WO2023040006A1 - 一种提高蛋白质和/或肽段组质谱鉴定数的方法 - Google Patents

一种提高蛋白质和/或肽段组质谱鉴定数的方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2023040006A1
WO2023040006A1 PCT/CN2021/126630 CN2021126630W WO2023040006A1 WO 2023040006 A1 WO2023040006 A1 WO 2023040006A1 CN 2021126630 W CN2021126630 W CN 2021126630W WO 2023040006 A1 WO2023040006 A1 WO 2023040006A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
mass spectrometry
precipitate
sample
peptide
Prior art date
Application number
PCT/CN2021/126630
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
马聪聪
赵瑾
原续波
陈亮宇
宋雷
任丽
李捷
Original Assignee
谱天（天津）生物科技有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 谱天（天津）生物科技有限公司 filed Critical 谱天（天津）生物科技有限公司
Publication of WO2023040006A1 publication Critical patent/WO2023040006A1/zh

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry

Definitions

  • the invention belongs to the technical field of proteomics, and in particular relates to a method for increasing the mass spectrum identification number of proteins and/or peptide groups by using aluminosilicate molecular sieves.
  • serum/plasma is a free-flowing liquid in the body and contains substances released by various tissues and organs of the organism, it contains a large amount of potentially available physiological or pathological information. It is speculated that there are more than 10,000 protein types in serum/plasma, but due to the limitation of current detection and identification technology, only a small part of them can be detected. Serum/plasma contains dozens of high-abundance proteins, accounting for more than 95% of the total serum/plasma protein content, which brings great challenges to the separation and detection of plasma/serum proteins. At present, only 300-400 proteins can be detected by protein spectrum technology without removing high-abundance proteins. When using commercial high-abundance antibody kits, the number of identifications can be increased to 400-800 .
  • Molecular sieve refers to a kind of artificially synthesized hydrated aluminosilicate with the function of screening molecules. Its general chemical formula is (M′2M)O ⁇ Al 2 O 3 ⁇ xSiO 2 ⁇ yH 2 O, M′ and M are monovalent and divalent cations such as K + , Na + and Ca 2+ , Ba 2+ respectively wait. It has many pores with uniform apertures and well-arranged holes in its structure. Molecular sieves with different apertures separate molecules of different sizes and shapes. Molecular sieves with different pore sizes can be obtained according to the molecular ratio of SiO 2 and Al 2 O 3 . It has high adsorption capacity, strong selectivity and high temperature resistance.
  • the present invention provides a method for increasing the number of protein and/or peptide group mass spectrometric identifications by using aluminosilicate molecular sieves, in which silicon Aluminate-based molecular sieves and corresponding binding buffers are used to qualitatively and quantitatively identify and quantify serum/plasma proteins and peptide groups, which can effectively increase the number of identifications.
  • the material can be used for the enrichment of trace samples and enzymatic desalination at the protein level or peptide level, and can replace the existing traditional SP3 mixed material as a solid-phase enrichment carrier for routine protein spectrum analysis.
  • a protein and/or peptide group mass spectrometry identification method comprising the following steps:
  • the sample to be tested is selected from protein purifications, proteomes, peptide purifications or peptides from different species, parts, and purification means, preferably serum/plasma or tissue/cell samples;
  • the combination Buffer components include Tris, potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, potassium phosphate, phosphoric acid, sodium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, sodium phosphate, potassium chloride, sodium chloride, citric acid, sodium citrate, bar
  • bituric acid barbital sodium, sodium hydroxide, hydrochloric acid, formic acid, acetic acid, EDTA, SDS, NP-40, CHAPS, Tween, Triton, PEG, acetonitrile, methanol, preferably Combination buffer of Tris, EDTA.
  • the aluminosilicate molecules are selected from 3A (potassium A type), 4A (sodium A type), 5A (calcium A type), 10Z (calcium Z type), 13Z (sodium Z type ), Y (sodium Y type) or sodium mordenite type or a mixture of several types, or a mixture of several types of a certain type.
  • Y-type molecular sieves are used in an amount of 0.01-100 mg/mL.
  • the incubation condition is: incubate at 18-37° C. for 1-120 minutes.
  • the conditions of the high-speed centrifugation are as follows: the centrifugal force is 8,000-22,000 g, the temperature is 2-8° C., and the time is 5-120 minutes.
  • the washing buffer is selected from the binding buffer used in step S1 or the corresponding diluent.
  • the conditions of the high-speed centrifugation are as follows: the centrifugal force is 8,000-22,000 g, the temperature is 2-8°C, and the time is 5-120 minutes; this step can be repeated multiple times, preferably 3 times.
  • the preparation of the proteome sample includes proteome sample preparation or peptide group sample preparation:
  • the preparation method of proteome sample comprises the following steps:
  • the preparation method of the peptide group sample comprises the following steps:
  • the precipitate II is resuspended in a desorption solution (preferably 2% acetonitrile), sonicated and centrifuged to obtain the supernatant which is the peptide group sample.
  • a desorption solution preferably 2% acetonitrile
  • the reducing agent is dithiothreitol or tris(2-carboxyethyl)phosphine; the alkylating agent is iodoacetamide or chloroacetamide; react at 45-95°C after adding the reducing agent 0 to 60 minutes, then add the alkylating agent to avoid light and react at room temperature for 5 to 60 minutes;
  • the digestion buffer includes calcium chloride, ammonium bicarbonate, etc., with a pH value of 7.0-8.5; the amount of trypsin added is 0.1-100 ng/ ⁇ L; the enzymatic hydrolysis conditions are: the temperature is 25-37°C , the time is 1 to 16 hours; the desalination step is to use the aluminosilicate molecular sieve, SDB column, C18 column or SP3 magnetic beads for adsorption, cleaning and desorption.
  • step S4 the method for mass spectrometry detection includes:
  • Liquid chromatography-tandem mass spectrometry is used for detection, and software is used to extract the obtained data to obtain qualitative and quantitative data of proteins and peptides.
  • the aluminosilicate molecular sieve is an artificially synthesized hydrated aluminosilicate having the function of screening molecules. Its general chemical formula is (M′2M)O ⁇ Al 2 O 3 ⁇ xSiO 2 ⁇ yH 2 O, M′ and M are monovalent and divalent cations such as K + , Na + and Ca 2+ , Ba 2+ respectively wait. Molecular sieves with different pore sizes can be obtained according to the molecular ratio of SiO 2 and Al 2 O 3 .
  • Y-type molecular sieve a hydrogen, sodium, potassium, calcium ion type with a Y-shaped crystal structure, a silicon-aluminum ratio of 5-30, and a pore size of 1-10nm.
  • the molecular sieve can be used alone as a single molecular sieve with fixed parameters, or as a mixture of multiple molecular sieves with different parameters.
  • the present invention uses aluminosilicate molecular sieves and corresponding binding buffers, which can be effectively applied to adsorb different types of protein and peptide samples, especially for serum/plasma samples, which can achieve serum/plasma
  • the selective enrichment of low-abundance proteins and peptides in plasma can effectively avoid the interference of high-abundance proteins in serum/plasma on the identification of low-abundance proteins during mass spectrometry identification, and can be used for various protein identifications.
  • Single-needle mass spectrometry can perform qualitative and quantitative analysis of more than 2000 serum/plasma proteins.
  • the method of the present invention is simple to operate, and only needs four steps of incubation-centrifugation-elution-centrifugation to complete the enrichment of low-abundance proteins and peptides in serum/plasma, thereby improving detection sensitivity and reducing human error.
  • Figure 1 is the picture of the protein glue on the material before and after using the Y-shaped material to adsorb the same plasma, 1 is the result of the Y-shaped material binding protein, and 2 is the original plasma.
  • Figure 2 is the Venn diagram of the same sample treated with Y-type molecular sieves for triple co-identification of proteins.
  • Figure 3 shows the correlation of three replicate protein quantitation data for the same sample treated with Y-type molecular sieves.
  • Table 2 The results of Y-type molecular sieve treatment, direct enzymatic hydrolysis identification, and the number of proteins and peptides identified by the peak-removing antibody kit
  • the number of identified proteins in untreated plasma is only 300+, and the number of peptides is only about 2000.
  • the number of identified peptides is 3000-4000, and the number of identified proteins is 600 -800, are much smaller than the results of Y-type molecular sieves;
  • this material can be used for the enrichment of micro samples and enzymatic desalination at the protein level or peptide level, it can be used to replace the existing traditional SP3 mixed magnetic bead material.
  • the SP3 mixed material was used as the control group, and the Y-type material in Example 1 was used as the carrier, and the proteomics analysis experiment was carried out on Hela cell protein and peptide extracts:

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

一种提高蛋白质和或肽段组质谱鉴定数的方法，包括：步骤S1、向待测样本中加入结合缓冲液，并加入硅铝酸盐类分子筛，得到混悬液；步骤S2、将混悬液孵育后，进行高速离心，去除上清液，保留沉淀Ⅰ；步骤S3、采用清洗缓冲液重悬沉淀Ⅰ重悬得到重悬液，将重悬液高速离心后去除上清，保留沉淀Ⅱ，重复步骤S3数次；步骤S4、将沉淀Ⅱ制备成蛋白质组样品，进行质谱检测。通过采用硅铝酸盐类分子筛及相应结合缓冲液，可有效吸附不同种类的蛋白及肽段，实现低丰度蛋白及肽段的选择性富集，有效避免质谱鉴定时高丰度蛋白对低丰度蛋白鉴定的干扰，可用于各种蛋白质谱鉴定，可在蛋白水平或者肽段水平进行微量样本的富集以及酶解脱盐等过程。

Description

一种提高蛋白质和/或肽段组质谱鉴定数的方法 技术领域
本发明属于蛋白组学技术领域，具体地，涉及一种利用硅铝酸盐类分子筛提高蛋白质和/或肽段组质谱鉴定数的方法。
背景技术
由于血清/血浆由于是体内自由流动的液体，含有生物体各个组织器官释放的物质，因此蕴藏着大量的潜在可利用的生理或病理信息。据推测，血清/血浆的蛋白质种类超过万种，但是由于目前检测鉴定技术所限，仅能检测到其中很小一部分。由于血清/血浆中含有数十种高丰度蛋白，占了血清/血浆总蛋白量的95％以上，给血浆/血清蛋白的分离、检测带来了巨大的挑战。目前，在不去除高丰度蛋白的情况下，仅能通过蛋白质谱技术检测到300-400个蛋白，当使用商业化去高丰度抗体试剂盒时，可以将鉴定数提高到400～800个。
分子筛指一种人工合成的、具有筛选分子作用的水合硅铝酸盐。其化学通式为(M′2M)O·Al 2O 3·xSiO 2·yH 2O，M′、M分别为一价、二价阳离子如K +、Na +和Ca 2+、Ba 2+等。它在结构上有许多孔径均匀的孔道和排列整齐的孔穴，不同孔径的分子筛把不同大小和形状分子分开。根据SiO 2和Al 2O 3的分子比不同，得到不同孔径的分子筛。其吸附能力高、选择性强、耐高温，被广泛用于有机化工和石油化工，也是煤气脱水的优良吸附剂。但是目前没有利用该类材料去除血清/血浆高丰度蛋白及肽段、富集低丰度蛋白及肽段的探索研究。
发明内容
发明目的：针对目前血清/血浆蛋白质及肽段组样品制备方法的局限性，本发明提供了一种利用硅铝酸盐类分子筛提高蛋白质和/或肽段组质谱鉴定数的方法，其中使用硅铝酸盐类分子筛和相应的结合缓冲液，对血清/血浆蛋白质及肽段组进行定性与定量，能够有效提高鉴定数目。此外，使用该材料可以在蛋白水平或者肽段水平进行微量样本的富集以及酶解脱盐等过程，可替代现有的传统SP3混合材料作为常规蛋白质谱分析的固相富集载体使用。
技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种蛋白质和/或肽段组质谱鉴定方法，包括以下步骤：
S1、向待测样本中加入结合缓冲液，并加入硅铝酸盐类分子筛，得到混悬液；
S2、将所述混悬液孵育后，进行高速离心，去除上清液，保留沉淀Ⅰ；
S3、采用清洗缓冲液重悬所述沉淀Ⅰ重悬得到重悬液，将所述重悬液高速离心后去除上清，保留沉淀Ⅱ，重复该步骤数次；
S4、将所述沉淀Ⅱ制备成蛋白质组样品，进行质谱检测。
优选的，步骤S1中，所述待测样本选自不同物种、部位、纯化手段来源的蛋白纯化物、蛋白质组、肽纯化物或肽组，优选血清/血浆或者组织/细胞样本；所述结合缓冲液成分包括Tris、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸钾、磷酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠、氯化钾、氯化钠、柠檬酸、柠檬酸钠、巴比妥酸、巴比妥钠、氢氧化钠、盐酸、甲酸、乙酸、EDTA、SDS、NP-40、CHAPS、吐温、Triton、PEG、乙腈、甲醇的中的一种或任意组合，优选为Tris、EDTA的组合缓冲液。
优选的，步骤S1中，所述硅铝酸盐类分子筛选自3A(钾A型)、4A(钠A型)、5A(钙A型)、10Z(钙Z型)、13Z(钠Z型)、Y(钠Y型)或钠丝光沸石型中的一种或几种的混合物，或者某一类型中几种的混合物。优选Y型分子筛，用量为0.01-100mg/mL。更优选的，所述硅铝酸盐类分子筛选自Y型分子筛材料HY、NaY和LaY的混合物，其中三者的质量比为HY：NaY：LaY＝1：(0.5-2)：(0.5-2)，优选为1:1:1。
优选的，步骤S2中，所述孵育的条件为：18～37℃下孵育1～120分钟。
优选的，步骤S2中，所述高速离心的条件如下：离心力为8,000～22,000g，温度为2～8℃，时间为5～120分钟。
优选的，步骤S3中，所述清洗缓冲液选自步骤S1所使用的结合缓冲液或相应稀释液。
优选的，步骤S3中，所述高速离心的条件如下：离心力为8,000～22,000g，温度为2～8℃，时间为5～120分钟；该步骤可重复多次，优选3次。
优选的，步骤S4中，所述蛋白质组样品的制备包括蛋白质组样品制备或者肽段组样品制备：
蛋白质组样品的制备方法包括如下步骤：
采用还原试剂缓冲液重悬所述沉淀Ⅱ，经反应后加入烷基化巯基的烷基化试剂，再加入测序级的胰蛋白酶及消化缓冲液，经酶解并脱盐即得蛋白质组样品；
肽段组样品的制备方法包括如下步骤：
使用解吸附液(优选2％乙腈)重悬所述沉淀II，超声，离心后得上清即为肽段组样品。
进一步优选的：
所述还原试剂为二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦；所述烷基化试剂为碘乙酰胺或氯乙酰胺；加入所述还原试剂后于45～95℃条件下反应0～60分钟，再加入烷基化试剂避光室温反应5～60分钟；
所述消化缓冲液包括氯化钙、碳酸氢铵等，pH值为7.0～8.5；所述胰蛋白酶的加入量为0.1～100ng/μL；所述酶解的条件为：温度为25～37℃，时间为1～16小时；所述脱盐步骤为使用所述硅铝酸盐类分子筛、SDB柱、C18柱或SP3磁珠进行吸附、清洗及解吸附。
优选的，步骤S4中，所述质谱检测的方法包括：
采用液相色谱-串联质谱法进行检测，使用软件对获得数据进行抽提，获得蛋白及肽段定性定量数据。
所述硅铝酸盐类分子筛为一种人工合成的具有筛选分子作用的水合硅铝酸盐。其化学通式为(M′2M)O·Al 2O 3·xSiO 2·yH 2O，M′、M分别为一价、二价阳离子如K +、Na +和Ca 2+、Ba 2+等。根据SiO 2和Al 2O 3的分子比不同，得到不同孔径的分子筛。其型号有：3A(钾A型)、4A(钠A型)、5A(钙A型)、10Z(钙Z型)、13Z(钠Z型)、Y(钠Y型)、钠丝光沸石型等。Y型分子筛，一种具有Y型晶体结构的氢、钠、钾、钙等离子型，硅铝比为5～30，孔径为1～10nm。所述分子筛可以为只具有固定参数的单一分子筛单独使用，也可以为多种具有不同参数的分子筛混合使用。
有益效果：与现有技术相比，本发明采用硅铝酸盐类分子筛及相应结合缓冲液，可有效应用于吸附不同种类的蛋白及肽段样本，尤其对于血清/血浆样本，可以实现血清/血浆中低丰度蛋白及肽段的选择性富集，有效避免了质谱鉴定时血清/血浆中高丰度蛋白对低丰度蛋白鉴定的干扰，可用于各种蛋白质谱鉴定，在常规色谱梯度下单针质谱分析可以对大于2000种血清/血浆蛋白进行定性定量分析。本发明方法操作简单，只需要通过孵育-离心-洗脱-离心4个步骤就可完成血清/血浆中低丰度蛋白及肽段的富集，提高检测灵敏度的同时减少人为操作误差。
附图说明
图1为使用Y型材料吸附同一个血浆前后，材料上蛋白胶图，1为Y型材料结合蛋 白结果，2为原血浆。
图2为同一样本使用Y型分子筛处理三重复共鉴定蛋白venn图。
图3为同一样本使用Y型分子筛处理三重复蛋白定量数据相关性。
具体实施方式
以下对本发明方案进行全面的描述，所述的实施案例是本发明中最优选实施方式，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1
1.从冰箱中取出不同血浆样本，每个样本取200μL血浆于37℃解冻，4℃、1,500g
离心10分钟，去除底部沉淀后上清转移至新管；
2.取100μL血浆加入100μL结合缓冲液(50mM Tris,10mM EDTA)重悬的Y型混合材料(HY:NaY:LaY，1:1:1，HY(NKF-8)硅铝比10，NaY(NKF-7)硅铝比4.8～5.4，LaY(NKF-8-2)硅铝比≥5.1)，室温孵育30min；
3.孵育完成后12,000g离心10分钟去掉上清溶液，沉淀用200μL结合缓冲液重悬后，12,000g离心5分钟去掉上清；
4.重复步骤3两次；
5.将原血浆及材料结合得到的沉淀加入蛋白电泳Loading Buffer煮沸，上清跑电泳，结果如图1；
6.向平行制备、未跑胶的沉淀加入一定体积含有DTT的缓冲液重悬沉淀，95℃反应1h；
7.加入一定体积IAM，避光室温反应45min；
8.加入消化缓冲液及胰蛋白酶，混匀，37℃酶解过夜；
9.加入过量甲酸溶液，12,000g离心10分钟，上清加入SDB除盐柱，离心，使酶解后肽段结合于SDB柱上；
10.清洗SDB柱数次并解吸附，得到纯化肽段溶液；
11.冻干纯化肽段溶液，并使用上机缓冲液复溶肽段；
12.将肽段使用纳升级高效液相色谱串联质谱进行DIA数据采集；
13.使用Spectronaut软件依据以及建立的血清/血浆数据库对质谱数据进行抽提，获得蛋白定性定量结果；
14.在三个人员同时操作，对4个不同来源血浆样品进行处理，每个样品三个平行重复 实验，鉴定到肽段及蛋白数如表1所示：
表1的血浆蛋白质组质谱鉴定结果
Figure PCTCN2021126630-appb-000001
15.使用Y型分子筛进行去高峰度同时，与不使用任何处理，直接酶解血浆，及使用抗体去高峰度试剂盒结果进行比较，结果如表2：
表2 Y型分子筛处理、直接酶解鉴定、去高峰度抗体试剂盒鉴定蛋白和肽段数量结果
Figure PCTCN2021126630-appb-000002
16.以SAMPLE1举例，人员3操作的三重复鉴定到的蛋白进行共鉴定分析，共鉴定蛋白数如图2，蛋白定量数据相关性如图3；
结论：
1.通过图1，可以看出分子筛能够较好去除高丰度蛋白；
2.通过表1可以看出，每个样本多个重复之间具有较高相似度，不同来源的血浆样本鉴定数也较为类似，不同人操作结果相似，所以鉴定结果都为蛋白超过2000，肽段在10000左右，因而分子筛方法学稳定；
3.通过与没有处理的血浆样本进行比较，没有处理的血浆蛋白鉴定数只有300+，肽段只有2000左右，使用去高峰度抗体试剂盒，鉴定肽段在3000-4000，鉴定蛋白数在600-800，都远小于Y型分子筛的结果；
4.通过共鉴定蛋白分析及蛋白定量数据相关性分析，说明使用分子筛对单个样本的蛋白富集结果十分稳定，具有高度重现性。
实施例2
为证明使用本材料可以在蛋白水平或者肽段水平进行微量样本的富集以及酶解脱盐等过程，用以替代现有的传统SP3混合磁珠材料。本实例使用SP3混合材料作为对照组，使用实施例1中的Y型本材料为载体，对Hela细胞蛋白及肽段提取物进行了蛋白组学分析实验：
使用Hela细胞提取蛋白标准品为例：
1.分别取两份100μg溶于40uL缓冲液(4％SDS，100mMTris，pH 8.0)中的Hela细胞蛋白样品，进行还原烷基化反应；
2.分别加入10μL储存的10μg/μL SP3混合beads以及同等数量的Y型分子筛材料(HY:NaY:LaY，1:1:1，HY(NKF-8)硅铝比10，NaY(NKF-7)硅铝比4.8～5.4，LaY(NKF-8-2)硅铝比≥5.1)，再加入150uL缓冲液及200uL乙腈作为结合缓冲液，轻轻震荡混匀，室温反应8min；
3.使用离心机12,000g离心5min之后，轻轻吸弃上清，避免接触到beads/材料；加入200μL 70％乙醇，轻轻震荡混匀，12,000g离心5min，轻轻吸弃上清，重复该步骤；
4.加入180μL 100％乙腈，轻轻震荡混匀，瞬离，轻轻吸弃上清，自然挥干30s；
5.加入适量消化缓冲液及胰蛋白酶，37℃酶解过夜，得SP3酶解的肽段产物(A)和Y型材料的酶解肽段产物(B)；
6.取SP3酶解的肽段产物(A)加入Y型材料进行如下操作，用枪洗打轻轻混匀beads/ 材料，加入终浓度至少为95％的乙腈作为结合缓冲液，轻轻震荡混匀，室温孵育5min；12,000g离心5min，轻轻吸弃上清，避免接触到beads/材料；分别加入180μL乙腈，轻轻震荡混匀，瞬离，轻轻吸弃上清，加入适量体积2％乙腈，瞬离2s，用枪头将管壁上的beads/材料轻轻推入溶液中，轻轻震荡混匀，超声30s；瞬离2s，轻轻吸上清至新的离心管；12,000g离心5min，轻轻吸出上清，得SP3酶解脱盐后的肽段产物(C)；
7.取上述SP3酶解的肽段产物(A)、Y型材料的酶解肽段产物(B)以及单独100μg的SP3酶解脱盐后的肽段产物(C)并加入Y型材料进行如下操作，用枪洗打轻轻混匀beads/材料，加入终浓度至少为95％的乙腈作为结合缓冲液，轻轻震荡混匀，室温孵育5min；12,000g离心5min，轻轻吸弃上清，避免接触到beads/材料；分别加入180μL乙腈，轻轻震荡混匀，瞬离，轻轻吸弃上清；
8.加入适量体积2％乙腈，瞬离2s，用枪头将管壁上的beads/材料轻轻推入溶液中，轻轻震荡混匀，超声30s；瞬离2s，轻轻吸上清至新的离心管；12,000g离心5min，轻轻吸出上清至上样瓶中，上机检测。
9.将肽段使用纳升级高效液相色谱串联质谱进行DDA数据采集；
10.使用Maxquant软件对质谱数据进行抽提，获得定性定量结果，结果如表3：
表3 Y型材料对比SP3混合材料在蛋白和肽段水平富集质谱检测结果
Figure PCTCN2021126630-appb-000003
结论：
通过对比SP3混合磁珠材料与Y型分子筛材料分别在蛋白和肽段水平对Hela标准品进行富集之后质谱检测结果，发现单独Y型的材料可以替代传统的氨基和羧基修饰的SP3的混合材料，作为进行蛋白和肽段水平的富集的常规蛋白质谱分析手段。

Claims (10)

  1. 一种蛋白质和/或肽段组质谱鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
    S1、向待测样本中加入结合缓冲液，并加入硅铝酸盐类分子筛，得到混悬液；
    S2、将所述混悬液孵育后，进行高速离心，去除上清液，保留沉淀Ⅰ；
    S3、采用清洗缓冲液重悬所述沉淀Ⅰ重悬得到重悬液，将所述重悬液高速离心后去除上清，保留沉淀Ⅱ，重复该步骤数次；
    S4、将所述沉淀Ⅱ制备成蛋白质组样品，进行质谱检测。
  2. 根据权利要求1所述的蛋白质和/或肽段组质谱鉴定方法，其特征在于，步骤S1中，所述待测样本选自不同物种、部位、纯化手段来源的蛋白纯化物、蛋白质组、肽纯化物或肽组；所述结合缓冲液成分包括Tris、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸钾、磷酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠、氯化钾、氯化钠、柠檬酸、柠檬酸钠、巴比妥酸、巴比妥钠、氢氧化钠、盐酸、甲酸、乙酸、EDTA、SDS、NP-40、CHAPS、吐温、Triton、PEG、乙腈、甲醇的中的一种或任意组合。
  3. 根据权利要求1所述的蛋白质和/或肽段组质谱鉴定方法，其特征在于，步骤S1中，所述待测样本选自血清/血浆或者组织/细胞样本。
  4. 根据权利要求1所述的蛋白质和/或肽段组质谱鉴定方法，其特征在于，步骤S1中，所述硅铝酸盐类分子筛选自3A型、4A型、5A型、10Z型、13Z型、Y型或钠丝光沸石型中的一种或几种的混合物，或者某一类型中几种的混合物。
  5. 根据权利要求1所述的蛋白质和/或肽段组质谱鉴定方法，其特征在于，步骤S1中，所述硅铝酸盐类分子筛选自Y型分子筛材料HY、NaY和LaY的混合物，其中三者的质量比为HY：NaY：LaY＝1：(0.5-2)：(0.5-2)。
  6. 根据权利要求1所述的蛋白质和/或肽段组质谱鉴定方法，其特征在于，步骤S2中，所述孵育的条件为：18～37℃下孵育1～120分钟；所述高速离心的条件如下：离心力为8,000～22,000g，温度为2～8℃，时间为5～120分钟。
  7. 根据权利要求1所述的蛋白质和/或肽段组质谱鉴定方法，其特征在于，步骤S3中，所述清洗缓冲液选自步骤S1所使用的结合缓冲液或相应稀释液；所述高速离心的条件如下：离心力为8,000～22,000g，温度为2～8℃，时间为5～120分钟；该步骤重复3次。
  8. 根据权利要求1所述的蛋白质和/或肽段组质谱鉴定方法，其特征在于，步骤S4中，所述蛋白质组样品的制备包括蛋白质组样品制备或者肽段组样品制备：
    蛋白质组样品的制备方法包括如下步骤：
    采用还原试剂缓冲液重悬所述沉淀Ⅱ，经反应后加入烷基化巯基的烷基化试剂，再加入测序级的胰蛋白酶及消化缓冲液，经酶解并脱盐即得蛋白质组样品；
    肽段组样品的制备方法包括如下步骤：
    使用解吸附液重悬所述沉淀II，超声，离心后得上清即为肽段组样品。
  9. 根据权利要求8所述的蛋白质和/或肽段组质谱鉴定方法，其特征在于：
    所述还原试剂为二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦；所述烷基化试剂为碘乙酰胺或氯乙酰胺；加入所述还原试剂后于45～95℃条件下反应0～60分钟，再加入烷基化试剂避光室温反应5～60分钟；
    所述消化缓冲液包括氯化钙、碳酸氢铵等，pH值为7.0～8.5；所述胰蛋白酶的加入量为0.1～100ng/μL；所述酶解的条件为：温度为25～37℃，时间为1～16小时；所述脱盐步骤为使用所述相同硅铝酸盐类分子筛、SDB柱、C18柱或SP3磁珠进行吸附、清洗及解吸附。
  10. 根据权利要求1所述的蛋白质和/或肽段组质谱鉴定方法，其特征在于，步骤S4中，所述质谱检测的方法包括：
    采用液相色谱-串联质谱法进行检测，使用软件对获得数据进行抽提，获得蛋白及肽段定性定量数据。
PCT/CN2021/126630 2021-09-14 2021-10-27 一种提高蛋白质和/或肽段组质谱鉴定数的方法 WO2023040006A1 (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111076303 2021-09-14
CN202111076303.8 2021-09-14
CN202111243949.0A CN113687003B (zh) 2021-09-14 2021-10-26 一种提高蛋白质和/或肽段组质谱鉴定数的方法
CN202111243949.0 2021-10-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023040006A1 true WO2023040006A1 (zh) 2023-03-23

Family

ID=78587896

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2021/126630 WO2023040006A1 (zh) 2021-09-14 2021-10-27 一种提高蛋白质和/或肽段组质谱鉴定数的方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN113687003B (zh)
WO (1) WO2023040006A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117169393A (zh) * 2023-11-03 2023-12-05 杭州湃肽生化科技有限公司 一种植物组织中环肽的检测方法
CN117169489A (zh) * 2023-07-18 2023-12-05 西湖实验室(生命科学和生物医学浙江省实验室) 一种用于处理生物样品以鉴定其中蛋白质的方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114199665B (zh) * 2021-12-10 2024-02-09 谱天（天津）生物科技有限公司 一种尿液中外泌体的富集方法
CN114674955B (zh) * 2022-03-25 2023-12-22 谱天（天津）生物科技有限公司 一种纳米磁性分子筛材料及其制备方法和应用
CN114705794B (zh) * 2022-04-15 2022-12-02 西湖大学 一种生物样本的蛋白质组学分析方法
CN115197895A (zh) * 2022-07-28 2022-10-18 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 基于TiO2的外泌体组学串联提取技术及其应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1431497A (zh) * 2003-01-28 2003-07-23 复旦大学 纳米沸石分子筛组装材料作为亲和色谱填料分离功能蛋白质分子的方法
CN1560625A (zh) * 2004-03-11 2005-01-05 复旦大学 痕量多肽或蛋白质富集及其直接分析方法
WO2010102162A1 (en) * 2009-03-05 2010-09-10 George Mason University Quantitation of serum cell signaling pathway proteins
CN108333263A (zh) * 2017-01-20 2018-07-27 北京蛋白质组研究中心 一种尿蛋白制备方法及尿蛋白质组的检测方法
CN111721939A (zh) * 2020-06-23 2020-09-29 谱度众合(武汉)生命科技有限公司 一种蛋白质凝胶样品的质谱检测前处理方法及处理试剂盒
CN112710755A (zh) * 2020-12-22 2021-04-27 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种血清/血浆蛋白质组分析新方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6890717B1 (en) * 2000-11-28 2005-05-10 Forsyth Dental Infirmary For Children OBP1: a novel protein selectively expressed in osteoblasts
CN101849024B (zh) * 2007-11-05 2015-11-25 荣研化学株式会社 核酸扩增用样品的制备方法及制备试剂盒
CN103145833B (zh) * 2013-03-11 2014-06-18 许瑞安 一种单环刺螠血红蛋白及其分离纯化和应用
CN103304627B (zh) * 2013-05-31 2015-09-30 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 通过电泳特异性分离富集小分子量蛋白质或多肽的方法
CN107525842B (zh) * 2016-06-22 2020-08-11 中国科学院大连化学物理研究所 一种用于研究蛋白质结构或蛋白质相互作用的分析方法
CN107179364B (zh) * 2017-05-26 2019-08-13 桂林理工大学 一种利用高效液相测定沸石分子筛抗菌剂抗菌机理的方法
CN107737603B (zh) * 2017-09-05 2020-05-22 天津大学 一种反蛋白石分子筛催化剂以及制备方法
CN111220690A (zh) * 2018-11-27 2020-06-02 中国科学院大连化学物理研究所 一种低丰度蛋白质翻译后修饰组的直接质谱检测方法
CN112986569B (zh) * 2019-12-02 2022-05-06 中国科学院大连化学物理研究所 一种单端交联肽去除方法及其在蛋白质复合物交联位点分析中的应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1431497A (zh) * 2003-01-28 2003-07-23 复旦大学 纳米沸石分子筛组装材料作为亲和色谱填料分离功能蛋白质分子的方法
CN1560625A (zh) * 2004-03-11 2005-01-05 复旦大学 痕量多肽或蛋白质富集及其直接分析方法
WO2010102162A1 (en) * 2009-03-05 2010-09-10 George Mason University Quantitation of serum cell signaling pathway proteins
CN108333263A (zh) * 2017-01-20 2018-07-27 北京蛋白质组研究中心 一种尿蛋白制备方法及尿蛋白质组的检测方法
CN111721939A (zh) * 2020-06-23 2020-09-29 谱度众合(武汉)生命科技有限公司 一种蛋白质凝胶样品的质谱检测前处理方法及处理试剂盒
CN112710755A (zh) * 2020-12-22 2021-04-27 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种血清/血浆蛋白质组分析新方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Postdoctoral Dissertations", 27 July 2005, FUDAN UNIVERSITY, CN, article WANG, XIAOYAN: "Research on New Techniques of Capillary Electrophoretic-Mass Spectrometry and Sample Enrichment and Their Applications in Proteomics Research", pages: 1 - 72, XP009544606 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117169489A (zh) * 2023-07-18 2023-12-05 西湖实验室(生命科学和生物医学浙江省实验室) 一种用于处理生物样品以鉴定其中蛋白质的方法
CN117169393A (zh) * 2023-11-03 2023-12-05 杭州湃肽生化科技有限公司 一种植物组织中环肽的检测方法
CN117169393B (zh) * 2023-11-03 2024-03-19 杭州湃肽生化科技有限公司 一种植物组织中环肽的检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN113687003B (zh) 2022-06-14
CN113687003A (zh) 2021-11-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2023040006A1 (zh) 一种提高蛋白质和/或肽段组质谱鉴定数的方法
JP6668415B2 (ja) 微生物学的分析用の装置及び方法
JP6258707B2 (ja) 質量分析によるインスリンの定量
CN113009017B (zh) 一种基于抗体偶联磁珠富集技术的激素质谱检测方法
CN110850099B (zh) 一种非疾病诊断目的的血清中c反应蛋白的定值方法
CN111537658A (zh) 一种血清或血浆蛋白的数据非依赖性采集检测方法及应用
Ren et al. Carbon nanotubes (2, 5-dihydroxybenzoyl hydrazine) derivative as pH adjustable enriching reagent and matrix for MALDI analysis of trace peptides
CN114019069A (zh) 生物样品中小分子物质检测的前处理试剂
CN111617746B (zh) 聚离子液体改性纳米材料及其制备方法及其在富集磷酸化肽中的应用
US20120196297A1 (en) Mass tags for mass spectrometric analysis of immunoglobulins
Kånge et al. Comparison of different IMAC techniques used for enrichment of phosphorylated peptides
Li et al. Enrichment of peptides from plasma for peptidome analysis using multiwalled carbon nanotubes
CN114199665B (zh) 一种尿液中外泌体的富集方法
WO2023185840A1 (zh) 一种基于质谱检测体液样本里中低丰度蛋白的方法
EP1711833A2 (en) Preparation of biologically derived fluids for biomarker determination by mass spectrometry
CN116660549A (zh) 一种神经***来源外泌体的蛋白质组学分析方法
CN114034791A (zh) 一种利用聚苯乙烯类材料提高蛋白质和或肽段组质谱鉴定数的方法
CN111644163B (zh) 一种用于富集磷酸化多肽的三足离子液体材料及其制备方法及其应用
JP7203407B2 (ja) 質量分析用のペプチド試料の調製方法
KR100784479B1 (ko) 나노다공성 탄소자성체를 이용한 펩타이드의 농축 및 염류제거 방법과 질량분석에의 응용
JPWO2002103360A1 (ja) 細胞内に存在するタンパク質又は当該タンパク質と相互作用する物質を分析する方法
CN114674955B (zh) 一种纳米磁性分子筛材料及其制备方法和应用
CN116046923B (zh) 一种血清中降钙素原的定值方法
CN103884569B (zh) 水牛***多肽组的制备和质谱分析方法
Pham et al. Nanodiamond for Mass‐Spectrometry‐Based Analysis of Peptides, Proteins, and Proteomes

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21957273

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE