WO2023032957A1 - がんの予防および／または治療のための医薬組成物 - Google Patents

がんの予防および／または治療のための医薬組成物 Download PDF

Info

Publication number
WO2023032957A1
WO2023032957A1 PCT/JP2022/032534 JP2022032534W WO2023032957A1 WO 2023032957 A1 WO2023032957 A1 WO 2023032957A1 JP 2022032534 W JP2022032534 W JP 2022032534W WO 2023032957 A1 WO2023032957 A1 WO 2023032957A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
monocytes
cxcr1
mmp
antibody
cells
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/032534
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
正人 田中
謙一 浅野
直輝 池田
聡志 四元
Original Assignee
学校法人東京薬科大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 学校法人東京薬科大学 filed Critical 学校法人東京薬科大学
Publication of WO2023032957A1 publication Critical patent/WO2023032957A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Definitions

  • the present invention relates to pharmaceutical compositions for preventing and/or treating cancer.
  • Ym1-positive regulatory monocytes that increased in the bone marrow of late-stage inflammatory mice and migrated to peripheral tissues. That is, in mice in which Ym1-positive regulatory monocytes have been eliminated, weight loss and tissue repair associated with enteritis are delayed, and it was found that the monocytes promote inflammation suppression and tissue repair (Patent Document 1, Non-Patent Document 1). Furthermore, recently, studies using cancer-bearing model mice have reported that Ym1-positive regulatory monocytes are involved in promoting cancer metastasis (Patent Document 2, Non-Patent Document 2).
  • JP 2019-201561 A Patent application 2021-126801
  • the purpose of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention and/or treatment of cancer.
  • the present inventors In order to obtain information leading to the search for human regulatory monocytes, the present inventors analyzed in detail the differentiation pathway and surface markers of Ym1-positive regulatory monocytes in mice, and identified regulatory monocytes and neutrophils. (Fig. 1 and Fig. 2). Using this similarity between regulatory monocytes and neutrophils as a clue, the present inventors searched for human regulatory monocytes using neutrophil marker expression as an index, and identified CD14-positive monocytes as CXCR1 expression levels. It was clarified that they could be classified into two different clusters (Fig. 3).
  • CXCR1-positive monocytes monocytes isolated from peripheral blood of healthy individuals (CXCR1-positive CD14-positive monocytes, CXCR1-negative CD14-positive monocytes, CD14/CD16 double-positive monocytes and RNA sequence analysis of total gene expression in CD16-positive monocytes (4 types of CD16-positive monocytes) and neutrophils showed that CXCR1-positive monocytes resembled neutrophils even at the gene level (Fig. 4).
  • the present inventors isolated CXCR1-positive CD14-positive monocytes and CXCR1-negative CD14-positive monocytes from the peripheral blood of healthy individuals, and co-cultured them in vitro with T cells prepared from the same donor.
  • CXCR1-positive CD14-positive monocytes were found to have a T-cell proliferation-suppressing function. This proved that the CXCR1-positive CD14-positive monocytes identified for the first time corresponded to mouse regulatory monocytes (Fig. 5).
  • TACE transcatheter arterial chemoembolization
  • the ratio of CXCR1-positive CD14-positive monocytes to CD14-positive monocytes was , significantly increased, demonstrating that human CXCR1-positive CD14-positive monocytes also behaved similarly to mouse Ym1-positive monocytes (FIG. 6).
  • FIG. 2 shows the correlation between CD88 and CD157 expression in peripheral blood and Ym1 protein expression in Ly6C + monocytes.
  • FIG. 13 shows the workflow of the experimental strategy; Specifically, this figure shows that bone marrow cells derived from na ⁇ ve and LPS-administered Ym1-Venus mice were stained with 11 types of backbone markers and PE-conjugated variable antibodies (255 types: LEGENDScreen mouse PE kit), and analyzed by flow cytometry. Analyzed by metric. The results obtained were analyzed by the InfinityFlow pipeline to predict co-expression patterns of 255 markers per cell. Based on the results of FIG.
  • FIG. 2A a UMAP plot of naive Ym1-Venus mouse bone marrow was created, and the expression of each marker is displayed as a heat map. Based on the results in Figure 2K, the distribution of various mature and progenitor cells on the UMAP plot is shown. Similar to FIG. 2B, UMAP plot of bone marrow of LPS-treated Ym1-Venus mice.
  • FIG. 2B is a diagram showing differentiation pathways predicted by clustering and pseudo-time series analysis based on the results of FIG. 2A. UMAP plots of bone marrow cells from na ⁇ ve (upper left) and LPS-treated mice (lower left).
  • FIG. 2 shows differentiation of Ym1 + Ly6C + monocytes from GMP, proNeu1 and CD81 + CX3CR1 ⁇ cMoP in vitro in the presence of GM-CSF.
  • FIG. 2A is a diagram showing the UMAP plot obtained by the analysis of FIGS. 2A to 2C superimposed on the distribution of various immune cells, including progenitor cells, classified by previously reported surface markers.
  • FIG. 2A is a diagram showing the UMAP plot obtained by the analysis of FIGS. 2A to 2C superimposed on the distribution of various immune cells, including progenitor cells, classified by previously reported surface markers.
  • FIG. 2 shows the gating strategy for various cells used in FIGS. 2H-2T.
  • FIG. 1 shows markers that are preferentially expressed on human peripheral blood neutrophils compared to monocytes.
  • FIG. 2 shows the results of a cluster analysis identifying two subpopulations of monocytes among CD14 + monocytes based on different CXCR1 expression levels.
  • FIG. 1 shows the gating strategy used to define neutrophils, CD14 + monocytes, CD14 + CD16 + monocytes and CD16 + monocytes. Morphological characteristics of CXCR1 + CD14 + monocytes, CXCR1 ⁇ CD14 + monocytes and neutrophils.
  • FIG. 3B shows expression in CD14 + monocytes of various surface markers shown in FIG. 3A.
  • FIG. 4 shows the results of principal component analysis (PCA) based on four monocyte and neutrophil RNA sequences.
  • PCA principal component analysis
  • FIG. 4 shows the hierarchical clustering of four monocyte and neutrophil RNA-sequencing results. The figure shows that the gene expression pattern of CXCR1 + CD14 + monocytes is more similar to neutrophils than CXCR1 ⁇ CD14 + monocytes.
  • Heat map showing genes highly expressed in CXCR1 + CD14 + monocytes or CXCR1 ⁇ CD14 + monocytes extracted by RNA sequencing.
  • FIG. 4C shows gene ontology with significant increase in genes highly expressed in CXCR1 + CD14 + monocytes as defined in FIG. 4C.
  • FIG. 4C shows the results of qRT-PCR confirmation of gene expression highly expressed in CXCR1 + CD14 + monocytes defined in FIG. 4C.
  • UMAP plot (left) and heat map (right) reanalyzed from Villani et al.'s single-cell RNA-sequencing results.
  • FIG. 4 shows a heatmap of relative expression of marker genes that distinguish monocyte clusters.
  • FIG. 2 shows the expression levels in various cells of three genes that are highly expressed in neutrophils. The figure shows that not all genes that are highly expressed in neutrophils are highly expressed in CXCR1 + CD14 + monocytes.
  • FIG. 3 shows cytokine array results using culture supernatants of CXCR1 + CD14 + monocytes and CXCR1 ⁇ CD14 + monocytes.
  • FIG. 5B shows the results of confirmation by ELISA of the decreased expression of pro-inflammatory cytokines (IL-6 and TNF ⁇ ) by CXCR1 + CD14 + monocytes identified in FIG. 5A.
  • CXCR1 + CD14 + monocytes suppress T cell proliferation in a cell number-dependent manner.
  • FIG. 4 shows that suppression of T cell proliferation by CXCR1 + CD14 + monocytes is cell-cell contact dependent.
  • FIG. 4 shows that addition of catalase (left) or Nec-1 (right) reversed T cell proliferation suppression by CXCR1 + monocytes.
  • FIG. 4 shows that inhibitors of T cell proliferation by CXCR1 + CD14 + monocytes are absent in the culture supernatant of the same cells.
  • FIG. 2 shows the results of flow cytometry analysis of peripheral blood of cancer patients before TACE (upper) and 3 to 4 days after TACE (lower).
  • FIG. 4 shows increased CXCR1 + CD14 + monocytes 3-4 days after TACE compared to pre-TACE.
  • FIG. 4 shows the ratio of CXCR1 + CD14 + monocytes before and after TACE.
  • FIG. 2 shows the correlation between percentage of CXCR1 + CD14 + monocytes and neutrophil count and serum CRP.
  • FIG. 4 shows the degree of suppression of T cell proliferation by CXCR1 + CD14 + monocytes before TACE and 96 hours after TACE.
  • FIG. 2 shows expression of CD66a/c/e and CD66b in CXCR1 + CD14 + monocytes before and after TACE.
  • FIG . 2 shows the correlation between the percentage of CXCR1 + CD66a/c/e + and CXCR1 + CD66b + cells among CD14 + monocytes and neutrophil count and serum CRP.
  • a first aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition for administration to a subject having CXCR1 + CD14 + monocytes, the pharmaceutical composition comprising Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) Contains compounds that inhibit activity.
  • CXCR1 + CD14 + monocytes refers to monocytes expressing the CXCR1 (also known as “CD181") gene and the CD14 gene, "CD14 + monocytes expressing CXCR1", “CXCR1 and CD14-expressing monocytes” and “CXCR1-positive CD14-positive monocytes”.
  • CXCR1 and CD14 are typically expressed on the monocyte surface.
  • CXCR1 + CD14 + monocytes refer to the CXCR1 gene and the CD14 gene, expressing both these genes and proteins.
  • each marker gene may be confirmed based on either gene or protein.
  • the expression of the marker gene can be confirmed using techniques known in the art, for example, by measuring the expression level of the marker gene by qPCR.
  • a “subject having CXCR1 + CD14 + monocytes” is preferably a subject in which a high proportion of CD14 + monocytes in the subject is CXCR1 + CD14 + monocytes, more preferably CD14 + in the subject. Subjects in which the proportion of CXCR1 + CD14 + monocytes among monocytes is higher than that of healthy subjects.
  • the ratio of "CXCR1 + CD14 + monocytes/CD14 + monocytes” is, for example, 30% or more, preferably 35% or more, more preferably 40% or more, and even more It is preferably 45% or more, and more preferably 50% or more.
  • marker genes expressed in monocytes shall include their homologues.
  • Monocytes that expressed CXCR1 and CD14 specifically refer to monocytes that expressed the CXCR1 gene or its homolog and the CD14 gene or its homolog.
  • the scope of the marker gene shall also include homologues thereof.
  • a “homolog” of a specific gene means an entity having specific homology with the nucleotide sequence of the specific gene or the amino acid sequence of the protein encoded by the gene.
  • sequences the terms “homology”, “identity” and “sequence identity” are used interchangeably.
  • the percentage of “sequence identity” is determined by aligning the nucleotide sequences of two genes or the amino acid sequences of proteins encoding them using alignment algorithms well known to those skilled in the art. refers to the ratio of identical nucleotides or amino acid residues.
  • the above alignments include the GCG Wisconsin Bestfit package (Devereux et al., 1984 Nuc. Acids Research 1 p387), the BLAST package (Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th edition, Chapter 18), FASTA (Alts90 et al., J. Mol. Biol. 403-410), DNASISTM (Hitachi Software) and other computer programs can be used, but are not limited to these.
  • the terms “suppression” and “prevention” both encompass both therapeutic and prophylactic measures, preferably preventing, delaying, and shall include mitigation.
  • the terms “suppression” and “prevention” include reducing the number of cancer foci, reducing the extent of foci, stabilizing the number and extent of foci (i.e., not increasing or enlarging), including, but not limited to, slowing down and delaying the increase or expansion of the number and extent of .
  • “Suppression” or “prevention” of cancer metastasis can be evaluated according to methods known in the art. For example, the number of nodules, localization of cancer cells, and genes highly expressed in cancer cells can be used as indicators for evaluation. The number of nodules and cancer cell localization can be assessed using, for example, tissue staining and imaging. In addition, genes highly expressed in cancer cells can be confirmed by, for example, immunofluorescence staining and RT-PCR.
  • MMP-9 activation pathway includes CXCR1 + CD14 + monocytes and MMP-9.
  • the “MMP-9 activation pathway” preferably includes CXCR1 + CD14 + monocytes, Lcn2 and MMP-9. More specifically, “MMP-9 activation pathway” refers to a pathway involving the secretion of MMP-9 by CD14 + monocytes that expressed CXCR1.
  • MMP-9 activation pathway is synonymous with “cancer progression cascade”.
  • the pathway may further include Neutrophil gelatinase-associated lipocalin protein (Lcn2).
  • Lcn2 has the effect of enhancing the activity of MMP-9 by stabilizing MMP-9.
  • progression of cancer includes, for example, onset of cancer, metastasis of cancer, invasion of cancer, recurrence of cancer, proliferation of cancer cells, and invasion of cancer. included.
  • the "MMP-9 activation pathway” further comprises at least one selected from CD66a, CD66b, CD66c and CD66e. In another aspect, the "MMP-9 activation pathway” further comprises CD66b and at least one selected from CD66b, CD66c and CD66e.
  • a compound that inhibits the activity of MMP-9 is not limited to compounds that directly inhibit the activity of MMP-9, and a series of pathways (e.g., "MMP-9 activation pathway” or " Also included are compounds that indirectly inhibit the activity of MMP9 in the cancer progression cascade”).
  • an “antagonist” is used in the broadest sense.
  • An “antagonist” is a molecule that partially or completely blocks, inhibits, neutralizes, prevents and/or interferes with the biological activity of the target molecule, regardless of the underlying mechanism of action.
  • MMP-9 activation pathway the pathway leading to activation of MMP-9 (hereinafter also referred to as "MMP-9 activation pathway”) in the treatment of subjects with CXCR1 + CD14 + monocytes. It shows the usefulness of this.
  • the term “compounds involved in pathways leading to activation of MMP-9” includes, for example, CXCR1, IL-8, Lcn2, CD66a, CD66b, CD66c, CD66e and MMP-9.
  • the term “cells involved in a pathway leading to activation of MMP-9” includes, for example, CXCR1 + CD14 + monocytes, and any of CXCR1, CD66a, CD66b, CD66c, CD66e and MMP-9. Expression or production cells and the like are included.
  • CXCR1 antagonists for example, specifically recognizes and binds CXCR1, antibody-dependent cytotoxicity by activation of immune system cells (Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity; ADCC) activity, complement-dependent cytotoxicity (Complement - based on the ability to induce Dependent Cytotoxicity (CDC) and Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis (ADCP) activity and to inhibit or block MMP-9 production by CXCR1-expressing monocytes.
  • ADCC Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity
  • CDC Dependent Cytotoxicity
  • ADCP Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis
  • a CXCR1 antagonist can be obtained, for example, by incubating monocytes expressing CXCR1 on their surface in the presence and absence of a test compound, further adding effector cells or serum containing complement, incubating, and cytotoxicity in culture. It can be identified by measuring a substance released in the serum, such as LDH.
  • a test compound is a CXCR1 antagonist if the concentration of the substance released with cytotoxicity is higher in the presence of the test compound than in the absence of the test compound.
  • CXCR1 antagonists can also be used, for example, by incubating monocytes expressing CXCR1 on their surface in the presence and absence of test compounds and monitoring MMP-9 levels in cell culture supernatants, for example, by ELISA.
  • a test compound is a CXCR1 antagonist if MMP-9 levels are lower with the test compound than without the test compound.
  • real-time RT-PCR can be used to monitor MMP-9 mRNA expression in tissues expressing CXCR1 before and after treatment with test compounds. A decrease in MMP-9 mRNA levels in the presence of a test compound indicates that the compound is a CXCR1 antagonist.
  • CXCR1 antagonists include neutralizing antibodies against whole native CXCR1 polypeptides or against native CXCR1 polypeptide subunits, immunoadhesins comprising CXCR1 subunits fused to immunoglobulin constant region sequences, small molecules, native CXCR1 polypeptides. Aptamers that bind to whole or native CXCR1 polypeptide subunits, nucleic acid molecules (e.g., siRNA, antisense oligonucleotides) capable of inhibiting translation and/or transcription of genes encoding whole or subunits of native CXCR1 polypeptides , decoys and ribozymes) and the like.
  • nucleic acid molecules e.g., siRNA, antisense oligonucleotides
  • amino acid sequences of native CXCR1 polypeptides can be obtained from databases known in the art.
  • amino acid sequences of native CXCR1 polypeptides include: CXC chemokine receptor type 1 [Homo sapiens], NCBI Reference Sequence: NP_000625 is mentioned.
  • CXCR1 antagonists include antibodies and fragments thereof that specifically recognize polypeptides having such sequences, as well as certain sequence identities with such sequences (e.g., 80% or greater, 85% or greater, 90% or greater, 95% or greater). % or greater than 98% sequence identity), antibodies and fragments thereof, and the like.
  • CXCR1 antagonists include - a gene encoding a polypeptide having an amino acid sequence as described above, - a gene encoding a polypeptide having a certain sequence identity (e.g., 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, or 98% or more sequence identity) with the above amino sequences; - A gene having the base sequence as described above, - Translation of a gene having a base sequence with a certain sequence identity (e.g., 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, or 98% or more sequence identity) with the above base sequence, and Included are nucleic acid molecules and the like that are capable of inhibiting at least one of transcription.
  • CXCR1 antagonists include, for example, antibodies, antibody fragments, and low-molecular-weight compounds.
  • CXCR1 antagonists are, for example, anti-CXCR1 antibodies and CXCR1 inhibitors.
  • Lcn2 is a secreted glycoprotein, also known as Lipocalin-2, Neutrophil Gelatinase-associated Lipocalin (NGAL), 24p3 or Neutrophil Lipocalin (NL). Lcn2 also functions as a stress protein and is involved in diverse cellular processes such as the innate immune response, differentiation, tumorigenesis and cell survival.
  • a "biological activity" of the target molecule, "Lcn2", in the context of an “Lcn2 antagonist” is the ability to maintain MMP-9 activity, eg, by stabilizing MMP-9.
  • Lcn2 antagonists can be identified, for example, based on their ability to specifically recognize and bind Lcn2 and inhibit the gelatinase activity of MMP-9.
  • Lcn2 antagonists for example, incubate Lcn2-expressing cells, or Lcn2-coated plates, in the presence and absence of a test compound, further incubate with MMP-9, and increase the gelatinase activity of MMP-9. It can be identified by measuring.
  • a test compound is an Lcn2 antagonist if the gelatinase activity is lower with the test compound than without the test compound.
  • Lcn2 includes an antibody that specifically recognizes a polypeptide having such a sequence and a fragment thereof, and a certain sequence identity with the sequence (e.g., 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or greater than 98% sequence identity), antibodies and fragments thereof, and the like.
  • Lcn2 antagonists include - a gene encoding a polypeptide having an amino acid sequence as described above, - a gene encoding a polypeptide having a certain sequence identity (e.g., 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, or 98% or more sequence identity) with the above amino sequences; - A gene having the base sequence as described above, - Translation of a gene having a base sequence with a certain sequence identity (e.g., 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, or 98% or more sequence identity) with the above base sequence, and Included are nucleic acid molecules and the like that are capable of inhibiting at least one of transcription.
  • Lcn2 antagonists include, for example, antibodies and antibody fragments and low-molecular-weight compounds. Lcn2 antagonists are, for example, anti-Lcn2 antibodies and Lcn2 inhibitors.
  • CD66b antagonist "CD66b (Cluster of Differentiation 66b)" was confirmed by the present inventors to be highly expressed on the surface of CXCR1 + CD14 + monocytes in the peripheral blood of liver cancer patients after TACE (Fig. 6A-6D).
  • CD66b is a glycosyl-phosphatidylinositol-linked glycoprotein, also known as "CGM6”.
  • CD66b is typically thought to be involved via signaling in the regulation of CD11/CD18 adhesion activity on neutrophils, including myelocytes, metamyelocytes, neutrophils and lobulated nucleophiles.
  • CD66b antagonists can be identified, for example, based on their ability to specifically recognize and bind CD66b and inhibit its function.
  • a CD66b antagonist inhibits CD66b expressed on the surface of CXCR1 + CD14 + monocytes, which exists upstream in the cancer development cascade that the present inventors discovered, thereby inducing the production of MMP-9 by the monocytes. and indirectly inhibits the activity of MMP-9 downstream in this cascade.
  • the CD66b antagonist is an anti-CD66b antibody
  • the recognition of CD66b by the anti-CD66b antibody can ablate CXCR1 + monocytes and inhibit the production of MMP-9, eg by ADCC, CDC or ADCP.
  • CD66b antagonists include neutralizing antibodies against the whole native CD66b polypeptide or against native CD66b polypeptide subunits, immunoadhesins comprising CD66b subunits fused to immunoglobulin constant region sequences, small molecules, native CD66b polypeptides. Aptamers that bind to whole or native CD66b polypeptide subunits, nucleic acid molecules (e.g., siRNA, antisense oligonucleotides) capable of inhibiting translation and/or transcription of genes encoding whole or subunits of native CD66b polypeptide , decoys and ribozymes) and the like.
  • nucleic acid molecules e.g., siRNA, antisense oligonucleotides
  • amino acid sequences of native CD66b polypeptides can be obtained from databases known in the art.
  • amino acid sequences of native CD66b polypeptides include: Homo sapiens carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 8 precursor, NCBI Reference Sequence: NP_001807 are mentioned.
  • CD66b antagonists include antibodies and fragments thereof that specifically recognize polypeptides having such sequences, as well as certain sequence identities (e.g., 80% or greater, 85% or greater, 90% or greater, 95% or greater) with such sequences. % or greater than 98% sequence identity), antibodies and fragments thereof, and the like.
  • CD66b antagonists include: - a gene encoding a polypeptide having an amino acid sequence as described above, - a gene encoding a polypeptide having a certain sequence identity (e.g., 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, or 98% or more sequence identity) with the above amino sequences; - A gene having the base sequence as described above, - Translation of a gene having a nucleotide sequence with a certain degree of sequence identity (e.g., 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, or 98% or more sequence identity) with the above nucleotide sequence, and Included are nucleic acid molecules and the like that are capable of inhibiting at least one of transcription.
  • CD66a antagonist, CD66c antagonist and CD66e antagonist At least one of CD66a, CD66c and CD66e, like CD66b, was highly expressed on the surface of CXCR1 + CD14 + monocytes in the peripheral blood of liver cancer patients after TACE by the present inventors. was confirmed (Fig. 6F).
  • the notation "CD66a/c/e” means that at least one of CD66a, CD66c and CD66e was detected using an "anti-CD66a/c/e antibody” capable of recognizing three molecules of CD66a, CD66c and CD66e. indicates that one was detected.
  • CD66a, CD66c and CD66e are members of the carcinoembryonic antigen (CEA) family of the Ig superfamily.
  • CD66a antagonists can be identified, for example, based on their ability to specifically recognize and bind CD66a and inhibit its function.
  • a CD66a antagonist inhibits CD66a expressed on the surface of CXCR1 + CD14 + monocytes, which exists upstream in the cancer development cascade discovered by the present inventors, thereby inducing the production of MMP-9 by the monocytes. and indirectly inhibits the activity of MMP-9 downstream in this cascade.
  • CD66a antagonist is an anti-CD66a antibody
  • the recognition of CD66a by the anti-CD66a antibody may deplete CXCR1 + monocytes and inhibit the production of MMP-9, eg by ADCC, CDC or ADCP.
  • MMP-9 eg by ADCC, CDC or ADCP.
  • CD66c and CD66e antagonists the same explanations as for CD66a antagonists apply.
  • a CD66a antagonist can be identified, for example, by incubating cells expressing CD66a on their surface in the presence and absence of a test compound and measuring the binding activity to the molecule to which CD66a originally binds.
  • a test compound is a CD66a antagonist if the binding activity is lower with the test compound than without the test compound.
  • CD66c and CD66e antagonists can also be identified by methods similar to CD66a antagonists.
  • amino acid sequences of native CD66a, CD66c and CD66e polypeptides can be obtained from databases known in the art.
  • amino acid sequences of these polypeptides include: - Homo sapiens carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 isoform 2 precursor, NCBI Reference Sequence: NP_001020083, - Homo sapiens carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6 preprotein, NCBI Reference Sequence: NP_002474, ⁇ Homo sapiens carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 isoform 1 preprotein, NCBI Reference Sequence: NP_001278413 is mentioned.
  • nucleotide sequence of the gene encoding the natural CD66a polypeptide examples include: - Homo sapiens Homo sapiens CEA cell adhesion molecule 1 (CEACAM1), transcript variant 2, mRNA; NCBI Reference Sequence: NM_001024912, - Homo sapiens CEA cell adhesion molecule 6 (CEACAM6), mRNA; NCBI Reference Sequence: NM_002483, - Homo sapiens CEA cell adhesion molecule 5 (CEACAM5), transcript variant 2, mRNA; NCBI Reference Sequence: NM_001291484 are mentioned.
  • Each of the CD66a antagonists, CD66c antagonists and CD66e antagonists include - a gene encoding a polypeptide having an amino acid sequence as described above, - a gene encoding a polypeptide having a certain sequence identity (e.g., 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, or 98% or more sequence identity) with the above amino sequences; - A gene having the base sequence as described above, - Translation of a gene having a nucleotide sequence with a certain degree of sequence identity (e.g., 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, or 98% or more sequence identity) with the above nucleotide sequence, and Included are nucleic acid molecules and the like that are capable of inhibiting at least one of transcription.
  • CD66a antagonist each include, for example, antibodies and antibody fragments and low-molecular-weight compounds.
  • MMP-9 is a matrix metalloproteinase that regulates extracellular domain secretion of cell growth factors.
  • a "biological activity" of the target molecule "MMP-9" in the context of an "MMP-9 antagonist” is, for example, the ability to degrade components of the extracellular matrix.
  • MMP-9 antagonist is an MMP-9 inhibitor, it can inhibit degradation of components of the extracellular matrix by MMP-9.
  • the MMP-9 antagonist is an anti-MMP-9 antibody, the antagonist is identified based on, for example, the ability to specifically recognize and bind MMP-9 and induce ADCC, CDC and ADCP activities.
  • MMP-9 antagonists can be identified, for example, by incubating plates coated with MMP-9 protein in the presence and absence of test compounds and measuring gelatinase activity.
  • a test compound is an MMP-9 antagonist if the level of gelatinase activity is lower with the test compound than without the test compound.
  • MMP-9 antagonists include neutralizing antibodies against the whole native MMP-9 polypeptide or against native MMP-9 polypeptide subunits, immunoadhesins comprising MMP-9 subunits fused to immunoglobulin constant region sequences , a small molecule, an aptamer that binds to the entire native MMP-9 polypeptide or a native MMP-9 polypeptide subunit, inhibits translation and/or transcription of a gene encoding the entire native MMP-9 polypeptide or a subunit thereof nucleic acid molecules (eg, siRNA, antisense oligonucleotides, decoys and ribozymes), etc.
  • nucleic acid molecules eg, siRNA, antisense oligonucleotides, decoys and ribozymes
  • amino acid sequences of native MMP-9 polypeptides can be obtained from databases known in the art.
  • amino acid sequences of native MMP-9 polypeptides include: Homo sapiens matrix metalloproteinase-9 preprotein, NCBI Reference Sequence: NP_004985 are mentioned.
  • MMP-9 antagonists include antibodies and fragments thereof that specifically recognize polypeptides having such sequences, as well as certain sequence identities (e.g., 80% or greater, 85% or greater, 90% or greater) with such sequences. , 95% or greater or 98% or greater sequence identity), antibodies and fragments thereof, and the like.
  • antibody is used in the broadest sense, specifically monoclonal antibodies (e.g. neutralizing and agonistic antibodies), polyclonal antibodies, multispecific antibodies (e.g. bispecific antibodies) and antibody fragments. is included.
  • Monoclonal antibodies include chimeric antibodies and fragments of such antibodies, so long as they exhibit the desired biological activity. Chimeric antibodies are those in which a portion of the heavy or light chain or both is identical or homologous to the corresponding sequences of an antibody from a particular species or belonging to a particular antibody class or subclass, and the remaining chains are are identical or homologous to the corresponding sequences of antibodies from another species, as well as fragments of such antibodies, or antibodies belonging to another antibody class or subclass (U.S. Pat. No.
  • Monoclonal antibodies also include "humanized" antibodies or fragments that contain minimal sequence derived from non-human immunoglobulin, such as Fv, Fab, Fab', F(ab')2, etc. Examples include, but are not limited to, antigen-binding subsequences of antibodies.
  • the humanized antibody is a human immune antibody in which residues from the CDRs of the recipient have been replaced with residues from the CDRs of a non-human species (donor antibody) with the desired specificity, affinity and potency. It may be a globulin (recipient antibody).
  • monoclonal antibody refers to antibodies that are substantially homogeneous, i.e., antibodies obtained from a population such that each antibody comprising the population is identical except for naturally occurring variations that may be present in minor amounts. point to Monoclonal antibodies are highly specific, being directed against a single antigenic site. Furthermore, in contrast to conventional (polyclonal) antibody preparations which typically contain different antibodies directed against different determinants (epitopes), each monoclonal antibody is directed against a single determinant on the antigen.
  • ribozymes which are designed to induce catalytic cleavage of target RNA by adding sequences with natural self-splicing activity (e.g., W arzocha et al., Leuk.Lymphoma 24:267-281 [1997]).
  • compositions according to the present invention are formulated into tablets, powders, granules, capsules, injections, liquids, suppositories, etc., and administered, for example, orally, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, or intramuscularly. can do.
  • the dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention varies depending on the subject's age, body weight, medical condition, and the like.
  • composition according to the present invention may be used as a combination, in combination with further pharmaceutical compositions.
  • the ingredients i.e., the first active ingredient and the second active ingredient
  • each pharmaceutical composition may be combined, in sequence or individually, in one combined unit dosage form or two separate units. It may be administered in dosage form.
  • a therapeutically effective amount of each active ingredient of the combination according to the invention may be administered simultaneously, separately or in any order, sequentially or sequentially.
  • the first active ingredient and said second active ingredient may be present in multiple units.
  • Combinations also include, for example, kits containing each active ingredient and instructions for use.
  • a second aspect of the present invention relates to a composition that inhibits the MMP-9 activation pathway, said MMP-9 activation pathway comprising CXCR1 + CD14 + monocytes, Lcn2 and MMP-9, said composition comprising , including compounds that inhibit the activity of MMP-9.
  • said MMP-9 activation pathway further comprises at least one selected from CD66a, CD66b, CD66c and CD66e.
  • said MMP-9 activation pathway further comprises CD66a and at least one selected from CD66b, CD66c and CD66e.
  • said MMP-9 activation pathway may further comprise IL-8.
  • steps (i) and/or (ii) are typically performed by flow cytometry.
  • the measurements in both (i) and (ii) above are performed by flow cytometry.
  • kits for predicting the likelihood of cancer progression are for evaluating or predicting the possibility of cancer progression.
  • the kit contains, for example, at least one selected from anti-CXCR1 antibody, anti-Lcn2 antibody, anti-CD66a antibody, anti-CD66b antibody, anti-CD66c antibody, anti-CD66e antibody and anti-MMP-9 antibody.
  • the ratio of CXCR1 + CD14 + monocytes to white blood cells in a subject's peripheral blood sample can be detected.
  • compositions comprising compounds that inhibit MMP-9.
  • compounds that inhibit MMP-9 include anti-CXCR1 antibodies, CXCR1 inhibitors, anti-Lcn2 antibodies, Lcn2 inhibitors, anti-CD66a antibodies, CD66a inhibitors, anti-CD66b antibodies, CD66b inhibitors, anti-CD66c antibodies, At least one selected from the group consisting of CD66c inhibitors, anti-CD66e antibodies, CD66e inhibitors, anti-MMP-9 antibodies and MMP-9 inhibitors.
  • the composition may contain multiple compounds that inhibit MMP-9 in combination. Such compositions may be used, for example, to detect CXCR1 + CD14 + monocytes.
  • Yet another aspect of the present invention relates to a method of screening for compounds that modulate the T cell antiproliferative effects of CXCR1 + CD14 + monocytes, the method comprising: (i) adding a candidate compound to a co-culture system of CXCR1 + CD14 + monocytes and T cells; Identifying as a compound that modulates antiproliferative activity.
  • modulation of T cell growth inhibitory action is preferably "release of T cell growth inhibitory action".
  • release of T cell growth inhibitory action When the antiproliferative action of T cells is released, T cells proliferate.
  • the number of T cells is multiplied by 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.
  • the candidate compound increases or decreases 7-fold, 1.8-fold, 1.9-fold, 2.0-fold, 2.5-fold or 3.0-fold or more, it modulates the T cell growth inhibitory effect of monocytes can be identified as a compound that The number of T cells can be measured using methods known to those skilled in the art, for example, using a flow cytometer and a hemacytometer.
  • the screening method comprises: (i) adding a candidate compound to a monocyte population comprising CXCR1 + CD14 + monocytes; (ii) measuring the proportion of monocytes expressing the CXCR1 gene in the monocyte population; and (iii) if the candidate compound changes the proportion of monocytes expressing the CXCR1 gene, the candidate Identifying the compound as a compound that modulates the T cell antiproliferative effects of monocytes.
  • screening refers to the selection of targets such as organisms or substances with specific properties of interest from a population containing a large number by a specific operation/evaluation method.
  • identification refers to the selection of targets such as organisms or substances with specific properties of interest from a population containing a large number by a specific operation/evaluation method.
  • identification refers to the selection of targets such as organisms or substances with specific properties of interest from a population containing a large number by a specific operation/evaluation method.
  • isolation separation
  • isolation isolation
  • purification may be used interchangeably herein.
  • Candidate compounds are not particularly limited, and various compounds such as low-molecular-weight compounds, proteins, nucleic acids, other polymers, metals and other inorganic compounds can be used. Fragments of cells or cells themselves may be used as candidate compounds.
  • Yet another aspect of the present invention relates to a method of screening for compounds that modulate the T cell antiproliferative effects of CXCR1 + CD14 + monocytes, the method comprising: (i) adding a candidate compound to the monocyte progenitor cell population; (ii) differentiating a monocyte population from said monocyte progenitor cell population; (iii) measuring the percentage of monocytes expressing the CXCR1 gene in said differentiated monocyte population; and (iv) if said candidate compound alters the percentage of monocytes expressing said CXCR1 gene, identifying the candidate compound as a compound that modulates the antiproliferative effect of monocytes on T cells.
  • the above monocyte progenitor cell population can be obtained from bone marrow tissue or the like by a known method.
  • common monocyte progenitor cells cMoP
  • monocyte progenitor cell populations can be obtained by known methods using cell surface markers and the like.
  • a known method can be used for differentiating the monocyte progenitor cell population from the monocyte progenitor cell population.
  • Monocyte populations can be differentiated by culturing in the presence of cytokine combinations for a period of time.
  • the percentage of monocytes expressing the CXCR1 gene in the differentiated monocyte population is reduced to 1%, 2%,
  • the candidate compound increases or decreases by 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% or 100% or more, can be identified as compounds that modulate the T cell antiproliferative effects of
  • a compound that increases the proportion of monocytes that express the CXCR1 gene in a differentiated monocyte population can be identified as a compound that inhibits the T cell antiproliferative effects of monocytes.
  • mice C57BL/6J (7-12 weeks old) mice were obtained from CLEA Japan, Inc.; Obtained from Ym1-Venus mice were generated in our laboratory (ref. 2). All mice were housed under SPF conditions at the Tokyo University of Pharmacy and Life Science Animal Facility. All mouse experiments described herein were approved by the Tokyo University of Pharmacy and Life Sciences Animal Care and Use Committee (L20-18, L21-19) and were performed in accordance with appropriate guidelines and regulations.
  • Lipopolysaccharide LPS
  • E. coli E. coli, O111:B4
  • catalase N-acetyl-L-cysteine
  • ferrostatin Fecrostatin-1 was purchased from Abcam.
  • 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) PerCP/Cy5.5 Streptavidin, Brilliant Violet 421 Streptavidin, Fixation Buffer, Intracellular staining Permm Wash Buffer and GM-CSF were purchased from Biolegend.
  • 4′,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) and L-NMMA were purchased from Dojindo.
  • Diff-Quik staining set was purchased from Sysmex. nor-NOHA and 1400W were purchased from Cayman.
  • Z-VAD-FMK was purchased from Peptide Institute. The antibodies used are summarized in Table 1.
  • hemolyzed bone marrow cells were labeled with lineage markers (CD3, CD4, CD8, NK1.1, B220 and Ter119) and cKit, CD106. , CD16/32, CD115, Ly6C, CD81 and CD157 and analyzed by FACSVerse (BD).
  • FACSVerse FACSVerse
  • intracellular Ym1 staining post-hemolysis cells were stained with a mixture of antibodies against CD115, Ly6C, CD88 and CD157 and EMA, then fixed with Fixation Buffer and permeabilized in Intracellular staining Permm Wash Buffer. .
  • Fixed/permeabilized cells were stained with anti-Ym1 or isotype-matched control antibody and Alexa Fluor 488 streptavidin, then cells were analyzed by FACS Verse.
  • bone marrow cells were incubated with anti-CD16/32 followed by a cocktail of biotinylated antibodies against lineage markers (CD4, CD8, NK1.1, B220 and Ter119) followed by , were incubated with anti-biotin microbeads (Miltenyi, Germany). Lin + cells were removed by magnetic sorting using AutoMACS pro (Miltenyi). Lin ⁇ cells were stained with a mixture of antibodies against CD11b, Ly6G, CD115, Ly6C, CD88 and CD157 before sorting using FACSAriaIII (BD).
  • BD FACSAriaIII
  • bone marrow cells were incubated with anti-CD16/32 and then identified with lineage markers (CD3, CD4, CD8, NK1.1, B220, Ter119, Ly6G, Sca-1, CD11b, and Gr-1). 1), followed by incubation with anti-biotin microbeads. Lin + cells were removed by magnetic sorting. Lin ⁇ cells were stained with a mixture of antibodies against CD117, CD135, CD16/32, CD106, Ly6C, CD115, CD81 and CX3CR1 before sorting using FACSAriaIII (BD).
  • lineage markers CD3, CD4, CD8, NK1.1, B220, Ter119, Ly6G, Sca-1, CD11b, and Gr-1).
  • erythrocyte lysed myeloid cells were incubated with anti-CD16/32 and then in a cocktail of antibodies against backbone markers (CD115, Ly6C, Ly6G and CD11b). suspended in Cells were then stained with 255 different PE-conjugated antibodies using the LEGENDScreen Mouse PE kit (BioLegend). These cells were analyzed by FACS Verse (BD). Dead cells were excluded by DAPI staining.
  • na ⁇ ve and LPS-treated Ym1-Venus mouse bone marrow cells were incubated with anti-CD16/32 followed by lineage markers (CD3, CD4, CD8, NK1.1, B220, Ter119 and Ly6G) followed by incubation with anti-biotin microbeads.
  • Lin + cells were removed by magnetic sorting. Lin + cells were placed in buffer containing antibodies against backbone markers (CD34, c-Kit, CD135, CD182, Ly6C, CD115, CD106, CD88, CD157, CD16/32 and CD11b) and PerCP/Cy5.5 streptavidin. Suspended.
  • FCS files were analyzed individually in FlowJo and single and live cells and Lin cells were exported to individual FCS files.
  • the InfinityFlow pipeline (ref. 9) was implemented using these FCS files.
  • HetaSep-treated PBMC were incubated with anti-CD16/32 antibodies, followed by a cocktail of antibodies against backbone markers (CD14, CD15, CD16 and HLA-DR). Suspended. Cells were then stained with 361 different PE-conjugated antibodies using the LEGENDScreen Human PE kit (BioLegend). These cells were analyzed by FACS Verse (BD). Dead cells were excluded by DAPI staining.
  • the InfinityFlow pipeline was implemented using the R package 'infinityFlow' (https://www.github.com/ebecht/infinityFlow).
  • the input data was logically transformed with the default parameters of the R package "flowCore”.
  • 255 XGBoost regression models were created by randomly picking half of the data and training with the default parameters of the R library 'XGBoost'.
  • the intensity of the PE binding marker was used as the response variable and the intensity of the backbone marker as the independent variable.
  • each XGBoost regression model was applied to the vector of associated backbone marker intensities to predict the intensities of the 255 PE-bound markers. These regression values were converted to linear values and concatenated with backbone and PE marker values for each of the 255 files. And output as a single file.
  • RNA extraction and qRT-PCR total RNA extraction and qRT-PCR
  • TRIzol LS Thermo Fisher Scientific
  • total RNA was extracted using RNeasy Mini Kit (QIAGEN).
  • cDNA was synthesized using ReverTra Ace (TOYOBO) and qRT-PCR was performed using THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (TOYOBO).
  • Expression levels were normalized to 18s ribosomal RNA (rRNA).
  • the sequences of the primers used are summarized in Tables 2-1 and 2-2.
  • RNA sequence analysis Preparation of RNA-Sequencing Library and Sequencing Total RNA was extracted from cells sorted by a cell sorter according to the protocol attached to TRIzol LS. After synthesizing the cDNA, it was amplified using the SMART-Seq HT kit (Clontech) and an RNA-seq library was prepared using the Nextra XT kit (Illumina). Sequences were analyzed on the NextSeq 500 platform (Illumina) 75 bp single read. Each cell sample was provided by a healthy volunteer.
  • Progenitor cells sorted from Ym1-Venus mice were resuspended in 20 ⁇ l of PBS and injected into the bone cavity of Ly5.1 mice. Bone marrow was harvested from Ly5.1 mice 2 or 3 days after transplantation and analyzed by FACSVerse (BD).
  • cytokine array and ELISA Sorted human CXCR1-positive CD14-positive monocytes and human CXCR1-negative CD14-positive monocytes were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin.
  • cytokine arrays 1 ⁇ 10 5 were seeded in 24-well plates. After 24 hours of culture, the culture supernatant was collected, and cytokine array was performed using a human cytokine array kit (R&D Systems).
  • ELISA monocytes were seeded at 2 x 104 in 96-well plates. After 24 hours, culture supernatants were collected and quantified with ELISA MAX Standard Kit (IL-6 and TNF ⁇ , BioLegend) or ELISA MAX Deluxe Set (CCL2, BioLegend).
  • T cells were added to the lower chamber of the Transwell plate (3 ⁇ m pores, polycarbonate membrane, Corning) and monocytes were added to the upper chamber.
  • N-acetyl-L-cysteine (NAC; 1 mM), 1400 W (2 ⁇ M), nor-NOHA (5 ⁇ M), catalase (20 U / ml), Z-VAD-FMK (20 ⁇ M), necrostatin -1 (Nec-1; 50 ⁇ M), ferrostatin (2 ⁇ M) or CA-074Me (10 ⁇ M) inhibitors were added. After 4 days of culture, cells were analyzed by FACSVerse (BD).
  • Figure 1A Identification of highly expressed surface markers on Ym1 + Ly6C + monocytes. Expression of surface molecules on bone marrow monocytes (Mo) and neutrophils (Neu) of Ym1-Venus mice was examined by flow cytometry (upper left). Surface molecules with differential expression levels between Ym1 + Ly6C + monocytes (blue) and Ym1 ⁇ Ly6C + monocytes (red, bottom left) were selected. Scatter plot showing the expression levels of surface markers (right). (FIG. 1B) CD88 and CD157 are expressed at higher levels in Ym1 + monocytes compared to Ym1 ⁇ monocytes.
  • CD88 and CD157 on Ym1 + Ly6C + monocytes, Ym1 ⁇ Ly6C + monocytes or neutrophils (Neu) of the bone marrow of na ⁇ ve or LPS-treated Ym1-Venus mice were examined by flow cytometry.
  • FIG. 1C CD88 and CD157 double positive monocytes and Ym1 + monocytes show similar gene expression patterns.
  • Ym1 + Ly6C + monocytes or Ym1 ⁇ Ly6C + monocytes were sorted from the bone marrow of LPS-treated Ym1-Venus mice (top).
  • Ly6G ⁇ Ly6C + CD115 + CD88 + CD157 + and CD88 ⁇ CD157 ⁇ monocytes were sorted from the bone marrow of LPS-treated WT mice (bottom).
  • Expression levels of Ym1 + Ly6C + monocyte-associated genes identified in a previous study (ref. 2) were expressed in Ym1 + Ly6C + monocytes and Ym1 ⁇ Ly6C + monocytes (top) or CD88 and CD157 double Quantified by qRT-PCR in positive monocytes and CD88 and CD157 double negative monocytes (bottom).
  • Fig. 1D CD88 and CD157 expression positively correlates with Ym1 protein expression in Ly6C + monocytes.
  • Intracellular Ym1 protein was stained using the protocol described in our previous report (ref. 2).
  • FIG. 1E Several neutrophil markers are highly expressed in Ym1 + monocytes. Expression levels of surface markers highly expressed in neutrophils (gray), Ym1 + monocytes (red), and Ym1 - monocytes (blue) were examined by flow cytometry.
  • FIG. 1F CD88 and CD157 are highly expressed on Ym1 + monocytes compared to Ym1 ⁇ monocytes.
  • Peripheral blood was collected from na ⁇ ve or LPS-treated Ym1-Venus mice and the expression levels of CD88 and CD157 on Ym1 + Ly6C + monocytes, Ym1 ⁇ Ly6C + monocytes or neutrophils (Neu) were examined by flow cytometry. .
  • FIG. 1G CD88 and CD157 expression positively correlates with Ym1 protein expression on Ly6C + monocytes in peripheral blood. Intracellular Ym1 protein was stained using the protocol described in our previous report (ref. 2).
  • FIG. 2A Experimental workflow Bone marrow cells from na ⁇ ve and LPS-treated Ym1-Venus mice were stained with 11 backbone markers and one of 255 PE-conjugated antibodies (LEGENDScreen mouse PE kit), followed by flow Analyzed by cytometry. Data from 255 FCS files were analyzed with the InfinityFlow pipeline (ref. 9), dimensionally compressed using the UMAP algorithm, and rendered on the UMAP plane.
  • FIG. 2B Clustering analysis of bone marrow mature and progenitor cells from na ⁇ ve Ym1-Venus mice. The cell population name was described based on known progenitor cell markers and mature cell markers (Fig.
  • FIG. 2K A heat map shows the expression levels of c-Kit (left) and Ym1 (right) expressed by progenitor cells and mature cells.
  • cMoP is arranged contiguously with MDP.
  • FIG. 2C Cluster analysis of bone marrow mature and progenitor cells in LPS-treated mice Compared to steady state (Fig. 2B), MDP is reduced and cMoP communicates poorly with MDP, conversely cMoP and proNeu1 ties are growing.
  • Fig. 2D cMoPs differentiate from different progenitor cells in steady-state and inflammatory conditions.
  • cMoP is located downstream of MDP in pseudo-time (SLINGSHOT) analysis of na ⁇ ve bone marrow (left). In contrast, cMoP is predicted to differentiate from proNeu1 in the bone marrow of LPS-treated mice (right).
  • FIG. 2E Heat map of CD81 and CX3CR1 expression levels in naive mice (top) and bone marrow cells of LPS-treated mice (bottom). Bone marrow cMoP of LPS-treated mice overexpresses CD81 and conversely underexpresses CX3CR1 compared to that of naive mice.
  • MDP-CD81 ⁇ CX3CR1 cMoP or proNeu2 In contrast, there is little differentiation from MDP-CD81 ⁇ CX3CR1 cMoP or proNeu2.
  • GMP, proNeu1, CD81 + CX3CR1 ⁇ cMoP, MDP, CD81 ⁇ CX3CR1 + cMoP and proNeu2 were sorted from bone marrow of naive Ym1-Venus mice. These progenitor cells were cultured in the presence of GM-CSF for 2 or 3 days. Ym1 expression in Ly6G + neutrophils, Ly6G ⁇ Ly6C + CD115 monocytes was examined by flow cytometry.
  • GMP, proNeu1 and CD81 + CX3CR1 ⁇ cMoP gave rise to Ym1 + Ly6C + monocytes.
  • MDP and CD81 ⁇ CX3CR1 + cMoP also gave rise to Ly6C monocytes, but these monocytes were mostly Ym1 negative.
  • proNeu2 was incapable of producing monocytes. Dotted line indicates wild-type control.
  • FIG. 2H CD81 + CX3CR1 - cMoP, but not MDP, differentiate into proNeu1.
  • GMP and proNeu1 were isolated from the bone marrow of naive Ym1-Venus mice and cultured in vitro for 1 day in the same manner as in FIG. 2G.
  • FIG. 2I GMP-proNeu1-CD81 + CX3CR1 ⁇ cMoP differentiate into Ym1 + Ly6C + monocytes in vivo.
  • Progenitor cells sorted from the bone marrow of naive Ym1-Venus mice were transferred into the bone marrow of LPS-administered congenic mice according to the same criteria as in FIG. 2G.
  • Differentiation of Ym1 + Ly6C + monocytes was examined 1 day after transfer.
  • FIG. 2J Schematic representation of monocyte and neutrophil differentiation pathways under inflammatory conditions. GMP differentiates into Ym1 + monocytes via proNeu1 and CD81 + CX3CR1 ⁇ cMoP.
  • FIG. 2K A diagram showing which known cells correspond to each cell population on the UMAP.
  • FIG. 2L A diagram showing sorting criteria for sorting various cells used in Figs. 2H-2I.
  • Figure 3 Identification of markers that are highly expressed on neutrophils compared to human peripheral blood monocytes. Criteria for defining human peripheral blood neutrophils and monocytes (left). The expression levels of surface markers in neutrophils and monocytes are shown in a scatter plot (right).
  • Fig. 3B Cluster analysis of human peripheral blood leukocytes. Criteria for defining neutrophils and monocytes expressing CD14 and/or CD16 (top row). UMAP dimensional compaction and phenogram clustering of progenitor and mature cells are shown (bottom left). Heat map of CXCR1 expression level (bottom right).
  • FIG. 3C Sorting criteria for neutrophils, CD14 + monocytes, CD14 + CD16 + monocytes and CD16 + monocytes.
  • FIG. 3D Giemsa staining of CXCR1 + CD14 + monocytes, CXCR1 - CD14 + monocytes and neutrophils.
  • CXCR1 + CD14 + monocytes like CXCR1 ⁇ CD14 + monocytes, have large monolobed nuclei but lack the azurophilic granules typical of neutrophils. Scale bar represents 20 ⁇ m.
  • FIG. 3E Expression in CD14 + monocytes of various surface markers shown in Fig. 3A was analyzed by flow cytometry.
  • FIG. 4 Peripheral blood leukocytes from healthy volunteers were enriched by HetaSep density gradient centrifugation. Neutrophils, CXCR1 + CD14 + monocytes, CXCR1 + CD14 + monocytes, CD14 + CD16 + monocytes, and CD16 + monocytes were sorted by a cell sorter based on the criteria shown in Figure 3C. Total gene expression was quantified by RNA-seq analysis.
  • FIG. 4A Principal component analysis (PCA) of four monocytes and neutrophils.
  • FIG. 4B Hierarchical cluster analysis of gene expression in 5 cells. The dendrogram shows that CXCR1 + CD14 + monocytes are more closely related to neutrophils than to other monocytes.
  • FIG. 4C Hierarchical cluster analysis of CXCR1 + CD14 + and CXCR1 - CD14 + monocytes and extraction of genetic markers.
  • FIG. 4D Gene Ontology analysis of genes strongly expressed in CXCR1 + CD14 + monocytes. In CXCR1 + CD14 + monocytes, genes related to "granulocyte” and "neutrophil” activation are highly expressed.
  • FIG. 4F Data from single-cell RNA-seq analysis were reanalyzed using the UMAP algorithm (left, ref. 8).
  • Fig. 4G Gene expression in single-cell RNA-seq analysis (clusters 1, 5, 2, 8, left in Fig. 4F) and monocyte subsets sorted based on the sorting criteria defined in Fig. 3C. were compared in a heat map. Namely, clusters 1, 5, 2 and 8 defined by single-cell RNA-seq analysis correspond to CD16 + monocytes, CD14 + CD16 + monocytes, CXCR1 ⁇ CD14 + monocytes and CXCR1 + CD14 + monocytes, respectively. do. (FIG.
  • FIG. 5A Cytokines and chemokines differentially produced between CXCR1 + CD14 + and CXCR1 ⁇ CD14 + monocytes were identified by cytokine array.
  • CXCR1 + CD14 + monocytes (lower left) showed lower production of IL-6 and several other pro-inflammatory cytokines than CXCR1 ⁇ CD14 + monocytes (upper left).
  • the right figure is a graph that quantifies the average signal strength of the left figure.
  • White bars indicate CXCR1 ⁇ CD14 + monocytes
  • black bars indicate CXCR1 + CD14 + monocytes. Results from one healthy volunteer are shown.
  • FIG. 5C CXCR1 + CD14 + monocytes suppress T cell proliferation in a cell number-dependent manner. T cells stimulated with anti-CD3 and anti-CD28 were co-cultured with CXCR1 + CD14 + monocytes or CXCR1 ⁇ CD14 + monocytes for 4 days. T cell numbers were quantified by flow cytometry. Control represents the number of T cells when cultured with T cells only. A representative example of experiments performed three times under the same conditions is shown.
  • FIG. 5D Suppression of T cell proliferation by CXCR1 + CD14 + monocytes is cell-contact dependent. T cells were stimulated with anti-CD3 and anti-CD28 in the lower chamber of the Transwell device. Monocytes were added to the upper chamber (No Contact) or lower chamber (Contact) of the same well and cultured for 4 days. Controls represent T cells without monocytes. Mean relative counts to controls were expressed as S.E. D. displayed with Shown by two-way ANOVA. *p ⁇ 0.05. Representative results from 3 healthy volunteers are shown. (FIG.
  • FIG. 5G Addition of catalase (left) or Nec-1 (right) abolished T cell proliferation suppression by CXCR1 + monocytes in a concentration-dependent manner.
  • Anti-CD3 and anti-CD28 stimulated T cells were co-cultured with CXCR1 + CD14 + monocytes or CXCR1 ⁇ CD14 + monocytes in the presence or absence (control) of various inhibitors for 4 days. It was shown that catalase (left) or Nec-1 (right) relieved the T cell proliferation-suppressive effect by CXCR1 + monocytes in a concentration-dependent manner.
  • FIG. 6A The percentage of CXCR1 + CD14 + monocytes among CD14 + monocytes was elevated after TACE (trans-arterial chemoembolization) in patients with liver cancer .
  • TACE trans-arterial chemoembolization
  • Peripheral blood of cancer patients before TACE (upper row) and 3-4 days after TACE (lower row) was analyzed by flow cytometry.
  • a FACS plot of peripheral blood HLA-DR + CD15 ⁇ CD14 + CXCR1 + monocytes (red) is shown. Blue areas represent isotype controls.
  • FIG. 6B The increase in CXCR1 + CD14 + monocytes observed in FIG. 6A is statistically significant.
  • FIG. 6C The percentage of CXCR1 + CD14 + monocytes was transiently elevated after TACE.
  • FIG. 6D The percentage of CXCR1 + CD14 + monocytes is positively correlated with neutrophil count and CRP. r; Pearson correlation coefficient.
  • FIG. 6E Increased CXCR1 + CD14 + monocytes after tissue injury suppressed T cell proliferation, similar to that observed in healthy volunteers (FIG. 5C).
  • Peripheral blood T cells were co-cultured for 4 days in the presence of CXCR1 + CD14 + monocytes or CXCR1 ⁇ CD14 + monocytes.
  • the average relative cell number to the cell number when cultured with T cells alone (control) is expressed as S.M. Displayed with D. *p ⁇ 0.05. Results from one patient are shown.
  • FIG. 6G Expression levels of CD66a/c/e and CD66b were positively correlated with neutrophil count and serum CRP. r; Pearson correlation coefficient.
  • Figure 1 Identification of surface markers with higher expression on Ym1+Ly6C+ monocytes compared to Ym1 - Ly6C + monocytes . and that its cell number increased rapidly during late inflammation in mice.
  • Ym1 + Ly6C + monocytes can be distinguished from classical Ym1 ⁇ Ly6C + monocytes by the expression levels of several neutrophil-associated genes such as Retnlg, Lcn2, Ltf.
  • Transcriptome analysis provides a useful tool for determining cell type, but does not allow for further functional analysis. As one way to solve this problem, we attempted to identify surface markers that could distinguish between Ym1 + Ly6C + monocytes and Ym1 ⁇ Ly6C + monocytes.
  • Ym1 + Ly6C + monocyte numbers increase rapidly in response to LPS administration in mice.
  • 57.1% of Ym1 + Ly6C + monocytes were double positive for CD88 and CD157 (Fig. 1B, bottom row).
  • 24.4% of Ym1 + Ly6C + monocytes were double positive for CD88 and CD157 (Fig. 1B, bottom row).
  • CD88 and CD157 are selectively expressed by Ym1 + Ly6C + monocytes.
  • CD88 and CD157 are also highly expressed by neutrophils (FIGS. 1B and 1E), indicating that Ym1 + Ly6C + monocytes share features with neutrophils. It is shown that.
  • FIG. 2-1 Identification of the Ym1 + Ly6C + monocyte differentiation pathway by InfinityFlow . + may be generated via a specific differentiation pathway different from that of monocytes.
  • CD88 and CD157 were added to the backbone markers as Ym1 + Ly6C + monocyte-specific surface markers, and 11 kinds of backbone markers and PE-conjugated variable antibodies (255 kinds) were used. and analyzed by flow cytometry.
  • Fig. 2A Data from 255 FCS files were analyzed with the InfinityFlow pipeline, dimensionally compressed using the UMAP algorithm, and rendered on the UMAP plane.
  • cMoP was located contiguously with MDPs in the bone marrow of naive mice. Interestingly, in the bone marrow of LPS-treated mice, cMoPs were located further from the MDPs and instead aligned more closely with neutrophil progenitor cells (Figs. 2B and 2C).
  • c-Kit + progenitor cells from HSCs, basophils, eosinophils, monocytes, and neutrophil lineages.
  • a SLINGSHOT analysis was performed to mimic the pathway of cell differentiation up to mature c-Kit - cells.
  • cMoP in the bone marrow of na ⁇ ve and LPS-treated mice is composed of two different cell types, the proportions of which differ depending on the state of the mouse (steady state or inflammatory state), and that these two This suggests that there are surface molecules that distinguish between the two different cMoPs.
  • Fig. 2A we searched for surface proteins that showed different expression levels between the two cells by reanalyzing the flow cytometry data (Fig. 2A).
  • Fig. 2E we found enhanced CD81 expression and decreased CX3CR1 expression in cMoP of the bone marrow of LPS-administered mice.
  • Fig. 2-2 Commonality of differentiation pathways of Ym1 + Ly6C + regulatory monocytes and neutrophils Based on the above analysis, Ym1 + Ly6C + monocytes are presumed to differentiate through the GMP-proNeu1-CD81 + CX3CR1 - cMoP pathway. bottom. To test this speculation, GMP was purified from the bone marrow of naive Ym1-Venus mice and stimulated with GM-CSF in vitro (Fig. 2G). GM-CSF stimulated GMPs produce both Ly6G + neutrophils and Ly6C + CD115 monocytes in 3 days (Fig. 2G, top panel).
  • Ly6C + monocytes contained 23.8% Ym1 + Ly6C + monocytes (Fig. 2G, top row).
  • proNeu1-derived CD11b + cells were Ly6G + neutrophils.
  • proNeu1 gave rise to a small fraction of Ly6C + monocytes (4.5% of CD11b + cells).
  • 17% of these Ly6C + monocytes were Ym1 positive (Fig. 2G, second column). This finding fits with the pathways predicted by pseudo-time series analysis (Fig. 2D).
  • CD81 + CX3CR1 ⁇ cMoP also differentiated into monocytes, 12.3% of which were Ym1 positive (FIG. 2G, third column). These findings indicate that GMP, proNeu1 and CD81 + CX3CR1 ⁇ cMoP can generate Ym1 + Ly6C + monocytes. On the other hand, MDP and CD81 ⁇ CX3CR1 + cMoP gave rise mainly to Ly6C monocytes, whereas Ym1 expression was barely detectable in those monocytes (FIG. 2G, 4th, 5th and last row). proNeu2 differentiated only into neutrophils (Fig. 2G, bottom panel), supporting the finding that proNeu2 has lost the ability to differentiate into monocytes.
  • proNeu1 In a short-term (1 day) in vitro culture, proNeu1 was found to differentiate into Ly6C + CD115 + CD81 + CX3CR1 ⁇ cMoP, a result that also supports the prediction of pseudo-time series analysis (Fig. 2D). . In contrast, MDPs were found to differentiate predominantly into CD81 ⁇ CX3CR1 + cMoP upon short-term culture (FIG. 2H). Taken together, these findings suggest that the Ym1 + Ly6C + monocyte branch point within granulocytic progenitor cells is proNeu1, and that Ym1 + Ly6C + monocytes differentiate through GMP, proNeu1 to CD81 + CX3CR1 ⁇ cMoP. means to
  • the present inventors further conducted adoptive transfer of the above-mentioned 6 progenitor cells prepared from CD45.2-positive Ym1-Venus mice into CD45.1-positive congenic mice administered with LPS, whereby these progenitor cells were inflammatory. It was confirmed which cells differentiated in vivo in the mouse in this state. Consistent with the observations of the in vitro culture system, some of the GMP, proNeu1 and CD81 + CX3CR1 ⁇ cMoP differentiated into Ym1 + Ly6C + monocytes 2 or 3 days after transfer (Fig. 2I, top, second 2 and 3rd column).
  • FIG. 3 Heterogeneity of Neutrophil Marker Expression in Human CD14 + Monocytes
  • Ym1 the gene encoding Ym1 (Chil3) is not conserved in humans, the human cell counterparts of mouse regulatory monocytes cannot be identified based on Ym1 expression.
  • the inventors noted that mouse regulatory monocytes expressed several neutrophil markers, and used the neutrophil markers as indicators to detect mouse Ym1 + regulatory monocytes. We searched for human cells corresponding to .
  • CXCR1 is more selective for neutrophils and CD14 + monocyte subsets, as CXCR1 expression was barely detectable on other monocyte subsets (CD14 + CD16 + monocytes and CD16 + monocytes).
  • CXCR1 + CD14 + monocytes had large monolobular nuclei and had morphological features distinct from neutrophils (Fig. 3D). identified a subpopulation of HLA-DR + CD15 ⁇ CD14 + monocytes expressing CXCR1 as the human counterpart of mouse Ym1 + Ly6C + regulatory monocytes in the peripheral blood of healthy donors. bottom.
  • FIG. 4 Characterization of CXCR1 + CD14 + Monocytes by Transcriptome Analysis
  • PCA Principal component analysis
  • Hierarchical cluster analysis of gene expression in the five cells revealed that the dendrogram showed that CXCR1 + CD14 + monocytes were more closely related to neutrophils than other monocytes (Fig. 4B).
  • hierarchical cluster analysis of CXCR1 + CD14 + monocytes and CXCR1 ⁇ CD14 + monocytes and extraction of gene markers were performed, and Gene Ontology analysis of genes strongly expressed in CXCR1 + CD14 + monocytes was performed.
  • + CD14 + monocytes were found to have high expression of gene clusters related to activation of "granulocytes" and "neutrophils" (Figs. 4C and 4D). Quantitative PCR also confirmed that some of the genes overexpressed in CXCR1 + CD14 + monocytes identified in FIG.
  • Clusters 2 and 5 correspond to CD14 + 'classical' monocytes and CD14CD16 double positive monocytes, respectively.
  • Cluster 8 one of the two smaller clusters, showed a gene expression pattern similar to that named "Mono3" in Villani's analysis (high expression of CXCR1, TNFRSF10C, NAMPT).
  • Another small cluster, cluster 9, was excluded from subsequent analyses, as it may correspond to natural killer dendritic cells defined as "Mono4" in Villani's analysis.
  • gene expression in single-cell RNA-seq analysis clusters 1, 5, 2, 8 in FIG. 4F, left
  • monocyte subsets sorted based on the sorting criteria defined in FIG. 3C were analyzed. Compare with a heatmap.
  • RNA-seq analysis of CXCR1 + CD14 + monocytes showed expression profiles very similar to cluster 8 defined by single-cell RNA-seq when comparing these marker genes (e.g., TNFRSF10C and CXCR2, Fig. 4G). These results suggest that CXCR1 + CD14 + monocytes are an independent subpopulation within CD14 + classical monocytes, defined by distinct gene expression profiles, using CD14, CD16 and CXCR1 as surface markers. We conclude that it can be isolated.
  • FIG. 5 Immunoregulatory Phenotype of CXCR1 + CD14 + Monocytes
  • cytokine panel The concentrations of 15 cytokines and chemokines fell within the detectable range of this assay. Consequently, the production of proinflammatory cytokines ( IL-1 ⁇ , IL-6, TNF ⁇ and chemokines (CCL2, CXCL1) by CXCR1 + CD14 + monocytes was reduced compared to CXCR1 ⁇ CD14 + monocytes .
  • Fig. 5A The reduced production of some of these cytokines (IL-6 and TNF ⁇ ) was verified by ELISA (Fig. 5B). These findings suggest that CXCR1 + CD14 + monocyte cytokines The profile (IL-6, TNF ⁇ ) partially matches that of mouse Ym1 + regulatory monocytes, ie they produce more inflammatory cytokines and chemokines than CXCR1 ⁇ CD14 + monocytes. indicates low volume.
  • the immunosuppressive potential of the two monocytes was then assessed by co-culturing the monocytes in vitro with T cells prepared from the same donor.
  • Addition of CXCR1 ⁇ CD14 + monocytes to T cells increased CD4 and CD8 T cells after 4 days of co-culture (Fig. 5C). This suggests that CXCR1 ⁇ CD14 + monocytes support T cell survival.
  • CXCR1 + monocytes reduced the number of co-cultured T cells in vitro in a cell number-dependent manner (Fig. 5C). This reduction was not observed when CXCR1 + CD14 + monocytes were used with the Transwell device, which prevents cell-cell interactions (Fig. 5D).
  • T cells were co-cultured with CXCR1 + CD14 + monocytes to which N-acetylcysteine (antioxidant NAC), 1400W (iNOS inhibitor) or -NOHA (arginase 1 inhibitor) was added.
  • NAC antioxidant NAC
  • 1400W iNOS inhibitor
  • -NOHA arginase 1 inhibitor
  • necrostatin-1 an inhibitor of necroptosis, inhibited suppression of T cells by CXCR1 + CD14 + monocytes (FIG. 5E right, FIG. 5F, FIG. 5G).
  • FIG. 6 Expansion of CXCR1 + CD14 + monocytes after tissue injury and inflammation in humans
  • One of the hallmarks of murine regulatory monocytes is a rapid increase in cell number following systemic inflammation.
  • inflammation associated with primary tumor intervention also increases the production of regulatory monocytes in the bone marrow, resulting in enhanced cancer metastasis in the lung (ref. 3).
  • TACE transcatheter arterial chemoembolization
  • TACE a therapeutic method in which an anticancer drug is administered into blood vessels near a tumor to block blood flow to the liver tumor. This allows larger amounts of the drug to reach the tumor for a longer period of time, potentially killing more cancer cells.
  • TACE causes liver tissue damage, usually accompanied by a transient increase in body temperature and serum CRP.
  • the proportion of CXCR1 + CD14 + monocytes increased significantly 3-4 days after TACE (Figs. 6A and 6B: 21.5% to 37.6%) and then tapered off towards basal values over the next 2 weeks (Figure 6B). Figure 6C).
  • FIGs. 6A and 6B 21.5% to 37.6%
  • CXCR1 + CD14 + monocytes proliferating after inflammation exhibit immunologically distinct phenotypes from those under physiological conditions CXCR1 + CD14 + monocytes and CXCR1 + CD14 + monocytes were co-cultured in vitro with T cells purified from the same donor as described in Figure 5C.
  • CD88 and CD157 are surface markers specific for Ym1 + Ly6C + monocytes that are not expressed on Ym1 ⁇ Ly6C + monocytes, but are expressed on Ym1 + Ly6C + monocytes.
  • molecules corresponding to mouse CD88 and CD157 include CXCR1, CD66a, CD66b, CD66c and CD66e. These markers are upregulated on the cell surface of CXCR1 + CD14 + monocytes after cancer treatment in a subject.
  • CXCR4 chemokine receptor involved in the migration of Ym1 + Ly6C + monocytes (to the lungs)
  • CXCR1 a candidate chemokine receptor that may be involved in the migration of human CXCR1 + CD14 + monocytes.
  • This CXCR1 acts as a receptor for the cytokine IL-8.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Mycology (AREA)

Abstract

【課題】　がんの予防および／または治療のための医薬組成物を提供すること。 【解決手段】　ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を有する対象に投与するための医薬組成物であって、マトリックスメタロプロテナーゼ－９（Ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　９；ＭＭＰ－９）の活性を阻害する化合物を含む、医薬組成物。

Description

がんの予防および／または治療のための医薬組成物
　本発明は、がんの予防および／または治療のための医薬組成物に関する。
　本発明者らは、免疫抑制型マクロファージを探索する過程で、炎症後期のマウスの骨髄で増加し、末梢組織に移動するＹｍ１陽性制御性単球を発見した。すなわち、Ｙｍ１陽性制御性単球を消去したマウスでは、腸炎に伴う体重減少や組織修復が遅延することから、当該単球が、炎症抑制と組織修復を促進することを見出した（特許文献１、非特許文献１）。さらに、最近、担癌モデルマウスを用いた研究で、Ｙｍ１陽性制御性単球が、がんの転移促進に関与することを報告した（特許文献２、非特許文献２）。
　この細胞の免疫調節作用および組織修復機能は、様々な炎症疾患やがんの治療標的として有望であるが、臨床応用を進めるためには、マウス制御性単球に相当するヒトのカウンターパートを同定し、その産生機構を解明する必要があった。しかしながら、ヒトにはＹｍ１の相同遺伝子が保存されていないため、Ｙｍ１発現を指標としてヒト制御性単球を解析することができなかった。
Ikeda N, Asano K, Kikuchi K, Uchida Y, Ikegami H, Takagi R, Yotsumoto S,Shibuya T, Makino-Okamura C, Fukuyama H, Watanabe T, Ohmuraya M, Araki K, NishitaiG, Tanaka M. Emergence of immunoregulatory Ym1(+)Ly6C(hi) monocytes during recovery phase of tissue injury. Sci Immunol 3; 2018. Shibuya T, Kamiyama A, Sawada H, Kikuchi K, Maruyama M, Sawado R, Ikeda N, Asano K, Kurotaki D, Tamura T, Yoneda A, Imada K, Satoh T, Akira S, Tanaka M,Yotsumoto S. Immunoregulatory Monocyte Subset Promotes Metastasis Associated WithTherapeutic Intervention for Primary Tumor. Front Immunol 12; 663115, 2021.
特開２０１９－２０１５６１号公報 特願２０２１－１２６８０１
　本発明は、がんの予防および／または治療のための医薬組成物を提供することを目的とする。
　本発明者らは、ヒト制御性単球の探索につながる情報を得るため、マウスにおいて、Ｙｍ１陽性制御性単球の分化経路や表面マーカーを詳細に解析し、制御性単球と好中球との類似性に関する知見を得た（図１および図２）。この制御性単球と好中球との類似性を手掛かりとして、本発明者らは、好中球マーカー発現を指標にヒト制御性単球を探索し、ＣＤ１４陽性単球を、ＣＸＣＲ１発現レベルの異なる２つのクラスターに分類できることを明らかにした（図３）。
　次いで、ヒトＣＸＣＲ１陽性単球の機能および特徴を理解するため、健常人末梢血から分取した単球（ＣＸＣＲ１陽性ＣＤ１４陽性単球、ＣＸＣＲ１陰性ＣＤ１４陽性単球、ＣＤ１４／ＣＤ１６二重陽性単球およびＣＤ１６陽性単球の４種類の単球）ならびに好中球の全遺伝子発現を、ＲＮＡシークエンス解析した結果、ＣＸＣＲ１陽性単球が、遺伝子レベルでも、好中球と類似することが示された（図４）。さらに、本発明者らは、健常人の末梢血からＣＸＣＲ１陽性ＣＤ１４陽性単球と、ＣＸＣＲ１陰性ＣＤ１４陽性単球とを分取し、同じドナーから調製したＴ細胞と、インビトロで共培養したところ、ＣＸＣＲ１陽性ＣＤ１４陽性単球が、Ｔ細胞増殖抑制機能を有することを見出した。これにより、はじめて同定したＣＸＣＲ１陽性ＣＤ１４陽性単球が、マウスの制御性単球に相当することを証明した（図５）。また、肝動脈化学塞栓術（Ｔｒａｎｓｃａｔｈｅｔｅｒ　ａｒｔｅｒｉａｌ　ｃｈｅｍｏｅｍｂｏｌｉｚａｔｉｏｎ；ＴＡＣＥ）を施行し、広範な肝組織傷害を惹起したがん患者の末梢血において、ＣＤ１４陽性単球中に占めるＣＸＣＲ１陽性ＣＤ１４陽性単球の割合が、有意に増加することを示し、ヒトＣＸＣＲ１陽性ＣＤ１４陽性単球も、マウスＹｍ１陽性単球と同じような挙動を示すことを実証した（図６）。これらの結果は、ヒトＣＸＣＲ１陽性ＣＤ１４陽性単球が、マウスＹｍ１陽性単球のカウンターパートに相当することを強く支持する知見であり、本発明は、これらの知見に基づき成されたものである。
　すなわち、本発明は以下のとおりである：
［１］ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を有する対象に投与するための医薬組成物であって、
　マトリックスメタロプロテナーゼ－９（Ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　９；ＭＭＰ－９）の活性を阻害する化合物を含む、医薬組成物；
［２］前記ＭＭＰ－９の活性を阻害する化合物が、ＣＸＣＲ１アンタゴニスト、Ｌｃｎ２アンタゴニスト、ＣＤ６６ａアンタゴニスト、ＣＤ６６ｂアンタゴニスト、ＣＤ６６ｃアンタゴニスト、ＣＤ６６ｅアンタゴニストおよびＭＭＰ－９アンタゴニストからなる群より選択される少なくとも１つである、［１］に記載の医薬組成物；
［３］前記ＭＭＰ－９の活性を阻害する化合物が、
　抗ＣＸＣＲ１抗体、ＣＸＣＲ１阻害剤、抗Ｌｃｎ２抗体、Ｌｃｎ２阻害剤、抗ＣＤ６６ａ抗体、ＣＤ６６ａ阻害剤、抗ＣＤ６６ｂ抗体、ＣＤ６６ｂ阻害剤、抗ＣＤ６６ｃ抗体、ＣＤ６６ｃ阻害剤、抗ＣＤ６６ｅ抗体、ＣＤ６６ｅ阻害剤、抗ＭＭＰ－９抗体およびＭＭＰ－９阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つである、［１］または［２］に記載の医薬組成物；
［４］がんを予防および／または治療するための、［１］～［３］のいずれか１項に記載の医薬組成物；
［５］がん転移を抑制および／または予防するための、［１］～［３］のいずれか１項に記載の医薬組成物；
［６］前記がん転移が、急性炎症によって生じたがん転移であるか、または、腫瘍に対する治療的介入によって生じたがん転移である、［５］に記載の医薬組成物；
［７］前記腫瘍に対する治療的介入が、外科的切除、化学療法および放射線療法からなる群より選択される、［６］に記載の医薬組成物；
［８］前記腫瘍に対する治療的介入が、肝動脈化学塞栓術（Ｔｒａｎｓｃａｔｈｅｔｅｒ　ａｒｔｅｒｉａｌ　ｃｈｅｍｏｅｍｂｏｌｉｚａｔｉｏｎ；ＴＡＣＥ）である、［６］または［７］に記載の医薬組成物；
［９］前記ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を有する対象が、がんに罹患している、［１］～［８］のいずれか１項に記載の医薬組成物；
［１０］前記ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を有する対象が、ヒトである、［１］～［９］のいずれか１項に記載の医薬組成物；
［１１］ＭＭＰ－９活性化経路を阻害する組成物であって、
　前記ＭＭＰ－９活性化経路は、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球、Ｌｃｎ２およびＭＭＰ－９を含み、
　前記組成物が、ＭＭＰ－９の活性を阻害する化合物を含む、組成物；
［１２］前記ＭＭＰ－９活性化経路が、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃおよびＣＤ６６ｅから選択される少なくとも１つをさらに含む、［１１］に記載の組成物；
［１３］（ｉ）治療的介入前の対象の末梢血サンプル中の白血球に対するＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球の割合を測定する工程、
　（ｉｉ）治療的介入後の前記対象の末梢血サンプル中の白血球に対するＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球の割合を測定する工程、
　（ｉｉｉ）前記（ｉ）で測定した割合と、前記（ｉｉ）で測定した割合とを比較する工程
を含む、がんの進展のリスクの評価方法；
［１４］前記（ｉ）および／または（ｉｉ）における測定はフローサイトメトリーによって行われる、［１３］に記載の方法；
［１５］抗ＣＸＣＲ１抗体、抗Ｌｃｎ２抗体、抗ＣＤ６６ａ抗体、抗ＣＤ６６ｂ抗体、抗ＣＤ６６ｃ抗体、抗ＣＤ６６ｅ抗体および抗ＭＭＰ－９抗体から選択される少なくとも１つを含む、がんの進展の可能性を予測するためのキット；
［１６］ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を有する対象の血液から該ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を吸着除去するための血液浄化装置であって、
　抗ＣＸＣＲ１抗体を担持したアフィニティカラムを備えた、装置；
［１７］前記ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を有する対象が、がんに罹患している、［１６］に記載の装置；
［１８］抗ＣＸＣＲ１抗体を担持したアフィニティカラムによって、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を有する対象の血液からＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を吸着して、当該血液からＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を除去する方法；
［１９］ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球のＴ細胞増殖抑制作用を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
　（ｉ）ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球とＴ細胞との共培養系に、候補化合物を添加する工程、および
　（ｉｉ）Ｔ細胞の数が増えた場合に、前記候補化合物を前記単球のＴ細胞増殖抑制作用を調節する化合物として同定する工程
を含む、方法；
［２０］ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球のＴ細胞増殖抑制作用を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
　（ｉ）ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を含む単球集団に、候補化合物を添加する工程、
　（ｉｉ）前記単球集団においてＣＸＣＲ１遺伝子を発現する単球の割合を測定する工程、および
　（ｉｉｉ）前記候補化合物が、前記ＣＸＣＲ１遺伝子を発現する単球の割合を変化させた場合に、前記候補化合物を単球のＴ細胞増殖抑制作用を調節する化合物として同定する工程
を含む、方法；
［２１］ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球のＴ細胞増殖抑制作用を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
　（ｉ）単球前駆細胞集団に、候補化合物を添加する工程、
　（ｉｉ）前記単球前駆細胞集団から単球集団を分化させる工程、
　（ｉｉｉ）前記分化した単球集団においてＣＸＣＲ１遺伝子を発現する単球の割合を測定する工程、および
　（ｉｖ）前記候補化合物が、前記ＣＸＣＲ１遺伝子を発現する単球の割合を変化させた場合に、前記候補化合物を単球のＴ細胞増殖抑制作用を調節する化合物として同定する工程
を含む、方法。
　本発明によれば、がんの予防および／または治療のための医薬組成物を提供することができる。
Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球上で高発現した表面マーカーを示す図である。 骨髄でのＣＤ８８およびＣＤ１５７のＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球上での発現を示す図である。 ＣＤ８８およびＣＤ１５７の二重陽性単球は遺伝子発現に関してＹｍ１+Ｌｙ６Ｃ＋単球に相当することを示す図である。 骨髄でのＣＤ８８およびＣＤ１５７発現と、Ｌｙ６Ｃ＋単球におけるＹｍ１タンパク質発現との相関関係を示す図である。 図１Ａで示した各種表面マーカーの、Ｙｍ１＋単球、Ｙｍ１－単球および好中球上の発現を示す図である。 末梢血中でのＣＤ８８およびＣＤ１５７のＹｍ１＋単球上での発現を示す図である。 末梢血中でのＣＤ８８およびＣＤ１５７発現と、Ｌｙ６Ｃ＋単球におけるＹｍ１タンパク質発現との相関関係を示す図である。 実験戦略のワークフローを示す図である。本図は、具体的には、ナイーブおよびＬＰＳ投与をしたＹｍ１－Ｖｅｎｕｓマウス由来の骨髄細胞を、１１種類のバックボーンマーカーおよびＰＥ結合可変抗体（２５５種類：ＬＥＧＥＮＤＳｃｒｅｅｎマウスＰＥキット）で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。得られた結果を、ＩｎｆｉｎｉｔｙＦｌｏｗパイプラインにより解析し、細胞ごとに２５５のマーカーの共発現パターンを予測した。 図２Ａの結果をもとに、ナイーブのＹｍ１－Ｖｅｎｕｓマウス骨髄のＵＭＡＰプロットを作成し、各マーカー発現をヒートマップ表示した図である。図２Ｋの結果をもとにＵＭＡＰプロット上の各種成熟細胞および前駆細胞の分布を示してある。 図２Ｂと同様に、ＬＰＳ投与Ｙｍ１－Ｖｅｎｕｓマウスの骨髄のＵＭＡＰプロットを示す図である。 図２Ａの結果をもとに、クラスタリングおよび擬時系列解析により分化経路を予測した図である。 ナイーブ（左上）およびＬＰＳ投与をしたマウスの骨髄細胞（左下）のＵＭＡＰプロットを示す図である。 ナイーブ（上）またはＬＰＳ投与（下）マウス骨髄におけるｃＭｏＰ上のＣＤ８１およびＣＸ３ＣＲ１の発現を示す図である。本図は、具体的には、ナイーブマウスの骨髄のｃＭｏＰの大部分が、高レベルのＣＸ３ＣＲ１と低レベルのＣＤ８１を発現する（右上）のに対し、ＬＰＳ投与マウス骨髄のｃＭｏＰの大部分が、低レベルのＣＸ３ＣＲ１と高レベルのＣＤ８１を発現する（右下）ことを示す。 ＧＭ－ＣＳＦの存在下、インビトロでのＧＭＰ、ｐｒｏＮｅｕ１およびＣＤ８１＋ＣＸ３ＣＲ１－ｃＭｏＰからのＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の分化を示す図である。 ＧＭＰ、ｐｒｏＮｅｕ１およびＭＤＰをＧＭ－ＣＳＦの存在下で短時間（２４時間）培養して、ｃＭｏＰに分化させた際の、各ｃＭｏＰのＣＤ８１およびＣＸ３ＣＲ１の表面発現をフローサイトメトリーで調べた結果を示す図である。 ＧＭＰ－ｐｒｏＮｅｕ１ＣＤ８１＋ＣＸ３ＣＲ１－ｃＭｏＰが、インビボでＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球に分化することを示す図である。 炎症条件下における単球と好中球の分化模式図を示す。 図２Ａ～図２Ｃの解析で得られたＵＭＡＰプロットに、これまでに報告されている表面マーカーで分類した前駆細胞を含む各種免疫細胞の分布を重ねて示した図である。 図２Ｈ～図２Ｔに用いた各種細胞のゲーティング戦略を示した図である。 単球と比較してヒト末梢血好中球上で優先的に発現されるマーカーを示す図である。 異なったＣＸＣＲ１発現量に基づきＣＤ１４＋単球の中の単球の２つの亜集団を同定するクラスター解析の結果を示す図である。 好中球、ＣＤ１４＋単球、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球およびＣＤ１６＋単球を定義するのに使用されたゲーティング戦略を示す図である。 ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球、ＣＸＣＲ１－ＣＤ１４＋単球および好中球の形態的特徴を示す図である。 図３Ａで示した各種表面マーカーのＣＤ１４＋単球における発現を示す図である。 ４つ単球および好中球のＲＮＡシーケンスに基づく主成分分析（ＰＣＡ）の結果を示す図である。 ４つ単球および好中球のＲＮＡシーケンス結果の階層的クラスタリングを示す図である。本図は、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球の遺伝子発現パターンはＣＸＣＲ１－ＣＤ１４＋単球と比べて、好中球との類似性が高いことを示す。 ＲＮＡシーケンスにより抽出されたＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球あるいはＣＸＣＲ１－ＣＤ１４＋単球で高発現する遺伝子を示すヒートマップである。 図４Ｃで定義されたＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球で高発現する遺伝子で有意に増加する遺伝子オントロジーを示す図である。 図４Ｃで定義されたＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球で高発現する遺伝子発現をｑＲＴ－ＰＣＲで確認した結果を示す図である。 Ｖｉｌｌａｎｉらの一細胞ＲＮＡシーケンス結果を再解析したＵＭＡＰプロット（左）およびヒートマップ（右）を示す図である。 単球クラスターを識別するマーカー遺伝子の相対的発現のヒートマップを示す図である。 好中球で高発現する３つの遺伝子の各種細胞における発現量を示す図である。本図は、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球では、好中球で高発現するすべての遺伝子の発現が高いわけではないことを示している。 ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球とＣＸＣＲ１－ＣＤ１４＋単球の培養上清を用いたサイトカインアレイ結果を示す図である。 図５Ａで同定されたＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球による炎症誘発性サイトカイン（ＩＬ－６およびＴＮＦα）の発現低下をＥＬＩＳＡ法で確認した結果を示す図である。 ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球が、Ｔ細胞の増殖を細胞数依存的に抑制することを示す図である。 ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球によるＴ細胞増殖の抑制が、細胞間接触依存性であることを示す図である。 カタラーゼ（左）またはＮｅｃ－１（右）の添加により、ＣＸＣＲ１＋単球によるＴ細胞増殖抑制が打ち消されたことを示す図である。 ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球によるＴ細胞増殖の抑制因子が、同細胞の培養上清中には存在しないことを示す図である。 カタラーゼ（左）またはＮｅｃ－１（右）が濃度依存的に、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球によるＴ細胞増殖抑制効果を打ち消すことを示す図である。 ＴＡＣＥ前（上段）とＴＡＣＥ後３～４日（下段）の癌患者の末梢血をフローサイトメトリーで分析した結果を示す図である。 ＴＡＣＥ前と比較してＴＡＣＥの３～４日後のＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球が増加することを示す図である。 ＴＡＣＥ前後のＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球の比率を示す図である。 ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球の割合と、好中球数および血清ＣＲＰとの相関関係を示す図である。 ＴＡＣＥ前およびＴＡＣＥ９６時間後のＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球によるＴ細胞の増殖抑制の程度を示す図である。 ＴＡＣＥ前後のＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球におけるＣＤ６６ａ／ｃ／ｅおよびＣＤ６６ｂの発現を示す図である。 ＣＤ１４＋単球に占めるＣＸＣＲ１＋ＣＤ６６ａ／ｃ／ｅ＋およびＣＸＣＲ１＋ＣＤ６６ｂ＋細胞の割合と、好中球数および血清ＣＲＰとの相関関係を示す図である。
　本発明の第１の側面は、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を有する対象に投与するための医薬組成物に関し、当該医薬組成物は、マトリックスメタロプロテナーゼ－９（Ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　９；ＭＭＰ－９）の活性を阻害する化合物を含む。ここで、「ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球」は、ＣＸＣＲ１（「ＣＤ１８１」としても既知。）遺伝子およびＣＤ１４遺伝子を発現している単球をいい、「ＣＸＣＲ１を発現したＣＤ１４＋単球」、「ＣＸＣＲ１およびＣＤ１４を発現した単球」および「ＣＸＣＲ１陽性ＣＤ１４陽性単球」と同義である。本単球において、典型的には、ＣＸＣＲ１およびＣＤ１４は単球表面に発現する。好ましい態様において、「ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球」は、ＣＸＣＲ１遺伝子およびＣＤ１４遺伝子に関し、これらの遺伝子およびタンパク質の両方を発現している。
　本明細書において、各マーカー遺伝子の発現は、遺伝子およびタンパク質のいずれに基づいて確認してもよい。マーカー遺伝子の発現は、当該分野で公知の技術を用いて確認することができ、例えば、ｑＰＣＲにより、そのマーカー遺伝子の発現量を測定することによって確認することができる。
　本明細書において、「ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を有する対象」とは、ＣＸＣＲ１およびＣＤ１４を発現した単球を有する対象をいう。具体的に、当該対象は、ＣＸＣＲ１が発現していることが確認されたＣＤ１４陽性単球を有している。ＣＸＣＲ１は典型的には、ＣＤ１４＋単球の表面に発現している。ＣＤ１４＋単球のＣＸＣＲ１の発現は、当該分野で既知の方法、例えば、免疫細胞染色およびＲＴ－ＰＣＲによって検出することができる。また、ＣＸＣＲ１の発現は、フローサイトメトリーによって検出することも可能である。「ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を有する対象」とは、好ましくは、当該対象におけるＣＤ１４＋単球のうちＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球の占める割合が高い対象であり、より好ましくは、当該対象におけるＣＤ１４＋単球のうちＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球の占める割合が、健常人と比較して高い対象である。「ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を有する対象」において、「ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球／ＣＤ１４＋単球」の割合は、例えば３０％以上、好ましくは３５％以上、より好ましくは４０％以上、さらにより好ましくは４５％以上、特により好ましくは５０％以上である。
　本明細書において、単球に発現するマーカー遺伝子には、そのホモログが含まれるものとする。「ＣＸＣＲ１およびＣＤ１４を発現した単球」は具体的には、ＣＸＣＲ１遺伝子またはそのホモログ、および、ＣＤ１４遺伝子またはそのホモログを発現した単球を指す。本明細書で言及する他のマーカー遺伝子についても同様に、そのマーカー遺伝子の範囲には、そのホモログも包含されるものとする。
　本明細書において、特定の遺伝子の「ホモログ」は、該特定の遺伝子のヌクレオチド配列、または該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列と特定の相同性を有する実体を意味する。ここで、配列に関し、「相同性」、「同一性」および「配列同一性」の語は互換可能に使用される。「配列同一性」の割合は、具体的には、当業者に周知のアラインメントアルゴリズムを用いて２つの遺伝子のヌクレオチド配列またはこれらをコードするタンパク質のアミノ酸配列を整列させた後に、これら２つの配列間で同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の割合をいう。
　特定の遺伝子の「ホモログ」は、当該遺伝子のコードするタンパク質のアミノ酸配列に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列同一性を有する。配列同一性はまた、類似の化学的特性および／または機能を有するアミノ酸残基の観点から考慮してもよい。
　上記アラインメントには、ＧＣＧ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４　Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１　ｐ３８７）、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９　Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版、第１８章）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０　Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３～４１０）、ＤＮＡＳＩＳＴＭ（Ｈｉｔａｃｈｉ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ）等のコンピュータプログラムを使用できるが、これらに限定されない。
　「対象」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物である。本明細書において、「哺乳動物」の語は、哺乳動物に分類されるあらゆる動物を指すために使用され、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌおよびネコが含まれるが、これらに限定されない。本明細書において、「対象」は、好ましくはヒトである。
　本発明にかかる医薬組成物は、典型的には、がんを予防および／または治療するための医薬組成物である。がんの種類は、特に限定されないが、好ましくは固形がんである。固形がんは、限定されるものではないが、例えば、肝臓がん、胃がん、食道がん、肺がん、大腸がん、膵臓がん、乳がん、悪性黒色種である。一態様において、固形がんは、肝臓がんである。
　本発明にかかる医薬組成物は、がん転移を抑制および／または予防するための医薬組成物であってもよい。
　本明細書において「がん転移」に関し、「抑制」および「予防」の語は共に、治療および予防策の両方を包含するが、好ましくは、がんの転移を予防すること、遅らせること、および軽減することを包含するものとする。がん転移に関し、「抑制」および「予防」の語には、がんの病巣の数の減少、病巣の範囲の縮小、病巣の数および範囲の安定化（すなわち、増加および拡大させない）、病巣の数および範囲の増加または拡大の減速ならびに遅延が含まれるが、これらに限定されない。
　がん転移の「抑制」または「予防」は、当該分野で公知の方法に従って評価することができる。例えば、結節の数、がん細胞の局在、および、がん細胞に高発現する遺伝子を指標として評価することができる。結節の数およびがん細胞の局在は、例えば、組織染色および画像診断を用いて評価することができる。また、がん細胞に高発現している遺伝子は、例えば、免疫蛍光染色法、および、ＲＴ－ＰＣＲ法によって確認することができる。
　「ＭＭＰ－９の活性を阻害する化合物」の語は、最も広い意味で使用され、ＭＭＰ－９の活性化を引き起こす経路（以下、「ＭＭＰ－９活性化経路」とも称する。）に関与する化合物および細胞のいずれか１つ以上の生物学的活性を阻害する化合物が含まれるものとする。
　本明細書において、「ＭＭＰ－９活性化経路」は、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球と、ＭＭＰ－９とを含むものである。「ＭＭＰ－９活性化経路」は、好ましくは、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球と、Ｌｃｎ２と、ＭＭＰ－９とを含むものである。より具体的には、「ＭＭＰ－９活性化経路」は、ＣＸＣＲ１を発現したＣＤ１４＋単球が、ＭＭＰ－９を分泌することを含む経路をいう。
　本明細書において、「ＭＭＰ－９活性化経路」の語は「がん進展カスケード」と同義である。当該経路は、Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｌｃｎ２）をさらに含んでもよい。Ｌｃｎ２は、ＭＭＰ－９を安定化することによってＭＭＰ－９の活性を増強する作用を有する。ここで、「がんの進展」の語には、例えば、がんの発症、がんの転移、がんの浸潤、がんの再発、がん細胞の増殖、および、がんの浸潤などが含まれる。
　好ましい一態様において、「ＭＭＰ－９活性化経路」は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃおよびＣＤ６６ｅから選択される少なくとも１つをさらに含む。別の一態様において、「ＭＭＰ－９活性化経路」は、ＣＤ６６ｂと、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃおよびＣＤ６６ｅから選択される少なくとも１つとをさらに含む。
　「ＭＭＰ－９」は、細胞外マトリックス成分に対する生体内分解酵素の一種であり、活性中心に金属イオンが配座しているタンパク質分解酵素である。ＭＭＰ－９は、「ゼラチナーゼＢ」とも称される。ＭＭＰ－９は、組織、細胞および血中に存在し、細胞外マトリックスの構成成分であるゼラチン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲンおよびエラスチンを分解する活性を有し、癌の浸潤および転移に関与する。一般的に、ＭＭＰ－９は、好中球、マクロファージ、トロボブラスト、破骨細胞、癌細胞、Ｔ－リンパ球等によって産生されるが、本発明が対象とする「ＭＭＰ－９」は、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球によって産生されるＭＭＰ－９である。
　本明細書において、「ＭＭＰ－９の活性を阻害する化合物」は、ＭＭＰ－９の活性を直接的に阻害する化合物に限られず、一連の経路（例えば、「ＭＭＰ－９活性化経路」または「がん進展カスケード」）において、間接的に、ＭＭＰ９の活性を阻害する化合物も含む。例えば、ある化合物が、「ＭＭＰ－９活性化経路」の上流に存在する標的を阻害することによって、上記経路の下流においてＭＭＰ－９活性が阻害される場合、この化合物は直接的にはＭＭＰ－９の活性を阻害しないが、間接的にＭＭＰ－９の活性を阻害することにより、本明細書においては、「ＭＭＰ－９の活性を阻害する化合物」と定義される。ＭＭＰ－９の活性を間接的に阻害する化合物としては、例えば、後述のＣＸＣＲ１アンタゴニスト、ＣＤ６６ａアンタゴニスト、ＣＤ６６ｂアンタゴニスト、ＣＤ６６ｃアンタゴニストおよびＣＤ６６ｅアンタゴニストが挙げられる。
　「ＭＭＰ－９の活性を阻害する化合物」には、上記の化合物および細胞の少なくとも１つの活性を阻害する化合物が包含され、例えば、ＣＸＣＲ１アンタゴニスト、Ｌｃｎ２アンタゴニスト、ＣＤ６６ａアンタゴニスト、ＣＤ６６ｂアンタゴニスト、ＣＤ６６ｃアンタゴニスト、ＣＤ６６ｅアンタゴニストおよびＭＭＰ－９アンタゴニストが挙げられる。一態様において、「ＭＭＰ－９の活性を阻害する化合物」は、ＣＸＣＲ１アンタゴニスト、Ｌｃｎ２アンタゴニスト、ＣＤ６６ａアンタゴニスト、ＣＤ６６ｂアンタゴニスト、ＣＤ６６ｃアンタゴニスト、ＣＤ６６ｅアンタゴニストおよびＭＭＰ－９アンタゴニストからなる群より選択される少なくとも１つである。
　本明細書において、「アンタゴニスト」の語は、最も広い意味で使用される。「アンタゴニスト」は分子であり、作用の基となるメカニズムに関わらず、部分的にまたは完全に標的分子の生物学的活性を遮断、阻害、中和、防御および／または干渉するものである。
　本発明者らが得た知見は、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を有する対象の処置において、ＭＭＰ－９の活性化を引き起こす経路（以下「ＭＭＰ－９活性化経路」とも称する。）を標的にすることの有用性を示すものである。したがって、「ＭＭＰ－９の活性化を引き起こす経路に関与する化合物」の語には、例えば、ＣＸＣＲ１、ＩＬ－８、Ｌｃｎ２、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｅおよびＭＭＰ－９などが含まれる。また、「ＭＭＰ－９の活性化を引き起こす経路に関与する細胞」の語には、例えば、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球、並びに、ＣＸＣＲ１、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｅおよびＭＭＰ－９のいずれかを発現または産生する細胞などが含まれる。
　（ＣＸＣＲ１アンタゴニスト）
　「ＣＸＣＲ１アンタゴニスト」に関連して、標的分子である「ＣＸＣＲ１（ＣＤ１８１）」の「生物学的活性」とは、例えば、ＣＸＣＲ１がリガンドと結合する能力、および、ＣＸＣＲ１を表面に発現する単球においてＭＭＰ－９の産生を誘導する能力である。具体的には、ＣＸＣＲ１は、免疫細胞の局所への遊走に関わるサイトカインであるＩＬ－８のレセプターとして作用する。ＣＸＣＲ１アンタゴニストは、例えば、ＣＸＣＲ１を特異的に認識して結合し、免疫系細胞の活性化による抗体依存性細胞傷害（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；ＡＤＣＣ）活性、補体依存性細胞傷害（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；ＣＤＣ）活性および抗体依存性細胞貪食（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ；ＡＤＣＰ）活性を誘導する能力、ならびに、ＣＸＣＲ１を発現した単球によるＭＭＰ－９産生を阻害または遮断する能力に基づいて同定され得る。
　ＣＸＣＲ１アンタゴニストは例えば、ＣＸＣＲ１を表面に発現した単球を、試験化合物の存在下および不存在下でインキュベートし、エフェクター細胞あるいは補体を含む血清をさらに加えてインキュベートし、細胞障害に伴って培養上清中に遊離する物質、例えばＬＤＨなどを測定することによって同定することができる。試験化合物が無い場合と比較して試験化合物が有る場合の方が、細胞障害に伴って遊離する物質の濃度が高ければ、その試験化合物はＣＸＣＲ１アンタゴニストである。また、ＣＸＣＲ１アンタゴニストは例えば、ＣＸＣＲ１を表面に発現した単球を、試験化合物の存在下および非存在下でインキュベートし、細胞培養物上清のＭＭＰ－９レベルを、例えばＥＬＩＳＡによって、モニタリングすることができ、試験化合物が無い場合と比較して試験化合物が有る場合の方が、ＭＭＰ－９レベルが低ければ、その試験化合物はＣＸＣＲ１アンタゴニストである。他の方法として、試験化合物による処理の前後でリアルタイムＲＴ－ＰＣＲを用いて、ＣＸＣＲ１を発現する組織におけるＭＭＰ－９　ｍＲＮＡの発現をモニタリングすることもできる。試験化合物存在下でＭＭＰ－９　ｍＲＮＡレベルが減少することは、その化合物がＣＸＣＲ１アンタゴニストであることを示す。
　「ＣＸＣＲ１アンタゴニスト」の例には、天然ＣＸＣＲ１ポリペプチド全体もしくは天然ＣＸＣＲ１ポリペプチドサブユニットに対する中和抗体、免疫グロブリン定常領域配列と融合したＣＸＣＲ１サブユニットを含む免疫付着因子、小分子、天然ＣＸＣＲ１ポリペプチド全体もしくは天然ＣＸＣＲ１ポリペプチドサブユニットに結合するアプタマー、天然ＣＸＣＲ１ポリペプチド全体もしくはそのサブユニットをコードする遺伝子の翻訳および転写の少なくとも一方を阻害することのできる核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、デコイおよびリボザイム）などが含まれるが、これらに限定されない。
　ここで、天然ＣＸＣＲ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、当該分野で既知のデータベースから取得することができる。天然ＣＸＣＲ１ポリペプチドのアミノ酸配列としては例えば、
　Ｃ－Ｘ－Ｃ　ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｔｙｐｅ　１　［Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ］，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿０００６２５
が挙げられる。ＣＸＣＲ１アンタゴニストには、このような配列を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体およびその断片、ならびに、当該配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体およびその断片などが含まれる。
　天然ＣＸＣＲ１ポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列としては例えば、
　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　Ｃ－Ｘ－Ｃ　ｍｏｔｉｆ　ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　１　（ＣＸＣＲ１），ｍＲＮＡ；ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿０００６３４
が挙げられる。ＣＸＣＲ１アンタゴニストには、
　・上記のようなアミノ配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
　・上記のようなアミノ配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
　・上記のような塩基配列を有する遺伝子、
　・上記のような塩基配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有する塩基配列を有する遺伝子
の翻訳および転写の少なくとも一方を阻害することのできる核酸分子などが含まれる。
　「ＣＸＣＲ１アンタゴニスト」には、例えば、抗体および抗体フラグメントならびに低分子化合物が含まれる。ＣＸＣＲ１アンタゴニストは、例えば、抗ＣＸＣＲ１抗体およびＣＸＣＲ１阻害剤である。
　（Ｌｃｎ２アンタゴニスト）
　「Ｌｃｎ２」は、Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ－２、Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ Ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｚｉａｔｅｄ Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ（ＮＧＡＬ）、２４ｐ３またはＮｅｕｔｒｏｐｈｉｌ Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ（ＮＬ）としても知られる分泌型糖タンパク質である。Ｌｃｎ２は、ストレスタンパク質としても機能し、先天性免疫反応、分化、腫瘍発生および細胞の生存などの多様な細胞プロセスに関与する。「Ｌｃｎ２アンタゴニスト」に関連して、標的分子である「Ｌｃｎ２」の「生物学的活性」とは、例えば、ＭＭＰ－９を安定化させることによりＭＭＰ－９活性を維持する能力である。Ｌｃｎ２アンタゴニストは、例えば、Ｌｃｎ２を特異的に認識して結合し、ＭＭＰ－９のゼラチナーゼ活性を阻害する能力に基づいて同定され得る。
　Ｌｃｎ２アンタゴニストは例えば、Ｌｃｎ２を発現した細胞、または、Ｌｃｎ２をコートしたプレートを、試験化合物の存在下および非存在下でインキュベートし、ＭＭＰ－９をさらに加えてインキュベートし、ＭＭＰ－９のゼラチナーゼ活性を測定することによって同定することができる。試験化合物が無い場合と比較して試験化合物が有る場合の方が、ゼラチナーゼ活性が低ければ、その試験化合物はＬｃｎ２アンタゴニストである。
　「Ｌｃｎ２アンタゴニスト」の例には、天然Ｌｃｎ２ポリペプチド全体もしくは天然Ｌｃｎ２ポリペプチドサブユニットに対する中和抗体、免疫グロブリン定常領域配列と融合したＣＸＣＲ４サブユニットを含む免疫付着因子、小分子、天然Ｌｃｎ２ポリペプチド全体もしくは天然Ｌｃｎ２ポリペプチドサブユニットに結合するアプタマー、天然Ｌｃｎ２ポリペプチド全体もしくはそのサブユニットをコードする遺伝子の翻訳および転写の少なくとも一方を阻害することのできる核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、デコイおよびリボザイム）などが含まれるが、これらに限定されない。
　ここで、天然Ｌｃｎ２ポリペプチドのアミノ酸配列は、当該分野で既知のデータベースから取得することができる。天然Ｌｃｎ２ポリペプチドのアミノ酸配列としては例えば、
　Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ　ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿００５５５５
が挙げられる。Ｌｃｎ２には、このような配列を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体およびその断片、ならびに、当該配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体およびその断片などが含まれる。
　天然Ｌｃｎ２ポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列としては例えば、
　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ　２（Ｌｃｎ２），ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿００５５６４
が挙げられる。Ｌｃｎ２アンタゴニストには、
　・上記のようなアミノ配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
　・上記のようなアミノ配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
　・上記のような塩基配列を有する遺伝子、
　・上記のような塩基配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有する塩基配列を有する遺伝子
の翻訳および転写の少なくとも一方を阻害することのできる核酸分子などが含まれる。
　「Ｌｃｎ２アンタゴニスト」には、例えば、抗体および抗体フラグメントならびに低分子化合物が含まれる。Ｌｃｎ２アンタゴニストは、例えば、抗Ｌｃｎ２抗体およびＬｃｎ２阻害剤である。
　（ＣＤ６６ｂアンタゴニスト）
　「ＣＤ６６ｂ（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ６６ｂ）」は、本発明者らによって、ＴＡＣＥを行った後の肝癌患者の末梢血中において、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球の表面に高発現することが確認された（図６Ａ～６Ｄ）。ＣＤ６６ｂは、グリコシル－ホスファチジルイノシトール結合型糖タンパクであり、「ＣＧＭ６」としても既知である。ＣＤ６６ｂは、典型的には、好中球のＣＤ１１／ＣＤ１８接着活性調節において、シグナル伝達を介して関与していると考えられており、骨髄球、後骨髄球、好中球および分葉核好中球に強く発現することが知られているが、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球の表面上の「ＣＤ６６ｂ」に関し、その機能はまだ具体的に示されていない。ＣＤ６６ｂアンタゴニストは、例えば、ＣＤ６６ｂを特異的に認識して結合し、その機能を抑制する能力に基づいて同定され得る。ＣＤ６６ｂアンタゴニストは、本発明者らが見出したがん進展カスケードの上流に存在する、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球の表面に発現したＣＤ６６ｂを阻害することによって、当該単球のＭＭＰ－９の産生を誘導する能力を低下させ、本カスケードの下流におけるＭＭＰ－９の活性を間接的に阻害する。ＣＤ６６ｂアンタゴニストが抗ＣＤ６６ｂ抗体である場合、抗ＣＤ６６ｂ抗体がＣＤ６６ｂを認識することにより、例えばＡＤＣＣ、ＣＤＣまたはＡＤＣＰによりＣＸＣＲ１＋単球を除去し、ＭＭＰ－９の産生を阻害し得る。
　「ＣＤ６６ｂアンタゴニスト」の例には、天然ＣＤ６６ｂポリペプチド全体もしくは天然ＣＤ６６ｂポリペプチドサブユニットに対する中和抗体、免疫グロブリン定常領域配列と融合したＣＤ６６ｂサブユニットを含む免疫付着因子、小分子、天然ＣＤ６６ｂポリペプチド全体もしくは天然ＣＤ６６ｂポリペプチドサブユニットに結合するアプタマー、天然ＣＤ６６ｂポリペプチド全体もしくはそのサブユニットをコードする遺伝子の翻訳および転写の少なくとも一方を阻害することのできる核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、デコイおよびリボザイム）などが含まれるが、これらに限定されない。
　ここで、天然ＣＤ６６ｂポリペプチドのアミノ酸配列は、当該分野で既知のデータベースから取得することができる。天然ＣＤ６６ｂポリペプチドのアミノ酸配列としては例えば、
　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　８　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿００１８０７
が挙げられる。ＣＤ６６ｂアンタゴニストには、このような配列を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体およびその断片、ならびに、当該配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体およびその断片などが含まれる。
　天然ＣＤ６６ｂポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列としては例えば、
　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ＣＥＡ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ８ （ＣＥＡＣＡＭ８），ｍＲＮＡ；ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿００１８１６
が挙げられる。ＣＤ６６ｂアンタゴニストには、
　・上記のようなアミノ配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
　・上記のようなアミノ配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
　・上記のような塩基配列を有する遺伝子、
　・上記のような塩基配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有する塩基配列を有する遺伝子
の翻訳および転写の少なくとも一方を阻害することのできる核酸分子などが含まれる。
　「ＣＤ６６ｂアンタゴニスト」には、例えば、抗体および抗体フラグメントならびに低分子化合物が含まれる。ＣＤ６６ｂアンタゴニストは、例えば、抗ＣＤ６６ｂ抗体およびＣＤ６６ｂ阻害剤である。
　（ＣＤ６６ａアンタゴニスト、ＣＤ６６ｃアンタゴニストおよびＣＤ６６ｅアンタゴニスト）
　ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃおよびＣＤ６６ｅのうちの少なくとも１つは、ＣＤ６６ｂと同様、本発明者らによって、ＴＡＣＥを行った後の肝癌患者の末梢血中において、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球の表面に高発現することが確認された（図６Ｆ）。なお、「ＣＤ６６ａ／ｃ／ｅ」との表記は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃおよびＣＤ６６ｅの３つの分子を認識し得る「抗ＣＤ６６ａ／ｃ／ｅ抗体」を用いて、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃおよびＣＤ６６ｅのうちの少なくとも１つが検出されたことを示す。ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃおよびＣＤ６６ｅは、Ｉｇスーパーファミリーの癌胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ；ＣＥＡ）ファミリーのメンバーである。ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球の表面上の「ＣＤ６６ａアンタゴニスト」、「ＣＤ６６ｃアンタゴニスト」および「ＣＤ６６ｅアンタゴニスト」に関し、その機能はまだ具体的に示されていない。ＣＤ６６ａアンタゴニストは、例えば、ＣＤ６６ａを特異的に認識して結合し、その機能を抑制する能力に基づいて同定され得る。ＣＤ６６ａアンタゴニストは、本発明者らが見出したがん進展カスケードの上流に存在する、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球の表面に発現したＣＤ６６ａを阻害することによって、当該単球のＭＭＰ－９の産生を誘導する能力を低下させ、本カスケードの下流におけるＭＭＰ－９の活性を間接的に阻害する。ＣＤ６６ａアンタゴニストが抗ＣＤ６６ａ抗体である場合、抗ＣＤ６６ａ抗体がＣＤ６６ａを認識することにより、例えばＡＤＣＣ、ＣＤＣまたはＡＤＣＰによりＣＸＣＲ１＋単球を除去し、ＭＭＰ－９の産生を阻害し得る。ＣＤ６６ｃアンタゴニストおよびＣＤ６６ｅアンタゴニストについても、ＣＤ６６ａアンタゴニストと同様の説明が適用される。
　ＣＤ６６ａアンタゴニストは例えば、ＣＤ６６ａを表面に発現した細胞を、試験化合物の存在下および非存在下でインキュベートし、ＣＤ６６ａが本来結合する分子に対する結合活性を測定することによって同定することができる。試験化合物が無い場合と比較して試験化合物が有る場合の方が、当該結合活性が低下していれば、その試験化合物はＣＤ６６ａアンタゴニストである。ＣＤ６６ｃアンタゴニストおよびＣＤ６６ｅアンタゴニストについても、ＣＤ６６ａアンタゴニストと同様の方法によって同定することができる。
　「ＣＤ６６ａアンタゴニスト」の例には、天然ＣＤ６６ａポリペプチド全体もしくは天然ＣＤ６６ａポリペプチドサブユニットに対する中和抗体、免疫グロブリン定常領域配列と融合したＣＤ６６ａサブユニットを含む免疫付着因子、小分子、天然ＣＤ６６ａポリペプチド全体もしくは天然ＣＤ６６ａポリペプチドサブユニットに結合するアプタマー、天然ＣＤ６６ａポリペプチド全体もしくはそのサブユニットをコードする遺伝子の翻訳および転写の少なくとも一方を阻害することのできる核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、デコイおよびリボザイム）などが含まれるが、これらに限定されない。「ＣＤ６６ｃアンタゴニスト」の例および「ＣＤ６６ｅアンタゴニスト」の例についても、「ＣＤ６６ａアンタゴニスト」の例と同様の説明が適用される。
　ここで、天然ＣＤ６６ａポリペプチド、天然ＣＤ６６ｃポリペプチドおよび天然ＣＤ６６ｅポリペプチドのアミノ酸配列は、当該分野で既知のデータベースから取得することができる。これらポリペプチドのアミノ酸配列としては例えば、
　・Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ １ ｉｓｏｆｏｒｍ ２ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿００１０２００８３、
　・Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ６ ｐｒｅｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿００２４７４、
　・Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ ５ ｉｓｏｆｏｒｍ １ ｐｒｅｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿００１２７８４１３
が挙げられる。ＣＤ６６ａアンタゴニスト、ＣＤ６６ｃアンタゴニストおよびＣＤ６６ｅアンタゴニストのそれぞれには、このような配列を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体およびその断片、ならびに、当該配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体およびその断片などが含まれる。
　天然ＣＤ６６ａポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列、天然ＣＤ６６ｃポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列、および、天然ＣＤ６６ｅポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列としては例えば、
　・Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ＣＥＡ　ｃｅｌｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　１　（ＣＥＡＣＡＭ１), ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ ２，ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿００１０２４９１２、
　・Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ＣＥＡ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ６ （ＣＥＡＣＡＭ６），ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿００２４８３、
　・Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ＣＥＡ　ｃｅｌｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　５　（ＣＥＡＣＡＭ５），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ ２，ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿００１２９１４８４
が挙げられる。ＣＤ６６ａアンタゴニスト、ＣＤ６６ｃアンタゴニストおよびＣＤ６６ｅアンタゴニストのそれぞれには、
　・上記のようなアミノ配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
　・上記のようなアミノ配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
　・上記のような塩基配列を有する遺伝子、
　・上記のような塩基配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有する塩基配列を有する遺伝子
の翻訳および転写の少なくとも一方を阻害することのできる核酸分子などが含まれる。
　「ＣＤ６６ａアンタゴニスト」、「ＣＤ６６ｃアンタゴニスト」および「ＣＤ６６ｅアンタゴニスト」のそれぞれには、例えば、抗体および抗体フラグメントならびに低分子化合物が含まれる。
　（ＭＭＰ－９アンタゴニスト）
　ＭＭＰ－９は、細胞増殖因子の細胞外ドメイン分泌を制御するマトリックスメタロプロテナーゼである。「ＭＭＰ－９アンタゴニスト」に関連して、標的分子である「ＭＭＰ－９」の「生物学的活性」とは、例えば、細胞外マトリックスの構成成分を分解する能力である。ＭＭＰ－９アンタゴニストがＭＭＰ－９阻害剤である場合、ＭＭＰ－９による細胞外マトリックスの構成成分の分解を阻害し得る。ＭＭＰ－９アンタゴニストが抗ＭＭＰ－９抗体である場合、当該アンタゴニストは、例えば、ＭＭＰ－９を特異的に認識して結合し、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性およびＡＤＣＰ活性を誘導する能力に基づいて同定されてもよい。
　ＭＭＰ－９アンタゴニストは例えば、ＭＭＰ－９タンパク質をコートしたプレートを、試験化合物の存在下および不存在下でインキュベートし、ゼラチナーゼ活性を測定することによって同定することができる。試験化合物が無い場合と比較して試験化合物が有る場合の方が、ゼラチナーゼ活性レベルが低ければ、その試験化合物はＭＭＰ－９アンタゴニストである。
　「ＭＭＰ－９アンタゴニスト」の例には、天然ＭＭＰ－９ポリペプチド全体もしくは天然ＭＭＰ－９ポリペプチドサブユニットに対する中和抗体、免疫グロブリン定常領域配列と融合したＭＭＰ－９サブユニットを含む免疫付着因子、小分子、天然ＭＭＰ－９ポリペプチド全体もしくは天然ＭＭＰ－９ポリペプチドサブユニットに結合するアプタマー、天然ＭＭＰ－９ポリペプチド全体もしくはそのサブユニットをコードする遺伝子の翻訳および転写の少なくとも一方を阻害することのできる核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、デコイおよびリボザイム）などが含まれるが、これらに限定されない。
　ここで、天然ＭＭＰ－９ポリペプチドのアミノ酸配列は、当該分野で既知のデータベースから取得することができる。天然ＭＭＰ－９ポリペプチドのアミノ酸配列としては例えば、
　Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－９ ｐｒｅｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿００４９８５
が挙げられる。ＭＭＰ－９アンタゴニストには、このような配列を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体およびその断片、ならびに、当該配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体およびその断片などが含まれる。
　天然ＭＭＰ－９ポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列としては例えば、
　Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ　ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ９（Ｍｍｐ９），ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿００４９９４
が挙げられる。ＭＭＰ－９アンタゴニストには、
　・上記のようなアミノ配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
　・上記のようなアミノ配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
　・上記のような塩基配列を有する遺伝子、
　・上記のような塩基配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有する塩基配列を有する遺伝子
の翻訳および転写の少なくとも一方を阻害することのできる核酸分子などが含まれる。
　「ＭＭＰ－９アンタゴニスト」には、例えば、抗体および抗体フラグメントならびに低分子化合物が含まれる。ＭＭＰ－９アンタゴニストは、例えば、抗ＭＭＰ－９抗体およびＭＭＰ－９阻害剤である。公知のＭＭＰ－９阻害剤として、例えば、ＳＢ－３ＣＴ（ＣＡＳ：２９２６０５－１４－２）、ＡＧ－Ｌ－６６０８５（ＣＡＳ １１７７７４９－５８－４）およびレプトマイシンＢ（ＬＭＢ）（ＣＡＳ：８７０８１－３５－４）が挙げられる。
　本明細書において、「抗体」の語は最も広い意味で使用され、特にモノクローナル抗体（例えば中和抗体および作動性抗体）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）および抗体フラグメントが含まれる。目的とする生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体には、キメラ抗体および当該抗体のフラグメントが含まれる。キメラ抗体は、重鎖あるいは軽鎖もしくはその両方の一部分が、特定の種由来の抗体、あるいは特定の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるかまたは相同であり、残りの鎖は別の種由来の抗体ならびにこのような抗体のフラグメント、あるいは別の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるもしくは相同であるものである（米国特許第４，８１６，５６７号明細書； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５、１９８４）。さらにモノクローナル抗体には、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む、「ヒト化」抗体またはフラグメントが含まれ、当該フラグメントとしては、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、その他抗体の抗原結合部分配列が挙げられるがこれらに限定されない。一態様において、ヒト化抗体は、受容者のＣＤＲ由来の残基が、所望の特異性、親和性、能力を持つ非ヒト種（供与体抗体）のＣＤＲ由来の残基に置き換わっているヒト免疫グロブリン（受容者抗体）であってもよい。非ヒト種の例には、マウスもしくはラット、ウサギ等がある。一例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖ、ＦＲ残基は、非ヒトの対応する残基に置換されている。ヒト化抗体は受容者抗体に導入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列にもみられない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は、抗体の性能を向上させる目的で行われる。一般に、ヒト化抗体は実質的にあらゆる、１つ以上、典型的には２つの可変ドメインを含み、ここで、全てのもしくは実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に相当し、且つ全ての、もしくは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である。また最適なヒト化抗体は免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含み、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域を含む。ヒト化抗体には霊長類化抗体が含まれてもよい。詳細は、当該分野で公知の文献、例えば、Ｊｏｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２－５２５（１９８６）およびＲｅｉｃｈｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３－３２９（１９９８）などに記載される。
　「抗体フラグメント」には、全長抗体の一部分、一般的にはその抗原結合領域または可変領域が含まれる。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；単一鎖抗体分子；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子および抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。
　「モノクローナル抗体」の語は、実質的に均質な抗体、すなわち母集団を含むそれぞれの抗体がわずかに存在してもよい天然に生じ得る変異を除いて同等であるような母集団から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位を指向する。更に、典型的には異なる決定基（エピトープ）に向けられた異なる抗体を含む慣用の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に向けられている。
　「アンチセンスオリゴヌクレオチド」の語は、配列特異的な方法で標的遺伝子の転写または翻訳、もしくはその両方を阻害することができる核酸分子として定義される。「アンチセンス」の語は、その核酸が標的遺伝子のコーディング（「センス」）遺伝子配列に対して相補的であることを指す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ワトソン－クリック塩基結合によって逆平行方向に新生ｍＲＮＡとハイブリダイズする。標的ｍＲＮＡ鋳型と結合することによって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、コードされているタンパク質の翻訳の達成を阻害する。この語には特に「リボザイム」と呼ばれるアンチセンス薬剤が含まれ、これは自然自己スプライシング活性を持つ配列を加えることによって標的ＲＮＡの触媒切断を誘導するように設計されたものである（例えば、Ｗ ａｒｚｏｃｈａ ｅｔ　ａｌ．，Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ ２４：２６７－２８１［１９９７］参照）。
　一態様において、ＭＭＰ－９の活性を阻害する化合物は、抗ＣＸＣＲ１抗体、ＣＸＣＲ１阻害剤、抗Ｌｃｎ２抗体、Ｌｃｎ２阻害剤、抗ＣＤ６６ｂ抗体、ＣＤ６６ｂ阻害剤、抗ＣＤ６６ａ／ｃ／ｅ抗体、ＣＤ６６ａ／ｃ／ｅ阻害剤、抗ＭＭＰ－９抗体およびＭＭＰ－９阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つである。
　好ましい態様において、がん転移は、急性炎症によって生じたがん転移であるか、または、腫瘍に対する治療的介入によって生じたがん転移である。ここで、腫瘍に対する治療的介入は、例えば、外科的切除、化学療法および放射線療法からなる群より選択され、好ましくは、外科的切除、より好ましくは、腫瘍の切除である。別の態様において、治療的介入は、肝動脈化学塞栓術（ＴＡＣＥ）である。
　一態様において、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を有する対象は、がんに罹患している。別の一態様において、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を有する対象は、固形がんに罹患している。
　本発明に係る医薬組成物には、典型的には、製薬上に許容される添加剤、例えば、当該分野で既知の賦形剤、結合剤、滑沢剤、溶剤、希釈剤、安定化剤、等張化剤などを含んでよい。
　本発明に係る医薬組成物は、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、注射剤、液剤、坐剤などに製剤化され、例えば、経口、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内により投与することができる。本発明に係る医薬組成物の投与量は、対象の年齢、体重、病状などによって異なる。
　本発明にかかる組成物は、更なる医薬組成物と組み合わせた、組合せ剤として用いられてもよい。組合せ剤に関し、それぞれの医薬組成物における成分（すなわち、第１の有効成分および第２の有効成分）は、一緒に、順々にまたは個別に、１つの組み合わせ単位剤形または個別の２つの単位剤形で投与されてもよい。治療有効量の、本発明にかかる組合せ剤の各有効成分が、同時に、個別に、または、任意の順序で、順次にもしくは連続して投与されてもよい。組合せ剤において、第１の有効成分および前記第２の有効成分が複数のユニットで存在してもよい。組合せ剤には、例えば、それぞれの有効成分と使用指示とを含むキットも含まれる。
　本発明の第２の側面は、ＭＭＰ－９活性化経路を阻害する組成物に関し、該ＭＭＰ－９活性化経路は、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球、Ｌｃｎ２およびＭＭＰ－９を含み、前記組成物は、ＭＭＰ－９の活性を阻害する化合物を含む。好ましい態様において、前記ＭＭＰ－９活性化経路は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃおよびＣＤ６６ｅから選択される少なくとも１つをさらに含む。別の一態様において、前記ＭＭＰ－９活性化経路は、ＣＤ６６ａと、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃおよびＣＤ６６ｅから選択される少なくとも１つとをさらに含む。別の一態様において、前記ＭＭＰ－９活性化経路は、ＩＬ－８をさらに含んでもよい。
　本発明の第３の側面は、がん進展のリスクの評価方法に関し、当該方法は、
　（ｉ）治療的介入前の対象の末梢血サンプル中の白血球に対するＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球の割合を測定する工程、
　（ｉｉ）治療的介入後の前記対象の末梢血サンプル中の白血球に対するＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球の割合を測定する工程、
　（ｉｉｉ）前記（ｉ）で測定した割合と、前記（ｉｉ）で測定した割合とを比較する工程
を含む、がんの進展のリスクの評価方法を含む。一態様において、工程（ｉｉｉ）における比較において、前記（ｉｉ）で測定した割合が前記（ｉ）で測定した割合よりも増加している場合、がんの進展の可能性が存在すると同定する。
　本明細書において、がんの進展のリスクの評価には、例えば、がんの進展の可能性の評価、がんの進展のリスクの予測、および、がんの進展の可能性の予測と同義に使用される。
　前記工程（ｉ）および／または（ｉｉ）における測定は、典型的には、フローサイトメトリーによって行われる。好ましい態様において、前記（ｉ）および（ｉｉ）の双方における測定が、フローサイトメトリーによって行われる。
　上記がんの進展のリスクの評価方法は、例えば、対象におけるがん発症の予測、対象におけるがんの経過観察、および、対象におけるがんの予後の観察に使用することができる。
　本発明の別の側面は、がんの進展の可能性を予測するためのキットに関する。当該キットは、がんの進展の可能性を評価または予測するためのキットである。本キットは、例えば、抗ＣＸＣＲ１抗体、抗Ｌｃｎ２抗体、抗ＣＤ６６ａ抗体、抗ＣＤ６６ｂ抗体、抗ＣＤ６６ｃ抗体、抗ＣＤ６６ｅ抗体および抗ＭＭＰ－９抗体から選択される少なくとも１つを含む。当該キットを使用する場合、対象の末梢血サンプル中の白血球に対するＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球の割合を検出することができる。好ましくは、治療的介入前の対象の末梢血サンプル中の白血球に対するＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球の割合Ｒ１と、治療的介入後の前記対象の末梢血サンプル中の白血球に対するＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球の割合Ｒ２とを比較することを含んでよい。
　本発明のさらに別の側面は、ＭＭＰ－９を阻害する化合物を含む組成物に関する。当該組成物において、ＭＭＰ－９を阻害する化合物は、抗ＣＸＣＲ１抗体、ＣＸＣＲ１阻害剤、抗Ｌｃｎ２抗体、Ｌｃｎ２阻害剤、抗ＣＤ６６ａ抗体、ＣＤ６６ａ阻害剤、抗ＣＤ６６ｂ抗体、ＣＤ６６ｂ阻害剤、抗ＣＤ６６ｃ抗体、ＣＤ６６ｃ阻害剤、抗ＣＤ６６ｅ抗体、ＣＤ６６ｅ阻害剤、抗ＭＭＰ－９抗体およびＭＭＰ－９阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つである。当該組成物において、ＭＭＰ－９を阻害する化合物は、複数を組み合わせて含んでもよい。かかる組成物は、例えば、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球の検出に使用されてもよい。
　本発明のさらに別の側面は、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を有する対象の血液からＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を吸着除去するための血液浄化装置に関し、当該装置は、抗ＣＸＣＲ１抗体を担持したアフィニティカラムを備える。当該ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を有する対象は、例えば、がんに罹患している。
　本発明のさらに別の側面は、抗ＣＸＣＲ１抗体を担持したアフィニティカラムによって、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を有する対象の血液からＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を吸着して、当該血液からＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を除去する方法に関する。当該ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を有する対象は、例えば、がんに罹患している。
　本発明のさらに別の側面は、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球のＴ細胞増殖抑制作用を調節する化合物をスクリーニングする方法に関し、当該方法は、
　（ｉ）ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球とＴ細胞との共培養系に、候補化合物を添加する工程、および
　（ｉｉ）Ｔ細胞の数が増えた場合に、前記候補化合物を前記単球のＴ細胞増殖抑制作用を調節する化合物として同定する工程
を含む。
　ここで、「Ｔ細胞増殖抑制作用の調節」とは、好ましくは、「Ｔ細胞増殖抑制作用の解除」である。Ｔ細胞の増殖抑制作用が解除されると、Ｔ細胞が増殖する。
　Ｔ細胞の数を評価する際には、例えば、Ｔ細胞の数を１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．５倍または３．０倍以上増加または減少させた場合に、当該候補化合物を単球のＴ細胞増殖抑制作用を調節する化合物として同定することができる。Ｔ細胞の数は、当業者に公知の方法を利用することができ、例えば、フローサイトメーターおよび血球計算盤を使用して測定することができる。
　別の一態様において、本スクリーニング方法は、以下：
　（ｉ）ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を含む単球集団に、候補化合物を添加する工程、
　（ｉｉ）前記単球集団においてＣＸＣＲ１遺伝子を発現する単球の割合を測定する工程、および
　（ｉｉｉ）前記候補化合物が、前記ＣＸＣＲ１遺伝子を発現する単球の割合を変化させた場合に、前記候補化合物を単球のＴ細胞増殖抑制作用を調節する化合物として同定する工程
を含む。
　本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物または物質などの標的を、特定の操作／評価方法で多数を含む集団の中から選抜することをいう。本明細書においては、「同定」、「分離」、「単離」、「純化」といった用語も、同様の意味で使用されることがある。
　候補化合物としては、低分子化合物、タンパク質、核酸、その他のポリマー、金属その他の無機化合物等、特に限定されず様々なものを用いることができる。候補化合物として、細胞の断片や細胞自体を用いてもよい。
　単球集団においてＣＸＣＲ１遺伝子を発現する単球の割合を測定する際には、公知の方法を使用することができ、例えば、フローサイトメトリーなどを用いることができる。
　前記ＣＸＣＲ１遺伝子を発現する単球の割合の変化を評価する際には、例えば、ＣＸＣＲ１遺伝子を発現する単球の割合を１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％以上増加または減少させた場合に、当該候補化合物を単球のＴ細胞増殖抑制作用を調節する化合物として同定することができる。ＣＸＣＲ１遺伝子を発現する単球の割合を増加させる化合物は、単球のＴ細胞増殖抑制作用を抑制する化合物として同定され得る。この際、当該変化について統計学的有意性を検討することが望ましい。このような統計学的有意性の検討に際しては、当業者に公知の方法を利用することができる。
　本発明のさらに別の側面は、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球のＴ細胞増殖抑制作用を調節する化合物をスクリーニングする方法に関し、当該方法は、
　（ｉ）単球前駆細胞集団に、候補化合物を添加する工程、
　（ｉｉ）前記単球前駆細胞集団から単球集団を分化させる工程、
　（ｉｉｉ）前記分化した単球集団においてＣＸＣＲ１遺伝子を発現する単球の割合を測定する工程、および
　（ｉｖ）前記候補化合物が、前記ＣＸＣＲ１遺伝子を発現する単球の割合を変化させた場合に、前記候補化合物を単球のＴ細胞増殖抑制作用を調節する化合物として同定する工程
を含む。
　上記単球前駆細胞集団は、公知の方法により、骨髄組織等から得ることができる。例えば、上記単球前駆細胞集団として、共通単球前駆細胞（ｃＭｏＰ）を用いることができるが、これに限定されない。このような単球前駆細胞集団は、細胞表面マーカーなどを利用して、公知の方法により取得することができる。
　前記単球前駆細胞集団から単球集団を分化させる際には、公知の方法を利用することができ、例えば、単球前駆細胞集団をＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－３、ＩＬ－６等のサイトカインの組み合わせの存在下で一定期間培養することにより、単球集団を分化させることができる。
　前記候補化合物は、単球前駆細胞集団から単球集団を分化させる工程の前に投与されてもよいし、分化させる工程の途中で投与されてもよい。
　前記分化した単球集団においてＣＸＣＲ１遺伝子を発現する単球の割合の変化を評価する際には、例えば、前記分化した単球集団においてＣＸＣＲ１遺伝子を発現する単球の割合を１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％以上増加または減少させた場合に、当該候補化合物を単球のＴ細胞増殖抑制作用を調節する化合物として同定することができる。分化した単球集団においてＣＸＣＲ１遺伝子を発現する単球の割合を増加させる化合物は、単球のＴ細胞増殖抑制作用を抑制する化合物として同定され得る。
　本明細書において、マーカー分子の発現に関して、「＋」の表記と「陽性」の表記とは同義であるものとする。同様に、「－」の表記と「陰性」の表記も、同義であるものとする。
　以上、本発明を実施するための形態を例示したが、上記実施形態はあくまでも例として示されるものであり、発明の範囲を限定することを意図するものではない。上記実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置換、変更を行うことができる。以下、更なる説明の目的として実施例を記載するが、本発明は当該実施例に限定されるものではない。
　以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
　＜方法＞
　（試験デザイン）
　組織再生を促進する能力を有する単球サブセットをｉｎ ｖｉｖｏで同定するため、細胞免疫学および動物研究における実験を設計および実施した。ｉｎ ｖｉｖｏ実験のサンプルサイズ（ｎ＝３～８）は、適切な数の実験用マウスを使用し、独立した反復を可能にしつつ、統計解析に最適なサイズとなるよう決定した。
　（マウス）
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（７～１２週齢）マウスは、ＣＬＥＡ　Ｊａｐａｎ，Ｉｎｃ．から入手した。Ｙｍ１－Ｖｅｎｕｓマウスを本発明者らの研究室で作製した（参考文献２）。すべてのマウスは、東京薬科大学実験動物施設においてＳＰＦ条件下で飼育した。ここに記載したマウスを用いた実験はすべて、東京薬科大学動物実験委員会（Ｌ２０－１８、Ｌ２１－１９）の承認を受け、適切なガイドラインおよび規則に従って実施した。
　（試薬）
　リポ多糖(ＬＰＳ；Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｏ１１１：Ｂ４）およびカタラーゼ、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、フェロスタチンをＳｉｇｍａ社から購入した。ネクロスタチン－１はＡｂｃａｍ社から購入した。７－アミノ－アクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５ストレプトアビジン、ブリリアントバイオレット４２１ストレプトアビジン、Ｆｉｘａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｓｔａｉｎｉｎｎｇ　Ｐｅｒｍm　Ｗａｓｈ　ＢｕｆｆｅｒおよびＧＭ－ＣＳＦをＢｉｏｌｅｇｅｎｄ社から購入した。４’，６－Ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２-ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）およびＬ－ＮＭＭＡをＤｏｊｉｎｄｏから購入した。Ｄｉｆｆ－Ｑｕｉｋ染色セットはシスメックス社から購入した。ｎｏｒ－ＮＯＨＡおよび１４００ＷはＣａｙｍａｎ社から購入した。Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫはペプチド研究所社から購入した。使用した抗体を表１にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（ヒト血液試料および単核細胞の単離）
　健常ボランティア由来の末梢血を用いた実験は、東京薬科大学倫理委員会の承認のもと（承認番号：２０－４）、ＴＡＣＥ（肝動脈化学塞栓術）治療患者検体を用いた実験は、東京医科歯科大学倫理審査委員会の承認を受けたプロトコール（承認番号：Ｇ２０２０－０１１）に従い、我が国の関連法に準拠して実施した。東京大学薬学倫理委員会または東京医科歯科大学倫理審査委員会で承認された手順に従い、全ドナーから書面によるインフォームドコンセントを得た。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健常ボランティアまたはＴＡＣＥ治療患者から得たサンプルのＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはＨｅｔａＳｅｐ（Ｖｅｒｉｔａｓ）密度勾配遠心法により分離した。細胞表面マーカー分析のために、ＰＢＭＣを、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１５、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１０、ＣＤ２４、ＣＤ６６ａ／ｃ／ｅ、ＣＤ６６ｂ、ＣＸＣＲ１、Ｓｉａｌｙｌ　LｅｗｉｓＸおよびＣＣＲ２に対する抗体で染色し、ＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ（ＢＤ）により分析した。データ収集後、ＦＣＳファイルを、ＵＭＡＰによる非線形次元圧縮および、Ｐｈｅｎｏｇｒａｐｈ－ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇを行った。ＵＭＡＰパラメーターは「ｎ＿ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ＝２０」、「ｍｉｎ＿ｄｉｓｔ＝０．５」および「ｍｅｔｒｉｃ＝“ｅｕｃｌｉｄｅａｎ”」を使用した。Ｐｈｅｎｏｇｒａｐｈパラメーターは「ｋ＝１７４」を使用した。単球およびＴ細胞単離のために、ＰＢＭＣを、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１５、ＣＤ１４およびＣＤ１６またはＣＤ３に対する抗体の混合物で染色し、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩ（ＢＤ）でそれぞれの細胞を分取した。
　（マウス骨髄細胞単離およびフローサイトメトリーならびにソーティング）
　マウス骨髄から単細胞懸濁液を調製するため、両側脛骨および大腿骨を氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（０．５％　ＢＳＡ／２ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＰＢＳ）中で、２６ゲージ針でフラッシュし、７０μｍナイロンメッシュに通した。単球の細胞表面マーカー分析のために、赤血球をＰｈａｒｍ　Ｌｙｓｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＪ）で溶解し、細胞をＣＤ１１５、Ｌｙ６Ｃ、ＣＤ８８およびＣＤ１５７に対する抗体の混合物で染色し、細胞をＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（ＢＤ）により分析した。前駆細胞の細胞表面マーカー分析のために、溶血済の骨髄細胞を、ｌｉｎｅａｇｅマーカー（以下「Ｌｉｎ」と称することもある。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ１．１、Ｂ２２０およびＴｅｒ１１９）および、ｃＫｉｔ、ＣＤ１０６、ＣＤ１６／３２、ＣＤ１１５、Ｌｙ６Ｃ、ＣＤ８１およびＣＤ１５７に対する抗体の混合物で染色し、ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（ＢＤ）により解析した。細胞内Ｙｍ１染色のために、溶血処理後の細胞を、ＣＤ１１５、Ｌｙ６Ｃ、ＣＤ８８およびＣＤ１５７に対する抗体とＥＭＡの混合物で染色した後、Ｆｉｘａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒで固定し、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｓｔａｉｎｉｎｎｇ　Ｐｅｒｍm　Ｗａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒ中で細胞膜透過処理した。固定／細胞膜透過処理した細胞を、抗Ｙｍ１またはアイソタイプ一致対照抗体およびＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８ストレプトアビジンで染色し、次いで、ＦＡＣＳ　Ｖｅｒｓｅによって細胞を分析した。
　単球の単離のために、骨髄細胞を抗ＣＤ１６／３２とインキュベートし、次いで、ｌｉｎｅａｇｅマーカー（ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ１．１、Ｂ２２０、およびＴｅｒ１１９）に対するビオチン化抗体のカクテルとインキュベートし、続いて、抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、ドイツ）とインキュベートした。Ｌｉｎ＋細胞はＡｕｔｏＭＡＣＳ　ｐｒｏ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いた磁気ソーティングによって除去した。Ｌｉｎ－細胞を、ＣＤ１１ｂ、Ｌｙ６Ｇ、ＣＤ１１５、Ｌｙ６Ｃ、ＣＤ８８およびＣＤ１５７に対する抗体の混合物で染色した後、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩ（ＢＤ）を用いて分取した。
　各種前駆細胞単離のために、骨髄細胞を抗ＣＤ１６／３２とインキュベートし、次いで、ｌｉｎｅａｇｅマーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ１．１、Ｂ２２０、Ｔｅｒ１１９、Ｌｙ６Ｇ、Ｓｃａ－１、ＣＤ１１ｂ、およびＧｒ－１）に対するビオチン化抗体のカクテルとインキュベートし、続いて、抗ビオチンマイクロビーズとインキュベートした。Ｌｉｎ＋細胞は磁気ソーティングによって除去した。Ｌｉｎ－細胞を、ＣＤ１１７、ＣＤ１３５、ＣＤ１６／３２、ＣＤ１０６、Ｌｙ６Ｃ、ＣＤ１１５、ＣＤ８１およびＣＸ３ＣＲ１に対する抗体の混合物で染色した後、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩ（ＢＤ）を用いて分取した。
　（ＬＥＧＥＮＤＳｃｒｅｅｎによるスクリーニング）
　Ｙｍ１＋単球およびＹｍ１－単球の細胞表面マーカー発現を検証するために、赤血球溶解骨髄細胞を抗ＣＤ１６／３２とインキュベートし、次いでバックボーンマーカー（ＣＤ１１５、Ｌｙ６Ｃ、Ｌｙ６ＧおよびＣＤ１１ｂ）に対する抗体のカクテル中で懸濁した。次に、ＬＥＧＥＮＤＳｃｒｅｅｎ　Ｍｏｕｓｅ　ＰＥキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いて、２５５種類の異なるＰＥ結合抗体で細胞を染色した。これらの細胞をＦＡＣＳ　Ｖｅｒｓｅ（ＢＤ）により分析した。死細胞はＤＡＰＩ染色により除外した。
　骨髄における単球、好中球およびこれらの前駆細胞における表面マーカー発現を検証するために、ナイーブおよびＬＰＳ投与Ｙｍ１－Ｖｅｎｕｓマウス骨髄細胞を抗ＣＤ１６／３２とインキュベートし、次いでｌｉｎｅａｇｅマーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ１．１、Ｂ２２０、Ｔｅｒ１１９およびＬｙ６Ｇ）に対するビオチン化抗体とインキュベートした後、抗ビオチンマイクロビーズとインキュベートした。Ｌｉｎ＋細胞は磁気ソーティングによって除去した。Ｌｉｎ＋細胞を、バックボーンマーカー（ＣＤ３４、ｃ－Ｋｉｔ、ＣＤ１３５、ＣＤ１８２、Ｌｙ６Ｃ、ＣＤ１１５、ＣＤ１０６、ＣＤ８８、ＣＤ１５７、ＣＤ１６／３２およびＣＤ１１ｂ）およびＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５ストレプトアビジンに対する抗体を含む緩衝液中に懸濁した。次いで、ＬＥＧＥＮＤＳｃｒｅｅｎ Ｍｏｕｓｅ ＰＥキットを用いて、２５５種類の異なるＰＥ結合抗体で細胞を染色した。これらの細胞を４レーザーＦＡＣＳＡｒｉａ Ｆｕｓｉｏｎ （ＢＤ）により分析した。死細胞は７－ＡＡＤ染色により除外した。データ収集後、ＦＣＳファイルをＦｌｏｗＪｏで個別に解析し、単一かつ生細胞およびＬｉｎ細胞を個々のＦＣＳファイルにエクスポートした。これらのＦＣＳファイルを用いてＩｎｆｉｎｉｔｙＦｌｏｗパイプライン（参考文献９）を実施した。
　ヒト単球および好中球の細胞表面マーカー発現を検証するために、ＨｅｔａＳｅｐ処理ＰＢＭＣを抗ＣＤ１６／３２抗体とともにインキュベートし、次いでバックボーンマーカー（ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６およびＨＬＡ－ＤＲ）に対する抗体のカクテルに懸濁した。次に、ＬＥＧＥＮＤＳｃｒｅｅｎ　Ｈｕｍａｎ　ＰＥキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いて、３６１種類の異なるＰＥ結合抗体で細胞を染色した。これらの細胞をＦＡＣＳ　Ｖｅｒｓｅ（ＢＤ）により分析した。死細胞はＤＡＰＩ染色により除外した。
　（ＩｎｆｉｎｉｔｙＦｌｏｗパイプライン）
　ＩｎｆｉｎｉｔｙＦｌｏｗパイプラインはＲパッケージ「ｉｎｆｉｎｉｔｙＦｌｏｗ」（ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｇｉｔｈｕｂ.ｃｏｍ/ｅｂｅｃｈｔ/ｉｎｆｉｎｉｔｙＦｌｏｗ)）を用いて実施した。入力データは、Ｒパッケージ「ｆｌｏｗＣｏｒｅ」のデフォルトパラメーターでロジクル変換した。ファイルごとに、データの半分をランダムに選出し、Ｒライブラリー「ＸＧＢｏｏｓｔ」のデフォルトパラメーターで学習され、２５５個のＸＧＢｏｏｓｔ回帰モデルが作成された。各モデルについて、ＰＥ結合マーカーの強度を応答変数として、バックボーンマーカーの強度を独立変数として用いた。各イベントについて、各ＸＧＢｏｏｓｔ回帰モデルを、関連するバックボーンマーカー強度のベクトルに適用して、２５５個のＰＥ結合マーカーの強度を予測した。２５５個のファイルのそれぞれについて、これらの回帰値を線形値に変換し、バックボーンおよびＰＥマーカー値と連結した。そして、単一ファイルとして出力した。
　（学習評価）
　回帰モデルのパフォーマンスを評価するために、最初に各アイソタイプコントロール抗体のＰＥ強度を２値化した。この数値と予測された発現強度の連続ベクトルを使用して、曲線下領域（ＡＵＣ）を計算し、ＡＵＣが０.７５（ナイーブ）または０.６８（ＬＰＳ処理）未満のデータを削除した。
　（次元圧縮）
　次元圧縮には、ＦｌｏｗＪｏ ｐｌｕｇｉｎｓを用いたＵＭＡＰアルゴリズムを用いた。ナイーブサンプルのパラメーターは「ｎ＿ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ＝１２」、「ｍｉｎ＿ｄｉｓｔ＝０．２」、「ｍｅｔｒｉｃ＝“ｅｕｃｌｉｄｅａｎ”」、ＬＰＳ処理したサンプルのパラメーターは「ｎ＿ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ＝２５」、「ｍｉｎ＿ｄｉｓｔ＝０．４」、「ｍｅｔｒｉｃ＝“ｅｕｃｌｉｄｅａｎ”」を用いた。
　（擬時系列解析）
　クラスタリングは、ｐｙｔｈｏｎパッケージ「ｐａｒｃ」を用いて実施した。パラメーターは、ｋｎｎ＝２０（ナイーブ）または４０（ＬＰＳ処理）を用いた。上記の手法で定義されたクラスターについて、Ｒパッケージ「Ｓｌｉｎｇｓｈｏｔ」を用いた擬時系列解析を行った。Ｓｌｉｎｇｓｈｏｔ解析では、ＩｎｆｉｎｉｔｙＦｌｏｗで予測したＰＥ強度を使用した。この解析は、造血幹細胞と骨髄系前駆細胞を含むクラスターを開始クラスターとして、半教師ありの方法で行われた。
　（ｔｏｔａｌＲＮＡ抽出ならびにｑＲＴ－ＰＣＲ）
　セルソーターにより分取した細胞は、ＴＲＩｚｏｌ ＬＳ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に回収し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した。ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてｃＤＮＡを合成し、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ （ＴＯＹＯＢＯ）によってｑＲＴ－ＰＣＲを行った。発現レベルは１８ｓリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）で標準化した。使用したプライマーの配列を表２－１および表２－２にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　（ＲＮＡシーケンス解析）
　ＲＮＡ－シーケンスライブラリーの調製および配列決定
　セルソーターにより分取した細胞から、ＴＲＩｚｏｌ　ＬＳ付属のプロトコールに従ってｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡを合成後、ＳＭＡＲＴ－Ｓｅｑ ＨＴキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて増幅し、Ｎｅｘｔｒａ　ＸＴキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーを調製した。ＮｅｘｔＳｅｑ　５００プラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）７５ｂｐ　ｓｉｎｇｌｅ　ｒｅａｄで配列を解析した。各細胞サンプルは健常ボランティアから提供された。
　（データ解析）
　シークエンシングリードをＢｏｗｔｉｅソフトウェア（ｖ．１．１．２）のヒト参照ゲノム配列（ｈｇ３８／ＧＲＣ３８）にアラインメントした。Ｐｉｃａｒｄツールを使用して、読み取りの重複を取り除いた（ｈｔｔｐ://ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ.ｇｉｔｈｕｂ.ｉｏ/ｐｉｃａｒｄ)。Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓソフトウェアを用いて遺伝子発現量を定量化した。解析にはＦＰＫＭ（ｆｌａｇｍｅｎｔｓ　ｐｅｒ　ｋｉｌｏｂａｓｅ　ｏｆ　ｍｉｌｌｉｏｎ）値を使用した。Ａｌｔａｎａｌｙｚｅソフトウェアで主成分分析、階層的クラスタリング分析を行った。遺伝子オントロジー（ＧＯ）濃縮分析をＰＡＮＴＨＥＲ分類システム（参考文献１０および１１）で行った。
　（細胞培養と分析）
　選別した２．５ｘ１０３個の前駆細胞を、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（和光）および２０ｎｇ／ｍｌ組換マウスＧＭ－ＣＳＦ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を添加したＤ－ＭＥＭで培養した。培養後、細胞をＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（ＢＤ）により分析した。
　（生体内移植）
　Ｙｍ１－Ｖｅｎｕｓマウスから分取した前駆細胞を２０μｌのＰＢＳに再懸濁し、Ｌｙ５．１マウスの骨腔に注入した。移植の２または３日後に、Ｌｙ５．１マウスから骨髄を採取し、ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（ＢＤ）により分析した。
　（形態学的分析）
　分取したヒトＣＸＣＲ１陽性ＣＤ１４陽性単球、ヒトＣＸＣＲ１陰性ＣＤ１４陽性単球およびヒト好中球の形態をギムザ染色により観察した。１×１０４個の単球、または２×１０４個の好中球を、８００ｒｐｍで５分遠心してスライドガラスに定着させ、その後、メーカーの手順に従ってＤｉｆｆ－Ｑｕｉｋ（Ｄａｄｅ　Ｂｅｈｒｉｎｇ）で染色した。
　（ｓｃＲＮＡｓｅｑデータ解析）
　ヒトＰＢＭＣのｓｃＲＮＡｓｅｑ解析のために、ＧＥＯからデータを取得した。解析は、Ｒパッケージ「Ｓｅｕｒａｔ（ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０．３）」を用いた。ＰＣＡ解析により、２０個の成分を抽出した。Ｓｅｕｒａｔパッケージ「ＦｉｎｄＣｌｕｓｔｅｒｓ」の共有最近傍（SNN）モジュール性最適化ベースのクラスタリングアルゴリズムを使用し、パラメーターｒｅｓｏｌｕｓｔｉｏｎ＝１．１を使用して、１０個のクラスターを定義しました。次元削減分析では、ｓｅｕｒａｔパッケージ「ＲｕｎＵＭＡＰ」のＵＭＡＰアルゴリズムをデフォルトのパラメーターで実施しました。クラスター内の細胞を他のすべてのクラスター内の細胞と比較して特定のマーカーを識別するために、Ｓｅｕｒａｔパッケージ「ＦｉｎｄＡｌｌＭａｒｋｅｒｓ」を使用し、パラメーターｐｏｓ＝ＴＲＵＥ、ｍｉｎ.ｐｃｔ ＝ ０.２５、ｌｏｇｆｃ.ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝０.２５で実施した。ヒートマップは Ｓｅｕｒａｔパッケージ「ＤｏＨｅａｔｍａｐ」を使用した。
　（サイトカインアレイとＥＬＩＳＡ）
　分取したヒトＣＸＣＲ１陽性ＣＤ１４陽性単球、およびヒトＣＸＣＲ１陰性ＣＤ１４陽性単球を、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ中で培養した。サイトカインアレイ用に、１×１０５個で２４穴プレートに播種した。培養２４時間後、培養上清を回収し、ヒトサイトカインアレイキット（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてサイトカインアレイを実施した。ＥＬＩＳＡでは、単球を２ｘ１０４個で９６穴プレートに播種した。２４時間後、培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ　ＭＡＸ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｋｉｔ（ＩＬ－６およびＴＮＦα、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）またはＥＬＩＳＡ　ＭＡＸ　Ｄｅｌｕｘｅ Ｓｅｔ（ＣＣＬ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で定量した。
　（ヒトＴ細胞と単球のｉｎ　ｖｉｔｒｏ共培養）
　分取した１ｘ１０４個のＣＤ３陽性Ｔ細胞と選別した単球を、１：２の比または各図で示した比で、抗ＣＤ３（５μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ２８（５μｇ／ｍｌ）抗体でコーティングした９６穴プレートで共培養した。細胞は１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび５０μＭの２－ＭＥを添加したＤＭＥＭ中で培養した。
　細胞接触試験のために、Ｔ細胞をＴｒａｎｓｗｅｌｌプレートの下部チャンバー（３μｍ孔、ポリカーボネート膜、コーニング）に加え、単球を上部チャンバーに加えた。各種阻害剤添加実験では、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ；１ｍＭ）、１４００Ｗ（２μＭ）、ｎｏｒ－ＮＯＨＡ（５μＭ）、カタラーゼ（２０Ｕ／ｍｌ）、Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ（２０μＭ）、ネクロスタチン－１（Ｎｅｃ－１；５０μＭ）、フェロスタチン（２μＭ）またはＣＡ－０７４Ｍｅ（１０μＭ）の阻害剤を添加した。４日間の培養後、ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（ＢＤ）によって細胞を分析した。
　（統計解析）
　データは、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて統計解析し、分散分析（ＡＮＯＶＡ）とその後の多重比較、または対応のあるもしくは対応のないｔ検定のいずれかによって分析した。Ｐ値＜０．０５を有意とみなした。
＜結果＞
　図１の説明
　（図１Ａ）Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球上に高発現する表面マーカーの同定。Ｙｍ１－Ｖｅｎｕｓマウスの骨髄の単球（Ｍｏ）と好中球（Ｎｅｕ）上の表面分子の発現をフローサイトメトリー（左上）で調べた。Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球（青色）とＹｍ１－Ｌｙ６Ｃ＋単球（赤色、左下）の間で発現量に差のある表面分子を選択した。表面マーカーの発現量を示す散布図（右）。
　（図１Ｂ）ＣＤ８８およびＣＤ１５７は、Ｙｍ１－単球と比較してＹｍ１＋単球で発現レベルが高い。ナイーブまたはＬＰＳ投与Ｙｍ１‐Ｖｅｎｕｓマウスの骨髄のＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球、Ｙｍ１－Ｌｙ６Ｃ＋単球または好中球（Ｎｅｕ）上のＣＤ８８およびＣＤ１５７の発現量をフローサイトメトリーにより調べた。
　（図１Ｃ）ＣＤ８８およびＣＤ１５７の二重陽性単球とＹｍ１＋単球は類似の遺伝子発現パターンを示す。ＬＰＳ投与Ｙｍ１－Ｖｅｎｕｓマウス（上）の骨髄からＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球またはＹｍ１－Ｌｙ６Ｃ＋単球を分取した。ＬＰＳ投与したＷＴマウス（下）の骨髄からＬｙ６Ｇ－Ｌｙ６Ｃ＋ＣＤ１１５＋ＣＤ８８＋ＣＤ１５７＋単球およびＣＤ８８－ＣＤ１５７－単球を分取した。以前の研究（参考文献２）で同定されたＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球関連遺伝子の発現レベルを、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球およびＹｍ１－Ｌｙ６Ｃ＋単球において（上）、または、ＣＤ８８およびＣＤ１５７二重陽性単球ならびにＣＤ８８およびＣＤ１５７二重陰性単球において（下）、ｑＲＴ－ＰＣＲによって定量した。
　（図１Ｄ）ＣＤ８８およびＣＤ１５７発現は、Ｌｙ６Ｃ＋単球におけるＹｍ１タンパク質発現と正相関する。細胞内Ｙｍ１タンパク質を、本発明者らの以前の報告（参考文献２）に記載されたプロトコールを用いて染色した。
　（図１Ｅ）いくつかの好中球マーカーは、Ｙｍ１＋単球で高発現する。好中球で高発現している表面マーカーの、好中球（灰色）、Ｙｍ１＋単球（赤）、Ｙｍ１－単球（青）における発現量をフローサイトメトリーにより調べた。
　（図１Ｆ）ＣＤ８８およびＣＤ１５７は、Ｙｍ１－単球と比較するとＹｍ１＋単球上で高発現する。ナイーブまたはＬＰＳ投与Ｙｍ１－Ｖｅｎｕｓマウスの末梢血を採取し、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球、Ｙｍ１－Ｌｙ６Ｃ＋単球または好中球（Ｎｅｕ）上のＣＤ８８およびＣＤ１５７の発現量をフローサイトメトリーにより調べた。
　（図１Ｇ）ＣＤ８８およびＣＤ１５７発現は、末梢血中のＬｙ６Ｃ＋単球におけるＹｍ１タンパク質発現と正相関する。細胞内Ｙｍ１タンパク質を、本発明者らの以前の報告（参考文献２）に記載されたプロトコールを用いて染色した。
　図２の説明
　（図２Ａ）実験のワークフロー
ナイーブマウスおよびＬＰＳ投与Ｙｍ１－Ｖｅｎｕｓマウスの骨髄細胞を１１種類のバックボーンマーカーと、２５５種類のＰＥ結合抗体（ＬＥＧＥＮＤＳｃｒｅｅｎマウスＰＥキット）のひとつで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。２５５種類のＦＣＳファイルのデータを、ＩｎｆｉｎｉｔｙＦｌｏｗパイプライン（参考文献９）で分析し、ＵＭＡＰアルゴリズムを用いて次元圧縮し、ＵＭＡＰ平面上に描出した。
　（図２Ｂ）ナイーブＹｍ１－Ｖｅｎｕｓマウスの骨髄成熟細胞および前駆細胞のクラスタリング解析。既知の前駆細胞マーカーと成熟細胞マーカー（図２Ｋ）と、ＵＭＡＰ平面上の共局在を元に細胞集団名を記載した。前駆細胞と成熟細胞が発現するｃ－Ｋｉｔ(左）とＹｍ１（右）の発現量をヒートマップで示す。定常状態では、ｃＭｏＰはＭＤＰと連続的に配置される。
　（図２Ｃ）ＬＰＳ投与マウスの骨髄成熟細胞および前駆細胞のクラスター分析
定常状態（図２Ｂ）と比較して、ＭＤＰが減少し、ｃＭｏＰとＭＤＰとの連絡が希薄となり、反対に、ｃＭｏＰとｐｒｏＮｅｕ１とのつながりが増強している。
　（図２Ｄ）定常状態と炎症状態では、異なる前駆細胞からｃＭｏＰが分化する。ナイーブ骨髄（左）のｐｓｅｕｄｏ－ｔｉｍｅ（ＳＬＩＮＧＳＨＯＴ）解析では、ｃＭｏＰはＭＤＰの下流に位置している。これに対しＬＰＳ投与マウス（右）の骨髄では、ｃＭｏＰはｐｒｏＮｅｕ１から分化すると予測される。
　（図２Ｅ）ナイーブマウス（上）およびＬＰＳ投与マウス骨髄細胞（下）のＣＤ８１およびＣＸ３ＣＲ１発現量をヒートマップであらわしている。ＬＰＳ投与マウスの骨髄ｃＭｏＰは、ナイーブマウスのそれと比較して、ＣＤ８１を高発現し反対にＣＸ３ＣＲ１を低発現する。
　（図２Ｆ）ナイーブマウス（上）またはＬＰＳ投与（下）野生型マウス骨髄のｃＭｏＰにおけるＣＤ８１およびＣＸ３ＣＲ１の発現をフローサイトメトリーで解析した。ナイーブ骨髄のｃＭｏＰでは、ＣＸ３ＣＲ１発現が高くＣＤ８１発現が低い。これとは反対に、炎症条件下のｃＭｏＰは、ＣＸ３ＣＲ１発現が低くＣＤ８１発現が高い。
　（図２Ｇ）ＧＭＰ－ｐｒｏＮｅｕ１－ＣＤ８１＋ＣＸ３ＣＲ１－ｃＭｏＰをインビトロでＧＭ－ＣＳＦ存在下で培養すると、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球が分化する。これに対し、ＭＤＰ－ＣＤ８１－ＣＸ３ＣＲ１ ｃＭｏＰまたはｐｒｏＮｅｕ２からはほとんど分化しない。ＧＭＰ、ｐｒｏＮｅｕ１、ＣＤ８１＋ＣＸ３ＣＲ１－ｃＭｏＰ、ＭＤＰ、ＣＤ８１－ＣＸ３ＣＲ１＋ｃＭｏＰおよびｐｒｏＮｅｕ２を、ナイーブＹｍ１－Ｖｅｎｕｓマウスの骨髄から分取した。これらの前駆細胞を、ＧＭ－ＣＳＦ存在下で２日間または３日間培養した。Ｌｙ６Ｇ＋好中球、Ｌｙ６Ｇ－Ｌｙ６Ｃ＋ＣＤ１１５単球におけるＹｍ１発現をフローサイトメトリーにより調べた。ＧＭＰ、ｐｒｏＮｅｕ１およびＣＤ８１＋ＣＸ３ＣＲ１－ｃＭｏＰは、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球を生じた。ＭＤＰおよびＣＤ８１－ＣＸ３ＣＲ１＋ｃＭｏＰもＬｙ６Ｃ単球を生じたが、これらの単球はほとんどＹｍ１陰性であった。ｐｒｏＮｅｕ２は単球を産生する能力がなかった。点線は野生型コントロールを示す。
　（図２Ｈ）ＣＤ８１＋ＣＸ３ＣＲ１-ｃＭｏＰは、ｐｒｏＮｅｕ１に分化するが、ＭＤＰは分化しない。ナイーブＹｍ１－Ｖｅｎｕｓマウスの骨髄からＧＭＰとｐｒｏＮｅｕ１を分取し、図２Ｇと同様の方法でｉｎ ｖｉｔｒｏで１日間培養した。ｃＭｏＰにおけるＣＤ８１とＣＸ３ＣＲ１の表面発現をフローサイトメトリーで調べた。
　（図２Ｉ）ＧＭＰ－ｐｒｏＮｅｕ１－ＣＤ８１＋ＣＸ３ＣＲ１－ｃＭｏＰは、インビボでＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球に分化する。図２Ｇと同様のクライテリアで、ナイーブＹｍ１－Ｖｅｎｕｓマウスの骨髄から分取した前駆細胞を、ＬＰＳ投与コンジェニックマウスの骨髄に移入した。移入１日後にＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の分化を調べた。ＧＭＰ、ｐｒｏＮｅｕ１およびＣＤ８１＋ＣＸ３ＣＲ１－ｃＭｏＰは、移入２～３日後に、生体内でＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球に分化した。ＭＤＰまたはＣＤ８１－ＣＸ３ＣＲ１＋ｃＭｏＰはＹｍ１陽性単球にほとんど分化せず、ｐｒｏＮｅｕ２は主に好中球にのみ分化し、単球を産生しなかった。
　（図２Ｊ）炎症条件下における単球と好中球の分化経路の模式図。ＧＭＰは、ｐｒｏＮｅｕ１とＣＤ８１＋ＣＸ３ＣＲ１－ｃＭｏＰを介してＹｍ１＋単球に分化する。
　（図２Ｋ）ＵＭＡＰ上の各細胞集団が、既知のどの細胞に相当するかを示した図。図２Ａ～２Ｃの解析で得られた結果と、これまでに報告されている前駆細胞を含む各種免疫細胞の表面マーカー発現を照合することにより、それぞれのクラスターがどの細胞に該当するかを解析した。
　（図２Ｌ）図２Ｈ～２Ｉに用いた各種細胞を分取するためのソーティングクライテリアを示した図。
　図３の説明
　（図３Ａ）ヒト末梢血の単球と比較して好中球上で高発現するマーカーの同定。ヒト末梢血好中球および単球（左）を定義するためのクライテリア。好中球と単球における表面マーカーの発現量を散布図で示した（右）。
　（図３Ｂ）ヒト末梢血白血球のクラスター解析。ＣＤ１４および／またはＣＤ１６を発現する好中球および単球を定義するためのクライテリア（上段）。前駆細胞と成熟細胞のＵＭＡＰ次元圧縮とフェノグラムクラスタリングを示した（左下）。ＣＸＣＲ１発現量のヒートマップ（右下）。
　（図３Ｃ）好中球、ＣＤ１４＋単球、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球およびＣＤ１６＋単球のソーティングクライテリア。単球分画中のＣＸＣＲ１＋細胞（赤色）の割合を示す（右側）。青色の領域はアイソタイプのコントロールを表す。
　（図３Ｄ）ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球、ＣＸＣＲ１－ＣＤ１４＋単球および好中球のギムザ染色。ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球は、ＣＸＣＲ１－ＣＤ１４＋単球と同様、大型の単葉核を有するが、好中球に典型的なアズール顆粒を欠く。スケールバーは２０μｍを表す。
　（図３Ｅ）図３Ａで示した各種表面マーカーのＣＤ１４＋単球における発現をフローサイトメトリーにより解析した。
　図４の説明
　健常ボランティアの末梢血白血球をＨｅｔａＳｅｐ密度勾配遠心法により濃縮した。好中球、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球、およびＣＤ１６＋単球を、図３Ｃに示す基準に基づいて、セルソーターにより分取した。全遺伝子発現をＲＮＡ－ｓｅｑ解析により定量した。
　（図４Ａ）４つの単球および好中球の主成分分析（ＰＣＡ）。
　（図４Ｂ）５つの細胞における遺伝子発現を階層的クラスター分析した。樹状図は、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球が他の単球よりも好中球に近縁なことを示している。
　（図４Ｃ）ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球とＣＸＣＲ１－ＣＤ１４＋単球の階層的クラスター分析と遺伝子マーカーの抽出。
　（図４Ｄ）ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球で強発現する遺伝子のＧｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ解析。ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球では、「顆粒球」および「好中球」の活性化に関する遺伝子群が高発現する。
　（図４Ｅ）図４Ｃで同定された、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球強発現遺伝子のいくつかが、同細胞において確かに強発現することが、定量ＰＣＲでも確認できた。ｎ＝３例。*ｐ＜０．０５。
　（図４Ｆ）一細胞ＲＮＡシークエンス解析のデータを、ＵＭＡＰアルゴリズムを用いて再解析した（左、参考文献８）。ＵＭＡＰ解析で定義された各クラスターにおける、相対発現量上位１５個の遺伝子発現量のヒートマップ（右）。
　（図４Ｇ）一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ解析（図４Fのクラスター１、５、２、８、左）における遺伝子発現と、図３Ｃで定義されたソーティングクライテリアに基づいて分取した単球サブセットの遺伝子発現をヒートマップで比較した。すなわち、一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ解析によって定義されたクラスター１、５、２および８が、ＣＤ１６＋単球、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球、ＣＸＣＲ１－ＣＤ１４＋単球およびＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球にそれぞれ相当する。
　（図４Ｈ）好中球で高発現し、かつ、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球よりも、ＣＸＣＲ１－ＣＤ１４＋単球で、発現の高い３種の遺伝子の各種細胞における発現量を示す（左）。ＣＡＭＫＤの定量ＰＣＲ解析（右）。この結果は、好中球で高発現するすべての遺伝子の発現がＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球でも高いわけではないことを示している。
　図５の説明
　（図５Ａ）ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球とＣＸＣＲ１－ＣＤ１４＋単球との間で産生量の異なるサイトカインとケモカインを、サイトカインアレイにより同定した。ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球（左下）ではＩＬ－６および他のいくつかの炎症誘発性サイトカインの産生が、ＣＸＣＲ１－ＣＤ１４＋単球よりも低い（左上）ことが示された。右図は左図の平均信号強度を数値化したグラフ。白いバーは、ＣＸＣＲ１－ＣＤ１４＋単球、黒いバーはＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を示す。健常ボランティア１名の結果を示す。
　（図５Ｂ）図５Ａで同定されたＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球による炎症誘発性サイトカイン（ＩＬ－６およびＴＮＦα）の発現低下をＥＬＩＳＡ法で確認した。健常ボランティアｎ＝４～５。*ｐ＜０．０５、ｎｓ、有意差なし。
　（図５Ｃ）ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球は、Ｔ細胞の増殖を細胞数依存的に抑制する。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で刺激されたＴ細胞を、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球またはＣＸＣＲ１－ＣＤ１４＋単球と４日間共培養した。Ｔ細胞数はフローサイトメトリーで定量した。コントロールはＴ細胞のみで培養したときのＴ細胞数を表す。同条件で３回実施した実験の代表例を示す。Ｔ細胞単独で培養した場合に対する平均相対数とＳ．Ｄ．を示す。Ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ。*ｐ＜０．０５．健常ボランティアの代表的な結果を示した。
　（図５Ｄ）ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球によるＴ細胞増殖の抑制は、細胞間接触依存性である。Ｔ細胞を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌデバイスの下部チャンバーで、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で刺激した。同一ウェルの上部チャンバー(Ｎｏ Ｃｏｎｔａｃｔ)または下部チャンバー（Ｃｏｎｔａｃｔ）に単球を添加し、４日間培養した。コントロールは単球のないＴ細胞を表す。対照に対する平均相対数をＳ．Ｄ．とともに表示した。Ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡで示す。*ｐ＜０．０５．健常ボランティア３名から得られた代表的な結果を示す。
　（図５Ｅ）カタラーゼ（左）またはＮｅｃ－１（右）の追加は、ＣＸＣＲ１＋単球によるＴ細胞抑制を解除した。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で刺激したＴ細胞を、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球またはＣＸＣＲ１－ＣＤ１４＋単球と、様々な阻害剤の存在下または非存在下（対照）で４日間共培養した。対照に対する平均相対数をＳ．Ｄ．とともに表示した。Ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ。*ｐ＜０．０５．健常ボランティア２名から得られた代表的な結果を示す。
　（図５Ｆ）ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球とT細胞の共培養系の上清は、別のウェルで抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で刺激したＴ細胞の増殖を抑制しなかった。この結果は、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球によるＴ細胞増殖の抑制因子が、同細胞の培養上清中には存在しないことを示している。
　（図５Ｇ）カタラーゼ（左）またはＮｅｃ－１（右）の追加は、ＣＸＣＲ１＋単球によるＴ細胞増殖抑制を濃度依存的に解除した。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で刺激したＴ細胞を、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球またはＣＸＣＲ１－ＣＤ１４＋単球と、様々な阻害剤の存在下または非存在下（対照）で４日間共培養した。カタラーゼ（左）またはＮｅｃ－１（右）が濃度依存的に、ＣＸＣＲ１＋単球によるＴ細胞増殖抑制効果を解除することが示された。
　図６の説明
　（図６Ａ）ＣＤ１４＋単球に占める、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球の割合は、肝癌患者においてＴＡＣＥ（肝動脈化学塞栓療法）後に上昇した。ＴＡＣＥ前（上段）とＴＡＣＥ後３～４日（下段）の癌患者の末梢血をフローサイトメトリーで分析した。末梢血ＨＬＡ－ＤＲ＋ＣＤ１５－ＣＤ１４＋ＣＸＣＲ１＋単球（赤色）のＦＡＣＳプロットを示す。青色の領域はアイソタイプコントロールを表している。
　（図６Ｂ）図６Ａで観察されたＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球の増加が、統計的に有意なことを示す。ＣＤ１４＋単球中のＣＸＣＲ１＋細胞の割合をＴＡＣＥ前後で比較した。ｎ＝６例。*ｐ＝０．０１６６。
　（図６Ｃ）ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球の割合はＴＡＣＥ後一過性に上昇した。
　（図６Ｄ）ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球の割合は好中球数およびＣＲＰと正相関する。ｒ；ピアソン相関係数。
　（図６Ｅ）組織傷害後に増加するＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球は、健常ボランティアで観察された（図５Ｃ）のと同様、Ｔ細胞の増殖を抑制した。末梢血Ｔ細胞を、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球またはＣＸＣＲ１－ＣＤ１４＋単球存在下で４日間共培養した。Ｔ細胞単独で培養した場合の細胞数（対照）に対する平均相対細胞数をＳ．Ｄとともに表示した．*ｐ＜０．０５。一人の患者の結果を示した。
　（図６Ｆ）ＣＤ６６ａ／ｃ／ｅおよびＣＤ６６ｂの発現量は、ＴＡＣＥ後のＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球で有意に高い。＊ｐ＜０．０５を有意差ありと判定した、ｎ＝５例。
　（図６Ｇ）ＣＤ６６ａ／ｃ／ｅおよびＣＤ６６ｂの発現量は好中球数および血清ＣＲＰと正の相関を示した。ｒ；ピアソン相関係数。
　＜結果の詳細＞
　図１：Ｙｍ１ － Ｌｙ６Ｃ ＋ 単球と比較してＹｍ１ ＋ Ｌｙ６Ｃ ＋ 単球上での発現が高い表面マーカーの同定
　以前の研究で、マウスＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋制御性単球は免疫制御性の機能を有すること、ならびに、マウスの炎症後期にその細胞数が急速に増加することを示した。Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球は、古典的Ｙｍ１－Ｌｙ６Ｃ＋単球から、Ｒｅｔｎｌｇ、Ｌｃｎ２、Ｌｔｆのようないくつかの好中球関連遺伝子の発現量で識別することができる。トランスクリプトーム解析は細胞の種類を決定するのに有用な手段となるが、それ以上の機能解析はできない。この問題を解決する１つの方法として、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球とＹｍ１－Ｌｙ６Ｃ＋単球とを識別することのできる表面マーカーを同定することを試みた。この目的のために、フローサイトメトリーを用いて、２５５種類の表面分子について、２つの単球の発現レベルを比較した。この解析により、Ｙｍ１－Ｌｙ６Ｃ＋単球（図１Ａおよび補足図１Ａ）と比較したとき、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球で高く発現するいくつかの表面マーカーが同定された。これらのマーカーの中で、ＣＤ８８とＣＤ１５７の組合せがＹｍ１（Ｖｅｎｕｓ）＋単球およびＹｍ１単球を効率的に識別することを見出した。ナイーブマウスの骨髄におけるＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の低頻度に一致して、ナイーブマウスの骨髄におけるＬｙ６Ｃ＋単球のほとんどはＣＤ８８およびＣＤ１５７陰性であった（図１Ｂ、上段）。Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球数は、マウスでのＬＰＳ投与に応じて急速に増大する。そのマウスでは、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の５７．１％がＣＤ８８およびＣＤ１５７の二重陽性であった（図１Ｂ、下列）。対照的に、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の２４．４％のみがＣＤ８８およびＣＤ１５７の二重陽性であった（図１Ｂ、下列）。これらの知見は、ＣＤ８８とＣＤ１５７がＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球によって選択的に発現されることを示している。文献で報告されているように、ＣＤ８８およびＣＤ１５７は好中球によっても高度に発現され（図１Ｂおよび図１Ｅ）、このことは、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球が好中球と共通の特徴を有することを示している。骨髄と同様に、Ｌｙ６Ｃ＋単球のＹｍ１発現は末梢血のＣＤ８８およびＣＤ１５７と正の相関を示したが、ＬＰＳ投与マウスのＹｍ１－のＬｙ６Ｃ＋単球の一部は、ＣＤ８８、ＣＤ１５７が二重陽性であった（図１Ｆ）。さらに、ＣＤ８８＋ＣＤ１５７＋単球が事実上Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球であることを確認するために、ＬＰＳ投与野生型マウスの骨髄からＣＤ８８＋ＣＤ１５７＋Ｌｙ６Ｃ＋単球およびＣＤ８８－ＣＤ１５７－Ｌｙ６Ｃ＋単球を精製し、２つの単球間で、遺伝子発現プロファイルを比較した。ｑＲＴ－ＰＣＲ解析により、Ｙｍ１（Ｃｈｉｌ３）ｍＲＮＡの発現レベルおよびいくつかのＹｍ１＋制御性単球規定遺伝子（参考文献２）に関し、ＣＤ８８＋ＣＤ１５７＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の方がＣＤ８８－ＣＤ１５７－Ｌｙ６Ｃ＋単球よりも発現が高いことが検証された（図１Ｃ）。ビオチン化抗Ｙｍ１抗体（クローン７Ｄ４、本発明者らが樹立し、ビオチン化した）を用いたＹｍ１タンパク質の細胞内染色は、骨髄および末梢血の両方において、ＣＤ８８およびＣＤ１５７発現レベルとＹｍ１タンパク質発現レベルとの間に正の相関があることを明らかにした（図１Ｇ）。まとめると、これらの知見は、ＣＤ８８とＣＤ１５７との組合せが、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋制御性単球の効率的な精製を可能にし、さらに表現型解析を可能にすることを示している。
　図２－１：ＩｎｆｉｎｉｔｙＦｌｏｗによるＹｍ１ ＋ Ｌｙ６Ｃ ＋ 単球分化経路の同定
　Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球が好中球といくつかの特徴を共有することを考慮すると、これらの細胞は、骨髄における古典的Ｌｙ６Ｃ＋単球のそれとは異なった特異的分化経路を介して生成される可能性がある。Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の分化経路を分析するために、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球固有の表面マーカーとしてＣＤ８８およびＣＤ１５７をバックボーンマーカーに追加し、１１種類のバックボーンマーカーおよびＰＥ結合可変抗体（２５５種類）で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。（図２Ａ）。２５５種類のＦＣＳファイルのデータを、ＩｎｆｉｎｉｔｙＦｌｏｗパイプラインで分析し、ＵＭＡＰアルゴリズムを用いて次元圧縮し、ＵＭＡＰ平面上に描出した。これまでに報告されている前駆細胞を含む各種免疫細胞の表面マーカー発現を照合することにより（図２Ｋ）、それぞれのクラスターがどの細胞に該当するかを解析した。これらの解析の結果、Ｙｍ１＋単球は、ナイーブ骨髄のＬｙ６Ｃ＋単球クラスター内ではほとんど観察されなかった（図２Ｂ）。対照的に、ＬＰＳ投与マウスの骨髄では、好中球クラスターに比較的近接して、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球クラスターが検出された（図２Ｃ）。ナイーブマウス骨髄と比較して、ＬＰＳ投与マウス骨髄で見られる主な変化は、ＭＤＰクラスターの減少とＧＭＰおよびｐｒｏＮｅｕ１などの顆粒球系前駆細胞の増加であった（図２Ｂおよび２Ｃ）。ｃＭｏＰはナイーブマウスの骨髄においてＭＤＰに連続的に位置していた。興味深いことに、ＬＰＳ投与マウスの骨髄では、ｃＭｏＰはＭＤＰから離れたところに位置しており、その代わり、好中球前駆細胞とより密接に並んでいた（図２Ｂおよび２Ｃ）。ｃＭｏＰと骨髄の他の前駆細胞との発生関連性をそのタンパク発現に基づいて理解するために、ＨＳＣからｃ－Ｋｉｔ＋前駆細胞、好塩基球、好酸球、単球、好中球系の成熟ｃ－Ｋｉｔ－細胞まで、細胞分化の経路を擬似的に示すＳＬＩＮＧＳＨＯＴ解析を行った。以前の報告（参考文献４および５）の通り、擬時系列解析は、ナイーブマウスの骨髄において単球がＣＭＰ、ＭＤＰからｃＭｏＰを介して分化することを予測した。一方、好中球はＧＭＰからｐｒｏＮｅｕ１、ｐｒｏＮｅｕ２を介して分化する（参考文献６、図２Ｄ）。予想外に、ＬＰＳ投与マウスの骨髄では、ｃＭｏＰの主要な上流前駆細胞がＭＤＰからＧＭＰ－ｐｒｏＮｅｕ１に変化した（図２Ｄ）。この知見は、ナイーブマウスの骨髄とＬＰＳ投与マウスの骨髄のｃＭｏＰが、２種類の異なる細胞で構成されており、その割合がマウスの状態（定常状態か炎症状態）によって異なること、かつ、この２つの異なるｃＭｏＰを識別する表面分子が存在することを示唆する。生理的条件と炎症条件下でのｃＭｏＰ間の差異を解明するために、フローサイトメトリーデータを再分析することにより、２つの細胞間で異なる発現量を示す表面タンパク質を探索した（図２Ａ）。その結果、ＬＰＳ投与マウスの骨髄のｃＭｏＰにおいてＣＤ８１の発現増強とＣＸ３ＣＲ１の発現減少を見出した（図２Ｅ）。ナイーブマウスの骨髄のｃＭｏＰの大部分はＣＤ８１－ＣＸ３ＣＲ１＋であった（図２Ｆ）。対照的に、ＬＰＳ投与マウスの骨髄のｃＭｏＰの大部分は、ＣＤ８１＋ＣＸ３ＣＲ１－であった（図２Ｆ）。これらの知見は、骨髄Ｌｙ６Ｃ＋単球の分化経路が炎症条件下で変化したことを示している。Ｙａｎｅｚのグループは、単球前駆細胞が、ＧＭＰ由来細胞（ＭＰ）とＭＤＰ由来細胞（ｃＭｏＰ）の２つから構成されることを理論的に明らかにしたが（参考文献１）、これまで、表面タンパク質発現の点でそれらの前駆細胞を区別することはできなかった。しかし、本研究では、２種類の単球前駆細胞を、ＣＤ８１およびＣＸ３ＣＲ１の発現に基づいて分類できることを示した。
　図２－２：Ｙｍ１ ＋ Ｌｙ６Ｃ ＋ 制御性単球および好中球の分化経路の共通性
　上記の解析より、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球は、ＧＭＰ―ｐｒｏＮｅｕ１―ＣＤ８１＋ＣＸ３ＣＲ１－ｃＭｏＰ経路で分化すると推測した。この推測を検証するため、ナイーブＹｍ１－Ｖｅｎｕｓマウスの骨髄からＧＭＰを精製し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＧＭ－ＣＳＦにより刺激した（図２Ｇ）。ＧＭ－ＣＳＦで刺激したＧＭＰは、３日間でＬｙ６Ｇ＋好中球およびＬｙ６Ｃ＋ＣＤ１１５単球の両方を産生する（図２Ｇ、上段）。これらのＬｙ６Ｃ＋単球は、２３．８％のＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球を含んでいた（図２Ｇ、上段）。このアッセイを用いて、擬時系列解析によって予測された潜在的前駆細胞がＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球に分化するか調べた。刺激２日後、ｐｒｏＮｅｕ１由来ＣＤ１１ｂ＋細胞の１３．１％がＬｙ６Ｇ＋好中球であった。さらに、ｐｒｏＮｅｕ１がＬｙ６Ｃ＋単球の小さな分画（ＣＤ１１ｂ＋細胞の４．５％）を生じることに注目した。さらに、これらのＬｙ６Ｃ＋単球の１７％はＹｍ１陽性であった（図２Ｇ、第２列）。この知見は、擬時系列解析によって予測された経路と適合する（図２Ｄ）。ＣＤ８１＋ＣＸ３ＣＲ１－ｃＭｏＰも、単球に分化し、その１２．３％はＹｍ１陽性であった（図２Ｇ、第３列）。これらの知見はＧＭＰ、ｐｒｏＮｅｕ１およびＣＤ８１＋ＣＸ３ＣＲ１－ｃＭｏＰがＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球を生み出す可能性があることを示している。一方、ＭＤＰおよびＣＤ８１－ＣＸ３ＣＲ１＋ｃＭｏＰは主に、Ｌｙ６Ｃ単球を生ずるが、Ｙｍ１発現は、それらの単球ではほとんど検出できなかった（図２Ｇ，第４、第５および最終列）。ｐｒｏＮｅｕ２は好中球のみに分化しており（図２Ｇ、下段）、ｐｒｏＮｅｕ２が単球への分化能を失っているという知見を支持する。短期間（１日）のｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養では、ｐｒｏＮｅｕ１は、Ｌｙ６Ｃ＋ＣＤ１１５＋ＣＤ８１＋ＣＸ３ＣＲ１－ｃＭｏＰに分化することが認められ、これも擬時系列解析の予測を支持する結果である（図２Ｄ）。対照的に、ＭＤＰは、短期間の培養により主にＣＤ８１－ＣＸ３ＣＲ１＋ｃＭｏＰに分化することが分かった（図２Ｈ）。これらの知見を合わせると、顆粒球系前駆細胞内のＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球分岐点がｐｒｏＮｅｕ１であること、ならびに、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球がＧＭＰ、ｐｒｏＮｅｕ１からＣＤ８１＋ＣＸ３ＣＲ１－ｃＭｏＰを介して分化することを意味する。
　本発明者らはさらに、ＣＤ４５．２陽性のＹｍ１－Ｖｅｎｕｓマウスから調製した上記６前駆細胞を、ＬＰＳを投与したＣＤ４５．１陽性のコンジェニックマウスに養子移入することにより、これらの前駆細胞が炎症状態のマウスの生体内で、どの細胞に分化するのか確認した。インビトロ培養実験系の観察結果と一致して、ＧＭＰ、ｐｒｏＮｅｕ１およびＣＤ８１＋ＣＸ３ＣＲ１－ｃＭｏＰの一部は、移入２日あるいは３日後に、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球に分化した（図２Ｉ、上段、第２および第３列）。対照的に、ＭＤＰおよびＣＤ８１－ＣＸ３ＣＲ１＋ｃＭｏＰは、主にＹｍ１－Ｌｙ６Ｃ＋単球（図２Ｉ、第４および第５列）に分化した。インビトロ培養実験系で示されるように、ｐｒｏＮｅｕ２は単球を産生しなかった（図２Ｉ、下段）。これらの知見より、ＭＤＰからＣＤ８１－ＣＸ３ＣＲ１＋ｃＭｏＰを介してＹｍ１－Ｌｙ６Ｃ＋ 単球に分化する従来の経路とは異なり、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球は、ＧＭＰから、ｐｒｏＮｅｕ１およびＣＤ８１＋ＣＸ３ＣＲ１ ｃＭｏＰを介して分化すると結論づけた（図２Ｊ）。
　図３：ヒトＣＤ１４ ＋ 単球における好中球マーカー発現の不均一性
　以前の研究では、Ｙｍ１をマーカーとしてマウス制御性単球を分類した。しかし、Ｙｍ１（Ｃｈｉｌ３）をコードする遺伝子はヒトでは保存されていないので、マウス制御性単球に対応するヒトの細胞を、Ｙｍ１発現に基づいて同定することはできない。この問題を克服するために、発明者らは、マウス制御性単球がいくつかの好中球マーカーを発現していることに注目し、好中球マーカーを指標としてマウスＹｍ１＋制御性単球に対応するヒトの細胞を探索した。マウスでは定常状態でも、Ｌｙ６Ｃ＋単球中に、わずかながら（＜５％）、Ｙｍ１＋制御性単球が存在するため、マウスＬｙ６Ｃ＋単球に相当するヒトＨＬＡＤＲ＋ＣＤ１５－ＣＤ１４＋単球にも好中球マーカー発現によって識別できる制御性単球が存在すると推測した。ヒトとマウスの白血球ではその表面に発現する分子が大きく異なることが知られているため（参考文献７）、本発明者らはまず、フローサイトメトリーによって健常ドナーから調製された末梢血ＨＬＡＤＲ－ＣＤ１５＋好中球上に選択的に発現されるマーカーを選択した（ＬＥＧＥＮＤＳｃｒｅｅｎ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、図３Ａ）。次に、ＨＬＡ－ＤＲ＋ＣＤ１５－ＣＤ１４＋単球上でのこれらの発現を調べた。その結果、ヒト好中球に発現している分子のうち、６つ（ＣＸＣＲ１、ＣＤ１０、ＣＤ２４、ＣＤ６６ａ／ｃ／ｅ、ＣＤ６６ｂおよびＳｉａｌｙｌ Ｌｅｗｉｓ ＸがＨＬＡ－ＤＲ＋ＣＤ１５－ＣＤ１４＋単球でもわずかに発現していることがわかった（図３Ｅ）。これらの好中球マーカーの発現に基づいて、ヒト末梢血中に骨髄系細胞をＵＭＡＰ次元圧縮とフェノグラムクラスタリングにより解析した。その結果、ＣＤ１４＋単球はＣＸＣＲ１発現の観点から２つのクラスターに分けられた（図３Ｂ）。健常ドナーの末梢血ではＣＤ１４＋単球のうちの９．９～３２．０％がＣＸＣＲ１陽性であることを見出した（図３Ｃ）。ＣＸＣＲ１発現は他の単球サブセット（ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球およびＣＤ１６＋単球）ではほとんど検出されなかったことから、ＣＸＣＲ１は好中球およびＣＤ１４＋単球のサブセットにより選択的に発現されるマーカーであることが明らかとなった。ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球は大型の単小葉核を有し、好中球とは異なる形態的特徴を有していた（図３Ｄ）。これらの知見を総合して、健常ドナーの末梢血において、マウスＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋制御性単球の対応するヒトの細胞として、ＣＸＣＲ１を発現するＨＬＡ－ＤＲ＋ＣＤ１５－ＣＤ１４＋単球の亜集団を同定した。
　図４：トランスクリプトーム解析による、ＣＸＣＲ１ ＋ ＣＤ１４ ＋ 単球の特徴
　フローサイトメトリーに基づく細胞サブセットの同定をさらに検証するため、ＲＮＡシークエンス解析により、４つのＨＬＡＤＲ＋ＣＤ１５－単球（ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋、ＣＸＣＲ１－ＣＤ１４＋、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋、ＣＤ１４－ＣＤ１６＋）およびＨＬＡＤＲ－ＣＤ１５＋好中球の遺伝子発現を比較した。分取された細胞が発現する全遺伝子に基づく主成分解析（ＰＣＡ）では、４つの単球が密接に集まって、好中球から明確に分離された（図４Ａ）。５つの細胞における遺伝子発現を階層的クラスター分析した結果、樹状図は、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球が他の単球よりも好中球に近縁なことが分かった（図４Ｂ）。次に、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球とＣＸＣＲ１－ＣＤ１４＋単球の階層的クラスター分析と遺伝子マーカーの抽出を行ない、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球で強発現する遺伝子のＧｅｎｅ　Ｏｎｔｏｌｏｇｙ解析を行ったところ、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球では、「顆粒球」「好中球」の活性化に関する遺伝子群が高発現することが分かった（図４Ｃおよび４Ｄ）。図４Ｃで同定された、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球強発現遺伝子のいくつかが、同細胞において確かに強発現することが、定量ＰＣＲでも確認できた（図４Ｅ）。ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球における好中球関連遺伝子の高発現は、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球における好中球の混入に起因するものではなかった。なぜなら、一部の好中球関連遺伝子は、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球よりもＣＸＣＲ１－ＣＤ１４＋単球において高発現していたからである（図４Ｈ）。
　最近、Ｖｉｌｌａｎｉのグループは、一細胞ＲＮＡシークエンスの結果から、末梢血中のヒト単球を、４つのクラスターに分離できることを実証した（参考文献８）。そこで、細胞表面タンパク質発現に基づいて定義されたＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球が、一細胞ＲＮＡシークエンスの解析により同定される単球のいずれかに相当するかを探索した。このために、Ｖｉｌｌａｎｉの１細胞ＲＮＡシークエンシングデータをＵＭＡＰアルゴリズムを用いて再解析した。本発明者らの解析では、５つの樹状細胞と５つの単球クラスター（クラスター１、２、５、８、９）が同定された（図４Ｆ）。これらの単球のうち、ＣＤ１６（ＦＣＧＲ３Ａ）を高発現するクラスター１は、ＣＤ１４－ＣＤ１６＋の「非古典的」単球に相当する。クラスター２と５は、それぞれＣＤ１４＋の「古典的」単球とＣＤ１４ＣＤ１６二重陽性単球に相当する。２つのより小さなクラスターの１つであるクラスター８は、Ｖｉｌｌａｎｉの解析で「Ｍｏｎｏ３」と命名されたものと同様の遺伝子発現パターンＣＸＣＲ１、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＮＡＭＰＴを高発現）を示した。もう１つの小さなクラスターであるクラスター９は、Ｖｉｌｌａｎｉの解析で「Ｍｏｎｏ４」と定義されたナチュラルキラー樹状細胞に相当する可能性があるため、その後の解析から除外した。次に、一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ解析（図４Ｆのクラスター１、５、２、８、左）における遺伝子発現と、図３Ｃで定義されたソーティングクライテリアに基づいて分取した単球サブセットの遺伝子発現をヒートマップで比較した。ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球のバルクＲＮＡ－ｓｅｑ解析では、これらのマーカー遺伝子を比較した場合、一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑによって定義されたクラスター８に非常によく似た発現プロファイルを示した（例えば、ＴＮＦＲＳＦ１０ＣおよびＣＸＣＲ２、図４Ｇ）。これらの結果より、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球は、明確な遺伝子発現プロファイルによって定義される、ＣＤ１４＋古典的単球内の独立した亜集団であり、ＣＤ１４、ＣＤ１６およびＣＸＣＲ１を表面マーカーとして用いることで単離できると結論する。
　図５：ＣＸＣＲ１ ＋ ＣＤ１４ ＋ 単球の免疫制御表現型
　次に、本発明者らは、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球とＣＸＣＲ１－ＣＤ１４＋単球との間の機能的相違を評価することを試みた。この目的のために、まず、健康な供血者から分取した２つの単球の培養液中のサイトカイン濃度をサイトカインパネルを用いて定量した。１５種類のサイトカインおよびケモカインの濃度は、このアッセイの検出可能な範囲内に収まった。その結果、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球による炎症誘発性サイトカイン（ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＴＮＦαおよびケモカイン（ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１）の産生が、ＣＸＣＲ１－ＣＤ１４＋単球と比較して低下していることを見出した（図５Ａ）。これらのサイトカインの一部（ＩＬ－６およびＴＮＦα）の産生低下は、ＥＬＩＳＡ法により検証された（図５Ｂ）。これらの知見は、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球のサイトカインプロファイル（ＩＬ－６、ＴＮＦα）が、マウスＹｍ１＋制御性単球のそれと部分的に一致していること、すなわち、同単球が、ＣＸＣＲ１－ＣＤ１４＋単球よりも炎症性サイトカインおよびケモカインの産生量が低いことを示している。
　次いで、単球を同一ドナーから調製したＴ細胞とｉｎ ｖｉｔｒｏで共培養することにより、２つの単球の免疫抑制能を評価した。ＣＸＣＲ１－ＣＤ１４＋単球をＴ細胞に加えると、共培養４日後にＣＤ４ Ｔ細胞とＣＤ８ Ｔ細胞が増加した（図５Ｃ）。これは、ＣＸＣＲ１－ＣＤ１４＋単球がＴ細胞の生存を支持することを示唆する。対照的に、ＣＸＣＲ１＋単球は、インビトロで共培養されたＴ細胞の数を細胞数依存的に減少させた（図５Ｃ）。この減少は、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を、細胞間相互作用を妨げるＴｒａｎｓｗｅｌｌ装置を用いた場合には観察されなかった（図５Ｄ）。また、Ｔ細胞と４日間共培養したＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球の培養上清は、Ｔ細胞の増殖を抑制しなかった（図５Ｆ、図５Ｇ）。以上より、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球は、細胞間接触依存的にエフェクターＴ細胞の増殖を抑制することが明らかとなった。
　次に、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球によるＴ細胞抑制の機序の検討を試みた。そのために、Ｔ細胞をＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球と共培養し、そこにＮアセチルシステイン（抗酸化剤ＮＡＣ）、１４００Ｗ（ｉＮＯＳ阻害剤）または－ＮＯＨＡ（アルギナーゼ１阻害剤）を添加した。しかし、これらの阻害薬はいずれもＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球によるＴ細胞の抑制を解除しなかった（図５Ｅ、左）。対照的に、Ｈ２Ｏ２の分解を触媒するカタラーゼの添加により、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球と共培養したＴ細胞の数が用量依存的に増加した（図５Ｅ左側、図５Ｆ、図５Ｇ）。このことは、Ｈ２Ｏ２が、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球によるＴ細胞抑制の原因の１つであることを示唆する。次に、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球によるＴ細胞の減少に細胞死が関与するかを検討した。汎カスパーゼ阻害剤であるｚ－ＶＡＤ－ｆｍｋ、フェロスタチン－１、またはＣＡ－０７４Ｍｅを培地に加えても、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球と共培養したＴ細胞の数は増加しなかったことから、カスパーゼ依存性細胞死、フェロトーシスまたはパイロプトーシスがＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球によるＴ細胞の減少の原因でないことが分かった（図５Ｅ、右）。対照的に、ネクロプトーシスの阻害剤であるネクロスタチン－１を加えると、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球によるＴ細胞の抑制が阻害された（図５Ｅ右側、図５Ｆ、図５Ｇ）。これらの発見は、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球がＨ２Ｏ２を生成することにより、エフェクターＴ細胞にネクロプトーシスを引き起こすことを示唆するが、ネクロスタチン－１は、ＩＤＯの阻害剤としても知られていることから、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球によるＴ細胞の抑制にＩＤＯが関与している可能性は否定できない。
　図６：ヒトにおける組織損傷および炎症後のＣＸＣＲ１ ＋ ＣＤ１４ ＋ 単球の拡大
　マウス制御性単球の特徴の１つは、全身性炎症後の急速な細胞数の増加である。本発明者らは近年、原発腫瘍の介入に伴う炎症が、骨髄における制御性単球の産生も増加させ、その結果、肺における癌転移が増強されることを示した（参考文献３）。炎症状態での制御性単球の動態に関して、マウスとヒトの類似性を検討するために、肝癌患者の末梢血中のＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球の頻度を、経カテーテル動脈化学塞栓療法（ＴＡＣＥ）の施行前後で解析した。ＴＡＣＥとは、腫瘍近傍の血管内に抗癌剤を投与し、肝腫瘍への血流を遮断する治療方法である。これにより、より多くの量の薬がより長期間腫瘍に到達し、より多くのがん細胞を死滅させる可能性がある。ＴＡＣＥは、通常、一過性の体温上昇と血清ＣＲＰの上昇を伴う肝臓の組織傷害を引き起こす。ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球の比率はＴＡＣＥ後３～４日で有意に増加し（図６Ａおよび図６Ｂ：２１．５％から３７．６％）、その後２週間で基底値に向かって漸減した（図６Ｃ）。次に、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球の存在量と臨床パラメーターとの関連性を検討した。図６Ｄに示すように、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球の頻度は、好中球数および血清ＣＲＰと正に相関した。これらのデータは、ヒトが生理的条件下で少数のＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を有し、組織傷害などの刺激に反応してそれらの産生が加速されることを示す。
　炎症後に増殖するＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球が、生理的条件下とは免疫学的に異なった表現型を示すかどうかを試験するために、ＴＡＣＥ後に患者の末梢血からＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球およびＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を、図５Ｃに記載されているように、同じドナーから精製したＴ細胞とｉｎ ｖｉｔｒｏで共培養した。ＴＡＣＥ後の末梢血からのＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球は、健常ドナーからのＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球と同様にＴ細胞の増殖を抑制した（図６Ｅ）。次に、健常ドナー由来のＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球とＴＡＣＥ施行例のそれらを区別する表面マーカーを探索した。その結果、ＣＤ６６ａ／ｃ／ｅおよびＣＤ６６ｂの発現量は、ＴＡＣＥ後のＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球上で有意に増加することを見出した（図６Ｆ）。これらのマーカーの発現は、好中球数、血清ＣＲＰおよびＡＬＴと正の相関を示した（図６Ｇ）。以上より、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球は、炎症条件下でその表層タンパク質発現を部分的に変化させることが示唆された。これらのデータは、組織傷害に続く炎症が、エフェクターＴ細胞増殖を抑制するヒトＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球の増殖を刺激することを明確に示している。
　＜考察＞
　これまで、Ｍ２マクロファージおよび骨髄由来抑制型細胞（ＭＤＳＣ）など、がん患者で増加し、免疫抑制に関与すると言われる免疫細胞について様々な研究が行われてきた。しかしながら、これまでの研究では、免疫抑制型細胞選択的に発現する表面分子を同定することができておらず、それが標的細胞を絞り込むうえでの障壁となり、抑制型マクロファージを標的とした治療応用がほとんど進んでいなかった。本発明者らは初めて、これまであまり単球には発現しないと考えられていたＣＸＣＲ１という表面マーカーを用いて、免疫抑制型の機能を有する単球を同定することに成功した。
　この発見は、免疫調節作用および組織修復機能を有し、がんの治療標的として有望であるマウスの制御性単球に相当する、ヒトの単球亜集団の同定に成功したことを意味する。具体的に、本発明者らは、これまでに、マウスにおけるＭＭＰ－９およびＬｃｎ２が、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球が産生するがん転移促進因子であることを示しているが、ヒトにおけるＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球も、ＭＭＰ－９およびＬｃｎ２を産生する。
　ヒトＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球によるＴ細胞の増殖抑制効果は、マウスのＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球にはみられないが、ヒトＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球は、かかる効果を有し、このＴ細胞増殖抑制が、がんの増殖を促進している可能性があると考えられる。例えば、図５Ｅに示すとおり、この抑制機能は、カタラーゼ（活性酸素の一種である過酸化水素を分解する酵素）の添加により抑えられることから、ヒトＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球は、何らかのメカニズムにより活性酸素を産生し、Ｔ細胞増殖を抑制していると考えられる。
　また、マウスにおいて、ＣＤ８８およびＣＤ１５７は、Ｙｍ１－Ｌｙ６Ｃ＋単球には発現しないが、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球では発現する、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球に特異的な表面マーカーである。一方、ヒトにおいては、マウスのＣＤ８８およびＣＤ１５７に相当する分子として、ＣＸＣＲ１、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃおよびＣＤ６６ｅが挙げられる。これらのマーカーは、対象のがん治療後に、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球の細胞表面での発現が上昇する。
　さらに、マウスにおいて、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の（肺への）遊走に関わるケモカインレセプターは、ＣＸＣＲ４であるのに対し、ヒトＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球の遊走に関わる可能性のあるケモカインレセプターの候補は、ＣＸＣＲ１そのものであると考えられる。このＣＸＣＲ１は、サイトカインＩＬ－８のレセプターとして作用する。
　したがって、上記の分子を治療標的とし、これらのアンタゴニスト（例えば、抗体および阻害剤）を投与して、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球の活性を阻害することにより、がんの進展を阻害できる可能性が示唆された。
（参考文献）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006

Claims (21)

  1. 　ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を有する対象に投与するための医薬組成物であって、
    　マトリックスメタロプロテナーゼ－９（Ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　９；ＭＭＰ－９）の活性を阻害する化合物を含む、医薬組成物。
  2. 　前記ＭＭＰ－９の活性を阻害する化合物が、ＣＸＣＲ１アンタゴニスト、Ｌｃｎ２アンタゴニスト、ＣＤ６６ａアンタゴニスト、ＣＤ６６ｂアンタゴニスト、ＣＤ６６ｃアンタゴニスト、ＣＤ６６ｅアンタゴニストおよびＭＭＰ－９アンタゴニストからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 　前記ＭＭＰ－９の活性を阻害する化合物が、
    　抗ＣＸＣＲ１抗体、ＣＸＣＲ１阻害剤、抗Ｌｃｎ２抗体、Ｌｃｎ２阻害剤、抗ＣＤ６６ａ抗体、ＣＤ６６ａ阻害剤、抗ＣＤ６６ｂ抗体、ＣＤ６６ｂ阻害剤、抗ＣＤ６６ｃ抗体、ＣＤ６６ｃ阻害剤、抗ＣＤ６６ｅ抗体、ＣＤ６６ｅ阻害剤、抗ＭＭＰ－９抗体およびＭＭＰ－９阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１または２に記載の医薬組成物。
  4. 　がんを予防および／または治療するための、請求項１または２に記載の医薬組成物。
  5. 　がん転移を抑制および／または予防するための、請求項１または２に記載の医薬組成物。
  6. 　前記がん転移が、急性炎症によって生じたがん転移であるか、または、腫瘍に対する治療的介入によって生じたがん転移である、請求項５に記載の医薬組成物。
  7. 　前記腫瘍に対する治療的介入が、外科的切除、化学療法および放射線療法からなる群より選択される、請求項６に記載の医薬組成物。
  8. 　前記腫瘍に対する治療的介入が、肝動脈化学塞栓術（Ｔｒａｎｓｃａｔｈｅｔｅｒ　ａｒｔｅｒｉａｌ　ｃｈｅｍｏｅｍｂｏｌｉｚａｔｉｏｎ；ＴＡＣＥ）である、請求項６に記載の医薬組成物。
  9. 　前記ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を有する対象が、がんに罹患している、請求項１または２に記載の医薬組成物。
  10. 　前記ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を有する対象が、ヒトである、請求項１または２に記載の医薬組成物。
  11. 　ＭＭＰ－９活性化経路を阻害する組成物であって、
    　前記ＭＭＰ－９活性化経路は、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球、Ｌｃｎ２およびＭＭＰ－９を含み、
    　前記組成物が、ＭＭＰ－９の活性を阻害する化合物を含む、組成物。
  12. 　前記ＭＭＰ－９活性化経路が、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃおよびＣＤ６６ｅから選択される少なくとも１つをさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
  13. 　（ｉ）治療的介入前の対象の末梢血サンプル中の白血球に対するＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球の割合を測定する工程、
    　（ｉｉ）治療的介入後の前記対象の末梢血サンプル中の白血球に対するＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球の割合を測定する工程、
    　（ｉｉｉ）前記（ｉ）で測定した割合と、前記（ｉｉ）で測定した割合とを比較する工程
    を含む、がんの進展のリスクの評価方法。
  14. 　前記（ｉ）および／または（ｉｉ）における測定はフローサイトメトリーによって行われる、請求項１３に記載の方法。
  15. 　抗ＣＸＣＲ１抗体、抗Ｌｃｎ２抗体、抗ＣＤ６６ａ抗体、抗ＣＤ６６ｂ抗体、抗ＣＤ６６ｃ抗体、抗ＣＤ６６ｅ抗体および抗ＭＭＰ－９抗体から選択される少なくとも１つを含む、がんの進展の可能性を予測するためのキット。
  16. 　ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を有する対象の血液から該ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を吸着除去するための血液浄化装置であって、
    　抗ＣＸＣＲ１抗体を担持したアフィニティカラムを備えた、装置。
  17. 　前記ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を有する対象が、がんに罹患している、請求項１６に記載の装置。
  18. 　抗ＣＸＣＲ１抗体を担持したアフィニティカラムによって、ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を有する対象の血液からＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を吸着して、当該血液からＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を除去する方法。
  19. 　ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球のＴ細胞増殖抑制作用を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
    　（ｉ）ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球とＴ細胞との共培養系に、候補化合物を添加する工程、および
    　（ｉｉ）Ｔ細胞の数が増えた場合に、前記候補化合物を前記単球のＴ細胞増殖抑制作用を調節する化合物として同定する工程
    を含む、方法。
  20. 　ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球のＴ細胞増殖抑制作用を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
    　（ｉ）ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球を含む単球集団に、候補化合物を添加する工程、
    　（ｉｉ）前記単球集団においてＣＸＣＲ１遺伝子を発現する単球の割合を測定する工程、および
    　（ｉｉｉ）前記候補化合物が、前記ＣＸＣＲ１遺伝子を発現する単球の割合を変化させた場合に、前記候補化合物を単球のＴ細胞増殖抑制作用を調節する化合物として同定する工程
    を含む、方法。
  21. 　ＣＸＣＲ１＋ＣＤ１４＋単球のＴ細胞増殖抑制作用を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
    　（ｉ）単球前駆細胞集団に、候補化合物を添加する工程、
    　（ｉｉ）前記単球前駆細胞集団から単球集団を分化させる工程、
    　（ｉｉｉ）前記分化した単球集団においてＣＸＣＲ１遺伝子を発現する単球の割合を測定する工程、および
    　（ｉｖ）前記候補化合物が、前記ＣＸＣＲ１遺伝子を発現する単球の割合を変化させた場合に、前記候補化合物を単球のＴ細胞増殖抑制作用を調節する化合物として同定する工程
    を含む、方法。
PCT/JP2022/032534 2021-08-30 2022-08-30 がんの予防および／または治療のための医薬組成物 WO2023032957A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021-140333 2021-08-30
JP2021140333 2021-08-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023032957A1 true WO2023032957A1 (ja) 2023-03-09

Family

ID=85411238

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2022/032534 WO2023032957A1 (ja) 2021-08-30 2022-08-30 がんの予防および／または治療のための医薬組成物

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2023032957A1 (ja)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012508384A (ja) * 2008-11-11 2012-04-05 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン 抗ｃｘｃｒ１組成物および方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012508384A (ja) * 2008-11-11 2012-04-05 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン 抗ｃｘｃｒ１組成物および方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MASTIO JÉRÔME, CONDAMINE THOMAS, DOMINGUEZ GEORGE, KOSSENKOV ANDREW V., DONTHIREDDY LAXMINARASIMHA, VEGLIA FILIPPO, LIN CINDY, WAN: "Identification of monocyte-like precursors of granulocytes in cancer as a mechanism for accumulation of PMN-MDSCs", JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE, ROCKEFELLER UNIVERSITY PRESS, US, vol. 216, no. 9, 2 September 2019 (2019-09-02), US , pages 2150 - 2169, XP093043171, ISSN: 0022-1007, DOI: 10.1084/jem.20181952 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Jacquemont et al. Terminally differentiated effector memory CD8+ T cells identify kidney transplant recipients at high risk of graft failure
Picarda et al. Transient antibody targeting of CD45RC induces transplant tolerance and potent antigen-specific regulatory T cells
Liu et al. Distinct human Langerhans cell subsets orchestrate reciprocal functions and require different developmental regulation
Liu et al. Neutralizing IL-8 potentiates immune checkpoint blockade efficacy for glioma
Fraccarollo et al. Expansion of CD10neg neutrophils and CD14+ HLA-DRneg/low monocytes driving proinflammatory responses in patients with acute myocardial infarction
Desbois et al. Specific follicular helper T cell signature in Takayasu arteritis
Fang et al. The cell-surface 5′-nucleotidase CD73 defines a functional T memory cell subset that declines with age
Ban et al. Effect of Indoleamine 2, 3‐Dioxygenase Expressed in HTR‐8/SV neo Cells on Decidual NK Cell Cytotoxicity
Tao et al. Decidual CXCR4+ CD56brightNK cells as a novel NK subset in maternal–foetal immune tolerance to alleviate early pregnancy failure
Ikeda et al. The early neutrophil-committed progenitors aberrantly differentiate into immunoregulatory monocytes during emergency myelopoiesis
Hui et al. Single-cell sequencing reveals the transcriptome and TCR characteristics of pTregs and in vitro expanded iTregs
Hammoudi et al. Autologous organoid co-culture model reveals T cell-driven epithelial cell death in Crohn’s Disease
Zúñiga et al. Acute exercise mobilizes NKT-like cells with a cytotoxic transcriptomic profile but does not augment the potency of cytokine-induced killer (CIK) cells
Sparrow et al. The cytotoxic molecule granulysin is capable of inducing either chemotaxis or fugetaxis in dendritic cells depending on maturation: a role for Vδ2+ γδ T cells in the modulation of immune response to tumour?
Quatrini et al. Glucocorticoids inhibit human hematopoietic stem cell differentiation toward a common ILC precursor
WO2018187786A1 (en) Unipotent neutrophil progenitor cells, methods of preparation, and uses thereof
WO2023032957A1 (ja) がんの予防および／または治療のための医薬組成物
US20220411500A1 (en) Treatment of fibrosis with combined blockade of il-6 and immune checkpoint
WO2021251908A1 (en) Neutrophil progenitors and related methods and uses
Xiang et al. Single-cell transcriptome profiling reveals immune and stromal cell heterogeneity in primary Sjögren’s syndrome
Fraccarollo et al. Expansion of CD14+ HLA-DRneg/low monocytes and CD10neg neutrophils driving proinflammatory responses in patients with acute myocardial infarction
Sérazin et al. Single cell analysis reveals CD45RClow/-TNFR2+ CD29lowCD8+ Tregs with superior activity
US10191055B2 (en) Detection of acute myeloid leukaemia (AML) leukaemic stem cells (LSC)
Wang et al. Single-cell immune landscape of human recurrent spontaneous abortion
Leveque et al. T helper cell-licensed mast cells promote inflammatory Th17 cells

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22864539

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2023545589

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE