に存在する被検物質を定性的に、あるいは定量的に測定する方法として、免疫学的測定方法が汎用されている。その中でもイムノクロマトグラフ法は、操作が簡便であり、短時間で測定可能であることから、利便性が高い。
 イムノクロマトグラフ法では、被検物質(例えば、抗原)に特異的に結合する抗体(捕捉抗体)を検査領域に固定した検査用ストリップを用いる。イムノクロマトグラフ法で用いられているアッセイ手法としては、サンドイッチ法及び競合法が広く使われている。サンドイッチ法では、検査用ストリップに、抗原と特異的に結合する標識化された抗体(標識抗体)及び検体を展開し、検体内に抗原が含まれている場合には、検査領域において、捕捉抗体-抗原-標識抗体の複合体を形成させる。そして、標識抗体の標識による発色などの信号を検出することにより、被検物質である抗原を定性的あるいは定量的に測定する。一方、競合法では、検査用ストリップに標識化された疑似抗原(標識疑似抗原)及び検体液を展開し、検査領域の捕捉抗体に、検体液中の抗原と標識疑似抗原とを競合的に捕捉させる。そして、検査領域に捕捉された標識疑似抗原の標識による発色などの信号を検出することにより、被検物質である抗原を定性的あるいは定量的に測定する。サンドイッチ法では、検体中の抗原量が多くなるにつれて標識による信号強度が増加するのに対して、競合法では、検体中の抗原量が多くなるにつれて標識による信号強度が低下する。
 上記のようなイムノクロマトグラフ法において、標識として発光タンパク質を用い、発光タンパク質と発光基質とを化学反応させることによって生じる発光タンパク質による発光を検出する化学発光イムノクロマトグラフ法が知られている(例えば、特開2015-105858号公報)。化学発光イムノクロマトグラフ法では、検査領域に捕捉抗体が固定された検査用ストリップに対し、検体及び発光タンパク質で標識された標識抗体を展開させる。その後、検査用ストリップに、標識である発光タンパク質と反応して光を生じさせる発光基質を展開する。検査領域に捕捉されている標識抗体を介して捕捉されている発光タンパク質と発光基質とが反応して生じる発光を検出することにより、被検物質である抗原を定性的あるいは定量的に測定する。
 また、特表2018-522221号公報には、競合法を用いた化学発光イムノクロマトグラフ法であって、発光タンパク質と、蛍光物質との間で生じる生体発光共鳴エネルギー転移(BRET : Bioluminescence Resonance Energy Transfer)という技術を用いることが開示されている。特表2018-522221号公報では、発光タンパク質が標識された捕捉抗体が検査領域に固定された検査用ストリップを用い、検体、予め用意されている蛍光物質が標識された標識疑似抗原、及び発光タンパク質と反応を生じさせる発光基質とを検査用ストリップに展開させる。そして、検体中の抗原と、標識疑似抗原とを競合的に捕捉抗体に捕捉させる。検査領域では、発光タンパク質と蛍光物質とが近接している場合、発光基質と発光タンパク質とが反応して生じるエネルギーが蛍光物質に転移して蛍光が生じる。特表2018-522221号公報に記載の化学発光イムノクロマトグラフ法においては、検体中の抗原が捕捉される量が多くなるほど、検査領域に捕捉される標識疑似抗原の量が少なくなるので、BRETによる蛍光は小さくなる。検査領域では、このBRETによる蛍光を検出することにより、被検物質である抗原を定性的あるいは定量的に測定する。
 特開2015-105858号公報の場合、検査ストリップにおいて検査領域を含めた全域に発光タンパク質で標識化された標識抗体が展開される。このうち、一部の標識抗体は抗原抗体反応によって抗原と特異的に結合するが、残りの標識抗体の一部は、抗原と特異的に結合しないにも関わらず、検査領域の周辺に残存する場合がある。検査ストリップに発光基質が展開されると、抗原と特異的に吸着した標識抗体の標識ばかりでなく、残存した標識抗体の標識である発光タンパク質と発光基質とが反応する。検査領域の周辺領域をバックグラウンドとすると、バックグラウンドにおいても残存した標識抗体に起因する発光が生じることになる。バックグラウンドにおける光信号は、抗原抗体反応によって生じる光信号に対してノイズとなるので、S(Signal)/N(Noise)比が低下することにより、測定精度が低くなってしまう。
 特表2018-522221号公報では、発光タンパク質は捕捉抗体の標識として検査領域にのみ固定されている。そのため、捕捉抗体の発光タンパク質と標識抗体の蛍光物質とが近接する検査領域においてのみBRETにより蛍光が生じるので、捕捉抗体が存在しないバックグラウンドにおいて蛍光は生じない。ただし、特表2018-522221号公報で用いられている競合法では、検体中に抗原が存在しない状態において検査領域に固定された捕捉抗体と結合する標識疑似抗原の量が最大となるため、抗原が存在しない状態で最も信号強度が大きく、抗原量が大きくなるにつれて信号強度が小さくなる。つまり、抗原が存在しない状態において信号強度が最大となり、これが抗原量を測定するための信号強度のベースラインとなるが、様々な要因によりベースラインの信号強度の変動があるという問題があった。というのも、検体中に抗原が存在しない状態において捕捉抗体に結合する標識疑似抗原の量は、検査ストリップへ検体を点着する際の勢い及び点着する検体量の多少などに起因する流体速度の変動によって変化する。また、BRETでは発光タンパク質と蛍光物質との距離に応じて蛍光の信号強度が変化する。そのため、捕捉抗体と結合する標識疑似抗原の結合状態に変動があるとベースラインも変動してしまう。ベースラインがばらつくと測定精度は低下する。特に、検体中の抗原量が少ないほど、すなわち検体中の抗原濃度が低いほど、ベースラインの測定毎の信号強度の変動が測定精度に与える影響が大きい。
 インフルエンザなどの感染症の感染初期は検体に含まれるウイルスが極微量であるため、被検物質が極微量であっても検出できる、イムノクロマトグラフキット及び検査装置が求められている。
 本開示は、上記事情に鑑みてなされたものであって、従来と比べて、検体中の被検物質濃度が低い場合でも高精度の測定が可能なイムノクロマトグラフキット及び検査装置を提供することを目的とする。
 本開示のイムノクロマトグラフキットは、検体が展開され、検体に含まれる被検物質を捕捉する検査領域を有する検査用ストリップを収容したカートリッジと、
 被検物質と特異的に結合する捕捉用結合物質であって、発光タンパク質で標識され、検査領域に固定化された捕捉用結合物質と、
 被検物質と特異的に結合する標識結合物質であって、蛍光物質で標識され、検査領域に供給される標識結合物質と、
 検査領域に供給される発光基質であって、発光タンパク質と反応することによりエネルギーを生じ、捕捉用結合物質に、被検物質を介して標識結合物質が捕捉された状態において、エネルギーが蛍光物質に移動する生物発光エネルギー共鳴移動現象を生じさせる発光基質と、を備えている。
 発光タンパク質は、青色発光を生じさせる発光タンパク質であり、蛍光物質は、量子収率が0.7以上の緑色の蛍光を発する緑色蛍光色素又は緑色蛍光タンパク質であってもよい。
 発光タンパク質は、青色発光を生じさせる青色発光タンパク質であり、蛍光物質は、530nm以上にピーク波長を有していてもよい。
 検体を採取するための検体採取具を含んでいてもよい。
 検体及び標識結合物質を検査領域に供給した後に、発光基質を検査領域に供給する旨の検査手順が記載された取扱説明書を含んでいてもよい。
 
 検査用ストリップ上の、検体の供給位置に、標識結合物質を備えた標識保持パッドが配置されていてもよい。
 カートリッジ内に、発光基質を含む基質溶液を内包する発光基質溶液保持部を備えてもよい。
 検体及び標識結合物質を検査領域に供給した後、かつ、発光基質を検査領域に供給する前に、検査領域に供給される洗浄液であって、検査領域に非特異吸着した標識結合物質を洗浄する洗浄液をさらに備えてもよい。
 カートリッジ内に、洗浄液を内包する洗浄液保持部を備えてもよい。
 本開示の検査装置は、本開示のイムノクロマトグラフキット中のカートリッジが、着脱可能に装填される装填部と、
 検査領域における蛍光物質からの発光の強度を検出する検出部と、
 検出部から取得した発光の強度に基づいて検体が陽性か陰性かの判定を行うプロセッサとを備えている。
 本開示の検査装置は、発光基質を検査領域に供給する発光基質供給機構を備え、
 プロセッサは、検体及び標識結合物質が検査領域へ供給された後に、発光基質供給機構によって検査領域に発光基質を供給するものであってもよい。
 本開示の検査装置は、装填部には、洗浄液保持部を内部に備えたカートリッジが装填され、
 洗浄液を検査領域に供給する洗浄液供給機構をさらに備え、
 プロセッサは、検体及び標識抗体が検査領域に供給された後、かつ、発光基質を検査領域に供給する前に、洗浄液供給機構によって検査領域に洗浄液を供給してもよい。
 本開示の検査装置においては、検出部は、検査領域における蛍光物質からの発光の強度(蛍光物質のピーク波長での発光強度)を第1発光強度として検出し、発光タンパク質からの発光の強度(発光タンパク質のピーク波長での発光強度)を第2発光強度として検出し、プロセッサは、検出部から第1発光強度と第2発光強度を取得し、第1発光強度を第2発光強度で除した値を用いて、判定を行ってもよい。
 本開示の検査装置においては、検出部は、検査領域における蛍光物質からの発光の強度を第1発光強度として検出し、蛍光物質からの発光のピーク波長と発光タンパク質からの発光のピーク波長との間の波長域に存在する等発光点での発光の強度を第3発光強度として検出し、プロセッサは、検出部から第1発光強度と第3発光強度を取得し、第1発光強度を第3発光強度で除した値を用いて、判定を行ってよい。
 本開示のイムノクロマトグラフキット及び検査装置によれば、従来と比べて、検体中の被検物質濃度が低い場合でも高精度の測定が可能である。
イムノクロマトグラフキットの全体構成を示す図である。 カートリッジの分解斜視図である。 イムノクロマト検査の手順を示す図である。 (a)は陰性時の検査領域からの発光を説明する図であり、(b)は陽性時の検査領域からの発光を説明する図である。 (a)は陰性時の検査領域から検出される発光スペクトルの一例を示す図であり、(b)は陽性時の検査領域から検出される発光スペクトルの一例を示す図である。 BRETにより蛍光物質から生じる光の発光強度と被検物質濃度との関係を示す図である。 陰性時及び陽性時における等発光強度点を示す図である。 BRETを用いない化学発光イムノクロマトグラフ検査(従来技術1)における検査領域からの発光を説明する図である。 競合法、かつBRETを用いた化学発光イムノクロマトグラフ検査(従来技術2)に関し、(a)は陰性時の検査領域からの発光を説明する図であり、(b)は陽性時の検査領域からの発光を説明する図である。 従来技術2におけるBRETにより蛍光物質から生じる光の発光強度と被検物質濃度との関係を示す図である。 設計変更例のカートリッジの斜視図である。 設計変更例のカートリッジの分解斜視図である。 設計変更例のカートリッジの破断側面図である。 第1押圧操作部が押し込まれた状態を示すカートリッジの破断側面図である。 第1押圧操作部に加えて第2押圧操作部が押し込まれた状態を示すカートリッジの破断側面図である。 検査装置を示す斜視図である。 検査装置の内部を示す断面図である。 検査装置のCPUの処理部を示すブロック図である。 検査装置の処理手順を示すフローチャートである。
 以下、本開示のイムノクロマトグラフキット及び検査装置の具体的な実施形態を、図面を参照しながら説明する。各図面において同一の符号を用いて示される構成要素は、同一の構成要素であることを意味する。
 図1及び図2に示すように、一実施形態のイムノクロマトグラフキット1は、検査用ストリップ2を収容したカートリッジ3と、発光基質4を含む発光基質溶液5と、洗浄液6と、検体採取具7と、取扱説明書8とを備える。
 カートリッジ3は、検体毎に1つずつ用いられる1回使用型であり、細長直方体状のケース21を有する。ケース21はケース本体22とカバー部材23とで構成される。ケース本体22は、細長板状であり、検査用ストリップ2を収容する凹部を備える。カバー部材23は、検体滴下口24、発光基質滴下口26及び観察窓28を備える。なお、図2中のX方向およびY方向はいずれも水平面に沿う方向であり、互いに直交している。X方向はケース21の短辺に沿う方向であり、Y方向はケース21の長辺に沿う方向である。Z方向は鉛直方向に沿う方向であり、X方向およびY方向と直交している。以降の図面において同様である
 検体滴下口24は、検体を含む試料液70(図3参照)が滴下される丸穴である。検体は、被検物質71を含み得るものであれば何でもよく、特に限定されるものではない。検体は、イムノクロマト検査の対象の個体、特には動物、さらに言えば人の生物学的試料、例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、便、膿、鼻汁、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、鼻腔吸引液、または喀痰等、さらには臓器、組織、粘膜、および皮膚、またはそれらを含むスワブ、あるいは動植物それ自体もしくはそれらの乾燥体を含む。被検物質71としては、抗原、抗体、タンパク質、および低分子化合物等が挙げられる。
 なお、洗浄液6も検体滴下口24から滴下される。
 発光基質滴下口26は、発光基質4を含む発光基質溶液5が滴下される丸穴である。ここで、発光基質溶液5を滴下する、とは、発光基質4を滴下することと同義である。発光基質4については、後述する。
 観察窓28は、検査用ストリップ2の検査領域Aを外部から観察するための矩形状の開口である。観察窓28は検体滴下口24と発光基質滴下口26との間に形成されている。
 検体採取具7は、検体を採取するための用具であり、本例においては、鼻腔拭い液を採取するためのスワブが用いられる。検体採取具7としては、上記検体に応じ適宜の採取具を備えることができる。なお、検体を採取したスワブを、図示しない展開液(検体処理液ともいう。)に浸し、採取した検体を抽出して、試料液70を調製する(図3参照)。このようにして得られた、検体を含む試料液70を検体滴下口24から滴下する。すなわち、試料液70を滴下するとは、検体を滴下することと同義である。
 取扱説明書8には、検査用ストリップ2、発光基質溶液5、洗浄液6および検体採取具7等の使用方法、及び検査手順等が記載されている。取扱説明書8には、検体及び標識結合物質を検査領域Aに供給した後に、発光基質4を検査領域Aに供給する旨の検査手順が記載されているが、検査手順についての詳細は後述する。なお、イムノクロマトグラフキット1に同梱される取扱説明書8としては、検査手順そのものが記載された冊子の他、電子データの形態でサーバにアップロードすることにより提供される検査手順書に通信回線を介してアクセスするためのアクセスコード(URL:Uniform Resource Locatorなど)が記載された書面でもよい。
 図2及び図3を参照しながらカートリッジ3の構成及び機能について詳細に説明する。図2はカートリッジ3の構成を示す図であり、図3はカートリッジ3を用いた検査手順を示す図である。図2に示すように、検査用ストリップ2は、全体的に細長矩形板状をしており、担体30、標識保持パッド31、吸収パッド33、およびバック粘着シート34を有する。
 担体30は、例えばニトロセルロースメンブレン等の多孔質の不溶性材料により形成されている。担体30の中央付近、検体に含まれる被検物質71(図3参照)を捕捉する検査領域Aが設けられている。検査領域Aには、発光タンパク質73(図3参照)で標識された捕捉用結合物質74(図3参照)が固定化されている。
 捕捉用結合物質74は、被検物質71と特異的に結合する結合物質である。捕捉用結合物質74は、例えば、被検物質71が抗原である場合は、その抗原に対する抗体であり、被検物質71が抗体である場合は、その抗体に対する抗原である。被検物質71がタンパク質および低分子化合物等の場合は、捕捉用結合物質74は、タンパク質および低分子化合物等に対するアプタマーである。
 捕捉用結合物質74に標識される発光タンパク質73は、発光基質4と反応して発光を生じさせるタンパク質である。
 標識保持パッド31は、検体滴下口24と対向する担体30の位置に取り付けられている。検体滴下口24に滴下された試料液70は、この標識保持パッド31に点着される。つまり、標識保持パッド31は検査用ストリップ2上の、検体の供給位置に配置されている。
 標識保持パッド31には、蛍光物質76(図3参照)で標識された標識結合物質77を含む。標識結合物質77は、被検物質71と特異的に結合する結合物質である。標識結合物質77は、例えば、被検物質71が抗原である場合は、その抗原に対する抗体であり、被検物質71が抗体である場合は、その抗体に結合可能な二次抗体である。被検物質71がタンパク質および低分子化合物等の場合は、標識結合物質77は、タンパク質および低分子化合物等に対するアプタマーである。
 捕捉用結合物質74と標識結合物質77は同一のものであってもよいし、異なるものであってもよい。例えば、被検物質71がインフルエンザA型ウイルスあるいはそのバイオマーカーである場合、捕捉用結合物質74および標識結合物質77として、抗インフルエンザA型モノクローナル抗体(Medix Biochemica社製、製品名:Anti-Influenza A SPT N-5 7307)を用いることができる。
 蛍光物質76は、励起エネルギーが与えられることにより蛍光を生じる蛍光色素あるいは蛍光タンパク質などである。
 発光タンパク質73と蛍光物質76とは、発光タンパク質73の発光スペクトルの波長域と蛍光物質76の励起スペクトルの波長域とに被りがあるものが選択される。発光タンパク質73の発光スペクトルが蛍光物質76の励起スペクトルと被っている波長域があれば、エネルギー移動が生じ得る。
 発光タンパク質73は、一例として青色光を生じさせる発光タンパク質であり、この場合、量子収率が0.7以上である蛍光物質76を緑色の蛍光を発する緑色蛍光色素または緑色蛍光タンパク質とすることができる。ここで、青色の光とは、約430nm~約490nmの波長域内に極大発光波長(以下、ピーク波長という)を有する光であり、緑色の光とは、約490nm~約550nmの波長域内にピーク波長を有する光である。また、発光タンパク質73のピーク波長と、蛍光物質76のピーク波長とは40nm以上異なることが好ましい。一例として、発光タンパク質73が青色発光を生じさせる青色発光タンパク質である場合、蛍光物質76を530nm以上にピーク波長を有する蛍光色素または蛍光タンパク質とすることができる。ピーク波長が離れているほど、それぞれの光のピークを識別しやすいため、好ましい。例えば、発光タンパク質73が、約430nm~約490nmの青色の光の波長域内にピーク波長を有する場合において、蛍光物質76が、約640nm~770nmの赤色の光の波長域内にピーク波長を有する、などである。
 発光基質4は、発光タンパク質73と反応して酸化されることによりエネルギーを生じ、励起状態になり、基底状態に遷移する際に発光を生じる。一方、発光タンパク質73と蛍光物質76とが近接し位置している場合、発光基質4が発光タンパク質73と反応して生じたエネルギーが蛍光物質76に移動する生物発光エネルギー共鳴移動現象(BRET)が生じる。これによって、蛍光物質76が発光する。すなわち、発光基質4と発光タンパク質73とが反応して生じる発光のエネルギーEにより、蛍光物質76が励起されて蛍光物質76から蛍光が生じる。本開示のイムノクロマトグラフキット1を用いた検査においては、このBRETによる蛍光物質76からの発光を検出することにより、検体が陽性であるか陰性であるかを判定する。検査手順についての詳細は後述する。
 発光タンパク質73、蛍光物質76および発光基質4の組み合わせの具体例としては、青色発光タンパク質であるNanoLuc(登録商標、プロメガ社製)、緑色蛍光タンパク質であるmNeongreen(Allele Biotechnology社製)、およびFurimazine(プロメガ社製)の組み合わせが挙げられる。
 吸収パッド33は、標識保持パッド31が取り付けられている担体30の一端とは反対側の他端に取り付けられている。吸収パッド33は担体30と同様に多孔質材料により形成されている。吸収パッド33は、担体30に展開された試料液70、洗浄液6、および発光基質溶液5を吸収する。
 バック粘着シート34は表面が粘着面となった基材であり、担体30が粘着固定される。
 洗浄液6は、検体及び標識結合物質77を検査領域Aに供給した後、かつ、発光基質4を検査領域Aに供給する前に、検査領域Aに供給される。洗浄液6は、検査領域Aに非特異吸着した標識結合物質77を洗浄する。ここで、「非特異吸着」とは、標識結合物質77が、被検物質71と捕捉用結合物質74との特異的な結合に依らず、担体上に吸着した状態をいう。
 以下、図3を参照して、イムノクロマト検査の手順を説明する。ここでは、検体が被検物質71を含んでいる場合、つまり、検体が陽性である場合を例に説明する。なお、図3においては、バック粘着シート34の図示を省略している。
 まず、ステップST1に示すように、試料液70が標識保持パッド31に点着される。標識保持パッド31に点着された試料液70中の被検物質71は、標識保持パッド31の標識結合物質77と特異的に結合する。
 ステップST2に示すように、試料液70は標識保持パッド31から担体30に浸透し、毛細管現象により検査領域A側(下流側)に展開される。検査領域Aに到達した被検物質71が捕捉用結合物質74に捕捉される。これにより、被検物質71と標識結合物質77を介して蛍光物質76が、検査領域Aの捕捉用結合物質74に捕捉される。
 ステップST3に示すように、検査領域Aで捕捉されなかった標識結合物質77はさらに下流側の吸収パッド33まで展開される。なお、標識結合物質77の一部は吸収パッド33まで展開されず、担体30上に非特異に吸着する場合がある。
 次に、ステップST4に示すように、洗浄液6が供給される。洗浄液6は標識保持パッド31を介して担体30に供給され、毛細管現象により検査領域A側(下流側)に展開される。この洗浄液6の展開により、担体上に非特異吸着した標識結合物質77を洗浄する。この際、検査領域Aに非特異吸着した標識結合物質77は洗浄液6と共に、吸収パッド33へと流される。
 その後、ステップST5に示すように、発光基質溶液5が供給される。発光基質溶液5は、検査領域Aよりも下流側から担体30に供給され、検査領域A側(上流側)に展開される。
 ステップST6に示すように、検査領域Aに到達した発光基質溶液5に含まれる発光基質4が、検査領域Aに固定されている発光タンパク質73と反応する。この反応により生じたエネルギーEが、捕捉された蛍光物質76に移動するBRETが生じ、蛍光物質76から蛍光78が生じる。検査領域Aからの発光により、検体が陽性か陰性かを判定することができる。
 なお、検査領域Aからの発光は、後述する検査装置100(図16および図17参照)における分光光度計などの検出部110により検出される。
 ここで、陽性および陰性のそれぞれの場合の検査領域Aからの発光について図4および図5を参照して説明する。
 図4は、(a)検体が陰性である場合(陰性時)の検査領域Aからの発光、および(b)検体が陽性である場合(陽性時)の検査領域Aからの発光を、それぞれ説明するための模式的である。図5は、(a)陰性時の検査領域Aからの発光スペクトル、および(b)陽性時の検査領域Aからの発光スペクトルを示す。なお、一例として、発光タンパク質73が発光する光75はピーク波長が460nmの青色光とし、蛍光物質76が発光する蛍光はピーク波長が530nmの緑色光とする。
 検体が陰性である場合、検体に被検物質71が含まれていないので、図4(a)に示すように、検査領域Aの捕捉用結合物質74に被検物質71は捕捉されず、結果として蛍光物質76も捕捉されない。この状態で、発光基質4が検査領域Aに供給されると、発光基質4が発光タンパク質73と反応して発光エネルギーを生じ、発光する。この際、発光タンパク質73の光75が生じる。検体が陰性である場合、一例として、図5(a)に示す、460nmにピークを有する発光スペクトルaが得られる。図5(a)に示す発光スペクトルaは、光75が、460nmのピーク波長を有する青色光の場合の発光スペクトルの一例である。
 検体が陽性である場合、図4(b)に示すように、検査領域Aの捕捉用結合物質74には、被検物質71が捕捉され、被検物質71を介して蛍光物質76が捕捉される。この状態で、発光基質4が検査領域Aに供給されると、発光基質4が発光タンパク質73と反応して発光エネルギーEを生じ、BRETにより蛍光物質76から蛍光78が生じる。蛍光78は、ピーク波長が530nmの緑色光である。なお、陽性の場合でも、検査領域Aにおいては、被検物質71を捕捉していない捕捉用結合物質74も存在する。そのため、蛍光物質76を捕捉していない捕捉用結合物質74の発光タンパク質73と発光基質4とが反応した場合、BRETが生じず、発光タンパク質73に依存するピーク波長460nmの光75が生じる。従って、検査領域Aからは蛍光78と光75とが同時に発光し、検査領域Aからは、一例として、図5(b)に示すように、波長460nmと530nmにピークを有する発光スペクトルbが得られる。
 なお、図6に示すように、検体中の被検物質71が多いほど、すなわち、被検物質71の濃度が大きくなるほど、BRETによる蛍光物質76からの発光強度が大きくなる。そして、相対的に発光基質4と発光タンパク質73が反応して発光基質4から生じる光75が小さくなる。すなわち、検体中に被検物質71が存在しない陰性時には、図5(a)に示すように460nmにピーク波長を有する光75の発光スペクトルが得られ、検体中の被検物質71量が多くなるにつれて、検出される発光スペクトル中の460nmピークが
小さくなり、相対的に530nmピークが大きくなる。
 なお、後述する検査装置100(図16参照)を用いた場合、図5に示すような発光スペクトルaあるいはbを検出し、BRETによって生じる蛍光78の発光強度IF(以下において、第1発光強度IFという。)とBRETを生じず発光した光75の発光強度IB(以下において、第2発光強度IBという。)とを取得し、第1発光強度IFを第2発光強度IBで除した値IF/IB(以下において、発光強度比IF/IBという。)を求めて、陽性か陰性かの判定を行うことができる。例えば、発光強度比IF/IBが予め定められた閾値よりも大きければ陽性と判定し、閾値以下であれば陰性と判定するなどである。
 なお、判定に用いる発光強度比としては、図7に示すように、陰性の場合の発光スペクトルa、陽性の場合の発光スペクトルbとで発光強度が変化しない等発光点での発光強度Iiso(以下において、第3発光強度Iisoという、)を用い、BRETによって生じる蛍光78の発光強度IFを等発光点での発光強度Iisoで除した比IF/Iiso(発光強度比IF/Iiso)を求めて、陽性か陰性かの判定を行ってもよい。例えば、発光強度比IF/Iisoが予め定められた閾値よりも大きければ陽性と判定し、閾値以下であれば陰性と判定するなどである。
 既述の特開2015-105858号公報に記載のBRETを用いない化学発光イムノクロマトグラフ法では、図8示すように、検査用ストリップ202の検査領域A2に標識されていない捕捉抗体204が固定されており、標識抗体207の標識として発光タンパク質73が用いられる。検体が陽性の場合、被検物質71を介して、発光タンパク質73が標識された標識抗体207を捕捉する。この状態で発光基質4が検査領域A2に供給されるので、発光基質4が発光タンパク質73と反応して発光する。この際、発光基質4と発光タンパク質73とが反応し、発光タンパク質73のピーク波長の光75が生じる。この手法では、非特異吸着した標識抗体207が存在する場合には、被検物質71と結合していない場合であっても、非特異吸着した標識抗体207の標識である発光タンパク質73と発光基質4とが反応して発光する。検査領域A2の周辺領域における、非特異吸着した標識抗体207の発光タンパク質73に起因する発光はバックグラウンドを上昇させることになり、S/N比が低下し、測定精度が低くなる、という問題があった。
 これに対し、本実施形態のイムノクロマトグラフキット1は、検体が展開され、検体に含まれる被検物質71を捕捉する検査領域Aを有する検査用ストリップ2を収容したカートリッジ3と、発光タンパク質73で標識され、検査領域Aに固定化された捕捉用結合物質74と、蛍光物質76で標識され、検査領域Aに供給される標識結合物質77と、発光基質4とを備える。
 かかる構成によれば、発光基質4と発光タンパク質73とが反応することにより生じるエネルギーEは、被検物質71を介して標識結合物質77が捕捉された状態において、蛍光物質76へ移動して、蛍光物質76から蛍光78を生じさせる。このエネルギーが移動するBRETという現象は、発光タンパク質73と蛍光物質76とが近接している状態(例えば、10nm程度以下の距離に位置する状態)である場合に生じる。従って、標識結合物質77が捕捉用結合物質74に捕捉していない場合には、発光タンパク質73と蛍光物質76とが近接していないために、BRETは生じない。そのため、検査領域Aの周辺領域において標識結合物質77が非特異吸着しても、この非特異吸着した標識結合物質77に標識されている蛍光物質76は励起されず、蛍光を生じない。従って、検査領域Aの周辺領域における、非特異吸着した標識結合物質77が生じても、バックグラウンドを上昇させず、S/N比の高い測定ができる。すなわち、BRETを用いた測定により判定が可能な本実施形態のイムノクロマトグラフキット1は、上記のBRETを用いていない従来の化学発光イムノクロマト法に比べて、バックグラウンドを抑制できるので、測定精度が高い。検査用ストリップ2の検査領域Aに発光タンパク質73で標識された捕捉用結合物質74が固定されており、この発光タンパク質73で標識された捕捉用結合物質74と発光基質4が反応した場合にのみ発光反応が生じる。また、この捕捉用結合物質74に被検物質71を介して標識結合物質77が捕捉された場合のみBRETによる蛍光物質76からの蛍光78が検出される。したがって、検査領域A以外の部分での発光が抑えられ、バックグラウンドの抑制ができ、測定精度を向上することができる。
 また、既述の特表2018-522221号公報に記載の競合法を用い、かつ、BRETを利用した化学発光イムノクロマトグラフ法では、本開示の技術と同様に、検査用ストリップ203の検査領域A3に発光タンパク質73が標識された捕捉抗体204が固定されている。特開2015-105858号公報に記載の競合法では、検体と共に蛍光物質76が標識された標識疑似抗原72及び発光基質4が検査用ストリップ203に展開される。図9は、(a)検体が陰性である場合(陰性時)の検査領域A3からの発光、および(b)検体が陽性である場合(陽性時)の検査領域A3からの発光を、それぞれ説明するための模式的である。図9(a)に示すように、陰性時には、検査領域A3の捕捉抗体204に、標識疑似抗原72が捕捉され、発光基質4と発光タンパク質73とが反応して生じた発光エネルギーEが蛍光物質76に転移して蛍光物質76から蛍光78が生じる。また、図9(b)に示すように、陽性時には、検査領域A3の捕捉抗体204に、標識疑似抗原72と被検物質71とが競合的に捕捉される。被検物質71は標識を備えていないため、被検物質71を捕捉した捕捉抗体204を標識する発光タンパク質73と発光基質4が反応して生じた発光エネルギーEは蛍光物質76に転移することなく、光75となり発光する。従って、陽性の場合は、BRETによる蛍光物質76からの蛍光78が減少し、発光タンパク質73と発光基質4とが反応することにより生じる光75が増加する。
 すなわち、競合法によれば、図10に示すように、検体中に被検物質71が存在しない状態でBRETによる蛍光物質76から生じる蛍光78の発光強度が最も大きく、被検物質71の量が多くなる(被検物質濃度が大きくなる)につれてBRETによる蛍光物質76から生じる蛍光78の信号強度が小さくなる。検体中に被検物質71である抗原が存在しない場合、捕捉抗体204に結合するのは標識疑似抗原72である。この被検物質71が存在しない場合、捕捉抗体204に結合する抗原の量や結合の仕方は、検体量のばらつきに伴う流体速度の変動および反応温度などによって変動し、結果として信号強度にばらつきが生じやすい。被検物質71が極微量である場合と被検物質71が存在しないベースラインとの差が出にくくなり、被検物質71が極微量である場合の測定精度が低い、という問題がある。
 これに対し、本実施形態のイムノクロマトグラフキット1では、検査用ストリップ2の検査領域Aにおいて、捕捉用結合物質74と標識結合物質77とで被検物質71を挟むサンドイッチ法を用いている。そのため、競合法を用いた従来のBRETに比べて、検体中の被検物質量が少ない場合における測定精度が高い。サンドイッチ法では、被検物質71が存在しない場合には、BRETによる蛍光物質から生じる蛍光の信号強度がゼロであり、被検物質71の量が増加するにしたがって、信号強度が大きくなる(図6参照)。そのため、被検物質71が極微量である場合における信号強度の変化を検出し易く、被検物質71がごく微量である場合の測定精度が高い。
 本実施形態においては、洗浄液6を備え、検体及び標識結合物質77を検査領域Aに供給させた後であって、発光基質4を検査領域Aに供給する前に検査領域Aに供給する。洗浄液6により、非特異吸着した標識抗体207を除去することができるので、測定精度を向上させることができる。
 上記実施形態のイムノクロマトグラフキット1は、洗浄液6および発光基質4を含む発光基質溶液5を、カートリッジとは別に備えている。しかし、本開示のイムノクロマトグラフキットにおいて、カートリッジは、検査用ストリップのみならず、発光基質4を含む発光基質溶液5を内包する発光基質溶液保持部52および洗浄液6を内包する洗浄液保持部45の少なくとも一方を内包するものであってもよい。
 次に、設計変更例のカートリッジ10及び検査装置100について説明する。なお、図1~4を参照して説明したカートリッジ3と同等の構成要素については同一の符号を付し、詳細な説明を省略する。
 図11および図12に示す設計変更例のカートリッジ10は、細長直方体状のケース11を有する。ケース11はケース本体12とカバー部材13とで構成される。ケース本体12は、細長矩形板状の底板と、底板の4つの辺から垂直に立設された4つの側板とで囲まれた収容空間を有する箱である。このケース本体12の収容空間に、検査領域Aが設けられた検査用ストリップ14が収容される。
 カバー部材13は、ケース本体12の底板と同じく細長矩形板状をしており、ケース本体12の収容空間を覆う蓋として機能する。
 カバー部材13には検体滴下口17および観察窓18が形成されている。また、カバー部材13には第1押圧操作部19および第2押圧操作部20が設けられている。これら検体滴下口17、観察窓18、第1押圧操作部19、および第2押圧操作部20は一体成形されている。
 検体滴下口17は、試料液70が滴下される丸穴であり、縁が表面から突出したボス状をしている。検体滴下口17は、カバー部材13の中心部に形成されている。
 観察窓18は、検査用ストリップ14の検査領域A等を外部から観察するための矩形状の開口である。観察窓18は、検体滴下口17と第2押圧操作部20との間に形成されている。
 第1押圧操作部19は、カバー部材13のY方向の一端部に設けられている。第1押圧操作部19は、洗浄液6(図14参照)を検査用ストリップ14に供給する際に、ユーザにより押圧操作される。第2押圧操作部20は、第1押圧操作部19とは反対側のカバー部材13のY方向の他端部に設けられている。第2押圧操作部20は、発光基質溶液5(図15参照)を検査用ストリップ14に供給する際に、ユーザにより押圧操作される。
 検査用ストリップ14は、担体30、標識保持パッド31、吸収パッド33、およびバック粘着シート34に加え、送液パッド32を有する。担体30のY方向の一端側には、検査領域Aに加え、コントロール領域Cが設けられている。標識保持パッド31から検査領域A等に向かう方向を検体の展開方向(図13参照)とした場合、検査領域Aがコントロール領域Cよりも展開方向の上流側に位置する。なお、図12では、検査領域A、およびコントロール領域Cにハッチングを施しているが、このハッチングは説明の便宜上施したものであって、各領域A,Cが発色していることを示したものではない。以降の図13~図15、および図17等も同様である。
 送液パッド32は、検査領域A等が設けられた担体30の一端とは反対側の担体30の他端に取り付けられている。送液パッド32は、担体30等と同様に多孔質材料により形成されており、毛細管現象によって洗浄液6を担体30に送液する。
 バック粘着シート34、ひいては検査用ストリップ14は、ケース本体12の収容空間に形成された凸状の支持台35および36に載置される。支持台35は、ケース本体12の中心部に設けられている。支持台36は、試料液70の展開方向の下流側のケース本体12の一端部に設けられている。支持台35および36は同じ高さである。
 試料液70の展開方向の上流側のケース本体12の他端部にも、凸状の支持台37が形成されている。支持台37は、支持台35および36と同じ高さである。支持台37には送液パッド32が載置される。
 支持台37には、凹状の第1収容部38が形成されている。第1収容部38は、担体30に取り付けられた一端とは反対側の送液パッド32の他端と対向する位置に設けられている。第1収容部38には洗浄液保持部45が収容される。
 洗浄液保持部45は、一面に開口を有する容器46と、容器46の開口を液密に覆うシール47とで構成される。容器46は例えば樹脂材料により形成されている。容器46の内部には洗浄液6が貯留される。シール47は例えばアルミニウムシートであり、鋭利な刃物等で容易に破断することが可能である。洗浄液保持部45は、シール47が送液パッド32の他端に対面するよう、シール47を上向きにした姿勢で第1収容部38に収容される。
 支持台36の上部には、多機能部材49が配置される。多機能部材49は、例えばアクリル樹脂等の透明樹脂材料により形成されている。多機能部材49は、第2収容部50と流路形成部51とが一体的に設けられた部材である。第2収容部50は上面が開口した箱であり、内部に発光基質溶液保持部52が収容される。流路形成部51は、第2収容部50の底部からY方向に延びる平板である。流路形成部51は標識保持パッド31の手前まで延びており、担体30の検査領域A、およびコントロール領域Cの上部を覆う。担体30と流路形成部51との間には間隔Dが空けられている(図13参照)。間隔Dは、例えば0.01mm~1mmの範囲である。こうして担体30と流路形成部51との間に間隔Dが空けられることにより、発光基質溶液5の流路が確保される。
 発光基質溶液保持部52は、一面に開口を有する容器53と、容器53の開口を液密に覆うシール54とで構成される。容器53は例えば樹脂材料により形成されている。容器53の内部には発光基質溶液5が貯留される。シール54は例えばアルミニウムシートであり、鋭利な刃物等で容易に破断することが可能である。発光基質溶液保持部52は、シール54が検査用ストリップ2に対面するよう、シール54を下向きにした姿勢で第2収容部50に収容される。
 一例として図13に示すように、第1押圧操作部19には第1破断突起60が設けられている。また、第2押圧操作部20の内面には発光基質溶液保持部52が取り付けられている。第2収容部50の底部には、第2破断突起61および供給口62が設けられている。第1破断突起60および第2破断突起61は先端が尖っている。
 一例として図14に示すように、第1破断突起60は、第1押圧操作部19が押圧操作された場合に送液パッド32の他端と当接し、送液パッド32の他端を洗浄液保持部45のシール47に向けて押し込む。この第1破断突起60による送液パッド32の他端の押し込みによってシール47が破断され、送液パッド32の他端が容器46内に落とされて洗浄液6に浸漬される。洗浄液6は、毛細管現象によって送液パッド32の他端から担体30に向けて展開される。第1押圧操作部19は、押圧操作により押し潰された後も、押し潰された状態を維持する。このため、洗浄液6の略全てが送液パッド32に吸い上げられるまで、洗浄液6の展開が続けられる。
 一例として図15に示すように、第2押圧操作部20が押圧操作された場合、発光基質溶液保持部52は第2収容部50内を下方に移動し、第2破断突起61を有する第2収容部50の底部に至る。そして、発光基質溶液保持部52のシール54が、第2破断突起61によって破断される。発光基質溶液保持部52に貯留された発光基質溶液5は、シール54の破断部分から供給口62へと流れ、さらに間隔D(図13参照)により確保された流路を流れて担体30に供給される。
 コントロール領域Cは、発光タンパク質73で標識されたコントロール用結合物質79を含む。コントロール用結合物質79は標識結合物質77に特異的に結合する。これによりコントロール領域Cに蛍光物質76が捕捉される。標識結合物質77の中には、被検物質71と結合しないものもある。こうした標識結合物質77は、検査領域Aで捕捉されることなくコントロール領域Cに到達し、コントロール領域Cに捕捉される。標識結合物質77を介して蛍光物質76が捕捉された場合、コントロール領域Cにおいて、発光タンパク質73と蛍光物質76が近接して位置することになる。この状態で、発光基質4が展開されると、コントロール領域Cにおいて、BRETが生じる。BRETによる蛍光物質76からの発光により、試料液70が担体30に十分に展開され、試料液70の展開が完了したことが確認できる。
 コントロール用結合物質79は、被検物質71そのものであってもよいし、標識結合物質77が認識する部位を持つ化合物でもよい。標識結合物質77が認識する部位を持つ化合物(標識結合物質77に特異的に結合する化合物)としては、例えば、被検物質71の誘導体とタンパク質とを結合させたような化合物等が挙げられる。例えば、被検物質71がインフルエンザA型ウイルスあるいはそのバイオマーカーである場合、コントロール用結合物質79として、抗マウスIgG抗体(富士フイルム和光純薬株式会社製、製品名:抗マウスIgG(H+L)、ウサギF(ab')2、製品コード:566-70621)を用いることができる。
 上記設計変更例のカートリッジ10を用いたイムノクロマト検査の手順は、カートリッジ3を用いた検査の手順は図3を参照して説明した検査の手順と同様である。
 上述の設計変更例のカートリッジ10は、カートリッジ10内に、発光基質4を含む発光基質溶液5を内包する発光基質溶液保持部52を備えている。イムノクロマトグラフキット1において、発光基質溶液5がカートリッジ10内に備えられていることにより、アンプルあるいはバイアルなどの容器から発光基質溶液5を計量し、検査領域Aに供給する等の作業が軽減される。本カートリッジ10では、第2押圧操作部20を備えており、第2押圧操作部20を押下することで、発光基質溶液5を検査用ストリップ14に供給することができるので、簡便な検査を実現できる。
 カートリッジ10は、カートリッジ10内に、洗浄液6を内包する洗浄液保持部45を備えている。イムノクロマトグラフキット1において、洗浄液6がカートリッジ10内に備えられていることにより、アンプルあるいはバイアルなどの容器から発光基質溶液5を計量し、検査領域Aに供給する等の作業が軽減される。本カートリッジ10では、第1押圧操作部19を備えており、第1押圧操作部19を押下することで、洗浄液6を検査用ストリップ14に供給することができるので、簡便な検査を実現できる。
 既述の通り、上記カートリッジ10の第1押圧操作部19および第2押圧操作部20は、ユーザにより押圧操作が可能であるが、以下に説明する検査装置100によれば、第1押圧操作部19及び第2押圧操作部20の押圧を検査装置100内において行うこともできる。
 次に、イムノクロマト検査を行う検査装置100の構成について説明する。
 一例として図16および図17に示すように、検査装置100は直方体状の筐体101を備える。筐体101内には、カートリッジ10が装填されるL字トレイ状の装填部102が設けられている。
 筐体101の前面には、カートリッジ10の装填口103が形成されている。また、筐体101の前面には、装填口103を覆う開閉可能な蓋104が取り付けられている。さらに、筐体101の前面には、検査装置100の電源スイッチ105が配置されている。
 筐体101の上面には、タッチパネルディスプレイ106が取り付けられている。タッチパネルディスプレイ106は、ユーザによるイムノクロマト検査の開始指示(以下、検査開始指示という)といった操作指示を受け付ける。また、タッチパネルディスプレイ106は、判定結果といった情報を表示する。
 ユーザは、蓋104を開いて装填口103を露呈させ、試料液70を点着したカートリッジ10を、装填口103を介して装填部102に装填する。その後、ユーザは、蓋104を閉め、タッチパネルディスプレイ106を操作して検査開始指示を入力する。
 図17に示すように、検査装置100は、筐体101内に洗浄液供給機構107、発光基質供給機構108および検出部110を備えている。
 洗浄液供給機構107は、洗浄液保持部45から担体30に対して洗浄液6の供給を開始させるための機構である。洗浄液供給機構107は、例えば電磁石と電磁石に対して移動可能なプランジャとを備えたソレノイドなどのアクチュエータが使用される。例えば、プランジャが移動することにより、プランジャが第1押圧操作部19と当接して第1押圧操作部19を押圧する。洗浄液供給機構107は、装填されたカートリッジ10の第1押圧操作部19と対向する位置に配置されている。
 洗浄液供給機構107は、カートリッジ10の第1押圧操作部19を押圧することにより、第1押圧操作部19に対して外部から押圧力を加える押圧機構である。洗浄液供給機構107によって第1押圧操作部19に対して押圧力が加えられると、上述の作用によって洗浄液保持部45から担体30に洗浄液6が供給される。
 発光基質供給機構108は、発光基質溶液保持部52から担体30に対して発光基質溶液5の供給を開始させるための機構である。発光基質供給機構108も、洗浄液供給機構107と同様にソレノイドなどのアクチュエータが使用される。発光基質供給機構108は、装填されたカートリッジ10の第2押圧操作部20と対向する位置に配置されている。発光基質供給機構108は、カートリッジ10の第2押圧操作部20を押圧することにより、第2押圧操作部20に対して外部から押圧力を加える押圧機構である。発光基質供給機構108によって第2押圧操作部20に対して押圧力が加えられると、上述の作用によって発光基質溶液保持部52から担体30に発光基質4が供給される。
 検出部110は、ケース11の観察窓18と対向する位置に配置されている。検出部110は、検査領域Aおよびコントロール領域Cからの発光を検出する。検出部110は、具体的には、発光タンパク質73と発光基質4とが反応して生じる光75及び蛍光物質76からの蛍光78を検出可能な分光光度計である。分光光度計によれば、波長ごとの光強度を検出することができる。
 一例として図18に示すように、検査装置100は、ストレージ140、メモリ141、およびCPU(Central Processing Unit)142を備えている。ストレージ140、メモリ141、およびCPU142は、バスライン143を介して相互に接続されている。ストレージ140、メモリ141、CPU142、およびバスライン143は、コンピュータを構成する。
 ストレージ140は、例えばハードディスクドライブ、あるいはソリッドステートドライブである。メモリ141は、CPU142が処理を実行するためのワークメモリである。CPU142は、ストレージ140に記憶されたプログラムをメモリ141へロードして、プログラムにしたがった処理を実行する。これによりCPU142は検査装置100の各部を統括的に制御する。
 ストレージ140には作動プログラム145が記憶されている。作動プログラム145は、コンピュータを本開示の検査装置100として機能させるためのアプリケーションプログラムである。なお、ストレージ140には、作動プログラム145の他に、検査領域Aの発色状態の識別に必要な情報等も記憶されている。
 作動プログラム145が起動されると、CPU142は、メモリ141等と協働して、指示受付部150、洗浄液供給機構制御部151、発光基質供給機構制御部152、検出部制御部153、判定部154、および表示制御部155として機能する。
 指示受付部150は、タッチパネルディスプレイ106を通じたユーザの各種操作指示を受け付ける。例えば指示受付部150は検査開始指示を受け付ける。検査開始指示を受け付けた場合、指示受付部150は、タイマ128に基づき時間を管理して、夫々のタイミングで制御開始トリガ信号を、洗浄液供給機構制御部151、発光基質供給機構制御部152および検出部制御部153に出力する。検査開始指示の後、所定時間経過後の時刻t1に洗浄液供給機構制御部151に制御開始トリガ信号を出力し、その後、所定時間経過後の時刻t2に発光基質供給機構制御部152に制御開始トリガ信号を出力し、さらに、その後の時刻t3に検出部制御部153に制御開始トリガ信号を出力する。これにより、洗浄液6の供給、発光基質4の供給及び光検出が最適なタイミングで実行される。発光基質供給のタイミングや、発光基質4の供給から測定までの時間を制御することで、より精度の高い測定が実現できる。
 洗浄液供給機構制御部151は、洗浄液供給機構107を作動させて、第1押圧操作部19を押圧するように制御する。洗浄液供給機構制御部151は、検体および標識結合物質77が検査領域Aに供給された後、かつ、発光基質4を検査領域Aに供給する前に、検査領域Aに洗浄液6を供給するように、洗浄液供給機構107を作動させる。
 発光基質供給機構制御部152は、発光基質供給機構108を作動させて、第2押圧操作部20を押圧するように制御する。発光基質供給機構制御部152は、検体および標識結合物質77が検査領域Aへ供給された後に、検査領域Aに発光基質4を供給するように発光基質供給機構108を作動させる。
 検出部制御部153は、検出部110の動作を制御する。検出部制御部153は、検出部110を駆動させて、検査領域Aからの発光を検出する。具体的には光75と蛍光78を含む波長域の発光スペクトルを取得する。検出部110は、取得した発光スペクトル156を判定部154に出力する。
 判定部154は、検出部110から取得した発光スペクトル156に基づいて検体が陽性か陰性かの判定を行う。判定部154は、BRETにより蛍光物質76から生じる蛍光78の発光強度に基づいて検体が陽性か陰性かの判定を行う。判定を行うにあたり蛍光78の発光強度のみならず、BRETを伴わない発光タンパク質73と発光基質4の反応により生じる光75の発光強度を用いてもよい。判定部154は、判定結果157を表示制御部155に出力する。
 ここで、判定部154におけるより具体的な処理の一例を説明する。判定部154では、検出部110から発光スペクトル156として、例えば、図5に示すような発光スペクトルaあるいはbを取得する。判定部154は、発光スペクトルaあるいはbからBRETによって生じる蛍光78の発光強度である第1発光強度IFとBRETを生じず発光した光75の発光強度である第2発光強度IBとを取得し、第1発光強度IFを第2発光強度IBで除した値である発光強度比IF/IBを求める。そして、この発光強度比IF/IBに基づいて陽性か陰性かの判定を行う。例えば、発光強度比IF/IBが予め定められた閾値よりも大きければ陽性と判定し、閾値以下であれば陰性と判定する。
 なお、判定部154は、発光スペクトルaあるいはbから上記の第2発光強度IBの代わりに、図7に示すように、陰性の場合の発光スペクトルa、陽性の場合の発光スペクトルbとで発光強度が変化しない等発光点での発光強度である第3発光強度Iisoを取得し、第1発光強度IFを第3発光強度Iisoで除した値である発光強度比IF/Iisoを求めて、陽性か陰性かの判定を行ってもよい。例えば、発光強度比IF/Iisoが予め定めら
れた閾値よりも大きければ陽性と判定し、閾値以下であれば陰性と判定する。
 表示制御部155は、タッチパネルディスプレイ106への各種情報の表示を制御する。例えば表示制御部155は、判定部154からの判定結果157をタッチパネルディスプレイ106に表示する
 次に、上記構成による作用について、一例として図19に示すフローチャートを参照して説明する。まず、ユーザによりカートリッジ10への試料液70の点着工程が行われる。そして、電源スイッチ105が操作されて検査装置100の電源が投入され、作動プログラム145が起動される。作動プログラム145が起動されると、図18で示したように、検査装置100のCPU142は、指示受付部150、洗浄液供給機構制御部151、発光基質供給機構制御部152、検出部制御部153、判定部154、および表示制御部155として機能する。
 ユーザにより蓋104が開かれ、カートリッジ10が、装填口103を介して装填部102に装填される(ステップST100)。その後、ユーザにより蓋104が閉められる。
 続いて、ユーザによりタッチパネルディスプレイ106が操作され、検査開始指示が入力される。検査開始指示は指示受付部150で受け付けられる(ステップST110)。そして、指示受付部150から洗浄液供給機構制御部151、発光基質供給機構制御部152および検出部制御部153に、検査開始から各々のタイミングで制御信号が出力される。
 まず、指示受付時を基準として、時刻t1に洗浄液供給機構制御部151の制御の下、洗浄液供給機構107が作動され、第1押圧操作部19を押圧する。これにより、第1押圧操作部19が押下され、図14に示したように、送液パッド32が洗浄液6中に浸漬され、洗浄液6が検査用ストリップ14に供給される。(ステップST120)。
 その後、時刻t1から所定時間経過後の時刻t2に、発光基質供給機構制御部152の制御の下、発光基質供給機構108が作動され、第2押圧操作部20を押圧する。これにより、第2押圧操作部20が押下され、図15に示したように、発光基質溶液保持部52押し下げられて、発光基質溶液保持部52のシール54が第2破断突起61により破断される。これにより、発光基質溶液5が供給口62から流れだし、検査用ストリップ14に供給される(ステップST130)。
 次いで、時刻t2からさらに所定時間経過後の時刻t3に、検出部制御部153の制御の下、検出部110が駆動され、蛍光物質76の蛍光のピーク波長および発光タンパク質73のピーク波長を含む波長域の発光強度(発光スペクトル156)が検出される。(ステップST140)。
 判定部154において発光スペクトル156が解析され、発光強度比が算出され、陽性陰性の判定がなされる(ステップST150)。この判定結果157は、判定部154から表示制御部155に出力される。
 表示制御部155の制御の下、タッチパネルディスプレイ106に判定結果157を示すメッセージが表示される(ステップST160)。これにより1つのカートリッジ10に対するイムノクロマト検査が終了する。
 以上説明したように、検査装置100は、カートリッジ10が着脱可能に装填される装填部102と、検査領域Aにおける蛍光物質76からの発光の強度を検出する検出部110と、検出部110から取得した発光の強度に基づいて検体が陽性か陰性かの判定を行うプロセッサ(ここでは、CPU142)とを備える。
 上記構成の検査装置100によればBRETによる蛍光物質76からの蛍光78の発光強度に基づいて陽性か陰性かを判定するので、精度の高い測定結果を得ることができる。
 また、本実施形態の検査装置100は、発光基質4を検査領域Aに供給する発光基質供給機構108を備え、プロセッサ(ここでは、CPU142)は、検体および標識結合物質77が検査領域Aへ供給された後に、発光基質供給機構108によって検査領域Aに発光基質4を供給するように構成されている。すなわち、検査領域Aに検体および標識結合物質77が特異的に結合した状態で、発光基質4を供給する。発光基質4と発光タンパク質73との発光反応は発光基質4と発光タンパク質73とが触れ合うことで不可逆的に進み、発光強度は時間経過とともに落ちていくため、発光基質4を、検体と混合してあらかじめ混合され、インキュベートされる場合と比較して、検査領域Aからの発光を検出する際の発光強度の低減を抑制する効果が得られる。
 本実施形態の検査装置100において、検査領域Aにおける蛍光物質76から発光(蛍光78)の強度である第1発光強度IFを検出し、発光タンパク質73からの発光する光75の強度を第2発光強度IBとして検出し、発光強度比IF/IBに基づいて、陽性か陰性かの判定を行うことができる。発光強度比を用いることにより、第1発光強度IFのみを用いて判定を行うよりも、高い精度の判定結果を得ることができる。
 また、本実施形態の検査装置100において、検査領域Aにおける蛍光物質76からの発光(蛍光78)の強度を第1発光強度IFとして検出し、蛍光物質76からの発光のピーク波長と発光基質4と発光タンパク質73との反応により生じる発光のピーク波長との間の波長域に存在する等発光点での発光の強度を第3発光強度Iisoとして検出し、発光強度比IF/Iisoに基づいて、陽性か陰性かの判定を行うことができる。発光強度比を用いることにより、第1発光強度IFのみを用いて判定を行うよりも、高い精度の判定結果を得ることができる。
 上記実施形態において、各種の処理を実行する処理部(Processing Unit)のハードウェア的な構造としては、次に示す各種のプロセッサ(Processor)を用いることができる。各種のプロセッサには、ソフトウェア(作動プログラム145)を実行して各種の処理部として機能する汎用的なプロセッサであるCPU142に加えて、FPGA(Field Programmable Gate Array)等の製造後に回路構成を変更可能なプロセッサであるプログラマブルロジックデバイス(Programmable Logic Device:PLD)、および/またはASIC(Application Specific Integrated Circuit)等の特定の処理を実行させるために専用に設計された回路構成を有するプロセッサである専用電気回路等が含まれる。
 1つの処理部は、これらの各種のプロセッサのうちの1つで構成されてもよいし、同種または異種の2つ以上のプロセッサの組み合わせ(例えば、複数のFPGAの組み合わせ、および/または、CPUとFPGAとの組み合わせ)で構成されてもよい。また、複数の処理部を1つのプロセッサで構成してもよい。
 複数の処理部を1つのプロセッサで構成する例としては、第1に、クライアントおよびサーバ等のコンピュータに代表されるように、1つ以上のCPUとソフトウェアの組み合わせで1つのプロセッサを構成し、このプロセッサが複数の処理部として機能する形態がある。第2に、システムオンチップ(System On Chip:SoC)等に代表されるように、複数の処理部を含むシステム全体の機能を1つのIC(Integrated Circuit)チップで実現するプロセッサを使用する形態がある。このように、各種の処理部は、ハードウェア的な構造として、上記各種のプロセッサの1つ以上を用いて構成される。
 さらに、これらの各種のプロセッサのハードウェア的な構造としては、より具体的には、半導体素子等の回路素子を組み合わせた電気回路(Circuitry)を用いることができる。
 なお、上記においては、検査装置100を用いて、検体が陽性か陰性かを判定する場合について説明した。しかしながら、既述の通り、陰性時と陽性時とで、検査領域Aからの発光色は変化するため、検査装置100を用いることなく、ユーザが検査領域Aからの発光を視認して陽性か陰性かの判定をすることも可能である。
 以下、本開示の技術の実施例及び比較例について説明する。被検出物質をインフルエンザA型抗原とした。実施例1~3の検査用ストリップは、サンドイッチ法を用いた、かつ、BRETを利用した化学発光イムノクロマトグラフ検査用途のストリップとした。実施例2および実施例3の検査用ストリップの同様とした。
<実施例1>
(1)検査用ストリップ
(担体)
 60mm×300mmの多孔性担体(以下において、担体)を用意した。多孔性担体として、ニトロセルロースメンブレン(プラスチックの裏打ちあり、HiFlow Plus HF135(キャピラリーフローレート=135秒/cm)、ミリポア社製)を用いた。この担体の60mmの長さ方向の一端(以下において、下流端)から15mmの位置に300mmの長さ方向に沿ってライン状の検査領域を形成した。
(検査領域の形成)
 検査領域に捕捉用結合物質を固定化することにより検査領域を形成した。
 発光タンパク質として、Luciferase(NanoLuc(登録商標):Promega社製、ピーク波長460nm)を用いた。捕捉用結合物質として、抗インフルエンザA型モノクローナル抗体(Anti-Influenza ASPTN-5 7307、Medix Biochem ica社製)を用いた。Luciferaseで標識された抗インフルエンザA型モノクローナル抗体からなる捕捉用結合物質を含む溶液を1.5mg/mLとなるように調製した。調製された捕捉用結合物質を含む溶液を検査領域に塗布した後、担体を30分間乾燥させた。次に、ブロッキング液(0.5質量%カゼイン(乳由来、品番030-01505、富士フイルム和光純薬(株)社製)を含有する50mmol/Lの ホウ酸バッファー(pH8.5))500mLを入れたバットに、乾燥させた担体を浸漬させてそのまま30分間静置した。その後、担体を取り出して、別のバットに準備した洗浄安定化液(0.5質量%スクロースおよび0.05質量%コール酸ナトリウムを含む50mmol/L Tris-HCl(pH7.5)バッファー)500mL中に担体を浸し、そのまま30分間静置した。その後、担体を液から取り出し、25℃の環境で24時間乾燥させた。
 以上の工程により捕捉抗体を検査領域に固定化して検査領域を形成した。
(標識保持パッド)
 標識結合物質を保持した標識保持パッドを作製した。
 5mm×300mmに切断したグラスファイバーパッド(GlassFiber Conjugate Pad、ミリポア社製)を用意した。
 蛍光物質として、緑色蛍光タンパク質mNeogreen(AlleleBiotechnology社、ピーク波長517nm)を用い、標識結合物質と(ここでは、標識抗体)として、インフルエンザA型抗体を用いた。インフルエンザA型抗体-蛍光物質複合体を、Tris-HClバッファー(pH8.2)の濃度が20mmol/L、PEG(Mw.20000)の濃度が0.05質量%、スクロースの濃度が5質量%、そして光路長10mmとしたときの吸光度が506nmで0.8となるように水で希釈し、抗インフルエンザA型断片化抗体-蛍光物質複合体塗布液とした。この塗布液を上記のパッド1枚あたり0.1mLを均一に塗布し、24時間減圧乾燥した。これにより、蛍光物質で標識された標識結合物質(ここでは、標識抗体)を保持した標識保持パッドを得た。
(バック粘着シート)
 60mm×300nmの粘着シート(ニップンテクノクラスタ社製)をバック粘着シートとして用意した。
(送液パッド)
 25mm×300mmに切断したグラスファイバーパッド(Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社製))を送液パッドとした。
(吸収パッド)
 長さ12mm幅10mmに切断したグラスファイバーパッド(ガラス濾紙、アドバンテック社 製)を吸収パッドとして用いた。
 以上の部品を用いて、以下の手順により検査用ストリップを作製した。
 バック粘着シートに、検査領域を形成した担体を貼り付けた。次に、担体の60mmの長さ方向の下流端から26mmの位置に幅3mmの両面テープ(日東電工)を固定した。その後、両面テープの下流端と標識保持パッドの下流端が重なるように、標識保持パッドを担体に固定した。送液パッドを担体の上記下流端の反対の上流側に、送液パッドと担体が7mm重なるように貼り付けた。こうして作製したシート状部材を、60mmの長さ方向に平行に、幅が5mmとなるようにギロチン式カッター(CM4000、ニップンテクノ
クラスタ社製)で切断した。これにより、5mm幅60mm長さの60本のストリップを得た。一本のストリップの下流端に1枚の吸収パッドを重ねて配置することにより、検査用ストリップとした。
(2)展開液
 以下の展開液を用意した。
(基準展開液)
 0.05質量%カゼイン、0.5質量%Tween(登録商標)40、かつ、200mmol/L Tricine緩衝液(pH8.5)となる基準展開液を調製した。
(展開液-1)
 「富士ドライケムIMMUNO AGカートリッジFluAB」の添付文書に記載の、インフルエンザAウイルス抗原の最小検出感度(検出限界)の2倍に相当する抗原量となるように、模擬陽性検体(BD FluエグザマンコントロールA+B-(ベクトン・デ
ィッキンソン社製))を基準展開液に混合して展開液-1を得た。
(展開液-2)
 模擬陽性検体の量(抗原量)が展開液-1の300倍となるように、模擬陽性検体を基準試料液に混合して展開液-2を得た。
(3)発光基質溶液
 発光基質溶液として、20×10-6Mの発光基質を含む溶液(Furimazine、プロメガ社)を用いた。1回の検査で用いる発光基質溶液は100μLとした。
(イムノクロマト検査手順)
1)試料液を、標識保持パッドに点着する。
2)試料液の点着後10分経過した後に、発光基質溶液を多孔性担体に供給する。
3)発光基質溶液の供給から20秒後に検査領域からの発光を分光光度計で測定する。蛍光物質からの蛍光(ピーク波長517nm)の強度と、発光タンパク質と発光基質との反応により生じる発光(ピーク波長460nm)の強度の発光強度比(517nm/460nm)を算出する。
 検体液として、抗原が含まれていない基準展開液を用いた基準検査、検体液として、抗原量が少ない低濃度抗原の展開液-1を用いた検査1、及び検体液として、抗原量が多い高濃度抗原の展開液-2を用いた検査2の3パターンの検査を実施した。
 基準展開液、展開液-1および展開液-2を用いた、上記の検査を、それぞれ10回行った。検査用ストリップの作製および展開液の調製は、都度測定ごとに行った。
<実施例2>
 実施例1の標識保持パッドの作製において、標識抗体の作製方法を以下の通りとした。
 抗体として、抗インフルエンザA型モノクローナル抗体を用いる点は実施例1と共通する。蛍光物質として、蛍光抗体標識キット(Thermo-Fisher)の蛍光色素(ピーク波長525nm)を用いた。蛍光抗体標識キットの手順に沿って抗インフルエンザA型モノクローナル抗体を蛍光色素で標識し、蛍光物質で標識された標識結合物質(ここでは、標識抗体)を得た。他は実施例1と同様にして実施例2の検査用ストリップを作製した。
 展開液、発光基質溶液および検査手順は実施例1と同様とした。
<実施例3>
 検査用ストリップ、展開液および発光基質溶液は実施例1と同一のものを用いた。但し、実施例3においては実施例1の検査手順において、洗浄液を用いた洗浄工程を組み込んだ。上記検査手順の1)の検体液の点着した後、送液パッドを洗浄液に浸し、10分間洗浄液を送液した。この工程により非特異吸着している標識抗体を洗浄した。その後、上記検査手順の2)及び3)を実施した。洗浄液を送液パッドに供給して、洗浄液を10分間送液する。送液パッドを200μLの洗浄液を収容するポット中に浸漬させて、洗浄液を毛管力により担体中に展開させる。この工程により特異的に吸着していない(非特異吸着した)標識抗体を洗浄するその後、2)の発光基質溶液の供給、および3)の発光強度測定を行う。
 上記のように検査手順を変更した以外は、実施例1と同様の検査及び評価を行った。
 比較例1および比較例2の検査用ストリップは競合法を用い、かつBRETを利用した化学発光イムノクロマトグラフ法用途のストリップとした。
<比較例1>(標識保持パッドの作製)
 標識疑似抗原を保持した標識保持パッドを作製した。
(標識疑似抗原)
 標識疑似抗原として、蛍光物質で標識した抗インフルエンザA型疑似抗原を用いた。
 5mm×300mmに切断したグラスファイバーパッド(GlassFiber Conjugate Pad、ミリポア社製)を用意した。
 蛍光物質として、緑色蛍光タンパク質mNeogreen(ピーク波長517nm)を用い、標識結合物質(ここでは、標識疑似抗原)として、インフルエンザA型疑似抗原を用いた。
 20mMのTris-HClバッファー(pH8.2)、5質量%スクロース、及び水を用いて、蛍光物質で標識した抗インフルエンザA型疑似抗原を希釈し、光路長10mmとしたときの吸光度が506nmで0.8となるように塗布液を調製した。この塗布液を、上記のパッド1枚あたりに0.1mLを均一に塗布し、蛍光物質で標識された標識疑似抗原を保持した標識保持パッドを得た。他は実施例1と同様にして比較例1の検査用ストリップを作製した。
<比較例2>
 比較例2の検査用ストリップは、BRETを用いない化学発光イムノクロマトグラフ検査用途のストリップとした。
(1)検査用ストリップ
(検査領域の形成)
 検査領域に固定化する捕捉用結合物質として、発光タンパク質が標識された抗インフルエンザA型抗原(標識疑似抗原)を用いた。発光タンパク質として、Luciferase(NanoLuc(登録商標):Promega社製、発光波長460nm)を用いた。Luciferaseで標識された抗インフルエンザA型抗原からなる捕捉用結合物質を含む溶液を1.5mg/mLとなるように調製した。この点以外は実施例1と同様にして担体に検査領域を形成した。
(標識保持パッド)
 標識結合物質(ここでは標識抗体)を保持した標識保持パッドを作製した。
 5mm×300mmに切断したグラスファイバーパッド(GlassFiber Conjugate Pad、ミリポア社製)を用意した。
 蛍光物質として、緑色蛍光タンパク質mNeogreen(AlleleBiotechnology社、ピーク波長517nm)を用い、標識抗体として、抗インフルエンザA型モノクローナル抗体(Anti-Influenza ASPTN-5 7307、Medix Biochem ica社製)を用いた。
蛍光タンパク質で標識化された抗インフルエンザA型モノクローナル抗体からなる標識抗体の溶液、20mM Tris-HClバッファー(pH8.2)、5質量%スクロース、及び水を用いて希釈し、光路長10mmとしたときの吸光度が506nmで0.8となるように調製した。この塗布液を上記のグラスファイバーパッド1枚あたり0.1mL均一に塗布し、蛍光物質で標識された標識抗体を保持した保持パッドを得た。
 上記以外は、実施例1と同様にして比較例2の検査用ストリップを作製した。比較例2の検査用ストリップの検査領域において標識疑似抗原が固定化されており、被検物質である抗原と結合していない標識抗体が標識疑似抗原に捕捉される。比較例2は、標識抗体に対して被検物質である抗原と標識疑似抗原とが競合的に結合する。
 展開液、発光基質溶液および検査手順は実施例1と同様とした。
(評価)
 各実施例及び比較例について、以下のように評価した。
 基準検査について、10回測定した発光強度比の平均値を算出した。すなわち、抗原を含まない展開液を用いた測定により得られた発光強度比R0の平均値R0avを算出した。この平均値R0avを陰性基準とした。低濃度の抗原を含む展開液-1を用いた検査で得た発光強度比R1、及び高濃度の抗原を含む展開液-2を用いた検査で測定した発光強度比R2について、それぞれ10回の検査のうち、陰性基準であるROavに対して有意差があった回数で以下のように評価し、結果を表1に示した。
A:10回
B:8~9回
C:6~7回
D:5回以下
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 表1に示す通り、抗原濃度が高い場合は、比較例も含めて、抗原濃度0に対して全ての検査において基準検査の平均値に対して有意な差が確認された。一方、抗原濃度が低い場合に、実施例1~3のサンドイッチ法による検査に適用される検査用ストリップを用いた場合、比較例1および2の競合法による検査に適用される検査用ストリップを用いた場合に比べて、再現性良く抗原の検出が可能であることが明らかになった。また、実施例1、3の比較から、検査手順において、洗浄工程を含めることで、抗原濃度が低い場合であっても確実に検体の検出が可能であることが示された。
 2021年9月29日に出願された日本国特許出願2021-159997号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
 本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。

Claims (14)

  1.  イムノクロマトグラフキットであって、
     検体が展開され、前記検体に含まれる被検物質を捕捉する検査領域を有する検査用ストリップを収容したカートリッジと、
     前記被検物質と特異的に結合する捕捉用結合物質であって、発光タンパク質で標識され、前記検査領域に固定化された捕捉用結合物質と、
     前記被検物質と特異的に結合する標識結合物質であって、蛍光物質で標識され、前記検査領域に供給される標識結合物質と、
     前記検査領域に供給される発光基質であって、前記発光タンパク質と反応することによりエネルギーを生じ、前記捕捉用結合物質に、前記被検物質を介して前記標識結合物質が捕捉された状態において、前記エネルギーが前記蛍光物質に移動する生物発光エネルギー共鳴移動現象を生じさせる発光基質と、
    を備えた、イムノクロマトグラフキット。
  2.  前記発光タンパク質は、青色発光を生じさせる発光タンパク質であり、前記蛍光物質は、量子収率が0.7以上の緑色の蛍光を発する緑色蛍光色素又は緑色蛍光タンパク質である、請求項1に記載のイムノクロマトグラフキット。
  3.  前記発光タンパク質は、青色発光を生じさせる青色発光タンパク質であり、前記蛍光物質は、530nm以上にピーク波長を有する、請求項1に記載のイムノクロマトグラフキット。
  4.  前記検体を採取するための検体採取具を含む、請求項1から3のいずれか1項に記載のイムノクロマトグラフキット。
  5.  前記検体及び前記標識結合物質を前記検査領域に供給した後に、前記発光基質を前記検査領域に供給する旨の検査手順が記載された取扱説明書を含む、請求項1から4のいずれか1項に記載のイムノクロマトグラフキット。
  6.  前記検査用ストリップ上の、前記検体の供給位置に、前記標識結合物質を備えた標識保持パッドが配置された、請求項1から5のいずれか1項に記載のイムノクロマトグラフキット。
  7.  前記カートリッジ内に、前記発光基質を含む発光基質溶液を内包する発光基質溶液保持部を備えた、請求項1から6のいずれか1項に記載のイムノクロマトグラフキット。
  8.  前記検体及び前記標識結合物質を前記検査領域に供給した後、かつ、前記発光基質を前記検査領域に供給する前に、前記検査領域に供給される洗浄液であって、前記検査領域に非特異吸着した前記標識結合物質を洗浄する洗浄液をさらに備えた、請求項1から7のいずれか1項に記載のイムノクロマトグラフキット。
  9.  前記カートリッジ内に、前記洗浄液を内包する洗浄液保持部を備えた、請求項8に記載のイムノクロマトグラフキット。
  10.  請求項1から9のいずれか1項に記載のイムノクロマトグラフキット中のカートリッジが、着脱可能に装填される装填部と、
     前記検査領域における前記蛍光物質からの発光の強度を検出する検出部と、
     前記検出部から取得した前記発光の強度に基づいて前記検体が陽性か陰性かの判定を行うプロセッサとを備えた、検査装置。
  11.  前記発光基質を前記検査領域に供給する発光基質供給機構を備え、
     前記プロセッサは、前記検体及び前記標識結合物質が前記検査領域へ供給された後に、前記発光基質供給機構によって前記検査領域に前記発光基質を供給する、請求項10に記載の検査装置。
  12.  前記装填部には、請求項9に記載のイムノクロマトグラフキット中のカートリッジが装填され、
     前記洗浄液を前記検査領域に供給する洗浄液供給機構をさらに備え、
     前記プロセッサは、前記検体及び前記標識結合物質が前記検査領域に供給された後、かつ、前記発光基質を前記検査領域に供給する前に、前記洗浄液供給機構によって前記検査領域に前記洗浄液を供給する、請求項11に記載の検査装置。
  13.  前記検出部は、前記検査領域における前記蛍光物質からの前記発光の強度を第1発光強度として検出し、前記発光タンパク質からの発光の強度を第2発光強度として検出し、
     前記プロセッサは、前記検出部から前記第1発光強度と前記第2発光強度を取得し、前記第1発光強度を前記第2発光強度で除した値を用いて、前記判定を行う、請求項10から12のいずれか1項に記載の検査装置。
  14.  前記検出部は、前記検査領域における前記蛍光物質からの前記発光の強度を第1発光強度として検出し、前記蛍光物質からの前記発光のピーク波長と前記発光タンパク質からの発光のピーク波長との間の波長域に存在する等発光点での発光の強度を第3発光強度として検出し、
     前記プロセッサは、前記検出部から前記第1発光強度と前記第3発光強度を取得し、前記第1発光強度を前記第3発光強度で除した値を用いて、前記判定を行う、請求項10から12のいずれか1項に記載の検査装置。
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