WO2023006995A1 - Collinolacton-biosynthese und herstellung - Google Patents

Collinolacton-biosynthese und herstellung Download PDF

Info

Publication number
WO2023006995A1
WO2023006995A1 PCT/EP2022/071442 EP2022071442W WO2023006995A1 WO 2023006995 A1 WO2023006995 A1 WO 2023006995A1 EP 2022071442 W EP2022071442 W EP 2022071442W WO 2023006995 A1 WO2023006995 A1 WO 2023006995A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
collinolactone
nucleic acid
acid sequence
gene cluster
Prior art date
Application number
PCT/EP2022/071442
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Stephanie Grond
Julian Christopher SCHMID
Tilmann Weber
Jaime Felipe GUERRERO GARZÓN
Axel Zeeck
Original Assignee
Eberhard Karls Universität Tübingen
Danmarks Tekniske Universitet
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eberhard Karls Universität Tübingen, Danmarks Tekniske Universitet filed Critical Eberhard Karls Universität Tübingen
Publication of WO2023006995A1 publication Critical patent/WO2023006995A1/de

Links

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33Heterocyclic compounds
    • A61K31/335Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365Lactones
    • A61K31/366Lactones having six-membered rings, e.g. delta-lactones
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07DHETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D493/00Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C07D493/02Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D493/04Ortho-condensed systems
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/181Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system, e.g. Salinomycin, Septamycin
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12YENZYMES
    • C12Y114/00Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/13Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.13)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12YENZYMES
    • C12Y203/00Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)

Definitions

  • the present invention relates to isolated nucleic acids, proteins or peptides, gene clusters, expression vectors, host cells, methods for biosynthesis, genetic engineering methods for optimizing the product yield, biotechnologically produced collinolactone and its derivatives, and their use for the manufacture of a pharmaceutical composition for treatment, diagnosis and / or prophylaxis of diseases, especially neurodegenerative diseases.
  • Collinolactone is a natural product derived from a Streptomyces sp. Strain has been isolated and characterized and shown to have protective effects against oxidative stress.
  • the structure of the collinolactone is a tricyclic cyclodecatriene ring system with two lactones, a six-membered ring and a seven-membered ring, surrounding the cyclodecatriene ring (Fig. 1).
  • rhizolutin A substance with the same structural formula called rhizolutin has been isolated (Fig. 1) and its potential use in the treatment or prophylaxis of neurodegenerative diseases, particularly Alzheimer's, has been discussed (1).
  • a fermentative production of collinolactone with subsequent purification has hitherto yielded relatively low production rates of a maximum of 0.03 mg/l in a standard medium and of a maximum of 0.3 mg/l in an optimized nutrient medium after the addition of Panax ginseng root powder and olive oil (1) .
  • the inventors have succeeded for the first time in a bacterial strain Streptomyces sp. To identify, characterize and provide genes and proteins responsible for the biosynthesis of natural collinolactone.
  • this substance can be produced more efficiently than the known processes for isolating collinolactone, in particular in greater yields.
  • the following objects of the invention form the basis for this.
  • the invention relates to an isolated protein or peptide which is functional for a partial synthetic step in the biosynthesis of collinolactone, i. H. enabling such a partial synthesis step to be carried out.
  • biosynthesis means not only intracellular synthesis, but also includes uptake into a cell and ejection from a cell via the cell membrane and/or cell wall.
  • protein can mean not only a single protein or peptide according to the invention, but also a combination of several different proteins or peptides according to the invention.
  • a protein or peptide according to the invention can be produced biotechnologically or chemically.
  • a protein or peptide according to the invention can originate from a bacterium, in particular from a bacterium of the Streptomyces genus, or be taken from such a bacterium.
  • the protein or peptide consists of an amino acid sequence which has a correspondence of at least 80%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, particularly preferably at least 98%, in particular 99%-100% with the amino acid sequence selected is from the group consisting of SEQ ID No. 29 to SEQ ID 55.
  • the biological activities of individual proteins or peptides are given in the sequence listings SEQ ID No. 29 to SEQ ID 55, respectively.
  • the invention further relates to an isolated nucleic acid which codes for a protein or peptide which is responsible for a partial synthesis step in the biosynthesis of Collinolactone is functional, ie allows the implementation of such a partial synthesis step.
  • the nucleic acid consists of a nucleic acid sequence which has a match of at least 80%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, particularly preferably at least 98%, in particular 99%-100% with the nucleic acid sequence which is selected from the group consisting of SEQ ID No. 2 to SEQ ID No. 28 or SEQ ID No. 56.
  • nucleic acid can mean not only a single nucleic acid, but also a combination of several different nucleic acids.
  • nucleic acid within the meaning of the present invention can mean DNA or RNA and can in particular be selected from the group consisting of gene or open reading frame (ORF), cDNA and mRNA.
  • ORF open reading frame
  • a nucleic acid according to the invention can be chemically or recombinantly, i. H. genetically engineered.
  • a nucleic acid according to the invention can originate from a bacterium, in particular from a bacterium of the Streptomyces genus, or be taken from such a bacterium.
  • the invention relates to an isolated nucleic acid which preferably encodes a protein or peptide which is functional for a partial synthetic step in the biosynthesis of collinolactone, i. H. enables the implementation of such a partial synthesis step, wherein the nucleic acid consists of a nucleic acid sequence which corresponds to at least 80%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, particularly preferably at least 98%, in particular 99%-100% with the nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID No. 2 to SEQ ID No. 28 or SEQ ID No. 56.
  • nucleic acid sequences preferably encode as follows:
  • SEQ ID No. 17 for an amino acid sequence according to SEQ ID No. 44
  • SEQ ID No. 18 for an amino acid sequence according to SEQ ID No. 45
  • SEQ ID No. 28 for an amino acid sequence according to SEQ ID No. 55.
  • the invention relates to an isolated protein or peptide which is preferably functional for a partial synthetic step in the biosynthesis of collinolactone, i. H. enables such a partial synthesis step to be carried out, the protein or peptide being produced by means of expression of a gene or open reading frame and the gene or open reading frame consisting of a nucleic acid sequence which has a match of at least 80%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, particularly preferably at least 98%, in particular 99%-100% with the nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID No. 2 to SEQ ID No. 28 or SEQ ID No. 56.
  • the invention further encompasses an isolated gene cluster which is preferably functional for the biosynthesis of collinolactone, i. H. enabling such a biosynthesis to be carried out (FIG. 3).
  • gene cluster means a functional unit of the DNA of prokaryotes and some eukaryotes, which they use to regulate genes whose products (proteins or peptides) are involved in related processes, for example biosynthesis of a substance.
  • genes particularly in bacteria, are contiguous on a single chromosome in structures called gene clusters and can be transcribed together under the control of one or more regulatory sequences.
  • a gene cluster can also contain several promoters and operons and can also be controlled by several regulators.
  • the gene cluster mentioned above usually also contains a promoter and one or more operators.
  • the gene cluster can contain at least one promoter that has a strong effect in Streptomyces, for example a promoter from the /casOp family, preferably a /casOp* promoter.
  • the gene cluster consists of at least two nucleic acid sequences whose gene products have a correspondence of at least 80%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, particularly preferably at least 98%, in particular 99%-100% with the amino acid sequence. which is selected from the group consisting of SEQ ID No. 29 to SEQ ID No. 55 and combinations thereof.
  • the gene cluster can in particular consist of all of the nucleic acid sequences mentioned in the previous paragraph.
  • the gene cluster can consist in particular of a nucleic acid sequence which has a match of at least 80%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, particularly preferably at least 98%, in particular 99%-100% with the nucleic acid sequence SEQ ID #1.
  • the nucleic acid sequence SEQ ID No. 1 was identified and characterized by the inventors as the gene cluster responsible for collinolactone biosynthesis in a bacterium of the Streptomyces genus.
  • the invention relates to an artificial or recombinant, i. H. genetically engineered expression vector, d. H. a vehicle for transferring at least one nucleic acid into a recipient or host cell, which then expresses at least one protein or peptide, for which the at least one nucleic acid encodes, as part of gene expression.
  • the expression vector contains at least one nucleic acid according to the invention as described above.
  • the expression vector can contain a gene cluster according to the invention as described above.
  • the expression vector can be a plasmid or a cosmid.
  • a plasmid or cosmid is preferred which can integrate into the chromosome of bacteria of the genus Streptomyces or exists in the cell as a replicative plasmid, cosmid, fosmid or “bacterial artificial chromosome” and contains native or correspondingly constitutive or inducible (regulatable) promoters.
  • the expression vector according to the invention is suitable both for carrying out a homologous expression and for carrying out a heterologous expression.
  • the invention relates to an artificial or recombinant, i. H. bioengineered collinolactone-producing host cell.
  • the host cell is characterized in that, alternatively or in combination, it contains at least one of the nucleic acids according to the invention, at least one of the proteins or peptides according to the invention, a gene cluster according to the invention, or an expression vector according to the invention.
  • the host cell can in principle be a eukaryotic or prokaryotic cell, which can in particular be selected from the group consisting of bacterial cells, yeast cells and fungal cells.
  • a bacterium of the genus Streptomyces is particularly preferred as the host cell.
  • the host cell can be a homologous or heterologous host cell.
  • the host cell can be produced or can be produced by means of transformation, transduction, transfection or conjugation, in particular using an expression vector according to the invention.
  • the invention relates to a method for the biosynthesis of collinolactone, comprising the steps: a) culturing a collinolactone-producing host cell according to the invention and b) purification of collinolactone from the cell, a culture medium used for culturing, or the reaction solution.
  • the following cultivation parameters can be changed individually or in combination as follows according to the invention: a) adding at least one precursor compound for the biosynthesis of collinolactone to the culture medium or the reaction solution, which is selected in particular from the group consisting, for example, but not exclusively, of alkaline acid, alkenoic acid, dicarboxylic acid, their esters and thioesters and their salts, in particular acetate, propionate and malonate; b) adding an adsorbent, preferably an adsorber resin, to the culture medium during the cultivation of the host cell or the reaction solution during the reaction and not only during the subsequent purification of collinolactone; c) In the production culture, the insertion of the steps (single to multiple, preferably three times) of the circulating production medium against the volumes with nutrient medium or diluent solution of the previous step and volumes with diluent solution, or in the chemical and chemical-enzymatic reaction the insertion of the steps
  • the invention relates to the substance collinolactone or a bioactive derivative thereof, produced or producible using proteins or peptides, nucleic acids, gene clusters, expression vectors, host cells or methods described above.
  • the collinolactone characterized in the present invention thus differs from rhizolutin in the stereochemistry at carbon atoms C-5, C-10, C-12 and C-14.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition which contains the collinolactone produced or producible according to the invention or at least one of its bioactive derivatives.
  • the invention relates to the use of the collinolactone produced or producible according to the invention or at least one bioactive derivative for the production of a pharmaceutical composition for the treatment, diagnosis and/or prophylaxis of diseases, preferably neurodegenerative diseases, in particular Alzheimer's or dementia.
  • the invention includes the following specific embodiments.
  • the invention includes an isolated gene cluster which is preferably functional for the synthesis or a partial synthetic step of the biosynthesis of collinolactone.
  • the isolated gene cluster of this aspect is an isolated gene cluster from any other aspect of the invention.
  • the gene cluster disclosed here generally also contains a promoter and one or more operators.
  • the gene cluster can contain at least one promoter which has a strong effect in Streptomyces, for example a promoter from the kasOp family, preferably a kasOp* promoter.
  • the isolated gene cluster comprises at least 2 of the nucleic acid sequences which have a match of at least 80%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, particularly preferably at least 98%, in particular 99%-100% have the nucleic acid sequence consisting of a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID No. 13 to SEQ ID No. 15, and which preferably code for a protein or peptide which is preferably functional for the synthesis or a partial synthesis step of Biosynthesis of collinolactone is.
  • the isolated gene cluster comprises at least 3 of the nucleic acid sequences which have a match of at least 80%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, particularly preferably at least 98%, in particular 99%-100% with the Have a nucleic acid sequence consisting of a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID No. 13 to SEQ ID No. 15, and which preferably code for a protein or peptide which is preferably functional for the synthesis or a partial synthesis step of the biosynthesis of collinolactone.
  • the isolated gene cluster comprises at least 2 of the nucleic acid sequences which have a match of at least 80%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, particularly preferably at least 98%, in particular 99%-100% with the Have a nucleic acid sequence consisting of the nucleic acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID No. 14 and SEQ ID No. 15, and which preferably code for a protein or peptide which is preferably functional for the synthesis or a partial synthesis step of the biosynthesis of collinolactone.
  • the isolated gene cluster comprises at least 2 of the nucleic acid sequences which have a match of at least 80%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, particularly preferably at least 98%, in particular 99%-100% with the Have a nucleic acid sequence consisting of a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID No. 2 to SEQ ID No. 28 or SEQ ID No. 56 and combinations thereof, and which preferably encode a protein or peptide.
  • the isolated gene cluster comprises at least one, preferably at least two, preferably at least 3, preferably at least 4, etc., nucleic acid sequences which have a match of at least 80%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, particularly preferably at least 98%, in particular 99%-100% with the nucleic acid sequence consisting of a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID Nos. 5, 6, 10 and 28, preferably SEQ ID No. 5, 10 and 28, and which encode a protein or peptide functional for the synthesis or a partial synthetic step of the biosynthesis of collinolactone.
  • the isolated gene cluster comprises at least one, preferably at least 2, nucleic acid sequences which have a match of at least 80%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, particularly preferably at least 98%, in particular 99%-100% with the nucleic acid sequence consisting of a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID Nos. 2 and 9, which preferably code for a protein or peptide.
  • the isolated gene cluster can comprise or consist of any nucleic acid sequences mentioned in this document.
  • the isolated nucleic acid sequence has a match of at least 80%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, particularly preferably at least 98%, in particular 99%-100% with the nucleic acid sequence consisting of one nucleic acid -Sequence selected from the group consisting of SEQ ID Nos. 2, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 15, 16, 28 and/or combinations thereof, and preferably encodes a protein or peptide which is functional for the synthesis or a partial synthetic step of the biosynthesis of collinolactone.
  • the isolated nucleic acid sequence has a match of at least 80%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, particularly preferably at least 98%, in particular 99%-100% with the nucleic acid sequence consisting of one nucleic acid -Sequence selected from the group consisting of SEQ ID Nos. 5, 10, 13, 14, 15, 28 and preferably encodes a protein or peptide which is functional for the synthesis or a partial synthetic step of the biosynthesis of collinolactone.
  • the isolated nucleic acid sequence has a match of at least 80%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, particularly preferably at least 98%, in particular 99%-100% with the nucleic acid sequence consisting of one nucleic acid -Sequence selected from the group consisting of SEQ ID Nos. 2, 5, 9, 10, 13, 14, 15, 28, preferably from the group consisting of SEQ ID Nos. 2, 9, 14, 15, and preferably encodes a protein or peptide which is functional for the synthesis or a partial synthesis step of the biosynthesis of collinolactone.
  • the isolated nucleic acid sequence has a match of at least 80%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, particularly preferably at least 98%, in particular 99%-100% with the nucleic acid sequence consisting of one nucleic acid -Sequence selected from the group consisting of SEQ ID No. 13 to SEQ ID No. 15, more preferably selected from the group consisting of SEQ ID No. 14 and SEQ ID No. 15, and preferably encodes a protein or peptide which is functional for the synthesis or a partial synthetic step in the biosynthesis of collinolactone and is a T1PKS subunit.
  • the isolated nucleic acid sequence has a match of at least 80%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, particularly preferably at least 98%, in particular 99%-100% with the nucleic acid sequence consisting of one nucleic acid -Sequence selected from the group consisting of SEQ ID Nos. 5, 6, 10 and 28, preferably selected from the group consisting of SEQ ID Nos. 5, 10 and 28, and preferably encodes a protein or peptide which is functional for the Synthesis or a partial synthetic step in the biosynthesis of collinolactone and is a monooxygenase.
  • the invention includes, in another specific aspect, a set of isolated proteins or peptides, which is preferably functional for the synthesis or a partial synthetic step of the biosynthesis of collinolactone, which is at least 2, preferably at least 3, preferably at least 4, and so on, isolated proteins or peptides includes.
  • the isolated proteins or peptides of this set of isolated proteins or peptides are selected from any of the proteins or peptides mentioned in this specification.
  • the set of isolated proteins or peptides is produced by expressing the isolated gene cluster of this document.
  • the set of isolated proteins or peptides comprises at least two, preferably at least three, preferably at least four, preferably at least five, and so on, isolated proteins or peptides which have a match of at least 80%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, particularly preferably at least 98%, in particular 99%-100% with the amino acid sequence consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID No. 29 to SEQ ID No. 55 and combinations thereof .
  • the set of isolated proteins or peptides comprises at least two isolated proteins or peptides, which are preferably functional for a partial synthesis step of the biosynthesis of collinolactone, which have a correspondence of at least 80%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, particularly preferably at least 98%, in particular 99%-100% having the amino acid sequence consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID No. 40 to SEQ ID No. 42.
  • the isolated protein or peptide which is preferably functional for the synthesis or a partial synthesis step of the biosynthesis of collinolactone, has a correspondence of at least 80%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, particularly preferably at least 98%, in particular 99%-100% having the amino acid sequence consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 29, 32, 33, 36, 37, 40, 41, 42, 43, and 55 and/or combinations thereof.
  • the isolated protein or peptide which is preferably functional for the synthesis or a partial synthesis step of the biosynthesis of collinolactone, has a match of at least 80%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, particularly preferably at least 98%, in particular 99%-100% with the amino acid sequence consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID Nos. 29, 32, 36, 37, 40, 41, 42, and 55, preferably selected from the Group consisting of SEQ ID Nos. 29, 36, 41, and 42.
  • the isolated protein or peptide which is preferably functional for the synthesis or a partial synthesis step of the biosynthesis of collinolactone, has a match of at least 80%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, particularly preferably at least 98%, in particular 99%-100% with the amino acid sequence consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID Nos. 29 and 36.
  • the isolated protein or peptide which is preferably functional for the synthesis or a partial synthesis step of the biosynthesis of collinolactone, has a match of at least 80%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, particularly preferably at least 98%, in particular 99%-100% with the amino acid sequence consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID Nos. 32, 37, 40, 41, 42, and 55.
  • the isolated protein or peptide which is preferably functional for the synthesis or a partial synthesis step of the biosynthesis of collinolactone and is a T1PKS subunit, has an identity of at least 80%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, particularly preferably at least 98%, in particular 99%-100% with the amino acid sequence consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID No. 40 to SEQ ID No. 42.
  • the isolated protein or peptide which is preferably functional for the synthesis or a partial synthetic step of the biosynthesis of collinolactone and is a T1PKS subunit, preferably has a identity of at least 80%, preferably at least 90% at least 95%, particularly preferably at least 98%, in particular 99%-100% with the amino acid sequence consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID No. 41 and SEQ ID No. 42.
  • the isolated protein or peptide which is preferably functional for the synthesis or a partial synthesis step of the biosynthesis of collinolactone and is a monooxygenase or has similarity to a monooxygenase, has a correspondence of at least 80%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, particularly preferably at least 98%, in particular 99%-100% with the amino acid sequence consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID Nos. 32, 33, 40 and 55, preferably SEQ ID No. 32, 40 and 55.
  • an isolated nucleic acid sequence which has a correspondence of at least 80%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, particularly preferably at least 98%, in particular 99%-100% with the nucleic acid sequence which is responsible for the isolated proteins and or peptides of the specific embodiments.
  • the expression vector contains at least one isolated gene cluster according to the invention, which is disclosed in this document.
  • the expression vector preferably also contains at least one nucleic acid according to the invention and described.
  • the expression vector preferably contains at least one strong promoter, preferably a promoter from the kasOP family, in particular a kasOP*
  • the host cell contains at least one set of isolated proteins or peptides disclosed in this document, a gene cluster disclosed in this document, a peptide or protein disclosed in this document, and/or an expression vector disclosed in this document.
  • the host cell is preferably a Streptomyces Gö 40/10 pKC1218-KasOp_luxR cell.
  • Gö 40/10 cell contains a nucleic acid which has a correspondence of at least 80%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, particularly preferably at least 98%, in particular 99%-100% with the nucleic acid sequence consisting of the nucleic acid - Sequence SEQ ID No. 56.
  • the method for the biosynthesis of collinolactone comprises an alternative step of a) culturing any collinolactone-producing host cell according to this invention; b) Purifying collinolactone from the cell and/or a culture medium used for the cell.
  • the absorber resin is separated from the culture medium in step b), preferably by means of centrifugation, and then the absorber resin is extracted.
  • the extraction of the absorber resin preferably comprises an extraction with acetone, an extraction with toluene and/or at least one purification by column chromatography.
  • the invention relates to the substance collinolactone or a bioactive derivative thereof, produced or producible using the proteins or peptides described here, sets of isolated proteins or peptides, nucleic acids, gene clusters, expression vectors,
  • the cultures are inoculated with an approximately 48 hour old preculture.
  • At least one precursor compound for the biosynthesis of collinolactone is added to the culture medium when culturing the collinolactone-producing host cell approximately 8 hours after the start of fermentation.
  • the absorber resin is treated with the following sequential steps before addition to the culture medium:
  • the invention includes collinolactone or the pharmaceutical composition disclosed in this specification for the treatment of a disease, preferably a neurodegenerative disease, preferably Alzheimer's or dementia.
  • an isolated gene cluster an isolated nucleic acid sequence, an isolated amino acid sequence, an isolated peptide or protein or a set of isolated proteins or peptides
  • a gene cluster a nucleic acid sequence, an amino acid sequence, a peptide or protein, or a set of isolated proteins or peptides. This preferably also applies vice versa.
  • the object of the present invention is also achieved by a protein or peptide according to items 1 or 4, a nucleic acid according to items 2 and 3, a gene cluster or operon according to item 5 or 6, an expression vector according to claim 7, a host cell according to item 8 , a method according to items 9 to 11 , collinolactone or its bioactive derivative according to item 12, a pharmaceutical composition according to item 13, and a use according to item 14.
  • Subject 1 Isolated protein or peptide which is functional for a partial synthesis step of the biosynthesis of collinolactone, which corresponds to at least 80%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, particularly preferably at least 98%, in particular 99%-100% having the amino acid sequence consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID No. 29 to SEQ ID No. 55 and combinations thereof.
  • Item 2 Isolated nucleic acid consisting of a nucleic acid sequence which has a match of at least 80%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, particularly preferably at least 98%, in particular 99%-100% with the nucleic acid sequence, which encodes a protein or peptide according to item 1.
  • Item 3 Isolated nucleic acid consisting of a nucleic acid sequence which has a match of at least 80%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, particularly preferably at least 98%, in particular 99%-100% with the nucleic acid sequence, which is selected from the group consisting of SEQ ID No. 2 to SEQ ID No. 28 or SEQ ID No. 56 and combinations thereof.
  • Subject 4 Isolated protein or peptide, produced by expressing a gene consisting of a nucleic acid sequence that has a match of at least 80%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, particularly preferably at least 98%, in particular 99%-100 % with the Nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID No. 2 to SEQ ID No. 28 or SEQ ID No. 56 and combinations thereof.
  • Item 5 Isolated gene cluster consisting of at least two nucleic acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID No. 2 to SEQ ID No. 28 or SEQ ID No. 56 and combinations thereof.
  • Subject 6 Isolated gene cluster consisting of a nucleic acid sequence which has a match of at least 80%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, particularly preferably at least 98%, in particular 99%-100% with the nucleic acid sequence SEQ ID NO:1.
  • Subject 7 Expression vector containing at least one nucleic acid according to subject 2 or 3 or a gene cluster according to subject 5 or 6 and/or at least one strong promoter, preferably a promoter from the /casOp family, in particular a /casOp* promoter.
  • Item 8 Host cell containing at least one protein or peptide according to item 1 or 4, at least one nucleic acid according to item 2 or 3, a gene cluster according to item 5 or 6 and/or an expression vector according to item 7.
  • Item 9 A method for the biosynthesis of collinolactone, comprising the steps of: a) culturing a collinolactone-producing host cell according to item 8; b) Purifying collinolactone from the cell and/or a culture medium used for the cell.
  • Subject 10 Method according to subject 9, wherein when culturing the collinolactone-producing host cell at least one precursor compound for the biosynthesis of collinolactone is added to the culture medium, which is preferably selected from the group consisting of alkynic acids, alkenoic acids, dicarboxylic acids, their esters and thioesters and their salts , especially acetate, propionate and malonate.
  • the culture medium which is preferably selected from the group consisting of alkynic acids, alkenoic acids, dicarboxylic acids, their esters and thioesters and their salts , especially acetate, propionate and malonate.
  • Item 11 Method according to one of items 9 and 10, wherein an adsorbent, preferably an adsorber resin, is added to the culture medium during cultivation of the collinolactone-producing host cell, or product recovery is mediated in the dialysis process with diluent solutions.
  • an adsorbent preferably an adsorber resin
  • Item 12 Collinolactone or its bioactive derivative produced or producible using a protein or peptide of item 1 or 4, a nucleic acid of item 2 or 3, a gene cluster of item 5 or 6, an expression vector of item 7, a host cell under Item 8, or a method under Items 9 through 11.
  • Item 13 Pharmaceutical composition containing collinolactone or at least one of its bioactive derivatives according to item 12.
  • Subject 14 Use of the collinolactone or its bioactive derivative according to subject 12 for the production of a pharmaceutical composition for the treatment, diagnosis and/or prophylaxis of diseases, preferably neurodegenerative diseases, in particular Alzheimer's or dementia.
  • Figure 1 Structure of collinolactone compared to the prior art stereochemistry of rhizolutin.
  • Figure 2 Proposed biosynthesis of collinolactone via a type I PKS pathway deduced by 13 C-isotope-labeled precursor feeding experiments.
  • Figure 3 The identified and characterized gene cluster responsible for collinolactone biosynthesis. Functions of individual genes of the gene cluster according to the invention for collinolactone biosynthesis:
  • FIG. 4 Fermentation curve of the wild-type Streptomyces Gö 40/10 and the overproducer strain Streptomyces Gö 40/10 pKC1218-KasOp_luxR.
  • B Production of the wild-type strain Streptomyces Gö 40/10 (left) in comparison to the control strain Streptomyces Gö with the hygromycin resistance plasmid pKC1218 (middle) and the overproducer strain Streptomyces Gö 40/10 pKC1218-KasOpJuxR.
  • collinolactone produced according to the invention.
  • Collinolactone was tested in concentrations of 1 - 25 mM regarding its neuroprotective properties against glutamate-induced oxidative intracellular stress against HT22 cells.
  • the result of the MTT test is presented as the mean ⁇ standard deviation of three independent replicates in six replicates. Untreated cells were normalized to 100%. Significance level: *p ⁇ 0.05; **p ⁇ 0.01; ***p ⁇ 0.001; #p ⁇ 0.05; ##p ⁇ 0.01 ; ###p ⁇ 0.001.
  • the strains were stored in the form of glycerol stocks at - 80 °C.
  • the respective strain was inoculated onto an SM agar plate and incubated at 28° C. for 7 days.
  • the densely overgrown plate was then wetted with 5 ml of a sterile 50% glycerol/water mixture and the spore lawn was scraped off the plate surface with an inoculation loop.
  • the suspension was filtered through cotton and the spores pelleted by centrifugation. The supernatant was removed and the pellet was then taken up in 25% glycerol-water mixture and vortexed thoroughly.
  • the solution was transferred to a cryo-tube and frozen at -80°C.
  • collinolactone is a product of polyketide biosynthesis. Accordingly, the typical building blocks for this biosynthetic pathway, acetate and propionate, were fed in isotopically labeled, the product collinolactone was isolated (method see below) and its incorporation into the carbon skeleton was investigated using 13 C-NMR spectroscopy. It could be determined that collinolactone is made up of 6 acetate or malonate units and 3 propionate or methyl malonate units.
  • sgRNAs were derived using the software CRISpy-web (6) (Table S1), cloned into the pCRISPR-BEST vector and individually via interspecies conjugation via E. coli ET12567 pUZ8007 in S.sp. Gö 40/10 transferred (7) and via nalidixic acid (30 pg/ml) and apramycin (50 pg/ml) selected for clones with transferred plasmid.
  • regions 3 and 39 An alternative approach was chosen for regions 3 and 39, in which an internal fragment of the genes LLPMBPKK_00537 (region 3) and LLPMBPKK_07936 (region 39) was PCR-amplified with template genomic DNA from S. sp. Gö 40/10 and the primers GoR3_0537_R_Fw, GoR3_0537_R_Rv or GoR39_07936_R_Fw and GoR39_07936_R_Rv.
  • the primers contain restriction sites for EcoRI and HindIII, via which the PCR fragment was cloned with the 3.0 kb EcoRI-HindIII fragment of plasmid pSOK201, which contains a ColE1 origin of replication, oriT and an apramycin resistance gene (8). Both plasmids were introduced into S. sp. Gö 40/10 transferred.
  • Table S2 List of oligonucleotide primers to validate CRISPR-BEST editing and amplification of internal gene regions for gene inactivation of region 3 and 39.
  • the identified genomic region 23 (SEQ ID No. 1) encodes three genes encoding putative type I polyketide synthases ⁇ colL, colM, coIN, SEQ ID Nos. 13-15). It is assumed that the interaction of these genes/gene products forms the carbon backbone of the collinolactone. Also included in SEQ ID No.1 three genes that show similarities to monooxygenases that may be involved in the postulated Baeyer-Villiger oxidation reaction (colD, coli, colZA; SEQ ID Nos. 5, 10, 28). With colA (SEQ ID No. 2), the BGC also contains a gene which codes for a potential transcription activator of the LuxR family, and with colH (SEQ ID No. 9), a putative transporter gene.
  • the collinolactone BGC encodes a putative positive regulator of the LuxR family with colA (SEQ ID NO:2).
  • a DNA fragment consisting of the kasOp* promoter and the colA gene (SEQ ID No. 2) flanked by a HindIII and XbaI restriction site was synthesized (Genscript Biotech, Leiden, NL) (SEQ ID No. 56) and cloned delivered in the vector pUC57.
  • the HindIII/XbaI fragment was then cloned into the vector pKC1218 via these restriction sites. For transfer into S. sp. Gö 40/10, E.
  • coli ET12567 pUZ8002 was then transformed with this pKC1218 kasOp*-colA construct and used for conjugation using the standard protocol (7). After selection with nalidixic acid (30 pg/ml) and hygromycin (50 pg/ml), single colonies were obtained and used for further experiments.
  • Cultivation was carried out starting from cryo stocks of the respective strains.
  • a colony forming unit test was carried out beforehand. For this purpose, a defined amount (100 ⁇ l) of spore suspension was removed and gradually diluted in sterilized water (1:10 per dilution step). The individual dilutions were streaked onto SM agar plates (see storage) and incubated for 72 hours at 28 °C. The number of colonies formed was determined by manual counting.
  • Incubation was carried out at 28°C and 165 rpm for a total of 144 hours. 1 ml culture was taken every 24 hours, centrifuged and the supernatant analyzed by LC-DAD-MS.
  • the adsorber resin is prepared as follows:
  • the cultures were inoculated with 10 ml of a 48 hour old preculture.
  • a sterile-filtered solution of sodium propionate and malonic acid (each 500 mg/l culture) with a pH value of 7 (adjusted by addition of NaOH) was added 8 hours after the start of the fermentation.
  • the cultivation and production can be done either in shake flasks or in the fermenter.
  • the processing takes place after 48 hours or after 96 hours for Streptomyces Gö 40/10 pKC1218-KasOp_luxR.
  • the culture is centrifuged and the supernatant discarded. Due to the added XAD-16, this contains no collinolactone.
  • the residue obtained is extracted three times with stirring, each time with 2 l of acetone, until the extract obtained is almost colorless.
  • the solvent of the combined extracts is removed and the residue is taken up in 300 ml of water before being extracted three times with 200 ml of toluene.
  • the diluent solutions of product in demineralized water with 5% dimethyl sulfoxide are lyophilized in the cold until a dry residue is obtained.
  • the residue obtained is extracted three times with stirring, each time with 2 l of acetone, until the extract obtained is almost colorless.
  • the solvent of combined extracts are removed and the residue is taken up in 300 ml of water before being extracted three times with 200 ml of toluene.
  • Flash chromatography A: diisopropyl ether, B: acetone at 20 mL/min.
  • the individual gradient steps are as follows: 5 min 2% B, 10 min 8% B, 20 min 8% B, 25 min 16% B, 35 min 16% B, 40 min 20% B, 45 min 20% B .
  • the collinolactone produced by the method described above was tested at concentrations of 1-25 mM for its neuroprotective properties against glutamate-induced oxidative intracellular stress against HT22 cells.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Biophysics (AREA)

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte Nukleinsäuren, Proteine oder Peptide, Sätze derselben, Gen-Cluster, Expressionsvektoren, Wirtszellen, Verfahren zur Biosynthese, gentechnologisches Verfahren zur Optimierung der Produktausbeute, biotechnologisch hergestelltes Collinolacton und seine Derivate, sowie ihre Verwendung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung, Diagnose und / oder Prophylaxe von Krankheiten, insbesondere von neurodegenerativen Erkrankungen.

Description

Anmelder:
Eberhard Karls Universität Tübingen
Geschwister-Scholl-Platz
72074 Tübingen
Deutschland
Danmarks Tekniske Universitet Anker Engelunds Vej 101 2800 Köngens Lyngby Denmark
Collinolacton-Biosynthese und Herstellung Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte Nukleinsäuren, Proteine oder Peptide, Gen-Cluster, Expressionsvektoren, Wirtszellen, Verfahren zur Biosynthese, gentechnologisches Verfahren zur Optimierung der Produktausbeute, biotechnologisch hergestelltes Collinolacton und seine Derivate, sowie ihre Verwendung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung, Diagnose und / oder Prophylaxe von Krankheiten, insbesondere von neurodegenerativen Erkrankungen.
Collinolacton ist ein Naturstoff, der aus einem Streptomyces sp. Stamm isoliert und charakterisiert wurde und für den eine Schutzwirkung vor oxidativem Stress gezeigt wurde. Bei der Struktur des Collinolactons handelt es sich um ein tricyclisches Cyclodecatrien-Ringsystem mit zwei Lactonen, einem Sechsring und einem Siebenring, die den Cyclodecatrienring umrahmen (Fig. 1).
Eine Substanz mit der gleichen Strukturformel mit dem Namen Rhizolutin wurde isoliert (Fig. 1) und ihre potentielle Verwendung zur Behandlung oder Prophylaxe neurodegenerativer Erkrankungen, insbesondere von Alzheimer, diskutiert (1).
Eine chemische Synthese von Collinolacton ist wegen struktureller Komplexität bislang nicht gelungen.
Eine fermentative Herstellung von Collinolacton mit einer anschließenden Aufreinigung lieferte bislang relativ geringe Produktionsraten von maximal 0,03 mg/l in einem Standardmedium und von maximal 0,3 mg/l in einem optimierten Nährmedium nach Zugabe von Wurzelpulver der Panax ginseng und Olivenöl (1).
Die Verwendung von Adsorberharz bei der Aufreinigung führte zur Erhöhung der Ausbeute von Collinolacton auf bis zu 20 mg/l (2).
Die im Stand der Technik beschriebenen Ausbeuten reichen jedoch nicht für die Herstellung von Collinolacton im industriellen Maßstab, um seine Verwendung z.B. im medizinischen Bereich interessant zu machen. Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mittel und Verfahren bereitzustellen, die eine Herstellung von Collinolacton mit einer höheren als vom Stand der Technik bekannt und für eine wirtschaftliche Verwendung geeignete Produktionsrate ermöglichen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein isoliertes Gen-Cluster nach einem der Ansprüche 1 bis 7, durch einen Satz isolierter Proteine oder Peptide nach einem der Ansprüche 8 bis 10, durch einen Expressionsvektor nach Anspruch 11 , durch eine Wirtszelle nach Anspruch 12, durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, Collinolacton oder sein bioaktives Derivat nach Anspruch 16, eine pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 17, sowie eine Verwendung nach Anspruch 18 oder 19. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch ausdrückliche Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht.
Den Erfindern ist es erstmalig gelungen, in einem Bakterienstamm Streptomyces sp. Gene und Proteine zu identifizieren, zu charakterisieren und bereitzustellen, die für die Biosynthese von natürlichem Collinolacton verantwortlich sind.
Dadurch ist eine im Vergleich zu den bekannten Verfahren zur Isolierung von Collinolacton effizientere Herstellung dieser Substanz, insbesondere in größeren Ausbeuten möglich. Folgende Erfindungsgegenstände bilden hierfür die Grundlage.
In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes Protein oder Peptid, das für einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese von Collinolacton funktional ist, d. h. die Durchführung eines solchen Teilsyntheseschrittes ermöglicht.
Der Begriff Biosynthese bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung nicht nur eine intrazelluläre Synthese, sondern umfasst auch die Aufnahme in eine Zelle sowie Ausschleusung aus einer Zelle über die Zellmembran und / oder Zellwand.
Der Begriff Protein kann im Sinne der vorliegenden Erfindung nicht nur ein einzelnes erfindungsgemäßes Protein oder Peptid, sondern auch eine Kombination von mehreren verschiedenen erfindungsgemäßen Proteinen bzw. Peptiden bedeuten.
Ein erfindungsgemäßes Protein oder Peptid kann biotechnologisch oder chemisch hergestellt sein. Alternativ kann ein erfindungsgemäßes Protein oder Peptid aus einem Bakterium, insbesondere aus einem Bakterium der Gattung Streptomyces, stammen bzw. einem solchen Bakterium entnommen sein.
Das Protein oder Peptid besteht aus einer Aminosäure-Sequenz, die eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Aminosäure-Sequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 29 bis SEQ ID 55. Die biologischen Aktivitäten einzelner Proteine oder Peptide sind jeweils in den Sequenzprotokollen SEQ ID Nr. 29 bis SEQ ID 55 angegeben.
Die Erfindung betrifft ferner eine isolierte Nukleinsäure, welche für ein Protein oder Peptid codiert, welches für einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese von Collinolacton funktional ist, d. h. die Durchführung eines solchen Teilsyntheseschrittes ermöglicht.
Die Nukleinsäure besteht aus einer Nukleinsäure-Sequenz, die eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Nukleinsäure-Sequenz aufweist, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 2 bis SEQ ID Nr. 28 oder SEQ ID Nr. 56.
Der Begriff Nukleinsäure kann im Sinne der vorliegenden Erfindung nicht nur eine einzelne Nukleinsäure, sondern auch eine Kombination von mehreren verschiedenen Nukleinsäuren bedeuten. Weiterhin kann der Begriff Nukleinsäure im Sinne der vorliegenden Erfindung eine DNA oder eine RNA bedeuten und kann insbesondere ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Gen bzw. offenes Leseraster (Open Reading Frame, ORF), cDNA und mRNA. Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure kann chemisch oder rekombinant, d. h. gentechnologisch, hergestellt sein.
Alternativ kann eine erfindungsgemäße Nukleinsäure aus einem Bakterium, insbesondere aus einem Bakterium der Gattung Streptomyces stammen bzw. einem solchen Bakterium entnommen sein.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine isolierte Nukleinsäure, welche vorzugsweise für ein Protein oder Peptid codiert, welches für einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese von Collinolacton funktional ist, d. h. die Durchführung eines solchen Teilsyntheseschrittes ermöglicht, wobei die Nukleinsäure aus einer Nukleinsäure-Sequenz besteht, die eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Nukleinsäure-Sequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 2 bis SEQ ID Nr. 28 oder SEQ ID Nr. 56.
Die oben genannten Nukleinsäure-Sequenzen codieren bevorzugt wie folgt:
SEQ ID Nr. 2 für eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 29,
SEQ ID Nr. 3 für eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 30,
SEQ ID Nr. 4 für eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 31 ,
SEQ ID Nr. 5 für eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 32,
SEQ ID Nr. 6 für eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 33,
SEQ ID Nr. 7 für eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 34,
SEQ ID Nr. 8 für eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 35,
SEQ ID Nr. 9 für eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 36,
SEQ ID Nr. 10 für eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 37,
SEQ ID Nr. 11 für eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 38,
SEQ ID Nr. 12 für eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 39,
SEQ ID Nr. 13 für eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 40,
SEQ ID Nr. 14 für eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 41 ,
SEQ ID Nr. 15 für eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 42,
SEQ ID Nr. 16 für eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 43,
SEQ ID Nr. 17 für eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 44, SEQ ID Nr. 18 für eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 45,
SEQ ID Nr. 19 für eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 46,
SEQ ID Nr. 20 für eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 47,
SEQ ID Nr. 21 für eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 48,
SEQ ID Nr. 22 für eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 49,
SEQ ID Nr. 23 für eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 50,
SEQ ID Nr. 24 für eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 51 ,
SEQ ID Nr. 25 für eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 52,
SEQ ID Nr. 26 für eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 53,
SEQ ID Nr. 27 für eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 54,
SEQ ID Nr. 28 für eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 55.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes Protein oder Peptid, welches vorzugsweise funktional ist für einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese von Collinolacton, d. h. die Durchführung eines solchen Teilsyntheseschrittes ermöglicht, wobei das Protein bzw. Peptid mittels Expression eines Gens bzw. offenen Leserasters hergestellt ist und das Gen bzw. offene Leseraster aus einer Nukleinsäure-Sequenz besteht, die eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Nukleinsäure-Sequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 2 bis SEQ ID Nr. 28 oder SEQ ID Nr. 56.
Die Erfindung umfasst des Weiteren ein isoliertes Gen-Cluster, welches vorzugsweise für die Biosynthese von Collinolacton funktional ist, d. h. die Durchführung einer solchen Biosynthese ermöglicht (Fig. 3).
Der Begriff Gen-Cluster bedeutet eine Funktionseinheit der DNA von Prokaryoten und manchen Eukaryoten, die sie zur Regulation von solchen Genen anwenden, deren Produkte (Proteine oder Peptide) an zusammenhängenden Prozessen, beispielsweise einer Biosynthese einer Substanz, beteiligt sind. Derartige Gene liegen vor allem bei Bakterien auf einem einzelnen Chromosom in Strukturen, die als Gen-Cluster bezeichnet werden, nebeneinander und können zusammen unter der Kontrolle einer oder mehrerer regulatorischer Sequenzen transkribiert werden. Ein Gen-Cluster kann grundsätzlich aber auch mehrere Promotoren und Operons enthalten und auch von mehreren Regulatoren kontrolliert werden.
Das oben erwähnte Gen-Cluster enthält in der Regel ferner einen Promotor sowie einen oder mehrere Operatoren. Insbesondere kann das Gen-Cluster mindestens einen in Streptomyces starkwirkenden Promotor enthalten, z.B. einen Promotor aus der Familie /casOp, bevorzugt einen /casOp* Promotor.
Das Gen-Cluster besteht aus wenigstens zwei Nukleinsäure-Sequenzen, deren Genprodukte eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Aminosäure-Sequenz aufweist, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 29 bis SEQ ID Nr. 55 und Kombinationen davon. Das Gen-Cluster kann insbesondere aus allen der im vorherigen Absatz genannten Nukleinsäure-Sequenzen bestehen.
Alternativ kann das Gen-Cluster insbesondere aus einer Nukleinsäure-Sequenz bestehen, die eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Nukleinsäure-Sequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist. Die Nukleinsäure-Sequenz SEQ ID Nr. 1 wurde von den Erfindern als das Gen-Cluster identifiziert und charakterisiert, welches in einem Bakterium der Gattung Streptomyces für die Collinolacton-Biosynthese zuständig ist.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen artifiziellen bzw. rekombinanten, d. h. gentechnologisch hergestellten, Expressionsvektor, d. h. ein Vehikel zur Übertragung wenigstens einer Nukleinsäure in eine Empfänger- oder Wirtszelle, die dann im Rahmen einer Genexpression wenigstens ein Protein bzw. Peptid, für welches die wenigstens eine Nukleinsäure codiert, exprimiert. Der Expressionsvektor enthält wenigstens eine erfindungsgemäße, oben beschriebene Nukleinsäure.
Alternativ kann der Expressionsvektor ein erfindungsgemäßes, oben beschriebenes Gen-Cluster enthalten. Bei dem Expressionsvektor kann es sich grundsätzlich um ein Plasmid oder ein Cosmid handeln. Bevorzugt ist ein Plasmid bzw. Cosmid, das in das Chromosom von Bakterien der Gattung Streptomyces integrieren kann oder als replikatives Plasmid, Cosmid, Fosmid oder „Bacterial Artificial Chromosome“ in der Zelle existiert und native oder entsprechend konstitutive oder induzierbare (regulierbaren) Promotoren enthält.
Der erfindungsgemäße Expressionsvektor eignet sich sowohl zur Durchführung einer homologen Expression als auch zur Durchführung einer heterologen Expression.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine artifizielle bzw. rekombinante, d. h. biotechnologisch hergestellte, Collinolacton-produzierende Wirtszelle. Die Wirtszelle zeichnet sich dadurch aus, dass sie alternativ oder in Kombination wenigstens eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, wenigstens eines der erfindungsgemäßen Proteine oder Peptide, ein erfindungsgemäßes Gen-Cluster, oder einen erfindungsgemäßen Expressionsvektor enthält.
Bei der Wirtszelle kann es sich grundsätzlich um eine eukaryotische oder prokaryotische Zelle handeln, die insbesondere aus der Gruppe bestehend aus Bakterienzelle, Hefezelle und Pilzzelle ausgewählt sein kann. Besonders bevorzugt als Wirtszelle ist ein Bakterium der Gattung Streptomyces. Des Weiteren kann es sich bei der Wirtszelle um eine homologe oder heterologe Wirtszelle handeln.
Die Wirtszelle kann in einerweiteren Ausführungsform mittels Transformation, Transduktion, Transfektion oder Konjugation, insbesondere unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Expressionsvektors, hergestellt oder herstellbar sein.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren für die Biosynthese von Collinolacton, umfassend die Schritte: a) Kultivieren einer Collinolacton- produzierenden erfindungsgemäßen Wirtszelle und b) Aufreinigung von Collinolacton aus der Zelle, einem zum Kultivieren verwendeten Kulturmedium oder der Reaktionslösung.
Zur Steigerung der Produktionsausbeute von Collinolacton können erfindungsgemäß folgende Kultivierungsparameter einzeln oder in Kombination folgendermaßen verändert werden: a) Hinzuzufügen wenigstens einer Vorläuferverbindung für die Biosynthese von Collinolacton dem Kulturmedium oder der Reaktionslösung, die insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend beispielhaft, jedoch nicht ausschließlich aus Alkinsäure, Alkensäure, Dicarbonsäure, deren Ester und Thioester sowie deren Salze, insbesondere Acetat, Propionat und Malonat; b) Hinzufügen von einem Adsorbens, bevorzugt einem Adsorberharz dem Kulturmedium bereits beim Kultivieren der Wirtszelle oder der Reaktionslösung bei der Reaktion und nicht erst bei der anschließenden Aufreinigung von Collinolacton zugegeben; c) In die Produktionskultur das Einfügen der Schritte (einfach bis mehrfach, bevorzugt dreifach) des zirkulierenden Produktionsmediums gegen die Volumina mit Nährmedium oder Verdünnerlösung des vorhergehenden Schrittes und Volumina mit Verdünnerlösung, oder in die chemische und chemisch-enzymatische Reaktion das Einfügen der Schritte (einfach bis mehrfach, bevorzugt dreifach) der zirkulierenden Reaktionslösung oder Verdünnerlösung des vorhergehenden Schrittes gegen die Volumina des Reaktionsgefäßes gegen die Volumina mit Verdünnerlösung im Dialyseverfahren mit semipermeablen Membranen, bevorzugt unterschiedlicher Porengrößen. Das Zielprodukt kann aus Verdünnerlösungen gewonnen werden, bevorzugt aus der in Reihenfolge dritten Verdünnerlösung.
Des Weiteren betrifft die Erfindung die Substanz Collinolacton oder ein bioaktives Derivat davon, hergestellt oder herstellbar unter Verwendung von oben beschriebenen Proteinen oder Peptiden, Nukleinsäuren, Gen-Cluster, Expressionsvektor, Wirtszelle oder Verfahren.
Die von den Erfindern vorgenommenen NMR und Kristallstrukturanalyse der nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellten Substanz zeigten überraschenderweise eine abweichende Strereochemie des Collinolacton-Moleküls, als die im Stand der Technik (1) beschriebene (Fig. 1). Das in der vorliegenden Erfindung charakterisierte Collinolacton unterscheidet sich vom Rhizolutin demnach in der Stereochemie an den Kohlenstoffatomen C-5, C-10, C-12 und C-14.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das erfindungsgemäß hergestellte oder herstellbare Collinolacton oder mindestens eines seiner bioaktiven Derivate enthält.
Schließlich betrifft die Erfindung eine Verwendung des erfindungsgemäß hergestellten oder herstellbaren Collinolactons oder mindestens eines bioaktiven Derivats zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung, Diagnose und / oder Prophylaxe von Krankheiten, bevorzugt von neurodegenerativen Erkrankungen, insbesondere von Alzheimer oder Demenz.
Zusätzlich, beinhaltet die Erfindung die folgenden speziellen Ausführungsformen. Die Erfindung beinhaltet in einem speziellen Aspekt ein isoliertes Gen-Cluster, das vorzugsweise funktional für die Synthese oder einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese von Collinolacton ist.
In speziellen Ausführungsformen ist vorzugsweise das isolierte Gen-Cluster dieses Aspekts ein isoliertes Gen-Cluster aus einem beliebigen anderen Aspekt der Erfindung.
In speziellen Ausführungsformen enthält das hier offenbarte Gen-Cluster in der Regel ferner einen Promotor sowie einen oder mehrere Operatoren. Insbesondere kann das Gen-Cluster mindestens einen in Streptomyces starkwirkenden Promotor enthalten, z.B. einen Promotor aus der Familie kasOp, bevorzugt einen kasOp* Promotor.
In einer bevorzugten speziellen Ausführungsform umfasst das isolierte Gen-Cluster, mindestens 2 der Nukleinsäure-Sequenzen, welche eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Nukleinsäure-Sequenz aufweisen, bestehend aus einer Nukleinsäure-Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 13 bis SEQ ID Nr. 15, und welche vorzugsweise für ein Protein oder Peptid codieren, welches vorzugsweise funktional für die Synthese oder einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese von Collinolacton ist.
In einer bevorzugten speziellen Ausführungsform umfasst das isolierte Gen-Cluster mindestens 3 der Nukleinsäure-Sequenzen, welche eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Nukleinsäure-Sequenz aufweisen, bestehend aus einer Nukleinsäure-Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 13 bis SEQ ID Nr. 15, und welche vorzugsweise für ein Protein oder Peptid codieren, welches vorzugsweise funktional für die Synthese oder einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese von Collinolacton ist.
In einer bevorzugten speziellen Ausführungsform umfasst das isolierte Gen-Cluster mindestens 2 der Nukleinsäure-Sequenzen, welche eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Nukleinsäure-Sequenz aufweisen, bestehend aus den Nukleinsäure-Sequenzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 14 und SEQ ID Nr. 15, und welche vorzugsweise für ein Protein oder Peptid codieren, welches vorzugsweise funktional für die Synthese oder einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese von Collinolacton ist.
In einer bevorzugten speziellen Ausführungsform umfasst das isolierte Gen-Cluster mindestens 2 der Nukleinsäure-Sequenzen, welche eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Nukleinsäure-Sequenz aufweisen, bestehend aus einer Nukleinsäure-Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 2 bis SEQ ID Nr. 28 oder SEQ ID Nr. 56 und Kombinationen davon, und welches vorzugsweise für ein Protein oder Peptid codieren.
In speziellen besonderen Ausführungsformen umfasst das isolierte Gen-Cluster mindestens eine, vorzugsweise mindestens zwei, vorzugsweise mindestens 3, vorzugsweise mindestens 4, usw., Nukleinsäure-Sequenzen, welche eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Nukleinsäure-Sequenz aufweisen, bestehend aus einer Nukleinsäure- Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 5, 6, 10 und 28, vorzugweise SEQ ID Nr. 5, 10 und 28, und welche für ein Protein oder Peptid codieren, welches funktional für die Synthese oder einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese von Collinolacton ist.
In speziellen besonderen Ausführungsformen umfasst das isolierte Gen-Cluster mindestens eine, bevorzugt mindestens 2 Nukleinsäure-Sequenzen, welche eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Nukleinsäure-Sequenz aufweist, bestehend aus einer Nukleinsäure-Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 2 und 9, welche vorzugsweise für ein Protein oder Peptid codieren.
Das isolierte Gen-Cluster kann insbesondere in den speziellen Ausführungsformen beliebige in dieser Schrift genannten Nukleinsäure-Sequenzen umfassen oder daraus bestehen.
In einer speziellen Ausführungsform weist die isolierte Nukleinsäure-Sequenz eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Nukleinsäure-Sequenz auf, bestehend aus einer Nukleinsäure-Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 2, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 15, 16, 28 und/oder Kombinationen davon, und codiert vorzugsweise für ein Protein oder Peptid, welches funktional für die Synthese oder einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese von Collinolacton ist.
In einer speziellen Ausführungsform weist die isolierte Nukleinsäure-Sequenz eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Nukleinsäure-Sequenz auf, bestehend aus einer Nukleinsäure-Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 5, 10, 13, 14, 15, 28, und codiert vorzugsweise für ein Protein oder Peptid, welches funktional für die Synthese oder einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese von Collinolacton ist.
In einer speziellen Ausführungsform weist die isolierte Nukleinsäure-Sequenz eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Nukleinsäure-Sequenz auf, bestehend aus einer Nukleinsäure-Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 2, 5, 9, 10, 13, 14, 15, 28, vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 2, 9, 14, 15, und codiert vorzugsweise für ein Protein oder Peptid, welches funktional für die Synthese oder einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese von Collinolacton ist.
In bevorzugten speziellen Ausführungsformen weist die isolierte Nukleinsäure- Sequenz eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Nukleinsäure-Sequenz auf, bestehend aus einer Nukleinsäure-Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 13 bis SEQ ID Nr. 15, besonders bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 14 und SEQ ID Nr. 15, und codiert vorzugsweise für ein Protein oder Peptid, welches funktional für die Synthese oder einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese von Collinolacton ist und eine T1PKS Untereinheit ist.
In bevorzugten speziellen Ausführungsformen weist die isolierte Nukleinsäure- Sequenz eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Nukleinsäure-Sequenz auf, bestehend aus einer Nukleinsäure-Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 5, 6, 10 und 28, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 5, 10 und 28, und codiert vorzugsweise für ein Protein oder Peptid, welches funktional für die Synthese oder einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese von Collinolacton ist und eine Monooxygenase ist.
Die Erfindung beinhaltet in einem weiteren speziellen Aspekt einen Satz isolierter Proteine oder Peptide, welcher vorzugsweise für die Synthese oder einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese von Collinolacton funktional ist, welcher mindestens 2, vorzugsweise mindestens 3, vorzugsweise mindestens 4, und so weiter, isolierte Proteine oder Peptide umfasst.
Vorzugsweise sind die isolierten Proteine oder Peptide dieses Satzes isolierter Proteine oder Peptide ausgewählt aus beliebigen der Proteinen oder Peptiden, welche in dieser Schrift genannt sind. Vorzugsweise ist der Satz isolierter Proteine oder Peptide mittels Expression des isolierten Gen-Clusters dieser Schrift hergestellt.
In einer speziellen Ausführungsform umfasst der Satz isolierter Proteine oder Peptide mindestens zwei, vorzugsweise mindestens drei, vorzugsweise mindestens vier, vorzugsweise mindestens fünf, und so weiter, isolierte Proteine oder Peptide, welche eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Aminosäure-Sequenz aufweisen, bestehend aus einer Aminosäure-Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend SEQ ID Nr. 29 bis SEQ ID Nr. 55 und Kombinationen davon.
In einer speziellen Ausführungsform umfasst der Satz isolierter Proteine oder Peptide mindestens zwei isolierte Proteine oder Peptide, welche vorzugsweise für einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese von Collinolacton funktional sind, welche eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Aminosäure-Sequenz aufweisen, bestehend aus einer Aminosäure-Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 40 bis SEQ ID Nr. 42.
In einer speziellen Ausführungsform weist das isolierte Protein oder Peptid, welches vorzugsweise funktional für die Synthese oder einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese von Collinolacton ist, eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Aminosäure-Sequenz auf, bestehend aus einer Aminosäure-Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 29, 32, 33, 36, 37, 40, 41, 42, 43, und 55 und/oder Kombinationen davon.
In speziellen bevorzugten Ausführungsformen weist das isolierte Protein oder Peptid, welches vorzugsweise funktional für die Synthese oder einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese von Collinolacton ist, eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Aminosäure-Sequenz auf, bestehend aus einer Aminosäure-Sequenz die ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 29, 32, 36, 37, 40, 41, 42, und 55, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend SEQ ID Nr. 29, 36, 41, und 42.
In speziellen bevorzugten Ausführungsformen weist das isolierte Protein oder Peptid, welches vorzugsweise funktional für die Synthese oder einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese von Collinolacton ist, eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Aminosäure-Sequenz auf, bestehend aus einer Aminosäure-Sequenz die ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 29 und 36.
In speziellen bevorzugten Ausführungsformen weist das isolierte Protein oder Peptid, welches vorzugsweise funktional für die Synthese oder einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese von Collinolacton ist, eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Aminosäure-Sequenz auf, bestehend aus einer Aminosäure-Sequenz die ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 32, 37, 40, 41, 42, und 55.
In speziellen bevorzugten Ausführungsformen weist das isolierte Protein oder Peptid, welches vorzugsweise funktional für die Synthese oder einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese von Collinolacton ist und eine T1PKS Untereinheit ist, eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Aminosäure-Sequenz auf bestehend aus einer Aminosäure-Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 40 bis SEQ ID Nr. 42.
In speziellen bevorzugten Ausführungsformen weist das isolierte Protein oder Peptid, welches vorzugsweise funktional für die Synthese oder einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese von Collinolacton ist und eine T1PKS Untereinheit ist, eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Aminosäure-Sequenz auf bestehend aus einer Aminosäure-Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 41 und SEQ ID Nr. 42.
In speziellen bevorzugten Ausführungsformen weist das isolierte Protein oder Peptid, welches vorzugsweise funktional für die Synthese oder einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese von Collinolacton ist und eine Monooxygenase ist oder Ähnlichkeit zu einer Monooxygenase aufweist, eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Aminosäure-Sequenz auf bestehend aus einer Aminosäure-Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 32, 33, 40 und 55, vorzugsweise SEQ ID Nr. 32, 40 und 55.
In speziellen Ausführungsform, eine isolierte Nukleinsäure-Sequenz, die eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Nukleinsäure-Sequenz aufweist, welche für die isolierten Proteine und oder Peptide der speziellen Ausführungsformen codiert.
In einer speziellen Ausführungsform enthält der Expressionsvektor wenigstens ein isoliertes erfindungsgemäßes Gen-Cluster, welches in dieser Schrift offenbart ist. Vorzugsweise enthält der Expressionsvektor außerdem wenigstens eine erfindungsgemäße, beschriebene Nukleinsäure.
In speziellen Ausführungsformen enthält vorzugsweise der Expressionsvektor mindestens einen starken Promotor, vorzugsweise einen Promotor aus der Familie kasOP, insbesondere einen kas OP*
In einer speziellen Ausführungsform enthält die Wirtszelle wenigstens einen in dieser Schrift offenbarten Satz isolierter Proteine oder Peptide, ein in dieser Schrift offenbartes Gen-Cluster, ein in dieser Schrift offenbartes Peptid oder Protein, und/oder einen in dieser Schrift offenbarten Expressionsvektor.
In speziellen Ausführungsformen ist vorzugsweise die Wirtszelle eine Streptomyces Gö 40/10 pKC1218-KasOp_luxR Zelle. Vorzugsweise bedeutet in diesem Kontext, dass eine Streptomyces sp. Gö 40/10 Zelle eine Nukleinsäure enthält, welche eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Nukleinsäure-Sequenz aufweist, bestehend aus der Nukleinsäure-Sequenz SEQ ID Nr. 56.
In einer alternativen speziellen Ausführungsform umfasst das Verfahren für die Biosynthese von Collinolacton einen alternativen Schritt a) das Kultivieren einer beliebigen Collinolacton-produzierenden Wirtszelle gemäß dieser Erfindung; b) Aufreinigen von Collinolacton aus der Zelle und/oder einem für die Zelle verwendeten Kulturmedium. In einer speziellen Ausführungsform des Verfahrens für die Biosynthese von Collinolacton wird in Schritt b) das Absorberharz vom Kulturmedium abgetrennt, vorzugsweise mittels Zentrifugation, anschließend das Absorberharz extrahiert.
Vorzugsweise umfasst in einer speziellen Ausführungsform das Extrahieren des Absorberharzes eine Extrahierung mit Aceton, eine Extrahierung mit Toluol und/oder mindestens eine säulenchromatographische Aufreinigung.
In weiteren speziellen Ausführungsformen betrifft die Erfindung die Substanz Collinolacton oder ein bioaktives Derivat davon, hergestellt oder herstellbar unter Verwendung der hier beschriebenen Proteine oder Peptiden, Sätze isolierter Proteine oder Peptide, Nukleinsäuren, Gen-Cluster, Expressionsvektoren,
Wirtszellen und/oder Verfahren.
In bevorzugten speziellen Ausführungsformen des Verfahrens für die Biosynthese von Collinolacton wird die Wirtszelle in einem Kulturmedium kultiviert, welches fettarmes Sojamehl, D-Mannit, D-Glucose, Hefeextrakt, Calciumcarbonat, deionisiertes Wasser, und/oder Absorberharz, sowie optional Hygromycin B, umfasst, und einen pH von ungefähr pH = 7 aufweist.
In bevorzugten speziellen Ausführungsformen werden die Kulturen mit einer ungefähr 48-Stunden-alten Vorkultur angeimpft.
Vorzugsweise umfasst in einer speziellen Ausführungsform die 48-Stunden-alte Vorkultur ein Kulturmedium, welches fettarmes Sojamehl, D-Mannit, und deionisiertes Wasser umfasst und einen pH von ungefähr pH = 7 aufweist.
Vorzugsweise in einer speziellen Ausführungsform dem Kulturmedium beim Kultivieren der Collinolacton-produzierenden Wirtszelle ungefähr 8 h nach Fermentationsbeginn wenigstens eine Vorläuferverbindung für die Biosynthese von Collinolacton zugefügt.
In einer alternativen speziellen Ausführungsform wird das Absorberharz vor Zugabe zum Kulturmedium mit den folgenden aufeinanderfolgenden Schritten behandelt:
I. Quellen des Absorberharzes, vorzugsweise in einer sauren Lösung, vorzugsweise in einer 1 N HCI-Lösung in Methanol;
II. Quellen des abgetrennten Absorberharzes in einer Lösung, vorzugsweise in Aceton;
III. Quellen des erneut abgetrennten Absorberharzes durch eine basische Lösung, vorzugsweise eine 1N wässrige Natriumhydroxidlösung;
IV. Waschen des Absorberharzes, vorzugsweise mit Wasser, vorzugsweise bis sich der Geruch des Acetons vollkommen verflüchtigt hat; wobei zwischen jedem der Schritte l-IV das Absorberharz von der Lösung, in der es gequollen wurde, abgetrennt wird, vorzugsweise durch Filtration und wobei vorzugsweise für eine Zeit von ungefähr 30 min gequollen wird. In einem weiteren speziellen Aspekt beinhaltet die Erfindung Collinolacton oder die in dieser Schrift offenbarte pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung einer Krankheit, vorzugsweise einer neurodegenerativen Krankheit, vorzugsweise Alzheimer oder Demenz.
Im Zusammenhang mit den speziellen Ausführungsformen und speziellen Aspekten dieser Schrift sind vorzugsweise die Definitionen und Ausführungsformen, welche sich auf ein isoliertes Gen-Cluster, eine isolierte Nukleinsäure-Sequenz, eine isolierte Aminosäure-Sequenz, ein isoliertes Peptid oder Protein odereinen Satz isolierter Proteine oder Peptide beziehen auch auf Gen-Cluster, eine Nukleinsäure-Sequenz, eine Aminosäure-Sequenz, ein Peptid oder Protein oder einen Satz isolierter Proteine oder Peptide anwendbar. Dies gilt vorzugsweise auch umgekehrt.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird ebenfalls gelöst durch ein Protein oder Peptid nach Gegenständen 1 oder 4, eine Nukleinsäure nach Gegenständen 2 und 3, ein Gen-Cluster oder Operon nach Gegenstand 5 oder 6, einen Expressionsvektor nach Anspruch 7, eine Wirtszelle nach Gegenstand 8, ein Verfahren nach Gegenständen 9 bis 11 , Collinolacton oder sein bioaktives Derivat nach Gegenstand 12, eine pharmazeutische Zusammensetzung nach Gegenstand 13, sowie eine Verwendung nach Gegenstand 14.
Die Erfindung betrifft außerdem die folgenden Ausführungsformen in Form von Gegenständen:
Gegenstand 1 : Isoliertes Protein oder Peptid, welches für einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese von Collinolacton funktional ist, die eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Aminosäure-Sequenz aufweist, bestehend aus einer Aminosäure-Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 29 bis SEQ ID Nr. 55 und Kombinationen davon.
Gegenstand 2: Isolierte Nukleinsäure, bestehend aus einer Nukleinsäure-Sequenz, die eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Nukleinsäure-Sequenz aufweist, die für ein Protein oder Peptid nach Gegenstand 1 codiert.
Gegenstand 3: Isolierte Nukleinsäure, bestehend aus einer Nukleinsäure-Sequenz, die eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Nukleinsäure-Sequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 2 bis SEQ ID Nr. 28 oder SEQ ID Nr. 56 und Kombinationen davon.
Gegenstand 4: Isoliertes Protein oder Peptid, hergestellt mittels Expression eines Gens, bestehend aus einer Nukleinsäure-Sequenz, die eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Nukleinsäure-Sequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 2 bis SEQ ID Nr. 28 oder SEQ ID Nr. 56 und Kombinationen davon.
Gegenstand 5: Isoliertes Gen-Cluster, bestehend aus wenigstens zwei Nukleinsäure- Sequenzen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 2 bis SEQ ID Nr. 28 oder SEQ ID Nr. 56 und Kombinationen davon.
Gegenstand 6: Isoliertes Gen-Cluster, bestehend aus einer Nukleinsäure-Sequenz, die eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Nukleinsäure-Sequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist.
Gegenstand 7: Expressionsvektor, enthaltend wenigstens eine Nukleinsäure nach Gegenstand 2 oder 3 oder ein Gen-Cluster nach Gegenstand 5 oder 6 und/oder mindestens einen starken Promotor, vorzugsweise einen Promotor aus der Familie /casOp, insbesondere einen /casOp* Promotor.
Gegenstand 8: Wirtszelle, enthaltend wenigstens ein Protein oder Peptid nach Gegenstand 1 oder 4, wenigstens eine Nukleinsäure gemäß Gegenstand 2 oder 3, ein Gen-Cluster nach Gegenstand 5 oder 6 und/oder einen Expressionsvektor nach Gegenstand 7.
Gegenstand 9: Verfahren für die Biosynthese von Collinolacton, umfassend die Schritte: a) Kultivieren einer Collinolacton-produzierenden Wirtszelle gemäß Gegenstand 8; b) Aufreinigen von Collinolacton aus der Zelle und/oder einem für die Zelle verwendeten Kulturmedium.
Gegenstand 10: Verfahren nach Gegenstand 9, wobei beim Kultivieren der Collinolacton-produzierenden Wirtszelle wenigstens eine Vorläuferverbindung für die Biosynthese von Collinolacton dem Kulturmedium hinzugefügt wird, die bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alkinsäuren, Alkensäuren, Dicarbonsäuren, deren Ester und Thioester sowie deren Salze, insbesondere Acetat, Propionat und Malonat.
Gegenstand 11 : Verfahren nach einem der Gegenstände 9 und 10, wobei beim Kultivieren der Collinolacton-produzierenden Wirtszelle ein Adsorbens, bevorzugt ein Adsorberharz dem Kulturmedium hinzugefügt wird, oder im Dialyseverfahren mit Verdünnerlösungen die Produktgewinnung vermittelt wird.
Gegenstand 12: Collinolacton oder sein bioaktives Derivat, hergestellt oder herstellbar unter Verwendung eines Proteins oder Peptids nach Gegenständen 1 oder 4, einer Nukleinsäure nach Gegenständen 2 oder 3, eines Gen-Clusters nach Gegenstand 5 oder 6, eines Expressionsvektors nach Gegenstand 7, einer Wirtszelle nach Gegenstand 8, oder eines Verfahrens nach Gegenständen 9 bis 11.
Gegenstand 13: Pharmazeutische Zusammensetzung, die Collinolacton oder mindestens eines seiner bioaktiven Derivate gemäß Gegenstand 12 enthält. Gegenstand 14: Verwendung des Collinolactons oder seines bioaktiven Derivats nach Gegenstand 12 zur Fierstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung, Diagnose und / oder Prophylaxe von Krankheiten, bevorzugt von neurodegenerativen Erkrankungen, insbesondere von Alzheimer oder Demenz.
Es versteht sich, dass die Anwendung der Lehren der vorliegenden Erfindung auf ein spezifisches Problem oder eine spezifische Umgebung und die Einbeziehung von Variationen der vorliegenden Erfindung oder zusätzlicher Merkmale dazu (wie etwa weitere Aspekte und Ausführungsformen) innerhalb der Fähigkeiten eines Durchschnittsfachmanns angesichts der hierin enthaltenen Lehren sind.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Ansprüchen und Gegenständen wird die oben beschriebene Aufgabe durch jeden in dieser Schrift genannten Bestandteile oder Ausführungsformen oder jeden der oben genannten Permutationen oder Kombinationen gelöst.
In dieser Schrift werden die Bestandteile der Erfindung beschrieben. Diese Bestandteile sind mit spezifischen Ausführungsformen genannt. Die hier beschriebenen Ausführungsformen können in beliebiger Weise und in beliebiger Anzahl kombiniert werden können, um zusätzliche Ausführungsformen zu erzeugen. Die in verschiedener Weise beschriebenen Beispiele und bevorzugten Ausführungsformen sollten nicht so ausgelegt werden, dass sie die vorliegende Erfindung nur auf die explizit beschriebenen Ausführungsformen beschränken. Die vorliegende Beschreibung sollte so verstanden werden, dass sie Ausführungsformen unterstützt und umfasst, welche zwei oder mehr der explizit beschriebenen Ausführungsformen kombinieren oder welche eine oder mehrere der explizit beschriebenen Ausführungsformen mit einer beliebigen Anzahl der offenbarten und/oder bevorzugten Bestandteile kombinieren. Darüber hinaus sollten alle Permutationen und Kombinationen aller beschriebenen Bestandteile in dieser Anmeldung als durch die Beschreibung der vorliegenden Anmeldung offenbart betrachtet werden, es sei denn, der Kontext gibt etwas anderes vor.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus den nachfolgenden Beispielen in Verbindung mit den Figuren und Unteransprüchen. Diese Beispiele sind nur repräsentativ und sollen nicht so verstanden werden, dass sie den Umfang der vorliegenden Erfindung auf nur die gezeigten repräsentativen Beispiele beschränken.
Fiqurenbeschreibunq
Fig. 1. Struktur von Collinolacton im Vergleich zur aus dem Stand der Technik bekannten Stereochemie des Rhizolutins.
Fig. 2. Postulierte Biosynthese von Collinolacton über einen Typ I PKS Weg, abgeleitet durch 13C-isotopenmarkierte Vorstufen-Fütterungsexperimente.
Fig. 3. Das identifizierte und charakterisierte Gen-Cluster, welches für die Biosynthese von Collinolacton zuständig ist. Funktionen einzelner Gene des erfindungsgemäßen Gen-Clusters für die Collinolacton-Biosynthese:
Gene Genfunktion colA Positiver Transkriptionsregulator (luxR Familie) colB Unbekanntes Protein colC Asparaginsynthetase colD Flavinreductase colE Anthranilate 3-monooxygenase (4-Flydroxyphenylacetate 3- monooxygenase) colF Methyltransferase colG DNA-Bindeprotein colH Purin-Efflux-Pumpe PbuE coli Luziferase-ähnliche Monooxygenase colJ Protein der Class-Il DAFIP Synthetase Familie colK Methylenetetrahydrofolat-Reductase colL T1PKS Untereinheit colM T1PKS Untereinheit coIN T1PKS Untereinheit co/O Polyketidcyclase (SnoaL Familie) colP Chaperonprotein HtpG colQ Unbekanntes Protein coIR Methylmalonyl-Co-A Mutase (assoziiert mit GTPase MeaB) colS Methylmalonyl-Co-A Mutase colT Methylmalonyl-Co-A Mutase (Untereinheit beta) colU Membranprotein colV Zellzeilungsprotein SepF colW bldA-reguliertes Nucleotidebindungsprotein coIX Nucleotide-Pyrophosphohydrolase colY Unbekanntes Protein co/Z Unbekanntes Protein colZA Luziferase-ähnliche Monooxygenase
Fig. 4. A: Fermentationskurve des Wildtyp Streptomyces Gö 40/10 und des Überproduzentenstamm Streptomyces Gö 40/10 pKC1218-KasOp_luxR. B: Produktion des Wildtyp Stamm Streptomyces Gö 40/10 (links) um Vergleich zum Kontrollstamm Streptomyces Gö mit dem Hygromycin-Resistenzplasmid pKC1218 (Mitte) und dem Überproduzentenstamm Streptomyces Gö 40/10 pKC1218- KasOpJuxR.
Fig. 5. Testung von neuroprotektiven Eigenschaften von erfindungsgemäß hergestellten Collinolacton. Collinolacton wurde in Konzentrationen von 1 - 25 mM hinsichtlich seiner neuroprotektiven Eigenschaften gegen Glutamat-induzierten oxidativen intrazellulären Stress gegen HT22 Zellen getestet. Das Ergebnis des MTT-Tests ist als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt von jeweils drei unabhängigen Replikaten in sechsfacher Wiederholung. Unbehandelte Zellen wurden auf 100 % normiert. Signifikanzniveau: *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; #p < 0,05; ##p < 0,01 ; ###p < 0,001.
Ausführunasbeispiele Zur Aufklärung der Collinolacton-Biosynthese wurde der Bakterienstamm Streptomyces Gö 40/10 verwendet, der in (9) beschrieben ist. Aufbewahrung von Streptomyces Gö 40/10
Die Aufbewahrung der Stämme erfolgte in Form von Glycerol-Stocks bei - 80 °C. Zur Herstellung der Cryo-Stocks wurde der jeweilige Stamm auf einer SM-Agarplatte angeimpft und für 7 Tage bei 28 °C inkubiert. Die dicht bewachsene Platte wurde anschließend mit 5 ml einer sterilen 50 % Glycerol-Wassermischung benetzt und der Sporenrasen mit einer Impföse von der Plattenoberfläche geschabt. Die Suspension wurde durch Baumwolle filtriert und die Sporen durch Zentrifugation pelletiert. Der Überstand wurde abgenommen und das Pellet anschließend in 25 % Glycerol- Wassermischung aufgenommen und gründlich gevortext. Die Lösung wurde in ein Cryo-Röhrchen überführt und bei -80 °C eingefroren.
Herstellung von SM-Agarplatten: fettarmes Sojamehl 20 g/l, D-Mannit 20 g/l, 20 g/l Agar, deionisiertes Wasser, pH = 7,0 durch Zugabe von 1 N NaOH). Autoklavieren bei 121 °C für 20 min. Für die Kultivierung von Streptomyces Gö 40/10 pKC1218 und Streptomyces Gö 40/10 pKC1218-KasOp_luxR wurden vor dem Gießen 50 pg/ml Hygromycin B zugegeben.
Fütterunqsexperimente und biosynthetische Vorarbeiten
Die chemische Struktur von Collinolacton legt nahe, dass dieses ein Produkt aus einer Polyketidbiosynthese ist. Entsprechend wurden die typischen Bausteine für diesen Biosyntheseweg, Acetat und Propionat, isotopenmarkiert zugefüttert, das Produkt Collinolacton isoliert (Verfahren siehe unten) und der Einbau ins Kohlenstoffskelett mittels 13C-NMR Spektroskopie untersucht. Dabei konnte bestimmt werden, dass Collinolacton aus 6 Acetat- bzw. Malonateinheiten, sowie 3 Propionat- bzw. Methylmalonateinheiten aufgebaut wird.
Der Einbau von molekularem Sauerstoff konnte zudem über die Kultivierung unter 180-Atomosphäre bestätigt werden. Die Tatsache, dass die biosynthetische Zwischenstufe Collinoketon ebenfalls isoliert werden kann, liefert Informationen über den Ablauf der Biosynthese (Fig. 2). Zuerst wird das Gerüst aus den Einheiten aufgebaut, abschließend erfolgt der Einbau von Sauerstoff.
Diese Erkenntnisse wurden herangezogen, um die Auswahl der in Frage kommenden Gencluster, die verantwortlich für die Collinolacton-Produktion sind, einzugrenzen. Mit diesem Wissen wurden weiterhin die Bedingungen für die Fermentation und Aufarbeitung entsprechend optimiert.
Aufklärung der Biosynthese von Collinolacton
Basierend auf den Fütterungsstudien und der Komplexität des Collinolactons kann von einer Biosynthese nach dem Typ I Polyketid-Mechanismus ausgegangen werden. Dieser Biosynthesemechanismus zeichnet sich normalerweise darüber aus, dass das Kohlenstoffgerüst solcher Polyketide über modular-aufgebaute Polyketid- Synthase (PKS) Enzyme gebildet wird. Der modulare Aufbau der Enzyme entspricht im Normalfall (z.B. Erythromycin) der Struktur ihrer Biosyntheseprodukte und wird daher auch als „kollinear“ bezeichnet. Um das Collinolacton Biosynthese-Gencluster zu identifizieren, wurden deshalb in der Gesamt-Genomsequenz des Produzentenstamms mit der Software antiSMASH (3) gezielt nach Typ I Polyketid-Synthase codierenden Genclustern gesucht. Überraschenderweise konnte bei keinem der identifizierten Typ I PKS-Genclustern eine Kollinearität mit der Collinolacton-Struktur gefunden werden. Dies deutet klar auf einen atypischen PKS-Biosyntheseweg hin.
Um zu untersuchen, ob eine der in antiSMASH identifizierten Genom-Regionen mit Typ I PKS BGCs an der Collinolacton-Biosynthese beteiligt ist, wurden mit Hilfe der CRISPR-BEST Methode (4, 5) STOP-Codons in PKS-Gene der in antiSMASH identifizierten Regionen 1 , 23, 31 eingefügt.
Hierzu wurden, wie in (4) Tong et al, 2020 beschrieben, sgRNAs abgeleitet mit der Software CRISpy-web (6) (Tabelle S1), in den pCRISPR-BEST-Vektor kloniert und individuell über Interspezies-Konjugation über E. coli ET12567 pUZ8007 in S. sp. Gö 40/10 transferiert (7) und via Nalidixinsäure (30 pg/ml) und Apramycin (50 pg/ml) auf Klone mit übertragenem Plasmid selektiert.
Um zu überprüfen, dass ein korrektes Editing der Zielgene erfolgt ist, wurden mittels Kolonie-PCR 780-1049 bp-Fragmente, die die jeweiligen Editing-Targets überspannen, mit Hilfe der Primer aus Tabelle S2 amplifiziert, mittels konventioneller Sänger-Methode sequenziert und auf das Editing überprüft. Für ein detailliertes Protokoll siehe Tong et al, 2020.
Für Regionen 3 und 39 wurde ein alternativer Ansatz gewählt, bei dem ein internes Fragment der Gene LLPMBPKK_00537 (Region 3) und LLPMBPKK_07936 (Region 39) PCR-amplifiziert mit Template genomischer DNA aus S. sp. Gö 40/10 und den Primern GoR3_0537_R_Fw, GoR3_0537_R_Rv bzw. GoR39_07936_R_Fw und GoR39_07936_R_Rv. Die Primer enthalten Restriktions-Schnittstellen für EcoRI und Hindill, über die das PCR-Fragment mit dem 3.0 kb EcoRI-Hindl 11 Fragment des Plasmids pSOK201, welches einen ColE1-Repliationsursprung, oriT und ein Apramycin-Resistenzgen enthält (8), kloniert wurden. Beide Plasmide wurden wie oben beschrieben über interspezifische Konjugation in S. sp. Gö 40/10 übertragen.
Table S1. CRISPR-Protospacer-Sequenzen zum Einfügen von STOP-Codons via CRISPR-BEST Methode
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000021_0002
Table S2. Liste von Oligonukleotid-Primern zur Validierung des CRISPR-BEST Editings und Amplifikation der internen Genbereiche zur Geninaktivierung von Region 3 und 39.
Figure imgf000021_0001
Während die Geninaktivierung der BGC Regionen 1, 3, 31 und 39 keinen Einfluss auf die Collinolacton-Produktion hatte, führte das Einsetzen eines Stop-Codons in das colL- Gen (SEQ ID Nr. 13), welches einen Vorzeitigen Translations-Abbruch des
Polypeptids SEQ ID Nr. 40 zur Folge und damit zum Ausfall dessen Biosynthese- Funktion hat, zu einem vollständigen Verlust der Collinolacton-Produktion. Damit wurde gezeigt, dass das Gen colL (SEQ ID Nr. 13) und damit vermutlich das gesamte BGC (SEQ ID Nr. 1), in dem colL codiert ist, an der Collinolacton- Produktion beteiligt ist.
Die identifizierte genomische Region 23 (SEQ ID Nr. 1) codiert für drei Gene, die für putative Typ I Polyketidsynthasen codieren {colL, colM, coIN, SEQ ID Nr. 13-15). Es wird vermutet, dass im Zusammenspiel dieser Gene/Genprodukte das Kohlenstoff- Rückgrat des Collinolactons gebildet wird. Ebenfall in SEQ ID Nr. 1 enthalten sind drei Gene, die Ähnlichkeiten zu Monooxygenasen aufweisen, die an der postulierten Baeyer-Villiger-Oxidationsreaktion beteiligt sin können ( colD , coli, colZA ; SEQ ID Nr. 5, 10, 28). Mit colA (SEQ ID Nr. 2) enthält das BGC weiterhin ein Gen, das für einen potentiellen Transkriptionsaktivator der LuxR-Familie codiert sowie mit colH (SEQ ID Nr. 9) ein putatives Transportergen.
Erzeugung eines Collinolacton-Produktionsstamms
Das Collinolacton BGC codiert mit colA (SEQ ID Nr. 2) für einen putativen positiven Regulator der LuxR-Familie. Ein DNA-Fragment bestehend aus dem kasOp* Promotor und dem colA- Gen (SEQ ID Nr. 2), flankiert von einer Hindill und Xbal Restriktionsschnittstelle, wurde synthetisiert (Genscript Biotech, Leiden, NL) (SEQ ID Nr. 56) und kloniert im Vektor pUC57 geliefert. Das Hindlll/Xbal-Fragment wurde anschließend über diese Restriktionsschnittstellen in den Vektor pKC1218 kloniert. Zum Transfer in S. sp. Gö 40/10, wurde anschließend E. coli ET12567 pUZ8002 mit diesem pKC1218 kasOp*-colA Konstrukt transformiert und zur Konjugation eingesetzt mit Standardprotokoll (7). Nach Selektion mit Nalidixinsäure (30 pg/ml) und Hygromycin (50 pg/ml) wurden Einzelkolonien gewonnen und für die weiteren Experimente eingesetzt.
Überproduktion von Gö 40/10 pKC1218-KasOp luxR
Um eine Produktionssteigerung von Collinolacton in der Mutante Streptomyces Gö 40/10 pKC1218-KasOp_luxR nachzuweisen, wurde dieser unter Standardbedingungen fermentiert und der Überstand nach Zentrifugation mit Hilfe der LC-DAD-MS analysiert. Als Negativ-Kontrollen diente Kulturen von Streptomyces Gö 40/10 (Wild Typ) und Streptomyces Gö 40/10 pKC1218, die zeitgleich unter identischen Bedingungen kultiviert, aufgearbeitet und analysiert wurde.
Die Anzucht erfolgte ausgehend von Cryo-Stocks der jeweiligen Stämme. Um eine reproduzierbare und vergleichbare Menge an Sporen zum Animpfen zu erhalten, wurde vorher ein Colony-Forming-Unit Test durchgeführt. Dazu wurde eine definierte Menge (100 pl) Sporensuspension entnommen und schrittweise in sterilisiertem Wasser verdünnt (jeweils 1 : 10 pro Verdünnungsschritt). Die einzelnen Verdünnungen wurden auf SM-Agarplatten (siehe Aufbewahrung) ausgestrichen und für 72 Stunden bei 28 °C inkubiert. Die Anzahl der gebildeten Kolonien wurde durch manuelle Auszählung bestimmt.
Dieselbe Menge an Sporen wurde zum Animpfen der Flüssigkulturen verwendet. Alle Experimente wurden in Triplikaten durchgeführt.
Herstellung Flüssigkulturen: 250 ml Schüttelkolben mit drei Bodenschikanen, fettarmes Sojamehl 20 g/l, D-Mannit 20 g/l, deionisiertes Wasser, pH = 7,0 durch Zugabe von 1 N NaOH). Autoklavieren bei 121 °C für 20 min. Für die Kultivierung von Streptomyces Gö 40/10 pKC1218 und Streptomyces Gö 40/10 pKC1218- KasOpJuxR wurden nach dem Autoklavieren und Abkühlen 50 pg/ml Hygromycin B zugegeben. Als Verdünnerlösungen wurde demineralisiertes Wasser mit 5% Dimethylsulfoxid im Dialyseverfahren verwendet.
Die Inkubation wurde bei 28 °C und 165 rpm für insgesamt 144 Stunden durchgeführt. Alle 24 Stunden wurde jeweils 1 ml Kultur entnommen, zentrifugiert und der Überstand mittels LC-DAD-MS analysiert.
LC-DAD-MS-Analyse (Gerätespezifikation: HPLC: Thermo Fisher Scientific Dionex Ultimate 3000 HPLC; Säule: Macherey-Nagel Nucleoshell® EC RP-C18 (150 x 2 mm, 2,7pm); MS: Bruker MaXis 4G ESI-QTOF wurde mit folgendem Gradientensystem durchgeführt (Lösungsmittel A- Wasser mit 0,1% Ameisensäure, B - Methanol mit 0,1 % Ameisensäure): 10 % A auf 100 % B in 20 min, Flussrate: 0,3 ml/min.
Zur Datenauswertung wurde die vom Hersteller bereitgestellte Software Bruker DataAnalysis 4.2 verwendet. Extracted Ion Chromatograms (EICs) für Collinolacton (m/z = 361 ,2010 ± 0,005 Da) wurden erzeugt und die Peakflächen automatisch integriert.
Die Produktion des Überproduzentenstamm Streptomyces Gö 40/10 pKC1218- KasOpJuxR liegt um das 7-fache über der Produktion des Wildtyp-Stamm Streptomyces Gö (Fig. 4B). Da das produzierte Produkt Collinolacton wieder abgebaut wird (Fig. 4A), wurde eine spezielle Fermentationsmethode entwickelt, um das bereits produzierte Collinolacton aus der Kulturbrühe zu entziehen und so den Abbau zu verhindern.
Zugabe von XAD-16 zur Fermentation
Durch Zugabe von Amberlite XAD-16 Resin, eine polymerbasierten Adsorberharz wird der Kulturbrühe permanent Collinolacton entzogen. Um die Verträglichkeit des Harzes für den Bakterienstamm zu erhöhen, ist es notwendig, alle zugegebenen Additive wie Bindemittel, Trocknungsmittel und Bakterizide vorher zu entfernen. Dazu wird das Adsorberharz wie folgt vorbereitet:
I. Quellen in 1 N HCI-Lösung in Methanol für 30 min, danach abfiltrieren.
II. Der Rückstand wird in Aceton aufgenommen und für 30 min quellen gelassen, danach erneut abfiltriert.
III. Der Rückstand wird in 1 N wässriger Natriumhydroxidlösung aufgenommen und erneut quellen gelassen für 30 min. Abschließend wird erneut filtriert.
IV. Das Harz wird mit Wasser so lange gewaschen, bis sich der Geruch des Acetons vollkommen verflüchtigt hat.
Pro Schüttelkolben mit Medium werden 15 g des noch feuchten Adsorberharz zugegeben und anschließend zusammen autoklaviert. Die Zugabe des Adsorberharzes hat zudem den Vorteil, dass bei der Aufarbeitung der Kulturen das durch Zentrifugation erhaltene Filtrat verworfen werden kann, während sich das Collinolacton vollständig im Harz/Pellet Gemisch befindet.
Fermentation und Aufarbeitung von Collinolacton-Produzenten
In der erstellten Fermentationsprotokoll für die Collinolacton-Produzentenstämme und die Aufarbeitung wurden alle erworbenen Kenntnisse mit einbezogen.
Basierend auf dem Sojamehl-Mannit-Medium wurde ein optimiertes Medium zusammengestellt, welches folgende Bestandteile beinhaltet: fettarmes Sojamehl 20 g/l, D-Mannit 20 g/l, 20 g/l Kartoffelstärke (löslich), 10 g/l D-Glucose, 5 g/l Hefeextrakt, 1 g/l Calciumcarbonat, deionisiertes Wasser, pH = 7,0 durch Zugabe von 1 N NaOH). Zugabe von 75 g/l frisch äquilibriertes XAD-16 (siehe oben) und anschließendes Autoklavieren bei 121 °C für 20 min. Für die Kultivierung von Streptomyces Gö 40/10 pKC1218 und Streptomyces Gö 40/10 pKC1218- KasOpJuxR wurden nach dem Autoklavieren und Abkühlen 50 pg/ml Hygromycin B zugegeben.
Die Kulturen wurden mit 10 ml einer 48 Stunden alten Vorkultur angeimpft.
Herstellung der Vorkultur: 250 ml Schüttelkolben mit drei Bodenschikanen, fettarmes Sojamehl 20 g/l, D-Mannit 20 g/l, deionisiertes Wasser, pH = 7,0 durch Zugabe von 1 N NaOH). Autoklavieren bei 121 °C für 20 min. Für die Kultivierung von Streptomyces Gö 40/10 pKC1218 und Streptomyces Gö 40/10 pKC1218- KasOpJuxR wurden nach dem Autoklavieren und Abkühlen 50 pg/ml Hygromycin B zugegeben. Die Vorkulturen wurden ausgehend von einem Cryo-Stock angeimpft.
Um die Produktion weiter zu steigern, wurde eine sterilfiltrierte Lösung von Natriumpropionat und Malonsäure (jeweils 500 mg/l Kultur) mit einem pH-Wert von 7 (durch Zugabe von NaOH eingestellt) 8 Stunden nach Fermentationsbeginn zugegeben.
Die Kultivierung und Produktion kann entweder in Schüttelkolben oder im Fermenter erfolgen.
Die Aufarbeitung erfolgt im Falle des Wildtyps Streptomyces Gö 40/10 nach 48 Stunden bzw. nach 96 Stunden für Streptomyces Gö 40/10 pKC1218-KasOp_luxR. Dazu wird die Kultur zentrifugiert und der Überstand verworfen. Dieser enthält aufgrund des zugegebenen XAD-16 kein Collinolacton. Der erhaltene Rückstand wird drei Mal unter Rühren mit je 2 I Aceton extrahiert, bis das erhaltene Extrakt nahezu farblos ist. Das Lösungsmittel der vereinigten Extrakte wird entfernt und der Rückstand in 300 ml Wasser aufgenommen bevor dieser drei Mal mit 200 ml Toluol extrahiert wird.
Die Verdünnerlösungen aus Produkt im demineralisierten Wasser mit 5% Dimethylsulfoxid werden in der Kälte lyophilisiert bis ein trockener Rückstand erhalten wird. Der erhaltene Rückstand wird drei Mal unter Rühren mit je 2 I Aceton extrahiert, bis das erhaltene Extrakt nahezu farblos ist. Das Lösungsmittel der vereinigten Extrakte wird entfernt und der Rückstand in 300 ml Wasser aufgenommen bevor dieser drei Mal mit 200 ml Toluol extrahiert wird.
Das Lösungsmittel wird wiederum entfernt und der erhaltene ölige Rückstand säulenchromatographisch aufgereinigt:
I. Schwerkraftsäule Kieselgel, Cyclohexan/Aceton 3:2;
II: Flash-Chromatographie: A: Diisopropylether, B: Aceton mit 20 ml/min. Die einzelnen Gradienten-Schritte sind wie folgt: 5 min 2 % B, 10 min 8 % B, 20 min 8 % B, 25 min 16 % B, 35 min 16 % B, 40 min 20 % B, 45 min 20 % B.
III: Präparative HPLC: Säule: Dr. Maisch Kromasil 100 Cie, 34 % Acetonitril/Wasser, Flussrate 17,5 ml/min. Das Produkt eluiert bei Rt = 25 - 27 min.
Durch die Aufarbeitung konnten Ausbeuten an Collinolacton von 75 mg/l erhalten werden.
Testung von neuroprotektiven Eigenschaften von Collinolacton
Das nach dem oben beschriebenen Verfahren produziertes Collinolacton wurde in Konzentrationen von 1 - 25 mM hinsichtlich seiner neuroprotektiven Eigenschaften gegen Glutamat-induzierten oxidativen intrazellulären Stress gegen HT22 Zellen getestet.
Das Ergebnis des MTT-Tests ist als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt von jeweils drei unabhängigen Replikaten in sechsfacher Wiederholung (Fig. 5). Unbehandelte Zellen wurden auf 100 % normiert. Signifikanzniveau: *p < 0,05; **p < 0,01 ; ***p < 0,001 ; #p < 0,05; ##p < 0,01 ; ###p < 0,001.
Referenzen
(1) Y. Kwon, J. Shin, K. Nam, J. S. An, S. H. Yang, S. H. Hong, M. Bae, K. Moon, Y. Cho, J. Woo, K. Park, K. Kim, J. Shin, B. Y. Kim, Y. Kim, D. C. Oh, Angew Chem Int Ed Engl 2020, 59, 22994-22998
(2) J.-N. Fricke, Chemische Synthese von Struktur-modifikationen des Naturstoffs Collinolacton zur Target-Identifizierung und Untersuchung von Struktur-Aktivitäts- Beziehungen (SAR). Dissertation, Tübingen 2021
(3) Blin K, Shaw S, Kloosterman AM, Charlop-Powers Z, van Wezel GP, Medema MH, et al. antiSMASH 6.0: improving cluster detection and comparison capabilities. Nucleic Acids Res. 2021;49(W1):W29-W35. DOI: 10.1093/nar/gkab335.
(4) Tong Y, Whitford CM, Blin K, Jorgensen TS, Weber T, Lee SY. CRISPR-Cas9, CRISPRi and CRISPR-BEST-mediated genetic manipulation in streptomycetes. Nat Protoc. 2020; 15(8):2470-502. DOI: 10.1038/s41596-020-0339-z.
(5) Tong Y, Whitford CM, Robertsen HL, Blin K, Jorgensen TS, Klitgaard AK, et al. Highly efficient DSB-free base editing for streptomycetes with CRISPR-BEST. Proc Natl Acad Sei U S A. 2019; 116(41 ):20366-75. DOI: 10.1073/pnas.1913493116.
(6) Blin K, Shaw S, Tong Y, Weber T. Designing sgRNAs for CRISPR-BEST base editing applications with CRISPy-web 2.0. Synth Syst Biotechnol. 2020;5(2):99-102. DOI: 10.1016/j.synbio.2020.05.005.
(7) T. Kieser, M. J. Bibb, M. J. Büttner, K. F. Chater, D. A. Hopwood, Practical Streptomyces genetics: A Laboratory Manual, The John Innes Foundation, Norwich, 2000.
(8) S. Zotchev, K. Haugan, O. Sekurova, H. Sletta, T. E. Ellingsen, S. Valla, Microbiology (Reading) 2000, 146 ( Pt 3), 611-619.
(9) L. Hoffmann, Struktur und Biosynthese von Collinolacton aus Streptomyces sp. und Beiträge zum Screening neuer Wirkstoffe. Dissertation, Göttingen, 2006.

Claims

Patentansprüche
1. Isoliertes Gen-Cluster, das funktional für die Synthese oder einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese von Collinolacton ist, wobei das isolierte Gen-Cluster mindestens 2 der Nukleinsäure-Sequenzen umfasst, welche eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Nukleinsäure-Sequenz aufweisen, bestehend aus einer Nukleinsäure-Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 13 bis SEQ ID Nr. 15, und welche für ein Protein oder Peptid codieren, welches funktional für die Synthese oder einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese von Collinolacton ist.
2. Das isolierte Gen-Cluster nach Anspruch 1 , wobei das isolierte Gen-Cluster mindestens 2 der Nukleinsäure-Sequenzen umfasst, welche eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit einer Nukleinsäure-Sequenz aufweisen, bestehend aus den Nukleinsäure-Sequenzen SEQ ID Nr. 14 und SEQ ID Nr. 15, und welche für ein Protein oder Peptid codieren, welches funktional für die Synthese oder einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese von Collinolacton ist.
3. Das isolierte Gen-Cluster nach Anspruch 1 oder 2, wobei das isolierte Gen-Cluster mindestens 3 der Nukleinsäure-Sequenzen umfasst, welches eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Nukleinsäure-Sequenz aufweisen, bestehend aus einer Nukleinsäure-Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 13 bis SEQ ID Nr. 15, und welche für ein Protein oder Peptid codieren, welches funktional für die Synthese oder einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese von Collinolacton ist.
4. Das isolierte Gen-Cluster nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das isolierte Gen- Cluster mindestens eine, vorzugsweise mindestens zwei, vorzugsweise mindestens 3, Nukleinsäure-Sequenzen umfasst, welche eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Nukleinsäure-Sequenz aufweist, bestehend aus einer Nukleinsäure-Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 5, 6, 10 und 28, vorzugweise SEQ ID Nr. 5, 10 und 28, und welche für ein Protein oder Peptid codieren, welches funktional für die Synthese oder einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese von Collinolacton ist.
5. Das isolierte Gen-Cluster nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das isolierte Gen- Cluster mindestens eine, bevorzugt mindestens Nukleinsäure-Sequenzen umfasst, welche eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Nukleinsäure-Sequenz aufweist, bestehend aus einer Nukleinsäure-Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
SEQ ID Nr. 2 und 9.
6. Das isolierte Gen-Cluster nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das isolierte Gen- Cluster mindestens 2 der Nukleinsäure-Sequenzen umfasst, welche eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Nukleinsäure-Sequenz aufweisen, bestehend aus einer Nukleinsäure- Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 2 bis SEQ ID Nr. 28 oder SEQ ID Nr. 56 und Kombinationen davon.
7. Das isolierte Gen-Cluster nach Ansprüche 1 bis 6, wobei das isolierte Gen-Cluster aus einer Nukleinsäure-Sequenz besteht, die eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Nukleinsäure-Sequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist.
8. Ein Satz isolierter Proteine oder Peptide, welcher für die Synthese oder einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese von Collinolacton funktional ist, wobei der Satz isolierter Proteine oder Peptide mindestens zwei isolierte Proteine oder Peptide umfasst, welche für einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese von Collinolacton funktional sind, welche eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Aminosäure-Sequenz aufweisen, bestehend aus einer Aminosäure-Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 40 bis SEQ ID Nr. 42.
9. Der Satz isolierter Proteine oder Peptide nach Anspruch 8, wobei der Satz isolierter Proteine oder Peptide mindestens zwei isolierte Proteine oder Peptide umfasst, welche eine Übereinstimmung von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 99%-100% mit der Aminosäure-Sequenz aufweisen, bestehend aus einer Aminosäure-Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 29 bis SEQ ID Nr. 55 und Kombinationen davon.
10. Der Satz isolierter Proteine oder Peptide nach Anspruch 8 oder 9, welcher mittels Expression des isolierten Gen-Clusters nach einem der Ansprüchen 1 bis 7 hergestellt wird.
11. Expressionsvektor, enthaltend wenigstens ein isoliertes Gen-Cluster nach einem der Ansprüche 1 bis 7, und optional mindestens einen starken Promotor, vorzugsweise einen Promotor aus der Familie kasOp, insbesondere einen kasOp* Promotor.
12. Wirtszelle, enthaltend wenigstens ein isoliertes Gen-Cluster nach einem der Ansprüche 1 bis 7, den Satz isolierter Proteine oder Peptide nach einem der Ansprüche 8-10, und/odereinen Expressionsvektor nach Anspruch 11.
13. Verfahren für die Biosynthese von Collinolacton, umfassend die Schritte: a)
Kultivieren einer Collinolacton-produzierenden Wrtszelle gemäß Anspruch 12; b) Aufreinigen von Collinolacton aus der Zelle und/oder einem für die Zelle verwendeten Kulturmedium.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei beim Kultivieren der Collinolacton- produzierenden Wirtszelle wenigstens eine Vorläuferverbindung für die Biosynthese von Collinolacton dem Kulturmedium hinzugefügt wird, die bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alkinsäuren, Alkensäuren, Dicarbonsäuren, deren Ester und Thioester sowie deren Salze, insbesondere Acetat, Propionat und Malonat.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 und 14, wobei beim Kultivieren der Collinolacton-produzierenden Wirtszelle ein Adsorbens, bevorzugt ein Adsorberharz dem Kulturmedium hinzugefügt wird, oder im Dialyseverfahren mit Verdünnerlösungen die Produktgewinnung vermittelt wird.
16. Collinolacton oder sein bioaktives Derivat, hergestellt oder herstellbar unter Verwendung eines Gen-Clusters nach einem der Ansprüche 1 bis 7, einem Satz isolierter Proteine oder Peptide nach einem der Ansprüche 8 bis 10, eines Expressionsvektors nach Anspruch 11, einer Wirtszelle nach Anspruch 12, odereines Verfahrens nach einem der Ansprüche 13 bis 15.
17. Pharmazeutische Zusammensetzung, die Collinolacton oder mindestens eines seiner bioaktiven Derivate gemäß Anspruch 16 enthält.
18. Collinolacton oder die Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 17 zur Verwendung bei der Behandlung, Diagnose und/oder Prophylaxe einer Krankheit.
19. Das Collinolacton, oder die Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung nach Anspruch 18, wobei die Krankheit eine neurodegenerative Erkrankungen, insbesondere Alzheimer oder Demenz ist.
PCT/EP2022/071442 2021-07-29 2022-07-29 Collinolacton-biosynthese und herstellung WO2023006995A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102021003944.0 2021-07-29
DE102021003944.0A DE102021003944A1 (de) 2021-07-29 2021-07-29 Collinolacton-Biosynthese und Herstellung

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023006995A1 true WO2023006995A1 (de) 2023-02-02

Family

ID=83149389

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2022/071442 WO2023006995A1 (de) 2021-07-29 2022-07-29 Collinolacton-biosynthese und herstellung

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE102021003944A1 (de)
WO (1) WO2023006995A1 (de)

Non-Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BLIN KSHAW SKLOOSTERMAN AMCHARLOP-POWERS ZVAN WEZEL GPMEDEMA MH ET AL.: "antiSMASH 6.0: improving cluster detection and comparison capabilities", NUCLEIC ACIDS RES., vol. 49, no. W1, 2021, pages W29 - W35
BLIN KSHAW STONG YWEBER T.: "Designing sgRNAs for CRISPR-BEST base editing applications with CRISPy-web 2.0", SYNTH SYST BIOTECHNOL., vol. 5, no. 2, 2020, pages 99 - 102
FRICKE JAN-NIKLAS: "Chemische Synthese von Struktur- modifikationen des Naturstoffs Collinolacton zur Target-Identifizierung und Untersuchung von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen (SAR)", DISSERTATION, 1 January 2012 (2012-01-01), XP093004846, Retrieved from the Internet <URL:http://hdl.handle.net/10900/49954> [retrieved on 20221205] *
HOFFMANN LUISE: "Struktur und Biosynthese von Collinolacton aus Streptomyces sp. und Beiträge zum Screening neuer Wirkstoffe", DISSERTATION, 16 October 2006 (2006-10-16), XP093004827, Retrieved from the Internet <URL:http://dx.doi.org/10.53846/goediss-2054> [retrieved on 20221205] *
J.-N. FRICKE: "Chemische Synthese von Struktur-modifikationen des Naturstoffs Collinolacton zur Target-Identifizierung und Untersuchung von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen (SAR", DISSERTATION, 2021
KWON Y ET AL: "Rhizolutin, a Novel 7/10/6-Tricyclic Dilactone, Dissociates Misfolded Protein Aggregates and Reduces Apoptosis/Inflammation Associated with Alzheimer's Disease", ANGEWANDTE CHEMIE INTERNATIONAL EDITION, vol. 59, no. 51, 4 October 2020 (2020-10-04), pages 22994 - 22998, XP093004849, Retrieved from the Internet <URL:https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full-xml/10.1002/anie.202009294> DOI: 10.1002/anie.202009294 *
L. HOFFMANN: "Struktur und Biosynthese von Collinolacton aus Streptomyces sp. und Beiträge zum Screening neuer Wirkstoffe", DISSERTATION, 2006
MYRONOVSKYI M ET AL: "Native and engineered promoters in natural product discovery", NATURAL PRODUCT REPORTS, vol. 33, no. 8, 1 January 2016 (2016-01-01), pages 1006 - 1019, XP055622685, DOI: 10.1039/C6NP00002A *
S. ZOTCHEVK. HAUGANO. SEKUROVAH. SLETTAT. E. ELLINGSENS. VALLA, MICROBIOLOGY (READING, vol. 146, no. 3, 2000, pages 611 - 619
SCHMID J C ET AL: "The Structure of Cyclodecatriene Collinolactone, its Biosynthesis, and Semisynthetic Analogues: Effects of Monoastral Phenotype and Protection from Intracellular Oxidative Stress", ANGEWANDTE CHEMIE INTERNATIONAL EDITION, vol. 60, no. 43, 21 September 2021 (2021-09-21), pages 23212 - 23216, XP093004851, Retrieved from the Internet <URL:https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full-xml/10.1002/anie.202106802> DOI: 10.1002/anie.202106802 *
SCHMID JULIAN C ET AL: "Supporting Information for: The Structure of Cyclodecatriene Collinolactone, its Biosynthesis, and Semisynthetic Analogues: Effects of Monoastral Phenotype and Protection from Intracellular Oxidative Stress", ANGEWANDTE CHEMIE INTERNATIONAL EDITION, 21 September 2021 (2021-09-21), XP093006005, Retrieved from the Internet <URL:https://onlinelibrary.wiley.com/action/downloadSupplement?doi=10.1002%2Fanie.202106802&file=anie202106802-sup-0001-misc_information.pdf> [retrieved on 20221207] *
TONG YWHITFORD CMBLIN KJORGENSEN TSWEBER TLEE SY: "CRISPR-Cas9, CRISPRi and CRISPR-BEST-mediated genetic manipulation in streptomycetes", NAT PROTOC., vol. 15, no. 8, 2020, pages 2470 - 502, XP037207382, DOI: 10.1038/s41596-020-0339-z
TONG YWHITFORD CMROBERTSEN HLBLIN KJORGENSEN TSKLITGAARD AK ET AL.: "Highly efficient DSB-free base editing for streptomycetes with CRISPR-BEST", PROC NATL ACAD SCI USA., vol. 116, no. 41, 2019, pages 20366 - 75
Y. KWONJ. SHINK. NAMJ. S. ANS. H. YANGS. H. HONGM. BAEK. MOONY. CHOJ. WOO, ANGEW CHEM INT ED ENGL, vol. 59, 2020, pages 22994 - 22998

Also Published As

Publication number Publication date
DE102021003944A1 (de) 2023-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0334841B1 (de) Microorganismen and plasmide für die 2,4-dichlorphenoxyessigsäure (2,4-d)-monooxigenase - bildung und verfahren zur herstellung dieser plasmide und stämme
DE69033616T3 (de) Riboflavin überproduzierende Bakterienstämme
DE69629576T2 (de) Verfahren zur herstellung von rekombinanten plasmiden
EP1282716A1 (de) Verfahren zur herstellung rekombinanter proteine durch gram-negative bakterien
EP1700864A1 (de) Verfahren zur fermentativen Herstellung von S-Adenosylmethionin
DE102015103608A1 (de) Verfahren zur mikrobiellen de novo Synthese von Terpenen
EP3164494B1 (de) T7-expressionssystem, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung zur herstellung von rekombinanten proteinen
EP1897939B1 (de) Mikroorganismenstamm zur Produktion von rekombinanten Proteinen
DE69531686T2 (de) Glycosyltransferase kodierendes gen und seine verwendung
DE10196565B4 (de) Rekombinantes Human-Parathyroidhormon erzeugender Hefe-Transformant und Verfahren zur Herstellung des Hormons
WO2006131240A2 (de) Rückführung lysierter biomasse als nährmedium bei der fermentativen herstellung von riboflavin
DE69736673T2 (de) Rifamycin biosynthese genkluster
DE69627787T2 (de) Actinomyceten-Promotor
WO2023006995A1 (de) Collinolacton-biosynthese und herstellung
DE112019000467T5 (de) Rekombinanter Mikroorganismus, Verfahren zu dessen Herstellung und seine Anwendung bei der Herstellung von Coenzym Q10
EP0501921A2 (de) Verfahren zur genetischen Manipulation von Myxobakterien
DE102009053566B4 (de) Mikroorganismen mit gesteigerter Sucrosemutaseaktivität
DE60215881T2 (de) Methode für die Erweiterung der chemischen Zusammensetzung von Proteinen produziert in vivo unter Verwendung von mutierten Aminoacyl-tRNA-Synthetasen ohne Korrekturfunktion
EP2379721A1 (de) Verbesserte säure- und lösungsmittelproduktion in mikroorganismen
DE60130394T2 (de) Gene, die im Zusammenhang mit der Biosynthese von ML-236B stehen
DE60126767T2 (de) Neuartige (r)-2-hydroxy-3-phenylpropionat (d-phenyllaktat) dehydrogenase und für diese kodierendes gen
DE60313340T2 (de) Mikroorganismus und verfahren für die produktion von vitamin b6
DE102021111496A1 (de) Verbesserte Herstellung von natürlichen Verbindungen unter der Verwendung von Marginolactonen
DE102004040014B4 (de) Aureonitrile, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
WO2003093481A1 (de) Nukleinsäure zur autonomen replikation in mikroorganismen der familie der acetobacteraceae

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22761425

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE